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TW202237826A - 基因編輯的自然殺手細胞 - Google Patents

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TW202237826A
TW202237826A TW110144688A TW110144688A TW202237826A TW 202237826 A TW202237826 A TW 202237826A TW 110144688 A TW110144688 A TW 110144688A TW 110144688 A TW110144688 A TW 110144688A TW 202237826 A TW202237826 A TW 202237826A
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car
cell
gene
engineered
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TW110144688A
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維多利亞 克拉晨科
韋倫 梁
阿里瑞薩 里薩尼亞
瓦倫廷 史拉許
丹妮爾 斯溫
羅啟 派翠克 克勞迪奧 奧文多
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瑞士商克里斯珀醫療股份公司
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Abstract

本發明尤其關於包含破壞的 B2M基因和編碼SERPINB9、IL15與IL15Rα的融合體和/或HLA-E中的一者或多者的插入多核苷酸的工程化細胞（例如iPSC、IPS衍生的NK或NK細胞）。該工程化細胞可進一步包含破壞的 CIITA基因和編碼CAR的插入多核苷酸，其中該CAR可為抗BCMA CAR或抗CD30 CAR。該工程化細胞可進一步包含破壞的 ADAM17基因、破壞的 FAS基因、破壞的 CISH基因和/或破壞的 REGNASE-1基因。本發明還提供了用於產生該等工程化細胞之方法，並且還描述了該等工程化細胞之治療性用途。本發明還描述了靶向所述靶序列的引導RNA序列。

Description

基因編輯的自然殺手細胞
本發明關於基因編輯的iPSC和自然殺手（NK）細胞領域。
需要不依賴於使用從患者或供者獲得的細胞並且不誘導同種異體排斥的過繼性細胞療法。自然殺手（NK）細胞係強大的抗腫瘤效應細胞，使得它們成為癌症免疫療法的有吸引力的候選物。然而，將NK細胞，特別是表現嵌合抗原受體（CAR）的NK細胞用於過繼性細胞療法仍然具有挑戰性。例如，需要改善治療性NK細胞的功效、持久性、細胞毒活性、免疫逃避和腫瘤靶向。還需要治療性NK細胞的均一庫，其可以按一致的方式製造以用於有需要的任何患者。
在一些方面，本揭露提供了工程化細胞，該等工程化細胞已經使用例如CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯，以防止同種免疫反應，為免疫逃避性的，具有增加的存活和持久性、增加的活化、和/或特異性細胞靶向。
在一些方面，本揭露提供了工程化細胞，該等工程化細胞包含 (a) 破壞的 β-2- 微球蛋白（ B2M）基因，和 (b) 在該破壞的 B2M基因中第一多核苷酸和第二多核苷酸的插入，該第一多核苷酸編碼SERPINB9蛋白，並且該第二多核苷酸編碼介白素15（IL15）和介白素15受體亞基α（IL15Rα）之融合蛋白，其中該等細胞表現該SERPINB9蛋白以及該IL15與IL15Rα之融合蛋白，並且該等細胞具有破壞的B2M表現。在一些實施方式中，該等工程化細胞包含破壞的 II 類主要組織相容性複合體反式啟動子（ CIITA ）基因，其中該等細胞具有破壞的CIITA表現。在其他實施方式中，該等工程化細胞進一步包含編碼嵌合抗原受體（CAR）的第三多核苷酸的插入，其中該等細胞表現CAR。在另外的實施方式中，該等工程化細胞進一步包含編碼人白血球抗原E（HLA-E）三聚體的第四多核苷酸的插入，並且該等細胞進一步表現該HLA-E三聚體。在其他實施方式中，該等工程化細胞進一步包含破壞的 細胞介素誘導型含 SH2 蛋白（ CISH ）基因，其中該等細胞具有破壞的CISH表現。在其他實施方式中，該等工程化細胞進一步包含破壞的 Fas 細胞表面死亡受體（ FAS ）基因，其中該等細胞具有破壞的FAS表現。
在進一步的方面，本揭露提供了用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送：(a) 第一RNA引導的核酸酶和靶向 B2M基因座中的靶位點的第一引導RNA（gRNA）；(b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼SERPINB9蛋白的核苷酸序列以及編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白的核苷酸序列；(ii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)；其中該 B2M基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該SERPINB9蛋白以及該IL15與IL15Rα之融合蛋白的核苷酸序列被插入該 B2M基因座中，從而破壞該 B2M基因。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該細胞遞送：(c) 第二RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的第二gRNA；和 (d) 包含核酸的第二載體，該核酸包含：(i) 編碼嵌合抗原受體（CAR）的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)；並且其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該CAR的核苷酸序列被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因。在一些實施方式中，(d) (i) 的該核苷酸序列進一步包含編碼HLA-E三聚體的核苷酸序列。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該細胞遞送第三RNA引導的核酸酶和靶向 CISH基因座中的靶位點的第三gRNA；其中該 CISH基因座在該靶位點處被切割，並且至少一個插入-缺失突變被引入到該 CISH基因中，從而破壞該 CISH基因。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該細胞遞送第四RNA引導的核酸酶和靶向 FAS基因座中的靶位點的第四gRNA，其中該 FAS基因座在該靶位點處被切割，並且至少一個插入-缺失突變被引入到該 FAS基因中，從而破壞該 FAS基因。
在進一步的方面，本揭露提供了多個任何本文所述之工程化細胞。本揭露還提供了包含本文揭露的任何工程化細胞或者源自或得自本文揭露的任何工程化細胞之細胞的組成物，其中將組成物中的任一種用作藥物。在一些實施方式中，將本文揭露的組成物中的任一種用於治療癌症。
在一些方面，本揭露提供了用於治療有需要的受試者之方法，該方法包括：(a) 獲得或已獲得分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞後的本文所述之多個工程化細胞；以及 (b) 向該受試者投與該等譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
下文詳細描述本發明之其他方面和反覆運算。
相關申請的交叉引用
本申請要求於2020年11月30日提交的美國臨時申請案號63/119,512、於2021年6月23日提交的美國臨時申請案號63/214,134和於2021年9月29日提交的美國臨時申請案號63/250,048之權益，它們各自的揭露內容特此藉由援引以其全文併入。
本揭露提供了工程化幹細胞（例如iPSC）和譜系限制性先驅細胞或由其衍生的完全分化體細胞（例如，造血細胞如NK細胞，特別是人NK細胞）的組成物。
在某些實施方式中，本文所述之工程化細胞逃避免疫反應和/或在以比未修飾的細胞更高的成功率植入受試者後存活。在一些實施方式中，該等工程化細胞係低免疫性的。在一些實施方式中，與未修飾的或野生型細胞，例如野生型iPSC或野生型NK細胞相比，該等工程化細胞具有改善的持久性，(ii) 改善的免疫逃避性，(iii) 改善的細胞毒活性，(iv) 改善的ADCC活性，和/或 (v) 改善的抗腫瘤活性。
在一些實施方式中，該等工程化細胞缺乏功能性主要組織相容性複合體（MHC）。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞經基因編輯以破壞MHC-I或MHC-II複合體的一或多種基因。
在一些實施方式中，該等工程化細胞具有破壞的 B2M基因並且具有降低的B2M表現（例如，表現小於未修飾細胞水平的30%、小於25%、小於20%、小於10%、小於5%）或消除的B2M表現（例如，不表現可檢測水平的B2M）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞具有破壞的 CIITA基因並且具有降低的CIITA表現（例如，表現小於未修飾細胞水平的30%、小於25%、小於20%、小於10%、小於5%）或消除的CIITA表現（例如，不表現可檢測水平的CIITA）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞具有破壞的 ADAM17基因並且具有降低的ADAM17表現（例如，表現小於未修飾細胞水平的30%、小於25%、小於20%、小於10%、小於5%）或消除的ADAM17表現（例如，不表現可檢測水平的ADAM17）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞具有破壞的 FAS基因並且具有降低的FAS表現（例如，表現小於未修飾細胞水平的30%、小於25%、小於20%、小於10%、小於5%）或消除的FAS表現（例如，不表現可檢測水平的FAS）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞具有破壞的 CISH基因並且具有降低的CISH表現（例如，表現小於未修飾細胞水平的30%、小於25%、小於20%、小於10%、小於5%）或消除的CISH表現（例如，不表現可檢測水平的CISH）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞具有破壞的 REGNASE-1基因並且具有降低的REGNASE-1表現（例如，表現小於未修飾細胞水平的30%、小於25%、小於20%、小於10%、小於5%）或消除的REGNASE-1表現（例如，不表現可檢測水平的REGNASE-1）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞的基因組具有破壞的 B2M基因和一或多個插入多核苷酸，該一或多個插入多核苷酸編碼以下中的一種或全部：SERPINB9、IL15、IL15Rα和HLA-E。在某些實施方式中，該一或多個插入多核苷酸編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白（「IL15/IL15Rα」）以及HLA-E三聚體，該HLA-E三聚體包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。在某些實施方式中，該一或多個插入多核苷酸編碼SERPINB9以及IL15與IL15Rα之融合蛋白。該插入多核苷酸可被插入破壞的 B2M基因座中（例如，在 B2M基因座的外顯子1中）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞的基因組具有破壞的 CIITA基因和編碼一或多種CAR（例如，BCMA CAR或CD30 CAR）的一或多個插入多核苷酸。該插入多核苷酸可被插入破壞的 CIITA基因座中（例如，在 CIITA基因座的外顯子2中）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞的基因組具有破壞的 CIITA基因和編碼CAR和/或HLA-E三聚體的一或多個插入多核苷酸。在一些實施方式中，該一或多個插入多核苷酸編碼CAR（例如，CD30 CAR）和HLA-E三聚體。該插入多核苷酸可被插入破壞的 CIITA基因座中（例如，在 CIITA基因座的外顯子2中）。
在一些實施方式中，該等工程化細胞的基因組具有編碼MHC-I或MHC-II複合體的組分的一或多個破壞的基因、破壞的 ADAM17以及編碼一或多種CAR（例如BCMA CAR或CD30 CAR）的一或多個插入多核苷酸。
在一些實施方式中，該等工程化細胞的基因組具有一個、兩個、三個、四個或所有以下基因編輯：(i) 破壞的 B2M基因；(ii) 一或多個插入多核苷酸，其編碼以下中的一種或全部：SERPINB9、IL15/IL15Rα和HLA-E（例如，編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白以及HLA-E三聚體的多核苷酸，該HLA-E三聚體包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽，或編碼SERPINB9以及IL15與IL15Rα之融合蛋白的多核苷酸）；(iii) 破壞的 CIITA基因；(iv) 編碼一或多種CAR（例如，BCMA CAR或CD30 CAR）的一或多個插入多核苷酸；和 (v) 破壞的 ADAM17基因。在一些實施方式中，該等工程化細胞進一步包含破壞的 FAS、 CISH和/或 REGNASE-1基因。
在一些實施方式中，該等工程化細胞的基因組包含 (a) 破壞的 B2M基因；(b) 在該破壞的 B2M基因中之第一多核苷酸和第二多核苷酸的插入，該第一多核苷酸編碼SERPINB9蛋白，並且該第二多核苷酸編碼IL15與IL15Rα的融合體；(c) 破壞的 CIITA基因；(d) 在該破壞的 CIITA基因中的第三多核苷酸和第四多核苷酸的插入，該第三多核苷酸編碼CAR，並且該第四多核苷酸編碼HLA-E三聚體；(e) 破壞的 CISH基因；和 (f) 破壞的 FAS基因。
在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係幹細胞。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係iPSC。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係中胚層細胞。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係生血內皮（HE）細胞（例如，確定性生血內皮細胞）。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係造血幹細胞或先驅細胞（HSPC）（例如，確定性造血幹細胞或先驅細胞）。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係共同淋巴樣先驅細胞（CLP）。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係NK先驅細胞。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係未成熟的NK細胞。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係NK細胞。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係完全分化造血細胞（例如NK細胞）。在一些實施方式中，幹細胞（例如iPSC）如本文所述進行基因編輯，然後分化成一種、兩種、三種、四種、五種、六種或更多種以下細胞類型：中胚層細胞、HE細胞、HSPC、CLP細胞、NK先驅細胞、未成熟的NK細胞和NK細胞。在一些實施方式中，分化的細胞保持了在它們所來源的細胞中產生的所有編輯（例如，NK細胞保持了它們所來源的經基因編輯的幹細胞（例如，iPSC細胞）的所有編輯）。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係CD34 +細胞。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係多能先驅細胞（MPP）。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係共同淋巴樣先驅細胞。在一些實施方式中，本文所述之工程化細胞係T細胞先驅細胞。
在一些實施方式中，造血細胞如NK細胞（源自工程化幹細胞）包含本文所述之基因編輯。 定義
如本文所用，術語「約」或「大約」係指與參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度相比變化達15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。在一個實施方式中，術語「約」或「大約」係指關於參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度 ± 15%、± 10%、± 9%、± 8%、± 7%、± 6%、± 5%、± 4%、± 3%、± 2%或 ± 1%的數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度的範圍。
如本文所用，術語「誘導多能幹細胞」或iPSC係指由分化的成體、新生兒或胎兒細胞產生的幹細胞，該等成體、新生兒或胎兒細胞已被誘導或改變，即重程式設計為能夠分化成以下所有三種胚層或皮層的組織之細胞：中胚層、內胚層和外胚層。所產生的iPSC不是指天然發現的細胞。
術語「造血幹細胞和先驅細胞」、「造血幹細胞」、「造血先驅細胞」或「造血先質細胞」係指定向於造血譜系但能夠進一步造血分化的細胞，並且包括多能造血幹細胞（成血細胞）、骨髓先驅細胞、巨核細胞先驅細胞、紅血球先驅細胞和淋巴樣先驅細胞。造血幹細胞和先驅細胞（HSC）係產生所有血細胞類型的多能幹細胞，該等血細胞類型包括髓系（單核細胞和巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、紅血球、巨核細胞/血小板、樹突細胞）和淋巴譜系（T細胞、B細胞、NK細胞）。如本文所用的術語「確定性造血幹細胞」係指能夠產生成熟的骨髓和淋巴樣細胞類型（包括T細胞、NK細胞和B細胞）的CD34 +造血細胞。造血細胞還包括產生原始紅血球、巨核細胞和巨噬細胞的原始造血細胞的各種亞群。
如本文所用，術語「NK細胞」或「自然殺手細胞」係指由表現CD56或CD16和不存在T細胞受體（CD3）所定義的周邊血淋巴細胞的亞群。如本文所用，術語「適應性NK細胞」和「記憶NK細胞」係可互換的，並且係指在表型上為CD3 -和CD56 +，表現NKG2C和CD57中的至少一種，並且視需要表現CD16，但缺乏以下中的一或多種之表現的NK細胞亞群：PLZF、SYK、FceRy和EAT-2。在一些實施方式中，分離的CD56 +NK細胞亞群包含CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配位基、NKp30、NKp40、NKp46、活化和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-l之表現。
如本文所用，術語「破壞」、「遺傳修飾」或「基因編輯」通常係指其中基因組DNA的位點或區域被改變的遺傳修飾，例如藉由缺失或插入，藉由任何分子生物學方法（例如本文所述之方法），例如藉由向基因組DNA的位點遞送內切核酸酶和至少一種gRNA。示例性遺傳修飾包括插入、缺失、複製、倒位和易位及其組合。在一些實施方式中，遺傳修飾係缺失。在一些實施方式中，遺傳修飾係插入。在其他實施方式中，遺傳修飾係插入-缺失突變（或插缺），使得靶基因的閱讀框移位，從而導致基因產物改變或無基因產物。如本文所用，術語「工程化細胞」係指具有任何破壞、遺傳修飾或基因編輯的細胞。
如本文所用，可以與術語「遺傳缺失」、「敲除」或「KO」互換使用的術語「缺失」通常係指以下遺傳修飾，其中藉由任何分子生物學方法，例如本文所述之方法，例如藉由將內切核酸酶和至少一種gRNA遞送至基因組DNA的位點來去除基因組DNA的位點或區域。可以缺失任何數量的核苷酸。在一些實施方式中，缺失涉及去除至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少十個、至少十五個、至少二十個或至少25個核苷酸。在一些實施方式中，缺失涉及去除10-50、25-75、50-100、50-200或超過100個核苷酸。在一些實施方式中，缺失涉及去除靶基因的一部分，例如 B2M基因、 CIITA基因、 ADAM17基因、 FAS基因、 CISH基因和/或 REGNASE-1基因的啟動子和/或編碼序列之全部或一部分。在一些實施方式中，缺失涉及去除整個靶基因，例如 B2M基因、 CIITA基因、 ADAM17基因、 FAS基因、 CISH基因和/或 REGNASE-1基因。在一些實施方式中，缺失涉及去除靶基因的轉錄調控因子，例如啟動子區。在一些實施方式中，缺失涉及去除編碼區之全部或一部分，使得通常由編碼區表現的產物不再表現、表現為截短形式或以降低的水平表現。在一些實施方式中，缺失導致基因之表現相對於未經修飾的細胞減少。在一些實施方式中，表現的減少可為表現水平的降低（例如，表現小於未修飾細胞水平的30%、小於25%、小於20%、小於10%、小於5%）。在一些實施方式中，表現的減少可為消除表現（例如，無表現或不表現可檢測水平的RNA和/或蛋白）。可以使用任何標準的基於RNA、基於蛋白和/或基於抗體的檢測方法（例如RT-PCR、ELISA、流動式細胞分析術、免疫細胞化學等）來測量表現。可檢測水平被定義為高於檢測限（LOD），檢測限係可以藉由給定的檢測方法以統計學顯著性測量（檢測）的最低濃度。
如本文所用，術語「內切核酸酶」通常係指切割多核苷酸內的磷酸二酯鍵的酶。在一些實施方式中，內切核酸酶特異性切割DNA多核苷酸內的磷酸二酯鍵。在一些實施方式中，內切核酸酶係鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應物核酸酶（TALEN）、歸巢內切核酸酶（HE）、大範圍核酸酶、MegaTAL或CRISPR相關內切核酸酶。在一些實施方式中，內切核酸酶係RNA引導的內切核酸酶。在某些方面，RNA引導的內切核酸酶係CRISPR核酸酶，例如II型CRISPR Cas9內切核酸酶或V型CRISPR Cpf1內切核酸酶。在一些實施方式中，內切核酸酶係Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（也稱為Csn1和Csx12）、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1內切核酸酶、或其同源物、其天然存在的分子的重組、其密碼子優化型式或其修飾型式、或其組合。在一些實施方式中，內切核酸酶可以將一或多個單鏈斷裂（SSB）和/或一或多個雙鏈斷裂（DSB）引入。
如本文所用，術語「引導RNA」或「gRNA」通常係指可以與內切核酸酶相互作用，例如與內切核酸酶結合，並且與靶基因組位點或區域結合或雜交的短核糖核酸。在一些實施方式中，gRNA係單分子引導RNA（sgRNA）。在一些實施方式中，gRNA可以包含間隔子延伸區。在一些實施方式中，gRNA可以包含tracrRNA延伸區。在一些實施方式中，gRNA係單鏈的。在一些實施方式中，gRNA包含天然存在的核苷酸。在一些實施方式中，gRNA係經化學修飾的gRNA。在一些實施方式中，經化學修飾的gRNA係包含具有化學修飾（例如，2′-O-甲基糖修飾）的至少一個核苷酸的gRNA。在一些實施方式中，經化學修飾的gRNA包含經修飾的核酸骨架。在一些實施方式中，經化學修飾的gRNA包含2'-O-甲基-硫代磷酸酯殘基。在一些實施方式中，gRNA可以與DNA內切核酸酶預複合。
如本文所用，可以與術語「遺傳插入」或「敲入」互換使用的術語「插入」通常係指以下遺傳修飾，其中藉由任何分子生物學方法，例如本文所述之方法，例如藉由將內切核酸酶和至少一種gRNA遞送至基因組DNA的位點來將多核苷酸引入或添加至基因組DNA的位點或區域中。在一些實施方式中，插入可以發生在基因組DNA的已經是先前遺傳修飾（例如，缺失或插入-缺失突變）的位點的位點內或附近。在一些實施方式中，插入發生在基因組DNA的與先前遺傳修飾（例如，缺失或插入-缺失突變）的位點部分重疊、完全重疊或包含在該先前遺傳修飾的位點內的位點處。在一些實施方式中，插入涉及將編碼目的蛋白的多核苷酸引入。在一些實施方式中，插入涉及將編碼致耐受性因子（例如HLA-E）、CAR、IL15與ILRα之融合蛋白和/或SERPINB9的多核苷酸引入。在一些實施方式中，插入涉及將外源啟動子例如組成型啟動子（例如，CAG啟動子）引入。在一些實施方式中，插入涉及將編碼非編碼基因的多核苷酸引入。通常，待插入的多核苷酸側接有與插入位點處或附近的基因組DNA具有顯著的序列同源性的序列（例如，同源臂）。
如本文所用，術語「主要組織相容性複合體I類」或「MHC-I」通常係指這樣的一類生物分子，該類生物分子在脊椎動物（包括哺乳動物，例如人）中的所有有核細胞之細胞表面上發現；並且功能係從細胞內（即細胞溶質）向細胞毒性T細胞（例如，CD8 +T細胞）展示非自身或外來抗原（例如，蛋白）的肽，以便刺激免疫反應。在一些實施方式中，MHC-I生物分子係MHC-I基因或MHC-I蛋白。MHC-I蛋白與β-2微球蛋白（β2M）的複合係所有MHC-I蛋白的細胞表面表現所需的。在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞減少MHC-I人白血球抗原（HLA）之表現涉及MHC-I基因表現的減少（或降低）。在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞減少MHC-I人白血球抗原（HLA）之表現涉及MHC-I蛋白的細胞表面表現的減少（或降低）。在一些實施方式中，MHC-I生物分子係HLA-A（NCBI基因ID號：3105）、HLA-B（NCBI基因ID號：3106）、HLA-C（NCBI基因ID號：3107）或B2M（NCBI基因ID號：567）。
如本文所用，術語「主要組織相容性複合體II類」或「MHC-II」通常係指這樣的一類生物分子，該類生物分子通常在脊椎動物（包括哺乳動物，例如人）中的抗原呈現細胞之細胞表面上發現；並且功能係從細胞的外部（細胞外）向細胞毒性T細胞（例如，CD8 +T細胞）展示非自身或外來抗原（例如，蛋白）的肽，以便刺激免疫反應。在一些實施方式中，抗原呈現細胞係樹突細胞、巨噬細胞或B細胞。在一些實施方式中，MHC-II生物分子係MHC-II基因或MHC-II蛋白。在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞減少MHC-II人白血球抗原（HLA）之表現涉及MHC-II基因表現的減少（或降低）。在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞減少MHC-II人白血球抗原（HLA）之表現涉及MHC-II蛋白的細胞表面表現的減少（或降低）。在一些實施方式中，MHC-II生物分子係HLA-DPA（NCBI基因ID號：3113）、HLA-DPB（NCBI基因ID號：3115）、HLA-DMA（NCBI基因ID號：3108）、HLA-DMB（NCBI基因ID號：3109）、HLA-DOA（NCBI基因ID號：3111）、HLA-DOB（NCBI基因ID號：3112）、HLA-DQA（NCBI基因ID號：3117）、HLA-DQB（NCBI基因ID號：3119）、HLA-DRA（NCBI基因ID號：3122）或HLA-DRB（NCBI基因ID號：3123）。
如本文所用，可以與術語「核酸」互換使用的術語「多核苷酸」通常係指包含兩個或更多個核苷酸的生物分子。在一些實施方式中，多核苷酸包含至少兩個、至少五個、至少十個、至少二十個、至少30個、至少40個、至少50個、至少100個、至少200個、至少250個、至少500個或任何數量的核苷酸。多核苷酸可為DNA或RNA分子或雜合DNA/RNA分子。多核苷酸可為單鏈的或雙鏈的。在一些實施方式中，多核苷酸係基因組DNA的位點或區域。在一些實施方式中，多核苷酸係包含在未修飾的細胞或經基因編輯的iPSC的基因組內的內源基因。在一些實施方式中，多核苷酸係未整合到基因組DNA中的外源多核苷酸。在一些實施方式中，多核苷酸係整合到基因組DNA中的外源多核苷酸。在一些實施方式中，多核苷酸係質體或腺相關病毒載體。在一些實施方式中，多核苷酸係環狀或線性分子。
如本文所用，術語「受試者」係指哺乳動物。在一些實施方式中，受試者係非人靈長類動物或齧齒動物。在一些實施方式中，受試者係人。在一些實施方式中，受試者患有疾病或障礙、懷疑患有疾病或障礙或有疾病或障礙風險。在一些實施方式中，受試者具有疾病或障礙的一或多種症狀。
如本文所用，術語「MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子」通常係指調控（例如，增加或減少）MHC-I和/或MHC-II人白血球抗原之表現的生物分子。在一些實施方式中，生物分子係多核苷酸（例如，基因）或蛋白。在一些實施方式中，MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子將增加或減少至少一種MHC-I或MHC-II蛋白的細胞表面表現。在一些實施方式中，MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子將增加或減少至少一種MHC-I或MHC-II基因之表現。在一些實施方式中，轉錄調控因子係CIITA（NCBI基因ID號：4261）或NLRC5（NCBI基因ID號：84166）。在一些實施方式中，CIITA或NLRC5表現的缺失或降低減少了至少一種MHC-I或MHC-II基因之表現。
如本文所用，術語「工程化細胞」通常係指相對於未經修飾的細胞，在細胞移植過程中不易發生同種異體排斥和/或在移植後展示出增加的存活的經遺傳修飾的細胞。在一些實施方式中，如本文所述之遺傳修飾的細胞係工程化細胞。在一些實施方式中，與未修飾的細胞相比，工程化細胞具有增加的免疫逃避和/或細胞存活。在一些實施方式中，與未修飾的細胞相比，工程化細胞具有增加的細胞存活。在一些實施方式中，與未修飾的細胞相比，工程化細胞具有改善的持久性，(ii) 改善的免疫逃避性，(iii) 改善的細胞毒活性，(iv) 改善的ADCC活性，和/或 (v) 改善的抗腫瘤活性。在一些實施方式中，工程化細胞可為幹細胞。在一些實施方式中，工程化細胞可為胚胎幹細胞（ESC）、成體幹細胞（ASC）、誘導多能幹細胞（iPSC）或造血幹細胞或先驅細胞（HSPC）。在一些實施方式中，工程化細胞可為分化的細胞。在一些實施方式中，工程化細胞可為體細胞（例如免疫系統細胞）。在一些實施方式中，將工程化細胞投與至受試者。在一些實施方式中，將工程化細胞投與至患有、懷疑患有疾病或有疾病風險的受試者。在一些實施方式中，該等工程化細胞能夠分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。在一些實施方式中，譜系限制性先驅細胞係胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞。在一些實施方式中，完全分化體細胞係內分泌細胞如胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞或免疫系統細胞。
如本文所用，術語「未修飾的細胞」係指未經歷涉及編碼本文所述之任何基因的多核苷酸或基因之遺傳修飾的細胞。在一些實施方式中，未經修飾的細胞可為幹細胞。在一些實施方式中，未經修飾的細胞可為胚胎幹細胞（ESC）、成體幹細胞（ASC）、誘導多能幹細胞（iPSC）或造血幹細胞或先驅細胞（HSPC）。在一些實施方式中，未經修飾的細胞可為分化細胞。在一些實施方式中，未經修飾的細胞可以選自體細胞（例如，免疫系統細胞，例如T細胞，例如CD8 +T細胞）。如果「相對於未修飾的細胞」比較經基因編輯的iPSC或NK細胞，則iPSC或NK細胞和未修飾的細胞係相同的細胞類型或共用共同的親本細胞系，例如，相對於未修飾的NK細胞比較經基因編輯的NK細胞。
如本文所用，術語「在基因內或附近」係指基因組DNA的作為所述基因的內含子或外顯子組分或位於所述基因近側的位點或區域。在一些實施方式中，如果基因組DNA的位點包含基因的內含子或外顯子的至少一部分，則該基因組DNA的位點在所述基因內。在一些實施方式中，基因組DNA的位於基因附近的位點可以在所述基因的5’或3’端（例如，所述基因的編碼區的5’或3’端）。在一些實施方式中，基因組DNA的位於基因附近的位點可為調控所述基因之表現的啟動子區或阻遏子區。在一些實施方式中，基因組DNA的位於基因附近的位點可以與所述基因在同一染色體上。在一些實施方式中，如果基因組DNA的位點或區域在基因的5’或3’端（例如，所述基因的編碼區的5’或3’端）的50 Kb、40 Kb、30 Kb、20 Kb、10 Kb、5 Kb、1 Kb內或更接近，則該基因組DNA的位點或區域在所述基因附近。
如本文所用，術語「致耐受性因子」通常係指這樣的蛋白（例如，由如本文所述之多核苷酸表現），該蛋白當在細胞中增加或減少時使得細胞（例如，工程化細胞）在移植或植入宿主受試者中後能夠以相對於未經修飾的細胞更高的比率抑制或逃避免疫排斥。在一些實施方式中，致耐受性因子係人致耐受性因子。在一些實施方式中，至少一種致耐受性因子的遺傳修飾（例如，至少一種致耐受性因子的插入或缺失）使得細胞（例如，工程化細胞）在植入後能夠以未經修飾的細胞的至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的比率抑制或逃避免疫排斥。在一些實施方式中，致耐受性因子係HLA-E（NCBI基因ID號：3133）、HLA-G（NCBI基因ID號：3135）、CTLA-4（NCBI基因ID號：1493）、CD47（NCBI基因ID號：961）或PD-L1（NCBI基因ID號：29126）。在一些實施方式中，將致耐受性因子插入細胞，例如工程化細胞中。在一些實施方式中，使致耐受性因子從細胞，例如工程化細胞中缺失。在一些實施方式中，編碼HLA-E、HLA-G、CTLA-4、CD47和/或PD-L1之多核苷酸的插入使得細胞（例如工程化細胞）能夠在移植或移入宿主受試者後抑制或逃避免疫排斥。
如本文所用，術語「包含（comprising）」或「包含（comprises）」係包括性的或開放式的，並且不排除另外的、未列舉的要素、成分或方法步驟；短語「由......組成（consisting of）」或「由......組成（consists of）」係封閉式的並且排除未指定的任何要素、步驟或成分；並且短語「基本上由......組成（consisting essentially of）」或「基本上由......組成（consists essentially）」意指可存在特定的其他組成部分，即不實質性影響化合物、組成物或方法的基本特徵的那些。當在序列的上下文中使用時，短語「基本上由......組成（consisting essentially of）」或「基本上由......組成（consists essentially）」意指該序列可以包含不改變該序列的基本功能或特性的取代和/或另外的序列。 基因編輯
本文描述了使經遺傳修飾的細胞能夠逃避免疫反應和/或增加它們在移植入受試者後的存活或活力的策略。在一些實施方式中，該等策略使得經基因編輯的細胞能夠以與未修飾的細胞相比更高的成功率逃避免疫反應和/或存活。
在某些實施方式中，本文所述之任何細胞使用本文所述之任何基因編輯方法（例如，使用CRISPR/Cas基因編輯以插入或缺失一或多個核苷酸）進行基因編輯。在一些實施方式中，破壞的基因係不編碼功能蛋白的基因。在一些實施方式中，包含破壞的基因的細胞不表現（例如，不在細胞表面表現）由該基因編碼的可檢測水平（例如，藉由抗體，例如，藉由流動式細胞分析術）的蛋白。不表現可檢測水平的蛋白的細胞可以被稱為敲除細胞。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞編碼MHC-I或MHC-II人白血球抗原、MHC-I或MHC-II複合體的組分、或MHC-I或MHC-II複合體的轉錄調控子的一或多種基因。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞編碼MHC-I或MHC-II人白血球抗原的一或多種基因。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞編碼MHC-I或MHC-II複合體的一或多種組分的一或多種基因。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞編碼MHC-I或MHC-II複合體的一或多種轉錄調控子的一或多種基因。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞一或多種基因，該等基因包括但不限於： B2M、 CIITA、 ADAM17、 CISH、 REGNASE1、 FAS、 TIGIT、 PD-1、 NKG2A、 CD70和/或I型活化素受體 ALK4（例如，條件性地）。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 B2M、 CIITA 、 CISH 、 FAS和/或 ADAM17。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 B2M。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 CIITA。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 ADAM17。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 CISH。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 REGNASE1。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 FAS。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 TIGIT。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 PD-1。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 NKG2A。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞 CD70。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以破壞I型活化素受體ALK4（例如，條件性地）。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼（但不限於）以下中的一者或多者的多核苷酸：致耐受性因子、IL15、IL15Rα、IL15/IL15Rα、HLA-E、CAR和SERPINB9。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼IL15的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼IL15Rα的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼致耐受性因子諸如HLA-E的多核苷酸（例如，其中該HLA-E係三聚體，其包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽）。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼CAR的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼CAR-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼CD16（例如，高親和力不可切割的CD16）的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞不被基因編輯成插入編碼CD16的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞不被基因編輯成插入編碼高親和力不可切割CD16的多核苷酸。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼（但不限於）以下中的一者或多者的多核苷酸：IL15、IL15Rα、IL15/IL15Rα、HLA-E和CD16（例如，高親和力不可切割的CD16），其中該細胞具有破壞的B2M表現（例如，該細胞經基因編輯以破壞 B2M，從而導致例如 B2M表現的消除）。在一些實施方式中，編碼IL15/IL15Rα和HLA-E（例如，包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽的HLA-E三聚體，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽）的多核苷酸，或編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體的多核苷酸插入 B2M基因座中（例如，在 B2M基因座的外顯子1中）。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入本文所述之任何多核苷酸，其中該細胞具有破壞的CIITA表現（例如，該細胞經基因編輯以破壞 CIITA，從而導致例如 CIITA表現的消除）。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以將本文所述之任何多核苷酸插入破壞的 CIITA基因座中（例如，在 CIITA基因座的外顯子2中）。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼一或多種嵌合抗原受體（CAR）的多核苷酸。在一些實施方式中，且非限制性地，CAR係BCMA（即，B細胞成熟抗原）CAR、CD30 CAR、CD19 CAR、CD33 CAR、NKG2D（即，自然殺手組2D受體）CAR（或包含NKG2D胞外結構域的CAR或受體），CD70 CAR、NKp30（即，自然殺手蛋白30）CAR、CD73 CAR、GPR87（即，G蛋白偶合受體87）CAR或SLC7A11（即，溶質載體家族7成員11，其也稱為xCT）CAR。在一些實施方式中，CAR係BCMA CAR。在一些實施方式中，編碼CAR的多核苷酸包含或具有SEQ ID NO: 70的序列。在一些實施方式中，CAR係CD33 CAR。在一些實施方式中，CAR係CD19 CAR。在一些實施方式中，CAR係CD33 CAR。在一些實施方式中，CAR係NKG2D CAR（或包含NKG2D胞外結構域的CAR或受體）。在一些實施方式中，CAR係CD70 CAR。在一些實施方式中，CAR係NKp30 CAR。在一些實施方式中，CAR係CD73 CAR。在一些實施方式中，CAR係GPR87 CAR。在一些實施方式中，CAR係SLC7A11 (xCT) CAR。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼CAR的多核苷酸，其中該細胞具有破壞的CIITA表現（例如，該細胞經基因編輯以破壞 CIITA，從而導致例如 CIITA表現的消除）。在一些實施方式中，將編碼CAR的多核苷酸插入破壞的 CIITA基因中。在一些實施方式中，將編碼CAR的多核苷酸插入 CIITA基因座的外顯子2中。在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼CAR-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸，其中該細胞具有破壞的CIITA表現（例如，該細胞經基因編輯以破壞 CIITA，從而導致例如 CIITA表現的消除）。在一些實施方式中，將編碼CAR-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸插入破壞的 CIITA基因中。在一些實施方式中，將編碼CAR-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸插入 CIITA基因座的外顯子2中。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經基因編輯以插入編碼CAR的多核苷酸，其中該細胞具有破壞的 B2M表現（例如，該細胞經基因編輯以破壞B2M，從而導致例如 B2M表現的消除）。在一些實施方式中，將CAR插入破壞的 B2M基因座中（例如，在 B2M基因座的外顯子1中）。
在一些實施方式中，本文所述之細胞經編輯以破壞 (i) 編碼MHC-I或MHC-II人白血球抗原、MHC-I或MHC-II複合體的組分、或MHC-I或MHC-II複合體的轉錄調控子的一或多種基因，和 (ii) ADAM17。在一些實施方式中，此類細胞經進一步基因編輯以插入編碼一或多種嵌合抗原受體（CAR）的多核苷酸，諸如本文所述之任何CAR（例如BCMA CAR）。在一些實施方式中，此類細胞係低免疫性的。在一些實施方式中，此類細胞經進一步基因編輯以破壞本文所述之一或多種基因，例如 CIITA。在一些實施方式中，此類細胞經進一步基因編輯以插入本文所述之任何多核苷酸，例如，編碼IL15、IL15Rα、IL15/IL15Rα、HLA-E（例如，包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽的HLA-E三聚體，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽）的多核苷酸或編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體的多核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了生成基因組工程化幹細胞（例如，iPSC）之方法，其中該等幹細胞在基因組中的一或多個所選擇的位點處包含至少一種靶向基因組修飾，該方法包括藉由以下方式來遺傳工程化如本文所述之細胞類型：向所述細胞中引入一或多種構建體以實現在所選擇的位點處的靶向修飾；使用能夠識別所選擇的位點的一或多種內切核酸酶向所述細胞中引入在該等所選擇的位點處的一或多個雙鏈斷裂；以及培養該等經編輯的細胞以允許內源DNA修復在該等所選擇的位點處產生靶向插入或缺失；從而獲得基因組修飾幹細胞。在一些實施方式中，工程化的細胞（即，起始細胞）係幹細胞（例如，胚胎幹細胞（ESC）、成體幹細胞（ASC）、誘導多能幹細胞（iPSC）、或造血幹細胞或先驅細胞（HSPC））。藉由該方法生成或可獲得的幹細胞（例如iPSC）將包含至少一種功能性靶向基因組修飾，並且其中該等基因組修飾的細胞然後能夠分化成先驅細胞或完全分化細胞（例如自然殺手（NK）細胞）。在一些實施方式中，分化的細胞（例如NK細胞）保持它們所來源的細胞的所有基因編輯。
在一些實施方式中，將核糖核蛋白顆粒（RNP）遞送至本文所述之任何細胞（例如，iPSC），該核糖核蛋白顆粒包含RNA引導的核酸酶（例如，Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶）和靶向待破壞的基因的gRNA。RNP係與gRNA預複合/複合的RNA引導的核酸酶（例如Cas9）。在其他實施方式中，將RNA引導的核酸酶和gRNA分開遞送至細胞。在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的由破壞的基因編碼的蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞不表現可檢測水平的破壞的基因產物。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞表現可檢測水平的由插入多核苷酸編碼的蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞表現可檢測水平的由插入多核苷酸編碼的蛋白。 MHC I 和 MHC II 編輯
主要組織相容性複合體I和II（分別為MHC I和MHC II）係在適應性免疫系統中起重要作用的細胞表面蛋白。編碼主要組織相容性複合體（MHC）的基因位於人類染色體6p21上。由MHC基因編碼的所得蛋白係一系列表面蛋白，該等表面蛋白在細胞移植過程中對供體相容性至關重要。MHC基因分為MHC I類（MHC-I）和MHC II類（MHC-II）。MHC-I基因（HLA-A、HLA-B和HLA-C）在幾乎所有組織細胞類型中均表現，向CD8 +T細胞呈遞「非自身」抗原處理的肽，從而促進其活化為溶細胞性CD8 +T細胞。表現「非自身」MHC-I分子的移植或植入細胞將引起針對該等細胞的穩健的細胞免疫反應，最終藉由活化的溶細胞性CD8 +T細胞導致該等細胞的死亡。MHC-I蛋白與內質網中的β-2-微球蛋白（B2M）密切相關，該β-2-微球蛋白對於在細胞表面形成功能性MHC-I分子至關重要。另外，存在具有免疫調控功能的三種非典型MHC-II分子（HLA-E、HLA-F和HLA-G）。MHC-II生物分子包括HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。由於它們在免疫反應中的主要功能，MHC-I和MHC-II生物分子有助於在非宿主細胞之細胞植入（例如，用於再生醫學目的的細胞植入）後的免疫排斥。
在一些實施方式中，細胞包含一或多個MHC-I或MHC-II基因的基因組修飾。在一些實施方式中，細胞包含調控MHC-I和/或MHC-II之表現的一或多個多核苷酸序列的基因組修飾。在一些實施方式中，本揭露之遺傳修飾使用任何基因編輯方法（包括但不限於本文所述之那些方法）來進行。
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞具有MHC I和/或MHC II基因修飾。在一些實施方式中，MHC I被破壞。在一些實施方式中，MHC II被破壞。在一些實施方式中，MHC I和MHC II都被破壞。在一些實施方式中，插入MHC I編碼基因。在一些實施方式中，插入MHC II編碼基因。在一些實施方式中，本文所述之任何遺傳修飾的細胞包含在至少一種基因內或附近的相對於未經修飾的細胞減少一或多種MHC-I和MHC-II人白血球抗原之表現的至少一種遺傳修飾的引入；相對於未經修飾的細胞增加編碼致耐受性因子的至少一種多核苷酸之表現的至少一種遺傳修飾。在一些實施方式中，經遺傳修飾的細胞包含在至少一種基因內或附近的相對於未經修飾的細胞減少一或多種MHC-I和MHC-II人白血球抗原之表現的至少一種遺傳修飾的引入；相對於未經修飾的細胞增加編碼致耐受性因子的至少一種多核苷酸之表現的至少一種遺傳修飾。在其他實施方式中，經遺傳修飾的細胞包含在至少一種基因內或附近的相對於未經修飾的細胞改變一或多種MHC-I和MHC-II人白血球抗原之表現的至少一個缺失或插入-缺失突變；以及在與改變一或多種MHC-I和MHC-II HLA之表現的基因缺失的位點部分重疊、完全重疊或包含在該位點內的位點處的編碼至少一種致耐受性因子之多核苷酸的至少一個插入。
在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞減少一或多種MHC-I和MHC-II人白血球抗原之表現係藉由在MHC-I和/或MHC-II基因中直接靶向例如進行至少一個鹼基對的遺傳缺失和/或插入來實現的。在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞減少一或多種MHC-I和MHC-II人白血球抗原之表現係藉由靶向 CIITA基因例如進行遺傳缺失來實現的。在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞減少一或多種MHC-I和MHC-II人白血球抗原之表現係藉由靶向MHC-I或MHC-II的至少一種轉錄調控因子例如進行遺傳缺失來實現的。在一些實施方式中，MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子係 NLRC5或 CIITA基因。在一些實施方式中，MHC-I或MHC-II的轉錄調控子係 RFX5、 RFXAP 、 RFXANK 、 NFY-A 、 NFY-B 、 NFY-C 、 IRF-1和/或 TAP1基因。
在一些實施方式中，細胞的基因組已經過修飾以缺失 HLA-A 、 HLA-B和/或 HLA-C基因之全部或一部分。在一些實施方式中，細胞的基因組已經過修飾以缺失 HLA-A 、 HLA-B和/或 HLA-C基因的啟動子區域之全部或一部分。在一些實施方式中，細胞的基因組已經修飾為缺失編碼MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子的基因之全部或一部分。在一些實施方式中，細胞的基因組已經修飾為缺失編碼MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子的基因的啟動子區之全部或一部分。
MHC-I細胞表面分子由MHC編碼的重鏈（HLA-A、HLA-B或HLA-C）和不變亞基β-2-微球蛋白（B2M）構成。因此，細胞內B2M濃度的降低實現了降低MHC-I細胞表面分子的細胞表面表現之有效方法。在一些實施方式中，可以將致耐受性因子插入或重新插入經遺傳修飾的細胞中以產生免疫赦免的iPSC或NK細胞。在一些實施方式中，本文揭露的iPSC或NK細胞已經過進一步修飾以表現一或多種致耐受性因子。示例性致耐受性因子包括但不限於HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、CI-抑制劑和IL-35中的一或多種。在一些實施方式中，編碼至少一種致耐受性因子的至少一種多核苷酸的遺傳修飾（例如，插入）使得經基因編輯的iPSC或NK細胞在植入後能夠以未經修飾的細胞的至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍的比率抑制或逃避免疫排斥。在一些實施方式中，編碼HLA-E、HLA-G、CTLA-4、CD47和/或PD-L1之多核苷酸的插入使得iPSC或NK細胞在移植或植入宿主受試者中後能夠抑制或逃避免疫排斥。
編碼致耐受性因子的多核苷酸通常包含位於編碼致耐受性因子之序列側翼的左同源臂和右同源臂。同源臂與所靶向插入位點處或附近的基因組DNA具有顯著的序列同源性。例如，左同源臂可為與位於靶位點或切割位點的左側或上游的區域同源的核苷酸序列，並且右同源臂可為與位於靶位點或切割位點的右側或下游的區域同源的核苷酸序列。每個同源臂的近側端可以與鄰接切割位點的基因組DNA序列同源。替代性地，每個同源臂的近側端可以與定位成遠離切割位點多達約10、20、30、40、50、60或70個核鹼基的基因組DNA序列同源。這樣，可以將編碼致耐受性因子的多核苷酸在切割位點的約10、20、30、40、50、60或70個鹼基對內插入所靶向基因座中，並且可以缺失鄰接切割位點（並且與同源臂沒有同源性）的另外的基因組DNA。同源臂的長度範圍可為從約50個核苷酸至數千個核苷酸。在一些實施方式中，同源臂之長度範圍可為從約500個核苷酸至約1000個核苷酸。在一些實施方式中，同源臂係600 bp、700 bp、800 bp或900 bp。在一些實施方式中，同源臂係800 bp。在一些實施方式中，同源臂與基因組DNA之間的顯著的序列同源性係至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%。在一些實施方式中，同源臂與位於靶點側翼的基因組DNA具有100%的序列同一性。
在一些實施方式中，編碼至少一種致耐受性因子的至少一種多核苷酸可操作地連接至外源啟動子。在一些實施方式中，外源啟動子可為組成型啟動子、誘導型啟動子、時間特異性啟動子、組織特異性啟動子或細胞類型特異性啟動子。在一些實施方式中，外源啟動子係CAGGS、CMV、EFla、PGK、CAG或UBC啟動子。
在一些實施方式中，將編碼至少一種致耐受性因子的該至少一種多核苷酸插入安全港基因座（例如，AAVS 1基因座）中。在一些實施方式中，用於插入本文所述之任何基因的安全港基因座選自但不限於AAVS1 (PPP1 R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX (F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF和TTR。
在一些實施方式中，將編碼至少一種致耐受性因子的該至少一種多核苷酸插入基因組DNA的以下位點或區域中，該位點或區域與MHC-I基因、MHC-II基因或者MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子部分重疊、完全重疊或包含在MHC-I基因、MHC-II基因或者MHC-I或MHC-II的轉錄調控因子內（即，在其內或附近）。
在一些實施方式中，細胞的基因組已經修飾為減少NLR家族含CARD結構域5（NLRC5）之表現。NLRC5係MHC-I介導的免疫反應的關鍵調控因子，並且與CIITA相似，NLRC5可被IFN-γ高度誘導並且可以易位進入細胞核中。NLRC5活化MHC-I基因的啟動子並誘導MHC-I以及參與MHC-I抗原呈遞的相關基因的轉錄。
在一些實施方式中，將沒有MHC-II表現和具有MHC-I的中等表現的細胞遺傳修飾為沒有MHC-I或MHC-II的表面表現。在另一個實施方式中，沒有MHC-I/II表面表現的細胞經進一步編輯以具有計畫性死亡配位基-1（PD-L1）之表現，例如插入編碼PD-L1的多核苷酸。在另一個實施方式中，將沒有MHC-I/II的表面表現的細胞進一步編輯為具有PD-L1表現，例如插入編碼PD-L1的多核苷酸。
在一些實施方式中，該等細胞進一步包含不一定與植入後免疫逃避或細胞存活有牽連的一或多種另外的基因的增加或減少之表現（例如，藉由遺傳修飾）。在一些實施方式中，相對於未經修飾的細胞，該等細胞進一步包含一或多種安全開關蛋白的增加之表現。在一些實施方式中，該等細胞包含編碼安全開關蛋白的一或多種另外的基因的增加之表現。在一些實施方式中，安全開關亦為自殺基因。在一些實施方式中，安全開關係單純皰疹病毒-1胸苷激酶（HSV-tk）或誘導型半胱天冬酶-9。在一些實施方式中，將編碼至少一種安全開關的多核苷酸插入基因組中，例如插入安全港基因座中。在一些其他實施方式中，經遺傳修飾的該一或多種另外的基因編碼以下一或多種：安全開關蛋白；靶向模式；受體；傳訊分子；轉錄因子；藥物活性蛋白或肽；藥物靶標候選物；以及與構建體整合的促進其植入、運輸、歸巢、活力、自我更新、持久性和/或存活的蛋白。 B2M 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組經修飾以破壞β-2-微球蛋白（ B2M或 β2M）基因（NCBI基因ID：567）。 B2M係編碼所有多態性MHC I類重鏈表面表現所需的共同蛋白亞基的非多態性基因。HLA-I蛋白與內質網中的B2M密切相關，該B2M對於形成功能性細胞表面表現的HLA-I分子至關重要。藉由基因編輯破壞其表現將阻止宿主抗治療性細胞響應，從而導致治療性細胞持久性增加。在一些實施方式中，消除內源 B2M基因之表現以防止移植物抗宿主響應。在一些實施方式中，破壞的 B2M可防止由MHC-I引起的同種免疫反應。
在一些實施方式中，本文所述之任何基因編輯方法用於破壞 B2M基因。在一些實施方式中，本文所述之任何工程化細胞包含破壞的 B2M基因。在一些實施方式中，本文所述之iPSC包含破壞的 B2M基因。在一些實施方式中，本文所述之NK細胞包含破壞的 B2M基因。
在一些實施方式中，將核糖核蛋白顆粒（RNP）遞送至本文所述之任何細胞（例如iPSC），該核糖核蛋白顆粒包含RNA引導的核酸酶（例如，Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶）和靶向 B2M基因（或任何其他目的基因）的gRNA。核糖核蛋白顆粒（RNP）係與gRNA預複合/複合的RNA引導的核酸酶（例如Cas9）。在其他實施方式中，將RNA引導的核酸酶和gRNA分開遞送至細胞。在一些實施方式中，gRNA靶向 B2M基因中的位點。可以如本文所提供用於在 B2M基因中產生基因組破壞的經修飾的和未經修飾的 B2MgRNA序列之非限制性實例包括對應於SEQ ID NO: 34、78和79之序列的序列。在一些實施方式中，使用gRNA靶向 B2M位點以用於基因編輯。可以使用位於第15號染色體上的 B2M基因序列（GRCh38座標：染色體15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710）設計其他gRNA序列。在一些實施方式中，本文所述之任何B2M RNP與含有B2M同源臂的供體質體結合使用，以用於插入本文所述之任何多核苷酸。
在一些實施方式中，gRNA包含對應於SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 78和SEQ ID NO: 79中任一個之序列的多核苷酸序列。在一些實施方式中，gRNA/CRISPR核酸酶複合體靶向並切割 B2M基因座中的靶位點。在一些實施方式中， B2MgRNA靶向包含SEQ ID NO: 34、78或79的序列。藉由NHEJ修復雙鏈斷裂可能導致至少一個核苷酸的缺失和/或至少一個核苷酸的插入，從而破壞或消除 B2M之表現。在一些實施方式中， B2M基因座被至少兩個CRISPR系統靶向，該等CRISPR系統各自包含不同的gRNA，使得在 B2M基因座中的兩個位點處的切割導致兩個切口之間之序列的缺失，由此消除B2M之表現。
在一些實施方式中，同源臂與 B2M嚮導（例如，包含SEQ ID NO: 34的核苷酸序列的gRNA）一起使用。在一些實施方式中，同源臂被設計成與將消除 B2M基因的起始位點的任何 B2M嚮導一起使用。在一些實施方式中， B2M同源臂包含具有SEQ ID NO: 36和54之序列的多核苷酸，或與SEQ ID NO: 36或54具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的多核苷酸，或基本上由組成。在一些實施方式中，左B2M同源臂可以包含SEQ ID NO: 36或與SEQ ID NO: 36的多核苷酸序列具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其組成。在一些實施方式中，右B2M同源臂可以包含SEQ ID NO: 54或與SEQ ID NO: 54的多核苷酸序列具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其組成。
在一些實施方式中，靶向 B2M基因組區域的gRNA在 B2M基因中產生插缺，從而破壞mRNA或蛋白之表現。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的 B2M表面蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞可以不表現可檢測水平的 B2M表面蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞不表現可檢測水平的 B2M表面蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞表現可檢測水平的 B2M表面蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞表現可檢測水平的 B2M表面蛋白。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞表現可檢測水平的 B2M表面蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞表現可檢測水平的 B2M表面蛋白。 CIITA 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組經修飾以破壞 II 類主要組織相容性複合體反式啟動子（ CIITA）基因（NCBI基因ID：4261）。CIITA係LR或核苷酸結合結構域（NBD）富含白胺酸重複序列（LRR）蛋白家族的成員，並藉由與MHC增強體締合來調控MHC-II的轉錄。CIITA之表現在B細胞和樹突細胞中根據發育階段而誘導，並且在大多數細胞類型中可被IFN-γ誘導。在一些實施方式中，破壞的 CIITA基因座可以防止由於MHC-II引起的同種免疫反應。
在一些實施方式中，本文所述之任何基因編輯方法用於破壞 CIITA基因。在一些實施方式中，本文所述之任何工程化細胞包含破壞的 CIITA基因。在一些實施方式中，本文所述之iPSC包含破壞的 CIITA基因。在一些實施方式中，本文所述之NK細胞包含破壞的 CIITA基因。
在一些實施方式中，將核糖核蛋白顆粒（RNP）遞送至本文所述之任何細胞（例如iPSC），該核糖核蛋白顆粒包含RNA引導的核酸酶（例如，Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶）和靶向 CIITA基因（或任何其他目的基因）的gRNA。核糖核蛋白顆粒（RNP）係與gRNA預複合/複合的RNA引導的核酸酶（例如Cas9）。在其他實施方式中，將RNA引導的核酸酶和gRNA分開遞送至細胞。可以如本文所提供用於在 CIITA基因中產生基因組破壞的經修飾的和未經修飾的 CIITAgRNA序列之非限制性實例列於 表 15中（例如，SEQ ID NO: 13-17的相應序列）。在一些實施方式中，gRNA靶向 CIITA基因內的位點。在一些實施方式中， CIITAgRNA靶向包含SEQ ID NO: 13-17的序列。在一些實施方式中，gRNA包含對應於SEQ ID NO: 13之序列的多核苷酸序列。在一些實施方式中，本文所述之任何 CIITARNP與含有 CIITA同源臂的供體質體結合使用，以用於插入本文所述之任何多核苷酸。
在一些實施方式中，靶向 CIITA基因組區域的gRNA在 CIITA基因中產生插缺，從而破壞mRNA或蛋白之表現。在一些實施方式中，gRNA/CRISPR核酸酶複合體靶向並切割 CIITA基因座中的靶位點。藉由NHEJ修復雙鏈斷裂可能導致至少一個核苷酸的缺失和/或至少一個核苷酸的插入，從而破壞或消除 CIITA之表現。在一些實施方式中， CIITA基因座被至少兩個CRISPR系統靶向，該等CRISPR系統各自包含不同的gRNA，使得在 CIITA基因座中的兩個位點處的切割導致兩個切口之間之序列的缺失，由此消除 CIITA之表現。
在一些實施方式中，同源臂與 CIITA嚮導（例如，包含對應於SEQ ID NO: 13-17中任一個之序列的核苷酸序列的gRNA）一起使用。在一些實施方式中，同源臂被設計成與將消除 CIITA基因的起始位點的任何 CIITA嚮導一起使用。在一些實施方式中， CIITA同源臂包含SEQ ID NO: 22和32的多核苷酸，或與SEQ ID NO: 22或32具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由組成。在一些實施方式中，左 CIITA同源臂可以包含SEQ ID NO: 22，或與SEQ ID NO: 22的多核苷酸序列具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其組成。在一些實施方式中，右 CIITA同源臂可以包含SEQ ID NO: 32，或與SEQ ID NO: 32的多核苷酸序列具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的多核苷酸序列，或基本上由其組成。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的 CIITA表面蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞可以不表現可檢測水平的 CIITA表面蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞不表現可檢測水平的CIITA蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞表現可檢測水平的CIITA表面蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞表現可檢測水平的CIITA表面蛋白。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞表現可檢測水平的CIITA表面蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞表現可檢測水平的CIITA蛋白。
在一些實施方式中，將本文所述之任何多核苷酸插入 CIITA基因座中，使得在同源定向修復後去除 CIITA外顯子2的86個鹼基對（bp）。 HLA-E 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組包含編碼人白血球抗原E（HLA-E；也稱為I類主要組織相容性複合體E）之多核苷酸的插入。HLA-E由 HLA-E基因（NCBI基因ID：3133）編碼。HLA-E係I類異二聚體分子。HLA-E主要用作NK細胞抑制性受體KLRD1-KLRC1的配位基。HLA-E使得NK細胞能夠監測其他MHC I類分子之表現並耐受自身表現。在一些實施方式中，HLA-E的插入可以使iNK避免PB-NK「缺失自身」響應。在一些實施方式中，細胞中HLA-E之表現增加。在一些實施方式中，iPSC包含編碼HLA-E（或 HLA-E敲入）的插入多核苷酸。在一些實施方式中，NK細胞包含編碼HLA-E（或 HLA-E敲入）的插入多核苷酸。在一些實施方式中，HLA-E係HLA-E三聚體。
可以如本文所提供用於產生 HLA-E基因的基因組敲入的經修飾和未經修飾的 HLA-EcDNA序列之非限制性實例包括SEQ ID NO: 51（即HLA-E CDS）和SEQ ID NO: 75（例如由SEQ ID NO: 46-51組成的HLA-E三聚體）。在一些實施方式中，HLA-E三聚體多核苷酸與SEQ ID NO: 75具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一些實施方式中，HLA三聚體具有SEQ ID NO: 142的胺基酸序列。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞表現可檢測水平的HLA-E表面蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞表現可檢測水平的HLA-E表面蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞表現可檢測水平的HLA-E表面蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞不表現可檢測水平的HLA-E表面蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞不表現可檢測水平的HLA-E表面蛋白。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞不表現可檢測水平的HLA-E表面蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞不表現可檢測水平的HLA-E表面蛋白。
在一些實施方式中，將本文所述之任何 HLA-E多核苷酸插入本文所述之任何安全港基因座中。在一些實施方式中，將本文所述之任何 HLA-E多核苷酸插入本文所述之任何 B2M基因座中。在一些實施方式中，將本文所述之任何HLA-E多核苷酸插入本文所述之任何 CIITA基因座中。在一些實施方式中， HLA-E多核苷酸係HLA-E三聚體，該HLA-E三聚體由與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽構成，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而沒有其訊息肽。在一些實施方式中， HLA-E三聚體包含SEQ ID NO: 75或基本上由其組成。在一些實施方式中， HLA-E多核苷酸與SEQ ID NO: 75具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一些實施方式中，三聚體設計如Gornalusse等人 (2017) Nat. Biotechnol. [自然•生物技術] 35 (8): 765-772所述，該文獻整體併入本文中。 IL15 和 IL15Rα 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組包含編碼介白素-15（IL15）、IL15Rα和/或IL15與IL15Rα之融合蛋白（「IL15/IL15Rα」）之多核苷酸的插入。IL15係在調控NK細胞增殖和活化中起作用的細胞介素，並且由 IL15基因（MCBI基因ID：3600）編碼。IL15Rα（也稱為IR15α）係結合IL15的受體，並由 IL15Rα基因（MCBI基因ID：16169）編碼。在一些實施方式中，插入編碼IL15、IL15Rα和/或IL15與IL15Rα之融合蛋白的多核苷酸可導致工程化細胞的iNK持久性增加。
在一些實施方式中，細胞具有編碼IL15之多核苷酸的插入，並且該多核苷酸包含SEQ ID NO: 41或由其組成。在一些實施方式中，細胞具有編碼IL15Rα之多核苷酸的插入，並且該多核苷酸包含SEQ ID NO: 43或由其組成。在一些實施方式中，細胞具有編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白（「IL15/IL15Rα」）之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，融合序列如Hurton等人 (2016) Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊]; 113 (48): E7788-E7797. doi: 10.1073/pnas.1610544113等人所述，該文獻整體併入本文中。在一些實施方式中，編碼IL15/IL15Rα的多核苷酸包含SEQ ID NO: 76（其由SEQ ID NO: 40-44組成）或由其組成。在一些實施方式中， IL15/IL15R α多核苷酸與SEQ ID NO: 76具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一些實施方式中，IL15/IL15Rα融合體具有SEQ ID NO: 143的胺基酸序列。
在一些實施方式中，IL15和IL15Rα共表現。在一些實施方式中，自切割肽用於共表現IL15和IL15Rα。在一些實施方式中，自切割肽選自但不限於P2A（源自豬捷申病毒-1 2A）、E2A（源自馬甲型鼻炎病毒）、F2A（源自口蹄疫病毒18）和T2A（源自東亞細亞病毒2A）。在一些實施方式中，自切割肽源自P2A。在一些實施方式中，細胞具有編碼IL15、P2A、IL15R α（IL15-P2A-IL15R α）之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，iPSC包含 IL15-P2A-IL15R α多核苷酸的敲入。在一些實施方式中，NK細胞包含 IL15-P2A-IL15R α多核苷酸的敲入。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞表現可檢測水平的本文所述之任何IL15、IL15R α和/或IL15/IL15Rα。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞表現可檢測水平的IL15、IL15R α和/或IL15/IL15Rα。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞表現可檢測水平的IL15、IL15R α和/或IL15/IL15Rα。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞不表現可檢測水平的IL15、IL15R α和/或IL15/IL15Rα。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞不表現可檢測水平的IL15、IL15R α和/或IL15/IL15Rα。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞不表現可檢測水平的IL15、IL15R α和/或IL15/IL15Rα。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞不表現可檢測水平的IL15、IL15Rα和/或IL15/IL15Rα。
在一些實施方式中，將本文所述之任何IL15、IL15Rα和/或IL15/IL15Rα多核苷酸插入本文所述之任何安全港基因座中。在一些實施方式中，將本文所述之任何IL15、IL15Rα和/或IL15/IL15Rα多核苷酸插入本文所述之任何 B2M基因座中。 SERPINB9 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組包含編碼SERPINB9之多核苷酸的插入。由 SERPINB9基因（NCBI基因ID：5272）編碼的SERPINB9係主要藉由靶向中間蛋白酶（例如，以1 : 1的複合體共價結合蛋白酶，從而抑制蛋白酶）起作用的凋亡抑制劑大家族的成員。因此，SERPINB9之表現可以增加工程化細胞的存活。例如，經工程化以表現SERPINB9的iNK細胞可以藉由抑制所釋放的顆粒酶的活性而在NK細胞攻擊中存活。在一些實施方式中，SERPINB9之表現在細胞中增加。在一些實施方式中，iPSC包含編碼SERPINB9（或 SERPINB9敲入）之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，NK細胞包含編碼SERPINB9（或 SERPINB9敲入）之多核苷酸的插入。
可以如本文所提供用於產生 SERPINB9基因的基因組敲入的 SERPINB9cDNA序列的實例係SEQ ID NO: 129。在一些實施方式中， SERPINB9多核苷酸與SEQ ID NO: 129具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一些實施方式中，SERPINB9蛋白具有SEQ ID NO: 144的胺基酸序列。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞表現可檢測水平的SERPINB9蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞表現可檢測水平的SERPINB9蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞表現可檢測水平的SERPINB9蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞不表現可檢測水平的SERPINB9。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞不表現可檢測水平的SERPINB9。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞不表現可檢測水平的SERPINB9。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞不表現可檢測水平的SERPINB9。
在一些實施方式中，將本文所述之任何SERPINB9多核苷酸插入本文所述之任何安全港基因座中。在一些實施方式中，將本文所述之任何SERPINB9多核苷酸插入本文所述之任何 B2M基因座中。 ADAM17 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組經修飾以破壞去整合素和金屬蛋白酶結構域17（ ADAM17）基因（NCBI基因ID：6868）。ADAM17切割TNF-α先質。ADAM17負責幾種表面蛋白的蛋白水解切割。在一些實施方式中，破壞的 ADAM17可藉由防止CD16切割來增加ADCC殺傷。
在一些實施方式中，本文所述之任何基因編輯方法用於破壞 ADAM17基因。在一些實施方式中，iPSC包含破壞的 ADAM17基因。在一些實施方式中，NK細胞包含破壞的 ADAM17基因。
在一些實施方式中，將核糖核蛋白顆粒（RNP）遞送至本文所述之任何細胞（例如iPSC），該核糖核蛋白顆粒包含RNA引導的核酸酶（例如，Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶）和靶向 ADAM17基因（或任何其他目的基因）的gRNA。核糖核蛋白顆粒（RNP）係與gRNA預複合/複合的RNA引導的核酸酶（例如Cas9）。在其他實施方式中，將RNA引導的核酸酶和gRNA分開遞送至細胞。
可以如本文所提供用於在 ADAM17基因中產生基因組破壞的經修飾的和未經修飾的 ADAM17gRNA序列之非限制性實例包括對應於SEQ ID NO: 1-10之序列的序列。在一些實施方式中， ADAM17gRNA靶向包含SEQ ID NO: 1-10中任一個之序列。
在一些實施方式中，靶向ADAM17基因組區域的gRNA在 ADAM17基因中產生插缺，從而破壞mRNA或蛋白之表現。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的ADAM17蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞可以不表現可檢測水平的ADAM17表面蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞不表現可檢測水平的ADAM17蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞表現可檢測水平的ADAM17蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞表現可檢測水平的ADAM17蛋白。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞表現可檢測水平的ADAM17蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞表現可檢測水平的ADAM17蛋白。 CISH 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組經修飾以破壞細胞介素誘導型含SH2蛋白（ CISH，也稱為 CIS）基因（NCBI基因ID：1154）。CISH係控制HLA II類基因表現的轉錄輔活化因子。在一些實施方式中，破壞的 CISH可增加iNK對細胞介素的敏感性、改善iNK持久性和/或增加腫瘤殺傷。在一些實施方式中，iPSC包含破壞的 CISH基因。在一些實施方式中，NK細胞包含破壞的 CISH基因。
在一些實施方式中，靶向CISH基因組區域的gRNA在 CISH基因中產生插缺，從而破壞mRNA或蛋白之表現。在一些實施方式中，gRNA靶向 CISH基因內的位點。在一些實施方式中， CISHgRNA靶向包含SEQ ID NO: 81-92的序列。在一些實施方式中，靶向 CISH基因的gRNA包含對應於包含SEQ ID NO: 81-92中的任一個之序列的間隔子序列。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的CISH蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞可以不表現可檢測水平的CISH表面蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞不表現可檢測水平的CISH蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞表現可檢測水平的CISH蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞表現可檢測水平的CISH蛋白。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞表現可檢測水平的CISH表面蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞表現可檢測水平的CISH蛋白。 REGNASE-1 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組經修飾以破壞編碼鋅指CCCH-型含12A的 REGNASE-1基因（NCBI基因ID：80149）。REGNASE-1係參與mRNA衰變的內切核糖核酸酶。在一些實施方式中，破壞的REGNASE-1可以增加iNK持久性和/或增加腫瘤殺傷。在一些實施方式中，iPSC包含破壞的 REGNASE-1基因。在一些實施方式中，NK細胞包含破壞的 REGNASE-1基因。
在一些實施方式中，靶向 REGNASE-1基因組區域的gRNA在 REGNASE-1基因中產生插缺，從而破壞mRNA或蛋白之表現。在一些實施方式中，gRNA靶向 REGNASE-1基因內的位點。在一些實施方式中， REGNASE-1gRNA靶向包含SEQ ID NO: 93-101的序列。在一些實施方式中，靶向 REGNASE-1基因的gRNA包含對應於包含SEQ ID NO: 93-101中的任一個之序列的間隔子序列。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的REGNASE-1蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞可以不表現可檢測水平的REGNASE-1蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞不表現可檢測水平的REGNASE-1蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞表現可檢測水平的REGNASE-1蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞表現可檢測水平的REGNASE-1蛋白。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞表現可檢測水平的REGNASE-1蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞表現可檢測水平的REGNASE-1蛋白。 FAS 基因編輯
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞的基因組經修飾以破壞 Fas 細胞表面死亡受體（ FAS）基因（NCBI基因ID：355）。FAS係TNF-受體超家族的成員並且有助於計畫性細胞死亡的調控。在一些實施方式中，破壞的 FAS可降低活化誘導的細胞死亡（AICD）、抵抗細胞凋亡和/或增加腫瘤殺傷。在一些實施方式中，iPSC包含破壞的 FAS基因。在一些實施方式中，NK細胞包含破壞的 FAS基因。
在一些實施方式中，靶向 FAS基因組區域的gRNA在 FAS基因中產生插缺，從而破壞mRNA或蛋白之表現。在一些實施方式中，gRNA靶向 FAS基因內的位點。在一些實施方式中， FASgRNA靶向包含SEQ ID NO: 35、37、38、39、53、55或80的序列。在一些實施方式中，靶向 FAS基因的gRNA包含對應於包含SEQ ID NO: 35、37、38、39、53、55或80中的任一個之序列的間隔子序列。
在一些實施方式中，細胞群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的FAS蛋白。例如，群體中至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的工程化細胞可以不表現可檢測水平的FAS表面蛋白。在一些實施方式中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的工程化細胞不表現可檢測水平的FAS蛋白。
在一些實施方式中，細胞群體中少於50%的工程化細胞表現可檢測水平的FAS蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中少於30%的工程化細胞表現可檢測水平的FAS蛋白。例如，細胞群體中少於50%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%或少於5%的工程化細胞表現可檢測水平的FAS蛋白。在一些實施方式中，細胞群體中40%-30%、40%-20%、40%-10%、40%-5%、30%-20%、30%-10%、30%-5%、20%-10%、20%-5%或10%-5%的工程化細胞表現可檢測水平的FAS蛋白。 對敲入嵌合抗原受體的編輯
嵌合抗原受體（CAR）係指經工程化以識別並結合由腫瘤細胞表現的抗原的人工免疫細胞受體。CAR或編碼CAR的核苷酸可插入本文所述之任何細胞中。CAR係T細胞受體（TCR）複合體的傳訊結構域與抗原識別結構域（例如，抗體的單鏈片段（scFv）或其他抗體片段）的嵌合體（Enblad等人, Human Gene Therapy. [人類基因療法] 2015; 26 (8): 498-505）。CAR具有以非MHC限制的方式將細胞特異性和反應性重定向至所選靶標的能力。非MHC限制性抗原識別賦予表現CAR的細胞識別獨立於抗原加工的抗原的能力，從而繞開了腫瘤逃逸的主要機制。CAR通常藉由它們結合的抗原來指代。例如，「CD30 CAR」、「CD19 CAR」、「CD70 CAR」、「CD33 CAR」和「BCMA CAR」係包含分別特異性結合CD30、CD19、CD70、CD33或BCMA的抗原結合結構域的CAR。因此，此類術語可與抗CD30 CAR、抗CD19 CAR、抗CD70 CAR、抗CD33 CAR和抗BCMA CAR互換。熟悉該項技術者將理解，可以用任一術語來指代特異性結合抗原的CAR。
在一些實施方式中，本文所述之任何iPSC表現CAR。在一些實施方式中，本文所述之任何NK細胞表現CAR。在一些實施方式中，本文所述之任何HSPC表現CAR。
有四代CAR，每代CAR含有不同組分。第一代CAR通過鉸鏈結構域和跨膜結構域將抗體衍生的scFv與T細胞受體的CD3ζ（ζ或z）細胞內傳訊結構域連接。第二代CAR包含另外的結構域（例如CD28、4-1BB（41BB）或ICOS）以提供共刺激訊息。第三代CAR含有兩個與TCR CD3ζ鏈融合的共刺激結構域。第三代共刺激結構域可以包括例如CD3ζ、CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40的組合。第四代CAR包括免疫刺激細胞介素以改善細胞持久性和擴增。第四代CAR的細胞介素單獨地或組合地包括IL-7、IL-12、IL-15、IL-18或IL-23中的任一種。在一些實施方式中，CAR含有通常源自單鏈可變片段（scFv）的胞外結構域、鉸鏈、跨膜結構域，以及具有一個（第一代）、兩個（第二代）、或三個（第三代）源自CD3Z和/或共刺激分子的傳訊結構域的胞內結構域（Maude等人, Blood.[血液] 2015; 125 (26): 4017-4023；Kakarla和Gottschalk, Cancer J.[癌症雜誌] 2014; 20 (2): 151-155）。
CAR通常在其功能特性方面不同。T細胞受體的CD3ζ傳訊結構域（在參與時）會活化並誘導T細胞增殖，但可能導致無反應性（機體防禦機制缺少反應，導致直接誘導外周淋巴細胞耐受性）。當淋巴細胞對特定抗原無反應時，它們被認為是無反應的。在第二代CAR中增加共刺激結構域改善了經修飾的T細胞的複製能力和持久性。用CD28或4-1BB CAR在體外觀察到相似的抗腫瘤作用，但臨床先質內研究表明4-1BB CAR可以產生優異的增殖和/或持久性。臨床試驗表明，這兩種第二代CAR都能夠在體內誘導大量T細胞增殖，但是含有4-1BB共刺激結構域的CAR顯現可以持續更長的時間。第三代CAR組合了多個傳訊結構域（共刺激）以增強效能。
在一些實施方式中，嵌合抗原受體係第一代CAR。在其他實施方式中，嵌合抗原受體係第二代CAR。在還其他實施方式中，嵌合抗原受體係第三代CAR。在一些實施方式中，嵌合抗原受體係第四代CAR。
在一些實施方式中，CAR包含含有抗原結合結構域（例如抗體，如scFv）的細胞外（胞外）結構域、跨膜結構域、和細胞質（胞內）結構域。 CAR 的胞外結構域
胞外結構域係CAR的暴露於細胞外液的區域，並且在一些實施方式中，包括抗原結合結構域，以及視需要訊息肽、間隔子結構域、和/或鉸鏈結構域。在一些實施方式中，抗原結合結構域係單鏈可變片段（scFv），其包括與短連接子肽連接的免疫球蛋白的VL和VH。在一些實施方式中，連接子包括親水性殘基，即，多段甘胺酸和絲胺酸用於柔性，以及多段麩胺酸和離胺酸用於增加溶解度。單鏈可變片段（scFv）實際上不是抗體的片段，而是免疫球蛋白的重鏈（VH）和輕鏈（VL）的可變區之融合蛋白，該融合蛋白與十到約25個胺基酸的短連結頭肽連接。連接子通常富含甘胺酸用於柔性、以及絲胺酸或蘇胺酸用於溶解度，並且可以將VH的N-末端與VL的C-末端相連，反之亦然。儘管去除了恒定區並引入了連接子，但此蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特異性。在一些實施方式中，本揭露之scFv係人源化的。在其他實施方式中，scFv係完全人類的。在還其他實施方式中，scFv係嵌合體（例如，小鼠和人序列的嵌合體）。
在一些實施方式中，scFv係抗BCMA scFv（特異性結合BCMA或B細胞成熟抗原）。在一些實施方式中，抗BCA scFv包含SEQ ID NO: 71的核苷酸序列或由其組成。在一些實施方式中，抗BCA scFv多核苷酸與SEQ ID NO: 71具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv係抗CD30 scFv（特異性結合CD30，也稱為TNF受體超家族成員8或TNFRSF8）。在一些實施方式中，抗CD30 scFv可以包含來自小鼠單選殖AC10（例如，本妥昔單抗（Brentuximab））的可變結構域。在其他實施方式中，抗CD30 scFv可以包含來自人5F11抗體（美國專利案號7387776）的可變結構域。在一些實施方式中，CD30 CAR的scFV可以包含SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 115的核苷酸序列。在一些實施方式中，抗CD30 CAR編碼序列包含SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 112或SEQ ID NO: 116。在一些實施方式中，抗CD30 CAR編碼序列多核苷酸與SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 112或SEQ ID NO: 116具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。可以如本文所提供而使用的CD30 CAR之非限制性實例可以包括SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 113或SEQ ID NO: 117的胺基酸序列。
在一些實施方式中，scFv係抗CD19 scFv（特異性結合CD19）。
在一些實施方式中，scFv係抗CD70 scFv（特異性結合CD70）。
在一些實施方式中，scFv係抗CD33 scFv（特異性結合CD33）。
可以使用其他scFv蛋白。
訊息肽可以增強CAR結合的抗原特異性。訊息肽可源自抗體（諸如但不限於CD8）以及表位標籤（諸如但不限於GST或FLAG）。訊息肽之實例包括MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP（SEQ ID NO: 68）和MALPVTALLLPLALLLHAARP（SEQ ID NO: 69）。可以使用其他訊息肽。
在一些實施方式中，間隔子結構域或鉸鏈結構域位於CAR的胞外結構域（包含抗原結合結構域）與跨膜結構域之間或者CAR的胞質結構域與跨膜結構域之間。間隔子結構域係起到將跨膜結構域連接至多肽鏈中的胞外結構域和/或胞質結構域的功能的任何寡肽或多肽。鉸鏈結構域係起到向CAR或其結構域提供柔性或防止CAR或其結構域的空間位元阻的作用的任何寡肽或多肽。在一些實施方式中，間隔子結構域或鉸鏈結構域可以包含多達300個胺基酸（例如，10至100個胺基酸或5至20個胺基酸）。在一些實施方式中，一或多個間隔子結構域可以包括在CAR的其他區域中。在一些實施方式中，鉸鏈結構域係CD8鉸鏈結構域。可以使用其他鉸鏈結構域。 CAR 的跨膜結構域
跨膜結構域係跨過膜的疏水性α螺旋。跨膜結構域提供了CAR的穩定性。在一些實施方式中，如本文提供的CAR的跨膜結構域係CD8跨膜結構域。在其他實施方式中，跨膜結構域係CD28跨膜結構域。在又其他實施方式中，跨膜結構域係CD8和CD28跨膜結構域的嵌合體。如本文提供的，可以使用其他跨膜結構域。在一些實施方式中，CD8a跨膜結構域係SEQ ID NO: 28的核苷酸。在一些實施方式中，跨膜結構域係CD8a跨膜結構域：FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR (SEQ ID NO: 72)。在一些實施方式中，跨膜結構域係包含以下胺基酸序列的CD8a跨膜結構域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY (SEQ ID NO: 73)。在一些實施方式中，跨膜結構域係包含胺基酸序列SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR（SEQ ID NO: 122）的CD8跨膜結構域。可以使用其他跨膜結構域。
在一些實施方式中，跨膜結構域選自以下的跨膜結構域：NKG2D、FcYRIIIa、NKp44、NKp30、NKp46、actKIR、NKG2C、CD8a和IL15Rb。在一些實施方式中，跨膜結構域係NKG2D跨膜結構域。 CAR 的胞內結構域
胞內結構域係受體的功能端。抗原識別後，受體聚簇，並且訊息被傳遞到細胞。最常用的胞內結構域組分係CD3-ζ，該組分含有三（3）個基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。這會在抗原結合後向T細胞傳遞活化訊息。在許多情況下，CD3-ζ可能無法提供完全有效的活化訊息，因此，使用了共刺激傳訊。例如，CD28和/或4-1BB可以與CD3-ζ（CD3ζ）一起使用，以傳遞增殖/存活訊息。因此，在一些實施方式中，如本文提供的CAR的共刺激分子係CD28共刺激分子。在其他實施方式中，共刺激分子係4-1BB共刺激分子。在一些實施方式中，CAR包括CD3-ζ和CD28。在其他實施方式中，CAR包括CD3-ζ和4-1BB。在其他實施方式中，CAR包括CD3ζ、CD28、和4-1BB。 表 A提供了可用於本文的源自CD28、4-1BB和CD3-ζ的傳訊結構域的實例。 [ 表 A]
名稱 序列 SEQ ID NO:
CD28 SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 123
4-1BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 124
CD3-ζ RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 125
在一些實施方式中，本文所述之任何CAR具有來自例如CD137/41 BB、DNAM-1、NKrdO、2B4、NTBA、CRACC、CD2、CD27、一或多種整合素（例如ITGB1、ITGB2或ITGB3）、IL-15R、IL-18R、IL-12R、IL-21 R或IRE1a的一個、兩個或更多個細胞內傳訊結構域（例如來自該等分子中的兩種或更多種的傳訊結構域的任何組合）。
自然殺手細胞表現多種跨膜銜接子，為它們提供訊息增強。在一些實施方式中，本文所述之任何CAR的細胞內傳訊結構域包含跨膜銜接子。在一些實施方式中，跨膜銜接子係來自以下一或多種的跨膜銜接子：FceRl y、CD3ζ、DAP 12和DAP 10。
在一些實施方式中，本文所述之任何CAR具有一或多個共刺激結構域。在一些實施方式中，使用2B4共刺激結構域。在一些實施方式中，使用CD3ζ胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，DAP10或DAP12共刺激結構域與CD3ζ胞內傳訊結構域一起使用。在一些實施方式中，DAP10共刺激傳訊結構域與NKG2D跨膜結構域一起使用。在一些實施方式中，跨膜結構域來自NKG2D，並且胞內結構域來自DAP10和CD3ζ（例如，如Chang YH等人 Caner Res.[癌症研究] 2013. 73 (6): 1777-86所述）。在一些實施方式中，CAR包含與4-1BB和DAP10傳訊和/或共刺激結構域融合的NKG2D跨膜結構域（例如，如Guo C. 等人 Mol Immunol.[分子免疫學] 2019. 114: 108-113所述）。在一些實施方式中，CAR包含來自2B4的共刺激結構域。在一些實施方式中，CAR包含CD8跨膜結構域和4-1BB-CD3ζ傳訊結構域（例如，如在由Imai C等人 Blood.[血液] 2005, 106 (1). 376-383所述之構建體中）。
在一些實施方式中，CAR具有CD8跨膜結構域、4-1BB胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有CD28跨膜結構域、CD28胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有DAP12跨膜結構域和胞內結構域。在一些實施方式中，CAR具有2B4跨膜結構域和胞內結構域以及CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有CD8跨膜結構域、2B4胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有CD28跨膜結構域和胞內結構域、4-1BB胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有CD16跨膜結構域、2B4胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有NKp44跨膜結構域、DAP10胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有NKp46跨膜結構域、2B4胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。 在一些實施方式中，CAR具有NKG2D跨膜結構域、4-1BB胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有NKG2D跨膜結構域、4-1BB胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有NKG2D跨膜結構域、DAP12胞內結構域、2B4胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有NKG2D跨膜結構域、DAP10胞內結構域、2B4胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有NKG2D跨膜結構域、4-1BB胞內結構域、2B4胞內結構域和CD3ζ傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR具有NKG2D跨膜結構域和CD3ζ傳訊結構域。 多基因編輯
在一些實施方式中，本揭露之工程化細胞包括多於一個基因編輯，例如，在多於一個基因中。在一些實施方式中，編輯兩個、三個、四個、五個、六個或更多個基因。在一些實施方式中，基因編輯係插入（KI）。在一些實施方式中，基因編輯係破壞（KO）。在一些實施方式中，本文所述之兩個或更多個基因編輯的組合係插入（KI）和破壞（KO）的組合。在一些實施方式中，基因編輯係選自以下的基因編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個的任何組合： B2MKO、IL15 KI、IL15Rα KI、IL15/IL15Rα KI、HLA-E KI、SERPINB9 KI、 CIITAKO、 ADAM17KO、BCMA CAR KI、CD30 CAR KI、 CISHKO、 REGNASE-1KO、 FASKO、 TIGITKO、 PD-1KO、 NKG2AKO、 CD70KO、 ALK4I型活化素受體KO（例如，條件性KO）、CD16 KI、CD70 CAR KI、CD19 CAR KI、CD33 CAR KI、NKGD2 CAR KI、CAR或包含NKG2D胞外結構域的受體KI、NKp30 CAR KI、CD73 CAR KI、GPR87 CAR KI和SLC7A11(xCT) CAR KI。在一些實施方式中，兩個或更多個基因的編輯係同時的，諸如在同一方法步驟中。例如，工程化細胞可包含破壞的 CIITA基因、破壞的 B2M基因或其組合。在一些實施方式中，本文所述之任何iPSC細胞具有破壞的 CIITA基因和破壞的 B2M基因。在一些實施方式中，本文所述之任何工程化NK細胞包含破壞的 CIITA基因和破壞的 B2M基因。
在一些實施方式中，本文所述之任何插入多核苷酸與啟動子連接。在一些實施方式中，本文所述之任何插入多核苷酸與外源啟動子連接。在一些實施方式中，啟動子選自但不限於CAG啟動子（也稱為CBA啟動子或CAGGS啟動子）、CMV啟動子（源自巨細胞病毒）、EF-lα啟動子（源自EF-1基因的α亞基）、PGK啟動子（源自磷酸甘油酸激酶基因）、UBC啟動子（源自泛素C基因）或其他組成型啟動子、誘導型啟動子、時間特異性啟動子、組織特異性啟動子或細胞類型特異性啟動子。
在一些實施方式中，基因組工程化的細胞包含HLA-E、IL15/IL15Rα、CAR和SERPINB9中的至少一種的引入或增加之表現。在一些實施方式中，任何基因組工程化的細胞係HLA I類和/或II類缺陷型的。在一些實施方式中，基因組工程化的細胞包含編碼HLA-E、IL15/IL15Rα、CAR和SERPINB9蛋白中的一或多種的整合或非整合的外源多核苷酸。在一些實施方式中，所述引入之表現係來自所述細胞中包含的非表現或低表現基因的增加之表現。在一些實施方式中，使用仙台病毒、AAV、附加體或質體將非整合外源多核苷酸引入。在一些實施方式中，細胞係 B2Mnull，其具有引入的HLA-E表現。在一些實施方式中，細胞係 HLA-A、 HLA-B和 HLA-Cnull，其具有引入的HLA-E表現。在一些實施方式中，細胞係 B2Mnull，其具有引入的HLA-E、IL15/IL15Rα和SERPINB9中的一或多種之表現。設想使用但不限於本文所述之基因編輯方法中的任一種進行生成本文所述之任何經遺傳修飾的細胞之方法。
在一些實施方式中，將編碼HLA-E的多核苷酸插入本文所述之任何細胞中的 B2M基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，與缺失 B2M基因或啟動子之全部或一部分同時或在其之後，將編碼 HLA-E的多核苷酸插入 B2M基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，編碼HLA-E的多核苷酸與外源啟動子可操作地連接。在一些實施方式中，編碼HLA-E的多核苷酸與CAGGS啟動子可操作地連接。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以表現與CAGGS啟動子可操作地連接的編碼HLA-E的多核苷酸。
在一些實施方式中，將編碼IL15/IL15Rα融合蛋白的多核苷酸插入本文所述之任何細胞中的 B2M基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，與缺失 B2M基因或啟動子之全部或一部分同時或在其之後，將編碼IL15/IL15Rα融合蛋白的多核苷酸插入 B2M基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，編碼IL15/IL15Rα融合蛋白的多核苷酸與外源啟動子可操作地連接。在一些實施方式中，編碼IL15/IL15Rα融合蛋白的多核苷酸與CAGGS啟動子可操作地連接。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以表現與CAGGS啟動子可操作地連接的編碼IL15/IL15Rα融合蛋白的多核苷酸。
在一些實施方式中，將編碼SERPINB9的多核苷酸插入本文所述之任何細胞中的 B2M基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，與缺失 B2M基因或啟動子之全部或一部分同時或在其之後，將編碼SERPINB9的多核苷酸插入 B2M基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，編碼SERPINB9的多核苷酸與外源啟動子可操作地連接。在一些實施方式中，編碼SERPINB9的多核苷酸與CAGGS啟動子可操作地連接。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以表現與CAGGS啟動子可操作地連接的編碼SERPINB9的多核苷酸。
在一些實施方式中，本文所述之經編輯的細胞表現至少一種嵌合抗原受體（CAR）。在一些實施方式中，將CAR插入特定的基因座。在一些實施方式中，將CAR插入特定基因座以同時破壞靶基因之表現。
在一些實施方式中，將編碼本文所述之任何CAR的多核苷酸插入 CIITA基因座內或附近。在一些實施方式中，與缺失 CIITA同時或在其之後，將編碼本文所述之任何CAR的多核苷酸插入 CIITA基因座內或附近。在一些實施方式中，將編碼BCMA-CAR的多核苷酸插入 CIITA基因座內。在一些實施方式中，將編碼BCMA-CAR的SEQ ID NO: 66的多核苷酸插入 CIITA基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，與缺失 CIITA基因或啟動子同時或在其之後，將編碼BCMA-CAR的多核苷酸插入 CIITA基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，將BCMA CAR插入 CIITA基因座中，其中在同源定向修復後去除 CIITA外顯子2的86個鹼基對（bp）。在一些實施方式中，使用供體質體將BCMA CAR插入 CIITA基因座中。在一些實施方式中，將BCMA CAR供體質體與由任何 CIITA靶向gRNA和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何細胞中。在一些實施方式中，插入 CIITA基因座中的BCMA-CAR由本文所述之任何啟動子驅動。在一些實施方式中，插入 CIITA基因座中的BCMA-CAR由CAG啟動子驅動。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以在 CIITA基因座內表現BCMA-CAR。在一些實施方式中，iPSC經基因編輯以在 CIITA基因座內表現BCMA-CAR。
在一些實施方式中，將BCMA-CAR供體質體（SEQ ID NO: 66）與由任何 CIITA靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 13-17中任一個之序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何細胞中，以產生 CIITAnull、BCMA-CAR表現性細胞。在一些實施方式中，將BCMA CAR供體質體（SEQ ID NO: 66）與由任何 CIITA靶向gRNA（SEQ ID NO: 13）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何iPSC中以產生 CIITAnull、BCMA-CAR KI表現性細胞。
在一些實施方式中，將編碼CD30-CAR的多核苷酸插入 CIITA基因座內。在一些實施方式中，將編碼CD30 CAR的SEQ ID NO: 108、112或116的多核苷酸插入 CIITA基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，將編碼CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體的SEQ ID NO: 119、120或121的多核苷酸插入 CIITA基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，與缺失 CIITA基因或啟動子同時或在其之後，將編碼CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體的多核苷酸插入 CIITA基因座內或附近的位點。在一些實施方式中，將CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體插入 CIITA基因座中，其中在同源定向修復後去除 CIITA外顯子2的86個鹼基對（bp）。在一些實施方式中，使用供體質體將CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體插入 CIITA基因座中。在一些實施方式中，將CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體供體質體與由任何 CIITA靶向gRNA和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何細胞中。在一些實施方式中，插入 CIITA基因座中的CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體由本文所述之任何啟動子驅動。在一些實施方式中，插入 CIITA基因座中的CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體由CAG啟動子驅動。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以在 CIITA基因座內表現CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體。在一些實施方式中，iPSC經基因編輯以在 CIITA基因座內表現CD30 CAR或CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體。
在一些實施方式中，將CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 110、114或118）與由任何 CIITA靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 13-17中任一個之序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何細胞中，以產生 CIITAnull、CD30 CAR、HLA-E表現性細胞。在一些實施方式中，將CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 110、114或118）與由 CIITA靶向gRNA（SEQ ID NO: 13）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何iPSC中，以產生 CIITAnull、CD30 CAR、HLA-E表現性細胞。
在一些實施方式中，本文所述之細胞具有編碼IL15/IL15Rα、P2A、HLA-E三聚體和SERPINB9中的任一或多種之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞將編碼IL15/IL15Rα、P2A、HLA-E三聚體和SERPINB9中的任一或多種的多核苷酸插入 B2M基因座中。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞具有編碼IL15/IL15Rα融合蛋白之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，IL15/IL15Rα融合蛋白如先前在Hurton等人 (2016) Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊]; 113 (48): E7788-E7797. doi: 10.1073/pnas.1610544113中所述而設計，該文獻整體併入本文中。
在一些實施方式中，本文所述之細胞具有編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，本文所述之細胞具有編碼由SEQ ID NO: 77編碼的IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，細胞將編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體的多核苷酸插入 B2M基因座中。在一些實施方式中，IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體編碼序列由本文所述之任何啟動子驅動。在一些實施方式中，IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體編碼序列由CAGGS啟動子驅動。在一些實施方式中，包含由CAGGS啟動子驅動的IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體序列的供體質體包含SEQ ID NO: 67的核苷酸序列。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以表現IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體。在一些實施方式中，iPSC經基因編輯以表現IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體。在一些實施方式中，NK細胞經基因編輯以表現IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體。
在一些實施方式中，將IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 67）與由B2M靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 34、78或79的序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何細胞中，以產生 B2Mnull、IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體表現性細胞。在一些實施方式中，將IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 67）與由 B2M靶向gRNA（SEQ ID NO: 34）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何iPSC中，以產生 B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體表現性細胞。
在一些實施方式中，本文所述之細胞具有編碼SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，本文所述之細胞具有編碼SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體之多核苷酸的插入，其中該多核苷酸包含SEQ ID NO: 131的序列。在一些實施方式中，細胞將編碼SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體的多核苷酸插入 B2M基因座中。在一些實施方式中，SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體序列由本文所述之任何啟動子驅動。在一些實施方式中，SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體序列由CAGGS啟動子驅動。在一些實施方式中，包含編碼由CAGGS啟動子驅動的SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體之多核苷酸的質體包含SEQ ID NO: 130。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以表現SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體。在一些實施方式中，iPSC經基因編輯以表現SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體。在一些實施方式中，NK細胞經基因編輯以表現SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體。
