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TW202535911A - 長效glp-1/gip雙激動劑的藥物組合物 - Google Patents

長效glp-1/gip雙激動劑的藥物組合物

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Publication number
TW202535911A
TW202535911A TW114101197A TW114101197A TW202535911A TW 202535911 A TW202535911 A TW 202535911A TW 114101197 A TW114101197 A TW 114101197A TW 114101197 A TW114101197 A TW 114101197A TW 202535911 A TW202535911 A TW 202535911A
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TW
Taiwan
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colorless
clear
composition
trisodium citrate
citric acid
Prior art date
Application number
TW114101197A
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English (en)
Inventor
張楠
李宏昊
楊園園
滕莉
蔣春華
東舟 劉
Original Assignee
大陸商杭州中美華東製藥有限公司
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Publication date
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Abstract

發明提供了包含長效GLP-1/GIP雙激動劑的藥物組合物，包含該藥物組合物的試劑盒，以及該藥物組合物用於製備治療糖尿病或肥胖症的藥物的用途。

Description

長效GLP-1/GIP雙激動劑的藥物組合物
本發明屬於多肽藥物的製劑領域。具體地，本發明提供了包含長效GLP-1/GIP雙激動劑的藥物組合物，包含該藥物組合物的試劑盒，以及該藥物組合物用於製備治療糖尿病或肥胖症的藥物的用途。
胰高血糖素樣肽GLP-1 (glucagon-like peptide) 是在食物刺激後由腸道分泌的一種多肽類激素，GLP-1以葡萄糖依賴的方式刺激胰島素分泌以及減少胰高血糖素分泌。葡萄糖依賴性促胰島素激素GIP (gluocose-dependent insulinotropic)目前認為主要由十二指腸和空腸上段的腸內分泌K細胞分泌。與GLP-1類似，GIP可以刺激胰島素分泌。但是，天然GLP-1和GIP在人和動物體內的半衰期都很短，只有數分鐘。
藥物研發人員開發了一系列GLP-1R/ GIPR雙重激動劑，用以發揮與天然GLP-1和GIP相同的生物學作用，並且延長其作用時間。多肽類GLP-1受體激動劑和GIP受體激動劑普遍採用注射或非胃腸道給藥的方式。然而，多肽因其胺基酸序列、淨電荷、二級結構和化學修飾，以及其所處介質環境諸如輔料、pH、溫度等，易發生諸如化學降解、聚合物和物理聚集等產品非期望屬性。不良介質條件諸如緩衝劑、滲透壓調節劑、pH值，以及諸如溫度和光照的環境條件，都會影響甚至破壞多肽化合物的穩定性，包括發生多肽異構化、脫醯胺、醯胺鍵斷裂以及聚合物產生的不良化學反應，以及發生多肽化合物分子之間的物理聚集。再者，隨著多肽化合物濃度的增加，也會加重多肽的物理聚集傾向。
因此，仍然需要開發替代的包含GLP-1受體激動劑或GIP受體激動劑的藥物組合物，希望所述藥物組合物發揮良好且持久的降低血糖或減重療效，並在生產、儲存、使用期間保持穩定性，能夠耐受一定的異常溫度而不變質，增加使用者不同場景下的安全有效使用。
在本發明的一個方面，提供下式I的化合物、或其藥學上可接受的鹽、或其生理學上可接受的鹽、或其前體化合物：Y-Aib-E-G-T-αMePhe-T-S-D-Y-Aib-I-Aib-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K24-W-L-L-K28-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K   式I (SEQ ID NO:12)；其中，在16位、24位、28、40位K中任選1個K的位置，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-Z綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，其中每個a獨立的選自1、2、3的整數，每個b獨立的選自1、2、3的整數，每個c獨立的選自16、18、20的整數，其中Z獨立的選自-CH3、羧酸或羧酸生物電子等排體、膦酸鹽/酯或磺酸鹽/酯，優選是-COOH；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺。
在本發明的一個方面，提供了一種藥物組合物，其包含式I的化合物、或其藥學上可接受的鹽、或其生理學上可接受的鹽、或其前體化合物。
在本發明的一個方面，提供了根據本發明的藥物組合物的用途，其用於製備治療疾病的藥物，所述疾病例如是糖尿病或者肥胖症等相關疾病。
在本發明的一個方面，提供了根據本發明的藥物組合物，其用於治療疾病，所述疾病例如是糖尿病或者肥胖症。
在本發明的一個方面，提供了一種預防或治療疾病的方法，其包括向有需要的人或動物施用有效量的根據本發明的藥物組合物，所述疾病例如是糖尿病或者肥胖症。
本發明式I的化合物具有對GLP-1受體和GIP受體的雙重激動效果，可用作GLP-1/GIP雙激動劑，具有良好的降低血糖和/或減輕體重的療效，並具有長半衰期。包含本發明化合物的藥物組合物在高溫、室溫和冷藏儲存期間、以及在使用期間均保持優異的穩定性，特別是澄清度、顏色、純度、聚合物含量和pH值等方面的穩定性，能夠耐受一定的異常溫度而不變質。
除非另有說明，在本發明上下文中中，所有的科學和技術術語應當具有與本發明所屬領域具通常知識者所知相同的含義。若存在不一致，則以在本發明中提供的定義為准。
應當理解，所有的材料、方法和實施例的詳細描述是出於舉例說明的目的，因此除非另有明確說明，並不被解釋為對本發明的限制。
在此，術語「含有」、「包含」和「包括」意思相同，表示可以包括不影響最終效果的其他成分或其他步驟。該術語包括術語「由……組成」和「基本上由……組成」。根據本發明的產品和方法可以包括在此所述的本發明的基本技術特徵和/或限定以及在此所述的任何額外和/或任選的成分、組分、步驟或限定，由它們組成以及基本上由它們組成。
除非另有說明，在本發明的上下文中每個數值範圍意味著包括兩個端點以及落入所述數值範圍中的任何數值和子範圍。
本發明中所用術語「約」或「大約」是指數值在由本發明所屬領域具通常知識者一般所測定的具體值的可接受誤差範圍內，所述數值在一定程度上取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，「約」或「基本上包含」可意味著至多±20%的浮動範圍。例如，約5.5的pH值意指pH值為5.5±1.1。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和請求項中出現時，「約」或「基本上包含」的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
除非特別說明，在本發明中使用的所有的材料和試劑均是可商購獲得的。
[藥物組合物及其製備方法]
本發明公開了一種藥物組合物，其包含下式I的化合物、或其藥學上可接受的鹽、或其生理學上可接受的鹽、或其前體化合物：Y-Aib-E-G-T-αMePhe-T-S-D-Y-Aib-I-Aib-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K24-W-L-L-K28-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K   式I (SEQ ID NO:12)；其中，在16位、24位、28位、40位K中任選1個K的位置，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-Z綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，其中每個a獨立的選自1、2、3的整數，每個b獨立的選自1、2、3的整數，每個c獨立的選自16、18、20的整數，其中Z獨立的選自-CH3、羧酸或羧酸生物電子等排體、膦酸鹽/酯或磺酸鹽/酯，優選是-COOH；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺。
本發明式I化合物具有相同的多肽主鏈：Y-Aib-E-G-T-αMePhe-T-S-D-Y-Aib-I-Aib-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K24-W-L-L-K28-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K，故而具有與共同多肽主鏈相關聯的理化穩定性特徵，包括多肽主鏈的等電點和溶解特徵、特定胺基酸殘基官能團及其醯胺鍵在介質環境中的化學反應活性。在本發明式I化合物中，多肽主鏈經([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-Z進行側鏈化學修飾，賦予多肽主鏈以電荷、親水和疏水特性，但保留了多肽主鏈自身的共性特徵。
如本文所用，術語「藥物組合物」表示含有一種或多種本發明的式I的多肽化合物、或其藥學上可接受的鹽、或其生理學上可接受的鹽、或其前體化合物，以及任選存在的其他組分的混合物。所述其他組分包括生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，以利於作為藥物活性成分的本發明式I多肽化合物的吸收，進而發揮生物活性。
在本發明的上下文中，除非另有說明或者明顯矛盾，術語「藥物組合物」、「組合物」、和「製劑」可以互換使用。
本發明式I的化合物具有對GLP-1受體和GIP受體的雙重激動效果，可用作GLP-1/GIP雙激動劑，具有良好的降低血糖和/或減輕體重的療效，並具有長半衰期。包含式I化合物的藥物組合物在高溫、室溫和冷藏儲存期間、以及在使用期間均保持優異的穩定性，特別是澄清度、顏色、純度、聚合物含量、pH值等方面的穩定性，能夠耐受一定的異常溫度而不變質。
在一些實施方案中，藥物組合物是水溶液的形式。
在一些實施方案中，藥物組合物是可注射的。
在一些實施方案中，藥物組合物為純化液體製劑。
在一些實施方案中，純化液體製劑包括皮下注射製劑、靜脈注射製劑、腹腔給藥製劑、肌肉注射製劑、靜脈/皮下注射製劑、和玻璃體注射製劑。
在一些實施方案中，純化液體製劑包括水針注射製劑和預充式注射製劑，優選水針注射製劑。
在一些實施方案中，純化液體製劑包括水針注射製劑和預充式注射製劑，所述預充式注射製劑的容器可以為西林瓶、卡式瓶、或預充針。
在一些實施方案中，藥物組合物為皮下注射水針製劑。
在一些實施方案中，藥物組合物含有式I的多肽化合物、緩衝劑、滲透壓調節劑、水、以及任選存在的pH調節劑和其他賦形劑和/或載體。所述其他賦形劑和/或載體包括以下物質中的一種或多種：防腐劑、穩定劑和抗氧化劑。
在一些實施方案中，水優選為純化水、去離子水或注射用水。
在一些實施方案中，防腐劑包括苯酚、間甲酚、甲酚、苯氧乙醇、三氯三級丁醇、苯甲醇、苯甲酸酯衍生物、以及它們的任意組合；防腐劑優選為苯酚、間甲酚、苯甲醇及它們任意的組合。
在本發明的上下文中，甲酚包括間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、或它們的任意組合。
在本發明的上下文中，對於苯甲酸酯衍生物沒有特別限制，本領域常用的苯甲酸酯衍生物均可用於本發明。在一些實施方案中，苯甲酸酯衍生物可以為對羥基苯甲酸酯(paraben)，例如對羥基苯甲酸的C1~C10酯，優選對羥基苯甲酸的C1~C6酯，更優選對羥基苯甲酸的C1~C4酯，例如對羥基苯甲酸甲酯(methyl paraben)、對羥基苯甲酸乙酯(ethyl paraben)、對羥基苯甲酸丙酯(propyl paraben)、對羥基苯甲酸三級丁酯(t-butyl paraben)等。
在一些實施方案中，藥物組合物的製備方法包括：提供緩衝劑、滲透壓調節劑、以及任選存在的其他賦形劑和/或載體，得到混合物，將所述混合物與水混合，得到含水混合物，向所述含水混合物中加入式I的多肽化合物或者式I多肽化合物的水溶液，得到含式I多肽化合物的混合物，根據混合物pH值與目標pH值的差距，任選加入pH調節劑，將混合物pH值調節至目標pH值，和加入另外的水定容。
任選加入pH調節劑指的是：測試含式I多肽化合物的混合物的pH值，如果pH測試值與目標pH值有偏差，則加入pH調節劑，將含多肽水混合物的pH值調節至目標pH值，如果pH測試值為目標pH值，則不加入pH調節劑。
本發明所屬領域具通常知識者理解，最後加入的水用於定容，所以不必限定水的用量。
在一些實施方案中，藥物組合物含有式I的多肽化合物、緩衝劑、滲透壓調節劑、水和任選存在的pH調節劑。
在一些實施方案中，藥物組合物含有：式I的多肽化合物，pH調節劑，所述pH調節劑選自氫氧化鈉水溶液或鹽酸，緩衝劑，所述緩衝劑選自磷酸氫二鈉、氨丁三醇、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸一水合物-檸檬酸三鈉二水合物、及它們的組合，滲透壓調節劑，所述滲透壓調節劑選自甘露醇、氯化鈉、丙二醇、甘油和它們的組合，防腐劑，所述防腐劑選自苯酚、間甲酚、甲酚、苯氧乙醇、三氯三級丁醇、苯甲醇、苯甲酸酯衍生物、以及它們的任意組合，和水。
在一些實施方案中，根據本發明的藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述藥物組合物包含：約0.1-約50 mg/mL的的式I化合物，例如約1-約40mg/mL的化合物P016或P014或P020，總莫耳濃度為約0.5-約50mM的檸檬酸和檸檬酸三鈉，優選約1.0-約10mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比為約1:4-50，優選約1:4-20約0-約50mg/mL，優選約0.1-約50mg/mL，更優選約1-約10mg/mL，再更優選約2-約6mg/mL的防腐劑，約1-約100 mg/mL的滲透壓調節劑，優選約1-約100 mg/mL的甘露醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甘油、氯化鈉或它們的任意組合，任選存在的氫氧化鈉水溶液或鹽酸，水，其中所述水溶液的pH值為約5.0-約9.0，例如約5.8-約9.0，優選約6.0-約8.8，更優選約6.5-約7.4。
在一些實施方案中，藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述藥物組合物含有：約0.1 -約50 mg/mL，例如，約0.1-約40mg/mL的式I的多肽化合物，總莫耳濃度為約0.5-約50mM的檸檬酸和檸檬酸三鈉，優選約1.0-約10mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比為約1:4-50，優選約1:4-20，約0.1-約50mg/mL，優選約1-約10mg/mL，更優選約2-約6mg/mL的防腐劑，約1-約100 mg/mL的甘露醇，任選存在的氫氧化鈉水溶液或鹽酸，和水，其中所述水溶液的pH值為約5.0-約9.0，例如約5.8-約9.0，優選約6.0-8.8，更優選約6.5-約7.4。
在一些實施方案中，藥物組合物含有：式I的多肽化合物，pH調節劑，所述pH調節劑選自氫氧化鈉水溶液或鹽酸，緩衝劑，所述緩衝劑選自磷酸氫二鈉、氨丁三醇、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸一水合物-檸檬酸三鈉二水合物、及它們的組合，滲透壓調節劑，所述滲透壓調節劑選自甘露醇、氯化鈉、丙二醇、甘油和它們的組合，和水。
在一些實施方案中，滲透壓調節劑為甘露醇，並且藥物組合物不含防腐劑。
在一些實施方案中，藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述藥物組合物含有：約0.1 -約50 mg/mL，例如，約0.1-約40mg/mL的式I的多肽化合物，總莫耳濃度為約0.5-約50mM的檸檬酸和檸檬酸三鈉，優選約1.0-10mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比為約1:4-50，優選約1:4-20，約1-約100 mg/mL的甘露醇，任選存在的氫氧化鈉水溶液或鹽酸，和水，其中所述水溶液的pH值為約5.0-約9.0，例如約5.8-約9.0，優選約6.0-8.8，更優選約6.5-約7.4。
在一些實施方案中，所述藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述藥物組合物包含：約0.1-約50 mg/mL的式I化合物，例如約1-約40mg/mL的化合物P016或P014或P020，總莫耳濃度為約0.5-約50mM的檸檬酸和檸檬酸三鈉，優選約1.0-10mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比為約1:4-50，優選約1:4-20，約1-約100 mg/mL的甘露醇，任選存在的氫氧化鈉水溶液或鹽酸，和水，其中所述水溶液的pH值為約5.0-約9.0，例如約5.8-約9.0，優選約6.0-約8.8，更優選約6.5-約7.4。
在一些實施例中，式I的多肽化合物的含量或濃度為約0.1 -約50 mg/mL，例如，約0.1-約40mg/mL，約0.2 mg/mL-約40 mg/mL，約0.3 mg/mL-約40 mg/mL，約0.4 mg/mL-約40 mg/mL，約0.5 mg/mL-約40 mg/mL，約0.6 mg/mL-約40 mg/mL，約0.7mg/mL-約40 mg/mL，約0.8 mg/mL-約40 mg/mL，約0.9 mg/mL-約40 mg/mL，約1-約40mg/mL，約1.2-約40mg/mL，約1.5-約40mg/mL，約2.0-約40mg/mL，約2.4-約40mg/mL，約3.0-約40mg/mL，約4.0-約40mg/mL，約4.8-約40mg/mL，約5.0-約40mg/mL，約1-約30mg/mL，約1.2-約30mg/mL，約1.5-約30mg/mL，約2.0-約30mg/mL，約2.4-約30mg/mL，約3.0-約30mg/mL，約4.0-約30mg/mL，約4.8-約30mg/mL，約5.0-約30mg/mL，約0.1 mg/mL-約30 mg/mL，約0.1 mg/mL-約24 mg/mL，約0.1 mg/mL-約20 mg/mL，約0.1-約10mg/mL，約1-約30mg/mL，約1-約24mg/mL，約1-約20mg/mL，約1-約10mg/mL，或者約20-約30mg/mL。
在一些實施方案中，藥物組合物水溶液的pH值為約5.0-約9.0，例如約5.8-約9.0，優選約6.0-約9.0，例如約6.0-約8.8，約6.1-約9.0，約6.1-約8.8，約6.2-約9.0，約6.2-約8.8，約6.3-約9.0，約6.4-約9.0，約6.5-約9.0，約6.5-約8.9，約6.5-約8.8，約6.5-約8.7，約6.5-約8.6，約6.5-約8.5，約6.5-約8.4，約6.5-約8.3，約6.5-約8.2，約6.5-約8.1，約6.5-約8.0，約6.5-約7.9，約6.5-約7.8，約6.5-約7.7，約6.5-約7.6，約6.5-約7.5，約6.5-約7.4，約6.6-約7.4，約6.7-約7.4，約6.8-約7.4，更優選約6.5-約8.5，約6.5-約8.0，約6.3-約7.5，約6.5-約7.5，約6.8-約7.5，約6.8-約7.4，約7.1-約7.5，約7.1-約7.7，以及約7.2-約7.5。在一些實施方案中，藥物組合物水溶液的pH值為約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、或約7.5，例如約7.5或約7.4。
本發明的藥物組合物在高溫、室溫和/或低溫條件下貯藏一定時間後，以下各項指標均穩定：澄清度、顏色、pH值、API純度、聚合物含量、以及生物學活性。在高溫、室溫和/或低溫條件下貯藏一定時間後，在檢測本發明組合物的顏色和/或澄清度時，或者在通過pH計、滲透壓莫耳濃度測定儀、微粒測定儀、HPLC-UV、尺寸排阻色譜法(SEC)檢測時，未見本發明的藥物組合物有性狀、pH值、莫耳滲透壓濃度、不溶性微粒、藥物活性成分、聚合物雜質、物理聚集物、沉澱和/或變性等的顯著改變。
而且，本發明的多肽藥物組合物具有40℃最長1個月或25℃ 3-6個月的可接受的各項指標的穩定性，所述指標包括外觀、濃度、澄清度、pH值、滲透壓、藥物活性物質(API)純度、聚合物雜質含量、不溶性微粒等。本發明的這些指標均符合GLP-1/GIP雙激動劑藥物的現行質量標準要求，即便在高溫下儲藏也表現出良好的穩定性。
穩定的藥物製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、至少6個月、至少1年、至少2年、最多達3年。穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在25℃保存1個月、3個月、6個月或在40℃保存1個月的時段後表現出期望的質量概況。穩定性典型的可接受標準如下：通過SEC-HPLC測得聚合物含量不超過約3%，HPLC-UV測定製劑含量或有關物質(總雜)總量不超過約10%變化。目視檢測藥物製劑是無色至淡黃色的澄清或幾乎澄清液體，可見異物和不溶性微粒符合藥典對注射劑給藥安全性的要求，生物活性在60-140%的可接受範圍以內。
在一些實施方案中 所述藥物組合物於約2-約8℃穩定儲存至少3個月、至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或至少36個月。在一些實施方案中，所述藥物組合物於約25℃穩定儲存至少3個月、至少6個月、至少12個月、至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，所述藥物組合物於約40℃穩定儲存至少7天、至少14天、至少28天、至少1個月、至少3個月、至少6個月、至少12個月、至少18個月或至少24個月。
[多肽化合物]
根據本發明，藥物組合物中的藥物活性成分是下式I的化合物、或其藥學上可接受的鹽、或其生理學上可接受的鹽、或其前體化合物：Y-Aib-E-G-T-αMePhe-T-S-D-Y-Aib-I-Aib-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K24-W-L-L-K28-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K   式I(SEQ ID NO:12)；其中，在16位、24位、28位、40位K中任選1個K的位置，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-Z綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，其中每個a獨立的選自1、2、3的整數，每個b獨立的選自1、2、3的整數，每個c獨立的選自16、18、20的整數，其中Z獨立的選自-CH3、羧酸或羧酸生物電子等排體、膦酸鹽/酯或磺酸鹽/酯，優選是-COOH；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺。
在本發明的上下文中，術語「藥物活性成分」(active pharmaceutical ingredient, API))是式I的多肽化合物，其為GLP-1/GIP雙激動劑。
在一些具體實施方案中， API指的是本發明的多肽化合物P007、P008、P014、P019、P013、P015、P016、P017、P018、P020、及它們的組合。
在一些具體實施方式中，API指的是本發明的多肽化合物P016。
在本發明的上下文中，除非另有說明或者明顯矛盾，術語「多肽化合物」和「多肽」、「藥物活性成分」和「GLP-1/GIP雙激動劑」可以互換使用。
在一些實施方案中，在式I的化合物中，在24位K的位置上，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；或在28位K的位置上，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾。
在一些實施方案中，在式I的化合物中，在24位K的位置上，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，其中每個a獨立的選自2、3的整數，每個b獨立的為1，並且每個c獨立的選自16、18、20的整數，其中Z獨立的為-COOH。
在一些實施方案中，在式I的化合物中，在28位K的位置上，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，其中每個a獨立的選自2、3的整數，每個b獨立的選自1、3的整數，每個c獨立的選自16、20的整數，其中Z獨立的為-COOH。
在一些實施方案中，式I的化合物為選自以下中的一種或多種化合物：化合物P007(SEQ ID NO:2)：在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P013(SEQ ID NO:4)：在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)18-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P014(SEQ ID NO:5)：在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P015(SEQ ID NO:6)：在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P016(SEQ ID NO:7)：在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P008(SEQ ID NO:3)：在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P017(SEQ ID NO:8)：在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P018(SEQ ID NO:9)：在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，化合物P019(SEQ ID NO:10)：在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：，和化合物P020(SEQ ID NO:11)：在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺，結構如下：。
