TW202229339A - 結合胸腺基質淋巴細胞生成素的抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明關於能結合胸腺基質淋巴細胞生成素的抗體及其應用。具體地，本發明關於抗TSLP抗體，其藥物組合物，以及其作為治療哮喘藥物的用途。
Description
本發明要求申請日為2020/12/3的中國專利申請202011412850.4的優先權。本發明引用上述中國專利申請的全文。
本發明關於抗體藥物領域，具體地本發明關於抗TSLP抗體藥物以及其應用。
這裡的陳述僅提供與本發明有關的背景訊息，而不必然地構成現有技術。
哮喘是嚴重的氣道慢性炎症疾病，全球約有3.34億哮喘病人。隨著環境惡化和空氣污染加劇，可能會有更多人罹患此病，嚴重危害人類的生命健康。
TSLP是一種類白細胞介素7（IL-7）細胞因子，最早從小鼠的胸腺基質細胞條件培養基中發現。TSLP主要在肺、皮膚和腸道上皮細胞中表現。TSLP由4個α-螺旋以及AB和CD兩個環組成，分子內有三對由六個半胱氨酸組成的二硫鍵，有兩個N糖基化位點，分子量約為15-20kD。TSLP的受體是個複合物，包括兩部分，一部分為TSLPR，另一部分為IL7Rα。TSLP先與TSLPR以相對較低的親和力結合，然後以高親和力招募IL7Rα的結合，最終活化stat5等訊息通路，導致DC的成熟和T細胞的分化。
骨髓源性樹突狀細胞（myeloid dendritic cell，mDC）是TSLP最主要的效應細胞，TSLP作用於未成熟的mDC，mDC分泌細胞因子IL-8，eotaxin-2，TARC和MDC，同時高表現OX40L，在沒有IL-12的前提下，OX40L與天然CD4
+T細胞結合，使其分化成Th2細胞，進而Th2細胞分泌IL-5、IL-4、IL-9，IL-13和TNF等Th2細胞因子，誘導機體Th2炎症反應。另外，TSLP還可以誘導DC細胞產生細胞因子IL-8，進而招募嗜中性球，導致嗜中性球天然免疫炎症。TSLP還可以誘導DC產生eotaxin-2，eotaxin-2招募嗜酸性球，和IL5一起作用，使機體迅速進入嗜酸性球浸潤的炎症狀態。TSLP也作用於肥大細胞、自然殺手細胞，通過誘導產生IL-4、IL-6、IgE等介導天然炎症。綜上，TSLP可同時導致天然炎症和Th2炎症，進而使組織黏液增多，氣道重塑導致氣管狹窄，細胞纖維化嚴重，進而逐步演變成哮喘、過敏性皮炎和過敏性鼻炎等三大過敏性疾病。因此，阻斷TSLP對治療哮喘、過敏性皮炎等疾病是一個潛在的有效策略。
目前，WO2008155365、WO2009035577、WO2011056772、WO2016142426、WO2017004149公開了抗TSLP的抗體，但並沒有相應的抗體上市，因此，有必要繼續開發有效的治療TSLP相關疾病的藥物。
本發明提供一種抗TSLP抗體。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
i）重鏈可變區氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且輕鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
或
ii）重鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且輕鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
或
iii）重鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，輕鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其中所述抗TSLP抗體是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
所述重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14所示，或與SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14所示的序列具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，或與SEQ ID NO: 6具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14所示的重鏈可變區；和氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示的重鏈可變區；和氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區組合如下所示：
表1. 抗體的輕鏈和重鏈可變區的組合
| 抗體 | VH | VL |
| Ab-1 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 6 |
| Ab-2 | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 6 |
| Ab-6 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 7 |
| Ab-9 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 8 |
| Ab-25 | SEQ ID NO: 15 | SEQ ID NO: 6 |
| Ab-27 | SEQ ID NO: 16 | SEQ ID NO: 6 |
| Ab-14 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 6 |
| Ab-23 | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 6 |
| Ab-24 | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 6 |
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其中所述抗體進一步包含抗體恆定區。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，所述抗體的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體，所述抗體的輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其常規變體。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 34所示的重鏈恆定區；和/或氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體包含重鏈和輕鏈，其中：
重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 39所示，或與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 39所示的序列具有至少85%的序列同一性；且
輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 37所示，或與SEQ ID NO: 37具有至少85%的序列同一性。
所述的至少85%序列同一性包括但不限於85%、86%、87%、88%、89%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在一些實施方案中，如前所述抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體包含：
如SEQ ID NO: 36的重鏈和SEQ ID NO: 37的輕鏈；或
如SEQ ID NO: 38的重鏈和SEQ ID NO: 37的輕鏈；或
如SEQ ID NO: 39的重鏈和SEQ ID NO: 37的輕鏈。
在一些實施方案中，如前所述的抗TSLP抗體，其具有以下特性中的一種或多種：
a) 以小於9 pM的KD值與人TSLP結合；
b) 以小於0.6nM的IC50值阻斷TSLP與TSLPR的結合；或
c) 以小於9 pM的KD值與食蟹猴TSLP結合。
在一些實施方案中，如前所述的抗TSLP抗體，其以小於9pM、小於5pM或小於3pM的KD值與人TSLP結合。
在一些實施方案中，如前所述的抗TSLP抗體，其以小於9pM、小於5pM、小於3pM或小於2pM的KD值與食蟹猴TSLP結合。
在一些實施方案中，其中所述KD值可使用Biacore方法檢測獲得。
在一些實施方案中，其中所述KD值可參照測試例1中所述的方法測得。
在一些實施方案中，如前所述的抗TSLP抗體，其以小於0.6nM、小於4nM或小於2nM的IC50值阻斷TSLP與TSLPR的結合。
在一些實施方案中，其中所述的IC50值可以通過ELISA實驗測得。在一些實施方案中，其中所述的IC50值也可參照本發明的測試例2檢測。
在一些實施方案中，如前所述的抗TSLP抗體，其可以抑制TSLP誘導的天然CD4
+T細胞往Th2細胞的分化。
本發明還提供核酸分子，其編碼如前所述的抗TSLP抗體。
本發明還提供表現載體，其包含如前所述的核酸分子。
本發明還提供一種宿主細胞，其包含如如前所述的核酸分子或如前所述的表現載體；優選地，其中所述的宿主細胞為細菌、真菌細胞、昆蟲動物細胞或哺乳動物細胞。在一些實施方案中，其中所述哺乳動物包括但不限於293、CHO細胞；在一些實施方案中，其中所述的哺乳動物細胞不是人類胚胎細胞。
