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TW202445126A - 基於質譜法之體內共表現抗體之表徵 - Google Patents

基於質譜法之體內共表現抗體之表徵 Download PDF

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TW202445126A
TW202445126A TW113102883A TW113102883A TW202445126A TW 202445126 A TW202445126 A TW 202445126A TW 113102883 A TW113102883 A TW 113102883A TW 113102883 A TW113102883 A TW 113102883A TW 202445126 A TW202445126 A TW 202445126A
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antibodies
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protein
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TW113102883A
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English (en)
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悅恬 嚴
順海 王
Original Assignee
美商再生元醫藥公司
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Abstract

本發明大體上係關於表徵所關注蛋白質之方法。特定言之，本發明係關於天然免疫沉澱及天然強陽離子交換層析-質譜法於鑑別及定量體內共表現之兩種或更多種抗體之配對產物的用途。

Description

基於質譜法之體內共表現抗體之表徵
本申請案係關於用於表徵治療性蛋白質，諸如抗體及融合蛋白，以及其衍生物及片段之方法。
在體內產生治療性蛋白質(例如單株抗體(mAb))之基因療法係投與使用哺乳動物宿主細胞株產生之重組蛋白的有吸引力的替代方案。出於藥物功效與安全性之考慮，必須對體內表現之mAb分子進行充分表徵。特定言之，在自同一生產細胞共表現多種抗體以獲得組合治療優勢的情況下，正確鏈配對之評估及監測至關重要。然而，歸因於樣本數量及基質複雜度之限制，此表徵具有挑戰性。
抗體通常包括與第一重鏈(HC)配對之第一輕鏈(LC)，其同與第二重鏈配對之第二輕鏈二聚。在單特異性抗體中，通常兩條重鏈將彼此相同且兩條輕鏈將彼此相同，而在雙特異性抗體中，通常兩條重鏈將彼此不同且兩條輕鏈將彼此相同。輕鏈及重鏈對之特定組合，在本文中稱為鏈配對，決定特定抗體或抗體衍生蛋白之結構及功能。當兩種或更多種抗體在同一細胞中共表現時，各種輕鏈及重鏈可無差別地配對，形成正確配對及錯配蛋白質產物之混合物。舉例而言，具有不同重鏈及輕鏈序列之兩種mAb的共表現可引起至多10種不同HC-LC對之產生，其中兩種代表所需mAb且其中八種代表錯配雜質。
基於電灑游離質譜法(ESI MS)之完整蛋白質分析已成為在開發期間表徵治療性蛋白質的基本工具。最常見地，質譜法(MS)與逆相液相層析(RPLC)在變性條件下耦接。然而，此方法之靈敏度及由具有各種分析物電荷狀態之所得複雜樣品產生的信雜比具有限制，此可使得其對於低豐度抗體之準確定量不可靠。
與習知變性RPLC-MS相比，使用天然強陽離子交換層析(SCX)-MS為治療性蛋白質之分析提供了許多優點。天然SCX-MS可展現相比於RPLC之高靈敏度及寬動態範圍，以及自基質(諸如血清樣品中之血清蛋白)分離目標分析物之優良能力。
因此，需要靈敏的方法來表徵包括複雜基質之樣品中的治療性蛋白質及肽，諸如治療性抗體。本發明提供用於表徵治療性蛋白質之新的天然免疫沉澱及天然LC-MS方法，其適用於開發治療性抗體。舉例而言，使用天然免疫沉澱，隨後使用天然LC-MS及自下而上方法，開發了新穎方法以成功表徵在小鼠中使用不同體內基因遞送平台共表現之兩種mAb混合物的鏈配對及N-連接醣基化。
已開發出一種用於表徵體內表現之抗體混合物之鏈配對的方法。舉例而言，包括體內共表現之兩種或更多種抗體之抗體混合物的樣品可在天然或接近天然條件下進行免疫沉澱。固定化抗體可與消化酶(例如IdeS或其變異體)接觸以產生抗體片段，例如Fab 2片段。接著可溶離抗體片段且對其進行天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)分析以鑑別且定量正確配對及錯配的抗體產物。
亦已開發出一種用於表徵體內表現之抗體混合物之醣基化概況的方法。舉例而言，包括體內共表現之兩種或更多種抗體之抗體混合物的樣品可在天然或接近天然條件下進行免疫沉澱。固定化抗體可與消化酶(例如IdeS或其變異體)接觸以產生抗體片段，例如Fc片段。接著可溶離抗體片段且使其與另一消化酶(例如胰蛋白酶)接觸以產生肽消化物。可對肽消化物進行逆相液相層析-質譜法(RPLC-MS)分析以表徵構成抗體混合物之抗體的醣基化概況。
本發明提供用於表徵至少一種所關注多次單元(multi-subunit)蛋白質之次單元之組裝的方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括至少一種所關注多次單元蛋白質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該至少一種所關注多次單元蛋白質之至少一個次單元的捕獲抗體，以形成固定化蛋白質；(b)溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品；及(c)在天然條件下對該增濃樣品進行液相層析-質譜法(LC-MS)分析以表徵該至少一種所關注多次單元蛋白質之次單元之組裝。
在一範疇中，至少一種多次單元蛋白質係選自由以下組成之群：抗體、單株抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體衍生蛋白、抗原結合蛋白、抗體-藥物結合物或融合蛋白。
在一範疇中，液相層析包括逆相液相層析、離子交換層析、陰離子交換層析、弱陽離子交換層析、強陽離子交換層析、粒徑排阻層析、親和層析、疏水相互作用層析、親水相互作用層析、混合模式層析、或其組合。
本發明亦提供用於自包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品鑑別及/或定量正確配對之抗體的方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品與固相基質接觸以形成固定化抗體；(b)使該等固定化抗體與消化酶接觸以產生該等抗體之未結合片段；(c)溶離該等未結合片段；及(d)對經溶離片段進行天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)分析以鑑別及/或定量正確配對之抗體。
在一範疇中，固相基質係選自由以下組成之群：微量盤、樹脂、及珠粒。在一範疇中，固相基質包括珠粒。在一特定範疇中，珠粒為瓊脂糖珠粒或磁性珠粒。
在一範疇中，結合係藉由黏附於固相基質之抗體結合分子進行。在一特定範疇中，抗體結合分子為蛋白A、蛋白G或抗Fc抗體。在一範疇中，結合係藉由黏附於固相基質之抗體進行。
在一範疇中，消化酶係選自由以下組成之群：胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、胰凝乳蛋白酶、Lys-N、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、木瓜酶、IdeS或其變異體。
在一範疇中，未結合片段為Fab片段、Fab'片段、Fab 2片段、F(ab') 2片段、Fc片段、Fv片段、Fd片段或Fd'片段。
本發明進一步提供用於自包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品鑑別及/或定量正確配對之抗體的方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體；(b)使該等固定化抗體與包括IdeS或其變異體之消化條件接觸以形成游離Fab 2片段；(c)溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；及(d)對該等經溶離Fab 2片段進行天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)分析以鑑別及/或定量正確配對之抗體。
在一範疇中，兩種或更多種抗體係選自由以下組成之群：治療性抗體、單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、抗體-藥物結合物、抗體融合蛋白或抗體片段。
在一範疇中，兩種或更多種抗體為卡斯瑞韋單抗(casirivimab)及依米得韋單抗(imdevimab)。
在一範疇中，樣品為生物樣品。在一特定範疇中，生物樣品係選自由以下組成之群：全血、血漿、血清、唾液或器官組織。
在一範疇中，樣品為血清。
在一範疇中，來自至少兩種抗體中之各者的至少一個次單元在質量上類似。在一特定範疇中，來自至少兩種抗體中之各者的至少一個次單元之質量差異小於10道爾頓、小於9道爾頓、小於8道爾頓、小於7道爾頓、小於6道爾頓、小於5道爾頓、小於4道爾頓、小於3道爾頓、小於2道爾頓或小於1道爾頓。
在一範疇中，固相基質係選自由以下組成之群：微量盤、樹脂、瓊脂糖珠粒及磁性珠粒。
在一範疇中，固相基質包括瓊脂糖珠粒。
在一範疇中，該方法進一步包括在使樣品與固相基質接觸之後洗滌固相基質之步驟。
在一範疇中，溶離包括離心固相基質及游離Fab 2片段之步驟。
在一範疇中，質譜儀為電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀。
本發明另外提供用於表徵體內表現之至少一種所關注抗體的方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括體內表現之至少一種所關注抗體之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體；(b)使該等固定化抗體接觸包括IdeS或其變異體之消化條件以形成游離Fab 2片段；(c)溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；及(d)對該等經溶離Fab 2片段進行天然粒徑排阻層析-質譜法(nSEC-MS)或天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)分析以表徵該至少一種所關注抗體。
本發明亦提供用於鑑別及/或定量雙特異性抗體產生中之雜質的方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括雙特異性抗體及至少一種雜質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體；(b)使該等固定化抗體與包括IdeS或其變異體之消化條件接觸以形成游離Fab 2片段；(c)溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；及(d)對該等經溶離Fab 2片段進行nSCX-MS分析以鑑別及/或定量該等雜質。
在一範疇中，至少一種雜質為副產物雜質。在一特定範疇中，至少一種副產物雜質為單特異性抗體。
在一範疇中，雙特異性抗體係藉由表現兩條不同重鏈及一條共同輕鏈來產生。在一特定範疇中，至少一種雜質為重鏈中之一者同二聚化的結果。
本發明進一步提供用於表徵所關注蛋白質之醣基化概況的方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括所關注蛋白質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該所關注蛋白質之捕獲抗體，以形成固定化蛋白質；(b)溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品；及(c)對該增濃樣品進行天然液相層析-質譜法分析以表徵該所關注蛋白質之醣基化概況。
本發明另外提供用於表徵來自包括體內共表現之至少兩種抗體之樣品的抗體之醣基化概況的方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括體內共表現之至少兩種抗體之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體；(b)使該等固定化抗體與包括IdeS或其變異體之消化條件接觸以形成固定化Fc片段；(c)溶離該等固定化Fc片段以形成經溶離Fc片段；(d)使該等經溶離Fc片段經受消化條件以形成肽消化物；及(e)對該肽消化物進行逆相液相層析-質譜法(RPLC-MS)分析以表徵該等抗體之醣基化概況。
