RS55571B1

RS55571B1 - Anti-c5a vezujuće grupe sa visokom blokirajućom aktivnosti

Info

Publication number: RS55571B1
Application number: RS20170025A
Authority: RS
Inventors: Renfeng Guo; Niels Christoph Riedemann; Yan Li; Beifen Shen
Original assignee: Inflarx Gmbh
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2017-05-31
Also published as: HRP20200241T1; PT2504362T; BR112012012514B1; EA201200795A1; HRP20170041T1; SMT201700054T1; KR101844611B1; KR20180034690A; EP3181582A1; EP2327725A1; JP6104605B2; IL219911A0; JP2018080170A; CY1122674T1; PT3181582T; RS59955B1; ES2773725T3; US8802096B2; PL2504362T3; NZ600348A

Description

Opis pronalaska

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na vezujuće grupe koje se specifično vezuju za konformacioni epitop C5a, a naročito humani C5a. Poželjne vezujuće grupe su antiC5a antitela koja se vezuju za ovaj konformacioni epitop. Vezujuće grupe koje su ovde opisane su korisne kao aktivne materije u farmaceutskim kompozicijama za lečenje i prevenciju različitih akutnih i hroničnih bolesti, a naročito akutnih zapaljenskih bolesti, kao što su sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), i različiti stadijumi sepse uključujući sepsu, ozbiljnu sepsu, i septični šok.

STANJE TEHNIKE

[0002]C5a se odvaja od C5 posle aktivacije komplementa. Među proizvodima aktivacije komplementa, C5a je jedan od najpotentnijih zapaljenskih peptida, sa širokim spektrom funkcija (Guo i VVard 2005). C5a je glikoprotein koji je prisutan u krvi zdravih ljudi, sa molekulskom težinom od 11.2 kDa. Polipeptidni deo C5a sadrži 74 aminokiselina, čija molekulska težina iznosi 8 2 kDa, dok težina ugljenohidratnog dela iznosi približno 3 kDa C5a ostvaruje svoje efekte preko visoko-afinitetnih C5a receptora (C5aR i C5L2) (VVard 2009). C5aR pripada familiji sa G-proteinom kuplovanih receptora tipa rodopsina sa sedam transmembranskih segmenata; C5L2 je sličan, ali nije kuplovan sa G-proteinom. Sada se smatra da C5a primarno izvršava svoje biološke funkcije putem C5a-C5aR interakcije, pošto je otkriveno nekoliko bioloških reakcija za C5a-C5L2 interakciju. C5aR se široko izražava na mijeloidnim ćelijama, uključujući neutrofile, eozinofile, bazofile, i monocite, i nemijeloidnim ćelijama u mnogim organima, a naročito u plućima i jetri, što ukazuje na značaj C5a/C5aR signalizacije. C5a ima mnoštvo bioloških funkcija (Guo i VVard 2005). C5a je jak hemoatraktant za neutrofile, a takođe ima hemotaktičku aktivnost za monocite i makrofage. C5a izaziva oksidativnu eksploziju (potrošnju 02) u neutrofilima i povećava fagocitozu i oslobađanje granularnih enzima. Takođe je otkriveno daje C5a vazodilatator. Pokazano je da je C5a uključen u modulaciju ekspresije citokina iz različitih tipova ćelija, da bi se povećala ekspresija adhezije molekula na neutrofilima. Otkriveno je da C5a postaje veoma štetan kada se prekomerno proizvodi u uslovima bolesti, pošto je jak induktor i pojačavač zapaljenskih reakcija koje funkcionišu uzvodno u lancu zapaljenske reakcije. Visoke doze C5a mogu dovesti do nespecifične hemotaktičke "desenzibilizacije" neutrofila, čime se izaziva široka disfunkcija (Huber-Lang et al. 2001a).

[0003]Za C5a je bilo navedeno da vrši brojne pro-zapaljenske reakcije, i bilo je navedeno da je štetan tokom sepse. Pokazano je da inhibicija C5a ili C5a receptora (C5aR) pomoću antitela dramatično poboljšava preživljavanje u različitim modelima sepse kod miševa i pacova (Czermak et al. 1999; Guo et al. 2000; Huber-Lang et al. 2001b; Riedemann et al 2002a). Pored toga, različiti izveštaji su pokazali štetne efekte C5a na prirodne urođene imune funkcije i funkcije organa tokom eksperimentalne sepse (Guo et al. 2000, Guo et al. 2002, Huber-Lang et al. 2001a; Huber-Lang et al. 2002, Laudes et al. 2002; Riedemann et al. 2003; Riedemann et al 2004a; Riedemann et al. 2004b). C5a deluje kao anafilatoksin i bilo je navedeno da vrši brojne pro-zapaljenske efekte Bilo je navedeno da je kod ljudi sepsa sa visokim nivoima C5a povezana sa znatno pogoršanim ishodima u različitim studijama (Bengtson i Heideman 1988, Nakaeetal 1994, Nakaeetal. 1996).

[0004]U uslovima eksperimentalne sepse, izlaganje neutrofila C5a može dovesti do disfunkcije neutrofila i paralize signalnih puteva, što dovodi do defektnog formiranja NADPH oksidaze, paralize MAPK signalnih kaskada, veoma depresirane oksidativne eksplozije, fagocitoze i hemotakse (Guo et al. 2006a; Huber-Lang et al. 2002). Apoptoza timocita i odložena apoptoza neutrofila su dva važna patogena događaja za razvoj sepse koji zavise od prisustva C5a (Guo et al. 2000; Guo et al. 2006b). Tokom eksperimentalne sepse, C5a prekomerno reguliše ekspresiju p2 integrina na neutrofilima da bi stimulisao migraciju ćelija u organe (Guo etal. 2002), koja je jedan od glavnih uzroka multiorganskog sistemskog otkaza (MOF). Takođe je otkriveno da se C5a može pripisati aktivacija puta koagulacije koja se pojavljuje u eksperimentalnoj sepsi (Laudes et al 2002). C5a stimuliše sintezu pro-zapaljenskih citokina i njihovo oslobađanje iz humanih leukocita kao što su TNF-a, IL-p, IL-6, IL-8, i inhibitorni faktor migracije makrofaga (MIF) (Hopken et al. 1996; Riedemann et al. 2004a; Strieter et al. 1992). C5a stvara snažan sinergistički efekat sa LPS u produkciji TNF-a, zapaljenskog proteian makrofaga (MIP)-2, citokinima indukovanog neutrofilnog hemoatraktanta (CINC)-1, i IL-ip u alveolarnim epitelnim ćelijama (Riedemann et al. 2002b; Rittirsch et al. 2008). Imajući u vidu daje aktivacija komplementa događaj koji se dešava tokom pojave/nastanke sepse, C5a može odigrati ulogu pre pojave "oluje zapaljenskih citokina". Izgleda da C5a igra ključnu ulogu u orkestraciji performansi mreže citokina i nastanku sindroma sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS). Blokada C5a u uslivima eksperimentalne sepse dramatično slabi MOF i SIRS. Masovna prekomerna regulacija C5aR ekspresije se dešava tokom nastanka sepse, i blokada C5a/C5aR interakcije pomoću anti-C5a, ili anti-C5aR antitela, ili C5aR antagonista obezbeđuje visoke zaštitne efekte u glodarskim modelima sepse (Czermak et al. 1999; Huber-Lang et al. 2001b; Riedemann et al. 2002a).

[0005]Pored toga se za indikaciju sepse takođe pokazalo da blokada C5a deluje zaštitno u mnogim drugim modelima zapaljenja, kao što su povrede povezane sa ishemijom/reperfuzijom, bubrežna bolest, odbacivanje grafta, malarija, reumatoidni artritis, infektivne crevne bolesti, zapaljenske bolesti pluća, autoimune bolesti tipa lupusa, neurodegenerativne bolesti, itd. kod različitih vrsta, kao što su delimično razmotrili Klos A. et al (Klos et al. 2009) i Allegretti M. et al (Allegretti et al. 2005). Pored toga, nedavno je otkriveno da blokada C5a ima veliku terapeutsku korist u modelu tumora kod miševa (Markievvski et al. 2008).

TEHNIČKI PROBLEMI KOJI SE REŠAVAJU PREDMETNIM PRONALASKOM

[0006]Antitela koja se specifično vezuju za C5a deo, ali ne i za C5b deo C5 su poznata iz stanja tehnike (Klos et al. (1998) J. Immunol. Meth. 111: 241-252; WO 01/15731; WO 03/015819).

[0007]Međutim, prethodno generisana anti-C5a antitela su ispoljavala samo umerene blokirajuće aktivnosti za biološke efekte indukovane sa C5a Kao posledica ovoga, anti-C5a antitela iz stanja tehnike nisu bila sposobna za ostvarivanje potpune blokade bioloških efekata indukovanih sa C5a ili su morala da se koriste u superstehiometrijskim količinama da bi se ostvarila razumno visoka aktivnost blokiranja C5a.

[0008]Shodno tome, a naročito u svetlu potencijalne kliničke primene na pacijentima, u stanju tehnike je ostala potreba za anti-C5a antitelima ili drugim vezujućim grupama koje bi ispoljile jaču blokirajuću aktivnost za biološke efekte indukovane sa C5a, dok bi se vezivala specifično za C5a sa visokim afinitetom. Takođe takva antitela prvenstveno ne bi trebalo da se vezuju za C5b i, shodno tome, ne bi uticala na biološke aktivnosti C5b.

[0009]Kao potpuno iznenađujuće, pronalazači predmetnog pronalaska su bili u stanju da identifikuju novi konformacioni vezujući epitop sa odgovarajućim vezujućim antitelima koji ispunjava gore navedene napredne zahteve i druge U brojnim eksperimentima na kojima je zasnovan predmetni pronalazak, mogla su biti generisana dva anti-C5a antitela među više od 2000 koja ispoljavaju novu blokirajuću aktivnost za biološke efekte indukovane sa C5a kada se koriste u stehiometrijskim količinama, tj. 0.5 mola bivalentnog antitela po molu C5a.

[0010]Gornji pregled ne opisuje nužno sve probleme koji su rešeni predmetnim pronalaskom.

SUŠTINA PRONALASKA

[0011]Prema prvom aspektu predmetni pronalazak se odnosi na vezujuću grupu koja se vezuje za konformacioni epitop obrazovan aminokiselinskim sekvencama NDETCEORA (SEQ ID NO: 2) i SHKDMOL (SEQ ID NO: 3) od C5a, pri čemu se vezujuća grupa vezuje za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2 i za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 3; pri čemu pomenuta vezujuća grupa ima konstantu vezivanja za C5a sa Kd vrednosti od 10 nM ili manju i ispoljava najmanje 80% blokirajuću aktivnost za biološki efekat indukovan sa C5a; i pri čemu je pomenuta vezujuća grupa izabrana iz grupe koja se sastoji od: (a) antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata; i (b) antitelima sličnih proteina, pri čemu su pomenuti antitelima slični proteini izabrani iz grupe koja se sastoji od afitela, antikalina, i određenih ankirin ponavljajućih proteina.

[0012]Prema drugom aspektu predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži vezujuću grupu prema prvom aspektu i koja dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razređivača, ekscipijenasa, punilaca, veziva, lubrikanata, glidanata, sredstava za raspadanje, adsorbenata, i/ili konzervanasa.

[0013]Prema trećem aspektu predmetni pronalazak se odnosi na primenu vezujuće grupe prema prvom aspektu za pripremanje farmaceutske kompozicije za prevenciju i/ili lečenje različitih bolesti uključujući akutno zapaljenje, kao što su sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), sepsa, ozbiljna sepsa, septični šok, povrede povezane sa ishemijom/reperfuzijom, kao što je ishemijska srčana bolest, akutna povreda pluća, pneumonija, akutno i hronično odbacivanje grafta kod pacijenata sa transplantacijom, reakcije graft protiv domaćina, kao i bolesti koje sadrže hronične tipove zapaljenja, kao što su bubrežne glomerularne bolesti, kao što su glomerulonefntis i druge vrste bubrežne insuficijencije, reumatoidni artritis i slične autoimune bolesti, kao što su Behterova bolest, bolesti tipa lupusa, zapaljenska bolest creva, Kronova bolest, rast tumora, ili kancer čvrstih organa.

[0014]Ova suština pronalaska ne opisuje nužno sve karakteristike pronalaska.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Definicije

[0015]Pre nego što predmetni pronalazak bude detaljno opisan, podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na posebnu metodologiju, protokole i reagense koji su ovde opisani, pošto isti mogu varirati. Takođe se podrazumeva da je ovde upotrebljena terminologija namenjena samo za svrhe opisivanja posebnih primera izvođenja i da nije namenjena za ograničavanje obima predmetnog pronalaska koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Osim ako nije drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni termini imaju ista značenja koja bi im normalno dao prosečan stručnjak iz odgovarajuće oblasti.

[0016]Ovde su upotrebljeni izrazi koji su prvenstveno definisani kao što je opisano u "A multilingual glossarv of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H G.W, Nagel, B. i Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Bazel, Švajcarska)

[0017]U ovom opisu i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, smatra se da reč "sadrže", i varijante kao što su "sadrži" i "koji sadrži", implicira uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka.

[0018]Kada se ovde koristi, "humani C5a" se odnosi na sledeći peptid od 74 aminokiseline:

[0019]Izraz "vezujuća grupa", kada se ovde koristi, se odnosi na bilo koji molekul ili deo molekula koji se može specifično vezivati za ciljni molekul ili ciljni epitop. Vezujuće grupe u kontekstu predmetne prijave su (a) antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti; ili (b) antitelima slični proteini. "Vezujuće grupe" koje se mogu koristiti za primenu predmetnog pronalaska mogu da se vezuju za konformacioni epitop sisarskog C5a koji je obrazovan sa dve aminokiselinske sekvence NDETCEORA (SEQ ID NO: 2)

i SHKDMOL (SEQ ID NO: 3).

[0020]Kada se ovde koristi, smatra se da se prvo jedinjenje (npr. antitelo) "vezuje" za drugo jedinjenje (npr. antigen, kao što je ciljni protein), ako ima konstantu disocijacije Kdza pomenuto drugo jedinjenje od 1 mM ili manju, a prvenstveno od 100 mM ili manju, a prvenstveno od 50 uM ili manju, a prvenstveno od 30 uM ili manju, a prvenstveno od 20 uM ili manju, a prvenstveno od 10 uM ili manju, a prvenstveno od 5 uM ili manju, još poželjnije od 1 uM ili manju, još poželjnije od 900 nM ili manju, još poželjnije od 800 nM ili manju, još poželjnije od 700 nM ili manju, još poželjnije od 600 nM ili manju, još poželjnije od 500 nM ili manju, još poželjnije od 400 nM ili manju, još poželjnije od 300 nM ili manju, još poželjnije od 200 nM ili manju, čak još poželjnije od 100 nM ili manju, čak još poželjnije od 90 nM ili manju, čak još poželjnije od 80 nM ili manju, čak još poželjnije od 70 nM ili manju, čak još poželjnije od 60 nM ili manju, čak još poželjnije od 50 nM ili manju, čak još poželjnije od 40 nM ili manju, čak još poželjnije od 30 nM ili manju, čak još poželjnije od 20 nM ili manju, i čak još poželjnije od 10 nM ili manju.

