TW202319059A - 用於治療動物之骨關節炎之間葉幹細胞 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療犬科動物及貓科動物之骨關節炎。本發明亦關於一種包含自周邊血液分離之MSC的醫藥組合物。
Description
本發明亦關於用於治療犬科動物及貓科動物之骨關節炎之間葉幹細胞。
骨關節炎(OA)為獸醫學實踐中因代謝紊亂及關節發炎反應所致之最常出現之關節病症中的一者。其在大致20%之超過一歲之狗中盛行且特徵在於進行性退化及滑動關節重塑，最終導致慢性疼痛、不適、關節腫脹及跛行。此外，所有貓中之幾乎40%顯示OA臨床徵象，且90%之超過12歲之貓顯示OA放射線跡象。諸如非類固醇抗炎藥(NSAID)及皮質類固醇之針對OA之體重管理、量身定製的運動及醫學治療主要集中於疼痛減輕及發炎反應治療，但不能夠減緩疾病惡化或逆轉病理病況。持續高劑量之某些老一代NSAID與胃腸、腎及肝異常相關。皮質類固醇提供相當短的疼痛減輕且可能會誘發進一步軟骨損傷。因此，極高度需要有效且長期的犬科動物及貓科動物OA治療選項。
已提議間葉幹細胞(MSC)作為潛在替代方案，此係歸因於其有免疫調節特性，可抑制OA發炎過程，在很短的時間內減緩其惡化，且甚至引起持續損傷之逆轉。若干犬科動物研究已調查了MSC在骨關節炎治療中之安全性及功效且顯示出非常有趣的結果。
此等犬科動物研究中之大部分使用衍生自脂肪組織或骨髓(BM)之自體MSC，該等自體MSC係藉由在受影響關節中進行關節內注射來投與。然而，因為骨關節炎常常會影響狗及貓之多個關節，因此此種MSC療法極為昂貴且耗時。關節內注射為侵入性程序，該程序要求鎮靜、經驗及靶向診斷。
在一些情況下，使用異體或異種MSC為更有利的選項，此係因為其提供嚴格選擇的健康且高品質的幹細胞供體。其允許產生即用型產品，從而避免自各個別患者侵入性收取及耗時性培養MSC。因為犬科動物及貓科動物MSC之培養能力相對較低，因此可有利地使用異種(例如人類或馬) MSC，尤其用於商業應用，諸如用於治療犬科動物或貓科動物之OA。另外，異種MSC不含傳染性物種特異性病原體。
在一些情況下，使用天然MSC為有利的選項，此係因為其允許在最少製造及操作之情況下產生即用型產品，藉此降低生產成本。
此項技術中仍需要MSC之改良使用以減緩貓科及犬科OA之疾病惡化及/或甚至逆轉病理病況。本發明之目標在於解決前述缺點中之至少一者。
本發明及其實施例用以提供針對上文所提及之缺點中之一或多者的解決方案。為此目的，本發明係關於如技術方案1之間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療犬科動物及貓科動物之骨關節炎。在實施例中，該等MSC係靜脈內投與的。在實施例中，該等MSC係天然MSC。在實施例中，該等MSC係異種MSC。用於本發明之MSC之較佳實施例示於技術方案2至19中之任一者中。在如技術方案18之尤其較佳實施例中，該治療為經診斷患有或罹患骨關節炎之犬科動物及貓科動物之跛行及/或關節疼痛治療。
在第二態樣中，本發明係關於如技術方案20之包含天然、周邊血液衍生之MSC之醫藥組合物，該等MSC為動物衍生的且存在於無菌液體中。
與僅到達局部關節且必須單獨地施用至(多個)受影響關節中之各者的局部關節內注射之MSC相比，靜脈內投與之MSC可到達多個關節。靜脈內投與為非侵入性程序且不需要鎮靜。該等侵入性程序及/或鎮靜可能會涉及風險，尤其對於已處於罹患骨關節炎之較高風險下之年歲較大的患者。因此，經由靜脈內(IV)注射進行之MSC全身投與在療法應用中提供實質效益。
本發明係關於用於治療犬科動物及貓科動物之骨關節炎(OA)之天然MSC，其中該等MSC可藉由靜脈內注射來投與。一種靜脈內注射為與必須單獨地施用至(多個)受影響關節中之各者之局部關節內注射相比到達多個關節之全身投與。另外，靜脈內注射為非侵入性程序且不需要鎮靜。該等侵入性程序及/或鎮靜可能會涉及風險，尤其對於已處於罹患骨關節炎之較高風險下之年歲較大的哺乳動物患者。因此，經由靜脈內(IV)注射進行之MSC全身投與在療法應用中提供實質效益。
定義除非另外定義，否則包括技術及科學術語之用於揭示本發明之所有術語皆具有如本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解之含義。藉助於進一步導引，將術語定義包括在內以更好地瞭解本發明之教示內容。
如本文所使用之以下術語具有以下含義：
除非上下文另外清楚地指示，否則如本文所使用之「一(a/an)」及「該」係指單數個提及物及複數個提及物。舉例而言，「一腔室(a compartment)」係指一個或超過一個腔室。
如本文所使用之「約」係指諸如參數、量、時距及其類似者之可量測值，意圖涵蓋規定值之+/- 20%或更低、較佳+/- 10%或更低、更佳+/- 5%或更低、甚至更佳+/- 1%或更低且仍更佳+/- 0.1%或更低及相對於規定值之變化，到目前為止，該等變化適合於在本發明中執行。然而，應理解，修飾語「約」所指之值自身亦為特定揭示的。
如本文所使用之「包含(comprise/comprising/comprises/comprised of)」與「包括(including/includes)」或「含有(contain/containing/contains)」同義且為包括性或開放式術語，其規定例如組分跟隨者之存在且不排除或妨礙此項技術中已知或其中揭示之額外非敍述組分、特點、要素、成員、步驟之存在。
此外，除非規定，否則本說明書及申請專利範圍中之術語第一、第二、第三及其類似術語用於區分類似要素且未必描述連續或時間次序。應理解，如此使用之術語在適當情況下可互換，且本文所描述之本發明之實施例能夠以本文所描述或說明之順序以外的順序操作。
以端點敍述數值範圍包括含於該範圍內之所有數值及分數以及所敍述之端點。
鑒於術語「一或多個」或「至少一個」，諸如一組成員中之一或多個成員或至少一個成員，藉助於進一步例證說明而使得本身為清楚的，該術語尤其涵蓋對以下之提及：該等成員中之任一者或該等成員中之任何兩者或更多者，諸如該等成員中之任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7個等，及至多所有該等成員。
除非另外定義，否則包括技術及科學術語之用於揭示本發明之所有術語皆具有如本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解之含義。藉助於進一步導引，將本說明書中所使用之術語之定義包括在內以更好地瞭解本發明之教示內容。本文所使用之術語或定義係僅提供用於輔助理解本發明。
本說明書通篇提及「一個實施例(one embodiment)」或「一實施例(an embodiment)」意謂結合實施例描述之特定特點、結構或特徵包括於本發明之至少一個實施例中。因此，片語「在一個實施例中」或「在一實施例中」出現在本說明書通篇各處未必全部指代同一實施例，但可全部指代同一實施例。此外，如熟習此項技術者將自本發明顯而易見，在一或多個實施例中，特定特點、結構或特徵可以任何適合方式組合。此外，如熟習此項技術者所理解，當本文所描述之一些實施例包括一些而非其他包括於其他實施例中之特點時，不同實施例之特點組合意圖在本發明之範疇內且形成不同實施例。舉例而言，在隨附申請專利範圍中，所主張之實施例中之任一者可以任何組合形式使用。
術語「間葉幹細胞」、「MSC」或「間葉基質細胞」係指表現特定集合之表面抗原且可當活體外培養時或當活體內存在時分化成包括但不限於脂肪細胞、軟骨細胞及骨細胞之各種細胞類型的多潛能、自身更新細胞。
術語「分離(isolated)」係指自細胞培養物或如血液之生物樣本物理上鑑別及分離細胞，此可藉由應用適當的細胞生物學技術來執行，該等技術係基於對應於準則之細胞培養物檢驗及細胞表徵(及當可能及需要時之物理分離)，或基於根據抗原之存在/不存在及/或細胞大小的細胞自動化分選(諸如利用FACS)。在一些實施例中，術語「分離(isolating/isolation)」可包含物理上分離及/或定量細胞，尤其藉由進行流動式細胞測量術之另一步驟。
如本文所使用之術語「活體外」指示在身體之外或外部。如本文所使用之術語「活體外」應理解為包括「離體」。術語「離體」通常指組織或細胞自身體移除且維持或在身體之外，例如在培養容器或生物反應器中繁殖。
術語「繼代(passage/passaging)」在此項技術中常見且係指經培養(間葉幹)細胞自培養受質及彼此剝離及解離。為簡單起見，在貼壁培養條件下首次生長細胞之後執行之繼代一般稱為「第一代」(或第1代，P1代)。細胞可繼代至少一次且較佳兩次或更多次。在第1代之後的各代係以數值加1提及，例如第2代、第3代、第4代、第5代或P1、P2、P3、P4、P5等。
術語「細胞培養基(cell medium/cell culture medium)」或「培養基(medium)」係指包含可用於維持細胞或使細胞生長之營養物的水性液體或膠狀物質。細胞培養基可含血清或不含血清。細胞培養基可包含或補充有生長因子。
如本文所使用之術語「生長因子(growth factor)」係指單獨或當藉由其他物質調節時影響各種細胞類型之增殖、生長、分化、存活及/或遷移且可影響生物體之發育、形態及功能變化的生物活性物質。生長因子通常可藉由以配位體形式結合至存在於細胞中之受體(例如表面或胞內受體)而起作用。
「自體(autologous)」投與MSC在本上下文中係指將來自供體之MSC投與接受者，其中接受者及供體係相同的。
「異體(allogeneic)」投與MSC在本上下文中係指將來自供體之MSC投與接受者，其中接受者及供體屬於相同物種，但不相同。
「異種(xenogeneic)」投與MSC在本上下文中係指將來自供體之MSC投與接受者，其中接受者及供體係來自不同物種。
「天然MSC (native MSC)」在本發明之上下文中係指尚未暴露於諸如發炎介質之刺激環境的MSC。如本文所使用之「發炎環境(inflammatory environment)」或「發炎病況(inflammatory condition)」係指特徵在於以下之狀態或病況：(i)至少一種促炎性免疫細胞、促炎性細胞介素或促炎性趨化因子增多；及(ii)至少一種抗炎性免疫細胞、抗炎性細胞介素或抗炎性趨化因子減少。
術語「抗炎性(anti-inflammatory)」、「抗炎(anti-inflammation)」、「免疫抑制性(immunosuppressive)」及「免疫抑制劑(immunosuppressant)」係指特徵在於局部發炎之至少一種適應症(諸如但不限於發熱、疼痛、腫脹、發紅及功能喪失)減輕之任何狀態或病況及/或特徵在於(i)至少一種促炎性免疫細胞、促炎性細胞介素或促炎性趨化因子減少及(ii)至少一種抗炎性免疫細胞、抗炎性細胞介素或抗炎性趨化因子增多之全身狀態變化。
本發明之「群體倍增時間(population doubling time)」或「PDT」係藉由下式計算：PDT = T/(ln(N
f/N
i)/ln(2))，其中T為達到80%匯合度之細胞培養時間(以天為單位)，N
f為細胞剝離後之最終細胞數目且其中N
i為零時間點之初始細胞數目。
術語「抗凝劑」意謂可抑制血液凝固之組合物。用於本發明中之抗凝劑之實例包括EDTA或肝素。
在本發明中，術語「膚色血球層(buffy coat)」應理解為較佳藉助於密度梯度離心獲得之未凝固血液之溶離份，其中該溶離份富含白血球及血小板。
術語「血液中間相(blood-inter-phase)」應理解為較佳藉助於密度梯度而獲得、位於主要由紅血球及多形核細胞組成之底部溶離份與主要由血漿組成之上部溶離份之間的血液之溶離份。血液中間相為包含單核球、淋巴球及MSC之血液單核細胞(BMC)之來源。
如本文所使用之術語「懸浮直徑(suspension diameter)」理解為當處於懸浮液中時細胞之平均直徑。量測直徑之方法為此項技術中已知的。可能方法為流動式細胞測量術、共焦顯微術、影像細胞儀或此項技術中已知之其他方法。
術語「治療有效量(therapeutically effective amount)」為化合物或組合物有效減輕疾病症狀或改善疾病病況之最低量或濃度。