本發明亦提供用於選擇用於產生至少一種所關注蛋白質之表現平台的方法。該等方法可包括：(a)獲得包括由第一表現平台產生之至少一種所關注蛋白質之樣品；(b)在天然或接近天然條件下使該樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該至少一種所關注蛋白質之捕獲抗體，以形成固定化蛋白質；(c)溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品；(d)對該增濃樣品進行nLC-MS分析以表徵由該表現平台產生之該至少一種所關注蛋白質；(e)使用至少一種替代表現平台重複步驟(a)至(d)；(f)比較該第一表現平台及該至少一種替代表現平台中之各者之步驟(d)的結果；及(g)基於該比較選擇表現平台。
在一範疇中，第一表現平台及至少一種替代表現平台包括重組表現平台及/或基因療法表現平台。
本發明進一步提供用於選擇用於產生抗體混合物之基因療法平台的方法。該等方法可包括：(a)獲得包括由第一基因療法平台產生之抗體混合物之樣品；(b)在天然或接近天然條件下使該樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體；(c)使該等固定化抗體與消化條件接觸以形成游離Fab 2片段；(d)溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；(e)對該等經溶離Fab 2片段進行nSCX-MS分析以表徵由該基因療法平台產生之該抗體混合物的正確次單元配對；(f)使用至少一種替代基因療法平台重複步驟(a)至(e)；(g)比較該第一基因療法平台及該至少一種替代基因療法平台中之各者之步驟(e)的結果；及(h)基於該比較選擇基因療法平台。
本發明另外提供用於選擇所關注蛋白質之方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括第一所關注蛋白質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該所關注蛋白質之捕獲抗體，以形成固定化蛋白質；(b)溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品；(c)對該增濃樣品進行nLC-MS分析以表徵該所關注蛋白質；(d)使用至少一種替代所關注蛋白質重複步驟(a)至(c)；(e)比較該第一所關注蛋白質及該至少一種替代所關注蛋白質中之各者之步驟(c)的結果；及(f)基於該比較選擇所關注蛋白質。
本發明亦提供用於選擇抗體混合物之方法。該等方法可包括：(a)在天然或接近天然條件下使包括第一抗體混合物之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體；(b)使該等固定化抗體與消化條件接觸以形成游離Fab 2片段；(c)溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；(d)對該等經溶離Fab 2片段進行nSCX-MS分析以表徵該抗體混合物之正確次單元配對；(e)使用至少一種替代抗體混合物重複步驟(a)至(d)；(f)比較該第一抗體混合物及該至少一種替代抗體混合物中之各者之步驟(d)的結果；及(g)基於該比較選擇抗體混合物。
除下一代產品外，本發明亦適用於生產生物相似藥。生物相似藥係取決於管轄區域以各種方式定義，但與先前該管轄區域中批准之生物產品(通常稱為「參考產品」)共有共同的比較特徵。根據世界衛生組織，生物相似藥係與已根據品質、安全性及功效授權之參考生物治療性產品類似的生物治療性產品，且在許多國家，諸如菲律賓被採用。
在美國，生物相似藥當前被描述為(A)生物產品與參考產品高度類似，不過在臨床上無活性之組分存在微小差異；且(B)在產品之安全性、純度及效力方面，生物產品與參考產品之間並無有臨床意義的差異。在美國，經顯示，可互換性生物相似藥或產品可替代先前產品而無需開具先前產品之健康照護提供者的干預。在歐盟，生物相似藥係與EU已批准之另一生物藥品(稱為「參考藥品」)高度類似的生物藥品且包括結構、生物活性、功效及安全性等考慮因素，且俄羅斯遵循此等指導原則。在中國，生物相似藥產品當前係指含有與原始生物藥物類似之活性物質且在品質、安全性及有效性方面與原始藥物類似且在臨床上無顯著差異的生物製劑。在日本，生物相似藥當前係與日本已批准之參考產品具有生物等效/品質等效之品質、安全性及功效的產品。在印度，生物相似藥當前稱為「類似生物製劑」且係指基於可比較性，與批准之參考生物產品在品質、安全性及功效方面類似的類似生物產品。在澳大利亞，生物相似藥品當前係參考生物藥品之高度類似的形式。在墨西哥、哥倫比亞及巴西，生物相似藥當前係在品質、安全性及功效方面與已許可之參考產品類似的生物治療性產品。在阿根廷，生物相似藥當前係來源於與其具有共同特徵之原始產品(比較劑)。在新加坡，生物相似藥當前係在物理化學特徵、生物活性、安全性及功效方面與新加坡登記之現有生物產品類似的生物治療性產品。在馬來西亞，生物相似藥當前係所開發的在品質、安全性及功效方面與已登記的公認之醫藥產品類似的新穎生物醫藥產品。在加拿大，生物相似藥當前係與已授權銷售之生物藥物高度類似的生物藥物。在南非，生物相似藥當前係所開發的與已批准人類使用之生物藥品類似的生物藥品。生物相似藥及其根據此等及任何經修訂定義之同義語的生產及分析可根據本發明進行。
當結合以下描述及附圖考慮時，將更好地瞭解及理解本發明之此等及其他範疇。以下描述儘管指示各種範疇及其多個具體細節，但僅藉助於說明給出且不具有限制性。可在本發明之範圍內作出許多取代、修改、添加或重排。
本申請案主張於2023年1月25日申請之美國申請案第63/441,050號之優先權，該申請案特此以引用之方式併入。
在體內產生治療性蛋白質(例如單株抗體(mAb))之基因療法係投與使用哺乳動物宿主細胞株產生之重組蛋白的有吸引力的替代方案。與重組mAb類似，出於藥物功效與安全性之考慮，必須對體內表現之mAb分子進行充分表徵(例如一級序列、轉譯後修飾及三級結構)。特定言之，在自同一生產細胞共表現多種抗體以獲得組合治療優勢的情況下，正確鏈配對之評估及監測至關重要。然而，歸因於樣本數量及基質複雜度之限制，此表徵具有挑戰性。
REGEN-COV(卡斯瑞韋單抗及依米得韋單抗)係由Regeneron Pharmaceuticals, Inc.開發之研究性抗體混合物療法，用於治療由嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起之2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)(Hansen等人, 2020, Science, 369:1010-1014；Baum等人, 2020, Science, 370:1110-1115；Weinreich等人, 2021, N Engl J Med, 384:238-251)。該抗體混合物包括兩種人源化IgG1單株抗體(本文中稱為mAb1及mAb2)，其經設計以靶向SARS-CoV-2棘蛋白上之非重疊抗原決定基，且藉此阻斷SARS-CoV-2病毒與人類ACE2之相互作用，且預防由病毒之快速基因突變所致的病毒逃逸(Hansen等人；Baum等人, 2020, Science, 369:1014-1018)。
當共表現具有不同重鏈(HC)及輕鏈(LC)序列之兩種mAb時，可產生至多10個不同HC-LC對。歸因於不同分析物之間可能類似的尺寸、電荷、結構及序列，分離正確配對之mAb及表徵產物之錯配帶來許多挑戰。當產物處於具有複雜基質(諸如血清)之樣品中時，此挑戰大大增加。
相關地，雙特異性抗體(bsAb)產物之生產涉及產生兩種不同HC序列及一種或兩種LC序列。視LC序列之數目而定，此生產可產生3個或10個不同HC-LC對。歸因於此等產物之總體相似性，其分離及表徵帶來重大挑戰。
關於治療性蛋白質之功效的另一重要考慮因素為蛋白質醣基化概況之變化。人類IgG亞類在Fc區中共用保守胺基酸序列，包括單個N-醣基化位點(N297)。Fc醣基化對Fc與不同類型之受體之間的相互作用至關重要，且因此與IgG分子之生物物理學概況(諸如壽命及效應功能)相關。舉例而言，具有Fc去岩藻糖基化之抗體展現對Fcγ受體III之較強結合親和力及增強的抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)；Fc半乳糖基化與對C1q之強結合親和力及增強的補體依賴性細胞毒性(CDC)相關；且具有N-連接甘露糖-5聚醣(Man5)之抗體可顯示較高免疫原性及血清中之較快清除。因此，表徵潛在治療性蛋白質之聚醣概況(諸如治療性抗體之Fc醣基化)係藥物開發之重要範疇，且需要在複雜樣品中有效進行此表徵之方法。
基於電灑游離質譜法(ESI MS)之完整蛋白質分析已成為在開發期間表徵治療性蛋白質的基本工具。最常見地，MS與逆相液相層析(RPLC)在變性條件下耦接。然而，此方法之靈敏度及由具有各種分析物電荷狀態之所得複雜樣品產生的信雜比具有限制，此可使得其對於低豐度抗體之準確定量不可靠。
最近，已描述包括線上耦接至ESI MS之天然離子交換層析的LC-MS系統(Yan et al.,2020, J Am Soc Mass Spectrom, 31:2171-2179)。與習知變性RPLC-MS相比，使用天然強陽離子交換層析(SCX)-MS為治療性蛋白質之分析提供了許多優點。天然SCX-MS可展現相比於RPLC之高靈敏度及寬動態範圍，以及自基質(諸如血清樣品中之血清蛋白)分離目標分析物之優良能力。天然SCX-MS概況亦可具有優良MS空間解析度，使得更易於偵測蛋白質變異體或生物轉化產物。
如上文所描述，需要靈敏的方法來表徵樣品中之治療性蛋白質及肽，諸如治療性抗體。本發明提供用於表徵治療性蛋白質之新穎天然免疫沉澱及天然LC-MS方法，其適用於開發治療性抗體。使用天然免疫沉澱，隨後使用天然LC-MS及自下而上方法，開發了本發明方法以成功表徵在小鼠中使用不同體內基因遞送平台共表現之兩種mAb混合物的鏈配對及N-連接醣基化。
除非另外描述，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與此等發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。儘管可在實踐或測試中使用與本文所描述之方法及材料類似或等效的任何方法及材料，但現描述特定方法及材料。
術語「一」應理解為意謂「至少一」。如本文所用，術語「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(including)」意欲為非限制性的，且應理解為分別意謂「包括(comprise)」、「包括(comprises)」及「包括(comprising)」。「該(said)」一字可以與「該(the)」相同之方式使用。
在數值及範圍之上下文中，術語「約」係指近似或接近於所述值或範圍之值或範圍，使得本發明可執行，諸如具有所需速率、量、密度、程度、增加、減少、百分比、比率、值、純度、pH、濃度、形式或變異體之存在、溫度或時間量，此係自本文所含之教示顯而易見。該術語允許一般熟習此項技術者所瞭解之標準變化，且在提供範圍時，包括端點。舉例而言，視執行能力而定，「約」可表示高於或低於在大約+/-10%或更大或更小之範圍內之所陳述值的值。因此，此術語涵蓋之值超出僅由系統誤差引起之值。
如本文所用，術語「蛋白質」或「所關注蛋白質」可包括具有共價連接之醯胺鍵的任何胺基酸聚合物。蛋白質包括一個或多個胺基酸聚合物鏈，其在此項技術中通常稱為「多肽」。「多肽」係指由經由肽鍵連接之胺基酸殘基、其天然存在之相關結構變異體及非天然存在之合成類似物構成的聚合物。「合成肽或多肽」係指非天然存在之肽或多肽。合成肽或多肽可例如使用自動化多肽合成器來合成。各種固相肽合成方法係熟習此項技術者已知的。蛋白質可包括一種或多種多肽以形成單一功能生物分子。在另一例示性範疇中，蛋白質可包括抗體片段、奈米抗體、重組抗體嵌合體、細胞介素、趨化介素、肽激素及其類似物。所關注蛋白質可包括生物治療性蛋白質、用於研究或療法之重組蛋白、捕獲蛋白及其他嵌合受體Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗體、單株抗體、多株抗體、人類抗體及雙特異性抗體中之任一者。蛋白質可使用基於重組細胞之生產系統產生，該等系統諸如昆蟲桿狀病毒系統、酵母系統(例如畢赤酵母屬(Pichia sp.))及哺乳動物系統(例如CHO細胞及CHO衍生物，如CHO-K1細胞)。關於論述生物治療性蛋白質及其生產之近期綜述，參見Ghaderi等人, 「Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation」(Darius Ghaderi等人, Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS 147-176 (2012)。蛋白質可包括修飾、加合物及其他共價連接部分。此等修飾、加合物及部分包括例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、生物素、聚醣(例如N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖、神經胺酸、N-乙醯基葡糖胺、岩藻糖、甘露糖及其他單醣)、PEG、聚組胺酸、FLAG標籤、麥芽糖結合蛋白(MBP)、甲殼素結合蛋白(CBP)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、myc-抗原決定基、螢光標記及其他染料，及其類似物。蛋白質可基於組成及溶解度分類且可因此包括簡單蛋白質，諸如球狀蛋白質及纖維蛋白質；結合蛋白質，諸如核蛋白、醣蛋白、黏蛋白、色蛋白、磷蛋白、金屬蛋白及脂蛋白；及衍生蛋白質，諸如初級衍生蛋白質及二級衍生蛋白質。
