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CN116802203A - 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法 - Google Patents

从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法 Download PDF

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CN116802203A
CN116802203A CN202180088288.0A CN202180088288A CN116802203A CN 116802203 A CN116802203 A CN 116802203A CN 202180088288 A CN202180088288 A CN 202180088288A CN 116802203 A CN116802203 A CN 116802203A
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cell
igsf
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cells
constant
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M·P·波尔托拉克
L·杰梅罗斯
C·斯坦伯格
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Juno Therapeutics Inc
Original Assignee
Juno Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本文提供了表达嵌合受体的工程化T细胞，所述嵌合受体包含与免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3‑IgSF)融合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述工程化T细胞含有编码所述嵌合受体的经修饰的恒定CD3‑IgSF链基因座。还提供了含有所述工程化T细胞的细胞组合物、用于将细胞工程化的核酸，以及用于产生所述工程化细胞的方法、试剂盒和制品，如通过靶向编码嵌合受体的一部分的转基因以供整合至恒定CD3‑IgSF链基因组基因座中。在一些实施方案中，可以将所述工程化细胞，例如T细胞与细胞疗法结合使用，包括与包含所述工程化细胞的过继转移的癌症免疫疗法结合使用。

Description

从经修饰的恒定CD3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受 体的细胞、相关多核苷酸和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月4日提交的美国临时申请号63/109,858的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。
序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2021年11月3日创建的名为735042016940SeqList.txt的文件提供，其大小为60,967字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本涉及表达嵌合受体的工程化T细胞，所述嵌合受体包含与免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF)融合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述工程化T细胞含有编码所述嵌合受体的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座。还提供了含有所述工程化T细胞的细胞组合物、用于将细胞工程化的核酸，以及用于产生所述工程化细胞的方法、试剂盒和制品，如通过靶向编码嵌合受体的一部分的转基因以供整合至恒定CD3-IgSF链基因组基因座中。在一些实施方案中，可以将所述工程化细胞，例如T细胞与细胞疗法结合使用，包括与包含所述工程化细胞的过继转移的癌症免疫疗法结合使用。
背景技术
利用嵌合受体(如包括结合结构域的嵌合受体)识别与疾病相关的抗原的过继细胞疗法代表用于治疗癌症和其他疾病的有吸引力的治疗方式。需要改进的策略用于工程化T细胞以表达嵌合受体，如用于过继免疫疗法，例如，用于治疗癌症、感染性疾病和自身免疫疾病。提供了用于在满足此类需求的方法中使用的方法、细胞、组合物和试剂盒。
发明内容
本文提供了工程化T细胞，其包含经修饰的恒定CD3-免疫球蛋白超家族(恒定CD3-IgSF)链基因座，所述基因座包含编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的核酸序列，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3链的融合蛋白，其中所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
本文提供了表达微型嵌合抗原受体(miniCAR)的工程化T细胞，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的融合蛋白。在任何实施方案中的一些中，miniCAR由经修饰的恒定CD3-免疫球蛋白超家族(恒定CD3-IgSF)链基因座表达，所述基因座包含编码所述miniCAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
本文提供了工程化T细胞，其包含编码抗原结合结构域的转基因，所述转基因框内插入编码免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的基因座的开放阅读框，其中所述工程化T细胞表达包含异源抗原结合结构域和所述内源恒定CD3-IgSF链的miniCAR融合蛋白。
在任何所提供的实施方案中的一些中，恒定CD3-IgSF链是CD3ε(CD3e)链。在任何所提供的实施方案中的一些中，恒定CD3-IgSF链是CD3δ(CD3d)链。在任何所提供的实施方案中的一些中，恒定CD3-IgSF链是CD3γ(CD3g)链。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的经修饰的CD3ε(CD3E)基因座、编码CD3d链的经修饰的CD3δ(CD3D)基因座或编码CD3g链的经修饰的CD3γ(CD3G)基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的经修饰的CD3E基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3d链的经修饰的CD3D基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3g链的经修饰的CD3G基因座。
本文提供了工程化T细胞，其包含经修饰的CD3E基因座，所述基因座包含编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的核酸序列，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和内源CD3e链的融合蛋白，其中所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述CD3e链的内源CD3E基因座的开放阅读框。
本文提供了表达微型嵌合抗原受体(miniCAR)的工程化T细胞，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和内源CD3e链的融合蛋白。
在任何所提供的实施方案中的一些中，miniCAR由经修饰的CD3E链基因座表达，所述基因座包含编码所述miniCAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述CD3e链的内源CD3E基因座的开放阅读框。
本文提供了工程化T细胞，其包含编码抗原结合结构域的转基因，所述转基因框内插入编码内源CD3e链的基因座的开放阅读框，其中所述工程化T细胞表达包含异源抗原结合结构域和所述内源CD3e链的miniCAR融合蛋白。
在任何所提供的实施方案中的一些中，抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合片段。在任何所提供的实施方案中的一些中，抗原结合结构域是或包含Fab片段、Fab2片段、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。在任何所提供的实施方案中的一些中，抗原结合结构域是scFv。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述异源抗原结合结构域和所述内源恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的CD3E基因座按5'到3'顺序包含编码所述异源抗原结合结构域和所述内源CD3e链的核苷酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，异源抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链直接连接。在任何所提供的实施方案中的一些中，异源抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链经由接头间接连接。在任何所提供的实施方案中的一些中，异源抗原结合结构域和所述CD3e链直接连接。在任何所提供的实施方案中的一些中，异源抗原结合结构域和所述CD3e链经由接头间接连接。在任何所提供的实施方案中的一些中，转基因还包含编码接头的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，接头定位于所述抗原结合结构域的3'处。
本文提供了工程化T细胞，其包含经修饰的CD3E基因座，所述基因座包含编码miniCAR的核酸序列，所述miniCAR包含异源抗原结合结构域和内源CD3e链，其中所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列和编码接头的序列的转基因，其中所述抗原结合结构域是scFv，(ii)编码所述CD3e链的内源CD3E基因座的开放阅读框。
在任何所提供的实施方案中的一些中，转基因序列按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列和编码所述接头的核苷酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域、所述接头和所述恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是多肽接头。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是长度为12至18个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是长度为15至18个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:122)、GGGGGS(SEQ ID NO:128)及其组合。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头包含(GGS)n，其中n是1至10；(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)，其中n是1至10；或(GGGGGS)n(SEQ ID NO:129)，其中n是1至4。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头选自以下接头，其是或包含GGS、是或包含GGGGS(SEQ IDNO:122)、是或包含GGGGGS(SEQ ID NO:128)、是或包含(GGS)2(SEQ ID NO:130)、是或包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:131)、是或包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:132)、是或包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:133)、是或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:134)、是或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:135)、是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，转基因还包含编码一种或多种多顺反子元件的核酸序列，任选地其中所述一种或多种多顺反子元件是或包含核糖体跳跃序列，任选地其中所述核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A元件。在任何所提供的实施方案中的一些中，P2A元件包含SEQ ID NO:3所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，一种或多种多顺反子元件中的至少一种定位于所述抗原结合结构域的5’处。在任何所提供的实施方案中的一些中，转基因序列按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件(任选地是P2A元件)、所述抗原结合结构域和所述接头的核苷酸序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，转基因还包含编码亲和标签的核酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，亲和标签是链霉亲和素结合肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:137)、Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:136)、Trp-Se r-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:146)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Gl u-Lys(SEQ ID NO:147)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:148)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件(任选地是P2A元件)、所述抗原结合结构域、所述接头和所述恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的CD3E基因座按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件(任选地是P2A元件)、所述抗原结合结构域、所述接头和所述CD3e链的核苷酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，(ii)中的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框编码全长成熟恒定CD3-IgSF链。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含所述内源基因座的可操作地连接的启动子和/或调节或控制元件，以控制编码所述miniCAR的核酸序列的表达。在任何所提供的实施方案中的一些中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含一种或多种可操作地连接的异源调节或控制元件，以控制所述miniCAR或其部分的表达。
在任何所提供的实施方案中的一些中，抗原结合结构域结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何所提供的实施方案中的一些中，靶抗原是肿瘤抗原。在任何所提供的实施方案中的一些中，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在任何所提供的实施方案中的一些中，miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物。在任何所提供的实施方案中的一些中，miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF CD3e链组装成TCR/CD3复合物。在任何所提供的实施方案中的一些中，靶抗原与miniCAR的异源抗原结合结构域的结合诱导经由TCR/CD3复合物的抗原依赖性信号传导。在任何所提供的实施方案中的一些中，与用包含相同抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述miniCAR展现经由TCR/CD3复合物的降低的强直信号传导。在任何所提供的实施方案中的一些中，与用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述工程化T细胞展现增加的持久性，所述CAR包含相同的抗原结合结构域和异源CD3ζ(CD3z)信号传导结构域、以及任选地共刺激信号传导结构域。在任何所提供的实施方案中的一些中，与用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述工程化T细胞展现增加的细胞溶解活性，所述CAR包含相同的抗原结合结构域和异源CD3ζ(CD3z)信号传导结构域、以及任选地共刺激信号传导结构域。
在任何所提供的实施方案中的一些中，T细胞是源自受试者的原代T细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，受试者是人。在任何所提供的实施方案中的一些中，T细胞是CD8+T细胞或其亚型，或者CD4+T细胞或其亚型。
在任何所提供的实施方案中的一些中，将所述转基因序列经由同源定向修复(HDR)整合在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座处。
本文提供了多核苷酸，其包含(a)编码抗原结合结构域的核酸序列；和(b)与所述核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与T细胞的免疫球蛋白超家族恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个同源臂包含与所述恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座、编码CD3d链的CD3D基因座或编码CD3g链的CD3G基因座。
在任何所提供的实施方案中的一些中，恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3d链的CD3D基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3g链的CD3G基因座。
本文提供了多核苷酸，其包含(a)编码抗原结合结构域的核酸序列；和(b)与编码所述转基因的核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与编码CD3e链的CD3E基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合片段。在任何所提供的实施方案中的一些中，抗原结合结构域是或包含Fab片段、Fab2片段、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。在任何所提供的实施方案中的一些中，抗原结合结构域是scFv。在任何所提供的实施方案中的一些中，核酸序列还包含编码可操作地与所编码的抗原结合结构域连接的接头的核苷酸，其中所述接头定位于所述抗原结合结构域的3'处。
本文提供了多核苷酸，其包含(a)编码单链可变片段(scFv)的核酸序列和编码接头的序列；和(b)与所述核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与编码CD3e链的CD3E基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头是多肽编码接头。在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头是长度为12至18个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头是长度为15至18个氨基酸的多肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:122)、GGGGGS(SEQ ID NO:128)及其组合。在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头包含(GGS)n，其中n是1至10；(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)，其中n是1至10；或(GGGGGS)n(SEQ ID NO:129)，其中n是1至4。在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头选自以下编码的接头，其是或包含GGS、是或包含GGGGS(SEQ ID NO:122)、是或包含GGGGGS(SEQ ID NO:128)、是或包含(GGS)2(SEQ ID NO:130)、是或包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:131)、是或包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:132)、是或包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:133)、是或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:134)、是或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:135)、是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的接头是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。在任何所提供的实施方案中的一些中，核酸序列按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列和编码所述接头的核苷酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，核酸序列还包含编码一种或多种多顺反子元件的核苷酸，任选地其中所述一种或多种多顺反子元件是或包含核糖体跳跃序列，任选地其中所述核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A元件。在任何所提供的实施方案中的一些中，P2A元件包含SEQ ID NO:3所示的序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，核酸序列按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件(任选地是P2A元件)、所述抗原结合结构域和所述接头的核苷酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，核酸序列还包含编码亲和标签的核酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，亲和标签是链霉亲和素结合肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:137)、Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:136)、Trp-Ser-His-Pr o-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:146)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQIDNO:147)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:148)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个同源臂包含5'同源臂和3'同源臂，并且所述多核苷酸包含结构[5'同源臂]-[(a)的核酸序列]-[3'同源臂]。在任何所提供的实施方案中的一些中，5'同源臂和所述3'同源臂独立地具有为或约100、200、300、400、500、600、700或800个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度；或者具有大于为或约100个核苷酸的长度，任选地为或约100、200或300个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度。在任何所提供的实施方案中的一些中，5'同源臂包含(i)SEQ ID NO:4所示的序列，或(ii)与SEQ ID NO:4展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列，或(ii)(i)或(ii)的部分序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，3'同源臂包含(i)SEQ ID NO:5所示的序列，或(ii)与SEQID NO:5展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列，或(iii)(i)或(ii)的部分序列。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所编码的抗原结合结构域结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何所提供的实施方案中的一些中，靶抗原是肿瘤抗原。在任何所提供的实施方案中的一些中，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在任何所提供的实施方案中的一些中，将多核苷酸引入T细胞的基因组中产生编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，其中所述miniCAR是包含由所述多核苷酸的核酸编码的抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白，并且其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码所述抗原结合结构域的核酸，其与编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框同框。