在一些實施方式中，將SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 130）與由B2M靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 34、78或79的序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何細胞中，以產生 B2Mnull、SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體表現性細胞。在一些實施方式中，將SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 130）與由B2M靶向gRNA（SEQ ID NO: 34）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何iPSC中，以產生 B2Mnull、SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體表現性細胞。
在一些實施方式中，本文所述之細胞具有編碼SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα之多核苷酸的插入。在一些實施方式中，本文所述之細胞具有編碼SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα之多核苷酸的插入，其中編碼序列包含SEQ ID NO: 137。在一些實施方式中，細胞將編碼SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα的多核苷酸插入 B2M基因座中。在一些實施方式中，SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα序列由本文所述之任何啟動子驅動。在一些實施方式中，SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα序列由CAGGS啟動子驅動。在一些實施方式中，包含編碼由CAGGS啟動子驅動的SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα之多核苷酸的質體包含SEQ ID NO: 148。在一些實施方式中，本文所述之任何細胞經基因編輯以表現SERPINB9-P2A- IL15/IL15Rα。在一些實施方式中，iPSC經基因編輯以表現SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα。在一些實施方式中，NK細胞經基因編輯以表現SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα。
在一些實施方式中，將SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα供體質體（SEQ ID NO: 148）與由 B2M靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 34、78或79的序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何細胞中，以產生 B2Mnull、SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα表現性細胞。在一些實施方式中，將SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα供體質體（SEQ ID NO: 148）與由 B2M靶向gRNA（SEQ ID NO: 34）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起電穿孔到本文所述之任何iPSC中，以產生 B2Mnull、SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα表現性細胞。
在一些實施方式中，將本文所述之任何 B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI細胞用BCMA-CAR供體質體（SEQ ID NO: 66）連同由 CIITA靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 13-17中任一個之序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體電穿孔，以產生 B2Mnull、IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull表現性細胞。在一些實施方式中，將本文所述之任何 B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI iPSC用BCMA-CAR供體質體（SEQ ID NO: 66）連同由CIITA靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 13-17中任一個之序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體電穿孔，以產生 B2Mnull、IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體表現性、 CIITAnull BCMA-CAR表現性iPSC。然後可以將工程化的iPSC分化成NK細胞。
在一些實施方式中，將本文所述之任何 CIITAnull、BCMA-CAR KI細胞用IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 67）連同由B2M靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 34的序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體電穿孔，以產生 B2Mnull、IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull表現性細胞。在一些實施方式中，將本文所述之任何 CIITAnull、BCMA-CAR KI iPSC用IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體供體質體（SEQ ID NO: 67）連同由 B2M靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 34的序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體電穿孔，以產生 B2Mnull、IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體表現性、 CIITAnull、BCMA-CAR表現性iPSC。然後可以將工程化的iPSC分化成NK細胞。
在一些實施方式中，將本文所述之任何 B2Mnull、SERPINB9-P2A-IL15/IR15α KI細胞用CAR-P2A-HLA-E供體質體（SEQ ID NO: 110、114、118）連同由 CIITA靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 13-17中任一個之序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體電穿孔，以產生 B2Mnull、SERPINB9-P2A-IL15/IR15α表現性、 CIITAnull、CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體表現性iPSC。
在一些實施方式中，將本文所述之任何 CIITAnull, CAR-P2A-HLA-E三聚體KI細胞用SERPINB9-P2A-IL15/IR15α供體質體（SEQ ID NO: 148）連同由 B2M靶向gRNA（對應於SEQ ID NO: 34的序列）和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體電穿孔，以產生 B2Mnull、 CAR-P2A-HLA-E三聚體表現性、 CIITAnull、SERPINB9-P2A-IL15/IR15α表現性細胞。
在一些實施方式中，任何 B2Mnull、SERPINB9-P2A-IL15/IR15α表現性、 CIITAnull、CAR-P2A-HLA-E三聚體性表現性細胞進一步包含 FASKO和 CISHKO。
在一些實施方式中，本文所述之任何細胞具有 ADAM17基因的破壞。
在一些實施方式中，本文所述之任何 B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull細胞經基因編輯以破壞 ADAM17。在一些實施方式中， B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull iPSC經基因編輯以破壞 ADAM17。在一些實施方式中，使用具有對應於由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10組成之序列的gRNA的RNP敲除 ADAM17。在一些實施方式中，使用具有對應於SEQ ID NO: 1之序列的gRNA的RNP敲除 ADAM17。在一些實施方式中，本文所述之iPSC係 B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull、 ADAM17null。在一些實施方式中，本文所述NK細胞係 B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull、 ADAM17null。在一些實施方式中，細胞進一步包含 FASKO、 CISHKO和/或 REGNASE-1KO。
在一些實施方式中， B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull iPSC經基因編輯以破壞 ADAM17，然後分化成NK細胞。在一些實施方式中， B2Mnull、IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA-CAR KI、 CIITAnull iPSC經基因編輯以破壞 ADAM17、 FAS、 CISH、 REGNASE-1，然後分化成NK細胞。 基因組編輯方法
基因組編輯通常係指較佳地以精確或預定的方式修飾基因組核苷酸序列的過程。在一些實施方式中，如本文所述之基因組編輯方法（例如CRISPR-內切核酸酶系統）用於遺傳修飾如本文所述之細胞，例如以產生經基因編輯的iPSC細胞。在一些實施方式中，如本文所述之基因組編輯方法（例如，CRISPR-內切核酸酶系統）用於遺傳修飾如本文所述之細胞，例如以在至少一種基因內或附近引入相對於未經修飾的細胞增加一或多種MHC-I和/或MHC-II人白血球抗原或者MHC-I或MHC-II複合體的其他組分之表現的至少一種遺傳修飾；以引入相對於未經修飾的細胞增加編碼致耐受性因子的至少一種多核苷酸之表現的至少一種遺傳修飾；和/或以引入增加或減少編碼提高免疫性的靶向因子的至少一種基因之表現的至少一種遺傳修飾。
本文所述之基因組編輯方法之實例包括使用定點核酸酶在基因組中的精確靶位置處切割去氧核糖核酸（DNA），從而在基因組內的特定位置處產生單鏈或雙鏈DNA斷裂之方法。此類斷裂可以且有規律地藉由天然的內源細胞過程（如同源定向修復（HDR）和非同源末端連接（NHEJ））進行修復，如在Cox等人, 「Therapeutic genome editing: prospects and challenges」[治療性基因組編輯：前景與挑戰], Nature Medicine [自然•醫學], 2015, 21 (2), 121-31中所述之。這兩個主要的DNA修復過程由一系列替代途徑組成。NHEJ直接連接由於雙鏈斷裂而產生的DNA末端，有時會丟失或添加核苷酸序列，這可以破壞或增強基因表現。HDR利用同源序列或供體序列作為模板，以在中斷點處插入確定的DNA序列。同源序列可以在內源基因組（如姐妹染色單體）中。替代性地，供體序列可為外源多核苷酸，如質體、單鏈寡核苷酸、雙鏈寡核苷酸、雙鏈體寡核苷酸或病毒，該外源多核苷酸具有與核酸酶切割的基因座有高度同源性的區域（例如，左同源臂和右同源臂），但是還可以含有另外的序列或序列變化（包括可併入經切割的靶基因座中的缺失）。第三種修復機制可為微同源介導的末端連接（MMEJ），也稱為「替代NHEJ」，其遺傳結果與NHEJ相似，因為在切割位點可以發生小的缺失和插入。MMEJ可以利用側翼於DNA斷裂位點的幾個鹼基對的同源序列來驅動更有利的DNA末端連接修復結果，並且最近的報導進一步闡明了此過程的分子機制；參見例如Cho和Greenberg, Nature [自然], 2015, 518, 174-76；Kent等人, Nature Structural and Molecular Biology [自然•結構與分子生物學], 2015, 22 (3): 230-7；Mateos-Gomez等人, Nature [自然], 2015, 518, 254-57；Ceccaldi等人, Nature [自然], 2015, 528, 258-62。在一些情況下，可以基於對DNA斷裂位點處潛在的微同源性的分析來預測可能的修復結果。
該等基因組編輯機制中的每一個均可以用於產生所需的遺傳修飾。基因組編輯過程中的一個步驟可為在預期突變位點的附近的靶基因座中產生一個或兩個DNA斷裂，後者為雙鏈斷裂或兩個單鏈斷裂。如本文所述和所示，這可以通過使用內切核酸酶來實現。
通常，本文所述之基因組編輯方法可為體外或離體方法。在一些實施方式中，本文揭露的基因組編輯方法不是藉由療法治療人或動物體的方法和/或不是用於修飾人類種系遺傳特性的過程。 CRISPR 內切核酸酶系統
CRISPR-內切核酸酶系統係原核生物中天然存在的防禦機制，該防禦機制已被重新用作用於基因編輯的RNA引導的DNA靶向平臺。CRISPR系統包括I、II、III、IV、V和VI型系統。在一些方面，CRISPR系統係II型CRISPR/Cas9系統。在其他方面，CRISPR系統係V型CRISPR/Cprf系統。CRISPR系統依賴於DNA內切核酸酶（例如，Cas9）和兩種非編碼RNA（crisprRNA（crRNA）和反式活化RNA（tracrRNA））來靶向DNA的切割。
crRNA通過通常與靶DNA中的約20個核苷酸（nt）序列的沃森-克裡克鹼基配對來驅動CRISPR-內切核酸酶複合體的序列識別和特異性。改變crRNA中5’ 20 nt的序列允許將CRISPR-內切核酸酶複合體靶向特定基因座。如果靶序列後面係特定的短DNA模體（序列為NGG）（稱為原型間隔子相鄰模體（PAM）），則CRISPR-內切核酸酶複合體僅結合含有與單引導RNA（sgRNA）的前20 nt序列匹配的DNA序列。
TracrRNA與crRNA的3’端雜交以形成RNA雙鏈體結構，該雙鏈體結構與內切核酸酶結合以形成具有催化活性的CRISPR-內切核酸酶複合體，該複合體然後可以切割靶DNA。
一旦CRISPR-內切核酸酶複合體在靶點處與DNA結合，內切核酸酶內的兩個獨立的核酸酶結構域便各自在PAM位點上游三個鹼基處切割DNA鏈之一，從而留下雙鏈斷裂（DSB），在這裡DNA的兩條鏈以鹼基對（平末端）終止。
在一些實施方式中，內切核酸酶係Cas9（CRISPR相關蛋白9）。在一些實施方式中，Cas9內切核酸酶來自釀膿鏈球菌，但是可以使用其他Cas9同源物，例如金黃色葡萄球菌（ S. aureus）Cas9、腦膜炎奈瑟氏球菌（ N. meningitidis）Cas9、嗜熱鏈球菌（ S. thermophilus）CRISPR 1 Cas9、嗜熱鏈球菌CRISPR 3 Cas9或齒垢密螺旋體（ T. denticola）Cas9。在一些實施方式中，CRISPR內切核酸酶係Cpf1，例如毛螺旋菌科細菌（L. bacterium）ND2006 Cpfl或胺基酸球菌屬物種（Acidaminococcus sp.）BV3L6 Cpfl。在一些實施方式中，內切核酸酶係Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（也稱為Csn1和Csx12）、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1內切核酸酶。在一些實施方式中，可以使用野生型變體。在一些實施方式中，可以使用前述內切核酸酶的修飾型式（例如，其同源物、其天然存在的分子的重組、其密碼子優化或其修飾型式）。
CRISPR核酸酶可以連接至至少一個核定位訊息（NLS）。該至少一個NLS可以位於CRISPR核酸酶的胺基末端的50個胺基酸處或內，和/或至少一個NLS可以位於CRISPR核酸酶的羧基末端的50個胺基酸處或內。
示例性CRISPR/Cas多肽包括如Fonfara等人, 「Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems」[Cas9的系統發育決定了雙RNA和Cas9在直系同源II型CRISPR-Cas系統中的功能可交換性], Nucleic Acids Research [核酸研究], 2014, 42: 2577-2590中公開的Cas9多肽。自從發現Cas基因以來，CRISPR/Cas基因命名系統已經進行了廣泛的重寫。Fonfara等人還提供了來自各種物種的Cas9多肽的PAM序列。 鋅指核酸酶
鋅指核酸酶（ZFN）係模組化蛋白，由與II型內切核酸酶FokI的催化結構域連接的經工程化的鋅指DNA結合結構域構成。由於FokI僅作為二聚體起作用，因此必須對一對ZFN進行工程化以使其與相反DNA鏈上的同源靶「半位點」序列結合，並且它們之間的精確間隔使得能夠形成具有催化活性的FokI二聚體。在本身沒有序列特異性的FokI結構域的二聚化之後，ZFN半位點之間會產生DNA雙鏈斷裂，作為基因組編輯的起始步驟。
每個ZFN的DNA結合結構域通常由豐富的Cys2-His2架構的3-6個鋅指構成，每個指主要識別靶DNA序列的一條鏈上的核苷酸三聯體，儘管與第四個核苷酸的跨鏈相互作用也可能很重要。與DNA進行關鍵接觸的位置中的指的胺基酸的改變會改變給定指的序列特異性。因此，四指鋅指蛋白將選擇性識別12 bp之靶序列，其中該靶序列係每個指貢獻的三聯體偏好的合成物，但是三聯體偏好可能會不同程度受到相鄰指的影響。ZFN的一個重要方面在於，只需修飾單個指即可輕鬆將ZFN重新靶向至幾乎任何基因組位址。在ZFN的大多數應用中，使用4-6指的蛋白，分別識別12-18 bp。因此，一對ZFN通常將識別24-36 bp的組合靶序列（不包括半位點之間的典型5-7 bp間隔子）。結合位點可以用更大的間隔子（包括15-17 bp）進一步隔開。假設在設計過程中排除了重複序列或基因同源物，則該長度之靶序列在人類基因組中可能是唯一的。然而，ZFN蛋白-DNA相互作用在其特異性上並不是絕對的，因此脫靶結合和切割事件的確會發生，要麼是兩個ZFN之間的異二聚體，要麼是ZFN中的一個或另一個的同二聚體。藉由對FokI結構域的二聚化介面進行工程化以產生「正」和「負」變體（也稱為專性異二聚體變體，它們只可以與彼此二聚化，而不可以與自身二聚化），有效地消除了後者的可能性。促成專性異二聚體阻止了同二聚體的形成。這大大提高了ZFN以及採用該等FokI變體的任何其他核酸酶的特異性。
在本領域中已經描述了多種基於ZFN的系統，定期報告其修改，並且大量參考文獻描述了用於指導ZFN設計的規則和參數；參見例如Segal等人, Proc Natl Acad Sci [美國國家科學院院刊], 1999 96 (6): 2758-63；Dreier B等人, J Mol Biol. [分子生物學雜誌], 2000, 303 (4): 489-502；Liu Q等人, J Biol Chem. [生物化學雜誌], 2002, 277 (6): 3850-6；Dreier等人, J Biol Chem. [生物化學雜誌], 2005, 280 (42): 35588-97；以及Dreier等人, J Biol Chem. [生物化學雜誌] 2001, 276 (31): 29466-78。 轉錄活化因子樣效應子核酸酶（ TALEN ）
TALEN代表模組化核酸酶的另一種形式，其中與ZFN一樣，經工程化的DNA結合結構域與FokI核酸酶結構域連接，並且一對TALEN串聯作用以實現靶向DNA切割。與ZFN的主要差異在於DNA結合結構域的性質以及相關的靶DNA序列識別特性。TALEN DNA結合結構域源自TALE蛋白，該等蛋白最初在植物細菌病原體黃單胞菌屬物種（Xanthomonas sp.）中有描述。TALE由33-35個胺基酸重複序列的串聯陣列組成，每個重複序列識別靶DNA序列中的單個鹼基對，該序列通常長達20 bp，從而使總靶序列長度達到40 bp。藉由重複可變雙殘基（RVD）確定每個重複序列的核苷酸特異性，該重複可變雙殘基僅在位置12和13處包括兩個胺基酸。鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶鹼基主要被四個RVD識別：分別為Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。這構成了比鋅指要簡單得多的識別碼，因此在核酸酶設計方面比鋅指具有優勢。然而，與ZFN一樣，TALEN的蛋白-DNA相互作用在其特異性上也不是絕對的，並且TALEN還受益於使用FokI結構域的專性異二聚體變體來降低脫靶活性。
已經產生了在其催化功能方面失活的FokI結構域的另外的變體。如果TALEN或ZFN對中的一半含有失活的FokI結構域，則在靶點處只會發生單鏈DNA切割（產生切口），而不會發生DSB。其結果與使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1「切口酶」突變體（其中Cas9切割結構域之一已失活）相當。DNA切口可以用於驅動藉由HDR進行基因組編輯，但是效率要比DSB低。與DSB不同，主要益處在於脫靶切口被快速而準確地修復，而DSB容易受到NHEJ介導的錯誤修復。
在本領域中已經描述了多種基於TALEN的系統，並且定期報告其修改；參見例如Boch, Science [科學] (2009) 326 (5959): 1509-12；Mak等人, Science [科學], 2012, 335 (6069): 716-9；以及Moscou等人, Science [科學], 2009, 326 (5959): 1501。已經有多個小組描述了基於「金門（Golden Gate）」平臺或選殖方案的TALEN的使用；參見例如Cermak等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 2011, 39 (12): e82；Li等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 2011, 39 (14): 6315-25；Weber等人, PLoS One. [公共科學圖書館•綜合], 2011, 6 (2): e16765；Wang等人, J Genet Genomics [遺傳學與基因組學雜誌], 2014, 41 (6): 339-47.；以及Cermak T等人, Methods Mol Biol. [分子生物學方法], 2015 1239: 133-59。 歸巢內切核酸酶
歸巢內切核酸酶（HE）係具有長的識別序列（14-44個鹼基對）並且通常在基因組中唯一的位點處以高特異性切割DNA的序列特異性內切核酸酶。至少有六個按其結構分類的已知HE家族，包括GIY-YIG、His-Cis框、H-N-H、PD-(D/E)xK和類Vsr，它們源自多種宿主，包括真核生物、原生生物、細菌、古細菌、藍細菌和噬菌體。與ZFN和TALEN一樣，HE可以用於在靶基因座處產生DSB，作為基因組編輯的起始步驟。另外，一些天然的和經工程化的HE僅切割DNA的單鏈，從而作為位點特異性切口酶起作用。HE的較大之靶序列以及HE提供的特異性使它們成為產生位點特異性DSB的有吸引力的候選物。
在本領域中已經描述了多種基於HE的系統，並且定期報告其修改；參見例如以下文獻的綜述：Steentoft等人, Glycobiology [糖生物學] (2014) 24 (8): 663-80；Belfort和Bonocora, Methods Mol Biol. [分子生物學方法], 2014, 1123:1-26；以及Hafez和Hausner, Genome [基因組], 2012, 55 (8): 553-69。 MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
作為雜合核酸酶另外的實例，MegaTAL平臺和Tev-mTALEN平臺利用TALE DNA結合結構域和具有催化活性的HE的融合，同時利用TALE的可調DNA結合和特異性兩者、以及HE的切割序列特異性；參見例如Boissel等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 2014, 42: 2591-2601；Kleinstiver等人, G3, 2014, 4: 1155-65；以及Boissel和Scharenberg, Methods Mol. Biol. [分子生物學方法], 2015, 1239: 171-96。
在另一種變型中，MegaTev架構係大範圍核酸酶（Mega）與源自GIY-YIG歸巢內切核酸酶I-TevI（Tev）的核酸酶結構域的融合。這兩個活性位點在DNA底物上相距約30 bp，並產生兩個具有不相容黏性末端的DSB；參見例如Wolfs等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 2014, 42, 8816-29。可以預見，現有基於核酸酶的方法的其他組合將會發展，並可用於實現本文所述之靶向基因組修飾。 dCas9-FokI 或 dCpf1-Fok1 和其他核酸酶
結合上述核酸酶平臺的結構和功能特性提供了一種另外的基因組編輯之方法，該方法可能克服一些固有缺陷。例如，CRISPR基因組編輯系統通常使用單一Cas9內切核酸酶產生DSB。靶向的特異性由引導RNA中的20或24個核苷酸的序列驅動，該序列與靶DNA進行沃森-克裡克鹼基配對（在來自釀膿鏈球菌的Cas9的情況下，加上相鄰的NAG或NGG PAM序列中的另外2個鹼基）。這種序列足夠長以至於在人類基因組中係唯一的，然而，RNA/DNA相互作用的特異性不是絕對的，有時可以耐受明顯的混雜，尤其是在靶序列的5'一半處，這有效地減少了驅動特異性的鹼基的數目。對此的一種解決方案係使Cas9或Cpf1催化功能完全失活（僅保留RNA引導的DNA結合功能），而將FokI結構域與失活的Cas9融合；參見例如Tsai等人, Nature Biotech [自然•生物技術] 2014, 32: 569-76；以及Guilinger等人, Nature Biotech. [自然•生物技術], 2014, 32: 577-82。由於FokI必須二聚化才能變得有催化活性，因此需要兩種引導RNA來將兩種FokI融合物拴系在緊密接近的位置，以形成二聚體並切割DNA。這本質上使組合靶點中的鹼基數目加倍，從而提高被基於CRISPR的系統靶向的嚴格性。
作為另一實例，TALE DNA結合結構域與具有催化活性的HE（如I-TevI）的融合利用TALE的可調DNA結合和特異性，以及I-TevI的切割序列特異性，預期可以進一步減少脫靶切割。 鹼基編輯
在一些實施方式中，使用鹼基編輯在細胞中編輯基因。鹼基編輯係一種能夠將一種核苷酸轉化為另一種而在DNA中沒有雙鏈斷裂的技術。鹼基編輯允許將C轉換為T、將G轉換為A，反之亦然。胞嘧啶之示例性編輯器包括與催化失活形式的Cas9融合的rAPOBEC1。Cas9有助於結合目的位點，而rAPOBEC1胞苷脫胺酶誘導點突變。如本文所述，腺嘌呤的轉化需要突變體轉移RNA腺苷脫胺酶（TadA）、Cas9切口酶和sgRNA。該構建體能夠將位點特異性突變引入而不將鏈斷裂引入。在一些實施方式中，鹼基編輯用於在本文所述之細胞中引入一或多個突變。 RNA 引導的內切核酸酶
如本文所用的RNA引導的內切核酸酶系統可以包含與野生型示例性內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，US 2014/0068797序列ID號8或Sapranauskas等人, Nucleic Acids Res [核酸研究], 39 (21): 9275-9282 (2011)）具有至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。內切核酸酶可以包含與野生型內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，同上）在10個連續胺基酸上至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的同一性。內切核酸酶可以至多包含：與野生型內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，同上）在10個連續胺基酸上至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的同一性。內切核酸酶可以至少包含：與野生型內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，同上）在內切核酸酶的HNH核酸酶結構域中的10個連續胺基酸上至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的同一性。內切核酸酶可以至多包含：與野生型內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，同上）在內切核酸酶的HNH核酸酶結構域中的10個連續胺基酸上至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的同一性。內切核酸酶可以至少包含：與野生型內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，同上）在內切核酸酶的RuvC核酸酶結構域中的10個連續胺基酸上至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的同一性。內切核酸酶可以至多包含：與野生型內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，同上）在內切核酸酶的RuvC核酸酶結構域中的10個連續胺基酸上至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的同一性。
內切核酸酶可以包括野生型示例性內切核酸酶的修飾形式。野生型示例性內切核酸酶的修飾形式可以包含降低內切核酸酶的核酸切割活性的突變。野生型示例性內切核酸酶的修飾形式可以具有小於90%、小於80%、小於70%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於20%、小於10%、小於5%或小於1%的野生型示例性內切核酸酶（例如，來自釀膿鏈球菌的Cas9，同上）的核酸切割活性。內切核酸酶的修飾形式可以不具有顯著的核酸切割活性。當內切核酸酶係不具有顯著核酸切割活性的修飾形式時，在本文中將其稱為「酶促失活的」。
設想的突變可以包括取代、添加和缺失或其任何組合。突變將突變的胺基酸轉化為丙胺酸。突變將突變的胺基酸轉化為另一種胺基酸（例如，甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、組胺酸、離胺酸或精胺酸）。突變將突變的胺基酸轉化為非天然胺基酸（例如，硒代甲硫胺酸）。突變將突變的胺基酸轉化為胺基酸模擬物（例如，磷酸模擬物（phosphomimic））。突變可為保守突變。例如，突變將突變的胺基酸轉化為類似於突變胺基酸的大小、形狀、電荷、極性、構象和/或旋轉異構物的胺基酸（例如，半胱胺酸/絲胺酸突變、離胺酸/天冬醯胺突變、組胺酸/苯丙胺酸突變）。突變可以引起閱讀框的移位和/或提前終止密碼子的產生。突變可以引起影響一或多種基因表現的基因或基因座的調控區的改變。 引導 RNA
本揭露提供了引導RNA（gRNA），該等引導RNA可以將相關內切核酸酶的活性指向多核苷酸內的特定靶位點。引導RNA可以包含與目的靶核酸序列雜交的至少一個間隔子序列、和CRISPR重複序列。在II型CRISPR系統中，gRNA還包含稱為tracrRNA序列的第二RNA。在II型CRISPR引導RNA（gRNA）中，CRISPR重複序列和tracrRNA序列彼此雜交以形成雙鏈體。在V型CRISPR系統中，gRNA包含形成雙鏈體的crRNA。在一些實施方式中，gRNA可以結合內切核酸酶，使得gRNA和內切核酸酶形成複合體。gRNA可以由於其與內切核酸酶締合而為複合體提供靶標特異性。因此，靶向基因組的核酸可以指導內切核酸酶的活性。
示例性引導RNA包括包含15-200個核苷酸的間隔子序列，其中gRNA靶向基於GRCh38人類基因組組裝的基因組位置。如熟悉該項技術者所理解的，每種gRNA可以設計成包括與其基因組靶位點或區域互補的間隔子序列。參見Jinek等人, Science [科學], 2012, 337, 816-821和Deltcheva等人, Nature [自然], 2011, 471, 602-607。
gRNA可為雙分子引導RNA。gRNA可為單分子引導RNA。
雙分子引導RNA可以包含兩條RNA鏈。第一條鏈在5'至3'方向上包含視需要的間隔子延伸序列、間隔子序列和最小CRISPR重複序列。第二條鏈可以包含最小tracrRNA序列（與最小CRISPR重複序列互補）、3’ tracrRNA序列和視需要的tracrRNA延伸序列。
單分子引導RNA（sgRNA）在5'至3'方向上可以包含視需要的間隔子延伸序列、間隔子序列、最小CRISPR重複序列、單分子引導連接子、最小tracrRNA序列、3’ tracrRNA序列和視需要的tracrRNA延伸序列。視需要的tracrRNA延伸序列可以包含為引導RNA貢獻另外的功能（例如，穩定性）的元件。單分子引導連接子可以將最小CRISPR重複序列和最小tracrRNA序列連接起來以形成髮夾結構。視需要的tracrRNA延伸可以包含一或多個髮夾。
在一些實施方式中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含20個核苷酸的間隔子序列。在一些實施方式中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含少於20個核苷酸的間隔子序列。在一些實施方式中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含超過20個核苷酸的間隔子序列。在一些實施方式中，sgRNA在sgRNA序列的5’端包含具有17-30個核苷酸的可變長度的間隔子序列。在一些實施方式中，sgRNA包含長度超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200個核苷酸的間隔子延伸序列。在一些實施方式中，sgRNA包含長度少於3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個核苷酸的間隔子延伸序列。
在一些實施方式中，sgRNA包含含有另一部分（例如，穩定性控制序列、內切核糖核酸酶結合序列或核酶）的間隔子延伸序列。該部分可以減少或增加靶向核酸的核酸的穩定性。該部分可為轉錄終止子區段（即，轉錄終止序列）。該部分可以在真核細胞中起作用。該部分可以在原核細胞中起作用。該部分可以在真核細胞和原核細胞兩者中起作用。合適的部分之非限制性實例包括：5'帽（例如，7-甲基鳥苷酸帽（m7 G）），核糖開關序列（例如，允許蛋白和蛋白複合體調控穩定性和/或調控可及性），形成dsRNA雙鏈體的序列（即，髮夾），將RNA靶向亞細胞位置（例如，細胞核、粒線體、葉綠體等）的序列，提供跟蹤的修飾或序列（例如，直接與螢光分子軛合、與促進螢光檢測的部分軛合、允許進行螢光檢測的序列等），和/或為蛋白（例如，作用於DNA的蛋白，包括轉錄活化因子、轉錄阻遏因子、DNA甲基轉移酶、DNA脫甲基化酶、組蛋白乙醯轉移酶、組蛋白脫乙醯化酶等）提供結合位點的修飾或序列。
在一些實施方式中，sgRNA包含與靶多核苷酸中的序列雜交的間隔子序列。gRNA的間隔子可以經由雜交（即，鹼基配對）以序列特異性方式與靶多核苷酸相互作用。間隔子的核苷酸序列可以根據目的靶核酸的序列而變化。
在CRISPR-內切核酸酶系統中，間隔子序列可以設計成與位於系統中使用的內切核酸酶的PAM的5'的靶多核苷酸雜交。間隔子可以與靶序列完全匹配或可以有錯配。每種內切核酸酶（例如，Cas9核酸酶）都有特定的PAM序列，使得該內切核酸酶識別靶DNA。例如，釀膿鏈球菌Cas9識別包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N係任何核苷酸並且N緊鄰由間隔子序列靶向的靶核酸序列的3'。
靶多核苷酸序列可以包含20個核苷酸。靶多核苷酸可以包含少於20個核苷酸。靶多核苷酸可以包含超過20個核苷酸。靶多核苷酸可以包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。靶多核苷酸可以包含至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。靶多核苷酸序列可以包含緊鄰PAM的第一核苷酸的5'的20個鹼基。
與靶多核苷酸雜交的間隔子序列可以具有至少約6個核苷酸（nt）的長度。間隔子序列可為至少約6 nt、至少約10 nt、至少約15 nt、至少約18 nt、至少約19 nt、至少約20 nt、至少約25 nt、至少約30 nt、至少約35 nt或至少約40 nt、從約6 nt至約80 nt、從約6 nt至約50 nt、從約6 nt至約45 nt、從約6 nt至約40 nt、從約6 nt至約35 nt、從約6 nt至約30 nt、從約6 nt至約25 nt、從約6 nt至約20 nt、從約6 nt至約19 nt、從約10 nt至約50 nt、從約10 nt至約45 nt、從約10 nt至約40 nt、從約10 nt至約35 nt、從約10 nt至約30 nt、從約10 nt至約25 nt、從約10 nt至約20 nt、從約10 nt至約19 nt、從約19 nt至約25 nt、從約19 nt至約30 nt、從約19 nt至約35 nt、從約19 nt至約40 nt、從約19 nt至約45 nt、從約19 nt至約50 nt、從約19 nt至約60 nt、從約20 nt至約25 nt、從約20 nt至約30 nt、從約20 nt至約35 nt、從約20 nt至約40 nt、從約20 nt至約45 nt、從約20 nt至約50 nt或從約20 nt至約60 nt。在一些實例中，間隔子序列可以包含20個核苷酸。在一些實例中，間隔子可以包含19個核苷酸。在一些實例中，間隔子可以包含18個核苷酸。在一些實例中，間隔子可以包含22個核苷酸。
在一些實例中，間隔子序列與靶核酸之間的百分比互補性係至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%。在一些實例中，間隔子序列與靶核酸之間的百分比互補性係至多約30%、至多約40%、至多約50%、至多約60%、至多約65%、至多約70%、至多約75%、至多約80%、至多約85%、至多約90%、至多約95%、至多約97%、至多約98%、至多約99%或100%。在一些實例中，間隔子序列與靶核酸之間的百分比互補性在靶核酸互補鏈之靶序列的六個連續最5'核苷酸上為100%。間隔子序列與靶核酸之間的百分比互補性在約20個連續核苷酸上可為至少60%。間隔子序列和靶核酸的長度可以相差1至6個核苷酸，這可以被認為是一或多個突起。
tracrRNA序列可以包含與細胞中的最小CRISPR重複序列雜交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重複序列可以形成雙鏈體，即鹼基配對的雙鏈結構。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重複序列可以一起結合RNA引導的內切核酸酶。最小tracrRNA序列的至少一部分可以與最小CRISPR重複序列雜交。最小tracrRNA序列可以與最小CRISPR重複序列具有至少約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或100%的互補性。
最小tracrRNA序列可以具有從約7個核苷酸至約100個核苷酸的長度。例如，最小tracrRNA序列的長度可為從約7個核苷酸（nt）至約50 nt、從約7 nt至約40 nt、從約7 nt至約30 nt、從約7 nt至約25 nt、從約7 nt至約20 nt、從約7 nt至約15 nt、從約8 nt至約40 nt、從約8 nt至約30 nt、從約8 nt至約25 nt、從約8 nt至約20 nt、從約8 nt至約15 nt、從約15 nt至約100 nt、從約15 nt至約80 nt、從約15 nt至約50 nt、從約15 nt至約40 nt、從約15 nt至約30 nt或從約15 nt至約25 nt。最小tracrRNA序列的長度可為大約9個核苷酸。最小tracrRNA序列可為大約12個核苷酸。最小tracrRNA可以由Jinek等人（同上）中描述的tracrRNA nt 23-48組成。
最小tracrRNA序列可以與參考最小tracrRNA（例如，來自釀膿鏈球菌的野生型tracrRNA）序列在一段至少6、7、或8個連續核苷酸上具有至少約60%的同一性。例如，最小tracrRNA序列可以與參考最小tracrRNA序列在一段至少6、7、或8個連續核苷酸上具有至少約65%的同一性、約70%的同一性、約75%的同一性、約80%的同一性、約85%的同一性、約90%的同一性、約95%的同一性、約98%的同一性、約99%的同一性或100%的同一性。
最小CRISPR RNA與最小tracrRNA之間的雙鏈體包含雙螺旋。最小CRISPR RNA與最小tracrRNA之間的雙鏈體可以包含至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個核苷酸。最小CRISPR RNA與最小tracrRNA之間的雙鏈體可以包含至多約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個核苷酸。
雙鏈體可以包含錯配（即，雙鏈體的兩條鏈不是100%互補）。雙鏈體可以包含至少約1、2、3、4或5個或錯配。雙鏈體可以包含至多約1、2、3、4或5個或錯配。雙鏈體可以包含不超過2個錯配。
在一些實施方式中，tracrRNA可為3' tracrRNA。在一些實施方式中，3’ tracrRNA序列可以包含與參考tracrRNA序列（例如，來自釀膿鏈球菌的tracrRNA）具有至少約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或100%序列同一性的序列。
在一些實施方式中，gRNA可以包含tracrRNA延伸序列。tracrRNA延伸序列可以具有從約1個核苷酸至約400個核苷酸的長度。tracrRNA延伸序列可以具有超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200個核苷酸的長度。tracrRNA延伸序列可以具有從約20至約5000個或更多個核苷酸的長度。tracrRNA延伸序列可以具有少於5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個核苷酸的長度。tracrRNA延伸序列的長度可以包含少於10個核苷酸。tracrRNA延伸序列的長度可為10-30個核苷酸。tracrRNA延伸序列的長度可為30-70個核苷酸。
tracrRNA延伸序列可以包含功能部分（例如，穩定性控制序列、核酶、內切核糖核酸酶結合序列）。功能部分可以包含轉錄終止子區段（即，轉錄終止序列）。功能部分可以具有從約10個核苷酸（nt）至約100個核苷酸、從約10 nt至約20 nt、從約20 nt至約30 nt、從約30 nt至約40 nt、從約40 nt至約50 nt、從約50 nt至約60 nt、從約60 nt至約70 nt、從約70 nt至約80 nt、從約80 nt至約90 nt、或從約90 nt至約100 nt、從約15 nt至約80 nt、從約15 nt至約50 nt、從約15 nt至約40 nt、從約15 nt至約30 nt或從約15 nt至約25 nt的總長度。
在一些實施方式中，sgRNA可以包含長度為從約3個核苷酸至約100個核苷酸的連接模體列。在Jinek等人（同上）中，例如，使用簡單的4個核苷酸的「四環」（-GAAA-）（Jinek等人, Science [科學], 2012, 337 (6096): 816-821）。說明性連接子具有從約3個核苷酸（nt）至約90 nt、從約3 nt至約80 nt、從約3 nt至約70 nt、從約3 nt至約60 nt、從約3 nt至約50 nt、從約3 nt至約40 nt、從約3 nt至約30 nt、從約3 nt至約20 nt、從約3 nt至約10 nt的長度。例如，連接子可以具有約3個nt至約5個nt、約5個nt至約10個nt、約10個nt至約15個nt、約15個nt至約20個nt、約20個nt至約25個nt、約25個nt至約30個nt、約30個nt至約35個nt、約35個nt至約40個nt、約40個nt至約50個nt、約50個nt至約60個nt、約60個nt至約70個nt、約70個nt至約80個nt、約80個nt至約90個nt或約90個nt至約100個nt的長度。單分子引導核酸的連接子可以在4與40個核苷酸之間。連接子可為至少約100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000個或更多個核苷酸。連接子可為至多約100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000個或更多個核苷酸。
連接子可以包含多種序列中的任一種，但在一些實例中，連接子將不含與引導RNA的其他部分具有同源性的廣泛區域的序列，否則可能引起可以干擾該嚮導的其他功能區域的分子內結合。在Jinek等人（同上）中，使用簡單的4個核苷酸的序列-GAAA-（Jinek等人, Science [科學], 2012, 337 (6096): 816-821），但是同樣可以使用許多其他序列，包括更長的序列。
連接模體列可以包含功能部分。例如，連接模體列可以包含一或多個特徵，包括適體、核酶、蛋白相互作用髮夾、蛋白結合位點、CRISPR陣列、內含子或外顯子。連接模體列可以包含至少約1、2、3、4或5個或更多個功能部分。在一些實例中，連接模體列可以包含至多約1、2、3、4或5個或更多個功能部分。
在一些實施方式中，sgRNA例如在sgRNA序列的3’端不含尿嘧啶。在一些實施方式中，sgRNA例如在sgRNA序列的3’端包含一或多個尿嘧啶。在一些實施方式中，sgRNA在sgRNA序列的3’端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個尿嘧啶（U）。
可以對sgRNA進行化學修飾。在一些實施方式中，經化學修飾的gRNA係包含具有化學修飾（例如，2′-O-甲基糖修飾）的至少一個核苷酸的gRNA。在一些實施方式中，經化學修飾的gRNA包含經修飾的核酸骨架。在一些實施方式中，經化學修飾的gRNA包含2'-O-甲基-硫代磷酸酯殘基。在一些實施方式中，化學修飾增強穩定性，降低先天性免疫反應的可能性或程度，和/或增強其他屬性，如本領域中所述之。
在一些實施方式中，經修飾的gRNA可以包含經修飾的骨架，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、𠰌啉代、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環烷基糖間鍵或者短鏈雜原子或雜環糖間鍵。
基於𠰌啉代的化合物在以下文獻中有描述：Braasch和David Corey, Biochemistry [生物化學], 2002, 41 (14): 4503-4510；Genesis [創世紀], 2001, 第30卷, 第3期；Heasman, Dev. Biol. [發育生物學], 2002, 243: 209-214；Nasevicius等人, Nat. Genet. [自然•遺傳學], 2000, 26: 216-220；Lacerra等人, Proc. Natl. Acad. Sci. [美國國家科學院院刊], 2000, 97: 9591-9596.；以及1991年7月23日發佈的美國專利案號5,034,506。
環己烯基核酸寡核苷酸模擬物在Wang等人, J. Am. Chem. Soc. [美國化學學會雜誌], 2000, 122: 8595-8602中有描述。
在一些實施方式中，經修飾的gRNA可以在2'位置處包含一或多個取代的糖部分，例如以下之一：OH、SH、SCH 3、F、OCN、OCH 3、OCH 3O(CH 2) nCH 3、O(CH 2) nNH 2或O(CH 2) nCH 3，其中n為1至約10；C1至C10低級烷基、烷氧基烷氧基、經取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF 3；OCF 3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH 3；SO 2CH 3；ONO 2；NO 2；N 3；NH 2；雜環烷基；雜環烷芳基；胺基烷基胺基；聚烷基胺基；經取代的矽基；RNA切割基團；報告基團；嵌入劑；2'-O-(2-甲氧基乙基)；2'-甲氧基（2'-O-CH 3）；2'-丙氧基（2'-OCH 2CH 2CH 3）；以及2'-氟（2'-F）。類似的修飾也可以在gRNA的其他位置進行，特別是3'末端核苷酸上的糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置。在一些實例中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵（即主鏈）均可被新基團替代。
引導RNA還可以另外地或替代性地包括核鹼基（在本領域中通常簡稱為「鹼基」）修飾或取代。如本文所用，「未經修飾的」或「天然的」核鹼基包括腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。經修飾的核鹼基包括僅在天然核酸中很少或暫態發現的核鹼基，例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶（特別是5-甲基胞嘧啶（也稱為5-甲基-2'去氧胞嘧啶，並且在本領域中通常稱為5-Me-C））、5-羥甲基胞嘧啶（HMC）、糖基HMC和龍膽二糖基（gentobiosyl）HMC）、以及合成的核鹼基（例如，2-胺基腺嘌呤、2-(甲基胺基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(胺基烷基胺基)腺嘌呤或其他雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N6(6-胺基己基)腺嘌呤、和2,6-二胺基嘌呤）。Kornberg, A., DNA Replication [DNA複製], 三藩市W. H. 弗裡曼公司（W. H. Freeman & Co., San Francisco）, 第75-77頁, 1980；Gebeyehu等人, Nucl. Acids Res. [核酸研究] 1997, 15: 4513。也可以包括本領域已知的「通用」鹼基，例如肌苷。已顯示5-Me-C取代使核酸雙鏈體穩定性提高0.6°C-1.2°C。（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. 和Lebleu, B. 編輯, Antisense Research and Applications [反義研究與應用], 波卡拉頓CRC出版社（CRC Press, Boca Raton）, 1993, 第276-278頁）係鹼基取代的方面。
經修飾的核鹼基可以包括其他合成的和天然的核鹼基，如5-甲基胞嘧啶（5-me-C），5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-胺基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵基特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤，以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。 基因組靶向核酸和內切核酸酶的複合體
gRNA與內切核酸酶（例如，RNA引導的核酸酶，如Cas9）相互作用，從而形成複合體。gRNA將內切核酸酶引導至靶多核苷酸。
內切核酸酶和gRNA可以各自分別投與至細胞或受試者。在一些實施方式中，內切核酸酶可以與一或多種引導RNA、或者一或多種crRNA以及tracrRNA預複合。然後可以將預複合材料投與至細胞或受試者。這種預複合材料稱為核糖核蛋白顆粒（RNP）。RNP中的內切核酸酶可為例如Cas9內切核酸酶或Cpf1內切核酸酶。內切核酸酶可以在N末端、C末端或N末端和C末端兩者側接有一或多個核定位訊息（NLS）。例如，Cas9內切核酸酶可以側接有兩個NLS，一個NLS位於N末端並且第二NLS位於C末端。NLS可為本領域已知的任何NLS，如SV40 NLS。RNP中靶向基因組的核酸與內切核酸酶之重量比可為1 : 1。例如，RNP中sgRNA與Cas9內切核酸酶之重量比可為1 : 1。 細胞
本文提供具有本文所述之任何基因編輯的本文所述之任何細胞。在一些實施方式中，細胞（和相應的未修飾的細胞）係哺乳動物細胞。在一些實施方式中，細胞（和相應的未修飾細胞）係人細胞。在一些實施方式中，細胞（和相應的未修飾的細胞）係幹細胞。在一些實施方式中，細胞（和相應的未修飾細胞）係多能幹細胞（PSC）。在一些實施方式中，細胞（和相應的未修飾的細胞）係胚胎幹細胞（ESC）、成體幹細胞（ASC）、誘導多能幹細胞（iPSC）或造血幹細胞或先驅細胞（HSPC）。在一些實施方式中，細胞係iPSC。在一些實施方式中，細胞可為分化細胞。在一些實施方式中，細胞係體細胞，例如免疫系統細胞，或收縮細胞，例如骨骼肌細胞。
在一些實施方式中，本文所述之幹細胞（例如iPSC）如本文所述進行基因編輯，然後分化成目的細胞類型。在一些實施方式中，分化的細胞保持其所來源的細胞的所有基因編輯。
本文所述之細胞可分化成相關細胞類型。通常，分化包括在足以使細胞分化成目的分化細胞的時間段和條件下保持目的細胞。例如，可以使本文揭露的工程化幹細胞分化成間充質先驅細胞（MPC）、低免疫性心肌細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞、內皮細胞（EC）、巨噬細胞、自然殺手細胞、肝細胞、β細胞（例如，胰腺β細胞）、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞或神經先驅細胞（NPC）。在一些實施方式中，本文所述之任何幹細胞在基因編輯後分化。在一些實施方式中，細胞分化成自然殺手（NK）細胞。
幹細胞既能增殖又能產生更多的先驅細胞，該等先驅細胞反過來又具有產生大量母細胞的能力，該等母細胞反過來又能產生分化的或可分化的子細胞。子細胞本身可以被誘導增殖並產生後代，該等後代隨後分化成一或多種成熟細胞類型，同時還保留了一或多種具有親代發育潛能的細胞。因此，術語「幹細胞」係指在特定情況下具有分化成更專門化或更分化的表型的能力或潛力，並且在某些情況下在無實質分化的情況下仍保持增殖的能力的細胞。在一方面，術語先驅細胞或幹細胞係指廣義的母細胞，該母細胞的子代（後代）通常在不同的方向上藉由如在胚胎細胞和組織的逐漸多樣化中發生的分化（例如，藉由獲得完全獨立的特徵）而專門化。細胞分化係通常通過許多細胞分裂發生的複雜過程。分化細胞可以源自多潛能細胞，該多潛能細胞本身也源自多潛能細胞等。雖然該等多潛能細胞中的每一個都可以被認為是幹細胞，但每個多潛能細胞所能產生的細胞類型範圍卻可能變化很大。一些分化細胞也具有產生更大發展潛力的細胞的能力。這種能力可為天然的，或者也可以在用各種因素處理後被人工誘導。在許多生物學實例中，幹細胞也可為「多潛能的」，因為它們可以產生超過一種不同細胞類型的後代，但是這不是「幹性」所必需的。
「分化細胞」係比與之比較的細胞在發育途徑中進一步發展的細胞。因此，幹細胞可以分化成譜系限制性先質細胞（諸如造血幹細胞和先驅細胞（HSPC）），該等先質細胞反過來又可以分化成沿途徑進一步分化的其他類型的先質細胞（諸如共同淋巴樣先驅細胞），然後分化成終末期分化細胞（諸如自然殺手細胞），該終末期分化細胞在某些組織類型中起特定作用，並且可以保留或可以不保留進一步增殖的能力。
在一些實施方式中，本文所述之任何經基因編輯的細胞具有以下特徵中的一或多個；增加的持久性、免疫逃避性、缺乏同種免疫T細胞響應、增加的細胞毒活性、改善的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或增加的抗腫瘤活性。在一些實施方式中，相對於本文所述之未編輯的（野生型）細胞，本文所述之任何經基因編輯的細胞具有以下特徵中的一或多個；增加的持久性、免疫逃避性、缺乏同種免疫T細胞響應、增加的細胞毒活性、改善的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或增加的抗腫瘤活性。在一些實施方式中，本文所述之任何經基因編輯的細胞能夠在不存在外源IL15的情況下進行細胞擴增。 胚胎幹細胞
本文所述之細胞可為胚胎幹細胞（ESC）。ESC源自哺乳動物胚胎的胚細胞，並且能夠分化成任何細胞類型並快速增殖。據信ESC也具有正常的核型，保持高端粒酶活性，並展現出顯著的長期增殖潛力，從而使該等細胞成為用作經基因編輯的幹細胞的優異候選物。在一些實施方式中，具有以下編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部的ESC分化成NK細胞： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null。 成體幹細胞
本文所述之細胞可為成體幹細胞（ASC）。ASC係可以在哺乳動物（例如，人）中發現的未分化細胞。ASC藉由其自我更新（例如，藉由若干輪細胞複製傳代同時保持其未分化狀態）的能力和分化成若干種不同細胞類型（例如，神經膠質細胞）的能力來定義。成體幹細胞係一類廣泛的幹細胞，其可以包括造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間充質幹細胞、內皮幹細胞、神經幹細胞、嗅覺成體幹細胞、神經脊幹細胞和睪丸細胞。在一些實施方式中，具有以下編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部的ASC分化成NK細胞： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null。 誘導多能幹細胞
本文所述之細胞可為誘導多能幹細胞（iPSC）。藉由將編碼參與多能性的關鍵轉錄因子的基因（例如，Oct4、Sox2、cMyc和Klf4）引入，可以直接從成體人細胞生成iPSC。iPSC可以源自待投與後續先驅細胞的同一受試者。也就是說，可以從受試者獲得體細胞，將其重程式設計為誘導多能幹細胞，然後再分化成待投與至受試者的先驅細胞（例如，自體細胞）。然而，在自體細胞的情況下，仍然存在植入後免疫反應和活力差的風險。在一些實施方式中，使用本領域已知的遺傳重程式設計方法從成體體細胞生成iPSC。在一些實施方式中，iPSC源自商業來源。在一些實施方式中，本文所述之細胞係iPSC或衍生細胞。在一些實施方式中，具有以下編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部的iPSC分化成NK細胞： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null。 中胚層
本文所述之細胞可為中胚層細胞。這種細胞類型係胚胎發育中的三個胚層之一。中胚層最終分化成但不限於肌肉、結締組織、骨骼、紅血球、白血球和小膠質細胞。在一些實施方式中，本文所述之經基因編輯的細胞係中胚層細胞。在一些實施方式中，中胚層細胞源自本文所述之任何幹細胞。在一些實施方式中，中胚層細胞源自iPSC。在一些實施方式中，中胚層細胞具有本文所述之任何基因編輯。在一些實施方式中，中胚層細胞分化成NK細胞。在一些實施方式中，具有以下編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部的中胚層細胞分化成NK細胞： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null。 生血內皮
本文所述之細胞可為生血內皮（HE）細胞。這種細胞類型係造血先驅細胞的中間先質。在一些實施方式中，本文所述之細胞係生血內皮細胞。在一些實施方式中，本文所述之經基因編輯的細胞係生血內皮細胞。在一些實施方式中，生血內皮細胞源自本文所述之任何幹細胞。在一些實施方式中，生血內皮細胞源自iPSC。在一些實施方式中，生血內皮細胞具有本文所述之任何基因編輯。在一些實施方式中，生血內皮細胞分化成NK細胞。在一些實施方式中，具有以下編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部的HE細胞分化成NK細胞： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null。 人造血幹細胞和先驅細胞
本文所述之細胞可為人造血幹細胞和先驅細胞（hHSPC）。該幹細胞譜系產生所有血細胞類型，包括紅系細胞（紅血球（erythrocyte）或紅血球（RBC））、骨髓細胞（單核細胞和巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、巨核細胞/血小板和樹突細胞）和淋巴樣細胞（T細胞、B細胞、NK細胞）。血細胞由非常小的多能造血幹細胞（HSC）群的增殖和分化產生，該等多能造血幹細胞也具有藉由自我更新以補充自身的能力。在分化過程中，HSC的後代在達到成熟前經歷各種中間成熟階段，產生多潛能先驅細胞和譜系定向先驅細胞。骨髓（BM）係人體內血細胞生成的主要部位，並且在正常條件下，僅有少量造血幹細胞和先驅細胞（HSPC）可見於周邊血（PB）。用細胞介素、用於癌症治療的一些骨髓抑制藥物以及破壞造血細胞與BM基質細胞之間的相互作用的化合物進行處理可快速動員大量幹細胞和先驅細胞進入循環。在一些實施方式中，HSPC源自本文所述之任何幹細胞。在一些實施方式中，HSPC源自iPSC。在一些實施方式中，HSPC具有本文所述之任何基因編輯。在一些實施方式中，HSPC細胞分化成NK細胞。在一些實施方式中，具有以下編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部的 HSPC分化成NK細胞： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null。 共同淋巴樣先驅細胞
本文所述之細胞可為共同淋巴樣先驅細胞（CLP）。CLP係HSPC的後代。該等細胞分化成血細胞的淋巴譜系。進一步分化產生B細胞先驅細胞、自然殺手細胞和胸腺細胞。在一些實施方式中，本文所述之細胞係共同淋巴樣先驅細胞。在一些實施方式中，本文所述之經基因編輯的細胞係共同淋巴樣先驅細胞。在一些實施方式中，CLP細胞源自iPSC。在一些實施方式中，CLP細胞具有本文所述之任何基因編輯。在一些實施方式中，CLP細胞分化成NK細胞。在一些實施方式中，具有以下編輯中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部的CLP細胞分化成NK細胞： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null。 細胞向其他細胞類型的分化
本揭露之方法的另一個步驟可以包括使細胞分化成分化細胞。可以根據本領域已知的任何方法來進行分化步驟。例如，使用本領域已知的方法將人iPSC分化成自然殺手細胞。在一些實施方式中，分化步驟可根據Zhu和Kaufman, bioRxiv2019; dx.doi.org/10.1101/614792進行。分化細胞可為哺乳動物（例如，人）的任何體細胞。在一些實施方式中，體細胞可為內分泌上皮細胞（例如，甲狀腺激素分泌細胞、腎上腺皮質細胞）、外分泌上皮細胞（例如，唾液腺黏液細胞、前列腺細胞）、激素分泌細胞（例如，垂體前葉細胞、胰島細胞）、角化上皮細胞（例如，表皮角質形成細胞）、濕分層屏障上皮細胞、感覺轉導細胞（例如，光感受器）、自主神經元細胞、感覺器官和周圍神經元支援細胞（例如，施萬（Schwann）細胞）、中樞神經系統神經元、神經膠質細胞（例如，星狀細胞、寡樹突膠細胞）、晶狀體細胞、脂肪細胞、腎細胞、屏障功能細胞（例如，導管細胞）、細胞外基質細胞、收縮細胞（例如，骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞）、血細胞（例如，紅血球）、免疫系統細胞（例如，巨核細胞、小神經膠質細胞、嗜中性球、肥大細胞、T細胞、B細胞、自然殺手細胞）、生殖細胞（例如，精子細胞）、營養細胞或間質細胞。在一些實施方式中，本文所述之任何幹細胞分化成NK細胞。在一些實施方式中，本文所述之任何衍生細胞類型分化成NK細胞。
在一些實施方式中，本文提供了用於從幹細胞生成自然殺手（NK）細胞之方法。該方法包括：(a) 在足以形成聚集體的條件下，在包含ROCK抑制劑的第一培養基中培養幹細胞群體；(b) 在包含BMP-4的第二培養基中培養該等聚集體；(c) 在包含BMP-4、FGF2、WNT通路活化劑和活化素A的第三培養基中培養該等聚集體；(d) 在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3、FLT3L、WNT C-59和活化素/nodal抑制劑的第四培養基中培養該等聚集體以形成包含造血幹細胞和先驅細胞（HSPC）的細胞群體；(e) 在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3和FLT3L的第五培養基中培養該細胞群體；(f) 在包含IL-3、IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第六培養基中培養該細胞群體；(g) 在包含IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第七培養基中培養該細胞群體足以生成NK細胞的時間。在一些實施方式中，該方法包括 (a) 在足以形成聚集體的條件下，在包含ROCK抑制劑的第一培養基中培養幹細胞群體；(b) 在包含BMP-4的第二培養基中培養該等聚集體；(c) 在包含BMP-4、FGF2、WNT通路活化劑和活化素A的第三培養基中培養該等聚集體；(d) 在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3、FLT3L和活化素/nodal抑制劑的第四培養基中培養該等聚集體以形成包含造血幹細胞和先驅細胞（HSPC）的細胞群體；(e) 在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3和FLT3L的第五培養基中培養該細胞群體；(f) 在包含IL-3、IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第六培養基中培養該細胞群體；(g) 在包含IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第七培養基中培養該細胞群體，以及 (h) 在包含IL-7、FLT3L、IL-15、SCF和菸鹼醯胺的第八培養基中培養該細胞群體足以生成NK細胞的時間。在一些實施方式中，該方法包括 (a) 在足以形成聚集體的條件下，在包含ROCK抑制劑的第一培養基中培養幹細胞群體；(b) 在包含BMP-4的第二培養基中培養該等聚集體；(c) 在包含BMP-4、FGF2、WNT通路活化劑和活化素A的第三培養基中培養該等聚集體；(d) 在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3、FLT3L和活化素/nodal抑制劑的第四培養基中培養該等聚集體以形成包含造血幹細胞和先驅細胞（HSPC）的細胞群體；(e) 在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3和FLT3L的第五培養基中培養該細胞群體；(f) 在包含IL-3、IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第六培養基中培養該細胞群體；(g) 在包含IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第七培養基中培養該細胞群體，以及 (h) 在包含IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第八培養基中培養該細胞群體足以生成NK細胞的時間。在一些實施方式中，第二培養基進一步包含ROCK抑制劑。在一些實施方式中，ROCK抑制劑係噻唑維林（thiazovivin）。在一些實施方式中，ROCK抑制劑係Y27652。在一些實施方式中，WNT通路活化劑係CHIR-99021。在一些實施方式中，活化素/nodal抑制劑係SB-431542。
在一些實施方式中，步驟 (a)-(g) 發生在20-35天之間。在一些實施方式中，步驟 (a) 包括培養12-48小時。在一些實施方式中，步驟 (b) 包括培養長達24小時。在一些實施方式中，步驟 (c) 包括培養1-3天。在一些實施方式中，步驟 (d) 包括培養1-3天。在一些實施方式中，步驟 (e) 包括培養1-3天。在一些實施方式中，步驟 (f) 包括培養長達7天。在一些實施方式中，步驟 (g) 包括培養至少6天並且總共長達21-28天。在一些實施方式中，步驟 (a) 包括培養16-20小時；步驟 (b) 包括培養6-10小時；步驟 (c) 包括培養2天；步驟 (d) 包括培養2天；步驟 (e) 包括培養2天；步驟 (f) 包括培養4天；和/或步驟 (g) 包括培養14-28天。
在一些實施方式中，步驟 (a)-(h) 發生在19至36天之間。在一些實施方式中，步驟 (a)-(h) 發生在19至33天之間。在一些實施方式中，步驟 (a)-(h) 發生在24至36天之間。在一些實施方式中，步驟 (a) 包括培養12-48小時。在一些實施方式中，步驟 (b) 包括培養長達24小時。在一些實施方式中，步驟 (c) 包括培養1-3天。在一些實施方式中，步驟 (d) 包括培養1-3天。在一些實施方式中，步驟 (e) 包括培養1-3天。在一些實施方式中，步驟 (f) 包括培養長達7天。在一些實施方式中，步驟 (g) 包括培養長達6天。在一些實施方式中，步驟 (h) 包括培養至少6天並且總共長達10-16天。在一些實施方式中，步驟 (a) 包括培養16-20小時；步驟 (b) 包括培養6-10小時；步驟 (c) 包括培養2天；步驟 (d) 包括培養2天；步驟 (e) 包括培養2天；步驟 (f) 包括培養4天；步驟 (g) 包括培養6天和/或步驟 (h) 包括培養10-16天。
在一些實施方式中，該方法在懸浮攪拌下進行。在一些實施方式中，懸浮攪拌包括旋轉。在一些實施方式中，第一培養基包括StemFlex或StemBrew培養基。在一些實施方式中，第二培養基、第三培養基、第四培養基和第五培養基包括APEL培養基。在一些實施方式中，第六培養基和第七培養基可以包括DMEM/F12培養基。在一些方面，第六培養基和第七培養基包括DMEM（高葡萄糖）/F12培養基。在一些實施方式中，第六培養基和第七培養基包含人血清（例如，濃度為10%-20%）、硫酸鋅（例如，濃度為約20-40 μM）、乙醇胺（例如，濃度為約10-100 μM）、β-巰基乙醇（例如，濃度為約0.1-5 μM）、葡萄糖（例如，總濃度為2-40 mM）或其任何組合。在一些實施方式中，第六培養基和第七培養基包含人血清（例如，濃度為15%）、硫酸鋅（例如，濃度為約36或37 μM）、乙醇胺（例如，濃度為約50 μM）、β-巰基乙醇（例如，濃度為約1 μM）、葡萄糖（例如，總濃度為27 mM）或其任何組合。在一些實施方式中，第六培養基和第七培養基包含人血清（例如，濃度為約10%-40%）、硫酸鋅（例如，濃度為約20-40 μM）、乙醇胺（例如，濃度為約10-100 μM）、葡萄糖（例如，總濃度為約2-40 mM）或其任何組合。在一些實施方式中，第六培養基和第七培養基包含人血清（例如，濃度為約20%）、硫酸鋅（例如，濃度為約37 μM）、乙醇胺（例如，濃度為約50 μM）、葡萄糖（例如，總濃度為約20 mM）或其任何組合。在一些實施方式中，第八培養基包含人血清（例如，濃度為約2%-15%）、硫酸鋅（例如，濃度為約20-40 μM）、乙醇胺（例如，濃度為約10-100 μM）、葡萄糖（例如，總濃度為約2-40 mM）或其任何組合。在一些實施方式中，第八培養基可以包括DMEM/F12培養基。在一些方面，第八培養基包括DMEM（高葡萄糖）/F12培養基。在一些實施方式中，第八培養基包含人血清（例如，濃度為約10%）、硫酸鋅（例如，濃度為約37 μM）、乙醇胺（例如，濃度為約50 μM）、葡萄糖（例如，總濃度為約20 mM）或其任何組合。在本文提供的第六培養基、第七培養基和第八培養基的任一者中，總葡萄糖濃度包含來自所有來源的葡萄糖，包括存在於基礎培養基中的葡萄糖和任何添加的葡萄糖。在本文提供的第六培養基、第七培養基和第八培養基中的每一者中，可將另外的葡萄糖添加到含葡萄糖的基礎培養基（例如DMEM、F12或DMEM（高葡萄糖）/F12培養基）中以達到「總」葡萄糖濃度。在一些實施方式中，將約10.25 mM的葡萄糖添加到第六培養基或第七培養基的基礎培養基中以達到約27 mM的總葡萄糖濃度。在一些實施方式中，將約4.66 mM的葡萄糖添加到第六培養基或第七培養基的基礎培養基中以達到約20 mM的總葡萄糖濃度。在一些實施方式中，將約2.33 mM的葡萄糖添加到第八培養基的基礎培養基中以達到約20 mM的總葡萄糖濃度。在一些實施方式中，第一培養基包含10 µM ROCK抑制劑。在一些實施方式中，第二培養基包含30 ng/mL BMP-4。在一些實施方式中，第二培養基包含30 ng/mL BMP-4和10 µM ROCK抑制劑。在一些實施方式中，第三培養基包含30 ng/mL BMP-4、100 ng/mL FGF2、6 µM CHIR-99021和2.5-5 ng/mL活化素A。在一些實施方式中，第三培養基包含30 ng/mL BMP-4、100 ng/mL FGF2、7 µM CHIR-99021和2.5-5 ng/mL活化素A。
在一些實施方式中，將一半的第三培養基添加到幹細胞聚集體中。在一些實施方式中，第四培養基和第五培養基包含20 ng/mL FGF、20 ng/mL VEGF、20 ng/mL TPO、100 ng/mL SCF、40 ng/mL IL-3和10-20 ng/mL FLT3L。在一些實施方式中，第四培養基進一步包含2 µM WNT C-59和5 µM SB-431542。在一些實施方式中，第四培養基進一步包含5 µM SB-431542。在一些實施方式中，第四培養基不含WNT C-59。在一些實施方式中，第六培養基和第七培養基包含20 ng/mL IL-7、10-20 ng/mL FLT3L、10-20 ng/mL IL-15和20 ng/mL SCF。在一些實施方式中，第六培養基包含5 ng/mL IL-3。在一些實施方式中，第八培養基包含IL-7、FLT3L、IL-15、SCF和菸鹼醯胺。在各種實施方式中，第八培養基包含10-20 ng/mL IL-7、5-20 ng/mL FLT3L、10-30 ng/mL IL-15、20-40 ng/mL SCF和1-15 mM菸鹼醯胺。在各種實施方式中，第八培養基包含10 ng/mL IL-7、7.5 ng/mL FLT3L、15 ng/mL IL-15、20 ng/mL SCF和6.5 mM菸鹼醯胺。在一些實施方式中，第八培養基包含IL-7、FLT3L、IL-15和SCF。在各種實施方式中，第八培養基包含10-20 ng/mL IL-7、5-20 ng/mL FLT3L、10-30 ng/mL IL-15和20-40 ng/mL SCF。在各種實施方式中，第八培養基包含10 ng/mL IL-7、7.5 ng/mL FLT3L、15 ng/mL IL-15和20 ng/mL SCF。在一些實施方式中，第八培養基不含菸鹼醯胺。
在一些實施方式中，步驟 (d) 之HSPC表現CD34。在一些實施方式中，NK細胞表現CD56。在一些實施方式中，NK細胞表現至少一種活化受體。在一些實施方式中，該至少一種活化受體選自下組：NKp44、NKp46、CD16、KIR2DL4及其任何組合。在一些實施方式中，NK細胞表現至少一種抑制性受體。在一些實施方式中，該至少一種抑制性受體選自下組：CD94、NKG2A、KIR3DL2及其任何組合。
在一些實施方式中，NK細胞包括至少一種與內源NK細胞相關的功能。在一些實施方式中，該至少一種功能包括誘導靶細胞之細胞裂解和細胞死亡的能力。在一些實施方式中，該至少一種功能包括去顆粒。在一些實施方式中，去顆粒包括穿孔素和顆粒酶B的釋放。在一些實施方式中，去顆粒包括在NK細胞之細胞表面上表現CD107a。
在一些實施方式中，幹細胞群體係工程化細胞群體，諸如藉由本文揭露的方法生成或獲得的工程化細胞。在一些實施方式中，工程化細胞群體藉由本文揭露的從幹細胞生成自然殺手（NK）細胞的方法分化。
在一些實施方式中，藉由本文揭露的從幹細胞生成自然殺手（NK）細胞的方法產生或獲得多個自然殺手（NK）細胞。本文還揭露了用於治療有需要的受試者的多種NK細胞。在一些實施方式中，受試者係患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險的人。本文還揭露了一種包括向受試者投與多種NK細胞之方法。 自然殺手細胞
自然殺手（NK）細胞係在先天免疫系統中起關鍵作用的淋巴細胞亞群。NK細胞對多種細胞具有細胞毒性，包括但不限於腫瘤細胞和病毒感染的細胞。在一些實施方式中，本文所述之幹細胞分化成自然殺手細胞。在一些實施方式中，iPSC分化成NK細胞。在一些實施方式中，與未編輯或野生型NK細胞相比，工程化NK細胞（例如藉由分化源自基因編輯的iPSC的細胞，即iNK細胞）具有增強的抗腫瘤活性。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）NK細胞，工程化NK細胞的抗腫瘤活性增加至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%或至少90%。
在一些實施方式中，相對於對照細胞，工程化NK細胞表現出增加的細胞裂解能力。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出細胞裂解能力增加至少10%（殺傷至少10%以上的靶細胞），或細胞裂解能力增加至少20%（殺傷至少20%以上的靶細胞）。例如，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞之細胞裂解能力可表現出增加至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%或至少90%。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞之細胞裂解能力表現出增加20%-100%、20%-90%、20%-80%、20%-70%、20%-60%、20%-50%、30%-100%、30%-90%、30%-80%、30%-70%、30%-60%、30%-50%、40%-100%、40%-90%、40%-80%、40%-70%、40%-60%、40%-50%、50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%或50%-60%。在一些實施方式中，靶細胞係T細胞。在一些實施方式中，靶細胞係癌細胞。在一些實施方式中，靶細胞係白血病細胞。在一些實施方式中，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約0.1 : 1下觀察到。在一些實施方式中，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約0.5 : 1下觀察到。在一些實施方式中，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約1 : 1下觀察到。在一些實施方式中，當靶細胞係K562時並且當將細胞共培養例如24小時時，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約0.1 : 1下觀察到。在一些實施方式中，當靶細胞係K562時並且當將細胞共培養例如24小時時，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約0.5 : 1下觀察到。在一些實施方式中，當靶細胞係K562時並且當將細胞共培養例如24小時時，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約1 : 1下觀察到。在一些實施方式中，當靶細胞係RPMI時並且當將細胞共培養例如24小時時，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約0.1 : 1下觀察到。在一些實施方式中，當靶細胞係RPMI時並且當將細胞共培養例如24小時時，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約0.5 : 1下觀察到。在一些實施方式中，當靶細胞係RPMI時並且當將細胞共培養例如24小時時，細胞裂解能力的這種增加在E : T（效應細胞 : 靶細胞）比為等於或約1 : 1下觀察到。
在一些實施方式中，工程化NK細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或全部：CD45、CD56、CD94、NKG2A、CD16、NKp44、NKp46、KIR2DL4和KIR3DL2，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在未編輯或野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%、75%、80%、90%、95%或100%或更高的水平表現。在一些實施方式中，工程化NK細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種、四種、五種或全部：CD56、NKp44、NKp46、CD94、NKG2A和KIR2DL4，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在未編輯或野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%、75%、80%、90%、95%或100%或更高的水平表現。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%之表現以下標誌物中的一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或全部的細胞群體：CD45、CD56、CD94、NKG2A、CD16、NKp44、NKp46、KIR2DL4和KIR3DL2。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%之表現以下標誌物中的一種、兩種、三種、四種、五種或全部的細胞群體：CD56、NKp44、NKp46、CD94、NKG2A和KIR2DL4。
在一些實施方式中，工程化NK細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種或全部：CD38、CD96、DNAM-1和ICAM-1，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在未編輯或野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%、75%、80%、90%、95%或100%的水平或更高表現。在一些實施方式中，工程化NK細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種或全部：CD38、CD96、DNAM-1和ICAM-1，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在未編輯或野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%、75%、80%、90%、95%或100%的水平或更高表現。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%之表現以下標誌物中的一種、兩種、三種或全部的細胞群體：CD38、CD96、DNAM-1和ICAM-1。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%之表現以下標誌物中的一種、兩種、三種或全部的細胞群體：CD38、CD96、DNAM-1和ICAM-1。
在一些實施方式中，工程化NK細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種或全部：NKG2D、TIM3、CD16和CD25，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在未編輯或野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%、75%、80%、90%、95%或100%的水平或更高表現。在一些實施方式中，工程化NK細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種或全部：NKG2D、TIM3、CD16和CD25，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在未編輯或野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%、75%、80%、90%、95%或100%的水平或更高表現。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%之表現以下標誌物中的一種、兩種、三種或全部的細胞群體：NKG2D、TIM3、CD16和CD25。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%之表現以下標誌物中的一種、兩種、三種或全部的細胞群體：NKG2D、TIM3、CD16和CD25。
在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出增加的細胞介素分泌。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出大致相同的細胞介素分泌水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出降低（例如，降低小於10%、小於20%、小於30%、小於40%或小於50%）的細胞介素分泌水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出降低（例如，降低超過20%、超過30%、超過40%、超過50%或超過75%）的細胞介素分泌水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出增加（例如，增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%）的細胞介素分泌水平。被測量的細胞介素可為但不限於以下中的任何一或多種：TNFα、IFNγ和IL-7。在一些實施方式中，當將細胞與靶細胞以等於或約0.1 : 1的E : T比共培養時，由工程化NK細胞分泌的細胞介素（例如TNFα、IFNγ和IL-7）的水平與對照（例如未編輯或野生型）細胞中的水平大致相同。在一些實施方式中，當將細胞與靶細胞以等於或約0.1 : 1的E : T比共培養時，由工程化NK細胞分泌的細胞介素（例如TNFα、IFNγ和IL-7）的水平相對於對照（例如未編輯或野生型）細胞中的水平降低（例如降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、和/或不超過50%、60%、70%、80%或90%）。在一些實施方式中，當將細胞與靶細胞以等於或約0.1 : 1的E : T比共培養時，由工程化NK細胞分泌的細胞介素（例如TNFα、IFNγ和IL-7）的水平相對於對照（例如未編輯或野生型）細胞中的水平增加（例如增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%）。
在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出增加的顆粒酶B或穿孔素之表現或釋放。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出大致相同的顆粒酶B或穿孔素之表現或釋放水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出降低（例如，降低小於10%、小於20%、小於30%、小於40%或小於50%）的顆粒酶B或穿孔素表現或釋放水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出降低（例如，降低超過20%、超過30%、超過40%、超過50%或超過75%）的顆粒酶B或穿孔素表現或釋放水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出增加（例如，增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%）的顆粒酶B或穿孔素表現或釋放水平。在一些實施方式中，當將細胞與靶細胞以等於或約0.1 : 1的E : T比共培養時，由工程化NK細胞分泌的顆粒酶B或穿孔素的水平與對照（例如，未編輯或野生型）細胞中的水平大致相同。在一些實施方式中，當將細胞與靶細胞以等於或約0.1 : 1的E : T比共培養時，由工程化NK細胞分泌的顆粒酶B或穿孔素的水平相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞中的水平降低（例如，降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、和/或不超過50%、60%、70%、80%或90%）。在一些實施方式中，當將細胞與靶細胞以等於或約0.1 : 1的E : T比共培養時，由工程化NK細胞分泌的顆粒酶B或穿孔素的水平相對於對照（例如，未編輯的或野生型）細胞中的水平增加（例如，增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%）。
在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出增加（例如，增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%）的CD107a表現水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出大致相同的CD107a表現水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出降低（例如，降低小於10%、小於20%、小於30%、小於40%或小於50%）的CD107a表現水平。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出降低（例如，降低超過20%、超過30%、超過40%、超過50%或超過75%）的CD107a表現水平。
在一些實施方式中，與未編輯或野生型NK細胞相比，工程化NK細胞具有更高的增殖能力。在一些實施方式中，與未編輯或野生型NK細胞相比，工程化NK細胞具有大致相同的增殖能力。
在一些實施方式中，工程化NK細胞不表現出耗竭或表現出低水平的耗竭（例如，與功能性NK細胞相關的耗竭標誌物的水平）。在一些實施方式中，藉由檢測細胞中IFNγ、顆粒酶B、穿孔素、CD107a和/或TNFα的降低表現來檢測耗竭。在一些實施方式中，藉由檢測耗竭標誌物例如PD-1、LAG-3、TIGIT和/或TIM-3（例如，在細胞表面上）的增加之表現來檢測耗竭。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有正常或高於正常的穿孔素、顆粒酶B、CD107a、IFNγ和/或TNFα表現（相對於未編輯或野生型細胞）。在一些實施方式中，工程化NK細胞具有低於正常或無PD-1、LAG-3、TIGIT和/或TIM-3表現（相對於未編輯或野生型細胞）。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯細胞或野生型）NK細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出降低的耗竭。
在一些實施方式中，本揭露之工程化NK細胞表現出與對照（例如，未編輯或野生型）細胞大致相同的細胞活力。在一些實施方式中，相對於對照（例如，未編輯或野生型）細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出增加的細胞活力。在一些實施方式中，相對於對照細胞，本揭露之工程化NK細胞表現出細胞活力增加至少10%或至少20%。例如，相對於對照細胞，本揭露之工程化NK細胞之細胞活力可表現出增加至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%或至少90%。在一些實施方式中，相對於對照細胞，本揭露之工程化NK細胞之細胞活力表現出增加20%-100%、20%-90%、20%-80%、20%-70%、20%-60%、20%-50%、30%-100%、30%-90%、30%-80%、30%-70%、30%-60%、30%-50%、40%-100%、40%-90%、40%-80%、40%-70%、40%-60%、40%-50%、50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%或50%-60%。測量細胞活力的方法係熟悉該項技術者已知的並且在本文中描述。
在一些實施方式中，與未編輯或野生型NK細胞相比，工程化NK細胞具有一或多種細胞週期基因、一或多種細胞分裂基因和/或一或多種DNA複製基因的更高表現。在一些實施方式中，與未編輯或野生型NK細胞相比，工程化NK細胞具有大約相同的一或多種細胞週期基因、一或多種細胞分裂基因和/或一或多種DNA複製基因之表現。
在一些實施方式中，基因編輯的iPSC細胞分化成具有本文所述之任何特徵的NK細胞。在一些實施方式中，iPSC細胞用以下中的一或多種基因編輯： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、BCMA CAR敲入、CD30 CAR敲入、SERPINB9敲入、 FASnull、 CISHnull和 REGNASE-1null CAR，然後分化成NK細胞。在一些實施方式中，iPSC細胞用 B2Mnull、IL15/IL15Rα KI和HLA-E KI編輯，然後分化成NK細胞。在一些實施方式中，iPSC細胞用 B2Mnull、SERPINB9 KI和HLA-E KI編輯，然後分化成NK細胞。在一些實施方式中，iPSC細胞用 B2Mnull、SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI編輯，然後分化成NK細胞。在一些實施方式中， B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、CAR KI基因編輯的iPSC細胞分化成NK細胞。CAR可為但不限於BCMA CAR或CD30 CAR。在一些實施方式中， B2Mnull、 CIITAnull、 CISHnull、 FASnull、SERPINB9敲入、IL15/IL15Rα敲入、CD30 CAR敲入、HLA-E敲入基因編輯的iPSC細胞分化成NK細胞。
在一些實施方式中，具有本文所述之任何特徵的工程化NK細胞具有以下基因編輯： B2Mnull、IL15/IL15Rα KI和HLA-E KI（例如，IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體KI、 B2MKO）。在一些實施方式中，具有本文所述之任何特徵的工程化NK細胞具有以下基因編輯： B2Mnull、 CIITAnull、 ADAM17null、HLA-E敲入、IL15/IL15Rα敲入、CAR KI。在一些實施方式中，CAR係BCMA。在一些實施方式中，工程化NK細胞表現對BCMA特異的CAR，並且靶細胞（例如，癌細胞）表現BCMA。在一些實施方式中，CAR係CD30。在一些實施方式中，工程化NK細胞表現對CD30特異的CAR，並且靶細胞（例如，癌細胞）表現CD30。
在一些實施方式中，具有本文所述之任何特徵的工程化NK細胞具有以下基因編輯： B2Mnull、 CIITAnull、 CISHnull、 FASnull、SERPINB9敲入、IL15/IL15Rα敲入、CD30 CAR敲入、HLA-E敲入（例如，SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα KI、CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體KI、 B2MKO、 CIITAKO、 CISHKO、 FASKO）。
在一些實施方式中，相對於本文所述之未編輯的（野生型）NK細胞，本文所述之任何工程化NK細胞具有以下特徵中的一或多個：增加的持久性、增加的免疫逃避性、缺乏同種免疫T細胞響應、增加的細胞毒活性、改善的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或增加的抗腫瘤活性。
在一些實施方式中，本揭露之工程化細胞群體被工程化（例如，藉由使用CRISPR-Cas9基因編輯）以誘導靶基因序列中消除同種異體抗原表現的位點特異性破壞。在一些實施方式中，同種異體抗原係主要組織相容性抗原。在一些實施方式中，主要組織相容性抗原係MHC I複合體。在一些實施方式中，靶基因序列存在於編碼MHC I複合體的蛋白組分的 B2M基因中。
在一些實施方式中，藉由分析在向受試者投與工程化細胞後從受試者收集的一或多個組織樣本中工程化細胞的存在和數量來評估工程化細胞的持久性。在一些實施方式中，持久性被定義為從投與至其中可檢測水平的工程化細胞存在於給定組織類型（例如，周邊血）中的時間的最長持續時間。在一些實施方式中，持久性被定義為持續不存在疾病（例如，完全響應或部分響應）。確定疾病的不存在和對治療的反應係熟悉該項技術者已知的並且在本文中描述。
合適的組織收集、製備和儲存的方法係熟悉該項技術者已知的。在一些實施方式中，在來自由周邊血、腦脊髓液、腫瘤、皮膚、骨、骨髓、乳腺、腎、肝、肺、淋巴結、脾、胃腸道、扁桃體、胸腺和前列腺組成之群組的一或多個組織樣本中評估細胞的持久性。在一些實施方式中，在單一類型的組織樣本（例如，周邊血）中測量細胞數量。在一些實施方式中，在多種組織類型（例如，除了骨髓和腦脊髓液之外的周邊血）中測量細胞數量。藉由測量多種組織類型中的細胞數量，可確定細胞在身體的不同組織中的分佈。在一些實施方式中，在投與後的單個時間點測量一或多個組織樣本中的細胞數量。在一些實施方式中，在投與後的多個時間點測量一或多個組織樣本中的細胞數量。
可藉由已知方法測量給定組織中工程化細胞的可檢測水平。用於評估目的組織中細胞的存在或數量的方法係熟悉該項技術者已知的。該等方法包括但不限於逆轉錄聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR）、競爭性RT-PCR、即時RT-PCR、RNA酶保護測定法（RPA）、定量免疫螢光（QIF）、流動式細胞分析術、RNA印跡、使用DNA的核酸微陣列、蛋白印跡、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、組織免疫染色、免疫沈澱測定法、補體固定測定法、螢光活化細胞分選（FACS）、質譜、磁珠-抗體免疫沈澱或蛋白晶片。
如本文所用，在一些實施方式中，持久性係從投與時間到其中測量工程化細胞的可檢測水平的時間的最長時期。在一些實施方式中，細胞的可檢測水平根據分析方法的檢測限來定義。檢測限可被定義為當與預期不具有目的組分或物質的量的組織樣本比較時，可藉由分析過程可靠地且可再現地測量的組分或物質的最低量。確定檢測的可再現極限的非限制性示例性方法係測量相對於空白樣本的零校準品的重複樣的分析訊息（Armbruster, D. 等人 (2008) Clin Biochem [臨床生物化學] 第29版: S49-S52）。已知空白樣本不含目的分析物。零校準品係已知濃度或量的測試樣本的最高稀釋度，其給出的分析訊息高於對空白樣本測量的分析訊息。藉由對零校準品的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個重複樣的分析訊息進行定量，可確定目的分析方法的檢測限的平均值和標準差（SD）。熟悉該項技術者可確定用於定量給定組織中供體T細胞的具有合適檢測限的方法的選擇。在一些實施方式中，細胞的可檢測水平係組織樣本中給出高於分析方法的檢測限的分析訊息的任何數量的細胞。在一些實施方式中，細胞的可檢測水平係組織樣本中給出高於分析方法的檢測限至少2 SD、3 SD、4 SD、5 SD、6 SD、7 SD、8 SD、9 SD或10 SD的分析訊息的任何數量的細胞。
已知的是，表現CAR的供體細胞可在投與至接受者後經歷擴增。擴增係對抗原識別和訊息活化的反應（Savoldo, B. 等人 (2011) J Clin Invest. [臨床研究雜誌] 121: 1822；van der Stegen, S. 等人 (2015) Nat Rev Drug Discov. [自然綜述：藥物發現] 14: 499-509）。在一些實施方式中，在擴增後，表現CAR的工程化細胞經歷收縮期，其中該等細胞群體中為短壽效應細胞的部分被消除並且剩餘的是細胞群體中為長壽記憶細胞的部分。在一些實施方式中，持久性係工程化細胞群體在擴增和收縮後的壽命的量度。使用藥物動力學曲線評估擴增、收縮和持續階段的持續時間。在一些實施方式中，藥物動力學（PK）曲線係對給定組織中隨時間測量的細胞的描述，並且容易地由熟悉該項技術者藉由在多個時間點測量給定組織（例如，周邊血）中的細胞來確定。在一些實施方式中，PK曲線的量度提供了評估或監測工程化細胞療法在受試者（例如，患有癌症）中之有效性之方法。在一些實施方式中，PK曲線的量度提供了評估工程化細胞在受試者中的持久性之方法。在一些實施方式中，PK曲線提供了評估工程化細胞在受試者中的擴增之方法。在一些實施方式中，使用工程化細胞在受試者中的持久性的量度來評估工程化細胞療法在受試者中的有效性。在一些實施方式中，使用工程化細胞在受試者中的擴增的量度來評估工程化細胞療法在受試者中的有效性。
在一些實施方式中，藉由測量從接受者收集的給定組織類型（例如周邊血）的樣本中工程化細胞的數量並在不同時間點重複該評估來製作PK曲線。在一些實施方式中，在投與前不超過1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、13天、14天或15天從接受者收集基線組織樣本。在一些實施方式中，在投與工程化細胞的時間的0.25-2小時內、1-3小時內、2-6小時內、3-11小時內、4-20小時內、5-48小時內進行從接受者的組織收集。在一些實施方式中，從第1天、第2天、第3天或第4天開始並且持續至少第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天，每天進行從接受者的組織收集。在一些實施方式中，在投與細胞後，每週至少1次、2次、3次、4次、5次或6次進行從接受者的組織收集，持續至多1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週或16週。在一些實施方式中，在投與細胞後，每月至少1次、2次、3次、4次、5次或6次進行從接受者的組織收集，持續至多1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月或24個月。在一些實施方式中，在投與細胞後，每年至少1次、2次、3次、4次、5次或6次進行從接受者的組織收集，持續至多1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年。
在一些實施方式中，工程化細胞持久性被定義為從投與起其中工程化細胞的存在量為工程化細胞的峰值量的至少0.005%-0.05%、0.01%-0.1%、0.05%-0.5%、0.1%-1%、0.5%-5%、1%-10%、5%-10%或10%-15%（例如，至少1%、5%、10%或15%）的持續時間。在一些實施方式中，藉由將在給定組織類型（例如，周邊血）中測量的細胞量與在相同組織類型中測量的細胞峰值量進行比較來確定細胞的持久性。在一些實施方式中，藉由將在給定受試者（例如，周邊血）中測量的細胞量與在相同受試者中測量的細胞峰值量進行比較來確定細胞的持久性。在一些實施方式中，藉由將在給定受試者（例如，周邊血）中測量的細胞量與在不同受試者（即，具有部分響應的受試者、具有完全響應的受試者）中測量的細胞峰值量進行比較來確定細胞的持久性。
在一些實施方式中，工程化細胞在投與後持續存在於一或多種組織類型（例如周邊血）中，其中工程化細胞在第1天投與。在一些實施方式中，工程化細胞在投與後至多1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、21天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天或35天持續存在於一或多種組織類型（例如周邊血）中，其中工程化細胞在第1天投與。在一些實施方式中，在投與工程化細胞後至多1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、21個月、22個月、23個月或24個月工程化細胞持續存在於一或多種組織類型（例如周邊血）中。在一些實施方式中，在投與工程化細胞後至多1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年和10年在一或多種組織類型（例如周邊血）中測量到工程化細胞的持久性。在一些實施方式中，從投與（其中工程化細胞在第1天投與）起至少10-25天、至少25-50天、至少50-100天、至少100-364天、至少一年、至少兩年、至少三年、至少四年或至少五年的工程化細胞持久性指示接受者中的響應（例如完全響應或部分響應）。 細胞的分離和純化 純化
在一些實施方式中，本文所述之經基因編輯的細胞（例如iPSC、iNK或NK細胞）群在基因組編輯之前或之後被活化和/或擴增。在一些實施方式中，iPSC細胞在基因編輯後分化。在一些實施方式中，在基因組編輯之前將細胞活化和擴增約1天至約4天、約1天至約3天、約1天至約2天、約2天至約3天、約2天至約4天、約3天至約4天、或約1天、約2天、約3天、或約4天。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於從包含本文揭露的任何工程化NK細胞（例如，IL15/IL15Rα KI、HLA-E KI、 B2Mnull、 CIITAnull、CAR KI、 ADAM17null細胞或SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI、HLA-E KI、CAR KI、 B2Mnull、 CIITAnull、 FASnull、 CISHnull細胞）的細胞群體中基本上分離表現可檢測水平的表面蛋白（例如，B2M）的細胞之方法。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於分離包含本文揭露的任何工程化CAR NK細胞中的任一種（例如，包含CAR KI和 B2MKO、 CIITAKO、 ADAM17 KO 、 FASKO、 CISHKO、 REGNASE-1KO、IL15/IL15Rα KI、HLA-E KI和/或SERPINB9 KI）細胞群體之方法，該方法包括：提供細胞群體，其中工程化CAR NK細胞包含破壞的 CIITA基因、破壞的 B2M基因、破壞的 ADAM17基因、破壞的 FAS基因、破壞的 CISH基因和/或破壞的 REGNASE-1基因；以及分離表現CAR的細胞群體（例如，使得 ＞ 99%的群體包含表現CAR的細胞）。
在一些實施方式中，本揭露提供了包含本文所述之工程化NK細胞（例如， B2MKO、 CIITAKO、 ADAM17 KO 、 FASKO、 CISHKO、 REGNASE-1KO、IL15/IL15Rα KI、HLA-E KI、CAR KI和/或SERPINB9 KI）的細胞群體，其中群體中少於0.5%的細胞表現可檢測水平的ADAM17、B2M、CIITA、FAS和/或CISH。在一些實施方式中，本揭露提供了包含本文所述之工程化NK細胞之細胞群體，其中群體中少於0.1%、少於0.2%、少於0.3%、少於0.4%、少於0.5%、少於1%、少於2%、少於3%、少於4%、少於5%或少於10%的細胞表現可檢測水平的ADAM17、B2M、CIITA、FAS、CISH和/或REGNASE-1。
可以使用常規的細胞純化方法從群體中去除細胞亞群。細胞分選方法之非限制性實例包括螢光活化細胞分選、免疫磁性分離、層析和微流體細胞分選。在一些實施方式中，藉由免疫磁性分離從包含工程化NK細胞之細胞群體中去除表現CAR的細胞。在一些實施方式中，藉由免疫磁性分離從包含工程化NK細胞之細胞群體中去除表現HLA-E的細胞。
在一些實施方式中，經基因組編輯的細胞被分選為單個細胞。在一些實施方式中，經基因編輯細胞的單細胞分離物生長成單細胞選殖群體。在一些實施方式中，生成多個單細胞殖株。在一些實施方式中，將經編輯的殖株擴增以產生主細胞庫（MCB）。 配製和投與 針對基因編輯的配製和遞送
可以將引導RNA、多核苷酸（例如，編碼本文所述之任何蛋白的多核苷酸或編碼內切核酸酶的多核苷酸）和本文所述之內切核酸酶以本領域已知的任何方式配製並遞送至細胞。
根據特定的投與方式和劑型，將引導RNA和/或多核苷酸與藥學上可接受的賦形劑（諸如載劑、溶劑、穩定劑、佐劑、稀釋劑等）一起配製。可以將引導RNA和/或多核苷酸組成物配製以達到生理相容的pH，並且根據配製和投與途徑，其範圍係從約3的pH至約11的pH、約pH 3至約pH 7。在一些情況下，可以將pH調節到從約pH 5.0至約pH 8的範圍。在一些情況下，組成物可以包含治療有效量的至少一種如本文所述之化合物以及一或多種藥學上可接受的賦形劑。視需要，組成物可以包含本文所述之化合物的組合，或者可以包括可用於治療或預防細菌生長的第二活性成分（例如但不限於抗菌劑或抗微生物劑），或者可以包括本揭露之試劑的組合。
合適的賦形劑包括例如載劑分子，該等載劑分子包括大的、緩慢代謝的大分子（如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物和失活病毒顆粒）。其他示例性賦形劑可以包括抗氧化劑（例如但不限於抗壞血酸）、螯合劑（例如但不限於EDTA）、碳水化合物（例如但不限於糊精、羥烷基纖維素和羥烷基甲基纖維素）、硬脂酸、液體（例如但不限於油、水、鹽水、甘油和乙醇）、潤濕劑或乳化劑、pH緩衝物質等。
可以藉由本領域已知的病毒或非病毒遞送媒介物來遞送引導RNA多核苷酸（RNA或DNA）和/或一或多種內切核酸酶多核苷酸（RNA或DNA）。替代性地，可以藉由本領域已知的病毒或非病毒遞送媒介物（如電穿孔或脂質奈米顆粒）來遞送一或多種內切核酸酶多肽。在另外的替代性方面，DNA內切核酸酶可以作為一或多種多肽單獨地或與一或多種引導RNA、或一或多種crRNA與tracrRNA一起預複合地遞送。
多核苷酸可以藉由非病毒遞送媒介物來遞送，該等非病毒遞送媒介物包括但不限於奈米顆粒、脂質體、核糖核蛋白、帶正電荷的肽、小分子RNA-軛合物、適體-RNA嵌合體和RNA-融合蛋白複合體。一些示例性非病毒遞送媒介物在Peer和Lieberman, Gene Therapy [基因療法], 2011, 18: 1127-1133（其重點是用於siRNA的非病毒遞送媒介物也可用於遞送其他多核苷酸）中有描述。
對於本揭露之多核苷酸，配製物可以選自例如在國際申請WO 2013090648中教導的那些中的任一種。
藉由脂質奈米顆粒（LNP），可以將多核苷酸（諸如引導RNA、sgRNA和編碼內切核酸酶的mRNA）遞送至細胞或受試者。
LNP係指直徑小於1000 nm、500 nm、250 nm、200 nm、150 nm、100 nm、75 nm、50 nm或25 nm的任何顆粒。替代性地，奈米顆粒的大小範圍可為從1-1000 nm、1-500 nm、1-250 nm、25-200 nm、25-100 nm、35-75 nm或25-60 nm。
LNP可以由陽離子、陰離子或中性脂質製成。中性脂質（如融合磷脂DOPE或膜組分膽固醇）可以作為「輔助脂質」包括在LNP中，以增強轉染活性和奈米顆粒的穩定性。陽離子脂質的局限性包括由於穩定性差和快速清除、以及炎性反應或消炎反應的產生而導致的功效低下。
LNP也可以由疏水性脂質、親水性脂質或疏水性和親水性脂質兩者構成。
本領域已知的任何脂質或脂質組合均可以用於產生LNP。用於產生LNP的脂質的實例係：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-膽固醇、DOTAP-膽固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇（PEG）。陽離子脂質的實例係：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA（KC2）、DLin-MC3-DMA（MC3）、XTC、MD1和7C1。中性脂質的實例係：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修飾的脂質的實例係：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
脂質能以任何數量的莫耳比組合以產生LNP。另外，一或多種多核苷酸可以以寬範圍的莫耳比與一或多種脂質組合以產生LNP。
可以使用重組腺相關病毒（AAV）載體用於遞送。用於產生rAAV顆粒的技術（其中向細胞提供待包裝的AAV基因組（其包括待遞送的多核苷酸、rep和cap基因以及輔助病毒功能））在本領域係標準的。rAAV的產生通常要求單個細胞（在本文中稱為包裝細胞）記憶體在以下組分：rAAV基因組，與rAAV基因組分開（即不在其中）的AAV rep和cap基因，以及輔助病毒功能。AAV rep和cap基因可以來自任何AAV血清型（從該AAV血清型中可以衍生重組病毒），並且可以來自不同的AAV血清型而不是rAAV基因組ITR，包括但不限於本文所述之AAV血清型。假型rAAV的產生在例如國際專利申請公開案號WO 01/83692中有揭露。 細胞的配製和投與
如本文所述之經遺傳修飾的細胞可以藉由本領域已知的任何方式配製並投與至受試者。
術語「投與」、「引入」、「植入（implanting）」、「植入（engrafting）」和「移植」在將細胞（例如，先驅細胞）放置（藉由導致所引入的細胞在所需位點至少部分定位的方法或途徑）到受試者中的背景下可互換地使用。可以藉由任何合適的途徑投與細胞（例如先驅細胞或其分化的後代），該任何合適的途徑導致遞送至受試者中所需位置，在該位置中至少一部分植入的細胞或細胞組分保持活力。在投與至受試者後，細胞的活力期可以短至數小時（例如二十四小時）、幾天，長達數年，或甚至受試者的壽命（即長期植入）。
在一些實施方式中，如本文所述之經遺傳修飾的細胞在投與至受試者後存活的時段長於未修飾的細胞。
在一些實施方式中，包含如本文所述之細胞的組成物藉由合適的途徑來投與，該合適的途徑可包括靜脈內投與，例如作為推注或藉由在一段時間內的連續輸注。在一些實施方式中，靜脈內投與可以藉由肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內或鞘內途徑來進行。在一些實施方式中，組成物可以呈固體形式、水性形式或液體形式。在一些實施方式中，水性或液體形式可為霧化或凍乾的。在一些實施方式中，霧化或凍乾的形式可以用水性或液體溶液重構。
細胞組成物也可以被乳化或作為脂質體組成物呈現，其條件係乳化過程不會對細胞活力產生不利影響。可以將細胞和任何其他活性成分與藥學上可接受的並且與活性成分相容的賦形劑混合，並以適用於本文所述之治療方法的量混合。
細胞組成物中所含的另外的試劑可以包括其中的組分之藥學上可接受的鹽。藥學上可接受的鹽包括與無機酸（諸如鹽酸或磷酸）或有機酸（諸如乙酸、酒石酸、苦杏仁酸等）形成的酸加成鹽（與多肽的游離胺基基團形成）。與游離羧基基團形成的鹽也可以源自無機鹼（如例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵）以及有機鹼（如異丙胺、三甲胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等）。
生理上可耐受的載劑係本領域眾所周知的。示例性液體載劑係無菌水溶液，該等無菌水溶液除了活性成分和水外不含任何材料，或者含有緩衝液（如生理pH值的磷酸鈉、生理鹽水或兩者，如磷酸鹽緩衝鹽水）。更進一步，水性載劑可以含有超過一種緩衝鹽，以及鹽（如氯化鈉和氯化鉀）、右旋糖、聚乙二醇和其他溶質。除了並排除水之外，液體組成物還可以含有液相。此類另外的液相的實例係甘油、植物油（如棉籽油）和水油乳劑。在細胞組成物中使用的有效治療特定障礙或病症的活性化合物的量可以取決於障礙或病症的性質，並且可以藉由標準臨床技術來確定。
在一些實施方式中，可以將包含細胞的組成物投與至患有疾病、懷疑患有疾病或有疾病風險的受試者（例如，人類受試者）。在一些實施方式中，可以將組成物投與至沒有患有疾病、沒有懷疑患有疾病或沒有疾病風險的受試者。在一些實施方式中，受試者係健康的人。在一些實施方式中，受試者（例如，人類受試者）患有在遺傳上可遺傳的疾病、懷疑患有在遺傳上可遺傳的疾病或有在遺傳上可遺傳的疾病風險。在一些實施方式中，受試者正在遭受或有風險患上指示疾病的症狀。 治療方法
在一些實施方式中，本文提供了使用本文所述之任何工程化細胞（或本文所述之任何細胞群體）治療癌症（例如白血病，例如急性髓性白血病）之方法。可如本文所提供的那樣進行治療的癌症之非限制性實例包括多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病（B-ALL）、B細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NL）、慢性淋巴細胞白血病（C-CLL）、急性髓性白血病（AML）、T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、透明細胞腎細胞癌（ccRCC）、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、胰臟癌、黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌、神經膠質母細胞瘤和子宮頸癌。
在一些實施方式中，可如本文所提供的那樣進行治療的白血病包括慢性淋巴細胞白血病（CLL）、非何杰金氏淋巴瘤（例如彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、高級B細胞淋巴瘤、轉化濾泡性淋巴瘤（FL）、3B級FL和CLL的Richter轉化）和急性淋巴母細胞白血病（ALL）。在一些實施方式中，本文提供了一種治療有需要的受試者（例如，人）中的癌症之方法，該方法包括向受試者（例如，其中該受試者患有或已被診斷患有癌症）投與本文所述之任何工程化細胞。在一些實施方式中，本文提供了一種治療有需要的受試者（例如，人）中的非何杰金氏淋巴瘤（例如，彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、高級B細胞淋巴瘤、轉化濾泡性淋巴瘤（FL）、3B級FL和CLL的Richter轉化）之方法，該方法包括向受試者（例如，其中該受試者患有或已被診斷患有非何杰金氏淋巴瘤，或有非何杰金氏淋巴瘤風險）投與本文所述之任何工程化的細胞。在一些實施方式中，受試者（例如，人）患有（例如，已被診斷患有）復發性和/或難治性非何杰金氏淋巴瘤。在一些實施方式中，受試者（例如，人）患有（例如，已被診斷患有）非復發性或早期非何杰金氏淋巴瘤。在一些實施方式中，本文提供了一種治療有需要的受試者（例如，人）中的慢性淋巴細胞白血病（CLL）或急性淋巴母細胞白血病（ALL）之方法，該方法包括向受試者（例如，其中該受試者患有或已被診斷患有CLL或ALL）投與本文所述之任何工程化細胞。在一些實施方式中，受試者（例如，人）患有（例如，已被診斷患有）復發性和/或難治性CLL或ALL。在一些實施方式中，受試者（例如，人）患有（例如，已被診斷患有）非復發性或早期CLL或ALL。工程化細胞可以本文所述之任何劑量投與，特別是以治療有效量投與。在一些實施方式中，所治療的人係成人，例如18歲以上的人。在一些實施方式中，所治療的人係18歲以下的人。在一些實施方式中，該方法不是藉由療法治療人體或動物體之方法。
在一些實施方式中，該等方法包括將本揭露之工程化細胞（例如，抗BCMA CAR NK細胞）遞送至患有癌症（例如，白血病）的受試者，其中癌細胞表現BCMA。在一些實施方式中，該等方法包括將本揭露之工程化細胞（例如，抗CD30 CAR NK細胞）遞送至患有癌症（例如，白血病）的受試者，其中癌細胞表現CD30。在一些實施方式中，當所治療的疾病係非何杰金氏淋巴瘤時，所使用的細胞表現CD30 CAR（例如，抗CD30 CAR NK細胞）。
