TW202132560A - 製備car-t細胞之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之方面涉及用於製備表現嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor， CAR)的基因改造的T細胞之方法，該方法提供對常規製備方法的一些改良，進而能夠使臨床上有用的CART細胞療法產生穩定的供應。
Description
本發明係關於一種製備CAR-T細胞之方法。本申請主張於2019年11月13日申請之美國臨時專利申請第62/934,999號之優先權的權益，該臨時專利申請之全部內容透過引用合併於本文。
嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor, CAR) T細胞療法在治療血液系統癌症方面已顯現出令人鼓舞的治療效果。通常，CAR-T細胞是由患者的免疫細胞(自體)或來自無關聯的人類捐贈者的免疫細胞(同種異體)的基因改造所產生。高品質、臨床等級CAR-T細胞的生產是該技術廣泛應用的前提。因此，發展用於大規模生產CAR-T細胞的有效製備方法具有非常大的利益。
本發明至少部分基於用於製備表現嵌合抗原受體(CAR)的基因改造的T細胞之方法的開發，該方法提供優於常規製備方法的一些改良。這樣的改良包括但不限於本文所述之遺傳修飾的一致性及效率的改善(例如，三重基因組編輯的一致性及效率的改善)，這能夠使臨床上有用的CAR T細胞療法產生穩定的供應。
據此，本發明之一方面提供一種製備基因改造的T細胞之方法，該方法包括：(i) 提供第一T細胞群；(ii) 將包含第一Cas9酶以及以CD70
基因為目標的第一引導RNA (guide RNA，gRNA)的第一核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)錯合物引入該第一T細胞群，以產生第二T細胞群，其中該第二T細胞群包括該CD70
基因被破壞的T細胞；(iii) 將包含第二Cas9酶以及以T細胞受體α鏈恆定區(T cell receptor alpha chain constant region，TRAC
)基因為目標的第二引導RNA (gRNA)的第二核糖核蛋白(RNP)錯合物以及包含第三Cas9酶以及以β-2微球蛋白(beta-2 microglobulin，β2M
)基因為目標的第三引導RNA (gRNA)的第三核糖核蛋白(RNP)錯合物引入該第二T細胞群，以產生第三T細胞群，其中該第三T細胞群包括該CD70
基因被破壞、該TRAC
基因被破壞、該β2M
基因被破壞的活化的T細胞；(iv) 將該第三T細胞群與腺相關病毒(adeno-associated viral，AAV)載體一起培養以產生第四T細胞群，其中該腺相關病毒(AAV)載體包含編碼嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的核酸序列，且其中該核酸序列側接該TRAC
基因的同源序列，且其中該第四T細胞群包含表現該CAR且該CD70
基因被破壞、該TRAC
基因被破壞、該β2M
基因被破壞的活化T細胞；(v) 擴增該第四T細胞群進而產生一擴增的T細胞群；(vi) 從該擴增的T細胞群中去除TCRαβ+
T細胞以產生一基因改造的T細胞群，其中該基因改造的T細胞群包含表現該CAR且該CD70
基因被破壞、該TRAC
基因被破壞、該β2M
基因被破壞的T細胞；以及(vii) 收穫該基因改造的T細胞群。
於某些具體實施例中，該第一T細胞群係衍生自從人類血液細胞富集的冷凍保存的T細胞。於某些具體實施例中，該第一T細胞群係透過以下方法所製備：(a) 從人類捐贈者獲得血液細胞；(b) 從該血液細胞中富集CD4+
T細胞及/或CD8+
T細胞。於某些具體實施例中，步驟(b)係使用與抗CD4及/或抗CD8抗體綴合的磁珠進行的。於某些具體實施例中，該第一T細胞群具有至少約80%的細胞存活率及/或至少約80%的CD4+
及CD8+
T細胞的純度。於某些具體實施例中，該方法進一步包括(c)冷凍保存在步驟(b)中產生的富集的CD4+
T細胞及CD8+
T細胞。
於某些具體實施例中，步驟(ii)透過電穿孔進行。於某些具體實施例中，該第一Cas9酶的濃度為約0.15 mg/mL，且以該CD70
基因為目標的該第一gRNA的濃度為約0.16 mg/mL。於某些具體實施例中，步驟(ii)中的細胞濃度為約100x106
個細胞/mL至約400x106
個細胞/mL。於某些具體實施例中，步驟(ii)中的細胞濃度為約100x106
個細胞/mL至約350x106
個細胞/mL。於某些具體實施例中，步驟(ii)中的細胞濃度為約300x106
個細胞/mL。
於某些具體實施例中，該方法進一步包括在步驟(ii)之後及在步驟(iii)之前，在細胞培養容器中在T細胞活化劑存在下培養該第二T細胞群以產生活化的T細胞群，其中該活化的T細胞群包括該CD70
基因被破壞的活化的T細胞。該T細胞活化劑可包括CD3激動劑以及CD28激動劑，且其中該CD3激動劑以及CD28激動劑附著於奈米基質顆粒。在細胞培養容器中在T細胞活化劑存在下培養該第二T細胞群，且細胞接種密度可為約2x106
個細胞/cm2
，並以細胞濃度為約2x106
個細胞/mL培養約72小時。於某些具體實施例中，該混合物中該T細胞活化劑與培養基的比例為約1:12.5 (v/v)。於其他具體實施例中，本文公開之方法可以進一步包括在該T細胞活化劑存在下培養該第二T細胞群之後，稀釋在該活化的T細胞群中的該T細胞活化劑以降低活化並使細胞在步驟(iii)之前恢復。
於某些具體實施例中，步驟(iii)透過電穿孔進行。於某些具體實施例中，步驟(iii)涉及一個電穿孔事件。於某些具體實施例中，該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物在一個電穿孔事件中被引入該活化的T細胞。於某些具體實施例中，該第二RNP錯合物中的該第二Cas9酶的量與該第三RNA錯合物中的該第三Cas9酶的量相同。於某些具體實施例中，該第二Cas9酶的濃度為約0.3 mg/mL，該第三Cas9酶的濃度為約0.3 mg/mL，以該TRAC
基因為目標的該第二gRNA的濃度為約0.08 mg/mL，且以該β2M
基因為目標的該第三gRNA的濃度約為0.2 mg/mL。於某些具體實施例中，步驟(iii)中的細胞濃度為約100x106
個細胞/mL至約400x106
個細胞/mL。於某些具體實施例中，步驟(iii) 中的細胞濃度為約300x106
個細胞/mL。於其他具體實施例中，步驟(iii)中使用的每個容器中的總細胞數可為約5x108
至約2.5x109
個細胞，例如約7x108
個細胞。於某些實施例中，步驟(iii) (例如，電穿孔)中可使用多個容器，例如約5-10個容器。於特定的實施例中，步驟(iii)中可使用多達7個容器，其可包含例如用於電穿孔的約1.5x109
至約3x109
個細胞(例如，約2.1x109
個細胞或約2.7x109
個細胞)。
於某些具體實施例中，該AAV載體的感染複數(multiplicity of infection，MOI)值為約10,000至約80,000。於某些具體實施例中，該AAV載體的MOI為約20,000。於某些具體實施例中，該AAV載體為AAV血清型6 (AAV6)載體。
於某些具體實施例中，步驟(v)係透過在細胞培養容器中以約2x105
個細胞/cm2
至約5x105
個細胞/cm2
的接種密度培養該第四T細胞群約7天至約12天所進行的。於某些具體實施例中，可以約150,000個細胞/cm2
至約600,000個細胞/cm2
的接種密度將該第四T細胞群接種在細胞培養容器中。於某些具體實施例中，以約3x105
個細胞/cm2
至約5x105
個細胞/cm2
的接種密度培養該第四T細胞群。於某些具體實施例中，該細胞培養容器為靜態細胞培養容器(於本文中亦可互換地稱為靜態培養容器)，其允許細胞擴增約10天至約12天而無需更換培養基。
於某些具體實施例中，步驟(vi)係透過使該擴增的細胞與固定有抗TCRαβ抗體的微珠接觸，並收集未結合的細胞而進行的。
於某些具體實施例中，該第一Cas9酶、該第二Cas9酶，及/或該第三Cas9酶為化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes
) Cas9核酸酶(spCas9)。於某些具體實施例中，該第一Cas9酶、該第二Cas9酶，以及該第三Cas9酶是相同的。於某些具體實施例中，該第一Cas9酶、該第二Cas9酶，以及該第三Cas9酶包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
於某些具體實施例中，以該CD70
基因為目標的該第一gRNA包含SEQ ID NO: 4的間隔子序列。於某些具體實施例中，以該CD70
基因為目標的該第一gRNA包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
於某些具體實施例中，以該TRAC
基因為目標的該第二gRNA包含SEQ ID NO: 8的間隔子序列。於某些具體實施例中，以該TRAC
基因為目標的該第二gRNA包含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列。
於某些具體實施例中，以該β2M
基因為目標的該第三gRNA包含SEQ ID NO: 12的間隔子序列。於某些具體實施例中，以該β2M
基因為目標的該第三gRNA包含SEQ ID NO: 10的核苷酸序列。
於某些具體實施例中，該第一gRNA、該第二gRNA、該第三gRNA，及/或其組合包含一個或多個2’-O-甲基硫代磷酸酯修飾。
於某些具體實施例中，該CAR包含以癌症抗原為目標的胞外結構域、跨膜結構域、共刺激結構域，以及CD3ζ細胞質訊息傳遞結構域。於某些具體實施例中，該胞外結構域包含單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)，該跨膜結構域衍生自CD8a，及/或該共刺激結構域衍生自4-1BB。於某些具體實施例中，該scFv片段結合CD70。於某些具體實施例中，該CAR包含SEQ ID NO: 46的胺基酸序列。
據此，本發明之一方面提供一種製備基因改造的T細胞之方法，該方法包括：(i) 提供第一T細胞群；(ii) 將包含第一Cas9酶以及以CD70
基因為目標的第一引導RNA (guide RNA，gRNA)的第一核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)錯合物引入該第一T細胞群，以產生第二T細胞群，其中該第二T細胞群包括該CD70
基因被破壞的T細胞；(iii) 在細胞培養容器中在T細胞活化劑存在下培養該第二T細胞群，以產生第三T細胞群，其中該第三T細胞群包含CD70
基因被破壞的活化的T細胞；(iv)將包含第二Cas9酶以及以T細胞受體α鏈恆定區(TRAC
)基因為目標的第二引導RNA (gRNA)的第二核糖核蛋白(RNP)錯合物以及包含第三Cas9酶以及以β-2微球蛋白(β2M
)基因為目標的第三引導RNA (gRNA)的第三核糖核蛋白(RNP)錯合物引入該第三T細胞群，以產生第四T細胞群，其中該第四T細胞群包括該CD70
基因被破壞、該TRAC
基因被破壞、該β2M
基因被破壞的活化的T細胞；(v) 將該第四T細胞群與腺相關病毒(AAV)載體一起培養以產生第五T細胞群，其中該腺相關病毒(AAV)載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列，且其中該核酸序列側接該TRAC
基因的同源序列，且其中該第五T細胞群包含表現該CAR且該CD70
基因被破壞、該TRAC
基因被破壞、該β2M
基因被破壞的活化T細胞；(vi) 擴增該第五T細胞群進而產生擴增的T細胞群；(vii) 從該擴增的T細胞群中去除TCRαβ+
T細胞以產生基因改造的T細胞群，其中該基因改造的T細胞群包含表現該CAR且該CD70
基因被破壞、該TRAC
基因被破壞、該β2M
基因被破壞的T細胞；以及(viii) 收穫該基因改造的T細胞群。
於某些具體實施例中，透過本文所述之方法產生的一種基因改造的T細胞群。
於以下之描述中闡述本發明之一或多個實施例之細節。從以下附圖與數個實施例之詳細描述，以及從所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。
本發明至少部分地基於用於生產CAR-T細胞，特別是同種異體CAR-T細胞的改良的製備方法之發展，包括用於製備方法的一個或多個步驟的改良的條件。本文公開之改良的製備方法至少導致以下有益結果：
(a) 由於本文提供之改良的T細胞活化條件導致的電穿孔後增加的%CAR+
表現及減弱的細胞損失。
(b) 由於本文提供之活化的T細胞條件的改良的CRISPR-Cas9調節的基因編輯而導致的T細胞中的β2M
基因被破壞的改善的一致性及改善的效率。
(c) 由於本文提供之改善的T細胞電穿孔條件導致的較低的易位率。
(d) 由於本文所述之改良的製備方法所減少的生產時間及降低的生產成本而導致的CAR T細胞療法的供應增加。
(e) 由於使用本文所述之改良的製備方法生產均勻且高品質的CAR T療法而導致的製備藥物產品的可變性降低。
(f) 簡化的AAV轉導條件，同時在T細胞中維持高CAR表現含量。
因此，本文提供一種用於製備表現CAR構築體的基因改造的T細胞之方法，例如以癌症抗原，例如CD70，為目標且具有CD70
、TRAC
，以及β2M
基因敲除的CAR構築體。透過本文描述之方法產生的基因改造的T細胞群及其治療用途也在本發明之範圍內。I. 製備基因改造的 T 細胞
本發明之方面提供用於製備基因改造的T細胞之方法，該基因改造的T細胞包括被破壞的分化簇70 (CD70
)基因、被破壞的β2-微球蛋白(β2M
)基因，以及被破壞的T細胞受體α鏈恆定區(TRAC
)基因，以及編碼嵌合抗原受體(CAR)的插入的核酸。
該CD70
基因的破壞可防止基因改造的T細胞製備過程中的細胞間殺傷。替代地或另外地，該CD70
基因的破壞使得該基因改造的T細胞的健康及功能提高(例如，延長增殖，減少衰竭)。該β2M
基因以及該TRAC
基因的破壞使該基因改造的T細胞無反應性且適合同種異體移植。插入編碼一CAR的核酸可使該基因改造的T細胞在其表面上表現CAR，進而使該基因改造的T細胞以癌細胞為目標。
據此，於某些具體實施例中，本文公開之用於製備基因改造的T細胞之方法涉及使用CRISPR-Cas9基因編輯來破壞CD70
、TRAC
，以及β2M
基因的表現，並使用腺相關病毒(AAV)轉導以插入編碼CAR的核酸。
通常，本文公開之製備CAR-T細胞之方法可包括： (i) 從適合的人類免疫細胞來源富集CD4+
/CD8+
T細胞，(ii) 活化富集的CD4+
/CD8+
T細胞；(iii) 對活化的T細胞進行基因改造，以產生具有被破壞的CD70
、TRAC
，以及β2M
基因的CAR-T細胞；並收集基因改造的T細胞用於治療。需要時，可透過冷凍保存富集的CD4+
/CD8+
T細胞，以備將來使用。替代地或另外地，可在收穫之前在體外擴增該基因改造的T細胞。這樣產生的CAR-T細胞群中的TCRαβ+
T細胞可能被耗盡。 (i) T 細胞富集
本文公開之任何製備方法都可使用人類血液細胞作為起始材料。例如，可使用本領域技術人員已知之技術，例如沉澱，如，FICOLLTM
分離，從自個體收集的單位血液中獲得T細胞。或者，用於製備基因改造的T細胞之T細胞可透過體外分化衍生自幹細胞(例如，HSCs或iPSCs)。於某些具體實施例中，血液細胞可獲自單一人類捐贈者。於其他具體實施例中，血液細胞可以獲自多個人類捐贈者(例如，2、3、4或5個人類捐贈者)。
於某些實施例中，可使用來自適合的人類捐贈者的白血球單採術(leukopak)樣本。如本領域已知的，白血球單採術樣本為從周邊血收集的富集的白血球分離術產物。其通常包含各種血液細胞，包括單核細胞、淋巴細胞、血小板、血漿，以及紅血球。人類捐贈者較佳為健康的人類捐贈者。例如，人類捐贈者候選者可接受HBV、HCV、HIV、HTLV、WNV、克氏錐蟲，及/或CMV的篩選。在篩選中顯示陰性結果的人類個體可作為血液細胞的捐贈者。
在本方法中發現有用的T細胞的來源並無特別限制。於某些具體實施例中，來自T細胞庫的T細胞可作為本文公開之任何製備方法中的起始材料。T細胞庫可包含具有某些基因(例如，涉及細胞自我更新、細胞凋亡，及/或T細胞衰竭或複製性衰老的基因)的遺傳編輯的T細胞，以改善T細胞在細胞培養物中的持久性。T細胞庫可由真正的T細胞產生，例如，非轉化T細胞、終末分化T細胞、具有穩定基因組的T細胞，及/或依賴於細胞激素及生長因子進行增殖及擴增的T細胞。或者，可從例如造血幹細胞(例如，iPSCs)等前體細胞，例如體外培養產生這種T細胞庫。於某些實施例中，T細胞庫中的T細胞可包括對涉及細胞自我更新的一種或多種基因、涉及凋亡的一種或多種基因，及/或涉及T細胞衰竭的一種或多種基因的遺傳編輯，因此破壞或減少此類基因的表現，進而改善培養的持久性。T細胞庫中經編輯的基因之實施例包括，但不限於，Tet2、Fas、CD70、Regnase-1，或組合。相較於未經編輯的T對應物，T細胞庫中的T細胞可能具有增強的培養擴增能力、增強的增殖能力、較強的T細胞活化作用，及/或降低的細胞凋亡程度。
使用常規方法或本文公開之方法，可從人類血液細胞中富集適合的T細胞。用於製備基因改造的T細胞之T細胞可表現一種或多種T細胞標記物，包括但不限於CD4+
、CD8+
，或其一組合。於某些具體實施例中，CD4+
T細胞可從人類血液細胞中富集。於其他具體實施例中，可富集CD8+
T細胞。於特定的實施例中，從人類血液細胞中純化出CD4+
及CD8+
T細胞。
可使用本領域已知的任何方法或本文公開的那些方法，例如使用能夠針對該目標T細胞結合特定細胞表面生物標記的抗體，例如，對CD4特異性的抗體及/或對CD8特異性的抗體，從適合的血液細胞來源，如本文所述的那些中分離CD4+
T細胞及/或CD8+
T細胞。於某些具體實施例中，可使用綴合至磁珠的抗CD4及抗CD8抗體來富集CD4+
T細胞及CD8+
T細胞。可以在適合的條件下將包含CD4+
及CD8+
T細胞的細胞群體與此類磁珠一起培養一段適合的時間，以允許目標T細胞透過綴合至磁珠的抗體與磁珠結合。可洗滌未結合的細胞，並可使用常規方法收集與磁珠結合的CD4+
及CD8+
T細胞。
以常規方法進行後，可評估富集的T細胞(例如，CD4+
T細胞及CD8+
T細胞)的特徵，例如細胞存活率及/或該目標T細胞的純度。於某些具體實施例中，來自本文公開之富集步驟的T細胞群可具有至少約80%的細胞存活率(例如，至少約85%、至少約90%、至少約95%，或以上)。替代地或除此之外，該富集的T細胞群可具有至少約80%的目標T細胞(例如，CD4+