在一些實施方案中，本發明提供一種藥物組合物，其含有治療有效量的如前所述的抗TSLP抗體，或如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主細胞，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑；優選地，所述治療有效量為單位劑量的組合物中含有0.1-3000mg或1-1000mg如前所述的抗TSLP抗體。
在一些實施方案中，本發明提供一種製備如前所述的TSLP抗體的方法。
在一些實施方案中，本發明提供一種用於體外或離體免疫檢測或測定TSLP的方法，所述方法包括使用如前所述的抗TSLP抗體的步驟。
在一些實施方案中，本發明提供如前所述的抗TSLP抗體在製備免疫檢測人TSLP的試劑中的用途。
在一些實施方案中，本發明提供一種用於免疫檢測或測定TSLP的如前所述的抗TSLP抗體。
在一些實施方案中，本發明提供一種試劑盒，其包含如前所述的抗TSLP抗體。
在一些實施方案中，本發明提供如前所述的抗TSLP抗體，或如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主細胞，或如前所述的藥物組合物，其用於製備：
a. 治療TSLP相關炎症的藥物；或
b. 治療TSLP相關纖維化病症的藥物。
在一些實施方案中，前述的TSLP相關炎症包括但不限於過敏症、皮炎、哮喘、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎和過敏性鼻竇炎。
在一些實施方案中，前述的TSLP相關纖維化病症包括但不限於硬皮症、間質性肺病、特發性肺纖維化、B型或C型慢性肝炎引發的纖維化、輻射誘發的纖維化和傷口癒合引發的纖維化。
在一些實施方案中，本發明提供如前所述的抗TSLP抗體，或如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主細胞，或如前所述的藥物組合物在製備用於治療炎症疾病或纖維化疾病的藥物中的用途。
在一些實施方案中，本發明提供一種治療炎症疾病或纖維化疾病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的抗TSLP抗體，或如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主細胞或如前所述的藥物組合物。
在一些實施方案中，本發明提供一種用作藥物的如前所述的抗TSLP抗體，或如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主細胞。在一些實施方案中，其中所述的藥物用於治療炎症疾病或纖維化疾病。
在一些實施方案中，前述的炎症疾病包括但不限於過敏症、皮炎、哮喘、過敏性結膜炎、變應性鼻炎、嗜酸性球性胃腸炎、過敏性支氣管肺麴菌病、過敏性真菌鼻竇炎、慢性嗜酸性球性肺炎、嗜酸性球性支氣管炎、炎性腸病和過敏性鼻竇炎。
在一些實施方案中，前述的纖維化疾病包括但不限於硬皮症、間質性肺病、特發性肺纖維化、B型或C型慢性肝炎引發的纖維化、輻射誘發的纖維化和傷口癒合引發的纖維化。
在一些實施方案中，前述的炎症疾病或纖維化疾病與TSLP相關。
術語
本文所用的術語只是為了描述實施方案的目的，並非旨在進行限制。除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的意義。
說明書和申請專利範圍中所用的單數形式「一個」、「一種」和「所述」包括複數指代，除非上下文清楚表明並非如此。
除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語「包含」、「具有」、「包括」等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，「包括但不僅限於」的意義。
術語「和/或」，例如「X和/或Y」應當理解為意指「X和Y」或「X或Y」並且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。
本發明所用氨基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558（1968）中所述。
術語「胸腺基質淋巴細胞生成素（Thymic Stromal Lymphopoietin，TSLP）」是四α-螺旋束I型細胞因子，也是響應促炎症刺激而產生的上皮細胞衍生的細胞因子，與白細胞介素-7（IL-7）密切相關，其通過刺激樹突細胞（DC）起始變態反應，是調節人體免疫反應的重要因子。術語「TSLP」包括TSLP的變體、同種型、同系物、直系同源物和旁系同源物。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體，多特異性抗體（例如雙特異性抗體），全長抗體和抗體片段（或抗原結合片段，或抗原結合部分），只要它們展現出期望的抗原結合活性。
「天然抗體」指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫鍵結合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區（VH），又稱作可變重域，或重鏈可變域，接著是三個恆定域（CH1、CH2和CH3）。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區（VL），又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕域（CL）。
本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體和人源化抗體。
術語「可變區」或「可變域」指抗體重鏈或輕鏈中關於抗體結合抗原的域。VH和VL各包含四個保守的框架區（FR）和三個互補決定區（CDR）。其中，術語「互補決定區」、「CDR」指可變結構域內主要促成與抗原結合的區域；「框架」或「FR」是指除CDR殘基之外的可變結構域殘基。VH包含3個CDR區：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3個CDR區：LCDR1、LCDR2、和LCDR3。每個VH和VL由從氨基末端至羧基末端由按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。單個VH或VL可能足以賦予結合抗原的特異性。
可以通過各種公知方案來確定CDR的氨基酸序列邊界，例如：「Kabat」編號規則（參見Kabat等（1991），「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD）、「Chothia」編號規則、「AbM」編號規則、「contact」編號規則（參見Martin, ACR. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001）和ImMunoGenTics（IMGT）編號規則（Lefranc， M.P.等，Dev. Comp. Immunol.， 27，55-77（2003）；Front Immunol. 2018 Oct 16;9:2278）等。這些編號規則之間的關係是本發明所屬技術領域中具通常知識者熟知的，具體如下表2中所示。
表2.CDR編號系統之間的關係
| CDR | IMGT | Kabat | AbM | Chothia | Contact |
| HCDR1 | 27-38 | 31-35 | 26-35 | 26-32 | 30-35 |
| HCDR2 | 56-65 | 50-65 | 50-58 | 52-56 | 47-58 |
| HCDR3 | 105-117 | 95-102 | 95-102 | 95-102 | 93-101 |
| LCDR1 | 27-38 | 24-34 | 24-34 | 24-34 | 30-36 |
| LCDR2 | 56-65 | 50-56 | 50-56 | 50-56 | 46-55 |
| LCDR3 | 105-117 | 89-97 | 89-97 | 89-97 | 89-96 |
除非另有說明，本發明實施例中的可變區和CDR序列均適用「Kabat」編號規則。
抗體的「類」指其重鏈擁有的恆定區的類型。根據恆定區氨基酸序列，抗體輕鏈包括兩種類型，卡帕（κ）和拉姆達（λ）。根據抗體重鏈恆定區的氨基酸組成和排列順序不同，可將抗體分為五類，或稱為抗體同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
本發明中所述人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區的「常規變體」是指現有技術已公開的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體，示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和氨基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4重鏈恆定區變體。在一些實施方案中，所述替換是YTE突變，L234A和/或L235A突變，S228P突變，和/或獲得杵臼（knob-into-hole）結構的突變。這些突變已被證實使得抗體具有新的性能，但不改變抗體可變區的功能。在一些實施方案中，抗體是IgG1同種型的，具有鉸鏈區中的P329G、L234A和L235A突變以降低效應子功能。在一些實施方案中，抗體是IgG2同種型。在一些實施方案中，抗體是IgG4同種型的，具有鉸鏈區中的S228P突變以改善IgG4抗體的穩定性。
術語「抗體片段」指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，所述部分與完整抗體所結合的抗原相結合。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、單域抗體、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