在一些實施方案中，式I的化合物為化合物P016：H-Tyr1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-αMePhe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Aib11-Ile12-Aib13-Leu14-Asp15-Lys16-Gln17-Ala18-Gln19-Ala20-Glu21-Phe22-Val23-Lys24(AEEA-AEEA-AEEA-γGlu-CO-(CH2)20-COOH)-Trp25-Leu26-Leu27-Lys28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-Lys40-NH2，即，Y1-Aib2-E3-G4-T5-αMePhe6-T7-S8-D9-Y10-Aib11-I12-Aib13-L14-D15-K16-Q17-A18-Q19-A20-E21-F22-V23-K24(AEEA-AEEA-AEEA-γGlu-CO-(CH2)20-COOH)-W25-L26-L27-K28-G29-G30-P31-S32-S33-G34-A35-P36-P37-P38-S39-K40(SEQ ID NO:12)，分子式C243H382N52O73，結構如下：。
在一些實施方案中，在藥物組合物中，式I的多肽化合物的濃度為約0.1 -約50 mg/mL，例如，約0.1-約40mg/mL，約0.2 mg/mL-約40 mg/mL，約0.3 mg/mL-約40 mg/mL，約0.4 mg/mL-約40 mg/mL，約0.5 mg/mL-約40 mg/mL，約0.6 mg/mL-約40 mg/mL，約0.7mg/mL-約40 mg/mL，約0.8 mg/mL-約40 mg/mL，約0.9 mg/mL-約40 mg/mL，約1-約40mg/mL，約1.2-約40mg/mL，約1.5-約40mg/mL，約2.0-約40mg/mL，約2.4-約40mg/mL，約3.0-約40mg/mL，約4.0-約40mg/mL，約4.8-約40mg/mL，約5.0-約40mg/mL，約1-約30mg/mL，約1.2-約30mg/mL，約1.5-約30mg/mL，約2.0-約30mg/mL，約2.4-約30mg/mL，約3.0-約30mg/mL，約4.0-約30mg/mL，約4.8-約30mg/mL，約5.0-約30mg/mL，約0.1 mg/mL-約30 mg/mL，約0.1 mg/mL-約24 mg/mL，約0.1 mg/mL-約20 mg/mL，約0.1-約10mg/mL，約1-約30mg/mL，約1-約24mg/mL，約1-約20mg/mL，約1-約10mg/mL，或者約20-約30mg/mL。
在一些實施方案中，在藥物組合物中，式I的多肽化合物的濃度為至少約0.1 mg/mL，至少約1mg/mL，至少約10 mg/mL，更優選至少約20 mg/mL，再更優選至少約30 mg/mL，甚至更優選至少約50 mg/mL。
在一些實施方案中，式I的多肽化合物的濃度為約0.1 -約50mg/mL，例如，約0.1mg/mL，約0.2 mg/mL，約0.3 mg/mL，約0.4 mg/mL，約0.5 mg/mL，約0.6 mg/mL，約0.7mg/mL，約0.8 mg/mL，約0.9 mg/mL，約1 mg/mL、約1.2 mg/mL、約2 mg/mL、約2.4mg/mL、約3 mg/mL、約4 mg/mL、約5 mg/mL、約6 mg/mL、約7 mg/mL、約8 mg/mL、約9 mg/mL、約10 mg/mL、約11 mg/mL、約12 mg/mL、約13 mg/mL、約14 mg/mL、約15 mg/mL、約16 mg/mL、約17 mg/mL、約18 mg/mL、約19 mg/mL、約20 mg/mL、約21 mg/mL、約22 mg/mL、約23 mg/mL、約24 mg/mL、約25 mg/mL、約26 mg/mL、約27 mg/mL、約28 mg/mL、約29 mg/mL或約30 mg/mL。
[pH調節劑和緩沖劑]
在一些實施方案中，藥物組合物包含pH調節劑。
在一些實施方案中，藥物組合物不含pH調節劑。
在一些實施方案中，藥物組合物包含緩衝劑。
在一些實施方案中，在藥物組合物的製備過程中，將活性成分和除pH調節劑的之外的賦形劑混合後，檢測混合物的pH值，如果pH的檢測值為目標pH值或者接近目標pH值，則不需要額外添加pH調節劑。如果pH的檢測值與目標pH值有偏差，那麼緩慢添加少量pH調節劑直至pH值達到目標值。即便在採用pH調節劑的情況下，本發明所屬領域具通常知識者理解，不需要專門限定pH調節劑的量，因為pH調節劑的添加量極少，而且可以根據目標pH值進行調節。
在本發明的上下文中，pH調節劑和緩沖劑均用於調節藥物組合物的pH值。為了區別起見，在本發明的上下文中，「緩衝劑」特指具有通過酸-鹼共軛作用而保持pH值相對穩定的物質，「pH調節劑」特指不同於「緩衝劑」並具有pH調節作用的物質。
常用於藥物中的緩衝劑和pH調節劑均可用於本發明，只要不影響本發明藥物組合物的治療效果和穩定性即可。
在一些實施方案中，緩衝劑包括無機酸、有機酸、無機鹼、有機鹼、無機酸與其鹽的組合、有機酸及其鹽的組合、無機鹼及其鹽的組合、有機鹼及其鹽的組合。
在本發明的上下文中，酸、鹼和鹽均可以為它們本身、或者為它們的水合物的形式。
在一些實施方案中，無機酸的鹽由無機酸根離子與鹼金屬離子或銨離子構成，鹼金屬優選鈉或鉀。
在一些實施方案中，有機酸的鹽由有機酸根離子與鹼金屬離子或銨離子構成，鹼金屬優選鈉或鉀。
在一些實施方案中，緩衝劑包括醋酸、琥珀酸、檸檬酸、磷酸、葡萄糖酸、草酸、乳酸、酒石酸、延胡索酸、4-羥乙基哌𠯤乙磺酸(HEPES)、氨丁三醇(Tris)、甘胺酸、組胺酸、甘氨醯甘胺酸、麩胺酸、醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸-檸檬酸鹽、它們的水合物、以及它們的任意組合。
在本發明的上下文中，同一種物質因同時具有不同的功能而可以歸為不同的組分。比如，甘胺酸可以作為緩衝劑、滲透壓調節劑以及穩定劑。
在一些實施方案中，緩衝劑選自以下中的一種或多種：甘氨醯甘胺酸、組胺酸、麩胺酸、氨丁三醇(Tris)、4-羥乙基哌𠯤乙磺酸HEPES、檸檬酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、它們的水合物、以及它們的任意組合。
在一些實施方案中，緩衝劑選自以下中的一種或多種：磷酸氫二鈉、氨丁三醇、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸一水合物-檸檬酸三鈉二水合物、及它們的組合。
在一些實施方案中，緩衝劑在藥物組合物中的莫耳濃度為約0.5-約50 mM，例如約0.5mM-約40.0mM、約0.5mM-約30.0mM、約0.5mM-約20.0mM、約0.5mM-約10.0mM、約1.0mM-約40.0mM、約1.0mM-約35.0mM、約1.0mM-約30.0mM、約1.0mM-約25.0mM、約1.0mM-約20.0mM、約1.0mM-約15.0mM、約1.0mM-約10.0mM、約2.0mM至40.0mM、約2.0mM-約35.0mM、約2.0mM-約30.0mM、約2.0mM-約25.0mM、約2.0mM-約20.0mM、約2.0mM-約15.0mM、約2.0mM-約10.0mM、約5.0mM-約20.0mM、約5.0mM-約15.0mM、約5.0mM-約10.0mM、約6.0-約9.0mM、約6.0-約8.5mM、約6.0-約8.0mM、或約6.0-約7.5mM。
在一些實施方案中，緩衝劑在藥物組合物中的莫耳濃度為約1.0mM、約1.5mM、約2.0mM、約2.5mM、約3.0mM、約3.5mM、約4.0mM、約4.5mM、約5.0mM、約5.5mM、約6.0mM、約6.5mM、約7.0mM、約7.5mM、約8.0mM、約8.5mM、約9.0mM、約9.5mM、約10.0mM、約10.5mM、約11mM、約12.0mM、約15.0mM、約18.0mM、或約20.0mM。
在一些實施方案中，所述的緩衝劑是磷酸鹽，包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸銨、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-檸檬酸中的一種或多種。
在一些實施方案中，所述的磷酸鹽為選自磷酸氫二鈉或其水合物、磷酸二氫鈉或其水合物、磷酸氫二鉀或其水合物、磷酸二氫鉀或其水合物。
在一些實施方案中，所述的磷酸鹽是磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉的組合、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的組合，或者是其他的磷酸或其藥學上可接受鹽或其水合物的組合形成的磷酸鹽緩衝液。
在一些實施方案中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉和/或磷酸氫二鈉水合物。其在藥物組合物中的莫耳濃度為約0.5-約50 mM，例如約0.5mM-約40.0mM、約0.5mM-約30.0mM、約0.5mM-約20.0mM、約0.5mM-約10.0mM、約1.0mM-約40.0mM、約1.0mM-約35.0mM、約1.0mM-約30.0mM、約1.0mM-約25.0mM、約1.0mM-約20.0mM、約1.0mM-約15.0mM、約1.0mM-約10.0mM、約2.0mM至40.0mM、約2.0mM-約35.0mM、約2.0mM-約30.0mM、約2.0mM-約25.0mM、約2.0mM-約20.0mM、約2.0mM-約15.0mM、約2.0mM-約10.0mM、約5.0mM-約20.0mM、約5.0mM-約15.0mM、約5.0mM-約10.0mM、約6.0-約9.0mM、約6.0-約8.5mM、約6.0-約8.0mM、或約6.0-約7.5mM。
在一些實施方案中，磷酸氫二鈉和/或磷酸氫二鈉水合物在藥物組合物中的莫耳濃度為約1.0mM、約1.5mM、約2.0mM、約2.5mM、約3.0mM、約3.5mM、約4.0mM、約4.5mM、約5.0mM、約5.5mM、約6.0mM、約6.5mM、約7.0mM、約7.5mM、約8.0mM、約8.5mM、約9.0mM、約9.5mM、約10.0mM、約10.5mM、約11mM、約12.0mM、約15.0mM、約18.0mM、或約20.0mM。
在一些實施方案中，氨丁三醇在藥物組合物中的莫耳濃度為約0.5-約50 mM，例如約0.5mM-約40.0mM、約0.5mM-約30.0mM、約0.5mM-約20.0mM、約0.5mM-約10.0mM、約1.0mM-約40.0mM、約1.0mM-約35.0mM、約1.0mM-約30.0mM、約1.0mM-約25.0mM、約1.0mM-約20.0mM、約1.0mM-約15.0mM、約1.0mM-約10.0mM、約2.0mM至40.0mM、約2.0mM-約35.0mM、約2.0mM-約30.0mM、約2.0mM-約25.0mM、約2.0mM-約20.0mM、約2.0mM-約15.0mM、約2.0mM-約10.0mM、約5.0mM-約20.0mM、約5.0mM-約15.0mM、約5.0mM-約10.0mM、約6.0-約9.0mM、約6.0-約8.5mM、約6.0-約8.0mM、或約6.0-約7.5mM。
在一些實施方案中，氨丁三醇在藥物組合物中的莫耳濃度為約1.0mM、約1.5mM、約2.0mM、約2.5mM、約3.0mM、約3.5mM、約4.0mM、約4.5mM、約5.0mM、約5.5mM、約6.0mM、約6.5mM、約7.0mM、約7.5mM、約8.0mM、約8.5mM、約9.0mM、約9.5mM、約10.0mM、約10.5mM、約11mM、約12.0mM、約15.0mM、約18.0mM、或約20.0mM。
在一些實施方案中，所述的緩衝劑是檸檬酸鹽，包括檸檬酸三鈉、檸檬酸三鉀、檸檬酸二鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸鎂、它們的水合物、或者它們的任意組合。
在一些實施方案中，所述的緩衝劑是檸檬酸-檸檬酸鹽，包括檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸-檸檬酸鉀、檸檬酸-檸檬酸鈣、檸檬酸-檸檬酸鎂等。
在本發明的上下文中，「枸櫞酸」與「檸檬酸」意思相同，可互換使用。「枸櫞酸鈉」、「檸檬酸鈉」和「檸檬酸三鈉」意思相同，可互換使用。
在一些實施方案中，檸檬酸-檸檬酸鹽緩衝劑是檸檬酸-檸檬酸三鈉或其水合物，以檸檬酸和檸檬酸三鈉的總莫耳量計，其在藥物組合物中的莫耳濃度為約0.5-約50 mM，例如約0.5mM-約40.0mM、約0.5mM-約30.0mM、約0.5mM-約20.0mM、約0.5mM-約10.0mM、約1.0mM-約40.0mM、約1.0mM-約35.0mM、約1.0mM-約30.0mM、約1.0mM-約25.0mM、約1.0mM-約20.0mM、約1.0mM-約15.0mM、約1.0mM-約10.0mM、約2.0mM至40.0mM、約2.0mM-約35.0mM、約2.0mM-約30.0mM、約2.0mM-約25.0mM、約2.0mM-約20.0mM、約2.0mM-約15.0mM、約2.0mM-約10.0mM、約5.0mM-約20.0mM、約5.0mM-約15.0mM、約5.0mM-約10.0mM、約6.0-約9.0mM、約6.0-約8.5mM、約6.0-約8.0mM、或約6.0-約7.5mM。
在一些實施方案中，檸檬酸三鈉在藥物組合物中的莫耳濃度為約1.0mM、約1.5mM、約2.0mM、約2.5mM、約3.0mM、約3.5mM、約4.0mM、約4.5mM、約5.0mM、約5.5mM、約6.0mM、約6.5mM、約7.0mM、約7.5mM、約8.0mM、約8.5mM、約9.0mM、約9.5mM、約10.0mM、約10.5mM、約11mM、約12.0mM、約15.0mM、約18.0mM、或約20.0mM。
在一些實施方案中，以檸檬酸和檸檬酸三鈉的總莫耳量計，檸檬酸-檸檬酸鈉或其水合物在藥物組合物中的總莫耳濃度為約1.0mM、約1.5mM、約2.0mM、約2.5mM、約3.0mM、約3.5mM、約4.0mM、約4.5mM、約5.0mM、約5.5mM、約6.0mM、約6.5mM、約7.0mM、約7.5mM、約8.0mM、約8.5mM、約9.0mM、約9.5mM、約10.0mM、約10.5mM、約11mM、約12.0mM、約15.0mM、約18.0mM、或約20.0mM。
在一些實施方案中，在檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：4-50，例如約1：5-50，優選的莫耳比例為約1：6-50，例如莫耳比例為約1：1-20。在一些實施方案中，檸檬酸和檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：18。在一些實施方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：16。在一些實施方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：14。在一些實施方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：12。在一些實施方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：10。在一些實施方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：9。在一些實施方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：8。在一些實施方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：7。在一些所述方案中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：6.15。
在同一個溶液體系中，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例等同於檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳濃度比例。
在一些所述方案中，檸檬酸和檸檬酸三鈉的總莫耳濃度為約7.5mM，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：6.15。
在一些所述方案中，檸檬酸和檸檬酸三鈉的總莫耳濃度為約7.5mM，檸檬酸和檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：9。
在一些所述方案中，檸檬酸和檸檬酸三鈉的總莫耳濃度為約5mM，檸檬酸和檸檬酸三鈉的莫耳比例為約1：9。
pH調節劑包括檸檬酸、氫氧化鈉、鹽酸(即，HCl水溶液)中的一種或多種；優選為氫氧化鈉和/或鹽酸。
在本發明的上下文中，「HCl水溶液」與「鹽酸」意思相同，可互換使用。
在一些實施方案中，pH調節劑為約0.1-約0.5M的氫氧化鈉水溶液或者HCl水溶液。
在一些實施方案中，pH調節劑為約0.1M、約0.2M、約0.3M、約0.4M、或約0.5M的氫氧化鈉水溶液。
在一些實施方案中，pH調節劑為約0.1M、約0.2M、約0.3M、約0.4M、或式約0.5M的HCl水溶液。
在一些實施方案中，在藥物組合物的製備過程中，因為調節pH值的需要，有可能出現交替採用HCl水溶液和氫氧化鈉水溶液的情形。也就是說，pH調節劑可以是HCl水溶液與NaOH水溶液的組合。在一些實施方案中，pH調節劑可以是約0.1-約0.5M的HCl水溶液與約0.1-約0.5M的NaOH水溶液的組合。
[滲透壓調節劑]
在一些實施方案中，藥物組合物，優選藥物組合物的水溶液含有滲透壓調節劑。
在本發明的上下文中，滲透壓調節劑與等滲調節劑可以互換。常用於藥物中的滲透壓調節劑均可用於本發明，只要不影響本發明藥物組合物的治療效果和穩定性即可。
在一些實施方案中，滲透壓調節劑包括但不限於：鹽(例如氯化鈉、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和酒石酸鹽)、糖或糖醇(乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇)、胺基酸(例如L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸)、多元醇(例如甘油、1,2-丙二醇(又稱丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG 400)、或者它們的任意組合。磷酸鹽，包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸銨、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀中的一種或多種。
在一些實施方案中，所述滲透壓調節劑選自丙二醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、氯化鈉、磷酸鹽、檸檬酸三鈉、硼酸和酒石酸鈉中一種或多種。
在一些實施方案中，滲透壓調節劑包括甘露醇、氯化鈉、丙二醇和甘油中的一種或多種。
在一些實施方案中，藥物組合物的滲透壓為約200-約500 mOsm/kg，優選約250-約350 mOsm/kg，更優選為約260-約320 mOsm/kg。所述滲透壓可以是採用滲透壓莫耳濃度測定儀所測定的。
在一些實施方案中，滲透壓調節劑為氯化鈉。
在一些實施方案中，氯化鈉濃度為約1-20mg/mL，優選濃度約5-20mg/mL，更優選濃度約為6-15mg/mL，更優選為約6-10mg/mL。
在一些實施方案中，藥物組合物中氯化鈉濃度為約1mg/mL至約20mg/mL，例如約1mg/mL至約19mg/mL，約1mg/mL至約18mg/mL、約1mg/mL至約17mg/mL、約1mg/mL至約16mg/mL、約1mg/mL至約15mg/mL、約2mg/mL至約18mg/mL、約2mg/mL至約17mg/mL、約2mg/mL至約16mg/mL、約2mg/mL至約15mg/mL、約3mg/mL至約18mg/mL、約3mg/mL至約17mg/mL、約3mg/mL至約16mg/mL、約3mg/mL至約15mg/mL、約4mg/mL至約14mg/mL、約5mg/mL至約13mg/mL、約6mg/mL至約12mg/mL、約7mg/mL至約11mg/mL、約7mg/mL至約10.5mg/mL、約7mg/mL至約10mg/mL、約7mg/mL至約9mg/mL、約7mg/mL至約9.5mg/mL、約7mg/mL至約9mg/mL、約7mg/mL至約8.5mg/mL、約7.5mg/mL至約11mg/mL、約7.5mg/mL至約10.5mg/mL、約7.5mg/mL至約10mg/mL、約7.5mg/mL至約9.5mg/mL、約7.5mg/mL至約9.0mg/mL、約7.5mg/mL至約8.5mg/mL、約8mg/mL至約11mg/mL、約8mg/mL至約10.5mg/mL、約8mg/mL至約10mg/mL、8約mg/mL至約9.5mg/mL、約8mg/mL至約9mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中氯化鈉的濃度為約2mg/mL至約18mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中氯化鈉的濃度為約3mg/mL至約15mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中氯化鈉的濃度為約7mg/mL至約10mg/mL 例如約7.5mg/mL、約7.6mg/mL、約7.7mg/mL、約7.8mg/mL、約7.9mg/mL、約8mg/mL、約8.1mg/mL、約8.2mg/mL、約8.3mg/mL、約8.4mg/mL、約8.5mg/mL、約8.6mg/mL、約8.7mg/mL、約8.8mg/mL、約8.9mg/mL、約9.0mg/mL、約9.1mg/mL、約9.28mg/mL、約9.3mg/mL、約9.4mg/mL、約9.5mg/mL、約9.6mg/mL、約9.7mg/mL、約9.8mg/mL、約9.9mg/mL或約10mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中氯化鈉的濃度為約7.5mg/mL至約9.5mg/mL。
在一些實施方案中，滲透壓調節劑為丙二醇。
在一些實施方案中，丙二醇濃度為約5-50mg/mL，優選約10-50mg/mL，更優選濃度約15-40mg/mL，更優選濃度約20-40mg/mL，更優選濃度為約20-30mg/mL。
在一些實施方案中，藥物組合物中丙二醇的濃度為約10mg/mL至約20mg/mL 例如，約10mg/mL至約19mg/mL、約10mg/mL至約18mg/mL、約10mg/mL至約17mg/mL、約10mg/mL至約16mg/mL、約10mg/mL至約15mg/mL、約11mg/mL至約20mg/mL、約11mg/mL至約19mg/mL、約11mg/mL至約18mg/mL、約11mg/mL至約17mg/mL、約11mg/mL至約16mg/mL、約11mg/mL至約15mg/mL、約12mg/mL至約20mg/mL、約12mg/mL至約19mg/mL、約12mg/mL至約18mg/mL、約12mg/mL至約17mg/mL、約12mg/mL至約16mg/mL、約12mg/mL至約15mg/mL、約13mg/mL至約20mg/mL、約13mg/mL至約19mg/mL、約13mg/mL至約18mg/mL、約13mg/mL至約17mg/mL、約13mg/mL至約16mg/mL、或約13mg/mL至約15mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中丙二醇的濃度為約12mg/mL至約16mg/mL，例如約14mg/mL。
在一些實施方案中，滲透壓調節劑為甘露醇。
在一些實施方案中，藥物組合物中甘露醇的濃度為約10mg/mL至約60mg/mL 例如約15mg/mL至約48mg/mL、約20mg/mL至約48mg/mL、約20mg/mL至約48mg/mL、約25mg/mL至約48mg/mL、約30mg/mL至約48mg/mL、約15mg/mL至約40mg/mL、約15mg/mL至約35mg/mL、 約20mg/mL至約40mg/mL、約20mg/mL至約35mg/mL、約25mg/mL至約40mg/mL、 約25mg/mL至約35 mg/mL、約30mg/mL至約40mg/mL、約35mg/mL至約40mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中甘露醇的濃度為約25mg/mL、約25.5mg/mL、約26mg/mL、26.5mg/mL、約27mg/mL、約27.5mg/mL、約28mg/mL、約28.5mg/mL、約29mg/mL、約29.5mg/mL、約30mg/mL、30.5mg/mL、約31mg/mL、約31.5mg/mL、約32mg/mL、約32.5mg/mL、約33mg/mL、33.5mg/mL、約34mg/mL、34.5mg/mL、約35mg/mL、35.5mg/mL、約36mg/mL、36.5mg/mL、約37mg/mL、37.5mg/mL、約38mg/mL、38.5mg/mL、約39mg/mL、39.5mg/mL、約40mg/mL、約41mg/mL、約41.5mg/mL、約42mg/mL、約42.5mg/mL、約43mg/mL、約43.5mg/mL、約44mg/mL、約44.5mg/mL、約45mg/mL、約45.5mg/mL、約46mg/mL、約46.5mg/mL、約47mg/mL、約47.5mg/mL、約48mg/mL、約48.5mg/mL、約49mg/mL、約49.5mg/mL、或約50mg/mL。
[防腐劑]
本發明的藥物組合物可任選包含防腐劑。
在一些實施方案中，藥物組合物含有防腐劑。
在一些實施方案中，藥物組合物不含防腐劑。
在本發明的上下文中，防腐劑與抑菌劑可以互換。常用於藥物中的防腐劑均可用於本發明，只要不影響本發明藥物組合物的治療效果和穩定性即可。
在一些實施方案中，防腐劑包括苯酚、間甲酚、甲酚、苯氧乙醇、三氯三級丁醇、苯甲醇、苯甲酸酯衍生物、以及它們的任意組合。
在一些實施方案中，防腐劑包括苯酚、間甲酚、甲酚、三氯三級丁醇、苯甲醇、以及它們的任意組合。在一些實施方案中，藥物組合物中間甲酚的濃度為約0.10 mg/mL至約10.00 mg/mL，例如約0.5mg/mL至約9.00 mg/mL、約1.0 mg/mL至約8.00 mg/mL、約1.5mg/mL至約7.00 mg/mL、約2.0 mg/mL至約6.00 mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中間苯酚的濃度為約0.50mg/mL、約1.00 mg/mL、約2.00 mg/mL、約2.10 mg/mL、約2.20 mg/mL、約2.30 mg/mL、約2.40 mg/mL、約2.50 mg/mL、約2.60 mg/mL、約2.70 mg/mL、約2.80 mg/mL、約2.90 mg/mL、約3.00 mg/mL、約3.50mg/mL、約4.00 mg/mL、約4.50 mg/mL、約5.00 mg/mL、約5.50 mg/mL、約6.0mg/mL、約6.5mg/mL、約7.0mg/mL、約7.5mg/mL、約8.0mg/mL、約8.5mg/mL、約9.0mg/mL、約9.5mg/mL、或約10.0mg/mL。