術語「治療(treatment)」係指用於減輕病理病況或病症、或防止罹患病理病況或病症、或防止病理病況或病症惡化之治療性、防治性或預防性措施。
「骨關節炎(osteoarthritis)」(OA)亦稱為「退化性關節疾病」(DJD)，係由軟骨劣變造成之進行性惡化的關節發炎。在健康關節中，軟骨充當軟墊以允許關節在其整個活動範圍內平穩地移動。在骨關節炎之情況下，此軟骨軟墊由於諸如年齡、損傷、重複應激或疾病之因素而開始破裂。此保護性軟墊之損耗會導致疼痛、發炎、活動範圍減少及出現骨刺。儘管體內任何關節均可能會罹患骨關節炎，但病況最常影響肢體及下脊椎。對於諸如狗及貓之動物，OA之典型視覺徵象可包括僵硬、跛行或難以起身；嗜睡；厭惡跑步、跳躍或玩耍；體重增加；應激性或行為變化；撫摸或觸碰時疼痛；難以作出排尿或排便姿勢或在家裏發生意外；及/或肢體及脊椎上方之肌肉質量損失。
術語「患者(patient)」、「受試者(subject)」、「動物(animal)」或「哺乳動物(mammal)」可互換使用且係指待治療之哺乳動物受試者。較佳地，哺乳動物為犬科動物或貓科動物，諸如狗或貓。
本發明中之「貓科動物(feline/felines)」係指貓科中之貓。此科中之成員亦稱為貓類。將活貓科劃分為兩個亞科：豹亞科(Pantherinae)及貓亞科(Felinae)。豹亞科包括五個豹物種及兩個雲豹物種，而貓亞科包括十個屬中之其他34個物種，尤其包括家貓、獵豹、藪貓、猞猁及美洲獅。
本發明中之「犬科動物(canine/canines)」係指犬科中之類狗食肉目。此科中之成員稱為犬類。犬科內存在三個亞科，亦即滅絕的恐犬亞科(Borophaginae)及黃昏犬亞科(Hesperocyoninae)以及尚存的犬亞科(Caninae)。犬亞科稱為犬科動物，且包括家狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼以及其他尚存的物種及滅絕的物種。
「混合淋巴球反應(Mixed Lymphocyte Reaction；MLR)」分析傳統上用於研究外部試劑是否刺激或抑制T細胞增殖。可藉由使用MLR分析研究MSC之免疫調節特性。對於此MLR分析，反應者T細胞經螢光染料標記，當其暴露於特定光頻率時會發出綠光。隨後，此等反應者T細胞經植物促分裂原刀豆球蛋白A (ConA)刺激以誘導或刺激增殖。ConA為抗原非依賴性促分裂原且可用作替代性T細胞刺激物。此凝集素常常用作T細胞刺激實驗中之抗原呈現細胞之替代物。刀豆球蛋白A不可逆地結合至細胞表面上之醣蛋白且提交T細胞進行增殖。此係用於刺激轉錄因子及細胞介素產生之快速方式。當T細胞開始分裂時，染料分佈於其子細胞上，因此染料在每一細胞分裂之情況下連續稀釋。因此，T細胞增殖量可藉由察看顏色減退來量測。因此，為了研究MSC之免疫調節特性，將此等MSC添加至經刺激之反應者T細胞中且共同培育若干天。包括適當的陽性對照及陰性對照以查看是否成功地執行測試。在培育期結束時，使用流動式細胞測量術來量測T細胞增殖量，從而使得能夠查看MSC是否抑制T細胞增殖。
描述在第一態樣中，本發明係關於間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療犬科動物及貓科動物之骨關節炎(OA)，或用作用於治療犬科動物及貓科動物之OA之方法，或用於製備用以治療犬科動物及貓科動物之OA的藥劑，其中該等MSC較佳為原生的且較佳靜脈內投與。
由於MSC有免疫調節特性，因此提議其用於治療發炎相關疾病。此等免疫調節特性可抑制尤其骨關節炎(OA)之擴大發炎過程，在很短的時間內減緩其惡化，且甚至引起持續損傷之逆轉。先前(犬科動物)研究已調查了MSC在骨關節炎治療中之安全性及功效且顯示出非常有趣的結果。此等犬科動物研究中之大部分使用衍生自脂肪組織或骨髓(BM)之自體MSC，該等自體MSC係藉由在受影響關節中進行關節內注射來投與。然而，因為OA常常會影響類狗及類貓哺乳動物之多個關節，因此此種MSC療法極為昂貴且耗時。另外，關節內注射為侵入性程序，該程序要求鎮靜、經驗及靶向診斷。
因此，MSC之全身投與可有利地經由靜脈內(IV)投與，例如經由注射或輸注來達成，在療法應用中提供實質效益。
該犬科動物及貓科動物可為犬科，較佳犬亞科中之任何類狗食肉目，更佳為家狗(domestic dog) (家犬(
Canis familiaris))；或貓科，較佳貓亞科中之任何貓，更佳為家貓(domestic cat) (家貓(
Felis catus))。
在一實施例中，所使用之該等MSC為原生的。該等天然MSC首先不活體外暴露於諸如發炎介質或發炎環境之刺激劑。該發炎環境係指特徵在於以下之狀態或病況：(i)至少一種促炎性免疫細胞、促炎性細胞介素或促炎性趨化因子增多；及(ii)至少一種抗炎性免疫細胞、抗炎性細胞介素或抗炎性趨化因子減少。使用天然MSC有時為有利的選項，此係因為其允許在最少製造及操作之情況下產生即用型產品，藉此降低生產成本。
較佳地，MSC具有在10 µm與100 μm之間、更佳在15 µm與80 µm之間、更佳在20 µm與75 μm之間、更佳在25 µm與50 μm之間的細胞大小。在一實施例中，用於本發明之MSC係藉助於過濾器系統選擇大小，其中使用40 μm過濾器使細胞經歷雙重過濾步驟。雙重或多重過濾步驟係較佳的。後者提供高單細胞群體且避免細胞聚集體之存在。該等細胞聚集體可在藉由冷凍保存細胞期間造成細胞死亡且可全部對細胞之另外下游應用具有影響。舉例而言，當靜脈內投與細胞聚集體時，其可能會有較高的出現毛細管栓塞之風險。
用於本發明之MSC可源自各種組織或體液，特定言之，源自血液、骨髓、脂肪組織或羊膜組織。已報導自骨髓收取MSC與出血、慢性疼痛、神經血管損傷及甚至死亡相關。作為MSC來源之脂肪組織視為更安全的選項。然而，自脂肪組織收取MSC仍要求在供體動物中進行切開，因此，此仍為侵入性程序。衍生自血液之MSC與衍生自骨髓及脂肪組織之MSC顯示類似形態。因此，較佳地，MSC源自血液，包括但不限於臍帶血及周邊血液。更佳地，MSC源自周邊血液。血液不僅為非侵入性且無痛的來源，而且收集簡單且安全，且因此可易於獲得。MSC或包含MSC之血液可源自所有哺乳動物，包括但不限於人類、家養動物及農場動物、動物園動物、運動型動物、寵物動物、伴生動物及實驗動物，諸如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、母牛、馬、豬及例如猴及猿之靈長類動物；尤其馬、人類、貓、狗、嚙齒動物等。在一實施例中，該來源為馬。特定言之，MSC可衍生自周邊血液，較佳馬周邊血液，此允許每年多次收集MSC，且供體動物的不適或發病率最低。
在一些情況下，使用異體或異種MSC為更有利的選項，此係因為其提供嚴格選擇的健康且高品質的幹細胞供體。其允許產生即用型產品，從而避免自各個別患者侵入性收取及耗時性培養MSC。由於犬科動物及貓科動物MSC之培養能力與例如馬或人類MSC相比相對較低，因此使用異種(例如人類或馬) MSC相比異體犬科動物或貓科動物MSC較佳，尤其用於商業應用，諸如用於治療犬科動物或貓科動物之OA。
因此，在一特定實施例中，本發明之MSC可用於異體或異種投與受試者。如已指示，異體或異種用法允許更好地控制MSC之品質，此係因為可篩檢不同供體，且可選擇最佳供體。鑒於製備功能性MSC，後者為必不可少的。此與使用自體MSC時相反，因為在此情況下，較難以確保細胞品質。儘管如此，自體用法亦可具有其效益。在一種情況下，分離血液MSC，此時所使用之血液來自後來亦成為該經分離MSC之接受者的供體。在另一情況下，使用來自供體之血液，其中供體較佳與自供體血液分離之MSC之接受者屬於相同家族、性別或人種。特定言之，將針對常見的當前可傳染疾病或病變對此等供體進行測試，以避免經由幹細胞水平傳播此等病變或疾病之風險。較佳地，供體/供體動物保持隔離。當使用馬供體時，可例如針對以下病變、病毒或寄生蟲對其進行測試：馬感染性貧血(EIA)、馬鼻肺炎(EHV-1、EHV-4)、馬病毒性動脈炎(EVA)、西尼羅河病毒(West Nile virus；WNV)、非洲馬疫(African horse Sickness；AHS)、馬媾疫(錐蟲)、馬焦蟲病、鼻疽(馬鼻疽(malleus)、鼻疽)、馬流感、萊姆疏螺旋體病(Lyme borreliosis；LB) (伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、萊姆病(Lyme disease))。
在一實施例中，用於本發明之MSC之特徵可在於出現以下中之一或多者/經量測之以下中之一或多者呈陽性：標記物CD29、CD44、CD90、CD105、波形蛋白、纖維結合蛋白、Ki67、CK18或其任何組合。在另一實施例中，用於本發明之MSC之特徵可在於存在間葉標記物CD29、CD44及CD90。藉助於後者，可分析所獲得MSC之純度，且可測定MSC之百分比。
CD29為由整合素β 1基因編碼之細胞表面受體，其中受體與其他蛋白質形成複合物以在配位體結合後調節生理活性。CD44抗原為參與細胞-細胞相互作用、細胞黏附及遷移之細胞表面醣蛋白。另外，CD44為玻糖醛酸之受體且亦可與諸如骨橋蛋白、膠原蛋白及基質金屬蛋白酶(MMP)之其他配位體相互作用。CD90抗原為視為如MSC之幹細胞之標記物的保守細胞表面蛋白。對CD29/CD44/CD90呈三陽性之本發明之MSC使得熟習此項技術者能夠快速且明確地選擇MSC且提供對另外下游應用有益之MSC生物特性。
在一實施例中，用於本發明之MSC之特徵在於不存在以下各者/量測之以下各者呈陰性：II類主要組織相容複合體(MHC)分子，較佳所有當前已知的II類MHC分子，從而將細胞分類為可用於諸如貓科動物或犬科動物細胞療法之哺乳動物細胞療法中的細胞。即使當MSC部分分化時，MSC對II類MHC分子仍呈陰性。可使用流動式細胞測量術對MHC II分子之存在或不存在執行偵測及對MHC II分子之表現執行定量。
在另一進一步實施例中，MSC量測之作為造血細胞之標記物之CD45抗原呈陰性。
在一實施例中，MSC量測之II類MHC分子及CD45呈陰性。
在一尤其較佳實施例中，用於本發明之MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45呈陰性。
一般而言，MSC在其表面上表現I類MHC抗原。在一特定實施例中，用於本發明之MSC具有低含量或不可偵測含量之I類MHC標記物。在一最佳實施例中，該等MSC量測之II類MHC標記物呈陰性且具有低含量或不可偵測含量之I類MHC標記物，其中該細胞展現極低免疫原性表現型。出於本發明起見，該低含量應理解為小於所有表現該MHC I或MHC II之細胞之25%，更佳小於15%。可使用流動式細胞測量術對MHC I及MHC II分子之存在或不存在執行偵測及對MHC I及MHC II分子之表現執行定量。
MSC之此等免疫特性限制接受者免疫系統在細胞移植之後辨識及排斥細胞、較佳異體或異種細胞之能力。MSC產生調節免疫反應的因子以及其在局部刺激下分化成適當細胞類型之能力使其成為細胞療法所需之幹細胞。
在一實施例中，當用於本發明之MSC存在於發炎環境或條件中時，其分泌免疫調節性前列腺素E2細胞介素。
發炎環境或條件之特徵在於募集血液之免疫細胞。發炎介質包括前列腺素、諸如IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-15之發炎性細胞介素、諸如IL-8之趨化因子及如TNF-α、IFN-γ之其他發炎性蛋白質。此等介質主要由單核球、巨噬細胞、T細胞、B細胞產生以在發炎部位處募集白血球，且隨後刺激具有刺激性及抑制性相互作用之複雜網狀物以同時破壞組織且使該組織自發炎過程中治癒。
前列腺素E2 (PgE2)為前列腺素家族之亞型。PgE2由經由連續酶反應自膜磷脂釋放之二十碳四烯酸(AA)合成。稱為前列腺素-內過氧化酶合成酶之環氧合酶-2 (COX-2)將AA轉化成前列腺素H2 (PgH2)，且PgE2合成酶將PgH2異構化成PgE2。作為速率限制酶，COX-2因應包括生長因子、發炎性細胞介素及腫瘤啟動子刺激之生理條件控制PgE2合成。