[0021]Izraz "vezivanje" prema pronalasku se prvenstveno odnosi na specifično vezivanje "Specifično vezivanje" znači da se vezujuća grupa (npr. antitelo) vezuje jače za cilj kao što je epitop za koji je specifičan u poređenju sa vezivanjem za drugi cilj. Vezujuća grupa se vezuje jače za prvi cilj u poređenju sa drugim ciljem ako se vezuje za prvi cilj sa konstantom disocijacije (Kd) koja je manja od konstante disocijacije za drugi cilj. Prvenstveno je konstanta disocijacije (Kd) za cilj za koji se vezujuća grupa vezuje specifično više nego 10-struko, a prvenstveno više nego 20-struko, još poželjnije više nego 50-struko, čak još poželjnije više nego 100-struko, 200-struko, 500-struko ili 1000-struko manja od konstante disocijacije (Kd) za cilj za koji se vezujuća grupa ne vezuje specifično.

[0022]Kada se ovde koristi, izraz "Kd" (mereno u "mol/L", ponekad skraćeno kao "M") treba da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije posebne interakcije između vezujuće grupe (npr. antitela ili njegovog fragmenta) i ciljnog molekula (npr. antigena ili njegovog epitopa).

[0023]"Epitop", koji je takođe poznat kao antigenska determinanta, je deo makromolekula koji prepoznaje imuni sistem, a naročito antitela, B ćelije, ili T ćelije. Kada se ovde koristi, "epitop" je deo makromolekula koji može da se vezuje za vezujuću grupu (npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment) kao što je ovde opisano. U ovom kontekstu, izraz "vezivanje" se prvenstveno odnosi na specifično vezivanje. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupisanja molekula, kao što su bočni lanci aminokiselina ili šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za drugi gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.

[0024]Kada se ovde koristi, "konformacioni epitop" se odnosi na epitop linearnog makromolekula (npr. polipeptid) koji je obrazovan trodimenzionalnom strukturom pomenutog makromolekula. U kontekstu predmetne prijave, "konformacioni epitop" je "diskontinualni epitop", tj. konformacioni epitop na makromolekulu (npr. polipeptid) koji je formiran od najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci makromolekula (npr. aminokiselinska sekvenca polipeptida). Drugim rečima, epitop se smatra "konformacionim epitopom" u kontekstu predmetnog pronalaska, ako se epitop sastoji od najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci za koju se vezujuća grupa prema pronalasku (npr antitelo ili njegov antigen vezujući fragment) vezuje istovremeno, pri čemu su ova najmanje dva odvojena regiona prekinuta sa jednim od više regiona u primarnoj sekvenci za koju se vezujuća grupa prema pronalasku ne vezuje. Prvenstveno je takav "konformacioni epitop" prisutan na polipeptidu, a dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci su dve odvojene aminokiselinske sekvence za koje se vezuje vezujuća grupa prema pronalasku (npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment), pri čemu su ove najmanje dve odvojene aminokiselinske sekvence prekinute sa jednom od više aminokiselinskih sekvenci u primarnoj sekvenci za koje se vezujuća grupa prema pronalasku ne vezuje. Prvenstveno je prekidajuća aminokiselinska sekvenca susedna aminokiselinska sekvenca koja sadrži dve ili više aminokiselina za koje se vezujuća grupa ne vezuje Najmanje dve odvojene aminokiselinske sekvence za koje se vezujuća grupa prema pronalasku vezuje nisu posebno ograničene u pogledu svoje dužine. Takva odvojena aminokiselinska sekvenca se može sastojati od samo jedne aminokiseline sve dok je ukupni broj aminokiselina u okviru pomenute najmanje dve odvojene aminokiselinske sekvence dovoljno veliki da se ostvari specifično vezivanje između vezujuće grupe i konformacionog epitopa.

[0025]"Paratop" je deo antitela koji prepoznaje epitop. U kontekstu predmetnog pronalaska, "paratop" je deo vezujuće grupe (npr. antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta) kao što je ovde opisana koji prepoznaje epitop

[0026]Izraz "antitelo" se obično odnosi na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, ili na njihov antigen-vezujući deo. Izraz "antitelo" takođe obuhvata sve rekombinantne oblike antitela, a naročito ovde opisanih antitela, npr. antitela izraženih u prokariotama, neglikozilovana antitela, i bilo koji antigen-vezujući fragment i derivat antitela kao što je dole opisano Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao VH ili VH) i konstantni region teškog lanca Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca

(ovde skraćeno kao VL ili VL) i konstantni region lakog lanca VH i VL regioni se dalje mogu podeliti u regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regionima koji određuju komplementarnost (engl. complementaritv determining regions, skr. CDR), prošaranim sa regionima koji su bolje očuvani, odn. konzerviraniji, a koji se nazivaju okvirnim regionima (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDRs i četiri FRs, raspoređena od amino-terminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji sadejstvuje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati vezivanje imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćine, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog komplementnog sistema.

[0027]Izraz "antigen-vezujući fragment" antitela (ili jednostavno "vezujući deo"), kada se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvršiti pomoću fragmenata antitela cele dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih u okviru izraza "antigen-vezujući deo" antitela obuhvataju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab')2 fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana pomoću disulfidnog mosta u regionu zgloba; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena samo jednog kraka antitela, (v) dAb fragmente (VVard et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDRs koji opciono mogu biti povezani pomoću sintetičkog linkera. Dalje, mada su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana posebnim genima, oni se mogu spojiti uz korišćenje rekombinantnih metoda, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao samo jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju da bi obrazovali monovalentne molekule (poznate kao jednolančane Fv (scFv); vidi npr. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci USA 85: 5879-5883). Takva jednolanćana antitela takođe treba da budu obuhvaćena sa izrazom "antigen-vezujući fragment" antitela. Sledeći primer je vezujući-domen imunoglobulinskog fuzionog proteina koji sadrži (i) vezujući domen polipeptida koji je fuzionisan sa polipeptidom regiona zgloba imunoglobulina, (ii) konstantni region teškog lanca CH2 imunoglobulina fuzionisan sa regionom zgloba, i (iii) konstantni region teškog lanca CH3 imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Polipeptid vezujućeg domena može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Vezujući-domeni imunoglobulinskih fuzionih proteina su dalje opisani u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem uobičajenih tehnika koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, a fragmenti se podvrgavaju skriningu radi utvrđivanja korisnosti na isti način kao prirodna antitela. Sledeći primeri "antigen-vezujućih fragmenata" su takozvana mikroantitela, koja se dobijaju od jednolančanih CDRs. Na primer, Heap et al., 2005, opisuju mikrotelo sa 17 aminokiselinskih ostataka, koje je dobijeno od teškog lanca CDR3 antitela usmerenog protiv gp120 glikoproteina omotača HIV-1. Drugi primeri obuhvataju mala antitela mimetike koji sadrže dva ili više CDR regiona koji su međusobno fuzionisani, a prvenstveno kognitivnim okvirnim regionima. Takvi mali mimetici antitela koji sadrže VHCDR1 i VLCDR3 vezane za srodni VHFR2 su bili opisani u Qiu et al., 2007.

[0028]Shodno tome, izraz "antitelo ili njegov antigen vezujući fragment", kada se ovde koristi, se odnosi na imunoglobulinske molekule i imunološki aktivne delove imunoglobulinskih molekula, tj. molekula koji sadrže antigen-vezujuće mesto koje se imunospecifično vezuje za antigen Takođe su sadržani imunoglobulinu slični proteini koji se biraju pomoću tehnika, uključujući, na primer, ispoljavanje na fagima koji se specifično vezuju za ciljni molekul ili ciljni epitop, npr. za konformacioni epitop humanog C5a formiranog pomoću aminokiselinskih sekvenci sa SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3; ili konformacioni epitop humanog C5a formiran pomoću aminokiselinskih sekvenci DETCEOR (SEQ ID NO: 4) i KDM. Imunoglobulinski molekuli prema pronalasku mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i lgY), klase (npr. lgG1, lgG2, a prvenstveno lgG2a i lgG2b, lgG3, lgG4, lgA1 i lgA2) ili potklase imunoglobulinskog molekula

[0029]Antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti koji se mogu upotrebiti u pronalasku mogu biti poreklom od bilo koje životinje, uključujući ptice i sisare Prvenstveno su antitela ili fragmenti poreklom od čoveka, šimpanze, glodara (npr. miša, pacova, zamorčeta, ili zeca), pileta, ćurke, svinje, ovce, koze, kamile, krave, konja, magarca, mačke ili psa. Posebno je poželjno da antitela budu humanog ili mišijeg porekla. Antitela prema pronalasku takođe obuhvataju himerične molekule u kojima se konstantni region antitela dobijen od jedne vrste, a prvenstveno humani, kombinuje sa antigen vezujućim mestom dobijenim od neke druge vrste, npr miša. Pored toga antitela prema pronalasku obuhvataju humanizovane molekule u kojima su antigen vezujuća mesta antitela dobijenih od nehumane vrste (npr. od miša) kombinovana sa konstantnim i okvirnim regionima humanog porekla.

[0030]Kao što se ovde vidi iz primera, antitela prema pronalasku se mogu dobiti direktno iz hibridoma koji izražavaju antitelo, ili se mogu klonirati i rekombinantno izraziti u ćeliji domaćinu (npr. CHO ćeliji, ili limfocitnoj ćeliji). Sledeći primeri ćelija domaćina su mikroorganizmi, kao što jeE. coli,i gljive, kao što je kvasac. Alternativno tome, ona se mogu proizvesti rekombinatno u transgenskoj nehumanoj životinji ili biljci.

[0031]Izraz "himerično antitelo" se odnosi na ona antitela kod kojih je jedan deo svake od aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima

dobijenim od posebne vrste ili koji pripadaju posebnoj klasi, dok je preostali segment lanca homolog sa odgovarajućim sekvencama kod drugih vrsta ili klasa Obično su varijabilni region i lakih, i teških lanaca mimici varijabilnih regiona antitela dobijenih od jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologi sa sekvencama antitela dobijenim od drugog. Jedna jasna prednost takvih himeričnih oblika je ta što se varijabilni region može dobiti na podesan način iz trenutno poznatih izvora uz korišćenje lako raspoloživih B-ćelija ili hibridoma od nehumanog organizma domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima dobijenim, na primer, iz humanih ćelijskih preparata. Pošto varijabilni region ima prednost lakoće dobijanja i izvor ne utiče na specifičnost kada je konstantni region humani, onda je manje verovatno da će da pobudi imunu reakciju humanog subjekta kada se antitela injektiraju nego konstantni region iz nehumanog izvora Međutim, definicija nije ograničena na ovaj posebni primer.

[0032]Izraz "humanizovano antitelo" se odnosi na molekul koji ima antigen vezujuće mesto koje je u suštini dobijeno od imunoglobulina nehumane vrste, pri čemu je preostala imunoglobulinska struktura molekula bazirana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen vezujuće mesto može sadržati kompletne varijabilne domene fuzionisane na konstantnim domenima ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) graftovane na odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Antigen-vezujuća mesta mogu biti prirodna ili modifikovana sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana tako da više liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela očuvaju sve CDR sekvence (na primer, humanizovano misije antitelo koje sadrži svih šest CDRs iz mišijeg antitela). Drugi oblici imaju jedan ili više CDRs koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.

[0033]Različite metode za humanizaciju antitela su poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti, kao što su opisali Almagro & Fransson, 2008 Pregledni članak autora Almagro & Fransson je ukratko sumiran u nastavku. Almagro & Fransson razlikuju racionalne pristupe i empirijske pristupe. Racionalni pristupi su karakterisani generisanjem nekoliko varijanti genetskim inženjeringom dobijenog antitela i određivanjem njihovog svojstva vezivanja ili bilo kojeg drugog svojstva od interesa. Ako naznačene varijante ne proizvedu očekivane rezultate, onda započinje novi ciklus dizajna i određivanja vezivanja. Racionalni pristupi obuhvataju CDR graftovanje, izmenu površine („resurfacing"), superhumanizaciju, i optimizaciju sadržaja humanog niza. Nasuprot tome, empirijski pristupi su bazirani na genensanju velikih biblioteka humanizovanih varijanti i selekciji najboljih klonova uz korišćenje tehnologija obogaćivanja ili visoko produktivnog skrininga. Shodno tome, empirijski pristupi su zavisni od pouzdanog sistema selekcije i/ili skrininga koji može da pretražuje u okviru ogromnog skupa varijanti antitela.In vitrotehnologije prikazivanja, kao što su ispoljavanje na fagima i ispoljavanje na ribozomima ispunjavaju ove zahteve i dobro su poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. Empirijski pristupi obuhvataju FR biblioteke, vođenu selekciju, mešanje okvira, i „Humaneering".

CDR graftovanje

[0034]Protokol CDR graftovanja obično sadrži tri tačke za donošenje odluka: (1) definisanje regiona koji određuju specifičnost donorskog antitela, tj. cilja za graftovanje, (2) identifikaciju izvora humanih sekvenci koje će biti upotrebljene kao FR donori, i (3) selekciju ostataka izvan regiona koji definiše specifičnost, tj. određivanje pozicija aminokiselina koje su ciljevi za povratnu mutaciju da bi se ponovo uspostavio ili poboljšao afinitet humanizovanog antitela.

(1) Regioni koji određuju specifičnost antitela

[0035]Eksperimentalna struktura nehumanog antitela u kompleksu sa antigenom obezbeđuje detaljnu mapu ostataka u kontaktu sa antigenom i zbog toga su oni odgovorni za određivanje njegove specifičnosti. Strukturna informacija se može upotpuniti mutagenezom sa skeniranjem alaninom i/ili kombinatornom mutagenezom da bi se identifikovali ostaci koji najviše doprinose energiji vezivanja ili funkcionalnom paratopu. Pošto je funkcionalni paratop podskup ostataka u kontaktu, onda bi graftovanje samo funkcionalnog paratopa smanjilo broj nehumanih ostataka u humanizovanom proizvodu. Međutim, samo su u retkim slučajevima na raspolaganju eksperimentalna struktura kompleksa antigen-antitelo i/ili funkcionalnog paratopa na početku humanizacionog protokola. U odsustvu precizne definicije ostataka koji su odgovorni za datu specifičnost antitela, CDRs se često upotrebljavaju kao regioni koji definišu specifičnost. Takođe je moguće upotrebiti kombinaciju CDR i HV petlje kao ciljeva za graftovanje. Da bi se smanjio broj ostataka koji treba da budu graftovani na humane FRs, opisano je SDR graftovanje, tj. graftovanje ostataka koji određuju specifičnost (SDRs).