舉例而言，所關注蛋白質可為重組蛋白、基因療法之體內產物、治療性蛋白質、抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、抗體片段、單株抗體、抗原結合蛋白、融合蛋白、scFv、多次單元蛋白質、受體、受體配位體及其組合。
片語「含Fc蛋白質」包括抗體、雙特異性抗體、含有Fc之抗體衍生物、含有Fc之抗體片段、Fc融合蛋白、免疫黏附素及至少包括免疫球蛋白CH2及CH3區之功能部分的其他結合蛋白。「功能部分」係指可結合Fc受體(例如FcyR；或FcRn(新生兒Fc受體)及/或可參與補體活化之CH2及CH3區。若CH2及CH3區含有使其無法結合任何Fc受體且亦無法活化補體的缺失、取代及/或插入或其他修飾，則CH2及CH3區不具功能性。Fc融合蛋白包括例如Fc融合體(N端)、Fc融合體(C端)、單Fc融合體及雙特異性Fc融合蛋白。
「Fc」表示可結晶片段，且通常稱為恆定片段。抗體含有由兩個一致蛋白質序列構成的Fc區。IgG具有稱為γ鏈之重鏈。IgA具有稱為α鏈之重鏈，IgM具有稱為µ鏈之重鏈。IgD具有稱為σ鏈之重鏈。IgE具有稱為ε鏈之重鏈。在自然界中，Fc區在相同物種之給定種類及亞類的所有抗體中均相同。人類IgG具有四個亞類且在該等亞類中共有約95%同源性。在各亞類中，Fc序列皆相同。舉例而言，人類IgG1抗體將具有相同的Fc序列。同樣，IgG2抗體將具有相同的Fc序列；IgG3抗體將具有相同的Fc序列；且IgG4抗體將具有相同的Fc序列。Fc區中之改變產生電荷變異。
「Fc融合蛋白」係一種類型的融合蛋白且包括在天然狀態下不融合的兩種或更多種蛋白質之部分或全部，該等蛋白質中之一者為免疫球蛋白分子之Fc部分。Fc融合蛋白包括Fc融合體(N端)、Fc融合體(C端)、單Fc融合體及雙特異性Fc融合體。包括與抗體衍生之多肽(包括Fc域)之不同部分融合的某些異源多肽的融合蛋白之製備已例如由Ashkenazi等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-39 (1991)；Byrn等人, Nature 344:677-70, 1990；及Hollenbaugh等人, 「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」, 於Current Protocols in Immunology, 增刊4, 第10.19.1 - 10.19.11頁 (1992)描述。「受體Fc融合蛋白」包括與Fc部分偶合之受體之一個或多個細胞外域中之一者或多者，Fc部分可包括鉸鏈區，之後為免疫球蛋白之CH2及CH3域。Fc融合蛋白亦可含有結合於單一或超過一個配位體之兩條或更多條不同受體鏈。一些受體Fc融合蛋白可含有多個不同受體之配位體結合域。受體Fc融合蛋白亦稱為「捕獲劑」、「捕獲分子」或「捕獲蛋白」。舉例而言，此類捕獲蛋白包括IL-1捕獲劑(例如利納西普(Rilonacept)，其含有與hlgGl之Fc融合之IL-1R1胞外區融合的IL-lRAcP配位體結合區；參見美國專利第6,927,044號，或VEGF捕獲劑(例如阿柏西普(Aflibercept)，其含有與融合至hlgG1之Fc的VEGF受體Flkl之Ig域3融合的VEGF受體Fltl之Ig域2，參見美國專利第7,087,411號及第7,279,159號。
如本文所用，術語「治療性蛋白質」係指可向個體投與以治療疾病或病症之任何蛋白質。治療性蛋白質可用於但不限於生物及醫藥產品之生產。基於蛋白質之治療劑可具有任何胺基酸序列，且包括需要製造之任何蛋白質、多肽或肽。包括但不限於病毒蛋白、細菌蛋白、真菌蛋白、植物蛋白及動物(包括人類)蛋白。蛋白質類型可包括但不限於抗體、受體、含Fc蛋白質、捕獲蛋白、酶、因子、抑制子、活化子、配位體、報導蛋白、選擇蛋白、蛋白激素、蛋白毒素、結構蛋白、儲存蛋白、運輸蛋白、神經傳遞質及收縮性蛋白。亦包括上述之衍生物、組分、鏈及片段。序列可為天然的、半合成的或合成的。所關注蛋白質及所關注多肽由「所關注基因」編碼，其亦可稱為「所關注聚核苷酸」。
治療性蛋白質可為具有藥理學作用之任何蛋白質，例如抗體、可溶性受體、抗體-藥物結合物、抗原結合蛋白或酶。治療性蛋白質可為單株抗體。兩種或更多種治療性蛋白質可存在於同一樣品中。兩種或更多種治療性蛋白質可在細胞中共表現。治療性蛋白質可為抗SARS-CoV-2抗體，包括卡斯瑞韋單抗或依米得韋單抗。可共同投與多種治療性蛋白質以便達成藥理學作用，例如預防歸因於靶病毒突變之病毒逃逸。如本文所用，術語「抗體混合物」係指包括至少兩種治療性抗體之共同投與的治療性蛋白質。抗體混合物可包括REGEN-COV。
治療性蛋白質包括但不限於人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。亦可使用嵌合抗體，諸如IgG2/IgG4抗體、IgG2/IgG1抗體及IgG2/IgG1/IgG4抗體。
抗體可選自由以下組成之群：抗計劃性細胞死亡1抗體(例如抗PD1抗體，如美國專利申請公開案第US2015/0203579A1號中所描述)、抗計劃性細胞死亡配位體-1(例如抗PD-L1抗體，如美國專利申請公開案第US2015/0203580A1號中所描述)、抗Dll4抗體、抗血管生成素-2抗體(例如抗ANG2抗體，如美國專利第9,402,898號中所描述)、抗血管生成素樣3抗體(例如抗AngPtl3抗體，如美國專利第9,018,356號中所描述)、抗血小板衍生生長因子受體抗體(例如抗PDGFR抗體，如美國專利第9,265,827號中所描述)、抗Erb3抗體、抗促乳素受體抗體(例如抗PRLR抗體，如美國專利第9,302,015號中所描述)、抗補體5抗體(例如25抗C5抗體，如美國專利申請公開案第US2015/0313194A1號中所描述)、抗TNF抗體、抗表皮生長因子受體抗體(例如抗EGFR抗體，如美國專利第9,132,192號中所描述，或抗EGFRvIII抗體，如美國專利申請公開案第US2015/0259423A1號中所描述)、抗前蛋白轉化酶枯草溶菌素Kexin-9抗體(例如抗PCSK9抗體，如美國專利第8,062,640號或美國專利申請公開案第US2014/0044730A1號中所描述)、抗生長及分化因子-8抗體(例如抗GDF8抗體，亦稱為抗肌肉抑制素抗體，如美國專利第8,871,209號或第9,260,515號中所描述)、抗升糖素受體(例如抗GCGR抗體，如美國專利申請公開案第US2015/0337045A1號或第US2016/0075778A1號中所描述)、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、介白素4受體抗體(例如抗IL4R抗體，如美國專利申請公開案第US2014/0271681A1號或美國專利第8,735,095號或第8,945,559號中所描述)、抗介白素6受體抗體(例如抗IL6R抗體，如美國專利第7,582,298號、第8,043,617號或第9,173,880號中所描述)、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗介白素33(例如抗IL33抗體，如美國專利申請公開案第US2014/0271658A1號或第US2014/0271642A1號中所描述)、抗呼吸道融合病毒抗體(例如抗RSV抗體，如美國專利申請公開案第US2014/0271653A1號中所描述)、抗分化簇3(例如抗CD3抗體，如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號以及美國申請案第62/222,605號中所描述)、抗分化簇20(例如抗CD20抗體，如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號，以及美國專利第7,879,984號中所描述)、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗分化簇48(例如抗CD48抗體，如美國專利第9,228,014號中所描述)、抗Fel d1抗體(例如，如美國專利第9,079,948號中所描述)、抗中東呼吸道症候群(Middle East Respiratory Syndrome)病毒(例如抗MERS抗體，如美國專利申請公開案第US2015/0337029A1號中所描述)、抗伊波拉病毒(Ebola virus)抗體(例如，如美國專利申請公開案第US2016/0215040號中所描述)、抗茲卡病毒(Zika virus)抗體、抗淋巴球活化基因3抗體(例如抗LAG3抗體或抗CD223抗體)、抗神經生長因子抗體(例如抗NGF抗體，如美國專利申請公開案第US2016/0017029號及美國專利第8,309,088號及第9,353,176號中所描述)及抗活化素A(Activin A)抗體。雙特異性抗體可選自由以下組成之群：抗CD3×抗CD20雙特異性抗體(如美國專利申請公開案第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號中所描述)、抗CD3×抗黏蛋白16雙特異性抗體(例如抗CD3×抗Muc16雙特異性抗體)及抗CD3×抗前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體(例如抗CD3×抗PSMA雙特異性抗體)。亦參見美國專利公開案第US 2019/0285580 A1號。亦包括Met×Met抗體、針對NPR1之促效劑抗體、LEPR促效劑抗體、BCMA×CD3抗體、MUC16×CD28抗體、GITR抗體、IL-2Rg抗體、EGFR×CD28抗體、因子XI抗體、針對SARS-CoC-2變異體之抗體、Fel d 1多重抗體療法、Bet v 1多重抗體療法。亦包括以上之衍生物、組分、域、鏈及片段。
產生例示性抗體之細胞可根據本發明培養。例示性抗體包括阿利庫單抗(Alirocumab)、阿替韋單抗(Atoltivimab)、瑪替韋單抗(Maftivimab)、奧西韋單抗(Odesivimab)、奧西韋單抗-ebgn、卡西瑞單抗(Casirivimab)、伊德維單抗(Imdevimab)、西普利單抗(Cemiplimab)及西普利單抗-rwlc(結合PD-1之人類IgG4單株抗體)、度匹魯單抗(Dupilumab)(結合至IL-4Rα(alpha)次單元且由此抑制介白素4(IL-4)及介白素13(IL-13)信號傳導的IgG4亞類之人類單株抗體)、依凡納單抗(Evinacumab)、依凡納單抗-dgnb、法西奴單抗(Fasinumab)、弗安利單抗(Fianlimab)、加托索單抗(Garetosmab)、依特吉單抗(Itepekimab)、奈伐蘇單抗(Nesvacumab)、奧尼妥單抗(Odrononextamab)、帕澤利單抗(Pozelimab)、沙利姆單抗(Sarilumab)、曲弗單抗(Trevogrumab)及瑞奴庫單抗(Rinucumab)。
