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TW202227486A - 一種抗erbb3受體的抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents

一種抗erbb3受體的抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途 Download PDF

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TW202227486A
TW202227486A TW111100249A TW111100249A TW202227486A TW 202227486 A TW202227486 A TW 202227486A TW 111100249 A TW111100249 A TW 111100249A TW 111100249 A TW111100249 A TW 111100249A TW 202227486 A TW202227486 A TW 202227486A
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antigen
erbb3
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TW111100249A
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花海清
張莉
謝岳峻
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大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司
大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司
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Abstract

本發明關於一種抗ERBB3受體的抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途，尤其關於抗ERBB3受體的全人源抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途。同時包含抗ERBB3全人源抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。

Description

一種抗ERBB3受體的抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途
本發明關於一種抗ERBB3受體的抗體或其抗原結合片段，進一步地，本發明關於包含CDR區的ERBB3抗體或其抗原結合片段；本發明還關於包含該ERBB3全人源抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為ERBB3相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。
ERBB受體廣泛表達於神經元細胞、上皮細胞、間質細胞，與心血管、神經、肌肉骨骼以及其他器官的發育有關，並參與癌症發病機制。ERBB受體有4個家族蛋白：EGFR、ERBB2、ERBB3和ERBB4，均為膜蛋白，具有類似的分子結構，包含胞外區(ECD)、跨膜區、具有酪胺酸激酶活性的胞內區、以及C末端。ECD可細分為4個子結構域：子結構域I、II、III、IV(BMC Bioinformatics 2001,2：4.；Mol Cell 2003,11：507-17.)，其中I和III富含亮胺酸，是配體結合功能域；II和IV富含半胱胺酸，是形成二聚體的功能域。除ERBB2外，其他三個ERBB受體在無活性狀態下II和IV結合，在被配體結合並激活時才打開，使II暴露，形成二聚體。目前EGFR和ERBB2研究較多，相應的靶向 藥研發較密集。近年來，ERBB3的關注度不斷提高，在EGFR及ERBB2相關的耐藥中，ERBB3旁路發揮了關鍵作用，且ERBB3在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結直腸癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、黑色素瘤等腫瘤中有較高表達，因此ERBB3是腫瘤治療的又一潛在靶點。ERBB3有2個配體NRG1和NRG2，配體可激活ERBB3的激酶活性，活化的ERBB3可與EGFR或ERBB2形成異源二聚體，並使後者磷酸化，進而將信號傳遞到下游通路，促進腫瘤細胞的生長與增殖。此外，在癌症中ERBB3還可以藉由與其他RTKs進行“cross talk”傳遞信號，如與IGF1R、FGFR2和HGFR(c-Met)形成複合物(BioDrugs 2017,31：63-73)，可見ERBB3在腫瘤生長中扮演著重要的角色。
目前，針對ERBB3靶點的治療策略依循於以下幾種機制：1)將ERBB3鎖住在非活性狀態(如CDX-3379)；2)捕捉ERBB3的配體NRG(如RB200)；3)阻斷ERBB3與配體的結合(如U3-1287)；4)促進ERBB3的內吞(抗體藥物偶聯物)；5)阻斷ERBB3與其他EGFR家族成員的二聚化；6)招募免疫細胞殺傷表達內源性ERBB3的癌細胞。針對這些機制，ERBB3的靶向治療可以有：單株抗體、雙特異性抗體、抗ERBB3的疫苗、配體陷阱(ligand trap)、鎖定ERBB3的RNA抑制劑、抑制ERBB3激酶活性的小分子等。其中，靶向ERBB3抗體的研發熱度較高。