在一些實施方案中，藥物組合物中苯酚的濃度為約0.10 mg/mL至約10.00 mg/mL，例如約1.0mg/mL至約9.00 mg/mL、約2.0 mg/mL至約8.00 mg/mL、約3.0mg/mL至約7.00 mg/mL、約4.0 mg/mL至約6.00 mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中苯酚的濃度為約0.50mg/mL、約0.60mg/mL、約1.00 mg/mL、約2.00 mg/mL、約3.00 mg/mL、約4.00 mg/mL、約4.10 mg/mL、約4.20 mg/mL、約4.30 mg/mL、約4.40 mg/mL、約4.50 mg/mL、約4.60 mg/mL、約5.0mg/mL、約5.5mg/mL、約6.0mg/mL、約6.5mg/mL、約7.0mg/mL、約7.5mg/mL、約8.0mg/mL、約8.5mg/mL、約9.0mg/mL、約9.5mg/mL、或約10.0mg/mL。
在一些實施方案中，藥物組合物中苯甲醇的濃度為約0.10 mg/mL至約10.00 mg/mL，例如約0.5mg/mL至約9.00 mg/mL、約1.0 mg/mL至約8.00 mg/mL、約1.5mg/mL至約7.00 mg/mL、約2.0 mg/mL至約6.00 mg/mL。在一些實施方案中，藥物組合物中苯甲醇的濃度為約0.50mg/mL、約1.00 mg/mL、約2.00 mg/mL、約2.10 mg/mL、約2.20 mg/mL、約2.30 mg/mL、約2.40 mg/mL、約2.50 mg/mL、約2.60 mg/mL、約2.70 mg/mL、約2.80 mg/mL、約2.90 mg/mL、約3.00 mg/mL、約3.50mg/mL、約4.00 mg/mL、約4.50 mg/mL、約5.00 mg/mL、約5.50 mg/mL、約6.0mg/mL、約6.5mg/mL、約7.0mg/mL、約7.5mg/mL、約8.0mg/mL、約8.5mg/mL、約9.0mg/mL、約9.5mg/mL、或約10.0mg/mL。
[抗氧化劑]
本發明的藥物組合物可任選包含抗氧劑，在一些實施方案中，藥物組合物含有抗氧化劑。在一些實施方案中，藥物組合物不含抗氧化劑。
常用於藥物中的抗氧化劑均可用於本發明，只要不影響本發明藥物組合物的治療效果和穩定性即可。
在一些實施方案中，抗氧化劑選自維生素E、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、三級丁基對羥基茴香醚、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉或它們的組合。
在一些實施方案中，藥物組合物中不含有維生素E、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、三級丁基對羥基茴香醚、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉。
[穩定劑]
本發明的藥物組合物可任選包含穩定劑，在一些實施方案中，藥物組合物含有穩定劑，用以抑制多肽化學降解或聚合、物理聚集或析出。在一些實施方案中，藥物組合物不含有穩定劑。
常用於藥物中的穩定劑或表面活性劑均可用於本發明，只要不影響本發明藥物組合物的治療效果和穩定性即可。
本發明製劑可以包括穩定劑，可選自本領域常規表面活性劑、胺基酸、多糖、金屬螯合劑，例如非離子型表面活性劑和/或離子型表面活性劑，具體實例可以是脂質輔料(例如油醯聚氧乙烯甘油酯Labrafil、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯Labrasol、丙二醇二辛酸癸酸酯Labrafac、Gelucire)、聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80)，泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)，Triton，十二烷基硫酸鈉(SDS)，月桂基硫酸鈉，辛基糖苷鈉，月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-或硬脂醯基-磺基甜菜鹼，月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-或硬脂醯基-肌胺酸，亞油基-、肉豆蔻基或鯨蠟基-甜菜鹼，月桂醯氨基丙基-、椰油醯氨基丙基-、亞油醯氨基丙基-、肉豆蔻醯氨基丙基-、棕櫚醯氨基丙基-、或異硬脂醯氨基丙基-甜菜鹼(例如月桂醯氨基丙基)，肉豆蔻醯氨基丙基-、棕櫚醯氨基丙基-、或異硬脂醯氨基丙基-二甲胺，甲基椰油基牛磺酸鈉或甲基油基牛磺酸二鈉，和聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇和丙二醇共聚物(例如Pluronics PF68等)。其中，優選為聚山梨酯，更優選聚山梨酯80。基於藥物組合物的總體積，表面活性劑的含量可以為約0.01mg/mL-約50mg/mL，優選約0.5mg/mL-50mg/mL。
在一些實施方案中，穩定劑選自吐溫(例如吐溫-40)、泊洛沙姆、胺基酸(例如甘胺酸、組胺酸)、或它們的任意組合。
在一些實施方案中，藥物組合物不包含甘胺酸和吐溫。
在一些實施方案中，藥物組合物不包含泊洛沙姆和組胺酸。
[藥物組合物的治療疾病的用途、製藥用途、以及治療疾病的方法]
在一些實施方案中，本發明提供藥物組合物在製備用於預防或治療疾病的藥物中的用途。
在一些實施方案中，本發明的藥物組合物用於預防或治療疾病。
在一些實施方案中，本發明提供預防或治療疾病的方法，其包括向有需要的人或動物施用有效量的根據本發明的藥物組合物。
在一些實施方案中，所述疾病包括糖尿病、肥胖症、與糖尿病相關的疾病、和/或與肥胖症相關的疾病。
在一些實施方案中，所述藥物組合物的單位劑量為約0.1mg至約0.5mg或約0.5mg至約50mg，例如約1-約40mg、約10-35mg、約20-30mg、約0.5mg、約1mg、約1.5mg、約2mg、約2.5mg、約3mg、約3.5mg、約4mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg或約45mg。在本發明的上下文中，「單位劑量」與「單位給藥劑量」是同義詞，可互換使用，指的是一個單劑量給藥包裝中藥物組合物的量，或者指一個多劑量給藥包裝中可獨立給藥製劑單元中藥物組合物的量。
在一些實施方案中，所述疾病包括以下中的一種或多種：非胰島素依賴性糖尿病/II型糖尿病、胰島素依賴性糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝、肝脂肪變性、糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病變、糖尿病性腎病、胰島素抵抗、與胰島素抵抗相關的血脂異常、和/或與糖尿病相關的血脂異常。
在一些實施方案中，所述疾病包括以下中的一種或多種：症狀性肥胖症、基於單純性肥胖的肥胖症、與肥胖症有關的疾病狀態或疾病、進食障礙、糖尿病(例如，I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠期的糖尿病、肥胖性糖尿病)、高脂質血症(例如，高甘油三酯血症、高膽固醇血症、高LDL-膽固醇血、低HDL-膽固醇血、飯後高血脂症)、高血壓症、心力衰竭、糖尿病的併發症，例如，神經病、腎病、視網膜病、糖尿病性心肌病、白內障、巨血管病、骨質減少、高滲性糖尿病性昏迷、傳染病(例如，呼吸道感染、尿路感染、腸胃感染、表皮軟組織感染、下肢感染)、糖尿病性壞疽、口幹症、聽覺減退、腦血管病症、周圍血液循環病症、代謝性綜合症(具有三個或多個選自高甘油三酯血症(TG)、低HDL膽固醇血症(HDL-C)、高血壓症、腹部肥胖症和葡糖耐量削弱的疾病狀態)、肌肉減少，等等。
在一些實施方案中，所述疾病包括以下中的一種或多種：內分泌肥胖症(例如，柯興氏綜合征、甲狀腺機能減退、胰島瘤、肥胖性II型糖尿病、假甲狀旁腺機能減退、性腺機能減退)、中心性肥胖症(例如，丘腦下部性肥胖、額葉綜合症、克-列二氏綜合征)、遺傳性肥胖症(例如，Prader-Willi綜合症、勞-穆-比三氏綜合征)、藥物誘導的肥胖症(例如，甾體、吩噻𠯤、胰島素、磺醯脲(SU)藥物、β-阻斷劑誘導的肥胖症)，等等。
在一些實施方案中，與肥胖症有關的疾病狀態或疾病包括：葡糖耐量病症、糖尿病(尤其是II型糖尿病、肥胖性糖尿病)、脂類代謝異常(與上述高脂質血症同義)、高血壓症、心力衰竭、高尿酸血、脂肪肝(包括非酒精性肝炎)、冠心病(心肌梗塞、心絞痛)、腦梗塞(腦血栓、短暫性大腦缺血性發作)、骨/關節疾病(膝蓋骨關節炎、臀骨關節炎、變形性脊椎炎、腰痛)、睡眠無呼吸綜合症/Pickwick綜合症、月經紊亂(月經週期異常、閉經、異常的月經症狀)、代謝性綜合症，等等。
本發明所述的「有效量」或「治療有效量」是本發明藥物組合物的量或劑量，其以單個或多個劑量施用給動物或人時，在診斷或治療的動物中提供期望的效果。
本發明所述的「治療」包括減弱、抑制、逆轉、減緩、延緩或停止現有病況、疾病、病症或症狀的進程或嚴重程度。本發明所述的「預防」包括減少獲得特定疾病、疾病狀況或病症的風險。
除非另有說明或明顯矛盾，本發明藥物組合物可以施用於人和動物(包括寵物)。動物包括猴、鼠、犬、貓、兔、豬、羊駝、馬、羊和牛等。
[容器和試劑盒]
在一些實施方案中，本發明提供一種製品或試劑盒，其包含容器，以及裝有本發明藥物組合物的容器。
在一些實施方案中，容器為彈性密封組件密封的硼矽玻璃材質的模制瓶或管制瓶，例如西林瓶、卡式瓶、預灌封玻璃針、預充針。「預填充式注射器」指在分配給將對患者施用藥物的最終用戶前填充有藥物組合物(即含有本發明所述GLP-1/GIP雙激動劑的製劑)的注射器。預填充式注射器或者預裝針通常包括: 藥物容納容器，其形成注射器主體的一部分(即注射器筒)。如本發明所用術語「預填充式玻璃注射器」指預填充的注射器，其中至少注射器筒是由玻璃製成的。
在本發明的上下文中，「預充式」、「預填充式」和「預灌封」意思相同，可以互換使用。
在一些實施方案中，容器為注射筆或裝置，便於準確安全便捷給藥的裝置。
[包含多肽化合物P016的藥物組合物的具體實施方案]
實施方案1. 一種藥物組合物，所述藥物組合物的pH為約5.8-約9.0，並且所述藥物組合物包含約0.1-約50mg/mL的以下多肽化合物：
化合物P016 (SEQ ID NO:7)：H-Tyr1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-αMePhe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Aib11-Ile12-Aib13-Leu14-Asp15-Lys16-Gln17-Ala18-Gln19-Ala20-Glu21-Phe22-Val23-Lys24(AEEA-AEEA-AEEA-γGlu-CO-(CH2)20-COOH)-Trp25-Leu26-Leu27-Lys28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-Lys40-NH2 。
實施方案2. 如實施方案1所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述多肽化合物在所述水溶液中的濃度為至少10mg/mL。
實施方案3. 如實施方案1或2所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物還含有滲透壓調節劑、緩衝劑和水、以及任選存在的pH調節劑。
實施方案4. 如請求項3所述的藥物組合物，其中所述緩衝劑選自磷酸氫二鈉、氨丁三醇、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸一水合物-檸檬酸三鈉二水合物、及它們的組合。
實施方案5. 如實施方案3或4所述的藥物組合物，其中基於所述水溶液的總體積，所述緩衝劑的莫耳濃度為約0.5-約50mM。
實施方案6. 如實施方案3-5中任一項所述的藥物組合物，其中所述的滲透壓調節劑選自甘露醇、氯化鈉、丙二醇、及它們的組合。
實施方案7. 如實施方案3-6中任一項所述的藥物組合物，其中基於所述水溶液的總體積，所述滲透壓調節劑的含量為約1-約100mg/mL。
實施方案8. 如實施方案3-7中任一項所述的藥物組合物，其中所述pH調節劑為氫氧化鈉水溶液或鹽酸。
實施方案9. 如實施方案1-8中任一項所述藥物組合物，其中所述藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述藥物組合物包含：約0.1-約50 mg/mL，例如約1-約40mg/mL的化合物P016，總莫耳濃度為0.5-約50mM的檸檬酸和檸檬酸三鈉，優選約1.0-約10mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比為約1:4-50，優選約1:4-20，約1-約100 mg/mL的甘露醇，任選存在的氫氧化鈉水溶液或鹽酸，和水，其中所述水溶液的pH值為約5.8-約9.0，優選約6.0-約8.8，更優選約6.5-約7.4。
實施方案10. 一種藥劑盒/試劑盒，其包含容器，以及容納在所述容器中的根據實施方案1-9中任一項所述的藥物組合物。
實施方案11. 根據實施方案1-10中任一項所述的藥物組合物的用途，其用於製備治療疾病的藥物，所述疾病例如是糖尿病或者肥胖症。
實施方案12. 根據實施方案1-10中任一項所述的藥物組合物，其用於治療疾病，所述疾病例如是糖尿病或者肥胖症。
實施方案13. 提供預防或治療疾病的方法，其包括向有需要的人或動物施用有效量的根據實施方案1-10中任一項所述的藥物組合物，所述疾病例如是糖尿病或者肥胖症。
以下實施例旨在對本發明進行具體說明，不對本發明的範圍構成限制。
實施例
[多肽化合物的製備]
[化合物製備實施例1--多肽化合物P015的製備]Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P015，SEQ ID NO:6)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24胺基酸殘基的結構已經展開。
其製備方法採用Fmoc固相多肽合成策略，方法包括：
(1)肽樹脂中間體1的合成
取Fmoc-Rink Linker-Nle-MBHA 樹脂(S=0.49 mmol/g)，適量DCM溶脹，並用DCM洗滌2-3次，20% PIP/ DMF溶液去保護30 min，過濾洗滌，得到去Fmoc的NH2-Rink linker–Nle-MBHA樹脂，抽幹溶劑備用。
分別取4當量Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOBt，適量DMF/DCM溶解；另取4當量的DIC，用DCM稀釋一倍，於攪拌下緩慢加至DMF/DMC溶液中，於-5～0℃下攪拌反應不少於60分鐘，活化後的備用。
將活化的Fmoc-Lys(Boc)-OH溶液加至NH2-Rink linker–Nle-MBHA樹脂，反應溫度控制在10-30℃，偶聯反應240～480 min，過濾洗滌，得Fmoc-Lys(Boc)-Rink linker–Nle-MBHA 樹脂，用20% PIP/ DMF溶液去保護30 min，過濾洗滌，得到去Fmoc的Lys(Boc)-Rink linker–Nle-MBHA 樹脂。
同樣如反應條件，依次從C端第二個胺基酸開始逐個偶聯到N端，遇到偶聯不完全的(顯色反應)，採用HBTU/DIEA 進行第二次縮合，確保每個胺基酸縮合完全。依次偶聯順序為Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH.H2O、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-α-Me-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)－Gly-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
得到：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val-Lys(Mtt)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Rink Linker-Nle-MBHA Resin
在上述縮合完全，用50% HFIP/DCM溶液去除Mtt保護30分鐘，再洗滌過濾，得到肽樹脂中間體1：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val- Lys-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Rink Linker-Nle-MBHA Resin。
(2)修飾鏈修飾步驟
取4當量Fmoc-AEEA-OH和HOBt 用適量DMF/DCM溶解；另取4當量DIC，用DCM稀釋一倍，攪拌下慢慢加入至DMF/DCM溶液中，於-5～0℃環境中攪拌反應不少於60分鐘，活化後的備用。
將活化後的Fmoc-AEEA-OH溶液，加入至事先溶脹洗滌好的肽樹脂中間體1，反應溫度控制在10～30℃，偶聯反應240～480分鐘，過濾洗滌，用20% PIP/ DMF溶液去Fmoc保護30 min，過濾洗滌。按照如上反應條件，依次將活化後的Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和十八烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P015肽樹脂：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val-Lys(tBuO-Ste-γ-Glu(α-OtBu)-γ-Glu(α-OtBu)-γ-Glu(α-OtBu)-AEEA-AEEA)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Rink-Linker-Nle-MBHA Resin。
取P 015肽樹脂，加入12-15 mL/克肽樹脂的裂解劑(TFA：EDT：TIS:H2O，體積比94：2：2：2)，25±5℃攪拌反應4小時，反應混合物使用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合併濾液後減壓濃縮，加入甲基三級丁基醚(MBTE)沉澱，再用MBTE洗滌3-4次，揮幹MTBE，室溫減壓乾燥粗品至恆重，得P015粗品，經後續純化，乾燥獲得P015樣品 (質譜MS：5255.2)。
[化合物製備實施例2—多肽化合物P019的製備]Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P019，SEQ ID NO:10)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28胺基酸殘基的結構已經展開。
其製備方法採用Fmoc固相多肽合成策略，方法包括：
(1)肽樹脂中間體2的合成
取Fmoc-Rink Linker-Nle-MBHA 樹脂(S=0.49 mmol/g)，適量DCM溶脹，並用DCM洗滌2-3次，20% PIP/ DMF溶液去保護30 min，洗滌過濾，得到去Fmoc的NH2-Rink linker–Nle-MBHA樹脂，抽幹溶劑備用。
分別取4當量Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOBt， 適量DMF/DCM溶解；另取4當量DIC，用DCM稀釋一倍，於攪拌下緩慢加至DMF/DMC溶液中，於-5～0℃下攪拌反應不少於60分鐘，活化後的備用。
將活化的Fmoc-Lys(Boc)-OH溶液加至NH2-Rink linker–Nle-MBHA樹脂，反應溫度控制在10-30℃，偶聯反應240～480 min，過濾洗滌，得Fmoc-Lys(Boc)-Rink linker–Nle-MBHA 樹脂，用20% PIP/ DMF溶液去保護30 min，過濾洗滌，得到去Fmoc的Lys(Boc)-Rink linker–Nle-MBHA 樹脂。
同樣如反應條件，依次從C端第二個胺基酸開始逐個偶聯到N端，遇到偶聯不完全的(顯色反應)，採用HBTU/DIEA 進行第二次縮合，確保每個胺基酸縮合完全。依次偶聯順序為Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH.H2O、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-α-Me-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)－Gly-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH。
得到：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Rink Linker-Nle-MBHA Resin
在上述縮合完全，用50% HFIP/DCM溶液去除Mtt保護30分鐘，再洗滌過濾，得到肽樹脂中間體2：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Leu- Lys-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Rink Linker-Nle-MBHA Resin。
(2)修飾鏈修飾步驟
取4當量Fmoc-AEEA-OH和HOBt 用適量DMF/DCM溶解；另取4當量DIC，用DCM稀釋一倍，攪拌下慢慢加入至DMF/DCM溶液中，於-5～0℃環境中攪拌反應不少於60分鐘，活化後的備用。
將活化後的Fmoc-AEEA-OH溶液，加入至事先溶脹洗滌好的肽樹脂中間體2，反應溫度控制在10～30℃，偶聯反應240～480分鐘，過濾洗滌，用20% PIP/ DMF溶液去Fmoc保護30 min，過濾洗滌。按照如上反應條件，依次將活化後的Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和十八烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P019肽樹脂：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val-Lys(tBuO-Ste-γ-Glu(α-OtBu)-AEEA-AEEA-AEEA)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Rink-Linker-Nle-MBHA Resin。
取P019肽樹脂，加入12-15 mL/克肽樹脂的裂解劑(TFA：EDT：TIS：H2O，體積比94：2：2：2)，25±5℃攪拌反應4小時，反應混合物使用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合併濾液後減壓濃縮，加入甲基三級丁基醚(MBTE)沉澱，再用MBTE洗滌3-4次，揮幹MTBE，室溫減壓乾燥粗品至恆重，得化合物P019粗品，經後續純化，乾燥獲得多肽化合物P019樣品 (質譜MS：5142.0)。
[化合物製備實施例3—多肽化合物P007的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P007，SEQ ID NO:2)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例1中所述類似地，採用肽樹脂中間體1，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P007(質譜MS：4997.2)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和十八烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P007肽樹脂，其他步驟類似。
[化合物製備實施例4--多肽化合物P013的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)18-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P013，SEQ ID NO:4)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例1中所述類似地，採用肽樹脂中間體1，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P013(質譜MS：5025.2)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和二十烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P013肽樹脂，其他步驟類似。
[化合物製備實施例5—多肽化合物P014的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P014，SEQ ID NO:5)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例1中所述類似地，採用肽樹脂中間體1，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P014(質譜MS：5052.4)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和二十二烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P014肽樹脂，其他步驟類似。
[化合物製備實施例6—多肽化合物P016的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P016，SEQ ID NO:7)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K24胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例1中所述類似地，採用肽樹脂中間體1，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P016(質譜MS：5198.0)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和二十二烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P016肽樹脂，其他步驟類似。