術語「抗體框架」或「FR區」，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環（CDR）的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
術語「Fc區」或「片段可結晶區」用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然序列Fc區和變體Fc區。在一些實施方式中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的氨基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端（根據EU編號系統）。抗體重鏈的Fc區的邊界還可以變化，例如缺失Fc區的C末端賴氨酸（根據EU編號系統的殘基447）或缺失Fc區的C末端甘氨酸和賴氨酸（根據EU編號系統的殘基446和447）。因此，在一些實施方式中，完整抗體的組合物可以包括去除了所有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組合物可以包括沒有去除K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組合物具有帶有和不帶有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體混合物的抗體群體。用於本文所述抗體的合適天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2（IgG2A、IgG2B）、IgG3和IgG4。除非本文中另有規定，Fc區或恆定區中的氨基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU索引，如記載於Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
術語「嵌合」抗體指其中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分自不同來源或物種衍生的抗體。
術語「人源化」抗體是保留非人抗體的與抗原的結合活性，同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，這可以通過保留非人CDR區並用其人對應物（即，恆定區以及可變區的框架部分）替換抗體的其餘部分來實現。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區（例如自小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區）和人恆定區。在又一個例子中，嵌合抗體是「類轉換的」抗體，其中類或亞類已經自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多個可變區，其中CDR或其部分衍生自非人抗體，而FR或其部分衍生自人抗體。任選地，人源化抗體還會包含人恆定區。在一些實施方案中，將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體（例如提供CDR序列的抗體）的相應殘基替代，以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其生成方法綜述於如Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)，並且進一步記載於如Riechmann等，Nature 332:323-329 (1988)；Queen等，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)。
此外，可以通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體來分離本發明的抗體。用於篩選組合文庫的方法綜述於例如Lerner等，
Nature Reviews16:498-508 (2016)。在某些噬菌體展示方法中，將VH和VL基因的全集分別通過PCR複製，並在噬菌體文庫中隨機重組，然後可以用該噬菌體文庫篩選抗原結合噬菌體，如記載於Winter等，
Annual Review of Immunology12:433-455 (1994)的方法。噬菌體通常以scFv片段或以Fab片段展示抗體片段，免疫的文庫可提供針對免疫原的高親和力抗體，不需要構建雜交瘤。或者，可以複製未免疫全集（例如來自人的），以在沒有任何免疫接種的情況下提供針對大範圍非自身和自身抗原的抗體，如Griffiths等，
EMBO Journal12:725-734 (1993)描述的。此外，也可以通過自幹細胞複製未重排的V基因區段，並使用含有隨機序列的PCR引物擴增編碼高度可變的CDR3區，並在體外實現重排來合成生成未免疫文庫，如由Hoogenboom and Winter,
Journal of Molecular Biology, 227:381-388 (1992)所描述的。
術語「全長抗體」、「完整抗體」、「完全抗體」和「全抗體」在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與本文定義的抗原結合片段相區分。該術語特別指輕鏈和重鏈包含恆定區的抗體。
術語「單鏈抗體」、「單鏈Fv」或「scFv」意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域，VH)和抗體輕鏈可變結構域（或區域，VL）的分子。此類scFv 分子可具有一般結構：NH
2-VL-接頭-VH-COOH或NH
2-VH-接頭-VL-COOH。現有技術已公開眾多適於連接抗體VH和VL的接頭，例如由重複的GGGGS氨基酸序列或其變體組成，例如使用1-4 個重複的變體（Holliger等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448）。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
術語「抗原」是指能夠由諸如抗原結合蛋白（包括例如抗體）的選擇性結合劑結合，且能夠用於動物中以產生能夠結合該抗原的抗體的分子或分子部分。抗原可具有一個或多個能夠與不同的抗原結合蛋白（例如抗體）相互作用的表位。
術語「親和力」是指分子（例如，抗體）的單個結合部位與其結合配體（例如，抗原）之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，「結合親和力」是指內部結合親和力，其反映出結合對（例如，抗體與抗原）的成員之間1:1相互作用。分子X對其配體Y的親和力通常可以由解離常數（KD）表示。親和力可以通過本領域已知的常規方法（包括本文所述的那些）測量。
術語「特異性地結合」、「特異性結合」或「結合」是指抗體以比針對其他抗原或表位更高的親和力，結合至某個抗原或其表位。通常，抗體以約1×10
-7M或更小（例如約1×10
-8M或更小、約1×10
-9M或更小、約1×10
-10M或更小、約1×10
-11M或更小，或者約1×10
-12M或更小）的平衡解離常數（KD）結合抗原或其表位。在一些實施方式中，抗體與抗原結合的KD為該抗體結合至非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）的KD的10%，或1%。可使用標準程序來測量KD，例如通過BIACORE®表面等離子體共振測定法測量的。然而，特異性結合至抗原或其表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種（同源）（諸如人或猴，例如食蟹獼猴（Macaca fascicularis）（cynomolgus，cyno）、黑猩猩（Pan troglodytes）（chimpanzee，chimp））或狨猴（Callithrix jacchus）（commonmarmoset，marmoset）的相應抗原具有交叉反應性。
術語「KD」指解離常數，其獲得自kd與ka的比率（即kd/ka）並且表示為摩爾濃度（M）。可以使用本領域公知的方法測定抗體的KD值。用於測定抗體KD的方法包括使用生物傳感系統例如系統測量表面等離子體共振，或通過溶液平衡滴定法（SET）測量溶液中的親和力。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的或非天然存在的，其具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNA）。「分離的」核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括在細胞中含有的核酸分子，所述細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在于染色體外或存在于不同于其天然染色體位置的染色體位置處。「編碼抗TSLP抗體的分離的核酸」指編碼抗體重鏈和輕鏈（或其片段）的一個或更多個核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的一個或更多個核酸分子，和存在於宿主細胞中一個或更多個位置的這樣的一個或更多個核酸分子。
除非另有說明，否則特定的核酸序列涵蓋其保守修飾的變體（例如，簡並密碼子取代）和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡並密碼子取代可以通過產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或多個所選的（或全部）密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代（Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081, 1991；Ohtsuka等 , J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985；和Rossolini等, Mol. Cell. Probes8:91-98, 1994）。