在臨床研究中，一種來自於鼠源的ERBB3抗體可顯著抑制患者胞瘤的生長(引用Celldex的數據)。目前在研的ERBB3抗體有鼠源抗體經人源化改造的人源化抗體，而人源化抗體在免疫時存在的免疫原性比不含鼠源抗體成分的全人源抗體要高，在人體應用時是一個不利的因素；也有一些在研ERBB3 抗體藥物是藉由噬菌體庫展示技術得到的全人源抗體，可以解決免疫原性的問題。
噬菌體展示技術(phage display technology)是將外源蛋白質或多肽與噬菌體外殼蛋白融合表達，從而將外源蛋白表達在噬菌體的表面。噬菌體抗體庫是將噬菌體展示技術、PCR擴增技術、蛋白表達技術相結合的一項運用綜合技術手段所建立起來的抗體庫。
噬菌體庫一般有合成庫、免疫庫以及天然庫，應用較多的是天然庫，天然庫通常是用人外周血的免疫細胞構建而成的全人源抗體庫，其最大的優點是不經額外的體內免疫，卻可以獲得人體已產生的多樣性高的全人源抗體。除此之外，噬菌體抗體庫還具有以下優勢：①實現了基因型與表型的統一。此外，實驗方法簡單、快速，傳統的藉由融合瘤技術抗體產生方法需歷經數月，而抗體庫技術只需短短幾週的時間。②表達的是完全人源抗體，且分子量小，主要以活性片段Fab、scFV的形式表達，與完整抗體相比在組織穿透力方面都有明顯優勢。③篩選容量大，融合瘤技術是在上千個純株內篩選，抗體庫技術可以對百萬甚至億萬個分子選擇。篩選到的抗體種類更多。④用途廣泛，採用了原核表達系統，當大規模生產時優勢更加明顯(Curr Opin Biotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602；Immunotechnology,2013,48(13)48(13)：63-73)。
目前，已有WO2007077028等專利報導了ERBB3的抗體，絕大多數都是鼠源抗體或人源化抗體，也有一部分是從噬菌體庫得到的全人源抗體，就國內外而言，大多數處於臨床早期和發現階段，還沒有靶向ERBB3的抗體藥物上市，因此，有必要進一步開發具有更高活性、高親和力和高穩定性的ERBB3全人源抗體，以進行相關疾病的治療研究和應用。
本發明提供了一種抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，尤其關於一種抗ERBB3的全人源抗體或其抗原結合片段，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含：抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區；其中，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含：
SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2和SEQ ID NO：3所示的HCDR3。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含：
SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2和SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中，
該抗體重鏈可變區包含：SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2和SEQ ID NO：3所示的HCDR3；
該抗體輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2和SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的重鏈可變區。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的輕鏈可變區。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的輕鏈可變區。
本發明一個較佳方案中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突變體的重鏈恆定區；
本發明進一步佳方案中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段進一步包含人的IgG1或其變體的重鏈恆定區；
本發明進一步佳方案中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1重鏈恆定區；
本發明進一步佳方案中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：11所示的重鏈恆定區；
本發明進一步佳方案中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈或其突變體的輕鏈恆定區；
本發明進一步佳方案中，包含源自人λ鏈的輕鏈恆定區；
本發明進一步佳方案中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：12所示的輕鏈恆定區。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9所示的重鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長重鏈。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10所示的輕鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長輕鏈。
