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TW202527997A - 靶向ｅｇｆｒ／ｃ—ｍｅｔ之抗體—藥物結合物以及其製備方法及用途 - Google Patents

靶向ｅｇｆｒ／ｃ—ｍｅｔ之抗體—藥物結合物以及其製備方法及用途

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TW202527997A
TW202527997A TW113144026A TW113144026A TW202527997A TW 202527997 A TW202527997 A TW 202527997A TW 113144026 A TW113144026 A TW 113144026A TW 113144026 A TW113144026 A TW 113144026A TW 202527997 A TW202527997 A TW 202527997A
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TW
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seq
amino acid
acid sequence
antibody
polypeptide chain
Prior art date
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TW113144026A
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鄭勇
田強
雷冬梅
邸岩書
周玥華
胡瑞斌
龍虎
蒲鈺芝
袁曉曦
宋宏梅
譚淼
向陽 譚
葛均友
Original Assignee
大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明揭示可用於預防c-MET及/或EGFR相關疾病、治療該等疾病及/或在治療該等疾病時用作佐劑的抗體-藥物結合物(ADC)。該等ADC包含雙特異性抗體或其抗原結合片段與細胞毒性藥物結合，該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含特異性結合EGFR之臂及特異性結合c-MET之臂。

Description

靶向EGFR/c-MET之抗體-藥物結合物以及其製備方法及用途
本揭示係關於靶向療法，且更具體而言係關於靶向EGFR及c-MET之抗體-藥物結合物以及其製備方法及用途。
EGFR (表皮生長因子受體，稱為EGFR、ErbB-1或HER1)為表皮生長因子受體(HER)家族之成員。此家族包括HER1 (erbB1, EGFR)、HER2 (erbB2, NEU)、HER3 (erbB3)及HER4 (erbB4)。HER家族在細胞生理過程中起重要調節作用。EGFR為由1210個胺基酸構成之I型跨膜醣蛋白，其分子量為約170 kDa。其主要結構包括配體結合細胞外域、疏水性跨膜區及包含酪胺酸激酶之細胞內區域。EGFR在各種腫瘤中，諸如在結腸直腸癌、頭頸癌及非小細胞肺癌中高度表現。其在一定程度上亦表現於諸如皮膚及肺之正常上皮組織中。在腫瘤組織中高度表現之EGFR經由配體(諸如EGF或TGFα)結合進行同源或異源二聚合。二聚合引起腫瘤細胞中之酪胺酸激酶活化及蛋白質磷酸化，從而介導基因轉錄及細胞週期。各種細胞信號傳導路徑之活化在促進腫瘤細胞之存活、增殖及遷移以及腫瘤血管生成中發揮重要作用。
酪胺酸蛋白激酶Met (c-MET)，亦稱為肝細胞生長因子受體(HGFR)，為由Met原癌基因編碼的異二聚跨膜酪胺酸激酶受體。c-MET為由1390個胺基酸構成之I型跨膜醣蛋白，其分子量為約190 kDa。其最終形成藉由雙硫鍵經由剪切連接之兩條多肽鏈，亦即α鏈(50 kDa)及β鏈(140 kDa)。自膜外至細胞內，MET蛋白可劃分成SEMA域(信號蛋白域，Semaphorin domain；SEMA)、PSI域(叢蛋白(Plexin)-信號蛋白-整聯蛋白域，PSI)、四個免疫球蛋白樣重複域(免疫球蛋白-叢蛋白-轉錄域，IPT)、跨膜區(Transmembrane region)、近膜區(JM)、酪胺酸激酶域(TK)及羧基端區(Carboxyl terminal region，CT)。c-MET受體之天然配體為肝細胞生長因子(HGF)，一種藉由蛋白酶切割轉化為其活性形式的無活性蛋白質。已在多種癌症中報導c-MET之異常調節，包括結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胃癌及乳癌。已顯示c-MET及其下游信號傳導路徑之高活化觸發過度增殖、腫瘤侵襲及血管生成，且與不良存活率相關。
對EGFR酪胺酸激酶抑制劑(TKI)具有抗性之接近60%腫瘤具有增加的c-MET表現、擴增的c-MET或增加的c-MET配體HGF (Turke等人, Cancer Cell, 17: 77-88, 2010)，指示腫瘤c-MET信號傳導路徑將補償EGFR信號傳導路徑。EGFR及c-MET信號皆經由相同存活及抗細胞凋亡路徑(ERK及AKT)轉導。預期同時靶向EGFR及c-MET能同時抑制EGFR及c-MET之兩個信號傳導路徑，從而避免EGFR抑制之後由c-MET信號傳導路徑之活化引起的腫瘤出現及發展，由此改良總體功效及安全性。
抗c-MET及抗EGFR抗體為此項技術中已知，例如，揭示於美國專利第10603389號中的特立妥珠單抗維多汀(Telisotuzumab vedotin) (Teliso-v或ABBV399)為與vc-MMAE(維多汀)結合的抗c-MET抗體ABT-700，且揭示於WO2023040941中的MRG003 (ADC-3或MYK-3)為與維多汀結合的抗EGFR抗體BA03。
此項技術中已揭示幾種EGFR/c-Met雙特異性抗體。WO2010115551中所揭示之雙特異性抗體BSAB01包含西妥昔單抗(cetuximab)之EGFR結合VH/VL對(Fab)及奧那妥珠單抗(onartuzumab)之c-Met結合VH/VL對(Fab)，目前正處於III期試驗中。美國專利第9,593,164號中揭示了一種以商品名RYBREVANT®出售之雙特異性抗體埃萬妥單抗(amivantamab)。埃萬妥單抗包含：包含紮魯姆單抗(Zalutumumab) (參見美國專利第7,247,301號及美國專利第7,595,378號)之VH及VL的抗EGFR Fab；及包含美國專利第9,068,011號中所揭示之抗體069之VH及VL的抗cMET Fab。與細胞毒素結合的EGFR/c-Met雙特異性抗體已揭示於Sellman等人(J Biol Chem. 291(48): 25106-25119 (2016)) (其揭示了與維多汀結合的EGFR /c-Met雙特異性抗體)及WO2023083846 (其揭示了與喜樹鹼衍生物結合的EGFR /c-Met雙特異性抗體AZD9592)中。在此項技術中需要結合於EGFR及c-MET兩者且包含細胞毒性藥物的抗體-藥物結合物(ADC)。
本發明提供可用於預防c-MET及/或EGFR相關疾病、治療該等疾病及/或在治療該等疾病時用作佐劑的抗體-藥物結合物(ADC)。本發明之ADC包含雙特異性抗體與細胞毒性藥物結合，該雙特異性抗體包含特異性結合EGFR之臂及特異性結合c-MET之臂。在特定實施例中，該雙特異性抗體包含結合EGFR之scFv及結合c-MET之Fab。在其他實施例中，該雙特異性抗體包含結合EGFR之Fab及結合c-MET之scFv或包含結合EGFR之scFv及結合c-MET之scFv。在其他實施例中，抗EGFR Fab及/或抗c-MET Fab包含選自CrossMab Fab、CrossMab VH-VL及CrossMab CH1-CL之CrossMab型式。ADC及其藥品適用於預防與c-MET及/或EGFR相關之疾病(例如癌症)、治療該等疾病及/或在治療該等疾病時用作佐劑。
與喜樹鹼衍生物結合的本文所揭示之包含雙特異性抗體07B、10B、38B、41B、49B、55B或56B的例示性ADC呈現EGFR及c-MET親和力以及針對EGFR及/或c-MET陽性腫瘤細胞(諸如胃癌、非小細胞肺癌(例如肺腺癌)、表皮鱗狀細胞癌等癌細胞)的活體內及活體外殺傷活性。
本發明提供一種抗體-藥物結合物，其包含下式中所示之結構： Ab-[M-L-E-D] x其中： Ab為雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域，其中該第一抗原結合域包含第一輕鏈可變區(VL)及第一重鏈可變區(VH)，且該第一VL及該第一VH共同形成能夠特異性結合於c-MET之域；且該第二抗原結合域包含第二VL及第二VH，且該第二VL及該第二VH一起形成能夠特異性結合於EGFR之域； M為連接至該雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段之連接子位點； L為連接該等連接子位點M與E之結構片段； E為連接L與D之結構片段； D為細胞毒性藥物或其殘基；且 x經選擇為1至10之任何整數。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自獨立地選自scFv、Fab及scFab。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段進一步包含Fc域，該Fc域包含第一Fc域單體及第二Fc域單體，且其中該第一Fc域單體及該第二Fc域單體包含一個或多個促進該等Fc域單體之異二聚合的修飾。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該Fc域包含有包含形成杵結構之修飾的第一Fc域單體及包含形成臼結構之修飾的第二Fc域單體，其中該臼結構可與該杵結構配對形成異二聚Fc域。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一Fc域單體包含如SEQ ID NO: 49或51中所示之胺基酸序列，且該第二Fc域單體包含如SEQ ID NO: 50或52中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自連接至該Fc域之該第一Fc域單體及該第二Fc域單體中之一者。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域連接至該第一Fc域單體，且該第二抗原結合域連接至該第二Fc域單體；或該第一抗原結合域連接至該第二Fc域單體，且該第二抗原結合域連接至該第一Fc域單體。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一VL包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 59中所示之VL胺基酸序列的互補決定區(CDR)-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列；及/或該第一VH包含SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 60中所示之VH胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一VL包含： (i)包含如SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；或 (ii)包含如SEQ ID NO: 35中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 37中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；及/或 該第一VH包含： (i)包含如SEQ ID NO: 39中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 43中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (ii)包含如SEQ ID NO: 40中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 44中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (iii)包含如SEQ ID NO: 42中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 46中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3；或 (iv)包含如SEQ ID NO: 41中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 45中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 48中所示之胺基酸序列的CDR-H3。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一VL包含如SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列及/或該第一VH包含如SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列；或該第一VL包含如SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，該第一VH包含如SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列；或該第一VL包含如SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，該第一VH包含如SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列；及/或該第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第二VL包含： (i)包含如SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；或 (ii)包含如SEQ ID NO: 20中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 22中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；及/或 該第二VH包含： (i)包含如SEQ ID NO: 24中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 28中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (ii)包含如SEQ ID NO: 25中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (iii)包含如SEQ ID NO: 27中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 31中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3；或 (iv)包含如SEQ ID NO: 26中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 30中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 33中所示之胺基酸序列的CDR-H3。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第二VL包含如SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列，及/或該第二VH包含如SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域為Fab，且該第二抗原結合域為scFv。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體包含多肽鏈I-A、多肽鏈I-B及多肽鏈I-C；其中該多肽鏈I-A包含該第一VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈I-B包含：該VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；該多肽鏈I-C包含：該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈I-A自N端至C端包含該第一VL及該輕鏈恆定區；該多肽鏈I-B自N端至C端包含該第一VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈I-C自N端至C端包含(i)該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第二VH、該第二VL及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈I-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，且該多肽鏈I-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈I-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自由以下組成之群：包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有如(GGGGS) n所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈I-A包含如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，該多肽鏈I-B包含如SEQ ID NO: 2或9中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈I-C包含如SEQ ID NO: 3或10中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域為scFv，且該第二抗原結合域為Fab。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體包含多肽鏈II-A、多肽鏈II-B及多肽鏈II-C；其中該多肽鏈II-A包含該第二VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈II-B包含該第二VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，該多肽鏈II-C包含：該第一VL、該第一VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈II-A自N端至C端包含該第二VL及該輕鏈恆定區；且該多肽鏈II-B自N端至C端包含該第二VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈II-C自N端至C端包含(i)該第一VL、該第一VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第一VH、該第一VL及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈II-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接；該多肽鏈II-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈II-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈II-A包含如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，該多肽鏈II-B包含如SEQ ID NO: 5或7中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈II-C包含如SEQ ID NO: 6或8中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域為Fab，且該第二抗原結合域為scFab。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體包含多肽鏈III-A、多肽鏈III-B及多肽鏈III-C；其中該多肽鏈III-A包含該第一VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈III-B包含：該第一VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，該多肽鏈III-C包含：該第二VL、輕鏈恆定區、該第二VH、重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈III-A自N端至C端包含該第一VL及該輕鏈恆定區；該多肽鏈III-B自N端至C端包含該第一VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈III-C自N端至C端包含(i)該第二VL、該輕鏈恆定區、該第二VH、該重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第二VH、該重鏈CH1區、該第二VL、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈III-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接；該多肽鏈III-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接；及/或該多肽鏈III-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈之該CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域為scFab，且該第二抗原結合域為Fab。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體包含多肽鏈IV-A、多肽鏈IV-B及多肽鏈IV-C；其中該多肽鏈IV-A包含該第二VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈IV-B包含：該第二VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；該多肽鏈IV-C包含：該第一VL、輕鏈恆定區、該第一VH、重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈IV-A自N端至C端包含該第二VL及該輕鏈恆定區，且該多肽鏈IV-B自N端至C端包含該第二VH、該重鏈之該CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈IV-C自N端至C端包含(i)該第一VL、該輕鏈恆定區、該第一VH、該重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)；或(ii)該第一VH、該重鏈CH1區、該第一VL、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈IV-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，且該多肽鏈IV-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接；及/或該多肽鏈IV-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈IV-A包含如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，該多肽鏈IV-B包含如SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈IV-C包含如SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域及該第二抗原結合域為Fab，且該第二抗原結合域之該Fab包含呈CrossMab形式之域交換。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體包含多肽鏈V-A、多肽鏈V-B、多肽鏈V-C及多肽鏈V-D；其中該多肽鏈V-A包含該第一VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈V-B包含：該第一VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，且該多肽鏈V-C包含：該第二VH、輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，該多肽鏈V-D包含：該第二VL及重鏈CH1區。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈V-A自N端至C端包含該第一VL及該輕鏈恆定區；該多肽鏈V-B自N端至C端包含該第一VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；該多肽鏈V-C自N端至C端包含該第二VH、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，及/或該多肽鏈V-D自N端至C端包含該第二VL及該重鏈CH1區。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈V-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，該多肽鏈V-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接，該多肽鏈V-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈V-D之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈V-A包含如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，該多肽鏈V-B包含如SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列；該多肽鏈V-C包含如SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈V-D之序列在SEQ ID NO: 12中示出。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域及該第二抗原結合域為Fab，且該第一抗原結合域之該Fab包含呈CrossMab形式之域交換。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體包含多肽鏈VI-A、多肽鏈VI-B、多肽鏈VI-C及多肽鏈VI-D；其中該多肽鏈VI-A包含該第二VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈VI-B包含：該第二VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；該多肽鏈VI-C包含：該第一VH、輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)；該多肽鏈VI-D包含：該第一VL及重鏈CH1區。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈VI-A自N端至C端包含該第二VL及該輕鏈恆定區，且該多肽鏈VI-B自N端至C端包含該第二VH、該重鏈之該CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，該多肽鏈VI-C自N端至C端包含該第一VH、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，及/或該多肽鏈VI-D自N端至C端包含：該第一VL及該重鏈CH1區。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈VI-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接；該多肽鏈VI-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接；該多肽鏈VI-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接；及/或該多肽鏈VI-D之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該第一抗原結合域及該第二抗原結合域皆為scFv。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體包含多肽鏈VII-A及多肽鏈VII-B；其中該多肽鏈VII-A包含：該第一VL、該第一VH及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，該多肽鏈VII-B包含：該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈VII-A自N端至C端包含(i)該第一VL、該第一VH及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；或(ii)該第一VH、該第一VL及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈VII-B自N端至C端包含(i)該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第二VH、該第二VL及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，其中該多肽鏈VII-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈VII-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO:55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該多肽鏈VII-A包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈VII-B包含如SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含： (1)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C； (2)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C； (3)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C； (4)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C； (5)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-B及包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-C； (6)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-B、包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-C及包含如SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-D；或 (7)包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-A及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-B。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該抗體-藥物結合物具有相對於單特異性抗c-MET抗體及/或單特異性抗EGFR抗體增強的腫瘤抑制作用；其中該單特異性抗c-MET抗體之CDR之胺基酸序列與該第一抗原結合域之該等CDR之胺基酸序列一致，且該單特異性抗EGFR抗體之CDR之胺基酸序列與該第二抗原結合域之該等CDR之胺基酸序列一致。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該腫瘤抑制作用包含：EGFR及c-MET信號傳導路徑、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性的抑制。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，M包含 ，且其中環A為5員至6員脂族雜環或5員至20員芳族環系統，且該脂族雜環及芳族環系統視情況經一個或多個獨立地選自由以下組成之群的基團置換：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、硫醇基及C 1-6烷基；且M 1係選自單鍵及C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，M包含 ，其中環A為5員脂族雜環、6員雜芳族環或藉由經由單鍵連接超過一個6員芳族雜環與一個苯環或藉由經由單鍵連接超過一個6員雜芳族環而形成的多環，且其中該脂族雜環視情況經一個或多個選自側氧基(=O)、鹵素及C 1-4烷基取代之基團取代；且M 1係選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，M為 ，其中環A係選自 、 、 、 、 、 及 ；且M 1係選自單鍵、C 1-6伸烷基、C 2-6伸烯基、C 2-6伸炔基及胺基基團。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，M係選自 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，M為 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，M係選自 、 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，M係選自 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，L係選自包含以下中之一者或多者的結構：C 1-6伸烷基；-N(R')-；羰基；-O-；天然胺基酸或非天然胺基酸以及其等選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Lys (COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3))及包含1、2、3或4個胺基酸之肽的類似物； ； ； ； ； ； ； ； ； 及 ；其中R'表示氫、C 1-6烷基或含有1至10個環氧乙烷單元之聚乙二醇片段；且s係選自1至20之整數。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，肽係選自Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Lys(Ac)、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Val-Cit、Ala -Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75))。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，L係選自包含以下中之一者或多者的結構：C 1-6伸烷基、羰基、-NH-、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Ala、Val- Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75))、 、 、 、 及 ；其中s係選自1至20之整數。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，L係選自由以下中之一者或多者組成的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，L係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，L係選自以下結構： 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，L係選自以下結構： 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，L係選自以下結構： 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，E為單鍵或係選自以下結構： -NHCH 2-、 、 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，E為單鍵、-NHCH 2-、 或 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，E為-NHCH 2-或 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，E為-NHCH 2-或單鍵。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，E為 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中， 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中， 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓樸異構酶抑制劑及RNA聚合酶抑制劑。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該微管蛋白抑制劑為澳瑞他汀(auristatin)化合物或類美登素(maytansinoid)化合物。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該DNA嵌入劑為吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該DNA拓樸異構酶抑制劑為拓樸異構酶I抑制劑或拓樸異構酶II抑制劑。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，其中該拓樸異構酶I抑制劑係選自喜樹鹼(camptothecin)、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康(irinotecan)、拓樸替康(topotecan)、貝洛替康(bellotecan)、如博替康(rubotecan)及其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物，且該拓樸異構酶II抑制劑係選自阿黴素(doxorubicin)、PNU-159682、倍癌黴素(docarmicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普達非倫毒素(podophyllin toxin)、依託泊苷(etoposide)及其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該RNA聚合酶抑制劑為α-瓢菌素(α-amanitin)或其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：由式I及式II表示之化合物，或該等由式I及式II表示之化合物的醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前驅體： 其中R 1及R 2各自獨立地選自C 1-6烷基及鹵素； R 3係選自H及-CO-CH 2OH； R 4及R 5各自獨立地選自H、鹵素及羥基，或R 4及R 5連接形成5員至6員含氧雜環； R 6係選自氫或-C 1-4伸烷基-NR aR b；且 R 7係選自C 1-6烷基、-C 1-4伸烷基-NR aR b、-C 1-4伸烷基-SiR aR bR c、-SiR aR bR c、-C 1-4伸烷基=N-OR a；其中R a、R b及R c在每次出現時係獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2-C 1-6烷基及-CO-C 1-6烷基；其中視情況地，與相關原子連接的R a及R b形成5員至6員含氮雜環。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； 其中在將該細胞毒性藥物與該連接子連接之後獲得的該細胞毒性藥物之對應殘基為上文所描述之該式中的D。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ， 其中在將該細胞毒性藥物與該連接子連接之後獲得的該細胞毒性藥物之對應殘基為上文所描述之該式中的D。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，D為藉由自該細胞毒性藥物上之-OH、-NH 2或二級胺失去一個H而獲得的單價結構。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該抗體-藥物結合物係選自： ADC A-01 ， ADC A-02 ， ADC A-05 ， ADC A-06 ， ADC A-07 ， ADC A-08 ， ADC A-09 ， ADC A-10 ， ADC A-11 ， ADC A-14 ， ADC A-15 ， ADC A-16 ， ADC A-17 ， ADC A-18 ， ADC A-20 ， ADC A-21 ， ADC A-22 ， ADC A-24 ， ADC A-25 ， ADC A-26 ， ADC A-28 ， ADC A-29 ， ADC A-30 ， ADC A-32 ， ADC A-33 ， ADC A-34 ， ADC B-01 ， ADC B-03 ， ADC B-04 ， ADC B-06 ， ADC B-07 ， ADC C-02 ， ADC C-03 ， ADC C-05 ， ADC C-06 ， ADC C-08 ， ADC C-09 ， ADC C-11 ， ADC C-12 ， ADC C-14 ， ADC C-15 ， ADC C-17 ， ADC C-18 ， ADC C-19 ， ADC C-20 ， ADC C-21 ， ADC C-22 ， ADC C-23 ， ADC C-24 ， ADC C-25 ， ADC C-26 ， ADC C-27 ，及 ADC C-28 ； 其中Ab為如上文所定義之雙特異性抗體或其抗原結合片段； 及 表示該雙特異性抗體或其抗原結合片段中Cys殘基之硫氫基與該抗體-藥物結合物之M的特異性連接模式；且x表示載藥量。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，該雙特異性抗體或其抗原結合片段中之該硫氫基與該抗體-藥物結合物之M經由加成反應或取代反應形成硫醚鍵，以獲得該抗體-藥物結合物。
在抗體-藥物結合物之另一實施例中，Ab為選自由以下組成之群的雙特異性抗體：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B。
本發明進一步提供一種抗體-藥物結合物，其選自由以下組成之群：ADC 07B-A-05、ADC 07B-A-14、ADC 38B-A-14、ADC 49B-A-14、ADC 49B-B-01、ADC 49B-A-05、ADC 41B-A-05、ADC 55B-A-14及ADC 56B-A-14。
本發明進一步提供一種組合物，其包含一種或多種本文所揭示之抗體-藥物結合物。在該組合物之另一實施例中，該組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為1至10。在該組合物之另一實施例中，該組合物之DAR值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、4至5、4至6、4至7、4至8、4至9、4至10、5至6、5至7、5至8、5至9、5至10、6至7、6至8、6至9、6至10、7至8、7至9、7至10、8至9、8至10或9至10。在該組合物之另一實施例中，該組合物之DAR值為3至9。
在該組合物之另一實施例中，該組合物之DAR值為4至8。在該組合物之另一實施例中，該組合物之DAR值為3.0至3.5、3.0至4.0、3.0至4.5、3.0至5.0、3.0至5.5、3.0至6.0、3.5至4.0、3.5至4.5、3.5至5.0、3.5至5.5、3.5至6.0、3.5至6.5、3.5至7.0、3.5至7.5、3.5至8.0、4.0至4.5、4.0至5.0、4.0至5.5、4.0至6.0、4.0至6.5、4.0至7.0、4.0至7.5、4.0至8.0、4.5至5.0、4.5至5.5、4.5至6.0、4.5至6.5、4.5至7.0、4.5至7.5、4.5至8.0、5.0至5.5、5.0至6.0、5.0至6.5、5.0至7.0、5.0至7.5、5.0至8.0、5.5至6.0、5.5至6.5、5.5至7.0、5.5至7.5、5.5至8.0、6.0至6.5、6.0至7.0、6.0至7.5、6.0至8.5、6.5至7.0、6.5至7.5、6.5至8.5、7.0至7.5、7.0至9.0或7.5至9.0。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含一種或多種本文所揭示之抗體-藥物結合物或本文所揭示之組合物以及一種或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。在該醫藥組合物之另一實施例中，該醫藥組合物進一步包含一種或多種選自由以下組成之群的額外醫藥活性劑：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
本發明進一步提供一種藥物組合，其包含第一治療劑及第二治療劑，其中該第一治療劑及該第二治療劑係同時或依序投與；該第一治療劑係選自一種或多種本文所揭示之抗體-藥物結合物或本文所揭示之組合物；且該第二治療劑係選自由以下組成之群：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET抑制劑、VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
本發明進一步提供一種本文所提供之抗體-藥物結合物、本文所提供之組合物、本文所提供之醫藥組合物或本文所提供之藥物組合在製備藥品中的用途，其中該藥品係用於預防個體的與c-MET及/或EGFR有關之疾病、治療該等疾病及/或在治療該等疾病時起輔助作用及/或係用以活體外或在個體體內抑制c-MET及/或EGFR之活性；其中該等與c-MET及/或EGFR有關之疾病係與EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增相關，視情況其中該等與c-MET及/或EGFR有關之疾病包含癌症。
在該用途之另一實施例中，該癌症係選自上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌、前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌及頭頸癌。
在該用途之另一實施例中，該抗體-藥物結合物或醫藥組合物及額外醫藥學活性劑係以組合方式同時、分開或依序投與；其中該額外醫藥學活性劑係選自：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
本發明進一步提供一種用於抑制細胞中c-MET及/或EGFR之活性的方法，該方法包含使該等細胞與本文所提供之抗體-藥物結合物、本文所提供之組合物、本文所提供之醫藥組合物或本文所提供之藥物組合接觸；其中該等細胞為表現c-MET及/或EGFR之細胞。
本發明進一步提供一種用於預防有需要之個體的與c-MET及/或EGFR相關之疾病、治療該疾病及/或在治療該疾病時起輔助作用的方法，該方法包含向該個體投與有效量的本文所提供之抗體-藥物結合物、本文所提供之組合物、本文所提供之醫藥組合物或本文所提供之藥物組合，其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為包含EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增之疾病，視情況其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為癌症。
在該方法之另一實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌及前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。
在該方法之另一實施例中，該方法進一步包含向該個體投與第二療法，該第二療法係選自由以下組成之群：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法(nanotherapy)、病毒療法、輔助療法及其任何組合；視情況其中該第二療法係同時、分開或依序投與。
本發明進一步提供本文所提供之抗體-藥物結合物、本文所提供之組合物、本文所提供之醫藥組合物或本文所提供之藥物組合，其用於預防個體的與c-MET及/或EGFR相關之疾病、治療該疾病及/或在治療該疾病時用作佐劑，其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為包含EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增之疾病，視情況其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為癌症。在另一實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌及前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。在另一實施例中，該方法進一步包含向該個體投與第二療法，該第二療法係選自由以下組成之群：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任何組合；視情況其中該第二療法係同時、分開或依序投與。