氨基酸序列「同一性」指在比對氨基酸序列時，必要時引入間隙以達成最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，第一序列中與第二序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為測定氨基酸序列同一性的百分比，可以通過本領域技術的範圍內的多種比對序列的方式來實現，例如，使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本發明所屬技術領域中具通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。
術語「載體」意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是「質粒」，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接附加的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體（AAV或AAV2），其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非附加型哺乳動物載體）可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。
術語「宿主細胞」是指已向其中引入了表現載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(
enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(
Escherichia coli)或沙門氏菌(
Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(
Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(
Bacillus subtilis)；肺炎球菌(
Pneumococcus)；鏈球菌(
Streptococcus)和流感嗜血菌(
Haemophilusinfluenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(
Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(
Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、293細胞和NS0細胞。
本發明的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以複製並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。通過表現與人TSLP特異性結合的抗體得到穩定的複製。陽性的複製在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。包含抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物通常需要冷藏，或冷凍，如-70℃，或者凍乾。
「施用」、「給予」和「處理」當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。「施用」、「給予」和「處理」可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。「施用」、「給予」和「處理」還意指通過試劑、診斷、結合組合物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。「處理」當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
「治療」意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量（也稱作「治療有效量」）可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案（例如治療方法或製品）在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢定方法如Student t檢定、卡方檢定、依據Mann和Whitney的U檢定、Kruskal-Wallis檢定（H檢定）、Jonckheere-Terpstra檢定和Wilcoxon檢定確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
「保守修飾」或「保守置換或取代」是指具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等）的其它氨基酸置換蛋白中的氨基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本發明所屬技術領域中具通常知識者知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個氨基酸置換基本上不改變生物學活性（參見例如Watson等(1987) Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，（第4版））。另外，結構或功能類似的氨基酸的置換不大可能破壞生物學活性。示例性保守取代於下表「示例性氨基酸保守取代」中陳述。
表3. 示例性氨基酸保守取代
| 原始殘基 | 保守取代 |
| Ala(A) | Gly; Ser |
| Arg(R) | Lys; His |
| Asn(N) | Gln; His; Asp |
| Asp(D) | Glu; Asn |
| Cys(C) | Ser; Ala; Val |
| Gln(Q) | Asn; Glu |
| Glu(E) | Asp; Gln |
| Gly(G) | Ala |
| His(H) | Asn; Gln |
| Ile(I) | Leu; Val |
| Leu(L) | Ile; Val |
| Lys(K) | Arg; His |
| Met(M) | Leu; Ile; Tyr |
| Phe(F) | Tyr; Met; Leu |
| Pro(P) | Ala |
| Ser(S) | Thr |
| Thr(T) | Ser |
| Trp(W) | Tyr; Phe |
| Tyr(Y) | Trp; Phe |
| Val(V) | Ile; Leu |
「有效量」或「有效劑量」指獲得任一種或多種有益的或所需的治療結果所必需的藥物、化合物或藥物組合物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，諸如減少各種本發明靶抗原相關病症的發病率或改善所述病症的一個或更多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩患者的本發明靶抗原相關病症的進展。
「外源性」指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。「內源性」指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
「同源性」是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或氨基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。通常，當比對兩個序列時進行比較以給出最大百分比同源性。例如，可以通過BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。以下參考文獻關於經常用於序列分析的BLAST算法：BLAST算法（BLAST ALGORITHMS）: Altschul，S.F.等人，(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410；Gish，W.等人，(1993) Nature Genet. 3:266-272；Madden，T.L.等人，(1996) Meth. Enzymol. 266:131-141；Altschul，S.F.等人，(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；Zhang，J.等人，(1997) Genome Res. 7:649-656。其他如NCBI BLAST提供的常規BLAST算法也為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。
本文使用的表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，「轉化體」和「轉化細胞」包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
「任選」或「任選地」意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必然發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
