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TW202330911A - 人類誘導性控制性ｔ細胞及其製作方法 - Google Patents

人類誘導性控制性ｔ細胞及其製作方法 Download PDF

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TW202330911A
TW202330911A TW111144627A TW111144627A TW202330911A TW 202330911 A TW202330911 A TW 202330911A TW 111144627 A TW111144627 A TW 111144627A TW 111144627 A TW111144627 A TW 111144627A TW 202330911 A TW202330911 A TW 202330911A
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cell
inducible control
cell cluster
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三上統久
坂口志文
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日商雷格細胞股份有限公司
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Abstract

根據本發明，提供一種具有高功能性、具備穩定之免疫抑制功能之誘導性控制性T細胞。 本發明提供一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由FoxP3陽性、CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少一個特徵。

Description

人類誘導性控制性T細胞及其製作方法
本發明係關於一種具有高功能性之人類誘導性控制性T細胞及其製作方法。
作為免疫系統固有之CD25陽性CD4陽性控制性T細胞之重要特徵，係特異性地表現轉錄因子FoxP3，有因FoxP3之缺失或突變而有礙控制性T細胞之產生及分化、以及抑制功能的情況。控制性T細胞除了FoxP3以外，亦藉由CTLA4、IL-10等多種基因之表現抑制免疫系統。認為DNA去甲基化等表觀遺傳狀態有助於以FoxP3之穩定表現為代表之控制性T細胞之綜合基因表現控制，該等與功能性之控制性T細胞之表現型相關。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人在從人類末梢T細胞誘導控制性T細胞時，首次發現：從人類末梢T細胞藉由使用抗CD3抗體之刺激而誘導穩定之誘導性T細胞後，實施休眠培養，再次進行抗CD3抗體刺激並進行培養，進而實施休眠培養，藉此，能夠誘導具有較高之抑制性分子之表現與較高之抑制功能的控制性T細胞。
因此，本發明提供以下內容。 (項目X1) 一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由FoxP3陽性、CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少一個特徵。 (項目X1A) 一種誘導性控制性人類T細胞，其為NT5E陽性。 (項目X1B) 一種誘導性控制性人類T細胞，其為ITGAE(CD103)陽性。 (項目X1C) 一種誘導性控制性人類T細胞，其為AREG陽性。 (項目X1D) 一種誘導性控制性人類T細胞，其為CD172g陽性。 (項目X1E) 一種誘導性控制性人類T細胞，其為CD26陽性。 (項目X1F) 一種誘導性控制性人類T細胞，其為CTLA4陽性。 (項目X1G1) 一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少兩個特徵。 (項目X1G2) 一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少三個特徵。 (項目X1G3) 一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少四個特徵。 (項目X1G4) 一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少五個特徵。 (項目X1G5) 一種誘導性控制性人類T細胞，其具有CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性之所有特徵。 (項目X2) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞，其至少為CTLA4陽性及FoxP3陽性。 (項目X3) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞，其至少為CD172g陽性及/或CD26陽性。 (項目X4) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞，其中FOXP3基因之CNS2部位被去甲基化。 (項目X5) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞，其為CD4陽性或CD8陽性。 (項目X6) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞，其係從人類之末梢血T細胞、或源自人類組織之T細胞獲得或誘導。 (項目X7) 一種誘導性控制性人類T細胞，其係藉由包括如下步驟之方法獲得： (a)對人類末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟； (b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟； (c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及 (d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。 (項目X8) 一種細胞集群，其包含如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之選自由FoxP3陽性、CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少一個特徵之比率為約50%以上。 (項目X8A) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之NT5E陽性之比率為約50%以上。 (項目X8B) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之ITGAE(CD103)陽性之比率為約50%以上。 (項目X8C) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之AREG陽性之比率為約50%以上。 (項目X8D) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之CD172g陽性之比率為約50%以上。 (項目X8E) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之CD26陽性之比率為約50%以上。 (項目X8F) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之CTLA4陽性之比率為約50%以上。 (項目X8G1) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少兩個特徵之比率分別為約50%以上。 (項目X8G2) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少三個特徵之比率分別為約50%以上。 (項目X8G3) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少四個特徵之比率分別為約50%以上。 (項目X8G4) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少五個特徵之比率分別為約50%以上。 (項目X8G5) 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性之所有特徵之比率分別為約50%以上。 (項目X9) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其至少上述CTLA4陽性及FoxP3陽性之比率分別為約50%以上。 (項目X10) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其至少上述CD172g陽性及/或CD26陽性之比率分別為約50%以上。 (項目X11) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其中上述細胞集群中之上述至少一個特徵之比率為約60%以上。 (項目X12) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其中上述細胞集群中之上述至少一個特徵之比率為約80%以上。 (項目X12a) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其中FoxP3強陽性之比率為約50%以上。 (項目X13) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其中上述細胞集群之約90%以上為T細胞。 (項目X14) 一種醫藥組合物，其包含如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞或如上述項目中任一項所記載之細胞集群。 (項目X15) 一種再生醫療用材料或製品，其包含如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性人類T細胞或如上述項目中任一項所記載之細胞集群。 (項目X16) 一種製造誘導性控制性人類T細胞之方法，其包括如下步驟： (a)對人類末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟； (b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟； (c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及 (d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。 (項目X17) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中上述第一基礎培養基包含選自由抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸所組成之群中之至少一個因子。 (項目X18) 一種如上述項目中任一項所記載之方法，其中上述第一基礎培養基包含抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸。 (項目X19) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中上述第二基礎培養基包含選自由抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及CDK8/19抑制劑所組成之群中之至少一個因子。 (項目X20) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中上述第二基礎培養基包含抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及CDK8/19抑制劑。 (項目X21) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(a)係對上述CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用上述第一基礎培養基進行約3天刺激。 (項目X22) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(b)係對步驟(a)中所獲得之細胞利用上述包含IL-2之培養基進行至少約2天休眠培養。 (項目X23) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(c)係對步驟(b)中所獲得之細胞利用上述第二基礎培養基進行約3天刺激。 (項目X24) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(d)係對步驟(c)中所獲得之細胞利用上述包含IL-2之培養基進行至少約2天休眠培養。 (項目X25) 一種誘導性控制性人類T細胞或包含上述誘導性控制性人類T細胞之細胞集群，其係藉由如上述項目中任一項所記載之方法生成。
又，本發明亦提供以下內容。 (項目1) 一種誘導性控制性T細胞，其具有選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、及AREG陽性所組成之群中之至少一個特徵。 (項目2) 如上述項目所記載之誘導性控制性T細胞，其具有選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、及AREG陽性所組成之群中之至少兩個特徵。 (項目3) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞，其至少為CTLA4陽性。 (項目4) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞，其中FOXP3基因之CNS2部位被去甲基化。 (項目5) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞，其為CD4陽性或CD8陽性。 (項目6) 如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞，其係從人類之末梢血T細胞、或源自人類組織之T細胞獲得或誘導。 (項目7) 一種誘導性控制性T細胞，其係藉由包括如下步驟之方法獲得： (a)對末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟； (b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟； (c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及 (d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。 (項目8) 一種細胞集群，其包含T細胞，且上述細胞集群之T細胞中之約50%以上為如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞。 (項目9) 如上述項目所記載之細胞集群，其中上述細胞集群中之T細胞中之約80%以上為如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞。 (項目10) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其中上述細胞集群中之T細胞為控制性T細胞。 (項目11) 如上述項目中任一項所記載之細胞集群，其中上述細胞集群之約90%以上為T細胞。 (項目12) 一種醫藥組合物，其包含如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞或如上述項目中任一項所記載之細胞集群。 (項目13) 一種再生醫療用材料或製品，其包含如上述項目中任一項所記載之誘導性控制性T細胞或如上述項目中任一項所記載之細胞集群。 (項目A1) 一種製造誘導性控制性T細胞之方法，其包括如下步驟： (a)對末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟； (b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟； (c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及 (d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。 (項目A2) 如上述項目所記載之方法，其中上述第一基礎培養基包含選自由抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸所組成之群中之至少一個因子。 (項目A3) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中上述第一基礎培養基包含抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸。 (項目A4) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中上述第二基礎培養基包含選自由抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及CDK8/19抑制劑所組成之群中之至少一個因子。 (項目A5) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中上述第二基礎培養基包含抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及CDK8/19抑制劑。 (項目A6) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(a)係對上述CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用上述第一基礎培養基進行約3天刺激。 (項目A7) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(b)係對步驟(a)中所獲得之細胞利用上述包含IL-2之培養基進行至少約2天休眠培養。 (項目A8) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(c)係對步驟(b)中所獲得之細胞利用上述第二基礎培養基進行約3天刺激。 (項目A9) 如上述項目中任一項所記載之方法，其中步驟(d)係對步驟(c)中所獲得之細胞利用上述包含IL-2之培養基進行至少約2天休眠培養。 (項目A10) 一種誘導性控制性T細胞或包含上述誘導性控制性T細胞之細胞集群，其係藉由如上述項目中任一項所記載之方法生成。
於本發明中，上述一個或複數個特徵意在除了明示之組合以外，可進一步加以組合而提供。再者，本發明之進一步之實施方式及優點可由業者視需要閱讀以下詳細說明並加以理解而認識到。
再者，上述以外之本發明之特徵及顯著之作用、效果可由業者藉由參照以下發明之實施方式之項及附圖而明確。 [發明之效果]
本發明能夠提供一種在體外從人類末梢T細胞誘導具有高功能性之控制性T細胞的方法。藉由本發明之方法誘導之控制性T細胞高度表現與控制性T細胞相關之基因，具有較強之抑制能力。因此，作為控制性T細胞，能夠用於各種免疫疾病、自體免疫病等炎症性疾病之治療或預防等。
根據本發明之方法，能夠在體外從人類末梢T細胞誘導功能性之控制性T細胞。藉由本發明之方法所獲得之控制性T細胞具有功能性(例如，具有較高之抑制功能)、作為控制性T細胞而言穩定。即，藉由本發明之方法，能夠從人類末梢T細胞誘導穩定地表現作為控制性T細胞之主基因之FoxP3，具有高功能性的控制性T細胞。
以下，對本發明一面揭示最佳之形態一面進行說明。應理解，本說明書之全文中，只要未特別提及，則單數形式之表述亦包含其複數形式之概念。因此，應理解，只要未特別提及，則單數形式之冠詞(例如，於英語之情形時為「a」、「an」、「the」等)亦包含其複數形式之概念。又，應理解，只要未特別提及，則本說明書中使用之用語係以該領域中通常使用之含義使用。因此，只要無其他定義，則本說明書中使用之所有專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬之領域之業者通常所理解相同之含義。於矛盾之情形時，以本說明書(包括定義)優先。
以下，對本說明書中特別使用之用語之定義及/或基本之技術內容適當進行說明。
於本說明書中，「約」意指繼其後之數值之±10%。例如，「約20」係指包括「18～22」。數值之範圍包括兩端點之間之全部數值及兩端點之數值。有關範圍之「約」適用於該範圍之兩端點。因此，例如，「約20～30」係指包括「18～33」。
於本說明書中，在記載基因名及其產物時，於與通常之用法不同，均由大寫字母記載之情形時，有時指基因與蛋白雙方。例如，亦有時區分使用FOXP3基因、FOXP3蛋白，於記載為FoxP3之情形時，係指該基因或蛋白之概念與實體之雙方(整體)。
於本說明書中，「控制性T細胞(Regulatory T cell)」係指FoxP3表現為陽性之T細胞。於本說明書中，亦有時稱為「Treg」。Treg有內源性控制性T細胞(Naturally Occurring Regulatory T cell：nTreg)、誘導性控制性T細胞(Inducible Regulatory T cell：iTreg)等。控制性T細胞通常可具有各種功能(例如，免疫抑制功能)。