在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链是CD3e链、CD3d链或CD3g链。在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链是CD3e链。在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链是CD3d链。在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链是CD3g链。在任何所提供的实施方案中的一些中，编码的miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物。
在任何所提供的实施方案中的一些中，多核苷酸是线性多核苷酸，任选地是双链多核苷酸或单链多核苷酸。在任何所提供的实施方案中的一些中，多核苷酸包含在载体中。在任何所提供的实施方案中的一些中，多核苷酸具有为或约500与为或约3000个核苷酸之间、为或约1000与为或约2500个核苷酸之间或者为或约1500个核苷酸与为或约2000个核苷酸之间的长度。在任何所提供的实施方案中的一些中，任何所提供的多核苷酸构成载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，载体是病毒载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，病毒载体是AAV载体，任选地其中所述AAV载体是AAV2或AAV6载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，病毒载体是逆转录病毒载体，任选地是慢病毒载体。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述方法包括将任何所提供的多核苷酸引入T细胞群体，其中所述群体的T细胞在内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述方法包括将任何所提供的载体引入T细胞群体，其中所述群体的T细胞在内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
本文提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括(a)将能够在群体中的T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链；和(b)将任何所提供的多核苷酸引入所述T细胞群体，其中所述群体中的T细胞在所述内源恒定CD3 IgSF链基因座处包含遗传破坏。
本文提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括(a)将能够在群体中的T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链；和(b)将任何所提供的载体引入所述T细胞群体，其中所述群体中的T细胞在所述内源恒定CD3 IgSF链基因座处包含遗传破坏。
在任何所提供的实施方案中的一些中，将所述多核苷酸的核酸序列经由同源定向修复(HDR)整合到所述内源恒定CD3-IgSF链基因座中。
本文提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括(a)将能够在内源CD3E基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入包含T细胞的群体；和(b)将任何所提供的多核苷酸引入所述包含T细胞的群体，其中所述群体中的T细胞在所述内源CD3E基因座处包含遗传破坏。
本文提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括(a)将能够在内源CD3E基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入包含T细胞的群体；和(b)将任何所提供的载体引入所述包含T细胞的群体，其中所述群体中的T细胞在所述内源CD3E基因座处包含遗传破坏。
本文提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将任何所提供的多核苷酸引入包含T细胞的群体中，其中所述群体的T细胞在内源CD3E基因座内包含遗传破坏，其中将所述多核苷酸的转基因经由同源定向修复(HDR)整合到所述内源CD3E基因座中。
本文提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将任何所提供的载体引入包含T细胞的群体中，其中所述群体的T细胞在内源CD3E基因座内包含遗传破坏，其中将所述多核苷酸的转基因经由同源定向修复(HDR)整合到所述内源CD3E基因座中。
在任何所提供的实施方案中的一些中，通过将在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体来进行所述遗传破坏。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述方法在T细胞群体的T细胞中产生经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码miniCAR的核酸序列，其中所述miniCAR是包含由引入的多核苷酸或载体编码的抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白。在任何所提供的实施方案中的一些中，编码的miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物。
在任何所提供的实施方案中的一些中，能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含特异性结合至或杂交至所述靶位点的DNA结合蛋白或DNA结合核酸、包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或RNA指导的核酸酶，任选地其中所述一种或多种药剂包含特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)或和CRISPR-Cas9组合。在任何所提供的实施方案中的一些中，一种或多种药剂中的每一种包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。在任何所提供的实施方案中的一些中，一种或多种药剂是作为包含所述gRNA和Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物来引入的，任选地其中所述RNP是经由电穿孔、粒子枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压，任选地经由电穿孔来引入的。在任何所提供的实施方案中的一些中，RNP的浓度是为或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.2、2.5、3、4、5μg/106个细胞，或者由任两个前述值限定的范围，任选地其中所述RNP的浓度是为或约1μg/106个细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，其中所述RNP中gRNA与Cas9分子的摩尔比是为或约为或约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，或者由任两个前述值限定的范围，任选地其中所述RNP中gRNA与Cas9分子的摩尔比是为或约2:1。在任何所提供的实施方案中的一些中，gRNA具有靶向结构域序列UUGACAUGCCCUCAGUAUCC(SEQ ID NO:8)。
在任何所提供的实施方案中的一些中，T细胞群体包含源自受试者的原代T细胞，任选地其中所述受试者是人。在任何所提供的实施方案中的一些中，T细胞包含CD8+T细胞或其亚型，或者CD4+T细胞或其亚型。
在任何所提供的实施方案中的一些中，多核苷酸是线性多核苷酸，任选地是双链多核苷酸或单链多核苷酸。在任何所提供的实施方案中的一些中，多核苷酸包含在载体中。
在任何所提供的实施方案中的一些中，将所述一种或多种药剂和所述多核苷酸或载体同时或按任何顺序依序引入。在任何所提供的实施方案中的一些中，将所述一种或多种药剂和所述多核苷酸或载体同时引入。在任何所提供的实施方案中的一些中，在引入所述一种或多种药剂之后引入所述多核苷酸或载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，在引入所述一种或多种药剂之后立即，或者在引入所述一种或多种药剂之后约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、6分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时或4小时内引入所述多核苷酸或载体。
在任何所提供的实施方案中的一些中，在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之前，所述方法涉及在刺激或激活群体的一个或多个T细胞的条件下将所述T细胞群体与一种或多种刺激剂在体外一起孵育，任选地其中所述一种或多种刺激剂包含抗CD3和/或抗CD28抗体，任选地是抗CD3/抗CD28珠(任选地其中珠与细胞的比率为或为约1:1)或是包含抗CD3和/或抗CD28抗体的寡聚颗粒试剂。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述方法还涉及在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之前、期间或之后，将所述T细胞群体与一种或多种重组细胞因子一起孵育，任选地其中所述一种或多种重组细胞因子选自IL-2、IL-7和IL-15，任选地其中将所述一种或多种重组细胞因子以选自以下的浓度添加：从为或约10U/mL至为或约200U/mL、任选地为或约50IU/mL至为或约100U/mL的浓度的IL-2；0.5ng/mL至50ng/mL、任选地为或约5ng/mL至为或约10ng/mL的浓度的IL-7；和/或0.1ng/mL至20ng/mL、任选地为或约0.5ng/mL至为或约5ng/mL的浓度的IL-15。在任何所提供的实施方案中的一些中，孵育是在引入所述一种或多种药剂和引入所述多核苷酸或载体之后进行的，并且其中所述孵育持续长达或大约24小时、36小时、48小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，任选地长达或约7天。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述方法还涉及在用于扩增的条件下培育所述T细胞群体，其中所述培育是在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之后进行的。在任何所提供的实施方案中的一些中，在用于扩增的条件下进行培育包括将所述T细胞群体与所述抗原结合结构域的靶抗原、表达所述靶抗原的靶细胞或结合所述抗原结合结构域的抗独特型抗体一起孵育。在任何所提供的实施方案中的一些中，在用于扩增的条件下进行培育持续长达或大约24小时、36小时、48小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20或21天，任选地长达或约7天。
在任何所提供的实施方案中的一些中，所述方法导致至少或大于为或约75％、80％或90％的T细胞群体中的细胞包含恒定CD3-IgSF链基因座内的至少一个靶位点的遗传破坏。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述方法导致至少或大于为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或更多通过所述方法生成的T细胞群体中的T细胞表达所述miniCAR。
本文提供了包含通过本文提供的方法产生的工程化T细胞的群体。
本文提供了包含含有微型嵌合抗原受体(CAR)的TCR/CD3复合物的T细胞，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述TCR/CD3复合物的免疫球蛋白超家族内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的融合蛋白。
在任何所提供的实施方案中的一些中，miniCAR由所述T细胞的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座表达，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码所述miniCAR的核酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，恒定CD3-IgSF链基因座是CD3ε(CD3E)、CD3δ(CD3D)或CD3γ(CD3G)基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
本文提供了包含含有微型嵌合抗原受体(miniCAR)的TCR/CD3复合物的T细胞，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述TCR/CD3复合物的内源CD3e链的融合蛋白。
在任何所提供的实施方案中的一些中，miniCAR由包含编码所述miniCAR的核酸序列的经修饰的CD3E基因座表达。
本文提供了组合物，其包含任何本文提供的基因工程化T细胞。
本文还提供了通过所提供的方法产生的任何基因工程化T细胞。
在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物包含CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且CD4+与CD8+T细胞的比率为从或从约1:3至3:1，任选地1:1。在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物包含多种表达miniCAR的T细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物包含为或约1x 106、1.5x 106、2.5x 106、5x 106、7.5x 106、1x 107、1.5x 107、2x 107、2.5x 107、5x107、7.5x 107、1x 108、1.5x 108、2.5x 108或5x 108个总T细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物包含为或约1x 105、2.5x 105、5x 105、6.5x 105、1x 106、1.5x 106、2x106、2.5x 106、5x 106、7.5x 106、1x 107、1.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108或2.5x 108个表达miniCAR的T细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，T细胞在表达miniCAR的组合物中的频率是为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％或更多的在组合物中的总细胞，或在组合物中的总CD4+T细胞或CD8+T细胞，或在内源恒定CD3-IgSF链基因座内包含遗传破坏的组合物中的总细胞。
在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物是药物组合物。在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物还包含药学上可接受的载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，组合物还包含冷冻保护剂。
本文提供了治疗方法，其包括向患有疾病或障碍的受试者施用任何所提供的工程化T细胞或包含工程化T细胞的群体、任何所提供的T细胞或任何所提供的组合物。本文还提供了任何所提供的工程化T细胞或包含工程化T细胞的群体、任何所提供的T细胞或任何所提供的组合物用于治疗疾病或障碍的用途。本文提供了任何所提供的工程化T细胞或包含工程化T细胞的群体、任何所提供的T细胞或任何所提供的组合物在制造用于治疗疾病或障碍的药物中的用途。
在任何所提供的实施方案中的一些中，方法、所述工程化T细胞、包含工程化T细胞的群体、T细胞或组合物用于治疗疾病或障碍。在任何所提供的实施方案中的一些中，与所述疾病或障碍相关的细胞或组织表达由所述抗原结合结构域识别的靶抗原。
在任何所提供的实施方案中的一些中，疾病或障碍是癌症或肿瘤。在任何所提供的实施方案中的一些中，癌症或所述肿瘤是血液恶性肿瘤，任选地是淋巴瘤、白血病或浆细胞恶性肿瘤。在任何所提供的实施方案中的一些中，癌症是淋巴瘤，并且所述淋巴瘤是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、滤泡性淋巴瘤、小无裂细胞性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤、结节单核细胞样B细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、肺B细胞血管中心淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。在任何所提供的实施方案中的一些中，癌症是白血病，并且所述白血病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、浆细胞白血病或急性淋巴细胞白血病(ALL)。在任何所提供的实施方案中的一些中，癌症是浆细胞恶性肿瘤，并且所述浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)。在任何所提供的实施方案中的一些中，癌症或所述肿瘤是实体瘤，任选地其中所述实体瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)或头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
本文提供了试剂盒，其包含能够在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及任何所提供的多核苷酸。
本文提供了试剂盒，其包含能够在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及任何所提供的多核苷酸，其中所述多核苷酸被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于所述靶位点处或附近；以及用于执行任何所提供的方法的说明。
在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座、编码CD3d链的CD3D基因座或编码CD3g链的CD3G基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3d链的CD3D基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3g链的CD3G基因座。
本文提供了试剂盒，其包含能够在T细胞的CD3E基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及任何所提供的多核苷酸。
在任何所提供的实施方案中的一些中，能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含特异性结合至或杂交至所述靶位点的DNA结合蛋白或DNA结合核酸、包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或RNA指导的核酸酶，任选地其中所述一种或多种药剂包含特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)或和CRISPR-Cas9组合。在任何所提供的实施方案中的一些中，一种或多种药剂中的每一种包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。在任何所提供的实施方案中的一些中，gRNA具有靶向结构域序列UUGACAUGCCCUCAGUAUCC(SEQ ID NO:8)。
附图说明
图1A-图1C显示不同TCR/CD3复合物修饰的示意图。图1A描绘了包括示例性miniCAR的组装的TCR/CD3复合物，所述miniCAR含有经由接头连接至CD3e链的异源单链可变片段(scFv)抗原结合结构域。图1B描绘了包括示例性miniCAR的组装的TCR/CD3复合物，所述miniCAR含有直接连接至CD3e链的异源scFv抗原结合结构域。图1C描绘了组装的TCR/CD3复合物，其包括被异源scFv抗原结合结构域替代的示例性TCRα或β链可变结构域。
图2A描绘了分别使用抗CD3e和抗CD4抗体检测的CD3和CD4的表面表达(上小图)，以及分别使用抗CD3e和抗独特型(aID)抗体检测的CD3和示例性抗CD19 scFv的表面表达(下小图)，在模拟电穿孔T细胞(模拟细胞；左小图)、用含有靶向T细胞受体α恒定区(TRAC)基因的gRNA的RNP进行电穿孔的细胞(TRAC KO；中小图)、用仅含有靶向CD3E的gRNA的RNP在没有模板多核苷酸的情况下进行电穿孔的细胞(CD3E KO；右小图)上进行所述检测。图2B和图2C描绘了图2A中所述评估的、用含有靶向CD3E的gRNA和Cas9蛋白(1μg/1x 106个细胞)的预组装的RNP复合物以及1.2μg(图2B，左两个小图)、0.7μg(图2B，右两个小图)或1.4μg(图2C)的SEQ ID NO:6所示的示例性线性模板多核苷酸进行电穿孔的细胞的流式细胞术结果。
图3A显示CD3阴性细胞(使用抗CD3e抗体检测)在模拟电穿孔T细胞组(模拟细胞)、用仅含有靶向CD3E的gRNA的RNP在没有模板多核苷酸的情况下进行电穿孔的细胞(CD3EKO)、用预组装的RNP复合物以及1.2μg、0.7μg或1.4μg的SEQ ID NO:6所示的示例性线性模板多核苷酸进行电穿孔的细胞中的百分比，所述预组装的RNP复合物含有靶向CD3E的gRNA和Cas9蛋白(1μg/1x 106个细胞)。图3B显示图3A中描述的每个组的抗CD19 scFv阳性细胞(使用抗独特型抗体aID检测)的百分比。
图4A和图4B分别描绘了在以1:3的效应细胞与靶细胞比(E:T)与辐照的表达CD19的LCL细胞共培养五(5)天以诱导细胞抗原特异性细胞的扩增之前和之后，CD3阴性细胞(使用抗CD3e抗体检测)的百分比和抗CD19 scFv阳性细胞(使用抗独特型抗体aID检测)的百分比。所评估的细胞组与图3A和图3B中描述的细胞组相同。
图5显示在测试细胞和对照细胞与粘附板的表达CD19的靶人胚胎肾(HEK)细胞以10:1的效应细胞与靶细胞比(E:T)共培养期间，阻抗随时间的变化。所评估的细胞组与图1A-图1C中描述的细胞组相同。其他对照组包括仅铺板的HEK-CD19细胞和仅培养基。
图6显示在用预组装的RNP复合物以及SEQ ID NO:6所示的示例性线性模板多核苷酸进行电穿孔的细胞与HEK-CD19+细胞以10:1、5:1、2.5:1和1.25:1的E:T比共培养期间，阻抗随时间的变化，所述预组装的RNP复合物含有靶向CD3E的gRNA和Cas9蛋白。对照组包括仅铺板的HEK-CD19细胞和仅培养基。
图7显示抗CD19 scFv阳性细胞(使用抗独特型抗体aID检测)在用RNP复合物(其含有靶向TRAC的gRNA)和编码示例性抗CD19 scFv(SEQ ID NO:1)的示例性线性模板多核苷酸进行电穿孔的细胞、表达示例性全长抗CD19嵌合抗原受体(CAR，其含有scFv、间隔子、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z结构域，经由HDR在内源TRAC基因座处整合)的细胞、仅用靶向TRAC的gRNA进行电穿孔的对照细胞、以及仅用示例性全长CAR模板进行电穿孔的对照细胞中的百分比。
图8A显示抗CD19 scFv阳性细胞(使用抗独特型抗体检测)在用预组装RNP复合物(其含有靶向CD3E的gRNA和Cas9蛋白)以及SEQ ID NO:7所示的示例性线性模板多核苷酸进行电穿孔的细胞、表达示例性全长抗CD19嵌合抗原受体(CAR，其含有scFv、间隔子、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z结构域，经由HDR在内源TRAC基因座处整合)的细胞、以及模拟电穿孔细胞(阴性对照)中的百分比。图8B显示如图7和图8A中所述的由经修饰的TRAC基因座表达示例性全长CAR(右小图)以及如图8A中所述的由经修饰的CD3E基因座表达示例性miniCAR(左小图)的代表性直方图剖面图，所述表达是使用针对示例性抗CD19 scFv的抗独特型抗体(aID)检测的。
具体实施方式
本文提供了具有编码嵌合受体的免疫球蛋白超家族经修饰的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)基因座的基因工程化细胞，如T细胞。在一些方面，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码嵌合受体，所述嵌合受体是含有异源结合结构域(例如抗原结合结构域)和免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的融合蛋白(下文也称为微型嵌合抗原受体(miniCAR)。
内源恒定CD3-IgSF链基因座(即，未修饰的恒定CD3-IgSF链基因座)编码作为T细胞受体(TCR)-分化簇3(CD3)复合物(TCR/CD3复合物，其参与适应性免疫反应)的组分而组装的恒定CD3-IgSF链。所述TCR/CD3复合物的恒定CD3-IgSF链包括CD3ε(CD3e)链、CD3δ(CD3d)链和CD3γ(CD3g)链，它们各自含有免疫球蛋白样细胞外结构域，因此是免疫球蛋白超家族的结构相关成员。所述CD3e链、CD3d链和CD3g链与CD3ζ(CD3z)和T细胞受体(TCR)α/β(TCRαβ)或TCRγ/δ(TCRγδ)异二聚体一起形成存在于T细胞表面的TCR/CD3复合物。