在較佳方案中，本發明還關於一種如上所述抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9所示的重鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長重鏈，和SEQ ID NO：10所示的輕鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長輕鏈。
本發明進一步提供多核苷酸，其編碼上述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供表達載體，其含有上述的多核苷酸。
本發明進一步提供宿主細胞，其導入或含有上述的表達載體。
在本發明一個較佳的實施方案中，上述的宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌。
在本發明一個較佳的實施方案中，上述的宿主細胞為酵母菌，較佳為畢赤酵母。
在本發明一個較佳的實施方案中，上述的宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為CHO細胞或HEK293細胞。
本發明進一步提供一種生產抗ERBB3抗體或其抗原結合片段的方法，包括步驟：
a)培養上述的宿主細胞；
b)從培養物中分離抗體；以及
c)對該抗體進行純化。
本發明進一步提供一種醫藥組成物，其含有上述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段、以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
本發明進一步提供一種檢測或診斷試劑，其含有上述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段、以及可用於檢測或診斷的賦形劑、稀釋劑或載體。
本發明進一步提供一種上述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段或上述的組成物在製備用於治療或預防ERBB3介導的疾病或病症的藥物中的用途。
本發明進一步提供一種上述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段或上述的檢測或診斷試劑在製備用於檢測、診斷、預後ERBB3介導的疾病或病症試劑中的用途。
在本發明一個較佳的實施方案中，
上述的疾病或病症為癌症；
較佳ERBB3表達或過表達的癌症；
更佳乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、宮頸癌、膽囊癌、胰腺癌、睾丸癌、軟組織肉瘤、頭頸部癌、神經膠質瘤或黑色素瘤。
在本發明一個較佳的實施方案中，上述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段或上述的組成物，其用於檢測、診斷、預後ERBB3介導的疾病；該疾病選自：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、宮頸癌、膽囊癌、胰腺癌、睾丸癌、軟組織肉瘤、頭頸部癌、神經膠質瘤或黑色素瘤。
本發明進一步提供一種治療或預防ERBB3介導的疾病的方法，包括步驟：
向受試者提供治療有效量或預防有效量的上述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段；或者向受試者提供治療有效量或預防有效量的上述的醫藥組成物；其中該ERBB3介導的疾病選自：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、宮頸癌、膽囊癌、胰腺癌、睾丸癌、軟組織肉瘤、頭頸部癌、神經膠質瘤或黑色素瘤。
[發明詳述]
一、術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本申請所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本發明所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本申請所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本申請所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的 抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat或Chothia或ABM定義規則(http：//bioinf.org.uk/abs/)。
術語“抗原呈遞細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞。
術語“抗原呈遞”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：
1.從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；
2.從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；
3.從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及
4.藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而， 術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
術語“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
術語“Fc”區含有包含抗體的CH1和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。