於本說明書中，「誘導性控制性T細胞(Inducible Regulatory T cell、iTreg)」係指控制性T細胞之中IKZF2(Helios)之表現為陰性者。iTreg通常係藉由自初始CD4陽性T細胞等分化誘導而獲得。
於本說明書中，「內源性控制性T細胞(Naturally Occurring Regulatory T cell、nTreg)」係指控制性T細胞之中IKZF2(Helios)、及CTLA4之表現為陽性者。通常，係存在於生物體內之細胞。
於本說明書中，「末梢T細胞」係指存在於胸腺外之T細胞，可自末梢血液、淋巴結、其他組織獲取。於本說明書中，稱「末梢T細胞」時，只要於細胞群中包含末梢T細胞即可，無需單離T細胞。可使用末梢血單核細胞(PBMC)等除了T細胞以外亦包括各種淋巴細胞之細胞組分。
於本說明書中，「流式細胞分析」係指測量懸浮於液體中之細胞、個體及其他生物粒子之粒子數、各物理、化學、生物學性狀之技術。使用該技術之裝置稱為「流式細胞儀」。於本發明中，細胞標記物(例如，FoxP3、CTLA4、Helios、CD103等)之「陽性」「陰性」如在該領域中通常所使用，係藉由流式細胞分析確定。更詳細而言，於流式細胞分析中，使細胞排成一行流過，藉由光譜學方法對細胞數進行計數。例如，對經螢光或發光酵素標記之細胞照射雷射光，對藉此自細胞發出之螢光或發光信號利用光電二極體等檢測器進行檢測，藉此對目標細胞數進行計數。又，亦可將利用檢測器所獲得之檢測結果納入至電腦，生成二維圖進行顯示。藉此，能夠容易地掌握目標細胞之有無、及其數等。
於本說明書中，「去甲基化」代表性地係指去除經甲基化之腺嘌呤(例如，6位：m6A、1位：m1A)或胞嘧啶(例如，5位：m5C、3位：m3C)之甲基化修飾。去甲基化可使用該領域中公知之方法特定，例如，可使用亞硫酸氫鹽法等測定。
於本說明書中，「細胞集群」係指包含2個以上之細胞之集群，例如，可為細胞彼此平面地聚集之狀態者，亦可為細胞彼此三維地黏著而構成之細胞塊。又，「細胞集群」可由單一種類之細胞形成，亦可包含複數種細胞。
於本說明書中，「刺激」意指TCR介導之刺激。例如，T細胞之刺激包括：使用抗CD3抗體及包含其之複合體之刺激、使用結合於TCR之肽及包含肽之複合體之刺激、使用抗原呈現細胞之刺激、同時使用抗CD3抗體與抗原呈現細胞之刺激、同時使用肽或蛋白與抗原呈現細胞之刺激等。
於本說明書中，「休眠培養」係指在無如上所述之刺激之狀態下培養細胞。
(較佳之實施方式) 以下，對本發明之較佳之實施方式進行說明。以下提供之實施方式係為了更良好地理解本發明而提供，本發明之範圍並不應限定於以下之記載。因此，業者顯然能夠參考本說明書中之記載，在本發明之範圍內適當進行變更。又，本發明之以下之實施方式可單獨使用，或者可將該等組合使用。
(誘導性控制性T細胞) 本發明係關於一種高功能穩定型誘導性控制性T細胞(亦稱為高功能穩定型iTreg、HSF iTreg)及其利用。
於本發明之一態樣中，提供一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由FoxP3陽性、CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少一個特徵。於本發明之一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞亦可具有選自由CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、及AREG陽性所組成之群中之至少兩個特徵。又，於本發明之一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞亦可至少為CTLA4陽性。本發明之誘導性控制性T細胞亦可為CD4陽性或CD8陽性，但並不意在限定。
於本發明之一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞亦可至少為CTLA4陽性及FoxP3陽性。於本發明之一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞亦可至少為CD172g陽性及/或CD26陽性。
本發明提供一種CD172g陽性之誘導性控制性人類T細胞。CD172g為酪胺酸激酶相關之蛋白，參與神經元等之細胞黏著(小腦神經元之黏著、神經突生長及神經膠細胞之附著(adhesion of cerebellar neurons, neurite outgrowth and glial cell attachment))，因此，期待CD172g陽性之誘導性控制性人類T細胞被激活與黏著性等相關之功能，對與之相關之各種疾病之效果較高。
本發明提供一種CD26陽性之誘導性控制性人類T細胞。CD26係亦稱為DPP4之基因，與糖代謝或胰島素代謝、免疫功能(於感染症中亦明顯)相關，因此，期待CD26陽性之誘導性控制性人類T細胞對與之相關之各種疾病之效果較高。
本發明提供一種NT5E陽性之誘導性控制性人類T細胞。NT5E(CD73)係具有將細胞外之核苷酸轉換為膜穿透性之核苷之觸媒作用的細胞膜蛋白。所編碼之蛋白被用作淋巴細胞分化之決定因子。若該基因有缺陷，則有可能引起關節或動脈之鈣化，因此，期待NT5E陽性之誘導性控制性人類T細胞對與之相關之各種疾病之效果較高。
本發明提供一種ITGAE(CD103)陽性之誘導性控制性人類T細胞。ITGAE(CD103)編碼具有I域之α整合素，於胞外域受到轉譯後切斷，生成進行了雙硫鍵結之重鏈與輕鏈。該蛋白與β7整合素結合，形成作為人類黏膜淋巴細胞-1抗原為人所知之E-鈣黏蛋白結合整合素。該蛋白優先地於人類腸道上皮內淋巴細胞(IEL)表現，除了黏著之作用以外，可能作為用於IEL活化之附屬分子發揮功能。因此，期待ITGAE(CD103)陽性之誘導性控制性人類T細胞對與之相關之各種疾病之效果較高。
本發明提供一種AREG陽性之誘導性控制性人類T細胞。AREG係上皮生長因子家族之一員，與上皮生長因子(EGF)及轉化生長因子α(TGF-α)相關。該蛋白與EGF/TGF-α受體相互作用，促進正常之上皮細胞之生長，阻礙某些攻擊性癌細胞株之生長。又，亦對乳腺、卵子、骨組織之產生發揮功能。該基因與類似牛皮癬之皮膚表現型相關，亦與包括各種癌症或炎症狀態在內之其他病態疾病相關。因此，期待AREG陽性之誘導性控制性人類T細胞對與之相關之各種疾病之效果較高。
本發明提供一種CTLA4陽性之誘導性控制性人類T細胞。CTLA4屬於免疫球蛋白超家族，係對T細胞傳遞抑制性訊息之蛋白。膜結合型CTLA4作為經雙硫鍵結合而成之同源二聚體發揮功能，可溶型CTLA4作為單體發揮功能。認為該基因之變異與胰島素依賴性糖尿病、巴塞多氏病、橋本氏甲狀腺炎、乳糜瀉、全身性紅斑狼瘡、甲狀腺相關眼眶病、其他自體免疫疾病相關。因此，期待CTLA4陽性之誘導性控制性人類T細胞對與之相關之各種疾病之效果較高。
關於控制性T細胞中之FoxP3之表現，能夠藉由如下方式在試管內誘導：對CD4陽性T細胞在包含IL2與TGFβ之培養基中，在抗CD3抗體與抗CD28抗體之存在下進行培養，其後利用包含IL2及TGFβ之培養基進行培養。又，雖然已知若干從末梢T細胞誘導控制性T細胞之方法，但誘導性控制性T細胞中之FoxP3之表現不穩定，未確認到FoxP3以外之眾多功能性分子表現。
近年來，開發了藉由將抗壞血酸添加至培養基中之方法(Kasahara et al. Int. Immunol. (2017) 29(10): 457-469)、不使用CD28抗體刺激之方法(Mikami et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2020)117 (22): 12258-12268.)而於誘導性控制性T細胞中引起DNA去甲基化誘導的培養方法。然而，藉由該方法所製作之誘導性控制性T細胞中未確認到功能性分子之表現，未獲得充分之免疫抑制活性。於臨床中，亦有1件使用誘導性控制性T細胞之臨床試驗將GVHD向對象實施，但使用之細胞之控制性T細胞之比率較低，目前不認可GVHD之預防等有效性(MacMillan et al., Blood Adv. (2021) 5 (5): 1425-1436)。
於本發明中，能夠提供一種FoxP3之表現穩定，有利地，穩定保持免疫抑制作用之誘導性控制性T細胞，此種誘導性控制性T細胞例如可藉由本案說明書之其他處所說明之製造誘導性控制性T細胞之方法製造。例如，本發明可提供一種藉由包括如下步驟之方法所獲得之誘導性控制性T細胞：(a)對末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；(b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟；(c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及(d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。
本發明中製作之誘導性控制性T細胞具有誘導性控制性T細胞特異性去甲基化狀態。所獲得之控制性T細胞處於控制性T細胞特異性去甲基化狀態例如可藉由FoxP3之基因(FOXP3(均為斜體字))之CNS2部位被去甲基化而確認。此種去甲基化狀態可成為穩定型之指標，故而本發明之誘導性控制性T細胞可藉由確認去甲基化狀態而顯示係穩定型之誘導性控制性T細胞。
於本說明書中，本發明之誘導性控制性T細胞之免疫抑制活性或免疫抑制作用例如可藉由測定應答T細胞中之細胞追蹤紫強度而確認。本發明之誘導性控制性T細胞能夠穩定地提供免疫抑制活性或免疫抑制作用，例如，本發明之誘導性控制性T細胞能夠跨及至少約2週提供免疫抑制活性或免疫抑制作用。如後述之實施例中所示，本發明之誘導性控制性T細胞能夠具有高於先前之控制性T細胞(包括誘導性及內源性)之免疫抑制作用。因此，本發明之誘導性控制性T細胞亦可稱為功能性或高功能之誘導性控制性T細胞。
於一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞能夠穩定地表現FoxP3。因此，本發明之誘導性控制性T細胞亦可稱為穩定型誘導性控制性T細胞。本發明之誘導性控制性T細胞於一態樣中，為高功能且穩定型，可稱為高功能穩定型誘導性控制性T細胞(HSF iTreg)。
於本發明之一實施方式中，關於本發明之誘導性控制性T細胞中之標記物是否為陽性，可藉由利用流式細胞分析之陽性率測定進行。例如，可利用流式細胞儀進行解析，根據顯示基準以上之抗原表現量之細胞比率，判定是否為陽性。亦可根據細胞表面標記物之表現強度，分為陰性、弱陽性、中陽性、強陽性(將弱陽性、中陽性、及強陽性統稱為「陽性」)等。例如，亦可根據機器之設定，在各標記物之螢光強度中央值/陰性對照之螢光強度中央值(利用同型對照抗體之染色)之值未達5、5以上且未達10、10以上且未達30、30以上之情形時，分別設為陰性、弱陽性、中陽性、強陽性。此種判定可如(利用流式細胞分析之陽性率測定)中所例示般進行判定，但本發明並不限定於此。