在一特定實施例中，存在於發炎環境中之該等MSC以範圍在10
3皮克/毫升至10
6皮克/毫升之間的濃度分泌可溶性免疫因子前列腺素E2 (PgE2)，從而誘導或刺激經MSC調節之免疫抑制。
MSC以彼等特定濃度範圍分泌之PgE2在活體外刺激了抗炎過程且連同其分化成適當細胞類型之能力一起成為細胞移植所需之MSC。
在一較佳實施例中，用於本發明之MSC量測為：
- 對間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性；
- 對由波形蛋白、纖維結合蛋白、Ki67或其組合組成之群中所包含之一或多種標記物呈陽性；
- 對II類MHC分子呈陰性；
- 對造血標記物CD45呈陰性，及
- 較佳地具有低含量或不可偵測含量之I類MHC分子，其中該低含量理解為小於所有表現MHC I之細胞之25%，更佳小於15%。
在一最佳實施例中，用於本發明之MSC量測為：
- 對間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性；
- 對由波形蛋白、纖維結合蛋白、Ki67或其組合組成之群中所包含之一或多種標記物呈陽性；
- 對II類MHC分子呈陰性；
- 對造血標記物CD45呈陰性；及
- 較佳地具有低含量或不可偵測含量之I類MHC分子，其中該低含量理解為小於所有表現MHC I之細胞之25%，更佳小於15%，
其中當該細胞存在於發炎環境或條件中時，其以範圍在10
3皮克/毫升至10
6皮克/毫升之間的濃度分泌免疫調節性PgE2細胞介素。
在另一進一步實施例中，當用於本發明之MSC存在於發炎環境或條件中時且與具有相同特徵、但未接受該發炎環境或條件之MSC相比具有增加之選自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其組合中之至少一種分子的分泌及減少之IL-1之分泌。
在一較佳實施例中，當MSC存在於發炎環境或條件中時具有增加之選自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其組合中之至少一種分子的分泌及減少之IL-1之分泌。可與具有如上文呈現之相同特徵、但未接受該發炎環境或條件之間葉幹細胞進行比較。
較佳地，MSC具有增加之PgE2以及上文所提及之因子中之兩者或更多者的分泌。
PgE2、IL-6、IL-10、TGF-B及NO幫助抑制如T細胞及B細胞之主要免疫細胞群體的增殖及功能。另外，MSC表現低含量之I類MHC分子及/或對其表面上之II類MHC分子呈陰性，從而逃脫免疫原性反應。另外，當前MSC可藉由其增加之上文所提及之因子之分泌來抑制白血球增殖，再次幫助避免宿主之免疫原性反應。
在另一進一步實施例中，MSC在存在外周血液單核細胞(PBMC)之情況下刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其組合之分泌及/或抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-13或其組合之分泌。在另一進一步實施例中，MSC在存在PBMC之情況下抑制TGF-β1之分泌。
在發炎環境中，MSC分泌多種調節宿主免疫反應之因子。另外，MSC具有刺激作用以誘導或刺激一或多種選自由PgE2、IL-6、IL-10、NO或其組合組成之群之因子的分泌。緊接於MSC在發炎環境中對PBMC之刺激作用，MSC亦對PBMC之分泌具有抑制作用，從而引起一或多種選自由TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β1、IL-13或其組合組成之群之因子減少。MSC在發炎環境中具有調節作用，從而使其可用於治療所有類別之疾病，尤其免疫系統病症。
一般而言，文獻中公佈之用於鑑別及表徵用於特定細胞類型(例如間葉、肝、造血、上皮、內皮標記物)或具有特定定位(例如胞內、在細胞表面上或經分泌)之細胞標記物的任何技術可視為適合於表徵MSC。該等技術可分組成兩類：允許在分析期間維持細胞完整性之技術及基於使用該等細胞產生之提取物(包含蛋白質、核酸、膜等)之技術。在用於鑑別該等標記物且量測其為陽性或陰性之技術中，細胞培養基之免疫細胞化學或分析係較佳的，此係因為此等技術即使在低量細胞之情況下亦允許進行標記物偵測而不對其造成破壞(在西方墨點法或流動式細胞測量術之情況下將如此)。
MSC之免疫調節特性可使用MLR分析法來分析。對於此MLR分析法，反應者T細胞經螢光染料標記，當其暴露於特定光頻率時會發出綠色。隨後，此等反應者T細胞經植物促分裂原刀豆球蛋白(ConA)刺激以誘導或刺激增殖。當T細胞開始分裂時，染料分佈於其子細胞上，因此染料在每一細胞分裂之情況下連續稀釋。因此，T細胞增殖量可藉由察看顏色減退來量測。因此，為了研究MSC之免疫調節特性，將此等MSC添加至經刺激之反應者T細胞中且共同培育若干天。包括適當的陽性對照及陰性對照，以查看是否成功地執行測試。在培育期結束時，使用流動式細胞測量術來量測T細胞增殖量，從而使得吾等能夠查看MSC是否抑制T細胞增殖。
MSC之相關生物特點可藉由使用諸如以下之技術來鑑別：流動式細胞測量術、免疫細胞化學、質譜法、凝膠電泳、免疫分析(例如免疫墨點法、西方墨點法、免疫沈澱、ELISA)、核酸擴增(例如即時RT-PCR)、酶活性、體學技術(omics-technologies)(蛋白質體學、脂質體學、醣體學、轉譯體學、轉錄體學、代謝體學)及/或其他生物活性。
本發明之MSC可藉由此項技術中已知之任何標準方案衍生。在一實施例中，該等MSC可經由其中自血液或血液相分離MSC且其中在基礎培養基，較佳在低葡萄糖培養基中培養且擴增該等細胞之方法來獲得。
如此項技術中已知之基礎培養基調配物包括但不限於伊格爾氏(Eagle's)最低必需培養基(MEM)、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)、α改良最低必需培養基(α-MEM)、必需基礎培養基(BME)、伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium；IMDM)、BGJb培養基、F-12營養物混合物(漢姆(Ham))、李博維茲(Liebovitz) L-15、DMEM/F-12、必需改良伊格爾氏培養基(EMEM)、RPMI-1640、培養基199、威茅斯氏(Waymouth's) 10 MB 752/1或威廉姆斯培養基E (Williams Medium E)及改良培養基及/或其組合。以上基礎培養基之組成一般在此項技術中已知，且熟習此項技術者可在其技能範圍內，視所培養細胞之需要修改或調節培養基及/或培養基補充物之濃度。較佳基礎培養基調配物可為市售基礎培養基調配物中之一者，諸如DMEM，據報導其維持MSC之活體外培養，且包括生長因子之混合物，供其等適當生長、增殖、維持所需標記物及/或生物活性、或長期儲存。
該等基礎培養基調配物含有本身已知之哺乳動物細胞發育所需之成分。藉助於說明而非限制，此等成分可包括無機鹽(特定言之，含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P及可能地Cu、Fe、Se及Zn之鹽)、生理緩衝液(例如HEPES、碳酸氫鹽)、核苷酸、核苷及/或核酸鹼、核糖、去氧核糖、胺基酸、維生素、抗氧化劑(例如麩胱甘肽)及碳來源(例如葡萄糖；丙酮酸鹽，例如丙酮酸鈉；乙酸鹽，例如乙酸鈉)等。亦將顯而易見，許多培養基可以具有或不具有丙酮酸鈉之低葡萄糖調配物形式獲得。
用於自血液或血液相分離MSC且培養且擴增該等細胞之方法係此項技術中已知及例如WO2014053418或WO2014053420中所描述。
在一實施例中，該用於自血液或血液相分離MSC且在低葡萄糖培養基中培養且擴增該等細胞之方法可包含以下步驟：
a) 在經抗凝劑塗佈之樣本小瓶中自供體收集一或多個血液樣本；
b)將血液樣本離心以獲得由血漿相、膚色血球層及紅血球相組成之3相分佈；
c) 收集膚色血球層且將其裝載於密度梯度上；
d)收集自步驟c)之密度梯度獲得之血液中間相；
e) 藉由離心自血液中間相分離MSC；
f) 以在2.5 × 10
5個MSC/cm
2與5 × 10
5個MSC/cm
2之間在培養物中接種且將其保持在補充有地塞米松(dexamethasone)、抗生素及血清之低葡萄糖生長培養基中。
在一實施例中，可將抗凝劑補充至MSC中。非限制性實例為EDTA或肝素。
接種次數對於最終獲得呈可接受濃度之純且活的MSC群體為關鍵的，此係因為過於密集接種將會在擴增期間導致大規模細胞死亡及產生不均勻的MSC群體，而過於分散接種將會導致極少或無MSC群落形成，以使得擴增不可能或幾乎不可能，或其將花費過多時間。在兩種情況下，細胞活力將受到負面影響。
在本發明之一較佳實施例中，MSC具有高細胞活力，其中該等細胞之至少90%、更佳至少95%、最佳100%為活的。
血液中間相為包含單核球、淋巴球及MSC之血液單核細胞(BMC)之來源。較佳地，在37℃下洗掉淋巴球，而在不存在保持單核球存活所需之細胞介素之情況下單核球在2週內死亡。以此方式純化MSC。自血液中間相分離MSC較佳藉助於將血液中間相離心，之後用諸如磷酸鹽緩衝液之適合的緩衝液洗滌細胞集結粒至少一次來進行。
在另一實施例中，本發明之MSC對單核球及巨噬細胞呈陰性，兩者均在0%與7.5%之間的範圍內。
特定言之，間葉細胞在生長培養基中保持至少2週。較佳地，使用具有1%地塞米松之生長培養基，此係因為MSC之特定特徵保持於該培養基中。
在最少2週(14天)、較佳3週(21天)時段之後，MSC群落將在培養瓶中變得可見。在後續步驟g)中，出於擴增MSC之目的，將至少6 × 10
3個幹細胞/cm
2轉移至含有低葡萄糖、血清及抗生素之擴增培養基中。較佳地，MSC之擴增將在最少五個細胞繼代中發生。以此方式可獲得充足細胞。較佳地，細胞在70%至80%匯合度下分裂。MSC可在培養物中維持高達50個繼代。此後，出現活力損失、衰老或突變形成之風險。
在另一實施例中，在擴增MSC期間各繼代之間的群體倍增時間(PDT)應在胰蛋白酶處理之後0.7天與3天之間。在擴增MSC期間各繼代之間的該PDT較佳在胰蛋白酶處理之後0.7天與2.5天之間。
在一較佳實施例中，用於本發明之MSC具有軸狀形態。本發明之MSC之形態表徵將細胞分類為延長型、纖維母細胞樣、軸狀細胞。此類型之細胞為不同形式之具有大部分顯露類三角形或星形細胞形狀之小的自身更新型細胞的其他MSC群體及具有含突出核之大的立方形或扁平化圖案之MSC群體。具有此特定形態特徵以及生物標記物之MSC之選擇使得熟習此項技術者能夠分離本發明之MSC。細胞之形態分析可易於由熟習此項技術者使用相差顯微鏡執行。此外，可使用流動式細胞測量術或熟習此項技術者已知之其他技術中的正向及側面散射圖評估MSC之大小及粒度。
在另一較佳實施例中，MSC具有在10 μm與100 μm之間的懸浮直徑。用於本發明之MSC已基於大小/懸浮直徑進行選擇。較佳地，MSC具有在10 µm與100 μm之間、更佳在15 µm與80 µm之間、更佳在20 µm與75 μm之間、更佳在25 µm與50 μm之間的細胞大小。較佳地，基於細胞大小之細胞之選擇係藉由過濾步驟進行。舉例而言，細胞濃度範圍在10
3至10
7個MSC/毫升之間的MSC係藉助於過濾器系統來選擇大小，其中該等細胞較佳稀釋於低葡萄糖DMEM培養基中，其中使用40 μm過濾器使細胞經歷雙重過濾步驟。雙重或多重過濾步驟係較佳的。後者提供高單細胞群體且避免細胞聚集體之存在。該等細胞聚集體可在藉由冷凍保存細胞期間造成細胞死亡且可全部對細胞之另外下游應用具有影響。舉例而言，當靜脈內投與細胞聚集體時，其可能會有較高的出現毛細管栓塞之風險。
在一實施例中，在該組合物中MSC之該治療有效量係在10
5-10
7個MSC之間。
在一較佳實施例中，用於本發明之MSC經調配用於藉助於靜脈內注射或輸注在個體中投與。
在一實施例中，向犬科動物或貓科動物患者投與治療有效量之MSC，較佳地投與每患者10
5-10
7個MSC之劑量。在一實施例中，投與單次劑量。
對受試者產生治療效益之最小治療有效劑量為至少10