还提供了用于产生基因工程化细胞的方法，所述基因工程化细胞含有表达嵌合受体(例如，如本文所述的miniCAR)的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座。所提供的实施方案涉及将编码miniCAR的一部分(如包括细胞外抗原结合结构域(例如scFv)的一部分)的转基因序列特异性靶向内源恒定CD3-IgSF链基因座，从而产生或生成微型miniCAR。在一些情况下，所提供的实施方案涉及例如使用基因编辑方法诱导靶向遗传破坏(例如，生成DNA断裂)，以及用于将编码miniCAR的一部分(例如，miniCAR的结合结构域)的转基因序列靶向整合在内源恒定CD3-IgSF链基因座处的HDR。还提供了用于在产生本文提供的工程化细胞和/或本文提供的方法中使用的相关细胞组合物、核酸和试剂盒。在一些实施方案中，基因工程化细胞或其细胞组合物可以用于过继细胞疗法方法中。
在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包括一个或多个编码miniCAR的一部分(例如，miniCAR的结合结构域)的转基因序列(下文也可互换地称为“供体”序列，例如，对T细胞而言外源或异源的序列)。在一些实施方案中，miniCAR的至少一部分由所述工程化细胞(如T细胞)的内源恒定CD3-IgSF链基因座(编码恒定CD3-IgSF链的基因组基因座)处的基因组序列或其部分序列编码。在一些方面，例如通过同源定向修复(HDR)将所述转基因序列整合至所述内源恒定CD3-IgSF链基因座中，使得编码所述miniCAR的一部分的核酸序列与所述内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框或其部分序列(如开放阅读框的外显子)融合(例如，框内融合)。
基于T细胞的疗法，如过继T细胞疗法(包括涉及施用如下工程化细胞的那些疗法，所述工程化细胞表达对目的疾病或障碍具有特异性的重组、工程化或嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))或其他重组、工程化或嵌合受体)可以有效治疗癌症以及其他疾病和障碍。在某些情况下，用于产生过继细胞疗法用的工程化细胞的其他途径可能并不总是完全令人满意。在一些情况下，最佳功效可以取决于所施用的细胞表达所述受体的能力，包括具有所述受体在细胞(如免疫细胞群和/或治疗性细胞组合物中的细胞)之间的均匀、同质性和/或一致的表达，以及所述受体识别并结合至受试者、肿瘤及其环境内的靶标(例如，靶抗原)的能力。在一些情况下，在T细胞上表达的某些受体需要额外的刺激信号(如共刺激信号)，或者可以通过非抗原依赖性强直信号传导而激活。在一些方面，所提供的实施方案解决了这些问题。
在一些情况下，如本文所述的内源恒定CD3-IgSF链基因座的修饰导致表达的miniCAR作为恒定CD3-IgSF链的一部分组装成TCR/CD3复合物。因此，在一些实施方案中，由经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码的miniCAR可以参与典型的TCR/CD3复合物信号传导途径以刺激或激活其中表达miniCAR的细胞，例如T细胞。例如，miniCAR的异源结合结构域(例如，miniCAR的抗原结合结构域)的结合可以接合其所融合的内源恒定CD3-IgSF链，从而经由TCR/CD3复合物诱导T细胞中的激活或刺激信号。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法参与典型的TCR/CD3复合物信号传导途径的能力提供了工程化细胞增加的持久性、miniCAR的改善的表达、降低的强直信号传导、改善的靶标特异性细胞溶解活性和/或降低的毒性。
在一些情况下，用于将嵌合受体(如CAR)引入细胞中的可用方法包括编码所述嵌合受体的序列的随机整合，如通过病毒转导。在某些方面，此类方法并不完全令人满意。在一些方面，随机整合可能导致细胞中一个或多个随机遗传基因座(包括可能对细胞功能和活性重要的那些)的可能的插入诱变和/或遗传破坏。在一些方面，嵌合受体的表达效率在使用当前可用方法工程化的某些细胞或某些细胞群中是有限的。在一些情况下，嵌合受体仅在细胞群中的某些细胞中表达，并且所述嵌合受体的表达水平在所述群体中的细胞之间广泛变化。在特定方面，嵌合受体的表达水平可能难以预测、控制和/或调节。在一些情况下，由于将核酸序列整合至基因组中不期望的位置，例如整合至必需基因或对于调节细胞活性至关重要的基因中，将编码受体的转基因半随机或随机整合至细胞基因组中在一些情况下可能导致不良和/或不需要的影响。
在一些情况下，随机整合可能导致编码重组或嵌合受体的序列的可变整合，这可能在细胞组合物(如治疗性细胞组合物)的细胞内导致不一致的表达、核酸的可变拷贝数和/或受体表达的可变性。在一些情况下，编码受体的核酸序列的随机整合可能导致核酸序列的多变的、异质的、不均匀的和/或次最佳的表达或抗原结合、致癌转化和转录沉默，这取决于整合位点和/或核酸序列拷贝数。在一些方面，在细胞群中异质且不均匀的表达可能导致重组或嵌合受体的表达和/或抗原结合的不一致性或不稳定性、工程化细胞的功能的不可预测性或功能的降低和/或不均匀的药物产品，从而降低工程化细胞的功效。在一些方面，特定随机整合载体(如某些慢病毒载体)的使用需要确认，工程化细胞不含有复制能力的病毒，如通过有复制能力的慢病毒(RCL)测定的表现来确认。需要改善的策略来实现重组或嵌合受体的一致表达水平和功能，同时使核酸的随机整合和/或群体中的异质表达最小化。
在一些方面，用于递送编码嵌合受体的核酸序列的特定多核苷酸或载体中有效载荷(如要插入的转基因序列或异源序列)的大小可以具有限制性。在一些情况下，有限的大小可能影响在细胞中引入和表达的表达和/或效率。在一些情况下，载体(如病毒载体)和/或大的转基因有效载荷的使用可能导致降低的表达和/或核酸引入效率和/或对转导细胞的毒性。
所提供的实施方案涉及将细胞工程化，以使其具有要通过同源定向修复(HDR)整合至细胞(例如，T细胞)的内源恒定CD3-IgSF链基因座中的编码miniCAR的一部分的核酸。在一些方面，HDR可以介导转基因序列(如编码重组受体或嵌合受体或其部分、链或片段的转基因序列)位点特异性整合于用于遗传破坏的靶位点(如内源恒定CD3-IgSF链基因座)处或附近。在一些实施方案中，遗传破坏(例如，在内源恒定CD3-IgSF链基因座的靶位点处)以及含有一个或多个同源臂(例如，含有与所述遗传破坏周围的序列同源的核酸序列)的多核苷酸(例如，模板多核苷酸)的存在可以诱导或引导HDR，其中同源序列用作DNA修复的模板。基于遗传破坏周围的内源基因序列与多核苷酸(例如，模板多核苷酸)中包括的同源臂之间的同源性，细胞DNA修复机构可以使用所述多核苷酸(例如，模板多核苷酸)来修复遗传破坏靶位点处的DNA断裂并重新合成遗传信息，从而将同源臂之间的序列(如编码miniCAR的一部分的转基因序列)有效插入或整合至遗传破坏靶位点处或附近。所提供的实施方案可以产生含有编码miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座的细胞，其中将编码miniCAR的一部分(例如，结合结构域)的转基因序列通过HDR整合至内源恒定CD3-IgSF链基因座中。
在一些方面，所提供的实施方案提供产生工程化细胞方面的优点，其改进地和/或更有效地将编码嵌合受体的一部分的核酸靶向至细胞中。在一些情况下，所述方法使可能的半随机或随机整合和/或异质性或多变表达和/或来自未整合核酸序列的不期望的表达降至最低，并且导致嵌合或重组受体的改进的、均匀的、同质性的、一致的、可预测的或稳定的表达，或者使插入诱变具有降低的、低的可能性或无可能性。
在一些方面，与常规嵌合抗原受体(CAR)相比，所提供的嵌合受体miniCAR展现改进的特征。典型地，CAR是嵌合或重组受体，其含有细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、包含CD3zeta(CD3ζ)信号传导结构域的细胞内区域，并且任选地包含共刺激信号传导结构域，典型地其中CAR的所有结构域都是同一多肽链的一部分和/或对于表达其的工程化细胞都是外源的。在一些方面，与产生表达这样的其他常规嵌合或重组受体(例如，CAR)的基因工程化T细胞的其他方法相比，所提供的实施方案允许miniCAR嵌合受体更稳定的、更符合生理的、更可控的或更均匀的、一致的或同质性的表达。在一些情况下，所述方法导致产生更一致且更可预测的药物产品，例如含有工程化细胞的细胞组合物，所述药物产品可以为治疗的患者带来更安全的疗法。在一些方面，所提供的实施方案还允许在单一目的基因座或多个目的基因座处进行可预测且一致的整合。在一些实施方案中，所提供的实施方案还可以导致产生具有一致拷贝数(通常为1或2)的核酸的细胞群，所述核酸整合于所述群体的细胞中，这在一些方面提供细胞群内嵌合受体表达和内源受体基因表达的一致性。在一些情况下，所提供的实施方案不涉及使用病毒载体进行整合，因此可以减少确认工程化细胞不含有复制能力的病毒的需要，从而改善细胞组合物的安全性，并且降低由于在转导中使用病毒载体而产生的毒性。
与此类嵌合受体的其他整合方法(如随机或半随机基因组插入)相比，本文所述的整合方法(例如HDR)提供了进一步的优势。例如，将细胞工程化以在内源恒定CD3-IgSF链基因座处编码miniCAR防止了所述基因座表达内源恒定CD3-IgSF链，从而降低内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物的可用性，并增加miniCAR组装成TCR/CD3复合物的概率。在一些情况下，用于表达含有抗原结合结构域与异源恒定CD3-IgSF结构域的融合的嵌合受体的替代方法可能导致嵌合受体在工程化细胞中的表达的可变性增加，例如，由于与TCR/CD3复合物的内源恒定CD3-IgSF链的竞争。例如，此类方法包括利用随机基因组插入的方法，其不一定降低内源恒定CD3-IgSF链的可用性，这导致内源恒定CD3-IgSF链和随机插入链之间竞争组装成TCR/CD3复合物。因此，在一些情况下，本文提供的组合物和方法增加了miniCAR组装成TCR/CD3复合物的可能性。
还应当理解，在一些实施方案中，本文提供的整合方法和组合物使要整合的转基因的总大小最小化。例如，与包含多个起作用的结构域的典型或常规CAR序列的整合相反，本文提供的转基因可以最低限度地包括编码结合结构域(例如抗原结合结构域)的序列。在一些方面，转基因还可以包括编码接头的序列。在一些实施方案中，转基因还可以包括多顺反子元件，例如2A元件。因此，本文提供的转基因的总大小可以比CAR小至少75％、70％、65％、60％、55％、50％或更多。这可以减少制备编码嵌合受体的核酸所需的时间和成本以及细胞工程化所需的时间和成本。此外，由于转基因可以使用精确的HDR技术进行整合，所以转基因的表达可以由内源启动子序列或其他调节元件控制，从而避免了在转基因构建体中包括这些元件的需要。在一些实施方案中，较小的转基因大小(例如如本文提供的)可以降低生产成本；提高整合效率，例如转染效率；降低整合的细胞毒性作用；并且消除经由病毒来源的载体递送转基因的需要。
由本文提供的工程化细胞中的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码的嵌合受体可以在内源或外源调节元件的控制下被编码。在一些方面，所提供的实施方案允许嵌合受体在内源恒定CD3-IgSF链调节元件的控制下表达，这在一些情况下可以提供更符合生理的表达水平。在一些方面，所提供的实施方案允许编码miniCAR的核酸在内源调节或控制元件(例如，内源恒定CD3-IgSF链基因座的顺式调节元件(如启动子)或5'和/或3'非翻译区(UTR))的控制下表达。因此，在一些方面，所提供的实施方案允许miniCAR表达和/或以与内源恒定CD3-IgSF链相似的水平调节表达。
在一些方面，所提供的实施方案可以降低或最小化经由miniCAR的非抗原依赖性信号传导或活性(也称为“强直信号传导”)。在一些情况下，非抗原依赖性信号传导可能源自所表达嵌合受体的过表达或不受控活性，并且可能导致不期望的影响，如表达所述嵌合受体的T细胞增加的分化和/或耗竭。在一些实施方案中，所提供的工程化细胞和细胞组合物可以降低非抗原依赖性信号传导的影响，所述非抗原依赖性信号传导可能源自所表达嵌合受体的过表达或不受控活性。因此，所提供的实施方案可以促进如下工程化细胞的产生，所述工程化细胞展现改进的表达、功能和表达均匀性和/或其他所需特征或特性，并最终展现更高功效。在一些实施方案中，所提供的多核苷酸、转基因和/或载体在递送至T细胞中时导致嵌合受体(例如，miniCAR)的表达，所述嵌合受体可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态。
在一些方面，所提供的实施方案允许miniCAR在外源或异源调节或控制元件的控制下表达，这在一些方面提供更可控的表达水平。
在一些方面，所提供的实施方案可以防止不受控表达或来自随机整合或未整合多核苷酸的表达。在一些实施方案中，所引入的多核苷酸(例如，模板多核苷酸)不含有编码全长功能性受体的核酸序列，因为所述miniCAR部分地由细胞的内源组分编码。因此，典型地，完整的恒定CD3-IgSF链不由所引入的多核苷酸编码，而是至少部分地由引入所提供的多核苷酸的细胞的内源恒定CD3-IgSF基因座编码。在一些方面，从随机整合或未整合多核苷酸转录不会产生功能性受体。在一些方面，只有在整合于靶基因座(例如，内源恒定CD3-IgSF链基因座)之后，才可以生成含有所有所需信号传导区域的功能性受体。在一些方面，所提供的实施方案可以导致细胞组合物的改进的安全性，例如，通过防止例如随机整合或未整合多核苷酸(如未整合病毒载体序列)的不受控表达来实现。
如上所述，所提供的实施方案还可以减小产生miniCAR所需的转基因序列的长度。在一些实施方案中，减小转基因的大小允许有足够的空间将另外的元件和/或转基因包装在同一载体(例如病毒载体)内。在一些方面，通过利用编码恒定CD3-IgSF链的内源基因的开放阅读框序列的一部分或全部来编码miniCAR的恒定CD3-IgSF链的全部或一部分，所提供的实施方案还允许使用与现有方法相比更小的核酸序列片段进行工程化。在一些方面，与现有方法相比，所提供的实施方案为将细胞工程化以表达miniCAR提供灵活性，因为所述方法利用编码恒定CD3-IgSF链的内源基因的开放阅读框序列的一部分或全部来编码miniCAR的恒定CD3-IgSF链或其部分。在一些情况下，这可以减小编码miniCAR的一部分的序列的有效载荷空间并为编码其他组分(如其他转基因序列、同源臂、调节元件)的序列留出空间，因为对编码miniCAR的一部分的核酸序列的长度要求降低了。在一些方面，所提供的实施方案可以允许在所引入的多核苷酸中容纳与需要完整长度的嵌合受体(例如，CAR)的常规实施方案相比更大的同源臂，和/或允许容纳编码另外的分子的核酸序列，因为对编码miniCAR的一部分的核酸序列的长度要求降低了。在一些方面，可以使用所提供的实施方案促进或改进核酸序列(例如转基因序列)的生成、递送和/或同源定向修复(HDR)的靶向效率。在其他方面，所提供的实施方案允许容纳编码另外的分子的核酸序列用于在细胞上或细胞中表达。
还提供了用于工程化、制备和产生工程化细胞的方法，以及用于生成或产生工程化细胞的试剂盒和装置。还提供了通过所述方法产生的细胞和细胞组合物。提供了含有编码miniCAR的一部分的核酸序列的多核苷酸(例如，病毒载体)，以及用于将此类多核苷酸引入细胞中的方法，如通过转导或通过物理递送(如电穿孔)。还提供了含有工程化细胞的组合物，以及用于将所述细胞和组合物施用于受试者(如用于过继细胞疗法)的方法、试剂盒和装置。在一些方面，将细胞从受试者分离，工程化，并施用于同一受试者。在其他方面，将细胞从一名受试者分离，工程化，并施用于另一名受试者。所得基因工程化细胞或细胞组合物可以用于过继细胞疗法方法中。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。I.用于通过同源定向修复生成表达miniCAR的细胞的方法
本文提供了生成或产生基因工程化细胞的方法，所述基因工程化细胞包含免疫球蛋白超家族链的经修饰的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF)基因座，例如CD3E、CD3D或CD3G基因座，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包括编码嵌合受体(如微型嵌合抗原受体(miniCAR))的核酸序列。
在一些方面，基因工程化细胞中的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)包含编码miniCAR的一部分(如细胞外抗原结合结构域)的转基因序列，所述转基因序列整合到通常编码免疫球蛋白超家族的恒定CD3链之一的内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)中。在一些实施方案中，所述方法涉及诱导靶向遗传破坏，以及使用含有编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因的多核苷酸(例如，也称为“模板多核苷酸”)进行同源依赖性修复(HDR)，从而将转基因靶向整合于恒定CD3-IgSF链基因座处。还提供了通过所述方法产生的细胞和细胞组合物。在一些实施方案中，还提供了含有细胞群的组合物，所述细胞群已被工程化以表达miniCAR，使得所述细胞群展现所述miniCAR的更加改进的、均匀的、同质性的和/或稳定的表达和/或抗原结合，包括通过任何所提供的方法产生的基因工程化T细胞，以及用于所述方法中的多核苷酸(例如，模板多核苷酸)和试剂盒。
在一些方面，所表达的miniCAR包含免疫球蛋白超家族的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的全部或一部分。例如，在一些方面，所表达的miniCAR是包含由引入的异源序列(例如转基因)编码的抗原结合结构域以及由恒定CD3-IgSF链基因座的内源序列编码的恒定CD3-IgSF链的全部或一部分(如恒定CD3-IgSF链的细胞外区域或结构域、跨膜区域或结构域和细胞内区域或结构域)的融合蛋白。在一些方面，所表达的miniCAR是包含异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白。在一些方面，在将编码miniCAR的一部分(例如，抗原结合结构域)的转基因序列整合到恒定CD3-IgSF链基因座中之后，恒定CD3-IgSF链的至少一部分由基因组中恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框或其部分序列编码。在一些方面，异源抗原结合结构域在所述融合蛋白的N末端，所述内源恒定CD3-IgSF链在所述融合蛋白的C末端。在一些方面，恒定CD3-IgSF链是CD3ε(CD3e或CD3ε)链、CD3δ(CD3d或CD3δ)链或CD3γ(CD3g或CD3γ)链。
在一些实施方案中，方法采用HDR将转基因序列靶向整合到恒定CD3-IgSF链基因座中。在一些情况下，所述方法涉及通过基因编辑技术将一个或多个靶向遗传破坏(例如，DNA断裂)引入内源恒定CD3-IgSF链基因座处，与通过HDR靶向整合编码miniCAR的一部分的转基因序列组合。在一些实施方案中，HDR步骤需要靶基因组位置处的DNA中的破坏或断裂(例如，双链断裂)。在一些实施方案中，DNA断裂通过采用基因编辑方法(例如，靶向核酸酶)来诱导。
在一些方面，所提供的方法涉及将能够在恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞中；以及将包含转基因和一个或多个同源臂的多核苷酸(例如，模板多核苷酸)引入所述T细胞中。在一些方面，转基因含有编码miniCAR的一部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸序列(如转基因)被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于恒定CD3-IgSF链基因座内。在一些方面，所提供的方法涉及将包含编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因序列的多核苷酸引入具有恒定CD3-IgSF链基因座内的遗传破坏的T细胞中，其中所述遗传破坏已由能够诱导恒定CD3-IgSF链基因座内一个或多个靶位点的遗传破坏的一种或多种药剂诱导，并且其中所述核酸序列(如转基因)被靶向以供经由HDR整合于恒定CD3-IgSF链基因座内。
在一些方面，实施方案涉及使用基因编辑方法和/或靶向核酸酶生成靶向基因组破坏，如靶向DNA断裂，之后基于一个或多个多核苷酸(例如，一个或多个模板多核苷酸)进行HDR，所述多核苷酸含有与内源恒定CD3-IgSF链基因座处的序列同源的同源性序列，所述同源性序列与编码miniCAR的一部分的转基因序列以及(在一些实施方案中)编码其他分子的核酸序列连接，以特异性靶向所述转基因序列并将其整合于所述DNA断裂处或附近。因此，在一些方面，所述方法涉及诱导靶向遗传破坏(例如，经由基因编辑)和将多核苷酸(例如，包含转基因序列的模板多核苷酸)(例如，经由HDR)引入细胞中的步骤。
在一些实施方案中，靶向遗传破坏以及通过HDR进行的转基因序列的靶向整合发生在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，分别编码CD3e、CD3d或CD3g的CD3E、CD3D或CD3G基因座)的一个或多个靶位点处。在一些方面，靶向整合发生在内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框序列内。在一些方面，转基因序列的靶向整合产生转基因的编码部分与内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的一个或多个外显子的框内融合物，例如，与整合位点处的相邻外显子的框内融合物。
在一些实施方案中，在引入能够诱导一个或多个靶向遗传破坏的一种或多种药剂之前、同时或之后，将多核苷酸(例如，模板多核苷酸)引入工程化细胞中。在一个或多个靶向遗传破坏(例如，DNA断裂)的存在下，多核苷酸可以用作DNA修复模板，以基于遗传破坏周围的内源基因序列与模板多核苷酸中包括的一个或多个同源臂(如5'和/或3'同源臂)之间的同源性，在靶向遗传破坏的位点处或附近通过HDR有效拷贝和/或整合转基因。
在一些方面，可以依序进行这两个步骤。在一些实施方案中，基因编辑和HDR步骤是同时和/或在一个实验反应中进行的。在一些实施方案中，基因编辑和HDR步骤是在一个或连续的实验反应中连续或依序进行的。在一些实施方案中，基因编辑和HDR步骤是在单独实验反应中同时或在不同时间进行的。
免疫细胞可以包括含有T细胞的细胞群。此类细胞可以是已经从受试者获得的细胞，如从外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物获得。在一些实施方案中，T细胞是原代细胞，如原代T细胞。在一些实施方案中，可以使用阳性或阴性选择和富集方法分离或选择T细胞以在群体中富集T细胞。在一些实施方案中，群体含有CD4+、CD8+或CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方案中，引入多核苷酸(例如，模板多核苷酸)的步骤和引入药剂(例如，Cas9/gRNA RNP)的步骤可以同时或按任何顺序依序发生。在一些实施方案中，与能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂(例如，Cas9/gRNA RNP)的引入同时引入多核苷酸。在特定实施方案中，在通过引入一种或多种药剂(例如，Cas9/gRNA RNP)的步骤诱导遗传破坏后，将多核苷酸模板引入T细胞中。在一些实施方案中，在引入多核苷酸模板和一种或多种药剂(例如，Cas9/gRNA RNP)之前、期间和/或之后，在刺激细胞扩增和/或增殖的条件下培养或孵育细胞。
在所提供方法的特定实施方案中，模板多核苷酸的引入是在引入能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂之后进行的。根据用于诱导遗传破坏的一种或多种特定药剂，可以如所述采用用于引入所述一种或多种药剂的任何方法。在一些方面，破坏是通过基因编辑来进行的，如使用对所破坏的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)具有特异性的RNA指导的核酸酶，如成簇的规律间隔短回文核酸(CRISPR)-Cas系统，如CRISPR-Cas9系统。在一些方面，破坏是使用对恒定CD3-IgSF链基因座具有特异性的CRISPR-Cas9系统来进行的。在一些实施方案中，将含有Cas9和指导RNA(gRNA)(其含有靶向恒定CD3-IgSF链基因座的区域的靶向结构域)的药剂引入细胞中。在一些实施方案中，药剂是或包含Cas9和含有靶向恒定CD3-IgSF链基因座的靶向结构域的gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物(Cas9/gRNA RNP)。在一些实施方案中，引入包括使药剂或其部分与细胞在体外接触，这可以包括将细胞与药剂一起培育或孵育长达24、36或48小时或者3、4、5、6、7或8天。在一些实施方案中，引入还可以包括实现将药剂递送至细胞中。在各个实施方案中，根据本公开文本的方法、组合物和细胞例如通过电穿孔将Cas9和gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物直接递送至细胞中。在一些实施方案中，RNP复合物包括已经被修饰以包括3'多聚A尾和5'抗反向帽类似物(ARCA)帽的gRNA。在一些情况下，对要修饰的细胞进行电穿孔包括在将细胞电穿孔之后且在铺板之前，例如在32℃下使细胞冷休克。
在所提供方法的此类方面，在引入例如已经经由电穿孔引入的一种或多种药剂(如Cas9/gRNA RNP)之后，将多核苷酸(例如，模板多核苷酸)引入细胞中。在一些实施方案中，在引入能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂之后，立即引入多核苷酸(例如，模板多核苷酸)。在一些实施方案中，在引入能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂之后在为或约30秒内、在为或约1分钟内、在为或约2分钟内、在为或约3分钟内、在为或约4分钟内、在为或约5分钟内、在为或约6分钟内、在为或约6分钟内、在为或约8分钟内、在为或约9分钟内、在为或约10分钟内、在为或约15分钟内、在为或约20分钟内、在为或约30分钟内、在为或约40分钟内、在为或约50分钟内、在为或约60分钟内、在为或约90分钟内、在为或约2小时内、在为或约3小时内或在为或约4小时内，将多核苷酸(例如，模板多核苷酸)引入细胞中。在一些实施方案中，在引入所述一种或多种药剂之后在为或约15分钟与为或约4小时之间的时间，如在为或约15分钟与为或约3小时之间、在为或约15分钟与为或约2小时之间、在为或约15分钟与为或约1小时之间、在为或约15分钟与为或约30分钟之间、在为或约30分钟与为或约4小时之间、在为或约30分钟与为或约3小时之间、在为或约30分钟与为或约2小时之间、在为或约30分钟与为或约1小时之间、在为或约1小时与为或约4小时之间、在为或约1小时与为或约3小时之间、在为或约1小时与为或约2小时之间、在为或约2小时与为或约4小时之间、在为或约2小时与为或约3小时之间或在为或约3小时与为或约4小时之间，将多核苷酸(例如，模板多核苷酸)引入细胞中。在一些实施方案中，在引入例如已经经由电穿孔引入的一种或多种药剂(如Cas9/gRNA RNP)之后为或约2小时，将多核苷酸(例如，模板多核苷酸)引入细胞中。