術語“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
術語“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由藉由兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
術語“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、已共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
術語“與ERBB3結合”，指能與人ERBB3相互作用。
術語“抗原結合位點”指本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的， 包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人ERBB3作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
術語“交叉反應”是指本發明的抗體與來自不同物種的ERBB3結合的能力。例如，結合人ERBB3的本發明的抗體也可以結合另一物種的ERBB3。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達ERBB3的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗ERBB3抗體接觸時，與未與抗ERBB3抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本發明中所述的“ADCC”，即抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，增強或降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體 處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種抗體，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由......組成”或其變形表示包括所有該元件或元件組，並且視需要包括與該元件類似或不同性質的其它元件，該其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組成物的基本性質或新性質。
本發明所述的應用於某個對象的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體 (包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或其抗原結合片段，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
二、實施例
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1：全人源抗體的篩選和構建
ERBB3抗原設計：
以SEQ ID NO：13所示人ERBB3蛋白的胺基酸序列作為本發明抗原設計的模板。以下ERBB3抗原未特殊說明的均指人ERBB3。
ERBB3全長蛋白：ERBB3(SEQ ID NO：13)序列如下：
Figure 111100249-A0202-12-0018-1
篩選用ERBB3抗原為商業化產品生物素化的人ERBB3-His標簽(Sino biological，cat# 10201-H08H-B)；檢測用ERBB3抗原為商業化產品人ERBB3-His標簽(Sino biological，cat# 10201-H08H)。檢測用ERBB3抗原為人ERBB3的ECD區序列，在C端帶His標簽，篩選用ERBB3抗原是在此基礎上進行生物素化。人ERBB3的ECD序列如下：
Figure 111100249-A0202-12-0019-2
檢測用的猴ERBB3抗原(SEQ ID NO：15)為商業化產品恆河猴ERBB3 Protein-His標簽(Sino biological，cat# 90043-K08H)，是猴ERBB3抗原的ECD區序列在C端加His標簽，序列如下：
Figure 111100249-A0202-12-0019-3
收集多個人的PBMC，分離B細胞並提取RNA，反轉錄成cDNA，然後以cDNA為模板，構建天然噬菌體表面Fab展示庫(庫容1.6×1011)。將構建的天然Fab噬菌體文庫經過包裝形成噬菌體顆粒後，採用液相法進行淘篩，噬菌體與生物素化的ERBB3液相結合，再採用鏈黴親和素磁珠分離。為了獲得與人ERBB3結合的陽性序列，採用生物素化的人ERBB3進行2~3輪淘篩，挑取 384個單純株菌落包裝成噬菌體展示Fab片段，進行ELISA測試。測試單純株噬菌體與人ERBB3的結合活性：ELISA板上分別包被1μg/mL ERBB3，加入噬菌體上清，最後用抗人IgG Fab HRP檢測；將ELISA測試到的OD450值大於0.2的86個陽性純株進行測序，對序列進行分析，獲得獨特序列有：45個VH(重鏈可變區)和51個VL(輕鏈可變區)。將得到的重鏈和輕鏈可變區序列分別與人的IgG1重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列連接得到全長抗體，並對這些全長抗體進行實驗評估，最終確定1個結合力和功能均較好的抗體H01；其中，連接的人IgG1重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列分別如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。