[化合物製備實施例7—多肽化合物P008的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P008，SEQ ID NO:2)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例2中所述類似地，採用肽樹脂中間體2，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P008(質譜MS：4996.8)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和十八烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P008肽樹脂，其他步驟類似。
[化合物製備實施例8—多肽化合物P017的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P017，SEQ ID NO:8)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例2中所述類似地，採用肽樹脂中間體2，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P017(質譜MS：5052.8)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和二十二烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P017肽樹脂，其他步驟類似。
[化合物製備實施例9—多肽化合物P018的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P018，SEQ ID NO:9)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例2中所述類似地，採用肽樹脂中間體2，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P018(質譜MS：5255.2)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和十八烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P018肽樹脂，其他步驟類似。
[化合物製備實施例10—多肽化合物P020的製備]
Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K；其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(多肽化合物P020，SEQ ID NO:11)。除了殘基Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28之外，上述結構含有標準單字母胺基酸代碼，其中Aib2、αMePhe6、Aib11、Aib13和K28胺基酸殘基的結構已經展開。
與以上化合物製備實施例2中所述類似地，採用肽樹脂中間體2，進行製備步驟，合成本發明的多肽化合物P020(質譜MS：5198.4)。區別在於修飾鏈的修飾過程是依次將Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和二十二烷二酸單三級丁酯在樹脂上進行偶聯、Fmoc脫保護，用DCM洗滌乾燥，得到P020肽樹脂，其他步驟類似。
本發明的一些實施方案中，肽樹脂中間體3，參考實施例1中的肽樹脂中間體1的製備方法得肽樹脂中間體3(第16位Lys接修飾鏈的肽樹脂中間體)：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Rink Linker-Nle-MBHA Resin
肽樹脂中間體4，參考化合物製備實施例1中的肽樹脂中間體1的製備方法得肽樹脂中間體4(第40位Lys接修飾鏈的肽樹脂中間體)：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-αMePhe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Aib-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Phe-Val-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys-Rink Linker-Nle-MBHA Resin
[多肽化合物的藥效學]
[藥效學實施例1] 多肽化合物在db/db小鼠中的藥效學
本研究通過db/db小鼠單次皮下給藥，檢測小鼠血糖、攝食量、體重變化，以闡明本發明化合物降糖作用及藥效持續時間，並與陽性對照Tirzepatide、P001進行比較。在本研究中，使用8-9周齡的雄性db/db小鼠。db/db小鼠安置於溫度(20-26℃)、濕度(40-70%)控制的獨立通氣籠盒IVC設施中，12h:12h光/暗循環控制，可自由獲取食物和水。經尾尖取血，羅氏血糖儀檢測基礎血糖，根據初始血糖和初始體重隨機分組(n=6 /組)，各組具有相似的體重和血糖。
本發明的化合物(10 nmol/kg)或陽性對照Tirzepatide(10 nmol/kg)、P001(10 nmol/kg)用溶媒(含0.1% Tween20的PBS，pH 7.2-7.4)溶解。皮下單次給藥後，記錄設置時間點(0-120 h，化合物的隨機血糖與Vehicle組沒有區別時停止記錄該化合物的隨機血糖)的隨機血糖，以及每日的體重和攝食量。數據結果使用GraphPad Prism8進行統計學分析，採用T-TEST對各組之間的統計學差異進行分析，P＜0.05被認為差異具有顯著性。
降糖持續時間：化合物的隨機血糖與Vehicle組具有顯著性差異(P＜0.05)的最長時間。表1-1 化合物的降糖持續時間
組別 化合物 降糖持續時間 (h)
組1 P001* 32
Tirzepatide 56
P007 56
P008 72
P014 104
P019 56
組2 Tirzepatide 48
P013 72
P015 32
P016 104
P017 72
P018 48
P020 104
*化合物P001(SEQ ID NO:1)具有與式I相同的肽鏈，但是在24K和28K處，均不具有側鏈ε-氨基的化學修飾。
與P001相比，本發明化合物降糖持續時間比P001長24 h及以上(P007、P008、P014、P019)，甚至40小時以上(P008、P014)，72小時以上(P014)。
與Tirzepatide相比，本發明化合物降糖持續時間相當或更長(P007、P008、P013、P014、P016、P017、P018、P019、P020)，甚至長16小時及以上(P008、P013、P014、P016、P017、P020)，長24小時及以上(P013、P014、P016、P017、P020)，長48小時及以上(P014、P016、P020)，長56小時及以上(P016、P020)。
和P001相比較：基於上述方法所述試驗，在試驗週期內，在降糖藥效上，P008(p＜0.01)、P014(p＜0.001)和P019(p＜0.05)的降糖效果顯著優於P001(血糖AUC，P＜0.05)，血糖AUC抑制率分別是P001的2.3、2.6和2.2倍；降糖持續時間分別比P001長40 h、72 h和24 h。P007的降糖效果和P001相當，但是降糖持續時間比P001長24 h。
和Tirzepatide相比較：相比Tirzepatide，P014(p＜0.05)、P016(p＜0.05，)和P020(p＜0.05)的降糖效果更強(血糖AUC，p＜0.05)，血糖AUC抑制率分別是Tirzepatide的1.7、2.2和2.0倍；而且，還顯示出明顯更持久的藥效作用時間(分別比Tirzepatide長48 h、56 h和56 h，表9)。P013和P017降糖作用和Tirzepatide相當，但是藥效持續時間比Tirzepatide長24 h。
本發明醯化GLP-1/GIP激動劑大幅提高了降糖效果。不同形式修飾鏈的本發明化合物，可以實現較P001更強且更持久的降糖效果，且部分本發明化合物展現出較Tirzepatide更強且更持久的降糖效果。
[藥效學實施例2] 多肽化合物P016在DIO小鼠肥胖模型中的減重效果
本研究對本發明的多肽化合物P016進行DIO小鼠多次皮下給藥，檢測小鼠體重、血糖的變化，以闡明本發明化合物的減重作用，並與陽性對照Tirzepatide進行比較。在本研究中，使用26周齡的雄性DIO小鼠。DIO小鼠飼養於合適規格的飼養盒中；SPF級動物房，環境條件控制在室溫20-26℃，相對濕度40%-70%，光照12小時明暗交替；可自由獲取食物和水。試驗選擇隨機血糖(RBG)(D1)和體重(D1)相近的DIO小鼠隨機分組(n=10/組)。本發明的化合物P016(0.3、1、3、30 nmol/kg)或陽性對照Tirzepatide(1、30 nmol/kg)用溶媒(含0.1% Tween20的PBS，pH 7.2-7.4)溶解。皮下注射給藥，每3天給藥1次，連續給藥4周。在第1、4、7、10、13、16、19、22、25和28天進行皮下注射給藥。
首次給藥當天(D1)給藥前稱量動物體重，給藥後每3天固定時間稱量每只動物的體重。給藥後每天1次進行攝食量測定。分組前以及每次給藥後48 h檢測隨機血糖(RBG)。D30禁食5 h後(不禁水)，檢測FBG和糖化血紅蛋白(HbA1c)，並靜脈采血分離血清，用小鼠胰島素ELISA試劑盒檢測血清中胰島素含量，生化儀檢測血清中總膽固醇(TC)、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、游離脂肪酸(FFA)、ALT、天門冬胺酸氨基轉移酶(AST)含量；取肝臟，分離腎周、睾丸周圍脂肪組織，稱其重量，計算臟體比；取肝臟進行HE和油紅O染色，做病理評分。數據結果用單因素方差分析(ANOVA)進行統計分析，如果ANOVA有統計學意義(P≤0.05)且方差齊性，用Tukey test進行組間比較分析，若方差不齊性，則用Dunnet’t T3 test進行組間比較分析。結果用平均數和標準差表示(Mean±SEM)。檢驗水準為0.05，結果分析時同時考慮統計學意義和生物學意義。
在如上方法所述進行的實驗中，本發明的多肽化合物P016顯著降低肥胖小鼠的累積攝食量和體重，且呈劑量依賴性，起效劑量為1 nmol/kg，該劑量下減重藥效顯著優於同劑量的陽性對照品Tirzepatide；30 nmol/kg劑量下，本發明的化合物減重幅度大於Tirzepatide(體重降低百分比，39.97% vs 34.47%)。本發明化合物顯著降低DIO小鼠腹腔總脂肪(腎周脂肪和睾丸周圍脂肪總和)和血清TC，具有顯著的降脂作用。本發明多肽化合物P016在1、3、30 nmol/kg明顯降低D30禁食血糖和胰島素水平，改善胰島素抵抗作用。本發明化合物顯著降低和肝臟重量和血清ALT水平，改善肝功能。表1-2 DIO小鼠累計攝食量、體重、脂肪和肝臟重量
累積攝食量 體重(g) 腹腔總脂肪(g) 肝臟重量(g)
Vehicle 78.83±0.73 48.0±0.5 3.071±0.115 1.758±0.072
P016 0.3 nmol/kg 75.75±2.81 45.4±1.3 2.631±0.069 1.552±0.106
P016 1 nmol/kg 61.40±1.58**** 38.3±1.1**** 1.849±0.181*** 1.191±0.075***
P016 3 nmol/kg 55.47±2.72**** 34.1±0.7**** 0.972±0.076**** 1.069±0.029****
P016 30 nmol/kg 48.38±2.31**** 29±0.7**** 0.461±0.034**** 0.995±0.029****
Tirzepatide 1 nmol/kg 76.51±1.67 44.7±0.87 2.318±0.123** 1.305±0.073**
Tirzepatide 30 nmol/kg 47.95±2.14**** 31.8±0.7**** 0.781±0.093**** 0.951±0.031****
注：**P≤0.01、***P≤0.001、****P≤0.0001與Vehicle組對比，P≤0.01、P≤0.0001與同劑量陽性對照品Tirzepatide組對比。結果表示為10只小鼠的Mean±SEM。表1-3  DIO小鼠的禁食血糖、胰島素和胰島素抵抗指數
禁食血糖 胰島素 胰島素抵抗指數
Vehicle 14.84±0.67 2.911±0.294 41.698±4.071
P016 0.3 nmol/kg 13.78±0.39 3.285±0.481 43.94±6.288
P016 1 nmol/kg 11.23±0.40**** 1.911±0.29 21.532±3.705*
P016 3 nmol/kg 10.36±0.67**** 1.196±0.185* 11.991±1.907***
P016 30 nmol/kg 8.39±0.30**** 0.624±0.130** 5.179±1.178****
Tirzepatide 1 nmol/kg 9.19±0.35**** 2.317±0.511 20.983±4.926
Tirzepatide 30 nmol/kg 7.96±0.33**** 1.418±0.535 11.023±4.147*
注：*P≤0.05、**P≤0.01、***P≤0.001、****P≤0.0001與Vehicle組對比，P≤0.05與同劑量陽性對照品Tirzepatide組對比。結果表示為10只小鼠的Mean±SEM。表1-4 DIO小鼠的血清TC、ALT
血清TC ALT
Vehicle 4.48±0.24 120.90±16.22
P016 0.3 nmol/kg 4.07±0.26 95.60±14.09
P016 1 nmol/kg 3.26±0.20* 43.90±3.86*
P016 3 nmol/kg 2.61±0.13*** 52.80±9.62*
P016 30 nmol/kg 2.50±0.18**** 49.60±5.67*
Tirzepatide 1 nmol/kg 3.54±0.15 56.20±4.66*
Tirzepatide 30 nmol/kg 2.65±0.08*** 41.50±5.31*
注：*P≤0.05、***P≤0.001、****P≤0.0001與Vehicle組對比。結果表示為10只小鼠的Mean±SEM。
綜上所述，在該實驗體系下，本發明的多肽化合物P016皮下注射給藥4周可有效降低DIO小鼠的體重，起效劑量為1 nmol/kg，該劑量下減重藥效顯著優於同劑量的陽性對照品Tirzepatide，並且本發明化合物的最大減重幅度(30 nmol/kg)大於同劑量的Tirzepatide(體重降低百分比，39.97% vs 34.47%)。此外，本發明的化合物表現出降低血糖、改善胰島素抵抗以及改善肝功能的作用。
[組合物指標的測定方法]
以溶液的性狀、澄清度、顏色、滲透壓、pH值、純度和聚合物含量作為組合物的指標，分別測定各組合物樣品在不同儲存條件下的指標的經時穩定性。
[性狀]
取適量待測組合物樣品於光線明亮處，直接觀察。
[可見異物]
取適量待測組合物樣品，照可見異物檢查法(中國藥典2020年版四部通則0904)檢查。
[pH值]
採用pH計或微量pH計測量各組合物樣品的pH值。
[澄清度和顏色]目視法
取適量待測組合物樣品與等體積濁度標準液，分別置於無色透明試管或西林小瓶內，暗室內垂直同置於澄明度檢測儀傘棚燈下，照度為1000lx，從水平方向觀察、比較。樣品水溶液的澄清度不超過0.5號濁度標準液的濁度定義為「澄清」，濁度介於0.5至1號濁度標準液的濁度定義為「幾乎澄清」，其餘濁度對應相應濁度標準液的濁度值。
取適量待測組合物樣品與等體積標準比色液，分別置於納氏比色管或無色透明西林瓶中，將樣品與對照標準比色液同置於白色背景上，平視觀察，比較樣品和對照標準比色液的顏色，觀察樣品顏色。樣品水溶液的顏色相同於水或所用溶劑定義為「無色」；樣品水溶液的顏色不深於相應色調0.5號標準比色液定義為「幾乎無色」，其餘顏色色號對應相應的標準比色液的色調色號值。
[不溶性微粒]
取適量待測組合物樣品，照不溶性微粒檢查法(中國藥典2020年版四部通則0903)檢查。
[純度或有關物質] 高效液相色譜法(HPLC法)
方法一
取待測組合物樣品適量，加水溶解並稀釋製成約1.0 mg/mL樣品水溶液。色譜條件：YMC-Pack ODS-AQ 150×4.6 mm，3.0μm色譜柱；流動相A為25mM磷酸二氫鉀水溶液，用硫酸或磷酸調pH至2.1-2.3，流動相B為乙腈；進行梯度洗脫；檢測波長為220nm；柱溫為40-45℃；流速為1.0mL/min；進樣體積20µL。
純度是指組合物中藥物活性成分(API)的主峰色譜純度(%)。
方法二
色譜條件色譜柱：十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(YMC-Pack ODS-AQ 150×4.6mm 3µm色譜柱)；流動相A：100mM磷酸二氫鉀溶液-乙腈(90:10)；流動相B：100mM磷酸二氫鉀溶液-乙腈(40:60)；流速：1.0mL/min。檢測波長：220nm；柱溫：45℃；進樣體積10μL。
有關物質(總雜)含量是指組合物樣品所含的所有雜質的色譜峰面積百分比(%)。
[聚合物] 分子排阻色譜法(SEC法)
取適量待測組合物樣品，加水溶解並稀釋製成約0.25-約0.3mg/mL P016樣品水溶液。
系統適用性溶液：取本發明多肽化合物P016對照品適量，置於100℃破壞1小時後取出，自然冷卻至室溫，加水溶解並稀釋製成約0.25mg/mL系統適用性溶液。
色譜條件：親水改性矽膠為填充劑，TSKgel G2000SWxl，300mm×7.8mm，5μm色譜柱；以三氟醋酸-乙腈-水(0.1：30：70)為流動相；等度洗脫35分鐘；柱溫為35℃；檢測波長為210nm；流速為0.5mL/min；進樣體積10或20μL。
系統適用性要求系統適用性溶液色譜圖中，聚合物雜峰與本發明多肽化合物P016(API)主峰之間的分離度應不小於1.5。
聚合物含量是指組合物中藥物活性成分(API)所含的聚合物雜質的色譜峰面積百分比(%)。
[莫耳濃度滲透壓]
方法一
儀器及試劑：滲透壓莫耳濃度測定儀、移液槍、200mOsmol/kg標準氯化鈉溶液、300mOsmol/kg標準氯化鈉溶液、400mOsmol/kg標準氯化鈉溶液。
操作方法：
零點校正：使用移液槍將60µL純化水注入乾淨、乾燥的測試管內，確保其中無可見氣泡，進行校準，將測試管推入支撐座至停止位置，使測溫探頭完全進入測試管內純化水中，測試結果應符合0±2 mOsmol/kg H2O。
使用標準液校正：依次分別取200mOsmol/kg、300mOsmol/kg和400mOsmol/kg標準氯化鈉溶液60uL，置於一乾淨、乾燥的測試管中(確保其中無可見氣泡)，將測試管推入支撐座至停止位置，使測溫探頭完全進入測試管內標準品中，對儀器進行校正，測試結果均應符合±2 mOsmol/kg H2O。
樣品測定：取待測組合物樣品60μL，注入測試管中(確保其中無可見氣泡)，將測試管推入支撐座至停止位置，使測溫探頭完全進入測試管內供試品中，測定樣品溶液的莫耳濃度滲透壓。
方法二
儀器及試劑：滲透壓莫耳濃度測定儀、移液槍、200mOsmol/kg標準氯化鈉溶液、400mOsmol/kg標準氯化鈉溶液。
操作方法：
零點校正：使用移液槍將60µL純化水注入乾淨、乾燥的測試管內，確保其中無可見氣泡，進行校準，將測試管推入支撐座至停止位置，使測溫探頭完全進入測試管內純化水中，測試結果應符合0±3 mOsmol/kg H2O。
使用標準液校正：依次分別取200mOsmol/kg和400mOsmol/kg標準氯化鈉溶液60µL，置於一乾淨、乾燥的測試管中(確保其中無可見氣泡)，將測試管推入支撐座至停止位置，使測溫探頭完全進入測試管內標準品中，對儀器進行校正，測試結果均應符合±3 mOsmol/kg H2O。
樣品測定：取待測組合物樣品60μL，注入測試管中(確保其中無可見氣泡)，將測試管推入支撐座至停止位置，使測溫探頭完全進入測試管內供試品中，測定樣品溶液的莫耳濃度滲透壓。
[組合物實施例1] pH範圍篩選—磷酸鹽和氯化鈉體系
按照下表2-1，分別秤取80mg NaCl和14.2mg Na2HPO4，置於燒杯中，加入8mL純化水，攪拌溶解，緩慢加入300mg多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌直至溶解。測試得到的混合物的pH值，然後加入0.5M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至下表2-1所示的目標pH值，加純化水定容至10mL，混勻，用0.22µm PES膜濾過，由此得到具有如下組成的組合物A1、組合物A2和組合物A3：30mg/mL API，8 mg/mL NaCl，10 mM Na2HPO4。
用0.22µm PES膜除菌過濾，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得待測組合物樣品。
靜置，按照前述測定方法檢測所得組合物樣品在不同溫度下歷經不同時間後的澄清度和顏色、以及純度，並分別記錄於下表2-2和下表2-3中。表2-1  不同pH下磷酸鹽和氯化鈉的組合
30mg/mL API，8 mg/mLNaCl，10 mM Na2HPO4
用量 組分 組合物A1 組合物A2 組合物A3
多肽化合物P016(API) 300mg 300mg 300mg
NaCl 80mg 80mg 80mg
Na2HPO4 14.2mg 14.2mg 14.2mg
0.1 M HCl或0.5M NaOH水溶液調節pH至 5.8 (HCl調節) 6.5 (HCl調節) 8.0 (NaOH調節)
加純化水至 10mL 10mL 10mL
表2-2  不同pH值下的經時澄清度和顏色
30mg/mL API， 8 mg/mL NaCl，10 mM Na2HPO4
儲存條件 組合物A1 組合物A2 組合物A3
pH5.8 pH6.5 pH8.0
0天 渾濁 白色沉澱 澄清 無色 澄清 無色
2-8℃ 10天 / 澄清 無色 澄清 無色
40℃ 10天 / 澄清 黃色1 澄清 黃色1
40℃ 20天 / 幾乎澄清 橙黃色1-2 幾乎澄清 橙黃色1-2
60℃ 10天 / 澄清 黃色1-2 澄清 黃色2
60℃ 20天 / 濁度2 橙黃色2-3 澄清 橙黃色3-4
在上表2-2以及本文後面的表格中，顏色後面的數字表示組合物的顏色對應的標準比色液的色調色號值，數值越高，顏色越深；濁度後面的數字表示組合物的濁度對應的濁度標準液的濁度值，數值越高，溶液越渾濁。上表2-2的結果表明，pH5.8的組合物A1為混懸液，P016沉澱析出，表明本發明化合物在pH低至5.8時出現渾濁，無法制得澄清溶液劑；pH6.5的組合物A2和pH8.0的組合物A3呈澄清溶液。組合物A2和A3在低溫(2-8oC)和高溫(40oC、60oC)下放置10天時，仍保持澄清；40℃放置20天，組合物A2和A3呈幾乎澄清，60℃放置20天，組合物A2濁度增至濁度2，而60℃放置20天的組合物A3仍保持澄清。表明本發明多肽化合物溶液澄清度受高溫影響，具有一定pH相關性，pH6.5下較pH8.0更易濁度增加。
組合物A2和組合物A3各自在2-8℃、40oC和60℃儲存10天或20天后，隨著溫度增加，顏色深度加劇，本發明多肽化合物的溶液顏色呈現溫度依賴性。表2-3 不同pH值下的純度
30mg/mL API，8 mg/mL NaCl，10 mM Na2HPO4
儲存條件 組合物A2 純度(%) 組合物A3 純度(%)
pH6.5 pH8.0
2-8℃ 10天 95.51 95.07
40℃ 10天 94.04 92.10
40℃ 20天 91.08 90.22
60℃ 10天 80.84 69.77
60℃ 20天 66.93 55.65
上表2-3的結果表明：組合物A2和組合物A3各自在60℃下的純度下降顯著高於在40℃下的樣品純度下降，表明本發明多肽化合物溶液純度穩定性呈現溫度依賴的趨勢。在60℃放置10天和20天后，較pH6.5的組合物A2，pH8.0的組合物A2的純度下降更為顯著，本發明多肽化合物溶液的純度穩定性在高溫下呈現pH依賴的趨勢。綜上，本發明多肽化合物溶液純度穩定性具有顯著的pH相關、溫度依賴的趨勢。
[組合物實施例2] 緩衝劑種類篩選--檸檬酸鹽和磷酸鹽
按照下表2-4，分別秤取470mg甘露醇、29.4mg 檸檬酸三鈉二水合物或14.2mg Na2HPO4，置於燒杯中，加入8mL純化水，攪拌溶解。向燒杯中緩慢加入300mg多肽化合物P016，邊加邊攪拌至溶解，加入0.1-0.5M HCl水溶液調節pH至下表2-4所示目標pH值，加入純化水定容至10mL，混勻，用0.22µm PES膜濾過，由此得到具有如下組成的組合物B1至組合物B3、和組合物B4至組合物B6：30mg/mL API，47mg/mL甘露醇，10 mM Na2HPO4或10 mM檸檬酸三鈉。
用0.22µm PES膜除菌過濾，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得待測組合物樣品。
靜置，按照前述測定方法檢測所得組合物樣品在不同溫度下歷經不同時間後的澄清度和顏色、以及純度，並分別記錄於下表2-5和下表2-6中。表2-4甘露醇與不同緩衝劑在不同pH值下的組合
30mg/mL API， 47mg/mL 甘露醇 10 mM Na2HPO4 30mg/mL API， 47mg/mL 甘露醇 10 mM檸檬酸三鈉
用量 組分 組合物B1 組合物B2 組合物B3 組合物 B4 組合物B5 組合物B6
多肽化合物P016(API) 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg
甘露醇 470mg 470mg 470mg 470mg 470mg 470mg
檸檬酸三鈉二水合物(C6H5Na3O7•2H2O) / / / 29.4mg 29.4mg 29.4mg
Na2HPO4 14.2mg 14.2mg 14.2mg / / /
0.1-0.5M HCl調節pH至 6.5 7.0 7.5 6.5 7.0 7.5
加純化水至 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL
表2-5不同緩衝劑對澄清度和顏色的影響
30mg/mL API， 47mg/mL 甘露醇 10 mM Na2HPO4 30mg/mL API， 47mg/mL 甘露醇 10 mM檸檬酸三鈉
儲存 條件 組合物 B1 組合物 B2 組合物 B3 組合物 B4 組合物 B5 組合物 B6
pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5
2-8℃ 5天 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
40℃ 5天 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
40℃ 20天 澄清 橙黃色2 澄清 橙黃色2 澄清 橙黃色2 澄清 橙黃色1 N/A 澄清 橙黃色1
60℃ 5天 澄清 黃色0.5-1 澄清 黃色2-3 澄清 黃色1-2 澄清 黃色0.5-1 澄清 黃色0.5-1 澄清 黃色0.5-1