5個MSC/次投與。較佳地，各投與係藉由靜脈內注射進行且包含在10
5至5 × 10
5個MSC/次投與之間，其中該等MSC較佳為天然及/或異種的。
在一實施例中，該等MSC投與至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次，較佳以間隔投與。
在另一進一步實施例中，治療進一步包含：多次投與，例如多次靜脈內投與10
5-10
7個MSC/犬科動物或貓科動物患者之劑量的MSC或包含MSC之組合物，其中在各種時間點投與該等多次劑量，該等時間點包括但不限於以下時間點中之一或多者：間隔1天、間隔2天、間隔3天、間隔4天、間隔5天、間隔6天、間隔7天(1週)、間隔2週、間隔3週、間隔4週、間隔5週、間隔6週、間隔7週、間隔8週、間隔3個月、間隔6個月、間隔9個月及/或間隔1年。較佳地，各劑量間隔至少2週、更佳間隔至少3週、甚至更佳間隔至少4週且最佳間隔至少6週投與。
在一實施例中，該組合物包含存在於無菌液體中之該等MSC。該無菌液體之非限制性實例為最低必需培養基(MEM)，諸如杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM)。該無菌液體對於例如經由注射或輸注來靜脈內投與哺乳動物患者而言應為安全的。
作為非限制性實例，該無菌液體為諸如基礎培養基之最低必需培養基。如此項技術中已知之基礎培養基調配物包括但不限於伊格爾氏最低必需培養基(MEM)、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、α改良最低必需培養基(α-MEM)、必需基礎培養基(BME)、伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養基(IMDM)、BGJb培養基、F-12營養物混合物(漢姆)、李博維茲L-15、DMEM/F-12、必需改良伊格爾氏培養基(EMEM)、RPMI-1640、培養基199、威茅斯氏10 MB 752/1或威廉姆斯培養基E及改良培養基及/或其組合。以上基礎培養基之組成一般在此項技術中已知且視所培養細胞之需要修改或調節培養基及/或培養基補充物之濃度係在熟習此項技術者之技能範圍內。較佳基礎培養基調配物可為市售基礎培養基調配物中之一者，諸如DMEM，據報導其維持MSC之活體外培養，且包括生長因子之混合物以用於其適當生長、增殖、所需標記物及/或生物活性之維持或長期儲存。
該等基礎培養基調配物含有本身已知之哺乳動物細胞發育所需之成分。藉助於說明而非限制，此等成分可包括無機鹽(特定言之，含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P及可能地Cu、Fe、Se及Zn之鹽)、生理緩衝液(例如HEPES、碳酸氫鹽)、核苷酸、核苷及/或核酸鹼、核糖、去氧核糖、胺基酸、維生素、抗氧化劑(例如麩胱甘肽)及碳來源(例如葡萄糖；丙酮酸鹽，例如丙酮酸鈉；乙酸鹽，例如乙酸鈉)等。亦將顯而易見，許多培養基可以具有或不具有丙酮酸鈉之低葡萄糖調配物形式獲得。
較佳地，該組合物包含至少75%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、最佳至少90%單一細胞，且其中該等單一細胞具有在10 μm與100 μm之間、更佳在15 µm與80 µm之間、更佳在20 µm與75 μm之間、更佳在25 µm與50 μm之間的懸浮直徑。如先前所提及，細胞直徑以及其單一細胞性質對於任何下游應用，例如靜脈內投與，及細胞活力而言為關鍵的。
較佳地，該組合物包含至少90% MSC，更佳地，其將包含至少95% MSC、更佳至少99% MSC、最佳100% MSC。
呈包含MSC之無菌液體形式之組合物的體積及濃度較佳適於靜脈內注射。在一實施例中，醫藥組合物可以無菌液體形式投與動物，該無菌液體在最終調整之後包含呈10
5-10
7個細胞/毫升之濃度的MSC。
在一實施例中，在各靜脈內注射或輸注之情況下，投與治療有效量之MSC，較佳地，各注射或輸注包含10
5至10
7個該等MSC之劑量。
在一實施例中，醫藥組合物包含在10
5-10
7個MSC/毫升該組合物、較佳10
5至10
6個MSC/毫升該組合物、更佳10
5- 5 × 10
5個MSC/毫升該組合物之間的治療有效量之MSC。
在一實施例中，向犬科動物或貓科動物患者投與治療有效量之MSC，較佳地投與每患者10
5-10
7個MSC之劑量。在一實施例中，投與單次劑量。
在一實施例中，該等MSC投與至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次。
在一實施例中，該組合物之一個劑量具有約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至3 ml、較佳約0.5 ml至2 ml、更佳約0.5 ml至1.5 ml、最佳約1 ml之體積。在另一進一步實施例中，該組合物之一個劑量具有最大限度地約5 ml、較佳最大限度地約4 ml、更佳最大限度地約3 ml、更佳最大限度地約2 ml之體積，最佳地，該體積為約1 ml。此量適用於靜脈內投與。
該劑量可於小瓶或預填充注射器中調配。
在一實施例中，該組合物進一步包含選自由以下組成之群之組分：富血小板血漿(PRP)、玻糖醛酸、基於玻糖醛酸之組合物、葡萄胺聚醣或基於葡萄胺聚醣之組合物或其任何組合。已知此等組分在本發明之組合物之下游應用期間具有額外有益功能。在一些情況下，可能需要將MSC與該等載劑物質混合以增加組合物之有效性或產生協同作用。舉例而言，該等載劑物質有助於細胞組合物中之MSC之歸巢能力及免疫調節作用。舉例而言，作為富含生長因子之物質的PRP在植入之後刺激幹細胞。較佳地，出於相容性原因，自同一供體收取幹細胞及PRP。載劑物質亦可用於抵消重力：幹細胞遵循重力定律且因此難以在不具有其中幹細胞可發生遷移之載劑之情況下達到更高級的病變。另外，載劑物質本身亦對病理性環境具有有益作用，在該環境中其有助於組織修復本身且亦提供良好的幹細胞生態棲位以幫助分化此區域中之細胞。玻糖醛酸、葡萄胺聚醣或基於此之組合物之實例包括OSTENIL®、OSTENIL® +、Adant®及Adequan®。
在一實施例中，每次注射向患者投與之組合物之體積係根據患者體重來進行調適。在另一實施例中，投與10
5-10
7個MSC、較佳10
5至10
6個MSC、更佳10
5- 5 × 10
5個MSC、最佳3 × 10
5個MSC/位患者之固定劑量。
本發明人已進一步發現，特別有效的治療係藉由包含至少兩個劑量之如上文在實施例中之任一者中所描述的所使用之MSC或所使用之醫藥組合物的給藥方案來達成。
因此，另一實施例係關於用於治療犬科動物及貓科動物之骨關節炎之醫藥組合物，其中：
- 該治療包含投與，較佳靜脈內投與第一量之該組合物之步驟，該第一量包含10
5-10
7個MSC/位患者之總劑量，且
- 該治療進一步包含投與，較佳靜脈內投與第二量之該組合物之步驟，該第二量包含10
5-10
7個MSC之第二總劑量，其中該等MSC較佳為天然及/或異種的，且
其中該第二劑量係在第一量之後1天、在第一量之後2天、在第一量之後3天、在第一量之後4天、在第一量之後5天、在第一量之後6天、在第一量之後7天(1週)、在第一量之後2週、在第一量之後3週、在第一量之後4週、在第一量之後5週、在第一量之後6週、在第一量之後7週、在第一量之後8週、在第一量之後3個月、在第一量之後6個月、9個月及/或在第一量之後1年投與。較佳地，各劑量係在第一量之後至少2週、更佳在第一量之後至少3週、甚至更佳在第一量之後至少4週且最佳在第一量之後至少6週投與。
在一實施例中，該第二劑量與該第一劑量相同。在另一實施例中，該第二劑量低於該第一劑量。在又另一實施例中，該第二劑量高於該第一劑量。
在一實施例中，第三、第四及/或甚至第五量之該組合物可投與，較佳靜脈內投與該患者，其中該第三、第四及/或第五量包含10
5-10
7個MSC之第三、第四及/或第五總劑量，其中該等MSC較佳為天然及/或異種的。
在一實施例中，第六或更多量之該組合物可投與，較佳靜脈內投與該患者，其中該第六或更多量包含10
5-10
7個MSC之第六或更多總劑量，其中該等MSC較佳為天然及/或異種的。
許多經診斷患有或罹患骨關節炎之犬科動物及/或貓科動物顯示跛行及/或關節疼痛之(視覺)徵象。因此，本發明亦關於如先前實施例中之任一者中所描述之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療經診斷患有或罹患骨關節炎之犬科動物及貓科動物之跛行及/或關節疼痛，或用作用於治療經診斷患有或罹患骨關節炎之犬科動物及貓科動物之跛行及/或關節疼痛的方法，或用於製備用以治療經診斷患有或罹患骨關節炎之犬科動物及貓科動物之跛行及/或關節疼痛的藥劑。該等MSC或組合物較佳靜脈內投與，且該等MSC較佳為天然及/或異種的。
治療跛行及/或關節疼痛包含預防、減輕、緩解、改善及/或逆轉經診斷患有或罹患骨關節炎之貓科動物之該跛行及/或關節疼痛。
如之前所指示，諸如家狗及家貓之犬科動物及貓科動物之骨關節炎的典型視覺徵象可包括僵硬、跛行或難以起身；嗜睡；厭惡跑步、跳躍或玩耍；體重增加；應激性或行為變化；撫摸或觸碰時疼痛；難以作出排尿或排便姿勢或在家裏發生意外；及/或肢體及脊椎上方之肌肉質量損失。
由於骨關節炎常常會影響多個關節，因此與作為侵入性程序且要求鎮靜、經驗及靶向診斷之MSC關節內投與相比，藉由靜脈內投與MSC或包含MSC之醫藥組合物來治療跛行及關節疼痛在療法中同時在多個關節中提供實質效益。
在一實施例中，MSC或包含MSC之醫藥組合物如以上實施例中之任一者中所描述。
在第二態樣中，本發明係關於包含周邊血液衍生之MSC的特定醫藥組合物。該組合物包含天然周邊血液衍生之MSC，該等MSC為動物衍生的，較佳為哺乳動物衍生的，且以在10
5-10
7個MSC/毫升該組合物之間的濃度存在於無菌液體中，其中該組合物之一個劑量具有約0.5 ml至5 ml之體積，其中該等MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45呈陰性，且其中該等MSC具有在10 μm與100 μm之間的懸浮直徑。
在一實施例中，該醫藥組合物係靜脈內投與的。在一較佳實施例中，該等MSC為馬衍生的。
在一實施例中，該組合物之一個劑量具有約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至3 ml、較佳約0.5 ml至2 ml、更佳約0.5 ml至1.5 ml、最佳約1 ml之體積。在另一進一步實施例中，該組合物之一個劑量具有最大限度地約5 ml、較佳最大限度地約4 ml、更佳最大限度地約3 ml、更佳最大限度地約2 ml之體積，最佳地，該體積為約1 ml。此量適用於靜脈內投與。
在另一較佳實施例中，MSC具有在15 μm與80 μm之間、更佳在20 μm與75 μm之間、更佳在25 μm與50 μm之間的懸浮直徑。
一般技術者應瞭解，如上文所描述在經診斷患有或罹患骨關節炎之犬科動物及貓科動物中用於治療骨關節炎之MSC或醫藥組合物或用於治療跛行及/或關節疼痛之MSC或醫藥組合物之態樣的要素在本發明之醫藥組合物之態樣中恢復。因此，本發明之所有態樣係相關的。如上文所描述之態樣中之一者中所描述的所有特點及優點可關於此等態樣中之任一者，即使其結合特定態樣進行描述。
用於本發明之MSC或包含MSC之醫藥組合物以及可能的如上文所描述之另外組分將較佳地經冷凍以便允許長時間儲存MSC或組合物。較佳地，MSC或組合物將在低且恆定的溫度，諸如低於-20℃之溫度下經冷凍。此等條件允許安全儲存MSC或組合物，且使得MSC能夠在儲存期間及解凍後保持其生物及形態特徵以及其高細胞活力。
在一更佳實施例中，用於本發明之MSC或包含MSC之醫藥組合物可在-80℃之最高溫度下，視情況在液氮中儲存至少6個月。MSC冷凍中之關鍵因素為低溫培養基，特定言之，包含DMSO之低溫培養基。DMSO防止在冷凍過程期間在培養基中形成冰晶體，但在高濃度下可能對細胞具有毒性。在一較佳實施例中，在低溫劑中，DMSO之濃度包含至多20%、更佳至多15%，更佳地，DMSO之濃度包含10%。低溫培養基進一步包含低葡萄糖培養基，諸如低葡萄糖DMEM (杜爾貝科氏改良伊格爾培養基)。