(2) Izvor humanih FRs

[0036]Drugi korak u tipičnom protokolu CDR graftovanja je da se identifikuju humani FR donori. Inicijalni radovi koriste FRs od humanih antitela poznate strukture, bez obzira na njihovu homologiju sa nehumanim antitelom. Ovaj pristup je poznat kao "fiksni FR metod". Kasniji radovi su koristili humane sekvence koje imaju najvišu homologiju sa nehumanim antitelom. Ovaj pristup se naziva "najbolje fitovanje". Mada strategije "najboljeg fitovanja" imaju tendenciju da rezultuju antitelima sa većim afinitetom, takođe treba uzeti u obzir i druge parametre, kao što su mala imunogenost i prinosi proizvodnje, kada se bira FR za humanizaciju. Shodno tome, takođe su moguće kombinacije "najboljeg fitovanja" i "fiksnog FR". Na primer, VLdeo može biti humanizovan prema metodu fiksnog FR, dok VHdeo može biti humanizovan prema metodu najboljeg fitovanja, ili obratno.

[0037]Upotrebljavaju se dva izvora humanih sekvenci: zrele i germinativne sekvence Zrele sekvence, koje su proizvodi imunih reakcija, nose somatske mutacije koje su generisane slučajnim procesima i nisu pod selekcijom vrsta, što rezultuje potencijalnim imunogenim ostacima. Shodno tome, da bi se izbegli imunogeni ostaci, sve više se koriste geni humani germinativnih linija kao izvor FR donora. Nukleotidne sekvence FRs humanih germinativnih linija su opisane npr u Dodacima A i B članka autora Dall'Acqua et al, 2005. Dalje, antitela bazirana na genima germinativnih linija imaju tendenciju da budu fleksibilnija u poređenju sa zrelim antitelima. Smatra se da ova veća fleksibilnost omogućava bolje prihvatanje različitih CDRs sa manje ili bez povratnih mutacija u FR da bi se ponovo uspostavio afinitet humanizovanog antitela

(3) Povratne mutacije za ponovno uspostavljanje ili povećanje afiniteta

[0038]Afinitet se obično smanjuje posle CDR graftovanja kao posledica nekompatibilnosti između nehumanih CDRs i humanih FRs Zbog toga je treći korak u uobičajenom protokolu CDR graftovanja da se definišu mutacije koje bi ponovo uspostavile ili sprečile gubitak afiniteta. Povratne mutacije moraju da budu pažljivo osmišljene na osnovu strukture ili modela humanizovanog antitela i eksperimentalno testirane. Veb sajt za automatizovano modeliranje antitela pod nazivom VVAM se može naći na URL http://antibody.bath.ac uk. Softver za modeliranje proteinske strukture se može preuzeti sa sajtova http://salilab.org/modeller/modeller.html (Modeller) i http://spdbv.vital-it.ch (Swiss PdbVievver).

Izmena površine

[0039]Izmena površine („resurfacing") je slična CDR graftovanju i deli sa njim prve dve tačke za donošenje odluka. Nasuprot CDR graftovanju, izmena površine ostavlja neizložene ostatke nehumanog antitela. Samo površinski ostaci nehumanog antitela se zamenjuju humanim ostacima.

Superhumanizacija

[0040]Dok se CDR graftovanje oslanja na poređenje između FR nehumanih i humanih sekvenci, superhumanizacija je bazirana na poređenju CDR, tako da je FR homologija irelevantna Taj pristup obuhvata poređenje nehumane sekvence sa repertoarom funkcionalnih gena humanih germinativnih linija. Onda se biraju oni geni koji kodiraju iste ili blisko srodne kanonske strukture sa mišijim sekvencama. Kao sledeće, u okviru gena koji dele kanonske strukture sa nehumanim antitelom, biraju se oni sa najvišom homologijom u okviru CDRs kao FR donori. Konačno, nehumani CDRs se graftuju na ove FRs.

Optimizacija sadržaja humanog niza

[0041]Ovaj pristup je baziran na metrici "humanosti" antitela, koja se naziva sadržajem humanog niza (eng. Human String Content, skr. HSC). Ukratko, ovaj pristup upoređuje misiju sekvencu sa repertoarom gena humanih germinativnih linija. Razlike su vrednuju kao HSC Ciljna sekvenca se onda humanizuje maksimizacijom njegovog HSC umesto korišćenja merenja globalnog identiteta da bi se generisale višestruko različite humanizovane varijante.

Okvirne biblioteke ( skraćeno: FR biblioteke)

[0042]U pristupu sa FR bibliotekama, kolekcija varijanti ostataka se uvodi na specifične pozicije u FR, što je praćeno ispiranjem (engl. „panning") biblioteke da bi se izabrao FR koji najbolje nosi graftovani CDR. Shodno tome, ovaj pristup nalikuje CDR graftovanju, ali umesto stvaranja nekoliko povratnih mutacija u FR se konstruiše kombinatorna biblioteka koja obično ima više od 100 mutacionih varijanti.

Vođena selekcija

[0043]Ovaj pristup obuhvata kombinovanje VHili VL domena datog nehumanog antitela specifičnog za posebni antigen sa humanom VH i VLbibliotekom. Posle toga se biraju specifični humani V domeni protiv antigena od interesa. Na primer, nehumano antitelo može biti humanizovano prvo kombinovanjem nehumanog VHsa bibliotekom humanih lakih lanaca. Onda se biblioteka selekcioniše u odnosu na ciljni antigen ispoljavanjem na fagima, pa se izabrani VL klonira u biblioteku humanih VH lanaca i selekcioniše se u odnosu na ciljni antigen. Takođe je moguće da se počne sa kombinovanjem nehumanog VLsa bibliotekom humanih teških lanaca Biblioteka se onda selekcioniše prema ciljnom antigenu ispoljavanjem na fagima, a izabrani VHse klonira u biblioteku humanih VL lanaca i zatim se selekcioniše prema ciljnom antigenu. Kao rezultat ovoga se može izolovati potpuno humano antitelo sa sličnim afinitetom kao nehumano antitelo. Da bi se izbegla pojava derivacije epitopa, moguće je primeniti takozvanu inhibitornu ELISU, koja omogućava selekciju klonova koji prepoznaju isti epitop kao roditeljsko antitelo. Alternativno tome, može se primeniti zadržavanje CDR da bi se izbegla derivacija epitopa. U CDR zadržavanju, jedan ili više nehumanih CDRs se zadržava, a prvenstveno teški lanac CDR3, pošto je ovaj CDR centar mesta vezivanja antigena.

Mešanje okvira ( skraćeno: FR mešanje)

[0044]U pristupu sa FR mešanjem, celi FRs se kombinuju sa nehumanim CDRs. Korišćenjem FR mešanja, Dali Acqua i saradnici su humanizovali mišije antitelo. Svih šest CDRs mišijeg antitela su bili klonirani u biblioteku koja je sadržala sve FRs gene humanih germinativnih linija (Dali' Acqua et al., 2005). Biblioteke su bilo izložene skriningu u pogledu vezivanja u procesu selekcije koji se sastojao od dva koraka, prvo humanizaciji VL, koja je bila praćena sa VH- U jednoj kasnijoj studiji bio je uspešno primenjen proces FR mešanja koji se sastojao od jednog koraka (Damschroder et al., 2007). Oligonukleotidne sekvence koje kodiraju sve poznate okvire lakih lanaca (k) humanih germinativnih linija su opisane u Dall'Acqua et al., 2005, kao Dodatak A Oligonukleotidne sekvence koje kodiraju sve poznate okvire teških lanaca humanih germinativnih linija su opisane u Dall'Acqua et al., 2005, kao Dodatak B.

„ Humaneering"

[0045]„Humaneering" omogućava izolaciju antitela koja su 91-96% homologa sa genima antitela humanih germinativnih linija. Metod je baziran na eksperimentalnoj identifikaciji esencijalnih minimalnih determinanti specifičnosti (MSDs) i na sekvencijalnoj zameni nehumanih fragmenata u bibliotekama humanih FRs, kao i određivanju vezivanja. Ona počinje sa regionima CDR3 nehumanih VHi VLlanaca i onda se progresivno zamenjuju drugi regioni nehumanog antitela u humane FRs, uključujući CDR1 i CDR2 i od VHi odVL.

[0046]Gore opisane metode za humanizaciju antitela su poželjne kada se generišu humanizovana antitela koja se specifično vezuju za ovde opisane konformacione epitope. Ipak, predmetni pronalazak nije ograničen na gore navedene metode za humanizaciju antitela

[0047]Neki od gore navedenih metoda humanizacije se mogu izvršiti bez informacija o FR sekvencama u donorskom antitelu, a to su "metod fiksnih FR" ( varijanta CDR-graftovanja), superhumanizacija, mešanje okvira, i „Humaneering". Varijacije "metoda fiksnih FR" su uspešno izveli Qin et al., 2007 i Chang et al., 2007. Naročito su Qin et al. konstruisali fragment antitela koji sadrži varijabilni region humanog teškog lanca u kome su tri CDR regiona bila zamenjena sa antigenim peptidima, koji su bili dobijeni od CDR sekvenci mišijeg antitela. Chang et al. su nastavili ove eksperimente i konstruisali su scFv fragment, u kome su svi CDRs iz VHdela i CDR3 iz VLdela bili zamenjeni sa antigenim peptidima, koji su bili dobijeni od CDR sekvenci mišijeg antitela

[0048]Kada se ovde koriste, "humana antitela" obuhvataju antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione dobijene od imunoglobulinskih sekvenci humanih germinativnih linija. Humana antitela prema pronalasku mogu sadržati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani imunoglobulinskim sekvencama humanih germinativnih linija (npr. mutacije uvedene slučajnom ili mesno specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Humana antitela prema pronalasku obuhvataju antitela izolovana iz humanih imunoglobulinskih biblioteka ili od životinja koje su transgenske za jedan ili više humanih imunoglobulina i koje ne izražavaju endogene imunoglobuline, kao što je opisano, na primer, u US patentu br. 5,939,598 koji su dobili Kucherlapati & Jakobovits.

[0049]Izraz "monoklonsko antitelo", kada se ovde koristi, se odnosi na dobijanje molekula antitela sa jednom molekulskom kompozicijom. Monoklonsko antitelo ispoljava jednu specifičnost vezivanja i afinitet za posebni epitop. U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela se proizvode pomoću hibridoma koji obuhvataju B ćeliju dobijenu od nehumane životinje, npr. miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.

[0050]Izraz "rekombinantno antitelo", kada se ovde koristi, obuhvata sva antitela koja se dobijaju, izražavaju, stvaraju ili izoluju rekombinantnim putem, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgenska ili transhromozomska u pogledu imunoglobulinskih gena ili hibridom dobijen od nje, (b) antitela izolovana od ćelije domaćina koja je transformisana tako da izražava antitelo, npr. od transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatome biblioteke antitela, i (d) antitela dobijena, izražena, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim putem koji uključuje splajsovanje sekvenci imunoglobulinskih gena na druge DNK sekvence.

[0051]Izraz "transfektom", kada se ovde koristi, obuhvata rekombinantne eukariotske ćelije domaćine koji izražavaju antitelo kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, biljne ćelije, ili ćelije gljiva, uključujući ćelije kvasca.

[0052]Kada se ovde koristi, "heterologo antitelo" je definisano u odnosu na transgenski organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj izraz se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili koje kodira sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj koja se nalazi u organizmu koji ne predstavlja transgenski organizam, i koja je generalno dobijena od vrste koja je drugačija od transgenskog organizma.

[0053]Kada se ovde koristi, "heterohibridno antitelo" se odnosi na antitelo koje ima lake i teške lance poreklom od različitih organizama. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan sa mišijim lakim lancem je heterohibridno antitelo.

[0054]Shodno tome, "antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti" koja su podesna za primenu u predmetnom pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničena na poliklonska, monoklonska, monovalentna, bispecifična, heterokonjugatna, multispecifična, rekombinantna, heterologa, heterohibridna, himerična, humanizovana (a naročito CDR-graftovana), deimunizovana, ili humana antitela, Fab fragmente, Fab' fragmente, F(ab')2 fragmente, fragmente proizvedene pomoću biblioteke za izražavanje Fab, Fd, Fv, disulfidno-vezane Fvs (dsFv), jednolančana antitela (npr scFv), dijatela ili tetratela (Holliger P et al

(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 90(14). 6444-6448) nanotela (takođe poznata kao antitela sa samo jednim domenom), anti-idiotipska (anti-ld) antitela (uključujući, npr. anti-ld antitela od antitela prema pronalasku), i fragmente koji se vezuju za epitop bilo kog od gore navedenih.

[0055]Ovde opisana antitela su prvenstveno izolovana. "Izolovano antitelo", kada se ovde koristi, treba da se odnosi na antitelo koje u suštini ne sadrži druga antitela koja imaju drugačije antigenske specifičnosti (npr izolovano antitelo koje se specifično vezuje za C5a u suštini ne sadrži antitela koja se specifično vezuju za drugačije antigene od C5a). Međutim, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog C5a može imati unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, npr od drugih vrsta (npr. C5a vrste homologa, kao što je pacovska C5a). Pored toga, izolovano antitelo u suštini ne srne sadržati druge ćelijske materijale i/ili hemikalije. U jednom primeru izvođenja pronalaska, kombinacija "izolovanih" monoklonskih antitela se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanu kompoziciju.

[0056]Izraz "prirodni", kada se ovde koristi, kada se pnmenjuje na neki objekat se odnosi na činjenicu da se taj objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse), koja može biti izolovana iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji je prirodna

[0057]Kada se ovde koristi, izraz "antitelu sličan protein" se odnosi na protein koji je dobijen genetskim inženjeringom (npr. mutagenezom petlji) da bi se specifično vezivao za ciljni molekul. Obično takav antitelu sličan protein sadrži najmanje jednu varijabilnu peptidnu petlju vezanu na oba kraja proteinskog skeleta. Ovo dvostruko strukturno ograničenje znatno povećava afinitet vezivanja antitelu sličnog proteina sa nivoima koji su uporedivi sa onima za antitelo. Dužina varijabilne peptidne petlje se obično sastoji od 10 do 20 aminokiselina Skeletni protein može biti bilo koji protein koji ima dobra svojstva rastvorljivosti. Prvenstveno je skeletni protein mali globularni protein. Antitelima slični proteini obuhvataju afitela, antikaline, i određene ankirin ponavljajuće proteine (za pregled vidi: Binz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10):1257-1268). Antitelima slični proteini se mogu dobiti iz velikih biblioteka mutanata, npr. mogu se isprati iz velikih biblioteka za ispoljavanje na fagima i mogu se izolovati po analogiji sa regularnim antitelima. Takođe, antitelu slični vezujući proteini se mogu dobiti kombinatornom mutagenezom površinski izloženih ostataka u globularnim proteinima. Antitelima slični proteini se ponekad nazivaju "peptidnim aptamerima".