根据用于将多核苷酸(例如，模板多核苷酸)递送至细胞的特定方法，可以如所述采用用于引入多核苷酸(例如，模板多核苷酸)的任何方法。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括经由病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。在特定实施方案中，采用病毒转导方法。在一些实施方案中，可以使用重组感染性病毒颗粒(如例如，源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将多核苷酸转移或引入细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人,TrendsBiotechnol.2011年11月29(11):550-557)。在特定实施方案中，病毒载体是AAV，如AAV2或AAV6。
在一些实施方案中，在使药剂与细胞接触之前、期间或之后，和/或在实现递送(例如，电穿孔)之前、期间或之后，所提供的方法包括在能够诱导T细胞的增殖、刺激或激活的细胞因子、刺激剂和/或药剂的存在下孵育细胞。在一些实施方案中，孵育的至少一部分是在刺激剂的存在下进行，所述刺激剂是或包含对CD3具有特异性的抗体、对CD28具有特异性的抗体和/或细胞因子，如抗CD3/抗CD28珠。在一些实施方案中，孵育的至少一部分是在细胞因子的存在下进行，所述细胞因子是如重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15中的一种或多种。在一些实施方案中，在引入一种或多种药剂(如Cas9/gRNA RNP，例如通过电穿孔)和多核苷酸(例如，模板多核苷酸)之前或之后，孵育持续长达8天，如长达24小时、36小时或48小时或者3、4、5、6、7或8天。
在一些实施方案中，方法包括在引入药剂(例如，Cas9/gRNA RNP)和多核苷酸模板之前，用刺激剂(例如，抗CD3/抗CD28抗体)激活或刺激细胞。在一些实施方案中，在例如经由电穿孔引入一种或多种药剂(如Cas9/gRNA RNP)之前，在刺激剂(例如，抗CD3/抗CD28)存在下孵育持续6小时至96小时，如24至48小时或24至36小时。在一些实施方案中，与刺激剂一起孵育还可以包括细胞因子的存在，所述细胞因子是如重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15中的一种或多种。在一些实施方案中，孵育是在重组细胞因子的存在下进行，所述重组细胞因子是如IL-2(例如1U/mL至500U/mL，如10U/mL至200U/mL，例如至少或约50U/mL或100U/mL)、IL-7(例如0.5ng/mL至50ng/mL，如1ng/mL至20ng/mL，例如至少或约5ng/mL或10ng/mL)或IL-15(例如0.1ng/mL至50ng/mL，如0.5ng/mL至25ng/mL，例如至少或约1ng/mL或5ng/mL)。在一些实施方案中，在将能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂Cas9/gRNA RNP和/或多核苷酸模板细胞引入或递送到细胞中之前，从细胞中洗涤或去除一种或多种刺激剂(例如，抗CD3/抗CD28抗体)。在一些实施方案中，在引入一种或多种药剂之前，例如通过去除任何刺激剂或激活剂使细胞静息。在一些实施方案中，在引入一种或多种药剂之前，不去除刺激剂或激活剂和/或细胞因子。
在一些实施方案中，在引入一种或多种药剂(例如，Cas9/gRNA)和/或多核苷酸模板之后，将细胞在重组细胞因子存在下孵育、培育或培养，所述重组细胞因子是如重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15中的一种或多种。在一些实施方案中，孵育是在重组细胞因子的存在下进行，所述重组细胞因子是如IL-2(例如1U/mL至500U/mL，如10U/mL至200U/mL，例如至少或约50U/mL或100U/mL)、IL-7(例如0.5ng/mL至50ng/mL，如1ng/mL至20ng/mL，例如至少或约5ng/mL或10ng/mL)或IL-15(例如0.1ng/mL至50ng/mL，如0.5ng/mL至25ng/mL，例如至少或约1ng/mL或5ng/mL)。可以将细胞在诱导细胞的增殖或扩增的条件下孵育或培育。在一些实施方案中，可以孵育或培育细胞直至实现用于收获的阈值细胞数量，例如治疗有效剂量。
在一些实施方案中，在所述过程的任何部分或全部所述过程期间的孵育可以在30℃±2℃至39℃±2℃(如至少或约至少30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃或37℃±2℃)的温度下进行。在一些实施方案中，孵育的至少一部分是在30℃±2℃下进行，并且孵育的至少一部分是在37℃±2℃下进行。
在一些实施方案中，在靶向整合后，存在于经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处的核酸序列包含通过HDR靶向的转基因(例如，如本文所述的miniCAR的一部分)与内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框或其部分序列的融合物。在一些方面，存在于经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座处的核酸序列包含转基因，例如，如本文所述的miniCAR的一部分，其整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座处，所述基因座包含编码恒定CD3-IgSF链基因座(例如，分别为CD3e、CD3d或CD3g)的开放阅读框(参见本文关于示例性内源恒定CD3-IgSF链基因座的描述的表1-表5)。在一些方面，在靶向整合或融合(例如，框内融合)后，转基因的异源序列(例如，编码抗原结合结构域)和内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处的开放阅读框的一部分一起编码嵌合受体，例如miniCAR，其含有异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链。因此，所提供的实施方案利用内源恒定CD3-IgSF链基因座的全部或部分开放阅读框序列来编码miniCAR的一部分，例如，包括嵌合受体的跨膜和细胞内部分。在一些实施方案中，在靶向框内整合转基因序列后，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座含有编码整个、完整或全长miniCAR的序列，所述miniCAR含有细胞外抗原结合结构域和恒定CD3-IgSF链的全部或部分细胞外区域；恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和恒定CD3-IgSF链的细胞内区域。
用于在内源恒定CD3-IgSF链基因座处进行遗传破坏和/或用于进行HDR以将转基因序列(如嵌合受体的一部分，例如miniCAR的一部分)靶向整合到恒定CD3-IgSF链基因座中的示例性方法描述于以下小节中。
A.遗传破坏
在一些实施方案中，在编码免疫球蛋白超家族的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)(例如CD3ε(CD3e或CD3ε)链、CD3δ(CD3d或CD3δ)链或CD3γ(CD3g或CD3γ)链)的内源基因组基因座处诱导一个或多个靶向遗传破坏。在一些实施方案中，在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E(编码CD3e)、CD3D(编码CD3d)或CD3G(编码CD3g)基因座)处诱导一个或多个靶向遗传破坏。在一些实施方案中，在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如CD3E、CD3D或CD3G基因座)处或附近的一个或多个靶位点处诱导一个或多个靶向遗传破坏。在一些实施方案中，在内源恒定CD3-IgSF链基因座的内含子中诱导靶向遗传破坏。在一些实施方案中，在内源恒定CD3-IgSF链基因座的外显子中诱导靶向遗传破坏。在一些方面，一个或多个靶向遗传破坏和多核苷酸(例如，模板多核苷酸，其含有包含编码抗原结合结构域的序列的转基因)的存在可以导致将转基因序列靶向整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座的一个或多个遗传破坏(例如，靶位点)处或附近。
在一些实施方案中，遗传破坏导致基因组中一个或多个靶位点处的DNA断裂(如双链断裂(DSB))或切割、或切口(如单链断裂(SSB))。在一些实施方案中，在遗传破坏(例如，DNA断裂或切口)的位点处，细胞DNA修复机制的作用可以导致基因的全部或一部分的敲除、插入、错义或移码突变(如双等位基因移码突变)、缺失；或者，在修复模板(例如，模板多核苷酸)的存在下，可以基于修复模板改变DNA序列，如整合或插入模板中所含有的核酸序列，如编码miniCAR的全部或一部分的转基因。在一些实施方案中，遗传破坏可以被靶向至基因或其部分的一个或多个外显子。在一些实施方案中，遗传破坏可以被靶向于异源序列(例如编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因序列)的靶向整合的期望位点附近。
在一些实施方案中，使用特异性结合至或杂交至在至少一个靶位点中的一个位点附近区域的序列的DNA结合蛋白或DNA结合核酸进行靶向破坏。在一些实施方案中，可以引入模板多核苷酸(例如，包括核酸序列(如编码嵌合受体的一部分的转基因)和同源性序列的模板多核苷酸)用于通过HDR将嵌合受体编码序列靶向整合于遗传破坏位点处或附近，如本文例如在第I.A节中所述。
在一些实施方案中，遗传破坏是通过引入能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂来进行的。在一些实施方案中，此类药剂包含特异性结合至或杂交至基因的DNA结合蛋白或DNA结合核酸。在一些实施方案中，药剂包含各种组分，如包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指导的核酸酶的融合蛋白。在一些实施方案中，药剂可以靶向一个或多个靶位点或靶位置。在一些方面，可以在靶位点的每一侧上产生一对单链断裂(例如，切口)。
在所提供的实施方案中，术语“引入”涵盖在体外或在体内将核酸和/或蛋白质(如DNA)引入细胞中的多种方法，此类方法包括转化、转导、转染(例如电穿孔)和感染。载体可用于将编码分子的DNA引入细胞中。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体或其他载体，如腺病毒载体或腺相关载体。诸如电穿孔等方法也可以用于将蛋白质或核糖核蛋白(RNP)(例如，含有与靶向gRNA复合的Cas9蛋白)引入或递送至目的细胞中。
在一些实施方案中，遗传破坏发生于靶位点(也称为“靶位置(targetposition)”、“靶DNA序列”或“靶位置(target location)”)处，例如发生于内源恒定CD3-IgSF链基因(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处。在一些实施方案中，靶位点包括靶DNA(例如，基因组DNA)上的位点，其通过能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂修饰，所述药剂例如与指定靶位点的gRNA复合的Cas9分子。例如，靶位点可以包括内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处的DNA中发生切割或DNA断裂的位置。在一些方面，通过HDR整合核酸序列(如编码miniCAR的抗原结合结构域的转基因)可以发生在靶位点或靶序列处或附近。在一些实施方案中，靶位点可以是向其中添加一个或多个核苷酸的DNA上的两个核苷酸(例如，相邻核苷酸)之间的位点。靶位点可以包含通过模板多核苷酸改变的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，靶位点在靶序列(例如，与gRNA结合的序列)内。在一些实施方案中，靶位点位于靶序列的上游或下游。
1.内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)上的靶位点
在一些实施方案中，遗传破坏和/或经由同源定向修复(HDR)而对编码抗原结合结构域的转基因的整合被靶向于编码免疫球蛋白超家族的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的内源或基因组基因座。在任何所提供的实施方案中的一些中，遗传破坏和/或经由同源定向修复(HDR)而对编码抗原结合结构域的转基因的整合进入的遗传基因座是被靶向的，是编码免疫球蛋白超家族的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的基因座位。在一些方面，恒定CD3-IgSF链是CD3e，并且恒定CD3-IgSF链基因座是CD3E。在一些方面，恒定CD3-IgSF链是CD3d，并且恒定CD3-IgSF链基因座是CD3D。在一些方面，恒定CD3-IgSF链是CD3g，并且恒定CD3-IgSF链基因座是CD3G。在一些方面中，遗传破坏被靶向于恒定CD3-IgSF链基因座(例如CD3E、CD3D或CD3G基因座，其含有编码CD3e、CD3d或CD3g的开放阅读框)内的靶位点，使得转基因序列的靶向整合、融合或插入发生在恒定CD3-IgSF链基因座的遗传破坏位点处或附近。在一些方面，遗传破坏被靶向于编码恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的开放阅读框的外显子处或附近。在一些方面，遗传破坏被靶向于编码恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的开放阅读框的内含子处或附近。
恒定CD3-IgSF链是存在于T细胞表面的T细胞受体(TCR)-分化簇3(CD3)复合物(其参与适应性免疫反应)的组分。在一些方面，恒定CD3-IgSF链是CD3ε(CD3e)链、CD3δ(CD3d)链或CD3γ(CD3g)链。CD3ε(也称为CD3e、CD3ε、CD3E、IMD18、T3E、TCRE、CD3e分子)链、CD3δ(也称为CD3d、CD3δ、CD3D、CD3-DELTA、IMD19、T3D、CD3d分子)链以及CD3γ(也称为CD3g、CD3γ、CD3G、CD3-GAMMA、IMD17、T3G、CD3g分子)与CD3ζ(也称为CD3-ζ、CD3ζ、T细胞受体T3ζ链、CD3Z、T3Z、TCRZ、分化簇247、CD247、IMD25)和T细胞受体(TCR)α/β(TCRαβ)或TCRγ/δ(TCRγδ)异二聚体、CD3γ(CD3γ)、CD3δ(CD3δ)和CD3ε(CD3ε)形成TCR-CD3复合物。
TCR-CD3复合物是一种蛋白质复合物，其参与刺激或激活细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)和辅助T细胞(CD4+T细胞)两者。在一些方面，复合物含有与TCR和CD3z缔合的CD3g链、CD3d链和两条CD3e链，以在T淋巴细胞中产生刺激或激活型初级细胞质或细胞内信号。TCR/CD3复合物通常包含CD3ge-CD3de-CD3zz链六聚体以及TCRα和TCRβ链(参见例如，Call等人,Mol Immunol.2004年4月；40(18):1295–1305)。TCR、CD3z和恒定CD3-IgSF链一起构成TCR复合物。在抗原与抗原结合结构域结合之后，TCR-CD3复合物将来自抗原结合模块或配体结合模块(例如TCR)的信息传递到信号传导模块(例如包括恒定CD3-IgSF的CD3链)，并传递到细胞内信号传导装置。TCR/CD3复合物的CD3链在其细胞内或细胞质结构域中含有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些方面，免疫球蛋白超家族的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链，例如CD3e、CD3d或CD3g)是免疫球蛋白超家族的含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的高度相关的细胞表面蛋白，并含有单个保守的ITAM以产生刺激或激活信号。TCR/CD3复合物可以通过例如经由ITAM刺激或激活初级细胞质或细胞内信号传导来将抗原识别与细胞内信号转导途径偶联。在TCR与其配体(例如，在MHC分子的背景下为肽；MHC-肽复合物)接合后，ITAM基序可以被激酶(包括Src家族蛋白酪氨酸激酶LCK和FYN)磷酸化，从而导致刺激下游信号传导途径。在一些方面，CD3 ITAM的磷酸化产生蛋白质激酶ZAP70的停泊位点，从而导致ZAP70的磷酸化和激活以及T细胞中的信号传导级联。
示例性人CD3e前体多肽序列示于SEQ ID NO:17(亚型1；成熟多肽包括SEQ ID NO:17的残基23-207；参见Uniprot登录号P07766；NCBI参考序列：NP_000724.1；SEQ ID NO:18所示的mRNA序列，NCBI参考序列：NM_000733)或SEQ ID NO:19(亚型2；成熟多肽包括SEQ IDNO:18的残基22-201；参见Uniprot登录号E9PSH8)中。示例性成熟CD3e链亚型1含有细胞外区域(包括SEQ ID NO:17所示的人CD3e链前体序列的氨基酸残基23-126)、跨膜区域(包括SEQ ID NO:17所示的人CD3e链前体序列的氨基酸残基127-152)和细胞内区域(包括SEQ IDNO:17所示的人CD3e链前体序列的氨基酸残基153-207)。CD3e链亚型1含有在SEQ ID NO:17所示的人CD3e链前体序列的氨基酸残基178-205处的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)结构域。
在人类中，示例性基因组基因座CD3E(编码CD3e)包含开放阅读框，其含有编码亚型1的转录物变体的9个外显子和8个内含子。CD3E的示例性mRNA转录物可以跨越对应于正向链上的染色体11:118,304,730-118,316,173的序列，参照人类参考基因组联盟Build38patch release 13(GRCh38.p13)。表1列出了示例性人CD3E基因座的转录物的开放阅读框的外显子和内含子以及非翻译区的坐标。
表1.编码亚型1的转录物变体的示例性人CD3E基因座的外显子和内含子的坐标(GRCh38，第11号染色体，正向链)。
在人类中，CD3δ(CD3d或CD3δ)存在几种不同的mRNA和蛋白质同种型。示例性人CD3d前体多肽序列示于SEQ ID NO:20(亚型1；成熟多肽包括SEQ ID NO:20的残基22-171；参见Uniprot登录号P04234-1；NCBI参考序列：NP_000723.1；SEQ ID NO:21所示的mRNA序列，NCBI参考序列：NM_000732.4)；SEQ ID NO:22(亚型2；成熟多肽包括SEQ ID NO:22的残基22-127；参见Uniprot登录号P04234-2；NCBI参考序列：NP_001035741.1；SEQ ID NO:23所示的mRNA序列，NCBI参考序列：NM_001040651.1)；或SEQ ID NO:24(亚型3；成熟多肽包括SEQ ID NO:24的残基23-98；参见Uniprot登录号E9PMT5；SEQ ID NO:25所示的mRNA序列，NCBI参考序列：JN392069.1)中。示例性成熟CD3d链亚型1含有细胞外区域(包括SEQ ID NO:20所示的人CD3d链前体序列的氨基酸残基22-105)、跨膜区域(包括SEQ ID NO:20所示的人CD3d链前体序列的氨基酸残基106-126)和细胞内区域(包括SEQ ID NO:20所示的人CD3d链前体序列的氨基酸残基127-171)。CD3d链亚型1含有在SEQ ID NO:20所示的人CD3d链前体序列的氨基酸残基136-166处的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)结构域。示例性成熟CD3d链亚型3含有细胞外区域(包括SEQ ID NO:24所示的人CD3d链前体序列的氨基酸残基23-30)、跨膜区域(包括SEQ ID NO:24所示的人CD3d链前体序列的氨基酸残基31-53)和细胞内区域(包括SEQ ID NO:24所示的人CD3d链前体序列的氨基酸残基54-98)。
在人类中，示例性基因组基因座CD3D(编码CD3d)包含开放阅读框，其含有编码亚型1的转录物变体的5个外显子和4个内含子。CD3D的示例性mRNA转录物可以跨越对应于反向链上的染色体11:118,339,075-118,342,705的序列，参照人类参考基因组联盟Build38patch release 13(GRCh38.p13)。表2列出了编码示例性人CD3D基因座亚型1的转录物变体的开放阅读框的外显子和内含子以及非翻译区的坐标。
表2.编码亚型1的转录物变体的示例性人CD3D基因座的外显子和内含子的坐标(GRCh38，第11号染色体，反向链)。
起始(GrCh38) 终止(GrCh38) 长度
5'UTR和外显子1 118,342,705 118,342,553 153
内含子1-2 118,342,552 118,340,594 1,959
外显子2 118,340,593 118,340,375 219
内含子2-3 118,340,374 118,339,907 468
外显子3 118,339,906 118,339,775 132
内含子3-4 118,339,774 118,339,495 280
外显子4 118,339,494 118,339,451 44
内含子4-5 118,339,450 118,339,228 223
外显子5和3'UTR 118,339,227 118,339,075 153
在人类中，示例性基因组基因座CD3D(编码CD3d)包含开放阅读框，其含有编码亚型2的转录物变体的4个外显子和3个内含子。CD3D的示例性mRNA转录物可以跨越对应于反向链上的染色体11:118,339,094-118,342,631的序列，参照人类参考基因组联盟Build38patch release 13(GRCh38.p13)。表3列出了编码示例性人CD3D基因座亚型2的转录物变体的开放阅读框的外显子和内含子以及非翻译区的坐标。
表3.编码亚型2的转录物变体的示例性人CD3D基因座的外显子和内含子的坐标(GRCh38，第11号染色体，反向链)。
起始(GrCh38) 终止(GrCh38) 长度
5'UTR和外显子1 118,342,631 118,342,553 79
内含子1-2 118,342,552 118,340,594 1,959
外显子2 118,340,593 118,340,375 219
内含子2-3 118,340,374 118,339,495 880
外显子3 118,339,494 118,339,451 44
内含子3-4 118,339,450 118,339,228 223
外显子4和3'UTR 118,339,227 118,339,094 134
在人类中，示例性基因组基因座CD3D(编码CD3d)包含开放阅读框，其含有编码亚型3的转录物变体的4个外显子和3个内含子。CD3E的示例性mRNA转录物可以跨越对应于反向链上的染色体11:118,339,077-118,342,647的序列，参照人类参考基因组联盟Build38patch release 13(GRCh38.p13)。表4列出了编码示例性人CD3D基因座的亚型3的转录物变体的开放阅读框的外显子和内含子以及非翻译区的坐标。
表4.编码亚型3的转录物变体的示例性人CD3D基因座的外显子和内含子的坐标(GRCh38，第11号染色体，反向链)。
起始(GrCh38) 终止(GrCh38) 长度
5'UTR和外显子1 118,342,647 118,342,553 95
内含子1-2 118,342,552 118,339,907 2,646
外显子2 118,339,906 118,339,775 132
内含子2-3 118,339,774 118,339,495 280
外显子3 118,339,494 118,339,451 44
内含子3-4 118,339,450 118,339,228 223
外显子4和3'UTR 118,339,227 118,339,077 151
示例性人CD3g前体多肽序列示于SEQ ID NO:26(成熟多肽包括SEQ ID NO:26的残基23-182；参见Uniprot登录号P09693；NCBI参考序列：NP_000064.1；SEQ ID NO:27所示的mRNA序列，NCBI参考序列：NM_000073.2)中。示例性成熟CD3g链含有细胞外区域(包括SEQID NO:26所示的人CD3g链前体序列的氨基酸残基23-116)、跨膜区域(包括SEQ ID NO:26所示的人CD3g链前体序列的氨基酸残基117-137)和细胞内区域(包括SEQ ID NO:26所示的人CD3g链前体序列的氨基酸残基138-182)。CD3g链含有在SEQ ID NO:26所示的人CD3g链前体序列的氨基酸残基149-177处的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)结构域。
在人体中，CD3G的示例性基因组基因座(编码CD3g)包含含有7个外显子和6个内含子的开放阅读框。CD3G的示例性mRNA转录物可以跨越对应于正向链上的染色体11:118,344,344-118,355,161的序列，参照人类参考基因组联盟Build 38patch release 13(GRCh38.p13)。表5列出了示例性人CD3G基因座的转录物的开放阅读框的外显子和内含子以及非翻译区的坐标。
表5.示例性人CD3G基因座的外显子和内含子的坐标(GRCh38，第11号染色体，正向链)。
起始(GrCh38) 终止(GrCh38) 长度
5'UTR和外显子1 118,344,344 118,344,478 135
内含子1-2 118,344,479 118,349,026 4,548
外显子2 118,349,027 118,349,050 24
内含子2-3 118,349,051 118,349,742 692
外显子3 118,349,743 118,349,970 228
内含子3-4 118,349,971 118,350,551 581