額外例示性抗體包括雷武珠單抗(Ravulizumab)-cwvz、阿昔單抗(Abciximab)、阿達木單抗(Adalimumab)、阿達木單抗-atto、Ado-曲妥珠單抗(trastuzumab)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、阿特珠單抗(Atezolizumab)、阿維魯單抗(Avelumab)、巴利昔單抗(Basiliximab)、貝利單抗(Belimumab)、貝那利珠單抗(Benralizumab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、貝茨羅特斯單抗(Bezlotoxumab)、博納吐單抗(Blinatumomab)、維布妥昔單抗(Brentuximab vedotin)、布羅達單抗(Brodalumab)、卡那單抗(Canakinumab)、卡羅單抗噴地肽(Capromab pendetide)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(Certolizumab pegol)、西妥昔單抗(Cetuximab)、德諾單抗(Denosumab)、地努圖希單抗(Dinutuximab)、度伐魯單抗(Durvalumab)、依庫珠單抗(Eculizumab)、埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)、艾美賽珠單抗(Emicizumab)-kxwh、恩美阿利庫單抗(Emtansine alirocumab)、依羅庫單抗(Evolocumab)、戈利木單抗(Golimumab)、古塞庫單抗(Guselkumab)、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)、艾達賽珠單抗(Idarucizumab)、英利昔單抗(Infliximab)、英利昔單抗-abda、英利昔單抗-dyyb、伊匹單抗(Ipilimumab)、依奇珠單抗(Ixekizumab)、美泊珠單抗(Mepolizumab)、耐昔妥珠單抗(Necitumumab)、納武利尤單抗(Nivolumab)、奧托薩昔單抗(Obiltoxaximab)、阿托珠單抗(Obinutuzumab)、奧瑞組單抗(Ocrelizumab)、奧伐木單抗(Ofatumumab)、奧拉單抗(Olaratumab)、奧馬珠單抗(Omalizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)、帕妥株單抗(Pertuzumab)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、蘭尼單抗(Ranibizumab)、雷昔庫單抗(Raxibacumab)、瑞利珠單抗(Reslizumab)、瑞奴庫單抗、利妥昔單抗(Rituximab)、蘇金單抗(Secukinumab)、司妥昔單抗(Siltuximab)、托珠單抗(Tocilizumab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、烏司奴單抗(Ustekinumab)及維多珠單抗(Vedolizumab)。
本發明亦適合於其他治療性蛋白質，包括融合蛋白。融合蛋白包括Fc融合蛋白，諸如受體Fc融合蛋白，例如捕獲蛋白。所關注蛋白質可為含有Fc部分及另一域之重組蛋白(例如，Fc融合蛋白)。Fc融合蛋白可為受體Fc融合蛋白，其含有與Fc部分偶合之受體的一個或多個細胞外域。Fc部分可包括鉸鏈區，隨後為IgG之CH2及CH3域。受體Fc融合蛋白可含有結合於單一配位體或多個配位體之兩條或更多條不同受體鏈。舉例而言，Fc融合蛋白為TRAP蛋白，諸如IL-1捕獲(例如，利納西普(rilonacept)，其含有與hIgG1之Fc融合之IL-1R1胞外區融合的IL-1RAcP配位體結合區；參見美國專利第6,927,044號)或VEGF捕獲(例如阿柏西普(aflibercept)或塞維-阿柏西普(ziv-aflibercept)，其含有與融合至hIgG1之Fc的VEGF受體Flk1之Ig域3融合的VEGF受體Flt1之Ig域2；參見美國專利第7,087,411號及第7,279,159號)。Fc融合蛋白可為ScFv-Fc融合蛋白，其含有與Fc部分偶合之抗體的一種或多種抗原結合域，諸如可變重鏈片段及可變輕鏈片段中之一者或多者。亦包括以上之衍生物、組分、域、鏈及片段。
缺乏Fc部分之其他蛋白質，諸如以重組方式產生之酶類及微型捕獲蛋白，亦可根據發明製得。微型捕獲蛋白為使用多聚化組分(MC)而非Fc部分之捕獲蛋白，且揭示於美國專利第7,279,159號及第7,087,411號中。亦包括以上之衍生物、組分、域、鏈及片段。
如本文所用，術語「重組蛋白」係指由於已引入適合宿主細胞中之重組表現載體上所攜帶的基因之轉錄及轉譯而產生的蛋白質。重組蛋白可為抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體或完全人類抗體。重組蛋白可為選自由以下組成之群的同型之抗體：IgG、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。抗體分子可為全長抗體(例如IgG1)，或可替代地，抗體可為片段(例如Fc片段或Fab片段)。
如本文所用，術語「抗體」包括包括藉由二硫鍵互連之四條多肽鏈(兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子，以及其多聚體(例如，IgM)。各重鏈包括重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個域，亦即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包括輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個域(CL1)。VH及VL區可進一步細分為稱為互補決定區(CDR)之高變區，其中散佈有稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸共通序列可基於兩個或更多個CDR之並列分析定義。如本文所用，術語「抗體」亦包括完整抗體分子之抗原結合片段。
如本文所用，抗體之術語「抗原結合部分」、抗體之術語「抗原結合片段」及其類似術語包括特異性結合抗原以形成複合物的任何天然存在、以酶方式可獲得、合成或經基因工程改造之多肽或醣蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術衍生自例如完整抗體分子，該等技術諸如蛋白水解消化或涉及編碼抗體可變域及視情況恆定域之DNA之操縱及表現的重組基因工程改造技術。此類DNA為已知的及/或可自例如商業來源、DNA庫(包括例如噬菌體-抗體庫)容易地獲得，或可合成。DNA可以化學方式或藉由使用分子生物學技術定序及操縱，例如將一個或多個可變域及/或恆定域排列成適合組態，或引入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、添加或缺失胺基酸等。
如本文所用，「抗體片段」包括完整抗體之一部分，諸如抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括但不限於：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv雙功能抗體、dAb片段、Fd'片段、Fd片段及經分離之互補決定區(CDR)，以及三功能抗體、四功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。Fv片段為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區之組合，且ScFv蛋白質為其中免疫球蛋白輕鏈及重鏈可變區藉由肽連接子連接的重組單鏈多肽分子。抗體片段可包括親本抗體之足夠胺基酸序列，其為與親本抗體結合相同抗原之片段；且片段可以與親本抗體之親和力相當的親和力結合於抗原及/或與親本抗體競爭結合於抗原。抗體片段可藉由任何手段產生。舉例而言，抗體片段可藉由完整抗體之片段化來酶促或化學產生及/或其可以重組方式由編碼部分抗體序列之基因產生。或者或另外，抗體片段可完全或部分以合成方式產生。抗體片段可視情況包括單鏈抗體片段。或者或另外，抗體片段可包括多個例如藉由二硫鍵連接在一起之鏈。抗體片段可視情況包括多分子複合物。功能性抗體片段通常包括至少約50個胺基酸且更通常包括至少約200個胺基酸。
術語「雙特異性抗體」包括能夠選擇性結合兩個或更多個抗原決定基之抗體。雙特異性抗體一般包括兩條不同重鏈，其中各重鏈特異性結合在兩個不同分子(例如抗原)上或在同一分子(例如在同一抗原)上的不同的抗原決定基。若雙特異性抗體能夠選擇性結合兩個不同抗原決定基(第一抗原決定基及第二抗原決定基)，則第一重鏈對第一抗原決定基之親和力一般將比第一重鏈對第二抗原決定基之親和力低至少一個至兩個或三個或四個數量級，且反之亦然。由雙特異性抗體識別之抗原決定基可在相同或不同目標上(例如在相同或不同蛋白質上)。雙特異性抗體可例如藉由組合識別同一抗原之不同抗原決定基的重鏈來製得。舉例而言，編碼識別同一抗原之不同抗原決定基之重鏈可變序列的核酸序列可與編碼不同重鏈恆定區之核酸序列融合，且此類序列可在表現免疫球蛋白輕鏈之細胞中表現。
典型雙特異性抗體具有：兩條重鏈，其各自具有三個重鏈CDR，隨後為CH1域、鉸鏈、CH2域及CH3域；及免疫球蛋白輕鏈，其不賦予抗原結合特異性但可與各重鏈締合，或可與各重鏈締合且可結合重鏈抗原結合區所結合的一個或多個抗原決定基，或可與各重鏈締合且使得一條或兩條重鏈能夠與一個或兩個抗原決定基結合。bsAb可分為兩種主要類別，亦即帶有Fc區(IgG樣)之類別及缺乏Fc區之類別，後者通常小於包括Fc之IgG及IgG樣雙特異性分子。IgG樣bsAb可具有不同形式，諸如但不限於三功能單抗、杵臼IgG(kih IgG)、互換Mab、正交Fab IgG、雙可變域Ig(DVD-Ig)、二合一或雙作用Fab(DAF)、IgG-單鏈Fv(IgG-scFv)或κλ體。非IgG樣不同形式包括串聯scFv、雙功能抗體形式、單鏈雙功能抗體、串聯雙功能抗體(TandAb)、雙重親和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、奈米抗體或由對接鎖定(dock-and-lock，DNL)方法產生之抗體(Gaowei Fan, Zujian Wang及Mingju Hao, Bispecific antibodies and their applications, 8 JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY 130；Dafne Müller及Roland E. Kontermann, Bispecific Antibodies, HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES 265-310 (2014)。產生bsAb的方法不限於基於兩種不同融合瘤細胞株的體細胞融合的四融合瘤(quadroma)技術、涉及化學交聯劑的化學結合及利用重組DNA技術的基因方法。bsAb之實例包括以下專利申請案中所揭示之bsAb：美國第12/823838號，2010年6月25日申請；美國第13/488628號，2012年6月5日申請；美國第14/031075號，2013年9月19日申請；美國第14/808171號，2015年7月24日申請；美國第15/713574號，2017年9月22日申請；美國第15/713569號，2017年9月22日申請；美國第15/386453號，2016年12月21日申請；美國第15/386443號，2016年12月21日申請；美國第15/22343號，2016年7月29日申請；及美國第15814095號，2017年11月15日申請。
雙特異性抗體可藉由在細胞中(例如活體外以重組方式或透過體內基因療法)表現對第一抗原決定基具有特異性之第一重鏈與對第二抗原決定基具有特異性之第二重鏈來產生。由於抗體含有兩條重鏈，因此細胞將產生至少三種形式之抗體：具有兩條相同第一重鏈的對第一抗原決定基具有特異性之同二聚體(亦稱為同質B)、具有兩條相同第二重鏈的對第二抗原決定基具有特異性之同二聚體(亦稱為同質A)及對兩種抗原決定基具有特異性且具有第一重鏈與第二重鏈之異二聚體(亦稱為異質AB)。在一些情況下，同二聚體及異二聚體之生物物理學屬性(例如質量、等電點、胺基酸含量及其類似者)足夠類似，使得難以對各物種進行特異性鑑別及定量。本發明提供用於表徵來自產生雙特異性抗體之細胞的正確配對產物及錯配產物的方法。
如本文所用，「多特異性抗體」係指對至少兩種不同抗原具有結合特異性之抗體。雖然此類分子通常僅結合兩種抗原(亦即，雙特異性抗體bsAb)，但亦可藉由本文所揭示之系統及方法解決具有額外特異性之抗體，諸如三特異性抗體及KIH三特異性抗體。
如本文所用，術語「單株抗體」不限於透過融合瘤技術產生之抗體。單株抗體可藉由此項技術中可用或已知之任何方式衍生自單一純系，包括任何真核、原核或噬菌體純系。適用於本發明之單株抗體可使用此項技術中已知之多種技術製備，包括使用融合瘤、重組、噬菌體顯示技術、基因療法或其組合。
如本文所用，術語「多聚體」以及片語「多聚體蛋白質」及「多次單元蛋白質」可互換使用以表示由多於一種組分次單元構成之蛋白質。次單元可結合在一起或以其他方式締合以形成多聚體。結合或締合可經由任何一個或多個分子間鍵，包括共價及非共價鍵。「同二聚體」為包括兩個或更多個相同或功能上等效之次單元的多聚體。如本文所用，同二聚體包括至少兩條相同或功能上等效之多肽鏈，但同二聚體亦可包括額外次單元。舉例而言，單株抗體含有兩條相同重鏈。因此，單株抗體可被視為「同二聚體」。然而，完整典型單株抗體亦含有兩條輕鏈且因此可稱為四聚體。「異二聚體」為包括兩個或更多個不相同或功能上不等效之次單元的多聚體。除兩個不同次單元之外，異二聚體亦可含有額外次單元。舉例而言，雙特異性抗體含有兩條重鏈及兩條輕鏈，使得抗體之一半(例如一條重鏈及一條輕鏈)結合一種抗原決定基，且抗體之另一半(例如另一重鏈及同一輕鏈、同一重鏈及另一輕鏈或另一輕鏈及另一重鏈)特異性結合於另一抗原決定基。雙特異性抗體為四聚體。在一些情況下，雙特異性抗體稱為異二聚體，因為該術語係關於不相同或功能上不等效之重鏈。
如本文所用，術語「次單元」或「組分次單元」意謂多聚體，通常(但並非總是)多肽之組分。組分多肽為單鏈且可為三個胺基酸至數千個胺基酸長之任何尺寸。