[0058]"Konzervativne supstitucije" mogu biti napravljene, na primer, na osnovu sličnosti po polarnosti, naelektrisanju, veličini, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i/ili amfipatičnoj prirodi sadržanih aminokiselinskih ostataka. Aminokiseline se mogu grupisati u sledećih šest standardnih aminokiselinskih grupa: (1) hidrofobne: Met, Ala, Val, Leu, Me; (2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) kisele: Asp, Glu; (4) bazne: His, Lys, Arg;

(5) ostatke koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe

Kada se ovde koriste, "konzervativne supstitucije" su definisane kao zamene aminokiseline sa drugom aminokiselinom iz iste grupe od šest standardnih grupa aminokiselina koje su gore prikazane. Na primer, zamenom Asp sa Glu se zadržava jedno negativno naelektrisanje u tako modifikovanom polipeptida Pored toga, glicin i prolin mogu biti međusobno supstituisani zbog njihove sposobnosti da raskidaju a-zavojnice. Neke poželjne konzervativne supstitucije u okviru gore navedenih šest grupa su zamene u okviru sledećih podgrupa. (i) Ala, Val, Leu i lle; (ii) Ser i Thr; (ii) Asn i Gln; (iv) Lys i Arg; i (v) Tyr i Phe. Kada je dat genetski kod, i rekombinantne i sintetičke DNK tehnike, naučnik koji je stručnjak iz odgovarajuće oblasti može lako da konstruiše DNK koje kodiraju konzervativne varijante aminokiselina.

[0059]Kada se ovde koriste, "nekonzervativne supstitucije" ili "nekonzervativne aminokiselinske zamene" su definisane kao zamene jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom navedenom u drugačijoj grupi od šest standardnih grupa aminokiselina (1) do (6) koje su gore navedene.

[0060]"Biološka aktivnost" kada se ovde koristi, se odnosi na bilo koju aktivnost koju može ispoljiti polipeptid, uključujući bez ograničenja: enzimsku aktivnost; vezujuću aktivnost za drugo jedinjenje (npr. vezivanje za drugi polipeptid, a naročito vezivanje za receptor, ili vezivanje za nukleinsku kiselinu); inhibitornu aktivnost (npr. enzimsku inhibitornu aktivnost); aktivirajuću aktivnost (npr. enzimsku aktivirajuću aktivnost); ili toksične efekte. Što se tiče varijanti i derivata polipeptida, nije neophodno da varijanta ili derivat ispoljava takvu aktivnost u istoj meri kao roditeljski polipeptid. Varijanta se smatra varijantom u kontekstu predmetne prijave, ako ona ispoljava odgovarajuću aktivnost do stepena od najmanje 10% aktivnosti roditeljskog polipeptida. Isto tako, derivat se smatra derivatom u kontekstu predmetne prijave, ako ispoljava relevantnu biološku aktivnost stepena od najmanje 10% aktivnosti roditeljskog polipeptida. Odgovarajuća "biološka aktivnost" u kontekstu prema predmetnom pronalasku je aktivnost vezivanja za konformacioni epitop humanog C5a obrazovanog aminokiselinskim sekvencama sa SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3 Prvenstveno je odgovarajuća "biološka aktivnost" u kontekstu prema predmetnom pronalasku aktivnost vezivanja za konformacioni epitop humanog C5a obrazovanog aminokiselinskim sekvencama DETCEOR (SEQ ID NO: 4) i KDM. Testovi za određivanje aktivnosti vezivanja su poznate prosečnom stručnjaku iz odgovarajuće oblasti i obuhvataju ELISE, kao što je ona koja je opisana u delu sa primerima.

[0061]Kada se ovde koristi, "pacijent" označava bilo kog sisara ili pticu koji mogu imati koristi od lečenja sa ovde opisanom ciljnom vezujućom grupom. Prvenstveno je "pacijent" izabran iz grupe koja se sastoji od laboratorijskih životinja (npr. miš ili pacov), domaćih životinja (uključujući npr. zamorčiće, svinje, zečeve, piliće, ćurke, svinje, ovce, koze, kamile, krave, konje, magarce, mačke ili pse), ili primate uključujući šimpanze i ljudska bića Posebno je poželjno daje "pacijent" ljudsko biće.

[0062]Prema the American College of Chest Phvsicians and the Societv of Critical Care Medicine (Bone R.C. et al. (1992). "Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine". Chest 101 (6): 1644-55), postoje različiti nivoi sepse:Sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS):definisan je prisustvom dva ili više od sledećih nalaza:

- telesna temperatura < 36 °C (97 °F) ili > 38 °C (100 °F) (hipotermija ili groznica).

- srčana frekvencija > 100 otkucaja u minuti (tahikardija).

- frekvencija disanja > 20 udaha po minuti ili, gasovi u krvi, PaC02manji od 32 mm Hg (4.3 kPa)

(tahipneja ili hipokapnija zbog hiperventilacije).

- broj belih krvnih zrnaca < 4,000 ćelija/mm3 ili > 12,000 ćelije/mm3 (< 4 * 109ili > 12 * 10<9>ćelija/L), ili viši od 10% formiranih traka (nezrele bele krvne ćelije) (leukopenija, leukocitoza, ili bandemija)

[0063] Sepsa:Definisana kao SIRS je reakcija na potvrđeni infektivni proces. Infekcija može biti suspektna ili dokazana (kulturom, bojenjem, ili reakcijom lanca polimeraze (PCR)), ili klinički sindrom koji je patognomonski za infekciju. Specifični dokaz za infekciju obuhvata VVBCs u normalno sterilnom fluidu (kao što je urin ili cerebrospinalni fluid (CSF), dokaz o perfonranom viskusu (slobodni vazduh na rentgenskom snimku abdomena ili CT skenu, znaci akutnog peritonitisa), abnormalni rentgenski snimak grudnog koša (CXR) konzistentan sa pneumonijom (sa fokalnom opacifikacijom), ili petechiae, purpura, ili purpura fulminans.

[0064] Ozbiljna sepsa:Definisana je kao sepsa sa disfunkcijom organa, hipoperfuzijom, ili hipotenzijom.

[0065] Septični šok:Definisan kao sepsa sa refraktornim arterijskim hipotenzionim ili hipoperfuzionim abnormalnostima uprkos adekvatnoj resuscitaciji fluida Znaci sistemske hipoperfuzije mogu biti bilo finalna disfunkcija organa ili serumski laktat veći od 4 mmol/dL Drugi znaci obuhvataju oliguriju i izmenjeni mentalni status. Definisano je da pacijenti imaju septični šok ako imaju sepsu plus hipotenziju posle agresivne resiscitacije fluida (obično više od 6 litara ili 40 ml/kg kristaloida).

[0066]Pod "tumorom" se podrazumeva abnormalna grupa ćelija ili tkiva koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste posle prestanka dejstva stimulansa koji su inicirali novi rast. Tumori ispoljavaju delimični ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i obično obrazuju distinktivnu masu tkiva koja može biti benigna ili maligna.

[0067]Pod "metastazom" se podrazumeva širenje ćelija kancera sa njegovog originalnog mesta na drugi deo tela. Formiranje metastaza je veoma kompleksan proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija iz primarnog tumora, invazije ekstracelularne matrice, penetracije endotelnih osnovnih membrana da bi ušle u telesne šupljine i sudove, i onda, pošto su transportovane krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze Metastaza tumora se često pojavljuje i posle odstranjivanja primarnog tumora, jer ćelije ili komponente tumora mogu ostati i razviti metastatički potencijal. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" prema pronalasku se odnosi na "udaljenu metastazu", što se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova.

[0068]Kada se ovde koristi, "lečiti", "koji leči" ili "lečenje" bolesti ili poremećaja označava ostvarivanje jednog ili više od sledećih: (a) smanjenje ozbiljnosti i/ili trajanja poremećaja; (b) ograničavanje ili sprečavanje razvoja simptoma karakterističnih za poremećaj, odnosno poremećaje koji se leče; (c) inhibiciju pogoršanja simptoma karakterističnih za poremećaj, odnosno poremećaje koji se leče; (d) ograničavanje ili sprečavanje ponovne pojave poremećaja kod pacijenata koji su ranije imali poremećaj, odnosno poremećaje; i (e) ograničavanje ili sprečavanje ponovne pojave simptoma kod pacijenata koji su prethodno imali simptome poremećaja.

[0069]Kada se ovde koristi, "sprečavanje", "koji sprečava", "prevencija", ili "profilaksa" bolesti ili poremećaja znači da se sprečava da se poremećaj pojavi kod pacijenta.

[0070]Kada se ovde koristi, "administracija" obuhvatain vivoadministraciju, kao i administraciju direktno u tkivoex vivo,kao što su venski graftovi.

[0071]"Efektivna količina" je količina terapeutskog agensa koja je dovoljna za ostvarivanje željene svrhe. Efektivna količina datog terapeutskog agensa će varirati u zavisnosti od faktora kao što su priroda agensa, način administracije, veličina i vrsta životinje koja treba da primi terapeutski agens, i svrhe administracije. Efektivnu količinu za svaki individualni slučaj empirijski može odrediti stručnjak iz odgovarajuće oblasti prema utvrđenim metodama iz odgovarajuće oblasti.

[0072]"Farmaceutski prihvatljiv" znači odobren od strane regulatorne agencije federalne ili državne vlade ili uvršćen u US Farmakopeju ili drugu generalno priznatu farmakopeju za primenu kod životinja, a naročito kod ljudi.

[0073]Izraz "nosač", kada se ovde koristi, se odnosi na razređivač, adjuvans, ekscipijens ili inertnu materiju sa kojom se daje terapeutski agens. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, sa slanim rastvorima u vodi i uljima, uključujući on naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Slani rastvor je poželjni nosač kada se farmaceutska kompozicija daje intravenski Slani rastvori i vodeni dekstrozni i glicerolski rastvori se takođe mogu primeniti kao tečni nosači, a naročito za injektabilne rastvore. Podesni farmaceutski ekscipijensi obuhvataju škrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično Kompozicija, ako je poželjno, takođe može sadržati male količine agenasa za ovlaživanje ili emulgovanje, ili pH puferske agense. Ove kompozicije mogu imati oblik rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i sličnog. Kompozicija može biti formulisana kao supozitorija, sa tradicionalnim vezivima i nosačima, kao što su trigliceridi. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti formulisana u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju one koje su obrazovane sa slobodnim amino grupama, kao što su one koje su dobijene od hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one koje su obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama, kao što su one dobijene od natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, feri hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd. Primeri podesnih farmaceutskih nosača su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" autora E. W. Martina. Takve kompozicije će sadržati terapeutski efektivnu količinu jedinjenja, a prvenstveno u prečišćenom obliku, zajedno sa podesnom količinom nosača tako da se realizuje oblik koji je podesan za administraciju pacijentu. Formulacija bi trebala da odgovara načinu administracije.

[0074]Generalno poznate i primenjivane metode u oblasti molekularne biologije, ćelijske biologije, hernije proteina i tehnike antitela su potpuno opisane u kontinualno ažuriranim publikacijama "Molecular Cloning: A Laboratorv Manual", (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); Current Protocols in Molecular Biologv (F. M Ausubel et al Eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan et al. eds , Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J S Bonifacino etal., Wiley & Sons) i Current Protocols in lmmunology (J E Colligan et al., Eds., Wiley & Sons) Poznate tehnike koje se odnose na kulture i medijume za ćelije su opisane u "Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin., Biotechnol. 8: 148, 1997); "Serum free Media" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73, 1991); i "Suspension Culture of Mammalian Cells" (Birch et al. Bioprocess Technol. 19: 251, 1990).

Primeri izvođenja pronalaska

[0075]Predmetni pronalazak će sada biti detaljnije opisan. U sledećim pasusima su detaljnije definisani različiti aspekti prema pronalasku Svaki aspekt koji je tako definisan se može kombinovati sa bilo kojim drugim aspektom ili aspektima, osim ako nije jasno ukazano na suprotno. Naročito, bilo koja karakteristika na koju je ukazano kao na poželjnu ili prvenstvenu se može kombinovati sa bilo kojom drugom karakteristikom ili karakteristikama na koje je ukazano kao na poželjne ili prvenstvene.

[0076]U prvom aspektu predmetni pronalazak je usmeren na vezujuću grupu koja se vezuje za konformacioni epitop obrazovan aminokiselinskim sekvencama NDETCEORA (SEQ ID NO: 2) i SHKDMOL (SEQ ID NO: 3) od C5a (sekvenceHomo sapiensiPan troglodytes) ;pri čemu se vezujuća grupa vezuje za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2 i za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 3; pri čemu pomenuta vezujuća grupa ima konstantu vezivanja za C5a sa Kdvrednosti od 10 nM ili manju i ispoljava najmanje 80% blokirajuće aktivnosti za biološki efekat indukovan sa C5a, i pri čemu je pomenuta vezujuća grupa izabrana iz grupe koja se sastoji od: (a) antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata; i (b) antitelima sličnih proteina, pri čemu su pomenuti antitelima slični proteini izabrani iz grupe koja se sastoji od afitela, antikalina, i određenih ankirin ponavljajućih proteina.

[0077]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa se vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sa aminokiselinskom sekvencom DETCEOR (SEQ ID NO. 4)

[0078]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa se vezuje za najmanje jednu aminokiselinu sa aminokiselinskom sekvencom HKDMQ (SEQ ID NO. 5), a prvenstveno KDM.

[0079]U posebno poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, C5a je humani C5a. Shodno tome, poželjno je da se vezujuća grupa vezuje za konformacioni epitop obrazovan aminokiselinama NDETCEORA (SEQ ID NO: 2) i SHKDMOL (SEQ ID NO: 3) humanog C5a. Drugim recima, vezujuća grupa prema ovom poželjnom primeru izvođenja prvog aspekta se vezuje u isto vreme za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2 i za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 2 odgovara aminokiselinama 30-38 humanog C5a. SEQ ID NO: 3 odgovara aminokiselinama 66-72 humanog C5a. Aminokiselinska sekvenca humanog C5a je prikazana u SEQ ID NO: 1. U još poželjnijim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa se vezuje za najmanje jednu od aminokiselina DETCEOR (SEQ ID NO: 4). SEQ ID NO: 4 odgovara aminokiselinama 31-37 humanog C5a. U još poželjnijim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa se vezuje za najmanje jednu od aminokiselina HKDMO (SEQ ID NO: 5), još poželjnije za najmanje jednu od aminokiselina KDM. SEQ ID NO: 5 odgovara aminokiselinama 67-71 humanog C5a; sekvenca KDM odgovara aminokiselinama 68-70 humanog C5a. U posebno poželjnim primerima izvođenja, vezujuća grupa se vezuje u isto vreme za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence DETCEOR (SEQ ID NO: 4) i za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence KDM.