外显子4 118,350,552 118,350,683 132
内含子4-5 118,350,684 118,351,627 944
外显子5 118,351,628 118,351,671 44
内含子5-6 118,351,672 118,352,403 732
外显子6 118,352,404 118,352,487 84
内含子6-7 118,352,488 118,353,118 631
外显子7和3'UTR 118,353,119 118,355,161 2,043
在一些方面，遗传破坏的靶位点可以用作设计用于HDR的模板多核苷酸和/或同源臂的指导。在一些方面，模板多核苷酸内的转基因(例如，异源核酸序列)可以用于指导靶位点和/或同源臂的定位。在一些实施方案中，遗传破坏可以被靶向于转基因序列(例如，编码嵌合受体的一部分，如抗原结合结构域)的靶向整合的期望位点附近。在一些方面，基于编码抗原结合结构域的转基因序列和在模板多核苷酸的同源臂中含有的恒定CD3-IgSF链的融合的期望位置来靶向遗传破坏。在一些方面，基于编码在模板多核苷酸的同源臂中含有的恒定CD3-IgSF链的序列来靶向遗传破坏。在一些方面，靶位点在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的开放阅读框的外显子内。在一些方面，靶位点在恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的内含子内。
在某些实施方案中，遗传破坏被靶向于恒定CD3-IgSF链基因座处、附近或之内。在特定实施方案中，遗传破坏被靶向于恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框(如本文表1中所述的CD3E开放阅读框；表2、3或4中所述的CD3D开放阅读框；或本文表5中所述的CD3G开放阅读框)处、附近或之内。在某些实施方案中，遗传破坏被靶向于编码恒定CD3-IgSF链(如CD3e、CD3d或CD3g)的开放阅读框处、附近或之内。在一些实施方案中，遗传破坏被靶向于恒定CD3-IgSF链基因座(如本文表1中所述的CD3E开放阅读框；表2、3或4中所述的CD3D开放阅读框；或本文表5中所述的CD3G开放阅读框)；或与恒定CD3-IgSF链基因座(如本文表1中所述的CD3E开放阅读框；表2、3或4中所述的CD3D开放阅读框；或本文表5中所述的CD3G开放阅读框)的全部或部分(例如，为或至少500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500或4,000个连续核苷酸)具有为或至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列处、附近或之内。
在一些实施方案中，选择遗传破坏的靶位点，使得在整合转基因序列之后，由经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)编码的miniCAR含有功能性恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)，使得miniCAR能够被组装成TCR/CD3复合物和/或能够经由在编码的miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)进行信号传导。在一些实施方案中，选择遗传破坏的靶位点，使得在整合转基因序列之后，由经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码的miniCAR含有与恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的细胞外部分融合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，选择遗传破坏的靶位点，使得在整合转基因序列之后，由经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码的miniCAR含有在恒定CD3-IgSF链的细胞外部分中的与全长成熟恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)融合的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，模板多核苷酸的一个或多个同源臂序列设计为位于遗传破坏的位点周围。在一些方面，将靶位点置于内源恒定CD3-IgSF链基因座的外显子内或附近，使得编码嵌合受体的一部分的转基因可以与恒定CD3-IgSF链基因座的编码序列框内整合。在一些方面，将靶位点置于内源恒定CD3-IgSF链基因座的外显子内或附近，使得编码嵌合受体的一部分的转基因可以与编码恒定CD3-IgSF链基因座的细胞外部分的序列框内整合。
在一些实施方案中，选择靶位点，使得转基因的靶向整合产生转基因与恒定CD3-IgSF链基因座的内源序列的基因融合物，其编码包含异源(例如，由转基因编码)抗原结合结构域和内源(例如，由基因组或内源序列的开放阅读框编码)恒定CD3-IgSF链的miniCAR。
在一些方面，内源序列可以编码功能性恒定CD3-IgSF链基因座，其是能够介导、激活或刺激初级细胞质或细胞内信号的全长成熟链或其部分，例如，恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g，包括基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM))的细胞质结构域。在一些方面，将靶位点置于内源开放阅读框序列的开始处或附近，所述内源开放阅读框序列编码恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的成熟多肽的细胞外部分。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:17所示的人CD3e链前体序列的氨基酸残基23-207的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:19所示的人CD3e链前体序列的氨基酸残基22-201的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQID NO:20所示的人CD3d序列的氨基酸残基22-171的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:22所示的人CD3d序列的氨基酸残基22-127的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:24所示的人CD3d序列的氨基酸残基23-98的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:26所示的人CD3g序列的氨基酸残基23-182的开放阅读框序列处或附近。
在一些方面，靶位点在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的外显子内。在一些方面，靶位点在内源恒定CD3-IgSF链基因座的内含子内。在一些方面，靶位点在恒定CD3-IgSF链基因座的调节或控制元件(例如，启动子、5'非翻译区(UTR)或3'UTR)内。在一些实施方案中，靶位点在本文表1中所述的CD3E基因组区序列或CD3E基因组区序列含有的任何外显子或内含子内；在本文表2、3或4中所述的CD3D基因组区序列或CD3D基因组区序列含有的任何外显子或内含子内；或在本文表5中所述的CD3G基因组区序列或CD3G基因组区序列含有的任何外显子或内含子内。
在一些实施方案中，遗传破坏(例如，DNA断裂)被靶向于恒定CD3-IgSF链基因座或其开放阅读框的外显子内。在某些实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座或其开放阅读框的第一外显子、第二外显子、第三外显子或第四外显子内。在一些方面，靶位点在外显子(如对应于早期编码区的外显子)内。在一些实施方案中，靶位点在对应于早期编码区的外显子内或紧邻其，所述外显子例如内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的外显子1、2或3(如在本文表1中所述的CD3E基因组区序列或CD3E基因组区序列含有的任何外显子；在本文表2、3或4中所述的CD3D基因组区序列或CD3D基因组区序列含有的任何外显子；或在本文表5中所述的CD3G基因组区序列或CD3G基因组区序列含有的任何外显子)，或包括在外显子1、2或3内或者在外显子1、2或3的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内的紧接转录起始位点之后的序列。在一些方面，靶位点在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的外显子1处或附近，例如在外显子1的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些实施方案中，靶位点在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的外显子2处或附近，或在外显子2的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些方面，靶位点在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的外显子3处或附近，例如在外显子3的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些方面，靶位点位于恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的调节或控制元件(例如启动子)内。
在一些情况下，将靶位点置于示例性基因组基因座CD3E的外显子1、2或3处或其附近，例如，具有如本文表1中所述的基因组坐标。在一些情况下，将靶位点置于示例性基因组基因座CD3D的外显子1、2或3处或其附近，例如，具有如本文表2、3或4中所述的基因组坐标。在一些情况下，将靶位点置于示例性基因组基因座CD3G的外显子1、2或3处或其附近，例如，具有如本文表5中所述的基因组坐标。
在特定实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框的第一外显子内。在一些实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框的中的第一外显子的5'端下游的500个碱基对(bp)内。在特定实施方案中，遗传破坏在外显子1的5'核苷酸与外显子1的3'核苷酸的上游之间。在某些实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框中第一外显子的5'端下游的400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp或50bp内。在特定实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框中第一外显子的5'端下游的1bp与400bp之间、50bp与300bp之间、100bp与200bp之间或100bp与150bp之间，每个都包含端值。在某些实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框中的第一外显子的5'端下游100bp与150bp之间，包含端值。
在特定实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框的第二外显子内。在一些实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框的中的第二外显子的5'端下游的500个碱基对(bp)内。在特定实施方案中，遗传破坏在外显子1的5'核苷酸与外显子1的3'核苷酸的上游之间。在某些实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框中第二外显子的5'端下游的400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp或50bp内。在特定实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框中第二外显子的5'端下游的1bp与400bp之间、50bp与300bp之间、100bp与200bp之间或100bp与150bp之间，每个都包含端值。在某些实施方案中，遗传破坏在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)或其开放阅读框中的第二外显子的5'端下游100bp与150bp之间，包含端值。
在一些方面，将靶位点置于编码恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的跨膜区域的内源开放阅读框序列之前或上游。在一些方面，将靶位点置于编码恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的细胞外部分的内源开放阅读框序列内。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:17所示的人CD3e链前体序列的氨基酸残基23-126的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:20所示的人CD3d序列的氨基酸残基22-105的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:24所示的人CD3d序列的氨基酸残基23-30的开放阅读框序列处或附近。在一些情况下，将靶位点置于编码SEQ ID NO:26所示的人CD3g序列的氨基酸残基23-116的开放阅读框序列处或附近。
2.遗传破坏的方法
在一些方面，用于产生基因工程化细胞的方法涉及在一个或多个靶位点(例如，在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的一个或多个靶位点处)处引入遗传破坏。用于产生遗传破坏的方法(包括本文所述的那些)可以涉及使用能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂(如工程化系统)在内源或基因组DNA中的靶位点或靶位置诱导遗传破坏、切割和/或双链断裂(DSB)或切口(例如，单链断裂(SSB))，使得通过错误产生过程(error born process)(如非同源末端接合(NHEJ))修复所述断裂或使用修复模板通过HDR修复可以导致将目的序列(例如，编码嵌合受体的一部分的外源核酸序列或转基因)插入靶位点或位置处或附近。还提供了能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂，用于在本文所提供的方法中使用。在一些方面，一种或多种药剂可以与本文所提供的模板核苷酸组合用于同源定向修复(HDR)介导的转基因序列的靶向整合。
在一些实施方案中，能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含特异性结合至或杂交至基因组中的特定位点或位置(例如，靶位点或靶位置)的DNA结合蛋白或DNA结合核酸。在一些方面，内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处的靶向遗传破坏(例如，DNA断裂或切割)是使用如呈嵌合或融合蛋白形式的与基因编辑核酸酶偶联或复合的蛋白质或核酸来实现的。在一些实施方案中，能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含RNA指导的核酸酶或包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白。
在一些实施方案中，药剂包含各种组分，如RNA指导的核酸酶或包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白。在一些实施方案中，靶向遗传破坏是使用与核酸酶(如内切核酸酶)融合的DNA靶向分子来进行的，所述DNA靶向分子包括DNA结合蛋白，如一种或多种锌指蛋白(ZFP)或转录激活因子样效应子(TALE)。在一些实施方案中，靶向遗传破坏是使用RNA指导的核酸酶如成簇的规律间隔的短回文核酸(CRISPR)相关核酸酶(Cas)系统(包括Cas和/或Cfp1)来进行的。在一些实施方案中，靶向遗传破坏是使用能够诱导遗传破坏的药剂来进行的，所述药剂是如序列特异性或靶向核酸酶，包括DNA结合靶向核酸酶和基因编辑核酸酶(如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN))以及RNA指导的核酸酶(如CRISPR相关核酸酶(Cas)系统)，所述药剂被专门设计以被靶向至少一个靶位点、基因序列或其部分。示例性ZFN、TALE和TALEN描述于例如Lloyd等人,Frontiers in Immunology,4(221):1-7(2013)中。
在一些实施方案中，在自然界中未发现工程化锌指蛋白、TALE蛋白或CRISPR/Cas系统，并且其产生主要来自经验过程，如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择。参见例如，美国专利号5,789,538；美国专利号5,925,523；美国专利号6,007,988；美国专利号6,013,453；美国专利号6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197和WO 02/099084。
锌指和TALE DNA结合结构域可以被工程化以与预定的核苷酸序列结合，例如经由工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的锌指蛋白的识别螺旋区，或通过工程化参与DNA结合的氨基酸(重复可变双残基或RVD区)。因此，工程化锌指蛋白或TALE蛋白是非天然存在的蛋白质。用于工程化锌指蛋白和TALE的方法的非限制性例子是设计和选择。所设计的蛋白质是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要源自合理标准。设计的合理标准包括应用替代规则和计算机化算法，以处理存储现有ZFP或TALE设计(典型和非典型RVD)和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如，美国专利号9,458,205；8,586,526；6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。
已经描述了用于基因组DNA的靶向切割的各种方法和组合物。此类靶向切割事件可以用于例如诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失，并且促进预定的染色体基因座处的靶向重组。参见例如，美国专利号9,255,250；9,200,266；9,045,763；9,005,973；9,150,847；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公开案20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983；20130196373；20140120622；20150056705；20150335708；20160030477和20160024474，将其公开内容通过引用以其整体并入。
锌指蛋白(ZFP)、转录激活因子样效应子(TALE)和CRISPR系统结合结构域可以被“工程化”以与预定的核苷酸序列结合，例如经由工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的ZFP或TALE蛋白的识别螺旋区。工程化DNA结合蛋白(ZFP或TALE)是非天然存在的蛋白质。设计的合理标准包括应用替代规则和计算机化算法，以处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496以及美国公开号20110301073。
在一些实施方案中，一种或多种药剂特异性靶向恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处或附近的至少一个靶位点。在一些实施方案中，药剂包含特异性结合至、识别或杂交至一个或多个靶位点的ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9组合。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统包括工程化crRNA/tracr RNA(“单一指导RNA”)，以指导特异性切割。在一些实施方案中，药剂包含基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称为“TtAgo”(Swarts等人(2014)Nature507(7491):258-261))。使用本文所述的任何核酸酶系统的靶向切割可以用于使用HDR或NHEJ介导的过程将核酸序列(例如，编码嵌合受体的一部分的转基因序列)插入内源恒定CD3-IgSF链基因座的特定靶位置中。
在一些实施方案中，“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域，其结构通过锌离子的配位而稳定。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。ZFP包括靶向通常长9-18个核苷酸的特定DNA序列的人工ZFP结构域，其是通过单独指状物的组装产生的。ZFP包括如下那些，其中单一指状物结构域具有大约30个氨基酸的长度，并且包含含有通过锌与单一β转角的两个半胱氨酸配位的两个不变组氨酸残基且具有两个、三个、四个、五个或六个指状物的α螺旋。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)进行氨基酸取代来改变。因此，例如，ZFP或含有ZFP的分子是非天然存在的，例如被工程化以与所选靶位点结合。
在一些情况下，DNA靶向分子是或包含锌指DNA结合结构域，其与DNA切割结构域融合以形成锌指核酸酶(ZFN)。例如，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)和可以被或可以不被工程化的一个或多个锌指结合结构域。在一些情况下，切割结构域来自IIS型限制性内切核酸酶FokI，其通常催化DNA的双链切割，在距其一条链上的识别位点9个核苷酸处和距其另一条链上的识别位点13个核苷酸处。参见例如，美国专利号5,356,802、5,436,150和5,487,994；Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:978-982。一些基因特异性的工程化锌指是可商购获得的。例如，用于锌指构建的称为CompoZr的平台是可用的，其提供针对数千靶标的特异性靶向锌指。参见例如，Gaj等人,Trends inBiotechnology,2013,31(7),397-405。在一些情况下，使用或者定制设计可商购获得的锌指。在一些实施方案中，例如，在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)内的一个或多个靶位点可以被靶向用于通过工程化ZFN进行遗传破坏。
转录激活因子样效应子(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，包含多个重复序列，每个重复序列在位置12和13包含对核酸靶向序列的每个核苷酸碱基具有特异性的双残基(RVD)。具有类似的模块化碱基每碱基(base-per-base)核酸结合特性的结合结构域(MBBBD)也可以源自不同的细菌物种。在一些实施方案中，“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。各自包含重复可变双残基(RVD)的重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单一“重复单元”(也称为“重复序列”)通常具有33-35个氨基酸的长度，并且展现与天然存在的TALE蛋白内的其他TALE重复序列的至少一定序列同源性。可以使用重复单元内的典型或非典型RVD将TALE蛋白设计为与靶位点结合。参见例如，美国专利号8,586,526和9,458,205。
在一些实施方案中，“TALE-核酸酶”(TALEN)是一种融合蛋白，其包含通常源自转录激活因子样效应子(TALE)的核酸结合结构域和切割核酸靶序列的核酸酶催化结构域。催化结构域包含核酸酶结构域或具有内切核酸酶活性的结构域，像例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在特定实施方案中，TALE结构域可以与大范围核酸酶(像例如I-CreI和I-OnuI)或其功能性变体融合。在一些实施方案中，TALEN是单体TALEN。单体TALEN是进行特异性识别和切割无需二聚化的TALEN，如WO 2012138927中所述的工程化TAL重复序列与I-TevI的催化结构域的融合物。已描述了TALEN并将其用于基因靶向和基因修饰(参见例如，Boch等人(2009)Science 326(5959):1509-12；Moscou和Bogdanove(2009)Science 326(5959):1501；Christian等人(2010)Genetics 186(2):757-61；Li等人(2011)Nucleic Acids Res39(1):359-72)。在一些实施方案中，恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)中的一个或多个位点可以被靶向用于通过工程化TALEN进行遗传破坏。
在一些实施方案中，“TtAgo”是原核Argonaute蛋白，其被认为参与基因沉默。TtAgo源自细菌嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。参见例如，Swarts等人,(2014)Nature507(7491):258-261；G.Sheng等人,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,652。“TtAgo系统”是所需的所有组分，包括例如用于通过TtAgo酶进行切割的指导DNA。
在一些实施方案中，例如，在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)内的一个或多个靶位点可以被靶向用于通过使用成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白进行遗传破坏。参见Sander和Joung,(2014)NatureBiotechnology,32(4):347-355。在一些实施方案中，“CRISPR系统”统指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或引导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复序列”和在内源CRISPR系统的背景下的tracrRNA加工的部分同向重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔子”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