及/或CD8+
T細胞)的純度，例如，至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、約98%或更高。替代地或除此之外，該富集的T細胞群可具有至少約70%的該目標T細胞(例如，CD4+
及/或CD8+
T細胞)的純度，例如，至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、約98%或更高。
「大約」或「近似」等詞係指於特定值的可接受誤差範圍內，如本領域普通技術人員所確定的，該誤差範圍將部分取決於如何測量或確定該數值，即該測量系統的限制。例如，根據本領域的作法，「約」可表示在可接受的標準偏差內。替代地，「約」可意指給定值的至多±20%，較佳至多±10%，更佳至多±5%，且還更佳至多±1%的範圍。可替代地，特別是關於生物系統或方法，該術語可表示在數值的數量級內，較佳在數值的兩倍內。除非另有說明，否則在本發明及申請專利範圍中描述特定數值的情況下，術語「約」是隱含的，並且在此上下文中意味著該特定數值在可接受的誤差範圍內。
富集的T細胞群(也在本發明之範圍內)可立即用於本文所公開之進一步處理。替代地，可將富集的T細胞群在適合的條件下儲存以備將來使用，例如，透過冷凍保存。在進一步處理之前，可按照常規步驟將凍存的T細胞解凍。可評估解凍細胞的細胞存活率，以確定解凍細胞是否適合進一步處理。 (ii) CRISPR-CAS9 調節的富集 T 細胞基因編輯
透過本文公開之任何方法製備的富集的T細胞可透過例如CRISPR-Cas9基因編輯技術進行基因編輯以敲除CD70。在第一電穿孔步驟中敲除CD70
基因，然後在第二電穿孔步驟中敲除TRAC
及β2M
基因，可顯著提高編輯效率並減少基因編輯過程中產生的易位數量。請參閱以下實施例。
該CD70
基因編碼腫瘤壞死因子超級家族的成員，其表現僅限於活化的T淋巴細胞與B淋巴細胞以及成熟的樹突狀細胞。CD70透過與其配體CD27相互作用而參與腫瘤細胞及調節性T細胞的存活。CD70
基因的破壞可最大程度地降低基因改造的T細胞製備過程中細胞間殺傷的風險，並使產生的基因改造的T細胞的健康狀況及功能得以提高。CRISPR-Cas9 調節的基因編輯系統
CRISPR-Cas9系統為原核生物中天然存在的防禦機制，已被重新作為用於基因編輯的RNA引導的DNA標靶平台。其依靠DNA核酸酶Cas9以及兩個非編碼RNA，crispRNA (crRNA)以及反式活化RNA (trans-activating RNA，tracrRNA)，以DNA的切割為目標。CRISPR為簇狀規則間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)的縮寫字，這是一種在細菌與古細菌基因組中發現的一DNA序列家族，其中包含的DNA片段(間隔子DNA)與先前暴露於細胞的外源DNA相似，例如透過感染或攻擊該原核生物的病毒。當相似的外源DNA再度引入時，例如，從在隨後的攻擊中從相似的病毒引入，原核生物使用這些DNA片段來偵測並破壞該相似的外源DNA。CRISPR基因座的轉錄導致包含間隔子序列的RNA分子的形成，該間隔子序列與能夠識別並切割該陌生、外源DNA的Cas (CRISPR相關)蛋白結合並以其為標靶。許多類型及種類的CRISPR/Cas系統已被描述(參見，例如，Koonin等人，(2017年) Curr Opin Microbiol 37:67-78)。
crRNA透過Watson-Crick鹼基通常與目標DNA中的20個核苷酸(nucleotide，nt)序列配對以驅動CRISPR-Cas9錯合物的序列識別及特異性。改變crRNA中5’ 20個核苷酸的序列可使CRISPR-Cas9錯合物以特定基因座為目標。如果該目標序列後接特定的短DNA模體(具有序列NGG)，其稱為原間隔子相鄰模體(protospacer adjacent motif，PAM)，則CRISPR-Cas9錯合物僅結合包含與該crRNA的前20個核苷酸序列配對的DNA序列。
TracrRNA與crRNA的3’端雜交形成一RNA雙股結構，該雙股結構與該Cas9核酸內切酶結合形成催化活化的CRISPR-Cas9錯合物，然後可以切割該目標DNA。
一旦該CRISPR-Cas9錯合物在一目標位點與DNA結合，該Cas9酶內的兩個獨立的核酸酶結構域就分別裂解PAM位點上游的DNA雙股之一，進而留下一雙股斷裂(double-strand break，DSB)，其中該DNA的雙股都終止於一鹼基對(平端)。
在一特定目標位點處將CRISPR-Cas9錯合物與DNA結合並形成該位點特異性雙股斷裂(DSB)後，下一個關鍵步驟為修復該DSB。細胞使用兩種主要的DNA修復途徑來修復該DSB：非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)以及同源定向修復(homology-directed repair，HDR)。
非同源末端連接(NHEJ)為一種強大的修復機制，在包括非分裂細胞在內的大多數細胞類型中表現出很高的活性。NHEJ容易出錯，通常會導致在雙股斷裂(DSB)的位點去除或添加一個至幾百個核苷酸，儘管此類修飾通常小於20 個核苷酸。產生的插入及缺失(insertions and deletions，indels)會破壞基因的編碼或非編碼區域。此外，同源定向修復(HDR)使用內源性或外源性提供之一長段同源捐贈者DNA以高保真度來修復DSB。HDR僅在分裂的細胞中有效，且在大多數細胞類型中發生的頻率相對較低。於本發明之許多具體實施例中，使用NHEJ操作修復。
(a)Cas9
於某些具體實施例中，將Cas9 (CRISPR相關蛋白9)核酸內切酶用於CRISPR方法中以製備本文公開之基因改造的T細胞。該Cas9酶可為來自化膿鏈球菌的一種Cas9酶，儘管亦可使用其他Cas9同源物。應當理解的是，如本文所提供，可使用野生型Cas9或可使用Cas9的修飾形式(例如，Cas9的進化形式，或Cas9直向同源物或變體)。於某些具體實施例中，Cas9包含化膿鏈球菌來源的Cas9核酸酶蛋白，其已被改造為包括C及N端SV40大T抗原核定位序列(nuclear localization sequences，NLS)。所得的Cas9核酸酶(sNLS-spCas9-sNLS)為一162 kDa的蛋白質，透過重組大腸桿菌發酵產生並透過色層分析法純化。該spCas9胺基酸序列可以UniProt登錄號Q99ZW2找到，其在本文中提供為SEQ ID NO: 1。
(b)引導 RNAs ( Guide RNAs ， gRNAs)
如本文所述之CRISPR-Cas9調節的基因編輯包括使用引導RNA或gRNA。如本文所用，「gRNA」係指以基因組為目標的核酸，其可將Cas9引導至CD70
基因或TRAC
基因或β2M
基因內的特定目標序列，以於特定目標序列處進行基因編輯。引導RNA包含與欲編輯的目標基因內的目標核酸序列雜交的至少間隔子序列以及CRISPR重複序列。
SEQ ID NO: 2提供以CD70
基因為目標的示例性gRNA。亦參閱於2019年5月10日申請之國際申請第PCT/IB2019/000500號，其現公開為第WO2019/215500號，出於本文引用之主題及目的，其相關公開內容透過引用併入本文。可使用位於第19號染色體上的CD70
基因序列(GRCh38：染色體19：6,583,183-6,604,103；Ensembl；ENSG00000125726)設計其他gRNA序列。
於某些具體實施例中，以該CD70基因組區域及Cas9為目標的gRNA在該CD70基因組區域中產生斷裂，導致在該CD70
基因中的插入或缺失突變(Indels)破壞mRNA或蛋白質的表現。於某些具體實施例中，以該CD70基因組區域為目標的gRNA在該CD70
基因中產生插入或缺失突變，該CD70
基因包含選自表 11
中的序列的至少一個核苷酸序列。於某些具體實施例中，以該CD70基因組區域為目標的gRNA (SEQ ID NO: 2)在該CD70
基因中產生插入或缺失突變，該CD70
基因包含選自表 11
中的序列的至少一個核苷酸序列。
SEQ ID NO: 6提供以TRAC
基因為目標的示例性gRNA。亦參閱於2018年5月11日申請之國際申請第PCT/IB2018/001619號，其公開為第WO2019/097305A2號，出於本文引用之主題及目的，其相關公開內容透過引用併入本文。可使用位於第14號染色體上的TRAC基因序列(GRCh38：染色體14：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734)設計其他gRNA序列。
於某些具體實施例中，以TRAC基因組區域及Cas9為目標的gRNA在該TRAC基因組區域中產生斷裂，導致該TRAC
基因中的插入或缺失突變破壞mRNA或蛋白質的表現。於某些具體實施例中，以TRAC基因組區域為目標的gRNA在該TRAC
基因中產生插入或缺失突變，該TRAC
基因包含選自表 9
中的序列的至少一個核苷酸序列。於某些具體實施例中，以TRAC基因組區域為目標的gRNA (SEQ ID NO: 6)在該TRAC
基因中產生插入或缺失突變，該TRAC
基因包含選自表 9
中序列的至少一個核苷酸序列。
SEQ ID NO: 10提供以β2M
基因為目標的示例性gRNA。亦參閱於2018年5月11日申請之國際申請第PCT/IB2018/001619號，其公開為第WO2019/097305A2號，出於本文引用之主題及目的，其相關公開內容透過引用併入本文。可使用第15號染色體上的β2M
基因序列(GRCh38坐標：染色體15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710)設計其他gRNA序列。
於某些具體實施例中，以該β2M基因組區域為目標的gRNA以及RNA引導的核酸酶在該β2M
基因組區域中產生斷裂，導致該β2M
基因中的插入或缺失突變破壞mRNA或蛋白質的表現。於某些具體實施例中，以β2M基因組區域為目標的gRNA在該β2M
基因中產生插入或缺失突變，該β2M
基因包含選自表 10
中的序列的至少一個核苷酸序列。於某些具體實施例中，以β2M基因組區域為目標的gRNA (SEQ ID NO: 10)在該β2M
基因中產生插入或缺失突變，該β2M
基因包含選自表 10
中的序列的至少一個核苷酸序列。
在第II型系統中，該gRNA還包含稱為tracrRNA序列的第二RNA。在該第II型gRNA中，該CRISPR重複序列及tracrRNA序列彼此雜交形成雙股結構。在第V型gRNA中，該crRNA形成雙股結構。在這兩個系統中，該雙股結構都結合定位多胜肽，進而使該引導RNA與定位多胜肽形成錯合物。於某些具體實施例中，該以基因組為目標的核酸由於其與該定位多胜肽的結合而為該錯合物提供目標特異性。因此，該以基因組為目標的核酸指導該定位多胜肽的活性。
如本領域普通技術人員所理解的，每個引導RNA被設計為包括與其基因組目標序列互補的間隔子序列。參見Jinek等人，Science，337，816-821 (2012年)以及Deltcheva等人，Nature，471，602-607 (2011年)。
於某些具體實施例中，該以基因組為目標的核酸(例如，gRNA)為一雙分子引導RNA。於某些具體實施例中，該以基因組為目標的核酸(例如，gRNA)為單分子引導RNA。
雙分子引導RNA包含兩股RNA分子。第一股在5’至3’方向上包含選擇性的間隔子延伸序列、間隔子序列，以及最小CRISPR重複序列。第二股包含最小tracrRNA序列(與該最小CRISPR重複序列互補)、3’ tracrRNA序列，以及選擇性的tracrRNA延伸序列。
第II型系統中的單分子引導RNA (稱為「sgRNA」)在5’至3’方向上包含選擇性的間隔子延伸序列、間隔子序列、最小CRISPR重複序列、單分子引導連接子、最小tracrRNA序列、3’ tracrRNA序列，以及選擇性的tracrRNA延伸序列。該選擇性的tracrRNA延伸可包含對該引導RNA有貢獻的附加功能(例如，穩定性)的元素。該單分子引導連接子將該最小CRISPR重複序列以及該最小tracrRNA序列連接起來，形成髮夾結構。該選擇性的tracrRNA延伸包含一個或多個髮夾結構。第V型系統中的單分子引導RNA在5’至3’方向上包含最小CRISPR重複序列以及間隔子序列。
該「目標序列」在與PAM序列相鄰的目標基因中，且為要被Cas9修飾的序列。該「目標序列」在「目標核酸」中的所謂的PAM股上，該目標核酸為包含該PAM股以及互補的非PAM股的雙股分子。本領域技術人員認識到，該gRNA間隔子序列與位於該目標核酸的該非PAM股中的互補序列雜交。因此，該gRNA間隔子序列為該目標序列的RNA等同物。
例如，若該CD70目標序列為5’-GCTTTGGTCCCATTGGTCGC-3’ (SEQ ID NO: 15)，則該gRNA間隔子序列為5’-GCUUUGGUCCCAUUGGUCGC-3’ (SEQ ID NO: 5)。於另一實施例中，若該TRAC目標序列為5’-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3’ (SEQ ID NO: 17)，則該gRNA間隔子序列為5’-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3’ (SEQ ID NO: 9)。於另一實施例中，若該β2M目標序列為5’-GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3’ (SEQ ID NO: 19)，則該gRNA間隔子序列為5’-GCUACUCUCUCUUUCUGGCC-3’ (SEQ ID NO: 13)。gRNA的間隔子透過雜交(亦即，鹼基配對)以序列特異性的方式與目標核酸相互作用。因此，該間隔子的核苷酸序列根據目標核酸的目標序列而變化。
於本文的CRISPR/Cas系統中，該間隔子序列設計成與該目標核酸的區域雜交，該區域位於該系統中使用的Cas9酶可識別的PAM的5’端。該間隔子可能與該目標序列完全配對或可能有錯配。每個Cas9酶都有一個特定的PAM序列，可在目標DNA中識別。例如，化膿鏈球菌在目標核酸中識別包含序列5’-NRG-3’的PAM，其中R包括A或G，其中N為任何核苷酸，且N為緊鄰該間隔子序列靶向的目標核酸序列的3’端。
於某些具體實施例中，該目標核酸序列的長度為20個核苷酸。於某些具體實施例中，該目標核酸的長度小於20個核苷酸。於某些具體實施例中，該目標核酸的長度大於20個核苷酸。於某些具體實施例中，該目標核酸的長度至少為：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多個核苷酸。於某些具體實施例中，該目標核酸的長度最多為：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多個核苷酸。於某些具體實施例中，該目標核酸序列具有緊鄰該PAM的第一核苷酸的5’端的20個鹼基。例如，在包含5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3’的序列中，該目標核酸可為與Ns相對應的序列，其中N可為任何核苷酸，且以底線標示的NRG序列為化膿鏈球菌PAM。
gRNA中的間隔子序列為定義目標基因的目標序列(例如，DNA目標序列，例如基因組目標序列)的序列(例如，20個核苷酸序列)。SEQ ID NO: 4提供以CD70
基因為目標的gRNA的示例性間隔子序列。SEQ ID NO: 8提供以TRAC
基因為目標的gRNA的示例性間隔子序列。SEQ ID NO: 12提供以β2M
基因為目標的gRNA的示例性間隔子序列。
本文所公開之引導RNA可透過該crRNA中的間隔子序列以任何目標序列為目標。於某些具體實施例中，該引導RNA的間隔子序列與該目標基因中的目標序列之間的互補程度可為約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%，或100%。於某些具體實施例中，該引導RNA的間隔子序列與該目標基因中的目標序列為100%互補的。於其他具體實施例中，該引導RNA的間隔子序列與該目標基因中的目標序列可包含多達10個錯配，例如，至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個，或至多1個錯配。
可以如本文所提供使用的gRNAs的非限制性實施例提供於2018年5月11日申請的國際申請第PCT/IB2018/001619號，已公開為第WO2019/097305A2號，以及於2019年5月10日申請的國際申請第PCT/IB2019/000500號，已公開於為第WO2019/215500號，出於本文引用之目的及主題，將每個在先申請的相關公開內容透過引用併入本文。對於本文提供之任何gRNA序列，未明確指示修飾的那些目的在於包括未修飾的序列與具有任何適合的修飾的序列。
本文公開之任何gRNA中該間隔子序列的長度可取決於CRISPR/Cas9系統及用於編輯本文公開之任何目標基因的組成分。例如，來自不同細菌物種的不同Cas9蛋白具有不同的最佳間隔子序列長度。據此，該間隔子序列可具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 ，27、28、29、30、35、40、45、50或超過50個核苷酸的長度。於某些具體實施例中，該間隔子序列的長度可為18-24個核苷酸。於某些具體實施例中，該目標序列可具有19-21個核苷酸的長度。於某些具體實施例中，該間隔子序列可包含20個核苷酸的長度。
於某些具體實施例中，該gRNA可為sgRNA，其可在該sgRNA序列的5’端包含20個核苷酸間隔子序列。於某些具體實施例中，該sgRNA可在該sgRNA序列的5’端包含少於20個核苷酸的間隔子序列。於某些具體實施例中，該sgRNA可在該sgRNA序列的5’端包含大於20個核苷酸的間隔子序列。於某些具體實施例中，該sgRNA包含在該sgRNA序列的5’端具有17-30個核苷酸的可變長度間隔子序列。實施例 5
的表 8
提供了實例。
於某些具體實施例中，該sgRNA在該sgRNA序列的3’端不包含尿嘧啶。於其他具體實施例中，該sgRNA可在該sgRNA序列的3’端包含一個或多個尿嘧啶。例如，該sgRNA可在該sgRNA序列的3’端包含1-8個尿嘧啶殘基，例如，在該sgRNA序列的3’端的1、2、3、4、5、6、7或8個尿嘧啶殘基。