術語之定義
在本發明中，除非另有說明，否則本文所用之科學及技術術語具有熟習此項技術者通常所理解之含義。此外，本揭示中使用之細胞培養、生物化學、核酸化學、免疫學實驗室及其他操作程序為對應領域中廣泛使用之常規程序。同時，為了更好地理解本發明，下文提供相關術語之定義及解釋。
如本文所用，術語「抗體」以最廣泛意義使用且包括多種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，限制條件為其展現所需抗原結合活性。舉例而言，免疫球蛋白分子可由兩對多肽鏈構成，每對具有輕鏈(LC)及重鏈(HC)。抗體輕鏈可分類為κ (kappa)及λ (lambda)輕鏈。重鏈可分類為μ (mu)、δ (delta)、γ (gamma)、α (alpha)或ε (epsilon)，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區與恆定區係藉由大約12個或更多個胺基酸之「J」區連接，且重鏈亦含有大約3個或更多個胺基酸的「D」區。各重鏈由重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由三個域(CH1、CH2及CH3)組成。各輕鏈由VL (VL)及輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個域CL組成。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現多種效應功能，諸如介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之相互作用，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及典型補體系統之第一組分(C1q)。VH及VL區亦可細分為具高變性之區域，稱為互補決定區(CDR)，穿插有較為保守之區域，稱為構架區(FR)。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下次序排列的3個CDR及4個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各重鏈/輕鏈對之可變區(VH及VL)分別形成抗原結合位點。胺基酸在區或域中的分配可遵循Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))或Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917以及Chothia等人(1989) Nature 342:878-883之定義。
如本文所用，當提及術語「抗體」時，除非上下文另有明確說明，否則其不僅包括完整抗體，而且包括抗體之抗原結合片段。
術語「抗體」進一步包括其中重鏈恆定域可包含C端離胺酸或不具有C端離胺酸或C端甘胺酸-離胺酸二肽的實施例。該術語進一步包括其中抗體可變域之N端胺基酸已環化成焦麩胺酸的實施例。因此，在包含本文所揭示之抗體的組合物中，其中之各種抗體可獨立地包含C端離胺酸、不具有C端離胺酸、不具有C端甘胺酸-離胺酸及/或包含N端麩醯胺酸或麩胺酸或N端胺基酸環化成焦麩胺酸。
如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」係指抗體之可變區中負責抗原結合的胺基酸殘基。此等胺基酸殘基之確切邊界可根據此項技術中已知的各種編號系統界定，例如根據AbM編號系統(Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modeling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)、MacCallum編號系統(MacCallum等人, (1996) J Mol Biol 262: 732-745，亦參見例如Martin A. 「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,) in Antibody Engineering, Kontermann及Dübel編,第31章,第422-439頁, Springer-Verlag, Berlin (2001))、AHo編號系統(Honegger及Plückthun, A., J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001))或IMGT編號系統(Lefranc等人, Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003)。對於給定抗體，熟習此項技術者將容易鑑別由各編號系統定義之CDR。此外，不同編號系統之間的對應關係為熟習此項技術者所熟知(參見例如Lefranc等人, Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003)。
在本發明中，抗體或其抗原結合片段中包含之CDR可根據此項技術中已知之各種編號系統(諸如Kabat、Chothia、IMGT或AbM編號系統)確定。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段中包含之CDR係藉由Chothia編號系統確定。
揭示於www.bioinf.org.uk: Prof. Andrew C.R. Martin's Group中且複製在下文中的以下一般規則可用於定義抗體序列中之CDR，該抗體序列包括與構成抗原中與抗體結合之抗原決定基的胺基酸特異性相互作用的胺基酸。在極少數情況下，此等一般恆定的特徵不會出現；然而，Cys殘基為最保守的特徵。
環 Kabat AbM Chothia 1 Contact 2 IMGT
L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L27--L32
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L50--L52
L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 L89--L97
H1 H31--H35B (Kabat編號) 3 H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B H26--H35B
H1 H31--H35 (Chothia編號) H26--H35 H26--H32 H30--H35 H26--H33
H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58 H51--H56
H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 H93--H102
1：此等編號方案中的一些(尤其對於Chothia環)視所查閱的個別出版物而有所變化。 2: 編號方案中之任一者可用於此等CDR定義，除了Contact編號方案使用Chothia或Martin (增強型Chothia)定義。 3: 當使用Kabat編號規約進行編號時，視Chothia CDR-H1環之長度而定，環之末端在H32與H34之間變化。(此係因為Kabat編號方案在H35A及H35B處進行插入。) ●    若H35A及H35B均不存在，則環在H32處結束 ●    若僅存在H35A，則環在H33處結束 ●    若H35A及H35B皆存在，則環在H34處結束
VH之整個胺基酸序列通常根據Kabat編號，而可變區內之三個CDR可根據前述編號方案中之任一者來定義。在特定實施例中，VH中胺基酸位置之編號可為依序的，自胺基酸位置1開始且依序持續至序列之末端，或係根據Kabat。除非另有規定，否則本文中之VH及VL中的胺基酸位置係根據依序編號定義。
重鏈恆定域中之胺基酸位置的編號可為依序的，自胺基酸位置1開始且依序持續至序列之末端，或係根據Eu編號。IgG1重鏈恆定域胺基酸序列具有330個胺基酸，依序編號為1至330。根據Eu編號的相應序列以位置編號118開始且以位置編號447結束。除非另有規定，否則本文中之重鏈及輕鏈中的胺基酸位置係根據依序編號定義。
如本文所用，術語「構架區」或「FR」殘基係指抗體可變區中除如上文所定義之CDR殘基以外的彼等胺基酸殘基。
術語「抗體」不限於產生抗體之任何特定方法。此抗體包括例如重組抗體、單株抗體及多株抗體。該等抗體可具有不同同型，例如IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。
如本文所用，術語「雙特異性抗體」或「BsAb」係指對兩種不同抗原(或抗原決定基)具有結合特異性的抗體，其包括針對不同抗原(或抗原決定基)之結合特異性，例如兩個具有結合特異性之抗原結合域，從而能夠結合於兩個不同結合位點及/或目標分子。雙特異性抗體之各抗原結合域可獨立地選自全長抗體(例如IgG抗體)或其抗原結合片段(例如Fv、Fab、scFab或scFv)。在一些情況下，個別抗原結合域係藉由肽連接子連接。
如本文所用，術語「Fv片段」意謂由抗體之單個臂的VL及VH域組成之抗體片段。Fv片段一般被視為可形成完整抗原結合位點的最小抗體片段。一般認為六個CDR賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使可變區(諸如僅含有三個對抗原具特異性之CDR的Fd片段)可識別及結合抗原，但其親和力可能低於完整結合位點之親和力。
如本文所用，術語「Fc片段」意謂由抗體之第一重鏈的第二及第三恆定區與抗體片段之第二重鏈的第二及第三恆定區的雙硫鍵結合形成的片段。抗體之Fc片段具有許多不同功能，但不參與抗原結合。
如本文所用，術語「scFv」係指含有藉由連接子連接之VL及VH域的單一多肽鏈。此等scFv分子可具有一般結構：NH 2-VL-接點-VH-COOH或NH 2-VH-接點-VL-COOH。適合之先前技術肽連接子由重複GGGGS胺基酸序列(SEQ ID NO: 57)或其變異體(例如胺基酸序列(GGGGS) 4(SEQ ID NO: 58))組成，但亦可使用其變化形式。在一些情況下，scFv之VH與VL之間亦可存在雙硫鍵。
如本文所用，術語「Fab片段」意謂由VL、VH、CL及CH1域組成的抗體片段，其一般由一個含有VL及CL之肽鏈及另一個含有VH及CH1之肽鏈組成，然而，熟習此項技術者應理解Fab域可根據上文所描述之天然定向排列，但亦可含有促進正確VH及VL配對的域取代或交換(例如呈CrossMab形式之域交換)。術語「scFab」係指含有VL、VH、CL及CH1域之單一多肽鏈，其中相鄰域視情況藉由連接子連接。在典型結構中，scFab含有自N端至C端如下的單一多肽鏈：(1) VL、CL、VH及CH1，其中CL及VH通常經由肽連接子(例如柔性肽連接子)連接，或(1) VH、CH1、VL及CL，其中CH1及VL通常經由肽連接子(例如柔性肽連接子)連接。
如本文所用，術語「單株抗體」及「mAb」具有相同意義且可互換地用於指代一組高度同源抗體分子或其片段(亦即一組除可自發地出現之天然突變以外一致的抗體分子)中之一者。單株抗體對抗原上之單一抗原決定基具有高度特異性。與單株抗體相反，多株抗體通常係指來自含有至少2種或更多種不同抗體之一組抗體的抗體或其片段，該等不同抗體通常識別抗原上之不同抗原決定基。另外，修飾語「單株」僅指示抗體之特徵在於係自高度同源抗體群體獲得且不可理解為需要任何特定方法來製備該抗體。
如本文所用，術語「CrossMab」係指構築雙特異性抗體之方法，其能夠藉由交換雙特異性抗體之一半的抗原結合片段(Fab)內之重鏈與輕鏈域來使輕鏈與其同源重鏈正確締合。此「交換(crossover)」保留抗原結合親和力，但使兩個臂不同，使得不會再發生輕鏈錯配。三種可能的「CrossMab」型式為：CrossMab Fab，其係指雙特異性抗體之一半的完整VH-CH1與VL-CL域的位置交換(crossover或exchange)；CrossMab VH-VL，其係指雙特異性抗體之一半的僅VH與VL域的位置交換；及CrossMab CH1-CL，其係指雙特異性抗體之一半的Fab區內之CH1與CL域的位置交換。CrossMab抗體已描述或主張於WO2009080252、WO2009080253、WO2009080251、WO2009080254、WO2010136172、WO2010145792及WO2013026831中。術語「CrossMab」抗體為此項技術中一般公認的；參見例如Brinkmann及Kontennann, MAbs 9(2): 182-212 (2017)；Kontermann及Brinkmann, Drug Discovery Today 20(7):838-846 (2015)；Schaefer等人, PNAS, 108 11187-1191 (2011)；Klein等人, MAbs 8(6):1010-1020 (2016)；及Klein等人, MAbs 4(6):653-663 (2012)。
如本文所用，術語「特異性結合」係指兩個分子之間的非隨機結合反應，諸如抗體與其所針對之抗原之間的反應。特異性結合相互作用之強度或親和力可表示為相互作用之平衡解離常數(KD)或半數效應濃度(EC 50)。
兩個分子之間的特異性結合特性可使用此項技術中已知之方法來測定。一種方法涉及量測抗原結合位點/抗原複合體形成及解離之速率。「結合速率常數」(k a或k on)及「解離速率常數」(k dis或k off)皆可根據濃度以及實際締合及解離速率來計算(參見Malmqvist M, Nature, 1993, 361:186-187)。k dis/k on比等於解離常數KD(參見Davies等人, Annual Rev Biochem, 1990; 59:439-473)。KD、k on及k dis值可藉由任何有效方法量測。在某些實施例中，解離常數可使用生物發光干涉測量術(例如ForteBio Octet法)量測。或者，表面電漿子共振技術(例如Biacore)或Kinexa可用於量測解離常數。
如本文所用，術語「載體」係指可插入聚核苷酸的核酸遞送媒劑。當載體可表現由插入聚核苷酸編碼之蛋白質時，載體稱為表現載體。載體可經由轉化、轉導或轉染引入至宿主細胞中，使得其攜帶之基因物質元件可表現於宿主細胞中。載體為熟習此項技術者所熟知，包括但不限於：質體；噬菌質體(phagemid)；黏質體(cosmid)；人工染色體，諸如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生之人工染色體(PAC)；噬菌體，諸如λ噬菌體或M13噬菌體；及動物病毒等。可用作載體之動物病毒包括但不限於反轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(諸如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳突狀瘤病毒及多瘤病毒(諸如SV40)。載體可含有多種表現控制元件，包括但不限於啟動子序列、轉錄起始序列、強化子序列、選擇元件及報導基因。另外，載體亦可含有複製起始位點。
表現載體及選殖載體含有使得載體能夠在一個或多個所選宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在選殖載體中，此序列為使得載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製的序列，且其包括複製起點或自主複製序列。如本文所用之術語「表現載體」係指含有重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸含有表現控制序列可操作地連接至待表現之核苷酸序列。表現載體含有足夠的順式作用元件用於表現；用於表現之其他元件可由宿主細胞或活體外表現系統提供。表現載體包括此項技術中已知的所有載體，諸如黏質體、質體(例如裸質體或脂質體中所含的質體)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用，術語「宿主細胞」係指可用以引入載體的細胞，其包括但不限於原核細胞，諸如大腸桿菌( Escherichia coli)或枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)；真菌細胞，諸如酵母細胞或曲黴菌屬( Aspergillus)；昆蟲細胞，諸如S2、果蠅( Drosophila)細胞或Sf9；或動物細胞，諸如纖維母細胞、NS0細胞、Vero細胞、希拉細胞(Hela cell)、COS細胞、CHO細胞(諸如CHO-K1、CHO-S、CHO DXB11、ExpiCHO或CHO DG44細胞)、ExpiCHO細胞、HEK293細胞、Expi293細胞、BHK細胞及MDCKII細胞等。
如本文所用，術語「一致性」用以指代兩個多肽之間或兩個核酸之間的序列匹配。當所比較的兩個序列中的位置被相同鹼基或胺基酸單體次單元佔據，例如兩個DNA分子中各者之位置被腺嘌呤佔據，或兩個多肽中各者之位置被離胺酸佔據時，則該等分子在該位置處一致。兩個序列之間的「一致性百分比」為兩個序列共有之匹配位置數目除以所比較位置數目×100的函數。舉例而言，若兩個序列之10個位置中的6個匹配，則兩個序列為60%一致的。舉例而言，DNA序列CTGACT及CAGGTT共有50%一致性(總共6個位置中的3個位置匹配)。通常，比較係在比對兩個序列以產生最大一致性時進行。此等比對可使用例如Needleman等人(1970) J. Mol. Biol. 48：443-453之方法實現，該方法可藉由諸如Align程式(DNAstar, Inc.)之電腦程式方便地執行。已併入ALIGN程式(2.0版)中的E. Meyers及W. Miller (Comput. The algorithm of Appl Biosci., 4:11-17 (1988))之演算法亦可用以藉由使用PAM120權數殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。或者，Needleman演算法已整合至GCG套裝軟體之GAP程式(可在www.gcg.com獲得)中且可用以藉由使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以間隙權數16、14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、3、4、5或6測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。本揭示中涉及之二十個習知胺基酸已遵循習知用途製備。參見例如Immunology-A Synthesis (第2版, E. S. Golub及D. R. Gren編, Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))，其以引用之方式併入本文中。在本揭示中，術語「多肽」及「蛋白質」具有相同含義且可互換使用。且在本揭示中，胺基酸一般由此項技術中熟知的單字母及三字母縮寫表示。舉例而言，丙胺酸可由A或Ala表示。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑」係指在藥理學上及/或生理學上與個體及活性成分相容的載劑及/或賦形劑。其為此項技術中所熟知(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Gennaro AR編,第19版. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995)，且包括但不限於：pH調節劑、界面活性劑、佐劑、離子強度增強劑、稀釋劑、滲透壓維持劑、吸收延遲劑、防腐劑。舉例而言，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液。界面活性劑包括但不限於陽離子、陰離子或非離子型界面活性劑，諸如Tween-80。離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。防腐劑包括但不限於各種抗細菌及抗真菌劑，諸如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。滲透壓維持劑包括但不限於糖、NaCl以及其類似物。吸收延遲劑包括但不限於單硬脂酸酯及明膠。稀釋劑包括但不限於水、水性緩衝液(諸如緩衝鹽水)、醇及多元醇(諸如甘油)以及其類似物。穩定劑具有熟習此項技術者一般理解之含義，且穩定劑可使醫藥中之活性成分的所需活性穩定，包括但不限於麩胺酸鈉、明膠、SPGA、糖(諸如山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、乳糖、聚葡萄糖或葡萄糖)、胺基酸(諸如麩胺酸、甘胺酸)、蛋白質(諸如乾乳清、白蛋白或酪蛋白)或其降解產物(諸如乳白蛋白水解產物)等。
如本文所用，術語「DAR」或「藥物抗體比」或「藥物-抗體結合比」在本文可互換地使用，係指連接至組合物中存在之抗體的連接子/有效負載部分的平均數。對於包含本揭示之ADC的組合物，組合物之DAR為DAR平均值(該組合物中存在的所有個別ADC分子的連接子-有效負載部分)，且此平均值表示為整數或小數。因此，在一些實施例中，對於包含本揭示之ADC的組合物，組合物之DAR為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、4至5、4至6、4至7、4至8、4至9、4至10、5至6、5至7、5至8、5至9、5至10、6至7、6至8、6至9、6至10、7至8、7至9、7至10、8至9、8至10或9至10之整數或小數。在額外實施例中，對於包含本揭示之ADC的組合物，組合物之DAR為3.0至3.5、3.0至4.0、3.0至4.5、3.0至5.0、3.0至5.5、3.0至6.0、3.5至4.0、3.5至4.5、3.5至5.0、3.5至5.5、3.5至6.0、3.5至6.5、3.5至7.0、3.5至7.5、3.5至8.0、4.0至4.5、4.0至5.0、4.0至5.5、4.0至6.0、4.0至6.5、4.0至7.0、4.0至7.5、4.0至8.0、4.5至5.0、4.5至5.5、4.5至6.0、4.5至6.5、4.5至7.0、4.5至7.5、4.5至8.0、5.0至5.5、5.0至6.0、5.0至6.5、5.0至7.0、5.0至7.5、5.0至8.0、5.5至6.0、5.5至6.5、5.5至7.0、5.5至7.5、5.5至8.0、6.0至6.5、6.0至7.0、6.0至7.5、6.0至8.5、6.5至7.0、6.5至7.5、6.5至8.5、7.0至7.5、7.0至9.0或7.5至9.0之整數或小數。如上文所用之術語「組合物」應理解為涵蓋醫藥組合物。DAR平均值可藉由諸如UV光譜、質譜、ELISA檢定法、輻射量測法、疏水相互作用層析(HIC)、電泳及HPLC之各種習知手段測定。
如本文所用，術語「預防」係指一種為防止或延遲個體之疾病或病況或症狀(例如腫瘤)之出現而採取的方法。如本文所用，術語「治療」係指為獲得有益或所需臨床結果而採取的方法。出於本揭示之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於減輕症狀、降低疾病程度、使疾病狀態穩定(亦即無惡化)、延遲或減緩疾病進展、改善或減輕疾病病狀之症狀以及緩解症狀(部分或完全緩解)，無論可偵測抑或不可偵測。另外，「治療」亦可指代與不接受治療之預期存活期相比延長存活期。
如本文所用，術語「個體」係指哺乳動物，諸如靈長類哺乳動物，諸如人類。在某些實施例中，個體(例如人類)患有腫瘤，或具有罹患本文所描述之疾病之風險。
如本文所用，術語「有效量」係指足以達成或至少部分達成所需作用之量。舉例而言，預防有效量係指足以防止或延遲疾病(例如腫瘤)之出現的量；治療有效量係指足以治癒或至少部分預防現有疾病或其併發症的量。測定此等有效量完全在熟習此項技術者之能力範圍內。舉例而言，針對治療用途的有效量將視待治療之疾病的嚴重程度、患者之自身免疫系統的整體狀態、患者之一般狀況(諸如年齡、體重及性別)、投與藥物之方式、同時投與之其他治療等而定。
如本文所用，術語「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc域(原生序列Fc域或胺基酸序列變異Fc域)且隨抗體之Fc域變化的彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括但不限於：Fc受體結合親和力、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞表面受體(例如B細胞受體)結合、B細胞活化、細胞介素分泌、抗體及抗原-抗體複合體之半衰期/清除率等。改變抗體之效應功能的方法為此項技術中已知，例如藉由在Fc域中引入突變。
如本文所用，術語「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)」係指Ig與細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)相互作用，從而允許此等細胞毒性效應細胞特異性結合於抗原所連接之目標細胞，隨後藉由分泌細胞毒素殺死目標細胞的細胞毒性形式。
如本文所用，組合療法包括本揭示之雙特異性抗體或醫藥組合物與第二療法之一種或多種額外活性治療劑(例如化學治療劑)或其他防治性或治療性治療方式(例如放射療法)的組合。
在此等組合療法中，各種活性劑通常具有不同之互補作用機制，且組合療法可產生協同效應。組合療法包括影響免疫反應(例如增強或活化反應)之治療劑及影響(例如抑制或殺死)腫瘤/癌細胞之治療劑。組合療法降低抗藥性癌細胞發展之可能性。組合療法可允許降低一種或多種藥劑之劑量，以減少或消除與一種或多種藥劑相關之不良作用。此等組合療法可對潛在疾病、病症或病況具有協同治療性或預防性作用。
如本文所用，「組合」包括可分開投與，例如分開調配以供分開投與(例如可提供於套組中)的療法，以及可在單一調配物(亦即「共調配物」)中一起投與的療法。在某些實施例中，本揭示之雙特異性抗體可依序投與。在其他實施例中，雙特異性抗體可同時投與。本揭示之雙特異性抗體可與至少一種其他(活性)藥劑以任何組合使用。
術語「癌症」及「腫瘤」可互換使用且係指以體內異常細胞不受控生長為特徵的一大組疾病。不受調節之細胞分裂可引起惡性腫瘤或細胞形成，該等腫瘤或細胞侵入相鄰組織且可經由淋巴系統或血流轉移至身體遠端部分。癌症包括良性及惡性癌症以及休眠腫瘤或微小轉移灶。癌症亦包括血液惡性病。
術語「烷基」係指藉由自直鏈或分支鏈烴基移除一個氫原子而獲得的基團，諸如「C 1-20烷基」、「C 1-10烷基」、「C 1-6烷基」、「C 1-4烷基」、「C 1-3烷基」等。具體實例包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、異己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
術語「伸烷基」係指藉由自直鏈或分支鏈烴基移除2個氫原子而獲得的基團，諸如「C 1-20伸烷基」、「C 1-10伸烷基」、「C 3-10伸烷基」、「C 5-8伸烷基」、「C 1-6伸烷基」、「C 1-4伸烷基」、「C 1-3伸烷基」等。具體實例包括但不限於：亞甲基、伸乙基、1,3-伸丙基、1,4-伸丁基、1,5-伸戊基或1,6-伸己基等。
術語「伸烯基」係指藉由自含有至少一個碳碳雙鍵之直鏈或分支鏈烴基失去兩個氫原子而獲得的二價基團，包括例如「C 2-20伸烯基」、「C 3-10伸烯基」、「C 5-8伸烯基」等。實例包括但不限於：伸乙烯基、1-伸丙烯基、2-伸丙烯基、1-伸丁烯基、2-伸丁烯基、1,3-伸丁二烯基、1-伸戊烯基、2-伸戊烯基、3-伸戊烯基、1,3-伸戊二烯基、1,4-伸戊二烯基、1-伸己烯基、2-伸己烯基、3-伸己烯基、1,4-伸己二烯基等。
術語「伸炔基」係指藉由自含有至少一個碳-碳參鍵之直鏈或分支鏈烴基失去兩個氫原子而獲得的二價基團。包括例如「C 2-20伸炔基」、「C 3-10伸炔基」、「C 5-8伸炔基」等。實例包括但不限於：伸乙炔基、1-伸丙炔基、2-伸丙炔基、1-伸丁炔基、2-伸丁炔基、1,3-伸丁二炔基、1-伸戊炔基、2-伸戊炔基、3-伸戊炔基、1,3-伸戊二炔基、1,4-伸戊二炔基、1-伸己炔基、2-伸己炔基、3-伸己炔基、1,4-伸己二炔基等。
術語「脂族雜環」係指含有至少一個選自N、O及S之環成員的飽和或部分飽和環狀結構。具體實例包括但不限於5員至6員脂族雜環、5員至6員含氮脂族雜環、5員至6員含氧脂族雜環等，諸如四氫呋喃、吡咯啶、哌啶、四氫哌喃等。
術語「雜芳族環」係指含有至少一個選自N、O及S之環成員的芳族環狀結構。具體實例包括但不限於5員至6員芳族雜環、5員至6員含氮芳族雜環、5員至6員含氧芳族雜環等，諸如呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、異噻唑、噻二唑、噁唑、異噁唑、噁二唑、咪唑、吡唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、吡啶、嘧啶、嗒嗪、吡嗪、1,2,3-三嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4,5-四嗪等。
術語「芳族環系統」係指含有至少一個芳族環(諸如苯環等)或雜芳族環(諸如嘧啶環等)，其中兩個或更多個芳族環及/或雜芳族環的單環或多環系統可形成稠環或藉由單鍵連接(諸如二嘧啶基苯基等)。芳族環系統可為二價或更高價(諸如三價或四價)，諸如5員至20員芳族環系統。 縮寫
本文所用之縮寫具有以下含義：
縮寫 含義
CDR 免疫球蛋白可變區中之互補決定區
FR 抗體構架區：抗體可變區中除CDR殘基外之胺基酸殘基
VH 抗體重鏈可變區
VL 抗體輕鏈可變區
IgG 免疫球蛋白G
IMGT Lefranc等人提出的基於The international ImMunoGeneTics information system® (IMGT) 的編號系統可見於Lefranc等人, Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003中。
Kabat Elvin A. Kabat提出之免疫球蛋白比對及編號系統(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)。
Chothia Chothia等人提出之免疫球蛋白編號系統為用於基於結構環區位置鑑別CDR區邊界的經典規則(參見例如Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人(1989) Nature 342:878-883)。
AbM CDR之定義來自Martin之相關研究(Martin ACR、Cheetham JC、Rees AR (1989) Modeling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86:9268 - 9272)。
mAb 單株抗體
EC 50 產生50%功效或結合的濃度
IC 50 產生50%抑制的濃度
ELISA 酶聯免疫吸附檢定法
PCR 聚合酶連鎖反應
HRP 辣根過氧化酶
K D 平衡解離常數
Ka 結合速率常數
Kd 解離速率常數
ADCC 抗體依賴性細胞介導之細胞毒性
CDC 補體依賴性細胞毒性
FACS 流動式細胞測量術技術
CDR-H1 免疫球蛋白重鏈可變區中之互補決定區1
CDR-H2 免疫球蛋白重鏈可變區中之互補決定區2
CDR-H3 免疫球蛋白重鏈可變區中之互補決定區3
CDR-L1 免疫球蛋白輕鏈可變區中之互補決定區1
CDR-L2 免疫球蛋白輕鏈可變區中之互補決定區2
CDR-L3 免疫球蛋白輕鏈可變區中之互補決定區3
縮寫 含義 縮寫 含義
HATU 六氟磷酸N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲 HOBt 1-羥基苯并三唑
DIPEA 二異丙基乙胺 EDCI 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽
TFA 三氟乙酸 DMF N,N-二甲基甲醯胺
Pd/C 鈀碳 DMTMM 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽
NBS N-溴丁二醯亞胺 IPA 異丙醇
NaIO 4 過碘酸鈉 RuCl 3.H 2O 三氯化釕水合物
XPhos Pd G3 甲磺酸(2-二環己基膦-2',4',6'-三-異丙基-1,1'-聯苯基)(2'-胺基-1,1'-聯苯基-2-基)鈀(II) LiOH.H 2O 水合氫氧化鋰
K 3PO 4 磷酸鉀 m-CPBA 間氯過氧苯甲酸
THF 四氫呋喃 DMSO 二甲亞碸
DCM 二氯甲烷 MeOH 甲醇
HPLC HPLC LC-MS LC/MS
TCEP (參(2-羧乙基)膦 Na 2HPO 4 磷酸二鈉
EDTA 乙二胺四乙酸 PB 磷酸鹽緩衝液
DAR 藥物負載比
抗體-藥物結合物(ADC)
在一個範疇中，本揭示提供一種ADC，其具有式Ab-[M-L-E-D] x所示之結構，其中：
Ab為雙特異性抗體或雙特異性其抗原結合片段，包含特異性結合c-MET之第一抗原結合域及特異性結合EGFR之第二抗原結合域；
M為連接至該雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段之連接子位點；
L為連接該等連接子位點M與E之結構片段；
E為連接L與D之結構片段；
D為細胞毒性藥物片段；且
x經選擇為1至10之任何整數。 ADC之抗體
在某些實施例中，ADC之雙特異性抗體為對EGFR及c-MET兩者具有高親和力的雙特異性抗體，其可特異性地識別/結合EGFR及c-MET且可阻斷EGF與EGFR之結合及/或HGF與c-MET之結合，因此同時阻斷EGFR及/或c-MET之下游信號傳導路徑，從而引起細胞增殖抑制。
在一些實施例中，雙特異性抗體之第一抗原結合域包含第一輕鏈可變區(VL)及第一重鏈可變區(VH)，且第一VL及第一VH共同形成能夠特異性結合於c-MET之域；且第二抗原結合域包含第二VL及第二VH，且第二VL及第二VH一起形成能夠特異性結合於EGFR之域。
在某些實施例中，雙特異性抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域各自獨立地選自scFv、Fab及scFab。
除非另有明確說明，否則Fab域可根據其原生定向排列，或可包含促進正確VH及VL配對之域取代或交換(例如呈CrossMabs形式之域交換)。
CrossMab為一種用於防止輕鏈及重鏈之錯配的方法，參見美國專利US9266967B2，其以全文引用之方式併入本文中。此方法主要利用抗體之相同部分彼此排斥，亦即VH與VH彼此排斥，CH1與CH1彼此排斥，CL與CL彼此排斥，且VL與VL彼此排斥的原理。防止輕鏈錯配之目的係藉由雙特異性抗體中一個Fab之重鏈與輕鏈的區域互換(例如輕鏈CL-VL與重鏈CH1-VH交換，VL與VH互換，或CH與CL互換)來實現。
因此，在某些實施例中，CrossMab型式之域交換係選自：
CrossMab Fab：其中在抗體之兩條重鏈之一的Fab中，其抗體輕鏈CL-VL與Fab之抗體重鏈CH1-VH互換；
CrossMab VH-VL：其中在抗體之兩條重鏈之一的Fab中，抗體Fab之VL與VH互換；及
CrossMab CH1-CL：其中在抗體之兩條重鏈之一的Fab中，抗體Fab之CH與CL互換。
在某些實施例中，雙特異性抗體進一步包含Fc域(Fc)。在某些實施例中，Fc域包含第一Fc域單體及第二Fc域單體。在某些實施例中，第一及第二Fc域單體各自獨立地包含一個或多個能夠相較於第一及第二Fc域單體之同二聚合更促進其異二聚合的胺基酸修飾。
在某些實施例中，Fc域包含有包含能夠形成杵結構之胺基酸修飾的第一Fc域單體及包含能夠形成臼結構之胺基酸的第二Fc域單體，該臼結構對應於第一Fc域單體中之杵結構之位置，其中臼結構可與杵結構配對形成異二聚Fc域(Fc異二聚體)。
熟習此項技術者可容易地理解，臼結構可與杵結構配對形成「臼包杵(KIH)結構」。KIH結構係如下形成：經由胺基酸取代在兩個Fc域單體之CH3域中的對應位置處引入可形成「杵」結構及「臼」結構的胺基酸修飾，以便形成兩個僅可形成具有臼包杵結構之異二聚Fc域的Fc域單體。歸因於「杵」結構與「臼」結構之間的互引力及「杵」結構與「杵」結構之間的互斥力，用於藉由靶向單體之間的特定相互作用界面來減少雙特異性抗體中之重鏈錯配的方法(參見Ridgway等人, Protein Eng., 9:617-621(1996)；WO2006028936；其完整本文以引用之方式併入本文中)因此可有效地減少雙特異性抗體中之重鏈錯配。
促進異二聚體形成之胺基酸修飾已揭示於WO9850431中，該案揭示一種用於產生Fc域單體異二聚體之KIH方法。在KIH方法中，異二聚體對之一個Fc域單體包含胺基酸取代，從而產生自Fc域單體之表面向外延伸之突起(杵)，該突起與異二聚體對之另一Fc域單體中之適當胺基酸取代產生之臼相適配，此相較於同二聚體形成更促進異二聚體形成。胺基酸取代之實例包括對第一Fc域單體中之S354C:T366W胺基酸取代以形成杵，且包括第二Fc域單體中之Y349C:T366S:L368A:Y407V胺基酸取代以形成臼(胺基酸編號根據EU索引)，其中第一及第二Fc域單體形成異二聚體對。WO2014084607揭示KIH，其中Fc異二聚體包含第一Fc域單體及第二Fc域單體，該第一Fc域單體包含K409W胺基酸取代以形成杵，該第二Fc域單體包含D399V及F405T胺基酸取代以形成臼(胺基酸編號根據EU索引)，其中第一及第二Fc域單體形成異二聚體對。WO2013063702揭示KIH，其中Fc異二聚體包含第一Fc域單體及第二Fc域單體，該第一Fc域單體包含位置T350、L351、F405及Y407處之胺基酸修飾，該第二Fc域單體包含位置T350、T366、K392及T394處之胺基酸修飾(胺基酸編號根據EU索引)，其中第一及第二Fc域單體形成異二聚體對。
在某些實施例中，Fc域單體來源於人類免疫球蛋白之Fc且經修飾以提供一對能夠形成異二聚體對之Fc域單體。舉例而言，第一Fc域單體之胺基酸序列在其特定區域中經修飾以提供杵結構，且第二Fc域單體之胺基酸序列在對應區中經修飾以提供能夠接收第一Fc域單體上之杵結構的臼結構，從而使得第一及第二Fc域單體能夠形成異二聚體對，同時防止第一及第二Fc域單體形成同二聚體對。在某些實施例中，人類免疫球蛋白為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些實施例中，Fc域單體包含一個或多個形成杵結構之修飾，其中該一個或多個修飾包含S354C及/或T366W胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案。在某些實施例中，Fc域單體包含S354及T366W胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案。在某些實施例中，Fc域單體包含一個或多個形成臼結構之修飾，其中該一個或多個修飾包含Y349C、T366S、L368A及/或Y407V胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案。在某些實施例中，Fc域單體包含Y349C、T366S、L368A及Y407V胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案。
在某些實施例中，與野生型Fc域相比，Fc域單體在呈Fc異二聚體形式時進一步呈現改變之效應功能(例如增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性)。改變之效應功能可藉由例如構成Fc異二聚體之Fc域單體的突變或化學修飾引入。
在其他實施例中，第一及第二Fc域單體進一步包含一個或多個降低或消除Fc域之效應功能的胺基酸取代。在特定實施例中，第一及第二Fc域單體進一步包含：(i) E233A及L235A (EALA)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(ii) L234A及L235A (LALA)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(iii) L234A L235A D265S (LALADS)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(iv) L234A L235A P329G (LALAPG)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(v) L235E (LE)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(vi) D265A (DS)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(vii) D265A N297G (DANG)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(viii) N297X胺基酸取代，其中X為除N外之任何胺基酸，其中編號係根據EU編號方案；(ix) N297A/D356E/L358M (NADELM)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；或(x) D356E L358M (DELM)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49或51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50或52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自連接至Fc異二聚體之第一及第二Fc域單體中之一者。
在某些實施例中，第一抗原結合域連接至第一Fc域單體，且第二抗原結合域連接至第二Fc域單體；或第一抗原結合域連接至第二Fc域單體，且第二抗原結合域連接至第一Fc域單體。
本文所提供之ADC之雙特異性抗體之抗原結合域的個別CDR可根據此項技術中已知之任何CDR編號方案確定。
在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體之抗原結合域包含SEQ ID NO: 15、17及59中之任一者中所示的VL胺基酸序列之輕鏈CDR 1 (CDR-L1)、CDR-L2及/或CDR-L3，如藉由Kabat編號方案所確定。在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 16、18及60中之任一者中所示的VH胺基酸序列之重鏈CDR 1 (CDR-H1)、CDR-H2及/或CDR-H3，如藉由Kabat編號方案所確定。
在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 15、17及59中之任一者中所示的VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，如藉由Chothia編號方案所確定。在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 16、18及60中之任一者中所示的VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，如藉由Chothia編號方案所確定。
在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 15、17及59中之任一者中所示的VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，如藉由MacCallum編號方案所確定。在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 16、18及60中之任一者中所示的VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，如藉由MacCallum編號方案所確定。
在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 15、17及59中之任一者中所示的VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，如藉由IMGT編號方案所確定。在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 16、18及60中之任一者中所示的VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，如藉由IMGT編號方案所確定。
在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 15、17及59中之任一者中所示的VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，如藉由AbM編號方案所確定。在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 16、18及60中之任一者中所示的VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，如藉由AbM編號方案所確定。
在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 15、17及59中之任一者中所示的VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3，如藉由AHo編號方案所確定。在某些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體的抗原結合域包含SEQ ID NO: 16、18及60中之任一者中所示的VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3，如藉由AHo編號方案所確定。
在某些實施例中，本文提供之ADC之雙特異性抗體之抗原結合域的個別CDR各自獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM編號方案中之一者確定，或藉由抗原結合域之結構分析確定，其中結構分析鑑別出可變區中預測與c-MET或EGFR之抗原決定基區域接觸的殘基。
在某些實施例中，本揭示提供一種ADC，其包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域，其中第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 17或59中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 18或60中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，及/或其中第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 15中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 16中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，其中各CDR獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM編號方案中之一者確定，或藉由雙特異性分子之結構分析確定，其中結構分析鑑別出可變區中預測與c-MET或EGFR之抗原決定基區域接觸的殘基。
在某些實施例中，本揭示提供一種ADC，其包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域，其中第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 17中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 18中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，及/或其中第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 15中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 16中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，其中各CDR獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、Aho或AbM編號方案中之一者確定，或藉由雙特異性分子之結構分析確定，其中結構分析鑑別出可變區中預測與c-MET或EGFR之抗原決定基區域接觸的殘基。
在某些實施例中，本揭示提供一種ADC，其包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域，其中第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 59中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 60中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，及/或其中第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 15中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 16中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，其中各CDR獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM編號方案中之一者確定，或藉由雙特異性分子之結構分析確定，其中結構分析鑑別出可變區中預測與c-MET或EGFR之抗原決定基區域接觸的殘基。
在某些實施例中，本揭示提供一種ADC，其包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域，其中第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 17中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 60中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，及/或其中第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 15中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 16中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，其中各CDR獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM編號方案中之一者確定，或藉由雙特異性分子之結構分析確定，其中結構分析鑑別出可變區中預測與c-MET或EGFR之抗原決定基區域接觸的殘基。