表1. 抗體的重鏈和輕鏈可變區CDR序列
Figure 111100249-A0202-12-0020-4
表2. 抗體的重鏈和輕鏈可變區序列
Figure 111100249-A0202-12-0020-14
表3. 抗體的重鏈和輕鏈序列
Figure 111100249-A0202-12-0021-6
表4. 抗體及其重鏈、輕鏈、可變區的序列編號
Figure 111100249-A0202-12-0021-7
IgG1重鏈恆定區序列如下：
Figure 111100249-A0202-12-0021-8
SEQ ID NO：11
人λ鏈的輕鏈恆定區序列如下：
Figure 111100249-A0202-12-0022-9
SEQ ID NO：12
實施例2：全人源抗體的製備
根據H01抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表達載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表達載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。收取細胞培養液，離心過濾後上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，得到本發明的抗體蛋白，其濃度和純度如表5所示：
表5. 抗體的濃度和純度
Figure 111100249-A0202-12-0022-10
實施例3：全人源抗體的體外結合活性
3.1 體外間接ELISA結合實驗：
用pH7.4的PBS將人ERBB3 His蛋白(Sino biological，cat# 10201-H08H)、猴ERBB3 His蛋白(Sino biological，cat# 90043-K08H)、鼠ERBB3 His蛋白(Sino biological，cat# 51003-M08H)、人EGFR His蛋白(Sino biological，cat# 10001-H08H)、人ERBB2 His蛋白(Sino biological，cat# 10004-H08H)、人ERBB4 His蛋白(Sino biological，cat# 10363-H08H)分別稀釋至0.5μg/mL濃度，以100μL/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。 用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板3次後，加入用PBST稀釋的1%牛血清白蛋白(BSA)封閉液200μL/孔，37℃孵育2小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板1次。
用含1%BSA的PBST稀釋待測抗體，10nM起始，3倍梯度稀釋，11個劑量，以100μL/孔加到酶標板中，放於37℃孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入200μL/孔用含1%BSA的PBST稀釋的二抗抗人HRP(Abcam，cat# ab97225)，37℃孵育0.5小時。用PBST洗板5次後，加入100μL/孔TMB顯色受質(蘇州亞科化學試劑股份有限公司，cat# S0025)，於25℃避光孵育8-15分鐘，加入50μL/孔1M HCl終止反應，用酶標儀(Thermo,Lux)在450nm處讀取吸收值，分析數據。
做濃度信號值曲線分析，結果如下表所示，H01抗體對人源、猴源和鼠源ERBB3的親和力良好，不結合其他ERBB受體(EGFR、ERBB2、ERBB3)。
表6. 抗體對抗原蛋白的親和力
Figure 111100249-A0202-12-0023-13
3.2 體外細胞結合實驗：
(1)與穩轉細胞株293T人ERBB3的結合實驗
過表達人ERBB3的HEK293T細胞(293T-human ERBB3)經胰酶消化後，離心收集細胞，用FACS緩衝液(含2% FBS的1×PBS)調節細胞密度後分鋪於 96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。離心：1200g、5分鐘，棄上清，加入100μL已用FACS緩衝液梯度稀釋的抗體溶液(200nM起始，5倍梯度稀釋，8個劑量)，4℃孵育1小時。1200g、5分鐘離心，棄上清，FACS緩衝液洗細胞2次後，添加FACS緩衝液配製的螢光標記二抗工作液PE抗人IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat# 409304)，100μL每孔重新懸浮細胞，4℃孵育1小時。1200g、5分鐘離心，棄上清。FACS緩衝液洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞儀Bio-Rad(ZE5)檢測螢光信號，並作曲線分析抗體結合細胞的EC50濃度。
表7. 抗體對293T-hERBB3細胞的結合力(EC50值)
Figure 111100249-A0202-12-0024-15
結果顯示：本發明抗體可以和過表達人ERBB3的穩轉細胞株特異性結合。
(2)與腫瘤細胞株的結合實驗