本文公開之任何gRNA，包括任何sgRNA，可為未修飾的。或者，其可包含一個或多個修飾的核苷酸及/或修飾的主鏈。例如，修飾的gRNA，例如sgRNA，可包含一個或多個2’-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸，其可位於5’端、3’端，或這兩端。
於某些具體實施例中，超過一種的引導RNA可與CRISPR/Cas核酸酶系統一起使用。每個引導RNA可能包含不同的目標序列，以使CRISPR/Cas系統裂解一個以上的目標核酸。於某些具體實施例中，一種或多種引導RNA可在該Cas9 RNP錯合物中具有相同或不同的性質，例如活性或穩定性。當使用多個引導RNA時，每個引導RNA可在相同或不同的載體上編碼。用於驅動一個以上引導RNA表現的啟動子為相同或不同的。
應當理解的是，於本文所述之方法中可使用超過一種的適合的Cas9以及超過一種的適合的gRNA，例如，本領域已知的或本文所公開的那些。於某些具體實施例中，方法包括本領域已知的Cas9酶及/或gRNA。可在例如於2018年5月11日申請的國際申請第PCT/IB2018/001619號，現已公開為第WO 2019/097305A2號，以及於2019年5月10日申請的國際申請第PCT/IB2019/000500號，現已公開為第WO2019/215500號中找到實例，出於本文引用之目的及主題，將每個在先申請的相關公開內容透過引用併入本文。CD70
、TRAC
以及β2M
基因的基因編輯
於某些具體實施例中，本文所公開之富集的T細胞可在本文公開之條件下透過CRISPR-Cas9調節的基因編輯進行該CD70
基因、該TRAC
基因，以及該β2M
基因的基因編輯，相較於傳統條件，這將導致更高及更一致的基因編輯效率以及更低的易位率。
於特定實施例中，以該CD70
基因為目標的該RNP錯合物可包含約0.15 mg/mL的Cas9 (例如，SEQ ID NO: 1的Cas9)以及約0.16 mg/mL的以該CD70
基因為目標的gRNA (例如，CD70-7的gRNA)。RNPs對基因編輯很有用，至少因為它們使在富含核酸的細胞環境中混雜相互作用的風險降到最低，並保護RNA免受降解。形成RNPs之方法為本領域已知的。
透過將RNPs與適量的富集的T細胞混合，可將本文公開之以CD70為目標的RNPs引入富集的T細胞中，且由此形成的混合物在適合的條件下進行電穿孔，以允許將該RNPs遞送到該細胞中。於某些情況下，合適量的富集的T細胞可在約100x106
個細胞/mL至約400x106
個細胞/mL的範圍內。例如，用於第一電穿孔步驟的T細胞的合適量可在約200x106
個細胞/mL至約350x106
個細胞/mL的範圍內。於某些具體實施例中，該富集的T細胞的濃度可為約100x106
個細胞/mL。於某些具體實施例中，該富集的T細胞的濃度可為約200x106
個細胞/mL。於某些具體實施例中，該富集的T細胞的濃度可為約300x106
個細胞/mL或約350x106
個細胞/mL。
電穿孔後，可將該CD70
基因被破壞的T細胞在新鮮培養基中培養一段適合的恢復時間。基因編輯效率可按照常規方法進行。如此產生的經遺傳編輯的T細胞可進行T細胞活化步驟，以提高下游基因編輯效率及T細胞擴增步驟。
該TRAC
基因編碼TCR錯合物的組成分。該TRAC
基因的破壞導致該TCR功能喪失，並使基因改造的T細胞無反應性，適合同種異體移植，進而最大程度地降低移植物抗宿主疾病的風險。該β2M
基因編碼第I型主要組織相容性錯合物(major histocompatibility complex，MHC I)錯合物的常見(不變)組成分。破壞該β2M
基因可預防宿主與治療同種T細胞的反應。敲除該TRAC
基因及該β2M
基因將導致產生用於細胞治療的同種異體T細胞。
於某些具體實施例中，本文所公開之製備方法可包括多個基因編輯步驟，以依次編輯該T細胞中的目標基因(CD70
、TRAC
，以及β2M
)並將CAR編碼核酸引入該T細胞中用以表現。每個基因編輯步驟都可能涉及電穿孔步驟，以將引導RNAs、Cas9酶，及/或CAR編碼核酸引入該T細胞中，以對該目標基因(CD70
、TRAC
，以及β2M
)進行基因編輯以及使CAR 在T細胞中表現。
於某些具體實施例中，在第一電穿孔事件中編輯CD70，且在第二電穿孔事件中編輯β2M/TRAC。參見例如圖 3A
。然而，無意將本文描述之方法限於該步驟順序。圖 2A
及2B
中提供之數據顯示，在第一電穿孔中遞送的CD70及β2M的引導均有利地導致較低的易位比率。因此，於其他具體實施例中，CD70及β2M都可在第一電穿孔事件中被作為目標。
於某些情況下，可在第一電穿孔步驟中將以CD70
基因及Cas9酶為目標的一個或多個引導RNAs引入該T細胞以破壞該CD70
基因，且以TRAC
及β2M
基因為目標的一個或多個引導RNAs、一Cas9酶，以及一CAR編碼核酸可在第一電穿孔步驟之後，在第二電穿孔步驟中被引入該T細胞，以破壞該TRAC
及β2M
基因，並將該CAR編碼核酸引入T細胞。於某些實施例中，可使用一種或多種T細胞活化劑，例如在第一電穿孔步驟之後以及在第二電穿孔步驟之前的如本文所述的那些，以對T細胞進行活化。如以下實施例 3
所示，該設計允許在該第二電穿孔步驟中至少對該β2M
基因進行有效的基因編輯，同時保持高含量的具有由第一電穿孔步驟導致的CD70
基因被破壞的T細胞。
於第一基因編輯步驟中，將包含第一Cas9酶以及以CD70
基因為目標的第一gRNA的第一RNP錯合物引入富集的T細胞中，以產生該CD70
基因被破壞的T細胞。可在執行第二基因編輯步驟之前活化此類T細胞，以減輕由第一基因編輯步驟導致的細胞損失。
於第二基因編輯步驟中，將包含第二Cas9酶以及以TRAC
基因為目標的第二gRNA的第二RNP錯合物，以及包含第三Cas9酶以及以β2M
基因為目標的第三gRNA的第三RNP錯合物引入該T細胞以產生具有該CD70
、該TRAC
、該β2M
基因被破壞的T細胞。該Cas9酶以及該以TRAC
基因以及β2M
基因為目標的gRNAs可形成一種或多種核糖核蛋白(RNP)錯合物，可將其遞送至該CD70
基因被破壞的活化T細胞中，如本文所述。
於某些具體實施例中，被引入具有被破壞的CD70
基因的T細胞中的該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物可選擇性地被活化，其可包含相同量的Cas9酶。例如，該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物均可包含約0.1-0.3 mg/mL (例如，約0.1-0.2 mg/mL)的Cas9酶(例如，SEQ ID NO: 1的Cas9酶)。於某些實施例中，該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物中的每一個可包含約0.15 mg/mL的Cas9酶，其可為SEQ ID NO: 1的Cas9酶。
於其他具體實施例中，該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物可包含不同量的Cas9酶。於某些實施例中，相對於以β2M
基因為目標的第三RNP錯合物，以TRAC
基因為目標的第二RNP錯合物可包含更高量的Cas9酶。或者，相對於以TRAC
基因為目標的第三RNP錯合物，以β2M
基因為目標的第二RNP錯合物可包含更高量的Cas9酶。
該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物可包含相同量的gRNA (一個以TRAC
為目標，另一個以β2M
為目標)。或者，該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物可包含不同量的該gRNAs。例如，以TRAC
基因為目標的gRNA的量可在約0.035 mg/mL至約0.8 mg/mL的範圍內，例如約50 μg/ml至約80 μg/ml。於特定的實施例中，以該TRAC
基因為目標的gRNA的量為約0.08 mg/mL。替代地或除此之外，以β2M
基因為目標的gRNA的量可在約0.075 mg/mL至約0.3 mg/mL的範圍內，例如，約0.1 mg/mL至約0.3 mg/mL。於特定的實施例中，以β2M
基因為目標的gRNA的量約為0.2 mg/mL。
於特定的實施例中，以該TRAC
基因為目標的RNP錯合物可包含約0.15 mg/mL Cas9 (例如，SEQ ID NO: 1的Cas9)以及約0.08 mg/mL以該TRAC
基因為目標的gRNA (例如，TA-1的gRNA)。替代地或除此之外，以該β2M
基因為目標的RNP錯合物可包含約0.15 mg/mL的Cas9 (例如，SEQ ID NO: 1的Cas9)以及約0.2 mg/mL以該β2M
基因為目標的gRNA (例如，β2M-1的gRNA)。
於某些具體實施例中，該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物可透過電穿孔依序地(即，透過兩次電穿孔事件)引入該活化的T細胞中。或者，可將該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物同時，亦即透過一個電穿孔事件引入該活化的T細胞中。於此情況下，該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物可在該電穿孔事件之前結合形成一混合物。
透過將該RNPs與適當量的活化T細胞混合，可將本文公開之任何RNPs引入該活化的T細胞中，並將由此形成的混合物在適合的條件下進行電穿孔，以允許將該RNPs遞送至該細胞內。於某些情況下，該活化的T細胞的合適量可在約100x106
個細胞/mL至約300x106
個細胞/mL的範圍內。例如，用於電穿孔步驟的T細胞的合適量可在約200x106
個細胞/mL至約300x106
個細胞/mL的範圍內。於某些實施例中，該活化的T細胞的濃度可為約100x106
個細胞/mL。於某些具體實施例中，該活化的T細胞的濃度可為約200x106
個細胞/mL。於某些具體實施例中，該活化的T細胞的濃度可為約300x106
個細胞/mL。
於某些具體實施例中，該活化的T細胞的合適量可在約1x108
至約1x1010
個細胞的範圍內，例如約5x108
至約8x109
個細胞，約1x109
至約5x109
個細胞，或約1x109
至約3x109
個細胞。
用於電穿孔的T細胞可放置在多個細胞盒中，這取決於所使用的電穿孔儀器。適合的電穿孔儀器為本領域技術人員已知的，且可包括靜態及流動電穿孔儀器，包括Lonza Nucleofector、Maxcyte GT，以及MaxCyte GTx。於某些情況下，在電穿孔過程中可使用多個細胞盒。以下的實施例 6
提供更多詳細資訊。
於特定實施例中，以上公開之第二RNP錯合物以及第三RNP錯合物總共包含約0.3 mg/mL的Cas9酶(例如，SEQ ID NO: 1的Cas9酶)，約0.08 mg/mL的TA-1的gRNA，以及約0.2 mg/mL的β2M-1的gRNA，與該活化的T細胞以約100x106
個細胞/mL至約400x106
個細胞/mL的量混合(例如，約300x106
個細胞/mL)。然後將該混合物進行電穿孔以將該RNPs遞送到該T細胞中。
於某些實施例中，該第一Cas9酶、該第二Cas9酶，以及該第三Cas9酶是相同的，例如來自化膿鏈球菌的Cas9 (spCas9)或包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的Cas9酶。
電穿孔後，可將細胞在新鮮培養基中培養一段適合的恢復時間。基因編輯效率可根據常規方法確定。如此產生的經遺傳編輯的T細胞可進行病毒載體轉導，以遞送配置用於CAR表現的核酸。 (iii) T 細胞活化
本文公開之任何T細胞，例如，由該第一電穿孔步驟導致的具有被破壞的CD70
基因的T細胞，可進行活化步驟以允許T細胞增殖及T細胞擴增。本文公開之T細胞活化條件提供高T細胞活化效率，高%CAR+
表現，並減輕由於編輯CD70
基因而導致的細胞損失。此外，相較於常規條件，本文公開之T細胞活化條件提供更高的基因編輯效率及更高的編輯後T細胞擴增速率。請參閱以下之實施例。
於某些具體實施例中，可使用T細胞活化劑，例如刺激CD3/TCR調節的訊息傳遞途徑及/或共刺激分子(例如，CD28)調節的訊息傳遞途徑的試劑以實現T細胞活化。例如，T細胞活化劑可為CD3激動劑(例如，激動性抗CD3抗體)並活化該CD3/TCR調節的細胞訊息傳遞途徑。替代地或除此之外，T細胞活化劑可為CD28激動劑(例如，抗CD28抗體)，且活化由CD28調節的共刺激訊息傳遞途徑。用於本文公開之方法的任何T細胞活化劑都可與支持元件綴合，例如奈米基質顆粒。於這種情況下，可將該T細胞活化劑綴合至相同的支持元件。或者，可將每種T細胞活化劑與不同的支持元件綴合。於具體的實施例中，用於本文公開之方法的T細胞活化劑可包含抗CD3抗體以及抗CD28抗體，其可與奈米基質顆粒綴合。於某些具體實施例中，該T細胞活化劑包含附著於奈米基質顆粒的CD3激動劑及CD28激動劑。於某些具體實施例中，該CD3激動劑及CD28激動劑連接至相同的奈米基質顆粒。於某些具體實施例中，該CD3激動劑及CD28激動劑連接到不同的奈米基質顆粒。
為了實現T細胞活化，可將本文所述之具有被破壞的CD70
基因的T細胞以適合的細胞接種密度及適合的細胞濃度放置在一細胞培養容器中，並在任何所公開之T細胞活化劑存在下培養一段適合的時期以誘導T細胞活化。
於某些情況下，該細胞培養容器中該T細胞活化劑與該細胞培養基的比率可在約1:10 (v/v)至約1:15 (v/v)的範圍內。於某些實施例中，該細胞培養容器中該T細胞活化劑與該細胞培養基的比例可為約1:10 (v/v)、約1:10.5 (v/v)、約1:11 (v/v)、約1:11.5 (v/v)、約1:12 (v/v)、約1:12.5 (v/v)、約1:13 (v/v)、約1:13.5 (v/v)、約1:14 (v/v)、約1:14.5 (v/v)，或約1:15 (v/v)。於特定的實施例中，該細胞培養容器中的該T細胞活化劑與該培養基的比例為約1:12.5 (v/v)。
替代地或除此之外，適合的細胞接種密度可為約1.0x106
至2.5x106
個細胞/cm2
(例如2x106
個細胞/cm2
)，且適合的細胞濃度可為約1.0x106
至2.5x106
個細胞/ml (例如2x106
個細胞/ml)。可將具有被破壞的CD70
基因的T細胞與T細胞活化劑一起培養約60至80小時，例如，約66小時或約72小時。
替代地或除此之外，適合的細胞接種密度可為約1.5x106
至2.5x106
個細胞/cm2
(例如2x106
個細胞/cm2
)，且適合的細胞濃度可為約1.5x106
至2.5x106
個細胞/ml (例如2x106
個細胞/ml)。可將具有被破壞的CD70
基因的T細胞與T細胞活化劑一起培養約66至80小時，例如約72小時。
於某些具體實施例中，該細胞培養容器可為一靜態培養容器，其將允許相對大規模生產如本文所公開之基因改造的T細胞。相較於傳統的細胞培養瓶，靜態細胞培養容器可使T細胞駐留在高度透氣的膜上，該膜浸沒在為T細胞提供氧氣及營養的培養基下，而不需混合或搖動。靜態培養容器無需更換培養基即可進行T細胞製備。因此，於某些具體實施例中，本文公開之任何方法中的T細胞活化過程可不涉及培養基改變。
當需要時，可在下游基因編輯事件之前將該活化劑從該細胞培養容器中取出或稀釋，以最小化活化劑在基因編輯過程中可能產生的任何潛在影響。於某些具體實施例中，可使用常規方法例如離心從細胞培養容器中除去活化劑。或者，可在基因編輯之前在該細胞培養容器中將活化劑稀釋，例如透過向該細胞培養容器中添加培養基來稀釋。
於某些具體實施例中，可將衍生自本文公開之任何T細胞活化過程的具有被破壞的CD70
基因的活化的T細胞培養過夜(例如，約16小時)以允許該T細胞在基因編輯之前恢復。於某些情況下，具有被破壞的CD70
基因的活化T細胞培養物可能仍含有T細胞活化劑。於其他情況下，具有被破壞的CD70
基因的活化的T細胞的培養物可能具有很少或不存在T細胞活化劑。 (iv) T 細胞轉導
基因敲除的CD70
、TRAC
，及/或β2M
基因的基因改造的T細胞可透過病毒載體進行轉導，例如腺相關病毒(AAV)載體，該載體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列，以產生表現CAR的T細胞群。嵌合抗原受體 (CAR)
嵌合抗原受體(CAR)係指人工免疫細胞受體，其被工程化以識別並結合由不想要的細胞，例如，疾病細胞，如癌細胞，所表現的抗原。表現CAR多胜肽的T細胞被稱為CAR T細胞。CAR具有以非MHC限制的方式將T細胞特異性及反應性重新定向至所選目標的能力。非MHC限制性抗原識別使CAR-T細胞能夠識別獨立於抗原處理的抗原，進而繞開腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在T細胞上表現時，CAR有利地不會與內源性T細胞受體(T-cell receptor，TCR) α及β鏈產生二聚化。
有多種不同代的CARs，每個CAR包含不同的組成分。第一代CARs透過鉸鏈及跨膜結構域將抗體衍生的scFv連接到T細胞受體的CD3zeta (ζ或z)細胞內訊息傳遞結構域。第二代CARs併入一個額外的共刺激結構域，例如 ，CD28、4-1BB (41BB)，或ICOS，以提供共刺激訊號。第三代CARs包含兩個與TCR CD3ζ鏈融合的共刺激結構域(例如CD27、CD28、4-1BB、ICOS，或OX40的組合)。Maude等人，Blood. 2015年；125(26):4017-4023；Kakarla與Gottschalk，Cancer J. 2014年；20(2):151-155)。CAR構築體的各代中的任何一代都在本發明之範圍內。
通常，CAR為融合多胜肽，其包含識別目標抗原的胞外結構域(例如，抗體或其他抗體片段的單鏈可變片段(scFv))以及包含該T細胞受體(TCR)錯合物(例如，CD3ζ)的訊息傳遞結構域的胞內結構域，且在大多數情況下為共刺激結構域。(Enblad等人，Human Gene Therapy. 2015年；26(8):498-505)。CAR構築體還可在該胞外結構域及該胞內結構域之間包含鉸鏈及跨膜結構域，以及在N端用於表面表現的訊號胜肽。訊號胜肽的實例包括MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 52)以及MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 53)。可使用其他訊號胜肽。
(a)抗原結合胞外結構域