於本發明之一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞中之細胞表面標記物之表現強度例如係基於使用如本案實施例所記載般準備之樣品並藉由BD FACSLyric流式細胞儀(BD Biosciences公司)進行解析之結果，其表現強度為10 2以上可設為弱陽性、10 3以上可設為中陽性、10 4以上可設為強陽性，或10 3以上可設為強陽性、其以下可設為弱陽性，或10 2以上可設為強陽性、其以下可設為弱陽性。此種判定可根據實驗條件、實驗目的、細胞之種類、機器之設定條件等而適當設定，本發明並不限定於此。又，於利用BD FACSLyric流式細胞儀以外之流式細胞儀機器進行解析之情形時，亦可算出與利用BD FACSLyric流式細胞儀進行解析之情形之表現強度對應之其他機器中之表現強度，可根據使用之機器適當發現表示表現強度之值。
於本發明之一實施方式中，本發明中製作之誘導性控制性T細胞可從任意之細胞誘導，較佳為可從人類之末梢血T細胞、或源自人類組織之T細胞誘導而獲得。
於本發明之一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞或其細胞集群可以人類細胞為對象，可製成以從人類之末梢血獲得之T細胞作為材料藉由特定之方法誘導之誘導性控制性人類T細胞或其細胞集群。人類細胞與小鼠細胞中其性質明確不同，假設存在相同之細胞表面標記物，細胞之性質亦無法視作相同。例如，於誘導性控制性T細胞之領域中，小鼠與人類中可應用之技術不同，於小鼠之情形時，大部分為抗原未致敏之淋巴細胞，另一方面，於人類之情形時，末梢血中T細胞之抗原致敏之程度或活化之程度多種多樣。因此，小鼠可由從小鼠淋巴組織採集之T細胞直接製作高功能穩定型誘導性控制性T細胞，但人類難以如此，無法僅因存在細胞表面標記物而視作同樣之細胞。
於本發明之一態樣中，提供一種細胞集群，其係包括包含如上所述之誘導性控制性人類T細胞之細胞集群者，該細胞集群之選自由FoxP3陽性、CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少一個特徵之比率為約50%以上。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之CTLA4陽性及FoxP3陽性之比率分別為約50%以上。於一實施方式中，本發明之細胞集群之CTLA4陽性及FoxP3陽性之比率可設為約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上。
於本發明之一實施方式中，於本發明之細胞集群中，至少上述CD172g陽性及/或CD26陽性之比率可分別設為約50%以上。於一實施方式中，本發明之細胞集群之CD172g陽性及/或CD26陽性之比率可設為約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上。
於本發明之一實施方式中，本發明之細胞集群中，FoxP3強陽性之比率可設為約50%以上。於一實施方式中，本發明之細胞集群之FoxP3強陽性之比率可設為約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上。於此種細胞集群中，細胞表面標記物之表現強度之測定可藉由如上所述之利用流式細胞分析之陽性率測定進行，但並不意在限定。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之FoxP3陽性之比率為約50%以上。於一實施方式中，此種細胞集群可以細胞數基準計，包含約50%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上之FoxP3陽性之誘導性控制性人類T細胞，但並不意在限定。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之CTLA4陽性之比率為約50%以上。於一實施方式中，此種細胞集群可以細胞數基準計，包含約50%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上之CTLA4陽性之誘導性控制性人類T細胞，但並不意在限定。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之NT5E陽性之比率為約50%以上。於一實施方式中，此種細胞集群可以細胞數基準計，包含約50%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上之NT5E陽性之誘導性控制性人類T細胞，但並不意在限定。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之ITGAE(CD103)陽性之比率為約50%以上。於一實施方式中，此種細胞集群可以細胞數基準計，包含約50%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上之ITGAE(CD103)陽性之誘導性控制性人類T細胞，但並不意在限定。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之AREG陽性之比率為約50%以上。於一實施方式中，此種細胞集群可以細胞數基準計，包含約50%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上之AREG陽性之誘導性控制性人類T細胞，但並不意在限定。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之CD172g陽性之比率為約50%以上。於一實施方式中，此種細胞集群可以細胞數基準計，包含約50%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上之CD172g陽性之誘導性控制性人類T細胞，但並不意在限定。
於本發明之其他態樣中，提供一種細胞集群，其係包含誘導性控制性人類T細胞者，該細胞集群之CD26陽性之比率為約50%以上。於一實施方式中，此種細胞集群可以細胞數基準計，包含約50%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上之CD26陽性之誘導性控制性人類T細胞，但並不意在限定。
如上所述，由於人類細胞與小鼠細胞中其性質明確不同，故而即便誘導之條件相同，小鼠細胞與人類細胞中特定之細胞之誘導之比率亦不同，於本發明中，於利用特定之誘導方法進行了誘導之情形時，能夠獲得特定之細胞表面標記物之陽性之比率成為約50%以上之細胞集群，較佳為能夠獲取「CTLA4陽性及FoxP3陽性之比率分別為約50%以上之」細胞集群。
CTLA4係侷限於細胞內之分子，至少並非可用作濃縮或純化之指標之水平。又，FoxP3為轉錄因子，係全部存在於細胞內之分子，因此於表面完全無法檢測出，亦無法用於純化。即，CTLA4及FoxP3成為於T細胞「內」表現之標記物，因此無法以CTLA4及/或FoxP3作為指標進行分選並濃縮，獲得CTLA4陽性及/或FoxP3陽性為約50%以上之細胞集群。因此，亦無法依據先前之方法，獲得CTLA4陽性及FoxP3陽性之比率分別未達約50%之細胞集群，以此種細胞集群作為原料，以CTLA4及/或FoxP3作為指標進行濃縮，獲得該細胞分別為約50%以上之細胞集群。
於本發明之一實施方式中，本案發明之誘導性控制性人類T細胞主要負責基於Treg之免疫抑制功能，該細胞藉由於某一細胞集群中占半數以上，從而能夠穩定地達成醫學上有效之免疫抑制效果，技術性、醫學性效果亦重要。即，藉由包含50%以上之發揮醫學上有效之免疫抑制效果之T細胞，從而能夠提供作為細胞製劑穩定者，因此，該效果在醫學上為極其重要之方面，不單量或數值之差異，作為是否作為製劑成立之品質問題，亦成為重要之方面。
於本發明之一實施方式中，於本發明之細胞集群中，誘導性控制性人類T細胞可進而具備ITGAE(CD103)陽性、NT5E陽性、及/或AREG陽性之特徵。該等細胞標記物係於免疫抑制功能中發揮重要之作用之基因，藉由該等標記物高度表現，在細胞之投予後，能夠較先前之誘導性控制性T細胞保持功能穩定性。例如，CD103對控制性T細胞向炎症部位之遊走重要，NT5E(CD73)對具有免疫抑制能力之腺苷(adenosine)之產生重要，又，AREG對基於控制性T細胞之組織之再生重要。本發明之細胞集群藉由該等標記物高度表現，能夠達成可保持功能穩定性之效果。
於本發明之一實施方式中，本發明之細胞集群中之T細胞可設為控制性T細胞。於該情形時，於本發明之細胞集群之控制性T細胞中，可將約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上設為本案說明書之其他處所記載之誘導性控制性T細胞。
於本發明之一實施方式中，本發明之細胞集群可包含T細胞以外之細胞，較佳為本發明之細胞集群之約60%以上、約65%以上、約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、或約99%以上可為T細胞，較佳為約90%以上可為T細胞。
於本發明之一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含本發明之誘導性控制性T細胞或細胞集群。又，於其他態樣中，提供一種再生醫療用材料或製品，其包含本發明之誘導性控制性T細胞或細胞集群。該醫藥組合物或再生醫療用材料或製品能夠用於可藉由免疫抑制作用醫治之自體免疫疾病、炎症性疾病、過敏。該等醫藥、再生醫療用材料或製品可與培養基、其他該領域中使用之任意之添加物質一起使用。作為此種培養基，可使用向細胞之培養所使用之動物細胞培養用基礎培養基添加必需之因子所獲得的培養基。此種培養基之例於本說明書之其他處進行詳述。關於添加至培養基之成分，其例亦於本說明書之其他處詳述。於作為此種製品提供之情形時，亦可包含DMSO等。
(製法) 本發明提供一種製造本發明之誘導性控制性T細胞之方法。本發明之方法係能夠製造高功能且穩定型之誘導性控制性T細胞之新穎方法，於本說明書中，以下詳細地進行說明。
於本發明之一態樣中，提供一種製造誘導性控制性T細胞之方法，其包括如下步驟：(a)對末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；(b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟；(c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及(d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。於本發明中，使用CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞之任一者作為原料均能夠製造本發明之誘導性控制性T細胞，於一實施方式中，本發明之誘導性控制性T細胞亦能夠以CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞之混合細胞作為原料進行製造。