所關注蛋白質可由哺乳動物細胞產生。哺乳動物細胞可為人類來源或非人類來源的，可包括初代上皮細胞(例如角質細胞、子宮頸上皮細胞、支氣管上皮細胞、氣管上皮細胞、腎上皮細胞及視網膜上皮細胞)，確立細胞株及其株系(例如HEK293胚胎腎細胞、BHK細胞、HeLa子宮頸上皮細胞及PER-C6視網膜細胞、MDBK(NBL-1)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、CHO細胞、BeWo細胞、Chang細胞、Detroit 562細胞、HeLa 229細胞、HeLa S3細胞、Hep-2細胞、KB細胞、LSI80細胞、LS174T細胞、NCI-H-548細胞、RPMI2650細胞、SW-13細胞、T24細胞、WI-28 VA13、2RA細胞、WISH細胞、BS-C-I細胞、LLC-MK2細胞、純系M-3細胞、1-10細胞、RAG細胞、TCMK-1細胞、Y-l細胞、LLC-PKi細胞、PK(15)細胞、GHi細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC 256細胞、MHiCi細胞、XC細胞、MDOK細胞、VSW細胞及TH-I、B1細胞、BSC-1細胞、RAf細胞、RK細胞、PK-15細胞或其衍生物)，來自任何組織或器官(包括但不限於心、肝、腎、結腸、腸、食道、胃、神經組織(腦、脊髓)、肺、血管組織(動脈、靜脈、毛細管)、淋巴組織(淋巴腺、腺樣增殖體、扁桃體、骨髓及血液)、脾，及纖維母細胞及纖維母細胞樣細胞株之纖維母細胞(例如CHO細胞、TRG-2細胞、IMR-33細胞、Don細胞、GHK-21細胞、瓜胺酸血症細胞、Dempsey細胞、Detroit 551細胞、Detroit 510細胞、Detroit 525細胞、Detroit 529細胞、Detroit 532細胞、Detroit 539細胞、Detroit 548細胞、Detroit 573細胞、HEL 299細胞、IMR-90細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、WI-26細胞、Midi細胞、CHO細胞、CV-1細胞、COS-1細胞、COS-3細胞、COS-7細胞、Vero細胞、DBS-FrhL-2細胞、BALB/3T3細胞、F9細胞、SV-T2細胞、M-MSV-BALB/3T3細胞、K-BALB細胞、BLO-11細胞、NOR-10細胞、C3H/IOTI/2細胞、HSDMiC3細胞、KLN205細胞、McCoy細胞、小鼠L細胞、株系2071(小鼠L)細胞、L-M株系(小鼠L)細胞、L-MTK'(小鼠L)細胞、NCTC純系2472及2555、SCC-PSA1細胞、Swiss/3T3細胞、印度麂細胞、SIRC細胞、Cn細胞及Jensen細胞、Sp2/0、NS0、NS1細胞或其衍生物)。
包括所關注蛋白質之樣品可在增濃步驟、分離步驟及/或分析步驟之前或之後製備。製備步驟可包括烷基化、還原、變性及/或消化。
如本文所用，術語「蛋白質烷基化劑」係指用於使蛋白質中之某些游離胺基酸殘基烷基化的試劑。蛋白質烷基化劑之非限制性實例為碘乙醯胺(IOA)、氯乙醯胺(CAA)、丙烯醯胺(AA)、N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)及4-乙烯吡啶或其組合。
如本文所用，「蛋白質變性」可指分子之三維形狀自其天然狀態改變的過程。蛋白質變性可使用蛋白質變性因子進行。蛋白質變性因子之非限制性實例包括熱、高或低pH、如DTT(參見下文)之還原劑，或暴露於離液劑。若干離液劑可用作蛋白質變性劑。離液溶質藉由干擾藉由非共價力(諸如氫鍵、凡得瓦爾力及疏水性作用)介導之分子內相互作用而增加系統之熵。離液劑之非限制性實例包括丁醇、乙醇、氯化鈲、過氯酸鋰、乙酸鋰、氯化鎂、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸鈉、硫脲、N-月桂醯基肌胺酸、脲及其鹽。
如本文所用，術語「蛋白質還原劑」係指用於還原蛋白質中二硫橋鍵的試劑。用於還原蛋白質之蛋白質還原劑之非限制性實例為二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、艾爾曼氏試劑(Ellman's reagent)、羥胺鹽酸鹽、氰基硼氫化鈉、參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP-HCl)或其組合。一種蛋白質分析之習用方法為還原肽圖譜，涉及在LC-MS分析之前進行蛋白質還原。相比之下，非還原肽圖譜省略了還原的樣品製備步驟以保留內源二硫鍵。舉例而言，可使用非還原製劑以保留抗體或抗體衍生蛋白之Fab臂之間的內源二硫鍵。舉例而言，可使用部分還原之製劑以還原抗體或抗體衍生蛋白之Fab臂之間的二硫鍵而不完全還原蛋白質。
如本文所用，術語「消化」係指蛋白質之一個或多個肽鍵的水解。存在若干使用適當水解劑對樣品中之蛋白質進行消化的方法，例如酶消化或非酶消化。
如本文所用，術語「消化酶」係指可進行蛋白質消化之大量不同試劑中之任一者。可進行酶消化之水解劑的非限制性實例包括來自齊藤氏麴菌(Aspergillus saitoi)之蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、蛋白酶XIII、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、胰凝乳蛋白酶、麴菌胃蛋白酶I、LysN蛋白酶(Lys-N)、LysC內切蛋白酶(Lys-C)、內切蛋白酶Asp-N(Asp-N)、內切蛋白酶Arg-C(Arg-C)、內切蛋白酶Glu-C(Glu-C)或外膜蛋白T(OmpT)、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)之免疫球蛋白降解酶(IdeS)、嗜熱菌蛋白酶、木瓜酶、鏈黴蛋白酶、V8蛋白酶或其生物學活性片段或同源物或其組合。關於論述蛋白質消化之可用技術的近期綜述，參見Switazar等人, 「Protein Digestion:An Overview of the Available Techniques and Recent Developments」(Linda Switzar, Martin Giera及Wilfried M. A. Niessen, Protein Digestion:An Overview of the Available Techniques and Recent Developments, 12 JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH 1067-1077 (2013))。
IdeS或其變異體可用於在鉸鏈區下方裂解抗體，產生Fc片段及Fab 2片段。分析物之消化可為有利的，因為尺寸減小可增加使用LC-MS表徵及偵測分析物之靈敏度及特異性。當用於此目的時，分離出Fc片段且保留Fab 2片段用於分析之消化可為較佳的。此係因為Fab 2片段中含有所關注可變區，諸如抗體之互補決定區(CDR)，而抗體之間的Fc片段可相對均一，且因此提供較少相關資訊。或者或另外，分離出Fab 2片段且保持Fc片段用於分析之消化可為較佳的，因為Fc片段含有所關注N-醣基化位點。
IdeS消化具有高效率，使得分析物之回收率高。消化及溶離過程可在天然條件下進行，使得可簡單地與天然LC-MS系統耦接。IdeS或其變異體係市售的且可作為例如FabRICATOR ®或FabRICATOR Z ®銷售。
如本文所用，術語「氧化性物種」、「OS」或「氧化變異體」係指藉由氧化形成之蛋白質的變異體。氧化變異體可由組胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、苯丙胺酸及/或酪胺酸殘基處發生之氧化產生。
如本文所用，「樣品」可獲自生物製程之任何步驟，諸如細胞培養液(CCF)、所收穫之細胞培養液(HCCF)、下游處理中之任何步驟、藥物物質(DS)或包括最終調配產物之藥品(DP)。樣品可選自澄清、層析生產、病毒滅活或過濾之下游製程之任何步驟。藥品可選自臨床、運送、儲存或處理中之製造藥品。
樣品為生物樣品。如本文所用，術語「生物樣品」係指取自活生物體，例如人類或非人類哺乳動物之樣品。生物樣品可包括例如全血、血漿、血清、唾液、淚液、精液、臉頰組織、器官組織、尿液、糞便、皮膚或毛髮或由其組成。樣品可取自患者，例如臨床樣品。樣品可取自非人類動物，例如臨床前樣品。樣品可取自進行基因療法之非人類動物，以便產生可包括於樣品中之至少一種所關注蛋白質。樣品為任何前述樣品實例之進一步處理形式。
如本文所用，術語「雜質」可包括存在於蛋白質樣品或蛋白質生物醫藥產品中之任何非所要的蛋白質。雜質可包括製程及產物相關雜質。雜質可進一步具有已知結構、經部分表徵或未經鑑別。製程相關雜質可來源於製造製程且可包括三大類別：來源於細胞基質、來源於細胞培養物及來源於下游。來源於細胞基質之雜質包括但不限於來源於宿主生物體及核酸(宿主細胞基因體、載體或總DNA)之蛋白質。來源於細胞培養物之雜質包括但不限於誘導劑、抗生素、血清及其他培養基組分。來源於下游之雜質包括但不限於酶、化學及生化處理試劑(例如溴化氰、胍、氧化劑及還原劑)、無機鹽(例如重金屬、砷、非金屬離子)、溶劑、載劑、配位體(例如單株抗體)及其他瀝濾物。
產物相關雜質(例如前驅體、某些降解產物)可為在製造及/或儲存期間產生之分子變異體，就活性、功效及安全性而言，其不具有與所需產物之特性相當的特性。此類變異體可能需要在分離及表徵方面付出相當大的努力以鑑別修飾類型。產物相關雜質可包括截短形式、經修飾形式及聚集體。截短形式係藉由水解酶或催化肽鍵裂解之化學品形成。經修飾形式包括但不限於去醯胺、異構化、失配S-S連接、氧化或改變之結合形式(例如醣基化、磷酸化)。經修飾形式亦可包括任何轉譯後修飾形式。聚集體包括所需產物之二聚體及更高倍數。(Q6B Specifications:Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, ICH 1999年8月, 美國衛生及公共服務部)。
在諸如抗體之多次單元蛋白質的產生中，次單元之間的錯配可形成可視為樣品中之雜質的替代抗體。舉例而言，細胞中兩種或更多種單特異性抗體之共表現可導致不同重鏈及輕鏈之間的錯配，從而導致產生不正確配對之抗體雜質。包括兩條不同重鏈之雙特異性抗體的表現可導致產生不正確配對之單特異性同二聚體雜質。由於具有類似尺寸、電荷、序列及/或結構，包括所需多次單元蛋白質之次單元之雜質與所需蛋白質的分離可能尤其具有挑戰性。
用於表徵及/或定量所關注蛋白質之方法可視情況包括使用免疫沉澱(IP)增濃樣品基質中之所關注蛋白質。如本文所用，術語「免疫沉澱」可包括使用特異性結合於特定蛋白質之抗體自溶液中沉澱出蛋白質抗原的過程。免疫沉澱可為直接的，其中將針對目標蛋白之抗體固定於固相基質上，或可為間接的，其中將游離抗體添加至蛋白質混合物中且隨後用例如蛋白A/G珠粒捕獲。IP可在天然或接近天然條件下進行，使得實質上保留一種或多種所關注蛋白質之天然結構；例如所關注抗體或抗體衍生蛋白之重鏈及輕鏈配對。
固相基質可為珠粒，例如瓊脂糖珠粒或磁性珠粒。珠粒可塗佈有鏈黴抗生物素蛋白以促進與抗體之黏附。接著可使經生物素標記之「捕獲」抗體與經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之珠粒接觸，黏附於珠粒且形成能夠結合於所黏附抗體之抗原的「免疫沉澱珠粒」。所黏附之捕獲抗體可為抗Fc抗體，且可特定地為抗人類Fc抗體。
抗人類Fc抗體將優先結合於任何人類抗體(諸如治療性抗體)之Fc域，且因此可用於自樣品中免疫沉澱或「拉下」治療性抗體，使得其經增濃以供分析。在治療性抗體之免疫沉澱之後，可使消化酶與免疫沉澱混合物接觸以裂解治療性抗體且釋放抗體片段，接著可將該等抗體片段溶離以供進一步分析。舉例而言，IdeS或其變異體用作消化酶。IdeS裂解產生兩個抗體片段：Fc片段及Fab 2片段。當治療性抗體之Fc域結合於抗人類Fc捕獲抗體時，用IdeS裂解將引起未結合之Fab 2片段的釋放，接著可將該片段溶離以供進一步分析。舉例而言，對經溶離Fab 2片段進行液相層析-質譜法分析。LC-MS分析可為天然SEC-MS或天然SCX-MS。或者或另外，可將結合於抗人類Fc捕獲抗體之Fc域溶離以供進一步分析。舉例而言，對經溶離Fc片段進行液相層析-質譜法分析。LC-MS分析可為天然SEC-MS或天然SCX-MS。
如本文所用，術語「液相層析」係指其中由液體攜載之生物/化學混合物可由於組分之差異分佈而在其流過(或流入)固定液相或固相時分離成各組分的過程。液相層析之非限制性實例包括逆相(RP)液相層析、離子交換(IEX)層析、粒徑排阻層析(SEC)、親和層析、疏水相互作用層析(HIC)、親水相互作用層析(HILIC)或混合模式層析(MMC)。
用於表徵及/或定量所關注蛋白質之方法可包括使用強陽離子交換(SCX)層析。陽離子交換層析為離子交換層析之子集，其用途呈現帶負電官能基之固定相以便捕獲帶正電分析物。可逐漸調節層析緩衝液之pH以便按pI次序釋放及溶離分析物。