抗原結合胞外結構域為CAR多胜肽在細胞表面表現時暴露於細胞外液的區域。於某些情況下，訊號胜肽可位於N端以促進細胞表面表現。於某些具體實施例中，抗原結合結構域可為單鏈可變片段(scFv，其可包括抗體重鏈可變區(VH
)以及抗體輕鏈可變區(VL
)(任一方向)。於某些情況下，VH
及VL
片段可透過胜肽連接子連接。於某些具體實施例中，該連接子包括親水性殘基，其具有一段甘胺酸及絲胺酸以增加彈性，以及一段麩胺酸及離胺酸以增加溶解度。該scFv片段保留了該scFv片段所衍生自的親本抗體的抗原結合特異性。於某些具體實施例中，該scFv可包含人源化的VH
及/或VL
結構域。於其他具體實施例中，該scFv的VH
及/或VL
結構域完全是人類的。
抗原結合胞外結構域可對感興趣的目標抗原具有特異性，例如病理抗原，例如腫瘤抗原。於某些具體實施例中，腫瘤抗原為「腫瘤相關抗原」，係指免疫原性分子，例如蛋白質，其通常在腫瘤細胞中的表現程度高於在非腫瘤細胞中的表現程度，在非腫瘤細胞中可能完全不表現或僅以低程度表現。於某些具體實施例中，窩藏腫瘤的宿主的免疫系統識別的腫瘤相關結構被稱為腫瘤相關抗原。於某些具體實施例中，如果大多數類型的腫瘤廣泛表現，則腫瘤相關抗原為通用腫瘤抗原。於某些具體實施例中，腫瘤相關抗原為分化抗原、突變抗原、過度表現的細胞抗原或病毒抗原。於某些具體實施例中，腫瘤抗原為「腫瘤特異性抗原」或「TSA (tumor specific antigen)」，係指腫瘤細胞特有的免疫原性分子，例如蛋白質。腫瘤特異性抗原僅在腫瘤細胞中表現，例如於特定類型的腫瘤細胞中表現。
於某些實施例中，本文公開之CAR構築體包含能夠結合CD70的scFv胞外結構域。於某些實施例中，本文公開之CAR構築體包含能夠結合CD19的scFv胞外結構域。於某些實施例中，本文公開之CAR構築體包含能夠結合BCMA的scFv胞外結構域。於以下之實施例中提供抗CD70 CAR的實施例。
(b)跨膜結構域
本文公開之CAR多胜肽可包含跨膜結構域，其可為跨膜的疏水性α螺旋。如本文所用，「跨膜結構域」係指在細胞膜，較佳為真核細胞膜中熱力學穩定的任何蛋白質結構。該跨膜結構域可提供包含該結構域的CAR的穩定性。
於某些具體實施例中，本文提供之CAR的跨膜結構域可為CD8跨膜結構域。於其他具體實施例中，該跨膜結構域可為CD28跨膜結構域。於其他具體實施例中，該跨膜結構域為CD8及CD28跨膜結構域的嵌合體。如本文所提供的，可使用其他跨膜結構域。於某些具體實施例中，該跨膜結構域為含有FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR (SEQ ID NO: 54)或IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY (SEQ ID NO: 54)序列的一CD8a跨膜結構域。可使用其他跨膜結構域。
(c)鉸鏈結構域
於某些具體實施例中，鉸鏈結構域可位於CAR的胞外結構域(包含該抗原結合結構域)以及跨膜結構域之間，或者位於CAR的細胞質結構域以及跨膜結構域之間。鉸鏈結構域可為具有將該跨膜結構域連接至該多胜肽鏈中的該胞外結構域及/或該細胞質結構域的功能的任何寡胜肽或多胜肽。鉸鏈結構域可具有向該CAR或其結構域提供彈性的作用，或防止該CAR或其結構域的空間位阻。
於某些具體實施例中，鉸鏈結構域可包含至多300個胺基酸(例如，10至100個胺基酸或5至20個胺基酸)。於某些具體實施例中，一個或多個鉸鏈結構域可包含在CAR的其他區域中。於某些具體實施例中，該鉸鏈結構域可為CD8鉸鏈結構域。可使用其他鉸鏈結構域。
(d)細胞內訊息傳遞結構域
任何CAR構築體都含有一個或多個細胞內訊息傳遞結構域(例如，CD3ζ，以及選擇性的一個或多個共刺激結構域)，其為該受體的功能端。抗原識別後，受體聚集，訊號傳遞到細胞。
CD3ζ為T細胞受體錯合物的細胞質訊息傳遞結構域。CD3ζ含有三(3)個基於酪胺酸的免疫受體的活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)，其在T細胞與同源抗原結合後將活化訊號傳遞給T細胞。於許多情況下，CD3ζ提供主要的T細胞活化訊號，但不提供完全感受態的活化訊號，這需要共刺激訊號。
於某些具體實施例中，本文公開之CAR多胜肽可進一步包含一個或多個共刺激訊息傳遞結構域。例如，CD28及/或4-1BB的共刺激結構域可用於傳遞完整的增殖/存活訊號，以及由CD3ζ調節的主要訊息傳遞。於某些實施例中，本文公開之CAR包含CD28共刺激分子。於其他實施例中，本文公開之CAR包含4-1BB共刺激分子。於某些具體實施例中，CAR包括CD3ζ訊息傳遞結構域及CD28共刺激結構域。於其他具體實施例中，CAR包括CD3ζ訊息傳遞結構域及4-1BB共刺激結構域。於其他具體實施例中，CAR包括CD3ζ訊息傳遞結構域、CD28共刺激結構域，以及4-1BB共刺激結構域。
應當理解的是，本文描述之方法涵蓋不止一種可用於產生表現CAR的基因改造的T細胞的適合的CAR，例如本領域已知或本文所公開的那些。實施例可在例如於2018年5月11日申請的國際申請第PCT/IB2018/001619號，公開為第WO 2019/097305A2號，以及於2019年5月10日申請的國際申請第PCT/IB2019/000500號中找到每個在先申請的相關公開內容，為了本文所引用之目的及主題，透過引用將其併入本文。
例如，CAR結合CD70 (亦稱為「CD70 CAR」或「抗CD70 CAR」)。結合CD70的示例性CAR的胺基酸序列如SEQ ID NO: 46所示中提供(參見下文實施例 5
中的表 12
)。用於將 CAR 構築體遞送至 T 細胞的 AAV 載體
可使用腺伴隨病毒(AAV)將編碼CAR構築體的核酸遞送至細胞。AAVs為小型病毒，可將位點特異性整合到宿主基因組中，因此可傳遞轉基因，例如CAR。存在反向末端重複序列(Inverted terminal repeats，ITRs)，位於AAV基因組及/或目標轉基因的側面，並作為複製起點。AAV基因組中還存在rep及cap蛋白，它們在轉錄時形成衣殼，該衣殼封裝該AAV基因組以傳遞至目標細胞中。這些衣殼上的表面受體會賦予AAV血清型，進而決定衣殼將主要結合哪些目標器官，進而決定該AAV將最有效地感染哪些細胞。目前已知十二種人類AAV血清型。於某些具體實施例中，用於遞送CAR編碼核酸的AAV為AAV血清型6 (AAV6)。
出於多種原因，腺相關病毒為用於基因治療的最常用病毒之一。首先，AAVs在施用於包括人類在內的哺乳動物時不會引起免疫反應。第二，將AAVs有效地傳遞至目標細胞，尤其是在考慮選擇適合的AAV血清型時。最後，AAVs具有感染分裂及非分裂細胞的能力，因為基因組可在宿主細胞中持續存在而不整合。這種特性使它們成為基因治療的理想候選物。
可設計編碼CAR的核酸，以插入宿主T細胞中的目標基因組位點中。於某些具體實施例中，該目標基因組位點可在安全港基因座中。
於某些具體實施例中，可設計編碼CAR的核酸(例如，透過捐贈者模板，其可由病毒載體，例如腺相關病毒(AAV)載體攜帶)，使得其可插入TRAC
基因的位置以破壞基因改造的T細胞中的TRAC
基因並表現該CAR多胜肽。TRAC
的破壞導致內源TCR的功能喪失。例如，可以例如本文所述之核酸內切酶以及以一個或多個TRAC
基因組區域為目標的一種或多種gRNA來產生TRAC
基因的破壞。TRAC
基因及目標區域特異的任何gRNA均可用於此目的，例如本文所公開的那些。
於某些實施例中，可透過同源性指導的修復或HDR來產生TRAC
基因中的基因組缺失並被CAR編碼區段替代(例如，使用捐贈者模板，其可為病毒載體，例如腺相關病毒(AAV)載體的一部分)。於某些實施例中，該gRNA目標序列或其部分被刪除(例如：SEQ ID NO: 17)。於某些具體實施例中，可用本文公開之核酸內切酶以及以一個或多個TRAC
基因組區域為目標的一種或多種gRNA，並將CAR編碼片段插入該TRAC
基因，以產生TRAC
基因的破壞。
如本文所公開之捐贈者模板可包含CAR的編碼序列。於某些實施例中，該CAR編碼序列可在兩個同源區域的兩側，以允許在目標基因組位置的有效HDR，例如在使用CRISPR-Cas9基因編輯技術的TRAC
基因處。於這種情況下，該目標基因座上的兩股DNA鏈都可被CRISPR Cas9酶切割，該酶由對目標基因座特異的gRNA引導。然後發生HDR以修復雙股斷裂(DSB)並插入編碼該CAR的捐贈者DNA。為了使這一點正確發生，設計捐贈者序列的側翼殘基與目標基因，如該TRAC
基因，中DSB位點周圍的序列(以下簡稱「同源臂」)互補。這些同源臂作為DSB修復的模板，並使HDR成為基本無錯誤的機制。同源性定向修復(HDR)的速率為突變與切割位點之間的距離的函數，因此選擇重疊或附近的目標位點很重要。模板可包括側翼為同源區域的額外序列，或者可包含與基因組序列不同的序列，進而可進行序列編輯。
替代地，捐贈者模板可與該DNA中的目標位置不具有同源性的區域，並可透過在目標位點切割後透過NHEJ依賴性末端結合而整合。
捐贈者模板可為單股及/或雙股的DNA或RNA，並可以線性或環狀形式引入細胞中。若以線性形式引入，則可透過本領域技術人員已知之方法保護該捐贈者序列的末端(例如，防止核酸外切降解)。例如，將一個或多個二去氧核苷酸殘基添加至線性分子的3’端及/或將自身互補的寡核苷酸連接至一個或兩個末端。參見，例如，Chang等人，(1987年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963；Nehls等人，(1996年) Science 272:886-889。保護外源多核苷酸免於降解的其他方法包括，但不限於，添加末端胺基及使用修飾的核苷酸間鍵，例如，硫代磷酸酯、胺基磷酸酯，以及O-甲基核糖或去氧核糖殘基。
可將捐贈者模板作為載體分子的部分引入細胞中，該載體分子具有附加序列，例如複製起點、啟動子，以及編碼抗生素抗性的基因。此外，捐贈者模板可作為裸露核酸，與例如脂質體或泊洛沙姆等試劑複合的核酸引入細胞，或可透過病毒傳遞 (例如腺病毒、AAV、皰疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒，以及整合酶缺陷型慢病毒(integrase defective lentivirus, IDLV))。
於某些具體實施例中，可將捐贈者模板插入在內源啟動子附近的位點(例如，下游或上游)，使得其表現可由該內源啟動子驅動。於其他具體實施例中，該捐贈者模板可包含外源啟動子及/或增強子，例如，組成型啟動子、誘導型啟動子，或組織特異性啟動子，以控制該CAR基因的表現。於某些具體實施例中，該外源啟動子為EF1α啟動子。可使用其他啟動子。
此外，外源序列還可包括轉錄或轉譯調控序列，例如，啟動子、增強子、絕緣子、內部核醣體進入位點、編碼2A胜肽的序列，及/或聚腺苷酸化訊號。T 細胞轉導
可將適合量的編碼本文公開之CAR構築體(例如，抗CD70 CAR)的任何病毒載體，例如AAV載體，與適合量的T細胞，例如本文公開之基因編輯的T細胞一起培養。在一段適合的時間內允許病毒載體進入T細胞。例如，該轉導過程可涉及使用一系列優化的感染複數(MOI)，其增加CAR+
T細胞的百分比。於某些情況下，一AAV載體在轉導過程中的MOI可為約1,000至約150,000，例如約10,000至約80,000。於某些實施例中，在該轉導過程中使用的AAV載體的MOI可為約1,000至約150,000、約5,000至約100,000、約10,000至約100,000、約10,000至約90,000、約10,000至約80,000、約10,000至約70,000、約10,000至約60,000、約10,000至約50,000、約10,000至約40,000、約10,000至約30,000、約10,000至約20,000、約20,000至約80,000、約30,000至約80,000、約40,000至約80,000、約50,000至約80,000、約60,000至約80,000，或約70,000至約80,000。於某些實施例中，在該轉導過程中使用的AAV載體的MOI可為約1,000、約2,500、約5,000、約10,000、約15,000、約20,000、約25,000、約30,000、約31,000、約32,000、約33,000、約34000、約35,000、約40,000、約50,000、約60,000、約70,000、約80,000、約90,000、約100,000、約110,000、約120,000、約130,000、約140,000，或約150,000。
於某些具體實施例中，該AAV載體編碼抗CD70 CAR (例如，如以下實施例 5
中的表 12
中所公開)，且用於轉導過程中的這種AAV載體的MOI為約20,000。於其他具體實施例中，該AAV載體編碼抗CD19 CAR，且用於轉導過程中的這種AAV載體的MOI為約20,000。於其他具體實施例中，該AAV載體編碼抗BCMA CAR，並且用於轉導過程中的這種AAV載體的MOI為約20,000。
轉導後，可將該T細胞在適合的細胞培養基中培養一段適合的時間以恢復。如下所述，具有CD70
、TRAC
，以及β2M
基因敲除並表現CAR的基因改造的T細胞可在體外擴增。 (v) T 細胞擴增
可在適合的條件下在體外擴增本文所公開之基因改造的T細胞，以產生臨床上相關規模的基因改造的T細胞群。在該擴增步驟中使用的細胞培養條件目的在至少部分地在較短的培養時間內實現更高的最終細胞密度(進而降低製備成本)，並在細胞療法中使用更高效能的T細胞。效力可透過各種T細胞功能，例如增殖、目標細胞殺傷、細胞激素產生、活化、遷移，及其組合來指示。
於某些具體實施例中，可透過以在細胞容器中約150,000個細胞/cm2
至約600,000個細胞/cm2
的接種密度在細胞培養容器中接種T細胞群(例如，本文公開之基因改造的T細胞)以進行T細胞擴增步驟。例如，可在細胞容器中以約300,000細胞/cm2
至約500,000細胞/cm2
接種T細胞。於某些方面，透過以至少約60,000個細胞/cm2
、至少約62,500個細胞/cm2
，或至少約83,000個細胞/cm2
的接種密度將T細胞群接種在細胞培養容器中來進行T細胞擴增。於某些方面，透過以至少約150,000個細胞/cm2
，或至少約250,000個細胞/cm2
，或至少約300,000個/cm2
個細胞/cm2
，或至少約400,000個細胞/cm2
，或至少約500,000個細胞/cm2
，或至少約600,000個細胞/cm2
的接種密度將T細胞群接種到細胞培養容器中來進行T細胞擴增。於某些方面，該接種密度為約250,000個細胞/cm2
。於其他方面，該接種密度為約500,000個細胞/cm2
。於其他方面，該接種密度為約600,000個細胞/cm2
。
於某些具體實施例中，可透過以約2x105
個細胞/cm2
至約7x105
個細胞/cm2
的接種密度將T細胞群(例如，本文公開之基因改造的T細胞)接種於細胞培養容器中來進行T細胞擴增步驟，並將細胞培養約6天至約12天。於某些實施例中，透過以約2x105
個細胞/cm2
至約7x105
個細胞/cm2
、約2x105
個細胞/cm2
至約5x105
個細胞/cm2
、約2x105
個細胞/cm2
至約4x105
個細胞/cm2
、約2x105
個細胞/cm2
至約3x105
個細胞/cm2
、約3x105
個細胞/cm2
至約5x105
個細胞/cm2
，或約4x105
個細胞/cm2
至約5x105
個細胞/cm2
的接種密度將T細胞群接種在細胞培養容器中來進行T細胞擴增，並將該細胞培養約6天至約12天、約6天至約11天、約6天至約10天、約6天至約9天、約6天至約8天、約6天至約7天天、約7天至約12天、約7天至約11天、約7天至約10天、約7天至約9天、約7天至約8天、約8天至約12天、約8天至約9天、約9天至約12天、約10天至約12天，或約11天至約12天。於某些具體實施例中，透過以約3x105
細胞/cm2
至約5x105
細胞/cm2
的接種密度將T細胞群接種在細胞培養容器中，並培養該細胞約7天至約9天來進行T細胞擴增。
於某些具體實施例中，該T細胞擴增步驟可包括重新鋪盤該細胞培養物(亦即，將該細胞培養物分至新的培養容器)。於某些具體實施例中，可在編輯後的第3、4、5、6或7天以1:4的比例(將1個容器分成4個新的容器)再次複製細胞培養物以進一步擴增。
T細胞擴增可在依靜態培養容器中進行，其允許T細胞擴增而無需更換培養基。例如，T細胞可在靜態培養容器中擴增約7天至約12天，或約7天至約9天而無需更換培養基。 (vi) TCRαβ+
T 細胞之耗竭
於某些具體實施例中，可從本文公開之擴增的T細胞群中去除TCRαβ+
T細胞，以產生用於細胞療法的同種異體T細胞群。如本文所用，「TCRαβ+
T細胞耗竭」係指從包含TCRαβ+
T細胞的細胞群中耗竭TCRαβ+
T細胞。在TCRαβ+
T細胞耗竭後，所得T細胞群的TCRαβ+
T細胞含量可能會大大降低 (例如，少於總細胞群的3%，或少於總細胞群的2%、少於1%，或少於0.5%)。於某些實施例中，所得的T細胞群可不含TCRαβ+
T細胞，亦即，透過常規方法偵測不到TCRαβ+
T細胞的存在(例如，在使用與TCRαβ+
結合的抗體的免疫測定中或透過流式細胞儀進行)。
可使用識別TCRαβ+
T細胞以捕獲TCRαβ+
T細胞的試劑來進行TCRαβ+
T細胞的消耗，進而例如透過進行磁性細胞分離來將它們與缺乏TCRαβ+
的細胞分離。這樣的方法可透過使以上公開之擴增的T細胞與固定有抗TCRαβ抗體的微珠接觸並收集未結合的細胞來進行。如此收集的未結合細胞(缺乏TCRαβ+
的那些)可先培養以使細胞恢復，例如，可將未結合細胞培養過夜以使細胞恢復。 (vii) 收穫基因改造的 T 細胞
然後可使用本領域已知的常規方法收穫透過本文公開之任何方法產生的基因改造的T細胞以用於治療用途。例如，收穫遺傳工程改造的T細胞可包括收集TCRαβ+
已經耗盡的細胞。遺傳工程T細胞的收穫群體可作為藥物。如本文所用，「藥物物質」係指可施用於患者的基因改造的一T細胞群。可將藥物配製為用於治療用途，例如配製在儲存介質(例如，CryoStor CS5)中，並冷凍保存以備將來使用。
可測試藥物中是否含有一種或多種污染物，例如黴漿菌、人類病毒(例如，HIV、HBV、HCV、CMV)，以及細菌內毒素。替代地或附加地，可對原料藥進行無菌測試。可將無污染的藥物等分到各個患者劑量中。替代地或附加地，可儲存無污染的藥物用於治療用途。
據此，本發明之方面提供一種基因改造的T細胞群(藥物物質)。該基因改造的T細胞群具有CD70
基因被破壞、TRAC
基因被破壞、β2M
基因被破壞，以及編碼CAR的核酸，例如本文所述的那些。於某些具體實施例中，該CAR結合在病理細胞上表現的抗原。於某些具體實施例中，該CAR結合CD70。於某些具體實施例中，該CAR結合CD19。於某些具體實施例中，該CAR結合BCMA。