在一些方面，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括与DNA序列特异性结合的非编码指导RNA(gRNA)和具有核酸酶功能性的Cas蛋白(例如，Cas9)。
在一些实施方案中，基因编辑导致所靶向基因座处的插入或缺失，或所靶向基因座的“敲除”以及所编码蛋白质的表达的消除。在一些实施方案中，通过使用CRISPR/Cas9系统进行非同源末端连接(NHEJ)实现基因编辑。在一些实施方案中，一种或多种指导RNA(gRNA)分子可以与一种或多种Cas9核酸酶、Cas9切口酶、酶促失活的Cas9或其变体一起使用。下文描述了所述一种或多种gRNA分子和所述一种或多种Cas9分子的示例性特征。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas核酸酶系统包含以下中的至少一种：具有与恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)；具有与例如恒定CD3-IgSF链基因座内的一个或多个靶位点互补的靶向结构域的gRNA；或至少一种编码gRNA的核酸。
在一些实施方案中，指导序列(例如，指导RNA)是至少包含序列部分(例如，靶向结构域)的任何多核苷酸序列，所述序列部分与靶位点序列(如例如人中的恒定CD3-IgSF链基因座内的一个或多个靶位点)具有足够的互补性以与靶位点处的靶序列杂交并引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合。在一些实施方案中，在形成CRISPR复合物的背景下，“靶位点”(也称为“靶位置(target position)”、“靶DNA序列”或“靶位置(targetlocation)”)可以指代指导序列被设计为与其具有互补性的序列，其中靶序列与指导RNA的结构域(例如，靶向结构域)之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成，则不一定需要完全互补性。在一些实施方案中，选择指导序列以降低所述指导序列内的二级结构的程度。可以通过任何合适的多核苷酸折叠算法来确定二级结构。
在一些方面，将与指导序列组合(并且任选地与其复合)的CRISPR酶(例如Cas9核酸酶)递送至细胞中。例如，CRISPR系统的一个或多个元件源自I型、II型或III型CRISPR系统。例如，CRISPR系统的一个或多个元件源自包含内源CRISPR系统的特定生物体，如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)。
在一些实施方案中，将对靶位点(在恒定CD3-IgSF链基因座(例如CD3E、CD3D或CD3G基因座)内，可以被靶向用于人中的遗传破坏)具有特异性的指导RNA(gRNA)与RNA指导的核酸酶(例如Cas)一起用于在靶位点或靶位置处引入DNA断裂。用于设计gRNA和示例性靶向结构域的方法可以包括例如国际PCT公开号WO 2015/161276中描述的那些。可以将靶向结构域掺入用于将Cas9核酸酶靶向靶位点或靶位置的gRNA中。
例如在以下文献中描述了用于选择和验证靶序列以及脱靶分析的方法：Mali等人,2013Science 339(6121):823-826；Hsu等人Nat Biotechnol,31(9):827-32；Fu等人,2014Nat Biotechnol,2014年3月；32(3):279-284；Heigwer等人,2014Nat Methods11(2):122-3；Bae等人,2014Bioinformatics 2014年5月15日；30(10):1473-5.；Xiao A等人,2014Bioinformatics 2014年4月15日；30(8):1180-1182。用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库是公众可获得的，其含有靶向人基因组或小鼠基因组中基因的组成型外显子的示例性单一指导RNA(sgRNA)序列(参见例如，genescript.com/gRNA-database.html；还参见Sanjana等人(2014)Nat.Methods,11:783-4)。在一些方面，gRNA序列是或包含具有与非靶位点或位置的最小脱靶结合的序列。
靶向结构域包含与靶核酸上的靶序列互补(例如，至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补，例如完全互补)的核苷酸序列。靶核酸的包含靶序列的链在本文中称为靶核酸的“互补链”。关于选择靶向结构域的指导可以在例如Fu等人,Nat Biotechnol2014年3月；32(3):279-284和Sternberg等人,Nature 2014,507:62–67中找到。靶向结构域的放置的例子包括WO 2015/161276中(例如，在其中的图1A至图1G中)所述的那些。
靶向结构域是RNA分子的一部分，因此将包含碱基尿嘧啶(U)，而编码gRNA分子的任何DNA都将包含碱基胸腺嘧啶(T)。尽管不希望受理论束缚，在一些实施方案中，认为靶向结构域与靶序列的互补性有助于gRNA分子/Cas9分子复合物与靶核酸的相互作用的特异性。应理解，在靶向结构域和靶序列对中，靶向结构域中的尿嘧啶碱基将与靶序列中的腺嘌呤碱基配对。在一些实施方案中，靶结构域本身在5'至3'方向上包含任选的次级结构域和核心结构域。在一些实施方案中，核心结构域与靶序列完全互补。在一些实施方案中，靶向结构域具有5至50个核苷酸的长度。靶核酸的与靶向结构域互补的链在本文中称为互补链。所述结构域的一些或所有核苷酸可以具有修饰，例如以使其更不易降解、改善生物相容性等。通过非限制性举例的方式，靶结构域的骨架可以用硫代磷酸酯或一个或多个其他修饰来修饰。在一些情况下，靶向结构域的核苷酸可以包含2'修饰(例如，2-乙酰化，例如2'甲基化)或一个或多个其他修饰。
在各个实施方案中，靶向结构域具有16-26个核苷酸的长度(即它具有16个核苷酸的长度，或17个核苷酸的长度，或18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸的长度)。
在一些实施方案中，设计或鉴定如下gRNA序列，其是或包含靶向特定基因(如恒定CD3-IgSF链基因座，例如CD3E、CD3D或CD3G基因座)中的靶位点的靶向结构域序列。用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库是公众可获得的，其含有靶向人基因组或小鼠基因组中基因的组成型外显子的示例性单一指导RNA(sgRNA)序列(参见例如，genescript.com/gRNA-database.html；还参见Sanjana等人(2014)Nat.Methods,11:783-4)。在一些方面，gRNA序列是或包含具有与非靶位点或位置的最小脱靶结合的序列。
在一些实施方案中，靶序列(靶结构域)在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处或附近。在一些实施方案中，与靶向结构域互补的靶核酸位于目的基因(如恒定CD3-IgSF链基因座)的早期编码区处。早期编码区的靶向可以用于目的基因的遗传破坏(即，消除其表达)。在一些实施方案中，目的基因的早期编码区包括紧接起始密码子(例如，ATG)之后或者在起始密码子的500bp内(例如，小于500bp、450bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp或10bp)的序列。在特定例子中，靶核酸在起始密码子的200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp或10bp内。在一些例子中，gRNA的靶向结构域与靶核酸(如恒定CD3-IgSF链基因座中的靶核酸)上的靶序列互补，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补，例如完全互补。在一些实施方案中，靶向结构域位于恒定CD3-IgSF链基因座的内源转录调节元件(例如启动子)的下游和/或附近。
在一些实施方案中，gRNA可以靶向恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的位点，其靠近转基因(例如编码miniCAR的一部分，如抗原结合结构域)的靶向整合的期望位点。在一些方面，gRNA可以基于编码恒定CD3-IgSF链基因座的序列的量靶向位点，所述基因座期望以与内源恒定CD3-IgSF链基因座的调节相似的方式、时间和程度调节miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的表达。在一些方面，gRNA可以基于编码恒定CD3-IgSF链基因座的序列的量靶向位点，所述基因座期望在表达miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的细胞中表达。在一些方面，gRNA可以靶向位点，使得在整合转基因(例如，编码miniCAR的一部分，如抗原结合结构域)之后，所得的恒定CD3-IgSF链基因座保留由恒定CD3-IgSF链基因座编码的全长内源成熟基因产物(例如，没有信号肽的成熟多肽)的表达。在一些方面，gRNA可以靶向在内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的外显子内的位点。在一些方面，gRNA可以靶向在恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的内含子内的位点。在一些方面，gRNA可以靶向恒定CD3-IgSF链基因座的调节或控制元件(例如，启动子)内或下游的位点。在一些方面，gRNA靶向的恒定CD3-IgSF链基因座处的靶位点可以是本文所述的任何靶位点。在一些实施方案中，gRNA可以靶向对应于早期编码区的外显子内或紧邻其的位点，所述外显子例如内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的外显子1、2、3、4或5，或者包括在外显子1、2、3、4或5内或者在外显子1、2、3、4或5的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内的紧接转录起始位点之后的序列。在一些实施方案中，gRNA可以靶向内源恒定CD3-IgSF链基因座的外显子2处或附近，或者在外显子2的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内的位点。
CD3E基因座的示例性靶序列包括SEQ ID NO:8和28-38中任一项所示的序列。示例性gRNA可以包括如下核糖核酸序列，其可以结合至或靶向或互补于或可以结合至SEQ IDNO:8和28-38中任一项所示的靶位点序列的互补链序列。示例性CD3E gRNA序列包括SEQ IDNO:9和39-49中任一项所示的序列。示例性CD3E gRNA序列包括SEQ ID NO:9所示的序列。可以使用任何已知方法来靶向和产生内源CD3E的遗传破坏，其可以用于本文提供的实施方案中。含有在gRNA内的用于靶向人CD3E基因座的遗传破坏的示例性靶序列或靶向结构域包括例如Chan等人,European Radiology(2020)30:3538-3548和Shifruit等人,Cell.2018年12月13日；175(7):1958–1971.e15中描述的那些，将其通过引用并入本文。
CD3D基因座的示例性靶序列包括SEQ ID NO:50-57中任一项所示的序列。示例性gRNA可以包括如下核糖核酸序列，其可以结合至或靶向或互补于或可以结合至SEQ ID NO:50-57中任一项所示的靶位点序列的互补链序列。示例性CD3D gRNA序列包括SEQ ID NO:58-65中任一项所示的序列。示例性CD3D gRNA序列包括SEQ ID NO:58所示的序列。可以使用任何已知方法来靶向和产生内源CD3D的基因破坏，其可以用于本文提供的实施方案中。含有在gRNA内的用于靶向人CD3D基因座的遗传破坏的示例性靶序列或靶向结构域包括例如Shifruit等人,Cell.2018年12月13日；175(7):1958–1971.e15中描述的那些，将其通过引用并入本文。
CD3G基因座的示例性靶序列包括SEQ ID NO:66-74中任一项所示的序列。示例性gRNA可以包括如下核糖核酸序列，其可以结合至或靶向或互补于或可以结合至SEQ ID NO:66-74中任一项所示的靶位点序列的互补链序列。示例性CD3G gRNA序列包括SEQ ID NO:75-83中任一项所示的序列。示例性CD3G gRNA序列包括SEQ ID NO:75所示的序列。可以使用任何已知方法来靶向和产生内源CD3G的遗传破坏，其可以用于本文提供的实施方案中。含有在gRNA内的用于靶向人CD3G基因座的遗传破坏的示例性靶序列或靶向结构域包括例如Shifruit等人,Cell.2018年12月13日；175(7):1958–1971.e15中描述的那些，将其通过引用并入本文。
3.用于遗传破坏的药剂的递送
在一些实施方案中，人体中的内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的靶向遗传破坏(例如，DNA断裂)是通过以下方式来进行：使用用于引入或转移至细胞的多种已知递送方法或媒介物中的任一种(例如，使用病毒(例如，慢病毒)递送载体)或者用于递送Cas9分子和gRNA的任何已知方法或媒介物，将能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂(例如，Cas9和/或gRNA组分)递送至或引入细胞中。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。在一些实施方案中，例如通过本文所述或已知的用于将核酸引入细胞中的任何方法将编码能够诱导遗传破坏(例如，DNA断裂)的一种或多种药剂的一种或多种组分的核酸序列引入细胞中。在一些实施方案中，可以将编码能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂(如CRISPR指导RNA和/或Cas9酶)的组分的载体递送至细胞中。
在一些实施方案中，将能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂(例如，作为Cas9/gRNA的一种或多种药剂)作为核糖核蛋白(RNP)复合物引入细胞中。RNP复合物包括核糖核苷酸序列(如RNA或gRNA分子)和蛋白质(如Cas9蛋白或其变体)。例如，例如使用电穿孔或其他物理递送方法，将Cas9蛋白作为RNP复合物递送，所述复合物包含Cas9蛋白和靶向靶序列的gRNA分子。在一些实施方案中，经由电穿孔或其他物理方式(例如，粒子枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压)将RNP递送至细胞中。在一些实施方案中，RNP可以穿过细胞的质膜而无需另外的递送剂(例如，小分子药剂、脂质等)。在一些实施方案中，将能够诱导遗传破坏的所述一种或多种药剂(例如，CRISPR/Cas9)作为RNP递送提供如下优点：例如在引入RNP的细胞中短暂发生靶向破坏，而不将所述药剂传播到细胞后代。例如，通过RNP进行的递送使被遗传到其后代的药剂最小化，从而减小后代中脱靶遗传破坏的可能性。在此类情况下，遗传破坏和转基因的整合可以被后代细胞遗传，但是可能会进一步引入脱靶遗传破坏的药剂本身不被传递给后代细胞。
使用多种递送方法和配制品(如表6和表7中所示)或者例如WO 2015/161276、US2015/0056705、US 2016/0272999、US 2017/0211075或US 2017/0016027中所述的方法可以将能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂和组分(例如，Cas9分子和gRNA分子)以多种形式引入靶细胞中。如本文进一步描述，可以在本文所述方法的先前或随后步骤中使用所述递送方法和配制品将模板多核苷酸和/或其他药剂(如用于工程化细胞所需的那些)递送至细胞。当Cas9或gRNA组分被编码为DNA用于递送时，DNA通常可以但不一定包括控制区，例如包含启动子，以实现表达。Cas9分子序列的有用启动子包括例如CMV、EF-1α、EFS、MSCV、PGK或CAG启动子。gRNA的有用启动子包括例如H1、EF-1α、tRNA或U6启动子。可以选择具有相似或不相似强度的启动子来调整组分的表达。编码Cas9分子的序列可以包含核定位信号(NLS)，例如SV40 NLS。在一些实施方案中，Cas9分子或gRNA分子的启动子可以独立地是可诱导的、组织特异性的或细胞特异性的。在一些实施方案中，能够诱导遗传破坏的药剂是引入的RNP复合物。
表6.示例性递送方法
表7.示例性递送方法的比较
在一些实施方案中，可以通过已知或如本文所述的方法将编码Cas9分子和/或gRNA分子的DNA或包含Cas9分子和/或gRNA分子的RNP复合物递送至细胞中。例如，可以例如通过载体(例如，病毒或非病毒载体)、基于非载体的方法(例如，使用裸DNA或DNA复合物)或其组合来递送Cas9编码DNA和/或gRNA编码DNA。在一些实施方案中，通过载体(例如，病毒载体/病毒或质粒)递送含有一种或多种药剂和/或其组分的多核苷酸。载体可以是本文所述的任何载体。
在一些方面，将与指导序列组合(并且任选地与其复合)的CRISPR酶(例如Cas9核酸酶)递送至细胞中。例如，CRISPR系统的一个或多个元件源自I型、II型或III型CRISPR系统。例如，CRISPR系统的一个或多个元件源自包含内源CRISPR系统的特定生物体，如化脓链球菌、金黄色葡萄球菌或脑膜炎奈瑟氏菌。
在一些实施方案中，将Cas9核酸酶(例如，其由来自金黄色葡萄球菌或来自化脓链球菌的mRNA编码，例如pCW-Cas9、Addgene#50661，Wang等人(2014)Science,3:343-80-4；或以目录号K002、K003、K005或K006可从Applied Biological Materials(ABM；加拿大)获得的核酸酶或切口酶慢病毒载体)和对靶基因(例如，内源恒定CD3-IgSF链基因座，例如CD3E、CD3D或CD3G基因座)具有特异性的指导RNA引入细胞中。
在一些实施方案中，通过基于非载体的方法(例如，使用裸DNA或DNA复合物)递送含有一种或多种药剂和/或其组分的多核苷酸或RNP复合物。例如，DNA或RNA或蛋白质或其组合(例如核糖核蛋白(RNP)复合物)可以例如通过以下来递送：有机改性的二氧化硅或硅酸盐(Ormosil)、电穿孔、瞬时细胞压缩或挤压(如Lee等人(2012)Nano Lett 12:6322-27；Kollmannsperger等人(2016)Nat Comm 7,10372中所述)、基因枪、声孔作用(sonoporation)、磁转染、脂质介导的转染、树状聚合物、无机纳米颗粒、磷酸钙或其组合。
在一些实施方案中，经由电穿孔递送包括将细胞与Cas9编码DNA和/或gRNA编码DNA或RNP复合物在筒、室或比色皿中混合，并且施加具有限定的持续时间和幅度的一次或多次电脉冲。在一些实施方案中，经由电穿孔递送是使用如下系统来进行，其中将细胞与Cas9编码DNA和/或gRNA编码DNA在与装置(例如，泵)连接的容器中混合，所述装置将混合物进料至筒、室或比色皿中，其中施加限定持续时间和幅度的一次或多次电脉冲，之后将细胞递送至第二容器。
在一些实施方案中，递送媒介物是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是无机纳米颗粒。示例性无机纳米颗粒包括例如磁性纳米颗粒(例如，Fe3MnO2)和二氧化硅。纳米颗粒的外表面可以与带正电荷的聚合物(例如，聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丝氨酸)缀合，其允许有效载荷的附着(例如，缀合或截留)。在一些实施方案中，非病毒载体是有机纳米颗粒。示例性有机纳米颗粒包括例如SNALP脂质体，其含有阳离子脂质和被聚乙二醇(PEG)包被的中性辅助脂质；以及被脂质包被的鱼精蛋白-核酸复合物。用于基因转移的示例性脂质包括例如WO 2015/161276、WO 2017/193107、WO 2017/093969、US 2016/272999和US 2015/056705中所述的那些。
在一些实施方案中，媒介物具有靶向修饰以增加纳米颗粒和脂质体(例如，细胞特异性抗原、单克隆抗体、单链抗体、适体、聚合物、糖和细胞穿透肽)的靶细胞更新。在一些实施方案中，媒介物使用促融合且内体去稳定的肽/聚合物。在一些实施方案中，媒介物经历酸触发的构象变化(例如，加快负荷的内体逃逸)。在一些实施方案中，使用刺激物可切割的聚合物，例如用于细胞区室中释放。例如，可以使用在还原性细胞环境中切割的基于二硫化物的阳离子聚合物。
在一些实施方案中，递送媒介物是生物非病毒递送媒介物。在一些实施方案中，媒介物是减毒细菌(例如，被天然或人工工程化已具有侵入性，但进行减毒以防止发病，并且表达转基因(例如，单核细胞增生李斯特菌、某些沙门菌属(Salmonella)菌株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和经修饰的大肠杆菌(Escherichia coli))、具有营养和组织特异性向性以靶向特定细胞的细菌、具有经修饰的表面蛋白以改变靶细胞特异性的细菌)。在一些实施方案中，媒介物是基因修饰的噬菌体(例如，具有大包装容量、较低免疫原性、含有哺乳动物质粒维持序列且具有掺入的靶向配体的工程化噬菌体)。在一些实施方案中，媒介物是哺乳动物病毒样颗粒。例如，可以产生经修饰的病毒颗粒(例如，通过纯化“空”颗粒，然后将病毒与所需负荷离体组装)。媒介物还可以被工程化以掺入靶向配体，以改变靶组织特异性。在一些实施方案中，媒介物是生物脂质体。例如，生物脂质体是源自人细胞的基于磷脂的颗粒(例如，红细胞血影，其是源自受试者的分解成球形结构的红细胞(例如，组织靶向可以通过附着各种组织或细胞特异性配体实现))或分泌性外来体—内吞起源的受试者来源的膜结合纳米囊泡(30-100nm)(例如，可以从各种细胞类型产生，因此可以被细胞摄取而不需要靶向配体)。
在一些实施方案中，可以通过已知方法或如本文所述将编码Cas9分子和/或gRNA分子的RNA递送至细胞(例如，本文所述的靶细胞)中。例如，Cas9编码和/或gRNA编码RNA可以例如通过以下来递送：显微注射、电穿孔、瞬时细胞压缩或挤压(如Lee等人(2012)NanoLett 12:6322-27中所述)、脂质介导的转染、肽介导的递送(例如，细胞穿透肽)或其组合。
在一些实施方案中，经由电穿孔递送包括将细胞与编码Cas9分子和/或gRNA分子的RNA在筒、室或比色皿中混合，并且施加具有限定的持续时间和幅度的一次或多次电脉冲。在一些实施方案中，经由电穿孔递送是使用如下系统来进行，其中将细胞与编码Cas9分子和/或gRNA分子的RNA在与装置(例如，泵)连接的容器中混合，所述装置将混合物进料至筒、室或比色皿中，其中施加限定持续时间和幅度的一次或多次电脉冲，之后将细胞递送至第二容器。
在一些实施方案中，可以通过已知方法或如本文所述将Cas9分子递送至细胞中。例如，Cas9蛋白分子可以例如通过以下来递送：显微注射、电穿孔、瞬时细胞压缩或挤压(如Lee等人(2012)Nano Lett 12:6322-27中所述)、脂质介导的转染、肽介导的递送或其组合。递送可以伴随编码gRNA的DNA或伴随gRNA。
在一些实施方案中，将能够引入切割的一种或多种药剂(例如，Cas9/gRNA)作为核糖核蛋白(RNP)复合物引入细胞中。RNP复合物包括核糖核苷酸序列(如RNA或gRNA分子)和蛋白质(如Cas9蛋白或其变体)。例如，例如使用电穿孔或其他物理递送方法，将Cas9蛋白作为RNP复合物递送，所述复合物包含Cas9蛋白和靶向靶序列的gRNA分子。在一些实施方案中，经由电穿孔或其他物理方式(例如，粒子枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压)将RNP递送至细胞中。
在一些实施方案中，经由电穿孔递送包括将细胞与Cas9分子在具有或不具有gRNA分子的情况下在筒、室或比色皿中混合，并且施加具有限定的持续时间和幅度的一次或多次电脉冲。在一些实施方案中，经由电穿孔递送是使用如下系统来进行，其中将细胞与Cas9分子在具有或不具有gRNA分子的情况下在与装置(例如，泵)连接的容器混合，所述装置将混合物进料至筒、室或比色皿中，其中施加限定持续时间和幅度的一次或多次电脉冲，之后将细胞递送至第二容器。
在一些实施方案中，经由电穿孔递送包括将细胞与Cas9分子在具有或不具有gRNA分子的情况下在筒、室或比色皿中混合，并且施加具有限定的持续时间和幅度的一次或多次电脉冲。在一些实施方案中，经由电穿孔递送是使用其中细胞与Cas9分子混合的系统来进行的。
在一些实施方案中，通过基于载体的方法与基于非载体的方法的组合递送含有一种或多种药剂和/或其组分的多核苷酸。例如，病毒体包含与失活的病毒(例如，HIV或流感病毒)组合的脂质体，其可以导致比单独的病毒或脂质体方法更有效的基因转移。
在一些实施方案中，将超过一种药剂或其组分递送至细胞中。例如，在一些实施方案中，将能够诱导基因组中两个或更多个位置(如在内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)内的两个或更多个位点)的遗传破坏的一种或多种药剂递送至细胞。在一些实施方案中，使用一种方法递送一种或多种药剂及其组分。例如，在一些实施方案中，将用于诱导内源恒定CD3-IgSF链基因座的遗传破坏的一种或多种药剂作为编码用于遗传破坏的组分的多核苷酸来递送。在一些实施方案中，一种多核苷酸可以编码靶向内源恒定CD3-IgSF链基因座的药剂。在一些实施方案中，两种或更多种不同的多核苷酸可以编码靶向内源恒定CD3-IgSF链基因座的药剂。在一些实施方案中，能够诱导遗传破坏的药剂可以作为核糖核蛋白(RNP)复合物来递送，并且两种或更多种不同的RNP复合物可以作为混合物一起递送或分开递送。