陽離子交換層析使用「陽離子交換層析材料」。視所採用之陽離子交換層析材料而定，陽離子交換層析可進一步細分為例如強陽離子交換(SCX)或弱陽離子交換。具有磺酸基(S)之陽離子交換層析材料可用於強陽離子交換劑，而具有羧甲基(CM)之陽離子交換層析材料可用於弱陽離子交換劑。強陽離子交換劑包括例如使用硫酸甲酯官能基之SOURCE S，及使用磺丙基官能基之SP瓊脂糖凝膠。弱陽離子交換劑包括例如使用羧甲基官能基之CM-纖維素。SCX可為較佳的，因為可使用較寬範圍之pH緩衝液而不損失強陽離子交換劑之電荷，使得可有效分離具有寬pI範圍之分析物。
陽離子交換層析材料可以不同名稱自眾多公司獲得，諸如Bio-Rex、Macro-Prep CM(可購自BioRad Laboratories, Hercules, Calif., USA)；弱陽離子交換劑WCX 2(可購自Ciphergen, Fremont, Calif., USA)；Dowex MAC-3(可購自Dow chemical company, Midland, Mich., USA)；Mustang C(可購自Pall Corporation, East Hills, N.Y., USA)；纖維素CM-23、CM-32、CM-52、hyper-D及partisphere(可購自Whatman plc, Brentford, UK)；Amberlite IRC 76、IRC 747、IRC 748、GT 73(可購自Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Germany)；CM 1500、CM 3000(可購自BioChrom Labs, Terre Haute, Ind., USA)；以及快流速CM-瓊脂糖凝膠(可購自GE Healthcare, Life Sciences, Germany)。另外，市售陽離子交換樹脂進一步包括羧甲基纖維素、Bakerbond ABX、固定於瓊脂糖上之磺丙基(SP)(例如可購自GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany之快流速SP-瓊脂糖凝膠或高效能SP-瓊脂糖凝膠)及固定於瓊脂糖上之磺醯基(例如可購自GE Healthcare, Life Sciences, Germany之快流速S-瓊脂糖凝膠)。
陽離子交換層析材料包括執行離子交換及疏水相互作用技術之組合的混合模式層析材料(例如Capto adhere、Capto MMC、MEP HyperCell、Eshmuno HCX等)、執行陰離子交換及陽離子交換技術之組合的混合模式層析材料(例如羥基磷灰石、陶瓷羥基磷灰石等)及其類似物。可用於本發明中之陽離子交換層析的陽離子交換層析材料可包括但不限於上文所描述之所有市售陽離子交換層析材料。
雖然變性RPLC-MS為表徵治療性蛋白質之習知技術，但天然SCX-MS可提供本文所描述之分析優勢。舉例而言，天然SCX-MS可提供改善的偵測靈敏度及特異性。在RPLC及SCX之偵測極限相當的情況下，SCX可提供優良資料品質及較高信雜比。SCX可具有改善的將目標分析物與基質蛋白(例如血清樣品中之血清蛋白)分離的能力，且另外可具有改善的分離所關注蛋白質之生物轉化產物的能力。天然SCX-MS分析之例示性方法描述於Yan等人 ,2020, J Am Soc Mass Spectrom, 31:2171-2179中。
舉例而言，SCX-MS條件如下。SCX管柱為YMC BioPro IEX SF 4.6×50 mm，5 µm。管柱溫度為45℃。移動相A(MPA)包括10 mM乙酸銨，且移動相B(MPB)包括300 mM乙酸銨。流動速率為0.4毫升/分鐘。梯度為：0-1分鐘：100% MPA；1-9分鐘：100% MPA至100% MPB；9-10.5分鐘：100% MPB；10.5-10.6分鐘：100% MPB至100% MPA；及10.6-15分鐘：100% MPA。MS解析度設定為12,500(UHMR)。毛細管噴灑電壓設定為3.0 kV。毛細管溫度設定為350℃。S透鏡RF位準設定為200。源內斷裂能量設定為100。HCD捕獲氣體壓力設定為3。利用2000與15,000之間的m/z範圍窗獲取質譜。
本發明之方法包括使用粒徑排阻層析。粒徑排阻層析或凝膠過濾依賴於組分隨其分子尺寸而變的分離。分離視與流體中之時間相比，物質在多孔固定相中耗費的時間量而定。分子將停留於孔隙中的機率視分子及孔隙之尺寸而定。另外，物質滲透至孔隙中之能力係由巨分子之擴散遷移率決定，對於較小巨分子而言擴散遷移率較高。極大巨分子根本不可能滲透固定相之孔隙，且對於極小巨分子而言，滲透機率接近一。雖然具有較大分子尺寸之組分更快速移動通過固定相，但具有小分子尺寸之組分通過固定相之孔隙的路徑長度較長且因此在固定相中保留較長時間。
層析材料可包括粒徑排阻材料，其中粒徑排阻材料為樹脂或膜。用於粒徑排阻之基質較佳地為惰性凝膠介質，其可為交聯多醣之複合物，例如呈球形珠粒形式之交聯瓊脂糖及/或聚葡萄糖。交聯程度決定膨脹凝膠珠粒中存在之孔隙的尺寸。大於某一尺寸之分子不會進入凝膠珠粒，因此最快地移動通過層析床。視尺寸與形狀而不同程度地進入凝膠珠粒的較小分子(諸如清潔劑、蛋白質、DNA及其類似物)在其通過床時經遲延。因此，分子一般以分子尺寸漸減之次序溶離。
適合於病毒之粒徑排阻層析的多孔層析樹脂可由具有不同物理特徵之右旋糖、瓊脂糖、聚丙烯醯胺或二氧化矽製成。亦可使用聚合物組合。最常用的係可購自Amersham Biosciences之商品名為「SEPHADEX」之聚合物組合。來自不同構築材料的其他粒徑排阻載體亦為適合的，例如Toyopearl 55F(聚甲基丙烯酸酯，來自Tosoh Bioscience, Montgomery Pa.)及Bio-Gel P-30 Fine(BioRad Laboratories, Hercules, Calif.)。
用於自粒徑排阻層析獲得溶離液之移動相可包括揮發性鹽。移動相可包括乙酸銨、碳酸氫銨或甲酸銨或其組合。
在接近天然條件下SEC與直接MS偵測之線上耦接(天然SEC-MS)在過去數年內對於研究mAb HMW物種獲得大量關注(Rouby等人, 前述；Ehkirch A, Hernandez-Alba O, Colas O, Beck A, Guillarme D, Cianferani S.  Hyphenation of size exclusion chromatography to native ion mobility mass spectrometry for the analytical characterization of therapeutic antibodies and related products.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2018:1086 (176-183)；Haberger M, Leiss M, Heidenreich AK, Pester O, Hafenmair G, Hook M, Bonnington L, Wegele H, Haindl M, Reusch D等人. Rapid characterization of biotherapeutic proteins by size-exclusion chromatography coupled to native mass spectrometry.MAbs 2016:8(2):331-339。使用可保留蛋白質構形及非共價相互作用之MS相容性移動相，天然SEC-MS(nSEC-MS)可基於精確質量量測提供尺寸變異體之快速且改良的鑑別。
如本文所用，術語「質譜儀」包括能夠鑑別特定分子物種及量測其精確質量的裝置。該術語意欲包括其中可表徵多肽或肽之任何分子偵測器。質譜儀可包括三個主要部分：離子源、質量分析器及偵測器。離子源之作用為產生氣相離子。分析物原子、分子或團簇可轉移至氣相中且同時(如在電灑游離中)或經由分開的過程離子化。離子源之選擇取決於應用。
質譜儀可為串聯質譜儀。如本文所用，術語「串聯質譜法」包括藉由使用多階段質量選擇及質量分離來獲得關於樣品分子之結構資訊的技術。前提條件為樣品分子轉變成氣相且經離子化，以使得在第一質量選擇步驟之後以可預測及可控制方式形成碎片。多階MS/MS或MS n可藉由首先選擇及分離前驅離子(MS 2)，將其碎片化，分離初級碎片離子(MS 3)，將其碎片化，分離二級碎片(MS 4)等來進行，只要吾人可獲得有意義的資訊或碎片離子信號可偵測即可。已經成功用廣泛多種分析器組合進行串聯MS。針對某一應用組合哪些分析器可藉由許多不同因素決定，諸如靈敏度、選擇性及速度，以及尺寸、成本及可用性。串聯MS方法之兩個主要類別為空間串聯及時間串聯，但亦存在其中時間串聯分析器在空間中或與空間串聯分析器耦接的混合體。空間串聯質譜儀包括離子源、前驅離子活化裝置及至少兩個非捕獲質量分析器。特定m/z分離功能可經設計以使得在儀器之一個部分中選擇離子，在中間區中解離，且產物離子隨後經傳輸至另一分析器以進行m/z分離及資料獲取。在時間串聯中，離子源中產生之質譜儀離子可在同一實體裝置中截留、分離、碎片化及m/z分離。藉由質譜儀鑑別之肽可用作完整蛋白質及其轉譯後修飾之替代物代表。其可藉由使實驗及理論MS/MS資料關聯來用於蛋白質表徵，後一資料係由蛋白質序列資料庫中之可能肽產生。表徵包括但不限於定序蛋白質片段之胺基酸、確定蛋白質定序、確定蛋白質從頭定序、定位轉譯後修飾或鑑別轉譯後修飾或可比較性分析或其組合。
如本文所用，術語「質量分析器」包括可根據物種(亦即，原子、分子或團簇)之質量分離物種的裝置。可採用之質量分析器的非限制性實例為飛行時間(TOF)、扇形磁場電場、四極質量過濾器(Q)、四極離子阱(QIT)、orbitrap、傅立葉變換離子迴旋共振(FTICR)以及加速器質譜法(AMS)技術。
在一些例示性範疇中，質譜儀可用於奈米電灑或奈米噴灑。如本文所用，術語「奈米電灑」或「奈米噴灑」係指在極低溶劑流動速率(通常數百奈升/分鐘之樣品溶液或更低)下電灑游離，通常不使用外部溶劑遞送。形成奈米電灑的電灑輸注設備可使用靜態奈米電灑發射器或動態奈米電灑發射器。靜態奈米電灑發射器在延長時段內進行小樣品(分析物)溶液體積之連續分析。在藉由質譜儀分析之前，動態奈米電灑發射器使用毛細管管柱及溶劑遞送系統對混合物進行層析分離。
質譜儀可耦接至液相層析-多反應監測系統。更一般而言，質譜儀可能能夠藉由選擇反應監測(SRM)進行分析，包括連續反應監測(CRM)及平行反應監測(PRM)。
如本文所用，「多反應監測」或「MRM」係指可以高靈敏度、特異性及寬動態範圍精確定量複雜基質內之小分子、肽及蛋白質的基於質譜法之技術(Paola Picotti及Ruedi Aebersold, Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions, 9 NATURE METHODS 555-566 (2012))。MRM通常可用三重四極質譜儀進行，其中在第一個四極中選擇對應於所選小分子/肽之前驅離子，且在第三個四極中選擇前驅離子之碎片離子用於監測(Yong Seok Choi等人, Targeted human cerebrospinal fluid proteomics for the validation of multiple Alzheimers disease biomarker candidates, 930 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 129-135 (2013))。
LC-MS，諸如SCX-MS或SEC-MS可在天然條件下進行。如本文所用，術語「天然條件」可包括在保留分析物中之非共價相互作用的條件下進行質譜法。天然質譜法係在天然或接近天然狀態下研究完整生物分子結構之方法。術語「天然」係指溶液中之分析物在進行離子化之前的生物狀態。可控制含有生物分析物之溶液的若干參數，諸如pH及離子強度，以維持溶液中生物分析物之天然摺疊狀態。通常，天然質譜法係基於電灑游離，其中生物分析物自非變性溶劑噴灑。其他術語，諸如非共價、天然噴灑、電灑游離、非變性、巨分子或超分子質譜法亦可描述天然質譜法。與非天然MS相比，天然MS具有更佳的空間解析度，從而改善治療性蛋白質之生物轉化產物的偵測。關於天然MS之詳細綜述，參考以下綜述：Elisabetta Boeri Erba及Carlo Pe-tosa, The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes, 24 PROTEIN SCIENCE 1176-1192 (2015)。
如本文所用，術語「資料庫」係指可能存在於樣品中之蛋白質序列之匯集集合，例如呈FASTA格式之檔案形式。相關蛋白質序列可來源於所研究之物種之cDNA序列。可用以搜尋相關蛋白質序列之公共資料庫包括由例如Uniprot或Swiss-prot代管之資料庫。資料庫可使用本文中稱為「生物資訊學工具」之工具搜尋。生物資訊學工具提供相對於資料庫中之所有可能序列搜尋未解譯MS/MS譜之能力，且提供經解譯(標註)MS/MS譜作為輸出。此類工具之非限制性實例為Mascot(www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(www.chem.agilent.com)、PLGS(www.waters.com)、PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(www.sagenresearch.com)、OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X!Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(fields.scripps.edu/sequest)。