於一實施方式中，本發明之方法亦可設為如下自人類末梢T細胞(包括CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞)製造控制性T細胞之方法，其包括如下步驟：對人類末梢T細胞於抗CD3抗體刺激之存在下利用包含TGFβ及IL-2之培養基進行培養之步驟；於抗CD3抗體不存在下利用包含IL-2之培養基進行培養之步驟；及再次於抗CD3抗體刺激之存在下利用包含TGFβ及IL-2之培養基進行培養之步驟。
於一實施方式中，T細胞之刺激係指獲得Treg時之刺激，只要為TCR介導之刺激，則無特別限制。例如，作為T細胞之刺激，可包括：使用抗CD3抗體及包含其之複合體之刺激、使用與TCR結合之肽及包含肽之複合體之刺激、使用抗原呈現細胞之刺激、同時使用抗CD3抗體與抗原呈現細胞之刺激、同時使用肽或蛋白與抗原呈現細胞之刺激等，只要能夠獲得Treg，則其培養基或條件無特別限定。
於一實施方式中，作為休眠培養，只要於無如上所述之刺激之狀態下培養細胞，則其培養基或條件無特別限制。
於本說明書中，「抗CD3抗體刺激」意指給予對細胞上之CD3受體具有特異性之刺激。作為CD3刺激，例如可例示抗CD3促效劑抗體。抗CD3促效劑抗體可使用作為研究用試劑所市售之製品，亦可藉由慣用方法製成。抗CD3抗體例如可使用源自小鼠、兔、山羊、牛等動物、及源自人類者。
於一實施方式中，於本發明之方法中，暫時誘導iTreg(刺激T細胞引起去甲基化誘導)後(步驟a)，更換培養基，進行1～3天休眠培養，藉此使細胞恢復(步驟b)，進而再一次刺激T細胞以引起去甲基化誘導(步驟c)，藉此能夠獲得具有功能性且具有穩定性之誘導性控制性人類T細胞。通常若進行2次刺激則T細胞出現細胞凋亡為技術常識，但於本發明之方法中，發現：藉由進行「休眠培養」與「第2次刺激」，從而獲得不顯示細胞凋亡而具有功能性且具有穩定性之誘導性控制性人類T細胞。
即，於本發明之方法中，藉由進行T細胞刺激、休眠培養、其後再次進行刺激，從而能夠獲得具有功能性且具有穩定性之誘導性控制性人類T細胞，因此若為如此獲得之誘導性控制性人類T細胞或包含此種誘導性控制性人類T細胞之細胞集群，則能夠達成本發明之所需效果。因此，於本發明之一實施方式中，用於培養之培養基或刺激之種類無特別限制，藉由使用任意組成之培養基及任意種類之刺激，能夠獲得具有功能性且具有穩定性之誘導性控制性人類T細胞。
於一實施方式中，各步驟中使用之培養基中可進而包含視黃酸及/或抗壞血酸。較佳為於培養基中可包含抗壞血酸。於一實施方式中，培養基中可進而包含CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及/或CDK8/19抑制劑。較佳為於培養基中可進而包含CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及/或CDK8/19抑制劑。
於本發明之一實施方式中，上述第一基礎培養基及上述第二基礎培養基亦可分別獨立地包含選自由抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸所組成之群中之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部因子。又，於其他實施方式中，上述第一基礎培養基及上述第二基礎培養基亦可分別獨立地包含抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸。關於作為該等各成分所包含之濃度，可為該領域中使用之通常之濃度。於一實施方式中，可使用之CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及/或CDK8/19抑制劑之濃度可為該領域中可使用之任意適當之濃度，例如於使用SenexinA之情形時，可設為約0.1 μM以上、約0.5 μM以上、約1 μM以上、約2 μM以上、約3 μM以上、約4 μM以上、約5 μM以上、約6 μM以上、約7 μM以上、約8 μM以上、約9 μM以上、約10 μM以上、約12 μM以上、約14 μM以上、約16 μM以上、約18 μM以上、約20 μM以上等，但不限於該等濃度，業者可根據其他培養基組成適當變更。
於一實施方式中，於本發明之方法中，自人類之末梢T細胞製造控制性T細胞。末梢T細胞包含初始控制性T細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞等。即便自包含複數種T細胞之培養物誘導控制性T細胞，亦可自該等細胞單離CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞等特定之細胞後誘導控制性T細胞。又，亦可單離對特定之抗原為特異性之T細胞後誘導控制性T細胞。因此，本發明之誘導性控制性T細胞包含CD4陽性者、CD8陽性者。再者，於本說明書中稱「CD4陽性」或者「CD4+」之情形時，只要無特別說明，則係指CD4陽性CD8陰性之單陽性細胞。又，於本發明中之製法中，可將CD4陽性或CD8陽性之任一T細胞用作原料，於生成誘導性控制性T細胞後，亦只要不作特別操作，則能夠維持CD4陽性或CD8陽性之特徵。
於一實施方式中，於本發明之方法中，抗體可添加至培養基，亦可使用固定於培養容器之內壁或不溶性載體表面者。不溶性載體可使用能夠物理地或化學地結合抗CD3抗體且不溶於水溶液之構件。作為能夠物理地吸附抗CD3抗體之素材，可例舉：聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚丙烯等合成樹脂或玻璃等。不溶性載體之形狀無特別限定，例如，可採用平板形狀或顆粒形狀、容器形狀等。抗CD3抗體量根據使用之抗體之效價或來源而變動，以給予用於誘導控制性T細胞之充分刺激的方式適當設定即可。
於一實施方式中，於本發明之方法中，細胞之培養可使用向動物細胞培養用基礎培養基添加必需之因子所獲得之培養基。作為本發明之方法中可使用之動物細胞培養用基礎培養基，例如，包含伊思考夫改良伊格爾培養基(Iscove's modified Eagle's Medium)、Ham's F12培養基、MEM Zinc Option培養基、IMEM Zinc Option培養基、IMDM培養基、Medium 199培養基、伊格爾最低限度必需培養基(EMEM，Eagle's Minimum Essential Medium)、αMEM培養基、達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM，Dulbecco's modified Eagle's Medium)培養基、RPMI1640培養基、Fischer's培養基、及該等之混合培養基或改變了一部分組成之培養基等。
基礎培養基中可含有血清(例如，胎牛血清(FBS))，或亦可無血清。無血清培養基中亦可根據需要包含例如白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、運鐵蛋白、原運鐵蛋白、KnockOut血清代替物(KSR，KnockOut Serum Replacement)(ES細胞培養時之血清代替物)(Thermo Fisher Scientific)、N2補充品(Thermo Fisher Scientific)、B27補充品(Thermo Fisher Scientific)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇、3'-硫醇甘油、單硫甘油等一種以上之血清代替物。又，基礎培養基中亦可含有脂質(例如，化學成分確定的脂質濃縮物(chemically defined lipid concentrate))、胺基酸、L-麩醯胺、GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)、非必需胺基酸(NEAA)、維生素類(例如，菸鹼醯胺、抗壞血酸)、生長因子、抗生素(例如，青黴素及鏈黴素)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、及該等之等效物等一種以上之物質。
於一實施形態中，作為基礎培養基，可例示包含血清及HEPES(4-(2-羥基乙基)-1-哌𠯤乙磺酸，4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)之RPMI 1640培養基。
於本發明之方法中，細胞之培養於一般之動物細胞培養條件下進行即可。培養溫度不限於以下，為約30～40℃、較佳為約37℃。培養較佳為於含CO 2之空氣之氛圍下進行培養，CO 2濃度較佳為約2～5%。
於本發明之方法中，抗CD3抗體可直接添加至培養基中，或者亦可使用固定於培養容器之內壁或不溶性載體表面者。抗CD3抗體量根據使用之抗體之效價或來源而變動，以給予用於誘導控制性T細胞之充分刺激之方式適當設定即可。
作為所使用之TGFβ，可例示TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3，例如為TGFβ1。TGFβ之濃度只要業者適當決定即可，無特別限定。於使用TGFβ1或TGFβ3作為TGFβ之情形時，培養基中之濃度無特別限定，設為0.25～25 ng/mL、例如約10 ng/mL即可。
所使用之培養基中之IL-2之濃度無限定，可設為約5 U/mL～約500 U/mL、例如約100 U/mL。
本發明中使用之培養基中可進而添加視黃酸及/或抗壞血酸。較佳為於培養基中包含抗壞血酸。抗壞血酸之濃度無限定，為約1～約100 μg/mL、例如約10 μg/mL。
本發明中使用之培養基中可進而添加CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及/或CDK8/19抑制劑。作為CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及/或CDK8/19抑制劑，可使用任意者，例如，可例舉：4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-㗁二唑-3-胺、3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡𠯤-2-胺或該等之鹽、水合物、溶劑合物等、或美國專利第8598344、WO2013/001310、WO2013/040153、WO2013/116786、WO2014/029726、WO2014/063778、WO2014/072435、WO2014/090692、WO2014/106606、WO2014/123900、WO2014/154723、WO2014/194245、WO2015/049325、WO2015/100420、WO2015/144290、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2016/009076、或WO2018/139660等中記載之化合物等。作為一例，可例示SenexinA或AS2863619，但本發明不限定於此。可使用之CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及/或CDK8/19抑制劑之濃度可為該領域中可使用之任意適當之濃度，可為上述文獻所記載之任意適當之濃度，業者可根據其他培養基組成適當變更。