「藥物組合物」表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語「藥學上可接受的載體」指適合用於製劑中用於遞送抗體或抗原結合片段的任何無活性物質。載體可以是抗粘附劑、粘合劑、包衣、崩解劑、充填劑或稀釋劑、防腐劑（如抗氧化劑、抗菌劑或抗真菌劑）、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適的藥學上可接受的載體的示例包括水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）右旋糖、植物油（例如橄欖油）、鹽水、緩衝液、緩衝的鹽水和等滲劑，例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化鈉。
此外，本發明包括用於治療與TSLP相關的疾病的藥劑，所述藥劑包含本發明的抗TSLP抗體作為活性成分。
本發明中與TSLP相關的疾病沒有限制，只要它是與TSLP相關的疾病即可，例如利用本發明的分子誘導的治療反應可通過結合人類TSLP，然後阻遏TSLP與其受體結合，進而阻斷TSLP相關的訊息通路，抑制疾病的進展。
上述與TSLP相關的疾病可以通過用本發明的抗體檢測或測定表現TSLP的細胞來診斷。
此外，本發明關於用於免疫檢測或測定目標抗原（例如TSLP）的方法、用於免疫檢測或測定目標抗原（例如TSLP）的試劑、用於免疫檢測或測定表現目標抗原（例如TSLP）的細胞的方法和用於診斷與目標抗原（例如TSLP）陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本發明的特異性識別目標抗原（例如人TSLP）並與胞外區的氨基酸序列或其三維結構結合的抗體或抗體片段作為活性成分。
在本發明中，用於檢測或測定目標抗原（例如TSLP）的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法（RIA）、酶免疫測定法（EIA或ELISA）、熒光免疫測定法（FIA）、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
在本發明中，對用於檢測或測定目標抗原（例如TSLP）的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表現目標抗原（例如TSLP）的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法，含有本發明的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別所述單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與所述標記對應的底物等。
實施例
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制本發明的範圍。
本發明實施例或測試例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，《分子複製——實驗室手冊》，冷泉港實驗室；《當代分子生物學方法》，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. TSLP和TSLP受體的表現
分別將編碼帶His標籤的人TSLP、食蟹猴TSLP、人TSLP受體胞外區序列複製至phr載體上，構建成表現質粒，然後轉染HEK293。具體轉染步驟為：前一天將HEK293E細胞以0.8×10
6/mL接種於Freestyle表現培養基（含有1% FBS）中，放置於37℃恆溫搖床（120rpm）繼續培養24小時。24小時後，將轉染質粒和轉染試劑PEI用0.22μm的濾器除菌，然後將轉染質粒調整為100μg/100mL細胞，PEI（1mg/mL）和質粒的質量比為3:1，以200mL HEK293E細胞的轉染為例，取10mL的Opti-MEM和200μg質粒混勻，靜置5分鐘（min）；另取10mL的Opti-MEM和600μg PEI混勻，靜置5min。將質粒和PEI進行混勻，靜置15 min。將質粒和PEI混合物緩慢加入200mL HEK293E的細胞中，放入8% CO
2，120rpm，37℃的搖床中培養。轉染第3天，補充10%體積的補料培養基。待轉染第6天，取樣4500rpm離心10min收集細胞上清，過濾，將重組的TSLP和TSLP受體蛋白上清通過實施例2進行純化，純化的蛋白可用於下述各實施例實驗中。相關序列如下所示：
1. 帶his標籤的人TSLP抗原（huTSLP-His）氨基酸序列
MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKARKSKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ
GSSDYKDDDDKHHHHHH註釋：下劃線為訊息肽序列；斜體部分為Flag-His6-tag標記。
SEQ ID NO: 1
2. 帶his標籤的食蟹猴TSLP抗原（cynoTSLP-His）氨基酸序列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGYDFTNCDFQKIEADYLRTISKDLITYMSGTKSTDFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTPRCASLAKEMFARKTKATLALWCPGYSETQINATQAMKKARKSKVTTNKCLEQVSQLLGLWRRFIRTLLKQQ
GSSDYKDDDDKHHHHHH註釋：下劃線為訊息肽序列；斜體部分為flag-His6-tag標記。
SEQ ID NO: 2
3. 帶Fc標籤的人TSLP 受體胞外區（人-TSLPR-Fc-ECD）氨基酸序列：
GAAEGVQIQIIYFNLETVQVTWNASKYSRTNLTFHYRFNGDEAYDQCTNYLLQEGHTSGCLLDAEQRDDILYFSIRNGTHPVFTASRWMVYYLKPSSPKHVRFSWHQDAVTVTCSDLSYGDLLYEVQYRSPFDTEWQSKQENTCNVTIEGLDAEKCYSFWVRVKAMEDVYGPDTYPSDWSEVTCWQRGEIRDACAETPTPPKPKLSK DIEGRMDEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK註釋：下劃線部分為人-TSLPR的胞外區，斜體部分為接頭-人Fc-tag。
SEQ ID NO: 3
4. 人TSLP 受體全長序列氨基酸序列：
MGRLVLLWGAAVFLLGGWMALGQGGAAEGVQIQIIYFNLETVQVTWNASKYSRTNLTFHYRFNGDEAYDQCTNYLLQEGHTSGCLLDAEQRDDILYFSIRNGTHPVFTASRWMVYYLKPSSPKHVRFSWHQDAVTVTCSDLSYGDLLYEVQYRSPFDTEWQSKQENTCNVTIEGLDAEKCYSFWVRVKAMEDVYGPDTYPSDWSEVTCWQRGEIRDACAETPTPPKPKLSKFILISSLAILLMVSLLLLSLWKLWRVKKFLIPSVPDPKSIFPGLFEIHQGNFQEWITDTQNVAHLHKMAGAEQESGPEEPLVVQLAKTEAESPRMLDPQTEEKEASGGSLQLPHQPLQGGDVVTIGGFTFVMNDRSYVAL
註釋：下劃線部分為訊息肽
SEQ ID NO: 4
5. 人IL7Rα全長序列氨基酸序列（Uniprot編號：P16871）
MTILGTTFGMVFSLLQVVSGESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNTTNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVIYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNP VAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
註釋：下劃線部分為訊息肽
SEQ ID NO: 5
實施例2. TSLP和TSLP受體（TSLPR）重組蛋白的純化
2.1帶His標籤的各種屬TSLP重組蛋白的純化
將細胞表現上清高速離心去除雜質，過濾，PBS溶液平衡鎳柱，沖洗10倍柱體積。將過濾後的上清上柱。用含有30mM咪唑的PBS溶液沖洗柱子，至A
280讀數降至基線。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。PBS濃縮換液，LC-MS鑑定為正確後分裝備用。得到帶His標籤的人TSLP和食蟹猴TSLP。
2.2帶人Fc標籤的各種屬TSLP和人TSLP受體胞外區重組蛋白的純化
將細胞表現上清高速離心去除雜質，重組抗體表現上清用Protein A柱進行純化。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.5洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。濃縮換液，所得到的蛋白經電泳，LC-MS鑑定為正確後分裝備用。
實施例3. 重組TSLP受體和IL7Rα受體細胞系的構建和鑑定
為篩選可以阻斷TSLP結合TSLP受體的抗體，構建了同時表現人TSLP受體和人IL7Rα（TSLPR/IL7Rα）的CHO-K1和BaF3細胞株。採用慢病毒包裝目的基因TSLPR/IL7Rα複製至細胞內形成穩定高表現細胞株。首先分別將人TSLPR和人IL7Rα基因複製至pCDH-CMV-MCS-EF1-puro和pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo（SBI，CD500B-1）質粒內，然後通過慢病毒感染的方法將人TSLPR複製至CHO-K1和BaF3細胞株內，經10 μg/mL嘌呤黴素（puromycin，Gibco，US）篩選壓力下選擇培養三周。在此基礎上進行第二輪感染，再將人IL7Rα基因複製進去，用1 mg/mL G418（Gibco，US）和10 μg/mL嘌呤黴素時篩選兩至三周。最後通過流式分選的方法，篩選出同時高表現TSLPR和IL7 Rα的CHO-K1和BaF3單株細胞株。