應理解，本發明不限於任何前述蛋白質、抗體、單株抗體、雙特異性抗體、蛋白質表現系統、多次單元蛋白質、蛋白質烷基化劑、蛋白質變性劑、蛋白質還原劑、消化酶、水解劑、樣品、固相基質、捕獲抗體、液相層析系統、移動相、質譜儀、資料庫或生物資訊學工具，且任何蛋白質、抗體、單株抗體、雙特異性抗體、蛋白質表現系統、多次單元蛋白質、蛋白質烷基化劑、蛋白質變性劑、蛋白質還原劑、消化酶、水解劑、樣品、固相基質、捕獲抗體、液相層析系統、移動相、質譜儀、資料庫或生物資訊學工具可藉由任何適合手段來選擇。
參考以下實例將更充分地理解本發明。然而，其不應視為限制本發明之範圍。 實例 實例 1. 用於蛋白質表徵之天然 IP 及天然 LC-MS 工作流程
基於天然免疫沉澱(IP)，接著進行天然液相層析-質譜法(nLC-MS)，開發出用於所關注治療性蛋白質的基於質譜法之表徵的方法。包括兩種共表現之治療性單株抗體(mAb)的樣品展示於圖1中。
在Agilent AssayMap Bravo平台上使用抗人類Fc抗體進行免疫沉澱，以進行免疫捕獲。使用筒柱上FabRICATOR(IdeS)消化自所捕獲之mAb釋放Fab 2域。自體內表現mAb1及/或mAb2之小鼠血清取得樣品。使用三種不同的小鼠體內基因遞送平台(平台I、平台II及平台III)。
對自天然免疫沉澱溶離之Fab 2片段使用天然粒徑排阻層析-紫外偵測/質譜法(nSEC-UV/MS)分析，以確定體內產生之mAb1及mAb2之胺基酸序列的變化，如圖2A中所示。在使用基因遞送平台I產生之mAb的N端偵測到額外「EAP」序列。在使用基因遞送平台II及III產生之mAb中未偵測到額外胺基酸。藉由SEC-MS量測之所有小鼠樣品中Fab 2之平均質量的概述展示於圖2B中。
此實例證明，包括複雜基質之樣品中的一種或多種所關注蛋白質(例如體內共表現且自血清獲得之單株抗體)可使用包括天然免疫沉澱、消化以形成次單元片段及天然粒徑排阻層析-紫外偵測/質譜法的方法來有效表徵。 實例 2. 使用 nSCX-MS 分離錯配 Fab 產物
多次單元蛋白質之表現可導致產生不合需要之產物或雜質，其包括失配或錯配次單元。舉例而言，具有不同重鏈(HC)及輕鏈(LC)序列之兩種mAb的共表現可引起至多10種不同HC-LC對之產生，其中兩種代表所需mAb且其中八種代表錯配雜質。所需mAb1及mAb2產物以及潛在錯配產物之Fab 2片段的理論質量展示於圖3A中。mAb1及mAb2重鏈之質量差異為3 Da，且因此錯配Fab 2產物亦具有彼此類似之質量。亦考慮氧化對產物質量之影響，因為mAb1 Fd具有氧化熱點。
圖3B展示來自天然IP之共表現mAb1及mAb2(「混合物」)Fab 2片段之nSEC-UV/MS分析的實例。在所有混合物樣品中鑑別出錯配產物，但無法使用nSEC-MS方法確信地區分及定量。由於mAb1 Fd與mAb2 Fd之間的質量差異小，因此僅藉由質量分離時，不同錯配產物無法完全與正確配對之產物區分或在其自身之間區分。
為了解決此問題，首先使用天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)來分離Fab片段。用DTT處理自天然免疫沉澱溶離之Fab 2樣品以產生Fab片段，且對所得Fab片段進行nSCX-MS分析，如圖4中所示。可利用nSCX-MS確信地分離Fab層級之不同HC-LC配對產物，表明相同方法可潛在地適用於分離不同配對之Fab 2物種。
使用nSCX-MS分析來自使用三種基因遞送平台中之各者產生的mAb1及mAb2混合物之Fab片段，如圖5A中所示及圖5B中所定量。在使用平台I產生之混合物中偵測到高豐度的mAb1及mAb2之正確HC-LC配對。在使用平台II產生之混合物中偵測到高豐度的正確mAb1 HC-LC配對，但使用此平台之正確mAb2 HC-LC配對較低。在使用平台III產生之混合物中偵測到低豐度的正確mAb1 HC-LC配對及mAb2 HC-LC配對。
此實例證明，包括複雜基質之樣品中的一種或多種所關注蛋白質(例如體內共表現且自血清獲得之單株抗體)可使用包括天然免疫沉澱、消化以形成次單元片段及天然強陽離子交換層析-質譜法的方法來有效表徵。特定言之，nSCX-MS能夠自抗體混合物中清楚地鑑別及定量正確配對及錯配Fab片段，且藉此比較使用不同基因療法平台及/或表現平台產生之抗體的配對分佈。 實例 3. 使用 nSCX-MS 分離錯配 Fab 2 產物
使用在nSCX分析中觀測到的Fab物種之溶離次序，預測對應的Fab 2物種之溶離次序，如圖6中所繪示。根據各Fab 2物種之預測溶離次序，使用nSCX-MS分析來表徵自使用三種基因遞送平台中之各者產生之mAb1及mAb2混合物之天然免疫沉澱溶離的Fab2片段之HC-LC配對，如圖7A至圖7F中所展示。使用萃取離子層析圖(XIC)產生含有不同LC組合之物種的溶離概況。基於SCX滯留時間及質量，可確信地將正確配對產物與錯配產物區分開。
自來自平台I之mAb1及mAb2混合物之天然免疫沉澱溶離的Fab 2片段之HC-LC配對的nSCX-MS分析展示於圖7A中。圖7B展示對應的去卷積質譜。在使用平台I產生之混合物偵測到高豐度之正確配對mAb1及mAb2。使用平台I產生之混合物中偵測到的錯配產物可分成四組，包括峰2、3、4及5，後兩者各自含有兩種可能錯配產物。
自來自平台II之mAb1及mAb2混合物之天然免疫沉澱溶離的Fab 2片段之HC-LC配對的nSCX-MS分析展示於圖7C中。圖7D展示對應的去卷積質譜。在使用平台II產生之混合物中偵測到低豐度之正確配對mAb1。在使用平台II產生之混合物中偵測到高豐度之正確配對mAb2。使用平台II產生之混合物中偵測到的錯配產物可分成四組，包括峰2、3、4及5，後兩者各自含有兩種可能錯配產物。
自來自平台III之mAb1及mAb2混合物之天然免疫沉澱溶離的Fab 2片段之HC-LC配對的nSCX-MS分析展示於圖7E中。圖7F展示對應的去卷積質譜。在使用平台III產生之混合物中偵測到低豐度之正確配對mAb1。在使用平台III產生之混合物中未偵測到正確配對mAb2。使用平台III產生之混合物中偵測到的錯配產物可分成五組，包括峰2、3、4、5及7，後三者各自含有兩種可能錯配產物。
由各平台產生之混合物之Fab 2配對分析的基於質譜法之定量展示於圖8A及圖8B中。使用平台I產生之混合物含有高水平之正確配對mAb1(約30%)及正確配對mAb2(約45%)。使用平台II產生之混合物含有極低水平之正確配對mAb1(＜2%)及高水平之正確配對mAb2(40%至45%)。使用平台III產生之混合物含有極低水平之正確配對mAb1(＜4%)，且未偵測到正確配對mAb2。
此實例證明，包括複雜基質之樣品中的一種或多種所關注蛋白質(例如體內共表現且自血清獲得之單株抗體)可使用包括天然免疫沉澱、消化以形成次單元片段及天然強陽離子交換層析-質譜法的方法來有效表徵。特定言之，nSCX-MS能夠自抗體混合物中清楚地鑑別及定量正確配對及錯配Fab 2片段，且藉此比較使用不同基因療法平台及/或表現平台產生之抗體的配對分佈。此比較可用於基於基因療法平台及/或表現平台在產生正確配對或組裝之蛋白質產物或混合物方面之有效性來最佳化及/或選擇基因療法平台及/或表現平台。此外，正確配對及錯配蛋白質產物之此鑑別及定量可用於比較兩種或更多種蛋白質產物或混合物，以確定何種產物或混合物在給定表現系統中正確配對更有效，例如在活體外使用重組宿主細胞或在體內使用基因療法。另外，此鑑別及定量可用於比較使用不同表現條件、增濃條件、純化條件或任何其他處理步驟的給定蛋白質產物或混合物之配對，以選擇或最佳化用於表徵、分析、定量、產生或純化一種或多種所關注蛋白質之方法及系統。 實例 4.Fc 聚醣之聚醣剖析
開發出用於表徵體內表現之所關注蛋白質之醣基化概況的天然IP及nLC-MS工作流程。包括兩種共表現之治療性mAb的樣品展示於圖9中。
在Agilent AssayMap Bravo平台上使用抗人類Fc抗體進行免疫沉澱，以進行免疫捕獲。使用筒柱上FabRICATOR(IdeS)消化自所捕獲之mAb釋放Fab 2域。使用Pierce溫和Ag/Ab溶離緩衝液(pH 6.6)自筒柱溶離剩餘Fc域。自體內表現mAb1及/或mAb2之小鼠血清取得樣品。使用三種不同的小鼠體內基因遞送平台(平台I、平台II及平台III)。兩種互補方法用於醣基化剖析：完整質量分析及自下而上分析。
自使用三種基因療法平台中之各者產生之mAb2溶離的Fc之完整質量分析展示於圖10中。使用nSEC-MS進行完整質量分析。使用完整質量分析鑑別之醣型在質譜上經標記。在使用三種平台中之任一者產生之mAb中，在HC之C端未發現額外胺基酸。此符合蛋白質C端K/R胺基酸通常在哺乳動物細胞培養及/或循環期間經(部分)移除之知識(J. Chrom.A, 705 (1995) 129-134；Biotechnology and Bioengineering, 108 (2011), 2, 401-412)。
使用平台I及平台II產生之mAb分子中發現的主要醣型包括G0及G1。使用平台III產生之mAb分子中發現的主要醣型包括Man5、G0F及G1F。
自mAb1及mAb2混合物之天然免疫沉澱溶離的Fc片段之自下而上分析的工作流程展示於圖11A中。對經溶離Fc片段進行胰蛋白酶消化以形成肽消化物，接著進行逆相(RP)-LC/MS分析。展示含有Fc片段之N-醣基化位點的肽。由平台I、平台II及平台III產生之混合物的Fc醣基化之自下而上分析的結果分別展示於圖11B、圖11C及圖11D中。由平台I及平台II表現之兩個樣品在Fc聚醣位點(EEQYN 300STYR)具有＞99%佔有率。G0及G1為偵測到的主要聚醣。使用平台III表現之樣品在同一Fc Asn位點上具有約72%「正常」聚醣佔有率(主要包括Man5、Man4、G0F及G1F)及約26% GlcNAc佔有率。應注意，G0-GlcNAc可為G0之源內斷裂產物之結果，且Man4可為Man5之源內斷裂產物之結果。
在圖12中比較使用完整質量分析及自下而上分析鑑別之醣型，其中自下而上分析所獨有的結果以紅色展示。完整質量分析使用mAb2樣品而非混合物樣品，但因為mAb1與mAb2之間的Fc片段相同，所以仍可在mAb2樣品與混合物樣品之間進行直接比較。比較展示，與完整質量分析相比，自下而上醣肽分析產生更一致且更詳細的Fc聚醣剖析。
此實例證明，包括複雜基質之樣品中的一種或多種所關注蛋白質(例如體內共表現且自血清獲得之單株抗體)可使用包括天然免疫沉澱、消化以形成次單元片段及完整質量分析及/或自下而上分析的方法有效表徵。特定言之，使用經溶離Fc片段之胰蛋白酶消化及RP-LC/MS分析，可獲得來自使用三種不同基因療法平台產生之抗體混合物之抗體的醣基化概況。此等醣基化概況可用於例如比較基因療法平台及/或表現平台、比較所關注蛋白質及/或比較產生或純化方法，以便選擇所關注蛋白質之最佳醣基化概況。
圖1繪示用於表徵至少一種所關注蛋白質之天然免疫沉澱及天然液相層析-質譜方法的工作流程。
圖2A展示使用三種基因療法平台產生之mAb的粒徑排阻層析(SEC)-MS層析圖及質譜。
圖2B展示藉由SEC-MS分析的使用三種基因療法平台產生之Fab 2片段的質量。
圖3A展示藉由共表現mAb1及mAb2產生之Fab 2片段的理論質量。
圖3B展示來自使用三種基因療法平台產生之mAb1及mAb2混合物之Fab 2片段的SEC-MS層析圖及質譜。
圖4展示來自使用基因療法平台產生之mAb1或mAb2 Fab片段之強陽離子交換層析(SCX)-MS分析的總離子層析圖(第1圖及第2圖)；及來自使用基因療法平台產生之共表現mAb1及mAb2混合物Fab片段之強陽離子交換層析(SCX)-MS分析的總離子層析圖(天然，第7圖)及萃取離子層析圖(具有管柱後變性，第3圖至第6圖)。
圖5A展示使用三種基因療法平台產生之mAb1及mAb2混合物Fab片段的SCX-MS分析。
圖5B展示使用三種基因療法平台產生之mAb1及mAb2混合物Fab片段之SCX-MS分析的定量。
圖6展示mAb1及mAb2混合物Fab 2片段之預測SCX溶離次序。
圖7A展示使用基因療法平台I產生之單獨表現mAb1、單獨表現mAb2及共表現mAb1/mAb2混合物Fab 2片段之SCX-MS分析。
圖7B展示來自使用基因療法平台I產生之共表現mAb1及mAb2混合物Fab 2片段之SCX-MS分析的去卷積質譜。
圖7C展示使用基因療法平台II產生之mAb1及mAb2混合物Fab 2片段的SCX-MS分析。
圖7D展示來自使用基因療法平台II產生之mAb1及mAb2混合物Fab 2片段之SCX-MS分析的去卷積質譜。
圖7E展示使用基因療法平台III產生之mAb1及mAb2混合物Fab 2片段的SCX-MS分析。
圖7F展示來自使用基因療法平台III產生之mAb1及mAb2混合物Fab 2片段之SCX-MS分析的去卷積質譜。
圖8A展示使用三種基因療法平台產生之mAb1及mAb2混合物Fab 2片段之SCX-MS分析的基於MS之定量。