之後，用於本發明之MSC或醫藥組合物較佳在投與之前在約室溫之溫度下、較佳在20℃與37℃之間的溫度下、更佳在25℃與37℃之間的溫度下且以最大20分鐘、較佳最大10分鐘、更佳最大5分鐘之時間跨度進行解凍。
此外，MSC或組合物較佳在解凍之後的2分鐘內投與以便保護MSC之活力。
本發明藉由以下非限制性實例進一步描述，該等實例進一步說明本發明且其不意欲、其亦不解釋為限制本發明之範疇。
實例及/或圖式描述
現將參考以下實例進一步例示本發明。本發明絕不限於既定實例。
實例 1 ： 用於治療狗之骨關節炎之 ePB-MSC此研究之目標為評估ePB-MSC (馬周邊血液衍生之MSC)之單次靜脈內注射作為用於罹患對當前標準療法無反應之天然存在之關節疼痛之狗之治療的潛能。特此，評估該治療之臨床作用及安全性。
材料及方法 狗在多次獸醫診療(n=10)中用研究產品(IVP)治療總共50隻犬科動物患者。患者納入受以下納入準則限制：一或多個關節之關節疼痛持續若干天/週；對保守療法無反應性；確認跛行、根據病歷確認之疼痛、藉由放射照相術(RX)或其他成像模式確認之關節疼痛相關徵象；及完成犬科動物簡單疼痛評估量表(Canine Brief Pain Inventory；CBPI)問卷，包括疼痛嚴重性評分(PSS) ≥3及疼痛干擾評分(PIS) ≥3。將具有以下病況及治療之患者排除在研究之外：扭傷、懷孕、可能會影響臨床研究之其他疾病、PSS ＜3及PIS ＜3、狗常規醫學治療之變化、清除期內之皮質類固醇投與或正在進行的皮質類固醇治療。在研究期間三個評估點(第0天、治療後3週及6週)，觀測到所有狗皆有不常見行為、姿勢及發生潛在不良事件，諸如跛行惡化、關節膨脹或注射部位處之皮膚過敏。由在犬科動物矯形外科學領域中具有至少5年實踐經驗之獸醫執行評估。確知主人有報導評估點之間發生潛在不良事件之任務。所有常規醫學治療皆在研究期間繼續。此動物研究經Global Stem cell Technology之倫理委員會批准。
分離且培養 ePB-MSC (IVP)根據先前所描述之方法，自靜脈血分離ePB-MSC，該靜脈血係自一隻供體馬之頸靜脈收集。如Broeckx等人2012所描述，在培養ePB-MSC之前，測試血清中是否存在多種可傳染疾病。隨後，在優良製造規範(GMP)認證之生產場所根據GMP指南培養幹細胞直至第5代(P)，且以活力、形態、細胞表面標記物之存在及群體倍增時間表征。藉由使用流動式細胞測量術實現對特定細胞表面標記物之存在(分化簇CD29、CD44及CD90)及不存在(主要組織相容複合體(MHC) II及CD45)的評估，如先前所描述(Spaas等人，2013)。然而，詳細表現及分泌模式先前已描述於WO 2020/182935中。
使用錐蟲藍(trypan blue)評估細胞活力。之後，在低葡萄糖及10%二甲亞碸(DMSO)杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM)中進一步培養細胞直至P10，進行胰蛋白酶處理且再懸浮，最終濃度為300.000個細胞/毫升。將ePB-MSC儲存於-80℃下之冷凍小瓶中直至進一步使用。根據好氧細菌、厭氧細菌、真菌、內毒素及黴漿菌之不存在測試最終產物之無菌性。所有患者皆經同一批次之ePB-MSC治療。
研究設計向所有所包括之犬科動物患者注射一個小瓶之含有1 mL ePB-MSC懸浮液之IVP。將小瓶在手掌中解凍且靜脈內注射。隨後，由有經驗的獸醫在三個評估點(第0天：投藥治療當天，第1次隨訪：治療後3週，及第2次隨訪：治療後6週)對狗進行臨床評估，且確知主人一直認真仔細地觀測狗。在評估點，藉由矯形外科檢查、跛行評估、活動範圍(ROM)測定(主觀評分+測角量測)及對一般臨床病況之影響評估來研究及評分治療作用(表1)。藉由將中心置放在肢體之軸上方且將透明臂與肢體上之解剖標誌對準來應用用於以度為單位測定ROM之測角計。根據Jaegger等人(2002)，將量測值與正常值進行比較(表2)。此外，根據Brown (2017)，由主人使用CBPI在隨訪點中之各者時對疼痛嚴重性、疼痛干擾及生活品質進行評分。CBPI由十一個問題組成，其中評分系統在0至10範圍內。特此，前四個問題用於對狗之疼痛嚴重性進行評分，接下來六個問題用於測定狗之疼痛干擾，且最後一個問題量測狗之整體生活品質(表3)。最後，在所有三個時間點，獸醫藉由觸診受影響關節來對關節發熱、關節疼痛及關節積液進行評估及評分(表4)。
表 1 ： 在矯形外科檢查及一般臨床檢查期間使用之評分系統之概述。
表 2 ： 正常犬科動物活動範圍之測角量測。
表 3 ：犬科動物簡單疼痛評估量表
表 4 ： 關節評估評分系統之概述
| 參數 | 評分 | 定義 |
| 跛行 | 1 | 站立、行走及疾走正常 |
| 2 | 站立正常，疾走時步態略微疼痛 | |
| 3 | 站立正常，行走時步態略微疼痛 | |
| 4 | 站立正常，行走時步態明顯疼痛 | |
| 5 | 站立異常，行走時步態明顯疼痛 | |
| 活動範圍 | 0 | 無運動限制或咿軋音 |
| 1 | 活動範圍減小10%至20%，無咿軋音 | |
| 2 | 活動範圍減小10%至20%，有咿軋音 | |
| 3 | 活動範圍減小20%至50% | |
| 4 | 活動範圍減小超過50% | |
| 臨床病況 | 0 | 不受影響 |
| 1 | 輕度受影響 | |
| 2 | 中等受影響 | |
| 3 | 嚴重受影響 | |
| 4 | 極嚴重受影響 |
| 關節 | 活動範圍 | |
| 彎曲 | 伸長 | |
| 肩部 | 57° | 165° |
| 肘部 | 36° | 166° |
| 膝關節 | 41° | 162° |
| 髖部 | 50° | 162° |
| 編號 | 描述 | 問題 | 評分 |
| 1 | 疼痛嚴重性評分 (PSS) | 對最後7天內處於其最差時之疼痛進行評分 | 0-10 |
| 2 | 對最後7天內處於其程度最輕時之疼痛進行評分 | 0-10 | |
| 3 | 對最後7天內處於其平均值時之疼痛進行評分 | 0-10 | |
| 4 | 對現在的疼痛進行評分 | 0-10 | |
| 5 | 疼痛干擾評分 (PIS) | 對伴隨一般活性之疼痛干擾進行評分 | 0-10 |
| 6 | 對伴隨生活樂趣之疼痛干擾進行評分 | 0-10 | |
| 7 | 對伴隨自躺下站立起來之能力之疼痛干擾進行評分 | 0-10 | |
| 8 | 對伴隨行走之能力之疼痛干擾進行評分 | 0-10 | |
| 9 | 對伴隨跑步之能力之疼痛干擾進行評分 | 0-10 | |
| 10 | 對伴隨爬樓梯、緣石、門階等之能力之疼痛干擾進行評分 | 0-10 | |
| 11 | 整體生活品質 | 對狗之最後7天內之整體生活品質進行評分 | 較差-一般-良好-極好-優異 |
| 參數 | 評分 | 定義 |
| 關節發熱感覺 | 0 | 無溫度升高感覺 |
| 1 | 溫度略微升高感覺 | |
| 2 | 溫度中度升高感覺 | |
| 3 | 溫度嚴重升高感覺 | |
| 關節疼痛 | 0 | 無 |
| 1 | 輕度徵象(狗在辨識中轉頭) | |
| 2 | 中度徵象(狗拉扯肢體) | |
| 3 | 嚴重徵象(狗喊叫或變得有侵襲性) | |
| 4 | 狗將不允許觸診 | |
| 關節積液 | 0 | 無 |
| 1 | 輕度徵象(僅在注射部位處) | |
| 2 | 中度徵象(整個關節輕度腫脹) | |
| 3 | 嚴重徵象(整個關節嚴重腫脹) | |
| 4 | 極度(關節周邊腫脹) |
統計分析使用可以R (3.6.3版)形式獲得之nparLD包執行非參數縱向分析。此方法為混合模型之非參數對應物。時間作為類別固定效應因素包括在內且狗(或狗內損傷)作為分層因素包括在內。經由基於穩健秩之檢定在總體5%顯著性位準下測試主要時間效應。此外，使用非參數威爾卡森秩和檢定(Wilcoxon rank sum test)進行三個時間點之間的事後分析配對比較且加以調整用於藉由邦弗朗尼氏技術(Bonferroni's technique)進行多重比較(比較型顯著性位準=0.05/3=0.0133)。亦衍生針對時間點之間的差異之非參數95%信賴區間。
結果 狗自50隻經治療犬科動物患者中之5隻，無法獲得第1次隨訪及/或第2次隨訪時間點之資料，從而經整個研究時段產生遺漏資料。此外，9隻狗不符合預設包括及排除準則。最後，一隻狗在研究結束之前因胃擴張腸扭結造成之胃破裂而經受安樂死。剩餘35隻符合預設包括及排除準則且具有完整隨訪資料集之狗包括於此研究之資料分析中。此等狗罹患以下關節中之一或多者之疼痛：肘部、膝關節或髖部。自此等35隻所包括之患者，18隻狗具有一個受影響關節(肘部：12隻，膝關節：4隻，及髖部：2隻)，11隻狗具有雙側受影響關節(肘部：1隻，膝關節：3隻，髖部：6隻，及肩部：1隻)，且6隻狗具有多個雙側受影響關節(肘部+髖部：1隻，膝關節+髖部：3隻，肘部+膝關節：1隻，及肘部+膝關節+髖部：1隻) (表5)。
表 5 ： 所包括之患者之概述。 y ： 年 ； m ： 月 ； m.d. ： 遺漏資料 ； M ： 雄性 ； F ： 雌性 ； MC ： 雄性去勢 ； FC ： 雌性去勢 ； CV ： 尋常犬 ； 0 ： 無受影響關節 ； 1 ： 單側受影響關節 ； 2 ： 雙側受影響關節。
| 狗 | 年齡 | 性別 | 品種 | 疾病持續時間 | (多個)受影響關節 | |||
| 肩部 | 肘部 | 膝關節 | 髖部 | |||||
| 1 | 11y | MC | 西藏㹴 | 2年 | 0 | 2 | 0 | 2 |
| 2 | 9y | MC | CV | 2至3個月 | 0 | 2 | 2 | 0 |
| 3 | 16y | M | 拉布拉多尋回犬(Labrador Retriever) | 若干年 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 4 | 15y | MC | 佛蘭德牧牛犬(Bouvier de Flandres) | 8年 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| 5 | 9y | MC | 拳師犬 | 若干年 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 6 | 14y | F | 傑克羅素梗(Jack Russell terrier) | 2年 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| 7 | 2y | F | 拉布拉多尋回犬 | 4個月 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| 8 | 13y | F | 捷克牧羊犬(Czech shephard) | 2年 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| 9 | 8y | F | 德國短毛指示犬 | 3年 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 10 | 13y | MC | 邊境牧羊犬 | 2個月 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 11 | 5y | FC | 羅得西亞背脊犬(Rhodesian ridgeback) | 1.5年 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 12 | 6y | F | CV | 2週 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 13 | 11y | F | 丹麥狗 | 2年 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 14 | 2y1m | F | 伯恩山狗(Bernese Sennen dog) | 1年2個月 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 15 | 1y2m | M | 比利時牧羊犬 | 9個月 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 16 | 2y8m | F | 美國鬥牛犬 | 10個月 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 17 | 12y2m | M | 格羅安達犬(Groenendael) | 3年 | 0 | 2 | 2 | 2 |