在某些實施例中，本揭示提供一種ADC，其包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域，其中第一抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 59中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 18中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，及/或其中第二抗原結合域包含有包含SEQ ID NO: 15中所示之VL胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列的VL及包含SEQ ID NO: 16中所示之VH胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列的VH，其中各CDR獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM編號方案中之一者確定，或藉由雙特異性分子之結構分析確定，其中結構分析鑑別出可變區中預測與c-MET或EGFR之抗原決定基區域接觸的殘基。
在本文所提供之ADC之某些實施例中，ADC之雙特異性抗體之第一VL包含：
包含SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由Kabat編號系統定義；
包含SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由Chothia編號系統定義；
包含SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或
包含SEQ ID NO: 35中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 37中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由IMGT編號系統定義；
及/或
ADC之雙特異性抗體之第一VH包含：
包含SEQ ID NO: 39中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 43中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由Kabat編號系統定義；
包含SEQ ID NO: 40中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 44中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由Chothia編號系統定義；
包含SEQ ID NO:42中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 46中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或
包含SEQ ID NO: 41中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 45中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 48中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由IMGT編號系統定義。
在某些實施例中，第一VL包含與SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL包含SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL由SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第一VH包含與SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH由SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第一VL包含與SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列，且第一VH包含與SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL包含SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列且第一VH包含SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL由SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列組成且第一VH由SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第一VL包含與SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列且第一VH包含與SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列且第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL由SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列組成且第一VH由SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第一VL包含與SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列，且第一VH包含與SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列且第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL由SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列組成且第一VH由SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第一VL包含與SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列，且第一VH包含與SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列且第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL由SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列組成且第一VH由SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第一VL包含與SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列且第一VH包含與SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列且第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL由SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列組成且第一VH由SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列組成。
在本文所提供之ADC之某些實施例中，ADC之雙特異性抗體之第二VL包含：
(i)包含SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由Kabat編號系統定義；
(ii)包含SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由Chothia編號系統定義；
(iii)包含SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或
(iv)包含SEQ ID NO: 20中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 22中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；其中CDR係藉由IMGT編號系統定義；
及/或
ADC之雙特異性抗體之第二VH包含：
(i)包含SEQ ID NO: 24中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 28中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由Kabat編號系統定義；
(ii)包含SEQ ID NO: 25中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由Chothia編號系統定義；
(iii)包含SEQ ID NO: 27中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 31中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或
(iv)包含SEQ ID NO: 26中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 30所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 33中所示之胺基酸序列的CDR-H3；其中CDR係藉由IMGT編號系統定義。
在某些實施例中，第二VL包含與SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VL由SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第二VH包含與SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH由SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，第二VL包含與SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列且第二VH包含與SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。在某些實施例中，第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列且第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VL由SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列組成且第二VH由SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列組成。
在某些實施例中，本揭示提供一種ADC，其包含與本文所描述之抗體中之任一者交叉競爭結合於c-MET及/或EGFR的雙特異性抗體。在某些實施例中，本揭示提供一種ADC，其包含與本文所描述之抗體結合於c-MET及/或EGFR之相同或重疊抗原決定基的雙特異性抗體。
在某些實施例中，抗體之抗原決定基可藉由例如NMR光譜、表面電漿子共振(BIAcore®)、X射線繞射晶體學研究、ELISA檢定法、氫/氘交換與質譜(例如液相層析電噴霧質譜)結合、基於陣列之寡肽掃描檢定法及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)測定。對於X射線晶體學，結晶可使用此項技術中已知之任何方法來實現(例如Giegé R等人, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274；McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中)。抗體:抗原晶體可使用熟知X射線繞射技術來研究，且可使用電腦軟體來優化，諸如X-PLOR (Yale University, 1992,由Molecular Simulations, Inc.分銷；參見例如Meth Enzymol (1985)第114及115卷, yckoff HW等人編；美國專利申請案第2004/0014194號)及BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60；Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, Carter CW編; Roversi P等人, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323，其皆以全文引用之方式併入本文中)。突變誘發定位研究可使用熟習此項技術者已知之任何方法實現。關於突變誘發技術(包括丙胺酸掃描突變誘發技術)之描述，參見例如Champe M等人,(1995)以及Cunningham BC及Wells JA (1989)。在一特定實施例中，抗體之抗原決定基係使用丙胺酸掃描突變誘發研究來測定。另外，識別且結合於c-MET及/或EGFR之相同或重疊抗原決定基的雙特異性抗體可使用諸如免疫檢定法之常規技術例如藉由顯示一種抗體阻斷另一抗體與目標抗原之結合的能力來鑑別，亦即競爭性結合檢定法。競爭結合檢定法亦可用於測定兩種抗體對於抗原決定基是否具有類似結合特異性。競爭性結合可在受測試之免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原(諸如c-MET或EGFR)之特異性結合的檢定法中進行測定。已知許多類型之競爭性結合檢定法，例如：固相直接或間接放射免疫檢定法(RIA)、固相直接或間接酶免疫檢定法(EIA)、夾心競爭檢定法(參見Stahli C等人, (1983) Methods Enzymol 9: 242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見Kirkland TN等人, (1986) J Immunol 137: 3614-9)；固相直接標記檢定法、固相直接標記夾心檢定法(參見Harlow E及Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA (參見Morel GA等人, (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見Cheung RC等人, (1990) Virology 176: 546-52)；及直接標記RIA (參見Moldenhauer G等人, (1990) Scand J Immunol 32: 77-82)，其皆以全文引用之方式併入本文中。通常，此等檢定法涉及使用結合於帶有未經標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白中任一者的固體表面或細胞之經純化抗原(例如c-MET或EGFR)。競爭性抑制可藉由測定在測試免疫球蛋白存在下結合於固體表面或細胞之標記的量來量測。通常，測試免疫球蛋白過量存在。通常，當競爭抗體過量存在時，其將參考抗體對共同抗原之特異性結合抑制至少50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%、70%至75%或更多。競爭結合檢定法可使用經標記之抗原或經標記之抗體以大量不同型式組態。在此檢定法之常見型式中，將抗原固定於96孔盤上。隨後使用放射性標記或酶標記來量測未經標記之抗體阻斷經標記之抗體與抗原之結合的能力。其他細節參見例如Wagener C等人, (1983) J Immunol 130: 2308-2315；Wagener C等人, (1984) J Immunol Methods 68: 269-274；Kuroki M等人, (1990) Cancer Res 50: 4872-4879；Kuroki M等人, (1992) Immunol Invest 21: 523-538；Kuroki M等人, (1992) Hybridoma 11: 391-407及Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E及Lane D編，見上文,第386-389頁，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在本文所提供之ADC之某些實施例中，將一個、兩個、或更多個突變(例如胺基酸取代)引入至ADC之雙特異性抗體之Fc域(例如CH2域(人類IgG1之殘基231-340))及/或CH3域(人類IgG1之殘基341-447，根據EU編號系統編號)及/或鉸鏈區(殘基216-230，根據EU編號系統編號)中，以改變抗體之一個或多個功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。
在某些實施例中，將一個、兩個或更多個突變(例如胺基酸取代)引入至Fc域中，以例如降低或消除Fc域之效應功能。在某些實施例中，抗體包含Fc域，該Fc域包含：(i) E233A及L235A (EALA)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(ii) L234A及L235A (LALA)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(iii) L234A L235A D265S (LALADS)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(iv) L234A L235A P329G (LALAPG)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(v) L234A L235A P329A (LALAPA)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(vi) L235E (LE)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(vii) D265A (DS)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(viii) D265A N297G (DANG)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；(ix) N297X胺基酸取代，其中X為除N外之任何胺基酸，其中編號係根據EU編號方案；(x) N297A/D356E/L358M (NADELM)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案；或(x1)D356E L358M (DELM)胺基酸取代，其中編號係根據EU編號方案。
在某些實施例中，可將本文所描述之恆定區突變或修飾中之任一者引入至本文所描述之具有兩個重鏈恆定區之抗體的一個或兩個重鏈恆定區中。 Fab-scFv結構
在某些實施例中，第一抗原結合域為Fab且第二抗原結合域為scFv。
在某些實施例中，雙特異性抗體包含多肽鏈I-A、多肽鏈I-B及多肽鏈I-C；其中(a)包含於多肽鏈I-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈I-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈I-C中之元件包含第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈I-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈I-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈I-C中之元件包含第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈I-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈I-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈I-C中之元件自N端至C端包含(i)第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體，或(ii)第二VH、第二VL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈I-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈I-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈I-C中之元件自N端至C端包含：(i)第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體，或(ii)第二VH、第二VL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，包含於多肽鏈I-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈I-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈I-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，各肽連接子可獨立地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個甘胺酸殘基。在某些實施例中，各肽連接子可獨立地包含肽GGGG (SEQ ID NO: 61)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子次單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS)n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽鏈I-A包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，多肽鏈I-B包含SEQ ID NO: 2或9中所示之胺基酸序列，及/或多肽鏈I-C包含SEQ ID NO: 3或10中所示之胺基酸序列。 scFv-Fab結構
在某些實施例中，第一抗原結合域為scFv且第二抗原結合域為Fab。
在某些實施例中，雙特異性抗體包含多肽鏈II-A、多肽鏈II-B及多肽鏈II-C；其中(a)包含於多肽鏈II-A中之元件包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈II-B中之元件包含第二VH、第二重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈II-C中之元件包含第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體，或(b)包含於多肽鏈II-A中之元件包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈II-B中之元件包含第二VH、第二重鏈CH1區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈II-C中之元件包含第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈II-A中之元件自N端至C端包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈II-B中之元件自N端至C端包含第二VH、第二重鏈CH1區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈II-C中之元件自N端至C端包含：(i)第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體，或(ii)第一VH、第一VL、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈II-A中之元件自N端至C端包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈II-B中之元件自N端至C端包含第二VH、第二重鏈CH1及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈II-C中之元件自N端至C端包含：(i)第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體，或(ii)第一VH、第一VL、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，包含於多肽鏈II-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈II-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈II-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子次單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS)n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，第一及第二重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列，及/或第二重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽鏈II-A包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，多肽鏈II-B包含SEQ ID NO: 5或7中所示之胺基酸序列，及/或多肽鏈II-C包含SEQ ID NO: 6或8中所示之胺基酸序列。 Fab-scFab結構
在某些實施例中，第一抗原結合域為Fab且第二抗原結合域為scFab (單鏈Fab)。
在某些實施例中，雙特異性抗體包含多肽鏈III-A、多肽鏈III-B及多肽鏈III-C；其中(a)包含於多肽鏈III-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈III-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈III-C中之元件包含第二VL、第二CL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈III-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈III-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈III-C中之元件包含第二VL、第二CL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈III-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈III-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈III-C中之元件自N端至C端包含：(i)第二VL、第二CL、第二VH、第二重鏈CH1區及第二Fc域單體；或(ii)第二VH、第二重鏈CH1區、第二VL、第二CL及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈III-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈III-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈III-C中之元件自N端至C端包含：(i)第二VL、第二CL、第二VH、第二重鏈CH1區及第一Fc域單體；或(ii)第二VH、第二重鏈CH1區、第二VL、第二CL及第一Fc域單體。
在某些實施例中，包含於多肽鏈III-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈III-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈III-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS) n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一及第二CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，第一及第二重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列，及/或第二重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。 scFab-Fab結構
在某些實施例中，第一抗原結合域為scFab且第二抗原結合域為Fab。
在某些實施例中，雙特異性抗體包含多肽鏈IV-A、多肽鏈IV-B及多肽鏈IV-C，其中(a)包含於多肽鏈IV-A中之元件包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈IV-B中之元件包含第二VH、第二重鏈CH1區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈IV-C中之元件包含第一VL、第一CL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈IV-A中之元件包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈IV-B中之元件包含第二VH、第二重鏈CH1區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈IV-C中之元件包含第一VL、第一CL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈IV-A中之元件自N端至C端包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈IV-B中之元件自N端至C端包含第二VH、第二重鏈CH1區及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈IV-C中之元件自N端至C端包含第一VL、第一CL、第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈IV-A中之元件自N端至C端包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈IV-B中之元件自N端至C端包含第二VH、第二重鏈CH1區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈IV-C中之元件自N端至C端包含(i)第一VL、第一CL、第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，包含於多肽鏈IV-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈IV-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈IV-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子次單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS)n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一及第二CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，第一及第二重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列，及/或第一重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列且第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽鏈IV-A包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，多肽鏈IV-B包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列，及/或多肽鏈IV-C包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列。 Fab-Fab (包括CrossMab形式之域交換)結構
在某些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域為Fab，且第二抗原結合域之Fab包含呈CrossMab形式之域交換。
在某些實施例中，第二抗原結合域之Fab包含呈CrossMab VH-VL形式的VH及VL之域交換。
在某些實施例中，第二抗原結合域之Fab包含呈CrossMab CH1-CL形式的CH1及CL之域交換。
在某些實施例中，第二抗原結合域之Fab包含呈CrossMab Fab形式之域交換。
在某些實施例中，包含呈CrossMab CH1-CL形式之域交換的雙特異性抗體包含多肽鏈V-A、多肽鏈V-B、多肽鏈V-C及多肽鏈V-D；其中(a)包含於多肽鏈V-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件包含第二VH、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈V-D中之元件包含第二VL及第二重鏈CH1區；或(b)包含於多肽鏈V-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件包含第二VH、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈V-D中之元件包含第二VL及第二重鏈CH1區。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二VH、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體，及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VL及第二重鏈CH1區；或(b)包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二VH、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體，及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VL及第二重鏈CH1區。
在某些實施例中，包含於多肽鏈V-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈V-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈V-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈V-D中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS) n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一及第二CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，第一及第二重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列，及/或第二重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽鏈V-A包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，多肽鏈V-B包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列，多肽鏈V-C包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列，及/或多肽鏈V-D包含SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列。 Fab (含有呈CrossMab形式之域交換)-Fab結構
在某些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域為Fab，且第一抗原結合域之Fab包含呈CrossMab形式之域交換。
在某些實施例中，第一抗原結合域之Fab包含呈CrossMab CH1-CL形式的CH1及CL之域交換。
在某些實施例中，第一抗原結合域之Fab包含呈CrossMab VH-VL形式的VH及VL之域交換。
在某些實施例中，第一抗原結合域之Fab包含呈CrossMab Fab形式之域交換。
在某些實施例中，雙特異性抗體包含多肽鏈VI-A、多肽鏈VI-B、多肽鏈VI-C及多肽鏈VI-D；其中(a)包含於多肽鏈VI-A中之元件包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈VI-B中之元件包含第二VH、重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈VI-C中之元件包含第一VH、第一CL及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈VI-D中之元件包含第一VL及第一重鏈CH1區；或(b)包含於多肽鏈VI-A中之元件包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈VI-B中之元件包含第二VH、重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈VI-C中之元件包含第一VH、第一CL、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈VI-D中之元件包含第一VL及第一重鏈CH1區。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈VI-A中之元件自N端至C端包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈VI-B中之元件自N端至C端包含第二VH、重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈VI-C中之元件自N端至C端包含第一VH、第一CL、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈VI-D中之元件自N端至C端包含第一VL及重鏈CH1區；或(b)包含於多肽鏈VI-A中之元件自N端至C端包含第二VL及第二CL；包含於多肽鏈VI-B中之元件自N端至C端包含第二VH、重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈VI-C中之元件自N端至C端包含第一VH、第一CL、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈VI-D中之元件自N端至C端包含第一VL及重鏈CH1區。
在某些實施例中，包含於多肽鏈VI-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈VI-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈VI-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈VI-D中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS) n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一CL及第二CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列，及/或第一重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，包含呈CrossMab VH-VL形式之域交換的雙特異性抗體包含多肽鏈V-A、多肽鏈V-B、多肽鏈V-C及多肽鏈V-D；其中(a)包含於多肽鏈V-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件包含第二VL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈V-D中之元件包含第二VH及第二CL；或(b)包含於多肽鏈V-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件包含第二VL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈V-D中之元件包含第二VH及第二CL。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VH及第二CL；或(b)包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二H、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體，及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VH及第二CL。
在某些實施例中，包含於多肽鏈V-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈V-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈V-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈V-D中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS) n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一及第二CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，第一及第二重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列，及/或第二重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，包含呈CrossMab Fab形式之域交換的雙特異性抗體包含多肽鏈V-A、多肽鏈V-B、多肽鏈V-C及多肽鏈V-D；其中(a)包含於多肽鏈V-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件包含第二VL、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈V-D中之元件包含第二VH及第二重鏈CH1區；或(b)包含於多肽鏈V-A中之元件包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件包含第二VL、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈V-D中之元件包含第二VH及第二重鏈CH1區。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二VL、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體，及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VH及第二重鏈CH1區；或(b)包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及第一CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、第一重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二VL、第二CL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體，及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VH及第二重鏈CH1區。
在某些實施例中，包含於多肽鏈V-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈V-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；包含於多肽鏈V-C中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接；及/或包含於多肽鏈V-D中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS) n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一及第二CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，第一及第二重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列，及/或第二重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。 scFv-scFv結構
在某些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域皆為scFv。
在某些實施例中，雙特異性抗體包含多肽鏈VII-A及多肽鏈VII-B；其中(a)包含於多肽鏈VII-A中之元件包含第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體；且包含於多肽鏈VII-B中之元件包含第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈VII-A中之元件包含第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；且包含於多肽鏈VII-B中之元件包含第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，(a)包含於多肽鏈VII-A中之元件自N端至C端包含(i)第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體，或(ii)第一VH、第一VL、第一重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈VII-B中之元件自N端至C端包含(i)第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體，或(ii)第二VH、第二VL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；或(b)包含於多肽鏈VII-A中之元件自N端至C端包含(i)第一VL、第一VH、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體，或(ii)第一VH、第一VL、第一重鏈CH1鉸鏈區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈VII-B中之元件自N端至C端包含(i)第二VL、第二VH、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體，或(ii)第二VH、第二VL、第二重鏈CH1鉸鏈區及第一Fc域單體。
在某些實施例中，包含於多肽鏈VII-A中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接，及/或包含於多肽鏈VII-B中之相鄰元件視情況藉由或不藉由肽連接子彼此連接。
在某些實施例中，肽連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含3至55個(例如3至10、10至25、10至20、10至17、10至15、10至25、10至35、10至45、10至55個)胺基酸殘基。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含肽連接子單元GGGGS (SEQ ID NO: 57)之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝，其可由(GGGGS) n表示，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (分別為SEQ ID NO: 57、65、55、58、66-68、56、69或70)。在某些實施例中，肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58或65-70中之任一者中所示的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一及第二重鏈CH1鉸鏈區包含SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列且第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一VH包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列，第一VL包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列，且第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在某些實施例中，第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列，且第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽鏈VII-A包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列，及/或多肽鏈VII-B包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列。