[0080]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, dve sekvence koje obrazuju konformacioni epitop (npr. parovi sekvenci sa SEQ ID NO: 2 i 3) su razdvojeni sa 1-50 susednih aminokiselina koje ne učestvuju u vezivanju za vezujuću grupu prema pronalasku. U nastavku se takve aminokiseline koje ne učestvuju u vezivanju za vezujuću grupu prema pronalasku nazivaju "nevezujuće aminokiseline". Dve sekvence koje obrazuju konformacioni epitop su prvenstveno razdvojene sa 6-45 susednih nevezujućih aminokiselina, još poželjnije sa 12-40 susednih nevezujućih aminokiselina, još poželjnije sa 18-35 susednih nevezujućih aminokiselina, još poželjnije sa 24-30 susednih nevezujućih aminokiselina, još poželjnije sa 25-29 susednih nevezujućih aminokiselina, čak još poželjnije sa 26-28 susednih nevezujućih aminokiselina, i najpoželjnije sa 27 susednih nevezujućih aminokiselina.

[0081]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa ima konstantu vezivanja za C5a, a prvenstveno za humani C5a, sa Kd vrednosti od 9 nM ili manju, a prvenstveno od 8 nM ili manju, još poželjnije od 7 nM ili manju, još poželjnije od 6 nM ili manju, još poželjnije od 5 nM ili manju, još poželjnije od 4 nM ili manju, još poželjnije od 3 nM ili manju, još poželjnije od 2 nM ili manju, i čak još poželjnije od 1 nM ili manju.

[0082]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, jedna vezujuća grupa ispoljava najmanje 85% blokirajuće aktivnosti, a prvenstveno najmanje 90% blokirajuće aktivnosti, još poželjnije najmanje 95% blokirajuće aktivnosti za biološke efekte indukovane sa jednim molekulom C5a, a prvenstveno humanim C5a. Ove poželjne blokirajuće aktivnosti se odnose na one primere izvođenja kod kojih vezujuća grupa sadrži samo jedan paratop koji se vezuje za C5a, a prvenstveno humani C5a. U primerima izvođenja u kojima vezujuća grupa sadrži dva ili više paratopa specifičnih za C5a, pomenute blokirajuće aktivnosti od najmanje 80%, još poželjnije najmanje 85%, itd se ostvaruju kada se jedan molekul koji se vezuje za grupu dovede u kontakt sa brojem C5a molekula koji je jednak broju paratopa specifičnih za C5a koji su prisutni u vezujućoj grupi. Drugim rečima, kada su paratopi vezujuće grupe prvog aspekta i C5a prisutni u ekvimolskim koncentracijama, onda vezujuća grupa prema prvom aspektu ispoljava najmanje 80% blokirajuće aktivnosti, još poželjnije najmanje 85% blokirajuće aktivnosti, još poželjnije najmanje 90% blokirajuće aktivnosti, i još poželjnije najmanje 95% blokirajuće aktivnosti za biološke efekte indukovane sa C5a. Poželjni biološki efekat koji treba da bude blokiran je oslobađanje lizozima iz ćelija humane cele krvi indukovano sa C5a. Testovi za određivanje ovog oslobađanja lizozima indukovanog sa C5a i njegovo blokiranje su opisani u delu sa primerima.

[0083]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa ne inhibira CH50 aktivnost u humanoj plazmi. Testovi za određivanje CH50 aktivnosti su poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti i opisani su dole u delu sa primerima.

[0084]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa ne ispoljava blokirajuću aktivnost za najmanje jedan biološki efekat indukovan sa C5b, a prvenstveno vezujuća grupa ne ispoljava blokirajuću aktivnost za bilo koji biološki efekat indukovan sa C5b.

[0085]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa može da redukuje produkciju IL-8 u humanoj celoj krvi indukovanu saE. coli.Testovi za merenje produkcije IL-8 u celoj krvi su poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti i biće opisani dole u delu sa primerima.

[0086]Kao što je gore navedeno, vezujuća grupa je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

(a) antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata i (b) antitelima sličnih proteina.

[0087]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, pri čemu je pomenuto antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od poliklonskih antitela, monoklonskih antitela, monovalentnih antitela, bispecifičnih antitela, heterokonjugatnih antitela, multispecifičnih antitela, deimunizovanih antitela, himeričnih antitela, humanizovanih (a naročito CDR-graftovanih) antitela, i humanih antitela

[0088]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa je antigen vezujući fragment antitela, pri čemu je pomenuti fragment izabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenata, Fab' fragmenata, F(ab')2 fragmenata, Fd fragmenata, Fv fragmenata, disulfidno vezanih Fvs (dsFv), antitela sa jednim domenom (takođe poznatih kao nanotela), i Fv (scFv) antitela sa jednim lancem.

[0089]U posebno poželjnom primeru izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži, (i) CDR3 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 6; ili (ii) CDR3 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 7; pri čemu CDR3 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije.

[0090]Prvenstveno, antitelo ili njegov fragment dalje sadrži: (i) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 8; ili (ii) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 9; pri čemu CDR3 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije.

[0091]Prvenstveno, antitelo ili fragment dalje sadrži najmanje jednu od sledećih sekvenci: (i) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 10; (ii) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 11; (iii)

CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 12; (iv) CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 13; (v) CDR1 sekvencu teškog lanca prema (SEQ ID NO: 14; (vi) CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO. 15; (vii) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 16; ili (viii) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 17; pri čemu CDR2 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR2 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR1 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR1 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1 2, ili 3 aminokiselinske adicije. Prvenstveno je ukupni broj ovih opcionih zamena u svakoj od aminokiselinskih sekvenci sa SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, i SEQ ID NO: 17, tj. ukupni broj zamena, delecija i adicija u svakoj 1 ili 2.

[0092]U nekim primerima izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa je antitelu sličan protein, npr. antitelu sličan protein, kao stoje dato u vidu primera u delu "Definicije".

[0093]Poželjni primer izvođenja prvog aspekta je usmeren na vezujuću grupu za prevenciju i/ili lečenje različitih bolesti koje uključuju akutno zapaljenje, kao što su sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), sepsa, ozbiljna sepsa, septični šok, povrede povezane sa ishemijom/reperfuzijom, kao što je ishemijska srčana bolest, akutna povreda pluća, pneumonija, akutno i hronično odbacivanje grafta kod pacijenata sa transplantacijom, reakcije graft protiv domaćina, kao i bolesti koje sadrže hronične tipove zapaljenja, kao što su bubrežne glomerularne bolesti, kao što su glomerulonefritis i druge vrste bubrežne insuficijencije, reumatoidni artritis i slične autoimune bolesti, kao što su Behterova bolest, bolesti tipa lupusa, zapaljenska bolest creva, Kronova bolest, rast tumora, ili kancer čvrstih organa.

[0094]U posebno poželjnom primeru izvođenja prvog aspekta, vezujuća grupa je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži: (i) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 8; ili (ii) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 9; pri čemu CDR3 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije. Prvenstveno je ukupni broj ovih opcionih zamena u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 8, tj. ukupni broj zamena, delecija i adicija je 1 ili 2. Prvenstveno je ukupni broj ovih opcionih zamena u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9, tj. ukupni broj zamena, delecija i adicija je 1 ili 2.

[0095]Prvenstveno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment dalje sadrži najmanje jednu od sledećih sekvenci: (i) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 10; (ii) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO 11; (iii) CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 12; (iv) CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 13; (v) CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 14; (vi) CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 15; (vii) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 16; ili (viii) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 17, pri čemu CDR2 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR2 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR1 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR1 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije. Prvenstveno je ukupni broj ovih opcionih zamena u svakoj od aminokiselinskih sekvenci sa SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, i SEQ ID NO: 17, tj. ukupni broj zamena, delecija i adicija u svakoj sekvenci 1 ili 2.

[0096]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, jedno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ispoljava najmanje 85% blokirajuće aktivnosti, a prvenstveno najmanje 90% blokirajuće aktivnosti, još poželjnije najmanje 95% blokirajuće aktivnosti za biološke efekte indukovane sa jednim molekulom C5a, a prvenstveno humanim C5a. Ove poželjne blokirajuće aktivnosti se odnose na one primere izvođenja u kojima antitelo (ili njegov antigen vezujući fragment) sadrži samo jedan paratop koji se vezuje za C5a, a prvenstveno humani C5a. U primerima izvođenja u kojima antitelo (ili njegov antigen vezujući fragment) sadrži dva ili više paratopa specifičnih za C5a se ostvaruju pomenute blokirajuće aktivnosti od najmanje 80%, a prvenstveno od najmanje 85%, itd. kada se jedan molekul sa vezujućom grupom dovede u kontakt sa brojem C5a molekula koji je jednak broju paratopa specifičnih za C5a koji su prisutni u antitelu (ili njegovom antigen vezujućem fragmentu). Na primer, tipično anti-C5a antitelo IgG-tipa sadrži dva paratopa koji mogu da se vezuju za C5a, dok tipično anti-C5a antitelo IgM-tipa sadrži deset paratopa koji mogu da se vezuju za C5a. Shodno tome, blokirajuća aktivnost antitela IgG-tipa bi trebalo da bude određena dovođenjem u kontakt pomenutog antitela sa C5a u molskom odnosu od 1:2. Blokirajuća aktivnost antitela IgM-tipa bi trebala da bude određena dovođenjem u kontakt pomenutog antitela sa C5a u molskom odnosu od 1:10. Kada se izaberu ovi molski odnosi, onda su paratopi u okviru antitela i C5a prisutni u ekvimolskim koncentracijama. Drugim rečima, kada su paratopi antitela (ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta) prema prvom aspektu i C5a prisutni u ekvimolskim koncentracijama, onda antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ispoljava najmanje 80% blokirajuće aktivnosti, a prvenstveno najmanje 85% blokirajuće aktivnosti, još poželjnije najmanje 90% blokirajuće aktivnosti, i još poželjnije najmanje 95% blokirajuće aktivnosti za biološke efekte indukovane sa C5a. Poželjan biološki efekat koji treba da bude blokiran je oslobađanje lizozima iz ćelija humane cele krvi indukovano sa C5a Testovi za određivanje ovog oslobađanja lizozima indukovanog sa C5a i njegovo blokiranje su opisani u delu sa primerima.

[0097]Poželjni primer izvođenja prvog aspekta je usmeren na antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za prevenciju i ili lečenje različitih bolesti uključujući akutno zapaljenje, kao što su sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), sepsa, ozbiljna sepsa, septični šok, povrede povezane sa ishemijom/reperfuzijom, kao što je ishemijska srčana bolest, akutna povreda pluća, pneumonija, akutno i hronično odbacivanje grafta kod pacijenata sa transplantacijom, reakcije graft protiv domaćina, kao i bolesti koje sadrže hronične tipove zapaljenja, kao što su bubrežne glomerularne bolesti, kao što su glomerulonefritis i druge vrste bubrežne insuficijencije, reumatoidni artritis i slične autoimune bolesti, kao što su Behterova bolest, bolesti tipa lupusa, zapaljenska bolest creva, Kronova bolest, rast tumora, ili kancer čvrstih organa

[0098]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži jedan od skupova teških lanaca CDR3 sekvence, teških lanaca CDR2 sekvence, i teških lanaca CDR1 sekvence, kao što je navedeno dole u Tabeli 1 pri čemu svaka CDR3 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR2 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; i pri čemu svaka CDR1 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije:

[0099]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži jedan od sledećih skupova CDR3 sekvenci lakog lanca, CDR2 sekvenci lakog lanca, i CDR1 sekvenci lakog lanca koje su navedene u Tabeli 2, pri čemu svaka CDR3 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR2 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; i pri čemu svaka CDR1 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije:

[0100]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži jedan od skupova CDR teškog lanca A-H navedenih gore u Tabeli 1 i jedan od skupova CDR sekvenci lakog lanca l-IV navedenih gore u Tabeli 2, tj jednu od sledećih kombinacija skupova: A-l, A-ll, A-lll, A-IV, B-l, B-ll, B-lll, B-IV, C-l, C-ll, C-lll, C-IV, D-l, D-ll, D-lll, D-IV, E-l, E-ll, E-lll, E-IV, F-l, F-ll, F-III, F-IV, G-l, G-ll, G-lll, G-IV, H-l, H-ll, H-lll, ili H-IV, pri čemu svaka CDR3 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR2 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR1 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR3 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR2 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; i pri čemu svaka CDR1 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, a prvenstveno konzervativne aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije.

[0101]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži VH domen koji sadrži, u suštini se sastoji ili se sastoji od (i) VH domena INab308 ili (ii) VH domena INab708

[0102]FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4 sekvence koje definišu VH domene INab308 i INab708 su prikazane dole u Tabeli 4.

[0103]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži VL domen koji sadrži, u suštini se sastoji ili se sastoji od (i) VL domena INab308 ili (ii) VL domena INab708.

[0104]FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4 sekvence koje definišu VL domene INab308 i INab708 su prikazane dole u Tabeli 4

[0105]U sledećim poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži VH domen i VL domen, pri čemu (i) pomenuti VH domen sadrži, u suštini se sastoji ili se sastoji od VH domena INab308 i pomenuti VL domen sadrži, u suštini se sastoji ili se sastoji od VL domena INab308; ili (i) pomenuti VH domen sadrži, u suštini se sastoji ili se sastoji od VH domena INab708 i pomenuti VL domen sadrži, u suštini se sastoji ili se sastoji od VL domena INab708.

[0106]U poželjnim primerima izvođenja prvog aspekta, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži jedan ili više CDRs, skup CDRs ili kombinaciju skupova CDRs kao što je ovde opisano sadrži pomenute CDRs u okviru humanog antitela.

[0107]Ovde se pozivanje na antitelo koje sadrži u odnosu na njegov teški lanac poseban lanac ili poseban region ili sekvencu prvenstveno odnosi na situaciju u kojoj svi teški lanci pomenutog antitela sadrže pomenuti poseban lanac, region ili sekvencu. Odgovarajuće tome, ovo važi i za laki lanac antitela

[0108]Ovde dato otkrivanje u pogledu specifične nukleinske kiseline i aminokiselinskih sekvenci, npr. onih koje su prikazane u listi sekvenci, treba protumačiti tako da se odnosi na modifikacije pomenutih specifičnih sekvenci koje rezultuju sekvencama koje su funkcionalno ekvivalentne pomenutim specifičnim sekvencama, npr aminokiselinske sekvence koje ispoljavaju svojstva koja su identična ili slična onima koja imaju specifične aminokiselinske sekvence i sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinske sekvence koje ispoljavaju svojstva koja su identična ili slična onima koja imaju aminokiselinske sekvence koje su kodirane specifičnim sekvencama nukleinskih kiselina. Jedno važno svojstvo je da se zadrži vezivanje antitela za njegov cilj ili da se održe efektorske funkcije antitela. Prvenstveno, sekvenca koja je modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zameni specifičnu sekvencu u antitelu zadržava vezivanje pomenutog antitela za C5a, a naročito ovde identifikovani konformacioni epitop od C5a, i prvenstveno zadržava ovde opisane funkcije pomenutog antitela, npr. blokiranje oslobađanja lizozima iz ćelija humane cele krvi indukovanog sa C5a i/ili smanjenje produkcije IL-8 u humanoj celoj krvi indukovane saE. coli.