60℃ 20天 澄清 橙黃色7 澄清 橙黃色7 澄清 橙黃色10 澄清 橙黃色2 澄清 橙黃色2 澄清 橙黃色2
上表2-5的結果表明：制得含磷酸氫二鈉+甘露醇的組合物B1、B2、B3和含檸檬酸三鈉+甘露醇的組合物B4、B5、B6，高溫40oC和60oC分別放置5天和20天后，組合物B1至B6均保持澄清。結合高溫下的樣品顏色觀察，相較於以Na2HPO4為代表的磷酸鹽緩衝劑，以檸檬酸三鈉為代表的檸檬酸鹽緩衝劑更能抑制本發明化合物溶液中有色降解雜質的產生。
另外，表2-2中組合物A2和表2-5中組合物B1的結果表明，在pH6.5下，相比於氯化鈉滲透壓調節劑，甘露醇作為滲透壓調節劑，具有改善組合物澄清度穩定性的效果。表2-6 不同緩衝劑對純度(%)的影響
30mg/mL API， 47mg/mL 甘露醇 10 mM Na2HPO4 30mg/mL API， 47mg/mL 甘露醇 10 mM檸檬酸三鈉
儲存條件 組合物 B1 (%) 組合物 B2 (%) 組合物 B3 (%) 組合物 B4 (%) 組合物 B5 (%) 組合物 B6 (%)
pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5
2-8℃ 5天 95.25 95.25 95.13 95.34 95.27 95.23
40℃ 5天 94.91 94.47 94.81 94.70 94.76 94.92
40℃ 20天 91.76 90.67 89.10 93.63 93.78 93.94
60℃ 5天 85.93 81.23 85.23 85.41 84.31 86.67
60℃ 20天 61.18 62.66 47.62 69.91 65.04 59.68
上表2-6的結果表明：在60℃放置5天和20天后，組合物B1至B6的純度下降較明顯。在40℃放置5天和20天后，組合物B1至B6在pH6.5、pH7.0和pH7.5下均呈現出相對優異的純度，在pH6.5-7.5的範圍內，純度穩定性對pH的依賴相對不明顯。這表明本發明多肽化合物P016溶液的純度穩定性呈現高度依賴溫度的趨勢。
上表2-6結果表明：相比於含磷酸鹽緩衝劑的組合物B1至B3，含檸檬酸鹽緩衝劑的組合物B4至B6在高溫下的純度變化趨勢更小，具有更好的穩定性。
綜合表2-5和2-6結果表明，在含有本發明多肽化合物P016和甘露醇的組合物中，含檸檬酸鹽緩衝劑的組合物較含磷酸鹽緩衝劑的組合物在高溫儲存時純度下降和顏色加深程度更小；pH6.5-pH7.5的組合物B1至B6在40℃放置20天，仍具有較好的純度和顏色，含檸檬酸鹽緩衝劑的組合物B4-B6的純度穩定性和顏色穩定性優於等pH值的含磷酸鹽緩衝劑的組合物B1-B3。
[組合物實施例3] 滲透壓調節劑的篩選--丙二醇、甘露醇、氯化鈉
按照下表2-7，分別秤取甘露醇或NaCl或丙二醇，以及檸檬酸三鈉二水合物和或Na2HPO4置於燒杯中，加入28mL純化水，攪拌溶解。向燒杯中緩慢加入1050mg多肽化合物P016，邊加邊攪拌至溶解。測試所得混合物的pH值，然後加入0.5M HCl水溶液或0.5M NaOH水溶液調節至pH 6.5，加純化水定容至35mL，混勻，用0.22µm PES膜除菌濾過，由此得到含有30mg/mL的本發明多肽化合物P016(API)的組合物C1至組合物C7。
將組合物C1-C7分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得待測組合物樣品。
靜置，按照前述測定方法檢測所得組合物樣品在不同溫度下歷經不同時間後的澄清度和顏色、以及純度，並分別記錄於下表2-8和下表2-9中。表2-7 不同滲透壓調節劑與不同緩衝劑的組合
用量 組分 組合物C1 組合物C2 組合物C3 組合物C4 組合物C5 組合物C6 組合物C7
多肽化合物P016(API) 1050mg 1050mg 1050mg 1050mg 1050mg 1050mg 1050mg
丙二醇 / / / / / 875mg 25 mg/mL 875mg 25 mg/mL
甘露醇 1645mg 47 mg/mL 1645mg 47 mg/mL 1645mg 47 mg/mL / / / /
NaCl / / / 280mg 8mg/mL 280mg 8mg/mL / /
檸檬酸三鈉二水合物 102.9mg (10mM) / 102.9mg (10mM) / 102.9mg (10mM) / 102.9mg (10mM)
Na2HPO4 24.85mg (5mM) 49.7mg (10mM) / 49.7mg (10mM) / 49.7mg (10mM) /
0.5M HCl或NaOH調節pH至 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5
加純化水至 35mL 35mL 35mL 35mL 35mL 35mL 35mL
表2-8不同滲透壓調節劑和緩沖劑對澄清度和顏色的影響
儲存條件 組合物C1 組合物C2 組合物C3 組合物C4 組合物C5 組合物C6 組合物C7
甘露醇、檸檬酸三鈉、Na2HPO4 甘露醇、 Na2HPO4 甘露醇、 檸檬酸三鈉 NaCl、 Na2HPO4 NaCl、 檸檬酸三鈉 丙二醇、Na2HPO4 丙二醇、 檸檬酸三鈉
0天 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
40℃ 5天 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 幾乎澄清 無色 濁度1 無色 幾乎澄清 無色 濁度1-2 無色
40℃ 10天 幾乎澄清 無色 幾乎澄清 無色 澄清 無色 濁度1 無色 濁度1-2 無色 幾乎澄清 無色 濁度1-2 無色
60℃ 5天 幾乎澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 濁度1 無色 濁度1-2 無色 幾乎澄清 無色 濁度1-2 無色
60℃ 10天 濁度1 無色 幾乎澄清 無色 幾乎澄清無色 濁度1 無色 濁度2-3 無色 濁度1 無色 濁度1-2 無色
25℃ 30天 濁度2 無色 幾乎澄清 無色 澄清 無色 濁度1-2 無色 幾乎澄清 無色 濁度＞4 無色 幾乎澄清 無色
上表2-8的結果表明，以溶液澄清度和顏色為指標時，對於含有30 mg/mL和pH6.5的本發明多肽化合物的組合物，在單獨採用檸檬酸三鈉或Na2HPO4緩衝劑的組合物C2至C7中，相比於採用氯化鈉或丙二醇，採用甘露醇做滲透壓調節劑的組合物C2和C3在室溫(25oC)和高溫(40oC、60oC)濁度增加更慢，表明甘露醇比氯化鈉或丙二醇更適合作為本發明多肽化合物溶液的滲透壓調節劑。
綜上，在採用檸檬酸三鈉或磷酸氫二鈉作為緩衝劑時，甘露醇作為滲透壓調節劑更適於保持本發明藥物組合物的溶液澄清度。表2-9不同滲透壓調節劑和緩沖劑對純度的影響
儲存 條件 組合物C1 組合物C2 組合物C3 組合物C4 組合物C5 組合物C6 組合物C7
甘露醇、檸檬酸三鈉、Na2HPO4 甘露醇、 Na2HPO4 甘露醇、 檸檬酸三鈉 NaCl、 Na2HPO4 NaCl、 檸檬酸三鈉 丙二醇、Na2HPO4 丙二醇、 檸檬酸三 鈉
2-8℃ 5天 99.50 99.47 99.52 99.44 99.50 98.41 98.41
40℃ 5天 98.86 98.81 98.95 98.76 98.50 97.94 97.87
40℃ 10天 98.28 98.05 98.32 98.18 97.89 97.13 97.16
60℃ 5天 94.34 93.56 95.13 94.80 93.99 94.24 93.49
60℃ 10天 91.38 86.89 92.06 90.23 89.43 87.37 86.95
25℃ 30天 98.85 98.97 99.04 99.08 98.89 N/A 98.00
注：C1-C5組合物的原料藥P016純度為99.48%，C6-C7組合物的原料藥P016的純度為98.46%。C1-C7組合物2-8℃下放置5天的P016純度與組合物所用原料藥純度相當。
上表2-9的結果表明，純度作為穩定性指標時，在25℃儲存30天時，組合物C1至C7之間純度變化趨勢差異小。在含檸檬酸三鈉緩衝劑的組合物C3、C5和C7中，相比氯化鈉或丙二醇作為滲透壓調節劑的組合物C5和C7，採用甘露醇作為滲透壓調節劑的組合物C3在高溫(40oC、60oC)下的純度下降相當或更小，穩定性綜合表現更好。表明甘露醇比氯化鈉或丙二醇更適合作為本發明溶液的滲透壓調節劑。
可以看出，採用以檸檬酸三鈉為代表的檸檬酸鹽緩衝劑和甘露醇的組合，相比採用Na2HPO4緩衝劑和氯化鈉或丙二醇的組合，更適合作為本發明溶液的介質環境，保持純度指標在不同溫度下的穩定性。
結合上表2-8和2-9的結果可以看出，在含有30 mg/mL API和pH6.5的組合物中，採用甘露醇作為滲透壓調節劑，並且採用檸檬酸三鈉作為緩衝劑的組合物在室溫(25℃)和高溫(40oC、60oC)儲存時，溶液澄清度和顏色、純度的穩定性最好。
[組合物實施例4] 穩定劑的篩選—吐溫20
按照下表2-10，分別秤取1645mg甘露醇、102.9 mg 檸檬酸三鈉二水合物和14mg吐溫20置於燒杯中，加入28mL純化水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入1050mg多肽化合物P016，邊加邊攪拌至溶解，然後加入0.1M HCl水溶液或0.5M NaOH水溶液調節pH 至目標pH值，加純化水定容至35mL，混勻，用0.22µm PES膜除菌濾過，由此得到含有30mg/mL的API組合物D1至組合物D5。
將組合物D1至D5分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得待測組合物樣品。
靜置，按照前述測定方法檢測所得組合物樣品在不同溫度下歷經不同時間後的澄清度和顏色、以及純度，並分別記錄於下表2-10和下表2-11中。表2-10含穩定劑吐溫20的組合物
用量 組分 組合物D1 組合物D2 組合物D3 組合物D4 組合物D5
多肽化合物 P016 (API) 1050mg 1050mg 1050mg 1050mg 1050mg
甘露醇 1645mg 47mg/mL 1645mg 47mg/mL 1645mg 47mg/mL 1645mg 47mg/mL 1645mg 47mg/mL
檸檬酸三鈉 二水合物 102.9mg (10 mM) 102.9mg (10 mM) 102.9mg (10 mM) 102.9mg (10 mM) 102.9mg (10 mM)
吐溫20 14mg 0.4mg/mL 14mg 0.4mg/mL 14mg 0.4mg/mL 14mg 0.4mg/mL 14mg 0.4mg/mL
0.1 M HCl或0.5M NaOH調節pH至 6.1 6.3 6.5 6.7 6.9
加純化水至 35mL 35mL 35mL 35mL 35mL
表2-11含穩定劑吐溫20的組合物在不同pH值下的澄清度與顏色
儲存 條件 組合物D1 組合物D2 組合物D3 組合物D4 組合物D5
pH=6.1 pH=6.3 pH=6.5 pH=6.7 pH=6.9
0天 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
40℃ 5天 濁度4 無色 濁度4 無色 濁度4 無色 濁度4 無色 濁度4 無色
40℃ 10天 濁度＞4 無色 濁度＞4 無色 濁度＞4 無色 濁度＞4 無色 濁度＞4 無色
60℃ 5天 濁度1 無色 濁度3 無色 濁度3 無色 濁度1 無色 濁度2-3 無色
60℃ 10天 濁度3 無色 濁度4 無色 濁度4 無色 濁度2 無色 濁度2 無色
上表2-11的結果表明，對於含有本發明多肽化合物、甘露醇和檸檬酸三鈉的組合物，在pH6.1-6.9的範圍內，儘管能夠配製澄清無色的含30 mg/mL API的溶液，然而，表2-11的組合物D3與上表2-8的組合物C3相比，吐溫20的加入，反而加劇了濁度的增加，表明吐溫20加劇本發明多肽化合物在組合物中的聚集。
吐溫20不適合作為本發明多肽化合物的穩定劑。
[組合物實施例5] 檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑濃度、P016(API)濃度和pH值的篩選--檸檬酸：檸檬酸三鈉=1：9(莫耳比)
如下配製檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑：40mM檸檬酸水溶液：秤取8.4056g檸檬酸一水合物(C6H8O7•H2O)，用水稀釋溶解至1000mL，即得40mM檸檬酸水溶液。
40mM檸檬酸三鈉水溶液：秤取11.764g檸檬酸三鈉二水合物(C6H5Na3O7•2H2O)，用水稀釋溶解至1000mL，即得40mM檸檬酸三鈉水溶液。
40mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑：取40mM檸檬酸水溶液10mL與90mL的40mM檸檬酸三鈉水溶液混合，即得40mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑，其中檸檬酸與檸檬酸三鈉的總莫耳濃度為40mM，檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳比=1：9，檸檬酸莫耳濃度為4mM，檸檬酸三鈉莫耳濃度為36mM。
20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑：取40mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑50mL與50mL的純化水混合，即得20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑，其中檸檬酸與檸檬酸三鈉的總莫耳濃度為20mM，檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳比=1：9，檸檬酸莫耳濃度為2mM，檸檬酸三鈉莫耳濃度為18mM。
10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑：取20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑50mL與50mL的純化水混合，即得10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑，其中檸檬酸與檸檬酸三鈉的總莫耳濃度為10mM，檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳比=1：9，檸檬酸莫耳濃度為1mM，檸檬酸三鈉莫耳濃度為9mM。
除非另有說明，在組合物實施例5中，組合物E1至組合物E14中的檸檬酸-檸檬酸三鈉最終濃度，指的是檸檬酸與檸檬酸三鈉的總莫耳濃度，其中檸檬酸的莫耳濃度為所述總莫耳濃度的1/10，檸檬酸三鈉的莫耳濃度為所述總濃度的9/10，檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳比=1：9。
按照下表2-12，分別秤取輔料固體於容量器中，依表加入適量純化水，攪拌或搖勻溶解。向容量器加入任選存在的合適濃度和用量的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑溶液，搖勻，緩慢加入適量多肽化合物P016(API)，搖勻溶解，然後加入0.1-0.5M 的HCl或NaOH水溶液調節至表2-12的目標pH值，加入純化水定容至3mL，混勻，用0.22µm PES膜濾過，由此得到含有本發明多肽化合物P016(API)的組合物E1至組合物E14。
用0.22µm PES膜濾過分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得待測組合物樣品。
靜置，按照前述測定方法檢測所得組合物樣品在不同溫度下歷經不同時間後的澄清度、顏色、純度和聚合物含量，並分別記錄於下表2-13至表2-15中。
在組合物E1至E14中，以甘露醇為滲透壓調節劑，以檸檬酸-檸檬酸三鈉、磷酸氫二鈉、或者氨丁三醇(Tris)作為緩衝劑，採用甘胺酸作為潛在穩定劑。表2-12不同種類和濃度的緩衝劑、不同API濃度在不同pH值下的組合
     用量 組分 組合物E1 組合物E2 組合物E3 組合物E4 組合物E5
組合物中檸檬酸-檸檬酸三鈉最終濃度 20mM 10mM 5mM 5mM 5mM
多肽化合物P016 (API) 90mg 90mg 90mg 90mg 60mg
純化水 第一次用量 1.25mL 1.25mL 2mL 2mL 2mL
甘露醇 141mg 141mg 141mg 141mg 141mg
甘胺酸 / / / 2.25mg /
20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 / 1.5mL 0.75mL 0.75mL 0.75mL
40mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 1.5mL / / / /
0.1M-0.5M HCl或NaOH調pH至 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5
加純化水至 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL
表2-12不同種類和濃度的緩衝劑、不同API濃度在不同pH值下的組合(續1)
  用量 組分 組合物E6 組合物E7 組合物E8 組合物E9 組合物E10
組合物中檸檬酸-檸檬酸三鈉最終濃度 5mM 5mM 7.5mM 10mM 10mM
多肽化合物P016(API) 90mg 60mg 75mg 90mg 60mg
純化水 第一次用量 2mL 2mL 0.5mL 1.25mL 1.25mL
甘露醇 141mg 141mg 141mg 141mg 141mg
10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 / / 2.25mL / /
20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 0.75mL 0.75mL / 1.5mL 1.5mL
0.5M HCl或NaOH調pH至 6.9 6.9 6.9 6.9 6.9
加純化水至 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL
表2-12不同種類和濃度的緩衝劑、不同API濃度在不同pH值下的組合(續2)
     用量 組分 組合物 E11 組合物 E12 組合物 E13 組合物 E14
組合物中檸檬酸-檸檬酸三鈉最終濃度 — — 10mM 5mM
多肽化合物P016(API) 90mg 90mg 90mg 60mg
純化水 第一次用量 2.75mL 2.75mL 1.25mL 2mL
甘露醇 141mg 141mg 141mg 141mg
20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 / / 1.5mL 0.75mL
磷酸氫二鈉 4.26mg / / /
氨丁三醇 / 3.63mg / /
0.5M HCl或NaOH調pH至 7.2 7.2 7.2 7.2
加純化水至 3mL 3mL 3mL 3mL
表2-13 緩衝劑的種類和濃度、API濃度、以及pH對澄清度和顏色的影響
組合物編號 緩衝鹽濃度、 API濃度、 pH值 澄清度/顏色
0天 60℃ 5天 60℃ 10天 40℃ 5天 40℃ 10天
E1 20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E2 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清無色 澄清無色
E3 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E4 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 甘胺酸 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E5 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH6.5 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E6 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.9 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E7 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH6.9 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E8 7.5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 25mg/mL API，pH6.9 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E9 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.9 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E10 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH6.9 澄清 無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色
E11 10mM磷酸氫二鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH7.2 澄清 無色 澄清 黃色1 幾乎 澄清 黃色2 澄清 無色 澄清 無色
E12 10mM氨丁三醇緩衝劑30mg/mL API，pH7.2 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E13 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH7.2 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
E14 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH7.2 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
上表2-13的結果表明，採用檸檬酸-檸檬酸三鈉(莫耳比1:9)作為緩衝劑，採用甘露醇作為滲透壓調節劑的組合物E1-E10和E13-E14，pH為6.5-7.2，含有20-30mg/mL本發明多肽化合物，在高溫(40oC、60℃)存儲5天和10天后，均保持澄清無色。
採用磷酸氫二鈉緩衝劑的組合物E11，在60℃存儲5天和10天后，濁度逐漸增加，顏色加重，再次表明檸檬酸-檸檬酸三鈉比磷酸氫二鈉更適合作為本發明多肽化合物的緩衝劑。
在組合物E3和E4中，採用和不採用甘胺酸作為穩定劑，對於澄清度、顏色的穩定性沒有明顯影響。表2-14 緩衝劑的種類和濃度、API濃度、以及pH值對純度的影響
組合物 編號 緩衝鹽濃度、 API濃度、pH值 API純度(%)
60℃ 10天 40℃ 10天
E1 20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 88.60 98.06
E2 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 88.95 97.97
E3 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 88.87 98.08
E4 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.5 甘胺酸 89.07 97.94
E5 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH6.5 89.52 98.01
E6 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.9 89.44 98.15
E7 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH6.9 89.58 98.08
E8 7.5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 25mg/mL API，pH6.9 89.31 98.11
E9 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH6.9 89.08 98.11
E10 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH6.9 89.33 98.16
E11 10mM磷酸氫二鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH7.2 74.54 97.88
E12 10mM氨丁三醇緩衝劑 30mg/mL API，pH7.2 87.12 97.90
E13 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API，pH7.2 88.96 98.25
E14 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API，pH7.2 89.76 98.17
上表2-14的結果表明，在高溫(40℃、60℃)下放置10天，在pH 7.2及含有30mg/mL 本發明多肽化合物的組合物E11、E12和E13中，按照檸檬酸-檸檬酸三鈉、氨丁三醇、磷酸氫二鈉的順序，緩衝劑對純度穩定性的改善逐漸劣化。檸檬酸-檸檬酸三鈉作為緩衝劑時，組合物E1-E10和E13-E14在高溫(40℃、60℃)下的純度穩定性最優。並且，檸檬酸和檸檬酸三鈉的總莫耳濃度在5-20 mM範圍內，以及本發明多肽化合物20-30 mg/mL，組合物E1-E10和E13-E14在高溫(40℃、60℃)下的純度穩定性相當。在組合物E3和E4中，採用和不採用甘胺酸作為穩定劑，對於組合物在高溫(40℃、60℃)下的純度穩定性沒有明顯影響。表2-15 緩衝劑的種類和濃度、API濃度、以及pH值對聚合物含量的影響
組合物 編號 緩衝鹽濃度、 API濃度、 pH值 聚合物含量(%)
60℃ 10天 40℃ 10天
E1 20mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API pH6.5 0.86 0.12
E2 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API pH6.5 0.84 0.13
E3 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API pH6.5 0.83 0.11