於本發明之方法中，藉由對人類末梢T細胞利用包含TGFβ及IL-2之培養基進行抗CD3抗體刺激而誘導控制性T細胞，又利用不含抗CD3抗體之含有IL-2之培養基實施休眠培養後，再次利用抗CD3抗體進行刺激，藉此能夠誘導具有高免疫抑制功能之控制性T細胞。例如，可藉由利用RNA定序法之綜合基因表現解析、體外之細胞增生抑制試驗而確認所獲得之誘導性控制性T細胞具有高免疫抑制功能。
於本發明之一實施方式中，(a)對末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟中的培養天數可由業者適當設定，並無特別限定，例如亦可設為約3天。
於又一實施方式中，步驟(b)之休眠培養步驟中之培養天數可由業者適當設定，並無特別限定，例如亦可設為約2天。
於又一實施方式中，步驟(c)之第二基礎培養基中之培養步驟中之培養天數可由業者適當設定，並無特別限定，例如亦可設為約3天。
於又一實施方式中，步驟(d)之休眠培養步驟中之培養天數可由業者適當設定，並無特別限定，例如亦可設為約2天。於一實施方式中，藉由於IL-2之存在下、於無刺激狀態下進行培養，能夠使誘導之具有控制性T細胞特異性去甲基化狀態之控制性T細胞增生。藉由培養基可進而包含抗壞血酸，及進而利用包含IL-2之培養基進行培養，能夠獲得誘導之控制性T細胞穩定之控制性T細胞培養物。
於自所獲得之包含控制性T細胞之細胞培養物單離控制性T細胞時，基於控制性T細胞所特有之細胞表面標記物藉由慣用方法單離細胞即可，例如，藉由細胞分選儀取出FoxP3陽性組份即可。又，亦可根據所需單離具有特定之抗原特性之控制性T細胞。
期待將藉由本發明之方法獲得之誘導性控制性T細胞用於人類之炎症性疾病、例如自體免疫疾病或過敏之治療。
(利用流式細胞分析之陽性率測定) 於一實施方式中，可按以下方式進行利用流式細胞分析之陽性率測定。
準備 ・固定/透化濃縮液(Fixation/Permeabilization Concentrate)(以下，稱為緩衝液)(eBio Science、00-5123-43) ・固定/透化稀釋液(Fixation/Permeabilization Diluent)(以下，稱為稀釋液)(eBio Science、00-5223-56) ・透化緩衝液(Permeabilization Buffer)(10×)(eBio Science、00-833-56) ・FOXP3單株抗體(236A/E7)，PE(以下，稱為抗FOXP3抗體)(eBio Science、12-4777-42) ・小鼠IgG1 kappa同型對照(Mouse IgG1 kappa Isotype Control) (P3.6.2.8.1)，PE(以下，稱為PE對照)(eBio Science) ・BV421，小鼠，抗人類，CD152(以下，稱為抗CTLA4抗體)(BD) ・BV421小鼠IgG2a，k同型對照(以下，稱為BV421對照)(BD) ・CD4單株抗體(RPA-T4)，APC(以下，稱為抗CD4抗體)(eBio Science) ・小鼠IgG1 kappa同型對照(P3.6.2.8.1)，APC(以下，稱為APC對照)(eBio Science) ・D-PBS(Nacalai Tesque、14249-95) ・FBS(HyClone、SH30084.03) ・0.5 mol/l-EDTA溶液(pH值8.0)(Nacalai Tesque、06894-14) ・MilliQ水 ・離心機 ・生物安全櫃 ・微量吸管(P200、P1000) ・5 mL聚苯乙烯圓底試管(以下，稱為專用試管)(Falcon、352008) ・尼龍網(65 μm)(共進理工、PP-65N)
試劑製備 ※固定緩衝液(每1個樣品使用100 μL) 將緩衝液與稀釋液以1：3之比率進行混合。 ※透化緩衝液 對透化緩衝液(10×)利用MilliQ水進行10倍稀釋。 ※FACS緩衝液(製備500 mL之情形) D-PBS         489 mL FBS            10 mL(最終濃度2%) 0.5 mol/l EDTA溶液   1 mL(最終濃度1 mM) 以上試劑於製備後，於4℃或冰上進行保管。
方法 (1)於1.5 mL試管中添加FACS緩衝液500 μL。 (2)於(1)之試管中添加1x10 6個最終製品，利用微量吸管輕輕懸浮。 (3)利用離心機以500×g、4℃、5分鐘進行離心。 (4)利用吸出器去除上清液後，添加固定緩衝液100 μL，小心地移液。→注意不要起泡。 (5)於冰上遮光靜置30分鐘以上而進行固定。→亦可為45分鐘。 (6)固定後，於試管中添加透化緩衝液1 mL，小心地移液。 (7)根據樣品數量準備新的1.5 mL試管。 (8)將樣品向對照用與抗體染色用各分注500 μL。 (9)利用離心機以500×g、4℃、5分鐘進行離心。 (10)於離心中利用透化緩衝液以100倍稀釋製備抗FOXP3抗體(原液濃度＝0.05 mg/ml)、抗CTLA4抗體(批次：0030269原液濃度＝0.2 mg/ml)抗CD4抗體(原液濃度＝0.1 mg/ml)(以下，稱為抗體製備液)。對於對照樣品用，將PE對照(原液濃度＝0.1 mg/ml)、BV421對照(原液濃度＝0.2 mg/ml)、APC對照(原液濃度＝0.1 mg/ml)以與對應之色素之抗體相同濃度進行調整(以下，稱為對照液) ＊於步驟內管理試驗中，不實施CTLA4之染色。 (11)利用吸出器去除上清液後，於抗體染色樣品中添加抗體製備液100 μL、於對照樣品中添加對照液100 μL，小心地移液。→注意不要起泡。 (12)於冰上遮光靜置60分鐘而進行固定。 (13)於染色中實施測定機器之啟動。 (14)染色後，添加FACS緩衝液1 mL，小心地移液。 (15)利用離心機以500×g、4℃、5分鐘進行離心。→利用吸出器去除上清液後，再一次重複(14)及(15)，進行洗淨。 (16)利用吸出器去除上清液後，添加FACS緩衝液500 μL，小心地移液。 (17)利用鑷子將尼龍網放置於專用試管，過濾懸浮液。 (18)利用任意之流式細胞儀機器進行解析。資料回收細胞數設為10000個以上。於計算目標抗原陽性率時，以對照樣品之陽性率成為5%以下之方式劃基準線，將顯示基準以上之抗原表現量的細胞之比率設為陽性率。
備註 ・固定及染色中使用之試劑類亦可作為「Foxp3/轉錄因子染色緩衝液套件(Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set)」(Cat.：00-5523)購買3件套。 ・機器之設定等只要不脫離可根據一般性/科學性見解明確地判斷無法實施正常之測定的程度，則為任意設定均無問題。明確之脫離係指對象之細胞集群之各種訊號低於設定之螢光閾值(threshold)之情形、對照樣品或測定對象樣品之各種訊號值低於或高於能夠利用機器正常地測定之極限值之情形等。
(免疫抑制活性測定) 本發明之細胞可具有免疫抑制活性。免疫抑制活性可利用各種方法進行測定。
於一實施方式中，如實施例所記載，可藉由測定應答T細胞所產生之免疫反應引起的細胞增生而判定是否被抑制。此外，可使用各種套組，可使用Treg免疫抑制分析(horizon discovery；https://www.horizondiscoverykk.com/products/research-services/immune-cell-based-assay/immune-suppression-assays/#Treg)等，但不限於此。本發明之細胞所具有之免疫抑制活性可較先前之iTreg增強。
(一般技術) 本說明書中使用之分子生物學方法、生化學方法、微生物學方法為該領域中周知慣用者，例如，記載於：Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor及其3rd Ed. (2001); Ausubel, F.M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊實驗醫學「基因導入＆表現解析實驗法」羊土社、1997等，該等於本說明書中，相關之部分(可為全部)係作為參考而援用。
關於用於製作人工地合成之基因之DNA合成技術及核酸化學，例如，亦可使用GeneArt、GenScript、Integrated DNA Technologies(IDT)等基因合成或片段合成服務，此外，例如記載於：Gait, M.J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press等，該等於本說明書中，相關之部分係作為參考援用。
於本說明書中，「或」可於能夠採用文章中列舉之事項之「至少一個以上」時使用。「或者」亦相同。於本說明書中，當明確記載「兩個值」之「範圍內」之情形時，該範圍亦包括兩個值本身。 本說明書中引用之科學文獻、專利、專利申請等參考文獻係以與分別具體地記載其全文相同之程度於本說明書中作為參考援用。
以上，對本發明例示較佳之實施方式進行了說明以易於理解。以下，基於實施例對本發明進行說明，但上述說明及以下之實施例僅以例示之目的提供，並不以限定本發明之目的提供。因此，本發明之範圍不受本說明書中具體地記載之實施方式亦不受實施例限定，而僅由申請專利範圍限定。 實施例
於以下之實施例中，使用不含麩醯胺之RPMI1640(含有10% FCS (v/v)、60 μg/mL青黴素G、100 μg/mL鏈黴素、10 mM HEPES)作為基礎培養基。視需要將30～300 mg/L之L-麩醯胺添加至培養基中使用。
亞硫酸氫鹽定序 自誘導之細胞獲取基因組DNA，使用MethylEasy Xceed快速DNA亞硫酸氫鹽修飾套組(MethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit)(Human Genetic Signatures)處理後，調查控制性T細胞所特徵性之基因之去甲基化。各基因之去甲基化之解析係使用已知之方法及引子(Floess et al. (2007) PloS Biology Volume 5, Issue 2, e38、及Ohkura et al. (2012) Immunity 37(5) 785-799)。
又，於人類Foxp3 CNS2區之解析中，在正向側使用5'-TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG-3'(序列編號1)、在反向側使用5'-ATCTAAACCCTATTATCACAACCCC-3'(序列編號2)。
各T細胞之組分之獲取 自健康正常人之PBMC單離人類CD4+T細胞。自濃縮之PBMC使用CliniMACS CD4 GMP MicroBeads，依據製品操作說明進行純化。