在某些例示性實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體包含：
包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C；
包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C；
包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C；
包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C；
包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-B及包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-C；
包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-B、包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-C及包含SEQ ID NO: 12如中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-D；或
包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-A及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-B。
在某些實施例中，包含雙特異性抗體之ADC具有相對於單特異性抗c-MET抗體及/或單特異性抗EGFR抗體增強的腫瘤抑制作用；其中單特異性抗c-MET之CDR的CDR胺基酸序列與第一抗原結合域之CDR序列的胺基酸序列一致，且單特異性抗EGFR抗體之CDR序列的胺基酸序列與第二抗原結合域之CDR的CDR胺基酸序列一致。
在某些實施例中，腫瘤抑制作用包括抑制EGFR及c-MET信號傳導、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。 ADC之藥物-連接子
本文所提供之ADC包含本文所描述之雙特異性抗體且進一步包含細胞毒性藥物片段D，其經由連接子-M-L-E-連接至抗體。
在一些實施例中，描述於歐洲專利公開案EP 4349372中之該等連接子特此以引用之方式併入。在一些實施例中，如歐洲專利公開案EP 4349372中所描述的連接子(M-L-E)及個別組分-M、L及E特此以引用之方式併入。在一些實施例中，描述於歐洲專利公開案EP 4349372中之細胞毒性藥物特此以引用之方式併入。在一些實施例中，描述於歐洲專利公開案EP 4349372中之連接子/細胞毒性藥物特此以引用之方式併入。
在一些實施例中，ADC中之M為 ，其中環A為5員至6員脂族雜環或5員至20員芳族環系統，且脂族雜環及芳族環系統視情況經一個或多個獨立地選自由以下組成之群的基團取代：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、硫醇基及C 1-6烷基取代；且M 1係選自單鍵及C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
在一些實施例中，M為 ，其中環A為5員脂族雜環、6員雜芳族環或藉由經由單鍵連接超過一個6員芳族雜環與一個苯環或藉由經由單鍵連接超過一個6員雜芳族環而形成的多環，且脂族雜環視情況經選自由側氧基(=O)、鹵素及C 1-4烷基取代組成之群的一者或多者取代；且M 1係選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
在一些實施例中，M為 ，其中環A係選自 、 、 、 、 、 及 ；且M 1係選自單鍵及C 1-6伸烷基、C 2-6伸烯基、C 2-6伸炔基或胺基基團。
在一些實施例中，M係選自 、 及 。
在一些實施例中，M為 。
在一些實施例中，M係選自 、 、 及 。
在一些實施例中，M係選自 、 及 。
在一些實施例中，ADC中之L係選自由以下中之一者或多者組成的結構：C 1-6伸烷基、-N(R')-、羰基、-O-、天然胺基酸或非天然胺基酸及其類似物(諸如Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) SOCH 3))以及由胺基酸構成之短肽(諸如Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Lys(Ac)、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75)))， 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；其中R'表示氫、C 1-6烷基或含有1至10個環氧乙烷(EO)單元之聚乙二醇片段；且s係選自1至20之整數。
在一些實施例中，L係選自由以下中之一者或多者組成的結構：C 1-6伸烷基、羰基、-NH-、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Ala、Val- Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75))、 、 、 、 及 ；其中s係選自1至20之整數。
在一些實施例中，L係選自由以下中之一者或多者組成的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中，L係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中，L係選自以下結構： 、 及 。
在一些實施例中，L係選自以下結構： 及 。
在一些實施例中，L係選自以下結構： 、 及 。
在一些實施例中，ADC中之E為單鍵或係選自以下結構： -NHCH 2-、 、 、 及 。
在一些實施例中，E為單鍵、-NHCH 2-、 或 。
在一些實施例中，E為-NHCH 2-或 。
在一些實施例中，E為-NHCH 2-。
在一些實施例中，E為單鍵。
在一些實施例中，E為 。
在一些實施例中，M係選自 、 、 、 及 ；L係選自 、 、 、 、 及 ；且E係選自-NHCH 2-及 。
在本文所提供之ADC之一些實施例中， 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中， 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中，本文提供之ADC之細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓樸異構酶抑制劑及RNA聚合酶抑制劑。在某些實施例中，微管蛋白抑制劑為澳瑞他汀或類美登素。在某些實施例中，DNA嵌入劑為吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在某些實施例中，DNA拓樸異構酶抑制劑為拓樸異構酶I抑制劑(例如喜樹鹼、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康、拓樸替康、貝洛替康或如博替康)或拓樸異構酶II抑制劑(例如阿黴素、PNU-159682、倍癌黴素、柔紅黴素、米托蒽醌、普達非倫毒素(podophyllotoxin)或依託泊苷)。在某些實施例中，RNA聚合酶抑制劑為α-蠅蕈素(α-amanitine) (α-瓢菌素)或其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
在一些實施例中，細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：由式I及式II表示之化合物，或由式I及式II表示之化合物的醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物及互變異構物，或該等化合物之前藥： 其中R 1及R 2各自獨立地選自C 1-6烷基及鹵素；R 3係選自H及-CO-CH 2OH；R 4及R 5各自獨立地選自H、鹵素及羥基；或R 4及R 5連接至相關碳原子以形成5員至6員含氧雜環；R 6係選自氫或-C 1-4伸烷基-NR aR b、-C 1-4伸烷基-SiR aR bR c、-SiR aR bR c、-C 1-4伸烷基=N-OR a；且R 7係選自C 1-6烷基、-C 1-4伸烷基-NR aR b；其中R a、R b及R c在每次出現時係獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2-C 1-6烷基及-CO-C 1-6烷基；其中視情況，連接至相關原子之R a及R b形成5員至6員含氮雜環。
在一些實施例中，細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
本文所提供之ADC之細胞毒性藥物可含有多種官能基，諸如羥基(-OH)、羧基(-COOH)、硫氫基(-SH)、一級胺基(-NH 2)、二級胺基(-NR AH)或三級胺基(-NR BR C)，其中R A、R B及R C表示N上之非氫取代基，且細胞毒性藥物可經由此等官能基與結合物合併。
在一些實施例中，細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。 連接子與藥物(有效負載)之間的連接
在一些實施例中，本文提供之ADC之細胞毒性藥物經由其上之-OH、-SH、一級胺基、二級胺基或三級胺基連接至ADC中之E。
在一些實施例中，D為藉由自細胞毒性藥物上之-OH、NH 2或二級胺基失去一個H而獲得的單價結構。 例示性ADC
在一些實施例中，本文提供之ADC係選自由ADC A-01至ADC A-34組成之群、由ADC B-01至ADC B-07組成之群或由ADC C-01至ADC C-28組成之群，其中ADC之結構如下： ADC A-01 ， ADC A-02 ， ADC A-04 ， ADC A-05 ， ADC A-06 ， ADC A-07 ， ADC A-08 ， ADC A-09 ， ADC A-10 ， ADC A-11 ， ADC A-13 ， ADC A-14 ， ADC A-15 ， ADC A-16 ， ADC A-17 ， ADC A-18 ， ADC A-20 ， ADC A-21 ， ADC A-22 ， ADC A-24 ， ADC A-25 ， ADC A-26 ， ADC A-28 ， ADC A-29 ， ADC A-30 ， ADC A-32 ， ADC A-33 ， ADC A-34 ， ADC B-01 ， ADC B-02 ， ADC B-03 ， ADC B-04 ， ADC B-06 ， ADC B-07 ， ADC C-01 ， ADC C-02 ， ADC C-03 ， ADC C-04 ， ADC C-05 ， ADC C-06 ， ADC C-07 ， ADC C-08 ， ADC C-09 ， ADC C-10 ， ADC C-11 ， ADC C-12 ， ADC C-13 ， ADC C-14 ， ADC C-15 ， ADC C-16 ， ADC C-17 ， ADC C-18 ， ADC C-19 ， ADC C-20 ， ADC C-21 ， ADC C-22 ， ADC C-23 ， ADC C-24 ， ADC C-25 ， ADC C-26 ， ADC C-27 ，或 ADC C-28 ； 其中Ab為本文所描述之雙特異性抗體或其抗原結合片段； 及 表示雙特異性抗體或其抗原結合片段中之硫氫基與抗體-藥物結合物中之其他部分之間的特異性連接方法；且x表示載藥量。
在一些實施例中，雙特異性抗體或其抗原結合片段中之硫醇基經由與抗體-藥物結合物其他部分之前驅物的加成反應或取代反應而形成硫醚鍵，以獲得抗體-藥物結合物。
在一些實施例中，Ab包含： (1)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 2或9中所示之胺基酸序列的肽鏈I-B及/或包含SEQ ID NO: 3或10中所示之胺基酸序列的肽鏈I-C； (2)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 5或7中所示之胺基酸序列的肽鏈II-B及/或包含SEQ ID NO: 6或8中所示之胺基酸序列的肽鏈II-C； (3)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的肽鏈IV-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的肽鏈IV-B及/或包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列的肽鏈IV-C； (4)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的肽鏈V-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的肽鏈V-B、包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列的肽鏈V-C及/或包含SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列的肽鏈V-D；或 (5)包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的肽鏈VII-A及/或包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的肽鏈VII-B。
在一些實施例中，Ab包含： (1)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列的肽鏈I-C肽； (2)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列的肽鏈I-C； (3)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列的肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的肽鏈II-C； (4)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的肽鏈II-C； (5)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的肽鏈IV-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的肽鏈IV-B及包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列的肽鏈IV-C； (6)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的肽鏈V-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的肽鏈V-B、包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列的肽鏈V-C及包含SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列的肽鏈V-D；或 (7)包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的肽鏈VII-A及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的肽鏈VII-B。
在特定實施例中，Ab係選自由以下組成之群：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B。
在本文所提供之ADC之特定實施例中，ADC之雙特異性抗體之重鏈恆定區可包含C端離胺酸、不具有C端離胺酸或不具有C端甘胺酸-離胺酸二肽。在一些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體之可變區的N端胺基酸可包含麩胺酸或麩醯胺酸殘基或環化成焦麩胺酸之麩胺酸或麩醯胺酸殘基。
在一些實施例中，本文所提供之ADC之雙特異性抗體或其抗原結合片段之可變區的N端胺基酸可環化成焦麩胺酸。因此，本文所揭示之ADC之組合物可包含ADC群體，其中各ADC可獨立地包含C端離胺酸、不具有C端離胺酸、不具有C端甘胺酸-離胺酸二肽及/或包含N端麩醯胺酸或麩胺酸殘基或環化成焦麩胺酸之N端麩醯胺酸或麩胺酸。
因此，在一些實施例中，本申請案進一步提供包含本文所描述之ADC的組合物，其中組合物中之ADC的主要種類包含：(i)其中重鏈C端不具有離胺酸殘基之抗體；(ii)其中重鏈N端包含麩醯胺酸、麩胺酸或焦麩胺酸殘基之抗體；(iii)其中重鏈C端不具有胺基酸殘基離胺酸且重鏈N端包含麩醯胺酸、麩胺酸或焦麩胺酸殘基之抗體；(iv)其中重鏈C端不具有胺基酸殘基離胺酸且重鏈N端包含焦麩胺酸殘基之抗體；或(v)其中重鏈C端不具有胺基酸殘基離胺酸且重鏈N端包含麩醯胺酸或麩胺酸殘基之抗體。
如熟習此項技術者所已知，焦麩胺酸為焦麩胺酸酯之共軛酸且在溶液中與焦麩胺酸酯平衡。因此，本申請案亦提供一種包含一種或多種任一前述實施例中所描述之ADC的組合物。舉例而言，本發明提供包含SEQ ID NO: 2、9、18或60中所示之胺基酸序列的ADC實施例，其中N端麩胺酸已轉化成焦麩胺酸；及/或包含SEQ ID NO: 5、7、13或16中所示之胺基酸序列的實施例，其中N端麩醯胺酸已轉化為成焦麩胺酸。
在一些實施例中，組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為1至10，諸如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、4至5、4至6、4至7、4至8、4至9、4至10、5至6、5至7、5至8、5至9、5至10、6至7、6至8、6至9、6至10、7至8、7至9、7至10、8至9、8至10或9至10。
在一些實施例中，組合物之DAR值為3至9或4至8，例如3.0至3.5、3.0至4.0、3.0至4.5、3.0至5.0、3.0至5.5、3.0至6.0、3.5至4.0、3.5至4.5、3.5至5.0、3.5至5.5、3.5至6.0、3.5至6.5、3.5至7.0、3.5至7.5、3.5至8.0、4.0至4.5、4.0至5.0、4.0至5.5、4.0至6.0、4.0至6.5、4.0至7.0、4.0至7.5、4.0至8.0、4.5至5.0、4.5至5.5、4.5至6.0、4.5至6.5、4.5至7.0、4.5至7.5、4.5至8.0、5.0至5.5、5.0至6.0、5.0至6.5、5.0至7.0、5.0至7.5、5.0至8.0、5.5至6.0、5.5至6.5、5.5至7.0、5.5至7.5、5.5至8.0、6.0至6.5、6.0至7.0、6.0至7.5、6.0至8.5、6.5至7.0、6.5至7.5、6.5至8.5、7.0至7.5、7.0至9.0或7.5至9.0。 結合
在另一範疇中，本申請案提供一種用於使本文所描述之連接子-有效負載與本文所描述之抗體結合以製得本文所描述之抗體-藥物結合物(ADC)的方法。
在某些實施例中，本文所描述之抗體係經由結合至抗體中之離胺酸而與本文所描述之連接子-有效負載結合。
在某些實施例中，本文所描述之抗體係經由結合至抗體中之半胱胺酸殘基而與本文所描述之連接子-有效負載結合。在某些實施例中，半胱胺酸殘基係來自抗體中之還原鏈內雙硫鍵。在某些實施例中，半胱胺酸殘基係來自抗體中之還原鏈間雙硫鍵。
在一些實施例中，抗體係經由結合至抗體中之還原性鏈間雙硫鍵而與連接子-有效負載結合。舉例而言，IgG1抗體係由四個多肽鏈組成：包含VH、CH1及Fc (例如鉸鏈、CH2及CH3)域之兩個重鏈及包含VL及CL域之兩個輕鏈，該等多肽鏈藉由鏈間半胱胺酸雙硫(-S-S-)鍵(例如，兩個重鏈-輕鏈鏈間雙硫鍵及兩個鉸鏈重鏈-重鏈鏈間雙硫鍵)連接。在某些實施例中，當此等雙硫鍵在還原條件下斷裂時，產生八(8)個反應性半胱胺酸硫氫基部分。在某些實施例中，八個反應性半胱胺酸硫氫基部分中之各者為連接子-藥物之連接點，使得最多八種(x = 8)連接子-有效負載可連接至經還原抗體。在某些實施例中，四個雙硫鍵中之任一者在還原條件下斷裂，產生兩(2)個反應性半胱胺酸硫氫基部分。在其他實施例中，兩個反應性半胱胺酸硫氫基部分中之各者為連接子-藥物之連接點，使得兩種(x = 2)連接子-藥物可連接至經還原抗體。在某些實施例中，四個雙硫鍵中之任兩者在還原條件下斷裂，產生四(4)個反應性半胱胺酸硫氫基部分。在其他實施例中，四個反應性半胱胺酸硫氫基部分中之各者為連接子-藥物之連接點，使得四種(x = 4)連接子-藥物可連接至經還原抗體。在某些實施例中，四個雙硫鍵中之任三者在還原條件下斷裂，產生六(6)個反應性半胱胺酸硫氫基部分。在其他實施例中，六個反應性半胱胺酸硫氫基部分中之各者為連接子-藥物之連接點，使得六種(x = 6)連接子-藥物可連接至經還原抗體。
在一些實施例中，鏈間雙硫鍵位於兩個半胱胺酸殘基之間，其在還原條件下斷裂，得到兩個反應性半胱胺酸硫氫基部分。在其他實施例中，抗體中之鏈間雙硫橋鍵位於重鏈與輕鏈之間，諸如根據EU編號的重鏈之C220與根據EU及/或Kabat編號的κ輕鏈之C214之間，或根據EU編號的重鏈之C220與根據EU及/或Kabat編號的λ輕鏈之C214之間。或者或另外，抗體中之鏈間雙硫橋鍵位於兩條重鏈之間，諸如根據EU編號的第一重鏈之C226及/或C229與第二重鏈之C226及/或C229之間。在一些實施例中，半胱胺酸殘基在抗體之鉸鏈區中。在一些實施例中，半胱胺酸殘基位於根據EU編號的重鏈中之位置220、226或229 (在本文中亦分別稱為C220、C226或C229)中之任一者或多者處。在一些實施例中，半胱胺酸殘基位於根據EU及/或Kabat編號的輕鏈中之位置214處(在本文中亦稱為C214，諸如根據EU及Kabat編號的κ輕鏈中之位置214或根據EU及Kabat編號的λ輕鏈中之位置214)。在一個實施例中，半胱胺酸殘基位於根據EU編號的重鏈中之位置220、226及229以及根據EU或Kabat編號的輕鏈中之位置214中之各者處。在一個實施例中，半胱胺酸殘基位於根據EU編號的重鏈中之位置220、226及229以及根據EU及Kabat編號的κ輕鏈中之位置214中之各者處。在一個實施例中，半胱胺酸殘基位於根據EU編號的重鏈中之位置220、226及229以及根據EU及Kabat編號的λ輕鏈中之位置214中之各者處。在一個實施例中，半胱胺酸殘基位於以下位置中之任一者或多者處： (i)根據EU編號的第一重鏈中之位置220、226及229中之任一者或任兩者或任三者； (ii)根據EU編號的第二重鏈中之位置220、226及229中之任一者或任兩者或任三者； (iii)根據Kabat編號及/或EU編號的第一輕鏈中之位置214；及/或 (iv)根據Kabat編號及/或EU編號的第二輕鏈中之位置214。
如本文所用，C220、C226及C229係指根據EU編號鑑別的免疫球蛋白之胺基酸殘基(半胱胺酸，Cys，C)。如熟習此項技術者應理解，此等編號相應地表示與免疫球蛋白中所鑑別之胺基酸殘基比對的多肽之胺基酸殘基，諸如www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html中所示之胺基酸殘基。
如本文所用，κ輕鏈之位置214處的半胱胺酸殘基係指根據Eu或Kabat編號鑑別的免疫球蛋白之胺基酸殘基(半胱胺酸，Cys，C)。如熟習此項技術者應理解，此等編號相應地表示與免疫球蛋白中所鑑別之胺基酸殘基比對的多肽之胺基酸殘基，諸如www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGKCnber.html中所示之胺基酸殘基。
如本文所用，λ輕鏈之位置214處的半胱胺酸殘基係指根據Eu或Kabat編號鑑別的免疫球蛋白之胺基酸殘基(半胱胺酸，Cys，C)。如熟習此項技術者應理解，此等編號相應地表示與免疫球蛋白中所鑑別之胺基酸殘基比對的多肽之胺基酸殘基，諸如www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGLCnber.html中所示之胺基酸殘基。
在某些實施例中，本文所描述之抗體包含鉸鏈區中之四個鏈間雙硫鍵，其可經還原，從而使鍵斷裂，並顯露出可與連接子-有效負載上之順丁烯二醯亞胺部分(諸如本文所描述之連接子-有效負載上之順丁烯二醯亞胺部分)結合的反應性硫氫基部分。
在某些實施例中，本文所描述之抗體包含離胺酸殘基，其中離胺酸殘基之反應性胺側鏈可與連接子-有效負載(諸如本文所描述之連接子-有效負載上之順丁烯二醯亞胺部分)結合。
在一個實施例中，本揭示提供一種製得本文所描述之ADC的方法，其包含以下步驟：a)提供包含抗體之溶液；b)使a)之溶液與還原劑接觸；c)使b)之溶液與包含本文所描述之連接子-有效負載或其鹽的溶液接觸以製得ADC。
在一個實施例中，還原劑為參(2羧乙基)膦(TCEP)。 醫藥組合物
在另一範疇中，本申請案提供一種醫藥組合物，其包含一種或多種本文所描述之ADC或組合物以及醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含額外醫藥學活性劑。在某些實施例中，額外醫藥學活性劑為具有抗癌活性的藥物。在一些實施例中，額外醫藥學活性劑係選自：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。在某些實施例中，本文所描述之ADC或組合物及額外醫藥學活性劑係呈分開之組分形式或呈混合組分形式提供。
在某些實施例中，本發明之醫藥組合物中之ADC或組合物足以(例如在個體中)發揮腫瘤抑制作用(例如優於單特異性抗c-MET抗體及/或單特異性抗EGFR抗體之腫瘤抑制作用，其中單特異性抗c-MET抗體之CDR之胺基酸序列與第一抗原結合域之CDR之胺基酸序列一致，且單特異性抗EGFR抗體之CDR之胺基酸序列與第二抗原結合域之CDR之胺基酸序列一致)。
在某些實施例中，腫瘤抑制作用包括：抑制EGFR及c-MET信號傳導、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。
在一些實施例中，本文提供之ADC與醫藥學上可接受之非經腸載劑一起以單元注射形式調配以供非經腸使用，諸如靜脈內推注注射、靜脈內注射、瘤內注射等。視情況，將具有所需純度之ADC與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、賦形劑或穩定劑混合以製備凍乾或溶液形式(Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)第16版, Osol, A.編)。本文所描述之ADC或包含ADC之醫藥組合物可藉由任何適合途徑向個體投與。 ADC之治療用途
在另一範疇中，本文提供本文所揭示之ADC、組合物或醫藥組合物中之任一者的用途，其用於製備用於個體之與c-MET及/或EGFR有關之疾病的預防及/或治療或輔助治療及/或用於活體外或在個體中抑制c-MET及/或EGFR之活性的藥物；其中該方法與c-MET及/或EGFR相關疾病有關，該等疾病包括但不限於與EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增相關的癌症。
在一些實施例中，癌症係選自上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌、前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。
在一些實施例中，ADC或醫藥組合物係與額外醫藥學活性劑組合投與，例如同時、分開或依序投與。在某些實施例中，額外醫藥學活性劑為具有抗癌活性的藥物。在某些實施例中，額外醫藥學活性劑係選自：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物或其任何組合。
在另一範疇中，本發明提供一種抑制細胞中之c-MET及/或EGFR之活性的方法，該方法包含使該細胞與本文所描述之ADC組合物或醫藥組合物接觸。在某些實施例中，細胞為表現c-MET及/或EGFR之細胞(例如腫瘤細胞)。
在另一範疇中，本發明提供一種用於預防個體之與c-MET及/或EGFR有關之疾病、治療該疾病及/或在治療該疾病時起輔助作用的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的本文所提供之ADC、組合物及/或醫藥組合物。
在某些實施例中，與c-MET及/或EGFR有關之疾病為癌症。在某些實施例中，癌症係與EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增相關。
在某些實施例中，癌症為上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌、前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與選自以下之第二療法：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任何組合。
在某些實施例中，第二療法可與上文所描述之方法同時、分開或依序施用。
在特定實施例中，本發明提供一種本文所描述之ADC、組合物或醫藥組合物，其用於預防個體之與c-MET及/或EGFR有關之疾病、治療該疾病及/或在治療該疾病時起輔助作用的方法中。在某些實施例中，與c-MET及/或EGFR有關之疾病為癌症。在某些實施例中，癌症係與EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增相關。
在一些實施例中，癌症係選自上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌、前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。
在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與第二療法，該第二療法係選自由以下組成之群：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任何組合。在某些實施例中，第二療法可同時、分開或依序施用。
本發明之ADC及本發明之醫藥組合物可調配成醫學領域中已知之任何劑型，例如錠劑、丸劑、懸浮液、乳液、溶液、凝膠、膠囊、粉劑、顆粒劑、酏劑、口含錠、栓劑、注射劑(包括注射用溶液、注射用無菌粉末及注射用濃縮溶液)、吸入劑、噴霧劑等。較佳劑型視預期投與模式及治療用途而定。本發明之醫藥組合物在製造及儲存條件下應為無菌及穩定的。較佳劑型為注射劑。此類注射劑可為注射用無菌溶液。舉例而言，注射用無菌溶液可藉由在適當溶劑中併入所需劑量之本發明之ADC或醫藥組合物，及視情況同時併入其他所需成分(包括但不限於pH調節劑、界面活性劑、佐劑、離子強度增強劑、等張劑、防腐劑、稀釋劑或其任何組合)，之後過濾滅菌來製備。另外，注射用無菌溶液可製備為無菌凍乾粉末(例如藉由真空乾燥或冷凍乾燥)以便於儲存及使用。此類無菌凍乾粉末可在使用之前分散於適合之載劑中，諸如無菌無熱原質水。
此外，本發明之ADC可呈單位劑型存在於醫藥組合物中以便於投與。
本發明之ADC及醫藥組合物可藉由此項技術中已知之任何適合方法投與，包括但不限於經口、經頰、舌下、經眼、局部、非經腸、經直腸、鞘內、內質網(intracytoplasmic reticulum)、腹股溝、膀胱內、局部(例如粉劑、軟膏或滴劑)或經鼻途徑。然而，對於許多治療用途而言，較佳投與途徑/模式為非經腸(例如靜脈內注射、皮下注射、腹膜內注射、肌肉內注射)。熟習此項技術者應理解，投與途徑及/或模式將視預期目的而變化。在一些較佳實施例中，本發明之ADC及醫藥組合物係藉由靜脈內注射或注射投與。
本發明之醫藥組合物可包含「治療有效量」或「預防有效量」之本發明之雙特異性抗體。「預防有效量」意謂足以預防、遏制或延遲疾病出現的量。「治療有效量」係指足以治癒或至少部分預防疾病及已患有疾病之患者之併發症的量。本發明之雙特異性抗體的治療有效量可根據以下因素變化：待治療之疾病的嚴重程度、患者之免疫系統的一般狀態、患者之一般狀況(諸如年齡、體重及性別)、藥物投與模式及同時投與之其他治療等。
在本發明中，給藥方案可經調整以獲得最佳所需反應(例如治療性或預防性反應)。舉例而言，可投與單次劑量，可隨時間推移投與多次劑量，或劑量可如治療情形之緊急狀態所指示而按比例減少或增加。
在本發明中，個體可為哺乳動物，諸如人類。 套組
亦提供套組，其包含一種或多種本文所描述之ADC或其醫藥組合物。在一特定實施例中，本文提供一種醫藥包裝或套組，其包含一個或多個填充有本文所描述之醫藥組合物之一種或多種成分(諸如一種或多種本文所提供之ADC)的容器。在某些實施例中，套組包含本文所描述之醫藥組合物及任何預防劑或治療劑，諸如本文所描述之彼等者。在某些實施例中，套組可包含T細胞促分裂原，諸如植物血凝素(phytohaemagglutinin；PHA)及/或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate；PMA)，或TCR複合物刺激性抗體，諸如抗CD3抗體及抗CD28抗體。視情況可將管制醫藥或生物產品製造、使用或銷售的政府機構所規定之形式的注意事項附於此類容器，該注意事項反映該機構對人類投與之製造、使用或銷售之批准。
亦提供可用於本文所描述之方法中的套組。在某些實施例中，套組在一個或多個容器中包含本文所描述之ADC，較佳純化ADC。在一特定實施例中，本文所描述之套組含有實質上分離的c-MET及/或EGFR抗原作為對照。在另一特定實施例中，本文所描述之套組進一步包含不與c-MET或EGFR抗原反應的對照抗體。在另一特定實施例中，本文所描述之套組含有一個或多個用於偵測抗體與c-MET及/或EGFR抗原之結合的元件(例如該抗體可與諸如螢光化合物、酶受質、放射性化合物或發光化合物之可偵測受質結合，或識別第一抗體之第二抗體可與可偵測受質結合)。在特定實施例中，本文所提供之套組可包括以重組方式產生或以化學方式合成的c-MET及/或EGFR抗原。提供於套組中之抗原亦可附著於撐體。在一更特定實施例中，上文所描述之套組之偵測構件包括c-MET及/或EGFR抗原所附著之撐體。此類套組亦可包括未附著的經報導基因標記之抗人類抗體或抗小鼠/大鼠抗體。在此實施例中，雙特異性抗體與抗原之結合可藉由結合該經報導基因標記之抗體來偵測。 本發明之具體實施例包括：
實施例1. 一種抗體-藥物結合物，其具有下式中所示之結構： Ab-[M-L-E-D] x其中：Ab為雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域；M為連接至該雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段之連接子位點；L為連接該等連接子位點M與E之結構片段；E為連接L與D之結構片段；D為細胞毒性藥物或其殘基；x經選擇為1至10之任何整數。
實施例2. 如實施例1之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域包含第一輕鏈可變區(VL)及第一重鏈可變區(VH)，該第一輕鏈可變區(VL)及該第一重鏈可變區(VH)一起形成能夠特異性結合c-MET之域；該第二抗原結合域包括第二輕鏈可變區(VL)及第二重鏈可變區(VH)，其一起形成結合EGFR之特異性域；其中該第一輕鏈(LC)可變區(VL)包含： (i)包含SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的互補決定區(CDR)-L1、包含SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由Kabat編號系統定義； (ii)包含SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由Chothia編號系統定義； (iii)包含SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或 (iv)包含SEQ ID NO: 35中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 37中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由IMGT編號系統定義； 及/或該第一重鏈(HC)可變區(VH)含有： (i)包含SEQ ID NO: 39中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 43中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由Kabat編號系統定義； (ii)包含SEQ ID NO: 40中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 44中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由Chothia編號系統定義； (iii)包含SEQ ID NO: 42中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 46中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或 (iv)包含SEQ ID NO: 41中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 45中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 48中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由IMGT編號系統定義。
實施例3. 如實施例2之抗體-藥物結合物，其中該第二輕鏈(LC)可變區(VL)包含： (i)包含SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的互補決定區(CDR)-L1、包含SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由Kabat編號系統定義； (ii)包含SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的互補決定區(CDR)-L1、包含SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由Chothia編號系統定義； (iii)包含SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的互補決定區(CDR)-L1、包含SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或 (iv)包含SEQ ID NO: 20中所示之胺基酸序列的互補決定區(CDR)-L1、包含SEQ ID NO: 22中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3，其中CDR係藉由IMGT編號系統定義； 及/或該第二重鏈(HC)可變區(VH)含有： (i)包含SEQ ID NO: 24中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 28中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由Kabat編號系統定義； (ii)包含SEQ ID NO: 25中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由Chothia編號系統定義； (iii)包含SEQ ID NO: 27中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 31中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由Abm編號系統定義；或 (iv)包含SEQ ID NO: 26中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 30中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 33中所示之胺基酸序列的CDR-H3，其中CDR係藉由IMGT編號系統定義。
實施例4. 如實施例2至3中任一例之抗體-藥物結合物，其中(i)該第一輕鏈可變區(VL)包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列且該第一重鏈可變區(VH)包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列；或(ii)該第一輕鏈可變區(VL)包含SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列且該第一重鏈可變區(VH)包含SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列。
實施例5. 如實施例2至4中任一例之抗體-藥物結合物，其中該第二輕鏈可變區(VL)包含SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列，及/或該第二重鏈可變區(VH)包含SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列。
實施例6. 如實施例1至5中任一例之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段進一步包含有包含第一Fc域單體及第二Fc域單體之Fc域二聚體，且該第一Fc域單體及該第二Fc域單體各自獨立地包含一個或多個胺基酸的促進該第一Fc域單體及該第二Fc域單體之異二聚合的修飾。
實施例7. 如實施例6之抗體-藥物結合物，其中該Fc包含含有能夠形成杵結構之胺基酸修飾的第一Fc域單體及含有能夠形成臼結構之胺基酸修飾的第二Fc域單體，其中該臼結構能夠與該杵結構配對形成異二聚Fc域二聚體。
實施例8. 如實施例6或7之抗體-藥物結合物，其中(a)該第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列，且該第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列；或(b)該第一Fc域單體包含SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列，且該第二Fc域單體包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列。
實施例9. 如實施例6至8中任一例之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域與該第一Fc域單體連接且該第二抗原結合域連接至該第二Fc域單體；或該第一抗原結合域與該第二Fc域單體連接且該第二抗原結合域連接至該第一Fc域單體。
實施例10. 如實施例1至9中任一例之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域為Fab且該第二抗原結合域為scFv。
實施例11. 如實施例10之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈I-A、多肽鏈I-B及多肽鏈I-C；其中 (a)包含於多肽鏈I-A中之元件自N端至C端包含第一VL及CL；包含於多肽鏈I-B中之元件自N端至C端包含第一VH、重鏈CH1區及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈I-C中之元件自N端至C端包含(i)第二VL、第二VH及第二Fc域單體；或(ii)第二VH、第二VL及第二Fc域單體；或 (b)包含於多肽鏈I-A中之元件自N端至C端包含第一VL及CL；包含於多肽鏈I-B中之元件自N端至C端包含第一VH、重鏈CH1區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈I-C中之元件自N端至C端包含(i)第二VL、第二VH及第一Fc域單體；或(ii)第二VH、第二VL及第一Fc域單體。
實施例12. 如實施例10或11之抗體-藥物結合物，其中(a)該多肽鏈I-A包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列；該多肽鏈I-B包含SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列；及/或該多肽鏈I-C包含SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列；或(b)該多肽鏈I-A包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列；該多肽鏈I-B包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列；及/或該多肽鏈I-C包含SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列。
實施例13. 如實施例1至9中任一例之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域為scFv，且該第二抗原結合域為Fab。
實施例14. 如實施例13之抗體-藥物結合物，其中 (a)該雙特異性抗體包含多肽鏈II-A、多肽鏈II-B及多肽鏈II-C；其中包含於多肽鏈II-A中之元件自N端至C端包含第二VL及CL；包含於多肽鏈II-B中之元件自N端至C端包含第二VH、重鏈CH1區及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈II-C中之元件自N端至C端包含： (i)第一VL、第一VH及第二Fc域單體；或 (ii)第一VH、第一VL及第二Fc域單體；或 (b)該雙特異性抗體包含多肽鏈II-A、多肽鏈II-B及多肽鏈II-C；其中包含於多肽鏈II-A中之元件自N端至C端包含第二VL及CL；包含於多肽鏈II-B中之元件自N端至C端包含第二VH、重鏈CH1區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈II-C中之元件自N端至C端包含： (i)第一VL、第一VH及第一Fc域單體；或 (ii)第一VH、第一VL及第一Fc域單體。
實施例15. 如實施例13或14之抗體-藥物結合物，其中(a)該多肽鏈II-A包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列；該多肽鏈II-B包含SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列；及/或該多肽鏈II-C包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列；或(b)該多肽鏈II-A包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列；該多肽鏈II-B包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列；及/或該多肽鏈II-C包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列。
實施例16. 如實施例1至9中任一例之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域為scFab，且該第二抗原結合域為Fab。
實施例17. 如實施例16之抗體-藥物結合物，其中 (a)該雙特異性抗體包含多肽鏈IV-A、多肽鏈IV-B及多肽鏈IV-C；其中包含於多肽鏈IV-A中之元件自N端至C端包含第二VL及CL；包含於多肽鏈IV-B中之元件自N端至C端包含第二VH、重鏈CH1區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈IV-C中之元件自N端至C端包含： (i)第一VL、CL、第一VH、重鏈CH1區及第一Fc域單體；或 (ii)第一VH、重鏈CH1區、第一VL、CL及第一Fc域單體；或 (b)該雙特異性抗體包含多肽鏈IV-A、多肽鏈IV-B及多肽鏈IV-C；其中包含於多肽鏈IV-A中之元件自N端至C端包含第二VL及CL；包含於多肽鏈IV-B中之元件自N端至C端包含第二VH、重鏈CH1區及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈IV-C中之元件自N端至C端包含： (i)第一VL、CL、第一VH、重鏈CH1區及第一Fc單體；或 (ii)第一VH、重鏈CH1區、第一VL、CL及第一Fc域單體。
實施例18. 如實施例16或17之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈IV-A包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列；該多肽鏈IV-B包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列；及/或該多肽鏈IV-C包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列。
實施例19. 如實施例1至9中任一例之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自為Fab，且其中該第二抗原結合域Fab包含CrossMab形式之域交換。
實施例20. 如實施例19之抗體-藥物結合物，其中 (a)該雙特異性抗體包含多肽鏈V-A、多肽鏈V-B、多肽鏈V-C及多肽鏈V-D；其中包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、重鏈CH1區及第一Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二VH、CL及第二Fc域單體；及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VL及重鏈CH1區；或 (b)該雙特異性抗體包含多肽鏈V-A、多肽鏈V-B、多肽鏈V-C及多肽鏈V-D；其中包含於多肽鏈V-A中之元件自N端至C端包含第一VL及CL；包含於多肽鏈V-B中之元件自N端至C端包含第一VH、重鏈CH1區及第二Fc域單體；包含於多肽鏈V-C中之元件自N端至C端包含第二VH、CL及第一Fc域單體；及/或包含於多肽鏈V-D中之元件自N端至C端包含第二VL及重鏈CH1區。
實施例21. 如實施例19或20之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈V-A包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列；該多肽鏈V-B包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列；該多肽鏈V-C包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列；及/或該多肽鏈V-D包含SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列。