投與步驟可包括藉由引入的細胞至少部分定位在所需位點（例如，腫瘤）的方法或途徑將細胞（例如，工程化NK細胞）放置（例如，移植）到受試者體內，從而產生所需的一或多種效果。工程化細胞可以藉由任何適當的途徑投與，該途徑導致遞送至受試者中的所需位置，在該位置中至少一部分植入的細胞或細胞組分保持活力。在投與至受試者後，細胞的活力期可以短至數小時（例如二十四小時）、幾天，長達數年，或甚至受試者的壽命（即長期移植）。例如，在一些實施方式中，有效量的工程化NK細胞經由全身性投與途徑（諸如腹膜內或靜脈內途徑）投與。
受試者可為期望對其進行診斷，治療或療法的任何受試者。在一些實施方式中，該受試者係哺乳動物。在一些實施方式中，該受試者係人。
在一些實施方式中，根據本文所述之方法投與的工程化NK細胞群體包含分化自經基因編輯的幹細胞（例如，iPSC細胞）的經基因編輯的造血細胞（例如，NK細胞）。
在一些實施方式中，根據本文所述之方法投與的工程化細胞群體（例如，NK細胞）在受試者中不誘導毒性，例如工程化NK細胞在非癌細胞中不誘導毒性。在一些實施方式中，所投與的工程化細胞群體（例如，NK細胞）不觸發補體介導的裂解，或不刺激抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。
在一些實施方式中，所治療的受試者不具有慢性免疫抑制。
有效量係指預防或減輕醫學病症（例如，癌症）的至少一或多種體征或症狀所需的工程化細胞（例如，NK細胞）群體的量，並且涉及足以提供所需效果（例如，治療患有醫學病症的受試者）的組成物的量。有效量還包括足以預防或延遲疾病症狀的發展、改變疾病症狀的進程（例如但不限於減慢疾病症狀的進展）或逆轉疾病症狀的量。應當理解，對於任何給定的情況，本領域的普通技術者可以使用常規實驗來確定適當的有效量。
在一些實施方式中，以約1 × 10 7至1 × 10 9個工程化細胞範圍內的劑量向受試者投與包含本文揭露的工程化細胞中之任一種的細胞群體。在一些實施方式中，以約1 × 10 7至3 × 10 8個工程化細胞範圍內的劑量向受試者投與包含本文揭露的工程化細胞中之任一種的細胞群體。在一些實施方式中，以約3 × 10 7至3 × 10 8個工程化細胞範圍內的劑量向受試者投與包含本文揭露的工程化細胞中之任一種的細胞群體。
在一些實施方式中，細胞係NK細胞。在一些實施方式中，細胞源自iPSC。在一些實施方式中，細胞在投與至有需要的受試者之前在培養物中擴增。
投與方式包括但不限於注射和輸注。在一些實施方式中，注射包括但不限於靜脈內、鞘內、腹膜內、脊柱內、腦脊髓內和胸骨內輸注。在一些實施方式中，該途徑係靜脈內。在一些實施方式中，本文所述之細胞作為大丸劑或藉由在一段時間內連續輸注（例如，靜脈內輸注）投與。在一些實施方式中，本文所述之細胞在一段時間內以若干劑量（例如，在一段時間內的若干輸注）投與。本文所述之細胞可以單劑量或以2、3、4、5、6或更多劑量（或輸注）投與。在一些實施方式中，約每1、2、3、4、5、6、7或8週向所治療的受試者給藥（例如，利用輸注）。在一些實施方式中，每2-4週（例如，每2週、3週或4週）向所治療的受試者給藥（例如，利用輸注）。
在一些實施方式中，全身性投與工程化細胞（例如，NK細胞），這係指將細胞群體以不同於直接投與至靶部位、組織或器官的方式投與，而是使其進入受試者的循環系統，從而經受代謝和其他類似過程。
可以由熟練的臨床醫生確定包含用於治療醫學病症的組成物的治療的功效。如果疾病（例如，癌症）的任何一種或所有體征或症狀（舉一個例子，以有益的方式改變功能性靶標的水平（例如，增加至少10%））或其他臨床上可接受的症狀或標誌物得到改善或減輕，則該治療被認為是「有效治療」。功效還可以藉由如藉由住院治療或需要醫療干預所評估的受試者惡化的失敗（例如，疾病進展停止或至少減慢）來測量。測量該等指標的方法係熟悉該項技術者已知的和/或本文所述之。治療包括對受試者疾病的任何治療，包括：(1) 抑制疾病，例如阻止或減緩症狀的進展；或 (2) 減輕疾病，例如引起症狀消退；以及 (3) 預防或降低症狀發展的可能性。
在一些實施方式中，本揭露提供了藉由投與靜脈內劑量的約1 × 10 7-3 × 10 8個表現可檢測水平的本文所述之CAR（例如，抗BCMA CAR或抗CD30 CAR）的工程化NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。在一些實施方式中，本揭露提供了藉由投與靜脈內劑量的約3 × 10 7個表現可檢測水平的本文所述之CAR（例如，抗BCMA CAR或抗CD30 CAR）的工程化NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。在一些實施方式中，本揭露提供了藉由投與靜脈內劑量的約1 × 10 8個表現可檢測水平的本文所述之CAR（例如，抗BCMA CAR或抗CD30 CAR）的工程化NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。在一些實施方式中，本揭露提供了藉由投與靜脈內劑量的約3 × 10 8個表現可檢測水平的本文所述之CAR（例如，抗BCMA CAR或抗CD30 CAR）的工程化NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。
在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以約1 × 10 7-3 × 10 8個表現可檢測水平的抗BCMA CAR或抗CD30 CAR的工程化NK細胞的劑量靜脈內投與NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以約3 × 10 7個表現可檢測水平的抗BCMA CAR或抗CD30 CAR的工程化NK細胞的劑量靜脈內投與NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以約1 × 10 8個表現可檢測水平的抗BCMA CAR或抗CD30 CAR的工程化NK細胞的劑量靜脈內投與NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以約3 × 10 8個表現可檢測水平的抗BCMA CAR或抗CD30 CAR的工程化NK細胞的劑量靜脈內投與NK細胞來治療人類患者中的非何杰金氏淋巴瘤（NHL）之方法。 淋巴細胞耗竭調理療法
在一些實施方式中，在受試者（例如，患有癌症例如非何杰金氏淋巴瘤的人類患者）接受淋巴細胞耗竭方案後，將本文所述之任何工程化細胞（或本文所述之任何細胞群體）投與至受試者。
在一些實施方式中，淋巴細胞耗竭方案包括投與至少一種化療劑。在一些實施方式中，至少一種化療劑係環磷醯胺。在一些實施方式中，淋巴細胞耗竭方案包括投與至少兩種化療劑。在一些實施方式中，至少兩種化療劑係環磷醯胺和氟達拉濱（fludarabine）。
在一些實施方式中，在淋巴細胞耗竭後，將第一劑量（例如，輸注）的本文所述之工程化細胞投與至受試者。 本揭露之具體組成物和方法
因此，本揭露特別涉及以下非限制性組成物和方法。
在第一組成物即組成物1中，本揭露提供了包含工程化細胞的組成物，該工程化細胞包含：(a) 破壞的 β-2- 微球蛋白（ B2M）基因，和 (b) 插入該破壞的 B2M基因中之第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中i. 該第一多核苷酸編碼人白血球抗原E或HLA I類組織相容性抗原α鏈E（HLA-E），並且ii. 該第二多核苷酸編碼介白素-15（IL15）與介白素-15受體亞基α（IL15Rα）之融合蛋白，其中該細胞表現HLA-E以及IL15與IL15Rα之融合蛋白，並且該細胞具有破壞的B2M表現。
在另一種組成物即組成物2中，本揭露提供了如組成物1中所提供的組成物，其中破壞的B2M表現包括降低或消除的B2M表現。
在另一種組成物即組成物3中，本揭露提供了如組成物1或2中所提供的組成物，其中該HLA-E係HLA-E三聚體，其包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
在另一種組成物即組成物4中，本揭露提供了如組成物3中所提供的組成物，其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸作為編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸插入，其中該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體包含IL15與IL15Rα之融合蛋白、P2A肽序列和HLA-E三聚體。
在另一種組成物即組成物5中，本揭露提供了如組成物4中所提供的組成物，其中編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體的多核苷酸被插入該 B2M基因座的外顯子1中。
在另一種組成物即組成物6中，本揭露提供了如組成物1-5中所提供的組成物，該組成物進一步包含破壞的 II 類主要組織相容性複合體反式啟動子（ CIITA）基因，其中該細胞具有破壞的CIITA表現。
在另一種組成物即組成物7中，本揭露提供了如組成物6中所提供的組成物，其中該破壞的CIITA表現包括降低或消除的CIITA表現。
在另一種組成物即組成物8中，本揭露提供了如組成物1-7中所提供的組成物，該組成物進一步包含編碼嵌合抗原受體（CAR）之多核苷酸的插入。
在另一種組成物即組成物9中，本揭露提供了如組成物8中所提供的組成物，其中該CAR被插入該破壞的 CIITA基因中。
在另一種組成物即組成物10中，本揭露提供了如組成物8或9中所提供的組成物，其中該CAR被插入該 CIITA基因座的外顯子2中。
在另一種組成物即組成物11中，本揭露提供了如組成物1-10中所提供的組成物，該組成物進一步包含破壞的 ADAM 金屬蛋白酶結構域 17（ ADAM17）基因，其中該細胞具有破壞的ADAM17表現。
在另一種組成物即組成物12中，本揭露提供了如組成物11中所提供的組成物，其中該破壞的ADAM17表現包括降低或消除的ADAM17表現。
在另一種組成物即組成物13中，本揭露提供了包含工程化細胞的組成物，該工程化細胞包含：(a) 破壞的 B2M基因，(b) 插入該破壞的 B2M基因中之第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中i. 該第一多核苷酸編碼HLA-E，並且ii. 該第二多核苷酸編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白，(c) 破壞的 CIITA基因，(d) 編碼CAR之多核苷酸的插入，視需要其中該CAR被插入該破壞的 CIITA基因中，和 (e) 破壞的 ADAM17基因，其中該等細胞表現HLA-E、IL15與IL15Rα之融合蛋白以及CAR，並且該等細胞具有破壞的B2M、CIITA和ADAM17表現。
在另一種組成物即組成物14中，本揭露提供了如組成物13中所提供的組成物，其中該破壞的B2M、CIITA和/或ADAM17表現包括降低或消除的B2M、CIITA和/或ADAM17表現。
在另一種組成物即組成物15中，本揭露提供了如組成物13或14中所提供的組成物，其中該HLA-E係HLA-E三聚體，其包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
在另一種組成物即組成物16中，本揭露提供了如組成物15中所提供的組成物，其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸作為編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸插入，其中該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體包含IL15與IL15Rα之融合蛋白、P2A肽序列和HLA-E三聚體。
在另一種組成物即組成物17中，本揭露提供了如組成物16中所提供的組成物，其中編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的該多核苷酸被插入該 B2M基因座的外顯子1中。
在另一種組成物即組成物18中，本揭露提供了如組成物13-17中所提供的組成物，其中該CAR被插入該 CIITA基因座的外顯子2中。
在另一種組成物即組成物19中，本揭露提供了包含工程化細胞的組成物，該工程化細胞包含：(a) 破壞的 ADAM17基因，(b) 編碼MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體的組分或其轉錄調控子的破壞的基因，和 (c) 編碼CAR之多核苷酸的插入，其中該細胞表現CAR、具有破壞的ADAM17表現、具有破壞的MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體的組分或其轉錄調控子之表現並且係低免疫性的。
在另一種組成物即組成物20中，本揭露提供了如組成物19中所提供的組成物，其中該破壞的ADAM17和/或MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體的組分或其轉錄調控子之表現包括降低或消除的MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體的組分或其轉錄調控子之表現。
在另一種組成物即組成物21中，本揭露提供了如組成物19或20中所提供的組成物，其中編碼該MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體的組分或其轉錄調控子的該破壞的基因係破壞的 B2M基因。
在另一種組成物即組成物22中，本揭露提供了如組成物21中所提供的組成物，該組成物進一步包含 (d) 編碼HLA-E的第一多核苷酸的插入，和 (e) 編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白的第二多核苷酸的插入，其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸被插入該破壞的 B2M基因中，並且其中該細胞表現HLA-E以及IL15與IL15Rα之融合蛋白。
在另一種組成物即組成物23中，本揭露提供了如組成物22中所提供的組成物，其中該HLA-E係HLA-E三聚體，其包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
在另一種組成物即組成物24中，本揭露提供了如組成物23中所提供的組成物，其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸作為編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸插入，其中該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體包含IL15與IL15Rα之融合蛋白、P2A肽序列和HLA-E三聚體。
在另一種組成物即組成物25中，本揭露提供了如組成物24中所提供的組成物，其中編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體的該多核苷酸被插入該 B2M基因座的外顯子1中。
在另一種組成物即組成物26中，本揭露提供了如組成物19-25中所提供的組成物，其中編碼該MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體的組分或其轉錄調控子的該破壞的基因係破壞的 CIITA基因。
在另一種組成物即組成物27中，本揭露提供了如組成物19-26中所提供的組成物，其中該CAR被插入該 CIITA基因中。
在另一種組成物即組成物28中，本揭露提供了如組成物27中所提供的組成物，其中該CAR被插入該 CIITA基因座的外顯子2中。
在另一種組成物即組成物29中，本揭露提供了包含工程化細胞的組成物，該工程化細胞包含破壞的CIITA基因和在該破壞的CIITA基因中編碼CAR之多核苷酸的插入，其中該細胞表現CAR並且該細胞具有破壞的CIITA表現。
在另一種組成物即組成物30中，本揭露提供了如組成物29中所提供的組成物，其中該破壞的CIITA表現包括降低或消除的CIITA表現。
在另一種組成物即組成物31中，本揭露提供了如組成物29或30中所提供的組成物，其中該CAR被插入該 CIITA基因座的外顯子2中。
在另一種組成物即組成物32中，本揭露提供了如組成物29-31中所提供的組成物，該組成物進一步包含破壞的 B2M基因、插入該破壞的 B2M基因中之第一多核苷酸和第二多核苷酸以及視需要破壞的 ADAM17基因，其中該第一多核苷酸編碼HLA-E並且該第二多核苷酸編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白，並且其中該細胞表現HLA-E以及IL15與IL15Rα之融合蛋白，並且該細胞具有破壞的B2M和/或ADAM17之表現。
在另一種組成物即組成物33中，本揭露提供了如組成物32中所提供的組成物，其中該破壞的B2M和/或ADAM17表現包括降低或消除的ADAM17表現。
在另一種組成物即組成物34中，本揭露提供了如組成物32或33中所提供的組成物，其中該HLA-E係HLA-E三聚體，其包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
在另一種組成物即組成物35中，本揭露提供了如組成物34中所提供的組成物，其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸作為編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的多核苷酸插入，其中該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體包含IL15與IL15Rα之融合蛋白、P2A肽序列和HLA-E三聚體。
在另一種組成物即組成物36中，本揭露提供了如組成物35中所提供的組成物，其中編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體的該多核苷酸被插入該 B2M基因座的外顯子1中。
在另一種組成物即組成物37中，本揭露提供了如組成物8-36中所提供的組成物，其中該CAR包含結合抗B細胞成熟抗原的胞外結構域。
在另一種組成物即組成物38中，本揭露提供了如組成物37中所提供的組成物，其中該CAR包含SEQ ID NO: 70的多核苷酸序列。
在另一種組成物即組成物39中，本揭露提供了如組成物4-12、16-18、24-28和35-38中所提供的組成物，其中該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體包含SEQ ID NO: 77的多核苷酸序列。
在另一種組成物即組成物40中，本揭露提供了如組成物1-39中所提供的組成物，其中該工程化細胞不含編碼CD16之多核苷酸的插入；視需要，其中該細胞的基因組不含編碼高親和力不可切割的CD16變體之多核苷酸的插入。
在另一種組成物即組成物41中，本揭露提供了如組成物1-40中所提供的組成物，其中該工程化細胞係幹細胞。
在另一種組成物即組成物42中，本揭露提供了如組成物41中所提供的組成物，其中該幹細胞係誘導多能幹細胞（iPSC）、造血幹細胞、胚胎幹細胞或成體幹細胞。
在另一種組成物即組成物43中，本揭露提供了如組成物1-40中所提供的組成物，其中該工程化細胞係經基因組編輯的iPSC。
在另一種組成物即組成物44中，本揭露提供了如組成物1-40中所提供的組成物，其中該工程化細胞係從經基因組編輯的iPSC獲得的自然殺手（NK）細胞。
在另一種組成物即組成物45中，本揭露提供了如組成物1-40中所提供的組成物，其中該工程化細胞係分化細胞或體細胞。
在另一種組成物即組成物46中，本揭露提供了如組成物1-40中所提供的組成物，其中該工程化細胞能夠分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
在另一種組成物即組成物47中，本揭露提供了如組成物1-40中所提供的組成物，其中該工程化細胞係自然殺手（NK）細胞。
在另一種組成物即組成物48中，本揭露提供了如組成物47中所提供的組成物，其中該NK細胞已從經基因組編輯的iPSC分化，其中該NK細胞包含該經基因組編輯的iPSC的基因組編輯，其中該NK細胞在分化後尚未被基因組編輯。
在另一種組成物即組成物49中，本揭露提供了如組成物1-48中所提供的組成物，其中該工程化細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種、四種或五種：CD56、NKp44、NKp46、CD94、NKG2A和KIR2DL4，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%或75%的水平表現。
在另一種組成物即組成物50中，本揭露提供了如組成物1-49中所提供的組成物，其中該工程化細胞具有以下特徵中的至少一個或其任何組合：(i) 相對於未修飾的細胞，同種免疫T細胞反應小於10%，以及 (ii) 當該等工程化細胞與靶細胞以1 : 1的比率混合時，細胞毒活性導致殺傷超過50%的靶細胞；(iii) 相對於未修飾的細胞，細胞活力增加至少50%。
在另一種組成物即組成物51中，本揭露提供了如組成物1-49中所提供的組成物，其中該工程化細胞具有以下特徵中的至少一個或其任何組合：(i) 改善的持久性，(ii) 改善的免疫逃避性，(iii) 改善的細胞毒活性，(iv) 改善的ADCC活性，和 (v) 改善的抗腫瘤活性；其中相對於野生型細胞，視需要相對於野生型iPSC或野生型NK細胞，該等特徵得到改善。
在另一種組成物即組成物52中，本揭露提供了如組成物1-51中所提供的組成物，其中該工程化細胞能夠在細胞培養基中不存在外源IL15的情況下進行細胞擴增。
在另一種組成物即組成物53中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含根據組成物1至52中任一種的多個工程化細胞。
在另一種組成物即組成物54中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含源自組成物53的多個工程化細胞的譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的群體。
在另一種組成物即組成物55中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物54的細胞群體，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34 +細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞，並且該等完全分化體細胞係造血細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
在另一種組成物即組成物56中，本發明提供一種組成物，該組成物包含組成物55的細胞群體，其中該等造血細胞係NK細胞、T細胞、B細胞或NKT細胞。
在另一種組成物即組成物57中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物56的細胞群體，其中該等造血細胞係人NK細胞。
在另一種組成物即組成物58中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物54-57中任一種的細胞群體，其中該群體中至少25%或至少50%的工程化細胞表現CAR、HLA-E和/或IL15與IL15Rα之融合蛋白。
在另一種組成物即組成物59中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物54-58中任一種的細胞群體，其中該群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的B2M蛋白、CIITA蛋白和/或ADAM17蛋白。
在另一種組成物即組成物60中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物57-59中任一種的細胞群體，其中該群體的工程化人NK細胞當與癌細胞群體在體外共培養時誘導至少70%、至少80%或至少90%的該癌細胞群體的細胞裂解。
在另一種組成物即組成物61中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物57-60中任一種的細胞群體，其中該群體的工程化人NK細胞當與癌細胞群體在體外共培養時分泌IFNγ。
在另一種組成物即組成物62中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物60或61的細胞群體，其中該工程化人NK細胞與癌細胞的比率為0.1 : 1至2 : 1。
在另一種組成物即組成物63中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物53的多個工程化細胞或組成物54-62的細胞群體。
在另一種組成物即組成物64中，本揭露提供了如組成物63中所提供的組成物，該組成物用於治療有需要的受試者。
在另一種組成物即組成物65中，本揭露提供了如組成物63中所提供的組成物，該組成物用於治療有需要的受試者中的癌症。
在另一種組成物即組成物66中，本揭露提供了如組成物65中所提供的組成物，其中該受試者患有多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病（B-ALL）、B-細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NL）、慢性淋巴細胞白血病（C-CLL）、T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、透明細胞腎細胞癌（ccRCC）、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、胰臟癌、黑色素瘤、卵巢癌、神經膠質母細胞瘤或子宮頸癌。
在另一種組成物即組成物67中，本揭露提供了如組成物64-66中任一種中所提供的組成物，其中該受試者係人。
在第一方法即方法1中，本揭露提供了獲得用於向有需要的受試者投與的細胞之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得組成物53的多個工程化細胞，和 (b) 將該多個工程化細胞在足以使該等細胞分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的條件下保持一段時間。
在另一種方法即方法2中，本揭露提供了用於治療有需要的受試者之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞後的組成物53的多個工程化細胞；以及 (b) 向該受試者投與該等譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
在另一種方法即方法3中，本揭露提供了如方法1或2中所提供之方法，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34 +細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞，並且該等完全分化體細胞係造血細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
在另一種方法即方法4中，本揭露提供了如方法1-3中任一種中所提供之方法，其中該受試者患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險。
在另一種方法即方法5中，本揭露提供了如方法1-4中任一種中所提供之方法，其中該受試者係人。
在另一種方法即方法6中，本揭露提供了用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送：(a) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 β-2 微球蛋白（ B2M）基因座中的靶位點的引導RNA（gRNA）的第一核糖核蛋白（RNP）複合體；(b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的核苷酸序列，其中該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體包含IL15與IL15Rα之融合蛋白、P2A肽序列和HLA-E三聚體；(ii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)，其中該 B2M基因座在該靶位點處被切割，並且包含編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的核苷酸序列的核酸被插入該 B2M基因座中，從而破壞該 B2M基因。
在另一種方法即方法7中，本揭露提供了方法6的體外方法，該方法進一步包括向該細胞遞送：(c) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的gRNA的第二RNP複合體，(d) 包含核酸的第二載體，該核酸包含：(i) 編碼CAR的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)，和 (e) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 ADAM17基因座中的靶位點的gRNA的第三RNP複合體，其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割並且包含編碼該CAR的核苷酸序列的核酸被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因，並且其中該 ADAM17基因座在該靶位點處被切割並且該 ADAM17基因被破壞。
在另一種方法即方法8中，本揭露提供了用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送：(a) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 β-2 微球蛋白（ B2M）基因座中的靶位點的引導RNA（gRNA）的第一核糖核蛋白（RNP）複合體，(b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的核苷酸序列，其中該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體包含IL15與IL15Rα之融合蛋白、P2A肽序列和HLA-E三聚體；(ii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)，(c) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的gRNA的第二RNP複合體，(d) 包含核酸的第二載體，該核酸包含：(i) 編碼CAR的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)；和 (e) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 ADAM17基因座中的靶位點的gRNA的第三RNP複合體，其中該 B2M基因座在該靶位點處被切割並且包含編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的核苷酸序列的核酸被插入該 B2M基因座中，從而破壞 B2M基因，其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割並且包含編碼該CAR的核苷酸序列的核酸被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因，並且其中該 ADAM17基因座在該靶位點處被切割並且該 ADAM17基因被破壞。
在另一種方法即方法9中，本揭露提供了方法6-8中任一種的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的B2M表現。
在另一種方法即方法10中，本揭露提供了方法7-9中任一種的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的CIITA表現。
在另一種方法即方法11中，本揭露提供了方法7-10中任一種的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的ADAM17表現。
在另一種方法即方法12中，本揭露提供了方法6-11中任一種的體外方法，其中該第一RNP複合體的gRNA包含對應於由以下項組成之序列的間隔子序列：SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79。
在另一種方法即方法13中，本揭露提供了方法7-12中任一種的體外方法，其中該第二RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17組成之序列的間隔子序列，並且該第三RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法14中，本揭露提供了方法6-13中任一種的體外方法，其中該第一RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 34組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法15中，本揭露提供了方法7-14中任一種的體外方法，其中該第二RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17組成之序列的間隔子序列，並且該第三RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法16中，本揭露提供了方法6-15中任一種的體外方法，其中該第一載體係質體載體。
在另一種方法即方法17中，本揭露提供了方法7-16中任一種的體外方法，其中該第二載體係質體載體。
在另一種方法即方法18中，本揭露提供了方法6-17中任一種的體外方法，其中編碼該HLA-E三聚體序列的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 75組成。
在另一種方法即方法19中，本揭露提供了方法6-18中任一種的體外方法，其中編碼該IL15/IL15Rα序列的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 76組成。
在另一種方法即方法20中，本揭露提供了方法6-19中任一種的體外方法，其中編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 77組成。
在另一種方法即方法21中，本揭露提供了方法6-20中任一種的體外方法，其中編碼該IL15/IL15Rα-P2A-HLA-E三聚體構建體的該核苷酸序列可操作地連接到外源啟動子。
在另一種方法即方法22中，本揭露提供了方法7-21中任一種的體外方法，其中編碼該CAR的該核苷酸序列可操作地連接到外源啟動子。
在另一種方法即方法23中，本揭露提供了方法21或22中任一種的體外方法，其中該外源啟動子係CMV、EF1α、PGK、CAG、或UBC啟動子。
在另一種方法即方法24中，本揭露提供了方法6-23中任一種的體外方法，其中該第一RNP複合體包含1 : 3的RNA引導的核酸酶與gRNA的莫耳比。
在另一種方法即方法25中，本揭露提供了方法7-24中任一種的體外方法，其中該第二RNP複合體和該第三RNP複合體中的每一種包含1 : 3的RNA引導的核酸酶與gRNA的莫耳比。
在另一種方法即方法26中，本揭露提供了方法7-25中任一種的體外方法，其中該第一RNP複合體的該RNA引導的核酸酶係Cas9核酸酶。
在另一種方法即方法27中，本揭露提供了方法7-26中任一種的體外方法，其中該第二RNP複合體和該第三RNP複合體的RNA引導的核酸酶中的每一種係Cas9核酸酶。
在另一種方法即方法28中，本揭露提供了方法26或27的體外方法，其中該Cas9核酸酶連接到至少一個核定位訊息。
在另一種方法即方法29中，本揭露提供了方法6-28中任一種的體外方法，其中該細胞係幹細胞。
在另一種方法即方法30中，本揭露提供了方法29的體外方法，其中該幹細胞係胚胎幹細胞、成體幹細胞、誘導多能幹細胞或造血幹細胞。
在另一種方法即方法31中，本揭露提供了方法29或30中任一種的體外方法，其中該幹細胞係人幹細胞。
在另一種方法即方法32中，本揭露提供了方法6-31中任一種的體外方法，其中 (b) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 36組成，並且 (b) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 54組成。
在另一種方法即方法33中，本揭露提供了方法6-32中任一種的體外方法，其中 (d) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 22組成，並且 (d) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 32組成。
在另一種方法即方法34中，本揭露提供了用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送：(a) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的gRNA的第一RNP複合體，(b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼CAR的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)；並且其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割，並且包含編碼該CAR的核苷酸序列的核酸被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因。
在另一種方法即方法35中，本揭露提供了用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送：(a) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 ADAM17基因座中的靶位點的引導RNA（gRNA）的第一核糖核蛋白（RNP）複合體，(b) 包含RNA引導的核酸酶和靶向MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體基因座的組分或轉錄調控子中的靶位點的gRNA的第二RNP複合體，(c) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼CAR的核苷酸序列；(ii) 與位於該MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體基因座的組分或其轉錄調控子中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體基因座的組分或其轉錄調控子中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)，其中該 ADAM17基因座在該靶位點處被切割並且該 ADAM17基因被破壞，並且其中該MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體基因座的組分或轉錄調控子在該靶位點處被切割並且包含編碼該CAR的核苷酸序列的核酸被插入該MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體基因座的組分或其轉錄調控子中，從而破壞該MHC-I或MHC-II人白血球抗原、或MHC-I或MHC-II複合體基因的組分或其轉錄調控子。
在另一種組成物即組成物68中，本揭露提供了藉由方法6-35中任一種的方法生成或可獲得的多個工程化細胞。
在另一種組成物即組成物69中，本揭露提供了組成物68的多個工程化細胞，該多個工程化細胞在足以使該等細胞經歷分化的條件下保持一段時間。
在另一種組成物即組成物70中，本揭露提供了組成物69或70的多個工程化細胞，該多個工程化細胞用於治療有需要的受試者。
在另一種組成物即組成物71中，本揭露提供了用於組成物70的多個細胞，其中該受試者係患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險的人。
在另一種方法即方法36中，本揭露提供了一種方法，該方法包括向受試者投與組成物68或69的多個工程化細胞。
在另一種方法即方法37中，本揭露提供了用於治療有需要的受試者之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞後的組成物68的多個工程化細胞，和 (b) 向該受試者投與該等譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
在另一種方法即方法38中，本揭露提供了獲得用於向有需要的受試者投與的細胞之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得組成物68的工程化細胞，和 (b) 將該等工程化細胞在足以使該等細胞分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的條件下保持一段時間。
在另一種方法即方法39中，本揭露提供了方法37或38之方法，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34 +細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞。
在另一種方法即方法40中，本揭露提供了方法37或38之方法，其中該等完全分化體細胞係造血細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
在另一種方法即方法41中，本揭露提供了方法36-40中任一種之方法，其中該受試者係患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險的人。
在另一種方法即方法42中，本揭露提供了方法41之方法，其中該受試者患有多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病（B-ALL）、B-細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NL）、慢性淋巴細胞白血病（C-CLL）、T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、透明細胞腎細胞癌（ccRCC）、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、胰臟癌、黑色素瘤、卵巢癌、神經膠質母細胞瘤或子宮頸癌。
在另一種組成物即組成物72中，本揭露提供了包含對應於由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10組成之序列的間隔子序列的引導RNA。
在另一種組成物即組成物73中，本揭露提供了包含對應於由SEQ ID NO: 1組成之序列的間隔子序列的引導RNA。
在另一種方法即方法43中，本揭露提供了用於從幹細胞生成自然殺手（NK）細胞之方法，該方法包括：(a) 將幹細胞群體在包含ROCK抑制劑的第一培養基中在足以形成聚集體的條件下培養，(b) 將該等聚集體在包含BMP-4的第二培養基中培養，(c) 將該等聚集體在包含BMP-4、FGF2、WNT通路活化劑和活化素A的第三培養基中培養，(d) 將該等聚集體在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3、FLT3L、WNT C-59和活化素/nodal抑制劑的第四培養基中培養以形成包含造血幹細胞和先驅細胞（HSPC）的細胞群體，(e) 將該細胞群體在包含FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL-3和FLT3L的第五培養基中培養，(f) 將該細胞群體在包含IL-3、IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第六培養基中培養細胞群體，(g) 將該細胞群體在包含IL-7、FLT3L、IL-15和SCF的第七培養基中培養；以及，視需要 (h) 將該細胞群體在包含IL-7、FLT3L、IL-15、SCF和菸鹼醯胺的第八培養基中培養足以生成NK細胞的時間。
在另一種方法即方法44中，本揭露提供了方法43之方法，其中該第二培養基進一步包含ROCK抑制劑。
在另一種方法即方法45中，本揭露提供了方法43或方法44之方法，其中該ROCK抑制劑係噻唑維林或Y27632。
在另一種方法即方法46中，本揭露提供了方法43-45中任一種之方法，其中該WNT通路活化劑係CHIR-99021。
在另一種方法即方法47中，本揭露提供了方法43-46中任一種之方法，其中該活化素/nodal抑制劑係SB-431542。
在另一種方法即方法48中，本揭露提供了方法43-47中任一種之方法，其中步驟 (a)-(g) 發生在20-35天之間或步驟 (a)-(h) 發生在24-36天之間。
在另一種方法即方法49中，本揭露提供了方法43-48中任一種之方法，其中 (a) 包括培養12-48小時。
在另一種方法即方法50中，本揭露提供了方法43-49中任一種之方法，其中 (b) 包括培養至多24小時。
在另一種方法即方法51中，本揭露提供了方法43-50中任一種之方法，其中 (c) 包括培養1-3天。
在另一種方法即方法52中，本揭露提供了方法43-51中任一種之方法，其中 (d) 包括培養1-3天。
在另一種方法即方法53中，本揭露提供了方法43-52中任一種之方法，其中 (e) 包括培養1-3天。
在另一種方法即方法54中，本揭露提供了方法43-53中任一種之方法，其中 (f) 包括培養至多7天。
在另一種方法即方法55中，本揭露提供了方法43-54中任一種之方法，其中 (g) 包括培養至少6天並且至多總共21-28天；或其中 (g) 包括培養至多6天並且 (h) 包括培養至少6天並且總共至多10-16天。
在另一種方法即方法56中，本揭露提供了方法43-56中任一種之方法，其中：(a) 包括培養16-20小時，(b) 包括培養6-10小時，(c) 包括培養2天，(d) 包括培養2天，(e) 包括培養2天，(f) 包括培養4天，(g) 包括培養14-28天，或 (a) 包括培養16-20小時，(b) 包括培養6-10小時，(c) 包括培養2天，(d) 包括培養2天，(e) 包括培養2天，(f) 包括培養4天，(g) 包括培養6天，和 (h) 包括培養10-16天。
在另一種方法即方法57中，本揭露提供了方法43-56中任一種之方法，其中該方法在懸浮攪拌下進行。
在另一種方法即方法58中，本揭露提供了方法57中任一種之方法，其中該懸浮攪拌包括旋轉。
在另一種方法即方法59中，本揭露提供了方法43-58中任一種之方法，其中該第一培養基包括StemFlex或StemBrew培養基。
在另一種方法即方法60中，本揭露提供了方法43-59中任一種之方法，其中該第二培養基、該第三培養基、該第四培養基和該第五培養基包括APEL培養基。
在另一種方法即方法61中，本揭露提供了方法43-60中任一種之方法，其中該第六培養基和該第七培養基包括DMEM/F12培養基。
在另一種方法即方法62中，本揭露提供了方法43-61中任一種之方法，其中該第六培養基和該第七培養基包含 (a) 人血清、硫酸鋅、乙醇胺、β-巰基乙醇、葡萄糖或其任何組合或 (b) 人血清、硫酸鋅、乙醇胺、葡萄糖或其任何組合；和/或該第八培養基包含人血清、硫酸鋅、乙醇胺、葡萄糖或其任何組合
在另一種方法即方法63中，本揭露提供了方法62中之任一種之方法，其中該人血清的濃度係10%-20%、10%、15%或20%。
在另一種方法即方法64中，本揭露提供了方法43-63中任一種之方法，其中該第一培養基包含10 µM ROCK抑制劑。
在另一種方法即方法65中，本揭露提供了方法43-64中任一種之方法，其中該第二培養基包含30 ng/mL BMP-4和視需要10 µM ROCK抑制劑。
在另一種方法即方法66中，本揭露提供了方法43-65中任一種之方法，其中該第三培養基包含30 ng/mL BMP-4、100 ng/mL FGF2、6 µM或7 µM CHIR-99021和2.5-5 ng/mL活化素A。
在另一種方法即方法67中，本揭露提供了方法66中之任一種之方法，其中將一半的該第三培養基添加到幹細胞聚集體中。
在另一種方法即方法68中，本揭露提供了方法43-66中任一種之方法，其中該第四培養基和該第五培養基包含20 ng/mL FGF、20 ng/mL VEGF、20 ng/mL TPO、100 ng/mL SCF、40 ng/mL IL-3和10-20 ng/mL FLT3L。
在另一種方法即方法69中，本揭露提供了方法43-68中任一種之方法，其中該第四培養基進一步包含5 µM SB-431542和視需要2 µM WNT C-59。
在另一種方法即方法70中，本揭露提供了方法43-69中任一種之方法，其中該第六培養基和該第七培養基包含20 ng/mL IL-7、10-20 ng/mL FLT3L、10-20 ng/mL IL-15和20 ng/mL SCF。
在另一種方法即方法71中，本揭露提供了方法43-70中任一種之方法，其中該第六培養基包含5 ng/mL IL-3。
在另一種方法即方法72中，本揭露提供了方法43-71中任一種之方法，其中 (d) 的該HSPC表現CD34。
在另一種方法即方法73中，本揭露提供了方法43-72中任一種之方法，其中該NK細胞表現CD56。
在另一種方法即方法74中，本揭露提供了方法43-73中任一種之方法，其中該NK細胞表現至少一種活化受體。
在另一種方法即方法75中，本揭露提供了方法74中任一種之方法，其中該至少一種活化受體選自下組：NKp44、NKp46、CD16、KIR2DL4及其任何組合。
在另一種方法即方法76中，本揭露提供了方法43-75中任一種之方法，其中該NK細胞表現至少一種抑制性受體。
在另一種方法即方法77中，本揭露提供了方法76中任一種之方法，其中該至少一種抑制性受體選自下組：CD94、NKG2A、KIR3DL2及其任何組合。
在另一種方法即方法78中，本揭露提供了方法43-77中任一種之方法，其中該NK細胞包括至少一種與內源NK細胞相關的功能。
在另一種方法即方法79中，本揭露提供了方法78中之任一種之方法，其中該至少一種功能包括誘導靶細胞之細胞裂解和細胞死亡的能力。
在另一種方法即方法80中，本揭露提供了方法78或79中之任一種之方法，其中該至少一種功能包括去顆粒。
在另一種方法即方法81中，本揭露提供了方法80中任一種之方法，其中去顆粒包括穿孔素和顆粒酶B的釋放。
在另一種方法即方法82中，本揭露提供了方法80或81中任一種之方法，其中去顆粒包括在NK細胞之細胞表面上表現CD107a。
在另一種方法即方法83中，本揭露提供了方法43-82中任一種之方法，其中該幹細胞群體係工程化細胞群體。
在另一種組成物即組成物74中，本揭露提供了藉由方法6-35中任一種的方法生成或可獲得的工程化細胞群體。
在另一種組成物即組成物75中，本揭露提供了藉由方法43-82中任一種的方法分化的工程化細胞群體。
在另一種組成物即組成物76中，本揭露提供了方法43-82中任一種之方法，其中該幹細胞群體係組成物75的工程化細胞群體。
在另一種組成物即組成物77中，本揭露提供了藉由方法43-83中任一種的方法生成或可獲得的多個自然殺手（NK）細胞。
在另一種組成物即組成物78中，本揭露提供了組成物77的多個工程化細胞，該多個工程化細胞用於治療有需要的受試者。
在另一種組成物即組成物79中，本揭露提供了用於組成物78的多個細胞，其中該受試者係患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險的人。
在另一種組成物即組成物80中，本揭露提供了一種方法，該方法包括向受試者投與組成物77的多種NK細胞。
在另一種組成物即組成物81中，本揭露提供了工程化細胞，該工程化細胞包含：(a) 破壞的 B2M基因，和 (b) 插入該破壞的 B2M基因中之第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中 (i) 該第一多核苷酸編碼SERPINB9，並且 (ii) 該第二多核苷酸編碼介白素-15（IL15）與介白素-15受體亞基α（IL15Rα）之融合蛋白，其中該細胞表現SERPINB9以及IL15與IL15Rα之融合蛋白，並且該細胞具有破壞的B2M表現。
在另一種組成物即組成物82中，本揭露提供了組成物81的工程化細胞，其中該破壞的B2M表現包括降低或消除的B2M表現。
在另一種組成物即組成物83中，本揭露提供了組成物81或82的工程化細胞，其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸作為編碼SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體的多核苷酸插入，其中編碼該SERPINB9的多核苷酸藉由2A肽編碼序列連接到編碼該Il15/IL15Rα融合體的多核苷酸。
在另一種組成物即組成物84中，本揭露提供了組成物83的工程化細胞，其中編碼該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα的該多核苷酸被插入該 B2M基因座的外顯子1中。
在另一種組成物即組成物85中，本揭露提供了組成物81-84中任一種的工程化細胞，該工程化細胞進一步包含破壞的CIITA基因，其中該細胞具有破壞的 CIITA表現。
在另一種組成物即組成物86中，本揭露提供了組成物85的工程化細胞，其中該破壞的CIITA表現包括降低或消除的CIITA表現。
在另一種組成物即組成物87中，本揭露提供了170。組成物81-86中任一種的工程化細胞，該工程化細胞進一步包含編碼嵌合抗原受體（CAR）之多核苷酸的插入，其中該細胞表現該CAR。
在另一種組成物即組成物88中，本揭露提供了組成物87的工程化細胞，其中該CAR被插入該破壞的 CIITA基因中。
在另一種組成物即組成物89中，本揭露提供了組成物87或88的工程化細胞，其中該CAR被插入該 CIITA基因座的外顯子2中。
在另一種組成物即組成物90中，本揭露提供了組成物87-89中任一種的工程化細胞，其中編碼該CAR的該多核苷酸藉由2A肽編碼序列連接到編碼該HLA-E的多核苷酸（CAR-P2A-HLA-E），並且其中該細胞表現該CAR和HLA-E。
在另一種組成物即組成物91中，本揭露提供了組成物81-90中任一種的工程化細胞，該工程化細胞進一步包含破壞的 CISH基因，其中該細胞具有破壞的CISH表現。
在另一種組成物即組成物92中，本揭露提供了組成物91的工程化細胞，其中該破壞的CISH表現包括降低或消除的CISH表現。
在另一種組成物即組成物93中，本揭露提供了組成物81-92中任一種的工程化細胞，該工程化細胞進一步包含破壞的 FAS基因，其中該細胞具有破壞的FAS表現。
在另一種組成物即組成物94中，本揭露提供了組成物93的工程化細胞，其中該破壞的FAS表現包括降低或消除的FAS表現。
在另一種組成物即組成物95中，本揭露提供了工程化細胞，該工程化細胞包含：(a) 破壞的 B2M基因，和 (b) 第一多核苷酸和第二多核苷酸的插入，視需要其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸被插入該破壞的 B2M基因中，其中 (i) 該第一多核苷酸編碼SERPINB9，並且 (ii) 該第二多核苷酸編碼介白素-15（IL15）與介白素-15受體亞基α（IL15Rα）之融合蛋白，(c) 破壞的 CIITA基因，(d) 編碼CAR的第三多核苷酸和編碼HLA-E的第四多核苷酸的插入，視需要其中該CAR和該HLA-E被插入該破壞的 CIITA基因中，(e) 破壞的 CISH基因，和 (f) 破壞的 FAS基因，其中該細胞表現SERPINB9、IL15與IL15Rα之融合蛋白、HLA-E和CAR，並且該細胞具有破壞的B2M、CIITA、CISH和FAS表現。
在另一種組成物即組成物96中，本揭露提供了組成物95的工程化細胞，其中該破壞的B2M、CIITA、CISH和FAS表現包括降低或消除的B2M、CIITA、CISH和FAS表現。
在另一種組成物即組成物97中，本揭露提供了組成物95或96的工程化細胞，其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸作為編碼SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體的多核苷酸插入，其中編碼該SERPINB9的該多核苷酸藉由2A肽編碼序列連接到編碼該Il15/IL15Rα融合體的多核苷酸。
在另一種組成物即組成物98中，本揭露提供了組成物97的工程化細胞，其中編碼該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體的該多核苷酸被插入該 B2M基因座的外顯子1中。
在另一種組成物即組成物99中，本揭露提供了組成物83-94、97和98中任一種的工程化細胞，其中編碼該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體的該多核苷酸包含SEQ ID NO: 137的多核苷酸序列。
在另一種組成物即組成物100中，本揭露提供了組成物83-94和97-99中任一種的工程化細胞，其中SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα可操作地連接到外源啟動子。
在另一種組成物即組成物101中，本揭露提供了組成物100的工程化細胞，其中該外源啟動子係CAG、CMV、EF1α、PGK或UBC啟動子。
在另一種組成物即組成物102中，本揭露提供了組成物100或101的工程化細胞，其中該外源啟動子係CAG並且CAG-SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα基本上由SEQ ID NO: 138組成。
在另一種組成物即組成物103中，本揭露提供了組成物95-102中任一種的工程化細胞，其中該第三多核苷酸和該第四多核苷酸作為編碼CAR-P2A-HLA-E構建體的多核苷酸插入，其中編碼該CAR的該多核苷酸藉由2A肽編碼序列連接到編碼該HLA-E的該多核苷酸
在另一種組成物即組成物104中，本揭露提供了組成物103的工程化細胞，其中該CAR-P2A-HLA-E構建體被插入該 CIITA基因座的外顯子2中。
在另一種組成物即組成物105中，本揭露提供了組成物90-104中任一種的工程化細胞，其中該HLA-E係HLA-E三聚體，其包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
在另一種組成物即組成物106中，本揭露提供了組成物87-105中任一種的工程化細胞，其中該CAR係CD30 CAR、BCMA CAR、GPC3 CAR、CD19 CAR、CD33 CAR、NKG2D CAR、CD70 CAR、NKp30 CAR、CD73 CAR、GPR87 CAR、L1V1A CAR、A33 CAR、EGFR CAR、CD20 CAR或SLC7A11 CAR。
在另一種組成物即組成物107中，本揭露提供了組成物87-106中任一種的工程化細胞，其中該CAR包含結合CD30的胞外結構域。
在另一種組成物即組成物108中，本揭露提供了組成物107的工程化細胞，其中該結合CD30的胞外結構域包含SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 115的多核苷酸序列。
在另一種組成物即組成物109中，本揭露提供了組成物107或108的工程化細胞，其中編碼該CAR-P2A-HLA-E的該多核苷酸包含SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120或SEQ ID NO: 121的多核苷酸序列。
在另一種組成物即組成物110中，本揭露提供了組成物90-94和103-109中任一種的工程化細胞，其中該CAR-P2A-HLA-E可操作地連接到外源啟動子。
在另一種組成物即組成物111中，本揭露提供了組成物110的工程化細胞，其中該外源啟動子係CAG、CMV、EF1α、PGK或UBC啟動子。
在另一種組成物即組成物112中，本揭露提供了組成物110或111的工程化細胞，其中該外源啟動子係CAG並且CAG-CAR-P2A-HLA-E基本上由SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140或SEQ ID NO: 141組成。
在另一種組成物即組成物113中，本揭露提供了組成物81-112中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞係幹細胞。
在另一種組成物即組成物114中，本揭露提供了組成物113的工程化細胞，其中該幹細胞係誘導多能幹細胞（iPSC）、造血幹細胞、胚胎幹細胞或成體幹細胞。
在另一種組成物即組成物115中，本揭露提供了組成物81-114中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞係經基因組編輯的iPSC。
在另一種組成物即組成物116中，本揭露提供了組成物81-112中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞係從經基因組編輯的iPSC獲得的自然殺手（NK）細胞。
在另一種組成物即組成物117中，本揭露提供了組成物81-112中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞係分化細胞或體細胞。
在另一種組成物即組成物118中，本揭露提供了組成物81-112中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞能夠分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
在另一種組成物即組成物119中，本揭露提供了組成物81-118中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞係自然殺手（NK）細胞。
在另一種組成物即組成物120中，本揭露提供了組成物119的工程化細胞，其中該NK細胞已從經基因組編輯的iPSC分化，其中該NK細胞包含該經基因組編輯的iPSC的基因組編輯，其中該NK細胞在分化後尚未被基因組編輯。
在另一種組成物即組成物121中，本揭露提供了組成物81-120中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種、四種或五種：CD56、NKp44、NKp46、CD94、NKG2A和KIR2DL4，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%或75%的水平表現。
在另一種組成物即組成物122中，本揭露提供了組成物81-121中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞具有以下特徵中的至少一個或其任何組合：(i) 相對於未修飾的細胞，同種免疫T細胞反應小於10%，以及 (ii) 當該等工程化細胞與靶細胞以1 : 1的比率混合時，細胞毒活性導致殺傷超過50%的靶細胞；(iii) 相對於未修飾的細胞，細胞活力增加至少50%。
在另一種組成物即組成物123中，本揭露提供了組成物81-122中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞具有以下特徵中的至少一個或其任何組合：(i) 改善的持久性，(ii) 改善的免疫逃避性，(iii) 改善的細胞毒活性，(iv) 改善的ADCC活性，和 (v) 改善的抗腫瘤活性；其中相對於野生型細胞，視需要相對於野生型iPSC或野生型NK細胞，該等特徵得到改善。
在另一種組成物即組成物124中，本揭露提供了組成物81-123中任一種的工程化細胞，其中該工程化細胞能夠在細胞培養基中不存在外源IL15的情況下進行細胞擴增。
在另一種組成物即組成物125中，本揭露提供了根據組成物81至124中任一種的多個工程化細胞。
在另一種組成物即組成物126中，本揭露提供了源自組成物125的多個工程化細胞的譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的群體。
在另一種組成物即組成物127中，本揭露提供了組成物126的細胞群體，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34 +細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞，並且該等完全分化體細胞係造血細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
在另一種組成物即組成物128中，本揭露提供了組成物127的細胞群體，其中該等造血細胞係NK細胞、T細胞、B細胞或NKT細胞。
在另一種組成物即組成物129中，本揭露提供了組成物128的細胞群體，其中該等造血細胞係人NK細胞。
在另一種組成物即組成物130中，本揭露提供了組成物126-129中任一種的細胞群體，其中該群體中至少25%或至少50%的工程化細胞表現CAR、HLA-E和/或IL15與IL15Rα之融合蛋白。
在另一種組成物即組成物131中，本揭露提供了組成物126-130中任一種的細胞群體，其中該群體中至少50%的工程化細胞不表現可檢測水平的B2M蛋白、CIITA蛋白和/或ADAM17蛋白。
在另一種組成物即組成物132中，本揭露提供了組成物129-131中任一種的細胞群體，其中該群體的工程化人NK細胞當與癌細胞群體在體外共培養時誘導至少70%、至少80%或至少90%的該癌細胞群體的細胞裂解。
在另一種組成物即組成物133中，本揭露提供了組成物129-132中任一種的細胞群體，其中該群體的工程化人NK細胞當與癌細胞群體在體外共培養時分泌IFNγ。
在另一種組成物即組成物134中，本揭露提供了組成物132或133的細胞群體，其中工程化人NK細胞與癌細胞的該比率為0.1 : 1至2 : 1。
在另一種組成物即組成物135中，本揭露提供了一種組成物，該組成物包含組成物125的多個工程化細胞或組成物126-134中任一種的細胞群體。
在另一種組成物即組成物136中，本揭露提供了組成物135的組成物，該組成物用於治療有需要的受試者。
在另一種組成物即組成物137中，本揭露提供了組成物135的組成物，該組成物用於治療有需要的受試者中的癌症。
在另一種組成物即組成物138中，本揭露提供了組成物或組成物137，其中該受試者患有多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病（B-ALL）、B-細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NL）、慢性淋巴細胞白血病（C-CLL）、T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、透明細胞腎細胞癌（ccRCC）、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、胰臟癌、黑色素瘤、卵巢癌、神經膠質母細胞瘤或子宮頸癌。
在另一種組成物即組成物139中，本揭露提供了組成物136-138中任一種的組成物，其中該受試者係人。
在另一種方法即方法84中，本揭露提供了獲得用於向有需要的受試者投與的細胞之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得組成物125的多個工程化細胞，和 (b) 將該多個工程化細胞在足以使該等細胞分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的條件下保持一段時間。
在另一種方法即方法85中，本揭露提供了用於治療有需要的受試者之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞後的組成物125的多個工程化細胞；以及 (b) 向該受試者投與該等譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
在另一種方法即方法86中，本揭露提供了方法84或85之方法，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34 +細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞，並且該等完全分化體細胞係造血細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
在另一種方法即方法87中，本揭露提供了方法84-86中任一種之方法，其中該受試者患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險。
在另一種方法即方法88中，本揭露提供了方法84-87中任一種之方法，其中該受試者係人。
在另一種方法即方法89中，本揭露提供了用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送：(a) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 B2M基因座中的靶位點的gRNA的第一RNP複合體；和 (b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼SERPINB9的核苷酸序列和編碼IL15/IL15Rα融合體的核苷酸序列；(ii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)；其中該 B2M基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該SERPINB9和IL15/IL15Rα融合體的該核苷酸序列被插入該 B2M基因座中，從而破壞該 B2M基因。
在另一種方法即方法90中，本揭露提供了方法229即方法89的體外方法，其中該第一RNP複合體的gRNA包含對應於由以下項組成之序列的間隔子序列：SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79，視需要對應於由SEQ ID NO: 34組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法91中，本揭露提供了89或90的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的B2M表現。
在另一種方法即方法92中，本揭露提供了方法即方法89至91中任一種的體外方法，其中 (b) (i) 的該核苷酸序列包含與編碼P2A肽序列的核苷酸序列連接的編碼該SERPINB9的該核苷酸序列，編碼該P2A肽序列的該核苷酸序列與編碼該IL15/IL15Rα融合體（SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα）的該核苷酸序列連接。
在另一種方法即方法93中，本揭露提供了方法92的體外方法，其中SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα基本上由SEQ ID NO: 137組成。
在另一種方法即方法94中，本揭露提供了方法92或93的體外方法，其中SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα可操作地連接到外源啟動子。
在另一種方法即方法95中，本揭露提供了方法94的體外方法，其中該外源啟動子係CAG（CAG-SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα），並且CAG-SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα基本上由SEQ ID NO: 138組成。
在另一種方法即方法96中，本揭露提供了方法89至94中任一種的體外方法，其中 (b) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 36組成，並且 (b) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 54組成。
在另一種方法即方法97中，本揭露提供了方法89至96中任一種的體外方法，其中該第一載體基本上由SEQ ID NO: 148組成。
在另一種方法即方法98中，本揭露提供了方法89至97中任一種的體外方法，進一步包括向該細胞遞送：(c) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的gRNA的第二RNP複合體，(d) 包含核酸的第二載體，該核酸包含：(i) 編碼CAR的核苷酸序列和編碼HLA-E三聚體的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)，並且其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該CAR和該HLA-E三聚體的核苷酸序列被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因。
在另一種方法即方法99中，本揭露提供了方法98的體外方法，其中該第二RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 13-17中任一種組成之序列的間隔子序列，視需要對應於由SEQ ID NO: 13組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法100中，本揭露提供了方法98或99的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的CIITA表現。
在另一種方法即方法101中，本揭露提供了方法98至100中任一種的體外方法，其中 (d) (i) 的該核苷酸序列包含與編碼P2A肽序列的核苷酸序列連接的編碼該CAR的該核苷酸序列，編碼該P2A肽序列的該核苷酸序列與編碼該HLA-E三聚體的該核苷酸序列連接。
在另一種方法即方法102中，本揭露提供了方法98至101中任一種的體外方法，其中 (d) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 22組成，並且 (d) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 32組成。
在另一種方法即方法103中，本揭露提供了方法89至102中任一種的體外方法，該體外方法進一步包括向該細胞遞送包含RNA引導的核酸酶和靶向 CISH基因座中的靶位點的gRNA的第三RNP複合體。
在另一種方法即方法104中，本揭露提供了方法103的體外方法，其中該第三RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 81-92組成之序列的間隔子序列，視需要對應於由SEQ ID NO: 82組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法105中，本揭露提供了方法103或104的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的CISH表現。
在另一種方法即方法106中，本揭露提供了方法89至105中任一種的體外方法，該體外方法進一步包括向該細胞遞送包含RNA引導的核酸酶和靶向 FAS基因座中的靶位點的gRNA的第四RNP複合體。
在另一種方法即方法107中，本揭露提供了方法106的體外方法，其中該第四RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 35、37、38、39、53、55和80中任一種組成之序列的間隔子序列，視需要對應於由SEQ ID NO: 37組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法108中，本揭露提供了方法106或107的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的FAS表現。
在另一種方法即方法109中，本揭露提供了用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送：(a) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 B2M基因座中的靶位點的gRNA的第一RNP複合體，(b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼SERPINB9的核苷酸序列和編碼IL15/IL15Rα融合體的核苷酸序列；(ii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)，(c) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的gRNA的第二RNP複合體；和 (d) 包含核酸的第二載體，該核酸包含：(i) 編碼CAR的核苷酸序列和編碼HLA-E三聚體的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)，(e) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 CISH基因座中的靶位點的gRNA的第三RNP複合體，和 (f) 包含RNA引導的核酸酶和靶向 FAS基因座中的靶位點的gRNA的第四RNP複合體，其中該 B2M基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該SERPINB9和該IL15/IL15Rα融合體的核苷酸序列被插入該 B2M基因座中，從而破壞該 B2M基因，其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該CAR和該HLA-E三聚體的核苷酸序列被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因，其中該 CISH基因座在該靶位點處被切割，從而破壞該 CISH基因，並且其中該 FAS基因座在該靶位點處被切割，從而破壞該 FAS基因。
在另一種方法即方法110中，本揭露提供了方法109的體外方法，其中該第一RNP複合體的gRNA包含對應於由以下項組成之序列的間隔子序列：SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79，視需要對應於由SEQ ID NO: 34組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法111中，本揭露提供了方法109或110的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的B2M表現。
在另一種方法即方法112中，本揭露提供了方法109-111中任一種的體外方法，其中 (b) (i) 的該核苷酸序列包含與編碼P2A肽序列的核苷酸序列連接的編碼該SERPINB9的該核苷酸序列，編碼該P2A肽序列的該核苷酸序列與編碼該IL15/IL15Rα融合體（SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα）的該核苷酸序列連接。
在另一種方法即方法113中，本揭露提供了方法112的體外方法，其中SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα基本上由SEQ ID NO: 137組成。
在另一種方法即方法114中，本揭露提供了方法112或113的體外方法，其中SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα可操作地連接到外源啟動子。
在另一種方法即方法115中，本揭露提供了方法114的體外方法，其中該外源啟動子係CAG（CAG-SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα），並且CAG-SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα基本上由SEQ ID NO: 138組成。
在另一種方法即方法116中，本揭露提供了方法109至115中任一種的體外方法，其中 (b) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 36組成，並且 (b) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 54組成。
在另一種方法即方法117中，本揭露提供了方法109至116中任一種的體外方法，其中該第一載體基本上由SEQ ID NO: 148組成。
在另一種方法即方法118中，本揭露提供了方法109至117中任一種的體外方法，其中該第二RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 13-17中任一種組成之序列的間隔子序列，視需要對應於由SEQ ID NO: 13組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法119中，本揭露提供了方法118的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的CIITA表現。
在另一種方法即方法120中，本揭露提供了方法109至119中任一種的體外方法，其中 (d) (i) 的該核苷酸序列包含與編碼P2A肽序列的核苷酸序列連接的編碼該CAR的該核苷酸序列，編碼該P2A肽序列的該核苷酸序列與編碼該HLA-E三聚體的該核苷酸序列連接。
在另一種方法即方法121中，本揭露提供了方法109至120中任一種的體外方法，其中 (d) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 22組成，並且 (d) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 32組成。
在另一種方法即方法122中，本揭露提供了方法98-121中任一種的體外方法，其中該HLA-E係HLA-E三聚體，其包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
在另一種方法即方法123中，本揭露提供了方法98-122中任一種的體外方法，其中該CAR係CD30 CAR、BCMA CAR、GPC3 CAR、CD19 CAR、CD33 CAR、NKG2D CAR、CD70 CAR、NKp30 CAR、CD73 CAR、GPR87 CAR、L1V1A CAR、A33 CAR、EGFR CAR、CD20 CAR或SLC7A11 CAR。
在另一種方法即方法124中，本揭露提供了方法98-123中任一種的體外方法，其中該CAR包含結合CD30的胞外結構域。
在另一種方法即方法125中，本揭露提供了方法124的體外方法，其中該結合CD30的胞外結構域包含SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 115的多核苷酸序列。
在另一種方法即方法126中，本揭露提供了方法124或125的體外方法，其中編碼該CAR-P2A-HLA-E的該多核苷酸包含SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120或SEQ ID NO: 121的多核苷酸序列。
在另一種方法即方法127中，本揭露提供了方法101-108和120-126中任一種的體外方法，其中CAR-P2A-HLA-E可操作地連接到外源啟動子。
在另一種方法即方法128中，本揭露提供了方法127的體外方法，其中該外源啟動子係CAG、CMV、EF1α、PGK或UBC啟動子。
在另一種方法即方法129中，本揭露提供了方法109-128中任一種的體外方法，其中該第三RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 81-92中任一種組成之序列的間隔子序列，視需要對應於由SEQ ID NO: 82組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法130中，本揭露提供了方法129的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的CISH表現。
在另一種方法即方法131中，本揭露提供了方法109-130中任一種的體外方法，其中該第四RNP複合體的gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 35、37、38、39、53、55和80中任一種組成之序列的間隔子序列，視需要對應於由SEQ ID NO: 37組成之序列的間隔子序列。
在另一種方法即方法132中，本揭露提供了方法131的體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的FAS表現。
在另一種方法即方法133中，本揭露提供了方法98-132中任一種的體外方法，其中該第一載體係質體載體，其中該第一載體基本上由SEQ ID NO: 148組成。
在另一種方法即方法134中，本揭露提供了方法98-133中任一種的體外方法，其中該第二載體係質體載體，其中該第二載體基本上由SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 114或SEQ ID NO: 118組成。
在另一種方法即方法135中，本揭露提供了方法89至135中任一種的體外方法，其中該RNA引導的核酸酶係Cas9核酸酶。
在另一種方法即方法136中，本揭露提供了方法135的體外方法，其中該Cas9核酸酶連接到至少一個核定位訊息。
在另一種方法即方法137中，本揭露提供了方法89至136中任一種的體外方法，其中該細胞係幹細胞。
在另一種方法即方法138中，本揭露提供了方法137的體外方法，其中該幹細胞係胚胎幹細胞、成體幹細胞、誘導多能幹細胞或造血幹細胞。
在另一種方法即方法139中，本揭露提供了方法137或138的體外方法，其中該幹細胞係人幹細胞。
在另一種組成物即組成物140中，本揭露提供了藉由方法89至139中任一種的方法生成或可獲得的多個工程化細胞。
在另一種組成物即組成物141中，本揭露提供了組成物140的多個工程化細胞，該多個工程化細胞在足以使該等細胞經歷分化的條件下保持一段時間。
在另一種組成物即組成物142中，本揭露提供了組成物140或141的多個工程化細胞，該多個工程化細胞用於治療有需要的受試者。
在另一種組成物即組成物143中，本揭露提供了用於組成物142的多個細胞，其中該受試者係患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險的人。
在另一種方法即方法140中，本揭露提供了一種方法，該方法包括向受試者投與組成物140或141的多個工程化細胞。
在另一種方法即方法141中，本揭露提供了用於治療有需要的受試者之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞後的組成物140的多個工程化細胞，和 (b) 向該受試者投與該等譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
在另一種方法即方法142中，本揭露提供了獲得用於向有需要的受試者投與的細胞之方法，該方法包括：(a) 獲得或已經獲得組成物140的工程化細胞，和 (b) 將該等工程化細胞在足以使該等細胞分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的條件下保持一段時間。
在另一種方法即方法143中，本揭露提供了方法141或142之方法，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34 +細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、確定性內胚層細胞、成肝細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞，並且該等完全分化體細胞係造血細胞、肝細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
在另一種方法即方法144中，本揭露提供了方法139至143中任一種之方法，其中該受試者係患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險的人。
在另一種方法即方法145中，本揭露提供了方法143之方法，其中該受試者患有多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病（B-ALL）、B-細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NL）、慢性淋巴細胞白血病（C-CLL）、T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、透明細胞腎細胞癌（ccRCC）、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、胰臟癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、神經膠質母細胞瘤或子宮頸癌。
在另一種組成物即組成物144中，本揭露提供了一種包含對應於由SEQ ID NO: 35、37、38、39、53、55和80中任一種組成之序列的間隔子序列的gRNA。
在另一種組成物即組成物145中，本揭露提供了一種包含對應於由SEQ ID NO: 81-92中任一種組成之序列的間隔子序列的gRNA。
在另一種組成物即組成物146中，本揭露提供了一種包含對應於由SEQ ID NO: 93-101中任一種組成之序列的間隔子序列的gRNA。 實例 實例 1 ：細胞維持和擴增
hiPSC 的維持。將人誘導多能幹細胞（hiPSC）系的細胞保持在STEMFLEX™完全培養基（生命科技公司（Life Technologies），A3349401）中，使用ACCUTASE®（幹細胞技術公司（Stemcell Technologies）07920或等同物）在BIOLAMININ 521 LN（LN521）、BIOLAMININ 511 LN（LN511）或重組層連結蛋白iMatrix-511 E8（AMSBIO公司，AMS.892 011）上進行單細胞傳代。對於傳代，添加1% REVITACELL™補充物（100X）。
hPSC 的單細胞選殖。對於單細胞選殖，用具有1% REVITACELL™補充物（100X）（賽默飛世爾公司目錄號A2644501）的STEMFLEX™完全培養基（生命科技公司，A3349401）飼餵hiPSC。在用ACCUTASE®解離後，將細胞分選為預包被板的每孔單個細胞。在37°C下，用BIOLAMININ 521 LN（LN521）在DPBS、鈣、鎂中的1 : 10或1 : 20稀釋液（生命科技公司，14040133）將96孔板預包被2小時。使用WOLF FACS分選儀（納諾賽萊克特公司（Nanocellect））來將單細胞分選到孔中。該板預填充有100-200 µL含有REVITACELL™補充物（100X）和4 µL/mL重組層連結蛋白iMatrix-511 E8（AMSBIO公司，AMS.892 011）的STEMFLEX™完全培養基。細胞接種後三天，用新鮮的STEMFLEX™飼餵細胞並且每隔一天繼續用100-200 µL培養基飼餵細胞。生長10天後，每天用STEMFLEX™飼餵細胞，直到第12-16天。此時，將板用ACCUTASE®解離並且將收集的細胞懸浮液1 : 2分開，一半進入新的96孔板以進行維持並且一半進入DNA提取溶液QuickExtract™ DNA提取溶液（盧西根公司（Lucigen））中。提取DNA後，進行PCR以評估所需的基因編輯在所靶向DNA基因座處的存在或不存在。使用Sanger定序來驗證所需的敲除（KO）編輯。
單細胞衍生的 hiPSC 殖株的擴增。使用STEMFLEX™和BIOLAMININ 521或重組層連結蛋白iMatrix-511 E8和1% REVITACELL™補充物（100X）將成功靶向的殖株從96孔板傳代至24孔板。在24孔板中擴增後，將細胞傳代到6孔板上，然後傳代到T25和更大的燒瓶形式上。 實例 2 ：將幹細胞分化成自然殺手細胞 - 方案 1
方案1用於將幹細胞諸如野生型和/或經編輯的誘導多能幹細胞（iPS）分化成造血幹細胞和先驅細胞（HSPC），然後分化成自然殺手（NK）細胞。在分化之前，將冷凍的iPS細胞解凍並重懸於NK-MED-001培養基中（ 表 1）。用層連結蛋白-521預包被的燒瓶用於細胞培養。每天用NK-MED-002（ 表 2）培養基更換培養基，直到細胞用於分化。
NK 細胞分化。 使用以下步驟分化iPS細胞：
第 -1 天（下午）， iPSC 聚集：從含有iPSC的燒瓶中吸出NK-MED-002（ 表 2）培養基，並用DPBS（無鈣、無鎂）（賽默飛世爾科技公司，14190250）洗滌該等細胞。吸出DPBS，並向每個T25燒瓶中添加2 mL ACCUTASE®（創新細胞技術公司（Innovative Cell Technologies），AT-104）（或80 µL ACCUTASE®/1 cm 2）。將細胞在37°C下孵育3-5 min或直至所有集落分離。將經Accutase消化的細胞用NK-MED-002培養基稀釋至至少3 : 1的比率（NK-MED-002 : ACCUTASE®）。將該等細胞輕輕地重懸並轉移到錐形管中。向該等細胞中添加足夠的NK-MED-002®培養基以將ACCUTASE®培養基稀釋至4 : 1的比率（NK-MED-002 : ACCUTASE®）。將該等細胞沈澱並重懸於10 ml NK-MED-003培養基中（ 表 3）。對該等細胞進行計數並將細胞濃度稀釋至1 × 10 6個/mL。將6 × 10 6個細胞轉移至另一管中，並重新懸浮於總共6 mL NK-MED-003培養基中。將該等細胞轉移到超低黏附6孔板（康寧公司，3471）的1個孔中，並將板置於平臺振盪器上，以98 RPM旋轉18 +/- 2小時（過夜）。
2. 在第 0 天，早晨，在 iPSC 聚集後 18 +/- 2 小時：將板以圓周運動旋轉，以使聚集體向孔的中心移動，並將聚集體收集在錐形管中。替代性地，收集所有的聚集體溶液混合物。使聚集體沈降15 +/- 5分鐘。將細胞重懸於NK-MED-004培養基中（ 表 4）。計數聚集體中的細胞數。根據需要調節接種密度以將3 × 10 5個細胞重懸於2 mL NK-MED-004培養基中，並鋪板於6孔低黏附板的一個孔中。替代性地，為了放大，將適當數量的細胞重懸並轉移到PBS旋轉容器（PBS生物技術公司（PBS Biotech））中。測試的PBS接種容器的接種密度為約1-1.2 × 10 5個細胞/mL最終培養基體積（第0天+ 8小時）。將板置於平臺振盪器上並以98 RPM旋轉8小時，或者將PBS旋轉容器置於PBS基座（PBS-MINI MagDrive基座單元；PBS生物技術公司）上，在CO 2培養箱中以38至39 RPM的旋轉速度旋轉。
3. 在第 0 天，下午，在 NK-MED-004 培養基添加後 8 小時：每孔添加2 mL NK-MED-005培養基（ 表 5），或放大用於PBS旋轉容器。將板放回CO 2培養箱中的平臺振盪器或PBS旋轉容器至其底部，並靜置直至第2天。NK-MED-005培養基組分係其終濃度的2X，因此將其以1 : 1體積比添加到NK-MED-004中的細胞中。
4. 在第 2 天：將NK-MED-005培養基替換為NK-MED-006培養基（ 表 6）。
5. 在第 4 天：將NK-MED-006培養基替換為NK-MED-007培養基（ 表 7）。
6. 在第 6 天：在第6天開始，將具有所有聚集體和單細胞的培養基轉移到適當體積的離心錐形管中。將細胞離心並重懸於NK-MED-008培養基（ 表 8）中，並放回原始孔中和平臺振盪器上，或放回原始容器中和基座上，並返回用於繼續培養。
7. 在第 10 天：用NK-MED-008培養基進行一半培養基更換。
8. 在第 14 天：用NK-MED-009培養基進行完全培養基更換（ 表 9）。
9. 從第 17 天開始：從第17天開始（並在第20天，以及從第20天開始每2至3天），從細胞培養物估計單細胞密度。如果細胞密度超過3 × 10 6，則藉由用新鮮NK-MED-009培養基補足培養物或如果培養基顏色已完全變黃則藉由完全培養基更換，將細胞稀釋至1-2 × 10 6。在第6天、第10天、第14天、第17天、第20天和第28天收集代表性培養物樣本用於FACS和TruSeq分析以監測細胞的分化。
在下表中，體積係獲得所需濃度的近似值。 [ 表 1]. 用於 NK-MED-001 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMFLEX™基礎培養基 （賽默飛世爾公司，A3349401） 90% 900 mL 100%
STEMFLEX™補充物 （賽默飛世爾公司，A3349401） 1X 100 mL 10X
噻唑維林 （生物工業公司（Biological Industry），1226056-71-8） 2 µM 200 µL 10 mM
[ 表 2]. 用於 NK-MED-002 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMFLEX™基礎培養基 （賽默飛世爾公司，A3349401） 90% 900 mL 100%
STEMFLEX™補充物 （賽默飛世爾公司，A3349401） 1X 100 mL 10X
[ 表 3]. 用於 NK-MED-003 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMFLEX™基礎培養基 （賽默飛世爾公司，A3349401） 90% 899 mL 100%
STEMFLEX™補充物 （賽默飛世爾公司，A3349401） 1X 100 mL 10X
噻唑維林 （生物工業公司，1226056-71-8） 10 µM 1000 µL 10 mM
[ 表 4]. 用於 NK-MED-004 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 999 mL 100%
rh BMP-4 （派普泰克公司（Peprotech），120-05ET） 30 ng/mL 300 µL 100 µg/mL
噻唑維林 （生物工業公司，1226056-71-8） 10 µM 1000 µL 10 mM
[ 表 5]. 用於 NK-MED-005 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 998 mL 100%
rh BMP-4 （派普泰克公司，120-05ET） 30 ng/mL 300 µL 100 µg/mL
rh FGF2 （派普泰克公司，100-18C-1MG） 100 ng/mL 1000 µL 100 µg/mL
CHIR 99021 （賽力克化學公司（Selleckchem），S1263） 6 µM 600 µL 10 mM
活化素-A （R & D生物科技公司（R & D Systems），338-AC-01M/CF 5 ng/mL 100 µL 50 µg/mL
[ 表 6]. 用於 NK-MED-006 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 997 mL 100%
rh FGF2 （派普泰克公司，100-18C-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh VEGF165 （派普泰克公司，100-20-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh TPO （派普泰克公司，300-18） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 100 ng/mL 1000 µL 100 µg/mL
rh IL-3 （派普泰克公司，200-03-100UG） 40 ng/mL 400 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
WNT C-59 （賽力克化學公司，S7037） 2 µM 200 µL 10 mM
SB431542 （賽力克化學公司，S1067） 5 µM 500 µL 10 mM
[ 表 7] . 用於 NK-MED-007 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 998 mL 100%
rh FGF2 （派普泰克公司，100-18C-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh VEGF165 （派普泰克公司，100-20-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh TPO （派普泰克公司，300-18） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 100 ng/mL 1000 µL 100 µg/mL
rh IL-3 （派普泰克公司，200-03-100UG） 40 ng/mL 400 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
[ 表 8]. 用於 NK-MED-008 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
DMEM（高葡萄糖，GlutaMAX） （賽默飛世爾公司，10566016） 55.47% 555 mL 100%
含GlutaMAX的F-12 （賽默飛世爾公司，31765035） 27.74% 277 mL 100%
GlutaMAX （賽默飛世爾公司，35050079） 1X 10 mL 100X
葡萄糖* 10.25 mM 4.1 mL 2500 mM
人AB血清 （谷生物醫學公司（Valley Biomedical Inc），HP1022） 15% 150 mL 100%
硫酸鋅 （密理博西格瑪公司（Millipore Sigma），Z0251） 37 µM 978 µL 37 mM
乙醇胺 （密理博西格瑪公司，E0135） 50 µM 3 µL 16.6 M
抗壞血酸 （飛世爾科技公司，NC0762606） 20 µg/mL 2000 µL 10 mg/mL
亞硒酸鈉 （密理博西格瑪公司，S9133-1MG） 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL
β-巰基乙醇 （賽默飛世爾公司，21985-023） 1 µM 18 µL 55 mM
rh IL-3 （派普泰克公司，200-03-100UG） 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL
rh IL-7 （派普泰克公司，200-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh IL-15 （派普泰克公司，200-15） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
*培養基中的總葡萄糖濃度為27 mM（考慮到DMEM培養基中的葡萄糖、F12補充物和這裡提供的添加的葡萄糖）。
[ 表 9]. 用於 NK-MED-009 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
DMEM（高葡萄糖，GlutaMAX） （賽默飛世爾公司，10566016） 55.47% 555 mL 100%
含GlutaMAX的F-12 （賽默飛世爾公司，31765035） 27.74% 277 mL 100%
GlutaMAX （賽默飛世爾公司，35050079） 1X 10 mL 100X
葡萄糖* 10.25 mM 4.1 mL 2500 mM
人AB血清 （谷生物醫學公司，HP1022） 15% 150 mL 100%
硫酸鋅 （密理博西格瑪公司，Z0251） 37 µM 978 µL 37 mM
乙醇胺 （密理博西格瑪公司，E0135） 50 µM 3 µL 16.6 M
抗壞血酸 （飛世爾科技公司，NC0762606） 20 µg/mL 2000 µL 10 mg/mL
亞硒酸鈉 （密理博西格瑪公司，S9133-1MG） 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL
β-巰基乙醇 （賽默飛世爾公司，21985-023） 1 µM 18 µL 55 mM
rh IL-7 （派普泰克公司，200-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh IL-15 （派普泰克公司，200-15） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
*培養基中的總葡萄糖濃度為27 mM（考慮到DMEM培養基中的葡萄糖、F12補充物和這裡提供的添加的葡萄糖）。
實例 3 ： 將幹細胞分化成自然殺手細胞 - 方案 1.5
方案1.5用於將幹細胞諸如野生型和/或經編輯的iPS分化成造血幹細胞和先驅細胞（HSPC），然後分化成自然殺手（NK）細胞。在開始分化之前，將該等iPS細胞在STEMFLEX™（SF）（賽默飛世爾公司，A3349401）培養基中培養。使用以下步驟分化iPS細胞。整個過程中使用的培養基示於 表 10- 表 11中：
第 -1 天（下午）：吸出STEMFLEX™培養基（SF）並用DPBS（無鈣、無鎂）（賽默飛世爾科技公司，14190250）洗滌該等細胞。吸出DPBS，並向每個燒瓶中添加2 mL預熱的ACCUTASE®（創新細胞技術公司，AT-104）（如果需要，按以下比例放大：80 µL ACCUTASE®/1 cm 2）。將細胞在37°C下孵育3-5分鐘或直至所有集落分離。將經accutase消化的細胞用SF以3 : 1（SF : ACCUTASE®）的比率稀釋。用血清移液管輕輕吸取細胞2-3次，直到細胞分離。將細胞轉移到錐形管中，並用SF沖洗板，將沖洗液加到同一管中。向該等細胞中添加足夠的SF以將ACCUTASE®稀釋至4 : 1的比率（SF : ACCUTASE®）。將該等細胞以300 g旋轉5分鐘。吸出上清液並將該等細胞重懸於SF中。對該等細胞進行計數。藉由將6 × 10 6個細胞轉移到另一管中，重懸於總共6 mL NK-MED-003培養基中，將細胞濃度調節至1 × 10 6個/mL。將該等細胞轉移到超低黏附6孔板（康寧公司，3471）的1個孔中。將板置於水平軌道振盪器上。
2. 第 0 天（早晨）：16小時後：開始分化：將板以圓周運動旋轉，以使聚集體向孔的中心移動，收集聚集體並轉移到錐形管中。使聚集體沈降。將聚集體重懸於NK-MED-004培養基中（2 mL/聚集孔）。對聚集體中的細胞數進行計數。藉由將聚集體中的3 × 10 5個細胞重懸於2 mL APEL-B培養基中來調節聚集體中的細胞密度，並鋪板於6孔低黏附板的1個孔中。將板置於水平軌道振盪器上並旋轉8小時。
3. 第 0 天（下午，預孵育 8 小時後）：每孔添加2 mL NK-MED-005培養基。將板放回軌道振盪器中並保持不接觸直至第2天。
4. 第 2 天：將NK-MED-006替換為A-FVTSIF-SW培養基。
5. 第 4 天：將NK-MED-007培養基替換為A-FVTSIF培養基。
6. 第 6 天：使用該方法，在第5-6天開始出現單細胞（HSPC）。將含有所有胚狀體（EB）和單細胞的培養基轉移到適當體積的離心錐形管中並離心。對於6孔板：將來自每個孔的EB重懸於3 mL DF-NK+IL3培養基（ 表 10）中並轉移到它們的原始孔中。將板返回到軌道振盪器。
7. 第 10 天：6孔板：將3 mL DF-NK+IL3培養基添加到原始培養基頂部的每個孔中，然後返回到軌道振盪器。
8. 第 14 天：完全培養基更換。將細胞轉移到DF-NK培養基（ 表 11）中，此時不添加IL3。將含有所有EB和單細胞的培養基轉移到離心錐形管中並離心。去除上清液。6孔板：將來自每個孔的EB重懸於3 mL DF-NK培養基中並轉移到它們的原始孔中。
9. 第 14-28 天：每3-4天用3 mL新鮮DF-NK培養基加滿培養基，然後3-4天後藉由將細胞收集在錐形管中並離心，而用3 mL新鮮DF-NK培養基替換用過的培養基。在第6、10、14、21、28和35天收集代表性培養物樣本用於FACS和TruSeq分析以監測細胞的分化。 [ 表 10] ： DF-NK+IL3 培養基
組分 工作濃度 體積 原液濃度 供應商 項目編號
DMEM （高葡萄糖，GlutaMAX） 比率為F12的2倍 558 100% 賽默飛世爾科技公司 10566016
含GlutaMAX的F-12 比率為DMEM的1 279 100% 賽默飛世爾科技公司 31765035
GlutaMAX 1X 10 mL 100X
人AB血清 15% 150 mL 100% 谷生物醫學公司 HP1022
抗壞血酸 20 µg/mL 2000 µL 10 mg/mL 密理博西格瑪公司
亞硒酸鈉 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL 密理博西格瑪公司
rh IL-3 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 200-03
rh IL-7 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 200-07
rh Flt3L 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 300-19
rh IL-15 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 200-15
rh SCF 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 300-07
[ 表 11] ： DF-NK 培養基
組分 工作濃度 體積 原液濃度 供應商 項目編號
DMEM （高葡萄糖，GlutaMAX） 比率為F12的2倍 558 100% 賽默飛世爾科技公司 10566016
含GlutaMAX的F-12 比率為DMEM的1 279 100% 賽默飛世爾科技公司 31765035
GlutaMAX 1X 10 mL 100X
人AB血清 15% 150 mL 100% 谷生物醫學公司 HP1022
抗壞血酸 20 µg/mL 2000 µL 10 mg/mL 密理博西格瑪公司
亞硒酸鈉 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL 密理博西格瑪公司
rh IL-3
rh IL-7 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 200-07
rh Flt3L 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 300-19
rh IL-15 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 200-15
rh SCF 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL 派普泰克公司 300-07
實例 4 ： ADAM17-Null 人多能幹細胞（ hPSC ）的生成 針對 hPSC 中 ADAM17 的引導 RNA （ gRNA ）選擇。
設計了十個靶向ADAM17的gRNA，用於靶向ADAM17編碼序列的外顯子1。基於使用gRNA設計軟體進行的序列同源性預測，該等gRNA具有預測的低脫靶得分。具有對應PAM的gRNA之靶序列如表12所呈現。在一些實施方式中，gRNA包含對應於靶DNA序列的RNA序列。 [ 表 12] . ADAM17 gRNA 靶序列
名稱 靶序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: PAM
ADAM17 Ex1_T2 GGTCGCGGCGCCAGCACGAA 1 AGG
ADAM17 Ex1_T4 CCGAAGCCCGGGTCATCCGG 2 AGG
ADAM17 Ex1_T9 CCGCGACCTCCGGATGACCC 3 GGG
ADAM17 Ex1_T10 CGTGCTGGCGCCGCGACCTC 4 CGG
ADAM17 Ex1_T11 CGAAAGGAACCACGCTGGTC 5 AGG
ADAM17 Ex1_T12 CAGCGTGGTTCCTTTCGTGC 6 TGG
ADAM17 Ex1_T19 GCCGCGACCTCCGGATGACC 7 CGG
ADAM17 Ex1_T24 GAACCACGCTGGTCAGGAAT 8 AGG
ADAM17 Ex1_T25 CAGCACGAAAGGAACCACGC 9 TGG
ADAM17 Ex1_T28 GTAGCGGGGCCGGGAACATG 10 AGG
為了評估它們在hPSC中的切割效率，使用Neon電穿孔儀（Neon轉染套組（Transfection Kit），賽默飛世爾公司，目錄號MPK5000），用Cas9蛋白（碧歐美公司（Biomay））和引導RNA（IDT公司）（參見 表 12中的gRNA序列）的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的核糖核蛋白（RNP）混合物（絕對值為125 pmol Cas9和625 pmol gRNA）對iPS細胞進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25 µL的總體積，並在室溫下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基（Gibco公司，目錄號11320033）中，使用NC-200（克莫麥特公司（ChemoMetec））計數並離心。用RNP複合體重懸總共1 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至125 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms並以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）的STEMFLEX™培養基的Eppendorf管中。然後將該細胞懸浮液鋪板到用1 : 20稀釋度下的BIOLAMININ 521 CTG預包被的組織培養皿中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養48小時。48小時後，使用QuickExtract（盧西根公司，威斯康辛州米德爾頓；目錄號QE09050）從細胞中收穫基因組DNA。
進行針對靶ADAM17序列的PCR，並藉由TIDE分析評估經擴增的所得DNA的切割效率。使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 13所呈現；並且循環條件如 表 14所提供。 [ 表 13] . ADAM17 TIDE/ 插缺引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
ADAM17 F2 正向 AGAATCTTCCCAGTAGGCGG 11
ADAM17 R2 反向 CTCAGGCGCTCAGTCACTAC 12
[ 表 14] . ADAM17 PCR/Indel PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 94°C 2 min 1
變性 94°C 15 s 34
退火 57°C 30 s
延伸 68°C 45 s
伸長 68°C 5 min 1
保持 4°C 保持   
將所得擴增子提交進行PCR清除和Sanger定序。將Sanger定序結果與引導序列一起輸入到Tsunami軟體中。藉由軟體計算插缺百分比和身份。然後基於它們在hPSC中的插缺頻率選擇特定的gRNA。 圖 1顯示了10個ADAM17嚮導的切割效率。選擇ADAM17 Ex1_T2用於進一步的殖株產生，這是由於其高的中靶活性。 ADAM17 KO hPSC 殖株的生成和表徵。
使用ADAM17 T2 gRNA，對iPSC進行電穿孔，並在電穿孔後3天使用WOLF FACS分選儀（納諾賽萊克特公司）將單細胞分選到具有STEMFLEX™和REVITACELL™補充物（100X）的BIOLAMININ 521 CTG包被的96孔板中。使經鋪板的單細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中生長，每隔一天更換一次培養基，直到集落大到足以作為單細胞重新接種。匯合時，將樣本分開以進行維持和基因組DNA提取。
如上所述，經由PCR和Sanger定序確認殖株的ADAM17 KO狀態。在Snapgene軟體中對靶ADAM17區域的所得DNA序列進行比對，以確定插缺身份以及純合性或雜合性。通過Cell Line Genetics服務（威斯康辛州麥迪森）評價殖株的核型狀態，並報告正常核型。 實例 5 ： CIITA gRNA 的生成和選擇 針對 hPSC 中 CIITA 的引導 RNA （ gRNA ）選擇。
設計了5個靶向CIITA的gRNA，用於靶向CIITA編碼序列的外顯子2和3。基於使用gRNA設計軟體進行的序列同源性預測，該等gRNA具有預測的低脫靶得分。gRNA之靶序列如 表 15所呈現。在一些實施方式中，gRNA包含對應於靶DNA序列的RNA序列。 [ 表 15] . CIITA gRNA 靶序列
名稱 靶序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: PAM
CIITA Ex3_T6 GGTCCATCTGGTCATAGAAG 13 TGG
CIITA Ex3_T16 GCTCCAGGTAGCCACCTTCT 14 AGG
CIITA Ex3_T20 TAGGGGCCCCAACTCCATGG 15 TGG
CIITA Ex4_T1 GGCTTATGCCAATATCGGTG 16 AGG
CIITA Ex4_T25 AGGTGATGAAGAGACCAGGG 17 AGG
為了評估它們在hPSC中的切割效率，使用Neon電穿孔儀（Neon轉染套組，賽默飛世爾公司，目錄號MPK5000），用Cas9蛋白（碧歐美公司（Biomay））和引導RNA（安捷倫公司（Agilent））（參見 表 15中的gRNA序列）的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的核糖核蛋白（RNP）混合物（絕對值為125 pmol Cas9和625 pmol gRNA）對人胚胎幹細胞進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25 µL的總體積，並在室溫下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基（Gibco公司，目錄號11320033）中，使用NC-200（克莫麥特公司（ChemoMetec））計數並離心。用RNP複合體重懸總共1 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至125 µL的總體積。然後將該混合物以1100 V用3個脈衝電穿孔30 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有RevitaCell™的STEMFLEX™培養基的Eppendorf管中。然後將該細胞懸浮液鋪板到用1 : 20稀釋度下的BIOLAMININ 521 CTG預包被的組織培養皿中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養48小時。48小時後，使用QuickExtract（盧西根公司，威斯康辛州米德爾頓；目錄號QE09050）從細胞中收穫基因組DNA。
進行針對靶CIITA序列的PCR，並藉由TIDE分析評估經擴增的所得DNA的切割效率。使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 16所呈現；並且循環條件如 表 17所提供。 [ 表 16] . CIITA TIDE/ 插缺引物
名稱 類型 序列（ 5'-3' ） SEQ ID NO:
CIITA F5 正向 TCCTGACTCTCTGGTGTGAGAT 18
CIITA R5 反向 CAGAGAGCGTCCCACAGAC 19
[ 表 17] . CIITA PCR/ 插缺 PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 94°C 2 min 1
變性 94°C 15 s 34
退火 57°C 30 s
延伸 68°C 45 s
伸長 68°C 5 min 1
保持 4°C 保持   
將所得擴增子提交進行PCR清除和Sanger定序。將Sanger定序結果與引導序列一起輸入到Tsunami軟體中。藉由軟體計算插缺百分比和身份。然後基於它們在hPSC中的插缺頻率選擇特定的gRNA。 圖 2示出了5個CIITA嚮導的切割效率。
使用序列相似性預測位點的雜交捕獲分析，在幹細胞衍生的DNA中評估所選擇的gRNA的脫靶。CIITA Ex3_T6和CIITA Ex4_T1嚮導未顯示出可檢測的脫靶效應。選擇CIITA T6 gRNA用於進一步的殖株產生，這是由於其高中靶活性和不可檢測的脫靶活性。 實例 6 ： CAR 敲入、 CIITA Null 人多能幹細胞（ hPSC ）的生成 CIITA KO 、 CAR KI 策略的設計。