(實施例1：自CD4陽性人類末梢T細胞製造控制性T細胞) 對CD4陽性T細胞利用包含抗CD3抗體(每孔添加10 μg/ml濃度之抗體100 μL，於室溫下靜置60分鐘，藉此固相化至容器)、hIL-2(100 U/ml)、hTGFβ1(10 ng/ml)、視黃酸(1 μM)、SenexinA(5 μM)之基礎培養基進行3天刺激。其後，利用包含hIL-2(100 U/ml)之基礎培養基進行2天休眠培養。2天後同樣地進行培養基更換，進而進行2天休眠培養。2天後再次利用包含抗CD3抗體(每孔添加10 μg/ml濃度之抗體100 μL，於室溫下靜置60分鐘，藉此固相化至容器)、hIL-2(100 U/ml)、h TGFβ1(10 ng/ml)、視黃酸(1 μM)、SenexinA(5 μM)、抗壞血酸(10 μg/ml)之基礎培養基進行2天刺激。其後，利用包含hIL-2(100 U/ml)之基礎培養基進行2天休眠培養。2天後同樣地進行培養基，進而進行2天休眠培養。2天後對所獲得之控制性T細胞之FoxP3、CTLA4、Helios之表現藉由流式細胞分析法進行解析(圖1)。
先前之誘導性控制性T細胞(普通iTreg)中，功能性分子(例如，該情形時為CTLA4)之表現不充分，FoxP3誘導效率亦較低。另一方面，在內源性控制性T細胞(nTreg)中，表現CTLA4、FoxP3，表現作為nTreg標記物分子代表性之Helios。可確認到利用本案之製作法所獲得之高功能之誘導性控制性T細胞係包含大量Helios陰性且表現FoxP3及CTLA4之細胞之集群。Helios係體內內源性之控制性T細胞之標記物，Helios為陰性表示係誘導性控制性T細胞。關於利用先前之方法所獲得之誘導性控制性T細胞，作為一例，CTLA4為陰性，因此就至少CTLA4為陽性之方面而言，可知所獲得之誘導性控制性T細胞係於體外新誘導之誘導性控制性T細胞。
又，藉由亞硫酸氫鹽定序法確認利用相同之實驗系統培養之細胞之去甲基化狀態(圖2)。利用本發明之製作法所獲得之誘導性控制性T細胞顯示與nTreg類似之去甲基化狀態。
顯示藉由以上之實施例所獲得之誘導性控制性T細胞與內源性nTreg不同，係於體外新誘導之控制性T細胞，並且係具有較高之誘導效率、較高之CTLA4表現、FOXP3 CNS2區之去甲基化的具備既有之誘導性控制性T細胞所沒有之特徵的細胞。
(實施例2：控制性T細胞之體外抑制活性) 藉由與實施例1相同之實驗系統獲得控制性T細胞。將細胞追蹤紫標記之應答T細胞(5x10 4)、製作之控制性T細胞(5x10 4)於Treg抑制功能檢測試劑(Miltenyi Biotec)(5 μL/孔)存在下進行3天混合培養，利用流式細胞分析法解析細胞追蹤紫強度。若應答T細胞產生免疫反應，則由於細胞增生，細胞追蹤紫強度顯示複數個較弱之波峰，但若該免疫反應被抑制，則細胞追蹤紫強度保持單獨之較強之波峰不變。確認利用本發明之製作法所獲得之控制性T細胞較強地抑制應答T細胞之免疫反應。因此，確認所獲得之控制性T細胞與既有之控制性T細胞集群相比，具有較高之抑制功能(圖3)。
(實施例3：控制性T細胞之綜合基因表現解析) 藉由RNA定序法確認利用實施例1之方法所製作之控制性T細胞之基因表現模式(圖4)。RNA定序係利用已知之方法進行(Kitagawa et al. (2017) Nat. Immunol. 18, 173-183)。關於FOXP3、IL-2RA(CD25)、及Treg之主要之抑制性分子(CTLA4等)之基因，與既有之誘導性控制性T細胞及活化Tconv細胞相比，於利用本發明之製作法所獲得之誘導性控制性T細胞及nTreg細胞中可確認到較高之表現。又，於誘導性控制性T細胞中，確認到作為nTreg細胞之標記物的IKZF2之表現較低。可確認利用本發明之製作法所獲得之誘導性控制性T細胞與其他控制性T細胞集群相比，ENTPD1、NT5E、AREG等若干抑制性分子表現較高。又，可確認ITGAE等黏著分子、CCR4等趨化因子受體表現較高(圖4)。
作為一例，若對ITGAE所編碼之CD103分子之表現利用流式細胞分析法進行解析，則可確認到利用本案之製作法所獲得之誘導性控制性T細胞與其他控制性T細胞集群相比，CD103表現較高(圖5)。作為綜合之探討，可期待利用本案之製作法所獲得之誘導性控制性T細胞與既有之控制性T細胞相比，發揮較高之抑制能力。
(實施例4：自CD8陽性人類末梢T細胞製造控制性T細胞) 對CD8陽性T細胞利用包含抗CD3抗體(每孔添加10 μg/ml濃度之抗體100 μL，於室溫下靜置60分鐘，藉此固相化至容器)、hIL-2(100 U/ml)、hTGFβ1(10 ng/ml)、視黃酸(1 μM)、SenexinA(5 μM)之基礎培養基進行3天刺激。其後，利用包含hIL-2(100 U/ml)之基礎培養基進行2天休眠培養。2天後同樣地進行培養基更換，進而進行2天休眠培養。2天後再次利用包含抗CD3抗體(每孔添加10 μg/ml濃度之抗體100 μL，於室溫下靜置60分鐘，藉此固相化至容器)、hIL-2(100 U/ml)、hTGFβ1(10 ng/ml)、視黃酸(1 μM)、SenexinA(5 μM)、抗壞血酸(10 μg/ml)之基礎培養基進行2天刺激。其後，利用包含hIL-2(100 U/ml)之基礎培養基進行2天休眠培養。2天後同樣地進行培養基更換，進而進行2天休眠培養。2天後對所獲得之控制性T細胞之FoxP3、CTLA4、Helios之表現藉由流式細胞分析法進行解析(圖6)。
關於由CD8陽性T細胞製成之本發明之誘導性控制性T細胞，亦可確認到係包含大量Helios陰性且表現FoxP3及CTLA4之細胞的集群。
(實施例5：自人類末梢T細胞製造誘導性控制性T細胞) 使用人類末梢T細胞，以與實施例1相同之方式獲得誘導性控制性T細胞或其細胞集群。製造包含該誘導性控制性T細胞或其細胞集群與載體之醫藥。該醫藥包含約2x10 5個細胞作為誘導性控制性T細胞或其細胞集群，可根據向炎症疾病患者投予1個月後回收之組織中之炎症之程度確認有效性。
(實施例6：製劑例) 以與實施例1相同之方式獲得誘導性控制性T細胞或其細胞集群。製造包含該誘導性控制性T細胞或其細胞集群與載體之醫藥。
(實施例7：表現強度解析) 關於實施例1中製造之誘導性控制性T細胞之細胞集群，對CD25與FOXP3之表現強度藉由使用BD FACSLyric流式細胞儀之流式細胞分析法進行解析。將結果示於圖7。 於進行了試驗之所有細胞中，均可確認到FOXP3 Hi之誘導性控制性T細胞之細胞集群以較高之比率存在。
(實施例8：誘導性控制性T細胞之抗體組(antibody panel)解析) 為了綜合地解析實施例1中製造之誘導性控制性T細胞中之細胞表面標記物，進行抗體組解析。使用BioLegend之LEGENDScreen人類PE套組，對實施例1中製造之誘導性控制性T細胞進行染色，對與本發明之誘導性控制性T細胞反應之抗體藉由流式細胞分析法進行解析。將結果之一部分(可確認到明確且有意義之表現者)示於表1～4。 藉由包含未達400種之抗體組進行染色，結果可藉由至少185種表面標記物分子確認到本發明之誘導性控制性T細胞中之細胞表面標記物之陽性/陰性之特徵。 [表1]
抗原 表現型    抗原 表現型
ICOS +    CD137 -
IFNγRβ -    CD138 -
CD1a -    CD141 -
CD2 +    CD142 -
β2微球蛋白 +    CD143 -
鈣黏蛋白11 -    CD15 -
CD10 -    CD156c +
CD100 +    CD158e1 -
CD103 +    CD162 +
CD106 -    CD163 -
CD107a +    CD164 +
CD107b +    CD169 -
CD116 -    CD172g +
CD117 -    CD18 +
CD11a +    CD183 +
CD122 -    CD194 +
CD123 +    CD202b -
CD126 -    CD206 -
CD127 -    CD207 -
CD135 -    CD21 -
      CD213α2 +
      CD229 -
      CD23 -
      CD231 -
[表2]
抗原 表現型    抗原 表現型
CD25 +    CD35 -
CD27 -    CD354 -
CD271 -    CD365 -
CD275 -    CD367 -
CD147 +    CD38 +
CD28 +    CD39 +
CD29 +    CD4 +
CD290 -    CD40 -
CD298 +    CD41 -
CD3 +    CD42b -
CD300c +    CD43 +
CD309 -    CD44 +
CD317 +    CD45 +
CD324 -    CD47 +
CD328 -    CD49d +
CD334 -    CD5 +
CD335 -    CD50 +
CD336 -    CD54 +
CD34 -    CD55 +
CD340 -    CD58 +
      CD6 +
      CD61 -
      CD62E -
      CD62P -
      CD63 +
      CD64 -
      CD81 +
      CD85g -
      CD85k -
      CD89 -
      CD95 +
      CD97 +
      CD99 +
      CXCL16 -
[表3]
抗原 表現型    抗原 表現型    抗原 表現型
DLL1 - SUSD2 - CD303 -
DLL4 - Tim-4 - CD307 -
EGFR - TM4SF3 -
CD323 -
GPR19 - TSLPR -
CD36 -
HVEM + VEGFR3 -
IgM - CD133 - CD369 -
Ksp37 - APCDD1 - CD370 -
LY6G6D - BTLA + CD371 -
MERTK - CCR8 + CD45RO +
MUC-13 - CD102 + CD51 -
NKp80 - CD104 -
CD59 +
Notch1 + CD130 -
Notch3 - CD144 - CD7 +
Notch4 - CD158b - CD71 +
PSMA - CXCR4 + CD88 -
Siglec10 - CD192 + CRTAM -
Siglec7 - CD209 - FPR3 -
Siglec8 - CD230 +
     
Siglec9 - CD24 -   
SSEA-5 - CD245 -
      CD26 +
   CD269 -
CD282 -
[表4]
抗原 表現型    抗原 表現型
IL28RA - CD120b +
LOX-1 - CD210 +
MICA -
CD267 -
Notch2 +
CD294 -
TACSTD2 -
CD129 + CD49f -
CXCR1 + CD85d +
CD1d - 整聯蛋白β7 +
CD20 + 平足蛋白 -
CD220 - CD132 +
CD32 -
     