實施例4.抗人TSLP單株抗體的相關序列
本發明中的抗體可以通過雜交瘤篩選、噬菌體展示、親和力成熟等技術獲得。本發明發明人經過大量實驗，獲得了一系列高親和力的TSLP抗體。示例性的，抗TSLP抗體的序列如下：
4.1抗TSLP的可變區序列如下：
＞VL1
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC
GGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY
DDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC
QVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 6
＞VL2
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC
GGNNLGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY
QDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRGEAGDEADYYC
QVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 7
＞VL3
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC
GGNNLGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY
DDSDRKSWIPERFSGSNSGNTATLTISRGEAGDEADYYC
QVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 8
＞ VH1
QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFR
SYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 9
＞ VH2
QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCAR
AHQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 10
＞ VH3
QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWQLVHEAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 11
＞ VH8
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSHKHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 12
＞ VH17
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWETVHEAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 13
＞ VH18
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWELVHEAFDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 14
＞ VH19
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVS
VIWYDGSNKHYAESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCAR
APQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 15
＞ VH21
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVS
VIWFDGSNKHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCAR
APQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 16
註釋：下劃線部分為互補決定區序列。
4.2本發明中抗TSLP抗體的CDR區序列如下表所示：
表4. 抗體重鏈及輕鏈的CDR區序列
| 抗體 | 重鏈CDR | 輕鏈CDR | ||
| Ab-14 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 20 |
| HCDR2 | VIWYDGSHKHYADSVKG SEQ ID NO: 18 | LCDR2 | DDSDRPS SEQ ID NO: 21 | |
| HCDR3 | APQWELVHEAFDI SEQ ID NO: 19 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-23 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 20 |
| HCDR2 | VIWYDGSNKHYADSVKG SEQ ID NO: 23 | LCDR2 | DDSDRPS SEQ ID NO: 21 | |
| HCDR3 | APQWETVHEAFDI SEQ ID NO: 24 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-24 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 20 |
| HCDR2 | VIWYDGSNKHYADSVKG SEQ ID NO: 23 | LCDR2 | DDSDRPS SEQ ID NO: 21 | |
| HCDR3 | APQWELVHEAFDV SEQ ID NO: 25 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-1 | HCDR1 | SYGMHW SEQ ID NO: 26 | LCDR1 | GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 20 |
| HCDR2 | VIWYDGSNKHYADSVKG SEQ ID NO: 23 | LCDR2 | DDSDRPS SEQ ID NO: 21 | |
| HCDR3 | APQWELVHEAFDI SEQ ID NO: 19 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-2 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 20 |
| HCDR2 | VIWYDGSNKHYADSVKG SEQ ID NO: 23 | LCDR2 | DDSDRPS SEQ ID NO: 21 | |
| HCDR3 | AHQWELVHEAFDI SEQ ID NO: 27 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-6 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNLGSKSVH SEQ ID NO: 29 |
| HCDR2 | VIWYDGSNKHYADSVKG SEQ ID NO: 23 | LCDR2 | QDSDRPS SEQ ID NO: 30 | |
| HCDR3 | APQWQLVHEAFDI SEQ ID NO: 28 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-9 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNLGSKSVH SEQ ID NO: 29 |
| HCDR2 | VIWYDGSNKHYADSVKG SEQ ID NO: 23 | LCDR2 | DDSDRKS SEQ ID NO: 31 | |
| HCDR3 | APQWQLVHEAFDI SEQ ID NO: 28 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-25 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 20 |
| HCDR2 | VIWYDGSNKHYAESVKG SEQ ID NO: 32 | LCDR2 | DDSDRPS SEQ ID NO: 21 | |
| HCDR3 | APQWELVHEAFDI SEQ ID NO: 19 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 | |
| Ab-27 | HCDR1 | TYGMH SEQ ID NO: 17 | LCDR1 | GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 20 |
| HCDR2 | VIWFDGSNKHYADSVKG SEQ ID NO: 33 | LCDR2 | DDSDRPS SEQ ID NO: 21 | |
| HCDR3 | APQWELVHEAFDI SEQ ID NO: 19 | LCDR3 | QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 22 |