進行將CAR序列諸如BCMA CAR序列插入 CIITA基因座中的質體設計，使得 CIITA外顯子2（GCCACCATGGAGTTGGGGCCCCTAGAAGGTGGCTACCTGGAGCTTCTTAACA GCGATGCTGACCCCCTGTGCCTCTACCACTTCTA（SEQ ID NO: 20））的86個鹼基對（bp）在經歷同源定向修復（HDR）後將被去除。去除CIITA的這一部分將導致CIITA編碼序列（CDS）的移碼，從而使功能性CIITA蛋白之表現無效。成功的HDR也將導致CAR序列插入基因組。供體質體含有CAGGS啟動子驅動的CAR序列的cDNA，其側接有800個鹼基對同源臂，該等同源臂與外顯子2周圍的 CIITA基因座具有相同序列。 圖 3呈現了示例性BCMA CAR編碼質體（SEQ ID NO: 66）的示意圖，並且 表 18標識了其中的元件和位置。 [ 表 18] . BCMA CAR 供體質體的元件
元件 位置（大小以 bp 計） SEQ ID NO:
左ITR 1-130（130） 21
LHA-CIITA 145-944（800） 22
CMV強化子 973-1352（380） 23
雞β-肌動蛋白啟動子 1355-1630（276） 24
嵌合內含子 1631-2639（1009） 25
CD8a訊息肽 2684-2746（63） 26
BCMA靶向片段 2747-3481（735） 27
CD8TM 3482-3745（264） 28
41BB共刺激結構域 3746-3871（126） 29
CD3Z結構域 3872-4207（336） 30
bGH聚(A)訊息 4229-4453（225） 31
RHA-CIITA 4460-5259（800） 32
右ITR 5301-5441（141） 33
使用CIITA-T6 gRNA（ 表 19）來促進BCMA CAR轉基因在所靶向的 CIITA基因座處的插入。供體質體中不存在CIITA-T6之靶序列，並且因此供體質體本身將不被該gRNA靶向。CIITA-T6誘導的人基因組中CIITA外顯子2處的CRISPR切割將導致CIITA蛋白的移碼和丟失。將BCMA CAR供體質體以及由CIITA靶向gRNA和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起引入。每1百萬個人胚胎幹細胞，通過電穿孔將4 µg質體DNA與RNP一起遞送。使用Neon電穿孔儀（Neon轉染套組，賽默飛世爾公司，目錄號MPK5000），用Cas9蛋白（碧歐美公司）和引導RNA（Synthego公司）的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的RNP混合物（絕對值為每1百萬個細胞125 pmol Cas9和625 pmol gRNA），在hiPSC細胞中進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基中，使用NC-200（克莫麥特公司（ChemoMetec））計數並離心。用RNP複合體重懸總共2 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至115 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms，接著以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）和層連結蛋白511的STEMFLEX™培養基的6孔板的孔中。用BIOLAMININ 521 CTG以1 : 10的稀釋度預包被板。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
電穿孔後七至十天，使用抗BCMA CAR的抗體（15C04-APC或15C04-PE）通過磁性輔助細胞分選（MACS）使用抗小鼠IgG Dynabeads（賽默飛世爾公司，CELLection™ Pan小鼠IgG套組，11531D）富集細胞中表現BCMA CAR的細胞。該等富集的細胞代表BCMA-CAR陽性細胞的大KI群體。 [ 表 19] . gRNA 靶序列
名稱 靶序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: PAM
CIITA Ex3_T6 gRNA GGTCCATCTGGTCATAGAAG 13 TGG
B2M-2 gRNA（外顯子1_T2） GGCCGAGATGTCTCGCTCCG 34 TGG
ADAM17 Ex1_T2 gRNA GGTCGCGGCGCCAGCACGAA 1 AGG
實例 7 ： IL15/IR15a-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 BCMA CAR 敲入、 CIITA Null 、 B2M Null 人多能幹細胞（ hPSC ）的生成 B2M KO 、 IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體 KI 策略的設計。
進行將IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體插入 B2M基因座中的質體設計，使得B2M的起始密碼子在經歷同源定向修復（HDR）以插入IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體後被去除，從而使部分B2M表現的任何機會無效。 圖 4呈現了質體SEQ ID NO: 67的示意圖，並且 表 20標識了其中的元件和位置。供體質體含有CAGGS啟動子驅動的IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體的cDNA，其側接有800個鹼基對的同源臂，該等同源臂與外顯子1周圍的 B2M基因座具有相同序列。
IL15/IR15α融合序列如先前公佈的那樣設計（Hurton等人 (2016) Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊]; 113 (48): E7788-E7797. doi: 10.1073/pnas.1610544113。）IL15/IR15α融合編碼序列（包括連接子）係SEQ ID NO: 76（即，SEQ ID NO: 40、41、42、43和44）。
HLA-E三聚體cDNA由與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽構成，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而沒有其訊息肽。HLA-E三聚體編碼序列（包括連接子）係SEQ ID NO: 75（即，SEQ ID NO: 46、47、48、49、50和51）。該三聚體設計先前已經公佈（Gornalusse等人 (2017) Nat. Biotechnol. [自然•生物技術] 35 (8): 765-772）。
連接IL15/IR15α融合體和HLA-E三聚體的P2A肽序列（源自豬捷申病毒-1 2A）允許從單一mRNA中分別表現兩種蛋白。 [ 表 20] . IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體供體質體的元件
元件 位置（大小以 bp 計） SEQ ID NO:
左ITR 1-130（130） 21
LHA-B2M 145-944（800） 36
CMV強化子 973-1352（380） 23
雞β-肌動蛋白啟動子 1355-1630（276） 24
嵌合內含子 1631-2639（1009） 25
IgE訊息肽 2684-2737（54） 40
IL15 CDS 2738-3136（399） 41
連接子 3137-3214（78） 42
IL15Rα CDS 3215-3925（711） 43
GSG標籤 3926-3934（9） 44
P2A 3935-3991（57） 45
B2M訊息序列 3992-4051（60） 46
HLA-G肽 4052-4078（27） 47
GS連接子 4079-4123（45） 48
B2M 4124-4420（297） 49
GS連接子 4421-4480（60） 50
HLA-E 4481-5491（1011） 51
3X終止密碼子 5492-5500（9） 52
bGH聚(A)訊息 5518-5742（225） 31
RHA-B2M 5749-6548（800） 54
右ITR 6590-6730（141） 33
為了將IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體序列插入hiPSC中，如 實例 6中所述產生BCMA CAR富集的hiPSC。在第二次電穿孔前一天，首先僅用供體質體（沒有CRISPR編輯試劑）對該群體進行電穿孔。在第一次電穿孔中，每1百萬個hiPSC使用Neon電穿孔儀遞送1 µg供體質體DNA。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基中，使用NC-200（克莫麥特公司）計數並離心。將總共24 × 10 6個細胞用R-緩衝液和供體質體DNA重懸至約600 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms，然後以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。進行總共6次電穿孔，並將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）和層連結蛋白511的STEMFLEX™培養基的6孔板中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
第二天，將該等細胞從板上解離，並使用另外的試劑再次電穿孔。使用該B2M-2 gRNA（ 表 19）來促進IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體轉基因在所靶向的 B2M基因座處的插入。將IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體供體質體以及由靶向B2M的gRNA和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起引入。每1百萬個hiPSC細胞，通過電穿孔將2 µg質體DNA與RNP一起遞送。使用Neon電穿孔儀，用Cas9蛋白（碧歐美公司）和引導RNA（Biospring公司）的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的RNP混合物（絕對值為每1百萬個細胞62.5 pmol Cas9和312.5 pmol gRNA），在hiPSC細胞中進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基中，使用NC-200（克莫麥特公司（ChemoMetec））計數並離心。用RNP複合體重懸總共7 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至約300 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms，然後以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。總共進行3次電穿孔。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）和層連結蛋白511的STEMFLEX™培養基的6孔板的2個孔中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
電穿孔後七至十天，使用抗HLA-E的抗體（參見 表 21），通過磁性輔助細胞分選（MACS），使用抗小鼠IgG Dynabeads（賽默飛世爾公司，CELLection™ Pan小鼠IgG套組，11531D）富集細胞中表現HLA-E三聚體的細胞。該等富集的細胞代表IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體陽性細胞的大KI群體。 [ 表 21] . 用於流動式細胞分析術的抗體
抗原 殖株 螢光團 製造商 目錄號
BCMA CAR 15C04 PE或APC CRISPRtx 定制
IL15 34559 PE 賽默飛世爾公司 MA5-23561
B2M 2M2 PE 百進生物科技公司 316305
HLA-ABC W6/32 Alexa 488 百進生物科技公司 311415
mIgG1κ N/A PE BD生物科學公司 555749
PD-L1 B7-H1 Alexa-488 賽默飛世爾公司 53-5983-42
HLA-E 3D12 PE 賽默飛世爾公司 12-9953-42
HLA-E 3D12 APC 賽默飛世爾公司 17-9953-42
實例 8 ： IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 B2M Null 人多能幹細胞（ hPSC ）的生成和表徵
將如 實例 7中所述之IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體序列插入hiPSC系中。使用B2M-2 gRNA（ 表 19）來促進IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體轉基因在所靶向的 B2M基因座處的插入。將IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體供體質體以及由靶向B2M的gRNA和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起引入。每1百萬個hiPSC細胞，通過電穿孔將2 µg質體DNA與RNP一起遞送。使用Neon電穿孔儀，用Cas9蛋白（碧歐美公司）和引導RNA（Biospring公司）的莫耳比為10 : 1（gRNA : Cas9）的RNP混合物（絕對值為每1百萬個細胞62.5 pmol Cas9和625 pmol gRNA），在hiPSC細胞中進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基中，使用NC-200（克莫麥特公司（ChemoMetec））計數並離心。用RNP複合體重懸總共2 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至約115 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms，然後以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。進行一次電穿孔。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）和層連結蛋白511的STEMFLEX™培養基的6孔板的孔中。用BIOLAMININ 521 CTG以1 : 10的稀釋度預包被板。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
電穿孔後七至十天，使用抗HLA-E的抗體（參見 表 21），通過磁性輔助細胞分選（MACS），使用抗小鼠IgG Dynabeads（賽默飛世爾公司，CELLection™ Pan小鼠IgG套組，11531D）富集細胞中表現HLA-E三聚體的細胞。該等富集的細胞代表IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體陽性細胞的大KI群體。藉由流動式細胞分析術評估該群體的HLA-E表現，顯示 ＞ 90%的HLA-E表現（ 圖 5B）。WT iPSC細胞係陰性對照（ 圖 5A）。
MACS富集後，如實例1所述對細胞進行單細胞分選。抗HLA-E-PE抗體（參見 表 21）用於FACS分選到96孔板中（ 圖 6）。為了進行FACS分選，未經編輯的細胞充當陰性對照。分選後，如實例1所述擴增細胞，當匯合時，將樣本分開以進行維持和基因組DNA提取。
單細胞衍生的殖株展示出擴增後IL15-PE表現，從而確認了編輯的保真度。測定了名為「殖株3」的殖株（ 圖 7B）和WT iPSC對照（ 圖 7A）中的IL-15-PE表現。
使用如實例3中所述之方案2，使用PBS旋轉容器，將殖株3（包含編輯IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull的hiPSC基因編輯的殖株）分化成iNK細胞。將分化自WT或殖株3（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC）的第20天的iNK細胞以5 × 10 6個細胞/孔鋪板並且在有或沒有外源IL15（20 ng/mL）的情況下生長。此外，在第0天和第4天向所有細胞投與SCF（20 ng/mL）、Flt3L（15 ng/mL）、IL-7（20 ng/mL）。殖株3（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC）衍生的iNK在培養基中在存在或不存在外源IL15的情況下類似地擴增。 圖 8顯示殖株3細胞在不存在外源IL15的情況下持續存在並擴增，而WT iNK細胞數在不存在外源IL15的情況下下降。
使用24小時殺傷測定法確定第36天的殖株3衍生的iNK細胞對K562細胞之細胞毒性。將K562-GFP細胞（每小瓶50,000個細胞）與iNK效應細胞系以所示的不同比率孵育24小時。孵育後，將細胞旋轉，並以1 : 1000的濃度重懸於含有SyTox Blue的175 µl培養基中。每孔添加25 µL countbright珠粒。使用流式細胞儀讀板，收集每孔100 µL體積用於分析。選擇GFP陽性、SyTox Blue-陰性靶細胞（活癌細胞）和countbright珠粒並測量絕對事件計數。如下計算總活細胞數： [總細胞數 = ((活細胞數)/(該樣本的珠粒計數))/(珠粒計數/50 µL/2)。
使用下式計算細胞裂解%： %細胞裂解 = (1-((測試樣本中靶細胞的總數)/(對照樣本中靶細胞的總數)) × 100。WT和經編輯的細胞系顯示針對K562的有效細胞毒性（ 圖 9）。 實例 9 ： IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 BCMA CAR 敲入、 CIITA Null 、 B2M Null 、 ADAM17 Null 人多能幹細胞（ hPSC ）的生成 ADAM17 KO 的設計。
使用ADAM17-T2 gRNA（ 表 19）藉由在 ADAM17基因外顯子1中引起移碼突變來敲除ADAM17蛋白。如 實例 6 和實例 7所述生成BCMA CAR和IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體富集的hiPSC。使用Neon電穿孔儀，用Cas9蛋白（碧歐美公司）和引導RNA（IDT公司）的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的RNP混合物（絕對值為每1百萬個細胞125 pmol Cas9和625 pmol gRNA），在該等富集的hiPSC細胞中進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。然後使用R-緩衝液將該混合物與細胞合併至約115 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms，接著以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）和層連結蛋白511的STEMFLEX™培養基的6孔板中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
電穿孔後三至五天，如實例1所述對細胞進行單細胞分選。抗BCMA CAR抗體（參見 表 21）用於FACS分選到96孔板中。為了進行FACS分選，未經編輯的細胞充當陰性對照。分選後，如實例1所述擴增細胞，當匯合時，將樣本分開以進行維持和基因組DNA提取。
進行針對經編輯的殖株（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null人多能幹細胞（hPSC））的基因分型的PCR，並藉由TIDE分析評估經擴增的所得DNA的切割效率。
為了確定靶B2M序列中的插缺，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 22所呈現；並且循環條件如 表 23所提供。 [ 表 22] . B2M 插缺引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
B2MF2 正向 CAGACAGCAAACTCACCCAG 56
B2MR2 反向 AAACTTTGTCCCGACCCTCC 57
[ 表 23] . B2M 插缺 PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 94°C 2 min 1
變性 94°C 15 s 30
退火 56°C 30 s
延伸 68°C 45 s
伸長 68°C 5 min 1
保持 4°C 保持   
圖 10示出了各種經編輯的殖株的B2M插缺結果。573 bp條帶的存在指示WT基因型將在未編輯或KI構建體雜合的殖株中發現，因為純合殖株將不具有條帶。為了確定B2M接合性，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 24所呈現；並且循環條件如 表 25所提供。 [ 表 24] . B2M 接合性引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
B2M-geno-F1 正向 AAAAGATCTGTGGACTCCACCACCACGAAATGGCGGCACCTTATTTATGGTC 58
B2M-geno-R1 反向 GCTCTGGAGAATCTCACGCAGAAGGCAGGCGTTTTTCTTAAAAAAAAATGCACGAATTA 59
[ 表 25] . B2M 接合性 PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 94°C 2 min 1
變性 98°C 10 s 30
退火 65°C 30 s
延伸 68°C 6 min 30 s
伸長 68°C 5 min 1
保持 4°C 保持   
圖 11示出了各種經編輯的殖株的B2M接合性結果。約2.5 kb條帶的存在指示WT基因型，而6.6 kb條帶的存在指示KI構建體成功整合到 B2M基因座中。未編輯的殖株將僅具有WT條帶，KI雜合的殖株將具有這兩個條帶，並且純合的殖株將僅具有KI條帶。將所得擴增子提交進行PCR清除和Sanger定序。將Sanger定序結果與引導序列一起輸入到Tsunami軟體中。在Snapgene軟體中對靶B2M區域的所得DNA序列進行比對，以確定插缺身份以及純合性或雜合性。為了確定靶B2M序列中的IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入基因分型，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 26所呈現；並且循環條件如 表 27所提供。 [ 表 26] . B2M KI 引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
聚-A-F 正向 AGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGG 60
B2M-geno-R1 反向 GCTCTGGAGAATCTCACGCAGAAGGCAGGCGTTTTTCTTAAAAAAAAATGCACGAATTA 61
[ 表 27] . B2M KI PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 98°C 30 s 1
變性 98°C 10 s 30
退火 65°C 30 s
延伸 72°C 1 min 30 s
伸長 72°C 5 min 1
保持 4 保持   
圖 12示出了各種經編輯的殖株的B2M KI基因分型結果。存在1.1 kb條帶指示KI構建體成功整合到 B2M基因座中，而不存在條帶指示WT基因型。為了確定靶CIITA序列中的插缺，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 16所呈現；並且循環條件如 表 17所提供。 圖 13示出了各種經編輯的殖株的CIITA插缺結果。557 bp條帶的存在指示WT基因型將在未編輯或KI構建體雜合的殖株中發現，因為純合殖株將不具有條帶。
為了確定CIITA接合性，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 28所呈現；並且循環條件如 表 29所提供。 [ 表 28] . CIITA 接合性引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
CIITA-OUT-F 正向 GCCCCACCCCTCCTACTTTATGTCTCCATGGATTTGCCTGTTTTGGTCATTTCA 62
CIITA-OUT-R 反向 CTCTAATGCAAACTTGGGTAGGTCGTTTCACCTCTCTAAACCTCAATTTCCTCATTTG 63
[ 表 29] . CIITA 接合性 PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 94°C 2 min 1
變性 98°C 10 s 30
退火 65°C 30 s
延伸 68°C 5 min 30 s
伸長 68°C 5 min 1
保持 4 保持   
圖 14示出了各種經編輯的殖株的CIITA接合性結果。約2.5 kb條帶的存在指示WT基因型，而5.6 kb條帶的存在指示KI構建體成功整合到 CIITA基因座中。未編輯的殖株將僅具有WT條帶，KI雜合的殖株將具有這兩個條帶，並且純合的殖株將僅具有KI條帶。將所得擴增子提交進行PCR清除和Sanger定序。將Sanger定序結果與引導序列一起輸入到Tsunami軟體中。在Snapgene軟體中對靶 CIITA區域的所得DNA序列進行比對，以確定插缺身份以及純合性或雜合性。
為了確定靶CIITA序列中BCMA CAR敲入基因分型，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 30所呈現；並且循環條件如 表 31所提供。 [ 表 30] . CIITA KI 引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
CD3Z-seq-F1 正向 GAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAG 64
CIITA-OUT-R 反向 CTCTAATGCAAACTTGGGTAGGTCGTTTCACCTCTCTAAACCTCAATTTCCTCATTTG 65
[ 表 31] . CIITA KI PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 98°C 30 s 1
變性 98°C 10 s 30
退火 65°C 30 s
延伸 72°C 1 min 30 s
伸長 72°C 5 min 1
保持 4 保持   
圖 15示出了各種經編輯的殖株的CIITA KI基因分型結果。存在1.5 kb條帶指示KI構建體成功整合到 CIITA基因座中，而不存在條帶指示WT基因型。為了確定靶ADAM17序列中的插缺，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如 表 13所呈現；並且循環條件如 表 14所提供。將所得擴增子提交進行PCR清除和Sanger定序。將Sanger定序結果與引導序列一起輸入到Tsunami軟體中。在Snapgene軟體中對靶ADAM17區域的所得DNA序列進行比對，以確定插缺身份以及純合性或雜合性。
基於經編輯的殖株的PCR和Sanger定序分析， 圖 10 至圖 15中泳道41中所示的殖株被選為「殖株1」，泳道48中所示的殖株被選為「殖株2」，其顯示具有BCMA CAR KI和IL15/ILRa-P2A-HLA-E KI，而定序數據確認B2M、CIITA和ADAM17被完全敲除。殖株1對於B2M KI係雜合的並且在B2M WT條帶中具有+1T的插缺（ 表 32）。殖株1對於CIITA KI係純合的，並且在ADAM17 WT條帶中含有純合的+1G插缺（ 表 33）。 [ 表 32] . IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 BCMA CAR 敲入、 CIITA Null 、 B2M Null 、 ADAM17 Null 人多能幹細胞殖株之 KI 基因型
殖株 IL-15/IR-15 融合 -P2A-HLA-E 進入 B2M BCMA CAR 進入 CIITA
1 雜合KI 純合KI
2 雜合KI 純合KI
[ 表 33] . IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 BCMA CAR 敲入、 CIITA Null 、 B2M Null 、 ADAM17 Null 人多能幹細胞殖株之 KO 基因型
殖株 B2M 插缺 CIITA 插缺 ADAM17 插缺
1 KI/+1 T    KI/KI +1 G/+1 G
2 KI/+1 T    KI/KI -20/大插入
hiPSC 階段 KI 基因表現和 KO 狀態的確認。為了檢測BCMA CAR、HLA-E和IL15表面表現，使用螢光抗體（參見 表 21）。未分化的殖株1，即含有所有編輯（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null）的hiPSC殖株，藉由流動式細胞分析術用未編輯的WT細胞作為陰性對照進行評估（ 表 34）。經基因編輯的殖株1顯示 ＞ 99% BCMA CAR表現、＞ 99% HLA-E表現和 ＞ 99% IL15表現。為了確認KO狀態，使用HLA-ABC的螢光抗體（參見 表 21），用未編輯的WT iNK細胞作為陰性對照（ 表 34）。 [ 表 34] ：
   WT iPSC 殖株 1 iPSC
CAR + 1.06% 99.7%
HLA-E + 0.22% 100%
IL-15 + 0.03% 99.2%
HLA-A、B、C (MHC-I) - 97.3% 0.74%
基因組編輯後 hiPSC 多能性的確認。為了檢測Oct4和Sox 2細胞內表現，使用螢光抗體。iPS細胞：藉由流動式細胞分析術評估含有所有編輯（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null）的WT以及未分化殖株1和2。IgG標記的細胞用作陰性對照（ 圖 16）。Oct4表現在WT中為99.5%、在經編輯的基因殖株1中為98.2%並且在經編輯的基因殖株2中為97.7%（ 圖 16）。在iPSC群體中存在以下百分比的Sox2-陽性細胞：WT iPSC具有 ＞ 99%的陽性，經編輯的殖株1和2相應地具有 ＞ 98和 ＞ 96%的陽性（ 圖 16）。經編輯的殖株保持高水平的多能性。 實例 10 ： IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 BCMA CA R 敲入、 CIITA Null 、 B2M Null 、 ADAM17 Null hPSC 的分化和表徵
如實例2所述，使用方案1將WT、殖株1和2（「細胞系1A c1和c2」；含有編輯IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null的hiPSC基因編輯的殖株）、殖株3（「B2M-/HLA-E +/IL15 +c3」；含有編輯IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull的hiPSC基因編輯的殖株）、細胞系1殖株2（「細胞系1 c2」；含有編輯IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull的hiPSC基因編輯的殖株）、CIITA -/BCMA CAR +大群體和 ADAM17KO殖株37（「Adam17-，c37」）分化成iNK細胞。在第6天和第10天對分化細胞的流動式細胞分析術分析顯示，與WT相比，所有經編輯的殖株和大群體（包括經編輯的iPSC殖株1和2）均有效地分化為HPSC（CD34 +/CD43 -）細胞群體（ 圖 17）。經編輯的iPSC殖株1較早表現CD43，但不影響其整體分化為iNK和細胞毒性。在整個分化過程中，藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD45和CD56表現（ 圖 18），顯示所有經編輯的殖株的與WT相當的有效分化。到第28天，＞ 99%的細胞係CD56 +。
在第6、10和14天對消化的細胞聚集體並且在第20天（ 圖 19A）、第28天（ 圖 19B）、第35天（ 圖 19C）和第42天（ 圖 19D）對單細胞進行流動式細胞分析術。收集活細胞，用1% BSA的PBS溶液洗滌，並與5% BSA的PBS溶液中的適當抗體混合物在冰上孵育30分鐘。將細胞洗滌並重懸於含有1 : 1000 SyTOX Blue細胞活力染料的1% BSA的PBS溶液中，然後將板載入到流式細胞儀上用於分析（所用抗體見 表 35）。分化的細胞系1A殖株1和2以及經編輯的IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入 B2Mnull殖株3 iNK細胞表現大部分成熟標誌物。在分化的第20天，所有三個經編輯的細胞系均顯示出比WT稍低的NK標誌物表現。然而，相同的標誌物僅在一週後（第28天）以與WT相當或甚至更高的水平表現。 [ 表 35]
抗原 螢光團 公司 目錄號 稀釋度
CD16 PE-Cy7 百進生物科技公司 360708 1 : 50
CD235a /血型糖蛋白A APC 百進生物科技公司 349114 1 : 10
CD34 FITC 梅旖旎公司（Miltenyi） 130-113-178 1 : 25
CD34 PE BD 555822 1 : 10
CD43 BB515 BD 564542 1 : 500
CD45 PE-Cy7 BD 557748 1 : 100
CD45 BB515 BD 564585 1 : 100
CD56 PE 梅旖旎公司 130-113-307 1 : 500
CD56 BB515 BD 564488 1 : 25
CD56/NCAM1 APC BD 555518 1 : 10
CD57 PE-Cy7 百進生物科技公司 359624 1 : 10
CD94/KLRD1 APC 梅旖旎公司 130-098-976 1 : 5
CD95/Fas1 FITC BD 555673 1 : 10
HLA-ABC FITC eBioscience公司 11-9983-42 1 : 10
HLA-DR、DP、DQ 647 百進生物科技公司 361703 1 : 10
HLA-E APC 百進生物科技公司 342605 1 : 10
hTACE/ADAM17 PE R & D公司 FAB9301P 1 : 10
IL-15 APC 英傑公司 MA5-23627 1 : 10
IL-15 PE 英傑公司 MA5-23561 1 : 10
IL-15 FITC 英傑公司 MA5-23664 1 : 10
KIR2DL4/CD158d APC 梅旖旎公司 130-112-466 1 : 25
KIR3DL2/CD158e/k PE-Vio770 梅旖旎公司 130-116-180 1 : 100
NKG2A/CD159a APC 梅旖旎公司 130-113-563 1 : 5
NKG2D BB515 BD 564566 1 : 2.5
NKp44/CD336 PE BD 558563 1 : 5
NKp46/CD335 PE-Cy7 BD 562101 1 : 5
Oct3/4 PE BD生物科學公司 560186 1 : 10
PD1/CD279 APC 百進生物科技公司 621610 1 : 10
PDL1/CD274 PE-Cy7 BD 558017 1 : 10
SOX2 Alexa 647 BD生物科學公司 562139 1 : 10
穿孔素，殖株δG9， PE 梅旖旎公司 130-123-726 1 : 25
顆粒酶B殖株REA226， APC 梅旖旎公司 130-120-773 1 : 25
對分化至 iNK 階段的經編輯的細胞的 KI 基因表現和 KO 狀態的確認。使用該等分化的細胞系1A殖株1細胞，重複流動式細胞分析術以評估KI基因表現和KO狀態。為了檢測BCMA CAR、HLA-E和IL15表面表現，使用螢光抗體（參見 表 21），用未編輯的WT iNK細胞作為陰性對照（ 表 36）。細胞系1A殖株1衍生的iNK細胞顯示 ＞ 99%的BCMA CAR表現、＞ 90%的HLA-E表現和 ＞ 99%的IL15表現。為了確認KO狀態，使用HLA-ABC的螢光抗體（參見 表 21），用未編輯的WT iNK細胞作為陰性對照（ 表 36）。 [ 表 36]
   WT iNK 殖株 1 iNK
CAR + 0.75% 99.9%
HLA-E + 5.65% 91%
IL-15 + 0.33% 99.1%
HLA-A、B、C (MHC-I) - 99.8% 0.8%
經編輯的 iNK 細胞的免疫表型。在iNK階段，將實例9的殖株1（包含所有編輯（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null）的hiPSC基因編輯的殖株）和實例8的殖株3（包含B2M KO（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull）的hiPSC基因編輯的殖株）和分化的野生型iPSC細胞與用CFSE標記的供體來源的T細胞共培養。共培養5天後，用流式細胞儀分析細胞並評估CFSE丟失的程度。WT iNK細胞誘導T細胞中CFSE訊息的丟失，表明發生了同種異體免疫反應。源自殖株1或殖株3的iNK細胞在T細胞中不產生CFSE丟失，表明該等細胞係免疫逃避的（ 圖 20）。
如實例8所述，使用24小時殺傷測定法確定第21天細胞系1A殖株1和2以及細胞系1殖株2（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull）細胞對K562和RPMI細胞之細胞毒性。WT和殖株1和2細胞系顯示出針對K562的有效細胞毒性（ 圖 21A），而殖株1和2也顯示出針對表現BCMA +的RPMI癌細胞系的更大細胞毒性，尤其是在效應細胞與靶細胞的比率最低為0.1 : 1時（ 圖 21B）。
使用ProteinSimple Ella系統，根據製造商的說明書，使用Simple Plex Runner軟體的軟體版本v.3.5.2.20和Simple Plex Explorer軟體測量細胞介素（IFNg、TNFa）。由ProteinSimple提供定制的8-plex Ella柱（32 x 8 Multiplex）以及稀釋緩衝液，其用於以1 : 2比率稀釋每個樣本（WT和細胞系1A殖株1），然後每個通道載入40 µL樣本。如 圖 22所示，培養基中的IFNg水平與增加的E : T比相關，在低E : T比（0.1 : 1）時高於WT。在較高的E : T比下，IFNg在經編輯的細胞中比WT稍低，這可能是由於靶細胞在24小時內的有效裂解而導致其急劇減少的結果。WT中的TNFa高於經編輯的殖株1中的TNFa。這種作用可能是由於缺乏切割TNFa的蛋白酶Adam17所致。
在分化的第14天和第36天，使用商購抗體藉由流動式細胞分析術測量細胞中的穿孔素和顆粒酶-B表現。 圖 23顯示WT細胞在分化的第14天幾乎不表現穿孔素或顆粒酶-B，但在第36天具有較高之表現。細胞系1A殖株1具有與WT類似之表現模式。
將分化自野生型（WT）、細胞系1A殖株1（「細胞系1A，c1」），細胞系1A殖株2（「細胞系1A，c2」）和殖株3（「B2M-/HLA-E +/IL15IL15Rα +」；IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC）衍生的iNK細胞的第20天的iNK以5 × 10 6個細胞/孔鋪板並且在有或沒有外源細胞介素的情況下生長。向細胞投與SCF（20 ng/mL）、Flt3L（15 ng/mL）、IL-7（20 ng/mL）和IL-15（15 ng/mL）（「4」）、SCF、Flt3L和IL-7（「3/-IL15-」）、無細胞介素（「0」）；或僅在第0天和第9天的IL-15（「IL15」）（ 圖 24）。經編輯的殖株在不存在外源IL15的情況下持續存在並擴增，而WT iNK細胞數在不存在外源IL15的情況下下降。 實例 11 ： FAS gRNA 、 CISH gRNA 和 REGNASE-1 gRNA 的生成和選擇
靶向gRNA被設計用於靶向FAS編碼序列的外顯子1、2和3，CISH編碼序列的外顯子1、2和3，REGNASE-1編碼序列的外顯子2和4。gRNA之靶序列分別如 表 37、 表 38和 表 39所呈現。每個gRNA包含對應於靶DNA序列的RNA間隔子序列。基於使用gRNA設計軟體進行的序列同源性預測，該等gRNA具有預測的低脫靶得分。 [ 表 37] . FAS 靶序列
名稱 靶序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: PAM
FAS Ex1 T7 GGATTGCTCAACAACCATGC 35 TGG
FAS Ex1 T9 GATTGCTCAACAACCATGCT 37 GGG
FAS Ex2 T1 GTGACTGACATCAACTCCAA 38 GGG
FAS Ex2 T2 CACTTGGGCATTAACACTTT 39 TGG
FAS Ex2 T3 TTGGAAGGCCTGCATCATGA 53 TGG
FAS Ex2 T7 ACTCCAAGGGATTGGAATTG 55 AGG
FAS Ex3 T1 CTAGGGACTGCACAGTCAAT 80 GGG
[ 表 38] . CISH 靶序列
名稱 靶序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: PAM
CISH Ex1 T2 TCGCCGCTGCCGCGGGGACA 81 TGG
CISH Ex1 T18 GACATGGTCCTCTGCGTTCA 82 GGG
CISH Ex2 T1 GTCCGCTCCACAGCCAGCAA 83 AGG
CISH Ex2 T2 GTTCCAGGGACGGGGCCCAC 84 AGG
CISH Ex3 T1 TCGGGCCTCGCTGGCCGTAA 85 TGG
CISH Ex3 T2 CGTACTAAGAACGTGCCTTC 86 TGG
CISH Ex3 T3 GGGTTCCATTACGGCCAGCG 87 AGG
CISH Ex3 T5 CAGGTGTTGTCGGGCCTCGC 88 TGG
CISH Ex3 T6 TACTCAATGCGTACATTGGT 89 GGG
CISH Ex3 T9 AAGGCTGACCACATCCGGAA 90 AGG
CISH Ex3 T11 TACATTGGTGGGGCCACGAG 91 TGG
CISH Ex3 T14 CTGTCAGTGAAAACCACTCG 92 TGG
[ 表 39] . REGNASE-1 靶序列
名稱 靶序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: PAM
REGNASE-1 Ex2 T1 GGTCATCGATGGGAGCAACG 93 TGG
REGNASE-1 Ex2 T2 CACCACCCCGCGGGACTAGA 94 GGG
ZC3H12A_區段2 T3 GGTCTGGCGCTCCCGCTCGG 95 TGG
REGNASE-1 Ex2 T4 CCACCACCCCGCGGGACTAG 96 AGG
REGNASE-1 Ex2 T5 TTAGGGGTGCCACCACCCCG 97 CGG
REGNASE-1 Ex4 T1 TTCACACCATCACGACGCGT 98 GGG
ZC3H12A_區段4 T2 ACACCATCACGACGCGTGGG 99 TGG
ZC3H12A_區段4 T3 CTACGAGTCTGACGGGATCG 100 TGG
ZC3H12A_區段4 T7 ACGACGCGTGGGTGGCAAGC 101 GGG
為了評估它們在hPSC中的切割效率，使用Neon電穿孔儀（Neon轉染套組，賽默飛世爾公司，目錄號MPK5000），用Cas9蛋白和引導RNA的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的核糖核蛋白（RNP）混合物（絕對值為125 pmol Cas9和625 pmol gRNA）對iPS細胞進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25 µL的總體積，並在室溫下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基（Gibco公司，目錄號11320033）中，使用NC-200（克莫麥特公司（ChemoMetec））計數並離心。用RNP複合體重懸總共1 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至125 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms並以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）的STEMFLEX™培養基的Eppendorf管中。然後將該細胞懸浮液鋪板到用1 : 10稀釋度下的BIOLAMININ 521 CTG預包被的組織培養皿中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO2）中培養48小時。48小時後，使用QuickExtract（盧西根公司，威斯康辛州米德爾頓；目錄號QE09050）從細胞中收穫基因組DNA。
進行針對靶序列的PCR，並藉由TIDE分析評估經擴增的所得DNA的切割效率。使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。將所得擴增子提交進行PCR清除和Sanger定序。將Sanger定序結果與引導序列一起輸入到Tsunami軟體中。藉由軟體計算插缺百分比和身份。然後基於它們在hPSC中的插缺頻率選擇特定的gRNA。選擇FAS Ex1 T9（SEQ ID NO: 37）、CISH Ex1 T18（SEQ ID NO: 82）和REGNASE-1 Ex2-T2（SEQ ID NO: 94）用於進一步的殖株產生，這是由於它們的高中靶活性。 實例 12 ： IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 BCMA CAR 敲入、 CIITA Null 、 B2M Null 、 ADAM17 Null 、 FAS Null 、 CISH Null 和 REGNASE-1 Null hPSC 的生成
FAS Ex1 T9（SEQ ID NO: 37）、CISH Ex1 T18（SEQ ID NO: 82）和REGNASE-1 Ex2 T2（SEQ ID NO: 94）gRNA分別用於敲除 FAS、 CISH和 REGNASE-1基因。使用Neon電穿孔儀，用Cas9蛋白和引導RNA的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的RNP混合物（絕對值為每1百萬個細胞125 pmol Cas9和625 pmol gRNA），對如實例9和實例10中所述之IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null細胞進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。然後使用R-緩衝液將該混合物與細胞合併至約115 µL的總體積。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms，接著以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充物（100X）和層連結蛋白511的STEMFLEX™培養基的6孔板中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
電穿孔後三至五天，如實例1所述對細胞進行單細胞分選。抗BCMA CAR抗體（參見 表 21）用於FACS分選到96孔板中。為了進行FACS分選，未經編輯的細胞充當陰性對照。分選後，如實例1所述擴增細胞，當匯合時，將樣本分開以進行維持和基因組DNA提取。
為了確定靶FAS、CISH和REGNASE-1序列中的插缺，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。將所得擴增子提交進行PCR清除和Sanger定序。將Sanger定序結果與引導序列一起輸入到Tsunami軟體中。在Snapgene軟體中對靶FAS、CISH和REGNASE-1區域的所得DNA序列進行比對，以確定插缺身份以及純合性或雜合性。
如以上實例9中所述，使用螢光抗體確認了BCMA CAR、HLA-E和IL15表面蛋白的持續表現。如以上實例9所述，藉由檢測OCT4和SOX2表現確認了經編輯細胞的多能性。選擇FAS、CISH和REGNASE-1基因座純合的殖株1（020殖株1）用於進一步分析， 實例 13 ：分化自 IL15/IR15α-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 BCMA CAR 敲入、 CIITA Null 、 B2M Null 、 ADAM17 Null 、 FAS Null 、 CISH Null 和 REGNASE-1 Null hPSC 的 NK 細胞的表徵
如實例2所述，使用方案1將「020殖株1」hPSC（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null、 FASNull、 CISHNull和 REGNASE-1Null）以及「012殖株1」hPSC（IL15/IR15α-P2A-HLA-E KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null）、「003殖株3」hPSCS（IL15/IR15α-P2A-HLA-E KI、 B2MNull）和野生型（WT）分化成iNK細胞。第10天和第14天的分化細胞的流動式細胞分析術分析顯示，如果CD31、CD34和CD43表現，則「020殖株1」分化的細胞具有與WT和分化自「012殖株1」和「003殖株3」的那些細胞類似的模式（ 圖 25A- 圖 25B）。在整個分化過程中，藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD45和CD56表現，顯示與WT相比所有經編輯的殖株的有效分化。到第20天，經編輯的殖株的類似水平係CD56 +（ 圖 26）。到第35天，超過99%的經編輯的殖株係CD45 +/CD56 +。
使用基於GFP的殺傷測定法，確定第31天「020殖株1」（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、BCMA CAR敲入、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null、 FASNull、 CISHNull和 REGNASE-1Null）、「012殖株1」（IL15/IR15α-P2A-HLA-E KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null）、「008殖株2」（IL15/IR15α-P2A-HLA-E KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull）和WT iNK細胞對K562和MM1S癌細胞之細胞毒性。用GFP標記癌細胞並在4小時內監測殺傷。WT細胞顯示出比經編輯的細胞更有效的針對K562細胞之細胞毒性（ 圖 27A 、圖 27B）。「012殖株1」細胞顯示出比WT和其他經編輯的細胞更大的針對表現BCMA +的MM1S癌細胞系的細胞毒性（ 圖 28A 、圖 28B）。 實例 14 ：抗 CD30 CAR 的開發和選擇
構建了幾種CD30 CAR，它們包含來自小鼠單株抗體的可變輕鏈和重鏈結構域（分別為SEQ ID NO: 102和103）或來自人抗CD30抗體的可變輕鏈和重鏈結構域（分別為SEQ ID NO: 104和105）、CD8跨膜結構域（SEQ ID NO: 122）、CD28（SEQ ID NO: 123）或41BB結構域（SEQ ID NO: 124）和CD3Z結構域（SEQ ID NO: 125）。 表 40詳述了抗CD30 CAR。 [ 表 40] . 抗 CD30 CAR
CAR 名稱
1 Brent_vL_vH_CD28
2 5F11_vH_vL-CD28
3 Brent_vL_vH_41BB
4 Brent_vH-vL_CD28
5 5F11_vH_vL_41BB
6 5F11_vL_vH-41BB
7 Brent_vH_vL_41BB
通過慢病毒載體將抗CD30 CAR遞送至WT NK92細胞。選擇後，使用螢光素酶殺傷測定法確定針對L428癌細胞系的細胞毒性。 圖 29A顯示4小時後NK92抗CD30 CAR殺傷結果，其中CAR 4、5和6在每種比率下勝過WT，CAR 5和6顯示最佳殺傷。CD30 KO強烈降低NK92殺傷能力。 圖 29B呈現了24小時後的結果。CAR 4、5和6在0.5 : 1下勝過WT，其中CAR 5和6顯示出對於所有比率的接近100%的殺傷。還測試了針對另一種癌細胞系KM-H2的細胞毒性。 圖 30A呈現了4小時時的結果，並且 圖 30B示出了24小時時的殺傷。CAR 4、5和6顯示最佳殺傷。選擇CAR 4、5和6用於KI進入iPSC的 CIITA基因座。 實例 15 ：抗 CD30 CAR-P2A-HLA-E 三聚體敲入、 CIITA Null 人多能幹細胞的生成
設計質體以將抗CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體插入基本上如實例6中所述之 CIITA基因座中（即， CIITA外顯子2的86個bp在經歷HDR後將被去除）。每個供體質體含有與抗CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體的cDNA可操作地連接的CAGGS啟動子，其側接有800個鹼基對的同源臂，該等同源臂與外顯子2周圍的 CIITA基因座具有相同序列。HLA-E三聚體cDNA由與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽構成，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而沒有其訊息肽。HLA-E三聚體編碼序列（包括連接子）係SEQ ID NO: 75（即，SEQ ID NO: 46、47、48、49、50和51）。連接抗CD30 CAR和HLA-E三聚體的P2A肽序列（SEQ ID NO: 45）允許從單一mRNA中分別表現兩種蛋白。每個供體質體還含有與右同源臂序列（SEQ ID NO: 32）下游的EF-1α啟動子（SEQ ID NO: 149）可操作連接的PD-L1編碼序列（SEQ ID NO: 146），使得如果質體整合到基因組中，PD-L1將表現。跨越質體骨架的探針可用於使用ddPCR檢測質體整合。用抗PD-L1抗體的FACS可用於去除PD-L1陽性細胞。
圖 31呈現了抗CD30 CAR 4-P2A-HLA-E編碼質體（SEQ ID NO: 110）的示意圖，並且 表 41標識了其中的元件和位置。抗CD30 CAR 4編碼序列係SEQ ID NO: 108（即，SEQ ID NO: 26、106、126、107和128），並且抗CD30 CAR 4胺基酸序列係SEQ ID NO: 109。抗CD30 CAR 4-P2A-HLA-E編碼序列係SEQ ID NO: 119（即，SEQ ID NO: 26、106、126、107、128和44-51）。
圖 32呈現了抗CD30 CAR 5-P2A-HLA-E編碼質體（SEQ ID NO: 114）的示意圖，並且 表 42標識了其中的元件和位置。抗CD30 CAR 5編碼序列係SEQ ID NO: 112（即，SEQ ID NO: 26、111、126、127和128），並且抗CD30 CAR 4胺基酸序列係SEQ ID NO: 113。抗CD30 CAR 5-P2A-HLA-E編碼序列係SEQ ID NO: 120（即，SEQ ID NO: 26、111、126、127、128和44-51）。
圖 33呈現了抗CD30 CAR 6-P2A-HLA-E編碼質體（SEQ ID NO: 118）的示意圖，並且 表 43標識了其中的元件和位置。抗CD30 CAR 6編碼序列係SEQ ID NO: 116（即，SEQ ID NO: 26、115、126、127和128），並且抗CD30 CAR 4胺基酸序列係SEQ ID NO: 117。抗CD30 CAR 6-P2A-HLA-E編碼序列係SEQ ID NO: 121（即，SEQ ID NO: 26、115、126、127、128和44-51）。 [ 表 41] . 抗 CD30 CAR 4-P2A-HLA-E 供體質體的元件
元件 位置（大小以 bp 計） SEQ ID NO:
LHA-CIITA 11,107-641（800） 22
CMV強化子 670-1049（380） 23
雞β-肌動蛋白啟動子 1052-1327（276） 24
嵌合內含子 1328-2336（1009） 25
CD8a訊息肽 2381-2443（63） 26
Brent_vH_vL 2444-3172（729） 106
CD8TM 3173-3436（264） 126
CD28結構域 3437-3556（120） 107
CD3Z結構域 3557-3892（336） 128
GSG標籤 3893-3901（9） 44
P2A 3902-3958（57） 45
B2M訊息序列 3959-4018（60） 46
HLA-G肽 4019-4045（27） 47
GS連接子 4046-4090（45） 48
B2M 4091-4387（297） 49
GS連接子 4388-4447（60） 50
HLA-E 4448-5458（1011） 51
3X終止密碼子 5459-5467（9） 52
bGH聚(A)訊息 5485-5709（225） 31
RHA-CIITA 5716-6515（800） 32
EF-1α啟動子 6535-7712（1178） 149
PD-L1 CDS 7728-8600（873） 146
SV40聚(A)序列 8618-8739（122） 147
總質體 11,265 bp 110
[ 表 42] . 抗 CD30 CAR 5-P2A-HLA-E 供體質體的元件
元件 位置（大小以 bp 計） SEQ ID NO:
LHA-CIITA 11,205-766（800） 22
CMV強化子 774-1153（380） 23
雞β-肌動蛋白啟動子 1156-1431（276） 24
嵌合內含子 1432-2440（1009） 25
CD8a訊息肽 2485-2547（63） 26
5F11_vH_vL 2548-3249（702） 111
CD8TM 3250-3513（264） 126
41BB共刺激結構域 3514-3639（126） 127
CD3Z結構域 3640-3975（336） 128
GSG標籤 3976-3984（9） 44
P2A 3985-4041（57） 45
B2M訊息序列 4042-4101（60） 46
HLA-G肽 4102-4128（27） 47
GS連接子 4129-4173（45） 48
B2M 4174-4470（297） 49
GS連接子 4471-4530（60） 50
HLA-E 4531-5541（1011） 51
3X終止密碼子 5542-5550（9） 52
bGH聚(A)訊息 5568-5792（225） 31
RHA-CIITA 5799-6598（800） 32
EF-1α啟動子 6618-7795（1178） 149
PD-L1 CDS 7811-8683（873） 146
SV40聚(A)序列 8701-8822（122） 147
總質體 12,224 114
[ 表 43] . 抗 CD30 CAR 6-P2A-HLA-E 供體質體的元件
元件 位置（大小以 bp 計） SEQ ID NO:
LHA-CIITA 11,205-766（800） 22
CMV強化子 795-1174（380） 23
雞β-肌動蛋白啟動子 1177-1452（276） 24
嵌合內含子 1453-2461（1009） 25
CD8a訊息肽 2500-2568（63） 26
5F11_vL_vH 2569-3270（700） 115
CD8TM 3271-3528（264） 126
41BB共刺激結構域 3529-3654（126） 127
CD3Z結構域 3655-3990（336） 128
GSG標籤 3991-3999（9） 44
P2A 4000-4056（57） 45
B2M訊息序列 4057-4116（60） 46
HLA-G肽 4117-4143（27） 47
GS連接子 4144-4188（45） 48
B2M 4189-4485（297） 49
GS連接子 4486-4545（60） 50
HLA-E 4546-5556（1011） 51
3X終止密碼子 5557-5565（9） 52
bGH聚(A)訊息 5583-5807（225） 31
RHA-CIITA 5814-6613（800） 32
EF-1α啟動子 6633-7810（1178） 149
PD-L1 CDS 7826-8698（873） 146
SV40聚(A)訊息 8716-8837（122） 147
總質體 11,238 bp 118
使用CIITA-T6 gRNA（ 表 19）來促進抗CD30 CAR轉基因在所靶向的 CIITA基因座處的插入。供體質體中不存在CIITA-T6之靶序列，並且因此供體質體本身將不被該gRNA靶向。CIITA-T6誘導的人基因組中CIITA外顯子2處的CRISPR切割將導致 CIITA蛋白的移碼和丟失。將每種CD30 CAR供體質體以及由靶向CIITA的gRNA和Cas9蛋白組成的RNP複合體一起引入。每1百萬個人胚胎幹細胞，通過電穿孔將2 µg質體DNA與RNP一起遞送。使用Neon電穿孔儀，用Cas9蛋白和引導RNA的莫耳比為1 : 5的RNP混合物（絕對值為每2百萬個細胞125 pmol Cas9和625 pmol gRNA）進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於STEMFLEX™培養基中，使用NC-200（克莫麥特公司（ChemoMetec））計數並離心。用RNP複合體重懸總共2 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至115 µL的總體積。然後將該混合物以1000 V用3個脈衝電穿孔30 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充劑（100X）和1 : 10稀釋的BIOLAMININ 521 CTG的STEMFLEX™培養基的6孔板中的孔中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
電穿孔後2天，使用抗HLA-E的抗體通過螢光活化細胞分選（FACS）富集細胞用於轉染（參見 表 21）。質體整合分析揭示1/46的細胞殖株不含整合的質體。然而，如果在細胞分選之前去除PD-L1陽性細胞，則24/82的細胞殖株不含質體。因此，使用PD-L1陰性細胞進行FACS。電穿孔後七至十天，使用FACS再次富集細胞中的HLA-E三聚體敲入細胞。該等富集的細胞代表抗CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體陽性細胞的大KI群體。進行針對經編輯的殖株的基因分型的PCR，並藉由TIDE分析評估經擴增的所得DNA的切割效率。 實例 16 ：將幹細胞分化成自然殺手細胞 - 方案 2
發現一些誘導多能幹細胞不能用上述 實例 1中的方案1有效分化。因此，開發了方案2（也稱為比對方法2.0或AP2.0）以將該等iPSC分化成造血幹細胞和先驅細胞（HSPC），然後分化成自然殺手（NK）細胞。在分化之前，將冷凍的iPSC解凍並重懸於NK-MED-001a培養基中（ 表 44）。用層連結蛋白-521預包被的燒瓶用於細胞培養。每天用NK-MED-002a（ 表 45）培養基更換培養基，直到細胞用於分化。
NK 細胞分化。 使用以下步驟分化iPS細胞：
1. 第 -1 天（下午）， iPSC 聚集：從含有iPSC的燒瓶中吸出NK-MED-002a培養基，並用DPBS（無鈣、無鎂）（賽默飛世爾科技公司，14190250）洗滌該等細胞。吸出DPBS，並向每個T25燒瓶中添加2 mL ACCUTASE®（創新細胞技術公司（Innovative Cell Technologies），AT-104）（或80 µL ACCUTASE®/1 cm 2）。將細胞在37°C下孵育3-5 min（不超過7分鐘）。用冷的NK-MED-002a培養基稀釋經Accutase消化的細胞至至少3 : 1的比率（NK-MED-002 : ACCUTASE®）。將該等細胞輕輕地重懸並轉移到錐形管中。視需要，向細胞中添加足夠的NK-MED-002a®培養基以將ACCUTASE®培養基稀釋到至少1 : 1和至多4 : 1的比率（NK-MED-002a : ACCUTASE®）。藉由以20-300 g旋轉4至5分鐘使細胞沈澱，並重懸於10 mL NK-MED-003a培養基中（ 表 46）。對該等細胞進行計數並將細胞濃度稀釋至1 × 10 6個/mL。將6 × 10 6個細胞轉移至另一管中，並重新懸浮於總共6 mL NK-MED-003a培養基中。將該等細胞轉移到超低黏附6孔板（康寧公司，3471）的1個孔中，並將板置於平臺振盪器上，以98 RPM旋轉18 +/- 2小時（過夜）。
2. 在第 0 天，早晨，在 iPSC 聚集後 18 +/- 2 小時：將板以圓周運動旋轉，以使聚集體向孔的中心移動，並將聚集體收集在錐形管中。替代性地，收集所有的聚集體溶液混合物。使聚集體沈降15 +/- 5分鐘。將細胞重懸於NK-MED-004培養基中（ 表 47）。計數聚集體中的細胞數。根據需要調節接種密度以將3 × 10 5個細胞重懸於2 mL NK-MED-004培養基中，並鋪板於6孔低黏附板的一個孔中。替代性地，為了放大，將適當數量的細胞重懸並轉移到PBS旋轉容器（PBS生物技術公司（PBS Biotech））中。測試的PBS接種容器的接種密度為約1 × 10 5個細胞/mL最終培養基體積（第0天+ 8小時）。將板置於平臺振盪器上並以98 RPM旋轉8小時，或者將PBS旋轉容器置於PBS基座（PBS-MINI MagDrive基座單元；PBS生物技術公司）上，在CO 2培養箱中以38至39 RPM的旋轉速度旋轉。
3. 在第 0 天，下午，在 NK-MED-004 培養基添加後 8 小時：每孔或旋轉容器分別添加50 mL或250 mL NK-MED-005c培養基（ 表 48）。將板放回CO 2培養箱中的平臺振盪器或PBS旋轉容器至其底部，並靜置直至第2天。NK-MED-005c培養基組分係其終濃度的2X，因此將其以1 : 1體積比添加到NK-MED-004中的細胞中。
4. 在第 2 天：將NK-MED-005c培養基替換為NK-MED-006b培養基（ 表 49）。
5. 在第 4 天：將NK-MED-006b培養基替換為NK-MED-007培養基（ 表 50）。
6. 在第 6 天：將NK-MED-007培養基替換為NK-MED-008b培養基（ 表 51），或替代性地：在第6天開始，將具有所有聚集體和單細胞的培養基轉移到適當體積的離心錐形管中。將細胞離心並重懸於NK-MED-008b培養基中，並放回原始孔中和平臺振盪器上，或放回原始容器中和基座上，並返回用於繼續培養。
7. 在第 10 天：用NK-MED-008b培養基進行一半或全部培養基更換。
8. 在第 14 天：用NK-MED-009b培養基進行完全培養基更換（ 表 52）。
9. 在第 17 天：對NK-MED-009b培養基進行三分之一培養基更換，然後對NK-MED-009b培養基進行完全培養基更換。
從第 20 天開始：在第20天開始，從細胞培養物估計單細胞密度。用NK-MED-010培養基（ 表 53）進行完全培養基更換，並將細胞密度調節至0.8至1.5 × 10 6個細胞/mL內。從第20天到第30天，每2-3天用NK-MED-010培養基更換完全培養基，並將細胞密度至0.8-1.5 × 10 6個細胞/mL。
在下表中，體積係獲得所需濃度的近似值。 [ 表 44]. 用於 NK-MED-001a 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
StemBrew基礎培養基 90% 980 mL 100%
StemBrew補充物 1X 20 mL 50X
噻唑維林（生物工業公司，1226056-71-8） 2 µM 200 µL 10 mM
[ 表 45]. 用於 NK-MED-002a 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
StemBrew基礎培養基 90% 980 mL 100%
StemBrew補充物 1X 20 mL 50X
[ 表 46]. 用於 NK-MED-003a 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
StemBrew基礎培養基 90% 979 mL 100%
StemBrew補充物 1X 20 mL 50X
噻唑維林 （生物工業公司，1226056-71-8） 10 µM 1000 µL 10 mM
[ 表 47]. 用於 NK-MED-004 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 999 mL 100%
rh BMP-4 （派普泰克公司，120-05ET） 30 ng/mL 300 µL 100 µg/mL
噻唑維林 （生物工業公司，1226056-71-8） 10 µM 1000 µL 10 mM
[ 表 48]. 用於 NK-MED-005c 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 998 mL 100%
rh BMP-4 （派普泰克公司，120-05ET） 30 ng/mL 300 µL 100 µg/mL
rh FGF2 （派普泰克公司，100-18C-1MG） 100 ng/mL 1000 µL 100 µg/mL
CHIR-99021 （賽力克化學公司，S1263） 7 µM 700 µL 10 mM
活化素-A （R & D生物科技公司（R & D Systems），338-AC-01M/CF 5 ng/mL 100 µL 50 µg/mL
[ 表 49]. 用於 NK-MED-006b 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 997 mL 100%
rh FGF2 （派普泰克公司，100-18C-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh VEGF165 （派普泰克公司，100-20-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh TPO （派普泰克公司，300-18） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 100 ng/mL 1000 µL 100 µg/mL
rh IL-3 （派普泰克公司，200-03-100UG） 40 ng/mL 400 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
SB431542 （賽力克化學公司，S1067） 5 µM 500 µL 10 mM
[ 表 50] . 用於 NK-MED-007 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
STEMdiff APEL 2培養基（幹細胞技術公司，05275） 100% 998 mL 100%
rh FGF2 （派普泰克公司，100-18C-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh VEGF165 （派普泰克公司，100-20-1MG） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh TPO （派普泰克公司，300-18） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 100 ng/mL 1000 µL 100 µg/mL
rh IL-3 （派普泰克公司，200-03-100UG） 40 ng/mL 400 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
[ 表 51] . 用於 NK-MED-008b 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
DMEM（高葡萄糖，GlutaMAX） （賽默飛世爾公司，10566016） 50.3% 503 mL 100%
含GlutaMAX的F-12 （賽默飛世爾公司，31765035） 28% 280 mL 100%
GlutaMAX （賽默飛世爾公司，35050079） 1X 10 mL 100X
葡萄糖* 4.66 mM 4.2 mL 1110 mM
人AB血清 （谷生物醫學公司，HP1022） 20% 20 mL 100%
硫酸鋅 （密理博西格瑪公司，Z0251） 36.2 µM 978 µL 37 mM
乙醇胺 （密理博西格瑪公司，E0135） 50 µM 3 µL 16.6 M
抗壞血酸 （飛世爾科技公司，NC0762606） 15 µg/mL 15 µL 10 mg/mL
亞硒酸鈉 （密理博西格瑪公司，S9133-1MG） 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL
rh IL-3 （派普泰克公司，200-03-100UG） 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL
rh IL-7 （派普泰克公司，200-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh IL-15 （派普泰克公司，200-15） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
*培養基中的總葡萄糖濃度為20 mM（考慮到DMEM培養基中的葡萄糖、F12補充物和這裡提供的添加的葡萄糖）。
[ 表 52]. 用於 NK-MED-009b 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
DMEM（高葡萄糖，GlutaMAX） （賽默飛世爾公司，10566016） 50.3% 503 mL 100%
含GlutaMAX的F-12 （賽默飛世爾公司，31765035） 28% 280 mL 100%
GlutaMAX （賽默飛世爾公司，35050079） 1X 10 mL 100X
葡萄糖* 4.66 mM 4.2 mL 1110 mM
人AB血清 （谷生物醫學公司，HP1022） 20% 20 mL 100%
硫酸鋅 （密理博西格瑪公司，Z0251） 37 µM 978 µL 37 mM
乙醇胺 （密理博西格瑪公司，E0135） 50 µM 3 µL 16.6 M
抗壞血酸 （飛世爾科技公司，NC0762606） 15 µg/mL 1500 µL 10 mg/mL
亞硒酸鈉 （密理博西格瑪公司，S9133-1MG） 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL
rh IL-7 （派普泰克公司，200-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
rh Flt3L （派普泰克公司，300-19） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh IL-15 （派普泰克公司，200-15） 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh SCF （派普泰克公司，300-07） 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
*培養基中的總葡萄糖濃度為20 mM（考慮到DMEM培養基中的葡萄糖、F12補充物和這裡提供的添加的葡萄糖）。
[ 表 53] . 用於 NK-MED-010 的培養基組成物
組分 工作濃度 體積 原液濃度
DMEM（高葡萄糖，GlutaMAX） 60.5% 605 mL 100%
含GlutaMAX的F-12 28% 280 mL 100%
GlutaMAX 1X 10 mL 100X
葡萄糖* 2.33 mM 2.1 mL 1110 mM
人AB血清 10% 100 mL 100%
硫酸鋅 37 µM 978 µL 37 mM
乙醇胺 50 µM 3 µL 16.6 M
抗壞血酸 15 µg/mL 1500 µL 10 mg/mL
亞硒酸鈉 5 ng/mL 50 µL 100 µg/mL
菸鹼醯胺 6.5 mM 6.5 mL 1000 mM
rh IL-7 10 ng/mL 100 µL 100 µg/mL
rh Flt3L 7.5 ng/mL 75 µL 100 µg/mL
rh IL-15 15 ng/mL 150 µL 100 µg/mL
rh SCF 20 ng/mL 200 µL 100 µg/mL
*培養基中的總葡萄糖濃度為20 mM（考慮到DMEM培養基中的葡萄糖、F12補充物和這裡提供的添加的葡萄糖）。
實例 17 ：具有 SERPINB9-P2A-HLA-E 三聚體敲入和 B2M 敲除的人多能幹細胞的生成
將SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體序列插入人iPSC細胞系中。使用B2M-2 gRNA（SEQ ID NO: 34； 表 19）來促進SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體轉基因在所靶向的 B2M基因座處的插入。
設計供體質體以將SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體轉基因插入 B2M基因座中，使得B2M的起始密碼子在經歷同源定向修復（HDR）以插入該轉基因後被去除，從而使部分B2M表現的任何機會無效。SERPINB9和HLA-E三聚體序列藉由P2A肽序列連接以允許表現由單個轉錄物編碼的兩種單獨的蛋白。 圖 34呈現了供體質體（SEQ ID NO: 130的示意圖，並且 表 54標識了其中的元件和位置。供體質體包含可操作地連接到CAGGS啟動子（包含CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子和嵌合內含子）的SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體轉基因（SEQ ID NO: 131），其側接有800個鹼基對的同源臂，該等同源臂與外顯子1中靶位點周圍的 B2M基因座具有序列同一性。HLA-E三聚體cDNA由與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽構成，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而沒有其訊息肽。HLA-E三聚體編碼序列（包括連接子）係SEQ ID NO: 75（即，SEQ ID NO: 46、4、48、49、50和51）。該HLA-E三聚體設計先前已經公佈（Gornalusse等人 (2017) Nat. Biotechnol. [自然•生物技術] 35 (8): 765-772）。 [ 表 54] . （ B2M ） SERPINB9-P2A-HLA-E 三聚體供體質體的元件
元件 位置（大小以 bp 計） SEQ ID NO:
左ITR 1-130（130） 21
LHA-B2M 145-944（800） 36
CMV強化子 973-1352（380） 23
雞β-肌動蛋白啟動子 1355-1630（276） 24
嵌合內含子 1631-2639（1009） 25
SERPINB9 CDS 2684-3811（1128） 129
GSG標籤 3812-3820（9） 44
P2A 3821-3877（57） 45
B2M訊息序列 3878-3937（60） 46
HLA-G肽 3938-3964（27） 47
GS連接子1 3965-4009（45） 48
B2M膜蛋白 4010-4306（297） 49
GS連接子2 4307-4366（60） 50
HLA-E CDS 4367-5377（1011） 51
3X終止密碼子 5378-5386（9） 52
bGH聚(A)訊息 5404-5628（225） 31
RHA-B2M 5635-6434（800） 54
右ITR 6476-6616（141） 33
完整質體 （8963） 130
將SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體供體質體以及由靶向B2M的gRNA和Cas9蛋白組成的核糖核蛋白（RNP）複合體一起引入。每1百萬個hiPSC細胞，通過電穿孔將4 µg質體DNA與RNP一起遞送。使用Neon電穿孔儀，用Cas9蛋白（碧歐美公司）和引導RNA（Biospring公司）的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的RNP混合物（絕對值為每1百萬個細胞125 pmol Cas9和625 pmol gRNA），在hiPSC細胞中進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。使用ACCUTASE®將細胞解離，然後重懸於StemFlex培養基中，使用NC-200（克莫麥特公司）計數並離心。用RNP複合體重懸總共2 × 10 6個細胞，並添加R-緩衝液至約115 µL的總體積。然後將該混合物以1100 V用3個脈衝電穿孔30 ms。進行兩次電穿孔。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有RevitaCell和層連結蛋白511的StemFlex培養基的6孔板的孔中。用BIOLAMININ 521 CTG以1 : 10的稀釋度預包被板。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
電穿孔後七至十天，使用抗HLA-E的抗體（ 表 21），通過磁性輔助細胞分選（MACS），使用抗小鼠IgG Dynabeads（賽默飛世爾公司，CELLection™ Pan小鼠IgG套組，11531D）富集細胞中表現HLA-E三聚體的細胞。該等富集的細胞代表SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體陽性細胞的大KI群體。藉由流動式細胞分析術評估該群體的HLA-E表現，顯示 ＞ 90%的HLA-E表現（ 圖 35）。
MACS富集後，如實例1所述對細胞進行單細胞分選。抗HLA-E-PE抗體（ 表 21）用於FACS分選到96孔板中。為了進行FACS分選，未經編輯的細胞充當陰性對照。分選後，如實例1所述擴增細胞，當匯合時，將樣本分開以進行維持和基因組DNA提取。
進行針對經編輯的殖株（SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull人多能幹細胞（hPSC））的基因分型的PCR，並藉由TIDE分析評估經擴增的所得DNA的切割效率。
為了確定靶B2M序列中的SERPINB9-P2A-HLA-E三聚體敲入基因分型，使用2步方案用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如上 表 26所呈現；並且循環條件如 表 27所提供。
圖 36示出了各種經編輯的殖株的轉基因KI進入 B2M基因座的基因分型結果。存在1.1 kb條帶指示KI構建體成功整合到 B2M基因座中，而不存在條帶指示WT基因型。
為了確定KI質體中任何不需要的細菌質體元件的存在，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行兩次PCR。PCR引物之序列所 表 55和 表 57所呈現；並且循環條件如 表 56和 表 58所提供。 [ 表 55] . 質體 #1 引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
Ori-F2 正向 CCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG 132
Ori-R 反向 GTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAG 133
[ 表 56] . 質體 #1 PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 98°C 30 s 1
變性 98°C 10 s 30
延伸 72°C 10 s
伸長 72°C 1 min 1
保持 4°C 保持   
[ 表 57] . 質體 #2 引物
名稱 類型 序列（ 5’-3’ ） SEQ ID NO:
F1-Ori-F 正向 CACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTC 134
F1-Ori-R2 反向 GGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGG 135
[ 表 58] . 質體 #2 PCR 循環參數
步驟 溫度 時間 循環數
變性 98°C 30 s 1
變性 98°C 10 s 30
延伸 72°C 10 s
伸長 72°C 1 min 1
保持 4 保持   
圖 37示出了第一次PCR擴增細菌質體元件，因為它們在同源臂外部，所以它們不應藉由HDR整合到基因組中。5’和3’引物均結合KI質體內的同源臂外部。340 bp條帶的存在指示質體骨架在基因組內隨機整合，沒有條帶的殖株不具有質體插入。
圖 38示出了第二次PCR擴增同源臂外部的細菌質體元件。476 bp條帶的存在指示質體骨架在基因組內隨機整合，沒有條帶的殖株不具有質體插入。
為了確定靶B2M序列中的插缺，使用Platinum Taq Supermix（英傑公司，目錄號125320176和目錄號11495017）進行相關區域的PCR。PCR引物之序列如上 表 22所呈現；並且循環條件如 表 23所提供。
圖 39示出了各種經編輯的殖株的B2M插缺結果。573 bp條帶的存在指示WT基因型將在未編輯或KI構建體雜合的殖株中發現，因為純合殖株將不具有條帶。經由PCR和Sanger定序確認殖株的B2M KO狀態。在Snapgene軟體中對靶B2M區域的所得DNA序列進行比對，以確定插缺身份以及純合性或雜合性。
基於經編輯的殖株的PCR和Sanger定序分析， 圖 36 至圖 39中泳道25中所示的殖株被選為「殖株1」，泳道42中所示的殖株被選為「殖株2」，其顯示具有SERPINB9-P2A-HLA-E KI並且沒有細菌質體元件，而定序數據確認B2M被完全敲除。殖株1對於進入B2M的KI係純合的，而殖株2對於KI係雜合的，並且在B2M WT條帶中具有+1T的插缺。泳道2、19、23和33中的殖株也分別被選為「殖株3-6」，並且確認對進入 B2M的SERPINB9-P2A-HLA-E KI係純合的。 實例 18 ：幹細胞分化成自然殺手細胞
將實例17中製備的SERPINB9 KI/HLA-E KI/B2M KO幹細胞（殖株1-4）分化成自然殺手（NK）細胞（iNK細胞）。 圖 40提供了iNK分化的示意性時間線和細胞階段，以及每個階段處的特徵性細胞標誌物。iNK分化方案係基於公佈的方案開發的（參見例如Ng等人, Nat Protocols [自然規程] 3: 768: 776 (2008)和US 9,260,696）。iNK細胞表現NK細胞標誌物。 圖 41呈現了使用iNK分化方案在IPSC WT和SERPINB9 KI/HLA-E KI/B2M KO細胞系分化成iNK期間CD45 +/CD56 +iNK細胞發育的實例。被引入IPSC中的所列編輯不影響iNK分化。 實例 19 ： SERPINB9 保護分化細胞免受 NK 細胞殺傷
使用發光細胞活力測定法（CellTiter-Glo®，普洛麥格公司（Promega））確定分化自SERPINB9 KI幹細胞之細胞從周邊血NK（PB-NK）細胞攻擊中存活的能力。該測定法基於存在的ATP的定量來確定活細胞數量，ATP的存在標誌著代謝活性細胞的存在。與效應細胞孵育後，向靶細胞中添加CellTiter-Glo試劑並測量發光。光強度與ATP濃度線性相關。
檢測PB-NK細胞對分化自經編輯的iPSC的iNK細胞之細胞毒性。將源自幾個供體的PB-NK效應細胞與以上實例18中製備的第31天的iNK靶細胞（源自殖株1和2）以1 : 1或2 : 1的E : T比孵育18-24小時。對照靶細胞包括源自野生型iPSC細胞和B2M KO iPSC細胞的iNK。 圖 42A和 圖 42B呈現了在分別來自兩個不同供體即PBNK供體4（ 圖 42A）和PBNK供體6（ 圖 42B）的PB-NK細胞存在下靶細胞裂解之百分比。與單獨的B2M KO相比，B2M KO/SERPINB9 KI/HLA-E KI提供了免於NK殺傷的保護。 圖 42C-42E示出了在分別來自3個不同供體即PBNK-CLL-供體#1（ 圖 42C）、PBNK供體4（ 圖 42D）和PBNK供體6（ 圖 42E）的PB-NK細胞存在下以0.5 : 1、1 : 1或2 : 1的E : T比持續24小時的靶細胞裂解（即，以上實例3中製備的第35天的iNK靶細胞（源自殖株4））之百分比。 實例 20 ：具有 SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα 融合體敲入和 B2M 敲除的人多能幹細胞的生成
將包含SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα融合體的轉基因插入人iPSC的 B2M基因座中。使用 表 19中所示的B2M-2 gRNA（SEQ ID NO: 34）。設計供體質體使得 B2M的起始密碼子在經歷同源定向修復以插入SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα序列後被去除，從而使部分B2M表現的任何機會無效。 圖 43呈現了質體（SEQ ID NO: 148）的示意圖，並且 表 59標識了其中的元件和位置。供體質體含有CAGGS啟動子驅動的SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα cDNA序列，其側接有800個鹼基對的同源臂，該等同源臂與外顯子1周圍的 B2M基因座具有相同序列。IL15/IR15α融合序列如先前公佈的那樣設計（Hurton等人 (2016) Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊]; 113 (48): E7788-E7797. doi: 10.1073/pnas.1610544113）。IL15/IR15α融合編碼序列（包括連接子）係SEQ ID NO: 76（即，SEQ ID NO: 40、41、42和43）。SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα編碼序列係SEQ ID NO: 137（即，SEQ ID NO: 129、44、45和40-43）。供體質體（SEQ ID NO: 148）還含有編碼PD-L1（SEQ ID NO: 146）的序列，該序列由位於右同源臂下游的EF-1α啟動子（SEQ ID NO: 145）驅動，用於篩選和去除供體質體錯誤整合到基因組中的細胞殖株。 [ 表 59] . （ B2M ） SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα 供體質體的元件
元件 位置（大小以 bp 計） SEQ ID NO:
LHA-B2M 9791-10590（800） 36
CMV強化子 10619-353（380） 23
雞β-肌動蛋白啟動子 356-631（276） 24
嵌合內含子 632-1640（1009） 25
SERPINB9 CDS 1685-2812（1128） 129
GSG標籤 2813-2821（9） 44
P2A 2822-2878（57） 45
IgE訊息肽 2879-2932（54） 40
IL-15 CDS 2933-3331（399） 41
連接子 3332-3409（78） 42
IL15Rα CDS 3410-4120（711） 43
bGH聚(A)訊息 4144-4368（225） 31
RHA-B2M 4375-5174（800） 54
EF-1α啟動子 5194-6396（1203） 145
PD-L1 6412-7284（873） 146
SV40聚(A)訊息 7302-7423（122） 147
完整質體 10,645 bp 148
將細胞用包含Cas9和 B2M-2 gRNA的RNP和供體質體進行電穿孔，基本上如實例15和17中所述進行培養和表徵。例如，在電穿孔後第2天，藉由FACS從PD-L1陰性細胞中分選IL15陽性細胞。一天後再次藉由FACS對IL15陽性細胞進行細胞分選。7. 圖 44顯示經編輯的細胞在大群體中被有效編輯和保持。基本上如實例16所述，對經編輯的細胞的大群體進行分化。在第28天測量iNK生物標誌物（ 圖 45A和 圖 45B）。在細胞殺傷測定法中，第28天和第35天的iNK細胞對K562細胞具有高水平的細胞毒性（4小時孵育）。
在確認轉基因KI和 B2MKO後，將具有鹼基編輯（SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KO、 B2MKO）的細胞進一步編輯成具有 CISHKO（CISH Ex1 T18；SEQ ID NO: 82）和 FASKO（FAS Ex 1 T9；SEQ ID NO: 37）（即，原型編輯）並且基本上如上文實例18中所述進行分化。 實例 21 ：具有 SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα 融合體敲入和 B2M 敲出、抗 CD30 CAR-P2A-HLA-E 三聚體敲入和 CIITA 敲出、 CISH 敲出和 Fas 敲出 的人多能幹細胞的生成
生成iPSC細胞以具有SERPINB9-P2A-IL15/IR15α KI和 B2MKO、抗CD30 CAR-P2A-HLA-E KI和 CIITAKO以及 CISHKO和 FASKO，通常如實例15和20中所述，但具有修改。
首先，使用SERPINB9-P2A-IL15/IR15α質體（SEQ ID NO: 148）和B2M-T2 gRNA將SERPINB9-P2A-IL15/IR15α敲入細胞。在電穿孔前一天將iPSC傳代，並以每T75瓶10百萬個細胞接種。在電穿孔的當天，使細胞再次分裂並使用Neon電穿孔儀用Cas9蛋白（碧歐美公司）和引導RNA（IDT公司）的莫耳比為5 : 1（gRNA : Cas9）的RNP混合物（絕對值為每2百萬個細胞625 pmol gRNA和125 pmol Cas9）進行電穿孔。為了形成RNP複合體，將gRNA和Cas9與R-緩衝液（Neon轉染套組）在一個容器中合併至25-50 µL的總體積，並在室溫（RT）下孵育15 min。然後使用R-緩衝液將該混合物與細胞合併至約115 µL的總體積。然後將該混合物以1000 V用3個脈衝電穿孔30 ms。電穿孔後，將細胞吸出到填充有含有REVITACELL™補充劑（100X）和1 : 10稀釋的BIOLAMININ 521 CTG的STEMFLEX™培養基的6孔板中。將細胞在常氧培養箱（37°C，8% CO 2）中培養。
在電穿孔後第2天，對PD-L1陰性細胞進行IL15陽性細胞的FACS分選（FACS#1），以富集轉染的細胞。在電穿孔後7至10天，再次對細胞進行FACS分選（FACS#2）用於IL15 +細胞以富集敲入陽性細胞（例如，L5V018B細胞）。使細胞擴增，然後使用 FASEx1 T9 gRNA（SEQ ID NO: 37）敲除 FAS。使用5 : 1（gRNA : Cas9）的RNP（絕對值為每1百萬個細胞625 pmol gRNA和125 pmol Cas9）進行敲除編輯。然後將該混合物以1500 V用1個脈衝電穿孔20 ms，然後以500 V用1個脈衝電穿孔100 ms。將細胞用靶向 FAS的RNP電穿孔兩次，間隔3天，以確保接近100%敲除。在敲除 FAS後，將細胞用靶向 CISH的RNP（ CISHEx1 T18 gRNA（SEQ ID NO: 82））處理，並且再電穿孔兩次，間隔3天，以確保接近100%敲除CISH。在該靶向後，大群體代表具有 B2M、 FAS和 CISH敲除的SERPINB9-P2A-IL15/IR15α KI細胞（例如，BL5V019B細胞）的富集群體。
擴增該群體並將細胞用編碼抗CD30 CAR-P2A-HLA-E三聚體（例如，分別編碼抗CD30 CAR 4、5或6的SEQ ID NO: 110、114或118）的質體和靶向 CIITA的RNP電穿孔。該KI的電穿孔以與以上針對SERPINB9-P2A-IL15/IR15α的KI的電穿孔相同的方式進行。在電穿孔後2天，藉由進行HLA-E的FACS（FACS#3）來富集細胞用於轉染。在電穿孔後7至10天，再次對細胞進行HLA-E的FACS（FACS#4）分選以富集HLA-E敲入陽性細胞。FACS#4後，將細胞批量分選以去除殘餘的PD-L1陽性細胞。該群體代表具有 B2M、 FAS、 CISH和 CIITA敲除的SERPINB9-P2A-IL15/IR15α KI和抗CD30 CAR-P2A-HLA-E KI雙陽性細胞（例如稱為L5V024B（抗CD30 CAR4）、L5V025B（抗CD30 CAR5）或L5V026B（抗CD30 CAR6）細胞）的富集群體。細胞基本上如實例18所述進行分化和表徵。將來自大群體細胞的一些細胞針對IL15和HLA-E雙陽性細胞進行單細胞分選，並鋪板在96孔板上用於生成單細胞殖株。 實例 22 ： 源自 SERPINB9 KI 、 IL15/IL15Rα KI 、抗 CD30 CAR KI 、 HLA-E KI 、 B2M KO 、 CIITA KO 、 CISH KO 、 FAS KO 細胞的 iNK 細胞的表徵
圖 46呈現了在具有鹼基編輯（例如，SERPINB9-P2A-IL15/IR15α KI、 B2MKO）、原型編輯（例如，SERPINB9-P2A-IL15/IR15α KI、 B2MKO、 CISHKO、 FASKO）和CAR插入物（例如，SERPINB9-P2A-IL15/IR15α KI、抗CD30 CAR-P2A-HLA-E KI、 B2MKO、 FAS KO、 CISHKO和 CIITAKO）的細胞的iNK分化期間CD45和CD56之表現模式。到第36天，所有細胞系中超過99%係CD45 +/CD56 +，表明有效的iNK分化。
第29天的iNK細胞與各種CD30 +癌細胞的共孵育揭示，具有抗CD30 CAR的細胞係比具有鹼基編輯或原型編輯的細胞更有效的殺傷細胞（參見 圖 47A-D）。抗CD30 CAR細胞中之一些細胞在最高效應細胞-靶標比（5 : 1）下在4小時後具有超過90%的殺傷。通常，在CD30癌細胞細胞毒性測定法中，CAR5勝過CAR4和CAR6。 實例 23 ： 源自 SERPINB9 KI 、 IL15/IL15Rα KI 、抗 CD30 CAR KI 、 HLA-E KI 、 B2M KO 、 CIITA KO 、 CISH KO 、 FAS KO 細胞 的 iNK 細胞的體內測試
將小鼠靜脈內注射用螢光素酶標記的5 × 10 6個L428癌細胞。四天後（第0天），將包含CAR5的10 × 10 6個iNK細胞（2 : 1 E : T比）靜脈內注射到小鼠中。將在第7天和第14天再靜脈內注射兩次各1000萬個iNK細胞來給出iNK細胞，並在第28天收穫器官用於癌細胞定位。 圖 48表示方案之示意圖。 實例 24 ：將幹細胞分化成自然殺手細胞的替代方案 - 方案 2.5
單獨或組合地用以下改變重複根據實例16的分化方案：
1. 在NK細胞分化階段，使用「放大」方法培養和聚集iPS細胞。具體地，如下進行NK細胞分化步驟1（第1天（下午），iPSC聚集）。使iPSC在T175、T225、1層細胞工廠（cell stack）或2層細胞工廠中生長，並如前所述用Accutase消化。用冷NK-MED-002培養基以1 : 1稀釋經Accutase消化的細胞。將該等細胞輕輕地重懸並轉移到錐形管中。藉由以20-300 g旋轉4至5分鐘使細胞沈澱，並重懸於10 mL NK-MED-003培養基中。對該等細胞進行計數並將細胞濃度稀釋至1 × 10 6個/mL。將60-100 × 10 6個細胞轉移到PBS100中，並相應地重懸於總共60-100 mL NK-MED-003培養基中。將PBS容器置於PBS基座上並以45 RPM旋轉過夜。
2. ROCK抑制劑：在先前步驟中在NK-MED-003中使用的ROCK抑制劑係Y-27652（10 µM）而不是噻唑維林。
3. 菸鹼醯胺：從NK-MED-010（在第20天開始使用）中省略菸鹼醯胺。
如前述實例所述對細胞進行分化和表徵。 藉由援引併入
本文引用了各種參考文獻，諸如專利、專利申請和出版物，它們的揭露內容特此藉由援引以其全文併入。
無
[ 圖 1]提供了示出10個ADAM17嚮導（guide）的切割效率之圖表。將誘導多能幹細胞（iPSC）用ADAM17 gRNA電穿孔並定序以測量插缺（indel）頻率。
[ 圖 2]提供了示出5個CIITA嚮導的切割效率之圖表。將人胚胎幹細胞用CIITA gRNA電穿孔並定序以測量插缺頻率。
[ 圖 3]提供了BCMA CAR敲入和CIITA敲除之質體圖譜。
[ 圖 4]提供了B2M-CAGGS-IL15-IR15融合體-P2A-HLA-E之質體圖譜。將IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體插入 B2M基因座的外顯子1附近以生成B2M敲除（KO）/IL15/IR15α-P2A-HLA-E敲入（KI）質體。
[ 圖 5A和 圖 5B]提供了IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull人多能幹細胞（hPSC）中HLA-E的流動式細胞分析術分析之圖表。使用抗HLA-E APC分析野生型誘導多能幹細胞（iPSC）（ 圖 5A）和HLA-E編輯的iPSC（ 圖 5B）。
[ 圖 6]說明了使用抗HLA-E-PE抗體對IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC進行單細胞分選的門控策略。使用FACS將單細胞分選到96孔板中。
[ 圖 7A和 圖 7B]提供了單細胞「殖株3」（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC）中IL-15的流動式細胞分析術分析之圖表。使用抗IL-15 PE分析野生型誘導多能幹細胞（iPSC）（ 圖 7A）和殖株3 IL-15編輯的iPSC（ 圖 7B）。
[ 圖 8]提供了說明當投與外源IL15或不投與外源IL 15時，野生型（WT）和殖株3（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC）衍生的iNK細胞中的細胞生長的線圖。在第0天和第4天，除了SCF（20 ng/mL）、Flt3L（15 ng/mL）、IL-7（20 ng/mL）之外，還向細胞投與20 ng/mL的IL-15。
[ 圖 9]提供了說明WT和殖株3（IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC）衍生的iNK細胞殺傷K562細胞之圖表。將效應細胞和K562細胞以不同的效應細胞 : 靶標（E : T）比接種24小時。無效應細胞，僅K562細胞，被用作陰性對照。
[ 圖 10]提供了說明B2M插缺之瓊脂糖凝膠圖像。在573 bp處具有條帶的殖株說明WT、未編輯的或雜合的基因型。無條帶的殖株說明具有成功敲入的殖株。
[ 圖 11]提供了說明B2M接合性結果之瓊脂糖凝膠圖像。2.5 kb條帶指示WT未編輯的殖株。具有6.6 kb條帶的殖株指示IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體的成功整合。
[ 圖 12]提供了說明B2M敲入基因分型結果之瓊脂糖凝膠圖像。無條帶指示WT未編輯的殖株。1.1 kb條帶指示IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體的成功整合。
[ 圖 13]提供了說明CIITA基因分型結果之瓊脂糖凝膠圖像。557 bp指示WT未編輯的殖株。經編輯的構建體沒有條帶。
[ 圖 14]提供了說明CIITA接合性結果之瓊脂糖凝膠圖像。結果。2.5 kb條帶指示WT未編輯的殖株。5.6 kb條帶指示BCMA-CAR成功整合到 CIITA基因座中。
[ 圖 15]提供了說明CIITA基因分型結果之瓊脂糖凝膠圖像。存在1.5 kb條帶指示KI構建體成功整合到 CIITA基因座中，而不存在條帶指示WT基因型。
[ 圖 16]提供了說明基因組編輯後hiPSC中的多能性之長條圖。對WT、殖株1和殖株2進行Oct4和Sox2染色並藉由流動式細胞分析術進行分析。
[ 圖 17]提供了說明在從iPSC分化為iNK細胞的第6天和第10天，與WT相比，在殖株1（細胞系1A c1）、殖株2（細胞系1A c2）、殖株3（B2M -/HLA-E +/IL15 +）、細胞系1殖株、CIITA-/BCMA CAR +大群體和ADAM17 KO殖株（「Adam17 -，c37」）細胞中的CD34/CD43表現之圖表。藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD34和CD43表現。
[ 圖 18]提供了說明在從iPSC分化為iNK細胞的第10天和第14天、第20天和第28天，與WT相比，在殖株1（細胞系1A c1）、殖株2（細胞系1A c2）、殖株3（B2M -/HLA-E +/IL15 +）、細胞系1殖株2、CIITA -/BCMA CAR +大群體和ADAM17 KO殖株（「Adam17 -，c37」）細胞中的CD45/CD56表現之圖表。藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD45和CD56表現。
[ 圖 19A]提供了說明在從iPSC分化為iNK細胞的第20天，與WT相比，在殖株1（細胞系1A c1）、殖株2（細胞系1A c2）、殖株3（B2M -/HLA-E +/IL15 +）、細胞系1殖株2、CIITA -/BCMA CAR +大群體和ADAM17 KO殖株（「Adam17 -，c37」）細胞中的分化標誌物表現之圖表。藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD56 +/CD16 +、CD56 +/NKp44 +、CD56 +/NKp46 +、CD56 +/CD94 +和CD56 +/NKG2A +表現。
[ 圖 19B和 圖 19C]提供了說明在從iPSC分化為iNK細胞的第28天（ 圖 19B）和第35天（ 圖 19C），與WT相比，在殖株1（細胞系1A c1）、殖株2（細胞系1A c2）、殖株3（B2M -/HLA-E +/IL15 +）、細胞系1殖株2、CIITA -/BCMA CAR +大群體和ADAM17 KO殖株（「Adam17 -，c37」）細胞中的分化標誌物表現之圖表。藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD56 +/CD16 +、CD56 +/NKp44 +、CD56 +/NKp46 +、CD56 +/CD94 +、CD56 +/NKG2A +、KIR2DL4和KIR3DL2表現。
[ 圖 19D]提供了說明在從iPSC分化為iNK細胞的第42天，與WT相比，在殖株1中的分化標誌物表現之圖表。藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD56 +/CD16 +、CD56 +/NKp44 +、CD56 +/NKp46 +、CD56 +/CD94 +、CD56 +/NKG2A +和CD56 +/CD57 +表現。
[ 圖 20]提供了代表分化的iNK細胞的T細胞活化之圖表。細胞系1A殖株1、殖株3和WT細胞的T細胞活化藉由羧基螢光素琥珀醯亞胺酯（CFSE）測定法測量。
[ 圖 21A和 圖 21B]提供了測量所指示的iNK細胞系殺傷K562（ 圖 21A）和RPMI（ 圖 21B）細胞之圖表。將WT、細胞系1殖株2、細胞系1A殖株1、細胞系1A殖株2和CIITA -/BCMA CAR +（「CIITA -/BCMA +」）大量細胞與K562或RPMI細胞以不同的E : T比培養24小時。
[ 圖 22]提供了測量與RPMI細胞以不同E : T比共培養的WT和細胞系1A殖株1細胞中的TNFa、IFNg、IL-7和顆粒酶B水平之圖表。
[ 圖 23]提供了在分化的第14天（WT）和第36天（WT以及細胞系1A殖株1和2）測量顆粒酶B和穿孔素表現性細胞的流動式細胞分析術圖。
[ 圖 24]提供了說明當投與外源IL15或不投與外源IL 15時，野生型（WT）、細胞系1A殖株1（「細胞系1A，c1」）、細胞系1A殖株2（「細胞系1A，c2」）和殖株3（「B2M -/HLA-E +/IL15/IL15Rα +」；IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體敲入、 B2MNull hPSC）衍生的iNK細胞中的細胞計數之圖表。在第0天和第9天向細胞投與SCF、Flt3L、IL7和IL15（「4」）；SCF、Flt3L和IL7（「3/-IL15 -」）；不投與細胞介素（「0」）；或僅投與IL15（「IL15」）。
[ 圖 25A 和 25B]示出了分化10天（ 圖 25A）或14天（ 圖 25B）後聚集體中的CD31/CD34/CD45表現譜。細胞分化自WT細胞；IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null細胞（「012.1」）細胞；IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null、 FASNull、 CISHNull、 REGNASE-1Null細胞（「020.1」）細胞；和IL15/IR15α-P2A-HLA-E KI、 B2Mnull（「003.3」）細胞。
[ 圖 26]呈現了分化10天、14天或20天後聚集體中的CD45/CD56表現譜。細胞分化自WT細胞；IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null細胞（「012.1」）細胞；IL15/IR15α-P2A-HLA-E三聚體KI、BCMA CAR KI、 CIITANull、 B2MNull、 ADAM17Null、 FASNull、 CISHNull、 REGNASE-1Null細胞（「020.1」）細胞；和IL15/IR15α-P2A-HLA-E KI、 B2Mnull（「003.3」）細胞。
[ 圖 27A]示出了在第31天經4小時殺傷K562-GFP細胞的百分比，並且 圖 27B呈現了在分化自WT細胞，IL15/IR15α融合-P2A-HLA-E KI進入 B2M和BCMA CAR進入 CIITA（「8.2」）細胞，IL15/IR15α融合-P2A-HLA-E KI進入 B2M、BCMA CAR進入 CIITA和 ADAM17KO（「12.1」）細胞，以及IL15/IR15α融合-P2A-HLA-E KI進入B2M、BCMA CAR進入 CIITA、 ADAM17KO、 FASKO、 CISHKO和 REGNASE-1KO（「20.1」）細胞之細胞中，無靶標與1 : 1殺傷中的活NK細胞比。
[ 圖 28A]示出了在第31天經4小時殺傷MM1S-GFP細胞的百分比，並且 圖 28B呈現了在分化自WT細胞，IL15/IR15α融合-P2A-HLA-E KI進入 B2M和BCMA CAR進入 CIITA（「8.2」）細胞，IL15/IR15α融合-P2A-HLA-E KI進入 B2M、BCMA CAR進入 CIITA和 ADAM17KO（「12.1」）細胞，以及IL15/IR15α融合-P2A-HLA-E KI進入B2M、BCMA CAR進入 CIITA、 ADAM17KO、 FASKO、 CISHKO和 REGNASE-1KO（「20.1」）細胞之細胞中，無靶標與1 : 1殺傷中的活NK細胞比。
[ 圖 29A]示出了4小時後L428細胞的殺傷，並且 圖 29B示出了24小時後所指示的NK92細胞對L428細胞的殺傷。
[ 圖 30A]示出了4小時後KM-H2細胞的殺傷，並且 圖 30B示出了24小時後所指示的NK92細胞對KM-H2細胞的殺傷。
[ 圖 31]呈現了CD30 CAR 4-P2A-HLA-E三聚體敲入和 CIITA敲除之質體圖譜。
[ 圖 32]呈現了CD30 CAR 5-P2A-HLA-E三聚體敲入和 CIITA敲除之質體圖譜。
[ 圖 33]呈現了CD30 CAR 6-P2A-HLA-E三聚體敲入和 CIITA敲除之質體圖譜。
[ 圖 34]呈現了B2M-CAGGS-SERPINB9-P2A-HLA-E供體質體之圖譜。
[ 圖 35]示出了在預先藉由MACS富集的B2M-SERPINB9-P2A-HLA-E大群體的單細胞分選過程中產生的FACS圖。
[ 圖 36]呈現了 B2M基因座處SERPINB9/HLA-E KI的PCR分析。凝膠顯示基因組的B2M區域的PCR擴增，其中3’引物位於敲入（KI）位點外（不存在於質體供體中）且5’引物位於僅KI區域內。存在1.1千鹼基（kb）條帶指示KI構建體成功整合到 B2M基因座中，不存在條帶指示WT基因型。
[ 圖 37]示出了在 B2M基因座中敲入SERPINB9/HLA-E期間隨機質體插入的PCR 1分析。用結合KI質體內的同源臂外部的5’和3’引物進行PCR。340鹼基對（bp）條帶的存在指示質體骨架在基因組內隨機整合，沒有條帶的殖株不具有隨機質體插入。
[ 圖 38]示出了在 B2M基因座中敲入SERPINB9/HLA-E期間隨機質體插入的PCR 2分析。用結合KI質體內的同源臂外部的5’和3’引物進行PCR。476 bp條帶的存在指示質體骨架在基因組內隨機整合，沒有條帶的殖株不具有隨機質體插入。
[ 圖 39]示出了敲入SERPINB9/HLA-E後 B2M基因座處的接合性。凝膠示出了使用跨越gRNA切割位點的引物擴增後的PCR產物。573 bp條帶的存在指示將在未編輯的或對於KI構建體係雜合的殖株中發現的野生型（WT）基因型，具有純合KI的殖株在該PCR中將不會產生條帶，因為KI大小對於該反應的伸長時間將太大。
[ 圖 40]呈現了NK細胞分化的時間過程。
[ 圖 41]示出了源自WT或SERPINB9 KI/HLA-E KI/B2M KO選殖iPSC的CD45 +/CD56 +iNK在分化時間過程中的發育。
[ 圖 42A]呈現了被來自PBNK供者4的周邊血NK（PB-NK）細胞殺傷的靶標（iNK）細胞之百分比圖。將各種iNK細胞與PB-NK細胞以各種E : T比孵育24小時。
[ 圖 42B]示出了被來自PBNK供者6的PB-NK細胞殺傷的靶標iNK細胞之百分比圖。將各種iNK細胞與PB-NK細胞以各種E : T比孵育24小時。
[ 圖 42C]示出了被來自PBNK-CLL供者1的PB-NK細胞殺傷的靶標iNK細胞之百分比圖。將各種iNK細胞與PB-NK細胞以各種E : T比孵育24小時。
[ 圖 42D]示出了被來自PBNK供者4的PB-NK細胞殺傷的靶標iNK細胞之百分比圖。將各種iNK細胞與PB-NK細胞以各種E : T比孵育24小時。
[ 圖 42E]示出了被來自PBNK供者6的PB-NK細胞殺傷的靶標iNK細胞之百分比圖。將各種iNK細胞與PB-NK細胞以各種E : T比孵育24小時。
[ 圖 43]呈現了B2M-CAGGS-SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα融合供體質體之圖譜。
[ 圖 44]示出了大群體中具有HLA-ABC +表現或IL15表面表現的細胞之百分比。藉由流動式細胞分析術分析細胞。
[ 圖 45A和 圖 45B]提供了說明在iPSC WT衍生的iNK細胞和經鹼基編輯的iPSC衍生的iNK細胞（ B2MKO、SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI）中的分化標誌物表現之圖表。藉由流動式細胞分析術分析細胞的CD56 +/NKp44 +、CD56 +/NKp46 +、CD56 +/CD16 +、CD56 +NKG2D +、CD56 +/CD57 +和CD56 +/CD33 +（ 圖 45A）以及CD56 +/NKG2A +、CD56 +/FAS +、CD56 +/FAS-L +、CD56 +/KIR +和PD1 +/TIGIT -（ 圖 45B）。
[ 圖 46]呈現了在從具有鹼基編輯（ B2MKO、SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI）、原型（ B2MKO、SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI、 CISHKO. FASKO）和原型+CD30 CAR（4、5或6）KI和HLA-E KI的iPSC分化為iNK細胞期間，在第14、20、28和36天表現CD45和/或CD56的細胞之百分比。
[ 圖 47A-D]呈現了分化自具有鹼基編輯（ B2MKO、SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI）、原型（ B2MKO、SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI、 CISHKO、 FASKO）和原型+CD30 CAR（4、5或6）KI和HLA-E KI的細胞的第29天的iNK細胞對K562癌細胞（ 圖 47A）、KMH2癌細胞（ 圖 47B）、L428癌細胞（ 圖 47C）或L540癌細胞（ 圖 47D）之殺傷百分比。
[ 圖 48]呈現了測試包含 B2MKO、SERPINB9 KI、IL15/IL15Rα KI、 CISHKO. FASKO、CD30 CAR KI、HLA-E KI和 CIITAKO的iNK細胞之細胞毒性的體內方案之示意圖。
無
 

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          gaccccctgt gcctctacca cttcta                                            86
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60
          ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact      120
          aggggttcct                                                             130
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  800]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          catatttatg gggtatatgt gaatatttat tacatgcata gaaggtataa tgatcatgtc       60
          aggatatttg aggtatccac atttgggatt gtttaaagat taaatgaaat agtgttaaaa      120
          gtatttaata tgcccttcaa caaatgatga ggaaatctta gaatctgctc agactccttc      180
          agtttacata ttaggaaact gaggcacaga aaggagcaga gacttgctca agtccaccca      240
          aagcagtaga gcattgtggt taaatgcagg acttcagtca gactgtctgg gttcaaatcc      300
          tggttccact tggacatggg tttccttaca taaatcactt cacctctctg agcctcagtt      360
          ttctcatatg caaagtgagg ataataataa taccttcctt acatggttac tgatatgagt      420