在一些实施方案中，一种或多种药剂是或包含核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些实施方案中，与用于工程化的细胞一起孵育、添加至所述细胞或与所述细胞接触的RNP的浓度是以下浓度：为或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.2、2.5、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μg/106个细胞，或者由任两个前述值限定的范围。在一些实施方案中，与用于工程化的细胞一起孵育、添加至所述细胞或与所述细胞接触的RNP的浓度是以下浓度：为或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.2、2.5、3、4、5μg/106个细胞，或者由任两个前述值限定的范围。在一些实施方案中，RNP的浓度是1μg/106个细胞。在一些实施方案中，在RNP复合物中，gRNA与Cas9分子或其他核酸酶的比率(例如，摩尔比)是为或约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，或者由任两个前述值限定的范围。在一些实施方案中，在RNP复合物中，gRNA与Cas9分子或其他核酸酶的比率(例如，摩尔比)是为或约3:1、2.9:1、2.8:1、2.7:1、2.6:1、2.5:1、2.4:1、2.3:1、2.2:1、2.1:1、2:1或1:1，或者由任两个前述值限定的范围。在一些实施方案中，在RNP复合物中，gRNA与Cas9分子或其他核酸酶的摩尔比是为或约2:1。
在一些实施方案中，递送除了能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂和/或其组分(例如，Cas9分子组分和/或gRNA分子组分)以外的一种或多种核酸分子，如用于HDR引导的整合的模板多核苷酸(如本文例如在第I.B.2节中所述的任何模板多核苷酸)。在一些实施方案中，在与Cas系统的一种或多种组分相同的时间递送核酸分子(例如，模板多核苷酸)。在一些实施方案中，在递送Cas系统的一种或多种组分之前或之后(例如，小于约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周或4周)递送核酸分子。在一些实施方案中，通过与Cas系统的一种或多种组分(例如，Cas9分子组分和/或gRNA分子组分)不同的方式来递送核酸分子(例如，模板多核苷酸)。核酸分子(例如，模板多核苷酸)可以通过本文所述的任何递送方法来递送。例如，核酸分子(例如，模板多核苷酸)可以通过病毒载体(例如，逆转录病毒或慢病毒)来递送，并且Cas9分子组分和/或gRNA分子组分可以通过电穿孔来递送。在一些实施方案中，核酸分子(例如，模板多核苷酸)包括一个或多个异源序列，例如，编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的序列和/或其他异源基因核酸序列。
B.经由同源定向修复(HDR)进行靶向整合
在一些方面，所提供的实施方案涉及多核苷酸的特定部分(如含有编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因的模板多核苷酸的部分)在基因组中内源恒定CD3-IgSF链基因座处的特定位置(如靶位点或靶位置)处的靶向整合。在一些方面，同源定向修复(HDR)可以介导转基因在靶位点处的位点特异性整合。在一些实施方案中，遗传破坏(例如，DNA断裂，如第I.A节中所述)和含有一个或多个同源臂(例如，含有与遗传破坏周围的序列同源的核酸序列)的模板多核苷酸的存在可以诱导或引导HDR，其中同源序列用作DNA修复的模板。基于遗传破坏周围的内源基因序列与模板多核苷酸中包括的5'和/或3'同源臂之间的同源性，细胞DNA修复机制可以使用模板多核苷酸来修复DNA断裂并重新合成遗传破坏的位点处的遗传信息，从而将转基因序列有效地插入或整合到模板多核苷酸中的遗传破坏位点处或附近。在一些实施方案中，内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处的遗传破坏可以通过本文所述的用于产生靶向遗传破坏的任何方法产生。
还提供了多核苷酸(例如，本文所述的模板多核苷酸)和包括此类多核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，所提供的多核苷酸和/或试剂盒可以用于本文所述的方法(例如，涉及HDR)中，以将编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因靶向于内源恒定CD3-IgSF链基因座处。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是或包含如下多核苷酸和同源序列(例如，同源臂)，所述多核苷酸含有编码miniCAR的一部分、区域或结构域(如抗原结合结构域)的转基因(如外源或异源核酸序列)，所述同源序列与内源恒定CD3-IgSF链基因座的内源基因组位点处或附近的序列同源。在一些方面，模板多核苷酸中的转基因包含编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的核苷酸序列。在一些方面，在转基因靶向整合后，对工程化细胞中的恒定CD3-IgSF链基因座进行修饰，使得经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座含有编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因。
在一些方面，模板多核苷酸是作为线性DNA片段引入或包含于载体中。在一些方面，诱导遗传破坏的步骤和用于靶向整合的步骤(例如，通过引入模板多核苷酸)是同时或依序进行的。
1.同源定向修复(HDR)
在一些实施方案中，同源定向修复(HDR)可以用于将一个或多个核酸序列(例如，转基因)靶向整合或插入于内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的一个或多个靶位点处。在一些实施方案中，核酸酶诱导的HDR可以用于改变靶序列，将转基因整合于特定靶位置，和/或编辑或修复特定靶基因中的突变。
靶位点处核酸序列的改变可以通过HDR用异源提供的模板多核苷酸(也称为“供体多核苷酸”或“模板序列”)来进行。例如，模板多核苷酸提供靶序列的改变，例如含于模板多核苷酸内的转基因的插入。在一些实施方案中，可以使用质粒或载体作为同源重组的模板。在一些实施方案中，可以使用线性DNA片段作为同源重组的模板。在一些实施方案中，可以使用单链模板多核苷酸作为通过靶序列与模板多核苷酸之间的同源定向修复的替代方法(例如，单链退火)来改变靶序列的模板。模板多核苷酸实现的靶序列的改变依赖于通过核酸酶(例如，靶向核酸酶，如CRISPR/Cas9)进行的切割。通过核酸酶进行的切割可以包括双链断裂或两个单链断裂。
在一些实施方案中，“重组”包括两个多核苷酸之间的遗传信息交换的过程。在一些实施方案中，“同源重组(HR)”包括这种交换的特化形式，其在例如经由同源定向修复机制修复细胞中的双链断裂期间进行。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用模板多核苷酸对靶DNA(即，经历双链断裂的DNA，如内源基因中的靶位点)进行模板修复，并且因为其导致遗传信息从模板多核苷酸转移至靶标而被不同地称为“非交换型基因转化”或“短束基因转化”。在一些实施方案中，这种转移可以涉及在断裂的靶标与模板多核苷酸之间形成的异源双链DNA的错配校正，和/或“合成依赖性链退火”(其中使用模板多核苷酸重新合成将成为靶标的一部分的遗传信息)，和/或相关过程。这种特化的HR通常导致靶分子序列的改变，使得模板多核苷酸的部分或全部序列掺入靶多核苷酸中。
在一些实施方案中，经由非同源性依赖性机制将模板多核苷酸(例如含有转基因的多核苷酸)整合至细胞基因组中。所述方法包括在细胞基因组中产生双链断裂(DSB)，并使用核酸酶切割模板多核苷酸分子，使得模板多核苷酸整合于DSB的位点处。在一些实施方案中，模板多核苷酸是经由非同源性依赖性方法(例如，NHEJ)来整合。在体内切割后，模板多核苷酸可以以靶向方式整合至细胞基因组中的DSB位置处。模板多核苷酸可以包括用于产生DSB的一种或多种核酸酶的一个或多个相同靶位点。因此，模板多核苷酸可以通过用于切割期望整合至其中的内源基因的一种或多种相同核酸酶来切割。在一些实施方案中，模板多核苷酸包括与用于诱导DSB的核酸酶不同的核酸酶靶位点。如本文所述，可以通过任何已知方法或本文所述的任何方法(如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统或TtAgo核酸酶)来产生靶位点或靶位置的遗传破坏。
在一些实施方案中，DNA修复机制可以通过核酸酶在以下之后诱导：(1)单一双链断裂；(2)两个单链断裂；(3)两个双链断裂，在靶位点的每一侧上发生断裂；(4)一个双链断裂和两个单链断裂，在靶位点的每一侧上发生双链断裂和两个单链断裂；(5)四个单链断裂，在靶位点的每一侧上发生一对单链断裂；或者(6)一个单链断裂。在一些实施方案中，使用单链模板多核苷酸，并且可以通过替代性HDR改变靶位点。
模板多核苷酸实现的靶位点的改变依赖于通过核酸酶分子进行的切割。通过核酸酶进行的切割可以包括切口、双链断裂、或两个单链断裂，例如在靶位点处DNA的每条链上一个断裂。在靶位点上引入断裂之后，在断裂末端处进行切除，得到单链突出的DNA区域。
在典型HDR中，引入双链模板多核苷酸，其包含靶位点的同源序列，所述同源序列将被直接掺入所述靶位点中，或者用作模板以插入转基因或校正所述靶位点的序列。在断裂处切除后，修复可以通过不同途径进行，例如通过双霍利迪连接体模型(doubleHolliday junction model)(或双链断裂修复(DSBR)途径)或合成依赖性链退火(SDSA)途径进行。
在双霍利迪连接体模型中，发生靶位点的两个单链突出端链侵入至模板多核苷酸的同源序列中，导致形成具有两个霍利迪结点的中间体。随着从侵入链的末端合成新DNA以填充切除产生的缺口，结点移行。新合成的DNA的末端连接至切除的末端，并且结点被分解，导致在靶位点处的插入，例如在模板多核苷酸中插入转基因。与模板多核苷酸的交换可以在结点分解后进行。
在SDSA途径中，仅一个单链突出端侵入模板多核苷酸，并且从侵入链的末端合成新DNA，以填充切除产生的缺口。然后新合成的DNA与剩余的单链突出端退火，合成新DNA以填充于缺口中，并且连接所述链以产生修饰的DNA双链体。
在替代性HDR中，引入单链模板多核苷酸，例如模板多核苷酸。在靶位点处用于改变所需靶位点的切口、单链断裂或双链断裂是由核酸酶分子介导的，并且进行在断裂处切除以露出单链突出端。掺入模板多核苷酸的序列以校正或改变DNA的靶位点通常是通过SDSA途径进行的，如本文所述。
在一些实施方案中，“替代性HDR”或替代性同源定向修复是指使用同源核酸(例如，内源同源序列，例如姐妹染色单体；或异源核酸，例如模板多核苷酸)修复DNA损伤的过程。替代性HDR与典型HDR的不同之处在于，所述过程利用与典型HDR不同的途径，并且可能被典型HDR介体RAD51和BRCA2抑制。替代性HDR也使用单链或带切口的同源核酸进行断裂的修复。在一些实施方案中，“典型HDR”或典型同源定向修复是指使用同源核酸(例如，内源同源序列，例如姐妹染色单体；或异源核酸，例如模板核酸)修复DNA损伤的过程。典型HDR通常在双链断裂处已经存在显著切除时发挥作用，形成DNA的至少一个单链部分。在正常细胞中，HDR通常涉及一系列步骤，如识别断裂、稳定断裂、切除、稳定单链DNA、形成DNA交换中间体、分解交换中间体以及连接。所述过程需要RAD51和BRCA2，并且同源核酸通常是双链的。除非另有指示，否则术语“HDR”在一些实施方案中涵盖典型HDR和替代性HDR。
在一些实施方案中，双链切割是通过核酸酶来实现的，所述核酸酶是例如具有与HNH样结构域相关的切割活性和与RuvC样结构域(例如，N末端RuvC样结构域)相关的切割活性的Cas9分子，例如野生型Cas9。此类实施方案仅需要单一gRNA。
在一些实施方案中，一个单链断裂或切口是通过具有切口酶活性的核酸酶分子(例如，Cas9切口酶)实现的。在靶位点处带切口的DNA可以是替代性HDR的底物。
在一些实施方案中，两个单链断裂或切口是通过具有切口酶活性(例如，与HNH样结构域相关的切割活性或与N末端RuvC样结构域相关的切割活性)的核酸酶(例如，Cas9分子)实现的。此类实施方案通常需要两种gRNA，每个单链断裂的放置需要一种。在一些实施方案中，具有切口酶活性的Cas9分子切割gRNA所杂交的链，但不切割与gRNA所杂交的链互补的链。在一些实施方案中，具有切口酶活性的Cas9分子不切割gRNA所杂交的链，而是切割与gRNA所杂交的链互补的链。在一些实施方案中，切口酶具有HNH活性，例如RuvC活性失活的Cas9分子，例如具有D10处的突变(例如，D10A突变)的Cas9分子。D10A使RuvC失活；因此，Cas9切口酶(仅)具有HNH活性，并且将在gRNA所杂交的链(例如，互补链，其上不具有NGGPAM)上进行切割。在一些实施方案中，可以使用具有H840(例如，H840A)突变的Cas9分子作为切口酶。H840A使HNH失活；因此，Cas9切口酶(仅)具有RuvC活性，并且在非互补链(例如，具有NGG PAM并且其序列与gRNA相同的链)上进行切割。在一些实施方案中，Cas9分子是N末端RuvC样结构域切口酶，例如，Cas9分子包含N863处的突变，例如N863A。
在使用切口酶和两种gRNA定位两个单链切口的一些实施方案中，一个切口在靶DNA的+链上，并且一个切口在-链上。PAM朝外。可以选择gRNA使得所述gRNA相隔约0-50、0-100或0-200个核苷酸。在一些实施方案中，在与两种gRNA的靶向结构域互补的靶序列之间没有重叠。在一些实施方案中，gRNA不重叠，并且相隔多达50、100或200个核苷酸。在一些实施方案中，使用两种gRNA可以例如通过减少脱靶结合来增加特异性(Ran等人,Cell.2013年9月12日；154(6):1380-9)。
在一些实施方案中，可以使用单一切口来诱导HDR，例如替代性HDR。在本文中考虑，可以使用单一切口增加给定切割位点(如靶位点)处的HR与NHEJ的比率。在一些实施方案中，在靶位点处在与所述gRNA的靶向结构域互补的DNA的链中形成单链断裂。在一些实施方案中，在靶位点处在除了与所述gRNA的靶向结构域互补的链以外的DNA的链中形成单链断裂。
在一些实施方案中，细胞可以采用其他DNA修复途径(如单链退火(SSA)、单链断裂修复(SSBR)、错配修复(MMR)、碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、链内交联(ICL)、跨损伤合成(TLS)、无误性复制后修复(PRR))来修复核酸酶产生的双链或单链断裂。
靶向整合导致转基因(例如，同源臂之间的序列)整合到基因组中的恒定CD3-IgSF链基因座中，以产生编码miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座。转基因可以被整合于基因组中所述至少一个靶位点或位点中的一个位点处或附近的任何位置。在一些实施方案中，转基因被整合于所述至少一个靶位点中的一个位点处或附近，例如在切割位点上游或下游300、250、200、150、100、50、10、5、4、3、2、1个或更少碱基对内，如在靶位点任一侧的100、50、10、5、4、3、2、1个碱基对内，如在靶位点任一侧的50、10、5、4、3、2、1个碱基对内。在一些实施方案中，包含转基因的整合的序列不包括任何载体序列(例如，病毒载体序列)。在一些实施方案中，整合的序列包括载体序列(例如，病毒载体序列)的一部分。
双链断裂或一条链中的单链断裂(如靶位点)应当与靶向整合位点(例如，用于靶向整合的位点)足够接近，使得在所需区域中产生改变，如发生转基因的插入或突变的校正。在一些实施方案中，距离不超过10、25、50、100、200、300、350、400或500个核苷酸。在一些实施方案中，认为断裂应当与靶整合位点足够接近，使得断裂位于在末端切除期间经历外切核酸酶介导的去除的区域内。在一些实施方案中，靶向结构域被配置使得切割事件(例如，双链或单链断裂)定位于期望改变的区域(例如，靶向插入位点)的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400或500个核苷酸内。断裂(例如，双链或单链断裂)可以定位于期望改变的区域(例如，靶向插入位点)的上游或下游。在一些实施方案中，断裂定位于期望改变的区域内，例如由至少两个突变体核苷酸限定的区域内。在一些实施方案中，断裂的定位紧邻期望改变的区域，例如紧接靶整合位点的上游或下游。
在一些实施方案中，单链断裂伴随通过第二gRNA分子定位的另外的单链断裂。例如，靶向结构域被配置使得切割事件(例如，两个单链断裂)定位于靶整合位点的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400或500个核苷酸内。在一些实施方案中，第一和第二gRNA分子被配置使得，在指导Cas9切口酶时，单链断裂将伴随通过第二gRNA定位的另外的单链断裂，它们彼此足够接近以导致所需区域的改变。在一些实施方案中，第一和第二gRNA分子被配置使得，例如在Cas9是切口酶时，通过第二gRNA定位的单链断裂位于通过第一gRNA分子定位的断裂的10、20、30、40或50个核苷酸内。在一些实施方案中，两种gRNA分子被配置为将切割定位于不同链上的相同位置，或者彼此的几个核苷酸内，例如从而基本上模拟双链断裂。
在出于诱导HDR介导的转基因插入或校正的目的，gRNA(单分子(或嵌合)或模块化gRNA)和Cas9核酸酶诱导双链断裂的一些实施方案中，切割位点(如靶位点)位于远离靶整合位点的0至200bp之间(例如，0至175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100bp)。在一些实施方案中，切割位点(如靶位点)位于远离靶向整合位点的0至100bp之间(例如，0至75、0至50、0至25、25至100、25至75、25至50、50至100、50至75或75至100bp)。
在一些实施方案中，可以通过使用切口酶产生具有突出端的断裂来促进HDR。在一些实施方案中，与例如NHEJ相反，突出端的单链性质可以增强细胞通过HDR修复断裂的可能性。
具体而言，在一些实施方案中，通过选择第一gRNA和第二gRNA来促进HDR，第一gRNA将第一切口酶靶向第一靶位点，并且第二gRNA将第二切口酶靶向第二靶位点，所述第二靶位点在与第一靶位点相对的DNA链上并且偏离第一切口。在一些实施方案中，gRNA分子的靶向结构域被配置为将切割事件定位于足够远离预选的核苷酸(例如，编码区的核苷酸)，使得所述核苷酸不发生改变。在一些实施方案中，gRNA分子的靶向结构域被配置为将内含子切割事件定位于足够远离内含子/外显子边界或天然存在的剪接信号，以避免外显子序列的改变或不期望的剪接事件。在一些实施方案中，gRNA分子的靶向结构域被配置为定位于早期外显子中，以允许转基因在所述至少一个靶位点中的一个位点处或附近的框内整合。
在一些实施方案中，双链断裂可以伴随通过第二gRNA分子定位的另外的双链断裂。在一些实施方案中，双链断裂可以伴随通过第二gRNA分子和第三gRNA分子定位的两个另外的单链断裂。在一些实施方案中，两种gRNA(例如，独立地为单分子(或嵌合)或模块化gRNA)被配置为将双链断裂定位于靶整合位点(例如，靶向整合位点)的两侧上。
2.模板多核苷酸
在一些实施方案中，可以将模板多核苷酸作为修复模板采用细胞DNA修复过程(如同源重组)中涉及的分子和机制，所述模板多核苷酸例如含有转基因和同源序性序列(例如，同源臂)的多核苷酸，所述转基因例如外源或异源核酸序列且包括编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的核苷酸序列，所述同源序性序列与用于靶向整合的内源基因组位点处或附近的序列同源。在一些方面，与内源DNA中一个或多个靶位点处或附近的序列具有同源性的模板多核苷酸可以用于改变靶DNA(如内源恒定CD3-IgSF链基因座处的靶位点)的结构，用于转基因、异源或外源序列(例如，编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的异源核酸序列)的靶向插入。还提供了用于在本文提供的方法中使用的多核苷酸，例如模板多核苷酸，例如作为同源定向修复(HDR)介导的转基因靶向整合的模板。在一些实施方案中，多核苷酸包括编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的核酸序列以及与所述核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列。
在一些实施方案中，模板多核苷酸含有与转基因(异源或外源核酸序列)连接和/或侧接所述转基因的一个或多个同源序列(例如，同源臂)，所述转基因包括编码抗原结合结构域的序列。在一些实施方案中，使用同源序列来靶向内源恒定CD3-IgSF链基因座处的异源序列。在一些实施方案中，模板多核苷酸包括在同源臂之间的核酸序列(如转基因)，用于插入或整合至细胞的基因组中。模板多核苷酸中的转基因可以包含编码功能多肽的一个或多个序列(例如，cDNA)，其具有或不具有启动子或其他调节元件。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是可以与能够引入遗传破坏(例如，靶向恒定CD3-IgSF链基因座的CRISPR-Cas9组合)的一种或多种药剂结合用于改变靶位点的结构的核酸序列。在一些实施方案中，模板多核苷酸通过同源定向修复事件改变靶位点的结构，例如插入转基因。
在一些实施方案中，模板多核苷酸改变靶位点的序列，例如导致同源臂之间的转基因插入或整合至细胞的基因组中。在一些方面，靶向整合导致转基因的编码部分与内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的一个或多个外显子的框内整合，例如与整合位点处的相邻外显子的框内整合。例如，在一些情况下，框内整合导致内源开放阅读框的一部分和miniCAR被表达。因此，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座可以表达融合蛋白，所述融合蛋白包含由整合的转基因编码的多肽和由内源恒定CD3-IgSF链基因座编码的多肽。
在一些实施方案中，模板多核苷酸包括对应于靶序列上的位点或与所述位点同源的序列，所述位点例如被能够引入基因破坏的一种或多种药剂切割。在一些实施方案中，模板多核苷酸包括对应于靶序列上的第一位点和靶序列上的第二位点两者或与所述两者同源的序列，第一位点在能够引入遗传破坏的第一药剂中被切割，第二位点在能够引入遗传破坏的第二药剂中被切割。
在一些实施方案中，模板多核苷酸包含以下组分：[5'同源臂]-[转基因(异源或外源核酸序列，例如，编码miniCAR的一部分，如抗原结合结构域)]-[3'同源臂]。同源臂提供重组至染色体中，从而有效地将例如编码miniCAR的抗原结合结构域的转基因插入或整合至基因组DNA中的切割位点(如一个或多个靶位点)处或附近。在一些实施方案中，同源臂侧接遗传破坏的靶位点处的序列。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是双链的。在一些实施方案中，模板多核苷酸是单链的。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含单链部分和双链部分。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含于载体中。在一些实施方案中，模板多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸是双链DNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸是单链DNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸是双链RNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸是单链RNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含单链部分和双链部分。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含于载体中。
在某些实施方案中，多核苷酸(例如，模板多核苷酸)含有和/或包括编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因。在任何实施方案中的一些中，转基因被靶向于编码恒定CD3-IgSF基因产物(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的内源基因、基因座或开放阅读框内的一个或多个靶位点处。在一些实施方案中，转基因被靶向以供整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座开放阅读框内，例如以导致所编码的恒定CD3-IgSF链基因产物(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的全部或一部分的表达。
用于插入的多核苷酸也可以被称为“转基因”、“异源序列”、“外源序列”或“供体”多核苷酸或分子。模板多核苷酸可以是单链和/或双链的DNA，并且可以以线性或环状形式引入细胞中。模板多核苷酸可以是单链和/或双链的DNA，并且可以以线性或环状形式引入细胞中。模板多核苷酸可以是单链和/或双链的RNA，并且可以作为RNA分子(例如，RNA病毒的一部分)引入。还参见，美国专利公开号20100047805和20110207221。模板多核苷酸也可以以DNA形式引入，可以将其以环状或线性形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过已知方法保护模板多核苷酸的末端(例如，防止核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3'端，和/或将自身互补的寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见例如，Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science 272:886-889。用于保护异源多核苷酸免于降解的另外的方法包括但不限于一个或多个末端氨基的添加以及经修饰的核苷酸间连接(例如，像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基)的使用。如果以双链形式引入，则模板多核苷酸可以包括一个或多个核酸酶靶位点，例如侧接要整合至细胞基因组中的转基因的核酸酶靶位点。参见例如，美国专利公开号20130326645。