E4 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API pH6.5 甘胺酸 0.99 0.13
E5 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API pH6.5 0.78 0.11
E6 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API pH6.9 0.81 0.11
E7 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API pH6.9 0.76 0.10
E8 7.5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 25mg/mL API pH6.9 0.80 0.12
E9 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API pH6.9 0.78 0.10
E10 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API pH6.9 0.80 0.11
E11 10mM磷酸氫二鈉緩衝劑 30mg/mL API pH7.2 N/A 0.28
E12 10mM氨丁三醇緩衝劑 30mg/mL API pH7.2 1.60 0.22
E13 10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 30mg/mL API pH7.2 0.79 0.10
E14 5mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑 20mg/mL API pH7.2 0.87 0.12
上表2-15的結果表明，在高溫(40℃、60℃)下放置10天，在pH 7.2及含有30mg/mL本發明多肽化合物的組合物E11、E12和E13中，按照檸檬酸-檸檬酸三鈉、氨丁三醇、磷酸氫二鈉的順序，聚合物含量增加。檸檬酸-檸檬酸三鈉作為緩衝劑時，組合物E1-E10和E13-E14在高溫(40℃、60℃)下的聚合物含量穩定性最優，且檸檬酸-檸檬酸三鈉的總莫耳濃度在5-20 mM的範圍內、和本發明多肽化合物在20-30 mg/mL濃度範圍內，於40℃放置10天后，組合物中的聚合物含量增長小且相當，聚合物含量均為0.10-0.13%。
結合表2-13、表2-14和表2-15，在組合物E3和E4中，採用和不採用甘胺酸作為穩定劑，對於組合物的溶液澄清度和顏色、純度、聚合物含量沒有明顯影響，加入甘胺酸甚至導致聚合物含量略微增加，表明甘胺酸不適合作為本發明多肽化合物的穩定劑。
表2-13和表2-14的組合物E2與表2-8和表2-9的組合物C3均為採用47mg/mL甘露醇、10mM緩衝劑和30mg/mL API、pH6.5的組合物，採用10mM檸檬酸-檸檬酸三鈉作為緩衝劑的組合物E2比採用單獨的10mM檸檬酸三鈉作為緩衝劑的組合物C3表現出改善的澄清度穩定性，顏色和純度在高溫(40℃、60℃)下的穩定性相當。
綜上，不同的檸檬酸-檸檬酸三鈉的總莫耳濃度(5-20mM)、不同的API濃度(20-30mg/mL)、以及不同的pH值(6.5-7.2)的組合物E1-E10和E13-E14，於40℃和60℃儲存10天后，澄清度、顏色、API純度和聚合物含量相當，這些指標的穩定性都優異，檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑總體上優於磷酸鹽緩衝劑和氨丁三醇緩衝劑。
[組合物實施例6] 檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑濃度、P016(API)濃度和pH值的篩選--檸檬酸：檸檬酸三鈉=1:6.15(1.05mM：6.45mM，莫耳比)
按照下表2-16，分別秤取適量的甘露醇、檸檬酸一水合物、檸檬酸三鈉二水合物於燒杯中，加入適量(純化水總量約80%)純化水，攪拌至溶解。向燒杯中緩慢加入適量多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌至溶解。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入0.1M HCl水溶液或0.1M NaOH水溶液調節至目標pH值，加入純化水定容，混勻。用0.22µm PES膜除菌濾過，由此得到含有本發明多肽化合物P016(API)的組合物F1至組合物F12。
分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得待測組合物樣品。
靜置，按照前述測定方法檢測所得組合物樣品在不同溫度下或強光照(1800lx，28µw/cm2)歷經不同時間後的澄清度、顏色、pH值(微量pH計)、純度和聚合物含量，由此考察4mg/mL-30mg/mL API在pH6.5-7.4內的組合物的各項指標及其穩定性，並分別記錄於下表2-17至表2-20中。
除非明確說明，在組合物實施例6的組合物F1至組合物F12中，檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液的總莫耳濃度為7.5mM，其中檸檬酸的莫耳濃度1.05mM，檸檬酸三鈉的莫耳濃度為6.45mM，檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳比=1.05:6.45=1:6.15。表2-16  不同濃度的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑、不同API濃度在不同pH值下的組合
用量 組分 組合物F1 組合物F2 組合物F3 組合物F4 組合物F5 組合物F6
多肽化合物P016(API) 1200mg 30mg/mL 600mg 20mg/mL 160mg 4mg/mL 1200mg 30mg/mL 600mg 20mg/mL 160mg 4mg/mL
甘露醇 1840mg 1380mg 1840mg 1840mg 1380mg 1840mg
檸檬酸一水合物 8.83mg 6.62mg 8.83mg 8.83mg 6.62mg 8.83mg
檸檬酸三鈉二水合物 75.88mg 56.91mg 75.88mg 75.88mg 56.91mg 75.88mg
用0.1M NaOH或0.1M HCl調pH至 6.5 6.5 6.5 6.8 6.8 6.8
加純化水至 40mL 30mL 40mL 40mL 30mL 40mL
初始滲透壓莫耳濃度(mOsmol/kg) 304 290 280 294 286 276
表2-16  不同濃度的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑、不同API濃度在不同pH值下的組合(續1)
用量 組分 組合物F7 組合物F8 組合物F9 組合物F10 組合物F11 組合物F12
多肽化合物P016(API) 1200mg 30mg/mL 600mg 20mg/mL 160mg 4mg/mL 1200mg 30mg/mL 600mg 20mg/mL 160mg 4mg/mL
甘露醇 1840mg 1380mg 1840mg 1840mg 1380mg 1840mg
檸檬酸一水合物 8.83mg 6.62mg 8.83mg 8.83mg 6.62mg 8.83mg
檸檬酸三鈉二水合物 75.88mg 56.91mg 75.88mg 75.88mg 56.91mg 75.88mg
用0.1M NaOH或0.1M HCl調pH至 7.1 7.1 7.1 7.4 7.4 7.4
純化水至 40mL 30mL 40mL 40mL 30mL 40mL
初始滲透壓莫耳濃度(mOsmol/kg) 292 285 278 295 287 281
上表2-16結果表明：組合物F1至F12的初始莫耳滲透壓均滿足近生理等滲值的要求，便於非胃腸道或注射給藥。表2-17  檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑的濃度、API濃度、以及pH值對澄清度和顏色的影響
組合物編號 初始 60℃ 10天 40℃ 10天 40℃ 30天 25℃ 30天 2-8℃ 30天 光照 10天
組合物F1 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
組合物F2 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 N/A N/A 澄清 無色
組合物F3 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
組合物F4 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
組合物F5 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 N/A N/A 澄清 無色
組合物F6 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
組合物F7 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
組合物F8 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 N/A N/A 澄清 無色
組合物F9 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
組合物F10 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
組合物F11 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 N/A N/A 澄清 無色
組合物F12 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色 澄清 無色
N/A：因組合物F2與組合物F1和F3配方相同，區別僅在於P016的濃度，因此，未採集N/A所標識的檢測時間點的數據。同樣的解釋適用於N/A所標識的其他檢測時間點。
以上表2-17的結果表明：組合物F1至F12具有良好的溶液澄清度穩定性，於高溫40℃放置10天和30天、高溫60℃放置10天、以及強光照下放置10天，均保持澄清無色。4 mg/mL或30mg/mL P016的組合物F1和F3、F4和F6、F7和F9、F10和F12在低溫(2-8℃)下30天、室溫(25℃)30天，均保持澄清無色。表2-18 檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑的濃度、API濃度、以及pH值對pH穩定性的影響
組合物編號 pH
初始值 60℃ 10天 40℃ 10天 40℃ 30天 25℃ 30天 2-8℃ 30天 光照 10天
組合物F1 6.53 6.52 6.52 6.57 6.57 6.56 6.54
組合物F2 6.54 6.51 6.51 6.57 N/A N/A 6.53
組合物F3 6.53 6.56 6.55 6.55 6.55 6.57 6.53
組合物F4 6.84 6.87 6.82 6.80 6.82 6.83 6.85
組合物F5 6.83 6.86 6.86 6.80 N/A N/A 6.88
組合物F6 6.84 6.84 6.86 6.80 6.81 6.81 6.87
組合物F7 7.13 7.16 7.15 7.08 7.08 7.08 7.11
組合物F8 7.13 7.12 7.13 7.05 N/A N/A 7.12
組合物F9 7.13 7.15 7.15 7.10 7.09 7.06 7.13
組合物F10 7.43 7.43 7.42 7.31 7.30 7.31 7.42
組合物F11 7.41 7.42 7.43 7.29 N/A N/A 7.38
組合物F12 7.43 7.39 7.37 7.30 7.29 7.32 7.34
上表2-18的結果表明：組合物F1至F12於低溫(2-8℃)放置30天、室溫(25℃)放置30天、高溫40℃放置10天和30天、高溫60℃放置10天、以及強光照下放置10天，pH變化不超過0.14。特別地，結合下表2-19，組合物F1至F12在高溫60℃或強光照下放置10天，純度變化約25%，但是組合物F12的pH變化不超過0.09，組合物F5的pH變化不超過0.05，其餘10個組合物的pH變化均不超過0.03，表明即便在60℃或光照下放置10天，7.5mM總莫耳濃度的檸檬酸-檸檬酸三鈉(檸檬酸和檸檬酸三鈉的莫耳濃度各自為1.05mM和6.45mM)緩衝液足以維持組合物在pH6.5-7.4範圍內的pH穩定性。表2-19 檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑的種類和濃度、API濃度、以及pH值對API純度的影響
組合物編號 純度(%)
初始值 60℃ 10天 40℃ 10天 40℃ 30天 25℃ 30天 2-8℃ 30天 2-8℃ 4個月 光照10天
組合物F1 98.40 73.66 96.69 92.77 97.70 98.39 98.45 96.99
組合物F2 98.33 72.56 96.84 92.65 N/A N/A 98.46 97.18
組合物F3 98.34 72.13 96.70 92.75 97.65 98.39 98.45 96.88
組合物F4 98.37 72.57 96.84 93.24 97.80 98.41 98.37 97.09
組合物F5 98.34 72.53 96.63 93.06 N/A N/A 98.45 97.43
組合物F6 98.34 73.15 96.74 93.21 97.80 98.39 98.41 97.27
組合物F7 98.36 72.87 96.79 93.51 97.88 98.42 98.39 97.12
組合物F8 98.41 72.94 96.77 93.67 N/A N/A 98.39 97.21
組合物F9 98.44 72.29 96.76 93.40 97.85 98.40 98.39 97.11
組合物F10 98.36 73.03 96.68 93.45 98.02 98.44 98.41 97.10
組合物F11 98.36 72.65 96.57 93.54 N/A N/A 98.40 97.39
組合物F12 98.37 72.05 96.71 93.48 97.99 98.38 98.44 97.51
上表2-19的結果表明：本發明多肽化合物的組合物F1至F12的純度為約98.4%，於60℃高溫或強光照下放置10天，12種組合物的API純度下降相當，分別下降至72.05-73.66%和96.88-97.51%；於40℃高溫放置10天和30天，12種組合物的API純度下降相當，分別下降至96.57-96.84%和92.65-93.67%；於室溫(25℃)放置1個月，4mg/mL和30mg/mL API濃度的組合物的API純度下降相當，降至97.65-98.02%(降幅小於0.7%)；低溫(2-8℃)放置30天和4個月，未見API純度明顯變化。總的來說，12種組合物的純度穩定性表現相當，且有高度的溫度依賴性，2-8℃低溫下組合物F1至F12的純度穩定性優異。表2-20  檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝劑的濃度、API濃度、以及pH值對聚合物含量的影響
組合物編號 聚合物含量(%)
2-8℃ 10天 60℃ 10天 40℃ 10天 40℃ 30天 25℃ 30天 2-8℃ 30天 光照 10天
組合物F1 0.05 0.71 0.10 0.24 0.06 0.03 0.68
組合物F2 0.05 0.77 0.10 0.23 N/A N/A 0.60
組合物F3 0.05 0.72 0.09 0.24 0.06 0.06 0.74
組合物F4 0.05 0.72 0.08 0.22 0.05 0.04 0.59
組合物F5 0.06 0.74 0.09 0.20 N/A N/A 0.47
組合物F6 0.05 0.66 0.10 0.18 0.05 0.06 0.56
組合物F7 0.05 0.72 0.08 0.18 0.05 0.03 0.62
組合物F8 0.04 0.73 0.08 0.18 N/A N/A 0.57
組合物F9 0.04 0.66 0.09 0.18 0.06 0.04 0.60
組合物F10 0.04 0.72 0.08 0.17 0.06 0.03 0.62
組合物F11 0.05 0.78 0.09 0.18 N/A N/A 0.48
組合物F12 0.06 0.74 0.10 0.19 0.06 0.02 0.44
上表2-20的結果表明，組合物F1至F12的初始聚合物含量均為約為0.05%。經60℃高溫放置10天后，增長至0.66-0.78%；經強光照10天后，增長至0.44-0.74%；40℃高溫放置1個月後，增長至0.17-0.24%；室溫(25℃)和低溫(2-8℃)下放置30天，API濃度4mg/mL至30mg/mL的組合物F1至F12的聚合物含量均保持在0.02-0.06%，幾乎未見變化。總的來說，12種組合物的聚合物含量穩定性表現相當，具有高度的溫度依賴性，組合物F1至F12在室溫(25℃)和低溫(2-8℃)的聚合物含量穩定。
綜上可知，開展12種組合物F1至F12 (7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液，4、20、30mg/mLAPI，pH6.5、6.8、7.1、7.4) 於60℃、40℃、強光照、25℃室溫、2-8℃低溫1-4個月的指標穩定性研究。結果表明，4-30mg/mL API濃度水平、pH6.5-7.4的12種組合物F1至F12中，各項指標(澄清度、顏色、pH值、API純度、聚合物含量)的穩定性表現相當，在低溫、室溫、高溫和光照下均具有優異的澄清度、顏色和pH值穩定性，API純度穩定性和聚合物含量穩定性具有高度的溫度依賴性，API純度和聚合物含量的低溫(2-8℃)穩定性最佳。
結合表2-18至2-20可以看出，在強光照下，組合物F1至F12的澄清度和顏色沒有變化，而API純度和聚合物含量表現出光敏感特徵。因此，對於包含本發明多肽化合物的組合物，採用避光包裝和儲藏措施，來規避光降解風險。
採用46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液作為緩衝劑，包含4-30mg/mL本發明多肽化合物在pH6.5-7.4的範圍內，組合物在低溫、室溫、高溫下均具有優異的各項指標(澄清度、顏色、pH值、API純度、聚合物含量)的穩定性，在低溫(2-8℃)下穩定性最佳。
[組合物實施例7]
[組合物G1、G1-a至G1-q的製備]
按照下表2-21-1或2-21-2，分別秤取46.00g甘露醇、1.90檸檬酸三鈉二水合物、0.22g檸檬酸一水合物，置於容器中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。緩慢加入0.5-1g或1-30.00 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物pH值，然後向容器中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4，加入注射用水定容至1000mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物G1或者組合物G1-a至G1-q：包含0.5-1mg/mL或1-30mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為1.05mM：6.45mM=1:6.15)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
制得藥液可分裝密封於1)中性硼矽玻璃管制注射劑瓶或2)預灌封注射器。
1)用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G1樣品。
2) 用0.22µm PES膜濾過，分裝於預灌封注射器，加塞密封，標示體積0.5mL，即得組合物G1-a至G1-q樣品。類似地，按照下表2-21-3至表2-21-6，以上述相同的方法製備組合物G1-a至G1-q樣品，除了各原料等比例減少。表2-21-1  組合物G1的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 0.5-1g或1-30.00g (0.5-1mg/mL或1-30 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.90 g (6.45 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.22 g (1.05 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
表2-21-2  組合物G1-a至G1-q的組成(預灌封注射器，批量可等比放大縮小)
組合物 規格 多肽化合物P016(API) 甘露醇 檸檬酸一水合物 檸檬酸三鈉二水合物 0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 加注射用水至
G1-a 0.5 mg/mL 0.50g 46.00g 0.22g 1.90g 6.8-7.4 加至1000mL
G1-b 1 mg/mL 1.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-c 1.5 mg/mL 1.50 g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-d 2 mg/mL 2.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-e 2.5 mg/mL 2.50g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-f 3 mg/mL 3.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-g 3.5 mg/mL 3.50g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-h 4 mg/mL 4.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-i 4.5 mg/mL 4.50g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-j 5 mg/mL 5.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-k 5.5 mg/mL 5.50g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-l 6 mg/mL 6.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-m 7 mg/mL 7.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-n 8 mg/mL 8.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-o 20 mg/mL 20.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-p 24 mg/mL 24.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
G1-q 30 mg/mL 30.00g 46.00g 0.22g 1.90g 加至1000mL
表2-21-3 組合物G1-b穩定性結果(0.5mL:0.5mg，1mg/mL)
檢驗項目 25℃±2℃/RH60%±5%，時間 5℃±3℃，時間
0天 1個月 2個月 3個月 1個月 3個月
性狀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH值 7.2 7.3 7.3 7.4 7.2 7.4
溶液的澄清度與顏色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色
聚合物 0.03% 0.07% 0.05% 0.10% 0.05% 0.03%
有關物質(總雜) 0.90% 1.7% 2.54% 2.64% 0.98% 1.11%
滲透壓莫耳濃度 283mOsmol/kg N/A N/A N/A N/A N/A
可見異物 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出
不溶性微粒 32粒 95粒 7粒 61粒 101粒 33粒
1粒 11粒 0粒 10粒 76粒 5粒
藥物活性成分含量 99.5% 98.7% 98.2% 96.8% 99.7% 99.3%
說明：在表2-21-3中，用於測試的組合物G1-b的體積為0.5mL，多肽化合物P016的含量為0.5mg，組合物中多肽化合物P016的濃度為1mg/mL。表2-21-4 組合物G1-d(0.5mL:1mg，2mg/mL)、G1-h(0.5mL:2mg，4mg/mL)、G1-l(0.5mL:3mg，6mg/mL)、G1-n(0.5mL:4mg，8mg/mL)穩定性結果
檢驗項目 G1-d 2mg/mL G1-h 4mg/mL
0天 25℃±2℃/RH60% ±5% 1個月 5℃±3℃ 1個月 0天 25℃±2℃/RH60% ±5% 1個月 5℃±3℃ 1個月
性狀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH值 7.3 7.4 7.4 7.3 7.4 7.3
溶液的澄清度與顏色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色
聚合物 0.03% 0.05% 0.03% 0.03% 0.04% 0.02%
有關物質(總雜) 0.85% 1.5% 0.73% 0.80% 1.4% 0.73%
滲透壓莫耳濃度 284m Osmol/ kg N/A N/A 287mOsmol/kg N/A N/A
可見異物 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出
不溶性微粒 74粒 136粒 72粒 108粒 147粒 63粒
藥物活性成分含量 1粒 15粒 2粒 3粒 16粒 3粒
性狀 101.1% 101.1% 101.0% 101.5% 101.0% 101.6%
檢驗項目 G1-l 6mg/mL G1-n 8mg/mL
0天 25℃±2℃/RH60%±5% 1個月 5℃±3℃ 1個月 0天 25℃±2℃/RH60%±5% 1個月 5℃±3℃ 1個月
性狀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH值 7.3 7.3 7.4 7.3 7.3 7.3
溶液的澄清度與顏色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色