實施例22. 如實施例1至9中任一例之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域兩者皆為scFv。
實施例23. 如實施例22之抗體-藥物結合物，其中 (a)該雙特異性抗體包含多肽鏈VII-A及多肽鏈VII-B；其中包含於多肽鏈VII-A中之元件自N端至C端包含： (i)第一VL、第一VH及第一Fc域單體，或 (ii)第一VH、第一VL及第一Fc域單體；及/或 包含於多肽鏈VII-B中之元件自N端至C端包含： (x)第二VL、第二VH及該第二Fc域單體，或 (y)第二VH第二VL及第二Fc域單體；或 (b)該雙特異性抗體包含多肽鏈VII-A及多肽鏈VII-B；其中該多肽鏈VII-A自N端至C端包含： (i)第一VL、第一VH及第二Fc域單體，或 (ii)第一VH、第一VL及第二Fc域單體；及/或 包含於多肽鏈VII-B中之元件自N端至C端包含： (x)第二VL、第二VH及該第一Fc域單體，或 (y)第二VH、第二VL及第一Fc域單體。
實施例24. 如實施例22或23之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈VII-A包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈VII-B包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列。
實施例25. 如實施例11、14、17、20或23之抗體-藥物結合物，其中構成多肽鏈中之各者的相鄰元件視情況經由或不經由肽連接子連接。
實施例26. 如實施例25之抗體-藥物結合物，其中各肽連接子獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子，其中各肽連接子選自由剛性肽連接子及柔性肽連接子組成之群。
實施例27. 如實施例26之抗體-藥物結合物，其中各肽連接子係獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)殘基的肽連接子。
實施例28. 如實施例27之抗體-藥物結合物，其中各肽連接子獨立地包含包含胺基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 57)之肽連接子次單元的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯拷貝。
實施例29. 如實施例28之抗體-藥物結合物，其中各肽連接子獨立地包含SEQ ID NO: 55或56中所示之胺基酸序列。
實施例30. 如實施例11、14、17、20或23之抗體-藥物結合物，其中該CL包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列；及/或該重鏈CH1區包含SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
實施例31. 如實施例1至30中任一例之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含： (a)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 2或9中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及/或包含SEQ ID NO: 3或10中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C； (b)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 5或7中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及/或包含SEQ ID NO: 6或8中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C； (c)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-B及/或包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-C； (d)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-B、包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-C及/或包含SEQ ID NO: 12如中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-D；或 (e)包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-A及/或包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的多肽鏈VII-B。
實施例32. 如實施例28之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含： (a)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C； (b)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C； (c)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C； (d)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含7SEQ ID NO:中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C； (e)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-B及具有SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-C； (f)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-B、包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-C及包含SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-D；或 (g)包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-A及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-B。
實施例33. 如實施例1至30中任一例之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段具有與單特異性抗c-MET抗體及/或單特異性抗EGFR抗體相比增強的腫瘤抑制作用；且其中 (a)單特異性抗c-MET抗體之CDR的胺基酸序列與第一抗原結合域之CDR的胺基酸序列相同，且單特異性抗EGFR抗體之CDR的胺基酸序列與第二抗原結合域之CDR的胺基酸序列相同，或 (b)單特異性抗c-MET抗體之CDR的胺基酸序列與第二抗原結合域之CDR的胺基酸序列相同，且單特異性抗EGFR抗體之CDR的胺基酸序列與第一抗原結合域之CDR的胺基酸序列相同。
實施例34. 如實施例33之抗體-藥物結合物，其中該腫瘤抑制作用包括抑制EGFR及c-MET信號傳導路徑、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。
實施例35. 如實施例1至34中任一例之抗體-藥物結合物，其中M包含 ，且其中環A為5員至6員脂族雜環或5員至20員芳族環系統，且該脂族雜環及芳族環系統視情況經一個或多個獨立地選自由以下組成之群的基團置換：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、硫醇基及C 1-6烷基；M 1係選自單鍵及C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
實施例36. 如實施例1至34中任一例之抗體-藥物結合物，其中M包含 ，其中環A為5員脂族雜環、6員雜芳族環或藉由經由單鍵連接超過一個6員芳族雜環與一個苯環或藉由經由單鍵連接超過一個6員雜芳族環而形成的多環，且其中該脂族雜環視情況經一個或多個選自側氧基(=O)、鹵素及C 1-4烷基取代之基團取代；M 1係選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
實施例37. 如實施例1至34中任一例之抗體-藥物結合物，其中M為 ，其中環A係選自 、 、 、 、 、 及 ；M 1係選自單鍵、C 1-6伸烷基、C 2-6伸烯基、C 2-6伸炔基及胺基基團。
實施例38. 如實施例1至34中任一例之抗體-藥物結合物，其中M係選自 、 及 。
實施例39. 如實施例1至34中任一例之抗體-藥物結合物，其中M為 。
實施例40. 如實施例1至34中任一例之抗體-藥物結合物，其中M係選自 、 、 及 。
實施例41. 如實施例1至34中任一例之抗體-藥物結合物，其中M係選自 、 及 。
實施例42. 如實施例1至41中任一例之抗體-藥物結合物，其中L係選自包含以下中之一者或多者的結構：C 1-6伸烷基；-N(R')-；羰基；-O-；天然胺基酸或非天然胺基酸以及其等選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3))及包含1、2、3或4個胺基酸之肽的類似物； ； ； ； ； ； ； ； ； 及 ；其中R'表示氫、C 1-6烷基或含有1至10個環氧乙烷單元之聚乙二醇片段；且s係選自1至20之整數。
實施例43. 如實施例42之抗體-藥物結合物，其中該肽係選自Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Lys(Ac)、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75))。
實施例44. 如實施例1至41中任一例之抗體-藥物結合物，其中L係選自包含以下中之一者或多者的結構：C 1-6伸烷基、羰基、-NH-、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Ala、Val- Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75))、 、 、 、 及 ；其中s係選自1至20之整數。
實施例45. 如實施例1至41中任一例之抗體-藥物結合物，其中L係選自由以下中之一者或多者組成的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
實施例46. 如實施例1至41中任一例之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；
實施例47. 如實施例1至41中任一例之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 、 及 。
實施例48. 如實施例1至41中任一例之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 及 。 實施例49. 如實施例1至41中任一例之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 。 實施例50. 如實施例1至49中任一例之抗體-藥物結合物，其中E為單鍵或係選自以下結構：-NHCH 2-、 、 、 及 。 實施例51. 如實施例1至49中任一例之抗體-藥物結合物，其中E為單鍵、-NHCH 2-、 或 。
實施例52. 如實施例1至49中任一例之抗體-藥物結合物，其中E為-NHCH 2-或 。
實施例53. 如實施例1至49中任一例之抗體-藥物結合物，其中E為-NHCH 2-；較佳地，E為單鍵。
實施例54. 如實施例1至49中任一例之抗體-藥物結合物，其中E為 。
實施例55. 如實施例1至54中任一項之抗體-藥物結合物，其中 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、及 。
實施例56. 如實施例1至54中任一項之抗體-藥物結合物，其中 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 及 。
實施例57. 如實施例1至56中任一例之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓樸異構酶抑制劑及RNA聚合酶抑制劑。
實施例58. 如實施例57之抗體-藥物結合物，其中該微管蛋白抑制劑為澳瑞他汀化合物或類美登素化合物。
實施例59. 如實施例57之抗體-藥物結合物，其中該DNA嵌入劑為吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
實施例60. 如實施例57之抗體-藥物結合物，其中該DNA拓樸異構酶抑制劑為拓樸異構酶I抑制劑或拓樸異構酶II抑制劑。
實施例61. 如實施例60之抗體-藥物結合物，其中該拓樸異構酶I抑制劑係選自喜樹鹼、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康、拓樸替康、貝洛替康、如博替康及其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物，且該拓樸異構酶II抑制劑係選自阿黴素、PNU-159682、倍癌黴素、柔紅黴素、米托蒽醌、普達非倫毒素、依託泊苷及其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
實施例62. 如實施例57之抗體-藥物結合物，其中該RNA聚合酶抑制劑為α-瓢菌素或其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
實施例63. 如實施例1至56中任一例之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：由式I及式II表示之化合物，或該等由式I及式II表示之化合物的醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前驅體： 其中R 1及R 2各自獨立地選自C 1-6烷基及鹵素；R 3係選自H及-CO-CH 2OH；R 4及R 5各自獨立地選自H、鹵素及羥基，或R 4與R 5連接以形成5員至6員含氧雜環；R 6係選自氫或-C 1-4伸烷基-NR aR；R 7係選自C 1-6烷基、-C 1-4伸烷基-NR aR b、-C 1-4伸烷基-SiR aR bR c、-SiR aR bR c、-C 1-4伸烷基=N-OR a；其中R a、R b及R c在每次出現時係獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2-C 1-6烷基及-CO-C 1-6烷基；其中視情況，連接至相關原子之R a及R b形成5員至6員含氮雜環。 實施例64. 如實施例1至56中任一例之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；其中在將該細胞毒性藥物與該連接子連接之後獲得的該細胞毒性藥物之對應殘基為如實施例1之式中的D。 實施例65. 如實施例1至56中任一例之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ，其中在將該細胞毒性藥物與該連接子連接之後獲得的該細胞毒性藥物之對應殘基為如實施例1之式中的D。
實施例66. 如實施例64或65之抗體-藥物結合物，其中D為藉由自該細胞毒性藥物上之-OH、-NH 2或二級胺失去一個H而獲得的單價結構。
實施例67. 如實施例1至66中任一例之抗體-藥物結合物，其中該抗體-結合物係選自： ADC A-01 ， ADC A-02 ， ADC A-04 ， ADC A-05 ， ADC A-06 ， ADC A-07 ， ADC A-08 ， ADC A-09 ， ADC A-10 ， ADC A-11 ， ADC A-13 ， ADC A-14 ， ADC A-15 ， ADC A-16 ， ADC A-17 ， ADC A-18 ， ADC A-20 ， ADC A-21 ， ADC A-22 ， ADC A-24 ， ADC A-25 ， ADC A-26 ， ADC A-28 ， ADC A-29 ， ADC A-30 ， ADC A-32 ， ADC A-33 ， ADC A-34 ， ADC B-01 ， ADC B-02 ， ADC B-03 ， ADC B-04 ， ADC B-06 ， ADC B-07 ， ADC C-01 ， ADC C-02 ， ADC C-03 ， ADC C-04 ， ADC C-05 ， ADC C-06 ， ADC C-07 ， ADC C-08 ， ADC C-09 ， ADC C-10 ， ADC C-11 ， ADC C-12 ， ADC C-13 ， ADC C-14 ， ADC C-15 ， ADC C-16 ， ADC C-17 ， ADC C-18 ， ADC C-19 ， ADC C-20 ， ADC C-21 ， ADC C-22 ， ADC C-23 ， ADC C-24 ， ADC C-25 ， ADC C-26 ， ADC C-27 ，及 ADC C-28 ； 其中Ab為如實施例1至34中任一項所定義的雙特異性抗體或其抗原結合片段； 及 表示該雙特異性抗體或其抗原結合片段中Cys殘基之硫氫基與該抗體-藥物結合物之M的特異性連接模式；且x表示載藥量。
實施例68. 如實施例67之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段中之該硫氫基與該抗體-藥物結合物之M經由加成反應或取代反應形成硫醚鍵，以獲得該抗體-藥物結合物。
實施例69. 如實施例67至68之抗體-藥物結合物，其中Ab為選自由以下組成之群的雙特異性抗體：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B。
實施例70. 一種抗體-藥物結合物，其選自由以下組成之群：ADC 07B-A-05、ADC 07B-A-14、ADC 38B-A-14、ADC 49B-A-14、ADC 49B-B-01、ADC 49B-A-05、ADC 41B-A-05、ADC 55B-A-14及ADC 56B-A-14。
實施例71. 一種組合物，其包含一種或多種如實施例1至70中任一例之抗體-藥物結合物。
實施例72. 如實施例71之組合物，其中該組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為1至10。
實施例73. 如實施例71之組合物，其中該組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、4至5、4至6、4至7、4至8、4至9、4至10、5至6、5至7、5至8、5至9、5至10、6至7、6至8、6至9、6至10、7至8、7至9、7至10、8至9、8至10或9至10。
實施例74. 如實施例71之組合物，其中該組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為3至9。
實施例75. 如實施例71之組合物，其中該組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為4至8。
實施例76. 如實施例71之組合物，其中該組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為3.0至3.5、3.0至4.0、3.0至4.5、3.0至5.0、3.0至5.5、3.0至6.0、3.5至4.0、3.5至4.5、3.5至5.0、3.5至5.5、3.5至6.0、3.5至6.5、3.5至7.0、3.5至7.5、3.5至8.0、4.0至4.5、4.0至5.0、4.0至5.5、4.0至6.0、4.0至6.5、4.0至7.0、4.0至7.5、4.0至8.0、4.5至5.0、4.5至5.5、4.5至6.0、4.5至6.5、4.5至7.0、4.5至7.5、4.5至8.0、5.0至5.5、5.0至6.0、5.0至6.5、5.0至7.0、5.0至7.5、5.0至8.0、5.5至6.0、5.5至6.5、5.5至7.0、5.5至7.5、5.5至8.0、6.0至6.5、6.0至7.0、6.0至7.5、6.0至8.5、6.5至7.0、6.5至7.5、6.5至8.5、7.0至7.5、7.0至9.0或7.5至9.0。
實施例77. 一種醫藥組合物，其含有一種或多種如實施例1至70中任一例之抗體-藥物結合物或如實施例71之組合物及一種或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
實施例78. 如實施例77之醫藥組合物，其中該醫藥組合物進一步包含一種或多種選自由以下組成之群的額外醫藥活性劑：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
實施例79. 一種藥物組合，其包含第一治療劑及第二治療劑，其中該第一治療劑及該第二治療劑係同時或依序投與；該第一治療劑係選自如實施例1至70之抗體-藥物結合物或如實施例71至76中任一例之組合物中之一者或多者；且該第二治療劑係選自由以下組成之群：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET抑制劑、VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
實施例80. 一種如實施例1至70中任一例之抗體-藥物結合物、如實施例71至76中任一例之組合物或如實施例77或78之醫藥組合物在製備藥品中的用途或如實施例79之藥物組合，其中該藥品係用於預防個體的與c-MET及/或EGFR有關之疾病及/或治療該等疾病及/或輔助治療該等疾病，及/或用於活體外或在個體體內抑制c-MET細胞或c-MET及/或EGFR之活性；其中該等與c-MET及/或EGFR有關之疾病為EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或與MET基因擴增相關的c-MET癌症。
實施例81. 如實施例80之用途，其中該疾病係選自上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌、前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌及頭頸癌。
實施例82. 如實施例80或81之用途，其中該抗體-藥物結合物或醫藥組合物及另一種藥物係以組合方式同時、分開或依序投與；其中該額外醫藥學活性劑係選自：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
實施例83. 一種用於抑制細胞中c-MET及/或EGFR之活性的方法，其包含將該等細胞與如實施例1至70中任一例之抗體-藥物結合物、如實施例71至76中任一例之組合物、如實施例77或78之組合物或醫藥組合物或如實施例79之藥物組合合併；其中該等細胞為表現c-MET及/或EGFR之細胞。
實施例84. 一種用於預防及/或治療及/或輔助治療個體之與c-MET及/或EGFR相關之疾病的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的如實施例1至70中任一例之抗體-藥物結合物、如實施例71至76中任一例之組合物、如實施例77或78之醫藥組合物或如實施例79之藥物組合，其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為包含EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增之疾病，如癌症。
實施例85. 如實施例84之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌及前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。
實施例86. 如實施例84或85之方法，其中該方法進一步包含向個體投與第二療法，該第二療法係選自由以下組成之群：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任何組合；視情況，該第二療法可同時、分開或依序施用。
實施例87. 如實施例1至70中任一例之抗體-藥物結合物、如實施例71至76中任一例之組合物、如實施例77或78之醫藥組合物或如實施例79之藥物組合，其用於預防及/或治療及/或輔助治療個體之與c-MET及/或EGFR相關之疾病，其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為包含EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增之疾病，如癌症。
實施例88. 如實施例87之抗體-藥物結合物，其中該癌症係選自由以下組成之群：上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌及前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。
實施例89. 如實施例87或88之抗體-藥物結合物，其中該方法進一步包含向個體投與第二療法，該第二療法係選自由以下組成之群：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任何組合；視情況，該第二療法可同時、分開或依序施用。
實施例90. 一種雙特異性抗體(BsAb)結合物，其包含選自由以下組成之群的雙特異性抗體：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B；與選自由以下組成之群的連接子-有效負載中之一者或多者結合：M-01、A-05、A-07、A-14、B-01、B-02、B-03、C-10、C-17、C-19、C-21及C-23。
實施例91. 一種雙特異性抗體(BsAb)結合物，其包含選自由以下組成之群的雙特異性抗體：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B；與連接子-有效負載之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個分子結合，其中該連接子-有效負載係選自由以下組成之群：M-01、A-05、A-07、A-14、B-01、B-02、B-03、C-10、C-17、C-19、C-21及C-23。
實施例92.一種用於產生雙特異性抗體(BsAb)結合物的方法，其包含：提供選自由以下組成之群的BsAb：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B，及選自由以下組成之群的連接子-有效負載：M-01、A-05、A-07、A-14、B-01、B-02、B-03、C-10、C-17、C-19、C-21及C-23；將該BsAb與該連接子-有效負載混合，得到反應混合物；在適合於產生該BsAb結合物的條件下培育反應混合物；及自該反應混合物分離該BsAb結合物，產生該BsAb結合物。
實施例93. 一種用於產生估計DAR為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之雙特異性抗體(BsAb)結合物的方法，其包含：提供選自由以下組成之群的BsAb：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B，及選自由以下組成之群的連接子-有效負載：M-01、A-05、A-07、A-14、B-01、B-02、B-03、C-10、C-17、C-19、C-21及C-23；將一量額之該BsAb與一量額之該連接子-有效負載混合，得到能夠產生估計DAR為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之BsAb結合物的反應混合物；在適合於產生估計DAR為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之該BsAb結合物的條件下培育該反應混合物；及自該反應混合物分離該BsAb結合物，產生估計DAR為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之該BsAb結合物。 序列資訊
對包含本文之ADC的雙特異性抗體之各種實施例所涵蓋的序列之描述提供於下表中。
SEQ ID NO: 描述 胺基酸序列
1 BsAb 07B、49B及55B之LC [抗c-MET-VL:CL] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2 BsAb 07B之HC [抗c-MET-VH: Fc:D356E:L358M:KIH-杵:S354C:T366W (Fc Eu編號方案)] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCR EE MTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3 BsAb 07B之scFv-Fc [抗EGFR-VL:抗EGFR-VH: Fc:D356E:L358M:KIH-hole:Y349C: T366S:L368A:Y407V (Fc Eu編號方案)] AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS GGGG DKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSR EE MTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4 BsAb 10B、38B及41B之LC [抗EGFR-VL:CL] AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
5 BsAb10B之HC [抗EGFR-VH: Fc:D356E:L358M:KIH-杵:S354C:T366W (Fc Eu編號方案)] QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCR EE MTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6 BsAb 10B之scFv-Fc [抗c-MET-VL:抗c-MET-VH: Fc:D356E:L358M:KIH-hole:Y349C: T366S:L368A:Y407V (Fc Eu編號方案)] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS GGGGDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSR EE MTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7  BsAb 38B及41B之HC [抗EGFR-VH: Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-杵:S354C:T366W (Fc Eu編號方案)] QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
8 BsAb 38B及56B之scFv-Fc [抗c-MET-VL:抗c-MET-VH: Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-臼:Y349C: T366S:L368A:Y407V (Fc Eu編號方案)] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS GGGG DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
9 BsAb 49B及55B之HC [抗c-MET-VH: Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-杵:S354C:T366W (Fc Eu編號方案)] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10 BsAb 49B之scFv-Fc [抗EGFR-VL:抗EGFR-VH: Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-臼:Y349C: T366S:L368A:Y407V (Fc Eu編號方案)] AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS GGGG DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
11 BsAb 41B之scFab-Fc [抗cMET-VL (Q106C):抗c-MET-VH (G304C): Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-臼:Y349C: T366S:L368A:Y407V (Fc Eu編號方案)] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFG CGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGK CLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
12 BsAb 55B之VL-CH1 [抗EGFR-VL:CH1] AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
13 BsAb 55B之VH-CL-Fc [抗EGFR-VH:CL: Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-臼:Y349C: T366S:L368A:Y407V (Fc Eu編號方案)] QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS ASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
14 BsAb 56B之scFv-Fc [抗EGFR-VL:抗EGFR-VH: Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-杵:S354C:T366W (Fc Eu編號方案)] AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS GGGG DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15 抗EGFR-VL AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK
16 抗EGFR-VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS
17 抗c-MET-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIK
18 抗c-MET-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS
19 抗EGFR-CDR-L1 (Kabat/Chothia/Abm定義) RASQDISSALV
20 抗EGFR-CDR-L1 (IMGT定義) QDISSA
21 抗EGFR-CDR-L2 (Kabat/Chothia/Abm定義) DASSLES
22 抗EGFR-CDR-L2 (IMGT定義) DAS
23 抗EGFR-CDR-L3 (Kabat/Chothia/Abm/IMGT定義) QQFNSYPLT
24 抗EGFR-CDR-H1 (Kabat定義) TYGMH
25 抗EGFR-CDR-H1 (Chothia定義) GFTFSTY
26 抗EGFR-CDR-H1 (IMGT定義) GFTFSTYG
27 抗EGFR-CDR-H1 (Abm定義) GFTFSTYGMH
28 抗EGFR-CDR-H2 (Kabat定義) VIWDDGSYKYYGDSVKG
29 抗EGFR-CDR-H2 (Chothia定義) WDDGSY
30 抗EGFR-CDR-H2 (IMGT定義) IWDDGSYK
31 抗EGFR-CDR-H2 (Abm定義) VIWDDGSYKY
32 抗EGFR-CDR-H3 (Kabat/Chothia/Abm定義) DGITMVRGVMKDYFDY
33 抗EGFR-CDR-H3 (IMGT定義) ARDGITMVRGVMKDYFDY
34 抗c-MET-CDR-L1 (Kabat/Chothia/Abm定義) KSSQSLLYTSSQKNYLA
35 抗c-MET-CDR-L1 (IMGT定義) QSLLYTSSQKNY
36 抗c-MET-CDR-L2 (Kabat/Chothia/Abm定義) WASTRES
37 抗c-MET-CDR-L2 (IMGT定義) WAS
38 抗c-MET-CDR-L3 (Kabat/Chothia/Abm/IMGT定義) QQYYAYPWT
39 抗c-MET-CDR-H1 (Kabat定義) SYWLH
40 抗c-MET-CDR-H1 (Chothia定義) GYTFTSY
41 抗c-MET-CDR-H1 (IMGT定義) GYTFTSYW
42 抗c-MET-CDR-H1 (Abm定義) GYTFTSYWLH
43 抗c-MET-CDR-H2 (Kabat定義) MIDPSNSDTRFNPNFKD
44 抗c-MET-CDR-H2 (Chothia定義) DPSNSD
45 抗c-MET-CDR-H2 (IMGT定義) IDPSNSDT
46 抗c-MET-CDR-H2 (Abm定義) MIDPSNSDTR
47 抗c-MET-CDR-H3 (Kabat/Chothia/Abm定義) YRSYVTPLDY
48 抗c-MET-CDR-H3 (IMGT定義) ATYRSYVTPLDY
49 BsAb 07B及10B之Fc (DELM:KIH) (杵) [Fc:D356E:L358M:KIH-杵:S354C:T366W (Fc Eu編號方案)] APE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCR EE MTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
50 BsAb 07B及10B之Fc (DELM:KIH) (臼) [Fc:D356E:L358M:KIH-臼 (Y349C: T366S:L368A:Y407V Fc Eu編號方案)] APE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSR EE MTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
51 BsAb 38B、41B、49B、55B及56B之Fc (LALAPA:KIH (杵) [Fc:L234A:L235A:P329A: KIH-杵:S354C:T366 W (Fc Eu編號方案)] APE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
52 BsAb 38B、41B、49B、55B及56B之Fc (LALAPA:KIH (臼) [Fc:(L234A:L235A:P329A):KIH-臼 (Y349C: T366S:L368A:Y407V Fc Eu編號方案)] APE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
53 BsAb 07B、10B、38B、41B、49B及55B之CL RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
54 CH1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
55 肽連接子-1 (GGGGS) 3 GGGGSGGGGSGGGGS
56 肽連接子-2 (GGGGS) 8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
57 肽連接子 GGGGS
58 肽連接子(GGGGS) 4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
59 抗c-MET-VL (Q106C) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFG CGTKVEIK
60 抗c-MET-VH (G44C) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGK CLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS
61 肽連接子 GGGG
62 重鏈CH1鉸鏈區 DKTHTCPPCP
63 BsAb 55B之CL ASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
64 突變人類IgG1重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
65 肽連接子(GGGGS) 2 GGGGSGGGGS
66 肽連接子(GGGGS) 5 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
67 肽連接子(GGGGS) 6 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
68 肽連接子(GGGGS) 7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
69 肽連接子(GGGGS) 9 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
70 肽連接子(GGGGS) 10 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
71 Gly-Gly-Phe-Gly肽1 GGFG
72 Gly-Gly-Val-Ala肽2 GGVA
73 Gly-Phe-Leu-Gly肽3 GFLG
74 Glu-Ala-Ala-Ala肽4 EAAA
75 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly肽5 GGGGG
實例
將經由描述特定實施例在下文進一步描述本發明，但此並不意欲限制本發明。在不脫離本發明之基本思想及範圍之情況下，熟習此項技術者可基於本發明之教示進行各種修改或改良。
以下實例中所描述的化合物之結構係藉由NMR ( 1H NMR)或質譜(MS)確定。
核磁共振( 1H NMR)係使用Bruker 400 MHz核磁共振儀量測；氘化試劑為六氘化二甲亞碸(DMSO-d6)；內標物為四甲基矽烷(TMS)。
實例中使用的核磁共振(NMR)譜中之縮寫如下所示。 s：單峰(Single peak/單峰)，d：雙重峰，t：三重峰，q：四重峰，m：多重峰，br：寬峰，J：偶合常數，Hz：赫茲，DMSO-d6：氘化二甲亞碸。δ值以ppm值表示。
質譜(MS)使用Agilent (ESI)質譜儀型號Agilent 6120B來量測。 實例1. 化合物製備 1.1. N-((S)-10-苯甲基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(M-01)之製備。
將化合物IM-1 (0.40 g，640.59 μmol，其合成參考專利申請案CN 111936169A)及甲磺酸依喜替康(exatecan mesylate) (0.37 g，704.65 μmol)溶解於DMF (8 mL)中，且添加HATU (0.32 g，832.77 μmol)及DIPEA (0.25 g，1.92 mmol)，所得混合物在25℃反應4小時。減壓移除DIPEA且藉由添加水冷凍乾燥以移除大部分DMF，從而獲得粗產物。藉由製備型高效液相層析(條件如下)純化粗產物，獲得273 mg 化合物M-01。 管柱：Waters XBridge Prep C18 OBD 45 mm × 450 mm × 8.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 70
5.00 30 70 70
60.00 70 30 70
M-01之結構表示數據如下： ESI-MS (m/z): 1034.4[M+H] +。 1.2. N-((S)-10-苯甲基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧基-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺(A-05)之製備。
在氮氣保護下，將2,5-二側氧基吡咯啶-1-基-6-(2-(甲磺酸酯)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯(IM-2，0.66 g，1.80 mmol)及(R)-16-胺基-10-苯甲基-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷酸(IM-3，0.75 g，1.77 mmol)添加至DMF (19 mL)中，且使溫度升至35℃。反應16小時之後，將(1S,9S)-1-胺基-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并[de]哌喃[3', 4': 6, 7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(1-4，1.00 g，1.77 mmol)添加至系統中，藉由冰水冷卻至5℃至15℃。添加DMTMM (0.98 g，3.53 mmol)，接著在25℃滴入DIPEA (1.14 g，8.84 mmol)，反應時間為16小時。將反應溶液倒入DCM (600 mL)、IPA (60 mL)及水(100 mL)之混合物中且攪拌10分鐘。將DCM相分離，用鹽水(100 ml)洗滌，濃縮，獲得粗產物，且使用製備型高效液相層析純化。純化之後，藉由冷凍乾燥獲得0.98 g 化合物A-05。
A-05之分離及純化方法如下： 管柱：Waters SunFire Prep C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 24
2.00 30 70 24
18.00 80 20 24
A-05之結構表示數據如下： MS m/z (ESI): 1107.3 [M+H]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.10 (s, 2H), 8.66 - 8.63 (m, 1H), 8.51 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.34 - 8.31 (m, 1H), 8.21 - 8.19 (m, 1H), 8.17 - 8.09 (m, 2H), 8.08 - 8.04 (m, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.26 - 7.15 (m, 5H), 6.55 (s, 1H), 5.56 - 5.55 (m, 1H), 5.48 - 5.35 (m, 2H), 5.25 - 5.10 (m, 2H), 4.64 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 4.45 - 4.44 (m, 1H), 4.06 - 3.98 (m, 2H), 3.77 - 3.52 (m, 6H), 3.41 (s, 3H), 3.25 - 3.12 (m, 2H), 3.03 - 3.00 (m, 1H), 2.83 - 2.72 (m, 1H), 2.58 - 2.56 (m, 2H), 2.48 (s, 3H), 2.33 - 2.30 (m, 2H), 2.21 - 2.13 (m, 2H), 1.91 - 1.76 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。 1.3. N-((S)-10-苯甲基-1-(((1S,9S)-5-氟-9-乙基-9-羥基-4-氯-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧基-5,8,11,14-四氮雜十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺(A-07)之製備。
在氮氣保護下，將2,5-二側氧基吡咯啶-1-基-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯(IM-2，21.6 mg，0.059 mmol)及(R)-16-胺基-10-苯甲基-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六烷酸(IM-3，24.5 mg，0.058 mmol)添加至DMF (1 mL)中，且使溫度升至35℃。反應16小時之後，將(1S, 9S)-1-胺基-5-氟-9-乙基-9-羥基-4-氯-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮三氟乙酸鹽(30.0 mg，0.053 mmol)、HATU (30 mg, 0.079 mmol)及DIPEA (27.2 mg, 0.21 mmol)添加至系統中。在25℃下培育反應系統16小時之反應時間。藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得26.4 mg化合物A-07。
A-07之分離及純化方法如下： 管柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm × 150 mm × 5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0 30 70 28
2 30 70 28
18 90 10 28
A-07之結構表示數據如下： ESI-MS (m/z): 1111.3[M+H] +。 1.4. N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10-二甲基-1,6,9,12-四側氧基-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十四烷-13-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺(A-14)之製備。