圖8B展示使用mAb1及mAb2混合物Fab 2片段之SCX-MS分析鑑別之正確及不正確配對產物的分佈。
圖9展示用於醣肽分析之天然免疫沉澱及天然液相層析-質譜方法的工作流程。
圖10展示使用三種基因療法平台產生之mAb2 Fc片段的完整質量分析。
圖11A展示自下而上醣肽分析之工作流程。
圖11B展示使用基因療法平台I產生之mAb1及mAb2混合物Fc片段的自下而上醣肽分析。
圖11C展示使用基因療法平台II產生之mAb1及mAb2混合物Fc片段的自下而上醣肽分析。
圖11D展示使用基因療法平台III產生之mAb1及mAb2混合物Fc片段的自下而上醣肽分析。
圖12展示使用完整質量分析(黑色)及自下而上醣肽分析(黑色及紅色)鑑別之醣型的比較。

Claims (37)

  1. 一種用於表徵至少一種所關注多次單元蛋白質之次單元之組裝的方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括該至少一種所關注多次單元蛋白質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該至少一種所關注多次單元蛋白質之至少一個次單元的捕獲抗體，以形成固定化蛋白質； (b)   溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品；及 (c)   在天然條件下對該增濃樣品進行液相層析-質譜法(LC-MS)分析以表徵該至少一種所關注多次單元蛋白質之次單元之該組裝。
  2. 如請求項1之方法，其中該至少一種多次單元蛋白質係選自由以下組成之群：抗體、單株抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體衍生蛋白、抗原結合蛋白、抗體-藥物結合物、或融合蛋白。
  3. 如請求項1之方法，其中該液相層析包括逆相液相層析、離子交換層析、陰離子交換層析、弱陽離子交換層析、強陽離子交換層析、粒徑排阻層析、親和層析、疏水相互作用層析、親水相互作用層析、混合模式層析、或其組合。
  4. 一種用於自包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品鑑別及/或定量正確配對之抗體的方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品與固相基質接觸以形成固定化抗體； (b)   使該等固定化抗體與消化酶接觸以產生該等抗體之未結合片段； (c)   溶離該等未結合片段；及 (d)   對經溶離片段進行天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)分析以鑑別及/或定量正確配對之抗體。
  5. 如請求項4之方法，其中該固相基質係選自由以下組成之群：微量盤、樹脂及珠粒。
  6. 如請求項4之方法，其中該固相基質包括珠粒。
  7. 如請求項6之方法，其中該等珠粒為瓊脂糖珠粒或磁性珠粒。
  8. 如請求項4之方法，其中結合係藉由黏附於該固相基質之抗體結合分子進行。
  9. 如請求項8之方法，其中該抗體結合分子為蛋白A、蛋白G或抗Fc抗體。
  10. 如請求項4之方法，其中該消化酶係選自由以下組成之群：胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、胰凝乳蛋白酶、Lys-N、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、木瓜酶、IdeS或其變異體。
  11. 如請求項4之方法，其中該等未結合片段為Fab片段、Fab'片段、Fab 2片段、F(ab') 2片段、Fc片段、Fv片段、Fd片段或Fd'片段。
  12. 一種用於自包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品鑑別及/或定量正確配對之抗體的方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括體內共表現之兩種或更多種抗體之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體； (b)使該等固定化抗體與包括IdeS或其變異體之消化條件接觸，以形成游離Fab 2片段； (c)   溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；及 (d)   對該等經溶離Fab 2片段進行天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)分析以鑑別及/或定量正確配對之抗體。
  13. 如請求項12之方法，其中該兩種或更多種抗體係選自由以下組成之群：治療性抗體、單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、抗體-藥物結合物、抗體融合蛋白、或抗體片段。
  14. 如請求項12之方法，其中該兩種或更多種抗體為卡斯瑞韋單抗(casirivimab)及依米得韋單抗(imdevimab)。
  15. 如請求項12之方法，其中該樣品為生物樣品。
  16. 如請求項15之方法，其中該生物樣品係選自由以下組成之群：全血、血漿、血清、唾液或器官組織。
  17. 如請求項12之方法，其中該樣品為血清。
  18. 如請求項12之方法，其中來自至少兩種抗體中之各者的至少一個次單元在質量上類似。
  19. 如請求項18之方法，其中來自該至少兩種抗體中之各者的該至少一個次單元之質量差異小於10道爾頓、小於9道爾頓、小於8道爾頓、小於7道爾頓、小於6道爾頓、小於5道爾頓、小於4道爾頓、小於3道爾頓、小於2道爾頓、或小於1道爾頓。
  20. 如請求項12之方法，其中該固相基質係選自由以下組成之群：微量盤、樹脂、瓊脂糖珠粒、及磁性珠粒。
  21. 如請求項12之方法，其中該固相基質包括瓊脂糖珠粒。
  22. 如請求項12之方法，其進一步包括在使該樣品與該固相基質接觸之後洗滌該固相基質之步驟。
  23. 如請求項12之方法，其中該溶離包括離心該固相基質及該等游離Fab 2片段之步驟。
  24. 如請求項12之方法，其中質譜儀為電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀。
  25. 一種用於表徵體內表現之至少一種所關注抗體的方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括體內表現之至少一種所關注抗體之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體； (b)   使該等固定化抗體與包括IdeS或其變異體之消化條件接觸，以形成游離Fab 2片段； (c)   溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；及 (d)   對該等經溶離Fab 2片段進行天然粒徑排阻層析-質譜法(nSEC-MS)或天然強陽離子交換層析-質譜法(nSCX-MS)分析以表徵該至少一種所關注抗體。
  26. 一種用於鑑別及/或定量雙特異性抗體產生中之雜質的方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括雙特異性抗體及至少一種雜質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體； (b)   使該等固定化抗體與包括IdeS或其變異體之消化條件接觸，以形成游離Fab 2片段； (c)   溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段；及 (d)   對該等經溶離Fab 2片段進行nSCX-MS分析以鑑別及/或定量該等雜質。
  27. 如請求項26之方法，其中該至少一種雜質為副產物雜質。
  28. 如請求項27之方法，其中該至少一種副產物雜質為單特異性抗體。
  29. 如請求項26之方法，其中該雙特異性抗體係藉由表現兩條不同重鏈及一條共同輕鏈來產生。
  30. 如請求項29之方法，其中該至少一種雜質係該等重鏈中之一者同二聚化的結果。
  31. 一種用於表徵所關注蛋白質之醣基化概況的方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括所關注蛋白質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該所關注蛋白質之捕獲抗體，以形成固定化蛋白質； (b)   溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品；及 (c)   對該增濃樣品進行天然液相層析-質譜法分析以表徵該所關注蛋白質之醣基化概況。
  32. 一種用於表徵來自包括體內共表現之至少兩種抗體之樣品的抗體之醣基化概況的方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括體內共表現之至少兩種抗體之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體； (b)   使該等固定化抗體與包括IdeS或其變異體之消化條件接觸，以形成固定化Fc片段； (c)   溶離該等固定化Fc片段以形成經溶離Fc片段； (d)   使該等經溶離Fc片段經受消化條件以形成肽消化物；及 (e)   對該肽消化物進行逆相液相層析-質譜法(RPLC-MS)分析以表徵該等抗體之醣基化概況。
  33. 一種用於選擇用於產生至少一種所關注蛋白質之表現平台的方法，其包括： (a)   獲得包括由第一表現平台產生之至少一種所關注蛋白質之樣品； (b)   在天然或接近天然條件下使該樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該至少一種所關注蛋白質之捕獲抗體，以形成固定化蛋白質； (c)   溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品； (d)   對該增濃樣品進行nLC-MS分析以表徵由該表現平台產生之該至少一種所關注蛋白質； (e)   使用至少一種替代表現平台重複步驟(a)至(d)； (f)    比較該第一表現平台及該至少一種替代表現平台中之各者之步驟(d)的結果；及 (g)   基於該比較選擇表現平台。
  34. 如請求項33之方法，其中該第一表現平台及該至少一種替代表現平台包括重組表現平台及/或基因療法表現平台。
  35. 一種用於選擇用於產生抗體混合物之基因療法平台的方法，其包括： (a)   獲得包括由第一基因療法平台產生之抗體混合物之樣品； (b)   在天然或接近天然條件下使該樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體； (c)   使該等固定化抗體與消化條件接觸以形成游離Fab 2片段； (d)   溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段； (e)   對該等經溶離Fab 2片段進行nSCX-MS分析，以表徵由該基因療法平台產生之該抗體混合物的正確次單元配對； (f)    使用至少一種替代基因療法平台重複步驟(a)至(e)； (g)   比較該第一基因療法平台及該至少一種替代基因療法平台中之各者之步驟(e)的結果；及 (h)   基於該比較選擇基因療法平台。
  36. 一種用於選擇所關注蛋白質之方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括第一所關注蛋白質之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括結合於該所關注蛋白質之捕獲抗體，以形成固定化蛋白質； (b)   溶離該等固定化蛋白質以形成增濃樣品； (c)   對該增濃樣品進行nLC-MS分析以表徵該所關注蛋白質； (d)   使用至少一種替代所關注蛋白質重複步驟(a)至(c)； (e)   比較該第一所關注蛋白質及該至少一種替代所關注蛋白質中之各者之步驟(c)的結果；及 (f)基於該比較選擇所關注蛋白質。
  37. 一種用於選擇抗體混合物之方法，其包括： (a)   在天然或接近天然條件下使包括第一抗體混合物之樣品與固相基質接觸，其中該固相基質包括抗Fc抗體，以形成固定化抗體； (b)   使該等固定化抗體與消化條件接觸以形成游離Fab 2片段； (c)   溶離該等游離Fab 2片段以形成經溶離Fab 2片段； (d)   對該等經溶離Fab 2片段進行nSCX-MS分析，以表徵該抗體混合物之正確次單元配對； (e)   使用至少一種替代抗體混合物重複步驟(a)至(d)； (f)    比較該第一抗體混合物及該至少一種替代抗體混合物中之各者之步驟(d)的結果；及 (g)   基於該比較選擇抗體混合物。
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