藉由FACS實驗，檢測抗體分別與下列表達人ERBB3的腫瘤細胞結合力：人乳腺癌細胞SK-BR-3(南京科佰，Cat# CBP60413)和MX-1(南京科佰，Cat# CBP60640)、人結腸腺癌細胞SW620(南京科佰，Cat# CBP60036)、人胃癌細胞NCI-N87(中科院細胞庫，Cat#TCHu130)、人頭頸癌細胞FaDu(中科院細胞庫，Cat# TCHu132)、人非小細胞肺癌細胞HCC827(中科院細胞庫，Cat# TCHu153)。腫瘤細胞經胰酶消化後，離心收集細胞，用FACS緩衝液(含2% FBS的1×PBS)調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。離心：1200g、5分鐘，棄上清，加入100μL已用FACS緩衝液梯度稀釋的抗體溶液(200nM 起始，5倍梯度稀釋，8個劑量)，4℃孵育1小時。1200g、5分鐘離心，棄上清，FACS緩衝液洗細胞2次後，添加FACS緩衝液配製的螢光標記二抗工作液PE抗人IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat# 409304)，100μL每孔重新懸浮細胞，4℃孵育1小時。1200g、5分鐘離心，棄上清。FACS緩衝液洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞儀Bio-Rad(ZE5)檢測螢光信號，並作曲線分析抗體結合細胞的EC50濃度。
表8. 抗體對腫瘤細胞的結合力(EC50值)
Figure 111100249-A0202-12-0025-16
結果顯示：本發明抗體可以和表達人ERBB3的腫瘤細胞株特異性結合。
實施例4：全人源抗體的內吞作用
檢測本發明抗體結合ERBB3後是否能和人ERBB3共同內吞入細胞內，分別用表達ERBB3的人乳腺癌細胞SK-BR-3和過表達人ERBB3的HEK293T細胞(293T-人ERBB3)進行評估。
4.1 全人源抗體在腫瘤細胞SK-BR-3的內吞作用
細胞使用胰酶消化，收集細胞並用預冷的FACS緩衝液重新懸浮，調整細胞濃度為2×106/mL。取EP管，加入1mL細胞懸液，1500rpm離心5分鐘後棄上清，加入1mL已經配製好的待測抗體重新懸浮細胞，抗體的終濃度均為15μg/ml，4℃搖床孵育1小時，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。每管加入1mL螢光標記二抗工作液PE抗人IgG Fc抗體(Biolegend,Cat# 409304)，重新懸浮細胞，4℃搖床孵育30分鐘，離心棄上清 (4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。每管加入1mL預熱的細胞培養基重新懸浮細胞並混勻，分裝為5管，每管200μL，分別為0分鐘組、空白組、15分鐘組、30分鐘組和60分鐘組，取出0分鐘及空白置於冰上，其餘放置於37℃培養箱，分別內吞15分鐘、30分鐘、60分鐘，在相應時間點取出EP管，置於冰上預冷5分鐘，所有處理組離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，用FACS緩衝液洗滌一次，棄上清。0分鐘組外所有處理組EP管中加入100μL條形緩衝液(strip buffer)，室溫孵育8分鐘，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。所有處理組加入100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀Bio-Rad(ZE5)進行檢測。
抗體內吞百分比(%)=(各個時間點螢光強度值-空白組的平均螢光強度值)/(0分鐘組的平均螢光輕度值-空白組的平均螢光強度值)*100，具體結果如下表所示：
表9.全人源抗體在腫瘤細胞SK-BR-3的內吞作用
Figure 111100249-A0202-12-0026-17
結果顯示，本發明全人源抗體H01在人乳腺腺癌細胞SK-BR-3中有明顯的內吞作用。
4.2 全人源抗體在穩定細胞株293T-人ERBB3的內吞作用
細胞使用胰酶消化，收集細胞並用預冷的FACS緩衝液重新懸浮，調整細胞濃度為2×106/mL。取EP管，加入1mL細胞懸液，1500rpm離心5分鐘後棄上清，加入1mL已經配製好的待測抗體重新懸浮細胞，抗體的終濃度均為15 μg/ml，4℃搖床孵育1小時，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。每管加入1mL螢光標記二抗工作液PE抗人IgG Fc抗體(Biolegend,Cat# 409304)，重新懸浮細胞，4℃搖床孵育30分鐘，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。每管加入1mL預熱的細胞培養基重新懸浮細胞並混勻，分裝為4管，每管250μL，分別為0分鐘組，空白組、30分鐘組、60分鐘組和120分鐘組，取出0分鐘及空白置於冰上，其餘放置於37℃培養箱，分別內吞30分鐘、60分鐘、120分鐘，在相應時間點取出EP管，置於冰上預冷5分鐘，所有處理組離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，用FACS緩衝液洗滌一次，棄上清。0分鐘組外所有處理組EP管中加入250μL條形緩衝液，室溫孵育8分鐘，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。所有處理組加入100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀Bio-Rad(ZE5)進行檢測。
抗體內吞百分比(%)=(各個時間點螢光強度值-空白組的平均螢光強度值)/(0分鐘組的平均螢光輕度值-空白組的平均螢光強度值)*100，具體結果下表所示：
表10.全人源抗體在293T-人ERBB3的內吞作用
Figure 111100249-A0202-12-0027-18
結果顯示，本發明全人源抗體H01在過表達人ERBB3的HEK293T細胞(293T-人ERBB3)中有明顯的內吞作用。
實施例5：全人源抗體的配體阻斷實驗