4.3 本發明中抗TSLP抗體及其對應的可變區序列如下：
表5. 抗體的可變區
| 抗體 | VH | VL | 抗體 | VH | VL |
| Ab-1 | VH1 | VL1 | Ab-14 | VH8 | VL1 |
| Ab-2 | VH2 | VL1 | Ab-23 | VH17 | VL1 |
| Ab-6 | VH3 | VL2 | Ab-24 | VH18 | VL1 |
| Ab-9 | VH3 | VL3 | |||
| Ab-25 | VH19 | VL1 | |||
| Ab-27 | VH21 | VL1 |
將上述抗體的輕、重鏈可變區與抗體的輕、重鏈恆定區連接後形成全長抗體。如，Ab-1抗體的重鏈可變區為VH1，輕鏈可變區為VL1，其他類推；示例性的，可使用IgG1重鏈恆定區（如：SEQ ID NO: 34）和λ輕鏈恆定區（如SEQ ID NO: 35）作為本發明中抗體的恆定區。
4.4. 抗體恆定區
抗體的重鏈恆定區可選自IgG1、IgG2、IgG4及其變體的恆定區。示例性的，本發明中使用了IgG1恆定區，其序列如SEQ ID NO: 34所示。輕鏈恆定區可選自人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。示例性的，本發明中使用了人源λ鏈的恆定區，其序列如SEQ ID NO: 35所示。
＞IgG1恆定區
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 34
＞λ輕鏈恆定區
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 35
將本發明中的重、輕鏈可變區與上述恆定區重組，得到重、輕鏈的全長序列。示例性的，抗體的序列如下所示：
＞Ab-14抗體重鏈：
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSHKHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 36
＞Ab-14抗體輕鏈：
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC
GGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY
DDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC
QVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 37
＞Ab-23抗體重鏈：
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWETVHEAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 38
＞Ab-23抗體輕鏈：
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC
GGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY
DDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC
QVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 37
＞Ab-24抗體重鏈：
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR
TYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VIWYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
APQWELVHEAFDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 39
＞Ab-24抗體輕鏈：
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC
GGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY
DDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC
QVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 37
本發明中使用的對照抗體為Amg157，其抗體序列如下：
＞Amg157的重鏈序列
QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 40
＞Amg157的輕鏈序列
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNLGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRGEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 41
本發明的抗體可用常規基因複製、重組表現的方法進行複製、表現和純化。
測試例
測試例1：Biacore測定抗TSLP抗體與人和食蟹猴TSLP的結合
用Biacore T200（GE）儀器測定人源化TSLP抗體與人和食蟹猴TSLP的親和力。
用Protein A生物感測晶片（Cat. # 29127556, GE）親和捕獲待測分子，然後於芯片表面流經抗原（huTSLP-his，cynoTSLP-his，實施例1製備所得），用Biacore T200儀器實時檢測反應訊息獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用甘氨酸-鹽酸再生溶液（pH 1.5 Cat. #BR-1003-54,GE）將生物感測晶片洗淨再生。用BIAevaluation version 4.1，GE軟體以（1:1）Langmuir模型擬合數據，得出親和力數值，如下表所示。
表6. 抗體與人和食蟹猴TSLP的親和力
| 抗體 | TSLP | ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD (M) |
| Amg157 | 人 TSLP | 1.20E+07 | 1.15E-04 | 9.65E-12 |
| 猴 TSLP | 5.18E+06 | 5.16E-05 | 9.97E-12 | |
| Ab-14 | 人 TSLP | 9.60E+06 | 3.13E-05 | 3.26E-12 |
| 猴 TSLP | 5.51E+06 | 6.60E-06 | 1.20E-12 | |
| Ab-23 | 人TSLP | 1.08E+07 | 3.09E-05 | 2.86E-12 |
| 猴TSLP | 6.32E+06 | 6.64E-06 | 1.05E-12 | |
| Ab-24 | 人 TSLP | 7.81E+06 | 3.13E-05 | 4.00E-12 |
| 猴 TSLP | 5.15E+06 | 9.26E-06 | 1.80E-12 |
結果顯示，本發明中的抗TSLP抗體與人和食蟹猴TSLP具有很高的親和力，優於對照Amg157抗體。
測試例2：基於ELSA的抗TSLP抗體阻斷TSLP結合TSLP受體實驗
TSLP受體有兩個亞基，TSLPR和IL7R，其中TSLPR為TSLP特異性受體，IL7R為TSLP與IL7的共用受體。TSLP先與TSLPR結合，再與IL7R結合。本測試例用來鑑定TSLP抗體是否可以阻斷TSLP結合到重組表現的TSLPR受體蛋白胞外區。
將人-TSLPR-Fc-ECD（2μg/mL，SEQ ID NO: 3）包被ELISA板，4℃孵育過夜，棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶封閉液200μL/孔，37℃孵育箱孵育2小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液（pH7.4PBS含0.05% 吐溫-20）洗板3次，將生物素標記的huTSLP-Fc抗原配製成3nM，待測抗體從200nM開始梯度稀釋，抗原和抗體1：1混勻後37℃放置15min，100μL每孔加入酶標板中，37℃放置1小時（h），用PBST洗板3次後，加入100μL/孔用樣品稀釋液以1：4000濃度稀釋的Streptavidin-Peroxidase Polymer，於37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入100µL/孔TMB顯色底物（KPL，52-00-03），於室溫孵育3-10min，加入100µL/孔1MH
2SO
4終止反應，用NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算TSLP抗體阻斷TSLP與TSLPR結合的IC50值，結果見下表。
表7. 抗體阻斷活性結果
| 抗體 | IC50（nM） |
| Amg157 | 0.61 |
| Ab-1 | 0.18 |
| Ab-2 | 0.18 |
| Ab-3 | 0.2 |
| Ab-6 | 0.2 |
| Ab-9 | 0.26 |
| Ab-14 | 0.2 |
| Ab-23 | 0.19 |
| Ab-24 | 0.21 |
| Ab-25 | 1.12 |
| Ab-27 | 5.98 |
結果顯示，本發明抗體Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-6、Ab-9、Ab-14、Ab-23和Ab-24均可較強地抑制TSLP與其受體TSLPR的結合；其抑制活性優於對照Amg157抗體。