| 18 | 3y3m | F | 羅威納犬(Rottweiler) | 2年 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 19 | 5y1m | F | 德國牧羊犬 | 9個月 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 20 | 8y | F | 可卡犬(Cocker Spaniel) | 超過3年 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| 21 | m.d. | m.d. | m.d. | m.d. | 0 | 2 | 0 | 0 |
| 22 | m.d. | m.d. | m.d. | m.d. | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 23 | m.d. | m.d. | m.d. | m.d. | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 24 | m.d. | m.d. | m.d. | m.d. | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 25 | 5y | FC | 聖伯納犬(Sint bernard) | 3年 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 26 | 11y | M | 獵狐㹴 | 2年 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 27 | 12y | F | 金毛尋回犬 | 1年 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 28 | 3y2m | M | 美國斯塔福梗(American Stafford terrier) | 1年10個月 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 29 | 7y | M | 邊境牧羊犬 | 若干年 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 30 | 1y | M | CV | 2年 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 31 | 9y | M | 可卡犬 | 若干年 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 32 | 10y | M | 杜賓犬(Dobberman) | 若干年 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| 33 | 11y | MC | 金毛尋回犬 | 若干年 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 34 | 8y | FC | 拉布拉多尋回犬 | 2個月 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 35 | 9y | M | 邊境牧羊犬 | 1年 | 0 | 1 | 0 | 0 |
矯形外科檢查所有三次隨訪點之跛行評估之概述繪示於圖1中。在研究開始時(第0天)，23%之狗之評分為5，5分制；26%之狗之評分為3或4，5分制；17%之狗之評分為2，5分制；且9%之狗之評分為1，5分制。在投藥治療之後三週(第1次隨訪)，與26%在基線時(第0天)評分為1或2之狗相比，44%顯示1或2之跛行評分，5分制(26%評分為1且18%評分為2)之狗的跛行評分顯著減小(P=0.002)。在投藥治療之後六週(第2次隨訪)，50%之狗之跛行評分為1或2，5分制(24%評分為1且26%評分為2)，其與基線條件相比顯著地更好(P=0.004)。在第1次隨訪與第2次隨訪之間可偵測不到跛行評分之顯著差異(P=0.484)。此外，個別患者之跛行評估在62%病例中經六週時段顯示跛行減輕。剩餘38%之狗在治療後六週顯示穩定(26%)或惡化(12%)程度之跛行。
在矯形外科檢查期間測試之第二參數為受影響關節之ROM。評分結果呈現於圖2中。在第二次隨訪期間，與基線條件(第0天)相比，見到對活動範圍之影響顯著降低(P＜0.001)。與在第0天之33%相比，50%之狗之評分為0或1。亦在第0天與第1次隨訪之間發現顯著差異(P=0.002)，但在第1次隨訪與第2次隨訪之間未發現顯著差異(P=0.455)。另外，在治療後六週，每一關節之ROM評估在34%之關節中顯示ROM改善。ROM分別在61%及5%之關節中保持不變或惡化。
亦使用測角計量測度數變化%來評估活動範圍。在治療之後三週(第1次隨訪)，與基線相比，以度為單位之活動範圍顯著較高(P=0.001)，其中中值增加9.0 (95% CI：[3.5;16.0])。六週後(第2次隨訪)，與基線相比，以度為單位之活動範圍顯著較高(P=0.004)，其中中值增加8.5 (95% CI：[2.5;13.5])，但兩次隨訪期並不顯著不同(P=0.964)。
考慮到對臨床病況之影響，在所有三個時間點之間未發現顯著差異。
犬科動物簡單疼痛評估量表在獸醫診療下，三次患者訪視期間(第0天、第1次隨訪及第2次隨訪)，主人完成CBPI，從而評估了疼痛嚴重性評分、疼痛干擾評分及生活品質。此問卷顯露第0天與第1次隨訪之間的PSS顯著減小(中值=-1；95% CI：[-1.5,-0.5]，P=0.005)，但第0天與第2次隨訪之間的PSS未顯著減小(中值=-1；95% CI：[-1.0,0.0]，P=0.073)且兩次隨訪期之間的PSS未顯著減小。關於PIS，在第0天與第1次隨訪之間發現顯著減小(中值=-1.4；95% CI：[-2.4,-0.9]，P＜0.001)，在第0天與第2次隨訪之間發現顯著減小(中值=-2.15；95% CI：[-3.1,-1.4]，P＜0.001)，但在第1次隨訪與第2次隨訪之間未發現顯著減小(中值=-0.5；95% CI：[-1.0,0.1]，P=0.016)。最後，在投藥治療之後經六週研究時段，在66%之狗中觀測到生活品質提高。在六週研究時段期間，生活品質分別在23%及11%病例中保持相同或降低。
關節評估最後，在投藥治療之後執行關節評估。對於發熱感覺評分，未發現顯著差異。在第0天與第1次隨訪之間關節疼痛顯著地減輕(中值=-1.0；95% CI：[-1.5,-0.5]，P=0.005)。在第0天與第2次隨訪之間未發現顯著差異(P=0.073)且在兩次隨訪期之間未發現顯著差異(P=0.429)。在投藥治療之後發現關節積液評分減小。在第0天與第1次隨訪之間關節積液評分顯著地減小(中值=-1.0；95% CI：[-1.5;-1.0]，P＜0.001)，且在第0天與第2次隨訪之間關節積液評分顯著地減小(中值=-1.0；95% CI：[-1.5;-1.0]，P＜0.001)，但兩次隨訪期並沒有顯著不同(P=0.023) (圖3)。每一關節之關節積液評估顯示在ePB-MSC投與之後六週，38%之關節中之積液量減少。分別在56%及6%之關節中偵測到相等或增加量之關節流體。
論述就吾等所知，此係研究靜脈內注射之異種馬周邊血液衍生之間葉幹細胞在患有關節疼痛之狗中之潛能的第一研究。幹細胞療法具有良好耐受性，此係因為在此研究期間未報導與投藥治療相關之疑似的不良藥物反應或嚴重不良事件。此外，關節評估顯示關節發熱感覺或關節疼痛未增加。相比之下，在治療後三週偵測到關節疼痛顯著地減輕。在投藥治療之後三週及六週，關節積液顯著地減少。
先前研究已調查了當使用自體MSC時MSC在OA治療中之安全性及功效。然而，此研究首先描述在狗中異種使用馬間葉幹細胞作為針對關節疼痛之治療選項。先前描述了在OA治療中使用關節內投與之馬軟骨性誘導型MSC，根據主人評估，減輕了經治療狗之跛行及疼痛。在當前研究中，天然MSC係靜脈內注射的而非關節內注射的，其可具有實質性全身抗炎作用，從而引起多個受影響關節之疼痛及發炎減輕。此外，MSC已顯示能夠遷移至發炎區域，從而促進額外局部抗炎作用。此類型之投與亦提供以立即治療型調配物形式靜脈內注射之優點。此研究表明，使用單次靜脈內注射ePB-MSC係狗之關節疼痛及跛行之有前景且安全的治療。
在隨訪期期間，在矯形外科檢查時未偵測到惡化及甚至跛行及活動範圍改善之趨勢。與基線條件相比，在兩個隨訪時間點，跛行評分顯著地減小。與第0天相比，用評分系統以及用測角計量測，在第1次隨訪及第2次隨訪時發現對活動範圍之影響顯著地減小。然而，在兩次隨訪訪視之間可能未發現顯著差異。犬科動物簡單疼痛評估量表之結果顯示狗所經歷之疼痛有所改善。此藉由與第0天相比在第一次隨訪訪視時疼痛嚴重性評分顯著地減小及在兩次隨訪訪視時干擾評分顯著地減小來說明。在第1次隨訪與第2次隨訪之間未發現顯著差異，但可觀測到另一種減小。66%之狗顯示生活品質提高。
結論總之，此研究之結果表明，單次靜脈內注射ePB-MSC在罹患關節疼痛及跛行之犬科動物患者中具有極好耐受性。在ePB-MSC注射之後關節疼痛及跛行不加重且甚至存在改善趨勢。
實例 2 ： 用於治療貓之骨關節炎之 ePB-MSC設定類似實驗以評估ePB-MSC (馬周邊血液衍生之MSC)之單次靜脈內注射作為用於罹患對當前療法無反應之天然存在之關節疼痛之貓之治療的潛能。特此，評估該治療之臨床作用及安全性。
材料及方法 貓用研究產品(IVP)治療一組貓科動物患者。應用類似的包括及排除準則。特定言之，納入準則為：一或多個關節之關節疼痛持續若干天/週、對保守療法無反應性、確認跛行、根據病歷確認之疼痛、藉由放射照相術(RX)或其他成像模式確認之關節疼痛相關徵象。排除準則為：扭傷、懷孕、可能會影響臨床研究之其他疾病、貓常規醫學治療之變化、清除期內之皮質類固醇投與或正在進行的皮質類固醇治療。在研究期間三個評估點(第0天、治療後3週及6週)，觀測到所有貓皆有不常見行為、姿勢及發生潛在不良事件，諸如跛行惡化、關節膨脹或注射部位處之皮膚過敏。由在貓科動物矯形外科學領域中具有至少5年實踐經驗之獸醫執行評估。確知主人有報導評估點之間發生潛在不良事件之任務。所有常規醫學治療皆在研究期間繼續。
ePB-MSC (IVP) 之 分離及培養、研究設計以及統計分析如在實例1中一樣，分離且培養ePB-MSC。研究設計與實例1中之狗之研究設計極為類似。向所有所包括之貓科動物患者注射一個小瓶之含有1 mL ePB-MSC懸浮液之IVP。將小瓶在手掌中解凍且靜脈內注射。隨後，由有經驗的獸醫在三個評估點(第0天：投藥治療當天，第1次隨訪：治療後3週，及第2次隨訪：治療後6週)對貓進行臨床評估，且確知主人一直認真仔細地觀測貓。在評估點，藉由矯形外科檢查、跛行評估、活動範圍(ROM)測定(主觀評分+測角量測)及對一般臨床病況之影響評估來研究及評分治療作用。藉由將中心置放在肢體之軸上方且將透明臂與肢體上之解剖標誌對準來應用用於以度為單位測定ROM之測角計。將量測值與正常值進行比較。此外，以與實例1中類似之方式由主人對疼痛嚴重性、疼痛干擾及生活品質進行評分。應用實例1之統計分析方法。