步驟一：將化合物IM-4 (657 mg，1.22 mmol)及化合物1-4 (500 mg，1.11 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10 mL)中，之後添加HATU (630.67 mg，1.66 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(428 mg，3.32 mmol)，且在室溫攪拌1小時。反應完成後，藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得700 mg IM-5化合物。
製備型HPLC純化方法如下： 管柱：Waters SunFire Prep C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 90 10 28
步驟二：將化合物IM-5 (500 mg，0.513 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(2 mL)中，添加二乙胺(75.05 mg，1.03 mmol)，且在室溫進行反應1小時。反應之後，藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得307 mg IM-6化合物。
製備型HPLC純化方法如下： 管柱：Waters SunFire Prep C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 20 80 24
2.00 20 80 24
18.00 80 20 24
步驟三：將IM-6 (170 mg，0.226 mmol)及化合物IM-2 (90.83 mg，0.249 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10 mL)中且添加N,N-二異丙基乙胺(29.21 mg，0.226 mmol)。在室溫攪拌反應溶液16小時。藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得50.56 mg化合物A-14。
其結構表徵數據如下： MS m/z (ESI): 1002.4 [M+H] +
製備型HPLC純化方法如下： 管柱：Waters SunFire Prep C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 90 10 28
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.11 (s, 2H), 8.68 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 8.49 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.65-5.55 (m, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 4.67-4.55 (m, 2H), 4.29-4.15 (m, 3H), 3.98 (s, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.25-3.15 (m, 2H), 2.57-2.56 (m, 2H), 2.35-2.27 (m, 2H), 2.22-2.12 (m, 2H), 1.91-1.75 (m, 4H), 1.23-1.09 (m, 9H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。 1.5. 4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)苯甲基((S)-4-乙基-11-(2-(N-(異丙基)甲基磺醯胺基)乙基)-3,14-二側氧基-3,4,12,14-四氫-1H-哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯(B-01)之製備。
步驟一：將化合物B-01-1 (413.40 mg，0.251 mmol，其合成參考專利CN111295389B)溶解於二甲亞碸及水(2.0 mL:0.5 mL)中，添加溴化銅(72.95 mg，0.503 mmol)及6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔醯胺(95.10 mg，0.302 mmol)，且攪拌溶液1小時，接著過濾。藉由製備型高效液相層析(條件如下)純化濾液，獲得30.00 mg 化合物B-01-2。 管柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm × 150 mm × 5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 40 60 28
8.00 40 60 28
50.00 90 10 28
步驟2：將化合物B-01-2 (30.00 mg，0.02 mmol)溶解於二氯甲烷(1.0 mL)中，添加三氟乙酸(0.2 mL)，且在室溫進行反應30 min。將反應溶液減壓濃縮且藉由製備型高效液相層析(條件如下)純化，獲得20.00 mg 化合物B-01之三氟乙酸鹽。 管柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm × 150 mm × 5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 15 85 28
8.00 15 85 28
50.00 60 40 28
結構表徵數據如下：ESI-MS (m/z): 1631.7 [M+H] +, 816.0[M/2+H] +。 1.6. 4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺))甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氮雜-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)苯甲基((1S,9R)-9-乙基-5-氟-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-02)之製備。
步驟一：在25℃，將1-1之甲磺酸鹽(30.00 mg，56.44 μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1 mL)中，且按順序添加六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(58.74 mg，112.88 μmol)、N,N-二異丙基乙胺(43.76 mg，338.63 μmol)及2-((三級丁基二苯基矽基)氧基)乙酸(26.62 mg，84.66 μmol)，維持在25℃，持續1小時之反應時間。用液相質譜監測反應。反應完成後，將水添加至反應溶液中，用乙酸乙酯萃取反應溶液，合併有機相，經硫酸鈉乾燥且減壓濃縮，且藉由薄層層析(二氯甲烷:甲醇=15:1)分離粗產物，獲得27.00 mg 化合物B-02-1。
步驟二：在0℃，將B-02-1 (20 mg，27.33 μmol)溶解於二氯甲烷(2 mL)中，且按順序添加含4-二甲基胺基吡啶(26.71 mg，218.61 μmol)及三光氣(8.11 mg，27.33 μmol)之二氯甲烷(0.5 mL)，且維持在0℃，持續0.5小時之反應時間。用氮氣置換殘餘三光氣且逐滴添加含(S)-2-(32-疊氮基-5-側氧基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧雜-6-氮雜三十二醯胺基)-N-(4-(羥甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)胺基)己醯胺(43.46 mg，40.99 μmol)之二氯甲烷(1 mL)，且維持在0℃，持續0.5小時之反應時間。使用液相質譜監測反應。反應完成後，濃縮反應溶液，且粗產物藉由薄層層析(二氯甲烷:甲醇= 15:1)且純化，獲得30.00 mg 化合物B-02-2。
步驟三：在25℃將B-02-2 (250.00 mg，137.51 μmol)溶解於DMSO (2 mL)及水(0.4 mL)之混合溶劑中，且添加6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔醯胺(62.98 mg，206.26 μmol)及溴化銅(39.45 mg，275.01 μmol)，且保持在25℃反應1小時；使用液相質譜層析監測反應。反應完成後，藉由製備型高效液相層析(條件如下文所示)純化反應溶液，且冷凍乾燥製備溶液，獲得150.00 mg 化合物B-02-3。 管柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm × 150 mm × 5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0 15 85 28
18 90 10 28
步驟四：在25℃將B-02-3 (150 mg，49.45 μmol)溶解於四氫呋喃(1 mL)中，且逐滴添加氟化四丁基銨(1 M四氫呋喃溶液)/冰乙酸(v/v=13/1) (50 μL)之混合物，且在25℃保持反應0.5小時，且用液相質譜監測。反應完成後，藉由製備型高效液相層析(條件如下)純化反應溶液，且冷凍乾燥製備溶液，獲得50.00 mg 化合物B-02-4。 管柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm× 150 mm× 5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0 15 85 28
20 90 10 28
步驟五：在25℃將B-02-4 (50 mg，26.52 μmol)溶解於二氯甲烷(1 mL)中，添加三氟乙酸(60.49 mg，530.49 μmol)，且將反應維持在25℃下0.5小時。用液相質譜監測反應。反應完成後，濃縮反應溶液，藉由製備型高效液相層析(條件如下)純化粗產物，且冷凍乾燥製備溶液，獲得23.69 mg 化合物B-02。 管柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm× 150 mm× 5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0 15 85 28
18 90 10 28
B-02之結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z):1613.6[M+H] +。 1.7. N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五側氧基-3,17,20,23-四氧雜-5,8,11,14-四氮雜二十五烷-25-基)-3,5-雙(2-(甲基磺醯基)嘧啶-4-基)苯甲醯胺(C-07)之製備。
步驟一：將原材料C-07-1 (4.80 g，16.33 mmol)、三丁基(2-甲基硫嘧啶--4-基)錫(16.27 g，39.19 mmol)及雙三苯基膦二氯化鈀(2.29 g，3.27 mmol)溶解於1,4-二噁烷(100 mL)中，且在氮氣氛圍下在110℃攪拌反應系統5小時，使用LC-MS監測反應，濃縮反應系統且經由管柱層析(EA/PE=0-50%)純化，獲得1.36 g化合物C-07-2。
步驟二：將化合物C-07-2 (510 mg，1.33 mol)、NaOH (212.24 mg，5.31 mmol)溶解於THF (12.5 mL)、MeOH (12.5 mL)及H 2O (2.5 mL)中。在25℃攪拌反應物2小時。用LC-MS監測反應。使用3 N HCl將系統之pH調節至約2。沉澱出大量固體。過濾反應物，收集濾餅，且乾燥，獲得380 mg化合物C-07-3。
步驟三：將化合物C-07-3 (315 mg，850.32 μmol)、2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基乙酸三級丁酯(246.31 mg，935.35 μmol)、HATU (484.99 mg，1.28 mmol)、DIPEA (329.69 mg，2.55 mmol)添加至DMF (3 mL)中，且在25℃反應2小時。藉由LC-MS監測反應。藉由製備型高效液相層析純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得40 mg化合物C-07-3。其製備方法如下： 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 55 45 24
2.00 55 45 24
18.00 100 0 24
步驟四：將化合物C-07-4 (40 mg，64.96 μmol)溶解於DCM (3 mL)及TFA (1.5 mL)中，在25℃反應1.5小時，使用LC-MS監測反應，且將反應系統濃縮至乾燥，獲得36 mg化合物C-07-5。
步驟五：合併化合物C-07-5 (26 mg，46.46 μmol)、過碘酸鈉(99.37 mg，464.57 μmol)、RuCl 3•H 2O (9.64 mg，46.46 μmol)且溶解於ACN (15 mL)及水(7.5 mL)中，且保持在25℃反應40分鐘。用LC-MS監測反應。添加水及乙酸乙酯以進行萃取，且濃縮乙酸乙酯層，獲得28 mg化合物C-07-6。
步驟六：將化合物甲磺酸依喜替康(600 mg，1.13 mmol)、5S,8S,11S)-1-(9H-茀-9-基)-5,8,11-三甲基-3, 6, 9, 12-四氧基-2,15-二氧雜-4,7,10,13-四氮雜十七烷-17-酸(IM-4，610.17 mg，1.13 mmol)、HATU (643.81 mg，1.69 mmol)、DIPEA (437.65 mg，3.39 mmol)添加至DMF (6 mL)，且在25℃反應16小時。藉由LC-MS監測反應。將水添加至反應溶液中，沉澱出大量固體，過濾且收集。將固體溶解於DCM中且濃縮，獲得粗產物，藉由管柱層析(DCM/MeOH=0-10%)純化，獲得660 mg化合物C-07-7。
步驟7：將化合物C-07-7 (660 mg，688.94 μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(6 mL)中，添加二乙胺(251.94 mg，3.44 mmol)，且在室溫進行反應，持續1小時。反應之後，藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得325 mg化合物C-07-8。其製備方法如下： 管柱：Waters SunFire Prep C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 10 90 28
4.00 10 90 28
20.00 90 10 28
步驟八：將化合物C-07-6 (15.95 mg，25.58 μmol)、C-07-8 (20 mg，25.58 μmol)、HATU (14.59 mg，38.37 μmol)及DIPEA (9.92 mg，76.75 μmol)添加至DMF (3 mL)，且在25℃保持反應2 h。藉由LC-MS監測反應。藉由製備型高效液相層析純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得7 mg化合物C-07。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1342.4 [M+H] +。
其製備方法如下： 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 20 80 24
2 20 80 24
18.00 90 10 24
1.8. N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五側氧基-3,17,20,23-四氧雜-5,8,11,14-四氮雜二十五烷-25-基)-3,5-雙(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)苯甲醯胺(C-10)之製備
步驟一：合併原材料C-07-1 (720 mg，2.45 mmol)、2-甲基硫嘧啶-5-硼酸(874 mg，5.14 mmol)、XPhosPd G3 (207 mg，245 μmol)、K 3PO 4(1.56 g，7.35 mmol)且添加至1,4-二噁烷(12 mL)及H 2O (4 mL)之混合溶劑，在氮氣氛圍下在90℃攪拌反應系統3小時。用LC-MS監測反應，經由矽藻土過濾，且將水及乙酸乙酯添加至濾液，萃取且濃縮，獲得粗產物，藉由管柱層析(EA/PE=0-25%)純化，獲得710 mg化合物C-10-1。
步驟二：將化合物C-10-1 (650 mg，1.69 mol)及氫氧化鋰(121 mg，5.07 mmol)溶解於THF (2 mL)、MeOH (2 mL)及H 2O (2 mL)中。在25℃攪拌反應物2小時。用LC-MS監測反應。使用1 N HCl將系統之pH調節至約2。沉澱出大量固體。過濾沉澱物，且收集濾餅並乾燥，獲得560 mg之化合物C-10-2。
步驟三：將化合物C-10-2 (450.80 mg，1.22 mmol)溶解於DCM (10 mL)中，將m-CPBA (2.46 g，12.1 mmol，純度85%)添加至反應系統中，且將反應維持在25℃下12小時並用LC-MS監測。藉由氮氣流乾燥溶劑，獲得粗產物，藉由製備型高效液相層析純化，接著冷凍乾燥，獲得153 mg化合物C-10-3。
其製備方法如下： 管柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10um。 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%鹽酸) 移動相：[水(HCl)-ACN]；B%：13%-43%，10min)。
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 13 87 25
10.00 43 57 25
18.00 90 10 25
步驟四：將化合物C-10-3 (140 mg，322.25 μmol)、2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基乙酸三級丁酯(84.86 mg，322.25 μmol)、HATU (183.80 mg，483.37 μmol)、DIPEA (124.94 mg，966.75 μmol)添加至DMF (4 mL)，且在25℃反應2小時。藉由LC-MS監測反應。藉由製備型高效液相層析純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得51 mg化合物C-10-4。
其製備方法如下： 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 24
2.00 30 70 24
18.00 90 10 24
步驟五：將化合物C-10-4 (50 mg，73.56 μmol)添加至DCM (2 mL)及TFA (1 mL)中，在25℃反應1小時，使用LC-MS監測，且使反應系統濃縮至乾燥，獲得45 mg化合物C-10-5。
步驟六：將化合物C-10-5 (31.91 mg，51.17 μmol)、C-07-8 (40 mg，51.17 μmol)、HATU (29.18 mg，76.75 μmol)、DIPEA (19.84 mg，153.50 μmol)添加至DMF (3 mL)，且將反應維持在25℃下2 h。藉由LC-MS監測反應。藉由製備型高效液相層析純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得13 mg化合物C-10。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1342.5 [M+H] +。
其製備方法如下： 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 20 80 24
2.00 20 80 24
18.00 90 10 24
1.9. N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氯-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15 -六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五側氧基-3,18,21,24-四氧雜-5,8,11,14-四氮雜二十六烷-26-基)-3,5-雙(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)苯甲醯胺(C-17)之製備。
步驟一：將C-10-2 (3.00 g，8.10 mmol)及3-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-丙酸三級丁酯(2.25 g，8.10 mmol)添加至DMF (3 mL)，之後添加HOBt (3.28 g，24.3 mmol)、EDCI (4.66 g，24.3 mmol)及DIPEA (4.19 g，32.4 mmol，5.64 mL)，且使溫度升至60℃，保持2小時。將水(50 mL)添加至反應溶液中，用乙酸乙酯(30 mL×3)萃取，合併之有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，獲得粗C-17-1 (3.8 g，4.75 mmol)，其不經純化即直接用於下一步驟。
步驟二：將C-17-1 (3.40 g，5.40 mmol)溶解於二氯甲烷(30 mL)中，且添加三氟乙酸(10.8 g，94.2 mmol，7 mL)。在25℃攪拌反應溶液2小時。直接濃縮反應溶液，藉由製備型高效液相層析純化，接著冷凍乾燥，獲得C-17-2 (2.09 g，3.64 mmol)。
其製備方法如下： 管柱：Phenomenex luna C18 (250 mm*70mm*10 μm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 30
22.00 60 40 30
步驟三：將C-17-2 (56 mg，97.61 μmol)添加至乙腈(6 mL)及水(3 mL)中，接著將過碘酸鈉(208.79 mg，976.15 μmol)及三氯化釕水合物(8.10 mg，39.05 μmol)添加至反應系統，在25℃攪拌30分鐘且用LC-MS監測。添加水及乙酸乙酯以進行萃取且濃縮，獲得C-17-3 (60 mg)。
步驟四：將IM-6 (20 mg，25.06 μmol)、C-17-3 (16 mg，25.06 μmol)、HATU (19.05 mg，50.11 μmol)、DIPEA (16.19 mg，125.28 μmol)按順序添加至DMF (3 mL)，且將反應系統調節至25℃並維持1小時。藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得C-17 (16 mg)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1371.4 [M+H] +。
其製備方法如下： 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 20 80 30
2.00 20 80 30
18.00 80 20 30
1.10. N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五側氧基-3,18,21,24-四氧雜-5,8,11,14-四氮雜二十六烷-26-基)-2,6-雙(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)異菸鹼醯胺(C-19)之製備。
步驟一：合併C-19-1 (5.00 g，16.9 mmol)、(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)硼酸(6.34 g，37.3 mmol)、XPhos Pd G3 (1.44 g，1.70 mmol)及磷酸鉀(10.80 g，50.9 mmol)且添加至1,4-二噁烷(51.0 mL)及水(17.0 mL)。用氮氣置換反應系統三次且在100℃反應5小時。反應系統冷卻至室溫之後，將水(50.0 mL)添加至反應溶液中且過濾。濃縮濾液，獲得粗產物，與石油醚一起攪拌且再次過濾。真空乾燥濾餅，獲得C-19-2 (5.65 g)。
步驟二：將C-19-2 (5.26 g，13.7 mmol)溶解於THF (30.0 mL)、MeOH (30.0 mL)及水(30.0 mL)中，添加LiOH•H 2O (1.72 g，40.9 mmol)，且在25℃攪拌反應物2小時。用1 N鹽酸水溶液將反應溶液調節至pH 3。使固體沉澱並過濾，且真空乾燥濾餅，獲得C-19-3 (4.20 g)。
步驟三：將C-19-3 (1.50 g，4.04 mmol)及3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基乙氧基)丙酸三級丁酯(1.12 g，4.04 mmol)溶解於DMF (20.0 mL)中，按順序添加HOBt (1.64 g，12.1 mmol)、EDCI (2.32 g，12.1 mmol)及DIPEA (2.09 g，16.2 mmol)，使溫度升至60℃並攪拌2小時。使反應系統冷卻至室溫，將水(10.0 mL)及乙酸乙酯(20.0 mL)添加至反應溶液，水相用乙酸乙酯(25.0 mL×2)萃取兩次，且合併有機相。反應物經無水硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，獲得C-19-4粗產物(2.50 g)，其不經純化即直接用於下一步驟中。
步驟四：將C-19-4 (2.50 g，3.96 mmol)溶解於二氯甲烷(3.00 mL)中。添加TFA (4.61 g，40.4 mmol)之後，在25℃攪拌反應系統12小時。直接濃縮反應溶液，藉由製備型高效液相層析純化，接著冷凍乾燥，獲得C-19-5 (1.20 g)。
其製備方法如下： 管柱：Phenomenex luna C18 (150 mm*25mm*10 μm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 36 64 30
15.00 66 34 30
步驟五：將C-19-5 (1.10 g，1.91 mmol)溶解於乙腈(30 mL)及水(15 mL)之混合溶劑中，添加三氯化釕水合物(39.70 mg，0.19 mmol)及過碘酸鈉(4.09 g，19.14 mmol)，且反應系統在25℃反應1小時，接著用水(50 mL)及乙酸乙酯(80 mL)萃取。濃縮有機相，獲得粗產物，藉由管柱層析(MeOH/DCM=10.20%)純化，且濃縮，獲得C-19-6 (130 mg)。
步驟六：將IM-6 (20.0 mg，0.025 mmol)及C-19-6 (16.0 mg，0.025 mmol)添加至DMF (1 mL)且攪拌以溶解。添加HATU (19.0 mg，0.050 mmol)及DIPEA (12.9 mg，0.100 mmol)，將反應維持在室溫下2小時，且藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得C-19 (20.4 mg)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z):1372.4 [M+H] +。 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 30
4.00 30 70 30
24.00 90 10 30
1.11. N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五側氧基-3,18,21,24,27,30,33,36,39-九氧雜-5,8,11,14-四氮雜四十一烷-41-基)-3,5-雙(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)苯甲醯胺(C-21)之製備。
步驟一：將C-10-2 (3.00 g，8.10 mmol)及1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-酸三級丁酯(4.03 g，8.10 mmol)添加至DMF (40 mL)，依序添加HOBt (3.28 g，24.3 mmol)、EDCI (4.66 g，24.3 mmol)及DIPEA (4.19 g，32.4 mmol，5.64 mL)，且在60℃攪拌反應系統2小時。將水(100 mL)及乙酸乙酯添加至反應溶液以用於萃取(60 mL×3)。合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，獲得C-21-1 (4.20 g，4.14 mmol)。其不經純化即直接用於下一步驟中。
步驟二：將C-21-1 (3.60 g，4.24 mmol)溶解於二氯甲烷(30 mL)中，添加TFA (15.3 g，134 mmol，10 mL)，且在25℃攪拌反應系統6小時。將水(60 mL)及乙酸乙酯添加至反應溶液以用於萃取(40 mL×3)。合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，獲得粗產物。藉由製備型高效液相層析純化粗產物，接著冷凍乾燥，獲得C-21-2 (2.93 g，3.63 mmol)。
其製備方法如下： 管柱：Phenomenex luna C18 (250 mm*70mm*10 μm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 30
15.00 60 40 30
步驟三：將C-21-2 (148 mg，0.186 mmol)添加至乙腈(15 mL)及水(7.5 mL)中，接著將過碘酸鈉(398.71 mg，1.86 mmol)及三氯化釕水合物(15.47 mg，74.56 μmol)添加至反應系統，且在25℃攪拌反應物30分鐘。用水及乙酸乙酯萃取反應系統，且濃縮，獲得C-21-3 (155 mg)。
步驟四：合併IM-6 (27.91 mg，34.97 μmol)、C-21-3 (30 mg，34.97 μmol)、HATU (26.59 mg，69.93 μmol)及DIPEA (22.60 mg，174.84 μmol)且添加至DMF (3 mL)，且使反應系統在25℃反應1小時。藉由高效液相層析純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得C-21 (15 mg)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1591.7 [M+H] +。
其製備方法如下： 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 20 80 30
2.00 20 80 30
18.00 90 10 30
1.12. N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7, 10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五側氧基-3,18,21,24,27,30,33,36,39-九氧雜-5,8,11,14-四氮雜四十一烷-41-基)-2,6-雙(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)異菸鹼醯胺(C-23)之製備。
步驟一：將C-19-3 (1.50 g，4.04 mmol)及1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-酸三級丁酯(2.01 g，4.04 mmol)添加至DMF (20.0 mL)，依序添加HOBt (1.64 g，12.1 mmol)、EDCI (2.32 g，12.1 mmol)及DIEA (2.09 g，16.2 mmol)，使溫度升至60℃，且攪拌反應物2小時。使反應物冷卻至室溫，將水(10.0 mL)及乙酸乙酯(20.0 mL)添加至反應溶液以分離各層。用乙酸乙酯(25.0 mL×2)萃取水相兩次。合併之有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，獲得粗產物C-23-1 (3.00 g)，其直接用於下一步驟中。
步驟二：將C-23-1 (3.00 g，3.53 mmol)添加至二氯甲烷(10.0 mL)中，添加TFA (15.4 g，134 mmol)，且在25℃攪拌混合物12小時。直接濃縮反應溶液，獲得粗產物，藉由製備型高效液相層析純化，接著冷凍乾燥，獲得C-23-2 (1.20 g)。
其製備方法如下： 管柱：Welch Ultimate C18 (150 mm*25mm*5 μm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 34 66 25
10.00 64 36 25
步驟三：將C-23-2 (500 mg，0.63 mmol)添加至乙腈(10 mL)及水(5 mL)中，添加三氯化釕水合物(13.0 mg，0.063 mmol)及過碘酸鈉(1.35 g，6.29 mmol)，且系統在25℃反應1小時，接著用水(10 ml)及乙酸乙酯(40 ml)萃取。濃縮有機相，獲得粗產物，藉由管柱層析(MeOH/DCM=10.20%)純化且濃縮，獲得C-23-3 (350 mg)。
步驟四：將IM-6 (20.0 mg，0.025 mmol)及C-23-3 (21.5 mg，0.025 mmol)溶解於DMF (1 mL)中，且添加HATU (19.0 mg，0.050 mmol)及DIPEA (12.9 mg，0.100 mmol)。在室溫反應2小時之後，藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，接著冷凍乾燥，獲得C-23 (17.0 mg)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z):1592.6 [M+H] +。
其製備方法如下： 管柱：Waters XBridge Prep C18OBD (5 μm*19mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 30 70 28
4.00 30 70 28
24.00 90 10 28
1.13. 4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)苯甲基((1S,9R)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[d ]哌喃并[3', 4': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-03)之製備。
步驟一：將(1S,9S)-1-胺基-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并[d]哌喃并[3', 4 ': 6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(2 g，3.65mmol)溶解於DMF (50 mL)中，之後逐滴添加DIPEA (1.18 g，9.12 mmol，1.59 mL)，且逐滴添加乙醯氧基乙醯氯(548.12 mg，4.01 mmol，431.59 μL)，同時在冰浴中冷卻並攪拌，且繼續攪拌1小時。將反應溶液添加至0.1 M稀鹽酸水溶液中以沉澱出固體並過濾。將濾餅溶解於二氯甲烷及甲醇中，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，獲得粗產物，藉由矽膠管柱(甲醇/二氯甲烷= 0%至5%)純化，且再次濃縮，獲得化合物B-03-1 (1.7 g，3.077 mmol)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 552.2[M+1] +
步驟二：將化合物B-03-1 (500 mg，0.905 mmol)及DMAP (885.33 mg，7.25 mmol)溶解於無水二氯甲烷(5 mL)中，在氮氣保護下冷卻至0℃，且逐滴添加含三光氣(268.81 mg，0.905 mmol)之二氯甲烷(5 mL)，且在維持溫度之情況下攪拌0.5小時。緩慢滴入含(S)-2-(32-疊氮基-5-側氧基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧雜-6-氮雜三十二烷醯胺基)-N-(4-(羥甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)胺基)己醯胺(1.44 g，1.36 mmol)之二氯甲烷，且使反應物自然地返回至室溫並反應4小時。添加水以淬滅反應物，用二氯甲烷萃取三次(100 mL×3)。合併有機相，用飽和鹽水洗滌，乾燥且濃縮。藉由矽膠管柱(MeOH/DCM=0%至5%)純化粗產物，獲得化合物B-03-2 (498 mg，0.304 mmol)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1352.8[M+1] +
步驟三：將化合物B-03-2溶解於THF (3 mL)及MeOH (3 mL)中，且在攪拌下逐滴添加碳酸鈉(25.88 mg，0.224 mmol)之水溶液(1 mL)。逐滴添加之後，繼續攪拌1小時。將稀鹽酸逐滴添加至反應溶液中以中和反應物，減壓濃縮且直接用於下一步驟中。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1596.7[M+1] +
步驟四：將化合物B-03-3 (190 mg，119.04 μmol)溶解於二氯甲烷(5 mL)中，添加三氟乙酸(0.5 mL)，且繼續反應1小時。將飽和碳酸氫鈉水溶液逐滴添加至反應溶液以中和及分離各層，且濃縮有機相，獲得粗產物。藉由逆相管柱層析(乙腈/1%甲酸水溶液= 0%至50%)純化之後，藉由冷凍乾燥獲得化合物B-03-4 (95 mg，69.35 μmol)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1323.6[M+1] +
步驟五：將化合物B-03-4 (90 mg，0.066 mmol)及6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔醯胺(24.07 mg，0.079 mmol)溶解於DMSO (2 mL)及水(0.2 mL)中，添加溴化銅(9.42 mg，0.066 mmol)，且繼續攪拌2小時。直接過濾且濃縮反應溶液，獲得粗產物，藉由製備型高效液相層析純化，接著冷凍乾燥，獲得化合物B-03 (42.2 mg，24.69 μmol)。
其結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1628.7[M+1] +
其分離及純化方法如下： 管柱：SunFire Prep C18 OBD 19 mm× 150 mm× 5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流動速率[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
實例2. 抗體製備 2.1. 重組抗EGFR及抗c-MET雙特異性抗體之構築及表現。 Fab-scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體
雙特異性抗體結構採用Fab-scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體結構，且在重鏈之間使用臼包杵(KIH)結構以防止錯配。結構圖在圖1A中示出。抗EGFR及抗c-MET雙特異性抗體之胺基酸序列組成在表1中示出。 表1：Fab-scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體胺基酸序列
BsAb 類型 LC HC(杵) scFv-Fc(臼)
07B 抗c-MET SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 /
抗EGFR / / SEQ ID NO: 3
10B 抗EGFR SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5
抗c-MET / / SEQ ID NO: 6
38B 抗EGFR SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 7 /
抗c-MET / / SEQ ID NO: 8
49B 抗c-MET SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 9 /
抗EGFR / / SEQ ID NO: 10
將以上胺基酸序列發送至Genscript Biotechnology Co., Ltd.進行密碼子最佳化及DNA合成，且將該雙特異性抗體之輕鏈及重鏈選殖至pKL GS表現載體(含有兩個表現卡匣；由Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.設計且由GenScript進行基因合成)。第一表現卡匣之啟動子為小鼠CMV啟動子且聚腺苷酸(polyA)信號序列為sv40聚腺苷酸信號序列。第二表現卡匣之啟動子為小鼠CMV啟動子且聚腺苷酸信號序列為胸苷激酶(TK)聚腺苷酸信號序列。將各雙特異性抗體之scFv-Fc分開選殖至pKL5載體(含有1個表現卡匣；啟動子為小鼠CMV啟動子且聚腺苷酸信號序列為CMV聚腺苷酸信號序列；由Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.設計且由GenScript進行基因合成)或pKL8表現載體(含有1個表現卡匣；啟動子為小鼠CMV啟動子且聚腺苷酸信號序列為CMV聚腺苷酸信號序列)。對於表現表1中所示的雙特異性抗體之輕鏈及重鏈的質體及表現雙特異性抗體scFv-Fc之質體的各質體對而言，將質體對共轉染至CHO-K1細胞(自美國典型培養物保藏中心(美國典型培養物保藏中心；ATCC TM), Manasas, VA獲得)中且在細胞培養基中培養細胞以表現該等雙特異性抗體。允許雙特異性抗體表現一時間段之後，自培養基收集雙特異性抗體且使用蛋白質A (MabSelect TMSuRe, GE)層析捕獲雙特異性抗體。隨後使用陽離子(Eshmuno ®CPX, Merck KGaA)層析純化雙特異性抗體，得到BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B及BsB 49B。 Fab-scFab-Fc (KIH)雙特異性抗體
雙特異性抗體結構包含Fab-scFab-Fc (KIH)雙特異性抗體結構且在重鏈之間使用KIH結構以防止錯配。為了增加穩定性，將一對雙硫鍵引入至scFab-Fc鏈中，亦即，scFab-Fc之位置106處的Q突變成C，且位置304處的G突變成C。結構圖在圖1B中示出。抗EGFR及抗c-MET雙特異性抗體之胺基酸序列在表2中示出。 表2：Fab-scFab-Fc (KIH)雙特異性抗體胺基酸序列
BsAb 類型 LC HC(杵) scFab-Fc(臼)
41B 抗EGFR SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 7 /
抗c-MET / SEQ ID NO: 11
將以上胺基酸序列發送至Genscript Biotechnology Co., Ltd.進行密碼子最佳化及DNA合成。將該雙特異性抗體之輕鏈及重鏈選殖至pKLGS表現載體(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.)，且將該雙特異性抗體之scFab-Fc選殖至pKL5表現載體(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.)。將表現該雙特異性抗體之輕鏈及重鏈及雙特異性抗體scFab-Fc之質體的質體對共轉染至CHO-K1細胞(ATCC TM)中且在細胞培養基中培養細胞以表現雙特異性抗體41B。允許雙特異性抗體表現一時間段之後，自培養基收集雙特異性抗體且使用蛋白質A (MabSelect TMSuRe TMLX, GE)親和力層析捕獲雙特異性抗體。隨後使用陽離子層析(Eshmuno ®CPX, Merck KGaA)純化雙特異性抗體，得到BsAb 41B。 CrossMab雙特異性抗體
在此實施例中，雙特異性抗體結構包含CrossMab VH-VL雙特異性抗體結構，且在重鏈之間使用KIH結構以防止錯配。結構圖在圖1C中示出。抗EGFR及抗c-MET雙特異性抗體之胺基酸序列組成在表3中示出。 表3：CrossMab VH-VL雙特異性抗體胺基酸序列
BsAb 類型 LC HC(杵) VL2-CH1 VH2-CL-Fc(臼)
55B 抗c-MET SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 9
抗EGFR SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13
將以上胺基酸序列發送至Genscript Biotechnology Co., Ltd.進行密碼子最佳化及DNA合成。將BsAb 55B之輕鏈及重鏈選殖至pKLGS表現載體(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.)，且將BsAb 55B之VL-CH1及VH-CL-Fc選殖至另一pKLGS表現載體。將兩個pKLGS質體共轉染至CHO-K1細胞(ATCC TM)中且在細胞培養基中培養細胞以表現BsAb 55B。允許雙特異性抗體表現一時間段之後，自培養基收集雙特異性抗體且使用蛋白質A (MabSelect TMSuRe TMLX, GE)親和力層析捕獲雙特異性抗體。隨後使用陽離子層析(Eshmuno ®CPX, Merck KGaA)純化雙特異性抗體，得到雙特異性抗體55B。 scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體
雙特異性抗體結構採用scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體結構，且在重鏈之間使用KIH結構以防止錯配。結構圖在圖1D中示出。抗EGFR及抗c-MET雙特異性抗體之胺基酸序列組成在表4中示出。 表4：scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體胺基酸序列
BsAb 類型 scFv-Fc(杵) scFv-Fc(臼)
56B 抗EGFR SEQ ID NO: 14 /
抗c-MET / SEQ ID NO: 8
將以上胺基酸序列發送至Genscript Biotechnology Co., Ltd.進行密碼子最佳化及DNA合成。將雙特異性抗體之scFv-Fc (杵)及scFv-Fc (臼)選殖至pKLGS表現載體(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.)。將表現雙特異性抗體之質體轉染至CHO-K1細胞(ATCC TM)中且在細胞培養基中培養細胞以表現BsAb 56B。允許雙特異性抗體表現一時間段之後，自培養基收集雙特異性抗體且使用蛋白質A (MabSelect TMSuRe TMLX, GE)親和力層析捕獲雙特異性抗體。隨後使用陽離子(Eshmuno ®CPX, Merck)層析純化雙特異性抗體，得到BsAb 56B。 2.2. 對照重組抗EGFR單株抗體及抗c-MET單株抗體以及hIgG1抗體之構築及表現。
抗EGFR單株抗體紮魯姆單抗為本發明提供之雙特異性抗體的親代單株抗體。紮魯姆單抗之可變區的胺基酸序列與本發明提供之雙特異性抗體的抗EGFR部分相同。紮魯姆單抗之可變區的胺基酸序列可使用INN編號8605自IMGT資料庫獲得。重鏈可變區與突變人類IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO: 64)融合，且輕鏈可變區與人類κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO: 53)融合。MRG003為處於臨床II期的基於抗EGFR單株抗體之ADC，且此ADC在鼻咽癌及頭頸癌患者中顯示良好功效。BA03為MRG003之抗體。BA03單株抗體胺基酸序列係自中國專利CN106999606B獲得。抗c-MET單株抗體奧那妥珠單抗為本發明提供之雙特異性抗體的親代單株抗體。奧那妥珠單抗之可變區的胺基酸序列與本發明提供之雙特異性抗體的抗c-MET部分相同。奧那妥珠單抗之可變區的胺基酸序列可使用INN編號9368自IMGT資料庫獲得。重鏈可變區與突變人類IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO: 64)融合，且輕鏈可變區與人類κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO: 53)融合。ABBV399為處於III期臨床試驗的抗c-MET單株抗體ADC且在非小細胞肺癌患者中顯示良好功效。特立妥珠單抗為ABBV399之抗體。特立妥珠單抗的胺基酸序列可使用INN編號10366自IMGT資料庫獲得。hIgG1為抗雞溶菌酶抗體。可變區序列來自專利CA2309763A1。重鏈可變區與突變人類IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO: 64)融合，且輕鏈可變區與人類κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO: 53)融合。為了獲得紮魯姆單抗、奧那妥珠單抗及特立妥珠單抗之對照單株抗體，構築編碼該等抗體之重鏈及輕鏈的表現質體。將該等表現質體分開轉染至CHO-K1細胞中且在適合條件下，在培養基中培養經轉染細胞以將抗體表現至培養基中。允許對照抗體表現一時間段之後，自培養基收集對照抗體且使用蛋白質A (MabSelect SuRe LX, GE)親和力層析捕獲對照抗體。隨後使用陽離子(Eshmuno ®CPX, Merck)層析純化對照抗體，得到對照抗體紮魯姆單抗、奧那妥珠單抗、特立妥珠單抗及hIgG1。 2.3. 抗EGFR/c-MET對照雙特異性抗體表現。
抗EGFR/c-MET雙特異性抗體埃萬妥單抗為批准用於治療非小細胞肺癌的市售雙特異性抗體。胺基酸序列可自世界衛生組織(World Health Organization；WHO)國際非專有藥名(INN)資料庫獲得。埃萬妥單抗經指定為INN編號11030。將雙特異性抗體胺基酸序列發送至Genscript Biotechnology Co., Ltd.以表現雙特異性抗體埃萬妥單抗。AZD9592為處於臨床I期的抗EGFR及c-MET雙抗體ADC。抗體序列來源為專利申請公開案WO2023083846A1。將表現AZD9592抗體之表現質體轉染至CHO-K1細胞中且在適合條件下，在培養基中培養經轉染細胞以將AZD9592抗體表現至培養基中。允許AZD9592抗體表現一時間段之後，自培養基收集AZD9592抗體且使用蛋白質A (MabSelect SuRe LX, GE)親和力層析捕獲AZD9592抗體。 實例3. 含有細胞生物活性分子及連接子的化合物與抗體之結合 3.1. 包含偶合至VC-MMAE (維多汀)之單特異性抗體(特立妥珠單抗、BA03及hIgG1)的ADC之製備