測試例3：抗TSLP抗體抑制TSLP誘導的過表現TSLPR/IL7R的BaF3細胞增殖實驗
TSLP可以與BaF3表面的TSLPR/IL7R結合，進而促進BaF3的增殖。本測試例用來鑑定本發明抗體可以阻斷TSLP的誘導BaF3增殖的活性。
實驗過程如下：
過表現TSLPR/IL7R的BaF3細胞培養於10% FBS以及2ng/mL rhIL3(聯科生物，Catalog No. 96-AF-300-03-20)的RPMI1640培養基中，於37℃，5% CO
2培養箱中培養，細胞密度不超過1×10
6個/mL。檢測抗體時，取對數生長期的細胞用PBS洗三遍800rpm離心5min，用RPMI1640（2% FBS，重組人TSLP-Fc：40ng/mL）調整細胞密度8000個/孔/90μL，並加入10μL梯度稀釋的待測抗體到96孔板中。培養2天後，加入30μL cell titer，混勻後進行檢測。根據讀值計算IC50。結果如表8所示。
表8. 抗體抑制BaF3細胞增殖活性
| 抗體 | IC50（nM） |
| Ab-1 | 2.24 |
| Ab-2 | 2.63 |
| Ab-3 | 2.5 |
| Ab-6 | 12.34 |
| Ab-9 | 13 |
| Ab-14 | 0.43 |
| Ab-23 | 0.43 |
| Ab-24 | 0.37 |
結果顯示，本發明的抗體Ab-14、Ab-23和Ab-24具有較強的抑制TSLP介導的BaF3細胞增殖的能力。
測試例4：抗TSLP抗體阻斷TSLP誘導的天然CD4
+T細胞往Th2細胞的分化
TSLP可以誘導原代髓樣mDC細胞成熟，成熟的mDC細胞高表現OX40配體，OX40配體可以與天然CD4
+T細胞表面的OX40結合，進而使天然CD4
+T分化成Th2細胞，產生IL4/IL5/IL13等免疫應答相關因子，使機體發生Th2炎症反應。本測試例用來檢測本發明中的抗體可以阻斷TSLP誘導的Th2細胞的分化。
採用磁珠分選的方法，（CD1c (BDCA-1)
+樹突細胞分離試劑盒Miltenyi Biotec）從人外周血單核細胞（PBMC）中分離純化初始髓樣DC，將得到的mDC種植於96孔細胞培養板內。梯度稀釋的抗體和重組表現的人TSLP（huTSLP-his，終濃度50ng/mL）預先孵育（37℃）45分鐘左右，再分別加入到含有mDC的各細胞培養孔內，37℃培養24小時。收集刺激成熟的mDC，用PBS洗兩次。用磁珠分離法（Myltenyi，Biotec）從PBMC中提取CD4
+CD45RA
+天然T細胞。將分離得到的天然T細胞和成熟的mDC以5:1的比例混合種植於96孔細胞培養板內，共同培養6天。收集細胞，種植於anti-CD3（10 μg/mL）預包被的96孔板內，並加入anti-CD28（1 μg/mL），再刺激分化的T細胞，培養24小時，最後收集細胞培養上清。ELISA檢測上清中細胞分泌的Th2相關的細胞因子。IL-4和IL-5細胞因子用的是R&D的ELISA試劑盒檢測，TNF-α和IL-13用欣博盛的ELISA試劑盒檢測。結果如表9和圖1A-1D所示。
表9. Th2相關的細胞因子濃度（給藥量1μg/mL）
| 細胞因子 | Amg157 | Ab-23 |
| IL-13（pg/mL） | 1789.9 | 537.9 |
| IL-4（pg/mL） | 50.1 | 38.7 |
| IL-5（pg/mL） | 99.1 | 68.1 |
| TNF-α | 263.2 | 194.2 |
結果顯示，本發明所得抗體Ab-23可以顯著抑制Th2細胞因子IL4、IL5、IL13和TNF-α的產生，表明本發明所得抗體可以阻斷TSLP誘導的Th2細胞的分化。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本發明所屬技術領域中具通常知識者應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
無
圖1：圖1A為抗體抑制Th2相關的細胞因子IL-13產生的活性；圖1B為抗體抑制Th2相關的細胞因子IL-4產生的活性；圖1C為抗體抑制Th2相關的細胞因子IL-5產生的活性；圖1D為抗體抑制Th2相關的細胞因子TNF-α產生的活性。
Claims (15)
- 一種抗TSLP抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： i）重鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且輕鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3； 或 ii）重鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且輕鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3； 或 iii）重鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且輕鏈可變區包含氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1所述的抗TSLP抗體，其中所述抗TSLP抗體是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
- 如請求項1或2所述的抗TSLP抗體，其中： 所述重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所示，或與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所示的序列分別具有至少90%的序列同一性；且 所述輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，或與如SEQ ID NO: 6所示的序列具有至少90%的序列同一性。
- 如請求項3所述的抗TSLP抗體，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所示的重鏈可變區；和氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示的輕鏈可變區。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體包含抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區。
- 如請求項5所述的抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體包含序列如SEQ ID NO: 34所示的重鏈恆定區；和/或序列如SEQ ID NO: 35所示的輕鏈恆定區。
- 如請求項1至6中任一項所述的抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體包含重鏈和輕鏈，其中： 重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 39所示，或分別與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 39所示的序列具有至少85%的序列同一性；且 輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 37所示，或與SEQ ID NO: 37所示的序列具有至少85%的序列同一性。
- 如請求項7所述的抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體包含： 如SEQ ID NO: 38所示的重鏈和如SEQ ID NO: 37所示的輕鏈；或 如SEQ ID NO: 36所示的重鏈和如SEQ ID NO: 37所示的輕鏈；或 如SEQ ID NO: 39所示的重鏈和如SEQ ID NO: 37所示的輕鏈。
- 如請求項1至8中任一項所述的抗TSLP抗體，其中所述的抗TSLP抗體具有以下特性中的一種或多種： a) 以小於9 pM的KD值與人TSLP結合； b) 以小於0.6nM的IC50值阻斷TSLP與TSLPR的結合；或 c) 以小於9 pM的KD值與食蟹猴TSLP結合。
- 一種核酸分子，其編碼如請求項1至9中任一項所述的抗TSLP抗體。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項10所述的核酸分子。
- 一種藥物組合物，其含有治療有效量的如請求項1至9中任一項所述的抗TSLP抗體，或如請求項10所述的核酸分子，或如請求項11所述的宿主細胞，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
- 一種用於體外或離體免疫檢測或測定TSLP的方法，所述方法包括使用請求項1至9中任一項所述的抗TSLP抗體的步驟。
- 一種試劑盒，其包含請求項1至9中任一項所述的抗TSLP抗體。
- 一種如請求項1至9中任一項所述的抗TSLP抗體，或如請求項10所述的核酸分子，或如請求項11所述的宿主細胞，或如請求項12所述的藥物組合物在製備用於治療炎症疾病或纖維化疾病的藥物中的用途；優選地， 其中所述的炎症疾病選自：過敏症、皮炎、哮喘、過敏性結膜炎、變應性鼻炎、嗜酸性球性胃腸炎、過敏性支氣管肺麴菌病、過敏性真菌鼻竇炎、慢性嗜酸性球性肺炎、嗜酸性球性支氣管炎、炎性腸病和過敏性鼻竇炎； 其中所述的纖維化疾病選自：硬皮症、間質性肺病、特發性肺纖維化、B型或C型慢性肝炎引發的纖維化、輻射誘發的纖維化和傷口癒合引發的纖維化； 更優選地，其中所述的炎症疾病或纖維化疾病與TSLP相關。
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