[0109]Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da se naročito sekvence CDR, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu modifikovati bez gubljenja sposobnosti vezivanja C5a. Na primer, CDR regioni će biti ili identični ili visoko homologi sa ovde specifikovanim regionima. Pod "visoko homologim" se smatra da može biti napravljeno od 1 do 5, a prvenstveno od 1 do 4, kao što je od 1 do 3 ili 1 ili 2 substitucija, delecija, ili adicija u CDRs. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni se mogu modifikovati tako da ispolje suštinsku homologiju sa ovde specifično opisanim regionima.

[0110]Dalje, prema predmetnom pronalasku može biti poželjno da se modifikuju ovde opisane aminokiselinske sekvence, a naročito da se konstantni regioni humanog teškog lanca prilagode sekvencama željenog alotipa, npr alotipa koji se nalazi u Kavkaskoj populaciji.

[0111]Predmetni pronalazak dalje sadrži antitela u kojima su napravljene izmene u Fc regionu da bi se promenila funkcionalna ili farmakokinetička svojstva antitela. Takve izmene mogu rezultovati smanjenjem ili povećanjem C1q vezivanja i CDC ili FcyR vezivanja i ADCC Supstitucije mogu biti napravljene, na primer, u jednom ili više aminokiselinskih ostataka konstantnog regiona teškog lanca, čime se izaziva promena efektorske funkcije, dok se zadržava sposobnost vezivanja za antigen u poređenju sa modifikovanim antitelom, upor. US pat. br. 5,624,821 i US pat. br. 5,648,260.

[0112]In vivopoluživot antitela se može poboljšati modifikacijom epitopa spasavajućeg receptora Ig konstantnog domena ili Ig-sličnog konstantnog domena tako da molekul ne sadrži neizmenjeni CH2 domen ili neizmenjeni Ig Fc region, upor. US pat. br. 6,121,022 i US pat br 6,194,551.In vivopoluživot može dalje biti povećan pravljenjem mutacija u Fc regionu, npr. supstitucijom treonina sa leucinom na poziciji 252, supstitucijom treonina sa serinom na poziciji 254, ili supstitucijom treonina sa fenilalaninom na poziciji 256, upor. US pat. br. 6,277,375.

[0113]Dalje, šema glikozilacije antitela može biti modifikovana da bi se promenila efektorska funkcija antitela. Na primer, antitela se mogu izraziti u transfektomu koji ne dodaje fukoznu jedinicu koja je normalno vezana za Asn na poziciji 297 Fc regiona da bi se pojačao afinitet Fc regiona za Fc-receptore, što dalje rezultuje povećanjem ADCC antitela u prisustvu NK ćelija, upor. Shield et al (2002) JBC, 277: 26733. Dalje, može biti izvršena modifikacija galaktozilacije da bi se modifikovao CDC.

[0114]Alternativno tome, u sledećem primeru izvođenja, mogu se uvesti slučajne mutacije duž cele sekvence ili njenog dela koja kodira anti-C5a antitelo, kao što su zasićenom mutagenezom, a rezultujuća modifikovana anti-C5a antitela se mogu podvrgnuti skriningu u pogledu vezujuće aktivnosti.

[0115]U drugom aspektu je predmetni pronalazak usmeren na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži vezujuću grupu prema prvom aspektu, i koja dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razređivača, ekscipijenata, punilaca, veziva, lubrikanata, glidanata, sredstava za raspadanje, adsorbenata, i/ili konzervansa

[0116]U trećem aspektu predmetni pronalazak je usmeren na primenu vezujuće grupe prema prvom aspektu za pripremanje farmaceutske kompozicije za prevenciju i/ili tečenje različitih bolesti uključujući akutno zapaljenje, kao što su sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), sepsa, ozbiljna sepsa, septični šok, povrede povezane sa ishemijom/reperfuzijom, kao što je ishemijska srčana bolest, akutna povreda pluća, pneumonija, akutno i hronično odbacivanje grafta kod pacijenata sa transplantacijom, reakcije graft protiv domaćina, kao i bolesti koje sadrže hronične tipove zapaljenja, kao što su bubrežne glomerularne bolesti, kao što su glomerulonefritis i druge vrste bubrežne insuficijencije, reumatoidni artritis i slične autoimune bolesti, kao što su Behterova bolest, bolesti tipa lupusa, zapaljenska bolest creva, Kronova bolest, rast tumora, ili kancer čvrstih organa.

[0117]U praksi bilo kog aspekta predmetnog pronalaska gore opisana farmaceutska kompozicija ili vezujuća grupa (npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment) se mogu davati pacijentu bilo kojim načinom primene koji se upotrebljava u odgovarajućoj oblasti, a koji obezbeđuje dovoljan nivo vezujuće grupe kod pacijenta. Ona se može davati sistemski ili lokalno. Takva administracija može biti parenteralna, transmukozna, npr. oralna, nazalna, rektalna, intravaginalna, sublingvalna, submukozna, transdermalna, ili inhalacijom Prvenstveno je administracija parenteralna, npr. pomoću intravenske ili intraperitonealne injekcije, i takođe obuhvata, ali nije ograničena na intra-arterijsku, intramuskularnu, intradermalnu i subkutanu administraciju. Ako se farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku daje lokalno, onda se ona može injektirati direktno u organ ili tkivo koji treba da budu lečeni, npr. u organ pogođen tumorom.

[0118]Farmaceutske kompozicije prilagođene za oralnu administraciju mogu biti pripremljene kao kapsule ili tablete; kao praškovi ili granule; kao rastvori, sirupi ili suspenzije (u vodenim ili nevodenim tečnostima); kao jestive pene ili kremovi; ili kao emulzije. Tablete ili tvrde želatinske kapsule mogu sadržati laktozu, škrob ili njihove derivate, magnezijum stearat, natrijum saharin, celulozu, magnezijum karbonat, stearinsku kiselinu ili njene soli. Meke želatinske kapsule mogu sadržati biljna ulja, voskove, masti, polu-čvrste, ili tečne poliole itd Rastvori i sirupi mogu sadržati vodu, poliole i šećere.

[0119]Aktivna materija namenjena za oralnu administraciju može biti obložena ili pomešana sa materijalom koji odlaže dezintegraciju i/ili apsorpciju aktivne materije u gastrointestinalnom traktu (npr. mogu se upotrebiti gliceril monostearat ili gliceril distearat). Shodno tome, može se ostvariti produženo oslobađanje aktivne materije tokom mnogo časova i, ako je potrebno, aktivna materija može biti zaštićena od degradacije u želucu Farmaceutske kompozicije za oralnu administraciju mogu biti formulisane tako da olakšavaju oslobađanje aktivne materije na specifičnoj gastrointestinalnoj lokaciji zbog specifičnog pH ili enzimskih uslova.

[0120]Farmaceutske kompozicije prilagođene za transdermalnu administraciju mogu biti pripremljene kao diskretni flasteri namenjeni da ostanu u bliskom kontaktu sa epidermom primaoca tokom produženog vremenskog perioda. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topičku administraciju mogu biti pripremljene kao melemi, kremovi, suspenzije, losioni, praškovi, rastvori, paste, gelovi, sprejovi, aerosoli ili ulja. Za topičku administraciju na kožu, usta, oči ili druga spoljašnja tkiva se prvenstveno primenjuje topički melem ili krem. Kada se formuliše kao melem, onda se aktivna materija može upotrebiti bilo sa parafinskom ili vodomešljivom bazom za meleme Alternativno tome, aktivna materija može biti formulisana u krem sa bazom ulje-u-vodi ili bazom voda-u-ulju. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topičku administraciju na oči obuhvataju kapi za oči. U ovim kompozicijama, aktivna materija može biti rastvorena ili suspendovana u podesnom nosaču, npr. u vodenom rastvaraču. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topičku administraciju u ustima obuhvataju lozenge, pastile i rastvore za ispiranje usta.

[0121]Farmaceutske kompozicije prilagođene za nazalnu administraciju mogu sadržati čvrste nosače kao što su praškovi (koji prvenstveno imaju veličinu čestica u opsegu od 20 do 500 mikrona). Praškovi se mogu davati tako da se ušmrknu, npr. brzom inhalacijom kroz nos iz kontejnera sa praškom koji se drži u blizini nosa. Alternativno tome, kompozicije prilagođene za nazalnu administraciju mogu sadržati tečne nosače, kao što su npr. sprejovi za nos ili kapi za nos. Ove kompozicije mogu sadržati vodene ili uljane rastvore aktivne materije. Kompozicije za administraciju inhalacijom se mogu davati u specijalno prilagođenim napravama uključujući, ali bez ograničavanja na aerosole pod pritiskom, nebulizere ili insuflatore, koji mogu biti konstruisani tako da izdaju unapred određene doze aktivne materije. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije prema pronalasku se daju preko nosne šupljine u pluća.

[0122]Farmaceutske kompozicije prilagođene za rektalnu administraciju mogu biti pripremljene kao supozitorije ili eneme. Farmaceutske kompozicije prilagođene za vaginalnu administraciju mogu biti pripremljene kao formulacije za pesare, tampone, kremove, gelove, paste, pene ili sprejove.

[0123]Farmaceutske kompozicije prilagođene za parenteralnu administraciju obuhvataju vodene i nevodene sterilne injektabilne rastvore ili suspenzije, koje mogu sadržati antioksidanse, pufere, bakteriostatike i rastvorene supstance koje omogućavaju da kompozicije budu u suštini izotonične sa krvi ciljnog primaoca. Druge komponente koje mogu biti prisutne u takvim kompozicijama obuhvataju vodu, alkohole, poliole, glicerin i biljna ulja, na primer. Kompozicije prilagođene za parenteralnu administraciju mogu biti prisutne kao kontejneri sa pojedinačnom dozom ili sa više doza, na primer, hermetički zatvorene ampule i bočice, i mogu biti čuvane u zamrzavanjem osušenom (liofilizovanom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, npr. sterilnog slanog rastvora za injekcije, neposredno pre upotrebe. Gotovi rastvori i suspenzije za injekcije se mogu pripremiti od sterilnih praškova, granula i tableta.

[0124]U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravensku administraciju ljudskim bićima. Obično su kompozicije za intravensku administraciju rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je to neophodno, kompozicija takođe može sadržati agens za poboljšanje rastvaranja i lokalni anestetik, kao što je lidokain, da bi se ublažio bol na mestu injekcije. Generalno se sastojci pripremaju odvojeno ili se mešaju zajedno u pojedinačni farmaceutski oblik, na primer, kao suvi liofilizovani prašak ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru, kao što je ampula ili kesica koji ukazuje na količinu aktivne materije. Kada kompozicija treba da se daje infuzijom, onda se ona može davati bocom za infuziju koja sadrži sterilnu vodu farmaceutskog kvaliteta ili slani rastvor. Kada kompozicija treba da se daje injekcijom, onda može biti pripremljena ampula sa sterilnim slanim rastvorom tako da se sastojci mogu pomešati pre administracije.

[0125]U sledećem primeru izvođenja, na primer, inhibitor hemoatrakcije se može davati u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. Na primer, inhibitor se može davati korišćenjem intravenske infuzije, implantabilne osmotske pumpe, transdermalnog flastera, lipozoma, ili drugih načina administracije. U jednom primeru izvođenja se može koristiti pumpa (vidi Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201: Buchvvald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574). U sledećem primeru izvođenja, jedinjenje se može davati u vezikuli, a naročito lipozomu (vidi Langer

(1990) Science 249:1527-1533; Treatet al. (1989) u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein i Fidler (eds ), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; US 4,704,355). U sledećem primeru izvođenja mogu se upotrebiti polimerni materijali (vidi Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer i Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen i Bali (eds ), Wiley: N.Y.; Ranger i Peppas (1953) J Macromol. Sci. Rev Macromol. Chem. 23: 61; vidi takođe Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105).

[0126]U još jednom primeru izvođenja, sistem za kontrolisano oslobađanje se može staviti u blizinu terapeutskog cilja, tj. ciljnih ćelija, tkiva ili organa, što zahteva samo deo sistemske doze (vidi npr. Goodson (1984) 115-138 u Medical Applications of Controlled Release, vol. 2). Drugi sistemi za kontrolisano oslobađanje su razmotreni u pregledu koji je pripremio Langer (1990, Science 249: 1527-1533).

[0127]U specifičnom primeru izvođenja može biti poželjno da se farmaceutske kompozicije prema pronalasku daju lokalno u oblasti gde je potrebno lečenje; ovo se može ostvariti, na primer, ali ne kao ograničenje, lokalnom infuzijom tokom hirurške intervencije, topičkom primenom, npr. zajedno sa previjanjem rane posle hirurške intervencije, injekcijom, kateterom, supozitorijom, ili implantatom, pri čemu je pomenuti implantat porozan, neporozan ili želatinozni materijal, uključujući membrane, kao što su silastične membrane, ili vlakna

[0128]Izbor poželjne efektivne doze će odrediti stručnjak iz odgovarajuće oblasti na osnovu razmatranja nekoliko faktora koji su poznati prosečnom stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. Takvi faktori obuhvataju specifičan oblik farmaceutske kompozicije, npr. polipeptid ili vektor, i njegove farmakokinetičke parametre, kao što su bioraspoloživost, metabolizam, poluživot, itd., koji se utvrđuju tokom uobičajenih procedura razvoja koje se obično primenjuju pri dobijanju zvaničnog odobrenja za farmaceutsko jedinjenje. Sledeći faktori pri razmatranju doze obuhvataju stanje ili bolest koji treba da se spreče i/ili leče ili korist koja treba da se ostvari kod normalnog pojedinca, telesnu masu pacijenta, način administracije, da li je administracija akutna ili hronična, prateće medikacije, i druge faktore za koje je dobro poznato da utiču na efikasnost davanih farmaceutskih agenasa. Shodno tome, precizna doza bi trebalo da bude određena na osnovu procene nadležnog lekara i uslova za svakog pacijenta, npr. u zavisnosti od stanja i imunog statusa individualnog pacijenta, u skladu sa standardnim kliničkim tehnikama.