於某些具體實施例中，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，或至少95%的基因改造的T細胞群透過本文所述之方法表現CAR。於其他方面，這些表現CAR的細胞進一步不表現出可檢測程度的表面CD70及/或可檢測程度的表面TCR及/或可檢測程度的表面β2M。
於其他具體實施例中，在透過本文描述之方法產生的基因改造的T細胞群的至少30%表現CAR的情況下，該細胞群體包含不超過約5%、不超過約2%，或不超過約1%的T細胞表現表面CD70。
於其他具體實施例中，在透過本文描述之方法產生的基因改造的T細胞群的至少30%表現CAR的情況下，該細胞群體包含不超過約1.0%、不超過約0.5%、不超過約0.4%，或不超過約0.15%的T細胞表現表面TCR (例如，TCRα/β+
細胞)。
於其他具體實施例中，在透過本文所述之方法產生的基因改造的T細胞群的至少30%表現CAR的情況下，該細胞群體包含不超過約50%、不超過約40%，或不超過約30%的T細胞表現表面β2M。
透過本文描述之方法產生的基因改造的T細胞群也在本發明之範圍內，其包括Cas9酶、以CD70
基因為目標的gRNA、以TRAC
基因為目標的gRNA、以β2M
基因為目標的gRNA，以及AAV載體，其包含編碼CAR (例如， CD70 CAR或CD19 CAR或BCMA CAR)的核酸序列。II. 治療應用
可出於治療目的將透過本文描述之方法產生的基因改造的T細胞群施用於個體，例如，治療由基因改造的T細胞群所表現的CAR構築體作為目標的癌症。
個體可為期望對其進行診斷、處理，或治療的任何個體。於某些具體實施例中，該個體為哺乳動物。於某些具體實施例中，該個體為人類。
可使用透過本文所述方法產生的基因改造的T細胞群治療的癌症的非限制性實施例包括，但不限於，多發性骨髓瘤、白血病(例如，T細胞白血病、B細胞急性淋巴細胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL)，及/或慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia, C-CLL))、淋巴瘤(例如，B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin’s lymphoma, B-NHL)、霍奇金氏淋巴瘤，及/或T細胞淋巴瘤)，及/或透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、腎癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung, NSCLC)、膠質母細胞瘤，及/或黑色素瘤。
施用可包括透過導致該基因改造的T細胞群至少部分定位在所需位點，例如腫瘤位點，之方法或途徑以將該基因改造的T細胞群放置(例如，移植)到個體中，而可產生期望的效果。該基因改造的T細胞群可透過任何適合的途徑施用，所述途徑導致遞送至該個體中的期望位置，在該位置中至少一部分植入的細胞或細胞組成分保持活力。給予個體後，該細胞的存活期可短至數小時，例如二十四小時、幾天、長達數年，甚至是該個體的壽命，亦即，長期嫁接。例如，在本文所述之一些方面，可透過全身性施用途徑，例如腹膜內或靜脈內途徑，施用有效量的基因改造的T細胞群。
於某些具體實施例中，該基因改造的T細胞群為全身性施用的，這是指除了直接進入目標位點、組織，或器官之外的細胞群體的施用，進而使其進入該個體的循環系統，並且因此會經歷新陳代謝及其他類似過程。適合的給藥方式包括注射、輸注、滴注，或攝取。注射劑包括，但不限於，靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、腦室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下腔、脊柱內、腦脊髓，以及胸骨內注射及輸注。於某些具體實施例中，該途徑為靜脈內的。
有效量係指預防或減輕至少一種或多種醫學病症(例如，癌症)的體徵或症狀所需的基因改造的T細胞群的量，且涉及足夠量的基因改造的T細胞群，以提供期望的效果，例如，治療患有醫療狀況的個體。有效量還包括足以預防或延遲疾病症狀發展、改變疾病症狀進程(例如，但不限於，減慢疾病症狀進展)，或扭轉這種疾病的症狀。可以理解的是，對於任何給定的情況，本領域普通技術人員可使用常規實驗確定ㄧ適合的有效量。
有效量的基因改造的T細胞群可包含至少102
個細胞、至少5x102
個細胞、至少103
個細胞、至少5x103
個細胞、至少104
個細胞、至少5x104
個細胞、至少105
個細胞、至少2x105
個 單元、至少3x105
個細胞、至少4x105
個細胞、至少5x105
個細胞、至少6x105
個細胞、至少7x105
個細胞、至少8x105
個細胞、至少9x105
個細胞、至少1x106
個細胞、至少2x106
個細胞、至少3x106
個細胞、至少4x106
個細胞、至少5x106
個細胞、至少6x106
個細胞、至少7x106
個細胞、至少8x106
個細胞、至少9x106
個細胞，或其倍數。
使用如本文所述製備的基因改造的T細胞群的治療功效可由本領域普通技術人員確定。若以一種有益的方式(例如，增加至少10%)改變了功能性目標程度的任何一種或所有體徵或症狀，或其他臨床上可接受的疾病(例如，癌症)的症狀或標記物得到改善或減緩，則該治療被視為「有效」。療效還可透過住院失敗或需要醫療干預評估(例如，疾病的進展停止或至少減慢)以評估個體的惡化程度來衡量。測量這些指標之方法為本領域技術人員已知的及/或於本文所描述的。治療包括對個體疾病的任何治療，包括： (1) 抑制疾病，例如阻止或減緩症狀的發展；或者 (2) 減輕疾病，例如引起症狀消退；以及 (3) 預防或減少症狀發展的可能性。
如本文所述製備的基因改造的T細胞群也可用於組合療法。例如，如本文所述製備的基因改造的T細胞群可與其他治療劑共同使用，以治療相同的適應症，或用於增強該基因改造的T細胞群的功效，及/或減少該基因改造的T細胞的副作用。 一般技術
除非另有說明，本發明之實踐將使用在本領域技術範圍內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學，以及免疫學的常規技術。在文獻中完全解釋了這樣的技術，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989年)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(M. J. Gait編輯，1984年)；Methods in Molecular Biology，Humana出版社；Cell Biology：A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編輯，1989年) Academic出版社；動物細胞培養(R. I. Freshney編輯，1987年)；細胞與組織培養介紹(J. P. Mather與 P. E. Roberts，1998年) Plenum出版社；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures (A. Doyle、J. B. Griffiths，以及D. G. Newell編輯，1993-8年) J. Wiley and Sons出版社；酵素學方法(Academic出版社公司)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir與C. C. Blackwell編輯)；哺乳動物細胞的基因轉移載體(J. M. Miller與M. P. Calos編輯，1987年)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel，等人編輯，1987年)；PCR：聚合酶連鎖反應(Mullis等人編輯，1994年)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編輯，1991年)；Molecular Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons出版社，1999年)；免疫生物學(C. A. Janeway與P. Travers，1997年)；抗體(P. Finch，1997年)；抗體：一種實用之方法(D. Catty編輯，IRL出版社，1988-1989年)；單株抗體：一種實用之方法(P. Shepherd與C. Dean編輯，Oxford University 出版社，2000年)；使用抗體：實驗室手冊(E. Harlow與D. Lan (冷泉港實驗室出版社，1999年)；The Antibodies (M. Zanetti與J. D. Capra編輯，Harwood Academic出版社，1995年)；DNA Cloning: A practical Approach
，第I及II卷(D.N. Glover編輯，1985年)；Nucleic Acid Hybridization
(B.D. Hames與S.J. Higgins編輯，1985年)；Transcription and Translation
(B.D. Hames與S.J. Higgins編輯，1984年)；Animal Cell Culture
(R.I. Freshney編輯，1986年)；Immobilized Cells and Enzymes
(lRL出版社)(1986年)；以及B. Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning
(1984年)；F.M. Ausubel等人(編輯)。
無需進一步的闡述，相信本領域技術人員可基於上述描述最大限度地利用本發明。因此，以下具體實施例將被解釋為僅僅是說明性的，而非以任何方式限制本發明其餘之部分。本文所引用之所有出版物係透過引用方式併入，為了本文參考之目的或主題。 實施例
為了可更充分地理解所描述之發明，闡述以下實施例。提供本發明中描述之實施例以舉例說明本文提供之方法及組合物，且不以任何方式解釋為限制其範圍。 實施例 1 ：鑑定 T 細胞富集之最佳條件。
該實施例報導了使用自動細胞處理系統富集來自白血球的CD4+
及CD8+
T細胞的T細胞富集的最佳條件之鑑定。方法 白血球單採術樣本及緩衝液之製備
自HemaCare或Stem Express收集人類白血球並進行T細胞富集處理。補充有0.5%的人類血清白蛋白(Human Serum Albumin HSA)的PBS/EDTA緩衝液(磷酸鹽緩衝液，pH 7.2，補充有1 mM EDTA)，用於T細胞選擇過程中的處理、引子、洗滌，以及流洗。
篩選該白血球單採術捐贈者的以下各項：
B型肝炎表面抗原(HBsAg EIA)
C型肝炎病毒抗體(Anti-HCV EIA)
人類免疫缺陷病毒抗體(HIV 1/2加O)
人類T淋巴細胞病毒抗體(HTLV-I/II)
HIV-1/HCV/HBV核酸檢測
WNV核酸檢測
錐蟲克魯茲氏抗體(選擇性南美錐蟲病檢測，每位捐贈者的終生檢測)
HIV/HBV/HCV
CMV
IDS
任何上述測試均顯示陽性結果的捐贈者被排除在外。表 1
所示為本文公開之實施例中使用的捐贈者的人口統計學資訊。
表 1
. 捐贈者人口統計及血液學參數。所有捐贈者均為男性。
使用 Sysmex 進行白血球單採術樣本血液學分析
| 批次 | 供應者 | 捐贈者來源識別 | 年齡 | 捐贈者重量 (lb) | BMI | 種族 | ABO/ Rh | 產品體積 (mL) | 白血球 (x10 9 ) | 淋巴球 % |
| 1 | HemaCare | D327083 | 26 | 144 | 19.0 | 西班牙裔/拉丁美洲裔 | O-POS | 279 | 9.77 | 79 |
| 2 | HemaCare | 141402 | 29 | 160 | 22.9 | 白人 | A-POS | 302 | 13.59 | 75.9 |
| 3 | HemaCare | 141121 | 26 | 154 | 24.8 | 西班牙裔 | O-POS | 250 | 8.75 | 74.7 |
| 4 | HemaCare | 136723 | 20 | 130 | 20.9 | 白人 | A-POS | 305 | 12.81 | 70.1 |
| 5 | HemaCare | D64140 | 28 | 272 | 42.6 | 西班牙裔/拉丁美洲裔 | A-POS | 339 | 21.36 | 81.1 |
| 6 | Stem Express | D001003864 | 33 | 176 | 24.0 | 白人 | A-POS | 140 | 8.14 | 70.9 |
| 7 | HemaCare | 141722 | 20 | 135 | 19.9 | 西班牙裔 | O-POS | 308 | 13.24 | 78.5 |
| 8 | HemaCare | D327737 | 36 | 200 | 26.4 | 非裔美國人 | B-POS | 310 | 14.57 | 81.3 |
| 9 | HemaCare | D326737 | 31 | 225 | 29.7 | 非裔美國人 | AB-POS | 314 | 10.99 | 77.9 |
按照廠商的說明，使用Sysmex XP300 (Sysmex，序號：B0628)對來自進入的白血球單採術的樣本進行血液學分析。白血球(White blood cell, WBC)計數用於計算加載到自動細胞處理系統中的總細胞量。T 細胞富集
在開始運行之前，將處理緩衝液、白血球單採術樣本、CD4微珠，以及CD8微珠加載到自動細胞處理系統中。洗滌細胞並在室中標記，並直接引導至磁柱進行分離。捕獲CD4+
及CD8+
T細胞，並在處理緩衝液中進一步流洗到目標袋中。細胞計數及存活率
細胞計數及存活率的評估係以COUNTESS®
II (Life Technologies公司，型號AMQAX1000)使用預設的參數進行的。透過上下吸移幾次，將細胞(20 µL)與台盼藍(20 µL)混合，而不引入氣泡。將細胞/台盼藍混合物(10 µL)裝入COUNTESS®
II細胞計數室玻片。流式細胞儀
在室溫(room temperature, RT)下，在95 µL染色緩衝液(0.5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)/DPBS)中，以5 µL人類TruStain FcXTM
阻隔約1x106
個總細胞。將細胞與Pacific Blue偶聯的抗人類CD45抗體(1:50)、BV510偶聯的抗人類CD3抗體(1:50)、APC-Cy7偶聯的抗人類CD4抗體(1:50)培養、PE-Cy7偶聯的抗人類CD8抗體(1:50)、APC偶聯的抗人類CD19抗體(1:50)、FITC偶聯的抗人類CD56抗體(1:50)，以及PE偶聯的抗人類CD33抗體(1:50)在4o
C作用30分鐘。然後，將1 mL含有5 µL 7-胺基放線菌素D (7-amino-actinomycin D, 7-AAD)活力染色液的氯化銨-鉀(Ammonium-Chloride-Potassium, ACK)裂解緩衝液加到每個樣品上。與ACK裂解緩衝液在室溫下培養10分鐘後，以NovoCyte-3000流式細胞儀採集細胞。結果 白血球單採術樣本中的白血球 (WBCs)
被測白血球單採術樣本中的WBC範圍為8.14x109
至21.36x109
個細胞，淋巴細胞數範圍為5.77x109
至17.32x109
。CD4 及 CD8 富集 – 純度、活力、細胞回收率，以及產率
在測試的9個批次中，使用程序A評估四個批次，使用程序B評估五個批次。所有批次均產生具有＞ 90%純度以及＞ 90%存活率的T細胞(表 2
)。從程序A的細胞回收率為31%，而從程序B的細胞回收率為55.69%。
表
2. CD4
及
CD8
富集結果
| 批次 | 程序 | 白血球單採術樣本 CD3% | 非目標細胞 CD3% | 目標細胞 | |||
| 細胞數 (x109 ) | CD3% | 存活率 (%) | 復原率 (%) | ||||
| 1 | A | 73.20 | 50.80 | 1.32 | 96.20 | 96.50 | 29.24 |
| 2 | 72.30 | 60.40 | 2.76 | 96.30 | 93.50 | 27.00 | |
| 3 | 64.90 | 46.00 | 2.32 | 96.80 | 95.00 | 39.15 | |
| 4 | 63.50 | 55.00 | 2.59 | 89.70 | 94.00 | 30.77 | |
| 平均 (A) | 68.48 | 53.05 | 2.25 | 94.75 | 94.75 | 31.54 | |
| 5 | B | 70.30 | 15.70 | 6.00 | 94.50 | 93.00 | 39.75 |
| 6 | 56.00 | 3.17 | 2.14 | 92.80 | 96.00 | 47.10 | |
| 7 | 69.00 | 16.80 | 4.68 | 96.60 | 93.00 | 49.10 | |
| 8 | 59.40 | 15.20 | 6.82 | 92.60 | 96.00 | 75.87 | |
| 9 | 55.50 | 11.20 | 3.88 | 93.60 | 98.00 | 61.65 | |
| 平均 (B) | 62.04 | 12.41 | 4.70 | 94.02 | 95.20 | 54.69 |
總之，這些結果表示，來自健康捐贈者(healthy donor, HD)白血球單採術樣本的T細胞富含高純度(＞ 90%)及高存活率(＞ 90%)的CD4+
及CD8+
T細胞。 實施例 2 ：鑑定 T 細胞活化之最佳條件。
該實施例報導使用與重組人源化CD3及CD28激動劑綴合的膠體聚合物奈米基質鑑定T細胞活化的最佳條件。於不同條件下活化的T細胞上檢查了基因編輯及/或CAR表現程度，以確定可實現優異基因編輯及/或CAR表現程度的優化T細胞活化條件。簡言之，轉基因的T細胞為在小規模的過程中製備的，解凍富集的T細胞，然後在活化前以一次電穿孔或兩次電穿孔活化48小時或72小時，並在轉導後7天以流式細胞儀確定%CAR+
表現。
要開始進行小規模生產，需要從液氮儲存中取出冷凍管，並在水浴中解凍，直到剩下少量冷凍物質為止。然後將細胞滴加到10X體積的全生長培養基(X-VIVOTM