藉由基於細胞的受體阻斷實驗(cRBA，cell-base receptor blocking assay)，測試抗體對配體與腫瘤細胞表達人ERBB3之間結合的阻斷作用。將表達ERBB3的人乳腺癌細胞SK-BR-3(南京科佰，Cat# CBP60413)進行胰酶消化並計數，用FACS緩衝液重新懸浮至1×106/mL，以每孔100μL鋪到96孔板中，離心：1500rpm、4℃、5分鐘，棄上清。配製2倍工作濃度的全人源抗體溶液(工作濃度30μg/mL)，以50μL每孔重新懸浮細胞沉澱，設置不加抗體孔作為對照孔，置於冰上孵育30分鐘。然後加入50μL濃度為1.2μg/mL的配體bio-HRG1(Sino Biological，Cat#11609-HNCH-B)，混勻後置於冰上孵育10分鐘，離心：1500rpm、4℃、5分鐘，棄上清，用FACS緩衝液洗兩次。加入100μL配製好的100倍稀釋液SA-PE(R&D，Cat # F0040)，4℃孵育45分鐘，FACS緩衝液洗兩次後用100μL重新懸浮細胞，用流式細胞儀Bio-Rad(ZE5)進行檢測，計算阻斷率並作曲線分析抗體的IC50濃度。
阻斷率(%)=(對照孔MFI-樣品孔MFI)/對照孔MFI×100，對照孔為不加全人源抗體的孔，樣品孔為加不同濃度梯度的全人源抗體孔。
表11.全人源抗體對配體的阻斷作用
Figure 111100249-A0202-12-0028-19
結果顯示，全人源抗體H01可以阻斷配體與腫瘤細胞表達的ERBB3之間的結合。
實施例6：二聚化阻斷實驗
本實驗藉由含報告系統的細胞株EGFR/ERBB3二聚化細胞(PathHunter®，Cat#93-1125C3)和ERBB2/ERBB3二聚化細胞(PathHunter®，Cat# 93-1042C3)，測定全人源抗體對EGFR/ERBB3和ERBB2/ERBB3異源二聚體形成的阻斷作用。將培養好的細胞配製成1×105/mL，以20μL每孔加入白色384孔板，孵育過夜。加入5μL配製好的抗體溶液(起始工作濃度30μg/mL，3倍梯度稀釋，10個濃度點)，室溫孵育1小時。然後加入5μL配體(對EGFR/ERBB3細胞株的工作濃度是64ng/mL，對ERBB2/ERBB3細胞株的工作濃度是36ng/mL)，設置加配體但不加抗體孔為二聚化陽性對照孔、不加抗體和配體孔為背景孔，37℃培養箱中孵育6~16小時，加入15μL(50% v/v)的PathHunter檢測試劑混合物(PathHunter®，Cat#93-0247)，室溫孵育1小時。在PerkinElmer EnvisionTM上進行化學發光讀數。藉由下列公式計算樣品孔的抑制率，並作曲線圖得到IC50值。
抑制率(%)=100% x (1-(樣品孔-背景孔)/(陽性對照孔-背景孔)
表12.全人源抗體的二聚化阻斷作用
Figure 111100249-A0202-12-0029-20
結果顯示，全人源抗體H01可阻斷EGFR/ERBB3、ERBB2/ERBB3的異源二聚化。
實施例7：磷酸化阻斷實驗
在配體依賴性ERBB3通路中，配體HRG結合腫瘤細胞表達的ERBB3蛋白使其磷酸化並被激活，進而與EGFR或ERBB2形成異源二聚體，從而激活下游的AKT和ERK途徑。本實驗藉由pHer3(Cisbio，Cat#64HR3PEG)、pAKT (Cisbio，Cat#64AKSPEG)以及pERK(Cisbio，Cat#64ERKPPEH)的磷酸化檢測試劑盒，測試ERBB3陽性的人乳腺癌細胞MCF-7在配體激活條件下，全人源抗體對Her3、AKT和ERK磷酸化的阻斷效果。
細胞MCF-7(ATCC，Cat#CRL-3435)經胰酶消化處理，離心棄上清，細胞沉澱用反應培養基(RPMI 1640培養基+10%熱滅活FBS+1%青黴素/鏈黴素)重新懸浮成1×106/mL，平底96孔板中(低吸附板)每孔加入100uL細胞懸液，四邊空孔用200ul PBS封閉，37度培養箱孵育6小時。排槍吸棄上清，每孔加入100uL饑餓培養基(RPMI 1640培養基+1%青黴素/鏈黴素)，放37度培養箱過夜孵育。加入50uL用饑餓培養基配製的全人源抗體(4倍工作濃度，即800nM)，設置不加抗體孔作為磷酸化激活的陽性對照孔，混勻後放37度孵育60分鐘。取出反應板，加入50ul用Starved medium配製的4倍工作濃度的配體HRG1-β(200ng/mL)，設置不加配體孔作為磷酸化陰性對照孔，設置不加抗體和配體孔作為背景對照孔。混勻後在37度培養箱孵育10分鐘。由於細胞是貼壁的，可以直接甩板棄上清，用pHer3、pAKT以及pERK的試劑盒檢測磷酸化作用。細胞沉澱加入70uL試劑盒裡的1*補充裂解緩衝液，室溫震盪反應30分鐘，排槍混勻後，取16ul裂解上清液到384孔板，然後加入4uL試劑盒中的兩種標記抗體混合液(20倍稀釋)。貼上錫紙膜封口，室溫孵育4h，酶標儀(Thermo,Lux)上進行HTRF(665nm和620nm)讀數，根據665nm/620nm×10000計算出各孔的Ratio值，並用該值計算阻斷率。
阻斷率(%)=(樣品孔-陰性對照孔)/(陽性對照孔-背景對照孔)。
表13.全人源抗體的磷酸化阻斷作用
Figure 111100249-A0202-12-0031-21
結果顯示，全人源抗體H01可阻斷Her3、AKT以及ERK的磷酸化。
<110> 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司(Shanghai Hansoh BioMedical Co.,Ltd) 大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司(Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co.,Ltd.)