結果在治療之後六週，與基線條件相比，跛行評分顯著地更好。經此六週時段，一些個別患者顯示跛行減輕，而其他患者之跛行程度係穩定的，且僅少數貓之跛行程度惡化。其次，在治療之後三週，總活動範圍值顯著地提高。在治療後六週，個別患者中之一些之關節顯示ROM改善。此外，基於貓主人所完成之問卷，在基線與治療後三週之間顯示疼痛嚴重性評分顯著地減小。在基線與治療後三週之間及在基線與治療後六週之間疼痛干擾評分亦減小。另外，經六週研究，大部分貓之生活品質有所改善，而對於少數貓，此僅d惡化。最後，治療後的關節評估顯示與基線相比，三週後關節疼痛減輕。另外，與基線相比，三週及六週後關節積液評分亦顯著地減小。
論述就吾等所知，此係研究靜脈內注射之異種馬周邊血液衍生之間葉幹細胞在患有關節疼痛之貓中之潛能的第一研究。幹細胞療法證明具有良好耐受性，此係因為在此研究期間未報導與投藥治療相關之疑似的不良藥物反應或嚴重不良事件。此外，關節評估顯示關節發熱感覺或關節疼痛未增加。相比之下，在治療後三週偵測到關節疼痛顯著地減輕。在投藥治療之後三週及六週，關節積液顯著地減少。
先前研究已調查了貓科動物之MSC之安全性。然而，此研究首先描述在貓中異種使用靜脈內注射之馬間葉幹細胞作為針對關節疼痛之治療選項。在當前研究中，未誘導/天然MSC係靜脈內注射的而非關節內注射的，其可具有實質性全身抗炎作用，從而引起多個受影響關節之疼痛及發炎減輕。此外，MSC已顯示能夠遷移至發炎區域，從而促進額外局部抗炎作用。此類型之投與亦提供以立即治療型調配物形式靜脈內注射之優點。此研究表明，使用單次靜脈內注射ePB-MSC係貓之關節疼痛及跛行之有前景且安全的治療。
當前基於臨床參數來評估ePB-MSC注射之安全性。在隨訪期期間，在矯形外科檢查時未偵測到惡化及甚至跛行及活動範圍改善之趨勢。與基線條件相比，在兩個隨訪時間點，跛行評分顯著地減小。與第0天相比，在三週及六週時發現對活動範圍之影響顯著地降低。結果亦顯示貓所經歷之疼痛有所改善。此藉由與第0天相比在第一次隨訪訪視時疼痛嚴重性評分顯著地減小及在兩次隨訪訪視時干擾評分顯著地減小來說明。大部分貓亦顯示生活品質提高。
結論總之，此研究之結果表明，單次靜脈內注射ePB-MSC在罹患關節疼痛及跛行之貓科動物患者中具有極好耐受性。在ePB-MSC注射之後關節疼痛及跛行不加重且甚至存在改善趨勢。
實例 3 ： IV 投與之 ePB-MSC 之 劑量功效及安全性為了驗證用於靜脈內投與之最佳劑量，進行一項研究，對此，將32隻帶目的飼養之狗分成四個治療組，該等治療組靜脈內接受為3×10
5建議劑量0.2倍、1倍或5倍之劑量的ePB-MSC或無本發明之ePB-MSC之對照注射。
方法在投藥治療之前兩週(第14天)，在32隻狗中之各者之右膝關節中藉由完全橫切顱骨十字韌帶及在股髁之負重表面上產生雙側軟骨缺陷來以手術方式誘發骨關節炎(OA)。在治療當天(第0天)，將狗隨機分成四個具有八隻狗之治療組(T1、T2、T3及T4)。治療組T1、T2及T3中之狗接受分別為3×10
5建議劑量之0.2倍(0.2 ml)、1倍(1 ml)及5倍(5 ml)之ePB-MSC的IV (靜脈內)注射。向作為對照組之治療組T4中之狗靜脈內注射5 ml 0.9% NaCl溶液(9 mg/mL Vetivex)。所有狗皆進行每日臨床觀測以評估不良事件之發生率。此外，在研究期間評估矯形外科、臨床、血液學、病理學及組織學參數直至治療後42天。
結果 一般臨床及物理評估在整個研究期期間，未報導不良臨床事件或一般物理健康變化。此外，根據常規血液分析，未偵測到有意義的血液學及生物化學變化。
矯形外科評估動物中無一者在OA引入之前顯示跛行、關節疼痛或關節積液。在基線後訪視中之各者時，與三組研究獸醫產品(IVP) (T1、T2、T3)相比，在對照組(T4)中較少動物不具有、具有輕度或具有中度關節跛行、關節疼痛及關節積液。另外，對於T2組中之所有矯形外科評分，在基線後訪視中之各者時發現相對於基線之顯著改善。此外，與T1及T3相比，在第42±4天在T2組中觀測到跛行評分、關節疼痛評分及關節積液評分顯著地減小(圖4a、圖4b及圖4c)。在第-21天及第0天，所有群組之平均活動範圍(ROM)係類似的。在自第14±1天向前之基線後訪視中之各者時，與T4組相比，在三個IVP組中發現較高ROM值。T2組在所有基線後訪視時顯示最高ROM增加(圖4d)。
在第0天，所有群組之平均力(MF)及平均最大力(MMF)係類似的。然而，在第28±1天，各組之間的MF及MMF顯著地不同(MF: P=0.031及MMF: P=0.037)，其中與T4組相比，三個IVP組之平均值較高。各組之間的自第0天至第42±4天之MF及MMF變化顯著地不同(MF: P=0.018及MMF: P=0.045)。與T4組相比，在三個IVP組中之各者中發現較大增加，其中T2組之增加最高(圖4e及圖4g)。對於平均對稱性指數，發現類似結果(圖4f)。
CBPI 評估在包括時，所有動物之疼痛嚴重性評分(PSS)及疼痛干擾評分(PIS)皆為零。在第0天，所有四組之平均PSS及PIS評分係類似的。在基線後訪視中之各者時，與安慰劑相比，三個IVP組之平均PSS及PIS評分顯著地較低(P≤0.001)。此外，T2組顯示在第42±4天與T1 (PSS：-1.9±0.35；PIS：-2.0±0.44)、T3 (PSS：-1.6±0.38；PIS：-1.7±0.27)及T4 (PSS：-0.8±0.30；PIS：-0.28 ± 0.33)相比PSS及PIS之最高評分減小(PSS：-3.0±0.55；PIS：-3.1±0.72) (資料未顯示)。
所有動物之生活品質評分(QOL)在第-21天為1分(=優異)且在第0天為4分(=一般)。在自第7±1天向前之基線後訪視中之各者時，與T4組相比，在所有三個IVP組中更多動物之評分為2 (=極好)或3 (=良好)。T2組顯示在第42±4天與T1 (12.5%)及T3 (0%)相比最高的評分為2之動物百分比(75.0%)且與T4 (0%)相比顯著地更好(P≤0.001) (資料未顯示)。
病理學、組織學及免疫組織化學在第42±4天，對於滑膜炎及軟骨評分，與T1組(75.0%及50.0%)及T3組(62.5%及75.0%)相比，在T2組中觀測到1分發生率最高(87.5%及87.5%)。與T4組相比，所有三個IVP組之各半月板之平均總評分較低。對於所有群組比較，此差異為顯著的(P≤0.035)，惟與T4組相比T3組中之內側半月板(P=0.092)除外。與T1組(0.3±0.7)及T3組(1.0±1.2)相比，T2組顯示最低的兩個半月板平均評分(0) (補充資料)。所有群組之關節表面及滑膜之組織病理學評估皆顯示類似結果。此外，各治療組之間的軟骨寡聚基質蛋白(COMP)、II型膠原蛋白、葡萄胺聚醣及馮威里氏因子(von Willebrand Factor；vWF)之免疫組織化學評估可能未發現顯著差異。最後，在注射部位，亦即內側股髁(MFC)、側面股髁(LFC)、內側脛骨平台及側面脛骨平台處未發現異位組織。
實例 4 ： 目標動物安全性為了評估向狗單次及重複IV投與ePB-MSC之安全性，在本實例中評估若干臨床安全性參數。
方法將48隻健康的帶目的飼養之小獵犬隨機分配接受測試物(n=40)或參考物(n=8)之靜脈內注射。經測試物治療之狗在第0天接受3 × 10
5個ePB-MSC (1 mL) (n=8)、9 × 10
5個ePB-MSC (3 mL) (n=8)及15 × 10
5個ePB-MSC (5 mL) (n=8) (單次注射治療組)，或在第0天、第42天及第84天接受3 × 10
5個ePB-MSC (1 mL) (n=8)及15 × 10
5個ePB-MSC (5 mL) (n=8) (重複注射治療組)。注射後，評估所有狗持續252天。所有狗皆進行每日臨床觀測以評估不良事件之發生率。採取血液及尿液樣本用於血液學、凝固及生物化學分析。在研究期結束時，將所有動物安樂死以用於徹底屍體剖檢及組織學且分析ePB-MSC之保留度。
結果在對照組與治療組之間未觀測到臨床安全性參數之明顯差異，若干MSC治療組中之暫時性網狀紅血球增加除外。然而，此與任何不良事件不相關且總體方式在參考範圍內。狗中無一者在體檢、臨床觀測及注射部位觀測期間顯示任何臨床異常。未發生體重顯著減輕。未觀測到與研究藥品相關之不良事件，且實驗室結果中無一者指示在研究期間有任何明顯異常。基於文獻研究，整個研究中之異常發現(除網狀紅血球增多症以外)可視為偶發的且與測試物不相關。在屍體剖檢及組織病理學評估期間未觀測到異位組織。另外，所觀測到之所有(輕度)異常不可能與測試物相關。PCR分析發現，eMSC不存在於分析樣本中，從而指示MSC並不長期滯留於組織或循環中。
結論測試物顯示為對於靜脈內使用/投與而言安全的。
實例 5 ： 在用 ePB-MSC 進行之治療之前及之後狗之混合淋巴球反應 (MLR) ： 設定 ：為了研究在狗中誘發OA之後、在向狗注射ePB-MSC之前及之後的細胞免疫反應，用自狗分離之周邊血液單核細胞(PBMC)執行混合淋巴球反應(MLR)分析。
為了確認狗中ePB-MSC之免疫調節特性，在混合淋巴球反應(MLR)分析中，將ePB-MSC與經刀豆球蛋白A (conA)刺激之犬科動物周邊血液單核細胞(PBMC)共同培育。因此，使用流動式細胞測量術，使用羧基螢光素丁二醯亞胺基酯7-胺基放線菌素D (CFSE-7AAD)標記物來評估PBMC增殖(%)。在治療之前及之後對兩項不同臨床研究(概念驗證研究及安全性研究)中所包括之所有狗執行此分析。
在手術OA模型誘發之後兩週將概念驗證研究中之32隻狗分配至四個治療組(亦即，低劑量(T1) (100.000個ePB-MSC)、標準劑量(T2) (300.000個ePB-MSC)及高劑量(T3) (1.500.000個ePB-MSC)及利用鹽水之對照組(T4))。對此，使用前十字韌帶(ACL)軟骨缺陷模型，其導致關節退化及軟骨缺陷。
將安全性研究中所包括之48隻狗分成6個具有8隻狗之相等群組且接受不同劑量之ePB-MSC或安慰劑(亦即，T1：安慰劑(對照組)，T2：單次注射建議劑量(= 300.000個ePB-MSC)，T3：單次注射3×建議劑量，T4：單次注射5×建議劑量，T5：重複注射(n=3次)建議劑量，及T6：重複注射(n=3次) 5×建議劑量)。
結果 ： 概念驗證研究在治療之前(第-7天)及之後(治療後第28天)，對於所有治療組，當與陽性對照相比時，共同培育樣本之PBMC增殖(%)顯著地較低(P＜0.001)。另外，在治療前與治療後相比之PBMC增殖(%)之間未發現顯著差異(對於各治療組) (P≥0.061) (圖5)。
安全性研究在治療之前(第-7天)及之後(第126天)，對於所有治療組，當與陽性對照相比時，共同培育樣本之PBMC增殖(%)顯著地較低(P≤0.002)。另外，與治療前相比，治療後共同培育樣本之PBMC增殖(%)降低。然而，此僅對於六組中之三組為顯著的(圖6)。
結論 ：兩項研究中之所有治療組之PBMC增殖顯著地低於治療之前及之後的陽性對照之PBMC增殖，從而確認ePB-MSC減少經刺激犬科動物PBMC之發炎反應的免疫調節能力。另外，在治療之前及之後發現ePB-MSC之強免疫調節特性。此外，重複注射不降低ePB-MSC之免疫調節特性。相反地，在六組中之三組中靜脈內注射之後發現此等免疫調節特性顯著地較高。免疫調節特性確認異種ePB-MSC可用於治療狗之骨關節炎。
實例 6 ： MLR 上清液中之免疫調節性及促炎性標記物 設定 ：使用商用ELISA套組在將ePB-MSC與經conA刺激之犬科動物PBMC共同培育4天之MLR分析期間收集之上清液中測試免疫調節性及促炎性標記物。此係為了進一步研究馬周邊血液衍生之間葉幹細胞(ePB-MSC)對犬科動物PBMC之免疫調節特性，及為了鑑別何種ePB-MSC分泌之旁分泌因子可參與此免疫調節過程。
結果 ：結果顯示，與陰性對照樣本相比，陽性對照樣本中之TGF-β1濃度較大增加。然而，與陽性對照相比，在免疫調節樣本中發現較大減少，此與陰性對照相當。先前已描述TGF-β1之促炎性特性，且該等特性潛在地誘導或刺激T細胞分化成發炎性T-輔助17細胞。此等結果指示，TGF-β1之產生可因ePB-MSC之免疫調節特性而下調至基線位準(圖7)。