15、5%人類AB血清、50 ng/mL IL7，以及10 ng/mL IL2)中，並透過在室溫下以300g離心10分鐘沉澱。將細胞重新懸浮至1x106
個細胞/mL的濃度，並與重組人源化CD3及CD28激動劑調節的活化綴合的奈米基質進行膠體聚合，可改善下游修飾，或電穿孔以引入用於CRISPR-Cas9依賴性基因編輯的組成分。
分離的T細胞以共價附於一膠體聚合物奈米基質的重組CD3及CD28活化。在未經處理的燒瓶中，將與重組人源化CD3及CD28激動劑綴合的膠體聚合物奈米基質以1:12.5的比例或以每40 µL 1x106
個細胞的比例施用於細胞。將細胞與綴合有重組人源化CD3及CD28激動劑的膠體聚合物奈米基質於37℃、5% CO2
的培養箱中培養48小時或72小時。培養後，將細胞於室溫下以300g離心10分鐘。然後將細胞沉澱重新懸浮於完全生長的培養基中，並在基因修飾之前以1x106
個細胞/mL的濃度培養過夜。
針對電穿孔，透過加入錐蟲藍並在COUNTESS®
細胞計數儀上進行計數以量化總細胞數及細胞存活率。然後，將細胞於室溫下以300g離心10分鐘。將細胞沉澱物在10 mL電穿孔緩衝液中洗滌，然後再次離心。在離心細胞的同時，製備核糖核蛋白(RNP)錯合物。RNP錯合物是分別形成的，如果執行多次編輯，則將它們組合在一起。使用指定濃度的gRNA以及Cas9形成了四個單獨的RNP錯合物(表 3
)。每個RNP錯合物與包含SEQ ID NO: 1的Cas9一起形成。關於Cas9級gRNA序列，亦參閱實施例 5
。
表 3
. 包含gRNA及Cas9的RNP錯合物。
| RNP 錯合物 | gRNA 的濃度 (µg/mL) | gRNA 的序列 | Cas9 的濃度 (µg/mL) |
| CD70 gRNA + Cas9 | 160 | G*C*U*UUGGUCCCAUUGGUCGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 2) | 150-170 |
| TRAC gRNA + Cas9 | 80 | A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 6) | 150 |
| β2M gRNA + Cas9 | 200 | G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 10) | 150 |
| PD1 gRNA + Cas9 | 160 | C*U*G*CAGCUUCUCCAACACAUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 66) | 170 |
使用基於流式電穿孔的轉染系統對細胞進行電穿孔。對每個比色皿進行電穿孔後，將細胞及RNP溶液等分到未處理的12孔盤中，每個孔含500 µL X-VIVOTM
15培養基(不含人類AB血清、IL2，或IL7)。使細胞在培養箱中靜置20分鐘。透過加入台盼藍並在COUNTESS®
細胞計數器上計數來定量總細胞數及細胞存活率。
根據靜息後的總細胞數，可能需要以X-VIVOTM
15 (無人類AB血清、IL2，或IL7)進一步稀釋細胞以達到所需濃度。需要總細胞數以計算進行轉導所需的AAV量。所需的 AAV 微升 = ( 總細胞數 )( 所需的 MOI ( 亦即， 20K))/( 病毒 vgc/mL ( 亦即 1.5x1013
))
將AAV以及細胞懸浮液混合，並在未處理的燒瓶中於37o
C及5% CO2
下培養1小時。將包括AAV在內的整個體積添加至裝有100 mL完全培養基的靜態培養容器中。將靜態培養容器培養3天以允許細胞擴增。
電穿孔後，在靜態培養皿的每個孔中充滿100 mL完全生長培養基。將基因修飾的細胞以5x105
細胞/mL至1x106
個細胞/mL的濃度接種在100 mL完全生長培養基中。將靜態培養容器培養三至四天以允許細胞擴增。每三至四天將IL2以及IL7補充至最終工作濃度100 U/mL或10 ng/mL IL2以及50 ng/mL IL7。每三至四天透過添加台盼藍並在COUNTESS®
細胞計數器上對總細胞數進行定量。電穿孔後將細胞在培養物中培養9至12天，以達到最大總細胞數。(i) 優化的 T 細胞活化條件，提高了 %CAR+ 表現
電穿孔用於將gRNA及Cas9引入T細胞中，以對CRISPR-Cas9依賴性基因編輯四個目標基因，包括CD70
、PD1
、β2M
，以及TRAC
基因。進行一次電穿孔以一次以所有四個基因為目標。當進行兩次電穿孔時，在第一次電穿孔中將以CD70
以及PD1
基因為目標的RNP錯合物引入T細胞，並在第二次電穿孔中將以β2M
以及TRAC
基因為目標的RNP錯合物引入該些T細胞。
如表 4
所示，在一次電穿孔或兩次電穿孔之前活化48小時的T細胞顯示%CAR+
表現分別為54.7%及57.5%。活化72小時的T細胞比活化48小時的T細胞表現出的總%CAR+
高出約10%，無論T細胞是進行一次電穿孔還是兩次電穿孔(表 4
)。
表 4
. 活化48小時或72小時的T細胞的%CAR+
表現。
| %CAR+ 表現 | ||
| 活化條件 ( 小時 ) | 1x 電穿孔 (CD70, PD1, β2M, TRAC) | 2x 電穿孔 (1) CD70, PD1 (2) β2M, TRAC |
| 48 | 54.7% | 57.5% |
| 72 | 63.0% | 68.4% |
這些結果顯示，相較於活化48小時的T細胞，活化72小時的T細胞增加%CAR+
表現。當電穿孔中不包含以PD1
為目標的RNP錯合物時，觀察到相似的結果。(ii)T 細胞活化的優化條件減輕了電穿孔引起的細胞損失
在T細胞上執行第一電穿孔步驟，以引入用於CRISPR-Cas9依賴性編輯CD70
基因以及PD1
基因的組成分。在T細胞活化48小時或72小時之前及之後測定細胞數目。
如表 5
所示，當T細胞被活化48小時，在第二次電穿孔之前獲得的細胞計數小於最初接種用於活化的細胞數量。相較之下，當T細胞被活化72小時，第二次電穿孔之前獲得的細胞數大於最初接種以活化的細胞數(表 5
)。
表 5
. 在T細胞活化之前及之後48小時或72小時的細胞數目。
| T細胞活化的持續時間 | ||
| 48 小時 | 72 小時 | |
| 活化開始時的細胞數 | 16.8x106 | 16.8x106 |
| 活化結束時的細胞數 | 10.7x106 | 36x106 |
這些結果證明，在僅電活化T細胞48小時觀察到的第一次電穿孔後，T細胞活化72小時可減輕細胞損失。當電穿孔中不包含以PD1
為目標的RNP錯合物時，觀察到相似的結果。 實施例 3 ：確定 β2M 的敲除之最佳條件。
該實施例報告使用CRISPR-Cas9依賴性基因編輯鑑定出敲除β2M的最佳條件。β2M的敲除可在第一電穿孔或第二電穿孔中進行。通常在第二次電穿孔中或在轉導之前進行TCR的敲除，以確保HDR調節的CD70 CAR插入。通常在初始電穿孔中進行CD70的敲除，以防止在插入CD70 CAR之前可能發生的細胞間殺滅性殺傷。
簡言之，基因改造化的T細胞是在小規模的過程中製備的，在該過程中形成以β2M
為目標的RNP錯合物，並透過一次電穿孔或兩次電穿孔過程將其引入T細胞。有關詳細資訊，請參見上面的實施例 2
。
為了在第一次電穿孔中敲除β2M
，在第一次電穿孔中將以CD70
及β2M
基因為目標的RNP錯合物引入T細胞，並在第二次電穿孔中將以PD1
及TRAC
基因為目標的RNP錯合物引入T細胞。為了在第二次電穿孔中敲除β2M
，在第一次電穿孔中將以CD70
及PD1
基因為目標的RNP錯合物引入T細胞，並在第二次電穿孔中將以β2M
及TRAC
基因為目標的RNP錯合物引入T細胞。在單次電穿孔事件中，也使用以CD70
、PD1
、β2M
，以及TRAC
基因為目標的RNP錯合物對T細胞進行電穿孔。
如表 6
所示，當在第一次電穿孔中包括以β2M
為目標的RNP錯合物時，無論T細胞被活化48小時還是72小時，殘餘的β2M+
表現在轉導後7天為約60%。當以β2M
為目標的RNP錯合物包含在單次電穿孔或第二次電穿孔中時，殘留的β2M+
表現約為20% (表 6
)。轉導後7天未檢測到殘餘CD70+
表現(表7)。可透過使用以CD70
為目標的RNP錯合物進行敲除來消除表現CD70+
的殘餘細胞，或者透過CD70 CAR+
來消除殘餘的CD70+
細胞。針對所測試的每個β2M敲除條件，觀察到相似的T細胞生長及T細胞存活率(圖 1
)。
表 6
. β2M敲除條件對β2M表現之影響。
| β2M+ 表現 | |||
| 活化條件 ( 小時 ) | 1x 電穿孔 (CD70, PD1, β2M, TRAC) | 2x 電穿孔 (1) CD70, PD1 (2) β2M, TRAC | 2x 電穿孔 (1) CD70, β2M (2) PD1, TRAC |
| 48 | 26.0% | 19.5% | 64.2% |
| 72 | 27.8% | 21.6% | 64.7% |
表 7
. β2M敲除條件對CD70表現之影響。
| CD70+ 表現 | |||
| 活化條件 ( 小時 ) | 1x 電穿孔 (CD70, PD1, β2M, TRAC) | 2x 電穿孔 (1) CD70, PD1 (2) β2M, TRAC | 2x 電穿孔 (1) CD70, β2M (2) PD1, TRAC |
| 48 | 0.29% | 0.41% | 0.30% |
| 72 | 0.19% | 0.43% | 0.26% |
這些結果顯示，在第二電穿孔步驟中引入以β2M
為目標的RNP錯合物提供了優異的β2M敲除，同時保持了CD70的有效敲除，或細胞生長及細胞存活率。當電穿孔中不包含以PD1
為目標的RNP錯合物時，觀察到相似的結果。 實施例 4 ：鑑定 T 細胞電穿孔之最佳條件。
該實施例報告優化條件的鑑定，該優化條件用於透過電穿孔將用於CRISPR-Cas9依賴性基因編輯的多個RNP錯合物引入T細胞。
簡言之，基因改造的T細胞是在小規模過程中製備的，其中RNP錯合物透過單次電穿孔或兩次電穿孔過程引入T細胞。有關詳細資訊，請參見上面的實施例 2
。透過ddPCR確定易位率。
以一次電穿孔進行基因改造的T細胞顯示出比透過兩次電穿孔的T細胞明顯更高的易位速率，除了在第一次電穿孔中將以PD1
及CD70
為目標的RNP錯合物結合在一起時(圖 2A
)。在第一次電穿孔中(透過RNP錯合物)遞送以CD70
為目標的gRNA時，易位率低於2%。參閱圖 2A 及 2B
。以四種RNP錯合物電穿孔的T細胞的細胞遺傳學分析顯示，易位於容納PD1
(第2號染色體)、β2M
(第15號染色體)、TCR
(第14號染色體)，以及CD70
(第19號染色體)的染色體中(數據未顯示) 。
綜上所述，這些結果顯示，透過在兩個步驟中進行的電穿孔引入RNP錯合物可實現較低的易位率。當電穿孔中不包含以PD1
為目標的RNP錯合物時，觀察到相似的結果。 實施例 5 ：製備表現抗 CD70 CAR 並具有被遺傳破壞的 CD70 、 TRAC ，以及 β2M 基因 (CTX130) 的基因改造的 T 細胞之製備方法開發。 概述
CTX130為一種定向於CD70的T細胞免疫療法，由同種異體T細胞組成，這些異源T細胞使用CRISPR/Cas9 (聚類的規則間隔的短回文重複序列/CRISPR相關蛋白9)基因編輯組成分(sgRNA以及Cas9核酸酶)進行離體基因修飾。
修飾包括以破壞T細胞受體α常數(TRAC)，β2M及CD70為目標。TRAC基因座的破壞會導致T細胞受體(TCR)表現的喪失，且目的在於降低移植物抗宿主病(Graft versus Host Disease, GvHD)的可能性，而β2M基因座的破壞會導致主要的第I型組織相容性錯合物(MHC I)蛋白表現的缺乏，且目的在於透過降低宿主排斥的可能性以提高持久性。CD70的破壞導致CD70表現的喪失，進而防止在插入CD70 CAR之前可能發生的細胞間殺滅性殺傷。抗CD70 CAR的添加將該修飾的T細胞導向表現CD70的腫瘤細胞。
抗CD70 CAR由對CD70特異的抗CD70單鏈可變片段(scFv)組成，隨後是一CD8鉸鏈及跨膜結構域，該結構域融合至一4-1BB的細胞內共訊息傳遞結構域及一CD3ζ訊息傳遞結構域。
CTX130的示例性製備過程描述於圖 3A
。 製備過程之演變
基於透過實施例 1-4
中描述之最優化方法確定的條件，以三個生產規模進行CTX130製備過程，包括研究規模、開發規模，以及臨床規模。研究規模過程是小規模執行的，研究規模過程被放大並轉移到開發規模過程以及臨床規模過程中。使用實驗室級原料藥進行初步活動(4個批次)，以確保可行性及調整操作參數。隨後，針對臨床規模流程實施使用GMP起始原料(sgRNA、Cas9，以及rAAV-145b)以及定量接受標準，該流程在操作上與開發規模流程相同。 起始原料之選擇
用於生產CTX130的起始材料包括：
- 從健康捐贈者所收集的白血球單採術樣本、
- 細菌衍生的Cas9核酸酶、
- 三個單引導RNA (sgRNA)、以CD70基因座為目標的CD70-7 sgRNA、以TRAC基因座為目標的TA-1，以及以β2M基因座為目標的β2M-1 sgRNA，以及
- 重組AAV-6載體(rAAV-145b)，其編碼抗CD70 CAR基因。
以下提供用於進行CTX110遺傳修飾以及編輯的TRAC及β2M基因位點的組成分的結構資訊：
Cas9核酸酶的胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
表 8. sgRNA 序列及目標基因序列。
*表示具有2’-O-甲基硫代磷酸酯修飾的核苷酸。「n」係指5’端的間隔子序列。
| sgRNA 序列 | SEQ ID NO: | ||
| CD70 sgRNA (CD70-7) | 修飾的 | G*C*U*UUGGUCCCAUUGGUCGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U | 2 |
| 未修飾的 | GCUUUGGUCCCAUUGGUCGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU | 3 | |
| CD70 sgRNA 間隔子 | 修飾的 | G*C*U*UUGGUCCCAUUGGUCGC | 4 |
| 未修飾的 | GCUUUGGUCCCAUUGGUCGC | 5 | |
| TRAC sgRNA (TA-1) | 修飾的 | A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U | 6 |
| 未修飾的 | AGAGCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU | 7 | |
| TRAC sgRNA 間隔子 | 修飾的 | A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCC | 8 |
| 未修飾的 | AGAGCAACAGUGCUGUGGCC | 9 | |
| β2M sgRNA ( β2M-1) | 修飾的 | G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U | 10 |
| 未修飾的 | GCUACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU | 11 | |
| β2M sgRNA 間隔子 | 修飾的 | G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCC | 12 |
| 未修飾的 | GCUACUCUCUCUUUCUGGCC | 13 | |
| 目標序列 (PAM) | |||
| CD70 sgRNA | GCTTTGGTCCCATTGGTCGC (GGG) | 14 | |
| CD70 sgRNA | GCTTTGGTCCCATTGGTCGC | 15 | |
| TRAC sgRNA | AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (TGG) | 16 | |
| TRAC sgRNA | AGAGCAACAGTGCTGTGGCC | 17 | |
| β2M sgRNA | GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (TGG) | 18 | |
| β2M sgRNA | GCTACTCTCTCTTTCTGGCC | 19 | |
| 示例性 sgRNA 公式 | |||
| sgRNA 序列 | Nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu | 20 | |
| sgRNA 序列 | Nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc | 21 | |
| sgRNA 序列 | n(17‑30) guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaa aaguggcaccgagucggugcu(1-8) | 22 |
表 9
. 編輯的TRAC
基因序列。
| 描述 | 序列 (以破折號(-)表示刪除；以粗體字 表示插入) | SEQ ID NO: |
| TRAC 基因編輯 | AA---------------------GAGCAACAAATCTGACT | 23 |
| TRAC 基因編輯 | AAGAGCAACAGTGCTGT-GCCTGGAGCAACAAATCTGACT | 24 |
| TRAC 基因編輯 | AAGAGCAACAGTG-------CTGGAGCAACAAATCTGACT | 25 |
| TRAC 基因編輯 | AAGAGCAACAGT------GCCTGGAGCAACAAATCTGACT | 26 |
| TRAC 基因編輯 | AAGAGCAACAGTG---------------------CTGACT | 27 |
| TRAC 基因編輯 | AAGAGCAACAGTGCTGTG GGCCTGGAGCAACAAATCTGACT | 28 |
| TRAC 基因編輯 | AAGAGCAACAGTGC—-TGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT | 29 |
| TRAC 基因編輯 | AAGAGCAACAGTGCTGTGT GCCTGGAGCAACAAATCTGACT | 30 |
表 10.