          attaaatgtg ccagctcatg tgcctggcgt ataggaggtg ctttataaac cttagctgtt      480
          accactcatg gcattgccaa atgtgggacg ggtctcctga ctctctggtg tgagattgat      540
          ggaatccaca ctttccagtt cccttttcta cctcctgggt atcttctcat atggttgtaa      600
          gttccttgga ggaagggaat gtggcttgct ctctccacca cgctgagcat ataagaggtg      660
          ctgaatgagc gcttttattc actcctctca tccccagccc tcaccagctg ggagttgttg      720
          taggtgtcaa ttttctgcct ctttccaaca ccctgtgagg tgactgagca ttgtcttccc      780
          tcccaggcag ctcacagtgt                                                  800
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  380]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的 - 巨細胞病毒]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc       60
          catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca      120
          acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga      180
          ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc      240
          aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct      300
          ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat      360
          tagtcatcgc tattaccatg                                                  380
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  276]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  原雞（Gallus gallus）]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa       60
          ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg      120
          cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg      180
          gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg      240
          cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcg                                276
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  1009]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc       60
          cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg      120
          ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc      180
          cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt      240
          gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc      300
          gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg      360
          gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt      420
          gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc      480
          ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg      540
          cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc      600
          cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg      660
          tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg      720
          acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct      780
          agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc      840
          gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc cgcaggggga      900
          cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg      960
          ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacag                 1009
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  63]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          atggcgcttc cggtgacagc actgctcctc cccttggcgc tgttgctcca cgcagcaagg       60
          ccg                                                                     63
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  735]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag ctcaagaagc ccggagcctc cgtgaaggtg       60
          agctgcaagg ccagcggcaa caccctgacc aactacgtga tccactgggt gagacaagcc      120
          cccggccaaa ggctggagtg gatgggctac atcctgccct acaacgacct gaccaagtac      180
          agccagaagt tccagggcag ggtgaccatc accagggata agagcgcctc caccgcctat      240
          atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgctgtgt actactgtac aaggtgggac      300
          tgggacggct tctttgaccc ctggggccag ggcacaacag tgaccgtcag cagcggcggc      360
          ggaggcagcg gcggcggcgg cagcggcgga ggcggaagcg aaatcgtgat gacccagagc      420
          cccgccacac tgagcgtgag ccctggcgag agggccagca tctcctgcag ggctagccaa      480
          agcctggtgc acagcaacgg caacacccac ctgcactggt accagcagag acccggacag      540
          gctcccaggc tgctgatcta cagcgtgagc aacaggttct ccgaggtgcc tgccaggttt      600
          agcggcagcg gaagcggcac cgactttacc ctgaccatca gcagcgtgga gtccgaggac      660
          ttcgccgtgt attactgcag ccagaccagc cacatccctt acaccttcgg cggcggcacc      720
          aagctggaga tcaaa                                                       735
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  264]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          agtgctgctg cctttgtccc ggtatttctc ccagccaaac cgaccacgac tcccgccccg       60
          cgccctccga cacccgctcc caccatcgcc tctcaacctc ttagtcttcg ccccgaggca      120
          tgccgacccg ccgccggggg tgctgttcat acgaggggct tggacttcgc ttgtgatatt      180
          tacatttggg ctccgttggc gggtacgtgc ggcgtccttt tgttgtcact cgttattact      240
          ttgtattgta atcacaggaa tcgc                                             264
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  126]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa       60
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt      120
          gaactg                                                                 126
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          cgagtgaagt tttcccgaag cgcagacgct ccggcatatc agcaaggaca gaatcagctg       60
          tataacgaac tgaatttggg acgccgcgag gagtatgacg tgcttgataa acgccggggg      120
          agagacccgg aaatgggggg taaaccccga agaaagaatc cccaagaagg actctacaat      180
          gaactccaga aggataagat ggcggaggcc tactcagaaa taggtatgaa gggcgaacga      240
          cgacggggaa aaggtcacga tggcctctac caagggttga gtacggcaac caaagatacg      300
          tacgatgcac tgcatatgca ggccctgcct cccaga                                336
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  牛（Bos taurus）]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc       60
          tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc      120
          tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt      180
          gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg                      225
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  795]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          tgaccagatg gacctggctg gagaagaaga gattgagctc tactcaggtg ggccctcctc       60
          cctctggtct cttccggtat cccccacccc tcagcttgct gtagagacgg caatcagggg      120
          aaattctggt ccctgccctc ccgtcagcac cacggacagc tcccacgtct gtgggacgct      180
          ctctgcagat ggggatgatc tcccagccct gccccgcctc tccctcgttc cccaccagcc      240
          ctctttccag aaatttcctt cttcatccaa gggacttttc ctcccagaac ccgacacaga      300
          caccatcaac tgcgaccagt tcagcaggct gttgtgtgac atggaaggtg atgaagagac      360
          cagggaggct tatgccaata tcggtgagga agcacctgag cccagaaaag gacaatcaag      420
          ggcaagagtt ctttgctgcc acttgtcaat atcacccatt catcatgagc cacgtcagtc      480
          ccctcccaca gaaatcattg caagggggat gcggagcaat ggctggagga acggagactc      540
          cagggaagag aggggagatg gaggccagtg ggggaaatag gccccttcac taatgaccac      600
          caagaaaaca aaatctcatg tttacatcct ccacctccat ttctatacgc atttctgctt      660
          cttgctcttc tgtccatcct ttctacaaag cccataccat acaccccttt cccttttcct      720
          cccagctcct tagccaagct actctagtat ttgtaataac tagcatttac tggatactca      780
          tagtatgctc attgc                                                       795
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  141]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg       60
          ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc      120
          gagcgcgcag ctgcctgcag g                                                141
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          ggccgagatg tctcgctccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          ggattgctca acaaccatgc                                                   20
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  800]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          gttctagggt ggaaactaag agaatgatgt acctagaggg cgctggaagc tctaaagccc       60
          tagcagttac tgcttttact attagtggtc gtttttttct cccccccgcc ccccgacaaa      120
          tcaacagaac aaagaaaatt acctaaacag caaggacata gggaggaact tcttggcaca      180
          gaactttcca aacacttttt cctgaaggga tacaagaagc aagaaaggta ctctttcact      240
          aggaccttct ctgagctgtc ctcaggatgc ttttgggact atttttctta cccagagaat      300
          ggagaaaccc tgcagggaat tcccaagctg tagttataaa cagaagttct ccttctgcta      360
          ggtagcattc aaagatctta atcttctggg tttccgtttt ctcgaatgaa aaatgcaggt      420
          ccgagcagtt aactggctgg ggcaccatta gcaagtcact tagcatctct ggggccagtc      480
          tgcaaagcga gggggcagcc ttaatgtgcc tccagcctga agtcctagaa tgagcgcccg      540
          gtgtcccaag ctggggcgcg caccccagat cggagggcgc cgatgtacag acagcaaact      600
          cacccagtct agtgcatgcc ttcttaaaca tcacgagact ctaagaaaag gaaactgaaa      660
          acgggaaagt ccctctctct aacctggcac tgcgtcgctg gcttggagac aggtgacggt      720
          ccctgcgggc cttgtcctga ttggctgggc acgcgtttaa tataagtgga ggcgtcgcgc      780
          tggcgggcat tcctgaagct                                                  800
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          gattgctcaa caaccatgct                                                   20
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          gtgactgaca tcaactccaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          cacttgggca ttaacacttt                                                   20
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgccgcca ccagggtgca cagc             54
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  399]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          ggcattcatg tcttcatttt gggctgtttc agtgcagggc ttcctaaaac agaagccaac       60
          tgggtgaatg taataagtga tttgaaaaaa attgaagatc ttattcaatc tatgcatatt      120
          gatgctactt tatatacgga aagtgatgtt caccccagtt gcaaagtaac agcaatgaag      180
          tgctttctct tggagttaca agttatttca cttgagtccg gagatgcaag tattcatgat      240
          acagtagaaa atctgatcat cctagcaaac aacagtttgt cttctaatgg gaatgtaaca      300
          gaatctggat gcaaagaatg tgaggaactg gaggaaaaaa atattaaaga atttttgcag      360
          agttttgtac atattgtcca aatgttcatc aacacttct                             399
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  78]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          agcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc       60
          ggcggcggca gcctgcag                                                     78
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  711]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc       60
          ttgtactcca gggagcggta catttgtaac tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc      120
          agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc acgaatgtcg cccactggac aacccccagt      180
          ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt caccaaaggc cagcgccacc ctccacagta      240
          acgacggcag gggtgacccc acagccagag agcctctccc cttctggaaa agagcccgca      300
          gcttcatctc ccagctcaaa caacacagcg gccacaacag cagctattgt cccgggctcc      360
          cagctgatgc cttcaaaatc accttccaca ggaaccacag agataagcag tcatgagtcc      420
          tcccacggca ccccctctca gacaacagcc aagaactggg aactcacagc atccgcctcc      480
          caccagccgc caggtgtgta tccacagggc cacagcgaca ccactgtggc tatctccacg      540
          tccactgtcc tgctgtgtgg gctgagcgct gtgtctctcc tggcatgcta cctcaagtca      600
          aggcaaactc ccccgctggc cagcgttgaa atggaagcca tggaggctct gccggtgact      660
          tgggggacca gcagcagaga tgaagacttg gaaaactgct ctcaccacct a               711
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          ggaagcgga                                                                9
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  57]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct          57
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          atgtctcgct ccgttgcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg attagaggct       60
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          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          gtcatggcgc cccgaaccct cttcctg                                           27
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  45]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg                       45
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  297]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca       60
          aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg      120
          aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg      180
          tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc      240
          cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatg         297
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc       60
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  1011]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          ggctcccact ccttgaagta tttccacact tccgtgtccc ggcccggccg cggggagccc       60
          cgcttcatct ctgtgggcta cgtggacgac acccagttcg tgcgcttcga caacgacgcc      120
          gcgagtccga ggatggtgcc gcgggcgccg tggatggagc aggaggggtc agagtattgg      180
          gaccgggaga cacggagcgc cagggacacc gcacagattt tccgagtgaa tctgcggacg      240
          ctgcgcggct actacaatca gagcgaggcc gggtctcaca ccctgcagtg gatgcatggc      300
          tgcgagctgg ggcccgacgg gcgcttcctc cgcgggtatg aacagttcgc ctacgacggc      360
          aaggattatc tcaccctgaa tgaggacctg cgctcctgga ccgcggtgga cacggcggct      420
          cagatctccg agcaaaagtc aaatgatgcc tctgaggcgg agcaccagag agcctacctg      480
          gaagacacat gcgtggagtg gctccacaaa tacctggaga aggggaagga gacgctgctt      540
          cacctggagc ccccaaagac acacgtgact caccacccca tctctgacca tgaggccacc      600
          ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct gcggagatca cactgacctg gcagcaggat      660
          ggggagggcc atacccagga cacggagctc gtggagacca ggcctgcagg ggatggaacc      720
          ttccagaagt gggcagctgt ggtggtgcct tctggagagg agcagagata cacgtgccat      780
          gtgcagcatg aggggctacc cgagcccgtc accctgagat ggaagccggc ttcccagccc      840
          accatcccca tcgtgggcat cattgctggc ctggttctcc ttggatctgt ggtctctgga      900
          gctgtggttg ctgctgtgat atggaggaag aagagctcag gtggaaaagg agggagctac      960
          tctaaggctg agtggagcga cagtgcccag gggtctgagt ctcacagctt g              1011
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          taatgatag                                                                9
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          ttggaaggcc tgcatcatga                                                   20
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  800]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          ccagcgtgag tctctcctac cctcccgctc tggtccttcc tctcccgctc tgcaccctct       60
          gtggccctcg ctgtgctctc tcgctccgtg acttcccttc tccaagttct ccttggtggc      120
          ccgccgtggg gctagtccag ggctggatct cggggaagcg gcggggtggc ctgggagtgg      180
          ggaagggggt gcgcacccgg gacgcgcgct acttgcccct ttcggcgggg agcaggggag      240
          acctttggcc tacggcgacg ggagggtcgg gacaaagttt agggcgtcga taagcgtcag      300
          agcgccgagg ttgggggagg gtttctcttc cgctctttcg cggggcctct ggctccccca      360
          gcgcagctgg agtgggggac gggtaggctc gtcccaaagg cgcggcgctg aggtttgtga      420
          acgcgtggag gggcgcttgg ggtctggggg aggcgtcgcc cgggtaagcc tgtctgctgc      480
          ggctctgctt cccttagact ggagagctgt ggacttcgtc taggcgcccg ctaagttcgc      540
          atgtcctagc acctctgggt ctatgtgggg ccacaccgtg gggaggaaac agcacgcgac      600
          gtttgtagaa tgcttggctg tgatacaaag cggtttcgaa taattaactt atttgttccc      660
          atcacatgtc acttttaaaa aattataaga actacccgtt attgacatct ttctgtgtgc      720
          caaggacttt atgtgctttg cgtcatttaa ttttgaaaac agttatcttc cgccatagat      780
          aactactatg gttatcttct                                                  800
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  55]]>
          actccaaggg attggaattg                                                   20
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          cagacagcaa actcacccag                                                   20
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          aaactttgtc ccgaccctcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  52]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          aaaagatctg tggactccac caccacgaaa tggcggcacc ttatttatgg tc               52
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  59]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          gctctggaga atctcacgca gaaggcaggc gtttttctta aaaaaaaatg cacgaatta        59
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  42]]>
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          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gg                          42
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  59]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          gctctggaga atctcacgca gaaggcaggc gtttttctta aaaaaaaatg cacgaatta        59
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          gccccacccc tcctacttta tgtctccatg gatttgcctg ttttggtcat ttca             54
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  58]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          ctctaatgca aacttgggta ggtcgtttca cctctctaaa cctcaatttc ctcatttg         58
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  50]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          gagtgaagtt ttcccgaagc gcagacgctc cggcatatca gcaaggacag                  50
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  58]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          ctctaatgca aacttgggta ggtcgtttca cctctctaaa cctcaatttc ctcatttg         58
          <![CDATA[<210>  66]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60
          ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact      120
          aggggttcct gcggccgcac gcgtcatatt tatggggtat atgtgaatat ttattacatg      180
          catagaaggt ataatgatca tgtcaggata tttgaggtat ccacatttgg gattgtttaa      240
          agattaaatg aaatagtgtt aaaagtattt aatatgccct tcaacaaatg atgaggaaat      300
          cttagaatct gctcagactc cttcagttta catattagga aactgaggca cagaaaggag      360
          cagagacttg ctcaagtcca cccaaagcag tagagcattg tggttaaatg caggacttca      420
          gtcagactgt ctgggttcaa atcctggttc cacttggaca tgggtttcct tacataaatc      480
          acttcacctc tctgagcctc agttttctca tatgcaaagt gaggataata ataatacctt      540
          ccttacatgg ttactgatat gagtattaaa tgtgccagct catgtgcctg gcgtatagga      600
          ggtgctttat aaaccttagc tgttaccact catggcattg ccaaatgtgg gacgggtctc      660
          ctgactctct ggtgtgagat tgatggaatc cacactttcc agttcccttt tctacctcct      720
          gggtatcttc tcatatggtt gtaagttcct tggaggaagg gaatgtggct tgctctctcc      780
          accacgctga gcatataaga ggtgctgaat gagcgctttt attcactcct ctcatcccca      840
          gccctcacca gctgggagtt gttgtaggtg tcaattttct gcctctttcc aacaccctgt      900
          gaggtgactg agcattgtct tccctcccag gcagctcaca gtgtaagctt gtggacgata      960
          tcgaattcgc acgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat     1020
          tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg     1080
          gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa     1140
          cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa actgcccact     1200
          tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta     1260
          aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt     1320
          acatctacgt attagtcatc gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc     1380
          actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta     1440
          ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg     1500
          cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct     1560
          ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc     1620
          gcggcgggcg ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg     1680
          ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc     1740
          ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct     1800
          gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg     1860
          gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg     1920
          tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg     1980
          gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg     2040
          gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc     2100
          ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg     2160
          gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc     2220
          ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg     2280
          ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga     2340
          gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg     2400
          caccccctct agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg     2460
          gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc     2520
          cgcaggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg     2580
          tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagg     2640
          ggggatccgt ttatctgcag aattcgccct tgacgtcgcc accatggcgc ttccggtgac     2700
          agcactgctc ctccccttgg cgctgttgct ccacgcagca aggccgcagg tgcagctggt     2760
          gcagagcgga gccgagctca agaagcccgg agcctccgtg aaggtgagct gcaaggccag     2820
          cggcaacacc ctgaccaact acgtgatcca ctgggtgaga caagcccccg gccaaaggct     2880
          ggagtggatg ggctacatcc tgccctacaa cgacctgacc aagtacagcc agaagttcca     2940
          gggcagggtg accatcacca gggataagag cgcctccacc gcctatatgg agctgagcag     3000
          cctgaggagc gaggacaccg ctgtgtacta ctgtacaagg tgggactggg acggcttctt     3060
          tgacccctgg ggccagggca caacagtgac cgtcagcagc ggcggcggag gcagcggcgg     3120
          cggcggcagc ggcggaggcg gaagcgaaat cgtgatgacc cagagccccg ccacactgag     3180
          cgtgagccct ggcgagaggg ccagcatctc ctgcagggct agccaaagcc tggtgcacag     3240
          caacggcaac acccacctgc actggtacca gcagagaccc ggacaggctc ccaggctgct     3300
          gatctacagc gtgagcaaca ggttctccga ggtgcctgcc aggtttagcg gcagcggaag     3360
          cggcaccgac tttaccctga ccatcagcag cgtggagtcc gaggacttcg ccgtgtatta     3420
          ctgcagccag accagccaca tcccttacac cttcggcggc ggcaccaagc tggagatcaa     3480
          aagtgctgct gcctttgtcc cggtatttct cccagccaaa ccgaccacga ctcccgcccc     3540
          gcgccctccg acacccgctc ccaccatcgc ctctcaacct cttagtcttc gccccgaggc     3600
          atgccgaccc gccgccgggg gtgctgttca tacgaggggc ttggacttcg cttgtgatat     3660
          ttacatttgg gctccgttgg cgggtacgtg cggcgtcctt ttgttgtcac tcgttattac     3720
          tttgtattgt aatcacagga atcgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa     3780
          acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt     3840
          tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gcgagtgaag ttttcccgaa gcgcagacgc     3900
          tccggcatat cagcaaggac agaatcagct gtataacgaa ctgaatttgg gacgccgcga     3960
          ggagtatgac gtgcttgata aacgccgggg gagagacccg gaaatggggg gtaaaccccg     4020
          aagaaagaat ccccaagaag gactctacaa tgaactccag aaggataaga tggcggaggc     4080
          ctactcagaa ataggtatga agggcgaacg acgacgggga aaaggtcacg atggcctcta     4140
          ccaagggttg agtacggcaa ccaaagatac gtacgatgca ctgcatatgc aggccctgcc     4200
          tcccagataa tccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt     4260
          tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa     4320
          taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg     4380
          gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg     4440
          gtgggctcta tgggtcgact gaccagatgg acctggctgg agaagaagag attgagctct     4500
          actcaggtgg gccctcctcc ctctggtctc ttccggtatc ccccacccct cagcttgctg     4560
          tagagacggc aatcagggga aattctggtc cctgccctcc cgtcagcacc acggacagct     4620
          cccacgtctg tgggacgctc tctgcagatg gggatgatct cccagccctg ccccgcctct     4680
          ccctcgttcc ccaccagccc tctttccaga aatttccttc ttcatccaag ggacttttcc     4740
          tcccagaacc cgacacagac accatcaact gcgaccagtt cagcaggctg ttgtgtgaca     4800
          tggaaggtga tgaagagacc agggaggctt atgccaatat cggtgaggaa gcacctgagc     4860
          ccagaaaagg acaatcaagg gcaagagttc tttgctgcca cttgtcaata tcacccattc     4920
          atcatgagcc acgtcagtcc cctcccacag aaatcattgc aagggggatg cggagcaatg     4980
          gctggaggaa cggagactcc agggaagaga ggggagatgg aggccagtgg gggaaatagg     5040
          ccccttcact aatgaccacc aagaaaacaa aatctcatgt ttacatcctc cacctccatt     5100
          tctatacgca tttctgcttc ttgctcttct gtccatcctt tctacaaagc ccataccata     5160
          cacccctttc ccttttcctc ccagctcctt agccaagcta ctctagtatt tgtaataact     5220
          agcatttact ggatactcat agtatgctca ttgctgtccg gtaaccacgt gcggaccgag     5280
          gctgcagcgt cgtcctccct aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg     5340
          cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg     5400
          ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag gggcgcctga tgcggtattt     5460
          tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatacgt caaagcaacc atagtacgcg     5520
          ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca     5580
          cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc     5640
          gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct     5700
          ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg gttcacgtag tgggccatcg     5760
          ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc     5820
          ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcgggct attcttttga tttataaggg     5880
          attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg     5940
          aattttaaca aaatattaac gtttacaatt ttatggtgca ctctcagtac aatctgctct     6000
          gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg     6060
          gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg     6120
          tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc     6180
          ctatttttat aggttaatgt catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac     6240
          aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa attccaacat     6300
          ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac     6360
          aatctatcgc ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg     6420
          tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat     6480
          gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac     6540
          tgcgatcccc ggaaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa     6600
          tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg     6660
          tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg     6720
          tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg     6780
          gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt     6840
          ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg     6900
          agtcggaatc gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt     6960
          ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa     7020
          taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa tctcatgacc aaaatccctt     7080
          aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt     7140
          gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag     7200
          cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca     7260
          gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca     7320
          agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg     7380
          ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg     7440
          cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct     7500
          acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga     7560
          gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc     7620
          ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg     7680
          agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg     7740
          cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgt                  7788
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  9077]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60
          ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact      120
          aggggttcct gcggccgcac gcgtgttcta gggtggaaac taagagaatg atgtacctag      180
          agggcgctgg aagctctaaa gccctagcag ttactgcttt tactattagt ggtcgttttt      240
          ttctcccccc cgccccccga caaatcaaca gaacaaagaa aattacctaa acagcaagga      300
          catagggagg aacttcttgg cacagaactt tccaaacact ttttcctgaa gggatacaag      360
          aagcaagaaa ggtactcttt cactaggacc ttctctgagc tgtcctcagg atgcttttgg      420
          gactattttt cttacccaga gaatggagaa accctgcagg gaattcccaa gctgtagtta      480
          taaacagaag ttctccttct gctaggtagc attcaaagat cttaatcttc tgggtttccg      540
          ttttctcgaa tgaaaaatgc aggtccgagc agttaactgg ctggggcacc attagcaagt      600
          cacttagcat ctctggggcc agtctgcaaa gcgagggggc agccttaatg tgcctccagc      660
          ctgaagtcct agaatgagcg cccggtgtcc caagctgggg cgcgcacccc agatcggagg      720
          gcgccgatgt acagacagca aactcaccca gtctagtgca tgccttctta aacatcacga      780
          gactctaaga aaaggaaact gaaaacggga aagtccctct ctctaacctg gcactgcgtc      840
          gctggcttgg agacaggtga cggtccctgc gggccttgtc ctgattggct gggcacgcgt      900
          ttaatataag tggaggcgtc gcgctggcgg gcattcctga agctaagctt gtggacgata      960
          tcgaattcgc acgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat     1020
          tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg     1080
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          gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg     2040
          gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc     2100
          ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg     2160
          gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc     2220
          ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg     2280
          ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga     2340
          gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg     2400
          caccccctct agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg     2460
          gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc     2520
          cgcaggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg     2580
          tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagg     2640
          ggggatccgt ttatctgcag aattcgccct tgacgtcgcc accatggact ggacctggat     2700
          cctgttcctg gtggccgccg ccaccagggt gcacagcggc attcatgtct tcattttggg     2760
          ctgtttcagt gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt     2820
          gaaaaaaatt gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag     2880
          tgatgttcac cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt     2940
          tatttcactt gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct     3000
          agcaaacaac agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga     3060
          ggaactggag gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat     3120
          gttcatcaac acttctagcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag     3180
          cggcggcggc ggcagcggcg gcggcagcct gcagatcacg tgccctcccc ccatgtccgt     3240
          ggaacacgca gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac tccagggagc ggtacatttg     3300
          taactctggt ttcaagcgta aagccggcac gtccagcctg acggagtgcg tgttgaacaa     3360
          ggccacgaat gtcgcccact ggacaacccc cagtctcaaa tgcattagag accctgccct     3420
          ggttcaccaa aggccagcgc caccctccac agtaacgacg gcaggggtga ccccacagcc     3480
          agagagcctc tccccttctg gaaaagagcc cgcagcttca tctcccagct caaacaacac     3540
          agcggccaca acagcagcta ttgtcccggg ctcccagctg atgccttcaa aatcaccttc     3600
          cacaggaacc acagagataa gcagtcatga gtcctcccac ggcaccccct ctcagacaac     3660
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          gggccacagc gacaccactg tggctatctc cacgtccact gtcctgctgt gtgggctgag     3780
          cgctgtgtct ctcctggcat gctacctcaa gtcaaggcaa actcccccgc tggccagcgt     3840
          tgaaatggaa gccatggagg ctctgccggt gacttggggg accagcagca gagatgaaga     3900
          cttggaaaac tgctctcacc acctaggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca     3960
          ggctggagac gtggaggaga accctggacc tatgtctcgc tccgttgcct tagctgtgct     4020
          cgcgctactc tctctttctg gattagaggc tgtcatggcg ccccgaaccc tcttcctggg     4080
          tggaggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga tcgatccagc gtactccaaa     4140
          gattcaggtt tactcacgtc atccagcaga gaatggaaag tcaaatttcc tgaattgcta     4200
          tgtgtctggg tttcatccat ccgacattga agttgactta ctgaagaatg gagagagaat     4260
          tgaaaaagtg gagcattcag acttgtcttt cagcaaggac tggtctttct atctcttgta     4320
          ctacactgaa ttcaccccca ctgaaaaaga tgagtatgcc tgccgtgtga accatgtgac     4380
          tttgtcacag cccaagatag ttaagtggga tcgagacatg ggtggtggtg gttctggtgg     4440
          tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc ggctcccact ccttgaagta     4500
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          cgtggacgac acccagttcg tgcgcttcga caacgacgcc gcgagtccga ggatggtgcc     4620
          gcgggcgccg tggatggagc aggaggggtc agagtattgg gaccgggaga cacggagcgc     4680
          cagggacacc gcacagattt tccgagtgaa tctgcggacg ctgcgcggct actacaatca     4740
          gagcgaggcc gggtctcaca ccctgcagtg gatgcatggc tgcgagctgg ggcccgacgg     4800
          gcgcttcctc cgcgggtatg aacagttcgc ctacgacggc aaggattatc tcaccctgaa     4860
          tgaggacctg cgctcctgga ccgcggtgga cacggcggct cagatctccg agcaaaagtc     4920
          aaatgatgcc tctgaggcgg agcaccagag agcctacctg gaagacacat gcgtggagtg     4980
          gctccacaaa tacctggaga aggggaagga gacgctgctt cacctggagc ccccaaagac     5040
          acacgtgact caccacccca tctctgacca tgaggccacc ctgaggtgct gggccctggg     5100
          cttctaccct gcggagatca cactgacctg gcagcaggat ggggagggcc atacccagga     5160
          cacggagctc gtggagacca ggcctgcagg ggatggaacc ttccagaagt gggcagctgt     5220
          ggtggtgcct tctggagagg agcagagata cacgtgccat gtgcagcatg aggggctacc     5280
          cgagcccgtc accctgagat ggaagccggc ttcccagccc accatcccca tcgtgggcat     5340
          cattgctggc ctggttctcc ttggatctgt ggtctctgga gctgtggttg ctgctgtgat     5400
          atggaggaag aagagctcag gtggaaaagg agggagctac tctaaggctg agtggagcga     5460
          cagtgcccag gggtctgagt ctcacagctt gtaatgatag ccgctgatca gcctcgactg     5520
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          aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga     5640
          gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg     5700
          aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat gggtcgaccc agcgtgagtc     5760
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          tagtccaggg ctggatctcg gggaagcggc ggggtggcct gggagtgggg aagggggtgc     5940
          gcacccggga cgcgcgctac ttgccccttt cggcggggag caggggagac ctttggccta     6000
          cggcgacggg agggtcggga caaagtttag ggcgtcgata agcgtcagag cgccgaggtt     6060
          gggggagggt ttctcttccg ctctttcgcg gggcctctgg ctcccccagc gcagctggag     6120
          tgggggacgg gtaggctcgt cccaaaggcg cggcgctgag gtttgtgaac gcgtggaggg     6180
          gcgcttgggg tctgggggag gcgtcgcccg ggtaagcctg tctgctgcgg ctctgcttcc     6240
          cttagactgg agagctgtgg acttcgtcta ggcgcccgct aagttcgcat gtcctagcac     6300
          ctctgggtct atgtggggcc acaccgtggg gaggaaacag cacgcgacgt ttgtagaatg     6360
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          ttttaaaaaa ttataagaac tacccgttat tgacatcttt ctgtgtgcca aggactttat     6480
          gtgctttgcg tcatttaatt ttgaaaacag ttatcttccg ccatagataa ctactatggt     6540
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          ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg     6960
          ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt     7020
          tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt     7080
          tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta     7140
          tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa     7200
          atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt     7260
          tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc     7320
          cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac     7380
          aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac     7440
          gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgaacaata     7500
          aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa     7560
          acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct     7620
          cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg     7680
          ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg     7740
          gtcagactaa actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt     7800
          actcctgatg atgcatggtt actcaccact gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta     7860
          ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc     7920
          cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc     7980
          gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag     8040
          cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca     8100
          ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg     8160
          aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt     8220
          gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa     8280
          aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag     8340
          tttttctaat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga     8400
          ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg     8460
          cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc     8520
          aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct     8580
          agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc     8640
          tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt     8700
          ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg     8760
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          tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg     9000
          gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg     9060
          gccttttgct cacatgt                                                    9077
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro 
                      20          
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          His Ala Ala Arg Pro 
                      20      
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          atggcgcttc cggtgacagc actgctcctc cccttggcgc tgttgctcca cgcagcaagg       60
          ccgcaggtgc agctggtgca gagcggagcc gagctcaaga agcccggagc ctccgtgaag      120
          gtgagctgca aggccagcgg caacaccctg accaactacg tgatccactg ggtgagacaa      180
          gcccccggcc aaaggctgga gtggatgggc tacatcctgc cctacaacga cctgaccaag      240
          tacagccaga agttccaggg cagggtgacc atcaccaggg ataagagcgc ctccaccgcc      300
          tatatggagc tgagcagcct gaggagcgag gacaccgctg tgtactactg tacaaggtgg      360
          gactgggacg gcttctttga cccctggggc cagggcacaa cagtgaccgt cagcagcggc      420
          ggcggaggca gcggcggcgg cggcagcggc ggaggcggaa gcgaaatcgt gatgacccag      480
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          caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag ctcaagaagc ccggagcctc cgtgaaggtg       60
          agctgcaagg ccagcggcaa caccctgacc aactacgtga tccactgggt gagacaagcc      120
          cccggccaaa ggctggagtg gatgggctac atcctgccct acaacgacct gaccaagtac      180
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          tgggacggct tctttgaccc ctggggccag ggcacaacag tgaccgtcag cagcggcggc      360
          ggaggcagcg gcggcggcgg cagcggcgga ggcggaagcg aaatcgtgat gacccagagc      420
          cccgccacac tgagcgtgag ccctggcgag agggccagca tctcctgcag ggctagccaa      480
          agcctggtgc acagcaacgg caacacccac ctgcactggt accagcagag acccggacag      540
          gctcccaggc tgctgatcta cagcgtgagc aacaggttct ccgaggtgcc tgccaggttt      600
          agcggcagcg gaagcggcac cgactttacc ctgaccatca gcagcgtgga gtccgaggac      660
          ttcgccgtgt attactgcag ccagaccagc cacatccctt acaccttcgg cggcggcacc      720
          aagctggaga tcaaa                                                       735
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  84]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro 
          1               5                   10                  15      
          Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          His Arg Asn Arg 
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 
                      20              
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  508]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu 
                      20                  25                  30          
          Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn 
                  35                  40                  45              
          Thr Leu Thr Asn Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Leu Pro Tyr Asn Asp Leu Thr Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Trp Asp Trp Asp Gly Phe Phe Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Ser Ile Ser 
                          165                 170                 175     
          Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr His Leu 
                      180                 185                 190         
          His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 
                  195                 200                 205             
          Ser Val Ser Asn Arg Phe Ser Glu Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ser Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr Ser His Ile Pro Tyr Thr 
                          245                 250                 255     
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ala Ala Ala Phe Val 
                      260                 265                 270         
          Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 
                  275                 280                 285             
          Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 
              290                 295                 300                 
          Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 
                          325                 330                 335     
          Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 
                      340                 345                 350         
          Asn Arg Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 
                  355                 360                 365             
          Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 
              370                 375                 380                 
          Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 
                          405                 410                 415     
          Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 
                      420                 425                 430         
          Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 
                  435                 440                 445             
          Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 
              450                 455                 460                 
          Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 
          465                 470                 475                 480 
          Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 
                          485                 490                 495     
          Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                      500                 505             
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  1500]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          atgtctcgct ccgttgcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg attagaggct       60
          gtcatggcgc cccgaaccct cttcctgggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc      120
          ggtggcggat cgatccagcg tactccaaag attcaggttt actcacgtca tccagcagag      180
          aatggaaagt caaatttcct gaattgctat gtgtctgggt ttcatccatc cgacattgaa      240
          gttgacttac tgaagaatgg agagagaatt gaaaaagtgg agcattcaga cttgtctttc      300
          agcaaggact ggtctttcta tctcttgtac tacactgaat tcacccccac tgaaaaagat      360
          gagtatgcct gccgtgtgaa ccatgtgact ttgtcacagc ccaagatagt taagtgggat      420
          cgagacatgg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt      480
          ggtggatccg gctcccactc cttgaagtat ttccacactt ccgtgtcccg gcccggccgc      540
          ggggagcccc gcttcatctc tgtgggctac gtggacgaca cccagttcgt gcgcttcgac      600
          aacgacgccg cgagtccgag gatggtgccg cgggcgccgt ggatggagca ggaggggtca      660
          gagtattggg accgggagac acggagcgcc agggacaccg cacagatttt ccgagtgaat      720
          ctgcggacgc tgcgcggcta ctacaatcag agcgaggccg ggtctcacac cctgcagtgg      780
          atgcatggct gcgagctggg gcccgacggg cgcttcctcc gcgggtatga acagttcgcc      840
          tacgacggca aggattatct caccctgaat gaggacctgc gctcctggac cgcggtggac      900
          acggcggctc agatctccga gcaaaagtca aatgatgcct ctgaggcgga gcaccagaga      960
          gcctacctgg aagacacatg cgtggagtgg ctccacaaat acctggagaa ggggaaggag     1020
          acgctgcttc acctggagcc cccaaagaca cacgtgactc accaccccat ctctgaccat     1080
          gaggccaccc tgaggtgctg ggccctgggc ttctaccctg cggagatcac actgacctgg     1140
          cagcaggatg gggagggcca tacccaggac acggagctcg tggagaccag gcctgcaggg     1200
          gatggaacct tccagaagtg ggcagctgtg gtggtgcctt ctggagagga gcagagatac     1260
          acgtgccatg tgcagcatga ggggctaccc gagcccgtca ccctgagatg gaagccggct     1320
          tcccagccca ccatccccat cgtgggcatc attgctggcc tggttctcct tggatctgtg     1380
          gtctctggag ctgtggttgc tgctgtgata tggaggaaga agagctcagg tggaaaagga     1440
          gggagctact ctaaggctga gtggagcgac agtgcccagg ggtctgagtc tcacagcttg     1500
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  1251]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgccgcca ccagggtgca cagcggcatt       60
          catgtcttca ttttgggctg tttcagtgca gggcttccta aaacagaagc caactgggtg      120
          aatgtaataa gtgatttgaa aaaaattgaa gatcttattc aatctatgca tattgatgct      180
          actttatata cggaaagtga tgttcacccc agttgcaaag taacagcaat gaagtgcttt      240
          ctcttggagt tacaagttat ttcacttgag tccggagatg caagtattca tgatacagta      300
          gaaaatctga tcatcctagc aaacaacagt ttgtcttcta atgggaatgt aacagaatct      360
          ggatgcaaag aatgtgagga actggaggaa aaaaatatta aagaattttt gcagagtttt      420
          gtacatattg tccaaatgtt catcaacact tctagcggcg gcggcagcgg cggcggcggc      480
          agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcagcctgca gatcacgtgc      540
          cctcccccca tgtccgtgga acacgcagac atctgggtca agagctacag cttgtactcc      600
          agggagcggt acatttgtaa ctctggtttc aagcgtaaag ccggcacgtc cagcctgacg      660
          gagtgcgtgt tgaacaaggc cacgaatgtc gcccactgga caacccccag tctcaaatgc      720
          attagagacc ctgccctggt tcaccaaagg ccagcgccac cctccacagt aacgacggca      780
          ggggtgaccc cacagccaga gagcctctcc ccttctggaa aagagcccgc agcttcatct      840
          cccagctcaa acaacacagc ggccacaaca gcagctattg tcccgggctc ccagctgatg      900
          ccttcaaaat caccttccac aggaaccaca gagataagca gtcatgagtc ctcccacggc      960
          accccctctc agacaacagc caagaactgg gaactcacag catccgcctc ccaccagccg     1020
          ccaggtgtgt atccacaggg ccacagcgac accactgtgg ctatctccac gtccactgtc     1080
          ctgctgtgtg ggctgagcgc tgtgtctctc ctggcatgct acctcaagtc aaggcaaact     1140
          cccccgctgg ccagcgttga aatggaagcc atggaggctc tgccggtgac ttgggggacc     1200
          agcagcagag atgaagactt ggaaaactgc tctcaccacc taggaagcgg a              1251
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  2808]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgccgcca ccagggtgca cagcggcatt       60
          catgtcttca ttttgggctg tttcagtgca gggcttccta aaacagaagc caactgggtg      120
          aatgtaataa gtgatttgaa aaaaattgaa gatcttattc aatctatgca tattgatgct      180
          actttatata cggaaagtga tgttcacccc agttgcaaag taacagcaat gaagtgcttt      240
          ctcttggagt tacaagttat ttcacttgag tccggagatg caagtattca tgatacagta      300
          gaaaatctga tcatcctagc aaacaacagt ttgtcttcta atgggaatgt aacagaatct      360
          ggatgcaaag aatgtgagga actggaggaa aaaaatatta aagaattttt gcagagtttt      420
          gtacatattg tccaaatgtt catcaacact tctagcggcg gcggcagcgg cggcggcggc      480
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          gagtgcgtgt tgaacaaggc cacgaatgtc gcccactgga caacccccag tctcaaatgc      720
          attagagacc ctgccctggt tcaccaaagg ccagcgccac cctccacagt aacgacggca      780
          ggggtgaccc cacagccaga gagcctctcc ccttctggaa aagagcccgc agcttcatct      840
          cccagctcaa acaacacagc ggccacaaca gcagctattg tcccgggctc ccagctgatg      900
          ccttcaaaat caccttccac aggaaccaca gagataagca gtcatgagtc ctcccacggc      960
          accccctctc agacaacagc caagaactgg gaactcacag catccgcctc ccaccagccg     1020
          ccaggtgtgt atccacaggg ccacagcgac accactgtgg ctatctccac gtccactgtc     1080
          ctgctgtgtg ggctgagcgc tgtgtctctc ctggcatgct acctcaagtc aaggcaaact     1140
          cccccgctgg ccagcgttga aatggaagcc atggaggctc tgccggtgac ttgggggacc     1200
          agcagcagag atgaagactt ggaaaactgc tctcaccacc taggaagcgg agctactaac     1260
          ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat gtctcgctcc     1320
          gttgccttag ctgtgctcgc gctactctct ctttctggat tagaggctgt catggcgccc     1380
          cgaaccctct tcctgggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg     1440
          atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca     1500
          aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg     1560
          aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg     1620
          tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc     1680
          cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatgggt     1740
          ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg tggatccggc     1800
          tcccactcct tgaagtattt ccacacttcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc     1860
          ttcatctctg tgggctacgt ggacgacacc cagttcgtgc gcttcgacaa cgacgccgcg     1920
          agtccgagga tggtgccgcg ggcgccgtgg atggagcagg aggggtcaga gtattgggac     1980
          cgggagacac ggagcgccag ggacaccgca cagattttcc gagtgaatct gcggacgctg     2040
          cgcggctact acaatcagag cgaggccggg tctcacaccc tgcagtggat gcatggctgc     2100
          gagctggggc ccgacgggcg cttcctccgc gggtatgaac agttcgccta cgacggcaag     2160
          gattatctca ccctgaatga ggacctgcgc tcctggaccg cggtggacac ggcggctcag     2220
          atctccgagc aaaagtcaaa tgatgcctct gaggcggagc accagagagc ctacctggaa     2280
          gacacatgcg tggagtggct ccacaaatac ctggagaagg ggaaggagac gctgcttcac     2340
          ctggagcccc caaagacaca cgtgactcac caccccatct ctgaccatga ggccaccctg     2400
          aggtgctggg ccctgggctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca gcaggatggg     2460
          gagggccata cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc     2520
          cagaagtggg cagctgtggt ggtgccttct ggagaggagc agagatacac gtgccatgtg     2580
          cagcatgagg ggctacccga gcccgtcacc ctgagatgga agccggcttc ccagcccacc     2640
          atccccatcg tgggcatcat tgctggcctg gttctccttg gatctgtggt ctctggagct     2700
          gtggttgctg ctgtgatatg gaggaagaag agctcaggtg gaaaaggagg gagctactct     2760
          aaggctgagt ggagcgacag tgcccagggg tctgagtctc acagcttg                  2808
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          gctactctct ctttctggcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          cgcgagcaca gctaaggcca                                                   20
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          ctagggactg cacagtcaat                                                   20
          <![CDATA[<210>  81]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          tcgccgctgc cgcggggaca                                                   20
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          gtccgctcca cagccagcaa                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  83]]>
          gtccgctcca cagccagcaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  84]]>
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          <![CDATA[<400>  84]]>