<120> 一種抗ERBB3受體的抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途
<130> 721151CPCT
<150> CN202110003930.2
<151> 2021-01-04
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR1
<400> 1
Figure 111100249-A0202-12-0032-22
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR2
<400> 2
Figure 111100249-A0202-12-0032-23
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR3
<400> 3
Figure 111100249-A0202-12-0032-24
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR1
<400> 4
Figure 111100249-A0202-12-0033-25
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR2
<400> 5
Figure 111100249-A0202-12-0033-26
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR3
<400> 6
Figure 111100249-A0202-12-0033-27
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCVR
<400> 7
Figure 111100249-A0202-12-0033-28
Figure 111100249-A0202-12-0034-29
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCVR
<400> 8
Figure 111100249-A0202-12-0034-30
<210> 9
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HC
<400> 9
Figure 111100249-A0202-12-0034-31
Figure 111100249-A0202-12-0035-32
<210> 10
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LC
<400> 10
Figure 111100249-A0202-12-0035-33
Figure 111100249-A0202-12-0036-34
<210> 11
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1重鏈恆定區
<400> 11
Figure 111100249-A0202-12-0036-35
Figure 111100249-A0202-12-0037-36
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 輕鏈恆定區
<400> 12
Figure 111100249-A0202-12-0037-37
<210> 13
<211> 1342
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Figure 111100249-A0202-12-0037-38
Figure 111100249-A0202-12-0038-39
Figure 111100249-A0202-12-0039-40
Figure 111100249-A0202-12-0040-41
<210> 14
<211> 643
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Figure 111100249-A0202-12-0041-42
Figure 111100249-A0202-12-0042-43
<210> 15
<211> 643
<212> PRT
<213> 恆河猴(rhesus monkey)
<400> 15
Figure 111100249-A0202-12-0042-44
Figure 111100249-A0202-12-0043-46

Claims (21)

  1. 一種抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其包含：抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區；其中，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
  2. 如請求項1所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2和SEQ ID NO：3所示的HCDR3。
  3. 如請求項1所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2和SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
  4. 如請求項1所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區，其中，
    該抗體重鏈可變區包含：SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2和SEQ ID NO：3所示的HCDR3；並且
    該抗體輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2和SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的重鏈可變區。
  6. 如請求項1至4中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的輕鏈可變區。
  7. 如請求項1至4中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源性的輕鏈可變區。
  8. 如請求項5至7中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區；
    較佳地，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人的IgG1或其變體的重鏈恆定區；
    更佳包含人IgG1重鏈恆定區；
    最佳包含SEQ ID NO：11所示的重鏈恆定區；
    視需要地，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈或其突變體的輕鏈恆定區；
    較佳包含源自人λ鏈的輕鏈恆定區；
    最佳包含如SEQ ID NO：12所示的輕鏈恆定區。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9所示的重鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長重鏈。
  10. 如請求項1至8中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10所示的輕鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長輕鏈。
  11. 如請求項1至8中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段，其中，該抗ERBB3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9所示的重鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長重鏈，和SEQ ID NO：10所示的輕鏈，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性的全長輕鏈。
  12. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至11中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段。
  13. 一種表達載體，其含有如請求項12所述的多核苷酸。
  14. 一種宿主細胞，其導入或含有如請求項13所述的表達載體。
  15. 如請求項14所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為細菌、酵母菌或哺乳動物細胞；較佳大腸桿菌、畢赤酵母、CHO細胞或HEK293細胞。
  16. 一種生產抗ERBB3抗體或其抗原結合片段的方法，包括步驟：
    a)培養如請求項14或15所述的宿主細胞；
    b)從培養物中分離抗體；以及，
    c)對該抗體進行純化。
  17. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至1中1任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段、以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  18. 一種檢測或診斷試劑，其含有如請求項1至11中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段、以及一種或多種能檢測標記該ERBB3抗體或其抗原結合片段與ERBB3結合的試劑。
  19. 一種如請求項1至11中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段或如請求項17所述的醫藥組成物在製備用於治療或預防ERBB3介導的疾病或病症的藥物中的用途。
  20. 一種如請求項1至11中任一項所述的抗ERBB3抗體或其抗原結合片段或如請求項18所述的檢測或診斷試劑在製備用於檢測、診斷、預後ERBB3介導的疾病或病症的試劑盒中的用途。
  21. 如請求項19或20所述的用途，其中，
    該疾病或病症為癌症；
    較佳ERBB3表達或過表達的癌症；
    更佳乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、宮頸癌、膽囊癌、胰腺癌、睾丸癌、軟組識肉瘤、頭頸部癌、神經膠質瘤或黑色素瘤。
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