聚合物 0.03% 0.04% 0.03% 0.02% 0.04% 0.02%
有關物質(總雜) 0.79% 1.5% 0.73% 0.81% 1.4% 0.70%
滲透壓莫耳濃度 288mOsmol/kg N/A N/A 291mOsmol/kg N/A N/A
可見異物 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出
不溶性微粒 137粒 145粒 86粒 157粒 175粒 74粒
7粒 8粒 5粒 3粒 12粒 4粒
藥物活性成分含量 102.3% 102.4% 101.0% 101.3% 102.0% 101.6%
注：藥物活性成分含量存在不高於2.5%的測量誤差。
說明：在表2-21-3中，用於測試的組合物G1-d的體積為0.5mL，多肽化合物P016的含量為1mg，組合物中多肽化合物P016的濃度為2mg/mL。用於測試的組合物G1-h的體積為0.5mL，多肽化合物P016的含量為2mg，組合物中多肽化合物P016的濃度為4mg/mL。用於測試的組合物G1-l的體積為0.5mL，多肽化合物P016的含量為3mg，組合物中多肽化合物P016的濃度為6mg/mL。用於測試的組合物G1-n的體積為0.5mL，多肽化合物P016的含量為4mg，組合物中多肽化合物P016的濃度為8mg/mL。
表2-21-5組合物G1-p穩定性結果(0.5mL:12mg，24mg/mL)
檢驗項目 25℃±2℃/RH60%±5%，時間 5℃±3℃，時間
0天 1個月 2個月 3個月 1個月 3個月
性狀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH值 7.2 7.3 7.1 7.4 7.2 7.4
溶液的澄清度與顏色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色
聚合物 0.04% 0.07% 0.05% 0.11% 0.05% 0.03%
有關物質 (總雜) 0.88% 1.6% 2.64% 2.69% 1.0% 1.07%
滲透壓莫耳濃度 298mOsmol/kg N/A N/A N/A N/A N/A
可見異物 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出
不溶性微粒 125粒 85粒 244粒 28粒 110粒 57粒
35粒 3粒 2粒 1粒 72粒 4粒
藥物活性成分含量 101.1% 100.8% 99.8% 98.6% 101.3% 100.6%
注：藥物活性成分含量存在不高於2.5%的測量誤差。
說明：在表2-21-5中，用於測試的組合物G1-p的體積為0.5mL，多肽化合物P016的含量為12mg，組合物中多肽化合物P016的濃度為24mg/mL。表2-21-6組合物G1-q穩定性結果(0.5mL:15mg，30mg/mL)
檢驗項目 檢驗結果
0天 40℃ 10天 40℃ 30天 25±2℃，RH60%± 5% 30天 光照10天
性狀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH值 7.3 7.3 7.2 7.2 7.3
溶液的澄清度與顏色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色 溶液澄清無色
不溶性微粒 245粒 339粒 195粒 214粒 130粒
21粒 20粒 31粒 117粒 23粒
聚合物 0.05% 0.12% (12天) 0.29% 0.11% 0.26%
有關物質 0.83% 2.54% (12天) 4.86% 1.36% 0.89
說明：在表2-21-6中，用於測試的組合物G1-q的體積為0.5mL，多肽化合物P016的含量為15mg，組合物中多肽化合物P016的濃度為30mg/mL。
以上表2-21-3至表2-21-6的結果表明，不同藥物濃度的代表性組合物，例如藥物濃度為1mg/mL至30mg/mL，均顯示具有溫度依賴的穩定性。並且，在25℃下，有關物質(總雜)指標下，各組合物均表現出相當的穩定性趨勢。在2-8℃下，性狀、pH、溶液澄清度和顏色、聚合物、含量、有關物質、不溶性微粒、可見異物等指標穩定，指示組合物在2-8℃具有優良的穩定性。
[組合物G2的製備]
按照下表2-22，分別秤取12.65 g甘露醇、0.52 g檸檬酸三鈉二水合物、0.06 g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入220mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入1.1 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至7.2(允許pH 6.8-7.4)，加注射用水定容至275mL，混勻，用0.22µm PES膜濾過，由此得到具有如下組成的組合物G2：包含4 mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為1.05mM：6.45mM=1:6.15)作為緩衝劑，pH為7.2(允許6.8-7.4)。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.1mL/瓶，共分裝250瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G2樣品。表2-22  組合物G2的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 1.1g (4 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 12.65g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 0.52 g (6.45 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.06 g (1.05 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 7.2 (允許6.8-7.4) pH調節劑
加注射用水至 275 mL 溶媒
[組合物G3的製備]
按照下表2-23，分別秤取12.65 g甘露醇、0.52 g檸檬酸三鈉二水合物、0.06 g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入220mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加8.25 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至7.2(允許pH 6.8-7.4)，加注射用水定容275mL，混勻，用0.22µm PES膜濾過，由此得到具有如下組成的組合物G3：包含30 mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為1.05mM：6.45mM=1:6.15)作為緩衝劑，pH為7.2(允許6.8-7.4)。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.1mL/瓶，共分裝250瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G3樣品。表2-23 組合物G3的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 8.25g (30 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 12.65g (46 mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 0.52 g (6.45 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.06 g (1.05 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 7.2 (允許6.8-7.4) pH調節劑
加注射用水至 275 mL 溶媒
[組合物G4的製備]
按照下表2-24，分別秤取46.00g甘露醇、1.985 g檸檬酸三鈉二水合物、0.158 g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入0.5-1g或1-30.00 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4。另外加入剩餘注射用水定容至1000mL，混勻，用0.22µm PES膜濾過，由此得到具有如下組成的組合物G4：包含0.5-1mg/mL或1-30mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為0.75mM：6.75mM=1:9)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G4樣品。表2-24  組合物G4的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 0.5-1g或 1-30.00g (0.5-1 mg/mL或1-30 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.985 g (6.75 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.158 g (0.75 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
[組合物G5的製備]
按照下表2-25，分別秤取46.00g甘露醇、1.324 g檸檬酸三鈉二水合物、0.105檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入0.5-1g或1-30.00 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4，加入剩餘注射用水定容至1000mL，混勻，用0.22µm PES膜濾過，由此得到具有如下組成的組合物G5：包含0.5-1mg/mL或1-30mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用5.0 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為0.50 mM：4.50 mM=1:9)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G5樣品。表2-25  組合物G5的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 0.5-1g或1-30.00g (1-30 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.324 g (4.50 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.105 g (0.50 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
[組合物G6的製備]
按照下表2-26，分別秤取46.00g甘露醇、1.90檸檬酸三鈉二水合物、0.22g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入1.00 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至 6.8-7.4，加入注射用水定容至1000mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物G6：包含1.00mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為1.05mM：6.45mM=1:6.15)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G6樣品。表2-26  組合物G6的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 1.00 g (1.00 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.90 g (6.45 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.22 g (1.05 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
[組合物G7的製備]
按照下表2-27，分別秤取46.00g甘露醇、1.985 g檸檬酸三鈉二水合物、0.158 g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入1.00 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4。另外加入剩餘注射用水定容至1000mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物G7：包含1.00 mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為0.75mM：6.75mM=1:9)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G7樣品。表2-27  組合物G7的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 1.0 g (1.00 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.985 g (6.75 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.158 g (0.75 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
[組合物G8-A和組合物G8-B的製備]
按照下表2-28，分別秤取46.00g甘露醇、1.90檸檬酸三鈉二水合物、0.22g檸檬酸一水合物，置於容器中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入30.00 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物pH值，然後向容器中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4，加入注射用水定容至1000mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物G8-B：包含30.0mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為1.05mM：6.45mM=1:6.15)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
與以上方法類似地，製備組合物G8-A，不同之處在於多肽化合物P016的用量為4.00 g。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G8-A或G8-B樣品。表2-28-1  組合物G8-A和G8-B的組成(批量等比放大縮小)
組分 G8-A 用量 G8-B 用量 功能
多肽化合物P016(API) 4.0g (4.00 mg/mL) 30.0g (30.00 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.90 g (6.45 mM) 1.90 g (6.45 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.22 g (1.05 mM) 0.22 g (1.05 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 1000 mL 溶媒
表2-28-2 G8-A穩定性結果(4mg/mL)
檢驗項目 25℃±2℃/RH60%±5%，時間 5℃±3℃，時間
0天 1個月 3個月 6個月 3個月 6個月 12個月
性狀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH值 7.3 7.2 7.3 7.2 7.3 7.3 7.4
溶液的澄清度與顏色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色
聚合物 0.04% 0.08% 0.13% 0.20% 0.06% 0.07% 0.08%
有關物質 (總雜) 0.87% 1.6% 3.2% 5.0% 1.1% 1.2% 1.2%
滲透壓莫耳濃度 292mOsmol/kg 294mOsmol/kg 288mOsmol/kg 287mOsmol/kg 287mOsmol/kg 286mOsmol/kg 282mOsmol/kg
可見異物 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出
不溶性微粒 15粒 4粒 38粒 8粒 7粒 11粒 19粒
1粒 0粒 2粒 4粒 0粒 1粒 7粒
藥物活性成分含量 99.2% 99.3% 96.3% 95.2% 99.6% 99.2% 98.1%
表2-28-3 G8-B穩定性結果(30mg/mL)
檢驗項目 25℃±2℃/RH60%±5%，時間 5℃±3℃，時間
0天 1個月 3個月 6個月 3個月 6個月 12個月
性狀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH值 7.3 7.3 7.3 7.4 7.4 7.4 7.5
溶液的澄清度與顏色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色
聚合物 0.05% 0.09% 0.13% 0.19% 0.07% 0.07% 0.08%
有關物質(總雜) 0.87% 1.6% 3.4% 5.1% 1.1% 1.2% 1.3%
滲透壓莫耳濃度 303mOsmol/kg 316mOsmol/kg 307mOsmol/kg 306mOsmol/kg 308mOsmol/kg 305mOsmol/kg 301mOsmol/kg
可見異物 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出
不溶性微粒 58粒 21粒 10粒 18粒 4粒 65粒 46粒
7粒 0粒 0粒 1粒 0粒 3粒 6粒
藥物活性成分含量 100.6% 101.1% 96.7% 94.4% 99.4% 98.1% 100.4%
依據表2-28-2和表2-28-3，組合物穩定性數據表明，組合物G8-A和組合物G8-B具有溫度依賴穩定性。並且，在2-8℃長期儲存12個月後，組合物指標仍舊穩定，指示組合物具有優良的穩定性，各項指標均滿足皮下注射給藥要求。
[組合物G9的製備]
按照下表2-29，分別秤取46.00g甘露醇、1.985 g檸檬酸三鈉二水合物、0.158 g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入30.0 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4。另外加入剩餘注射用水定容至1000mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物G9：包含30.00 mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.5 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為0.75mM：6.75mM=1:9)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G9樣品。表2-29  組合物G9的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 30.0 g (30.00 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.985 g (6.75 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.158 g (0.75 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
[組合物G10的製備]
按照下表2-30，分別秤取46.00g甘露醇、1.324 g檸檬酸三鈉二水合物、0.105 g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入1.00 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4，加入剩餘注射用水定容至1000mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物G10：包含1.00 mg/mL本發明多肽化合物P016 (API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用5.0 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為0.50 mM：4.50 mM=1:9)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G10樣品。表2-30  組合物G10的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 1.0g (1.00 g/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.324 g (4.50 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.105 g (0.50 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
[組合物G11的製備]
按照下表2-31，分別秤取46.00g甘露醇、1.324 g檸檬酸三鈉二水合物、0.105 g檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入800mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入30.0 g多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至6.8-7.4，加入剩餘注射用水定容至1000mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物G11：包含30.00mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用5.0 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為0.50 mM：4.50 mM=1:9)作為緩衝劑，pH為6.8-7.4。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物G11樣品。表2-31  組合物G11的組成
組分 用量 功能
多肽化合物P016(API) 30.0g (30.00 mg/mL) 活性藥物成分
甘露醇 46.00 g (46mg/mL) 滲透壓調節劑
檸檬酸三鈉二水合物 1.324 g (4.50 mM) 緩衝劑
檸檬酸一水合物 0.105 g (0.50 mM) 緩衝劑
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 6.8-7.4 pH調節劑
加注射用水至 1000 mL 溶媒
本發明上述的組合物G1-G11，其含枸櫞酸鹽、甘露醇輔料組合，其在高溫下均具有優越的溶液澄清度、顏色、純度、聚合物、pH值的經時穩定性。
[組合物實施例8-防腐劑配方]
[組合物H1的製備]
按照下表2-32，分別秤取920mg甘露醇、37.94mg檸檬酸三鈉二水合物、4.41mg檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入16mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入600 mg多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至7.2，加入剩餘注射用水定容至20mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物GH1：包含30.00mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑，採用7.50 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為1.05 mM：6.45 mM)作為緩衝劑，pH為7.2。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物H1樣品。表2-32  組合物H1至H3、對比組合物H-C1至H-C3的組成
組份 H1 H2 H3 H-C1 H-C2 H-C3
多肽化合物P016 (API) 600mg (30mg/mL) 600mg (30mg/mL) 600mg (30mg/mL) 600mg (30mg/mL) 600mg (30mg/mL) 600mg (30mg/mL)
甘露醇 920mg (46mg/mL) 920mg (46mg/mL) 800mg (40mg/mL) 920mg (46mg/mL) / /
檸檬酸一水合物 4.41mg (1.05 mM) 4.41mg (1.05 mM) 4.41mg (1.05 mM) / 4.41mg (1.05 mM) 4.41mg (1.05 mM)
檸檬酸三鈉二水合物 37.94mg (6.45 mM) 37.94mg (6.45 mM) 37.94mg (6.45 mM) / 37.94mg (6.45 mM) 37.94mg (6.45 mM)
磷酸二氫鈉 / / / 17.94mg (7.5mM) / /
丙二醇 / / / / / 560mg (28mg/mL)
氯化鈉 / / / / 160mg (8mg/mL) /
間甲酚 / 60mg (3mg/mL) / / / /
苯酚 / 110mg (5.5mg/mL)
用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2