          gttccaggga cggggcccac                                                   20
          <![CDATA[<210>  85]]>
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          <![CDATA[<400>  85]]>
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  86]]>
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          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          gggttccatt acggccagcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          caggtgttgt cgggcctcgc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          tactcaatgc gtacattggt                                                   20
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
          aaggctgacc acatccggaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
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          <![CDATA[<210>  92]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  94]]>
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          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  96]]>
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          <![CDATA[<400>  97]]>
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          <![CDATA[<400>  99]]>
          acaccatcac gacgcgtggg                                                   20
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          <![CDATA[<400>  100]]>
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  101]]>
          acgacgcgtg ggtggcaagc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  111]]>
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          <![CDATA[<400>  102]]>
          Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp 
                      20                  25                  30          
          Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  117]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ala 
                  115         
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  729]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          cagatccagc tgcagcagag cggccccgag gtggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatc       60
          agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactaca tcacctgggt gaagcagaag      120
          cccggccagg gcctggagtg gatcggctgg atctaccccg gcagcggcaa caccaagtac      180
          aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggaca ccagcagcag caccgccttc      240
          atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac accgccgtgt acttctgcgc caactacggc      300
          aactactggt tcgcctactg gggccagggc acccaggtga ccgtgagcgc cggcggcggc      360
          ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcgaca tcgtgctgac ccagagcccc      420
          gccagcctgg ccgtgagcct gggccagaga gccaccatca gctgcaaggc cagccagagc      480
          gtggacttcg acggcgacag ctacatgaac tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc      540
          aaggtgctga tctacgccgc cagcaacctg gagagcggca tccccgccag attcagcggc      600
          agcggcagcg gcaccgactt caccctgaac atccaccccg tggaggagga ggacgccgcc      660
          acctactact gccagcagag caacgaggac ccctggacct tcggcggcgg caccaagctg      720
          gagatcaag                                                              729
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          agcaagagaa gcagactgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag aagacccggc       60
          cccaccagaa agcactacca gccctacgcc ccccccagag acttcgccgc ctacagaagc      120
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  1512]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          atggcgcttc cggtgacagc actgctcctc cccttggcgc tgttgctcca cgcagcaagg       60
          ccgcagatcc agctgcagca gagcggcccc gaggtggtga agcccggcgc cagcgtgaag      120
          atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc accgactact acatcacctg ggtgaagcag      180
          aagcccggcc agggcctgga gtggatcggc tggatctacc ccggcagcgg caacaccaag      240
          tacaacgaga agttcaaggg caaggccacc ctgaccgtgg acaccagcag cagcaccgcc      300
          ttcatgcagc tgagcagcct gaccagcgag gacaccgccg tgtacttctg cgccaactac      360
          ggcaactact ggttcgccta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cgccggcggc      420
          ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg acatcgtgct gacccagagc      480
          cccgccagcc tggccgtgag cctgggccag agagccacca tcagctgcaa ggccagccag      540
          agcgtggact tcgacggcga cagctacatg aactggtacc agcagaagcc cggccagccc      600
          cccaaggtgc tgatctacgc cgccagcaac ctggagagcg gcatccccgc cagattcagc      660
          ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg aacatccacc ccgtggagga ggaggacgcc      720
          gccacctact actgccagca gagcaacgag gacccctgga ccttcggcgg cggcaccaag      780
          ctggagatca agagcgccgc cgccttcgtg cccgtgttcc tgcccgccaa gcccaccacc      840
          acccccgccc ccagaccccc cacccccgcc cccaccatcg ccagccagcc cctgagcctg      900
          agacccgagg cctgcagacc cgccgccggc ggcgccgtgc acaccagagg cctggacttc      960
          gcctgcgaca tctacatctg ggcccccctg gccggcacct gcggcgtgct gctgctgagc     1020
          ctggtgatca ccctgtactg caaccacaga aacagaagca agagaagcag actgctgcac     1080
          agcgactaca tgaacatgac ccccagaaga cccggcccca ccagaaagca ctaccagccc     1140
          tacgcccccc ccagagactt cgccgcctac agaagcagag tgaagttcag cagaagcgcc     1200
          gacgcccccg cctaccagca gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga     1260
          agagaggagt acgacgtgct ggacaagaga agaggcagag accccgagat gggcggcaag     1320
          cccagaagaa agaaccccca ggagggcctg tacaacgagc tgcagaagga caagatggcc     1380
          gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagagaagaa gaggcaaggg ccacgacggc     1440
          ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gacacctacg acgccctgca catgcaggcc     1500
          ctgcccccca ga                                                         1512
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  483]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 
                      180                 185                 190         
          Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 
              210                 215                 220                 
          Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Ser Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys 
                          245                 250                 255     
          Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 
                      260                 265                 270         
          Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 
              290                 295                 300                 
          Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg 
                          325                 330                 335     
          Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro 
                      340                 345                 350         
          Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala 
                  355                 360                 365             
          Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 
              370                 375                 380                 
          Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 
                          405                 410                 415     
          Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 
                      420                 425                 430         
          Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 
                  435                 440                 445             
          Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Pro Arg 
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  11265]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          agaatctgct cagactcctt cagtttacat attaggaaac tgaggcacag aaaggagcag       60
          agacttgctc aagtccaccc aaagcagtag agcattgtgg ttaaatgcag gacttcagtc      120
          agactgtctg ggttcaaatc ctggttccac ttggacatgg gtttccttac ataaatcact      180
          tcacctctct gagcctcagt tttctcatat gcaaagtgag gataataata ataccttcct      240
          tacatggtta ctgatatgag tattaaatgt gccagctcat gtgcctggcg tataggaggt      300
          gctttataaa ccttagctgt taccactcat ggcattgcca aatgtgggac gggtctcctg      360
          actctctggt gtgagattga tggaatccac actttccagt tcccttttct acctcctggg      420
          tatcttctca tatggttgta agttccttgg aggaagggaa tgtggcttgc tctctccacc      480
          acgctgagca tataagaggt gctgaatgag cgcttttatt cactcctctc atccccagcc      540
          ctcaccagct gggagttgtt gtaggtgtca attttctgcc tctttccaac accctgtgag      600
          gtgactgagc attgtcttcc ctcccaggca gctcacagtg taagcttgtg gacgatatcg      660
          aattcgcacg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag      720
          ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct      780
          gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc      840
          caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg      900
          cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat      960
          ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca     1020
          tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact     1080
          ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt     1140
          tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga     1200
          ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg     1260
          aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg     1320
          gcgggcggga gtcgctgcgt tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgcgccg cctcgcgccg     1380
          cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc     1440
          tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctc gtttcttttc tgtggctgcg     1500
          tgaaagcctt aaagggctcc gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc tcggggggtg     1560
          cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg gcggctgtga     1620
          gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcgtg tgcgcgaggg gagcgcggcc     1680
          gggggcggtg ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg     1740
          tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcggcggt cgggctgtaa cccccccctg     1800
          cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg gtgcggggct ccgtgcgggg     1860
          cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg     1920
          gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc cggagcgccg     1980
          gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg     2040
          cgcagggact tcctttgtcc caaatctggc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac     2100
          cccctctagc gggcgcgggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag     2160
          ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc tccagcctcg gggctgccgc     2220
          agggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga     2280
          ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacaggggg     2340
          gatccgttta tctgcagaat tcgcccttga cgtcgccacc atggcgcttc cggtgacagc     2400
          actgctcctc cccttggcgc tgttgctcca cgcagcaagg ccgcagatcc agctgcagca     2460
          gagcggcccc gaggtggtga agcccggcgc cagcgtgaag atcagctgca aggccagcgg     2520
          ctacaccttc accgactact acatcacctg ggtgaagcag aagcccggcc agggcctgga     2580
          gtggatcggc tggatctacc ccggcagcgg caacaccaag tacaacgaga agttcaaggg     2640
          caaggccacc ctgaccgtgg acaccagcag cagcaccgcc ttcatgcagc tgagcagcct     2700
          gaccagcgag gacaccgccg tgtacttctg cgccaactac ggcaactact ggttcgccta     2760
          ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cgccggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg     2820
          cagcggcggc ggcggcagcg acatcgtgct gacccagagc cccgccagcc tggccgtgag     2880
          cctgggccag agagccacca tcagctgcaa ggccagccag agcgtggact tcgacggcga     2940
          cagctacatg aactggtacc agcagaagcc cggccagccc cccaaggtgc tgatctacgc     3000
          cgccagcaac ctggagagcg gcatccccgc cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga     3060
          cttcaccctg aacatccacc ccgtggagga ggaggacgcc gccacctact actgccagca     3120
          gagcaacgag gacccctgga ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agagcgccgc     3180
          cgccttcgtg cccgtgttcc tgcccgccaa gcccaccacc acccccgccc ccagaccccc     3240
          cacccccgcc cccaccatcg ccagccagcc cctgagcctg agacccgagg cctgcagacc     3300
          cgccgccggc ggcgccgtgc acaccagagg cctggacttc gcctgcgaca tctacatctg     3360
          ggcccccctg gccggcacct gcggcgtgct gctgctgagc ctggtgatca ccctgtactg     3420
          caaccacaga aacagaagca agagaagcag actgctgcac agcgactaca tgaacatgac     3480
          ccccagaaga cccggcccca ccagaaagca ctaccagccc tacgcccccc ccagagactt     3540
          cgccgcctac agaagcagag tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccccg cctaccagca     3600
          gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga agagaggagt acgacgtgct     3660
          ggacaagaga agaggcagag accccgagat gggcggcaag cccagaagaa agaaccccca     3720
          ggagggcctg tacaacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg     3780
          catgaagggc gagagaagaa gaggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac     3840
          cgccaccaag gacacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca gaggaagcgg     3900
          agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat     3960
          gtctcgctcc gttgccttag ctgtgctcgc gctactctct ctttctggat tagaggctgt     4020
          catggcgccc cgaaccctct tcctgggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg     4080
          tggcggatcg atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa     4140
          tggaaagtca aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt     4200
          tgacttactg aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag     4260
          caaggactgg tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga     4320
          gtatgcctgc cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg     4380
          agacatgggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg     4440
          tggatccggc tcccactcct tgaagtattt ccacacttcc gtgtcccggc ccggccgcgg     4500
          ggagccccgc ttcatctctg tgggctacgt ggacgacacc cagttcgtgc gcttcgacaa     4560
          cgacgccgcg agtccgagga tggtgccgcg ggcgccgtgg atggagcagg aggggtcaga     4620
          gtattgggac cgggagacac ggagcgccag ggacaccgca cagattttcc gagtgaatct     4680
          gcggacgctg cgcggctact acaatcagag cgaggccggg tctcacaccc tgcagtggat     4740
          gcatggctgc gagctggggc ccgacgggcg cttcctccgc gggtatgaac agttcgccta     4800
          cgacggcaag gattatctca ccctgaatga ggacctgcgc tcctggaccg cggtggacac     4860
          ggcggctcag atctccgagc aaaagtcaaa tgatgcctct gaggcggagc accagagagc     4920
          ctacctggaa gacacatgcg tggagtggct ccacaaatac ctggagaagg ggaaggagac     4980
          gctgcttcac ctggagcccc caaagacaca cgtgactcac caccccatct ctgaccatga     5040
          ggccaccctg aggtgctggg ccctgggctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca     5100
          gcaggatggg gagggccata cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga     5160
          tggaaccttc cagaagtggg cagctgtggt ggtgccttct ggagaggagc agagatacac     5220
          gtgccatgtg cagcatgagg ggctacccga gcccgtcacc ctgagatgga agccggcttc     5280
          ccagcccacc atccccatcg tgggcatcat tgctggcctg gttctccttg gatctgtggt     5340
          ctctggagct gtggttgctg ctgtgatatg gaggaagaag agctcaggtg gaaaaggagg     5400
          gagctactct aaggctgagt ggagcgacag tgcccagggg tctgagtctc acagcttgta     5460
          atgatagccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc     5520
          cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa     5580
          atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg     5640
          ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg     5700
          gctctatggg tcgactgacc agatggacct ggctggagaa gaagagattg agctctactc     5760
          aggtgggccc tcctccctct ggtctcttcc ggtatccccc acccctcagc ttgctgtaga     5820
          gacggcaatc aggggaaatt ctggtccctg ccctcccgtc agcaccacgg acagctccca     5880
          cgtctgtggg acgctctctg cagatgggga tgatctccca gccctgcccc gcctctccct     5940
          cgttccccac cagccctctt tccagaaatt tccttcttca tccaagggac ttttcctccc     6000
          agaacccgac acagacacca tcaactgcga ccagttcagc aggctgttgt gtgacatgga     6060
          aggtgatgaa gagaccaggg aggcttatgc caatatcggt gaggaagcac ctgagcccag     6120
          aaaaggacaa tcaagggcaa gagttctttg ctgccacttg tcaatatcac ccattcatca     6180
          tgagccacgt cagtcccctc ccacagaaat cattgcaagg gggatgcgga gcaatggctg     6240
          gaggaacgga gactccaggg aagagagggg agatggaggc cagtggggga aataggcccc     6300
          ttcactaatg accaccaaga aaacaaaatc tcatgtttac atcctccacc tccatttcta     6360
          tacgcatttc tgcttcttgc tcttctgtcc atcctttcta caaagcccat accatacacc     6420
          cctttccctt ttcctcccag ctccttagcc aagctactct agtatttgta ataactagca     6480
          tttactggat actcatagta tgctcattgc tgtccggtaa ccacgtgcgg accgggctcc     6540
          ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg     6600
          gtcggcaatt gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc     6660
          gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc     6720
          gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt     6780
          ggttcccgcg ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc     6840
          actggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt     6900
          cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc     6960
          gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata     7020
          agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata     7080
          gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg     7140
          gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc     7200
          caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg     7260
          cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt     7320
          gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc     7380
          gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag     7440
          ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct     7500
          cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc     7560
          cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct     7620
          tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc     7680
          aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gacttgacgt cgccaccatg aggatatttg     7740
          ctgtctttat attcatgacc tactggcatt tgctgaacgc atttactgtc acggttccca     7800
          aggacctata tgtggtagag tatggtagca atatgacaat tgaatgcaaa ttcccagtag     7860
          aaaaacaatt agacctggct gcactaattg tctattggga aatggaggat aagaacatta     7920
          ttcaatttgt gcatggagag gaagacctga aggttcagca tagtagctac agacagaggg     7980
          cccggctgtt gaaggaccag ctctccctgg gaaatgctgc acttcagatc acagatgtga     8040
          aattgcagga tgcaggggtg taccgctgca tgatcagcta tggtggtgcc gactacaagc     8100
          gaattactgt gaaagtcaat gccccataca acaaaatcaa ccaaagaatt ttggttgtgg     8160
          atccagtcac ctctgaacat gaactgacat gtcaggctga gggctacccc aaggccgaag     8220
          tcatctggac aagcagtgac catcaagtcc tgagtggtaa gaccaccacc accaattcca     8280
          agagagagga gaaacttttc aatgtgacca gcacactgag aatcaacaca acaactaatg     8340
          agattttcta ctgcactttt aggagattag atcctgagga aaaccataca gctgaattgg     8400
          tcatcccaga actacctctg gcacatcctc caaatgaaag gactcacttg gtaattctgg     8460
          gagccatctt attatgcctt ggtgtagcac tgacattcat cttccgttta agaaaaggga     8520
          gaatgatgga tgtgaaaaaa tgtggcatcc aagatacaaa ctcaaagaag caaagtgata     8580
          cacatttgga ggagacgtaa ccgctgatca gcctcgaaac ttgtttattg cagcttataa     8640
          tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca     8700
          ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttag gcgcctgatg cggtattttc     8760
          tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacagta ctgtcaaagc aaccatagta     8820
          cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc     8880
          tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac     8940
          gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag     9000
          tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc     9060
          atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg     9120
          actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg ggctattctt ttgatttata     9180
          agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa     9240
          cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg     9300
          ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg     9360
          acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg     9420
          catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat     9480
          acgcctattt ttataggtta atgtcatgaa caataaaact gtctgcttac ataaacagta     9540
          atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc gaggccgcga ttaaattcca     9600
          acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg     9660
          cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca     9720
          aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat     9780
          ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca     9840
          ccactgcgat ccccggaaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg     9900
          aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta     9960
          attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata    10020
          acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag    10080
          tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg    10140
          atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg    10200
          gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg    10260
          agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata    10320
          tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaatctcat gaccaaaatc    10380
          ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct    10440
          tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta    10500
          ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc    10560
          ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac    10620
          ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct    10680
          gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat    10740
          aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg    10800
          acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa    10860
          gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg    10920
          gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga    10980
          cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc    11040
          aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gtgcggccgc    11100
          acgcgtcata tttatggggt atatgtgaat atttattaca tgcatagaag gtataatgat    11160
          catgtcagga tatttgaggt atccacattt gggattgttt aaagattaaa tgaaatagtg    11220
          ttaaaagtat ttaatatgcc cttcaacaaa tgatgaggaa atctt                    11265
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  702]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          caggtgcagc tgcagcagtg gggcgccggc ctgctgaagc ccagcgagac cctgagcctg       60
          acctgcgccg tgtacggcgg cagcttcagc gcctactact ggagctggat cagacagccc      120
          cccggcaagg gcctggagtg gatcggcgac atcaaccacg gcggcggcac caactacaac      180
          cccagcctga agagcagagt gaccatcagc gtggacacca gcaagaacca gttcagcctg      240
          aagctgaaca gcgtgaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccag cctgaccgcc      300
          tactggggcc agggcagcct ggtgaccgtg agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc      360
          ggcagcggcg gcggcggcag cgacatccag atgacccaga gccccaccag cctgagcgcc      420
          agcgtgggcg acagagtgac catcacctgc agagccagcc agggcatcag cagctggctg      480
          acctggtacc agcagaagcc cgagaaggcc cccaagagcc tgatctacgc cgccagcagc      540
          ctgcagagcg gcgtgcccag cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg      600
          accatcagca gcctgcagcc cgaggacttc gccacctact actgccagca gtacgacagc      660
          taccccatca ccttcggcca gggcaccaga ctggagatca ag                         702
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  1491]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          atggcgcttc cggtgacagc actgctcctc cccttggcgc tgttgctcca cgcagcaagg       60
          ccgcaggtgc agctgcagca gtggggcgcc ggcctgctga agcccagcga gaccctgagc      120
          ctgacctgcg ccgtgtacgg cggcagcttc agcgcctact actggagctg gatcagacag      180
          ccccccggca agggcctgga gtggatcggc gacatcaacc acggcggcgg caccaactac      240
          aaccccagcc tgaagagcag agtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttcagc      300
          ctgaagctga acagcgtgac cgccgccgac accgccgtgt actactgcgc cagcctgacc      360
          gcctactggg gccagggcag cctggtgacc gtgagcagcg gcggcggcgg cagcggcggc      420
          ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgacatc cagatgaccc agagccccac cagcctgagc      480
          gccagcgtgg gcgacagagt gaccatcacc tgcagagcca gccagggcat cagcagctgg      540
          ctgacctggt accagcagaa gcccgagaag gcccccaaga gcctgatcta cgccgccagc      600
          agcctgcaga gcggcgtgcc cagcagattc agcggcagcg gcagcggcac cgacttcacc      660
          ctgaccatca gcagcctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgcca gcagtacgac      720
          agctacccca tcaccttcgg ccagggcacc agactggaga tcaagagcgc cgccgccttc      780
          gtgcccgtgt tcctgcccgc caagcccacc accacccccg cccccagacc ccccaccccc      840
          gcccccacca tcgccagcca gcccctgagc ctgagacccg aggcctgcag acccgccgcc      900
          ggcggcgccg tgcacaccag aggcctggac ttcgcctgcg acatctacat ctgggccccc      960
          ctggccggca cctgcggcgt gctgctgctg agcctggtga tcaccctgta ctgcaaccac     1020
          agaaacagaa agagaggcag aaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga     1080
          cccgtgcaga ccacccagga ggaggacggc tgcagctgca gattccccga ggaggaggag     1140
          ggcggctgcg agctgagagt gaagttcagc agaagcgccg acgcccccgc ctaccagcag     1200
          ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac ctgggcagaa gagaggagta cgacgtgctg     1260
          gacaagagaa gaggcagaga ccccgagatg ggcggcaagc ccagaagaaa gaacccccag     1320
          gagggcctgt acaacgagct gcagaaggac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc     1380
          atgaagggcg agagaagaag aggcaagggc cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc     1440
          gccaccaagg acacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag a              1491
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  476]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 
                  115                 120                 125             
          Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 
              130                 135                 140                 
          Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
                      180                 185                 190         
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 
                  195                 200                 205             
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile Thr 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Ala Ala Ala Phe Val 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 
                          245                 250                 255     
          Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 
                      260                 265                 270         
          Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 
                  275                 280                 285             
          Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 
              290                 295                 300                 
          Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Arg Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 
                          325                 330                 335     
          Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 
                      340                 345                 350         
          Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 
                  355                 360                 365             
          Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 
              370                 375                 380                 
          Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 
                          405                 410                 415     
          Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 
                  435                 440                 445             
          Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 
              450                 455                 460                 
          Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
          465                 470                 475     
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  11235]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          atgtcaggat atttgaggta tccacatttg ggattgttta aagattaaat gaaatagtgt       60
          taaaagtatt taatatgccc ttcaacaaat gatgaggaaa tcttagaatc tgctcagact      120
          ccttcagttt acatattagg aaactgaggc acagaaagga gcagagactt gctcaagtcc      180
          acccaaagca gtagagcatt gtggttaaat gcaggacttc agtcagactg tctgggttca      240
          aatcctggtt ccacttggac atgggtttcc ttacataaat cacttcacct ctctgagcct      300
          cagttttctc atatgcaaag tgaggataat aataatacct tccttacatg gttactgata      360
          tgagtattaa atgtgccagc tcatgtgcct ggcgtatagg aggtgcttta taaaccttag      420
          ctgttaccac tcatggcatt gccaaatgtg ggacgggtct cctgactctc tggtgtgaga      480
          ttgatggaat ccacactttc cagttccctt ttctacctcc tgggtatctt ctcatatggt      540
          tgtaagttcc ttggaggaag ggaatgtggc ttgctctctc caccacgctg agcatataag      600
          aggtgctgaa tgagcgcttt tattcactcc tctcatcccc agccctcacc agctgggagt      660
          tgttgtaggt gtcaattttc tgcctctttc caacaccctg tgaggtgact gagcattgtc      720
          ttccctccca ggcagctcac agtgtaagct tgtggacgat atcgaattcg cacgacattg      780
          attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat      840
          ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc      900
          ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca      960
          ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta     1020
          tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta     1080
          tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat     1140
          cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc     1200
          cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg     1260
          cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg     1320
          aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg     1380
          gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct     1440
          gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga     1500
          ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat     1560
          tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttaaaggg     1620
          ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg     1680
          cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc     1740
          gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc     1800
          ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg     1860
          agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag     1920
          ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc gcggggctcg     1980
          ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg     2040
          ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc     2100
          ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt     2160
          gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc     2220
          gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc     2280
          cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg acggctgcct     2340
          tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc     2400
          ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag gggggatccg tttatctgca     2460
          gaattcgccc ttgacgtcgc caccatggcg cttccggtga cagcactgct cctccccttg     2520
          gcgctgttgc tccacgcagc aaggccgcag gtgcagctgc agcagtgggg cgccggcctg     2580
          ctgaagccca gcgagaccct gagcctgacc tgcgccgtgt acggcggcag cttcagcgcc     2640
          tactactgga gctggatcag acagcccccc ggcaagggcc tggagtggat cggcgacatc     2700
          aaccacggcg gcggcaccaa ctacaacccc agcctgaaga gcagagtgac catcagcgtg     2760
          gacaccagca agaaccagtt cagcctgaag ctgaacagcg tgaccgccgc cgacaccgcc     2820
          gtgtactact gcgccagcct gaccgcctac tggggccagg gcagcctggt gaccgtgagc     2880
          agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga catccagatg     2940
          acccagagcc ccaccagcct gagcgccagc gtgggcgaca gagtgaccat cacctgcaga     3000
          gccagccagg gcatcagcag ctggctgacc tggtaccagc agaagcccga gaaggccccc     3060
          aagagcctga tctacgccgc cagcagcctg cagagcggcg tgcccagcag attcagcggc     3120
          agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc     3180
          acctactact gccagcagta cgacagctac cccatcacct tcggccaggg caccagactg     3240
          gagatcaaga gcgccgccgc cttcgtgccc gtgttcctgc ccgccaagcc caccaccacc     3300
          cccgccccca gaccccccac ccccgccccc accatcgcca gccagcccct gagcctgaga     3360
          cccgaggcct gcagacccgc cgccggcggc gccgtgcaca ccagaggcct ggacttcgcc     3420
          tgcgacatct acatctgggc ccccctggcc ggcacctgcg gcgtgctgct gctgagcctg     3480
          gtgatcaccc tgtactgcaa ccacagaaac agaaagagag gcagaaagaa gctgctgtac     3540
          atcttcaagc agcccttcat gagacccgtg cagaccaccc aggaggagga cggctgcagc     3600
          tgcagattcc ccgaggagga ggagggcggc tgcgagctga gagtgaagtt cagcagaagc     3660
          gccgacgccc ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc     3720
          agaagagagg agtacgacgt gctggacaag agaagaggca gagaccccga gatgggcggc     3780
          aagcccagaa gaaagaaccc ccaggagggc ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg     3840
          gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagagaa gaagaggcaa gggccacgac     3900
          ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag     3960
          gccctgcccc ccagaggaag cggattcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag     4020
          aaccctggac ctatgtctcg ctccgttgcc ttagctgtgc tcgcgctact ctctctttct     4080
          ggattagagg ctgtcatggc gccccgaacc ctcttcctgg gtggaggcgg ttcaggcgga     4140
          ggtggctctg gcggtggcgg atcgatccag cgtactccaa agattcaggt ttactcacgt     4200
          catccagcag agaatggaaa gtcaaatttc ctgaattgct atgtgtctgg gtttcatcca     4260
          tccgacattg aagttgactt actgaagaat ggagagagaa ttgaaaaagt ggagcattca     4320
          gacttgtctt tcagcaagga ctggtctttc tatctcttgt actacactga attcaccccc     4380
          actgaaaaag atgagtatgc ctgccgtgtg aaccatgtga ctttgtcaca gcccaagata     4440
          gttaagtggg atcgagacat gggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggcggcggc     4500
          ggctccggtg gtggtggatc cggctcccac tccttgaagt atttccacac ttccgtgtcc     4560
          cggcccggcc gcggggagcc ccgcttcatc tctgtgggct acgtggacga cacccagttc     4620
          gtgcgcttcg acaacgacgc cgcgagtccg aggatggtgc cgcgggcgcc gtggatggag     4680
          caggaggggt cagagtattg ggaccgggag acacggagcg ccagggacac cgcacagatt     4740
          ttccgagtga atctgcggac gctgcgcggc tactacaatc agagcgaggc cgggtctcac     4800
          accctgcagt ggatgcatgg ctgcgagctg gggcccgacg ggcgcttcct ccgcgggtat     4860
          gaacagttcg cctacgacgg caaggattat ctcaccctga atgaggacct gcgctcctgg     4920
          accgcggtgg acacggcggc tcagatctcc gagcaaaagt caaatgatgc ctctgaggcg     4980
          gagcaccaga gagcctacct ggaagacaca tgcgtggagt ggctccacaa atacctggag     5040
          aaggggaagg agacgctgct tcacctggag cccccaaaga cacacgtgac tcaccacccc     5100
          atctctgacc atgaggccac cctgaggtgc tgggccctgg gcttctaccc tgcggagatc     5160
          acactgacct ggcagcagga tggggagggc catacccagg acacggagct cgtggagacc     5220
          aggcctgcag gggatggaac cttccagaag tgggcagctg tggtggtgcc ttctggagag     5280
          gagcagagat acacgtgcca tgtgcagcat gaggggctac ccgagcccgt caccctgaga     5340
          tggaagccgg cttcccagcc caccatcccc atcgtgggca tcattgctgg cctggttctc     5400
          cttggatctg tggtctctgg agctgtggtt gctgctgtga tatggaggaa gaagagctca     5460
          ggtggaaaag gagggagcta ctctaaggct gagtggagcg acagtgccca ggggtctgag     5520
          tctcacagct tgtaatgata gccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc     5580
          atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt     5640
          cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct     5700
          ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc     5760
          tggggatgcg gtgggctcta tgggtcgact gaccagatgg acctggctgg agaagaagag     5820
          attgagctct actcaggtgg gccctcctcc ctctggtctc ttccggtatc ccccacccct     5880
          cagcttgctg tagagacggc aatcagggga aattctggtc cctgccctcc cgtcagcacc     5940
          acggacagct cccacgtctg tgggacgctc tctgcagatg gggatgatct cccagccctg     6000
          ccccgcctct ccctcgttcc ccaccagccc tctttccaga aatttccttc ttcatccaag     6060
          ggacttttcc tcccagaacc cgacacagac accatcaact gcgaccagtt cagcaggctg     6120
          ttgtgtgaca tggaaggtga tgaagagacc agggaggctt atgccaatat cggtgaggaa     6180
          gcacctgagc ccagaaaagg acaatcaagg gcaagagttc tttgctgcca cttgtcaata     6240
          tcacccattc atcatgagcc acgtcagtcc cctcccacag aaatcattgc aagggggatg     6300
          cggagcaatg gctggaggaa cggagactcc agggaagaga ggggagatgg aggccagtgg     6360
          gggaaatagg ccccttcact aatgaccacc aagaaaacaa aatctcatgt ttacatcctc     6420
          cacctccatt tctatacgca tttctgcttc ttgctcttct gtccatcctt tctacaaagc     6480
          ccataccata cacccctttc ccttttcctc ccagctcctt agccaagcta ctctagtatt     6540
          tgtaataact agcatttact ggatactcat agtatgctca ttgctgtccg gtaaccacgt     6600
          gcggaccggg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga     6660
          agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact     6720
          gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata     6780
          taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagg     6840
          taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc     6900
          cttgaattac ttccactggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc gggttggaag     6960
          tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg cttgagttga     7020
          ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc gcgcctgtct     7080
          cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg cgacgctttt     7140
          tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta tttcggtttt     7200
          tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg cgaggcgggg     7260
          cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc ggcctgctct     7320
          ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc tggcccggtc     7380
          ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag ggagctcaaa     7440
          atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaaaagggc     7500
          ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc cgtccaggca     7560
          cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg aggggtttta     7620
          tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag cttggcactt     7680
          gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca ttctcaagcc     7740
          tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgacttg acgtcgccac     7800
          catgaggata tttgctgtct ttatattcat gacctactgg catttgctga acgcatttac     7860
          tgtcacggtt cccaaggacc tatatgtggt agagtatggt agcaatatga caattgaatg     7920
          caaattccca gtagaaaaac aattagacct ggctgcacta attgtctatt gggaaatgga     7980
          ggataagaac attattcaat ttgtgcatgg agaggaagac ctgaaggttc agcatagtag     8040
          ctacagacag agggcccggc tgttgaagga ccagctctcc ctgggaaatg ctgcacttca     8100
          gatcacagat gtgaaattgc aggatgcagg ggtgtaccgc tgcatgatca gctatggtgg     8160
          tgccgactac aagcgaatta ctgtgaaagt caatgcccca tacaacaaaa tcaaccaaag     8220
          aattttggtt gtggatccag tcacctctga acatgaactg acatgtcagg ctgagggcta     8280
          ccccaaggcc gaagtcatct ggacaagcag tgaccatcaa gtcctgagtg gtaagaccac     8340
          caccaccaat tccaagagag aggagaaact tttcaatgtg accagcacac tgagaatcaa     8400
          cacaacaact aatgagattt tctactgcac ttttaggaga ttagatcctg aggaaaacca     8460
          tacagctgaa ttggtcatcc cagaactacc tctggcacat cctccaaatg aaaggactca     8520
          cttggtaatt ctgggagcca tcttattatg ccttggtgta gcactgacat tcatcttccg     8580
          tttaagaaaa gggagaatga tggatgtgaa aaaatgtggc atccaagata caaactcaaa     8640
          gaagcaaagt gatacacatt tggaggagac gtaaccgctg atcagcctcg aaacttgttt     8700
          attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca     8760
          tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaggcgcct     8820
          gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac agtactgtca     8880
          aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg     8940
          cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct     9000
          tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta     9060
          gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt     9120
          tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg     9180
          ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat     9240
          tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt     9300
          taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact     9360
          ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc     9420
          gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc     9480
          gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga     9540
          aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgaacaataa aactgtctgc     9600
          ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc     9660
          gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt     9720
          cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt     9780
          tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa     9840
          ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga     9900
          tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg aaaaacagca ttccaggtat tagaagaata     9960
          tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc    10020
          gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca    10080
          atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg    10140
          gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt    10200
          cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg    10260
          ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg    10320
          gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat    10380
          tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc    10440
          tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa    10500
          agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa    10560
          aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc    10620
          cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt    10680
          agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc    10740
          tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac    10800
          gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca    10860
          gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg    10920
          ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag    10980
          gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt    11040
          ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat    11100
          ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc    11160
          acatgtgcgg ccgcacgcgt catatttatg gggtatatgt gaatatttat tacatgcata    11220
          gaaggtataa tgatc                                                     11235
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  7176]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          atgtcaggat atttgaggta tccacatttg ggattgttta aagattaaat gaaatagtgt       60
          taaaagtatt taatatgccc ttcaacaaat gatgaggaaa tcttagaatc tgctcagact      120
          ccttcagttt acatattagg aaactgaggc acagaaagga gcagagactt gctcaagtcc      180
          acccaaagca gtagagcatt gtggttaaat gcaggacttc agtcagactg tctgggttca      240
          aatcctggtt ccacttggac atgggtttcc ttacataaat cacttcacct ctctgagcct      300
          cagttttctc atatgcaaag tgaggataat aataatacct tccttacatg gttactgata      360
          tgagtattaa atgtgccagc tcatgtgcct ggcgtatagg aggtgcttta taaaccttag      420
          ctgttaccac tcatggcatt gccaaatgtg ggacgggtct cctgactctc tggtgtgaga      480
          ttgatggaat ccacactttc cagttccctt ttctacctcc tgggtatctt ctcatatggt      540
          tgtaagttcc ttggaggaag ggaatgtggc ttgctctctc caccacgctg agcatataag      600
          aggtgctgaa tgagcgcttt tattcactcc tctcatcccc agccctcacc agctgggagt      660
          tgttgtaggt gtcaattttc tgcctctttc caacaccctg tgaggtgact gagcattgtc      720
          ttccctccca ggcagctcac agtgtaagct tgtggacgat atcgaattcg cacgacattg      780
          attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat      840
          ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc      900
          ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca      960
          ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta     1020
          tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta     1080
          tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat     1140
          cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc     1200
          cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg     1260
          cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg     1320
          aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg     1380
          gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct     1440
          gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga     1500
          ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat     1560
          tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttaaaggg     1620
          ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg     1680
          cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc     1740
          gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc     1800
          ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg     1860
          agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag     1920
          ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc gcggggctcg     1980
          ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg     2040
          ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc     2100
          ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt     2160
          gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc     2220
          gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc     2280
          cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg acggctgcct     2340
          tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc     2400
          ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag gggggatccg tttatctgca     2460
          gaattcgccc ttgacgtcgc caccatggcg cttccggtga cagcactgct cctccccttg     2520
          gcgctgttgc tccacgcagc aaggccgcag gtgcagctgc agcagtgggg cgccggcctg     2580
          ctgaagccca gcgagaccct gagcctgacc tgcgccgtgt acggcggcag cttcagcgcc     2640
          tactactgga gctggatcag acagcccccc ggcaagggcc tggagtggat cggcgacatc     2700
          aaccacggcg gcggcaccaa ctacaacccc agcctgaaga gcagagtgac catcagcgtg     2760
          gacaccagca agaaccagtt cagcctgaag ctgaacagcg tgaccgccgc cgacaccgcc     2820
          gtgtactact gcgccagcct gaccgcctac tggggccagg gcagcctggt gaccgtgagc     2880
          agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga catccagatg     2940
          acccagagcc ccaccagcct gagcgccagc gtgggcgaca gagtgaccat cacctgcaga     3000
          gccagccagg gcatcagcag ctggctgacc tggtaccagc agaagcccga gaaggccccc     3060
          aagagcctga tctacgccgc cagcagcctg cagagcggcg tgcccagcag attcagcggc     3120
          agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc     3180
          acctactact gccagcagta cgacagctac cccatcacct tcggccaggg caccagactg     3240
          gagatcaaga gcgccgccgc cttcgtgccc gtgttcctgc ccgccaagcc caccaccacc     3300
          cccgccccca gaccccccac ccccgccccc accatcgcca gccagcccct gagcctgaga     3360
          cccgaggcct gcagacccgc cgccggcggc gccgtgcaca ccagaggcct ggacttcgcc     3420
          tgcgacatct acatctgggc ccccctggcc ggcacctgcg gcgtgctgct gctgagcctg     3480
          gtgatcaccc tgtactgcaa ccacagaaac agaaagagag gcagaaagaa gctgctgtac     3540
          atcttcaagc agcccttcat gagacccgtg cagaccaccc aggaggagga cggctgcagc     3600
          tgcagattcc ccgaggagga ggagggcggc tgcgagctga gagtgaagtt cagcagaagc     3660
          gccgacgccc ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc     3720
          agaagagagg agtacgacgt gctggacaag agaagaggca gagaccccga gatgggcggc     3780
          aagcccagaa gaaagaaccc ccaggagggc ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg     3840
          gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagagaa gaagaggcaa gggccacgac     3900
          ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag     3960
          gccctgcccc ccagaggaag cggattcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag     4020
          aaccctggac ctatgtctcg ctccgttgcc ttagctgtgc tcgcgctact ctctctttct     4080
          ggattagagg ctgtcatggc gccccgaacc ctcttcctgg gtggaggcgg ttcaggcgga     4140
          ggtggctctg gcggtggcgg atcgatccag cgtactccaa agattcaggt ttactcacgt     4200
          catccagcag agaatggaaa gtcaaatttc ctgaattgct atgtgtctgg gtttcatcca     4260
          tccgacattg aagttgactt actgaagaat ggagagagaa ttgaaaaagt ggagcattca     4320
          gacttgtctt tcagcaagga ctggtctttc tatctcttgt actacactga attcaccccc     4380
          actgaaaaag atgagtatgc ctgccgtgtg aaccatgtga ctttgtcaca gcccaagata     4440
          gttaagtggg atcgagacat gggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggcggcggc     4500
          ggctccggtg gtggtggatc cggctcccac tccttgaagt atttccacac ttccgtgtcc     4560
          cggcccggcc gcggggagcc ccgcttcatc tctgtgggct acgtggacga cacccagttc     4620
          gtgcgcttcg acaacgacgc cgcgagtccg aggatggtgc cgcgggcgcc gtggatggag     4680
          caggaggggt cagagtattg ggaccgggag acacggagcg ccagggacac cgcacagatt     4740
          ttccgagtga atctgcggac gctgcgcggc tactacaatc agagcgaggc cgggtctcac     4800
          accctgcagt ggatgcatgg ctgcgagctg gggcccgacg ggcgcttcct ccgcgggtat     4860
          gaacagttcg cctacgacgg caaggattat ctcaccctga atgaggacct gcgctcctgg     4920
          accgcggtgg acacggcggc tcagatctcc gagcaaaagt caaatgatgc ctctgaggcg     4980
          gagcaccaga gagcctacct ggaagacaca tgcgtggagt ggctccacaa atacctggag     5040
          aaggggaagg agacgctgct tcacctggag cccccaaaga cacacgtgac tcaccacccc     5100
          atctctgacc atgaggccac cctgaggtgc tgggccctgg gcttctaccc tgcggagatc     5160
          acactgacct ggcagcagga tggggagggc catacccagg acacggagct cgtggagacc     5220
          aggcctgcag gggatggaac cttccagaag tgggcagctg tggtggtgcc ttctggagag     5280
          gagcagagat acacgtgcca tgtgcagcat gaggggctac ccgagcccgt caccctgaga     5340
          tggaagccgg cttcccagcc caccatcccc atcgtgggca tcattgctgg cctggttctc     5400
          cttggatctg tggtctctgg agctgtggtt gctgctgtga tatggaggaa gaagagctca     5460
          ggtggaaaag gagggagcta ctctaaggct gagtggagcg acagtgccca ggggtctgag     5520
          tctcacagct tgtaatgata gccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc     5580
          atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt     5640
          cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct     5700
          ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc     5760
          tggggatgcg gtgggctcta tgggtcgact gaccagatgg acctggctgg agaagaagag     5820
          attgagctct actcaggtgg gccctcctcc ctctggtctc ttccggtatc ccccacccct     5880
          cagcttgctg tagagacggc aatcagggga aattctggtc cctgccctcc cgtcagcacc     5940
          acggacagct cccacgtctg tgggacgctc tctgcagatg gggatgatct cccagccctg     6000