[0129]U praksi bilo kog aspekta prema predmetnom pronalasku koji se odnosi na prevenciju i ili lečenje rasta tumora ili kancera čvrstih organa, subjekt kome se daje vezujuća grupa ili antitelo prema pronalasku se dodatno leci hemoterapeutskim agensom, zračenjem, ili agensom koji moduliše, npr. povećava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Fc receptora, npr. Fc-gama receptora, kao što je citokin. Tipični citokini za administraciju tokom lečenja obuhvataju faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocitnih makrofaga (GM-CSF), interferon-y (IFN-y), i faktor nekroze tumora (TNF). Tipični terapeutski agensi obuhvataju, između ostalih, antineoplastike, kao što su doksorubicin, cisplatin, taksoter, 5-fluoruracil, metotreksat, gemzitabin i ciklofosfamid.

[0130]Sledeće slike i primeri predstavljaju isključivo ilustraciju predmetnog pronalaska i ne treba ih tumačiti tako kao da ograničavaju obim pronalaska koji je u svakom slučaju određen priloženim patentnim zahtevima.

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0131]

Fig. 1 prikazuje efekat C5a mutanata na oslobađanje enzima iz krvnih ćelija

Potencijalne aminokiseline u C5a molekulima za konstituisanje epitopa antitela su bule mutirane u alanin, pa su onda ovi C5a mutanti bili testirani u pogledu svoje bioaktivnosti da indukuju oslobađanje lizozima iz ćelija humane cele krvi. C5a mesna mutacija koja je rezultovala gubitkom bioaktivnosti većim od 50% u poređenju sa humanim C5a je bila smatrana kao kritično mesto za C5a biološku funkciju. Ova mesta su 24, 29, 31, 37, 68, i 69.

Fig. 2 prikazuje sposobnost vezivanja INab308 za C5a mutante

C5a i C5a mutantma je bila obložena ploča sa 96-bunarčića. Sposobnost vezivanja INab308 za ove proteine je bila određena pomoću ELISA pristupa. Gubitak sposobnosti vezivanja veći od 50% je smatran značajnim. Podaci pokazuju da se INab308 vezuje za dva regiona, 31-37 i 68-69.

Fig. 3 prikazuje sposobnost vezivanja INab708 za C5a mutante

C5a i C5a mutantima je bila obložena ploča sa 96-bunarčića. Sposobnost vezivanja INab708 za ove proteine je bila određena pomoću ELISA pristupa. Gubitak sposobnosti vezivanja veći od 50% je smatran značajnim. Podaci pokazuju da se INab708 vezuje za dva regiona, 31-37 i 68-70.

Fig. 4: INab308 i INab708 ne utiču na CH50 aktivnost humane plazme

Hemolitička aktivnost humane plazme je bila određena klasičnim CH50 testom. Mabs za humani C5a uključujući INab708, INab308, i F20, su bila prethodno inkubirana sa humanom plazmom, a onda je posle toga bio izveden CH50 test. Od ovih antitela, F20 jako inhibira CH50 aktivnost, dok INab708 i INab308 nemaju uticaja kada se upotrebe u koncentraciji od pribl. 5 mM, koja je znatno viša od C5 koncentracije koja se pojavljuje u humanoj celoj krvi (pribl. 0.4 mM).

Fig. 5 prikazuje poređenje blokirajućih efekata INab308, INab708, i L2B23 na C5a bioaktivnost

Blokirajuća aktivnost INab308, INab708 i L2B23 je bila određena testom sa oslobađanjem lizozima indukovanim sa C5a. Molski odnos antitela prema C5a je bio podešen na 1 : 2 da bi se odredila blokirajuća aktivnost jednog antitela za biološki efekat pobuđen sa dva C5a molekula. Podaci pokazuju da INab308 i INab708 poseduju veoma visoku blokirajuću aktivnost (>90%) za C5a bioaktivnost, dok L2B23 pokazuje samo minimalni efekat.

Fig. 6 prikazuje inhibitorni efekat INab308 i INab708 na produkciju IL-8 u humanoj celoj krvi

indukovanu saE. coli

E. coli jebila inkubirana sa ćelom krvi tokom 4 sata, pa su nivoi IL-8 bili određeni pomoću ELISE. U prisustvu INab308 i INab708 tokom inkubacije, nivoi IL-8 su bili značajno smanjeni (P < 0.01), dok nije bilo značajnog smanjenja u prisustvu L2B23

PRIMERI

1. Metode

1.1 Priprema rekombinantnihC5a i C5amutanata:

[0132]DNK sekvence koje kodiraju humani C5a su bile dobijene reverznom reakcijom lanca transkriptaze-polimeraze (RTPCR) uz korišćenje RNK izolovane iz leukocita iz periferne krvi. C5a mutanti su bili generisani uz korišćenje PCR metoda uvođenjem GCT (alanina) u mesto mutacije. C5a DNK je onda bila ligatirana sa pET-32a (Novagen, Gibbstovvn, NJ), a smeša za ligaciju je bila upotrebljena za transformisanje JM109-kompetentnih ćelija. Ekspresioni plazmidi su bili transporfmisali u BL21 uz korišćenje standardnog metoda sa kalcijum hloridom Uzeta je samo jedna kolonija iz Luria-Bertani (LB) ploče sa bujonom, pa je inokulisana u LB medijumu sa ampicilinom, i inkubirana je na 37°C preko noći. Kultura je bila preneta u 2 L LB medijuma, pa je inkubirana na 37°C sve do srednje eksponencijalne faze (A600 = 0.6), a onda joj je bio dodat izopropil-p-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) do finalne koncentracije od 0 1 mM. Bilo je ostavljeno da ćelije nastave da rastu na 30°C preko noći i onda su prikupljene obrtanjem kulture na 7,000 rpm, na 4°C, tokom 15 min Posle ispiranja sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS; 10 mM PB, 150 mM NaCI [pH 7.4]) jednom, bakterijska peleta je bila resuspendovana u PBS i izložena je dejstvu ultrazvuka na ledu. Posle centrifugiranja na 12,000 rpm, na 4°C, tokom 15 min iz nerastvorljive pelete je bila izdvojena rastvorljiva frakcija. Da bi se prečistio humani rekombinantni C5a, supernatant ćelijskog lizata je bio stavljen na afinitetnu kolonu helatiranu sa niklom, koja je bila prethodno uravnotežena sa PBS. Onda je kolona bila isprana sa 50 mM imidazola i

200 mM imidazola u PBS, respektivno Konačno, vezani proteini su bili eluirani sa 500 mM imidazola, pa su dijalizirani protiv PBS preko noći, i onda su analizirani sa natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gel elektroforezom (SDS-PAGE).

1.2Imunizacija i skrining hibridoma pomoću ELISE:

[0133]Monoklonska antitela su bila napravljena korišćenjem hibridoma metoda, Imunizacija i proizvodnja MAbs su bile izvršene uz korišćenje standardnih protokola. Pet ženki BALB/c miševa starih 4 nedelje je bilo subkutano imunizovano sa 100 mg prečišćenog rekombinantnog C5a u kompletnom Frojdovom adjuvansu po životinji Životinje su bile busterovane dva puta u intervalima od 4 nedelje uz korišćenje 100 mg antigena u nekompletnom Frojndovom adjuvansu. Tri dana posle poslednjeg bustera, miševi su bili usmrćeni, a njihovi splenociti su bili fuzionisani sa NS-1 u odnosu 5:1, i onda je 200 mL ćelija bilo stavljeno u svaki bunarčić pet ploča sa po 96 bunarčića. Hibridi su bili selekcionisani u Dulbecco's Modified Eagle's Medijumu (DMEM) dopunjenom sa 20% fetusnog telećeg seruma i 5 x 3 10"<3>M hipoksantina, 2« 10~<5>M aminopterina, i 8 * 10~<4>M timidina (HAT).

[0134]Posle 8 dana, ćelijski klonovi koji su izlučivali antitela protiv humanog C5a su bili ispitani pomoću enzimski vezanog imunosorbentnog testa (ELISA) Ukratko, ploča sa 96 bunarčića je bila obložena sa 2 ug/mL rekombinantnog humanog C5a na 4°C preko noći. Posle blokiranja sa 5% obranog mleka u PBS na 37°C tokom 1h, bilo je dodato 50 uL medijuma za kultivaciju klonovima koji su rasli u svakom bunarčiću i inkubirani su na 37°C tokom 1 h, što je bilo praćeno sa 100 uL kozjeg anti-mišijeg antitela obeleženog sa ren peroksidazom (HRP) tokom 1 h. Reakcija peroksidaze je bila razvijena rastvorom za razvijanje boje koji je sadržao 5 5 mM o-fenilen-diamin hidrohlorida (OPD) i 8.5 mM H202. Apsorbansa svetlosti je bila izmerena na 492 nm sa ELISA čitačem (Anthos, Vals/Salcburg, Austrija).

1.3 Proizvodnja i prečišćavanje monoklonskih antitela:

[0135]Da bi se proizvela Mab u velikoj količini, 5 > 10<6>hibridoma ćelija je bilo injektirano u peritonealnu duplju miševa Posle 14 dana su bili izvučeni asciti, pa su centrifugirani na 1500 rpm, 4°C, tokom 5 min. Supernatant je bio sakupljen, pa je stavljen na kolonu protein A-Sefaroza 4B, koja je bila prethodno uravnotežena u PBS Vezano Mab je bilo eluirano sa limunskom kiselinom (pH 4.0) i zatim je dijalizirano protiv PBS preko noći. Prečišćeni proteini su bili analizirani pomoću SDS-PAGE.

1.4 Test oslobađanja enzima za C5a bioaktivnost

[0136]Indukcija oslobađanja enzima degranulacijom je važna biološka karakteristika C5a. U našoj studiji, za određivanje efekta C5a na oslobađanja lizozima je bila upotrebljena sveža humana cela krv zdravih dobrovoljaca Nivoi oslobođenih lizozima iz ćelija cele krvi su bili analizirani pomoću EnzChek® Lysozyme Assay Kita (Invitrogen, CA, USA). Da bi se proučila blokirajuća aktivnost anti-C5a antitela, rhC5a (100 nM) je bio pomešan sa različitom koncentracijom antitela. Posle toga, odmah su bile dodate ćelije cele krvi da bi se izbegla predinkubacija antitela sa C5a. Posle inkubacije, bilo je dodato 50 ul supernatanata uzorka u 50 ul razblaženog rastvora supstrata. Ploča je bila inkubirana na 37<C>C tokom 30 min u mraku, pa je posle toga očitana sa Perkin Elmer 1420 multifunkcionalnim brojačem (Masačusets, USA). Intenzitet fluorescencije je bio izmeren sa pobudom na 490 nm i emisijom na 525 nm, a nulta standardna vrednost (blanko) je bila oduzeta od svih uzoraka. Blokirajuća aktivnost antitela je bila izračunata posle oduzimanja intenziteta fluorescencije oslobađanja lizozima nezavisnog od rhC5a (puferska kontrola) od intenziteta fluorescencije oslobađanja lizozima indukovanog sa rhC5a Blokirajuća aktivnost je bila izračunata sa sledećom formulom, blokirajuća aktivnost = C5a Fluorescencija -

(C5a+A<b>) Fluorescencija /C5aFluorescencija"Puferska kontrolaFluorescencija-

1.5 ELISA analiza INab308 i INab708 sposobnosti vezivanja za humane C5a ili C5a mutante

[0137]Vezujuća Elisa je bila izvedena da bi se odredile aktivnosti vezivanja INab308 i INab708 za humane C5a i C5a mutante. C5a mutanti su bili proizvedeni zamenom odgovarajuće aminokiseline sa alaninom uvođenjem GCT u mesto mutacije sa kDNK nivoa. Ovi C5a mutanti obuhvataju mesnu mutaciju na 24, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, 30/37 dvostruku mutaciju, 40, 53, 64, 65, 66, 68, 64/68, 66/68, 69, 70, i C-del (12 aminokiselina je bilo izbrisano sa C5a C terminusa)

[0138]Humanim C5a (Sigma C5788), rekombinantnim C5a, i C5a mutantima (2 ug/mL) je bila obložena EIA ploča sa 96 bunarčića (Costar 9018) na 4°C preko noći. Posle blokiranja sa 5% obranog mleka u PBS na 37°C tokom 1 h, bilo je dodato 0.08, 0.4, 2 ug/ml anti-C5a antitela (INab308 i INab708) pripremljenih sa puferom za razređivanje u svaki bunarčić, pa je inkubirano na 37°C tokom 1 h, što je bilo praćeno sa 100 uL kozjeg anti-mišijeg antitela obeleženog sa ren peroksidazom (HRP) tokom 1 h. Reakcija peroksidaze je bila razvijena sa rastvorom za razvijanje boje koji je sadržao 5.5 mM o-fenilen-diamin hidrohlorida (OPD) i 8 5 mM H202. Apsorbansa svetlosti je bila izmerena na 492 nm sa ELISA čitačem (Anthos, Vals/Salcburg, Austrija). OD vrednost za rekombinantni C5a je bila podešena kao 100% aktivnost vezivanja. Sposobnost vezivanja C5a mutanata je bila izračunata sa ODC5a mutant/ODC5a.

1.6 Hemolitička aktivnost u plazmi (CH50):

[0139]Ukratko, ovčije crvene krvne ćelije (sRBC) su bile pripremljene od sveže ovčije cele krvi centrifugiranjem. a onda su bile senzibilizovane sa anti-sRBC. Uzorci plazme od zdravih dobrovoljaca su bili serijski razređeni. pa su inkubirani sa senzibilizovanim sRBC. Pola sata posle inkubacije, nelizirane ćelije su iscentrifugirane, pa su supernatanti bili očitani na 542 nm na čitaču ploča. Da bi se odredio efekat anti-C5a antitela na C5 aktivaciju, jednake zapremine anti-C5a antitela i plazme su bile predinkubirane tokom 1 sata pre dodavanja senzibilizovanih sRBC.

1.7 Produkcija IL-8 u celoj krvi u modelu infekcije saE. coli:

[0140]Da bi se odredila efikasnost anti-C5a antitela u uslovima bliskim kliničkoj sepsi, 250 ul cele krvi od zdravih dobrovoljaca je bilo imobilisano sa anti-C5a antitelima, i onda je bilo dodato 250 ulE. colirazređene u slanom puferu sa koncentracijom od 1 x 10<7>/ml. Posle 4-časovne inkubacije na 37°C, supernatanti su bili iscentrifugirani, pa su bili sakupljeni za ELISA analize IL-8. Nivoi IL-8 u supernatantima su bili analizirani sa IL-8 ELISA kitom (BioLegend, USA).