用20 mM PB將特立妥珠單抗(Teliso；ABT-700，參見美國專利第8329173號)、BA03 (參見CN103772504B)及hIgG1 (抗雞溶菌酶)抗體之溶液稀釋至3 mg/mL，且用1 M Na 2HPO 4將pH調節至pH 7.3。隨後將10 mM TCEP-HCl (參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽，pH 7.3)添加至抗體溶液，混合，且在4℃於冰浴中培育所得溶液過夜，產生還原抗體之溶液。隨後將MC-VC-MMAE (維多汀；Chengdu Dingdang Times Pharmaceutical Technology Co., Ltd.)溶解於N,N-二甲基乙醯胺中之溶液以MC-VC-MMAE比抗體6:1之莫耳比添加至各還原抗體溶液中，且在4℃培育所得溶液。反應4小時之後，藉由Toyopearl TMPPG-600M Tosoh)疏水性層析純化抗體結合物，接著使用Amicon超離心式過濾器(Millipore)將緩衝液置換為pH 6.0之20 mM組胺酸緩衝溶液，以獲得抗體結合物特立妥珠單抗維多汀(參見美國專利第10603389號)、MRG003 (BA03-維多汀；參見WO2023083846)及hIgG1-維多汀。對於各種類型之所獲得抗體結合物而言，藉由質譜量測之DAR值為約4。 3.2. AZD9592製備
用1 M Na 2HPO 4將AZD9592抗體溶液之pH調節至7.4。隨後將10 mM TCEP-HCl (參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽，pH 7.4)添加至溶液中，混合，且在室溫培育還原抗體溶液3.5小時。隨後將SG3932 (參見WO2023083846A1，購自Shanghai Xiyao Pharmaceutical Technology Co., Ltd.)溶解於DMSO中之10% (v/v)溶液以SG3932比抗體12:1之莫耳比添加至各還原抗體溶液中，且在室溫培育所得溶液3小時。使用NAP TM凝膠管柱(Cytiva)以將緩衝液置換為pH 6.0之20 mM組胺酸緩衝液，以獲得抗體藥物結合物AZD9592，如藉由質譜所量測，DAR值為約6。 3.3. 包含BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B及hIgG1與A-05結合的ADC之製備
用20 mM磷酸鹽緩衝液(PB) + 0.1 M乙二胺四乙酸(EDTA) (pH 7.6)稀釋BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B及hIgG1之溶液且用1 M Na 2HPO 4將pH調節至7.6。隨後，將10 mM TCEP-HCl溶液(pH 7.6)添加至BsAb溶液中，充分混合，在室溫培育2小時，產生還原BsAb溶液。對於雙特異性抗體07B、10B、38B及49B，將A-05溶解於二甲亞碸中之10 mM溶液以A-05比抗體8:1之莫耳比添加至各還原BsAb溶液中。對於雙特異性抗體41B及抗體hIgG1，將A-05溶解於二甲亞碸中之10 mM溶液以A-05比抗體10:1之莫耳比添加至還原BsAb溶液中。隨後將所得溶液均在室溫培育2小時。隨後使用NAP TM凝膠管柱(Cytiva)將緩衝液置換為pH 6.0的20 mM組胺酸緩衝溶液，獲得ADC 07B-A-05、ADC 10B-A-05、ADC 38B-A-05、ADC 41B-A-05、ADC 49B-A-05及hIgG1-A-05。藉由質譜所量測的ADC 07B-A-05、ADC 10B-A-05、ADC 38B-A-05及ADC 49B-A-05之DAR值為約6，且ADC 41B-A-05及hIgG1-A-05之DAR值為約8。 3.4. 包含BsAb 38B、BsAb 49B、BsAb 55B、BsAb 56B、奧那妥珠單抗、紮魯姆單抗及hIgG1與A-14結合的ADC之製備
用20 mM PB + 0.1 M EDTA (pH 7.6)稀釋BsAb 38B、BsAb 49B、BsAb 55B、BsAb 56B、奧那妥珠單抗、紮魯姆單抗及hIgG1之溶液，且用1 M Na 2HPO 4將pH調節至7.6。隨後添加10 mM TCEP-HCl溶液(pH 7.6)，充分混合，且在室溫培育2小時，產生還原BsAb溶液。對於BsAb 38B及BsAb 49B，將A-14溶解於二甲亞碸中之10 mM溶液以A-14比抗體8:1之莫耳比添加至各還原BsAb溶液中。對於BsAb 55B、奧那妥珠單抗、紮魯姆單抗及hIgG1，將A-14溶解於二甲亞碸中之10 mM溶液以A-14比抗體10:1之莫耳比添加至各還原BsAb溶液中。對於BsAb 56B，將A-14溶解於二甲亞碸中之10 mM溶液以A-14比抗體6:1之莫耳比添加至各還原BsAb溶液中。在室溫培育所有所得溶液2小時。隨後使用NAP TM凝膠管柱(Cytiva)將緩衝液置換為pH 6.0之20 mM組胺酸緩衝溶液，獲得ADC 38B-A-14、ADC 49B-A-14、ADC 55B-A-14、ADC 56B-A-14、ADC 奧那妥珠單抗-A-14、ADC紮魯姆單抗-A-14及ADC hIgG1-A-14。藉由質譜所量測的ADC 38B-A-14及ADC 49B-A-14之DAR值為約6，且ADC 55B-A-14、ADC奧那妥珠單抗-A-14、ADC紮魯姆單抗-A-14及ADC hIgG1-A-14之DAR值為約8。ADC 56B-A-14之DAR值為約4。 3.5. 包含BsAb 49B及hIgG1與B-01 ADC結合的ADC之製備
用20 mM PB + 0.1 M EDTA (pH 7.60)將BsAb 49B及抗體hIgG1之溶液稀釋至3 mg/mL，且使用1 M Na 2HPO 4將pH調節至7.6。對於BsAb 49B，將B-01溶解於二甲亞碸(8莫耳當量/抗體)中之10 mM溶液添加至各還原BsAb溶液中。對於IgG1，將B-01溶解於二甲亞碸中之10 mM溶液以B-01比抗體10:1之莫耳比添加至各還原抗體溶液中。在室溫培育所得溶液2小時。隨後使用NAP TM凝膠管柱(Cytiva)將各自之緩衝液置換為pH 6.0之20 mM組胺酸緩衝溶液，獲得ADC 49B-B-01及ADC hIgG1-B-01。藉由質譜所量測的ADC 49B-B-01之DAR值為約6，且ADC hIgG1-B-01之DAR值為約8。 3.6. 雙特異性抗體之親水性特性
藉由使用具有TSKgel Butyl-NPR管柱之Agilent 1260來偵測抗體之親水性。管柱溫度：30℃，偵測波長：280 nm，流動速率：0.5 ml/min，移動相A：1.5 mol/L (NH 4) 2SO 4，移動相B：25 mmol/L Na 2HPO 4，pH=7.0，25% IPA。用稀釋劑 (0.75 mol/L (NH 4) 2SO 4)稀釋適合量之測試樣本以製備1.0 mg/ml之溶液作為測試樣本溶液。對照抗體為作為親水性對照的泰特利單抗(Tagitanlimab) (揭示於WO2017148424中)及作為疏水性對照的(Sacituzumab) (揭示於WO2019114666中)。(兩種抗體皆由Kelun-Biotech產生。) 用稀釋劑稀釋對照抗體中之各者以製備1.0 mg/ml之溶液作為系統適用性溶液。注入約40 μg樣本並以梯度溶離分析：0-3 min，維持95%之移動相A及5%之移動相B；3-40 min，5%至100%之移動相B；40-45 min，維持95%之移動相A及5%之移動相B。用下式根據對照樣本計算測試樣本之疏水性值：(測試樣本之滯留時間-親水性對照之滯留時間)/(疏水性對照之滯留時間-親水性對照之滯留時間)，且滯留時間及疏水性值愈小，抗體之親水性愈佳。結果在表5中示出。該等雙特異性抗體皆具有良好親水性。良好親水性有益於抗體生產、品質控制或小分子結合等，其將增強活體內藥物功效且改良藥物動力學特性及藥物安全性。 表5：雙特異性抗體之親水性特性
樣本 滯留時間(min) 疏水性值
泰特利單抗(親水性對照) 11.009 0.00
賽妥珠單抗 (疏水性對照) 19.001 1.00
07B 14.734 0.47
10B 15.702 0.59
38B 15.332 0.54
41B 11.516 0.06
49B 11.368 0.04
55B 10.871 -0.02
56B 13.909 0.36
3.7. 不同ADC之親水性之偵測
使用Agilent 1260及分析型管柱TSKgel ®Butyl-NPR測定ADC之疏水性。管柱溫度為30℃，偵測波長為280 nm，且流動速率為：0.5 mL/min，移動相A：1.5 mol/L (NH 4) 2SO 4；移動相B：25 mmol/L Na 2HPO 4，pH=7.0，25%異丙醇(IPA)。為進行分析，使用稀釋劑0.75 mol/L (NH 4) 2SO 4將ADC之測試樣本稀釋至1 mg/mL溶液，得到測試溶液。親水性對照抗體為泰特利單抗，且疏水性對照抗體為賽妥珠單抗。對照抗體係由Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.使用稀釋劑製備1 mg/mL測試溶液作為系統適用性溶液而產生。注入約40 μg且使用梯度溶離進行溶離：用95%之移動相A及5%之移動相B進行0至3分鐘；隨後用自5%增加至100%之移動相B進行3至40分鐘；隨後以95%之移動相A及5%之移動相B進行40至45分鐘。測試後，基於對照樣本計算測試樣本之疏水性值。計算公式為：(測試樣本之滯留時間-親水性對照之滯留時間)/(疏水性對照之滯留時間-親水性對照之滯留時間)。滯留時間及疏水性值愈小，抗體之親水性愈高。
結果在表6中示出。雙特異性ADC 07B-A-05、ADC 07B-A-14、ADC 38B-A-14、ADC 49B-A-14、ADC 49B-B-01、ADC 49B-A-05、ADC 41B-A-05、ADC 55B-A-14及ADC 56B-A-14均展現良好親水性，亦即，疏水性相比賽妥珠單抗對照降低。良好親水性有益於生產及品質控制，同時改良活體內藥物功效及藥物代謝。降低疏水性亦降低免疫原性。 表6：各種ADC之雙特異性抗體親水性測定
樣本 滯留時間(分) 疏水性值
泰特利單抗(親水性對照) 11.01 0.00
賽妥珠單抗(疏水對照) 19.00 1.00
ADC 07B-A-05 17.50 0.81
ADC 07B-A-14 18.11 0.89
ADC 10B-A-05 20.21 1.15
ADC 38B-A-14 18.10 0.89
ADC 49B-A-14 13.98 0.37
ADC 49B-B-01 14.65 0.46
ADC 49B-A-05 16.23 0.65
ADC 41B-A-05 16.50 0.69
ADC 55B-A-14 13.98 0.37
ADC 56B-A-14 17.23 0.78
實例4. ADC活性之偵測 4.1. 抗人類EGFR/c-MET雙特異性抗體及其各別結合物之細胞親和力偵測
使用流動式細胞儀(Beckman，型號Cytoflex)偵測抗人類EGFR/c-MET雙特異性抗體及其結合物與人類胃癌細胞MKN45 (Nanjing Cobioer Biosciences)及過度表現人類EGFR MKN45-EGFR之人類胃癌細胞(Kelun-Biotech.)、人類肺鱗狀細胞癌EBC-1 (Nanjing Cobioer Biosciences)、過度表現人類EGFR之人類肺鱗狀細胞癌EBC-1-EGFR (Kelun-Biotech.)、人類非小細胞肺癌細胞HCC827 (ATCC TM)及人類表皮鱗狀細胞癌細胞A431 (Nanjing Cobioer Biosciences)之間的相互作用。方案如下。
用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25% )(Shanghai BasalMedia)消化黏附細胞且將細胞密度調節至4.0×10 6/mL。用1% BSA洗滌細胞兩次且再懸浮於1% BSA溶液中。隨後將50 µL細胞懸浮液添加至96孔盤之各孔中(細胞之數目為每孔2×10 5個)。用1% BSA稀釋抗體及其結合物(最終濃度10 μg/mL，3倍梯度稀釋，總計11個濃度點)。隨後將50 μL經稀釋抗體及ADC添加至96孔盤之孔中，且在4℃培育培養盤60分鐘。隨後用1% BSA洗滌96孔盤之孔兩次，將50 μL經稀釋二級抗體添加至各孔中，且在4℃培育96孔盤30分鐘。隨後用1% BSA洗滌細胞兩次，且將細胞再懸浮於200 μL之1% BSA中並進行流動式細胞測量術偵測。
數據處理：導出中值PE值，接著導入GraphPad Prism 6軟體中計算EC 50。
抗EGFR/c-MET雙特異性抗體及其結合物之腫瘤細胞親和力結果在表7及表8中示出。HCC827及A431細胞高度表現EGFR，MKN45及EBC-1細胞高度表現c-MET，且MKN45-EGFR及EBC-1-EGFR細胞同時高度表現EGFR及c-MET。無論EGFR及c-MET之表現量如何，雙特異性抗體皆可有效結合。所測試BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B及其與A-05結合之對應ADC的腫瘤細胞親和力相等且展現一致親和力。 表7：抗人類EGFR/c-MET BsAb 07B、BsAb 10B及BsAb 41B與其各別ADC之間對表現EGFR及c-MET之腫瘤細胞的親和力測定之結果
化合物 EC 50(nM)
A431 MKN45 EBC-1 MKN45-EGFR
BsAb 07B 2.66 / 1.46 1.41
ADC 07B-A-05 2.43 / 1.47 1.23
BsAb 10B 2.19 1.10 1.51 2.74
ADC10B-A-05 1.62 2.14 1.91 1.71
BsAb 41B 1.34 1.77 / /
ADC41B-A-05 0.48 0.69 / /
注意：「/」意謂未測試。 表8：抗人類EGFR/c-MET BsAb 38B及BsAb 49B與其各別ADC對表現EGFR及c-MET之腫瘤細胞的親和力測定之結果
化合物 EC 50(nM)
HCC827 MKN45 EBC-1 MKN45-EGFR EBC-1-EGFR
BsAb 38B 0.65 1.16 1.04 1.19 0.99
ADC 38B-A-14 0.62 0.68 1.29 1.04 0.73
BsAb 49B 0.30 0.34 1.32 0.41 0.98
ADC 49B-A-14 0.70 1.06 1.51 0.97 1.04
ADC 49B-B-01 0.74 1.36 1.13 0.83 1.21
ADC 49B-A-05 0.70 1.58 0.95 1.26 0.63
4.2. 抗人類EGFR/c-MET雙特異性抗體及其結合物之胞吞活性的偵測
使用流動式細胞儀(Thermo Fisher，型號Attune TMNxT)偵測抗EGFR/c-MET雙特異性抗體及其結合物對人類胃癌細胞MKN45 (Nanjing Cobioer Biosciences)及過度表現人類EGFR (MKN45-EGFR)之人類胃癌細胞(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.)、人類肺鱗狀細胞癌EBC-1 (Nanjing Cobioer Biosciences)、過度表現人類EGFR之人類肺鱗狀細胞癌EBC-1-EGFR (Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.)、人類非小細胞肺癌細胞HCC827 (來自ATCC TM)及人類表皮鱗狀細胞癌細胞A431 (Nanjing Cobioer Biosciences)胞吞活性的作用。用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%) (Shanghai BasalMedia)消化黏附細胞，對細胞進行計數，且用完全培養基將細胞密度調節至1×10 5個細胞/毫升。隨後將100 µL細胞懸浮液添加至96孔盤之各孔中(細胞之數目為1×10 4個細胞/孔)，且在37℃、CO 2下培育培養盤24小時。移除培養基且將50 µL新鮮完全培養基添加至各孔中；使用完全培養基逐漸稀釋雙特異性抗體及ADC，最終濃度為0.52、2.08、8.33、33.30、100.00、200.00、333.33、500 µg/mL (總計8個濃度點)。使完全培養基中之PHrodo ®試劑(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co.,Ltd.)降低至12 µg/mL (PHrodo ®之最終濃度為3 µg/mL)。將待測試之連續稀釋抗體及ADC與經稀釋之PHrodo ®試劑以1:1之比率(30 µL:30 µL)混合，且所得混合物於暗處在室溫培育30分鐘。隨後將50 µL混合物添加至96孔盤之孔中且在37℃、5% CO 2下培育24小時。隨後，移除培養基，用無菌PBS洗滌孔一次，接著將100 µL胰蛋白酶-EDTA (0.25%)添加至各孔中以自孔釋放細胞。接下來，添加100 µL完全培養基以中和胰蛋白酶且藉由移液分散細胞並經由FACS測試。
數據處理：導出中值YL1-H值，接著導入GraphPad Prism 6軟體中計算EC 50。結果在表9及表10中示出。雙特異性抗體展現對腫瘤細胞之良好胞吞活性，且ADC之胞吞活性與對應抗體之胞吞活性一致。 表9：抗人類EGFR/c-MET BsAb 07B及BsAb 10B及其各別ADC的胞吞活性檢定結果
化合物 EC 50(nM)
EBC-1 MKN45-EGFR
BsAb 07B 0.42 0.59
ADC 07B-A-05 0.67 1.01
BsAb 10B 0.28 1.14
ADC 10B-A-05 0.79 0.76
表10：抗人類EGFR/c-MET BsAb 38B及BsAb 49B及其各別ADC的胞吞活性檢定結果
化合物 EC 50(nM)
HCC827 MKN45 EBC-1 MKN45-EGFR EBC-1-EGFR
BsAb 38B 0.53 1.04 0.49 1.05 0.29
ADC 38B-A-14 0.67 1.20 0.57 0.34 0.27
BsAb 49B 0.63 2.06 0.19 0.96 0.27
ADC 49B-A-14 0.53 1.14 0.72 0.51 0.21
ADC 49B-B-01 0.49 1.13 0.29 1.27 0.24
ADC 49B-A-05 0.47 1.22 0.3 1.11 0.29
4.3. 抗人類EGFR/c-MET雙特異性ADC活體外細胞殺傷檢定法
使用胰蛋白酶-EDTA (0.25%) (Shanghai BasalMedia)溶液消化黏附的人類胃癌細胞MKN45 (Nanjing Cobioer Biosciences)過度表現人類EGFR MKN45-EGFR之人類胃癌細胞(Kelon Botai)及人類肺鱗狀細胞。癌細胞EBC-1 (Nanjing Cobioer Biosciences)、過度表現人類EGFR之人類肺鱗狀細胞癌EBC-1-EGFR (Kelen Botai)及人類非小細胞肺癌細胞HCC827 (來自ATCC TM)。對細胞進行計數且用完全培養基將細胞密度調節至5×10 4個細胞/毫升，且將100 µl細胞懸浮液添加至96孔盤之各孔中(各種類型之細胞的數目為5,000/孔)，將96孔盤置於37℃、CO 2恆定溫度培育箱中24 h。使用完全培養基稀釋待測試ADC，以800 nM之最終濃度開始，且稀釋3倍，總計11個濃度點；將100 µl經稀釋ADC添加至96孔盤中，且在37℃、5% CO 2下培育培養盤5天。將20 μl CCK8試劑添加至MKN45、MKN45-EGFR、EBC-1及EBC-1-EGFR細胞之各孔中且在37℃培育2至3小時，使用微量盤讀取器偵測OD 450nm信號值，將其導入GraphPad Prism 6軟體計算IC 50。對於HCC827細胞，將20 μl CCL試劑添加至各孔中，以600 rpm振盪該盤5分鐘，且使用微量盤讀取器偵測發光信號值，將其導入GraphPad Prism 6軟體計算IC 50。結果在表11中示出。所測試雙抗體ADC對各種細胞具有相當的殺傷活性。雙特異性抗體結合物之殺傷活性顯著強於hIgG1抗體結合物之殺傷活性，表明殺傷作用係由目標介導。 表11：包含BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B及BsAb 49B與A-05、A-14或B-01結合的抗人類EGFR/c-MET ADC之活體外細胞殺傷結果
化合物 IC 50(nM)
HCC827 MKN45 EBC-1 MKN45-EGFR EBC-1-EGFR
ADC 07B-A-05 / 0.41 0.48 0.09 /
ADC 10B-A-05 / 0.33 0.59 0.08 /
ADC 38B-A-05 / 0.41 0.73 0.07 /
ADC 41B-A-05 / 0.42 0.44 0.07 /
ADC 49B- A-05 0.63 0.68 1.08 0.16 0.39
ADC hIgG1-A-05 1675.00 418.30 501.20 261.40 267.60
ADC 38B-A-14 0.08 0.30 1.03 0.10 0.38
ADC 49B-A-14 0.21 0.57 2.93 0.14 0.29
ADC 55B-A-14 0.14 0.40 0.42 0.10 /
ADC 56B- A-14 0.30 1.17 2.95 0.27 /
ADC hIgG1-A-14 126.90 48.73 132.40 38.43 61.64
ADC 49B-B-01 3.43 0.78 0.66 0.17 0.37
ADC hIgG1-B-01 6.15 0.85 0.91 0.56 0.91
注意：「/」意謂未測試。 4.4. 不同抗體結合物MKN45模型之活體內功效測試
在含有10%胎牛血清之RPMI1640培養基中，於37℃在5% CO 2中以單層活體外培養人類胃癌細胞MKN45 (購自Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.)。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，移除培養基用於黴漿菌偵測，且收集細胞。將懸浮於0.1 mL PBS中之2.4×10 6個MKN45細胞皮下接種至各小鼠的右肩胛骨中。當平均腫瘤體積生長至約100至200 mm 3時，排除具有不規則、小或大腫瘤之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分組，每組6隻小鼠。藉由尾部靜脈注射(i.v.)投與ADC 07B-A-05、ADC 10B-A-05、ADC hIgG1-A-05及ADC 41B-A-05，在分組當天投與一次。劑量設定：07B-A-05以3 mg/kg投與；10B-A-05針對不同小鼠組分別以3 mg/kg及10 mg/kg投與；hIgG1-A-05及41B-A-05係以使得hIgG1-A-05及41B-A-05各自之有效負載的莫耳劑量與07B-A-05之莫耳劑量相同的方式投與。分組後，用游標卡尺一週兩次量測腫瘤，且根據以下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑；每天觀測及記錄動物死亡。如下計算腫瘤生長抑制百分比(TGI)：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(T Vt-T V0)/(C Vt-C V0)]× 100%；當腫瘤消退時，TGI(%)(腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/ T V0× 100%。T V0為在群組投與期間測試藥物組的平均腫瘤體積；T Vt為在投與之後第t天測試藥物組之平均腫瘤體積。C V0為在群組投與期間媒劑組之平均腫瘤體積；C Vt為在投與第t天媒劑組之平均腫瘤體積。
結果顯示，ADC 07B-A-05、ADC 10B-A-05及ADC 41B-A-05均展現顯著功效。具體結果在表12及圖2中示出。 表12：不同ADC對攜帶MKN45細胞腫瘤之小鼠模型的功效之分析
化合物 劑量(mg/kg) V P0(mm 3,平均值±SEM) V P29(mm 3,平均值±SEM) TGI (%)
鹽水 / 158.42±12.03 2083.19±294.96 /
ADC hIgG1-A-05 2.7 158.91±12.06 1806.14±275.55 14.42
ADC 07B-A-05 3 158.75±10.69 1169.46±121.84 47.49
ADC 10B-A-05 3 157.96±11.96 1489.51±173.46 30.82
ADC 10B-A-05 10 155.97±9.46 891.94±101.12 61.76
ADC 41B-A-05 2.9 159.33±9.35 392.77±42.89 87.72
4.5. 不同抗體結合藥物MKN45-EGFR模型之活體內功效測試
在含有10%胎牛血清及3 μg/mL嘌呤黴素之DMEM培養物中，於37℃及5% CO 2下以單層培養形式活體外培養人類胃癌細胞MKN45-EGFR。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，移除培養基用於黴漿菌偵測，且收集細胞。將懸浮於0.1 mL PBS中之2.5×10 6個MKN45細胞皮下接種至各小鼠的右肩胛骨中。當平均腫瘤體積生長至約100至200 mm 3時，排除具有不規則、小或大腫瘤之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分組，每組5隻小鼠。藉由尾部靜脈注射(i.v.)投與雙特異性ADC 38B-A-14、ADC 38B-A-05及ADC 49B-A-14、單特異性ADC hIgG1-A-14 (hIgG與A-14結合)、紮魯姆單抗-A-14 (紮魯姆單抗與A-14)結合及奧那妥珠單抗-A-14 (奧那妥珠單抗與A-14結合)，分組當天投與一次。劑量設定：38B-A-14、38B-A-05、49B-A-14係分別以3 mg/kg投與；hIgG1-A-14、奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14係以使得hIgG1-A-14、奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14各自之有效負載的莫耳劑量與38B-A-14之莫耳劑量相同的方式投與。在分組時僅投與一次ADC；將埃萬妥單抗(以商品名RYBREVANT ®出售的雙特異性抗體抗EGFR/c-MET，Janssen Pharmaceuticals,Inc.)用作比較物且在分組後投與一週兩次，總計5次，劑量為10 mg/kg。分組後，用游標卡尺一週兩次量測腫瘤，且根據以下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑；每天觀測及記錄動物死亡。如下計算TGI百分比：TGI (%) (腫瘤體積) = [ 1-(T Vt-T V0)/(C Vt-C V0)]×100%；當腫瘤消退時，TGI (%)(腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/ T V0×100%。T V0為在群組投與期間測試藥物組的平均腫瘤體積；T Vt為在投與之後第t天測試藥物組之平均腫瘤體積。C V0為在群組投與期間媒劑組之平均腫瘤體積；C Vt為在投與第t天媒劑組之平均腫瘤體積。
結果顯示，與同種毒素親代單株抗體結合藥物ADC奧那妥珠單抗-A-14及ADC紮魯姆單抗-A-14以及雙特異性抗體埃萬妥單抗相比，雙特異性ADC 38B-A-05、ADC 38B-A-14及ADC 49B-A-14更有效。具體結果在表13及圖3中示出。 表13：不同ADC對攜帶MKN45-EGFR細胞腫瘤之小鼠模型的功效之分析
化合物 劑量(mg/kg) V P0(mm 3,平均值±SEM) V P21(mm 3,平均值±SEM) TGI (%)
鹽水 / 198.32±11.37 1226.14±199.67 /
ADC hIgG1-A-14 2.1 198.24±11.58 1564.6±147.6 -32.94
ADC 38B-A-14 3 198.49±10.79 313.39±30.29 88.82
ADC 38B-A-05 3 196.97±12.19 416.45±85.67 78.65
ADC 49B-A-14 3 196.72±10.35 431.89±59.74 77.12
ADC奧那妥珠單抗-A-14 2.2 197.26±11.56 668.78±17.08 54.12
ADC紮魯姆單抗-A-14 2.2 197.27±10.36 536.64±43.19 66.98
埃萬妥單抗 10 196.45±10.84 595.29±113.66 61.20
4.6. 不同抗體結合藥物MKN45模型之活體內功效測試
在含有10%胎牛血清之DMEM培養基中，於37℃及5% CO 2下以單層活體外培養人類胃癌細胞MKN45 (購自Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.)。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，移除培養基用於黴漿菌偵測，且收集細胞。將懸浮於0.1 mL PBS中之2.5×10 6個MKN45細胞皮下接種至各小鼠的右肩胛骨中。當平均腫瘤體積生長至約100至200 mm 3時，排除具有不規則、小或大腫瘤之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分組，每組6隻小鼠。經由尾部靜脈注射(i.v.)投與雙特異性ADC 38B-A-14及ADC 49B-A-14、單特異性ADC MRG003、ADC Teliso-v、ADC hIgG1-A-14、ADC hIgG1-維多汀、ADC 紮魯姆單抗-A-14及ADC 奧那妥珠單抗-A-14，分組當天投與一次。劑量設定：38B-A-14、49B-A-14係分別以3 mg/kg投與；hIgG1-A-14、奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14係以使得hIgG1-A-14、奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14各自之有效負載的莫耳劑量與38B-A-14之莫耳劑量相同的方式投與；hIgG1-維多汀、Teliso-v及MRG003係以使得hIgG1-維多汀、Teliso-v及MRG003各自之蛋白質的莫耳劑量與38B-A-14相同的方式投與。分組後，用游標卡尺一週兩次量測腫瘤，且根據以下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑；每天觀測及記錄動物死亡。如下計算TGI百分比：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(T Vt-T V0)/(C Vt-C V0)]×100%；當腫瘤消退時，TGI(%)(腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/T V0×100%。T V0為在群組投與期間測試藥物組的平均腫瘤體積；T Vt為在投與之後第t天測試藥物組之平均腫瘤體積。C V0為在群組投與期間媒劑組之平均腫瘤體積；C Vt為在第t天媒劑組之平均腫瘤體積。
結果顯示，與臨床階段單特異性ADC MRG003、ADC Teliso-v以及同種毒素親代單株ADC紮魯姆單抗-A-14及ADC奧那妥珠單抗-A-14相比，雙特異性ADC 38B-A-14及ADC 49B-A-14更有效。具體結果在表14及圖4中示出。 表14：不同ADC對攜帶MKN45細胞腫瘤之小鼠模型的功效之分析
藥物 劑量 (mg/kg) V P0(mm 3,平均值±SEM) V P26(mm 3,平均值±SEM) TGI (%)
鹽水 / 161±7.8 1428.63±116.9 /
ADC hIgG1-A-14 2.6 160.8±9.12 1769.47±103.38 -26.9
ADC hIgG1-維多汀 3.6 160.98±6.76 1614.88±177.36 -14.7
ADC 38B-A-14 3 161.88±8.3 316.04±46.72 87.8
ADC 49B-A-14 3 161.3±6.38 287.15±28.06 90.1
ADC奧那妥珠單抗-A-14 2.7 161.11±6.73 409.25±63.79 80.4
ADC Teliso-v 3.6 160.62±7.24 740.15±47.51 54.3
ADC紮魯姆單抗-A-14 2.7 160.21±7.82 1297.61±138.67 10.3
ADC MRG003 3.6 162.28±8.74 1250.2±79.98 14.2
4.7. 不同抗體結合藥物HCC827模型之活體內功效測試
在含有10%胎牛血清之RPMI1640培養基中，於37℃及5% CO 2下以單層活體外培養人類非小細胞肺癌細胞HCC827 (購自Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.)。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，移除培養基用於黴漿菌偵測，且收集細胞。將懸浮於0.1 mL PBS中之5×10 6個HCC827細胞皮下接種至各小鼠的右肩胛骨中。當平均腫瘤體積生長至約100至200 mm 3時，排除具有不規則、小或大腫瘤之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分組，每組6隻小鼠。經由尾部靜脈注射(i.v.)投與雙特異性ADC 38B-A-14及ADC 49B-A-14、單特異性ADC MRG003、ADC Teliso-v、ADC hIgG1-A-14、ADC hIgG1-維多汀、ADC紮魯姆單抗-A-14及ADC奧那妥珠單抗-A-14，分組當天投與一次。劑量設定：38B-A-14、49B-A-14係分別以3 mg/kg投與；hIgG1-A-14、奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14係以使得hIgG1-A-14、奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14各自之有效負載的莫耳劑量與38B-A-14之莫耳劑量相同的方式投與；hIgG1-維多汀、Teliso-v及MRG003係以使得hIgG1-維多汀、Teliso-v及MRG003各自之蛋白質的莫耳劑量與38B-A-14相同的方式投與。分組後，用游標卡尺一週兩次量測腫瘤，且根據以下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑；每天觀測及記錄動物死亡。如下計算TGI百分比：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(T Vt-T V0)/(C Vt- C V0)]×100%；當腫瘤消退時，TGI(%)(腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/T V0×100%。T V0為在群組投與期間測試藥物組的平均腫瘤體積；T Vt為在投與之後第t天測試藥物組之平均腫瘤體積。C V0為在群組投與期間媒劑組之平均腫瘤體積；C Vt為在投與第t天媒劑組之平均腫瘤體積。
結果顯示，與臨床階段藥物MRG003、Teliso-v以及同種毒素親代單株ADC紮魯姆單抗-A-14及ADC奧那妥珠單抗-A-14相比，雙特異性ADC 38B-A-14及ADC 49B-A-14更有效。具體結果在表15及圖5中示出。 表15：不同抗體結合藥物對攜帶HCC827細胞腫瘤之小鼠模型的功效之分析
藥物 劑量(mg/kg) V P0(mm 3,平均值±SEM) V P39(mm 3,平均值±SEM) TGI (%)
鹽水 / 190.29±13.08 1716.47±478.35 /
ADC hIgG1-A-14 2.6 191.61±13.74 1203.91±116.19 33.7
ADC hIgG1-維多汀 3.6 194.11±15.92 1237.92±108.62 31.6
ADC 38B-A-14 3 185.22±13.07 84.83±12.25 154.2
ADC 49B-A-14 3 189.03±19.94 74.7±14.66 160.5
ADC奧那妥珠單抗-A-14 2.7 192.32±22.06 135.02±46.64 129.8
ADC Teliso-v 3.6 189.05±14.9 585.89±120.65 74.0
ADC紮魯姆單抗-A-14 2.7 187±15.35 123.93±41.3 133.7
ADC MRG003 3.6 188.27±12.35 970.76±131.53 48.7
4.8. 不同抗體結合藥物EBC-1-EGFR模型之活體內功效測試
在含有10%胎牛血清及1 μg/mL嘌呤黴素之DMEM培養基中，於37℃及5% CO 2下以單層活體外培養人類非小細胞肺癌細胞EBC-1-EGFR。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，移除培養基用於黴漿菌偵測，且收集細胞。將懸浮於0.1 mL PBS中之5×10 6個EBC-1-EGFR細胞皮下接種至各小鼠的右肩胛骨中。當平均腫瘤體積生長至約100至200 mm 3時，排除具有不規則、小或大腫瘤之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分組，每組5隻小鼠。經由尾部靜脈注射(i.v.)分別以1 mg/kg及3 mg/kg對不同小鼠組投與雙特異性ADC 49B-A-14；hIgG1-A-14係以使得hIgG1-A-14之有效負載的莫耳劑量與49B-A-14之莫耳劑量相同的方式以3 mg/kg之劑量投與；奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14係以使得奧那妥珠單抗-A-14及紮魯姆單抗-A-14各自之有效負載的莫耳劑量與49B-A-14相同的方式以1 mg/kg之劑量投與；hIgG1-維多汀、Teliso-v及MRG003係以使得hIgG1-維多汀、Teliso-v及MRG003各自之蛋白質的莫耳劑量與49B-A-14相同的方式以1 mg/kg之劑量投與。分組後，用游標卡尺一週兩次量測腫瘤，且根據以下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑；每天觀測及記錄動物死亡。如下計算腫瘤生長抑制百分比(TGI)：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(T Vt- T V0)/(C Vt- C V0)]× 100%；當腫瘤消退時，TGI(%)(腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/ T V0× 100%。T V0為在群組投與期間測試藥物組的平均腫瘤體積；T Vt為在投與之後第t天測試藥物組之平均腫瘤體積。C V0為在群組投與期間媒劑組之平均腫瘤體積；C Vt為在投與第t天媒劑組之平均腫瘤體積。
結果顯示，3 mg/kg之雙特異性ADC 49B-A-14使腫瘤完全消退，且1 mg/kg之劑量下的TGI為69.89%。該功效高於針對單特異性ADC MRG003、ADC Teliso-v以及同種毒素親代單株ADC紮魯姆單抗-A-14及ADC奧那妥珠單抗-A-14所觀測到的功效。具體結果在表16及圖6中示出。 表16：不同ADC對攜帶EBC-1-EGFR細胞腫瘤之小鼠模型的功效之分析
藥物 劑量(mg/kg) V P0(mm 3,平均值±SEM) V P28(mm 3,平均值±SEM) TGI (%)
鹽水 / 147±12.36 2121.27±226.93 /
ADC hIgG1-A-14 2.7 148.63±13.54 1900.59±210.2 11.26
ADC hIgG1-維多汀 1.2 147.29±13.47 2124.9±361 -0.17
ADC 49B-A-14 1 149.36±12.02 743.8±246.91 69.89
ADC 49B-A-14 3 152.78±15.79 0±0 200.00
ADC奧那妥珠單抗-A-14 0.9 148.56±18.36 1514.41±341.97 30.82
ADC Teliso-v 1.2 147.25±12.8 981.94±257.46 57.72
ADC紮魯姆單抗-A-14 0.9 145.9±11.34 1173.32±164.67 47.96
ADC MRG003 1.2 148.6±13.93 1890.29±277.85 11.78
4.9 不同抗體結合藥物HCC827模型之活體內功效測試
在含有10%胎牛血清之RPMI1640培養基中，於37℃及5% CO 2下以單層活體外培養人類非小細胞肺癌細胞HCC827 (購自Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.)。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，移除培養基用於黴漿菌偵測，且收集細胞。將懸浮於0.1 mL無血清RPMI1640中之5×10 6個HCC827細胞皮下接種至各小鼠的右肩胛骨中。當平均腫瘤體積生長至約100至200 mm 3時，排除具有不規則、小或大腫瘤之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分組，每組5隻小鼠。經由尾部靜脈注射(i.v.)以1 mg/kg投與雙特異性ADC 49B-A-14及AZD9592，每週一次(總計兩次)。分組後，用游標卡尺一週兩次量測腫瘤，且根據以下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑；每天觀測及記錄動物死亡。如下計算腫瘤生長抑制百分比(TGI)：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(T Vt- T V0)/(C Vt- C V0)]× 100%；當腫瘤消退時，TGI(%)(腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/ T V0× 100%。T V0為在群組投與期間測試藥物組的平均腫瘤體積；T Vt為在投與之後第t天測試藥物組之平均腫瘤體積。C V0為在群組投與期間媒劑組之平均腫瘤體積；C Vt為在投與第t天媒劑組之平均腫瘤體積。
結果顯示，1 mg/kg組中雙特異性抗體結合藥物49B-A-14之TGI為147.69%，且功效顯著。1 mg/kg組中AZD9592之TGI為84.80%。49B-A-14顯著優於AZD9592 (**，p＜0.01)。具體結果在表17及圖7中示出。 表17：不同ADC對攜帶HCC827細胞腫瘤之小鼠模型的功效之分析
藥物 劑量(mg/kg) V P0(mm 3,平均值±SEM) V P47(mm 3,平均值±SEM) TGI (%)
鹽水 / 150.45±11.24 1707.55±232.81 /
49B-A-14 1 147.38±9.93 77.1±14.58 147.69
AZD9592 1 148.09±10.78 384.84±151.86 84.80
4.10 不同抗體結合藥物PC-9模型之活體內功效測試
在含有10%胎牛血清之RPMI1640培養基中，於37℃及5% CO 2下以單層活體外培養人類非小細胞肺癌細胞PC-9 (購自Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.)。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，移除培養基用於黴漿菌偵測，且收集細胞。將懸浮於含有50% Matrigel之0.1 mL無血清RPMI1640中的5×10 6個PC-9細胞皮下接種至各小鼠之右肩胛骨中。當平均腫瘤體積生長至約100至200 mm 3時，排除具有不規則、小或大腫瘤之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分組，每組5隻小鼠。雙特異性ADC 49B-A-14及AZD9592係在分組當天各自經由尾部靜脈注射(i.v.)以3 mg/kg及10 mg/kg劑量投與一次。分組後，用游標卡尺一週兩次量測腫瘤，且根據以下計算公式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑；每天觀測及記錄動物死亡。如下計算腫瘤生長抑制百分比(TGI)：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(T Vt- T V0)/(C Vt- C V0)]× 100%；當腫瘤消退時，TGI(%)(腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/ T V0× 100%。T V0為在群組投與期間測試藥物組的平均腫瘤體積；T Vt為在投與之後第t天測試藥物組之平均腫瘤體積。C V0為分組期間媒劑組之平均腫瘤體積；C Vt為在投與第t天媒劑組之平均腫瘤體積。
結果顯示，3 mg/kg及10 mg/kg之劑量的雙特異性抗體結合藥物49B-A-14之TGI分別為28.81%及100.03%，且3 mg/kg及10 mg/kg之劑量的AZD9592之TGI分別為-8.86%及72.83%。在10 mg/kg下，49B-A-14顯著優於AZD9592 (*，p＜0.05)。具體結果在表18及圖8中示出。 表18：不同ADC對攜帶PC-9細胞腫瘤之小鼠模型的功效之分析
藥物 劑量(mg/kg) V P0(mm 3,平均值±SEM) V P37(mm 3,平均值±SEM) TGI (%)
鹽水 / 197.61±12.49 543.02±83.04
49B-A-14 3 199.22±14.08 445.11±91.60 28.81
49B-A-14 10 196.47±12.41 196.40±62.50 100.03
AZD9592 3 196.26±18.65 572.26±137.06 -8.86
AZD9592 10 197.09±11.46 290.95±14.03 72.83
4.11 不同抗體結合藥物之旁觀者效應偵測
在含10%胎牛血清之DMEM/F12培養基(完全培養基)中，於37℃及5% CO 2下以單層活體外培養EGFR/c-Met雙陰性人類乳癌細胞株MDA-MB-453細胞(購自Concortis)。在含有1%NEAA、1%丙酮酸鈉及10%胎牛血清之MEM培養基(完全培養基)中，於37℃及5% CO 2下以單層活體外培養EGFR/c-Met雙陽性人類非小細胞肺癌細胞株EBC-1細胞(購自Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.)。用胰蛋白酶-EDTA消化細胞且繼代2至3次/週。當細胞處於指數生長期時，收集細胞並進行計數。將兩種類型之細胞分成兩部分，一部分使用完全培養基將細胞密度調節至2.4×10 4個細胞/毫升。另一部分細胞使用無血清培養基將細胞密度調節至1×10 6個細胞/毫升。於暗處添加CellTrace TMViolet (1 μl)，且在37℃培育細胞20分鐘以進行螢光標記，以製備經標記細胞。添加完全培養基以終止標記。洗滌後，使用完全培養基將經標記細胞密度調節至2.4×10 4個細胞/毫升。製備三個細胞組合，如表19中所示。組合一為純陰性細胞，組合二為混合細胞，且組合三為純陽性細胞。 表19：細胞組合
組合 MDA-MB-453 經標記MDA-MB-453 EBC-1 經標記EBC-1
組合1 (個細胞/孔) 18000 6000 / /
組合2 (個細胞/孔) / 6000 18000 /
組合3 (個細胞/孔) / / 18000 6000
混合後，將細胞添加至24孔盤，將1 ml合併之細胞懸浮液添加至各孔且培養過夜。培養過夜後，將10 nM hIgG1-A-14及49B-A-14添加至各組合之細胞，且僅將完全培養基添加至對照孔中，總計72 h。培育72小時之後，自各孔移除培養基，在用PBS洗滌之後添加胰蛋白酶，且自各孔收集所有細胞。將PI/RNA酶添加至各孔中以標記死細胞。使用流動式細胞儀中之FSC/SSC/YL-1(PI)/VL-1 (CellTrace™)通道偵測在固定體積下各孔中經CellTrace™標記之活細胞的數目。基於所量測的經標記細胞數目計算經標記細胞之存活率：細胞存活率% =樣本孔中之細胞數目/對照組中之細胞數目×100%。使用GraphPad Prism對數據進行繪圖，且數據以平均值+標準誤差(平均值+SEM)形式展現。結果顯示，在49B-A-14處理之後，混合系統中MDA-MB-453細胞之存活率顯著低於純陰性細胞系統中MDA-MB-453細胞之存活率(p＜0.01)，表明49B-A-14具有明顯旁觀者效應。具體結果在圖9中示出。使用雙尾T-TEST計算兩組之間的統計差異，且p＜0.05視為顯著。
除非另有說明，否則本發明中使用之分子生物學實驗及免疫檢定方法係基本上根據J. Sambrook等人, Molecular cloning: Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989及F.M. Ausubel等人, Compiled Molecular Biology Laboratory Guide,第3版, John Wiley & Sons, Inc., 1995中所描述之方法進行的。
本發明之範圍不限於本文所描述之特定實施例。實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此等修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範圍內。
本文中所引用之所有參考文獻(例如出版物或專利或專利申請案)皆以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻(例如出版物或專利或專利申請案)具體且個別地指示為出於所有目的以全文引用之方式併入一般。
其他實施例在以下申請專利範圍內。
無
[圖1A]：Fab-scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體之結構的示意圖。
[圖1B]：Fab-scFab-Fc (KIH)雙特異性抗體之結構的示意圖。
[圖1C]：CrossMab VH-VL雙特異性抗體結構的示意圖。
[圖1D]：scFv-Fc (KIH)雙特異性抗體之結構的示意圖。
[圖2]：不同抗體-藥物結合物對MKN45模型的功效測試。
[圖3]：不同抗體-藥物結合物對MKN45-EGFR模型的功效之測試。
[圖4]：不同抗體-藥物結合物對MKN45模型的功效之測試。
[圖5]：不同抗體-藥物結合物對HCC827模型的功效測試。
[圖6]：不同抗體-藥物結合物對EBC-1-EGFR模型之功效的測試。
[圖7]：不同抗體-藥物結合物對HCC827模型之功效的測試。