          ccccgcctct ccctcgttcc ccaccagccc tctttccaga aatttccttc ttcatccaag     6060
          ggacttttcc tcccagaacc cgacacagac accatcaact gcgaccagtt cagcaggctg     6120
          ttgtgtgaca tggaaggtga tgaagagacc agggaggctt atgccaatat cggtgaggaa     6180
          gcacctgagc ccagaaaagg acaatcaagg gcaagagttc tttgctgcca cttgtcaata     6240
          tcacccattc atcatgagcc acgtcagtcc cctcccacag aaatcattgc aagggggatg     6300
          cggagcaatg gctggaggaa cggagactcc agggaagaga ggggagatgg aggccagtgg     6360
          gggaaatagg ccccttcact aatgaccacc aagaaaacaa aatctcatgt ttacatcctc     6420
          cacctccatt tctatacgca tttctgcttc ttgctcttct gtccatcctt tctacaaagc     6480
          gacatccaga tgacccagag ccccaccagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc     6540
          atcacctgca gagccagcca gggcatcagc agctggctga cctggtacca gcagaagccc     6600
          gagaaggccc ccaagagcct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc     6660
          agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc     6720
          gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacgacagct accccatcac cttcggccag     6780
          ggcaccagac tggagatcaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc     6840
          ggcagccagg tgcagctgca gcagtggggc gccggcctgc tgaagcccag cgagaccctg     6900
          agcctgacct gcgccgtgta cggcggcagc ttcagcgcct actactggag ctggatcaga     6960
          cagccccccg gcaagggcct ggagtggatc ggcgacatca accacggcgg cggcaccaac     7020
          tacaacccca gcctgaagag cagagtgacc atcagcgtgg acaccagcaa gaaccagttc     7080
          agcctgaagc tgaacagcgt gaccgccgcc gacaccgccg tgtactactg cgccagcctg     7140
          accgcctact ggggccaggg cagcctggtg accgtg                               7176
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  1485]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          atggcgcttc cggtgacagc actgctcctc cccttggcgc tgttgctcca cgcagcaagg       60
          ccggacatcc agatgaccca gagccccacc agcctgagcg ccagcgtggg cgacagagtg      120
          accatcacct gcagagccag ccagggcatc agcagctggc tgacctggta ccagcagaag      180
          cccgagaagg cccccaagag cctgatctac gccgccagca gcctgcagag cggcgtgccc      240
          agcagattca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag cagcctgcag      300
          cccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagtacgaca gctaccccat caccttcggc      360
          cagggcacca gactggagat caagggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc      420
          ggcggcagcc aggtgcagct gcagcagtgg ggcgccggcc tgctgaagcc cagcgagacc      480
          ctgagcctga cctgcgccgt gtacggcggc agcttcagcg cctactactg gagctggatc      540
          agacagcccc ccggcaaggg cctggagtgg atcggcgaca tcaaccacgg cggcggcacc      600
          aactacaacc ccagcctgaa gagcagagtg accatcagcg tggacaccag caagaaccag      660
          ttcagcctga agctgaacag cgtgaccgcc gccgacaccg ccgtgtacta ctgcgccagc      720
          ctgaccgcct actggggcca gggcagcctg gtgaccgtga gcgccgccgc cttcgtgccc      780
          gtgttcctgc ccgccaagcc caccaccacc cccgccccca gaccccccac ccccgccccc      840
          accatcgcca gccagcccct gagcctgaga cccgaggcct gcagacccgc cgccggcggc      900
          gccgtgcaca ccagaggcct ggacttcgcc tgcgacatct acatctgggc ccccctggcc      960
          ggcacctgcg gcgtgctgct gctgagcctg gtgatcaccc tgtactgcaa ccacagaaac     1020
          agaaagagag gcagaaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gagacccgtg     1080
          cagaccaccc aggaggagga cggctgcagc tgcagattcc ccgaggagga ggagggcggc     1140
          tgcgagctga gagtgaagtt cagcagaagc gccgacgccc ccgcctacca gcagggccag     1200
          aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc agaagagagg agtacgacgt gctggacaag     1260
          agaagaggca gagaccccga gatgggcggc aagcccagaa gaaagaaccc ccaggagggc     1320
          ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag     1380
          ggcgagagaa gaagaggcaa gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc     1440
          aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc ccaga                     1485
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  474]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 
                      100                 105                 110         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln 
                  115                 120                 125             
          Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn His Gly 
                          165                 170                 175     
          Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser 
                      180                 185                 190         
          Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr 
                  195                 200                 205             
          Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Thr Ala Tyr Trp 
              210                 215                 220                 
          Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Phe Val Pro Val 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 
                      260                 265                 270         
          Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 
                  275                 280                 285             
          Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 
              290                 295                 300                 
          Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 
              370                 375                 380                 
          Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 
                  435                 440                 445             
          Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
          465                 470                 
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  11238]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          tgcatagaag gtataatgat catgtcagga tatttgaggt atccacattt gggattgttt       60
          aaagattaaa tgaaatagtg ttaaaagtat ttaatatgcc cttcaacaaa tgatgaggaa      120
          atcttagaat ctgctcagac tccttcagtt tacatattag gaaactgagg cacagaaagg      180
          agcagagact tgctcaagtc cacccaaagc agtagagcat tgtggttaaa tgcaggactt      240
          cagtcagact gtctgggttc aaatcctggt tccacttgga catgggtttc cttacataaa      300
          tcacttcacc tctctgagcc tcagttttct catatgcaaa gtgaggataa taataatacc      360
          ttccttacat ggttactgat atgagtatta aatgtgccag ctcatgtgcc tggcgtatag      420
          gaggtgcttt ataaacctta gctgttacca ctcatggcat tgccaaatgt gggacgggtc      480
          tcctgactct ctggtgtgag attgatggaa tccacacttt ccagttccct tttctacctc      540
          ctgggtatct tctcatatgg ttgtaagttc cttggaggaa gggaatgtgg cttgctctct      600
          ccaccacgct gagcatataa gaggtgctga atgagcgctt ttattcactc ctctcatccc      660
          cagccctcac cagctgggag ttgttgtagg tgtcaatttt ctgcctcttt ccaacaccct      720
          gtgaggtgac tgagcattgt cttccctccc aggcagctca cagtgtaagc ttgtggacga      780
          tatcgaattc gcacgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc      840
          attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc      900
          tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt      960
          aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca     1020
          cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg     1080
          taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca     1140
          gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct     1200
          tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat     1260
          tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg     1320
          ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg     1380
          ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc     1440
          gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg ccccgctccg cgccgcctcg     1500
          cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc     1560
          ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggctcgtttc ttttctgtgg     1620
          ctgcgtgaaa gccttaaagg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg     1680
          gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc     1740
          tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcgtgtgcgc gaggggagcg     1800
          cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg     1860
          gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc tgtaaccccc     1920
          ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgtg     1980
          cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg     2040
          gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggccccggag     2100
          cgccggcggc tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga     2160
          gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc     2220
          cgcaccccct ctagcgggcg cgggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg     2280
          gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccatctccag cctcggggct     2340
          gccgcagggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg     2400
          tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca     2460
          ggggggatcc gtttatctgc agaattcgcc cttgacgtcg ccaccatggc gcttccggtg     2520
          acagcactgc tcctcccctt ggcgctgttg ctccacgcag caaggccgga catccagatg     2580
          acccagagcc ccaccagcct gagcgccagc gtgggcgaca gagtgaccat cacctgcaga     2640
          gccagccagg gcatcagcag ctggctgacc tggtaccagc agaagcccga gaaggccccc     2700
          aagagcctga tctacgccgc cagcagcctg cagagcggcg tgcccagcag attcagcggc     2760
          agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc     2820
          acctactact gccagcagta cgacagctac cccatcacct tcggccaggg caccagactg     2880
          gagatcaagg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagccaggtg     2940
          cagctgcagc agtggggcgc cggcctgctg aagcccagcg agaccctgag cctgacctgc     3000
          gccgtgtacg gcggcagctt cagcgcctac tactggagct ggatcagaca gccccccggc     3060
          aagggcctgg agtggatcgg cgacatcaac cacggcggcg gcaccaacta caaccccagc     3120
          ctgaagagca gagtgaccat cagcgtggac accagcaaga accagttcag cctgaagctg     3180
          aacagcgtga ccgccgccga caccgccgtg tactactgcg ccagcctgac cgcctactgg     3240
          ggccagggca gcctggtgac cgtgagcgcc gccgccttcg tgcccgtgtt cctgcccgcc     3300
          aagcccacca ccacccccgc ccccagaccc cccacccccg cccccaccat cgccagccag     3360
          cccctgagcc tgagacccga ggcctgcaga cccgccgccg gcggcgccgt gcacaccaga     3420
          ggcctggact tcgcctgcga catctacatc tgggcccccc tggccggcac ctgcggcgtg     3480
          ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac tgcaaccaca gaaacagaaa gagaggcaga     3540
          aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgagac ccgtgcagac cacccaggag     3600
          gaggacggct gcagctgcag attccccgag gaggaggagg gcggctgcga gctgagagtg     3660
          aagttcagca gaagcgccga cgcccccgcc taccagcagg gccagaacca gctgtacaac     3720
          gagctgaacc tgggcagaag agaggagtac gacgtgctgg acaagagaag aggcagagac     3780
          cccgagatgg gcggcaagcc cagaagaaag aacccccagg agggcctgta caacgagctg     3840
          cagaaggaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gagaagaaga     3900
          ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac     3960
          gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg     4020
          aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgt ctcgctccgt tgccttagct     4080
          gtgctcgcgc tactctctct ttctggatta gaggctgtca tggcgccccg aaccctcttc     4140
          ctgggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgat ccagcgtact     4200
          ccaaagattc aggtttactc acgtcatcca gcagagaatg gaaagtcaaa tttcctgaat     4260
          tgctatgtgt ctgggtttca tccatccgac attgaagttg acttactgaa gaatggagag     4320
          agaattgaaa aagtggagca ttcagacttg tctttcagca aggactggtc tttctatctc     4380
          ttgtactaca ctgaattcac ccccactgaa aaagatgagt atgcctgccg tgtgaaccat     4440
          gtgactttgt cacagcccaa gatagttaag tgggatcgag acatgggtgg tggtggttct     4500
          ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gatccggctc ccactccttg     4560
          aagtatttcc acacttccgt gtcccggccc ggccgcgggg agccccgctt catctctgtg     4620
          ggctacgtgg acgacaccca gttcgtgcgc ttcgacaacg acgccgcgag tccgaggatg     4680
          gtgccgcggg cgccgtggat ggagcaggag gggtcagagt attgggaccg ggagacacgg     4740
          agcgccaggg acaccgcaca gattttccga gtgaatctgc ggacgctgcg cggctactac     4800
          aatcagagcg aggccgggtc tcacaccctg cagtggatgc atggctgcga gctggggccc     4860
          gacgggcgct tcctccgcgg gtatgaacag ttcgcctacg acggcaagga ttatctcacc     4920
          ctgaatgagg acctgcgctc ctggaccgcg gtggacacgg cggctcagat ctccgagcaa     4980
          aagtcaaatg atgcctctga ggcggagcac cagagagcct acctggaaga cacatgcgtg     5040
          gagtggctcc acaaatacct ggagaagggg aaggagacgc tgcttcacct ggagccccca     5100
          aagacacacg tgactcacca ccccatctct gaccatgagg ccaccctgag gtgctgggcc     5160
          ctgggcttct accctgcgga gatcacactg acctggcagc aggatgggga gggccatacc     5220
          caggacacgg agctcgtgga gaccaggcct gcaggggatg gaaccttcca gaagtgggca     5280
          gctgtggtgg tgccttctgg agaggagcag agatacacgt gccatgtgca gcatgagggg     5340
          ctacccgagc ccgtcaccct gagatggaag ccggcttccc agcccaccat ccccatcgtg     5400
          ggcatcattg ctggcctggt tctccttgga tctgtggtct ctggagctgt ggttgctgct     5460
          gtgatatgga ggaagaagag ctcaggtgga aaaggaggga gctactctaa ggctgagtgg     5520
          agcgacagtg cccaggggtc tgagtctcac agcttgtaat gatagccgct gatcagcctc     5580
          gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac     5640
          cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg     5700
          tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga     5760
          ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatgggtc gactgaccag     5820
          atggacctgg ctggagaaga agagattgag ctctactcag gtgggccctc ctccctctgg     5880
          tctcttccgg tatcccccac ccctcagctt gctgtagaga cggcaatcag gggaaattct     5940
          ggtccctgcc ctcccgtcag caccacggac agctcccacg tctgtgggac gctctctgca     6000
          gatggggatg atctcccagc cctgccccgc ctctccctcg ttccccacca gccctctttc     6060
          cagaaatttc cttcttcatc caagggactt ttcctcccag aacccgacac agacaccatc     6120
          aactgcgacc agttcagcag gctgttgtgt gacatggaag gtgatgaaga gaccagggag     6180
          gcttatgcca atatcggtga ggaagcacct gagcccagaa aaggacaatc aagggcaaga     6240
          gttctttgct gccacttgtc aatatcaccc attcatcatg agccacgtca gtcccctccc     6300
          acagaaatca ttgcaagggg gatgcggagc aatggctgga ggaacggaga ctccagggaa     6360
          gagaggggag atggaggcca gtgggggaaa taggcccctt cactaatgac caccaagaaa     6420
          acaaaatctc atgtttacat cctccacctc catttctata cgcatttctg cttcttgctc     6480
          ttctgtccat cctttctaca aagcccatac catacacccc tttccctttt cctcccagct     6540
          ccttagccaa gctactctag tatttgtaat aactagcatt tactggatac tcatagtatg     6600
          ctcattgctg tccggtaacc acgtgcggac cgggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc     6660
          gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct     6720
          agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc     6780
          ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca     6840
          acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct     6900
          ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac tggctgcagt acgtgattct     6960
          tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc     7020
          cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat     7080
          ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt     7140
          ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga     7200
          tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca     7260
          gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta     7320
          gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc     7380
          ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc     7440
          cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga     7500
          gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac     7560
          ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc     7620
          tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac     7680
          tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt     7740
          tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca     7800
          ggtgtcgtga cttgacgtcg ccaccatgag gatatttgct gtctttatat tcatgaccta     7860
          ctggcatttg ctgaacgcat ttactgtcac ggttcccaag gacctatatg tggtagagta     7920
          tggtagcaat atgacaattg aatgcaaatt cccagtagaa aaacaattag acctggctgc     7980
          actaattgtc tattgggaaa tggaggataa gaacattatt caatttgtgc atggagagga     8040
          agacctgaag gttcagcata gtagctacag acagagggcc cggctgttga aggaccagct     8100
          ctccctggga aatgctgcac ttcagatcac agatgtgaaa ttgcaggatg caggggtgta     8160
          ccgctgcatg atcagctatg gtggtgccga ctacaagcga attactgtga aagtcaatgc     8220
          cccatacaac aaaatcaacc aaagaatttt ggttgtggat ccagtcacct ctgaacatga     8280
          actgacatgt caggctgagg gctaccccaa ggccgaagtc atctggacaa gcagtgacca     8340
          tcaagtcctg agtggtaaga ccaccaccac caattccaag agagaggaga aacttttcaa     8400
          tgtgaccagc acactgagaa tcaacacaac aactaatgag attttctact gcacttttag     8460
          gagattagat cctgaggaaa accatacagc tgaattggtc atcccagaac tacctctggc     8520
          acatcctcca aatgaaagga ctcacttggt aattctggga gccatcttat tatgccttgg     8580
          tgtagcactg acattcatct tccgtttaag aaaagggaga atgatggatg tgaaaaaatg     8640
          tggcatccaa gatacaaact caaagaagca aagtgataca catttggagg agacgtaacc     8700
          gctgatcagc ctcgaaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc     8760
          atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa     8820
          ctcatcaatg tatcttaggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat     8880
          ttcacaccgc atacagtact gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta     8940
          agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg     9000
          cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa     9060
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          cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca     9240
          acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc     9300
          tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta     9360
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          tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat     9600
          gtcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca     9660
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          gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt     9840
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          gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggaaaaac     9960
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          cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga    10140
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          tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat    10260
          ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg    10320
          ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa    10380
          acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt    10440
          gatgctcgat gagtttttct aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc    10500
          actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc    10560
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          <![CDATA[<210>  119]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  119]]>
          cagatccagc tgcagcagag cggccccgag gtggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatc       60
          agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactaca tcacctgggt gaagcagaag      120
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          atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac accgccgtgt acttctgcgc caactacggc      300
          aactactggt tcgcctactg gggccagggc acccaggtga ccgtgagcgc cggcggcggc      360
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          gtggacttcg acggcgacag ctacatgaac tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc      540
          aaggtgctga tctacgccgc cagcaacctg gagagcggca tccccgccag attcagcggc      600
          agcggcagcg gcaccgactt caccctgaac atccaccccg tggaggagga ggacgccgcc      660
          acctactact gccagcagag caacgaggac ccctggacct tcggcggcgg caccaagctg      720
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          cccgccccca gaccccccac ccccgccccc accatcgcca gccagcccct gagcctgaga      840
          cccgaggcct gcagacccgc cgccggcggc gccgtgcaca ccagaggcct ggacttcgcc      900
          tgcgacatct acatctgggc ccccctggcc ggcacctgcg gcgtgctgct gctgagcctg      960
          gtgatcaccc tgtactgcaa ccacagaaac agaagcaaga gaagcagact gctgcacagc     1020
          gactacatga acatgacccc cagaagaccc ggccccacca gaaagcacta ccagccctac     1080
          gcccccccca gagacttcgc cgcctacaga agcagagtga agttcagcag aagcgccgac     1140
          gcccccgcct accagcaggg ccagaaccag ctgtacaacg agctgaacct gggcagaaga     1200
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          gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag agaagaagag gcaagggcca cgacggcctg     1380
          taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg     1440
          ccccccagag gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag     1500
          gagaaccctg gacctatgtc tcgctccgtt gccttagctg tgctcgcgct actctctctt     1560
          tctggattag aggctgtcat ggcgccccga accctcttcc tgggtggagg cggttcaggc     1620
          ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgatc cagcgtactc caaagattca ggtttactca     1680
          cgtcatccag cagagaatgg aaagtcaaat ttcctgaatt gctatgtgtc tgggtttcat     1740
          ccatccgaca ttgaagttga cttactgaag aatggagaga gaattgaaaa agtggagcat     1800
          tcagacttgt ctttcagcaa ggactggtct ttctatctct tgtactacac tgaattcacc     1860
          cccactgaaa aagatgagta tgcctgccgt gtgaaccatg tgactttgtc acagcccaag     1920
          atagttaagt gggatcgaga catgggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc     1980
          ggcggctccg gtggtggtgg atccggctcc cactccttga agtatttcca cacttccgtg     2040
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          ttcgtgcgct tcgacaacga cgccgcgagt ccgaggatgg tgccgcgggc gccgtggatg     2160
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          cacaccctgc agtggatgca tggctgcgag ctggggcccg acgggcgctt cctccgcggg     2340
          tatgaacagt tcgcctacga cggcaaggat tatctcaccc tgaatgagga cctgcgctcc     2400
          tggaccgcgg tggacacggc ggctcagatc tccgagcaaa agtcaaatga tgcctctgag     2460
          gcggagcacc agagagccta cctggaagac acatgcgtgg agtggctcca caaatacctg     2520
          gagaagggga aggagacgct gcttcacctg gagcccccaa agacacacgt gactcaccac     2580
          cccatctctg accatgaggc caccctgagg tgctgggccc tgggcttcta ccctgcggag     2640
          atcacactga cctggcagca ggatggggag ggccataccc aggacacgga gctcgtggag     2700
          accaggcctg caggggatgg aaccttccag aagtgggcag ctgtggtggt gccttctgga     2760
          gaggagcaga gatacacgtg ccatgtgcag catgaggggc tacccgagcc cgtcaccctg     2820
          agatggaagc cggcttccca gcccaccatc cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt     2880
          ctccttggat ctgtggtctc tggagctgtg gttgctgctg tgatatggag gaagaagagc     2940
          tcaggtggaa aaggagggag ctactctaag gctgagtgga gcgacagtgc ccaggggtct     3000
          gagtctcaca gcttg                                                      3015
          <![CDATA[<210>  120]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          caggtgcagc tgcagcagtg gggcgccggc ctgctgaagc ccagcgagac cctgagcctg       60
          acctgcgccg tgtacggcgg cagcttcagc gcctactact ggagctggat cagacagccc      120
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          cccagcctga agagcagagt gaccatcagc gtggacacca gcaagaacca gttcagcctg      240
          aagctgaaca gcgtgaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccag cctgaccgcc      300
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          agcgtgggcg acagagtgac catcacctgc agagccagcc agggcatcag cagctggctg      480
          acctggtacc agcagaagcc cgagaaggcc cccaagagcc tgatctacgc cgccagcagc      540
          ctgcagagcg gcgtgcccag cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg      600
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          gacatccaga tgacccagag ccccaccagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc       60
          atcacctgca gagccagcca gggcatcagc agctggctga cctggtacca gcagaagccc      120
          gagaaggccc ccaagagcct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg cgtgcccagc      180
          agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc      240
          gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacgacagct accccatcac cttcggccag      300
          ggcaccagac tggagatcaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc      360
          ggcagccagg tgcagctgca gcagtggggc gccggcctgc tgaagcccag cgagaccctg      420
          agcctgacct gcgccgtgta cggcggcagc ttcagcgcct actactggag ctggatcaga      480
          cagccccccg gcaagggcct ggagtggatc ggcgacatca accacggcgg cggcaccaac      540
          tacaacccca gcctgaagag cagagtgacc atcagcgtgg acaccagcaa gaaccagttc      600
          agcctgaagc tgaacagcgt gaccgccgcc gacaccgccg tgtactactg cgccagcctg      660
          accgcctact ggggccaggg cagcctggtg accgtgagcg ccgccgcctt cgtgcccgtg      720
          ttcctgcccg ccaagcccac caccaccccc gcccccagac cccccacccc cgcccccacc      780
          atcgccagcc agcccctgag cctgagaccc gaggcctgca gacccgccgc cggcggcgcc      840
          gtgcacacca gaggcctgga cttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc cctggccggc      900
          acctgcggcg tgctgctgct gagcctggtg atcaccctgt actgcaacca cagaaacaga      960
          aagagaggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgag acccgtgcag     1020
          accacccagg aggaggacgg ctgcagctgc agattccccg aggaggagga gggcggctgc     1080
          gagctgagag tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccccg cctaccagca gggccagaac     1140
          cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga agagaggagt acgacgtgct ggacaagaga     1200
          agaggcagag accccgagat gggcggcaag cccagaagaa agaaccccca ggagggcctg     1260
          tacaacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc     1320
          gagagaagaa gaggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag     1380
          gacacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca gaggaagcgg agctactaac     1440
          ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat gtctcgctcc     1500
          gttgccttag ctgtgctcgc gctactctct ctttctggat tagaggctgt catggcgccc     1560
          cgaaccctct tcctgggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg     1620
          atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca     1680
          aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg     1740
          aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg     1800
          tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc     1860
          cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatgggt     1920
          ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg tggatccggc     1980
          tcccactcct tgaagtattt ccacacttcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc     2040
          ttcatctctg tgggctacgt ggacgacacc cagttcgtgc gcttcgacaa cgacgccgcg     2100
          agtccgagga tggtgccgcg ggcgccgtgg atggagcagg aggggtcaga gtattgggac     2160
          cgggagacac ggagcgccag ggacaccgca cagattttcc gagtgaatct gcggacgctg     2220
          cgcggctact acaatcagag cgaggccggg tctcacaccc tgcagtggat gcatggctgc     2280
          gagctggggc ccgacgggcg cttcctccgc gggtatgaac agttcgccta cgacggcaag     2340
          gattatctca ccctgaatga ggacctgcgc tcctggaccg cggtggacac ggcggctcag     2400
          atctccgagc aaaagtcaaa tgatgcctct gaggcggagc accagagagc ctacctggaa     2460
          gacacatgcg tggagtggct ccacaaatac ctggagaagg ggaaggagac gctgcttcac     2520
          ctggagcccc caaagacaca cgtgactcac caccccatct ctgaccatga ggccaccctg     2580
          aggtgctggg ccctgggctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca gcaggatggg     2640
          gagggccata cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc     2700
          cagaagtggg cagctgtggt ggtgccttct ggagaggagc agagatacac gtgccatgtg     2760
          cagcatgagg ggctacccga gcccgtcacc ctgagatgga agccggcttc ccagcccacc     2820
          atccccatcg tgggcatcat tgctggcctg gttctccttg gatctgtggt ctctggagct     2880
          gtggttgctg ctgtgatatg gaggaagaag agctcaggtg gaaaaggagg gagctactct     2940
          aaggctgagt ggagcgacag tgcccagggg tctgagtctc acagcttg                  2988
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  88]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          Ser Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr 
          1               5                   10                  15      
          Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 
                  35                  40                  45              
          Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg 
                          85              
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  40]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 
          1               5                   10                  15      
          Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 
                      20                  25                  30          
          Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 
                  35                  40  
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  42]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  124]]>
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
          1               5                   10                  15      
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 
                  35                  40          
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  264]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          agcgccgccg ccttcgtgcc cgtgttcctg cccgccaagc ccaccaccac ccccgccccc       60
          agacccccca cccccgcccc caccatcgcc agccagcccc tgagcctgag acccgaggcc      120
          tgcagacccg ccgccggcgg cgccgtgcac accagaggcc tggacttcgc ctgcgacatc      180
          tacatctggg cccccctggc cggcacctgc ggcgtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc      240
          ctgtactgca accacagaaa caga                                             264
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  126]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          aagagaggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgag acccgtgcag       60
          accacccagg aggaggacgg ctgcagctgc agattccccg aggaggagga gggcggctgc      120
          gagctg                                                                 126
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  336]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          agagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg       60
          tacaacgagc tgaacctggg cagaagagag gagtacgacg tgctggacaa gagaagaggc      120
          agagaccccg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc cccaggaggg cctgtacaac      180
          gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagaga      240
          agaagaggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc      300
          tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga                                336
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  1128]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          atggaaactc tttctaatgc aagtggtact tttgccatac gccttttaaa gatactgtgt       60
          caagataacc cttcgcacaa cgtgttctgt tctcctgtga gcatctcctc tgccctggcc      120
          atggttctcc taggggcaaa gggaaacacc gcaacccaga tggcccaggc actgtcttta      180
          aacacagagg aagacattca tcgggctttc cagtcgcttc tcactgaagt gaacaaggct      240
          ggcacacagt acctgctgag aacggccaac aggctctttg gagagaaaac ttgtcagttc      300
          ctctcaacgt ttaaggaatc ctgtcttcaa ttctaccatg ctgagctgaa ggagctttcc      360
          tttatcagag ctgcagaaga gtccaggaaa cacatcaaca cctgggtctc aaaaaagacc      420
          gaaggtaaaa ttgaagagtt gttgccgggt agctcaattg atgcagaaac caggctggtt      480
          cttgtcaatg ccatctactt caaaggaaag tggaatgaac cgtttgacga aacatacaca      540
          agggaaatgc cctttaaaat aaaccaggag gagcaaaggc cagtgcagat gatgtatcag      600
          gaggccacgt ttaagctcgc ccacgtgggc gaggtgcgcg cgcagctgct ggagctgccc      660
          tacgccagga aggagctgag cctgctggtg ctgctgcctg acgacggcgt ggagctcagc      720
          acggtggaaa aaagtctcac ttttgagaaa ctcacagcct ggaccaagcc agactgtatg      780
          aagagtactg aggttgaagt tctccttcca aaatttaaac tacaagagga ttatgacatg      840
          gaatctgtgc ttcggcattt gggaattgtt gatgccttcc aacagggcaa ggctgacttg      900
          tcggcaatgt cagcggagag agacctgtgt ctgtccaagt tcgtgcacaa gagttttgtg      960
          gaggtgaatg aagaaggcac cgaggcagcg gcagcgtcga gctgctttgt agttgcagag     1020
          tgctgcatgg aatctggccc caggttctgt gctgaccacc ctttcctttt cttcatcagg     1080
          cacaacagag ccaacagcat tctgttctgt ggcaggttct catcgcca                  1128
          <![CDATA[<210>  130]]>
          <![CDATA[<211>  8963]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  130]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60
          ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact      120
          aggggttcct gcggccgcac gcgtgttcta gggtggaaac taagagaatg atgtacctag      180
          agggcgctgg aagctctaaa gccctagcag ttactgcttt tactattagt ggtcgttttt      240
          ttctcccccc cgccccccga caaatcaaca gaacaaagaa aattacctaa acagcaagga      300
          catagggagg aacttcttgg cacagaactt tccaaacact ttttcctgaa gggatacaag      360
          aagcaagaaa ggtactcttt cactaggacc ttctctgagc tgtcctcagg atgcttttgg      420
          gactattttt cttacccaga gaatggagaa accctgcagg gaattcccaa gctgtagtta      480
          taaacagaag ttctccttct gctaggtagc attcaaagat cttaatcttc tgggtttccg      540
          ttttctcgaa tgaaaaatgc aggtccgagc agttaactgg ctggggcacc attagcaagt      600
          cacttagcat ctctggggcc agtctgcaaa gcgagggggc agccttaatg tgcctccagc      660
          ctgaagtcct agaatgagcg cccggtgtcc caagctgggg cgcgcacccc agatcggagg      720
          gcgccgatgt acagacagca aactcaccca gtctagtgca tgccttctta aacatcacga      780
          gactctaaga aaaggaaact gaaaacggga aagtccctct ctctaacctg gcactgcgtc      840
          gctggcttgg agacaggtga cggtccctgc gggccttgtc ctgattggct gggcacgcgt      900
          ttaatataag tggaggcgtc gcgctggcgg gcattcctga agctaagctt gtggacgata      960
          tcgaattcgc acgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat     1020
          tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg     1080
          gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa     1140
          cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa actgcccact     1200
          tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta     1260
          aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt     1320
          acatctacgt attagtcatc gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc     1380
          actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta     1440
          ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg     1500
          cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct     1560
          ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc     1620
          gcggcgggcg ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg     1680
          ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc     1740
          ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct     1800
          gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg     1860
          gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg     1920
          tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg     1980
          gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg     2040
          gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc     2100
          ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg     2160
          gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc     2220
          ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg     2280
          ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga     2340
          gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg     2400
          caccccctct agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg     2460
          gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc     2520
          cgcaggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg     2580
          tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagg     2640
          ggggatccgt ttatctgcag aattcgccct tgacgtcgcc accatggaaa ctctttctaa     2700
          tgcaagtggt acttttgcca tacgcctttt aaagatactg tgtcaagata acccttcgca     2760
          caacgtgttc tgttctcctg tgagcatctc ctctgccctg gccatggttc tcctaggggc     2820
          aaagggaaac accgcaaccc agatggccca ggcactgtct ttaaacacag aggaagacat     2880
          tcatcgggct ttccagtcgc ttctcactga agtgaacaag gctggcacac agtacctgct     2940
          gagaacggcc aacaggctct ttggagagaa aacttgtcag ttcctctcaa cgtttaagga     3000
          atcctgtctt caattctacc atgctgagct gaaggagctt tcctttatca gagctgcaga     3060
          agagtccagg aaacacatca acacctgggt ctcaaaaaag accgaaggta aaattgaaga     3120
          gttgttgccg ggtagctcaa ttgatgcaga aaccaggctg gttcttgtca atgccatcta     3180
          cttcaaagga aagtggaatg aaccgtttga cgaaacatac acaagggaaa tgccctttaa     3240
          aataaaccag gaggagcaaa ggccagtgca gatgatgtat caggaggcca cgtttaagct     3300
          cgcccacgtg ggcgaggtgc gcgcgcagct gctggagctg ccctacgcca ggaaggagct     3360
          gagcctgctg gtgctgctgc ctgacgacgg cgtggagctc agcacggtgg aaaaaagtct     3420
          cacttttgag aaactcacag cctggaccaa gccagactgt atgaagagta ctgaggttga     3480
          agttctcctt ccaaaattta aactacaaga ggattatgac atggaatctg tgcttcggca     3540
          tttgggaatt gttgatgcct tccaacaggg caaggctgac ttgtcggcaa tgtcagcgga     3600
          gagagacctg tgtctgtcca agttcgtgca caagagtttt gtggaggtga atgaagaagg     3660
          caccgaggca gcggcagcgt cgagctgctt tgtagttgca gagtgctgca tggaatctgg     3720
          ccccaggttc tgtgctgacc accctttcct tttcttcatc aggcacaaca gagccaacag     3780
          cattctgttc tgtggcaggt tctcatcgcc aggaagcgga gctactaact tcagcctgct     3840
          gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg tctcgctccg ttgccttagc     3900
          tgtgctcgcg ctactctctc tttctggatt agaggctgtc atggcgcccc gaaccctctt     3960
          cctgggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcga tccagcgtac     4020
          tccaaagatt caggtttact cacgtcatcc agcagagaat ggaaagtcaa atttcctgaa     4080
          ttgctatgtg tctgggtttc atccatccga cattgaagtt gacttactga agaatggaga     4140
          gagaattgaa aaagtggagc attcagactt gtctttcagc aaggactggt ctttctatct     4200
          cttgtactac actgaattca cccccactga aaaagatgag tatgcctgcc gtgtgaacca     4260
          tgtgactttg tcacagccca agatagttaa gtgggatcga gacatgggtg gtggtggttc     4320
          tggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt ggatccggct cccactcctt     4380
          gaagtatttc cacacttccg tgtcccggcc cggccgcggg gagccccgct tcatctctgt     4440
          gggctacgtg gacgacaccc agttcgtgcg cttcgacaac gacgccgcga gtccgaggat     4500
          ggtgccgcgg gcgccgtgga tggagcagga ggggtcagag tattgggacc gggagacacg     4560
          gagcgccagg gacaccgcac agattttccg agtgaatctg cggacgctgc gcggctacta     4620
          caatcagagc gaggccgggt ctcacaccct gcagtggatg catggctgcg agctggggcc     4680
          cgacgggcgc ttcctccgcg ggtatgaaca gttcgcctac gacggcaagg attatctcac     4740
          cctgaatgag gacctgcgct cctggaccgc ggtggacacg gcggctcaga tctccgagca     4800
          aaagtcaaat gatgcctctg aggcggagca ccagagagcc tacctggaag acacatgcgt     4860
          ggagtggctc cacaaatacc tggagaaggg gaaggagacg ctgcttcacc tggagccccc     4920
          aaagacacac gtgactcacc accccatctc tgaccatgag gccaccctga ggtgctgggc     4980
          cctgggcttc taccctgcgg agatcacact gacctggcag caggatgggg agggccatac     5040
          ccaggacacg gagctcgtgg agaccaggcc tgcaggggat ggaaccttcc agaagtgggc     5100
          agctgtggtg gtgccttctg gagaggagca gagatacacg tgccatgtgc agcatgaggg     5160
          gctacccgag cccgtcaccc tgagatggaa gccggcttcc cagcccacca tccccatcgt     5220
          gggcatcatt gctggcctgg ttctccttgg atctgtggtc tctggagctg tggttgctgc     5280
          tgtgatatgg aggaagaaga gctcaggtgg aaaaggaggg agctactcta aggctgagtg     5340
          gagcgacagt gcccaggggt ctgagtctca cagcttgtaa tgatagccgc tgatcagcct     5400
          cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga     5460
          ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt     5520
          gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg     5580
          attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatgggt cgacccagcg     5640
          tgagtctctc ctaccctccc gctctggtcc ttcctctccc gctctgcacc ctctgtggcc     5700
          ctcgctgtgc tctctcgctc cgtgacttcc cttctccaag ttctccttgg tggcccgccg     5760
          tggggctagt ccagggctgg atctcgggga agcggcgggg tggcctggga gtggggaagg     5820
          gggtgcgcac ccgggacgcg cgctacttgc ccctttcggc ggggagcagg ggagaccttt     5880
          ggcctacggc gacgggaggg tcgggacaaa gtttagggcg tcgataagcg tcagagcgcc     5940
          gaggttgggg gagggtttct cttccgctct ttcgcggggc ctctggctcc cccagcgcag     6000
          ctggagtggg ggacgggtag gctcgtccca aaggcgcggc gctgaggttt gtgaacgcgt     6060
          ggaggggcgc ttggggtctg ggggaggcgt cgcccgggta agcctgtctg ctgcggctct     6120
          gcttccctta gactggagag ctgtggactt cgtctaggcg cccgctaagt tcgcatgtcc     6180
          tagcacctct gggtctatgt ggggccacac cgtggggagg aaacagcacg cgacgtttgt     6240
          agaatgcttg gctgtgatac aaagcggttt cgaataatta acttatttgt tcccatcaca     6300
          tgtcactttt aaaaaattat aagaactacc cgttattgac atctttctgt gtgccaagga     6360
          ctttatgtgc tttgcgtcat ttaattttga aaacagttat cttccgccat agataactac     6420
          tatggttatc ttctggtaac cacgtgcgga ccgaggctgc agcgtcgtcc tccctaggaa     6480
          cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg     6540
          cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg     6600
          cgcagctgcc tgcaggggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt     6660
          tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg     6720
          cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc     6780
          ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa     6840
          atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac     6900
          ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt     6960
          tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca     7020
          accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt     7080
          taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta     7140
          caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc     7200
          gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt     7260
          acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac     7320
          cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga     7380
          acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa     7440
          cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa     7500
          tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgcttgta tgggaagccc     7560
          gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat     7620
          gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt     7680
          atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggaaa aacagcattc     7740
          caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc     7800
          ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt     7860
          cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat     7920
          gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa acttttgcca     7980
          ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac     8040
          gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag     8100
          gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt     8160
          tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc     8220
          gatgagtttt tctaatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc     8280
          gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat     8340
          ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga     8400
          gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt     8460
          ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata     8520
          cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac     8580
          cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg     8640
          ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg     8700
          tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag     8760
          cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct     8820
          ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc     8880
          aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt     8940
          ttgctggcct tttgctcaca tgt                                             8963
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  2944]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  131]]>
          atggaaactc tttctaatgc aagtggtact tttgccatac gccttttaaa gatactgtgt       60
          caagataacc cttcgcacaa cgtgttctgt tctcctgtga gcatctcctc tgccctggcc      120
          atggttctcc taggggcaaa gggaaacacc gcaacccaga tggcccaggc actgtcttta      180
          aacacagagg aagacattca tcgggctttc cagtcgcttc tcactgaagt gaacaaggct      240
          ggcacacagt acctgctgag aacggccaac aggctctttg gagagaaaac ttgtcagttc      300
          ctctcaacgt ttaaggaatc ctgtcttcaa ttctaccatg ctgagctgaa ggagctttcc      360
          tttatcagag ctgcagaaga gtccaggaaa cacatcaaca cctgggtctc aaaaaagacc      420
          gaaggtaaaa ttgaagagtt gttgccgggt agctcaattg atgcagaaac caggctggtt      480
          cttgtcaatg ccatctactt caaaggaaag tggaatgaac cgtttgacga aacatacaca      540
          agggaaatgc cctttaaaat aaaccaggag gagcaaaggc cagtgcagat gatgtatcag      600
          gaggccacgt ttaagctcgc ccacgtgggc gaggtgcgcg cgcagctgct ggagctgccc      660
          tacgccagga aggagctgag cctgctggtg ctgctgcctg acgacggcgt ggagctcagc      720
          acggtggaaa aaagtctcac ttttgagaaa ctcacagcct ggaccaagcc agactgtatg      780
          aagagtactg aggttgaagt tctccttcca aaatttaaac tacaagagga ttatgacatg      840
          gaatctgtgc ttcggcattt gggaattgtt gatgccttcc aacagggcaa ggctgacttg      900
          tcggcaatgt cagcggagag agacctgtgt ctgtccaagt tcgtgcacaa gagttttgtg      960
          gaggtgaatg aagaaggcac cgaggcagcg gcagcgtcga gctgctttgt agttgcagag     1020
          tgctgcatgg aatctggccc caggttctgt gctgaccacc ctttcctttt cttcatcagg     1080
          cacaacagag ccaacagcat tctgttctgt ggcaggttct catcgccagg aagcggagct     1140
          actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctatgtct     1200
          cgctccgttg ccttagctgt gctcgcgcta ctctctcttt ctggattaga ggctgtcatg     1260
          gcgccccgaa ccctcttcct gggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc     1320
          ggatcgatcc agcgtactcc aaagattcag gtttactcac gtcatccagc agagaatgga     1380
          aagtcaaatt tcctgaattg ctatgtgtct gggtttcatc catccgacat tgaagttgac     1440
          ttactgaaga atggagagag aattgaaaaa gtggagcatt cagacttgtc tttcagcaag     1500
          gactggtctt tctatctctt gtactacact gaattcaccc ccactgaaaa agatgagtat     1560
          gcctgccgtg tgaaccatgt gactttgtca cagcccaaga tagttaagtg ggatcgagac     1620
          atgggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtgga     1680
          tccggctccc actccttgaa gtatttccac acttccgtgt cccggcccgg ccgcggggag     1740
          ccccgcttca tctctgtggg ctacgtggac gacacccagt tcgtgcgctt cgacaacgac     1800
          gccgcgagtc cgaggatggt gccgcgggcg ccgtggatgg agcaggaggg gtcagagtat     1860
          tgggaccggg agacacggag cgccagggac accgcacaga ttttccgagt gaatctgcgg     1920
          acgctgcgcg gctactacaa tcagagcgag gccgggtctc acaccctgca gtggatgcat     1980
          ggctgcgagc tggggcccga cgggcgcttc ctccgcgggt atgaacagtt cgcctacgac     2040
          ggcaaggatt atctcaccct gaatgaggac ctgcgctcct ggaccgcggt ggacacggcg     2100
          gctcagatct ccgagcaaaa gtcaaatgat gcctctgagg cggagcacca gagagcctac     2160
          ctggaagaca catgcgtgga gtggctccac aaatacctgg agaaggggaa ggagacgctg     2220
          cttcacctgg agcccccaaa gacacacgtg actcaccacc ccatctctga ccatgaggcc     2280
          accctgaggt gctgggccct gggcttctac cctgcggaga tcacactgac ctggcagcag     2340
          gatggggagg gccataccca ggacacggag ctcgtggaga ccaggcctgc aggggatgga     2400
          accttccaga agtgggcagc tgtggtggtg ccttctggag aggagcagag atacacgtgc     2460
          catgtgcagc atgaggggct acccgagccc gtcaccctga gatggaagcc ggcttcccag     2520
          cccaccatcc ccatcgtggg catcattgct ggcctggttc tccttggatc tgtggtctct     2580
          ggagctgtgg ttgctgctgt gatatggagg aagaagagct caggtggaaa aggagggagc     2640
          tactctaagg ctgagtggag cgacagtgcc caggggtctg agtctcacag cttgtaatga     2700
          tagccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc     2760
          ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga     2820
          ggaaattgca tcgcattgtc gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag     2880
          gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct     2940
          atgg                                                                  2944
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
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          cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaagg          57
          <![CDATA[<210>  133]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acag             54
          <![CDATA[<210>  134]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctc              53
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          <![CDATA[<400>  135]]>
          gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg ggg                                    33
          <![CDATA[<210>  136]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  136]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60
          ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact      120
          aggggttcct gcggccgcac gcgtgttcta gggtggaaac taagagaatg atgtacctag      180
          agggcgctgg aagctctaaa gccctagcag ttactgcttt tactattagt ggtcgttttt      240
          ttctcccccc cgccccccga caaatcaaca gaacaaagaa aattacctaa acagcaagga      300
          catagggagg aacttcttgg cacagaactt tccaaacact ttttcctgaa gggatacaag      360
          aagcaagaaa ggtactcttt cactaggacc ttctctgagc tgtcctcagg atgcttttgg      420
          gactattttt cttacccaga gaatggagaa accctgcagg gaattcccaa gctgtagtta      480
          taaacagaag ttctccttct gctaggtagc attcaaagat cttaatcttc tgggtttccg      540
          ttttctcgaa tgaaaaatgc aggtccgagc agttaactgg ctggggcacc attagcaagt      600
          cacttagcat ctctggggcc agtctgcaaa gcgagggggc agccttaatg tgcctccagc      660
          ctgaagtcct agaatgagcg cccggtgtcc caagctgggg cgcgcacccc agatcggagg      720
          gcgccgatgt acagacagca aactcaccca gtctagtgca tgccttctta aacatcacga      780
          gactctaaga aaaggaaact gaaaacggga aagtccctct ctctaacctg gcactgcgtc      840
          gctggcttgg agacaggtga cggtccctgc gggccttgtc ctgattggct gggcacgcgt      900
          ttaatataag tggaggcgtc gcgctggcgg gcattcctga agctaagctt gtggacgata      960
          tcgaattcgc acgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat     1020
          tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg     1080
          gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa     1140
          cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa actgcccact     1200
          tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta     1260
          aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt     1320
          acatctacgt attagtcatc gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc     1380
          actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta     1440
          ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg     1500
          cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct     1560
          ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc     1620
          gcggcgggcg ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg     1680
          ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc     1740
          ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct     1800
          gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg     1860
          gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg     1920
          tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg     1980
          gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg     2040
          gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc     2100
          ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg     2160
          gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc     2220
          ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg     2280
          ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga     2340
          gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg     2400
          caccccctct agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg     2460
          gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc     2520
          cgcaggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg     2580
          tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagg     2640
          ggggatccgt ttatctgcag aattcgccct tgacgtcgcc accatggaaa ctctttctaa     2700
          tgcaagtggt acttttgcca tacgcctttt aaagatactg tgtcaagata acccttcgca     2760
          caacgtgttc tgttctcctg tgagcatctc ctctgccctg gccatggttc tcctaggggc     2820
          aaagggaaac accgcaaccc agatggccca ggcactgtct ttaaacacag aggaagacat     2880
          tcatcgggct ttccagtcgc ttctcactga agtgaacaag gctggcacac agtacctgct     2940
          gagaacggcc aacaggctct ttggagagaa aacttgtcag ttcctctcaa cgtttaagga     3000
          atcctgtctt caattctacc atgctgagct gaaggagctt tcctttatca gagctgcaga     3060
          agagtccagg aaacacatca acacctgggt ctcaaaaaag accgaaggta aaattgaaga     3120
          gttgttgccg ggtagctcaa ttgatgcaga aaccaggctg gttcttgtca atgccatcta     3180
          cttcaaagga aagtggaatg aaccgtttga cgaaacatac acaagggaaa tgccctttaa     3240
          aataaaccag gaggagcaaa ggccagtgca gatgatgtat caggaggcca cgtttaagct     3300
          cgcccacgtg ggcgaggtgc gcgcgcagct gctggagctg ccctacgcca ggaaggagct     3360
          gagcctgctg gtgctgctgc ctgacgacgg cgtggagctc agcacggtgg aaaaaagtct     3420
          cacttttgag aaactcacag cctggaccaa gccagactgt atgaagagta ctgaggttga     3480
          agttctcctt ccaaaattta aactacaaga ggattatgac atggaatctg tgcttcggca     3540
          tttgggaatt gttgatgcct tccaacaggg caaggctgac ttgtcggcaa tgtcagcgga     3600
          gagagacctg tgtctgtcca agttcgtgca caagagtttt gtggaggtga atgaagaagg     3660
          caccgaggca gcggcagcgt cgagctgctt tgtagttgca gagtgctgca tggaatctgg     3720
          ccccaggttc tgtgctgacc accctttcct tttcttcatc aggcacaaca gagccaacag     3780
          cattctgttc tgtggcaggt tctcatcgcc aggaagcgga gctactaact tcagcctgct     3840
          gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gactggacct ggatcctgtt     3900
          cctggtggcc gccgccacca gggtgcacag cggcattcat gtcttcattt tgggctgttt     3960
          cagtgcaggg cttcctaaaa cagaagccaa ctgggtgaat gtaataagtg atttgaaaaa     4020
          aattgaagat cttattcaat ctatgcatat tgatgctact ttatatacgg aaagtgatgt     4080
          tcaccccagt tgcaaagtaa cagcaatgaa gtgctttctc ttggagttac aagttatttc     4140
          acttgagtcc ggagatgcaa gtattcatga tacagtagaa aatctgatca tcctagcaaa     4200
          caacagtttg tcttctaatg ggaatgtaac agaatctgga tgcaaagaat gtgaggaact     4260
          ggaggaaaaa aatattaaag aatttttgca gagttttgta catattgtcc aaatgttcat     4320
          caacacttct agcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg     4380
          cggcggcagc ggcggcggca gcctgcagat cacgtgccct ccccccatgt ccgtggaaca     4440
          cgcagacatc tgggtcaaga gctacagctt gtactccagg gagcggtaca tttgtaactc     4500
          tggtttcaag cgtaaagccg gcacgtccag cctgacggag tgcgtgttga acaaggccac     4560
          gaatgtcgcc cactggacaa cccccagtct caaatgcatt agagaccctg ccctggttca     4620
          ccaaaggcca gcgccaccct ccacagtaac gacggcaggg gtgaccccac agccagagag     4680
          cctctcccct tctggaaaag agcccgcagc ttcatctccc agctcaaaca acacagcggc     4740
          cacaacagca gctattgtcc cgggctccca gctgatgcct tcaaaatcac cttccacagg     4800
          aaccacagag ataagcagtc atgagtcctc ccacggcacc ccctctcaga caacagccaa     4860
          gaactgggaa ctcacagcat ccgcctccca ccagccgcca ggtgtgtatc cacagggcca     4920
          cagcgacacc actgtggcta tctccacgtc cactgtcctg ctgtgtgggc tgagcgctgt     4980
          gtctctcctg gcatgctacc tcaagtcaag gcaaactccc ccgctggcca gcgttgaaat     5040
          ggaagccatg gaggctctgc cggtgacttg ggggaccagc agcagagatg aagacttgga     5100
          aaactgctct caccacctat gataaccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc     5160
          agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca     5220
          ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta     5280
          ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc     5340
          atgctgggga tgcggtgggc tctatgggtc gacccagcgt gagtctctcc taccctcccg     5400
          ctctggtcct tcctctcccg ctctgcaccc tctgtggccc tcgctgtgct ctctcgctcc     5460
          gtgacttccc ttctccaagt tctccttggt ggcccgccgt ggggctagtc cagggctgga     5520
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          gctacttgcc cctttcggcg gggagcaggg gagacctttg gcctacggcg acgggagggt     5640
          cgggacaaag tttagggcgt cgataagcgt cagagcgccg aggttggggg agggtttctc     5700
          ttccgctctt tcgcggggcc tctggctccc ccagcgcagc tggagtgggg gacgggtagg     5760
          ctcgtcccaa aggcgcggcg ctgaggtttg tgaacgcgtg gaggggcgct tggggtctgg     5820
          gggaggcgtc gcccgggtaa gcctgtctgc tgcggctctg cttcccttag actggagagc     5880
          tgtggacttc gtctaggcgc ccgctaagtt cgcatgtcct agcacctctg ggtctatgtg     5940
          gggccacacc gtggggagga aacagcacgc gacgtttgta gaatgcttgg ctgtgataca     6000
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          acgtgcggac cgaggctgca gcgtcgtcct ccctaggaac ccctagtgat ggagttggcc     6240
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          gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg     6960
          acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct     7020
          ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg     7080
          gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgaa caataaaact gtctgcttac     7140
          ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc gaggccgcga     7200
          ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg     7260
          caatcaggtg cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg     7320
          aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg     7380
          ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca     7440
          tggttactca ccactgcgat ccccggaaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct     7500
          gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt     7560
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          actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt     7800
          attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac     7860
          tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat     7920
          aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaatctcat     7980
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          gt                                                                    8702
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          gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc       60
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          gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc       60
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          ttcctttgtc ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag     1440
          cgggcgcggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt     1500
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          gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct     1620
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          cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tgtctcgctc     3300
          cgttgcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgga ttagaggctg tcatggcgcc     3360
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          gatccagcgt actccaaaga ttcaggttta ctcacgtcat ccagcagaga atggaaagtc     3480
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          gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc       60
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          tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg      480
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          caccaccccc gcccccagac cccccacccc cgcccccacc atcgccagcc agcccctgag     2580
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          cttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc cctggccggc acctgcggcg tgctgctgct     2700
          gagcctggtg atcaccctgt actgcaacca cagaaacaga aagagaggca gaaagaagct     2760
          gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgag acccgtgcag accacccagg aggaggacgg     2820
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          gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac     1380
          ttcctttgtc ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag     1440
          cgggcgcggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt     1500
          gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc ggggctgccg cagggggacg     1560
          gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct     1620
          ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagggg ggatccgttt     1680
          atctgcagaa ttcgcccttg acgtcgccac catggcgctt ccggtgacag cactgctcct     1740
          ccccttggcg ctgttgctcc acgcagcaag gccggacatc cagatgaccc agagccccac     1800
          cagcctgagc gccagcgtgg gcgacagagt gaccatcacc tgcagagcca gccagggcat     1860
          cagcagctgg ctgacctggt accagcagaa gcccgagaag gcccccaaga gcctgatcta     1920
          cgccgccagc agcctgcaga gcggcgtgcc cagcagattc agcggcagcg gcagcggcac     1980
          cgacttcacc ctgaccatca gcagcctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgcca     2040
          gcagtacgac agctacccca tcaccttcgg ccagggcacc agactggaga tcaagggcgg     2100
          cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc caggtgcagc tgcagcagtg     2160
          gggcgccggc ctgctgaagc ccagcgagac cctgagcctg acctgcgccg tgtacggcgg     2220
          cagcttcagc gcctactact ggagctggat cagacagccc cccggcaagg gcctggagtg     2280
          gatcggcgac atcaaccacg gcggcggcac caactacaac cccagcctga agagcagagt     2340
          gaccatcagc gtggacacca gcaagaacca gttcagcctg aagctgaaca gcgtgaccgc     2400
          cgccgacacc gccgtgtact actgcgccag cctgaccgcc tactggggcc agggcagcct     2460
          ggtgaccgtg agcgccgccg ccttcgtgcc cgtgttcctg cccgccaagc ccaccaccac     2520
          ccccgccccc agacccccca cccccgcccc caccatcgcc agccagcccc tgagcctgag     2580
          acccgaggcc tgcagacccg ccgccggcgg cgccgtgcac accagaggcc tggacttcgc     2640
          ctgcgacatc tacatctggg cccccctggc cggcacctgc ggcgtgctgc tgctgagcct     2700
          ggtgatcacc ctgtactgca accacagaaa cagaaagaga ggcagaaaga agctgctgta     2760
          catcttcaag cagcccttca tgagacccgt gcagaccacc caggaggagg acggctgcag     2820
          ctgcagattc cccgaggagg aggagggcgg ctgcgagctg agagtgaagt tcagcagaag     2880
          cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg     2940
          cagaagagag gagtacgacg tgctggacaa gagaagaggc agagaccccg agatgggcgg     3000
          caagcccaga agaaagaacc cccaggaggg cctgtacaac gagctgcaga aggacaagat     3060
          ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagaga agaagaggca agggccacga     3120
          cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc tacgacgccc tgcacatgca     3180
          ggccctgccc cccagaggaa gcggagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga     3240
          cgtggaggag aaccctggac ctatgtctcg ctccgttgcc ttagctgtgc tcgcgctact     3300
          ctctctttct ggattagagg ctgtcatggc gccccgaacc ctcttcctgg gtggaggcgg     3360
          ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgatccag cgtactccaa agattcaggt     3420
          ttactcacgt catccagcag agaatggaaa gtcaaatttc ctgaattgct atgtgtctgg     3480
          gtttcatcca tccgacattg aagttgactt actgaagaat ggagagagaa ttgaaaaagt     3540
          ggagcattca gacttgtctt tcagcaagga ctggtctttc tatctcttgt actacactga     3600
          attcaccccc actgaaaaag atgagtatgc ctgccgtgtg aaccatgtga ctttgtcaca     3660
          gcccaagata gttaagtggg atcgagacat gggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc     3720
          tggcggcggc ggctccggtg gtggtggatc cggctcccac tccttgaagt atttccacac     3780
          ttccgtgtcc cggcccggcc gcggggagcc ccgcttcatc tctgtgggct acgtggacga     3840
          cacccagttc gtgcgcttcg acaacgacgc cgcgagtccg aggatggtgc cgcgggcgcc     3900
          gtggatggag caggaggggt cagagtattg ggaccgggag acacggagcg ccagggacac     3960
          cgcacagatt ttccgagtga atctgcggac gctgcgcggc tactacaatc agagcgaggc     4020
          cgggtctcac accctgcagt ggatgcatgg ctgcgagctg gggcccgacg ggcgcttcct     4080
          ccgcgggtat gaacagttcg cctacgacgg caaggattat ctcaccctga atgaggacct     4140
          gcgctcctgg accgcggtgg acacggcggc tcagatctcc gagcaaaagt caaatgatgc     4200
          ctctgaggcg gagcaccaga gagcctacct ggaagacaca tgcgtggagt ggctccacaa     4260
          atacctggag aaggggaagg agacgctgct tcacctggag cccccaaaga cacacgtgac     4320
          tcaccacccc atctctgacc atgaggccac cctgaggtgc tgggccctgg gcttctaccc     4380
          tgcggagatc acactgacct ggcagcagga tggggagggc catacccagg acacggagct     4440
          cgtggagacc aggcctgcag gggatggaac cttccagaag tgggcagctg tggtggtgcc     4500
          ttctggagag gagcagagat acacgtgcca tgtgcagcat gaggggctac ccgagcccgt     4560
          caccctgaga tggaagccgg cttcccagcc caccatcccc atcgtgggca tcattgctgg     4620
          cctggttctc cttggatctg tggtctctgg agctgtggtt gctgctgtga tatggaggaa     4680
          gaagagctca ggtggaaaag gagggagcta ctctaaggct gagtggagcg acagtgccca     4740
          ggggtctgag tctcacagct tg                                              4762
          <![CDATA[<210>  142]]>
          <![CDATA[<211>  500]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  142]]>
          Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Gly Leu Glu Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr 
                  35                  40                  45              
          Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser 
              50                  55                  60                  
          Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser 
                          85                  90                  95      
          Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His 
                  115                 120                 125             
          Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp 
                      180                 185                 190         
          Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met 
                  195                 200                 205             
          Val Pro Arg Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp 
              210                 215                 220                 
          Arg Glu Thr Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Arg Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His 
                          245                 250                 255     
          Thr Leu Gln Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Gly Arg Phe 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr 
                  275                 280                 285             
          Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln 
              290                 295                 300                 
          Ile Ser Glu Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Tyr Leu Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Gly Lys Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val 
                      340                 345                 350         
          Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala 
                  355                 360                 365             
          Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly 
              370                 375                 380                 
          Glu Gly His Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu 
                          405                 410                 415     
          Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro 
                      420                 425                 430         
          Val Thr Leu Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val 
                  435                 440                 445             
          Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala 
              450                 455                 460                 
          Val Val Ala Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Ser Tyr Ser Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu 
                          485                 490                 495     
          Ser His Ser Leu 
                      500 
          <![CDATA[<210>  143]]>
          <![CDATA[<211>  417]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  143]]>
          Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 
          1               5                   10                  15      
          His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 
                      20                  25                  30          
          Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 
                  35                  40                  45              
          Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 
              50                  55                  60                  
          Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 
                          85                  90                  95      
          His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 
                      180                 185                 190         
          Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 
              210                 215                 220                 
          Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr 
                          245                 250                 255     
          Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser 
              290                 295                 300                 
          Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala 
                          325                 330                 335     
          Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 
                      340                 345                 350         
          Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala 
              370                 375                 380                 
          Ser Val Glu Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Ser Arg Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu Gly Ser 
                          405                 410                 415     
          Gly 
          <![CDATA[<210>  144]]>
          <![CDATA[<211>  376]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  144]]>
          Met Glu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Gly Thr Phe Ala Ile Arg Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Ile Leu Cys Gln Asp Asn Pro Ser His Asn Val Phe Cys Ser Pro 
                      20                  25                  30          
          Val Ser Ile Ser Ser Ala Leu Ala Met Val Leu Leu Gly Ala Lys Gly 
                  35                  40                  45              
          Asn Thr Ala Thr Gln Met Ala Gln Ala Leu Ser Leu Asn Thr Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Asp Ile His Arg Ala Phe Gln Ser Leu Leu Thr Glu Val Asn Lys Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Thr Gln Tyr Leu Leu Arg Thr Ala Asn Arg Leu Phe Gly Glu Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Cys Gln Phe Leu Ser Thr Phe Lys Glu Ser Cys Leu Gln Phe Tyr 
                      100                 105                 110         
          His Ala Glu Leu Lys Glu Leu Ser Phe Ile Arg Ala Ala Glu Glu Ser 
                  115                 120                 125             
          Arg Lys His Ile Asn Thr Trp Val Ser Lys Lys Thr Glu Gly Lys Ile 
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Ile Asp Ala Glu Thr Arg Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Val Asn Ala Ile Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Asn Glu Pro Phe Asp 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Tyr Thr Arg Glu Met Pro Phe Lys Ile Asn Gln Glu Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Arg Pro Val Gln Met Met Tyr Gln Glu Ala Thr Phe Lys Leu Ala His 
                  195                 200                 205             
          Val Gly Glu Val Arg Ala Gln Leu Leu Glu Leu Pro Tyr Ala Arg Lys 
              210                 215                 220                 
          Glu Leu Ser Leu Leu Val Leu Leu Pro Asp Asp Gly Val Glu Leu Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Val Glu Lys Ser Leu Thr Phe Glu Lys Leu Thr Ala Trp Thr Lys 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Cys Met Lys Ser Thr Glu Val Glu Val Leu Leu Pro Lys Phe 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Gln Glu Asp Tyr Asp Met Glu Ser Val Leu Arg His Leu Gly 
                  275                 280                 285             
          Ile Val Asp Ala Phe Gln Gln Gly Lys Ala Asp Leu Ser Ala Met Ser 
              290                 295                 300                 
          Ala Glu Arg Asp Leu Cys Leu Ser Lys Phe Val His Lys Ser Phe Val 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Val Asn Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ser Cys Phe 
                          325                 330                 335     
          Val Val Ala Glu Cys Cys Met Glu Ser Gly Pro Arg Phe Cys Ala Asp 
                      340                 345                 350         
          His Pro Phe Leu Phe Phe Ile Arg His Asn Arg Ala Asn Ser Ile Leu 
                  355                 360                 365             
          Phe Cys Gly Arg Phe Ser Ser Pro 
              370                 375     
          <![CDATA[<210>  145]]>
          <![CDATA[<211>  1203]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  145]]>
          ggctccggtg cccgtgtgcg gaccgggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc       60
          gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag      120
          gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg      180
          tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt      240
          tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg      300
          ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cactggctgc agtacgtgat tcttgatccc      360
          gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg      420
          cctcgtgctt gagttgaggc ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg      480
          caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga      540
          cctgctgcga cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca agatctgcac      600
          actggtattt cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca      660
          tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa      720
          gctggccggc ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg      780
          gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct      840
          gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc      900
          acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac      960
          cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt     1020
          tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt     1080
          aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct     1140
          tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg     1200
          tga                                                                   1203
          <![CDATA[<210>  146]]>
          <![CDATA[<211>  873]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  146]]>
          atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact       60
          gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc      120
          aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag      180
          gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc      240
          tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag      300
          atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt      360
          gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga      420
          attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac      480
          cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc      540
          accaccaatt ccaagagaga ggagaaactt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac      600
          acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat      660
          acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac      720
          ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt      780
          ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag      840
          aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa                                   873
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  147]]>
          aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca       60
          aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct      120
          ta                                                                     122
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  10645]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac       60
          ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa      120
          tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact      180
          atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc      240
          ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat      300
          gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgggtcgag      360
          gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg      420
          tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc      480
          gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc      540
          agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg      600
          gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc      660
          cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca      720
          ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg      780
          gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg      840
          cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg      900
          gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg      960
          cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg     1020
          ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg     1080
          cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag ttgctgagca cggcccggct     1140
          tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg     1200
          cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag     1260
          gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc     1320
          ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc     1380
          gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc     1440
          ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc     1500
          catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg acggctgcct tcggggggga cggggcaggg     1560
          cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac catgttcatg     1620
          ccttcttctt tttcctacag gggggatccg tttatctgca gaattcgccc ttgacgtcgc     1680
          caccatggaa actctttcta atgcaagtgg tacttttgcc atacgccttt taaagatact     1740
          gtgtcaagat aacccttcgc acaacgtgtt ctgttctcct gtgagcatct cctctgccct     1800
          ggccatggtt ctcctagggg caaagggaaa caccgcaacc cagatggccc aggcactgtc     1860
          tttaaacaca gaggaagaca ttcatcgggc tttccagtcg cttctcactg aagtgaacaa     1920
          ggctggcaca cagtacctgc tgagaacggc caacaggctc tttggagaga aaacttgtca     1980
          gttcctctca acgtttaagg aatcctgtct tcaattctac catgctgagc tgaaggagct     2040
          ttcctttatc agagctgcag aagagtccag gaaacacatc aacacctggg tctcaaaaaa     2100
          gaccgaaggt aaaattgaag agttgttgcc gggtagctca attgatgcag aaaccaggct     2160
          ggttcttgtc aatgccatct acttcaaagg aaagtggaat gaaccgtttg acgaaacata     2220
          cacaagggaa atgcccttta aaataaacca ggaggagcaa aggccagtgc agatgatgta     2280
          tcaggaggcc acgtttaagc tcgcccacgt gggcgaggtg cgcgcgcagc tgctggagct     2340
          gccctacgcc aggaaggagc tgagcctgct ggtgctgctg cctgacgacg gcgtggagct     2400
          cagcacggtg gaaaaaagtc tcacttttga gaaactcaca gcctggacca agccagactg     2460
          tatgaagagt actgaggttg aagttctcct tccaaaattt aaactacaag aggattatga     2520
          catggaatct gtgcttcggc atttgggaat tgttgatgcc ttccaacagg gcaaggctga     2580
          cttgtcggca atgtcagcgg agagagacct gtgtctgtcc aagttcgtgc acaagagttt     2640
          tgtggaggtg aatgaagaag gcaccgaggc agcggcagcg tcgagctgct ttgtagttgc     2700
          agagtgctgc atggaatctg gccccaggtt ctgtgctgac caccctttcc ttttcttcat     2760
          caggcacaac agagccaaca gcattctgtt ctgtggcagg ttctcatcgc caggaagcgg     2820
          agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat     2880
          ggactggacc tggatcctgt tcctggtggc cgccgccacc agggtgcaca gcggcattca     2940
          tgtcttcatt ttgggctgtt tcagtgcagg gcttcctaaa acagaagcca actgggtgaa     3000
          tgtaataagt gatttgaaaa aaattgaaga tcttattcaa tctatgcata ttgatgctac     3060
          tttatatacg gaaagtgatg ttcaccccag ttgcaaagta acagcaatga agtgctttct     3120
          cttggagtta caagttattt cacttgagtc cggagatgca agtattcatg atacagtaga     3180
          aaatctgatc atcctagcaa acaacagttt gtcttctaat gggaatgtaa cagaatctgg     3240
          atgcaaagaa tgtgaggaac tggaggaaaa aaatattaaa gaatttttgc agagttttgt     3300
          acatattgtc caaatgttca tcaacacttc tagcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag     3360
          cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc agcctgcaga tcacgtgccc     3420
          tccccccatg tccgtggaac acgcagacat ctgggtcaag agctacagct tgtactccag     3480
          ggagcggtac atttgtaact ctggtttcaa gcgtaaagcc ggcacgtcca gcctgacgga     3540
          gtgcgtgttg aacaaggcca cgaatgtcgc ccactggaca acccccagtc tcaaatgcat     3600
          tagagaccct gccctggttc accaaaggcc agcgccaccc tccacagtaa cgacggcagg     3660
          ggtgacccca cagccagaga gcctctcccc ttctggaaaa gagcccgcag cttcatctcc     3720
          cagctcaaac aacacagcgg ccacaacagc agctattgtc ccgggctccc agctgatgcc     3780
          ttcaaaatca ccttccacag gaaccacaga gataagcagt catgagtcct cccacggcac     3840
          cccctctcag acaacagcca agaactggga actcacagca tccgcctccc accagccgcc     3900
          aggtgtgtat ccacagggcc acagcgacac cactgtggct atctccacgt ccactgtcct     3960
          gctgtgtggg ctgagcgctg tgtctctcct ggcatgctac ctcaagtcaa ggcaaactcc     4020
          cccgctggcc agcgttgaaa tggaagccat ggaggctctg ccggtgactt gggggaccag     4080
          cagcagagat gaagacttgg aaaactgctc tcaccaccta tgataaccgc tgatcagcct     4140
          cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga     4200
          ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt     4260
          gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg     4320
          attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatgggt cgacccagcg     4380
          tgagtctctc ctaccctccc gctctggtcc ttcctctccc gctctgcacc ctctgtggcc     4440
          ctcgctgtgc tctctcgctc cgtgacttcc cttctccaag ttctccttgg tggcccgccg     4500
          tggggctagt ccagggctgg atctcgggga agcggcgggg tggcctggga gtggggaagg     4560
          gggtgcgcac ccgggacgcg cgctacttgc ccctttcggc ggggagcagg ggagaccttt     4620
          ggcctacggc gacgggaggg tcgggacaaa gtttagggcg tcgataagcg tcagagcgcc     4680
          gaggttgggg gagggtttct cttccgctct ttcgcggggc ctctggctcc cccagcgcag     4740
          ctggagtggg ggacgggtag gctcgtccca aaggcgcggc gctgaggttt gtgaacgcgt     4800
          ggaggggcgc ttggggtctg ggggaggcgt cgcccgggta agcctgtctg ctgcggctct     4860
          gcttccctta gactggagag ctgtggactt cgtctaggcg cccgctaagt tcgcatgtcc     4920
          tagcacctct gggtctatgt ggggccacac cgtggggagg aaacagcacg cgacgtttgt     4980
          agaatgcttg gctgtgatac aaagcggttt cgaataatta acttatttgt tcccatcaca     5040
          tgtcactttt aaaaaattat aagaactacc cgttattgac atctttctgt gtgccaagga     5100
          ctttatgtgc tttgcgtcat ttaattttga aaacagttat cttccgccat agataactac     5160
          tatggttatc ttctggtaac cacgtgcgga ccgggctccg gtgcccgtgt gcggaccggg     5220
          ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg     5280
          aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga     5340
          tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt     5400
          agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt     5460
          gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac     5520
          ttccactggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc gggttggaag tgggtgggag     5580
          agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg cttgagttga ggcctggcct     5640
          gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc gcgcctgtct cgctgctttc     5700
          gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg cgacgctttt tttctggcaa     5760
          gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta tttcggtttt tggggccgcg     5820
          ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg cgaggcgggg cctgcgagcg     5880
          cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc ggcctgctct ggtgcctggc     5940
          ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc tggcccggtc ggcaccagtt     6000
          gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag ggagctcaaa atggaggacg     6060
          cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaaaagggc ctttccgtcc     6120
          tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc cgtccaggca cctcgattag     6180
          ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg aggggtttta tgcgatggag     6240
          tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag cttggcactt gatgtaattc     6300
          tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca ttctcaagcc tcagacagtg     6360
          gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgacttg acgtcgccac catgaggata     6420
          tttgctgtct ttatattcat gacctactgg catttgctga acgcatttac tgtcacggtt     6480
          cccaaggacc tatatgtggt agagtatggt agcaatatga caattgaatg caaattccca     6540
          gtagaaaaac aattagacct ggctgcacta attgtctatt gggaaatgga ggataagaac     6600
          attattcaat ttgtgcatgg agaggaagac ctgaaggttc agcatagtag ctacagacag     6660
          agggcccggc tgttgaagga ccagctctcc ctgggaaatg ctgcacttca gatcacagat     6720
          gtgaaattgc aggatgcagg ggtgtaccgc tgcatgatca gctatggtgg tgccgactac     6780
          aagcgaatta ctgtgaaagt caatgcccca tacaacaaaa tcaaccaaag aattttggtt     6840
          gtggatccag tcacctctga acatgaactg acatgtcagg ctgagggcta ccccaaggcc     6900
          gaagtcatct ggacaagcag tgaccatcaa gtcctgagtg gtaagaccac caccaccaat     6960
          tccaagagag aggagaaact tttcaatgtg accagcacac tgagaatcaa cacaacaact     7020
          aatgagattt tctactgcac ttttaggaga ttagatcctg aggaaaacca tacagctgaa     7080
          ttggtcatcc cagaactacc tctggcacat cctccaaatg aaaggactca cttggtaatt     7140
          ctgggagcca tcttattatg ccttggtgta gcactgacat tcatcttccg tttaagaaaa     7200
          gggagaatga tggatgtgaa aaaatgtggc atccaagata caaactcaaa gaagcaaagt     7260
          gatacacatt tggaggagac gtaaccgctg atcagcctcg aaacttgttt attgcagctt     7320
          ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac     7380
          tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaggcgcct gatgcggtat     7440
          tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac agtactgtca aagcaaccat     7500
          agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga     7560
          ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg     7620
          ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat     7680
          ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg     7740
          ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata     7800
          gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt     7860
          tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat     7920
          ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa     7980
          tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc     8040
          cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga     8100
          gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg     8160
          tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac     8220
          agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc gcgattaaat     8280
          tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca     8340
          ggtgcgacaa tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat     8400
          ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg     8460
          gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta     8520
          ctcaccactg cgatccccgg aaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca     8580
          ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt     8640
          tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg     8700
          aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa     8760
          caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat     8820
          ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat     8880
          gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc     8940
          ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct     9000
          gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc tcatgaccaa     9060
          aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg     9120
          atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc     9180
          gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac     9240
          tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca     9300
          ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt     9360
          ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc     9420
          ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg     9480
          aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc     9540
          cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac     9600
          gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct     9660
          ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc     9720
          cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgtgcgg     9780
          ccgcacgcgt gttctagggt ggaaactaag agaatgatgt acctagaggg cgctggaagc     9840
          tctaaagccc tagcagttac tgcttttact attagtggtc gtttttttct cccccccgcc     9900
          ccccgacaaa tcaacagaac aaagaaaatt acctaaacag caaggacata gggaggaact     9960
          tcttggcaca gaactttcca aacacttttt cctgaaggga tacaagaagc aagaaaggta    10020
          ctctttcact aggaccttct ctgagctgtc ctcaggatgc ttttgggact atttttctta    10080
          cccagagaat ggagaaaccc tgcagggaat tcccaagctg tagttataaa cagaagttct    10140
          ccttctgcta ggtagcattc aaagatctta atcttctggg tttccgtttt ctcgaatgaa    10200
          aaatgcaggt ccgagcagtt aactggctgg ggcaccatta gcaagtcact tagcatctct    10260
          ggggccagtc tgcaaagcga gggggcagcc ttaatgtgcc tccagcctga agtcctagaa    10320
          tgagcgcccg gtgtcccaag ctggggcgcg caccccagat cggagggcgc cgatgtacag    10380
          acagcaaact cacccagtct agtgcatgcc ttcttaaaca tcacgagact ctaagaaaag    10440
          gaaactgaaa acgggaaagt ccctctctct aacctggcac tgcgtcgctg gcttggagac    10500
          aggtgacggt ccctgcgggc cttgtcctga ttggctgggc acgcgtttaa tataagtgga    10560
          ggcgtcgcgc tggcgggcat tcctgaagct aagcttgtgg acgatatcga attcgcacga    10620
          cattgattat tgactagtta ttaat                                          10645
          <![CDATA[<210>  149]]>
          <![CDATA[<211>  1178]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  149]]>
          ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg       60
          ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt      120
          gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca      180
          gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc      240
          gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt      300
          acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg      360
          agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc      420
          ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt      480
          tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc      540
          aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg      600
          cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag      660
          cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg      720
          gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag      780
          ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga      840
          cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt      900
          cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt      960
          agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg     1020
          agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat     1080
          tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag     1140
          tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga                             1178
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
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Claims (80)

  1. 一種工程化細胞，該工程化細胞包含： (a) 破壞的 β-2- 微球蛋白（ B2M）基因；以及 (b) 在該破壞的 B2M基因中之第一多核苷酸和第二多核苷酸的插入，其中該第一多核苷酸編碼SERPINB9蛋白，並且該第二多核苷酸編碼介白素-15（IL15）與介白素-15受體亞基α（IL15Rα）之融合蛋白； 其中該細胞表現該SERPINB9蛋白以及該IL15與IL15Rα之融合蛋白，並且該細胞具有破壞的B2M表現。
  2. 如請求項1所述之工程化細胞，其中該破壞的B2M表現包括降低或消除的B2M表現。
  3. 如請求項1或2所述之工程化細胞，其中該第一多核苷酸藉由P2A肽編碼序列與該第二多核苷酸連接，使得該插入包括SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體。
  4. 如請求項3所述之工程化細胞，其中該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體包含基本上由SEQ ID NO: 137組成之多核苷酸序列。
  5. 如請求項3或4所述之工程化細胞，其中該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體可操作地連接到選自CAG、CMV、EF1α、PGK或UBC啟動子的外源啟動子。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之工程化細胞，該工程化細胞進一步包含破壞的 II 類主要組織相容性複合體反式啟動子（ CIITA）基因，其中該細胞具有破壞的CIITA表現。
  7. 如請求項6所述之工程化細胞，其中該破壞的CIITA表現包括降低或消除的CIITA表現。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之工程化細胞，該工程化細胞進一步包含編碼嵌合抗原受體（CAR）的第三多核苷酸的插入，其中該細胞表現該CAR。
  9. 如請求項8所述之工程化細胞，其中該CAR係抗CD30 CAR、抗BCMA CAR、抗GPC3 CAR、抗CD19 CAR、抗CD33 CAR、抗NKG2D CAR、抗CD70 CAR、抗NKp30 CAR、抗CD73 CAR、抗GPR87 CAR、抗L1V1A CAR、抗A33 CAR、抗EGFR CAR、抗CD20 CAR、或抗SLC7A11 CAR，視需要其中該CAR係抗CD30 CAR。
  10. 如請求項8或9所述之工程化細胞，其中編碼該CAR的該第三多核苷酸包含基本上由SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 112或SEQ ID NO: 116組成之多核苷酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之工程化細胞，該工程化細胞進一步包含編碼人白血球抗原E（HLA-E）三聚體的第四多核苷酸的插入，並且該細胞進一步表現該HLA-E三聚體。
  12. 如請求項11所述之工程化細胞，其中該HLA-E三聚體包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
  13. 如請求項8至12中任一項所述之工程化細胞，其中該第三多核苷酸和該第四多核苷酸被插入該破壞的 CIITA基因中。
  14. 如請求項13所述之工程化細胞，其中該第三多核苷酸藉由P2A肽編碼序列與該第四多核苷酸連接，使得該插入包括CAR-P2A-HLA-E構建體。
  15. 如請求項14所述之工程化細胞，其中該CAR-P2A-HLA-E構建體包含基本上由SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120或SEQ ID NO: 121組成之多核苷酸序列。
  16. 如請求項14或15所述之工程化細胞，其中該CAR-P2A-HLA-E構建體可操作地連接到選自CAG、CMV、EF1α、PGK或UBC啟動子的外源啟動子。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之工程化細胞，該工程化T細胞進一步包含破壞的 細胞介素誘導型含 SH2 蛋白（ CISH ）基因，其中該細胞具有破壞的CISH表現。
  18. 如請求項17所述之工程化細胞，其中該破壞的CISH表現包括降低或消除的CISH表現。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之工程化細胞，該工程化T細胞進一步包含破壞的 Fas 細胞表面死亡受體（ FAS）基因，其中該細胞具有破壞的FAS表現。
  20. 如請求項19所述之工程化細胞，其中該破壞的FAS表現包括降低或消除的FAS表現。
  21. 一種工程化細胞，該工程化細胞包含： (a) 破壞的 B2M基因； (b) 第一多核苷酸和第二多核苷酸的插入，視需要其中該第一多核苷酸和該第二多核苷酸被插入該破壞的 B2M基因中，其中該第一多核苷酸編碼SERPINB9，並且該第二多核苷酸編碼介白素-15（IL15）與介白素-15受體亞基α（IL15Rα）之融合蛋白； (c) 破壞的 CIITA基因； (d) 編碼CAR的第三多核苷酸和編碼HLA-E的第四多核苷酸的插入，視需要其中該CAR和該HLA-E被插入該破壞的 CIITA基因中； (e) 破壞的 CISH基因，和 (f) 破壞的 FAS基因； 其中該細胞表現該SERPINB9蛋白、該IL15與IL15Rα之融合蛋白、該CAR和HLA-E三聚體，並且該細胞具有破壞的B2M、CIITA、CISH和FAS表現。
  22. 如請求項21所述之工程化細胞，其中該破壞的B2M、CIITA、CISH和FAS表現包括降低或消除的B2M、CIITA、CISH和/或FAS表現。
  23. 如請求項22或23所述之工程化細胞，其中該CAR係抗CD30 CAR、抗BCMA CAR、抗GPC3 CAR、抗CD19 CAR、抗CD33 CAR、抗NKG2D CAR、抗CD70 CAR、抗NKp30 CAR、抗CD73 CAR、抗GPR87 CAR、抗L1V1A CAR、抗A33 CAR、抗EGFR CAR、抗CD20 CAR、或抗SLC7A11 CAR，視需要其中該CAR係抗CD30 CAR。
  24. 一種用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送： (a) 第一RNA引導的核酸酶和靶向 B2M基因座中的靶位點的第一gRNA；以及 (b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼SERPINB9蛋白的核苷酸序列和編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白的核苷酸序列；(ii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)； 其中該 B2M基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該SERPINB9蛋白的該核苷酸序列和編碼該IL15與IL15Rα之融合蛋白的該核苷酸序列被插入該 B2M基因座中，從而破壞該 B2M基因。
  25. 如請求項24所述之體外方法，其中該第一RNA引導的核酸酶係Cas9核酸酶，並且該第一gRNA包含對應於基本上由SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79組成之靶序列的間隔子序列，視需要其中該第一gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 34組成之靶序列的間隔子序列。
  26. 如請求項24或25所述之體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的B2M表現。
  27. 如請求項24至26中任一項所述之體外方法，其中 (b) (i) 的該核苷酸序列包含SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體，其中編碼該SERPINB9蛋白的該核苷酸序列藉由P2A肽序列與編碼該IL15與IL15Rα之融合蛋白的該核苷酸序列連接。
  28. 如請求項27所述之體外方法，其中該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體包含基本上由SEQ ID NO: 137組成的核苷酸序列。
  29. 如請求項27或28所述之體外方法，其中該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體可操作地連接到外源啟動子，其中該外源啟動子係CAG、CMV、EF1α、PGK或UBC啟動子，視需要其中該SERPINB9-P2A-IL15/IL15Rα構建體可操作地連接到CAG啟動子。
  30. 如請求項24至29中任一項所述之體外方法，其中該第一載體包含基本上由SEQ ID NO: 148組成的核苷酸序列。
  31. 如請求項24至30中任一項所述之體外方法，其中 (b) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 36組成，並且 (b) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 54組成。
  32. 如請求項24至31中任一項所述之體外方法，該方法進一步包括向該細胞遞送： (c) 第二RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的第二gRNA；以及 (d) 包含核酸的第二載體，該核酸包含：(i) 編碼嵌合抗原受體（CAR）的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)；並且 其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該CAR的該核苷酸序列被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因。
  33. 如請求項32所述之體外方法，其中該第二RNA引導的核酸酶係Cas9核酸酶，並且該第二gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17組成之靶序列的間隔子序列，視需要其中該第二gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 13組成之靶序列的間隔子序列。
  34. 如請求項32或33所述之體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的CIITA表現。
  35. 如請求項32至34中任一項所述之體外方法，其中該CAR係抗CD30 CAR、抗BCMA CAR、抗GPC3 CAR、抗CD19 CAR、抗CD33 CAR、抗NKG2D CAR、抗CD70 CAR、抗NKp30 CAR、抗CD73 CAR、抗GPR87 CAR、抗L1V1A CAR、抗A33 CAR、抗EGFR CAR、抗CD20 CAR、或抗SLC7A11 CAR，視需要其中該CAR係抗CD30 CAR。
  36. 如請求項32至35中任一項所述之體外方法，其中編碼該CAR的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 112或SEQ ID NO: 116組成。
  37. 如請求項32至36中任一項所述之體外方法，其中 (d) (i) 的該核苷酸序列進一步包含編碼HLA-E三聚體的核苷酸序列。
  38. 如請求項37所述之體外方法，其中該HLA-E三聚體包含與HLA-G呈遞肽融合的B2M訊息肽，該HLA-G呈遞肽與B2M膜蛋白融合，該B2M膜蛋白與HLA-E蛋白融合而無訊息肽。
  39. 如請求項37或38所述之體外方法，其中 (d) (i) 的該核苷酸序列包含CAR-P2A-HLA-E構建體，其中編碼該CAR的該核苷酸序列藉由P2A肽序列與編碼該HLA-E三聚體的該核苷酸序列連接。
  40. 如請求項39所述之體外方法，其中該CAR-P2A-HLA-E構建體具有基本上由SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120或SEQ ID NO: 121組成的核苷酸序列。
  41. 如請求項37至40所述之體外方法，其中該CAR-P2A-HLA-E構建體可操作地連接到外源啟動子，其中該外源啟動子係CAG、CMV、EF1α、PGK或UBC啟動子，視需要其中該CAR-P2A-HLA-E構建體可操作地連接到CAG啟動子。
  42. 如請求項37至41中任一項所述之體外方法，其中該第二載體包含基本上由SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 114或SEQ ID NO: 118組成的核苷酸序列。
  43. 如請求項32至42中任一項所述之體外方法，其中 (d) (ii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 22組成，並且 (d) (iii) 的該核苷酸序列基本上由SEQ ID NO: 32組成。
  44. 如請求項24至43中任一項所述之體外方法，該方法進一步包括向該細胞遞送第三RNA引導的核酸酶和靶向 CISH基因座中的靶位點的第三gRNA；其中該 CISH基因座在該靶位點處被切割，並且至少一個插入-缺失突變被引入到該 CISH基因中，從而破壞該 CISH基因。
  45. 如請求項44所述之體外方法，其中該第三RNA引導的核酸酶係Cas9核酸酶，並且該第三gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91或SEQ ID NO: 92組成之靶序列的間隔子序列，視需要其中該第三gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 82組成之序列的間隔子序列。
  46. 如請求項44或45所述之體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的CISH表現。
  47. 如請求項24至46中任一項所述之體外方法，該方法進一步包括向該細胞遞送第四RNA引導的核酸酶和靶向 FAS基因座中的靶位點的第四gRNA，其中該 FAS基因座在該靶位點處被切割，並且至少一個插入-缺失突變被引入到該 FAS基因中，從而破壞該 FAS基因。
  48. 如請求項47所述之體外方法，其中該第四RNA引導的核酸酶係Cas9核酸酶，並且該第四gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55或SEQ ID NO: 80組成之靶序列的間隔子序列，視需要其中該第四gRNA包含對應於由SEQ ID NO: 37組成之序列的間隔子序列。
  49. 如請求項47或48所述之體外方法，其中該工程化細胞具有降低或消除的FAS表現。
  50. 一種用於生成工程化細胞的體外方法，該方法包括向細胞遞送： (a) 第一RNA引導的核酸酶和靶向 B2M基因座中的靶位點的第一gRNA； (b) 包含核酸的第一載體，該核酸包含：(i) 編碼SERPINB9蛋白的核苷酸序列和編碼IL15與IL15Rα之融合蛋白的核苷酸序列；(ii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 B2M基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和 (iii)； (c) 第二RNA引導的核酸酶和靶向 CIITA基因座中的靶位點的第二gRNA； (d) 包含核酸的第二載體，該核酸包含：(i) 編碼CAR的核苷酸序列和編碼HLA-E三聚體的核苷酸序列；(ii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點左側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列；和 (iii) 與位於該 CIITA基因座中的該靶位點右側的基因組區域具有序列同源性的核苷酸序列，其中 (i) 之側翼係 (ii) 和(iii)； (e) 第三RNA引導的核酸酶和靶向 CISH基因座中的靶位點的第三gRNA；以及 (f) 第四RNA引導的核酸酶和靶向 FAS基因座中的靶位點的第四gRNA； 其中該 B2M基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該SERPINB9蛋白的該核苷酸序列和編碼該IL15與IL15Rα之融合蛋白的該核苷酸序列被插入該 B2M基因座中，從而破壞該 B2M基因； 其中該 CIITA基因座在該靶位點處被切割，並且編碼該CAR的該核苷酸序列和編碼該HLA-E三聚體的該核苷酸序列被插入該 CIITA基因座中，從而破壞該 CIITA基因； 其中該 CISH基因座在該靶位點處被切割，並且至少一個插入-缺失突變被引入到該 CISH基因中，從而破壞該 CISH基因；並且 其中該 FAS基因座在該靶位點處被切割，並且至少一個插入-缺失突變被引入到該 FAS基因中，從而破壞該 FAS基因。
  51. 如請求項50所述之體外方法，其中該CAR係抗CD30 CAR、抗BCMA CAR、抗GPC3 CAR、抗CD19 CAR、抗CD33 CAR、抗NKG2D CAR、抗CD70 CAR、抗NKp30 CAR、抗CD73 CAR、抗GPR87 CAR、抗L1V1A CAR、抗A33 CAR、抗EGFR CAR、抗CD20 CAR、或抗SLC7A11 CAR，視需要其中該CAR係抗CD30 CAR。
  52. 如請求項50或51所述之體外方法，其中該細胞表現該SERPINB9蛋白、該IL15與IL15Rα之融合蛋白、該CAR和該HLA-E三聚體，並且該細胞具有降低或消除的B2M、CIITA、CISH和FAS表現。
  53. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞係幹細胞，視需要其中該幹細胞係誘導多能幹細胞（iPSC）、造血幹細胞、胚胎幹細胞或成體幹細胞。
  54. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞係經基因組編輯的iPSC。
  55. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞係分化細胞或體細胞。
  56. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞能夠分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
  57. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞係自然殺手（NK）細胞。
  58. 如請求項57所述之工程化細胞，其中該NK細胞已從經基因組編輯的iPSC分化，其中該NK細胞包含該經基因組編輯的iPSC的基因組編輯，視需要其中該NK細胞在該分化後沒有被基因組編輯。
  59. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞表現以下標誌物中的至少一種、兩種、三種、四種或五種：CD56、NKp44、NKp46、CD94、NKG2A和KIR2DL4，並且視需要其中該等標誌物相對於它們在野生型NK細胞中之表現以至少25%、30%、40%、50%或75%的水平表現。
  60. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞具有以下特徵中的至少一個或其任何組合：(i) 相對於未修飾的細胞，同種免疫T細胞反應小於10%，以及 (ii) 當該等工程化細胞與靶細胞以1 : 1的比率混合時，細胞毒活性導致殺傷超過50%的靶細胞；(iii) 相對於未修飾的細胞，細胞活力增加至少50%。
  61. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞具有以下特徵中的至少一個或其任何組合：(i) 改善的持久性，(ii) 改善的免疫逃避性，(iii) 改善的細胞毒活性，(iv) 改善的ADCC活性，和 (v) 改善的抗腫瘤活性；其中相對於野生型細胞，視需要相對於野生型iPSC或野生型NK細胞，該等特徵得到改善。
  62. 如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，其中該工程化細胞能夠在細胞培養基中不存在外源IL15的情況下進行細胞擴增。
  63. 多個如請求項53至62中任一項所述之工程化細胞。
  64. 一種可從如請求項63所述之多個工程化細胞獲得的譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的群體。
  65. 如請求項64所述之細胞群體，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34+細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞，並且該等完全分化體細胞係造血細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
  66. 如請求項65所述之細胞群體，其中該等造血細胞係NK細胞、T細胞、B細胞或NKT細胞，視需要其中該等造血細胞係人NK細胞。
  67. 如請求項66所述之細胞群體，其中該群體的工程化人NK細胞當與癌細胞群體在體外共培養時誘導至少70%、至少80%或至少90%的該癌細胞群體的細胞裂解。
  68. 如請求項66或67所述之細胞群體，其中該群體的工程化人NK細胞當與癌細胞群體在體外共培養時分泌IFNγ。
  69. 如請求項67或68所述之細胞群體，其中工程化人NK細胞與癌細胞的比率為0.1 : 1至2 : 1。
  70. 如請求項63所述之該多個細胞或如請求項64至68中任一項所述之細胞群體，其中至少25%或至少50%的該等細胞表現該SERPINB9蛋白、該IL15與IL15Rα的融合體、該CAR和/或該HLA-E三聚體，並且至少50%的細胞不表現可檢測水平的B2M、CIITA、CISH和/或FAS。
  71. 一種組成物，該組成物包含如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞，以用作藥物。
  72. 一種組成物，該組成物包含可從如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞獲得的譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞的群體，以用作藥物。
  73. 如請求項71或72所述之組成物，其中該組成物係藥物組成物。
  74. 如請求項73所述之組成物用於治療癌症。
  75. 如請求項74所述之組成物，其中該癌症係多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、白血病、B細胞急性淋巴母細胞白血病（B-ALL）、B-細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NL）、慢性淋巴細胞白血病（C-CLL）、T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、透明細胞腎細胞癌（ccRCC）、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、胰臟癌、黑色素瘤、卵巢癌、神經膠質母細胞瘤或子宮頸癌。
  76. 如請求項74或75所述之組成物，其中人包括該癌症。
  77. 一種用於治療有需要的受試者之方法，該方法包括： (a) 獲得或已經獲得分化成譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞後的如請求項1至23中任一項所述之工程化細胞或藉由如請求項24至52中任一項所述之方法可獲得的工程化細胞；以及 (b) 向該受試者投與該等譜系限制性先驅細胞或完全分化體細胞。
  78. 如請求項77所述之方法，其中該等譜系限制性先驅細胞係造血先驅細胞、中胚層細胞、確定性生血內皮細胞、確定性造血幹細胞或先驅細胞、CD34+細胞、多能先驅細胞（MPP）、共同淋巴樣先驅細胞、T細胞先驅細胞、NK細胞先驅細胞、胰腺內胚層先驅細胞、胰腺內分泌先驅細胞、間充質先驅細胞、肌肉先驅細胞、胚細胞或神經先驅細胞，並且該等完全分化體細胞係造血細胞、胰腺β細胞、上皮細胞、內胚層細胞、巨噬細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、血細胞、心肌細胞或免疫系統細胞。
  79. 如請求項77或78所述之方法，其中該受試者患有癌症、懷疑患有癌症或有癌症風險。
  80. 如請求項77至79中任一項所述之方法，其中該受試者係人。
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