此外，與陰性對照相比，在陽性對照樣本之上清液中發現TNF-α濃度顯著地增加。此指示，犬科動物PBMC之ConA刺激會誘導或刺激促炎性細胞介素TNF-α之釋放。免疫調節樣本之ELISA結果顯示，ePB-MSC能夠將TNF-α濃度降低至陰性對照之位準，此指示ePB-MSC能夠藉由其免疫調節特性來逆轉此發炎環境(圖8)。
最後，PGE2結果指示，當與陽性及陰性對照樣本相比時，免疫調節與上清液中之PGE2強力增加相關。此等結果指示PGE2在ePB-MSC之免疫調節作用中的重要性(圖9)。
結論 ：免疫調節上清液樣本上之ELISA顯示，ePB-MSC能夠將TNF-α及TGF-β1濃度降低至陰性對照之位準，此指示ePB-MSC能夠藉由其免疫調節特性來逆轉此發炎環境。此外，與陽性樣本及陰性樣本相比，在免疫調節上清液樣本中發現PGE2強力增加，此進一步加強PGE2在ePB-MSC之免疫調節作用中的重要性。
實例 7 ： IV ePB-MSC 治療對犬科動物血液中之發炎性標記物及軟骨代謝物之影響 設定 ：為了在狗之OA病理學期間對ePB-MSC之活體內免疫調節特性獲得更多洞察，在治療之前及之後在不同時間點(第-21天、第0天、第14天、第28天及第48天)，評估32隻狗之血清中所關注之不同發炎性標記物及軟骨代謝物。在手術OA模型誘發之後兩週將32隻狗分配至四個治療組(亦即，低劑量(T1) (100.000個ePB-MSC)、標準劑量(T2) (300.000個ePB-MSC)、高劑量(T3) (1.500.000個ePB-MSC)及利用鹽水之對照組(T4))。對此，使用前十字韌帶(ACL)軟骨缺陷模型，其導致關節退化及軟骨缺陷。所研究之發炎性標記物及軟骨代謝物為轉型生長因子β1 (TGF-β1)、前列腺素E2 (PGE2)、干擾素-γ (IFN-γ)、補體因子C3a、II型膠原蛋白裂解物(C2C)及玻糖醛酸(HA)。
在單獨的事後分析中，將此研究之所有狗基於其在研究結束時(第42天)之滑膜炎及軟骨評分(對照：評分≤2；病例：評分＞2)再細分為對照及病例。基於上文所提及之標記物使用單變數靜力學來查看是否在此等群組之間發現顯著差異。
結果 ：經300.000個ePB-MSC治療之狗(T2)之結果顯示在治療後第28天與對照組相比HA血清含量顯著地增加(圖10)。此外，事後分析顯示病例與對照群體之間的HA血清含量亦顯著地不同(圖11)。另外，在投藥治療之後的所有時間點，與對照組(T4)相比，在經300.000個ePB-MSC治療之狗(T2)中發現較高的PGE2血清含量。然而，此僅在治療後第14天顯著地不同(圖12)。在評估時間點未發現ePB-MSC投與對另一測試活體內標記物有顯著作用。
結論 ：增加之HA含量顯示ePB-MSC潛在地引起軟骨退化減輕且指示ePB-MSC之軟骨保護作用。根據顯示軟骨及滑膜炎評分與HA血清濃度之間的明確關係之事後分析，此得到加強。此外，PGE2含量增加確認以下吾等活體外發現：PGE2參與ePB-MSC之免疫調節作用模式。
實例 8 ： ePB-MSC 至患有 OA 之關節之生物分佈 設定 ：在實驗室狗中使用OA模型之利用
99mTc標記之ePB-MSC的生物分佈研究經設定以研究ePB-MSC至損傷區域之歸巢行為。在生物分佈研究開始之前四天，三隻帶目的飼養之狗經歷手術程序以誘發犬科動物OA模型。在各狗之右膝關節中藉由完全橫切顱骨十字韌帶及在股髁之負重表面上產生雙側軟骨缺陷來誘發OA。在手術之前三天及在手術之後四天，執行功率都卜勒檢查(power doppler examination)以評估手術對關節中之血管形成的影響。接下來，使用
99mTc標記之ePB-MSC檢查注射後24 h的ePB-MSC至受傷膝關節及健康膝關節之生物分佈。使用全身掃描之側視圖上手動繪製之所關注區域(ROI)定量兩個膝關節(對照及病灶)之放射性。ePB-MSC在病灶關節中之相對吸收表述為相比於對照病灶之量測計數增加倍數。
主要結果 ：研究犬科動物OA模型中
99mTc標記之ePB-MSC之生物分佈顯露，在注射後24小時，與對照關節(n=3)相比，作業膝關節中之吸收高13.0 ± 3.9倍。在手術後四天執行之超音波檢查指示，在作業肢體之膝關節處灌注輕度增加，而僅在健康膝關節之層級下觀測到灌注輕微增加(資料未顯示)。
結論 ：此等結果表明在犬科動物OA治療中在靜脈內注射之後ePB-MSC至損傷區域之天然歸巢行為且為ePB-MSC之作用模式提供更多洞察。
本發明絕不限於實例中所描述及/或圖式中所顯示之實施例。相反地，本發明之方法可在不脫離本發明之範疇之情況下以許多不同方式實現。
圖 1顯示持續三個時間點之狗之跛行評估的概述：第0天-用根據本發明之一實施例之天然MSC進行之治療當天、第1次隨訪-該治療後三週及第2次隨訪-該治療後六週。
圖 2顯示持續三個時間點之狗之活動範圍(ROM)評分的概述：第0天-用根據本發明之一實施例之天然MSC進行之治療當天、第1次隨訪-該治療後三週及第2次隨訪-該治療後六週。
圖 3顯示持續三個時間點之狗之關節積液評分的概述：第0天-用根據本發明之一實施例之天然MSC進行之治療當天、第1次隨訪-該治療後三週及第2次隨訪-該治療後六週。
圖 4顯示不同群組之經根據本發明之一實施例之天然MSC或經對照產品治療之狗的跛行-(A)、關節疼痛-(B)、關節積液(C)評分、活動範圍(D)、平均最大力(E)、對稱性指數(F)及平均力(G)的過程(平均值±SD)。
圖 5顯示在用經刀豆球蛋白A刺激之犬科動物周邊血液單核細胞(PBMC)進行之混合淋巴球反應(MLR)分析中在用根據本發明之一實施例之100.000個ePB-MSC (低劑量)、300.000個ePB-MSC (目標劑量)或1.500.000個ePB-MSC (高劑量)或鹽水(對照)治療患有手術誘發之骨關節炎之狗之前(第-7天，左側)及之後(第28天，右側)的PBMC增殖，* p值＜ 0.05。
圖 6顯示在用經刀豆球蛋白A (ConA)刺激之犬科動物周邊血液單核細胞(PBMC)進行之混合淋巴球反應(MLR)分析中在接受不同劑量之根據本發明之一實施例之ePB-MSC或安慰劑之前(第-7天，左側)及之後(第126天，右側)(亦即，T1：安慰劑(對照組)，T2：單次注射建議劑量(= 300.000個ePB-MSC)，T3：單次注射3×建議劑量，T4：單次注射5×建議劑量，T5：重複注射(n=3次)建議劑量及T6：重複注射(n=3次) 5×建議劑量)的PBMC增殖。
圖 7顯示MLR分析之陰性對照、陽性對照及免疫調節樣本之上清液中之TGF-β1濃度(平均值±SD)。
圖 8顯示MLR之陰性對照、陽性對照及免疫調節樣本之上清液中之TNF-α濃度(平均值±SD)。
圖 9顯示MLR分析之陰性對照、陽性對照及免疫調節樣本之上清液中之PGE2濃度(平均值±SD)。
圖 10顯示在第-21天、第14天、第28天及第42天經標準化持續第0天之HA濃度之盒狀圖視像化(*p值＜ 0.017)。
圖 11顯示基於事後分析之HA濃度(ng/mL)之盒狀圖視像化(*p值＜ 0.05)。填充盒：對照；點線盒：病例。
圖 12顯示在第-21天、第14天、第28天及第42天經標準化持續第0天之PGE2濃度之盒狀圖視像化(*p值＜ 0.017)。
Claims (20)
- 一種間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療犬科動物及貓科動物之骨關節炎。
- 如請求項1之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC係靜脈內投與。
- 如請求項1至2中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC係原生的。
- 如請求項1至3之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC衍生自血液，較佳衍生自周邊血液。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC為異體或異種MSC，較佳為異種MSC。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC為動物衍生的，較佳為哺乳動物衍生的，更佳為馬衍生的。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中投與之劑量為10 5-10 7個MSC/隻犬科動物或貓科動物。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中投與單次劑量。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中投與多次劑量，其中各劑量係在不同時間點投與。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該組合物之一個劑量具有最大約5 ml之體積，較佳地，該體積為約1 ml。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC量測之II類MHC分子及/或CD45係呈陰性。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90係呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45係呈陰性。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中當該等MSC存在於發炎環境或條件中時，會分泌免疫調節性前列腺素E2細胞介素。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中當該等MSC存在於發炎環境或條件中時且與具有相同特徵，但未接受該發炎環境或條件之細胞相比具有增加之選自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其組合中之至少一種分子的分泌；及/或減少之IL-1之分泌。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中當在存在PBMC之情況下時該等MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其組合之表現，及/或當在存在PBMC之情況下時該等MSC抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β、IL-13或其組合之分泌。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC存在於無菌液體中。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC或該組合物進一步包含選自由以下組成之群之組分：富血小板血漿(PRP)、玻糖醛酸、基於玻糖醛酸之組合物、葡萄胺聚醣或基於葡萄胺聚醣之組合物、或其任何組合。
- 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該治療為經診斷患有或罹患骨關節炎之犬科動物及貓科動物之跛行及/或關節疼痛治療。
- 如請求項18之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC或該組合物係靜脈內投與。
- 一種醫藥組合物，其包含周邊血液衍生之MSC，該等MSC為動物衍生的，較佳為哺乳動物衍生的，且以在10 5-10 7個MSC/毫升該組合物之間的濃度存在於無菌液體中，其中一個劑量之該組合物具有約0.5 ml至5 ml之體積，其中該等MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45呈陰性，且其中該等MSC具有在10 μm與100 μm之間的懸浮直徑。
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