1.8 Test za određivanje antitela koja se vezuju za novi konformacioni epitop:

[0141]U 3-D strukturi C5a koja je dobijena kompjuterskim metodom modeliranja, prostorni epitopi koji sadrže peptid C5a 28-40 (VNNDETCEORAAR, SEQ ID NO: 67) i C5a peptid 65-70 (ISHKDM, SEQ ID NO: 68) se mogu videti kao slučajne zavojnice. Kada su dva peptida povezana pomoću fleksibilnog peptidnog linkera, GGGGS (SEQ ID NO: 69), onda su rekonstruisani prostorni epitopi koji nalikuju konformaciji roditeljskog antigena, pošto slaba hidrofobna interakcija između dva peptida obezbeđuje konformaciju u obliku džepa. Analiza kompjuterskim modeliranjem peptida NH2-28-40-Linker(GGGGS)-65-70-COOH održava istu konformaciju kao roditeljski antigen. Ovaj novi 24-AA peptid se može sintetizovati i konjugovati sa hemocijaninom iz prilepkaMegathura crenulata,(engl. Kevhole limpet hemocvanin, skr. KLH) da bi se obrazovao imunogen za imunizaciju miševa, pa se zatim može primeniti tradicionalna tehnologija hibridoma za dobijanje INab308 i INab708 uz korišćenje nove na 24-AA peptidu bazirane ELISE kao alata za skrining.

[0142]ELISA ploča sa 96 bunarčića je bila obložena sa 1-2 ug/mL sintetičkih peptida sa konformacionim epitopom na 4°C preko noći Posle blokiranja sa 5% obranog mleka u PBS na 37°C tokom 1 h, 50 pL medijuma za kultivaciju hibridoma rastućih klonova je bilo dodato u svaki bunarčić, pa su inkubirani na 37°C tokom 1 h, što je bilo praćeno sa 100 uL kozjeg anti-mišijeg antitela označenog sa ren peroksidazom (HRP) tokom 1 h. Reakcija peroksidaze je razvijena sa rastvorom za razvijanje boje koji je sadržao 5.5 mM o-fenilen-diamin hidrohlorida (OPD) i 8.5 mM H202. Apsorbansa svetlosti je merena na 492 nm sa ELISA čitačem.

2. Rezultati

2.1 Identifikacija aminokiselina relevantnih za C5a aktivnost

[0143]Nekoliko aminokiselina u okviru C5a molekula koji predstavljaju potencijalne epitope antitela je bilo mutirano u alanin. C5a mutanti naročito sadrže mesne mutacije na 24, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, 30/37 dvostruku mutaciju, 40, 53, 64, 65, 66, 68, 64/68, 66/68, 69, 70, i C-del (12 aminokiselina je bilo izbrisano sa C-terminusa C5a). C5a mutanti subili testirani u pogledu svoje bioaktivnosti za indukovanje oslobađanja lizozima iz ćelija humane cele krvi(Fig. 1).

[0144]C5a mesna mutacija koja je rezultovala sa više od 50% manjom bioaktivnosti u poređenju sa humanim C5a je bila smatrana kao kritično mesto za C5a biološku funkciju. Shodno tome, aminokiselinski ostaci 24, 29, 31, 37, 68, i 69 su bili identifikovani kao mesta koja su kritična za funkciju

(Fig. 1).

2.2 Karakterizacija epitopa na C5a vezanih za antitela INab308 i INab708

[0145]2000 ćelijskih klonova koji su izlučivali antitela protiv humanog C5a je bilo ispitano funkcionalnim testom (oslobađanje enzima). Samo dva antitela su ispoljila superiorne blokirajuće aktivnosti.

[0146]Ova dva antitela, INab308 i INab708, su bila dalje karakterisana u odnosu na posebne amino kiseline na C5a koje su prepoznala dva antitela.

[0147]Naročito je bilo generisano nekoliko mutanata C5a u kojima su jedna ili više aminokiselina bile zamenjene sa alaninom. Antitela INab308 i INab708 su bila dovedena u kontakt sa ovim mutantima, a stepen vezivanja je bio određen pomoću ELISE (vidi sekciju 1.5 gore). Gubitak sposobnosti vezivanja veći od 50% (u poređenju sa prirodnim C5a) je smatran značajnim.

[0148]Podaci ukazuju da se INab308 vezuje za dva regiona, 31-37 i 68-69(Fig. 2).Isto tako, INab708 se vezuje za dva regiona, 31-37 i 68-70(Fig. 3).

[0149]Značajno je da regioni koji su identifikovani za oba antitela pokrivaju četiri aminokiselinska ostatka (31, 37, 68, i 69) koja su bila identifikovana kao mesta koja su kritična za C5a funkciju u sekciji 2.1 gore.

2.3 Efekat antitela INab308, INab708, i F20 na humanu hemolitičku aktivnost u plazmi

[0150]Ukupni hemolitički komplementni titar (CH50) je uobičajeni metod za određivanje aktivacije klasične putanje komplementa (vidi sekciju 1.6).

[0151]Monoklonska antitela za C5a (INab708, INab308, i F20) su bila predinkubirana sa humanom plazmom u koncentraciji od pribl. 5 mM, a onda je bio izveden CH50 test. Među ovim antitelima, F20 jako inhibira CH50 aktivnost, dok INab708 i INab308 nemaju uticaja(Fig. 4).

[0152]Ovi rezultati pokazuju da se INab708 i INab308 ne uključuju u aktivaciju komplementa posredovanu sa C5b.

2.4 Efekat antitela INab308, INab708, i L2B23 na bioaktivnost C5a

[0153]Blokirajuća aktivnost antitelaINab308,INab708, i L2B23 na C5a je bila određena testom oslobađanjem lizozima indukovanim sa C5a (vidi sekciju 1.4). Molski odnos antitela prema C5a je bio podešen na 1 : 2 da bi se odredila blokirajuća aktivnost jednog od dva antitela za biološki efekat pobuđen sa molekulima C5a. Ova antitela su bivalentna antitela. Shodno tome, izborom gornjeg molskog odnosa od 1 : 2, paratopi antitela, sa jedne strane, i C5a, sa druge strane, su prisutni u ekvimolskim koncentracijama.

[0154]Podaci naFig.5 pokazuju da INab308 i INab708 poseduju veoma visoku blokirajuću aktivnost za bioaktivnost C5a (94% i 100%, respektivno), dok L2B23 pokazuje samo minimalni efekat (oko 12%).

2.5 Efekat antitela INab308 i INab708 na produkciju IL-8 u humanoj celoj krvi indukovanu sa £.

coli

[0155]Da bi se odredila efikasnost anti-C5a antitela u uslovima bliskim kliničkoj sepsi, bila je određena produkcija IL-8 u celoj krvi indukovana sa E.coli.Ovaj test se može smatrati modelom infekcije saE. coli(vidi takođe sekciju 1.7).

[0156]U prisustvu INab308 i INab708 tokom inkubacije, nivoi IL-8 su bili znatno smanjeni (P < 0.01), dok nije bilo značajnog smanjenja prisustva L2B23(Fig. 6).

3. Rezime

[0157]Važna svojstva poželjnih antitela prema pronalasku INab308 i INab708 su sumirana dole u Tabeli 3. Dalje su uključena komparativna antitela 8g8, MAb 137-26, Ab11876, G57, F20, L2B23, i G13 koja se ne vezuju istovremeno za obe aminosekvence konformacionog epitopa identifikovanog u predmetnom pronalasku, tj aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO. 2 i SEQ ID NO: 3. Komparativna antitela 8g8, MAb 137-26, F20, G57, L2B23, i G13 se vezuju samo za jednu od ove dve aminokiselinske sekvence (8g8, MAb 137-26, F20, G57, i G13) ili za različite aminokiselinske sekvence (L2B23). Ciljni epitop Ab11876 nije poznat.

[0158]Kao što je prikazano u Tabeli 3, neka komparativna antitela (8g8, MAb 137-26) ispoljavaju veće afinitete vezivanja za C5a od poželjnih antitela prema pronalasku, INab308 i INab708. Međutim,

INab308 i INab708 ispoljavaju veće blokirajuće aktivnosti od bilo kog proučenog komparativnog antitela. Preciznije, svako INab308 i INab708 ispoljava veoma veliku blokirajuću aktivnost (>90%), čak i kada se primenjuje u stehiometrijskim količinama, tj. u odnosu od 1 paratop po 1 epitopu; tj. 0.5 molekula antitela po 1 ciljnom molekulu. Antitela iz stanja tehnike (MAb 137-26, Ab11876) su ostvarila umerene blokirajuće aktivnosti samo onda kada su primenjena u superstehiometrijskim količinama. Ovi nalazi pokazuju da se visoki afinitet vezivanja ne može uvek izjednačiti sa visokom blokirajućom aktivnosti.

[0159]Sumarno posmatrano, predmetnim pronalaskom su po prvi put realizovana antitela koja ispoljavaju ekstremno veliku blokirajuću aktivnost, čak i kada se primene samo u stehiometrijskim količinama.

[0160]Aminokiselinske sekvence regiona koji određuju komplementarnost teških i lakih lanaca antitela INab308 i INab708 su navedene dole u Tabeli 4.

Claims

1. Vezujuća grupa koja se vezuje za konformacioni epitop formiran aminokiselinskim sekvencama NDETCEORA (SEQ ID NO 2) i SHKDMOL (SEQ ID NO: 3) od C5a, pri čemu se vezujuća grupa vezuje za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2 i za najmanje jednu aminokiselinu u okviru aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO. 3; pri čemu pomenuta vezujuća grupa ima konstantu vezivanja za C5a sa Kdvrednosti od 10 nM ili manju i ispoljava najmanje 80% blokirajuće aktivnosti za biološki efekat indukovan sa C5a, i pri čemu je pomenuta vezujuća grupa izabrana iz grupe koja se sastoji od: (a) antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata; i (b) antitelu-sličnih proteina, pri čemu su pomenuti antitelu-slični proteini izabrani iz grupe koja se sastoji od afitela, antikalina, i određenih ankirin ponavljajućih proteina.

2. Vezujuća grupa prema zahtevu 1, pri čemu se vezujuća grupa vezuje za najmanje jednu aminokiselinu aminokiselinske sekvence sa DETCEOR (SEQ ID NO: 4).

3. Vezujuća grupa prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu se vezujuća grupa vezuje za najmanje jednu aminokiselinu aminokiselinske sekvence sa HKDMO (SEQ ID NO 5), a prvenstveno KDM.

4. Vezujuća grupa prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu pomenuta vezujuća grupa ispoljava jedno ili više sledećih svojstava: - pomenuta vezujuća grupa ne inhibira CH50 aktivnost u humanoj plazmi; - pomenuta vezujuća grupa može da redukuje produkciju IL-8 u humanoj celoj krvi indukovanu saE. coli.

5. Vezujuća grupa prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je vezujuća grupa antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, pri čemu je pomenuto antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji poliklonskih antitela, monoklonskih antitela, himeričnih antitela, humanizovanih antitela, i humanih antitela.

6. Vezujuća grupa prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je vezujuća grupa antigen vezujući fragment antitela, pri čemu je pomenuti fragment izabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenata, Fab' fragmenata, F(ab')2 fragmenata, Fd fragmenata, Fv fragmenata, disulfidno-vezanih Fvs (dsFv), antitela sa jednim domenom i Fv antitela sa jednim lancem (scFv).

7. Vezujuća grupa prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je pomenuta vezujuća grupa antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži: (i) CDR3 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 6; ili (ii) CDR3 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 7: pri čemu CDR3 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije, koja dalje sadrži najmanje jednu od sledećih sekvenci: (i) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 10; (ii) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 11; (iii) CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 12; (iv) CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 13; (v) CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 14; (vi) CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 15; (vn) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 16; ili (viii) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 17; pri čemu CDR2 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR2 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije, pri čemu CDR1 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR1 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije

8.Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 7, koji dalje sadrži: (i) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 8; ili (ii) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 9; pri čemu CDR3 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije.

9. Vezujuća grupa prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je pomenuta vezujuća grupa antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži: (i) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 8; ili (ii) CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 9; pri čemu CDR3 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije.

10.Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 9, koji dalje sadrži najmanje jednu od sledećih sekvenci: (i) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 10; (ii) CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 11; (iii) CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO 12;(iv) CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 13; (v) CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 14; (vi) CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 15; (vii) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 16; ili (viii) CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO: 17; pri čemu CDR2 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR2 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR1 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu CDR1 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije.

11.Vezujuća grupa prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je pomenuta vezujuća grupa antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži skup CDR3 sekvence teškog lanca, CDR2 sekvence teškog lanca, i CDR1 sekvence teškog lanca koji je izabran između jednog od sledećih skupova: (i) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 6, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 10, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO. 14; (ii) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 6, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 10, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 15; (iii) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 6, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 11, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 14; (iv) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 6, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 11, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 15; (v) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 7, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 10, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 14; (vi) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 7, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 10, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 15; (vii) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 7, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 11, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 14; ili (viii) CDR3 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 7, CDR2 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 11, i CDR1 sekvenca teškog lanca sa SEQ ID NO: 15; pri čemu svaka CDR3 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR2 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; i pri čemu svaka CDR1 sekvenca teškog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije.

12.Vezujuća grupa prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je pomenuta vezujuća grupa antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži skup CDR3 sekvence lakog lanca, CDR2 sekvence lakog lanca, i CDR1 sekvence lakog lanca koji je izabran između jednog od sledećih skupova: (i) CDR3 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 8, CDR2 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 12, i CDR1 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO. 16; (ii) CDR3 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 8, CDR2 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 12, i CDR1 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 17; (iii) CDR3 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 9, CDR2 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 12, i CDR1 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 16; ili (iv) CDR3 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO. 9, CDR2 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 12, i CDR1 sekvenca lakog lanca sa SEQ ID NO: 17; pri čemu svaka CDR3 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; pri čemu svaka CDR2 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije; i pri čemu svaka CDR1 sekvenca lakog lanca opciono sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske zamene, 1, 2, ili 3 aminokiselinske delecije i/ili 1, 2, ili 3 aminokiselinske adicije

13.Farmaceutska kompozicija koja sadrži (a) vezujuću grupu prema bilo kom od zahteva 1 do 6 ili (b) antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 7 do 12 i koja dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razređivača, ekscipijenata, punilaca, veziva, lubrikanata, glidanata, sredstava za raspadanje, adsorbenata, i/ili konzervansa.

14.Primena (a) vezujuće grupe prema bilo kom od zahteva 1 do 6 ili (b) antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 7 do 12 za pripremanje farmaceutske kompozicije za prevenciju i ili lečenje različitih bolesti uključujući akutno zapaljenje, kao što su sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), sepsa, ozbiljna sepsa, septični šok, povrede povezane sa ishemijom/reperfuzijom, kao što je ishemijska srčana bolest, akutna povreda pluća, pneumonija, akutno i hronično odbacivanje grafta kod pacijenata sa transplantacijom, reakcije graft protiv domaćina, kao i bolesti koje sadrže hronične tipove zapaljenja, kao što su bubrežne glomerularne bolesti, kao što su glomerulonefritis i druge vrste bubrežne insuficijencije, reumatoidni artritis i slične autoimune bolesti, kao što su Behterova bolest, bolesti tipa lupusa, zapaljenska bolest creva, Kronova bolest, rast tumora, ili kancer čvrstih organa.