編輯的β2M
基因序列。
| 描述 | 序列 (以破折號(-)表示刪除；以粗體字 表示插入) | SEQ ID NO: |
| β 2M 基因編輯 | CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCT-GCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT | 31 |
| β 2M 基因編輯 | CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTC--GCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT | 32 |
| β 2M 基因編輯 | CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT-----CTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT | 33 |
| β 2M 基因編輯 | CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGATA GCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT | 34 |
| β 2M 基因編輯 | CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGC-------------------------GCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT | 35 |
| β 2M 基因編輯 | CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTG TGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT | 36 |
表 11
. 編輯的CD70
基因序列。
| 描述 | 序列 (以破折號(-)表示刪除；以粗體字 表示插入) | SEQ ID NO: |
| CD70 基因編輯 | CACACCACGAGGCAGATCACCAAGCCCGCG--CAATGGGACCAAAGCAGCCCGCAGGACG | 37 |
| CD70 基因編輯 | CACACCACGAGGCAGATCACCAAGCCCGCGA ACCAATGGGACCAAAGCAGCCCGCAGGACG | 38 |
| CD70 基因編輯 | CACACCACGAGGCAGATC------------ACCAATGGGACCAAAGCAGCCCGCAGGACG | 39 |
| CD70 基因編輯 | CACACCACGAGGCAGATCACCAAGCCCGCG-CCAATGGGACCAAAGCAGCCCGCAGGACG | 40 |
| CD70 基因編輯 | CACACCACGAGGCAGATCACCAAGCCCGC-ACCAATGGGACCAAAGCAGCCCGCAGGACG | 41 |
| CD70 基因編輯 | CACACCACGAGGCAGATCACCA-------------------------AGCCCGCAGGACG | 42 |
表 12
. 抗CD70 CAR構築體組成分的序列
。
CTX130 之製備過程說明
(i)T 細胞富集
| 描述 | 序列 | SEQ ID NO: |
| CD70 rAAV (具有41BB 的CD70B scFV) | CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGCAGGTCCAGTTGGTGCAAAGCGGGGCGGAGGTGAAAAAACCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCGTCCGGTTATACGTTCACGAACTACGGGATGAATTGGGTTCGCCAAGCGCCGGGGCAGGGACTGAAATGGATGGGGTGGATAAATACCTACACCGGCGAACCTACATACGCCGACGCTTTTAAAGGGCGAGTCACTATGACGCGCGATACCAGCATATCCACCGCATACATGGAGCTGTCCCGACTCCGGTCAGACGACACGGCTGTCTACTATTGTGCTCGGGACTATGGCGATTATGGCATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGACTGTAACAGTTAGTAGTGGTGGAGGCGGCAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGAGGAGGGGGTTCTGGTGACATAGTTATGACCCAATCCCCAGATAGTTTGGCGGTTTCTCTGGGCGAGAGGGCAACGATTAATTGTCGCGCATCAAAGAGCGTTTCAACGAGCGGATATTCTTTTATGCATTGGTACCAGCAAAAACCCGGACAACCGCCGAAGCTGCTGATCTACTTGGCTTCAAATCTTGAGTCTGGGGTGCCGGACCGATTTTCTGGTAGTGGAAGCGGAACTGACTTTACGCTCACGATCAGTTCACTGCAGGCTGAGGATGTAGCGGTCTATTATTGCCAGCACAGTAGAGAAGTCCCCTGGACCTTCGGTCAAGGCACGAAAGTAGAAATTAAAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGGTAACCACGTGCGGACCGAGGCTGCAGCGTCGTCCTCCCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG | 43 |
| CD70 LHA至RHA (具有41BB 的CD70B scFV) | GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGCAGGTCCAGTTGGTGCAAAGCGGGGCGGAGGTGAAAAAACCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCGTCCGGTTATACGTTCACGAACTACGGGATGAATTGGGTTCGCCAAGCGCCGGGGCAGGGACTGAAATGGATGGGGTGGATAAATACCTACACCGGCGAACCTACATACGCCGACGCTTTTAAAGGGCGAGTCACTATGACGCGCGATACCAGCATATCCACCGCATACATGGAGCTGTCCCGACTCCGGTCAGACGACACGGCTGTCTACTATTGTGCTCGGGACTATGGCGATTATGGCATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGACTGTAACAGTTAGTAGTGGTGGAGGCGGCAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGAGGAGGGGGTTCTGGTGACATAGTTATGACCCAATCCCCAGATAGTTTGGCGGTTTCTCTGGGCGAGAGGGCAACGATTAATTGTCGCGCATCAAAGAGCGTTTCAACGAGCGGATATTCTTTTATGCATTGGTACCAGCAAAAACCCGGACAACCGCCGAAGCTGCTGATCTACTTGGCTTCAAATCTTGAGTCTGGGGTGCCGGACCGATTTTCTGGTAGTGGAAGCGGAACTGACTTTACGCTCACGATCAGTTCACTGCAGGCTGAGGATGTAGCGGTCTATTATTGCCAGCACAGTAGAGAAGTCCCCTGGACCTTCGGTCAAGGCACGAAAGTAGAAATTAAAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG | 44 |
| CD70 CAR 核苷酸序列 (具有41BB 的CD70B scFV) | ATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGCAGGTCCAGTTGGTGCAAAGCGGGGCGGAGGTGAAAAAACCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCGTCCGGTTATACGTTCACGAACTACGGGATGAATTGGGTTCGCCAAGCGCCGGGGCAGGGACTGAAATGGATGGGGTGGATAAATACCTACACCGGCGAACCTACATACGCCGACGCTTTTAAAGGGCGAGTCACTATGACGCGCGATACCAGCATATCCACCGCATACATGGAGCTGTCCCGACTCCGGTCAGACGACACGGCTGTCTACTATTGTGCTCGGGACTATGGCGATTATGGCATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGACTGTAACAGTTAGTAGTGGTGGAGGCGGCAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGAGGAGGGGGTTCTGGTGACATAGTTATGACCCAATCCCCAGATAGTTTGGCGGTTTCTCTGGGCGAGAGGGCAACGATTAATTGTCGCGCATCAAAGAGCGTTTCAACGAGCGGATATTCTTTTATGCATTGGTACCAGCAAAAACCCGGACAACCGCCGAAGCTGCTGATCTACTTGGCTTCAAATCTTGAGTCTGGGGTGCCGGACCGATTTTCTGGTAGTGGAAGCGGAACTGACTTTACGCTCACGATCAGTTCACTGCAGGCTGAGGATGTAGCGGTCTATTATTGCCAGCACAGTAGAGAAGTCCCCTGGACCTTCGGTCAAGGCACGAAAGTAGAAATTAAAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGATAA | 45 |
| CD70 CAR 胺基酸序列 (具有41BB 的CD70B scFV) | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADAFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYGDYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREVPWTFGQGTKVEIKSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 46 |
| CD70B scFv 核苷酸序列 | CAGGTCCAGTTGGTGCAAAGCGGGGCGGAGGTGAAAAAACCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCGTCCGGTTATACGTTCACGAACTACGGGATGAATTGGGTTCGCCAAGCGCCGGGGCAGGGACTGAAATGGATGGGGTGGATAAATACCTACACCGGCGAACCTACATACGCCGACGCTTTTAAAGGGCGAGTCACTATGACGCGCGATACCAGCATATCCACCGCATACATGGAGCTGTCCCGACTCCGGTCAGACGACACGGCTGTCTACTATTGTGCTCGGGACTATGGCGATTATGGCATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGACTGTAACAGTTAGTAGTGGTGGAGGCGGCAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGAGGAGGGGGTTCTGGTGACATAGTTATGACCCAATCCCCAGATAGTTTGGCGGTTTCTCTGGGCGAGAGGGCAACGATTAATTGTCGCGCATCAAAGAGCGTTTCAACGAGCGGATATTCTTTTATGCATTGGTACCAGCAAAAACCCGGACAACCGCCGAAGCTGCTGATCTACTTGGCTTCAAATCTTGAGTCTGGGGTGCCGGACCGATTTTCTGGTAGTGGAAGCGGAACTGACTTTACGCTCACGATCAGTTCACTGCAGGCTGAGGATGTAGCGGTCTATTATTGCCAGCACAGTAGAGAAGTCCCCTGGACCTTCGGTCAAGGCACGAAAGTAGAAATTAAA | 47 |
| CD70B scFv 胺基酸序列 (連接子以底線標示) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADAFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYGDYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSG DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREVPWTFGQGTKVEIK | 48 |
| CD70 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADAFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYGDYGMDYWGQGTTVTVSS | 49 |
| CD70 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREVPWTFGQGTKVEIK | 50 |
| 連接子 | GGGGSGGGGSGGGGSG | 51 |
| 訊息胜肽 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP | 52 |
| 訊息胜肽 | MALPVTALLLPLALLLHAARP | 53 |
| CD8a 跨膜結構域 | FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR | 54 |
| CD8a 跨膜 | IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY | 55 |
| 4-1BB 核苷酸序列 | AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG | 56 |
| 4-1BB 胺基酸序列 | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL | 57 |
| CD28 核苷酸序列 | TCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCC | 58 |
| CD28 胺基酸序列 | SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS | 59 |
| CD3ζ 核苷酸序列 | CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA | 60 |
| CD3ζ 胺基酸序列 | RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 61 |
| TRAC-LHA | GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCA | 62 |
| EF1α 啟動子 | GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA | 63 |
| 合成的聚 (A)訊息 | AATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG | 64 |
| TRAC–RHA | TGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG | 65 |
透過使用自動細胞處理系統使用抗CD8級抗CD4抗體包被的磁珠的混合物進行磁分離，從白血球單採術材料(白血球單採術樣本)中富集T細胞。在富集之前，對白血球單採術樣本取樣進行細胞計數及存活率(≥80%)採樣。
在具有HSA的PBS/EDTA緩衝液中分離富集的細胞，然後取樣進行細胞計數，存活率(≥80%)，T細胞純度(≥70%CD3)，並且無菌。然後將細胞在4±1℃下離心，並以50x106
個活細胞/mL的目標濃度重新懸浮於CryoStor CS5中。
(ii)T 細胞冷凍保存
取樣細胞以進行細胞計數、存活率(≥80%)，然後以目標細胞數為2500x106
個細胞/袋(30-70 mL細胞懸液)等分到乙酸乙酯醋酸乙烯冷凍袋中。一個白血球單採術樣本可能足以產生1-2袋T細胞。將每個袋子熱封、貼標籤、於2-8℃下儲存，直到轉移到控制速率的冰箱中，然後轉移到氣相液氮中進行儲存。
(iii)T 細胞解凍、首次電穿孔，以及活化
將一個冷凍的富集T細胞的袋子解凍，轉移到一個3L袋子中，並稀釋至X-VIVOTM
15補充培養基中 (X-VIVOTM
15、5%人類血清、100 IU/mL rhIL2、100 IU/mL rhIL7)。對細胞取樣以進行細胞計數及存活率(≥70%)。
將細胞於20 ± 1o
C下以540g離心15分鐘。將細胞沉澱重新懸浮於電穿孔緩衝液中，並在相同條件下再次離心。將細胞第二次重新懸浮於電穿孔緩衝液中至目標濃度為300x106
個細胞/mL。
在微量離心管中將Cas9核酸酶與CD70-7 sgRNA混合，並在室溫下培養不少於10分鐘，以形成核糖核蛋白(RNP)錯合物。然後將Cas9/sgRNA與細胞混合，使Cas9及CD70-7 sgRNA的最終濃度分別達到0.15 mg/mL及0.16 mg/mL。
將混合物等分，並透過移液將其裝入電穿孔盒中。以基於流式電穿孔的轉染系統將該盒蓋好並依序進行電穿孔。
電穿孔後，將細胞從每個盒中合併至一125 mL錐形瓶中，並於37℃下培養不少於20分鐘。採樣細胞的存活率(≥50%)並計數。然後以1:12.5 (v/v)的比例加入與重組人源化CD3及CD28激動劑溶液偶聯的可溶性膠體聚合物奈米基質以活化細胞。
將細胞以目標密度2x106
個活細胞/mL接種至靜態細胞培養容器中的，每個容器在總體積約為500 mL的補充X-VIVOTM
15培養基/與重組人源化CD3及CD28激動劑偶聯的膠體聚合物奈米基質。
將該靜態細胞培養容器在37±1℃以及5±1% CO2
下培養72±4小時。在整個過程中，每當處理靜態細胞培養容器時，都要檢查它們的凝集與洩漏，以及透明的黃色培養基的存在。
(iv)稀釋
三(3)天後，將補充的X-VIVOTM
15培養基添加到每個靜態細胞培養容器中，最終體積為5L。將細胞於37±1℃及5±1% CO2
下進一步培養過夜。
(v)第二電穿孔及轉導
使用連接至靜態細胞培養容器浸入管的幫浦，將X-VIVOTM
15補充培養基的最終體積降至約500 mL。
輕輕旋轉該靜態細胞培養容器，使細胞重新懸浮在培養基中。取樣細胞以進行細胞計數、存活率(≥70%)。
將細胞轉移至500 mL離心管中，並於540 g，20±1℃下離心15分鐘。將細胞沉澱重新懸浮於電穿孔緩衝液中，並在相同條件下再次離心。將細胞第二次重新懸浮於電穿孔緩衝液中至目標濃度為300x106
個細胞/mL。
將Cas9核酸酶與TA-1 sgRNA及β2M-1sgRNA在單獨的微量離心管中混合。每種溶液在室溫下培養不少於10分鐘，以形成每種核糖核蛋白(RNP)錯合物。合併兩種Cas9/sgRNA混合物，並與細胞混合，使Cas9、TA-1，以及β2M-1的終濃度分別為0.3 mg/mL、0.08 mg/mL，以及0.2 mg/mL。
將混合物等分，並透過移液將其裝入電穿孔盒中。用基於流式電穿孔的轉染系統將該盒蓋好並依序進行電穿孔。
電穿孔後，將細胞從每個盒中合併至一125 mL錐形瓶中，並於37℃下培養不少於20分鐘。採樣細胞的存活率(≥70%)並計數。以X-VIVOTM
15培養基將細胞稀釋至目標濃度1x107
個細胞/mL，並以20,000-50,000 vg/細胞的MOI加入新鮮融化的rAAV-145b。將細胞於37℃、5% CO2
下培養不少於60分鐘。
(vi)細胞擴展
以補充的X-VIVOTM
15培養基稀釋細胞，採樣細胞存活率(≥70%)並計數，並以0.2x106
活細胞/cm2
至0.5x106
活細胞/cm2
的密度接種到兩個靜態細胞培養容器中，以及一個較小的靜態細胞培養容器，可作為衛星培養物進行細胞監測。將靜態細胞培養容器於37±1℃以及5±1% CO2
下培養。
將細胞培養物培養長達9天。在此期間，每3至4天向培養物中每毫升培養液補充100 IU rhIL2及rhIL7。
測試衛星細胞培養物在整個擴增過程中的細胞數、存活率，以及T細胞純度。當衛星培養物中的細胞密度達至約30x106
/cm2
時，將進行TCRαβ消耗。如果衛星的細胞密度未達到30x106
/cm2
，則在第9天對主要培養物中的TCRαβ進行消耗。
(vii)TCRαβ 耗盡
使用連接至靜態細胞培養容器浸入管的幫浦將每個靜態細胞培養容器的培養基減至約500 mL的最終體積。去除大部分培養基後，輕輕旋轉靜態細胞培養容器，使細胞重新懸浮在培養基中。
將細胞轉移到裝有浸入管的500 mL離心管中，浸入管連接到靜態細胞培養容器。採樣細胞的存活率(≥70%)、計數，以及%CAR。然後將細胞於20±1℃下以540g離心15分鐘。將細胞沉澱重新懸浮並彙集在少於650 mL的含有0.5%HSA的PBS/EDTA中。將細胞懸浮液轉移到無菌袋中，該無菌袋與自動細胞處理系統相連。自動化細胞處理系統將細胞與生物素偶聯的抗TCRαβ抗體培養。洗滌細胞並與抗生物素磁珠一起培養，以使用自動細胞處理系統去除TCRαβ+
細胞。
測試細胞的細胞計數、存活率(≥70%)，以及%CAR細胞。
(viii)細胞恢復
將耗盡的細胞重新懸浮於補充X-VIVOTM
15培養基中，並轉移至3L袋中，接種至靜態細胞培養容器中，並於37±1℃以及5±1% CO2
下培養過夜。
(ix)細胞收穫 ( 藥物 )
為了收穫細胞，將靜態細胞培養容器從培養箱中取出，靜置以沉澱細胞。使用幫浦從每個靜態細胞培養容器中除去生長培養基，使最終體積約為500 mL。對除去的培養基進行無菌取樣。
輕輕旋轉靜態細胞培養容器，使細胞重新懸浮在培養基中。使用幫浦將每個靜態細胞培養容器中的內容物轉移到3L轉移袋中，並取樣進行濃度、存活率，以及藥物批次釋放測試。然後透過重力將細胞透過40 µm輸血過濾器過濾到單獨的無菌3L袋中。 CTX130 的特徵描述
CTX130為針對CD70的T細胞免疫療法，由表現抗CD70 CAR的同種異體T細胞組成，並具有被遺傳破壞的CD70
、TRAC
，以及β2M
基因。進行非臨床藥理及毒理學研究，以描述CTX130特徵非GMP開發批次的潛在功效及毒性。CTX130 的非 GMP 開發批次之生產及特徵描述