CD368 -   
CD52 +
CD66 +
CD85h -
CD85j -
EphA2 -
FceRla -
CD255 -
CD201 -
(實施例9：誘導性控制性T細胞中之細胞表面標記物解析) 將實施例8中實施之抗體篩選之結果中之特徵性者示於圖8。 可知本發明之誘導性控制性T細胞中，CD172g及CD26等特有之細胞表面標記物為陽性。
(註釋) 如以上所述，使用本發明之較佳之實施方式對本發明進行了例示，但應理解本發明應僅由申請專利範圍解釋其範圍。應理解本說明書中引用之專利、專利申請及其他文獻應與其內容本身具體地記載於本說明書中同樣地，將其內容作為對本說明書之參考援用。本案係主張於2021年11月24日向日本專利廳申請之特願2021-190127之優先權，其內容係與其整體構成本案之內容同樣地作為參考援用。 [產業上之可利用性]
本發明之誘導性控制性T細胞及/或細胞集群能夠用於各種免疫疾病、自體免疫病等炎症性疾病之治療或預防。又，藉由本發明之製作誘導性控制性T細胞及/或細胞集群之方法，能夠從末梢T細胞穩定地誘導具有高功能性之控制性T細胞，能夠期待向醫療領域之應用。 [序列表非關鍵文字]
序列編號1：實施例中使用之正向引子 序列編號2：實施例中使用之反向引子
圖1係表示本發明之誘導性控制性T細胞(亦稱為人類高功能穩定型iTreg(HSF iTreg)細胞)之一實施方式之表現型解析(流式細胞分析)的圖。從人類CD4陽性T細胞製作本發明之誘導性控制性T細胞(圖中為HSF-iTreg)，利用流式細胞分析法解析FOXP3、CTLA4、Helios之表現。比較對通常之nTreg(CD4陽性CD25陽性T細胞)進行了刺激之細胞、及通常之iTreg(普通iTreg：對CD4陽性T細胞於IL-2與TGF-β1之存在下進行了3天CD3/CD28刺激之細胞)。 圖2係表示本發明之iTreg(HSF iTreg)細胞之一實施方式之表觀基因組解析(亞硫酸氫鹽法)的圖。對圖1之各細胞利用亞硫酸氫鹽法解析FOXP3 CNS2區之去甲基化狀態。 圖3係表示本發明之iTreg(HSF iTreg)細胞之一實施方式之抑制能力解析(體外抑制分析)的圖。對圖1之各細胞之體外抑制能力進行解析。將人類CD4陽性T細胞利用細胞追蹤紫(Cell Trace Violet)試劑進行染色，與圖1之各細胞以一定之比率在Treg抑制功能檢測試劑(Treg Suppression Inspector)(Miltenyi Biotec)(5 μL/孔)之存在下進行3天混合培養，利用流式細胞分析法解析細胞追蹤紫強度。 圖4係表示本發明之iTreg(HSF iTreg)細胞之一實施方式之基因表現模式解析(RAN-seq法)的圖。對在IL-2存在下刺激圖1之各細胞及CD4陽性T細胞所得之FOXP3陰性細胞(Tconv)利用RNA定序法解析綜合基因表現模式。 圖5係表示本發明之iTreg(HSF iTreg)細胞之一實施方式之CD103表現(流式細胞分析法)的圖。對圖1之各細胞利用流式細胞分析法解析FOXP3陽性細胞中之CD103表現。 圖6係表示由人類CD8陽性T細胞製作之本發明之iTreg(HSF iTreg)細胞之一實施方式之表現型解析(流式細胞分析法)的圖。由人類CD8陽性T細胞製作本發明之控制性T細胞，利用流式細胞分析法解析FOXP3、CTLA4、Helios之表現。 圖7係表示本發明之iTreg(HSF iTreg)細胞之一實施方式之CD25表現及FOXP3表現(流式細胞分析法)的圖。藉由使用BD FACSLyric流式細胞儀之流式細胞分析法解析CD25與FOXP3之表現強度。 圖8係表示本發明之iTreg(HSF iTreg)細胞之一實施方式之表現型解析的圖。製作本發明之誘導性控制性T細胞(HSF-iTreg)，解析CD172g或CD26等之表現。
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Claims (38)

  1. 一種誘導性控制性人類T細胞，其具有選自由FoxP3陽性、CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少一個特徵。
  2. 一種誘導性控制性人類T細胞，其為NT5E陽性。
  3. 一種誘導性控制性人類T細胞，其為ITGAE(CD103)陽性。
  4. 一種誘導性控制性人類T細胞，其為AREG陽性。
  5. 一種誘導性控制性人類T細胞，其為CD172g陽性。
  6. 一種誘導性控制性人類T細胞，其為CD26陽性。
  7. 一種誘導性控制性人類T細胞，其為CTLA4陽性。
  8. 如請求項1至7中任一項之誘導性控制性人類T細胞，其至少為CTLA4陽性及FoxP3陽性。
  9. 如請求項1至8中任一項之誘導性控制性人類T細胞，其至少為CD172g陽性及/或CD26陽性。
  10. 如請求項1至9中任一項之誘導性控制性人類T細胞，其中FOXP3基因之CNS2部位被去甲基化。
  11. 如請求項1至10中任一項之誘導性控制性人類T細胞，其為CD4陽性或CD8陽性。
  12. 如請求項1至11中任一項之誘導性控制性人類T細胞，其係從人類之末梢血T細胞、或源自人類組織之T細胞獲得或誘導。
  13. 一種誘導性控制性人類T細胞，其係藉由包括如下步驟之方法獲得： (a)對人類末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟； (b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟； (c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及 (d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。
  14. 一種細胞集群，其包含如請求項1至13中任一項之誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之選自由FoxP3陽性、CTLA4陽性、NT5E陽性、ITGAE(CD103)陽性、AREG陽性、CD172g陽性、及CD26陽性所組成之群中之至少一個特徵之比率為約50%以上。
  15. 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之NT5E陽性之比率為約50%以上。
  16. 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之ITGAE(CD103)陽性之比率為約50%以上。
  17. 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之AREG陽性之比率為約50%以上。
  18. 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之CD172g陽性之比率為約50%以上。
  19. 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之CD26陽性之比率為約50%以上。
  20. 一種細胞集群，其包含誘導性控制性人類T細胞，且該細胞集群之CTLA4陽性之比率為約50%以上。
  21. 如請求項14至20中任一項之細胞集群，其至少上述CTLA4陽性及FoxP3陽性之比率分別為約50%以上。
  22. 如請求項14至21中任一項之細胞集群，其至少上述CD172g陽性及/或CD26陽性之比率分別為約50%以上。
  23. 如請求項14至22中任一項之細胞集群，其中上述細胞集群中之上述至少一個特徵之比率為約60%以上。
  24. 如請求項14至23中任一項之細胞集群，其中上述細胞集群中之上述至少一個特徵之比率為約80%以上。
  25. 如請求項14至24中任一項之細胞集群，其中FoxP3強陽性之比率為約50%以上。
  26. 如請求項14至25中任一項之細胞集群，其中上述細胞集群之約90%以上為T細胞。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之誘導性控制性人類T細胞或如請求項14至26中任一項之細胞集群。
  28. 一種再生醫療用材料或製品，其包含如請求項1至13中任一項之誘導性控制性人類T細胞或如請求項14至26中任一項之細胞集群。
  29. 一種製造誘導性控制性人類T細胞之方法，其包括如下步驟： (a)對人類末梢血中之CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用第一基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟； (b)對步驟(a)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟； (c)對步驟(b)中所獲得之細胞利用第二基礎培養基進行約1～約5天刺激之步驟；及 (d)對步驟(c)中所獲得之細胞利用包含IL-2之培養基進行至少約1～約3天休眠培養之步驟。
  30. 如請求項29之方法，其中上述第一基礎培養基包含選自由抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸所組成之群中之至少一個因子。
  31. 如請求項29或30之方法，其中上述第一基礎培養基包含抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、CDK8/19抑制劑、及抗壞血酸。
  32. 如請求項29至31中任一項之方法，其中上述第二基礎培養基包含選自由抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及CDK8/19抑制劑所組成之群中之至少一個因子。
  33. 如請求項29至32中任一項之方法，其中上述第二基礎培養基包含抗CD3抗體、TGF-β1、IL-2、視黃酸、CDK8抑制劑、CDK19抑制劑、及CDK8/19抑制劑。
  34. 如請求項29至33中任一項之方法，其中步驟(a)係對上述CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞利用上述第一基礎培養基進行約3天刺激。
  35. 如請求項29至34中任一項之方法，其中步驟(b)係對步驟(a)中所獲得之細胞利用上述包含IL-2之培養基進行至少約2天休眠培養。
  36. 如請求項29至35中任一項之方法，其中步驟(c)係對步驟(b)中所獲得之細胞利用上述第二基礎培養基進行約3天刺激。
  37. 如請求項29至36中任一項之方法，其中步驟(d)係對步驟(c)中所獲得之細胞利用上述包含IL-2之培養基進行至少約2天休眠培養。
  38. 一種誘導性控制性人類T細胞或包含上述誘導性控制性人類T細胞之細胞集群，其係藉由如請求項29至37中任一項之方法生成。
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