注射用水至 20mL 20mL 20mL 20mL 20mL 20mL
注：輔料用量允許不超過千分之五的誤差。例如檸檬酸一水合物4.41mg，其可以在4.378-4.422mg的範圍內變化。
[對比組合物H-C1、H-C2、H-C3]
如上表2-32，採用製備H1相同的方法製備對比組合物H-C1、H-C2和H-C3。H-C1區別僅在於將H1中37.94mg檸檬酸三鈉二水合物、4.41mg檸檬酸一水合物替換為17.94mg磷酸二氫鈉(7.5mM)；H-C2區別僅在於將H1中920mg甘露醇替換為160mg氯化鈉；H-C3區別僅在於將H1中920mg甘露醇替換為560mg丙二醇。
[組合物H2和組合物H3的製備]
按照上表2-32，分別秤取920mg甘露醇、37.94mg檸檬酸三鈉二水合物、4.41mg檸檬酸一水合物，置於燒杯中，加入16mL注射用水，攪拌均勻。向燒杯中緩慢加入600 mg多肽化合物P016(API)，邊加邊攪拌。測試得到的混合物的pH值，然後向燒杯中加入用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調節pH至7.2，加入60mg間甲酚或110mg苯酚，邊加邊攪拌，攪拌溶解混勻後，微調pH至7.2，加入剩餘注射用水定容至20mL，混勻，由此得到具有如下組成的組合物H2或H3：包含30.00mg/mL本發明多肽化合物P016(API)作為藥物活性成分、包含46mg/mL甘露醇作為滲透壓調節劑、包含3.00 mg/mL間苯酚或5.5mg苯酚作為防腐劑，採用7.50 mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液(檸檬酸：檸檬酸三鈉莫耳濃度比為1.05 mM：6.45 mM)作為緩衝劑，pH為7.2。
用0.22µm PES膜濾過，分裝於2mL中性硼矽玻璃管制注射劑瓶(滅菌後)中，1.0mL/瓶，加注射液用局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞(滅菌後)全壓塞，加抗生素用鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物H2或H3樣品。表2-33  不同組合物的澄清度和顏色
考察點 溫度 組合物H1 組合物H2 組合物H3 對比組合物H-C1 對比組合物H-C2 對比組合物H-C3
10天 ­-20℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色
40℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度2~3 澄清無色 澄清無色
60℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色 澄清無色
25℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度2~3 無色，濁度1 澄清無色
2～8℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度3~4 澄清無色 澄清無色
1個月 40℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度4 澄清無色 澄清無色
25℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度4 無色，濁度4 無色，濁度2~3
2～8℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度4 澄清無色 澄清無色
3個月 25℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度4 無色，濁度4 無色，濁度2~3
2～8℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度4 無色，濁度1~2 澄清無色
6個月 40℃ 澄清,黃色2 澄清,黃色0.5~1 澄清,黃色1 澄清,黃色2 澄清,黃色0.5~1 澄清,黃色1
60℃ 澄清,黃色7 澄清,黃色7~8 澄清,黃色7~8 澄清,黃色10 澄清,黃色7~8 澄清,黃色7~8
25℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度4 無色，濁度4 無色，濁度4
2～8℃ 澄清無色 澄清無色 澄清無色 無色，濁度4 無色，濁度1~2 無色，濁度1
表2-33的結果表明：
1)較對比組合物H-C1(磷酸鹽)、H-C2(氯化鈉)、H-C3(丙二醇)，組合物H1 (含枸櫞酸鹽、甘露醇)，依舊表現出更好的溶液澄清度。
2)意想不到的是，含防腐劑苯酚或間甲酚的組合物H2和H3，較無防腐劑的組合物H1，在40℃下具有更小的顏色深度改變，防腐劑的加入改善了組合物顏色性狀穩定性。表2-34  HPLC-UV測定不同組合物的色譜純度
考察點 溫度 組合物H1 組合物H2 組合物H3 對比組合物 H-C1 對比組合物 H-C2 對比組合物 H-C3
10天 ­-20℃ 96.52% 96.40% 96.43% 96.51% 96.52% 96.53%
40℃ 94.74% 94.72% 94.41% 94.35% 94.75% 94.73%
60℃ 81.53% 81.26% 80.38% 77.89% 80.89% 82.30%
1個月 40℃ 91.46% 90.99% 90.94% 88.28% 91.13% 91.41%
3個月 2～8℃ 96.03% 96.45% 96.42% 84.52% 95.92% 96.41%
25℃ 93.69% 94.21% 93.86% 78.32% 41.49% 87.48%
6個月 2～8℃ 95.83% 95.82% 95.79% / / /
25℃ 90.71% 91.91% 91.63% / / /
表2-35  SEC-HPLC測定不同組合物的聚合物
考察點 溫度 組合物H1 組合物H2 組合物H3 對比組合物 H-C1 對比組合物 H-C2 對比組合物 H-C3
10天 ­-20℃ 0.07% 0.09% 0.09% 0.08% 0.12% 0.10%
40℃ 0.15% 0.17% 0.18% 0.20% 0.18% 0.16%
60℃ 0.59% 0.63% 0.60% 2.92% 0.68% 0.55%
1個月 40℃ 0.25% 0.26% 0.25% 0.22% 0.30% 0.25%
3個月 2～8℃ 0.13% 0.13% 0.13% 0.11% 0.13% 0.12%
25℃ 0.12% 0.21% 0.22% 0.29% 0.39% 1.06%
6個月 2～8℃ 0.07% 0.08% 0.08% / / /
25℃ 0.24% 0.18% 0.17% / / /
綜上，在高濃度活性P016藥物濃度下，較H1的無防腐劑配方，含防腐劑的H2和H3配方，同樣表現出相當的聚合物、有關物質、澄清度穩定性概況，且改善的顏色性狀熱穩定性。通過本發明組合物H1至H3與對比組合物H-C1至H-C3的對比，再次表明檸檬酸鹽緩衝體系、甘露醇滲透壓調節劑的輔料組成具有優良的理化的熱穩定特徵。
[組合物實施例9-防腐劑配方]
15mM檸檬酸鹽緩衝液：1)15mM檸檬酸：秤取0.3143g檸檬酸一水合物，用水稀釋溶解至100mL，即得。2) 15mM檸檬酸三鈉：秤取0.4414g檸檬酸三鈉二水合物，用水稀釋溶解至100mL，即得。3) 取10.5mL的15mM檸檬酸與64.5mL的15mM檸檬酸三鈉混合，制得15mM檸檬酸鹽緩衝液。
55mg/3mL苯酚貯備液：準確苯酚適量，用水稀釋溶解定容即得。
30mg/3mL間甲酚貯備液：準確間苯酚適量，用水稀釋溶解定容即得。
組合物I1至I12的配製：根據下表2-36，將適量甘露醇加入各自容量器中，按需加入適量注射用水、檸檬酸鹽緩衝液、甘油或丙二醇、氯化鈉攪拌混勻後，秤取適量P016多肽緩慢加入其中，搖勻溶解得到澄清溶液後，用0.1M度HCl或0.1M NaOH調節pH值，按需滴加3mL的苯酚貯備液或間甲酚貯備液，按需調節pH至目標值，並用注射用水定容至10mL終體積，混勻。用0.22μm無菌聚醚碸膜(PES)濾過，分裝於經滅菌的2mL注射劑小瓶中，1.0mL/瓶，經滅菌的局部覆聚四氟乙烯膜丁基橡膠塞加塞，鋁塑組合蓋軋蓋，即得組合物I1至I12。表2-36 組合物I1至I12的組成
序號 組分 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12
1 多肽化合物P016 (API) 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg 300mg
2 15mM檸檬酸鹽緩衝液 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM) 5mL (7.5mM)
3 甘露醇 460mg (46mg/mL) 460mg (46mg/mL) / / 220mg (22mg/mL) 220mg (22mg/mL) / / 180mg (18mg/mL) 200mg (20mg/mL) / /
4 甘油 / / 220mg (22mg/mL) / 120mg (12mg/mL) / / 120mg (12mg/mL) 120mg (12mg/mL) / / 120mg (12mg/mL)
5 丙二醇 / / / 160mg (16mg/mL) / 100mg (10mg/mL) 110mg (11mg/mL) / / 100mg (10mg/mL) 100mg (10mg/mL) /
6 氯化鈉 / / / / / / 35mg 35mg / / 30mg 30mg
7 55mg/3mL苯酚 / / / 3mL (5.5mg/mL) / / / / 3mL (5.5mg/mL) 3mL (5.5mg/mL) 3mL (5.5mg/mL) 3mL (5.5mg/mL)
8 30mg/3mL間甲酚 / / 3mL (3mg/mL) / 3mL (3mg/mL) 3mL (3mg/mL) 3mL (3mg/mL) 3mL (3mg/mL) / / / /
9 注射用水 3mL 3mL 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 用0.1M NaOH或0.1M HCl水溶液調pH至 7.2 8.0 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2
11 加注射水定容至 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL
表2-37 組合物I1至I12的溶液澄清度和顏色
組合物 時間 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12
0天 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清
10天40℃ 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清
10天60℃ 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清
1個月40℃ 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清
1個月2-8℃ 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清
1個月25℃ 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清 無色澄清
表2-38 組合物I1至I12的聚合物(%)
組合物 時間    I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12
0天 0.09 0.05 0.06 0.08 0.08 0.10 0.07 0.04 0.04 0.06 0.07 0.07
10天40℃ 0.10 0.12 0.13 0.13 0.11 0.13 0.12 0.11 0.12 0.13 0.11 0.13
10天60℃ 0.78 0.69 1.06 0.81 0.91 0.87 0.94 0.93 1.00 0.93 0.86 0.96
1個月40℃ 0.32 0.33 0.40 0.36 0.35 0.33 0.38 0.42 0.42 0.33 0.38 0.44
1個月2-8℃ 0.08 0.07 0.08 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.08 0.12 0.08
1個月25℃ 0.11 0.13 0.14 0.12 0.13 0.11 0.12 0.13 0.14 0.12 0.13 0.15
表2-39 組合物I1至I12的純度 (%)
組合物 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12
0天 99.15 99.08 99.13 99.13 99.07 99.15 99.19 99.13 99.21 99.12 99.15 99.11
10天40℃ 97.06 97.03 96.21 96.97 97.21 97.22 97.35 97.41 97.07 97.21 97.40 97.20
10天60℃ 73.72 73.12 70.72 73.38 72.89 73.01 72.77 74.10 71.18 70.89 74.74 74.48
1個月40℃ 90.82 90.03 89.34 90.72 91.40 91.36 91.62 91.59 90.87 91.51 91.62 91.27
1個月2-8℃ 98.95 98.95 98.92 98.97 98.96 98.94 98.97 98.95 98.97 98.97 98.94 98.91
1月25℃ 98.52 98.01 97.69 98.08 98.17 98.17 98.25 98.24 98.11 98.23 97.26 97.24
表2-37至表2-39的結果表明：
溶液澄清度：在防腐劑苯酚或間甲酚的組合物I3至I12，儘管含有丙二醇、甘油、氯化鈉或其組合作為滲透壓調節劑，在25℃和40℃下1個月、60℃10天，均未出現濁度增加的現象。這與無防腐劑配方不同，當無防腐劑的組合物採用丙二醇或氯化鈉作為滲透壓調節劑時，其易出現濁度增加現象。意外發現，防腐劑苯酚或間甲酚的使用，使得組合物可採用更多種類的滲透壓調節劑(例如，甘露醇、丙二醇、甘油、氯化鈉及其組合)，且不破壞其溶液性狀/澄清度的物理穩定性。
聚合物(%)：較無防腐劑組合物I1和I2，含防腐劑的組合物I3至I12，在40℃或25℃或2-8℃表現出相當的穩定性趨勢。苯酚或間甲酚防腐劑、以及單個或組合的滲透壓調節劑的引入，未導致組合物I3至I12中聚合物指標惡化。
純度(%)：組合物I1至I12均表現出溫度依賴穩定性。組合物I3至I12採用不同的防腐劑(間甲酚或苯酚)與滲透壓調節劑(甘露醇、丙二醇、甘油、氯化鈉)組合，均表現出相似的溫度依賴的純度降低。
胺基酸序列：
在序列表中的編號 化合物名稱 結構式
SEQ ID NO:1 P001 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:1)
SEQ ID NO:2 P007 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:2).
SEQ ID NO:3 P008 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:3).
SEQ ID NO:4 P013 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)18-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:4).
SEQ ID NO:5 P014 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:5).
SEQ ID NO:6 P015 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:6).
SEQ ID NO:7 P016 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:7).
SEQ ID NO:8 P017 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:8).
SEQ ID NO:9 P018 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:9).
SEQ ID NO:10 P019 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:10).
SEQ ID NO:11 P020 Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib；在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(SEQ ID NO:11).
SEQ ID NO:12 式I Y-X1-E-G-T-X2-T-S-D-Y-X3-I-X4-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K-W-L-L-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K; 其中X1是Aib；X2是αMePhe；X3是Aib；X4是Aib； 在I式的16位、24位、28、40位K中任選1個K的位置，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-Z綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，其中每個a獨立的選自1、2、3的整數，每個b獨立的選自1、2、3的整數，每個c獨立的選自16、18、20的整數，其中Z獨立的選自-CH3、羧酸或羧酸生物電子等排體、膦酸鹽/酯或磺酸鹽/酯，優選是-COOH；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺 (SEQ ID NO:12)。
無
無
TW202535911A_114101197_SEQL.xml

Claims (15)

  1. 一種藥物組合物，所述藥物組合物的pH為約5.0-約9.0，並且所述藥物組合物包含約0.1-約50mg/mL的下式I的多肽化合物：Y-Aib-E-G-T-αMePhe-T-S-D-Y-Aib-I-Aib-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K24-W-L-L-K28-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K   式I  (SEQ ID NO:12)；其中，在I式的16位、24位、28、40位K中任選1個K的位置，通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)a-(γ-Glu)b-CO-(CH2)c-Z綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾，其中每個a獨立的選自1、2、3的整數，每個b獨立的選自1、2、3的整數，每個c獨立的選自16、18、20的整數，其中Z獨立的選自-CH3、羧酸或羧酸生物電子等排體、膦酸鹽/酯或磺酸鹽/酯，優選是-COOH；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺。
  2. 如請求項1所述的藥物組合物，其中所述式I的多肽化合物是Y-Aib-E-G-T-αMePhe-T-S-D-Y-Aib-I-Aib-L-D-K-Q-A-Q-A-E-F-V-K24-W-L-L-K28-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-K  式I，其中在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P007，SEQ ID NO:2)；或在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)18-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P013，SEQ ID NO:4)；或在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P014，SEQ ID NO:5)；或在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P015，SEQ ID NO:6)；或在位置24的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P016，SEQ ID NO:7)；或在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P008，SEQ ID NO:3)；或在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P017，SEQ ID NO:8)；或在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2-(γ-Glu)3-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P018，SEQ ID NO:9)；或在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)16-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P019，SEQ ID NO:10)；或在位置28的K通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)3-(γ-Glu)1-CO-(CH2)20-CO2H綴合至K側鏈的ε-氨基而化學修飾；並且C末端胺基酸被醯胺化為C末端一級醯胺(P020，SEQ ID NO:11)。
  3. 如請求項1或2所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物還含有滲透壓調節劑、緩衝劑和水、以及任選存在的其他賦形劑或載體，所述其他賦形劑或載體包括pH調節劑、防腐劑、抗氧化劑和穩定劑中的一種或多種。
  4. 如請求項3所述的藥物組合物，其中所述緩衝劑選自醋酸、琥珀酸、檸檬酸、磷酸、葡萄糖酸、草酸、乳酸、酒石酸、延胡索酸、4-羥乙基哌𠯤乙磺酸(HEPES)、氨丁三醇(Tris)、磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸一水合物-檸檬酸三鈉二水合物、磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸銨、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、及它們的組合。
  5. 如請求項3或4所述的藥物組合物，其中基於所述水溶液的總體積，所述緩衝劑的莫耳濃度為約0.5-約50mM。
  6. 如請求項3-5中任一項所述的藥物組合物，其中所述的滲透壓調節劑選自氯化鈉、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、酒石酸鹽、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、聚乙二醇、或者它們的任意組合。
  7. 如請求項3-6中任一項所述的藥物組合物，其中基於所述水溶液的總體積，所述滲透壓調節劑的含量為約1-約100mg/mL。
  8. 如請求項3-7中任一項所述的藥物組合物，其中所述pH調節劑為氫氧化鈉水溶液或鹽酸。
  9. 如請求項3-8中任一項所述的藥物組合物，其中所述防腐劑選自苯酚、間甲酚、甲酚、苯氧乙醇、三氯三級丁醇、苯甲醇、苯甲酸酯衍生物、以及它們的任意組合。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的藥物組合物，所述藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述藥物組合物包含：約0.1-約50 mg/mL的請求項1中的式I化合物，例如約1-約40mg/mL的化合物P016或P014或P020，總莫耳濃度為約0.5-約50mM的檸檬酸和檸檬酸三鈉，優選約1.0-10mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比為約1:4-50，優選約1:4-20，0-約50mg/mL，優選約0.1-約50mg/mL，更優選約1-約10mg/mL，再更優選約2-約6mg/mL的防腐劑，約1-約100 mg/mL的滲透壓調節劑，優選約1-約100 mg/mL的甘露醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甘油、氯化鈉或它們的任意組合，任選存在的氫氧化鈉水溶液或鹽酸，和水，其中所述水溶液的pH值為約5.0-約9.0，例如約5.8-約9.0，優選約6.0-約8.8，更優選約6.5-約7.4。
  11. 如請求項1-9中任一項所述的藥物組合物，所述藥物組合物為水溶液，基於所述水溶液的總體積，所述藥物組合物包含：約0.1-約50 mg/mL的請求項1中的式I化合物，例如約1-約40mg/mL的化合物P016或P014或P020，總莫耳濃度為約0.5-約50mM的檸檬酸和檸檬酸三鈉，優選約1.0-約10mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉，檸檬酸與檸檬酸三鈉的莫耳比為約1:4-50，優選約1:4-20，約1-約100 mg/mL的甘露醇，任選存在的氫氧化鈉水或鹽酸，任選存在的防腐劑，和水，其中所述水溶液的pH值為約5.0-約9.0，例如約5.8-約9.0，優選約6.0-約8.8，更優選約6.5-約7.4。
  12. 如請求項1-11中任一項所述的藥物組合物，所述藥物組合物的滲透壓為約200-約500 mOsm/kg，優選約250-約350 mOsm/kg，更優選為約260-約320 mOsm/kg，所述滲透壓為採用滲透壓莫耳濃度測定儀所測定的。
  13. 一種試劑盒，其包含容器，以及容納在所述容器中的根據請求項1-12中任一項所述的藥物組合物。
  14. 一種根據請求項1-12中任一項所述的藥物組合物的用途，其用於製備治療疾病的藥物，所述疾病例如是糖尿病、肥胖症、與糖尿病相關的疾病、和/或與肥胖症相關的疾病。
  15. 一種根據請求項14所述的用途，其中所述藥物組合物的單位劑量為0.1mg至約0.5mg或約0.5mg至約50mg。
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