[圖8]：不同抗體-藥物結合物對PC-9模型之功效的測試。
[圖9]：不同抗體-藥物結合物之旁觀者效應的測試。
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Claims (118)

  1. 一種抗體-藥物結合物，其包含下式所示之結構： Ab-[M-L-E-D] x其中： Ab為雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，包含特異性結合於c-MET之第一抗原結合域及特異性結合於EGFR之第二抗原結合域，其中該第一抗原結合域包含第一輕鏈可變區(VL)及第一重鏈可變區(VH)，且該第一VL及該第一VH共同形成能夠特異性結合於c-MET之域；且該第二抗原結合域包含第二VL及第二VH，且該第二VL及該第二VH共同形成能夠特異性結合於EGFR之域； M為連接至該雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段之連接子位點； L為連接該等連接子位點M與E之結構片段； E為連接L與D之結構片段； D為細胞毒性藥物或其殘基；且 x經選擇為1至10之任何整數。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自獨立地選自scFv、Fab及scFab。
  3. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段進一步包含Fc域，該Fc域包含第一Fc域單體及第二Fc域單體，且其中該第一Fc域單體及該第二Fc域單體包含一個或多個促進該等Fc域單體之異二聚合的修飾。
  4. 如請求項3之抗體-藥物結合物，其中該Fc域包含有包含形成杵結構之修飾的第一Fc域單體及包含形成臼結構之修飾的第二Fc域單體，其中該臼結構可與該杵結構配對形成異二聚Fc域。
  5. 如請求項3或4之抗體-藥物結合物，其中該第一Fc域單體包含如SEQ ID NO: 49或51中所示之胺基酸序列，且該第二Fc域單體包含如SEQ ID NO: 50或52中所示之胺基酸序列。
  6. 如請求項3至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自連接至該Fc域之該第一Fc域單體及該第二Fc域單體中之一者。
  7. 如請求項3至6中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域連接至該第一Fc域單體，且該第二抗原結合域連接至該第二Fc域單體；或該第一抗原結合域連接至該第二Fc域單體，且該第二抗原結合域連接至該第一Fc域單體。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一VL包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 59中所示之VL胺基酸序列的互補決定區(CDR)-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列；及/或該第一VH包含SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 60中所示之VH胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體-藥物結合物，其中： 該第一VL包含： (i)包含如SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；或 (ii)包含如SEQ ID NO: 35中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 37中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的CDR-L3；及/或 該第一VH包含： (i)包含如SEQ ID NO: 39中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 43中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (ii)包含如SEQ ID NO: 40中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 44中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (iii)包含如SEQ ID NO: 42中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 46中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列的CDR-H3；或 (iv)包含如SEQ ID NO: 41中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 45中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 48中所示之胺基酸序列的CDR-H3。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體-藥物結合物，其中： 該第一VL包含如SEQ ID NO: 17或59中所示之胺基酸序列，及/或該第一VH包含如SEQ ID NO: 18或60中所示之胺基酸序列；或 該第一VL包含如SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列，該第一VH包含如SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列；或該第一VL包含如SEQ ID NO: 59中所示之胺基酸序列，該第一VH包含如SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第二VL包含SEQ ID NO: 15中所示之VL胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3胺基酸序列；及/或該第二VH包含SEQ ID NO: 16中所示之VH胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中： 該第二VL包含： (i)包含如SEQ ID NO: 19中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；或 (ii)包含如SEQ ID NO: 20中所示之胺基酸序列的CDR-L1、包含如SEQ ID NO: 22中所示之胺基酸序列的CDR-L2及包含如SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列的CDR-L3；及/或 該第二VH包含： (i)包含如SEQ ID NO: 24中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 28中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (ii)包含如SEQ ID NO: 25中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3； (iii)包含如SEQ ID NO: 27中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 31中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的CDR-H3；或 (iv)包含如SEQ ID NO: 26中所示之胺基酸序列的CDR-H1、包含如SEQ ID NO: 30中所示之胺基酸序列的CDR-H2及包含如SEQ ID NO: 33中所示之胺基酸序列的CDR-H3。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第二VL包含如SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列，及/或該第二VH包含如SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域為Fab，且該第二抗原結合域為scFv。
  15. 如請求項14之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈I-A、多肽鏈I-B及多肽鏈I-C；其中該多肽鏈I-A包含該第一VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈I-B包含：該第一VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈I-C包含：該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  16. 如請求項15之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈I-A自N端至C端包含該第一VL及該輕鏈恆定區；該多肽鏈I-B自N端至C端包含該第一VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈I-C自N端至C端包含(i)該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第二VH、該第二VL及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  17. 如請求項15或16之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈I-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，且該多肽鏈I-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈I-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
  18. 如請求項17之抗體-藥物結合物，其中該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自由以下組成之群：包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有如(GGGGS) n所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
  19. 如請求項15至18中任一項之抗體-藥物結合物，其中該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
  20. 如請求項15至19中任一項之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈I-A包含如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，該多肽鏈I-B包含如SEQ ID NO: 2或9中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈I-C包含如SEQ ID NO: 3或10中所示之胺基酸序列。
  21. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域為scFv，且該第二抗原結合域為Fab。
  22. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈II-A、多肽鏈II-B及多肽鏈II-C；其中該多肽鏈II-A包含：該第二VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈II-B包含該第二VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈II-C包含：該第一VL、該第一VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  23. 如請求項22之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈II-A自N端至C端包含該第二VL及該輕鏈恆定區；且該多肽鏈II-B自N端至C端包含該第二VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈II-C自N端至C端包含(i)該第一VL、該第一VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第一VH、該第一VL及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  24. 如請求項22或23之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈II-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，該多肽鏈II-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈II-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
  25. 如請求項24之抗體-藥物結合物，其中該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
  26. 如請求項22至25中任一項之抗體-藥物結合物，其中該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
  27. 如請求項22至26中任一項之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈II-A包含如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，該多肽鏈II-B包含如SEQ ID NO: 5或7中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈II-C包含如SEQ ID NO: 6或8中所示之胺基酸序列。
  28. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域為Fab，且該第二抗原結合域為scFab。
  29. 如請求項28之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈III-A、多肽鏈III-B及多肽鏈III-C；其中該多肽鏈III-A包含該第一VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈III-B包含：該第一VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，該多肽鏈III-C包含：該第二VL、輕鏈恆定區、該第二VH、重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  30. 如請求項29之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈III-A自N端至C端包含該第一VL及該輕鏈恆定區；該多肽鏈III-B自N端至C端包含該第一VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈III-C自N端至C端包含(i)該第二VL、該輕鏈恆定區、該第二VH、該重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第二VH、該重鏈CH1區、該第二VL、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  31. 如請求項29或30之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈III-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，且該多肽鏈III-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接；及/或該多肽鏈III-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
  32. 如請求項31之抗體-藥物結合物，其中該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
  33. 如請求項29至32中任一項之抗體-藥物結合物，其中該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈之該CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
  34. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域為scFab，且該第二抗原結合域為Fab。
  35. 如請求項34之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈IV-A、多肽鏈IV-B及多肽鏈IV-C；其中該多肽鏈IV-A包含該第二VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈IV-B包含：該第二VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；該多肽鏈IV-C包含：該第一VL、輕鏈恆定區、該第一VH、重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  36. 如請求項35之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈IV-A自N端至C端包含該第二VL及該輕鏈恆定區；該多肽鏈IV-B自N端至C端包含該第二VH、該重鏈之該CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈IV-C自N端至C端包含(i)該第一VL、該輕鏈恆定區、該第一VH、該重鏈CH1區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第一VH、該重鏈CH1區、該第一VL、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  37. 如請求項35或36之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈IV-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，且該多肽鏈IV-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接；及/或該多肽鏈IV-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
  38. 如請求項37之抗體-藥物結合物，其中該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
  39. 如請求項35至38中任一項之抗體-藥物結合物，其中該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
  40. 如請求項35至39中任一項之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈IV-A包含如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列，該多肽鏈IV-B包含如SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈IV-C包含如SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列。
  41. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域為Fab，且該第二抗原結合域之該Fab包含呈CrossMab形式之域交換。
  42. 如請求項41之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈V-A、多肽鏈V-B、多肽鏈V-C及多肽鏈V-D；其中該多肽鏈V-A包含該第一VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈V-B包含：該第一VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，且該多肽鏈V-C包含：該第二VH、輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，該多肽鏈V-D包含：該第二VL及重鏈CH1區。
  43. 如請求項42之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈V-A自N端至C端包含該第一VL及該輕鏈恆定區；該多肽鏈V-B自N端至C端包含該第一VH、該重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；該多肽鏈V-C自N端至C端包含該第二VH、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，及/或該多肽鏈V-D自N端至C端包含該第二VL及該重鏈CH1區。
  44. 如請求項42或43之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈V-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，該多肽鏈V-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接，該多肽鏈V-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈V-D之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
  45. 如請求項44之抗體-藥物結合物，其中該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
  46. 如請求項42至45中任一項之抗體-藥物結合物，其中該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
  47. 如請求項42至46中任一項之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈V-A包含如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，該多肽鏈V-B包含如SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列；該多肽鏈V-C包含如SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈V-D之序列在SEQ ID NO: 12中示出。
  48. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域為Fab，且該第一抗原結合域之該Fab包含呈CrossMab形式之域交換。
  49. 如請求項48之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈VI-A、多肽鏈VI-B、多肽鏈VI-C及多肽鏈VI-D；其中該多肽鏈VI-A包含該第二VL及輕鏈恆定區；該多肽鏈VI-B包含：該第二VH、重鏈CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；該多肽鏈VI-C包含：該第一VH、輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)；該多肽鏈VI-D包含：該第一VL及重鏈CH1區。
  50. 如請求項49之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈VI-A自N端至C端包含該第二VL及該輕鏈恆定區，且該多肽鏈VI-B自N端至C端包含該第二VH、該重鏈之該CH1區及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，該多肽鏈VI-C自N端至C端包含該第一VH、該輕鏈恆定區及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，及/或該多肽鏈VI-D自N端至C端包含：該第一VL及該重鏈CH1區。
  51. 如請求項49或50之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈VI-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接；該多肽鏈VI-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接；該多肽鏈VI-C之相鄰域視情況用或不用連接子連接；及/或該多肽鏈VI-D之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
  52. 如請求項51之抗體-藥物結合物，其中該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)；或該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
  53. 如請求項49至52中任一項之抗體-藥物結合物，其中該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 63中所示之胺基酸序列，及/或該重鏈CH1區包含如SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列。
  54. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域兩者皆為scFv。
  55. 如請求項54之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體包含多肽鏈VII-A及多肽鏈VII-B；其中該多肽鏈VII-A包含：該第一VL、該第一VH及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)，該多肽鏈VII-B包含：該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  56. 如請求項55之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈VII-A自N端至C端包含(i)該第一VL、該第一VH及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；或(ii)該第一VH、該第一VL及該第一Fc域單體(或該第二Fc域單體)；及/或該多肽鏈VII-B自N端至C端包含(i)該第二VL、該第二VH及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)，或(ii)該第二VH、該第二VL及該第二Fc域單體(或該第一Fc域單體)。
  57. 如請求項55或56之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈VII-A之相鄰域視情況用或不用連接子連接，及/或該多肽鏈VII-B之相鄰域視情況用或不用連接子連接。
  58. 如請求項57之抗體-藥物結合物，其中該等連接子各自獨立地為相同肽連接子或不同肽連接子(例如剛性肽連接子或柔性肽連接子)；或該等肽連接子各自獨立地選自包含一個或多個甘胺酸(G)及/或絲胺酸(S)，例如具有(GGGGS) n中所示之結構的肽連接子，其中n係選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO: 55-58或65-70)。
  59. 如請求項58之抗體-藥物結合物，其中該等肽連接子各自獨立地包含SEQ ID NO: 55-58、61或65-70中所示之胺基酸序列。
  60. 如請求項55至59中任一項之抗體-藥物結合物，其中該多肽鏈VII-A包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列，及/或該多肽鏈VII-B包含如SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列。
  61. 如請求項1至60中任一項之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含： (1)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C； (2)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-B及包含SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列的多肽鏈I-C； (3)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C； (4)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-B及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈II-C； (5)包含SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-A、包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-B及包含SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列的多肽鏈IV-C； (6)包含SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-A、包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-B、包含SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-C及包含如SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列的多肽鏈V-D；或 (7)包含SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-A及包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的多肽鏈VII-B。
  62. 如請求項1至61中任一項之抗體-藥物結合物，其具有相對於單特異性抗c-MET抗體及/或單特異性抗EGFR抗體增強的腫瘤抑制作用；其中該單特異性抗c-MET抗體之CDR之胺基酸序列與該第一抗原結合域之CDR之胺基酸序列一致，且該單特異性抗EGFR抗體之CDR之胺基酸序列與該第二抗原結合域之CDR之胺基酸序列一致。
  63. 如請求項62之抗體-藥物結合物，其中該腫瘤抑制作用包含：抑制EGFR及c-MET信號傳導路徑、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。
  64. 如請求項1至63中任一項之抗體-藥物結合物，其中M包含 ，且其中環A為5員至6員脂族雜環或5員至20員芳族環系統，且該脂族雜環及芳族環系統視情況經一個或多個獨立地選自由以下組成之群的基團置換：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、硫醇基及C 1-6烷基；且M 1係選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
  65. 如請求項1至63中任一項之抗體-藥物結合物，其中M包含 ，其中環A為5員脂族雜環、6員雜芳族環或藉由經由單鍵連接超過一個6員芳族雜環與一個苯環或藉由經由單鍵連接超過一個6員雜芳族環而形成的多環，且其中該脂族雜環視情況經一個或多個選自側氧基(=O)、鹵素及C 1-4烷基之基團取代；且M 1係選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基、C 2-20伸炔基或胺基基團。
  66. 如請求項1至63中任一項之抗體-藥物結合物，其中M為 ，其中環A係選自 、 、 、 、 、 及 ；且M 1係選自單鍵、C 1-6伸烷基、C 2-6伸烯基、C 2-6伸炔基及胺基基團。
  67. 如請求項1至63中任一項之抗體-藥物結合物，其中M係選自 、 及 。
  68. 如請求項1至63中任一項之抗體-藥物結合物，其中M為 。
  69. 如請求項1至63中任一項之抗體-藥物結合物，其中M係選自 、 、 及 。
  70. 如請求項1至63中任一項之抗體-藥物結合物，其中M為 、 及 。
  71. 如請求項1至70中任一項之抗體-藥物結合物，其中L係選自包含以下中之一者或多者的結構：C 1-6伸烷基；-N(R')-；羰基；-O-；天然胺基酸或非天然胺基酸以及其等選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Lys (COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)及包含1、2、3或4個胺基酸之肽的類似物； ； ； ； ； ； ； ； ； ；及 ；其中R'表示氫、C 1-6烷基或含有1至10個環氧乙烷單元之聚乙二醇片段；且s係選自1至20之整數。
  72. 如請求項71之抗體-藥物結合物，其中該肽係選自Ala、Ala-Lys、Ala-Lys(Ac)、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75)。
  73. 如請求項1至70中任一項之抗體-藥物結合物，其中L係選自包含以下中之一者或多者的結構：C 1-6伸烷基、羰基、-NH-、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG (SEQ ID NO: 71))、Gly-Gly-Val-Ala (GGVA (SEQ ID NO: 72)、Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG (SEQ ID NO: 73))、Glu-Ala-Ala-Ala (EAAA (SEQ ID NO: 74))及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (GGGGG (SEQ ID NO: 75)、 、 、 、 及 ；其中s係選自1至20之整數。
  74. 如請求項1至70中任一項之抗體-藥物結合物，其中L係選自由以下中之一者或多者組成的結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
  75. 如請求項1至70中任一項之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
  76. 如請求項1至70中任一項之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 、 及 。
  77. 如請求項1至70中任一項之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 及 。
  78. 如請求項1至70中任一項之抗體-藥物結合物，其中L係選自以下結構： 、 及 。
  79. 如請求項1至78中任一項之抗體-藥物結合物，其中E為單鍵或係選自以下結構： -NHCH 2-、 、 、 及 。
  80. 如請求項1至78中任一項之抗體-藥物結合物，其中E為單鍵、-NHCH 2-、 或 。
  81. 如請求項1至78中任一項之抗體-藥物結合物，其中E為-NHCH 2-或 。
  82. 如請求項1至78中任一項之抗體-藥物結合物，其中E為-NHCH 2-或單鍵。
  83. 如請求項1至78中任一項之抗體-藥物結合物，其中E為 。
  84. 如請求項1至83中任一項之抗體-藥物結合物，其中 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
  85. 如請求項1至83中任一項之抗體-藥物結合物，其中 係選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 及 。
  86. 如請求項1至85中任一項之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓樸異構酶抑制劑及RNA聚合酶抑制劑。
  87. 如請求項86之抗體-藥物結合物，其中該微管蛋白抑制劑為澳瑞他汀(auristatin)化合物或類美登素(maytansinoid)化合物。
  88. 如請求項86之抗體-藥物結合物，其中該DNA嵌入劑為吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
  89. 如請求項86之抗體-藥物結合物，其中該DNA拓樸異構酶抑制劑為拓樸異構酶I抑制劑或拓樸異構酶II抑制劑。
  90. 如請求項89之抗體-藥物結合物，其中該拓樸異構酶I抑制劑係選自喜樹鹼(camptothecin)、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康(irinotecan)、拓樸替康(topotecan)、貝洛替康(bellotecan)、如博替康(rubotecan)及其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物，且該拓樸異構酶II抑制劑係選自阿黴素(doxorubicin)、PNU-159682、倍癌黴素(docarmicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普達非倫毒素(podophyllin toxin)、依託泊苷(etoposide)及其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
  91. 如請求項86之抗體-藥物結合物，其中該RNA聚合酶抑制劑為α-瓢菌素(a-amanitin)或其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
  92. 如請求項1至85中任一項之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自由以下組成之群：由式I及式II表示之化合物，或該等由式I及式II表示之化合物的醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前驅體： 其中R 1及R 2各自獨立地選自C 1-6烷基及鹵素； R 3係選自H及-CO-CH 2OH； R 4及R 5各自獨立地選自H、鹵素及羥基，或R 4及R 5連接形成5員至6員含氧雜環； R 6係選自氫或-C 1-4伸烷基-NR aR b；且 R 7係選自C 1-6烷基、-C 1-4伸烷基-NR aR b、-C 1-4伸烷基-SiR aR bR c、-SiR aR bR c、-C 1-4伸烷基=N-OR a；其中R a、R b及R c在每次出現時係獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2-C 1-6烷基及-CO-C 1-6烷基；其中視情況地，與相關原子連接的R a及R b形成5員至6員含氮雜環。
  93. 如請求項1至85中任一項之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； 其中在將該細胞毒性藥物與該連接子連接之後獲得的該細胞毒性藥物之對應殘基為如請求項1之式中的D。
  94. 如請求項1至85中任一項之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係選自以下化合物或該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、立體異構物、互變異構物或前藥： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ， 其中在將該細胞毒性藥物與該連接子連接之後獲得的該細胞毒性藥物之對應殘基為如請求項1之式中的D。
  95. 如請求項66或67之抗體-藥物結合物，其中D為藉由自該細胞毒性藥物上之-OH、-NH 2或二級胺失去一個H而獲得的單價結構。
  96. 如請求項1至95中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係選自： ADC A-01 ， ADC A-02 ， ADC A-05 ， ADC A-06 ， ADC A-07 ， ADC A-08 ， ADC A-09 ， ADC A-10 ， ADC A-11 ， ADC A-14 ， ADC A-15 ， ADC A-16 ， ADC A-17 ， ADC A-18 ， ADC A-20 ， ADC A-21 ， ADC A-22 ， ADC A-24 ， ADC A-25 ， ADC A-26 ， ADC A-28 ， ADC A-29 ， ADC A-30 ， ADC A-32 ， ADC A-33 ， ADC A-34 ， ADC B-01 ， ADC B-03 ， ADC B-04 ， ADC B-06 ， ADC B-07 ， ADC C-02 ， ADC C-03 ， ADC C-05 ， ADC C-06 ， ADC C-08 ， ADC C-09 ， ADC C-11 ， ADC C-12 ， ADC C-14 ， ADC C-15 ， ADC C-17 ， ADC C-18 ， ADC C-19 ， ADC C-20 ， ADC C-21 ， ADC C-22 ， ADC C-23 ， ADC C-24 ， ADC C-25 ， ADC C-26 ， ADC C-27 ，及 ADC C-28 ； 其中Ab為如請求項1至63中任一項所定義之雙特異性抗體或其抗原結合片段； 及 表示該雙特異性抗體或其抗原結合片段中Cys殘基之硫氫基與該抗體-藥物結合物之M的特異性連接模式；且x表示載藥量。
  97. 如請求項96之抗體-藥物結合物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段中之該硫氫基與該抗體-藥物結合物之M經由加成反應或取代反應形成硫醚鍵，以獲得該抗體-藥物結合物。
  98. 如請求項96或97之抗體-藥物結合物，其中Ab為選自由以下組成之群的雙特異性抗體：BsAb 07B、BsAb 10B、BsAb 38B、BsAb 41B、BsAb 49B、BsAb 55B及BsAb 56B。
  99. 一種抗體-藥物結合物，其選自由以下組成之群：ADC 07B-A-05、ADC 07B-A-14、ADC 38B-A-14、ADC 49B-A-14、ADC 49B-B-01、ADC 49B-A-05、ADC 41B-A-05、ADC 55B-A-14及ADC 56B-A-14。
  100. 一種組合物，其包含一種或多種如請求項1至99中任一項之抗體-藥物結合物。
  101. 如請求項100之組合物，其中該組合物之DAR值(藥物-抗體結合比)為1至10。
  102. 如請求項100之組合物，其中該組合物之DAR值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、4至5、4至6、4至7、4至8、4至9、4至10、5至6、5至7、5至8、5至9、5至10、6至7、6至8、6至9、6至10、7至8、7至9、7至10、8至9、8至10或9至10。
  103. 如請求項100之組合物，其中該組合物之DAR值為3至9。
  104. 如請求項100之組合物，其中該組合物之DAR值為4至8。
  105. 如請求項100之組合物，其中該組合物之DAR值為3.0至3.5、3.0至4.0、3.0至4.5、3.0至5.0、3.0至5.5、3.0至6.0、3.5至4.0、3.5至4.5、3.5至5.0、3.5至5.5、3.5至6.0、3.5至6.5、3.5至7.0、3.5至7.5、3.5至8.0、4.0至4.5、4.0至5.0、4.0至5.5、4.0至6.0、4.0至6.5、4.0至7.0、4.0至7.5、4.0至8.0、4.5至5.0、4.5至5.5、4.5至6.0、4.5至6.5、4.5至7.0、4.5至7.5、4.5至8.0、5.0至5.5、5.0至6.0、5.0至6.5、5.0至7.0、5.0至7.5、5.0至8.0、5.5至6.0、5.5至6.5、5.5至7.0、5.5至7.5、5.5至8.0、6.0至6.5、6.0至7.0、6.0至7.5、6.0至8.5、6.5至7.0、6.5至7.5、6.5至8.5、7.0至7.5、7.0至9.0或7.5至9.0。
  106. 一種醫藥組合物，其包含一種或多種如請求項1至99中任一項之抗體-藥物結合物，或如請求項100之組合物，以及一種或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
  107. 如請求項106之醫藥組合物，其中該醫藥組合物進一步包含一種或多種選自由以下組成之群的額外醫藥活性劑：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
  108. 一種藥物組合，其包含第一治療劑及第二治療劑，其中該第一治療劑及該第二治療劑係同時或依序投與；該第一治療劑係選自如請求項1至99之抗體-藥物結合物或如請求項100至105中任一項之組合物中之一者或多者；且該第二治療劑係選自由以下組成之群：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET抑制劑、VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
  109. 一種如請求項1至99中任一項之抗體-藥物結合物、如請求項100至105中任一項之組合物、如請求項106或107之醫藥組合物或如請求項108之藥物組合在製備藥品中的用途，其中該藥品係用於預防個體的與c-MET及/或EGFR有關之疾病、治療該等疾病及/或在治療該等疾病時起輔助作用及/或係用以活體外或在個體體內抑制c-MET及/或EGFR之活性；其中該等與c-MET及/或EGFR有關之疾病係與EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增相關，視情況其中該等與c-MET及/或EGFR有關之疾病包含癌症。
  110. 如請求項109之用途，其中該癌症係選自上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌、前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌及頭頸癌。
  111. 如請求項109或110之用途，其中該抗體-藥物結合物或醫藥組合物及額外醫藥學活性劑係以組合方式同時、分開或依序投與；其中該額外醫藥學活性劑係選自：EGFR抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、IGFR-1抑制劑、mTOR抑制劑、PI3激酶抑制劑、c-MET或VEGF抑制劑、化學療法藥物及其任何組合。
  112. 一種用於抑制細胞中c-MET及/或EGFR之活性的方法，該方法包含使該等細胞與如請求項1至99中任一項之抗體-藥物結合物、如請求項100至105中任一項之組合物、如請求項106或107之醫藥組合物或如請求項108之藥物組合接觸；其中該等細胞為表現c-MET及/或EGFR之細胞。
  113. 一種用於預防有需要之個體的與c-MET及/或EGFR相關之疾病、治療該疾病及/或在治療該疾病時起輔助作用的方法，該方法包含向該個體投與有效量的如請求項1至99中任一項之抗體-藥物結合物、如請求項100至105中任一項之組合物、如請求項106或107之醫藥組合物或如請求項108之藥物組合，其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為包含EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增之疾病，視情況其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為癌症。
  114. 如請求項113之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌及前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。
  115. 如請求項113或114之方法，其中該方法進一步包含向該個體投與第二療法，該第二療法係選自由以下組成之群：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法(nanotherapy)、病毒療法、輔助療法及其任何組合；視情況其中該第二療法係同時、分開或依序投與。
  116. 如請求項1至99中任一項之抗體-藥物結合物、如請求項100至105中任一項之組合物、如請求項106或107之醫藥組合物或如請求項108之藥物組合，其用於預防個體的與c-MET及/或EGFR相關之疾病、治療該疾病及/或在治療該疾病時用作佐劑，其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為包含EGFR活化突變、EGFR基因擴增、循環HGF含量升高、c-MET活化突變及/或c-MET基因擴增之疾病，視情況其中該與c-MET及/或EGFR相關之疾病為癌症。
  117. 如請求項116之抗體-藥物結合物，其中該癌症係選自由以下組成之群：上皮細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、口腔癌、結腸直腸癌、肛門癌及前列腺癌、膀胱癌、咽癌、鼻癌、胰臟癌、皮膚癌、舌癌、食道癌、陰道癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、散發性或遺傳性乳突狀腎細胞癌、結腸癌、肝癌、腎癌或頭頸癌。
  118. 如請求項116或117之抗體-藥物結合物，其中該方法進一步包含向該個體投與第二療法，該第二療法係選自由以下組成之群：手術、化學療法、放射療法、免疫療法、基因療法、DNA療法、RNA療法、奈米療法、病毒療法、輔助療法及其任何組合；視情況其中該第二療法係同時、分開或依序投與。
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