這項研究之目的是確定使用本文所述之方法是否實現可重複生產的非GMP的CD70 CAR T細胞。
在最初的步驟中，編輯了三個單獨的人類T細胞捐贈者，以創建非GMP開發批次的CTX130，其RNPs包含針對CD70的Cas9與gRNA，隨後為RNPs包含針對TRAC及β2M的Cas9與gRNA，然後在第二步進行以包含編碼CAR的捐贈者模板的AAV6轉導。隨後使用管柱純化法去除剩餘的殘留TCR+
細胞。
簡言之，將來自3個單獨捐贈者的T細胞解凍，並以含Cas9及以CD70基因座為目標的gRNA的RNP電穿孔，然後使用與重組人源化CD3及CD28激動劑綴合的膠體聚合物奈米基質活化3天。於第4天，將微珠稀釋，並使T細胞再擴增一天。於第5天，將細胞以含有Cas9的RNP以及以TRAC及β2M基因座為目標的gRNA進行電穿孔，然後與包含含有CD70 CAR的HDR模板的AAV6一起培養。在第二個基因編輯步驟之後的十天，使用流式細胞儀分析細胞，以評估TRAC、β2M及CD70的敲除效率以及表現CAR的細胞的百分比。使用抗TRAC、β2M及CD70蛋白的抗體進行染色，而CAR表現則透過用生物素標記的抗小鼠Fab2抗體染色並隨後與螢光鏈黴親和素一起培養來檢測。
編輯細胞的分析顯示99.7±0.1%的TRAC陰性細胞、79.4±1.1%的β2M陰性細胞，以及98.9±0.3%的CD70-
細胞(表 13
)。在3個測試的捐贈者中，在80.8±8.4%的細胞中檢測到CAR表現(表 13
)。使用相同的步驟，使用第四個捐贈者(捐贈者4)產生了另一個研究批號CTX130，但研究批號並未因剩餘的殘留TCR+
細胞而耗盡。
表13. 來自4個獨立捐贈者的CTX130批次的編輯效率之總結。
*大量研究產生的CTX130沒有耗盡殘留的TCR+
細胞；不包括在平均值中。
(x)效應子細胞激素釋放
| 樣品 | %TCR- | % β2M- | % CD70- | % CAR+ |
| 捐贈者1 | 99.6 | 80.63 | 99.15 | 85.2 |
| 捐贈者2 | 99.8 | 78.81 | 98.62 | 71.1 |
| 捐贈者3 | 99.9 | 78.7 | 99.06 | 86.1 |
| 平均 | 99.7 ± 0.1 | 79.4 ± 1.1 | 98.9 ± 0.3 | 80.8 ± 8.4 |
| 捐贈者4* | 99.4 | 85.9 | 90.2 | 79 |
這項研究之目的為評估CTX130細胞與CD70+
或CD70-
細胞共培養時分泌干擾素-γ (interferon-gamma, IFNγ)與介白素2 (Interleukin 2, IL-2)的能力。
將人類目標細胞(CD70+
細胞株A498以及ACHN，以及CD70-MCF7細胞)與T細胞以每孔50,000個目標細胞的不同比例(T細胞與目標細胞的比例從0.125:1到4:1)共培養於一96孔盤共24小時。將目標細胞與CTX130細胞或對照細胞(未編輯的T細胞)一起培養。測量培養基上清液中的IFNγ與IL-2含量，並證明CTX130與CD70+
共培養時具有分泌IFNγ及IL-2的能力，而與CD70-
細胞共培養時則不具有該能力。
(xi)腫瘤細胞的細胞毒性
這項研究之目的為評估CTX130細胞殺死CD70+
細胞的能力。簡言之，將人類目標CD70+
細胞(A498及ACHN)以50,000個目標細胞/孔接種在96孔盤中過夜，然後與CTX130或未經編輯的T細胞以不同的比率(從0.125:1至 4:1的T細胞與目標細胞)持續24小時。測量對目標細胞的殺傷，並證明CTX130細胞在體外殺死CD70+
細胞株。
(xii)其他研究
其他研究顯示，CTX130細胞在腎細胞癌及Sézary症候群的皮下模型中具有限制腫瘤細胞生長的能力，並證明CTX130治療對小鼠的每個測量終點，包括存活率、GvHD的臨床徵象，以及體重，均具有良好的耐受性。
(xiii)人類組織交叉反應性
這項研究之目的為在基於免疫組織化學的組織交叉反應研究中評估CTX130中包含的抗CD70 CAR的選擇性。在這項研究中使用的測試物品為CTX130的scFv部分所衍生的抗體。在兩種濃度的抗體下評估32個人體組織的標準樣本：最佳濃度(2.5 µg/mL)以及高濃度(10.0 µg/mL)，以捕獲與人體組織的任何潛在結合。針對每個測試的組織，評估來自3個捐贈者的切片。於某些淋巴組織(淋巴結及扁桃腺)中觀察到最小到中等陽性染色，與正常的CD70表現模式一致。在該切片的其餘組織中未觀察到染色。在陽性對照(人類腎細胞癌腫瘤細胞)中觀察到了牢固的染色。
(xiv)細胞激素非依賴性生長
這項研究之目的為評估在沒有血清及細胞激素IL-2與IL-7的情況下CTX130增殖的能力。簡言之，將來自研究批次級非GMP開發批次的CTX130細胞在完全T細胞培養基，含血清但不含IL2或IL7細胞激素(僅血清)或不含血清或細胞激素(基礎培養基)的培養基中生長。第0天發生在基因組編輯後14天。針對研究批次級非GMP開發批次，在沒有細胞激素的情況下均未觀察到生長。這些結果顯示基因組編輯後，在無血清及無細胞激素的培養基中缺乏生長及增殖。 實施例 6 ：改善的細胞擴增 最佳化電穿孔以增加 CTX130 細胞的擴增輸出
本發明中描述之方法利用電穿孔將各種核酸及多胜肽遞送至受體T細胞，包括例如包含Cas9級引導RNA錯合物的各種核糖核蛋白(RNP)錯合物。對電穿孔過程中使用的儀器沒有特別限制，因為來自各種製備商的任何適合的電穿孔儀器均可在本文所述之方法中找到用途。電穿孔中使用的細胞接種密度沒有特別限制。
本實施例使用一種能夠在電穿孔盒中電穿孔數量增加的細胞的電穿孔儀器，該電穿孔盒能夠保留更大的體積，同時保持有效的編輯。透過提供更多數量的經編輯的細胞用於轉導及擴增，較大的電穿孔能力可將任何給定的工程化T細胞(例如，CTX130工程化T細胞產品)的輸出增加(例如，增加一倍)。這是製備的好處，因為這種增加的容量無需延長過程持續時間及/或細胞倍增。
例如，可使用其他細胞來接種其他T細胞培養容器(具有5000 mL培養基容量的500 cm²透氣膜表面積)，例如2個或更多其他培養容器。例如，隨著細胞數量的增加，最多可接種4個培養容器，其中300e6 ≤ x ≤ 600e6個細胞可接種在2個培養容器中，600e6 ≤ x ≤ 800e6個細胞可接種在3個培養容器中，或者≤ 800e6細胞可接種在4x培養皿中。
於某些方面，每個培養容器接種約400,000個細胞/cm2
至500,000個細胞/cm2
。或者，每個培養皿可接種約250,000個細胞/cm2
至500,000個細胞/cm2
，或每個培養皿接種約300,000個細胞/cm2
至500,000個細胞/cm2
，或每個培養皿接種約150,000個細胞/cm2
至250,000個細胞/cm2
，或每個培養皿接種約150,000個細胞/cm2
至500,000個細胞/cm2
，或每個培養容器中接種約150,000個細胞/cm2
至600,000個細胞/cm2
。
於某些方面，目標接種密度為至少約150,000個細胞/cm2
，或至少約250,000個細胞/cm2
，或至少約300,000個細胞/cm2
，或至少約400,000個細胞/cm2
，或至少約500,000個細胞/ cm2
。
於某些方面，目標接種密度為約250,000個細胞/cm2
。於其他方面，目標接種密度為約500,000個細胞/cm2
。
可使用容量最高為1 mL的電穿孔盒。使用該系統，最多可在七個G1000盒中對2.7 x 109
個細胞進行電穿孔。透過將一次性鈍頭針連接到3 mL注射器從盒中取出細胞，也將消除微量移液器針頭彈射入錐形瓶的風險。
使用具有更大容量的系統還有助於細胞轉導步驟。將目前最多可轉導至7e8個細胞加倍至1.4e9個細胞，可產生足夠的材料以接種多達四個細胞培養容器以進行擴增。因此，可維持固定的第9天耗竭，在相同的處理時間內，有效地使每次運行的產量增加一倍。
CTX130生產過程中的其他步驟如以上實施例中所述。等同
雖然本文已描述並闡明了幾個發明實施例，但是本領域普通技術人員將容易想出用於執行功能及/或獲得結果的各種其他手段及/或結構及/或所述之一或多個優點，且這些變化及/或修改中的每一個被認為包含在本文所述之發明實施例的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易理解到，如本文所述之所有參數、尺寸、材料及配置目的為示例性的，且實際參數、尺寸、材料及/或配置將取決於具體應用或應用使用本發明之教示。本領域技術人員將認識到或能夠使用不超過常規實驗來確定如本文所述之具體創造性實施例的許多等同物。因此，應當理解的是，前述實施例僅以示例之方式呈現，且在所附之申請專利範圍及其等同物的範圍內，發明實施例可以不同於具體描述及請求保護之方式實施。本發明之發明實施例涉及如本文所述之每個單獨特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法。此外，如果這些特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則二個或更多個這樣的特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法的任何組合都包括在本發明之發明範圍內。
本文定義及使用之所有定義應理解為掌控字典定義、透過引用併入之文獻中的定義，及/或定義術語之普通含義。
本文中公開之所有參考文獻、專利及專利申請均透過引用方式併入本文，並涉及每個被引用的主題，在某些情況下其可包含整個文件。
在本說明書及申請專利範圍中使用之定冠詞「一」以及「一個」，除非明確指出相反意思，否則應理解為「至少一個」。
在本說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或」應被理解為係指所結合的元件中的「一個或二個」，亦即，在某些情況下該些元件結合存在，而在另一情況下則分開存在。以「及/或」列出的多個元件應該以相同之方式來解釋，亦即，「一個或多個」元件如此地連接。除了以「及/或」子句特別標識之元件外，其他元件可選擇性地存在，不論與這些特別標識之元件相關或不相關。因此，作為非限制性的示例，當結合例如「包含」的開放式語言使用時，對「A及/或B」的引用可以於一實施例中僅指A (選擇性地包括除了B之外的元件)；在另一具體實施例中，則僅指B (選擇性地包括除了A之外的元件)；在另一具體實施例中，則指A與B (選擇性地包括其它元件)；等等。
如本說明書及申請專利範圍中所使用的，「或」應理解為具有與上述定義之「及/或」相同的含義。例如，當於一列表中分離項目時，「或」或「及/或」應被解釋為包括的，亦即，包括數量或元件列表中的至少一個，但也包括多於一個，以及選擇性地，額外未列出之項目。只有明確指示出相反的意思，例如「只有一個」或「確切為一個」，或，當用於申請專利範圍中，「由...組成」時，將指的是僅列出之一或多個元件。一般而言，當前面放有排他性術語，例如「任一」、「之一」、「只有之一」或「確切為一個」時，本文所用之術語「或」應僅被解釋為表示排他性的替代品(亦即，「一個或另一個，但不是二者」)。當「主要由...組成」用於申請專利範圍中時，應具有其在專利法領域所使用之普通含義。
如本說明書及申請專利範圍中所使用的，片語「至少一個」對於一個或多個元件的列表，應當被理解為係指從元件列表中的任何一個或多個元件選擇出的至少一個元件，但不一定包括具體列在元件列表中的各個及每個元件中的至少一個，且並不排除元件列表中的元件之任何組合。該定義還允許選擇性地存在除了在片語「至少一個」所指的元件列表中具體標識的元件之外的元件，無論是與這些特定標識的元件相關或不相關的元件。因此，作為非限制性的實施例，「A和B中的至少一個」 (或等效地，「A或B中的至少一個」或等同地「A及/或B中的至少一個」)，於一具體實施例中，可以指至少一個，選擇性地包括多於一個，A，而沒有B的存在(且選擇性地包括除了B之外的元件)；在另一個具體實施例中，指至少一個，選擇性地包括多於一個，B，而沒有A的存在(且選擇性地包括除了A之外的元件)；在另一具體實施例中，指至少一個，選擇性地包括多於一個，A，以及至少一個，選擇性地包括多於一個，B (且選擇性地包括其它元件)；等等。
還應當理解的是，除非明確地指出相反者，否則在本文所要求的任何包括多於一個步驟或作用之方法中，方法的步驟或動作之順序不一定限於在所述之該方法的步驟或動作之順序。
無
圖 1
為顯示在小規模製備過程中製備的T細胞的編輯後的T細胞擴增的圖。RNP錯合物在括號中指出。2d：T細胞活化2天(48小時)；3d：T細胞活化3天(72小時)；1x EP：單次電穿孔；2x EP：兩次電穿孔。
圖 2A-2B
包括顯示單次電穿孔或兩次電穿孔對易位速率的影響的圖。圖 2A
：顯示11個指示的易位的易位百分比的圖。圖 2B
：顯示8個指示的易位的易位百分比的圖。
圖 3A-3B
包括製備CTX130T細胞之方法的流程圖，該CTX130T細胞表現抗CD70 CAR並具有遺傳被破壞的CD70、β2M，以及TRAC基因。圖 3A
包括根據本文描述之技術的一些具體實施例的用於製備表現抗CD70 CAR的T細胞的說明性製備過程的流程圖。CAR：嵌合抗原受體；EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)：乙二胺四乙酸； HAS (Human serum albumin)：人類血清白蛋白；IL (Interleukin)：介白素；PBS (Phosphate buffered saline)：磷酸鹽緩衝鹽水；rAAV (Recombinant adeno-associated virus)：重組腺相關病毒；sgRNA (Single guide ribonucleic acid)：單引導核糖核酸；TCRαβ：T細胞受體α鏈及T細胞受體β鏈；補充的X-VIVOTM
15：含5%男性人類血清AB，100 IU/mL rhIL-2，以及100 IU/mL rhIL-7的X-VIVOTM
15培養基。圖 3B
包括根據本文描述之技術的一些具體實施例的用於製備包含表現抗CD70 CAR的T細胞的藥物產品的說明性製備過程的流程圖。
無
Claims (47)
- 一種製備基因改造的T細胞之方法，該方法包括： (i) 提供第一T細胞群； (ii) 將包含第一Cas9酶以及以CD70 基因為目標的第一引導RNA (guide RNA，gRNA)的第一核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)錯合物引入該第一T細胞群，以產生第二T細胞群，其中該第二T細胞群包括該CD70 基因被破壞的T細胞； (iii) 將包含第二Cas9酶以及以T細胞受體α鏈恆定區(T cell receptor alpha chain constant region，TRAC )基因為目標的第二引導RNA (gRNA)的第二核糖核蛋白(RNP)錯合物以及包含第三Cas9酶以及以β-2微球蛋白(beta-2 microglobulin，β2M )基因為目標的第三引導RNA (gRNA)的第三核糖核蛋白(RNP)錯合物引入該第二T細胞群，以產生第三T細胞群，其中該第三T細胞群包括該CD70 基因被破壞、該TRAC 基因被破壞、該β2M 基因被破壞的T細胞； (iv) 將該第三T細胞群與腺相關病毒(adeno-associated viral，AAV)載體一起培養以產生第四T細胞群，其中該腺相關病毒(AAV)載體包含編碼嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的核酸序列，且其中該核酸序列側接該TRAC 基因的同源序列，且其中該第四T細胞群包含表現該CAR且該CD70 基因被破壞、該TRAC 基因被破壞、該β2M 基因被破壞的活化T細胞； (v) 擴增該第四T細胞群進而產生擴增的T細胞群； (vi) 從該擴增的T細胞群中去除TCRαβ+ T細胞以產生基因改造的T細胞群，其中該基因改造的T細胞群包含表現該CAR且該CD70 基因被破壞、該TRAC 基因被破壞、該β2M 基因被破壞的T細胞；以及 (vii) 收穫該基因改造的T細胞群。
- 如請求項1之方法，其中該第一T細胞群係衍生自從人類血液細胞富集的冷凍保存的T細胞。
- 如請求項1或2之方法，其中該第一T細胞群係透過以下方法所製備：(a) 從人類捐贈者獲得血液細胞；(b) 從該血液細胞中富集CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞。
- 如請求項3之方法，其中步驟(b)係使用與抗CD4及/或抗CD8抗體綴合的磁珠進行的。
- 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中該第一T細胞群具有至少約80%的細胞存活率及/或至少約80%的CD4+ 及CD8+ T細胞的純度。
- 如請求項3至5中任一項之方法，進一步包括(c)冷凍保存在步驟(b)中產生的富集的CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中步驟(ii)透過電穿孔進行。
- 如請求項7之方法，其中該第一Cas9酶的濃度為約0.15 mg/mL，且以該CD70 基因為目標的該第一gRNA的濃度為約0.16 mg/mL。
- 如請求項7或8之方法，其中步驟(ii)中的細胞濃度為約100x106 個細胞/mL至約350x106 個細胞/mL。
- 如請求項9之方法，其中步驟(ii)中的細胞濃度為約300x106 個細胞/mL。
- 如請求項1至10中任一項之方法，其中該擴增步驟包括以約150,000個細胞/cm2 至約600,000個細胞/cm2 之間，可視需要地約300,000個細胞/cm2 至約500,000個細胞/cm2 之間的密度在一細胞容器中接種該T細胞。
- 如請求項1至11中任一項之方法，該方法進一步包括在步驟(ii)之後及在步驟(iii)之前，在細胞培養容器中在T細胞活化劑存在下培養該第二T細胞群以產生活化的T細胞群，其中該活化的T細胞群包括該CD70 基因被破壞的活化的T細胞。
- 如請求項12之方法，其中該T細胞活化劑包括CD3激動劑以及CD28激動劑，且其中該CD3激動劑以及CD28激動劑附著於奈米基質顆粒。
- 如請求項12之方法，其中在細胞培養容器中在T細胞活化劑存在下培養該第二T細胞群，且細胞接種密度為約2x106 個細胞/cm2 ，並以細胞濃度為約2x106 個細胞/mL培養約72小時。
- 如請求項12至14中任一項之方法，其中該混合物中該T細胞活化劑與培養基的比例為約1:12.5 (v/v)。
- 如請求項12至15中任一項之方法，進一步包括在該T細胞活化劑存在下培養該第二T細胞群之後，稀釋在該活化的T細胞群中的該T細胞活化劑以降低活化並使細胞在步驟(iii)之前恢復。
- 如請求項1至16中任一項之方法，其中步驟(iii)透過電穿孔進行。
- 如請求項1至17中任一項之方法，其中步驟(iii)涉及一個電穿孔事件。
- 如請求項12至16中任一項之方法，其中該第二RNP錯合物以及該第三RNP錯合物在一個電穿孔事件中被引入該活化的T細胞。
- 如請求項17至19中任一項之方法，其中該第二RNP錯合物中的該第二Cas9酶的量與該第三RNA錯合物中的該第三Cas9酶的量相同。
- 如請求項17至20中任一項之方法，其中該第二Cas9酶的濃度為約0.15 mg/mL，該第三Cas9酶的濃度為約0.15 mg/mL，以該TRAC 基因為目標的該第二gRNA的濃度為約0.08 mg/mL，且以該β2M 基因為目標的該第三gRNA的濃度約為0.2 mg/mL。
- 如請求項17至21中任一項之方法，其中步驟(v)中該擴增的T細胞群中的細胞濃度為約100x106 個細胞/mL至約400x106 個細胞/mL。
- 如請求項17至21中任一項之方法，其中步驟(iv)中的細胞數目為約3x108 個細胞。
- 如請求項1至23中任一項之方法，其中該AAV載體的感染複數(multiplicity of infection，MOI)值為約10,000至約80,000。
- 如請求項24之方法，其中該AAV載體的MOI為約20,000。
- 如請求項24或25之方法，其中該AAV載體為AAV血清型6 (AAV6)載體。
- 如請求項1至26中任一項之方法，其中步驟(v)係藉由在細胞培養容器中以約2x105 個細胞/cm2 至約7x105 個細胞/cm2 的接種密度培養該第四T細胞群約6天至約12天而進行之。
- 如請求項1至26中任一項所述之方法，其中步驟(v)係藉由在細胞培養容器中以約2x105 個細胞/cm2 至約5x105 個細胞/cm2 的接種密度培養該第四T細胞群約7天至約9天而進行之。
- 如請求項27或28之方法，其中以約3x105 個細胞/cm2 至約5x105 個細胞/cm2 的接種密度培養該第四T細胞群。
- 如請求項27或29之方法，其中該細胞培養容器為靜態細胞培養容器，其允許細胞擴增約10天至約12天而無需更換培養基。
- 如請求項27、28或29中任一項之方法，其中該細胞培養容器為靜態細胞培養容器，其允許細胞擴增約7天至約9天而無需更換培養基。
- 如請求項1至30中任一項之方法，其中步驟(vi)係透過使該擴增的細胞與固定有抗TCRαβ抗體的微珠接觸，並收集未結合的細胞而進行的。
- 如請求項1至32中任一項之方法，其中該第一Cas9酶、該第二Cas9酶，及/或該第三Cas9酶為化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes ) Cas9核酸酶(spCas9)。
- 如請求項1至33中任一項之方法，其中該第一Cas9酶、該第二Cas9酶，以及該第三Cas9酶是相同的。
- 如請求項34之方法，其中該第一Cas9酶、該第二Cas9酶，以及該第三Cas9酶包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
- 如請求項1至35中任一項之方法，其中以該CD70 基因為目標的該第一gRNA包含SEQ ID NO: 4的間隔子序列。
- 如請求項36之方法，其中以該CD70 基因為目標的該第一gRNA包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
- 如請求項1至37中任一項之方法，其中以該TRAC 基因為目標的該第二gRNA包含SEQ ID NO: 8的間隔子序列。
- 如請求項38之方法，其中以該TRAC 基因為目標的該第二gRNA包含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列。
- 如請求項1至39中任一項之方法，其中以該β2M 基因為目標的該第三gRNA包含SEQ ID NO: 12的間隔子序列。
- 如請求項40之方法，其中以該β2M 基因為目標的該第三gRNA包含SEQ ID NO: 10的核苷酸序列。
- 如請求項36至41中任一項之方法，其中該第一gRNA、該第二gRNA、該第三gRNA，及/或其組合包含一個或多個2’-O-甲基硫代磷酸酯修飾。
- 如請求項1至42中任一項之方法，其中該CAR包含以癌症抗原為目標的胞外結構域、跨膜結構域、共刺激結構域，以及CD3ζ細胞質訊息傳遞結構域。
- 如請求項43之方法，其中該胞外結構域包含單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)，該跨膜結構域衍生自CD8a，及/或該共刺激結構域衍生自4-1BB。
- 如請求項44之方法，其中該scFv片段結合CD70。
- 如請求項45之方法，其中該CAR包含SEQ ID NO: 46的胺基酸序列。
- 一種基因改造的T細胞群，其係透過如請求項1至46中任一項所述之方法所產生。
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