在一些实施方案中，双链模板多核苷酸包括长度大于1kb(例如，在2与200kb之间、在2与10kb之间(或其间的任何值))的序列(也称为转基因)。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是单链核酸。在一些实施方案中，模板多核苷酸是双链核酸。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含例如一个或多个核苷酸的核苷酸序列，其将被添加至靶DNA或将作为靶DNA中变化的模板。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含可用于修饰靶位点的核苷酸序列，例如将模板多核苷酸中的转基因复制或插入细胞的基因组中。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含例如一个或多个核苷酸的核苷酸序列，其对应于靶DNA(例如，靶位点)的野生型序列。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是线性双链DNA。长度可以为例如约200-5000个碱基对，例如约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000或5000个碱基对。长度可以为例如至少200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000或5000个碱基对。在一些实施方案中，长度不大于200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000或5000个碱基对。在一些实施方案中，双链模板多核苷酸的长度大于为或约160个碱基对，例如约200-4000、300-3500、400-3000、500-2500、600-2000、700-1900、800-1800、900-1700、1000-1600、1100-1500或1200-1400个碱基对。
在一些实施方案中，模板多核苷酸的长度是为或约1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750或4000个核苷酸，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，多核苷酸的长度在为或约1500与为或约2500个核苷酸之间，或者在为或约1750与为或约2250个核苷酸之间。在一些实施方案中，模板多核苷酸的长度为约2000±250、2000±200、2000±150、2000±100或2000±50个核苷酸。
含于本文所述的模板多核苷酸上的转基因可以使用已知的标准技术如PCR从质粒、细胞或其他来源分离。用于使用的模板多核苷酸可以包括各种类型的拓扑学，包括环状超螺旋的、环状松弛的、线性的等。可替代地，它们可以使用标准寡核苷酸合成技术化学合成。另外，模板多核苷酸可以被甲基化或缺乏甲基化。模板多核苷酸可以呈细菌或酵母人工染色体(BAC或YAC)的形式。
模板多核苷酸可以是线性单链DNA。在一些实施方案中，模板多核苷酸是(i)可以与靶DNA的带切口的链退火的线性单链DNA，(ii)可以与靶DNA的完整链退火的线性单链DNA，(iii)可以与靶DNA的转录链退火的线性单链DNA，(iv)可以与靶DNA的非转录链退火的线性单链DNA，或多于一种的前述项。
长度可以为例如约200-5000个核苷酸，例如约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000或5000个核苷酸。长度可以为例如至少200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，长度不大于200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，单链模板多核苷酸的长度为约160个核苷酸，例如约200-4000、300-3500、400-3000、500-2500、600-2000、700-1900、800-1800、900-1700、1000-1600、1100-1500或1200-1400个核苷酸。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是环状双链DNA，例如质粒。在一些实施方案中，模板多核苷酸在转基因和/或靶位点的任一侧上包含约500至1000个同源性碱基对。在一些实施方案中，模板多核苷酸在靶位点或转基因的5'、在靶位点或转基因的3'、或同时在靶位点或转基因的5'和3'包含约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个同源性碱基对。在一些实施方案中，模板多核苷酸在靶位点或转基因的5'、在靶位点或转基因的3'、或同时在靶位点或转基因的5'和3'包含至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个同源性碱基对。在一些实施方案中，模板多核苷酸在靶位点或转基因的5'、在靶位点或转基因的3'、或同时在靶位点或转基因的5'和3'包含不超过10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个同源性碱基对。
a.转基因
在一些实施方案中，模板多核苷酸含有编码本文例如在第III.B节中所述的任何miniCAR的一部分(如结合结构域)或这样的miniCAR的一个或多个区域、结构域或链的转基因。
在一些方面，转基因可以编码miniCAR的全部或一部分。在一些实施方案中，转基因编码本文例如在第III.B节中所述的任何miniCAR或其一部分，或其一个或多个区域、结构域或链，如miniCAR(例如miniCAR)的抗原结合结构域。在一些方面，在将转基因整合到内源恒定CD3-IgSF链基因座中后，所得经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码miniCAR，如本文例如在第III.B节中所述的任何miniCAR。例如，转基因可以包括编码细胞外抗原结合结构域的核苷酸序列。在一些方面，转基因含有被接合或连接的、可以来自不同基因、编码序列或外显子或其部分的、编码miniCAR的不同区域或结构域或部分的核苷酸序列。
在一些方面，插入或整合于基因组中的靶位置处的转基因(其是编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的目的核酸序列，包括编码和/或非编码序列和/或其部分编码序列)也可以称为“转基因”、“转基因序列”、“异源序列”、“外源核酸序列”、“异源序列”或“供体序列”。在一些方面，转基因是对于T细胞(例如，人T细胞)的内源基因组序列(如基因组中特定靶基因座或靶定位处的内源基因组序列)为外源或异源的核酸序列。在一些方面，转基因是与T细胞(例如，人T细胞)的靶基因座或靶定位处的内源基因组序列相比被修饰或不同的序列。在一些方面，转基因是源自不同的基因、物种和/或来源的核酸序列，或者与来自不同基因、物种和/或来源的核酸序列相比被修饰的核酸序列。在一些方面，转基因是源自相同物种的不同基因座(例如，不同基因组区域或不同基因)的序列的序列。在一些方面，示例性miniCAR包括本文例如在第III.B节中所述的任一种。
在一些实施方案中，核酸酶诱导的HDR导致插入转基因(也称为“异源序列”或“转基因序列”)，用于表达用于靶向插入的转基因。模板多核苷酸序列通常与其所在的基因组序列不同。模板多核苷酸序列可以含有侧接有两个同源性区域的非同源序列，以允许在目的位置进行有效HDR。另外，模板多核苷酸序列可以包含载体分子，所述载体分子含有与细胞染色质中的目的区域不同源的序列。模板多核苷酸序列可以含有与细胞染色质具有同源性的几个不连续区域。例如，对于通常在目的区域中不存在的序列的靶向插入，所述序列可以存在于转基因中并且侧接有与目的区域中的序列具有同源性的区域。
在一些方面，转基因是对任选地人T细胞的内源基因组恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的开放阅读框而言是外源或异源的序列。在一些方面，在如下模板多核苷酸存在下进行的HDR产生编码miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述模板多核苷酸含有与一个或多个同源臂连接的转基因，所述一个或多个同源臂与内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)靶位点附近的序列同源。
在一些实施方案中，转基因编码miniCAR的各种区域、结构域或链以及本文在第III.B节中所述的区域、结构域或链(如结合结构域)的全部或一部分。
在一些方面，转基因是嵌合序列，其包含通过连接来自不同基因、物种和/或来源的不同核酸序列而产生的序列。在一些方面，转基因含有被接合或连接的、来自不同基因、编码序列或外显子或其部分的、编码不同区域或结构域或其部分的核苷酸序列。在一些方面，用于靶向整合的转基因编码多肽或其片段。
在一些实施方案中，转基因可以编码嵌合受体(如微型嵌合抗原受体(miniCAR))的一部分，如其结构域或区域，例如细胞外区域，如细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，转基因编码miniCAR的一部分，例如miniCAR的抗原结合结构域。示例性miniCAR包括下文在第III.B节中所述的那些。
在一些方面，转基因还含有非编码的调节或控制序列，例如用于允许、调节和/或调控所编码的多肽或其片段的表达所需的序列或修饰多肽所需的序列。在一些实施方案中，如果转基因源自基因组序列，则与基因组中的相应核酸相比，转基因不包含内含子或缺乏一个或多个内含子。在一些实施方案中，转基因不包含内含子。在一些实施方案中，转基因含有编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的序列，其中转基因的全部或一部分是密码子优化的，例如用于在人细胞中表达。
在一些实施方案中，转基因(包括编码区和非编码区)的长度在或在约100至约10,000个碱基对之间，如约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对。在一些实施方案中，转基因的长度受可以制备、合成或组装和/或引入细胞中的多核苷酸的最大长度或病毒载体的容量限制。在一些方面，转基因的长度可以根据模板多核苷酸的最大长度和/或所需的一个或多个同源臂的长度而变化。
在一些实施方案中，遗传破坏诱导的HDR导致将转基因插入或整合于基因组中的靶位置处。模板多核苷酸序列通常与其所靶向的基因组序列不同。模板多核苷酸序列可以含有侧接有两个同源性区域的转基因，以允许在目的位置进行有效HDR。模板多核苷酸序列可以含有与基因组DNA具有同源性的几个不连续区域。例如，对于通常在目的区域中不存在的序列的靶向插入，所述序列可以存在于转基因中并且侧接有与目的区域中的序列具有同源性的区域。在一些实施方案中，转基因编码miniCAR的一部分，如抗原结合结构域。
在一些方面，在通过HDR靶向整合转基因后，细胞的基因组含有经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述基因座包含编码功能性miniCAR的核酸序列。在一些方面，转基因还含有编码其他分子的核苷酸序列和/或调节或控制元件(例如，异源启动子)和/或多顺反子元件。
在一些实施方案中，转基因还包括编码信号肽的信号序列、调节或控制元件(如启动子)和/或一个或多个多顺反子元件(例如，核糖体跳跃元件或内部核糖体进入位点(IRES))。在一些实施方案中，可以将信号序列置于编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的核苷酸序列的5’处。
由转基因编码的示例性区域、结构域或链在下文有描述，并且还可以是本文在第III.B节中所述的任何区域或结构域。
(i)信号序列
在一些实施方案中，转基因包括编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽，例如来自不同基因或物种的信号肽或不同于内源恒定CD3-IgSF链基因座的信号肽的信号肽。在一些方面，示例性信号序列包括SEQ ID NO:84或87所示的并且编码SEQ ID NO:85所示的信号肽或SEQ ID NO:86所示的CD8α信号肽的GMCSFRα链信号序列。所编码的前体多肽(例如前体miniCAR)可以包括通常在所编码多肽的N末端的信号肽序列。在成熟形式的所表达的多肽中，将信号序列从多肽的其余部分切割下来。在一些方面，将信号序列置于异源调节或控制元件(如果存在的话，例如启动子，如异源启动子，例如不是源自恒定CD3-IgSF链基因座的启动子)的3’处。在一些方面，将信号序列置于一个或多个多顺反子元件(如果存在的话，例如，编码核糖体跳跃序列和/或内部核糖体进入位点(IRES)的核苷酸序列)的3’处。在一些方面，可以将信号序列置于转基因中编码细胞外区域(例如，抗原结合结构域)的一种或多种组分的核苷酸序列的5’处。在一些实施方案中，信号序列是存在于转基因中的最5'区，并且与同源臂之一连接。
(ii)结合结构域
在一些方面，转基因含有编码嵌合受体(如miniCAR)的细胞外区域的序列。在一些实施方案中，转基因序列编码细胞外结合结构域，如特异性结合抗原或配体的结合结构域，例如，细胞外抗原结合结构域。
由转基因编码的miniCAR的示例性细胞外区域或结合结构域(例如，抗原结合结构域)在下文有描述，并且可以包括任何细胞外区域或结合结构域，例如下文在第III.B.1节中所述的示例性miniCAR的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，转基因编码对特定抗原或配体(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的miniCAR的一部分。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织(例如，在健康细胞或组织中)相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤细胞或致病细胞)上选择性表达或过表达。在一些实施方案中，结合结构域能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原。在一些方面，转基因含有编码miniCAR的抗原结合结构域的序列。在一些实施方案中，转基因编码细胞外结合结构域，如特异性结合抗原或配体的结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含多肽、配体、受体、配体结合结构域、受体结合结构域、抗原、表位、抗体、抗原结合结构域、表位结合结构域、抗体结合结构域、标签结合结构域或前述任一种的片段。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些方面，抗原被结合结构域(如配体结合结构域或抗原结合结构域)识别。在一些方面，转基因编码含有一个或多个抗原结合结构域的细胞外区域。在一些实施方案中，由转基因编码的示例性结合结构域包括抗体及其抗原结合片段，包括scFv或sdAb。在一些实施方案中，抗原结合片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，结合结构域是或包含单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，结合结构域是或包含单结构域抗体(sdAb)。
由转基因编码的示例性抗原和抗原结合结构域或配体结合结构域包括本文在第III.B.1节中所述的那些。在一些方面，所编码的miniCAR含有结合结构域，所述结合结构域是或包含TCR样抗体或其片段(如scFv)，其特异性识别作为主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)。在一些方面，转基因可以编码作为TCR样抗体或其片段的结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域是多特异性(如双特异性)结合结构域。
在一些方面，在转基因中，将编码抗原结合结构域的核苷酸序列置于信号序列的3’处和3’同源臂的5’处(即，编码抗原结合结构域的核苷酸序列是转基因的最3’序列)。在一些方面，在转基因中，将编码抗原结合结构域的核苷酸序列置于信号序列与编码接头(如果存在于转基因中的话)的核苷酸之间。在一些方面，将编码接头的核苷酸序列置于编码结合结构域的核苷酸序列与3’同源臂之间。
在一些方面，可以将编码一个或多个结合结构域的核苷酸序列置于转基因中的信号序列(如果存在的话)的3’处。在一些方面，可以将编码一个或多个结合结构域的核苷酸序列置于转基因中编码一个或多个调节或控制元件的核苷酸序列的3’处。在一些方面，可以将编码一个或多个结合结构域的核苷酸序列置于转基因中编码接头的核苷酸序列(如果存在的话)的5’处。
在一些实施方案中，转基因还包含一个或多个多顺反子元件(例如，核糖体跳跃序列和/或内部核糖体进入位点(IRES))。在一些方面，转基因还包括通常位于转基因的最5'部分(例如，信号序列的5')处的调节或控制元件(如启动子)。在一些方面，编码一种或多种另外的分子或另外的结构域或区域的核苷酸序列可以被包括在多核苷酸的转基因部分中。在一些方面，可以将编码一种或多种另外的分子或另外的结构域或区域的核苷酸序列置于编码抗原结合结构域的核苷酸序列的5’处。在一些方面，编码一种或多种另外的分子或另外的结构域、区域或链的核苷酸序列在编码抗原结合结构域的核苷酸序列的上游。
(iii)接头
在一些实施方案中，转基因包括编码接头的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的细胞外区域(例如抗原结合结构域)包含接头，任选地其中所述接头可操作地连接在miniCAR的细胞外抗原结合结构域和跨膜区域(例如来自内源恒定CD3-IgSF链基因座，例如CD3E、CD3D或CD3G基因座)之间。在一些方面，接头可以连接含有抗原结合结构域(例如，由转基因编码)的细胞外部分和miniCAR的其他区域或结构域，如受体的细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域的全部或一部分，例如由内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)编码。在一些方面，转基因包括编码接头的序列。在一些实施方案中，转基因序列不包括编码接头的序列。
可以由转基因序列编码的示例性接头包括柔性肽接头，以及可以含有在下文在第III.B.2节中所述的示例性miniCAR中的任何接头。
在一些方面，可以将编码接头的核苷酸序列置于转基因中编码抗原结合结构域的核苷酸序列的3’处。在一些方面，可以将编码接头的核苷酸序列置于3’同源臂的5’处，即，编码接头的核苷酸序列是转基因的最3’序列并且与3’同源臂直接相邻。
(iv)亲和标签
在一些实施方案中，转基因包括编码亲和标签的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的细胞外区域(例如抗原结合结构域)包含亲和标签，任选地其中所述亲和标签定位于miniCAR的细胞外抗原结合结构域和跨膜区域(例如来自内源恒定CD3-IgSF链基因座，例如CD3E、CD3D或CD3G基因座)之间。在一些实施方案中，亲和标签定位于细胞外抗原结合结构域与接头之间。在一些实施方案中，亲和标签定位于接头与恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的细胞外区域之间。在一些方面，除了接头以外或代替接头，亲和标签定位于含有抗原结合结构域(例如，由转基因编码)的细胞外部分与miniCAR的其他区域或结构域(如受体的细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域的全部或一部分，例如由内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)编码)之间。在一些方面，转基因包括编码亲和标签的序列。在一些实施方案中，转基因序列不包括编码亲和标签的序列。
可以由转基因序列编码的示例性亲和标签包括链霉亲和素结合肽，以及可以含有在下文第III.B.3节中所述的示例性miniCAR中的任何亲和标签。
在一些方面，可以将编码亲和标签的核苷酸序列置于转基因中编码抗原结合结构域的核苷酸序列的5’处。在一些方面，可以将编码亲和标签的核苷酸序列置于转基因中编码抗原结合结构域的核苷酸序列的3’处。在一些方面，可以将编码亲和标签的核苷酸序列置于转基因中编码接头的核苷酸序列的5’处。在一些方面，可以将编码亲和标签的核苷酸序列置于转基因中编码接头的核苷酸序列的3’处。在一些方面，可以将编码亲和标签的核苷酸序列置于3’同源臂的5’处，即，编码亲和标签的核苷酸序列是转基因的最3’序列并且与3’同源臂直接相邻。
(v)另外的分子，例如标记物
在一些实施方案中，转基因还包括编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列，所述一种或多种另外的分子例如抗体、抗原、转导标记物或替代标记物(例如，截短的细胞表面标记物)、酶、因子、转录因子、抑制性肽、生长因子、核受体、激素、淋巴因子、细胞因子、趋化因子、可溶性受体、可溶性细胞因子受体、可溶性趋化因子受体、报告分子、另外的miniCAR、前述任一种的功能片段或功能变体以及前述的组合。在一些方面，可以将此类编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列置于编码miniCAR的细胞外抗原结合结构域的核苷酸序列的5’处。在一些方面，编码一种或多种其他分子的序列和编码miniCAR的区域或结构域的核苷酸序列由调节序列(如2A核糖体跳跃元件和/或启动子序列)隔开。
在一些实施方案中，转基因还包括编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列。在一些方面，一种或多种另外的分子包括一种或多种标记物。在一些实施方案中，一种或多种标记物包括转导标记物、替代标记物和/或选择标记物。在一些实施方案中，转基因还包括可以如通过促进转移细胞的活力和/或功能改善疗法的功效的核酸序列；提供用于选择和/或评价细胞的基因标记物如以便在体内评估存活或定位的核酸序列；例如通过使细胞对体内阴性选择易感来改善安全性的核酸序列，如以下文献中所述：Lupton等人,Mol.and CellBiol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见WO1992008796和WO 1994028143(描述了使用将显性阳性选择标记物与阴性选择标记物融合而获得的双功能选择融合基因)和美国专利号6,040,177。在一些方面，标记物包括本文例如在本节或第II或III.B节中所述的任何标记物，或本文例如在第III.B.1节中所述的任何另外的分子和/或受体多肽。在一些实施方案中，另外的分子是替代标记物，任选地是截短型受体，任选地其中截短型受体缺乏细胞内信号传导结构域和/或当与其配体结合时不能介导细胞内信号传导。
在一些实施方案中，标记物是转导标记物或替代标记物。转导标记物或替代标记物可用于检测已经引入多核苷酸(例如编码miniCAR的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记物可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记物是被制备以在细胞表面上与miniCAR共表达的蛋白质。在任何实施方案中的一些中，这种替代标记物是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记物由编码miniCAR的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码miniCAR的核酸序列与编码标记物的核酸序列可操作地连接，任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽(如2A序列，如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还可以用于促进细胞自杀。
示例性替代标记物可以包括细胞表面多肽的截短形式，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:7或16中列出的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记物(例如替代标记物)包括全部或部分(例如截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。在一些实施方案中，标记物是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记物是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
示例性替代标记物可以包括细胞表面多肽的截短形式，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:7或16中列出的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记物(例如替代标记物)包括全部或部分(例如截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。在一些实施方案中，标记物是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记物是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记物是选择标记物。在一些实施方案中，选择标记物是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，所述身分子，例如非自身蛋白，即不被将被过继转移细胞的宿主免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，标记物不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记物(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记物可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞反应的共刺激或免疫检查点分子。
在一些实施方案中，转基因包括编码作为免疫调节剂的一种或多种另外的分子的序列。在一些实施方案中，免疫调节分子选自免疫检查点调节剂、免疫检查点抑制剂、细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂能够抑制或阻断免疫检查点分子的功能或涉及免疫检查点分子的信号传导途径。在一些实施方案中，免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM3、VISTA、腺苷受体或胞外腺苷，任选地腺苷2A受体(A2AR)或腺苷2B受体(A2BR)、或涉及前述任一种的腺苷或途径。其他示例性的另外的分子包括表位标签、可检测分子如荧光或发光蛋白、或介导增强的细胞生长和/或基因扩增的分子(例如，二氢叶酸还原酶)。表位标签包括例如一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。在一些实施方案中，另外的分子可以包括非编码序列、抑制性核酸序列(如反义RNA、RNAi、shRNA和微RNA(miRNA))或核酸酶识别序列。
(vi)多顺反子元件和调节或控制元件
在一些方面，可以插入转基因(包括编码miniCAR的一部分(例如，miniCAR的抗原结合结构域)的转基因)，使得其表达由整合位点处的内源启动子(即，驱动内源恒定CD3-IgSF基因座基因表达的启动子)驱动。在多肽编码序列无启动子的一些实施方案中，则通过内源启动子或目的区域中的其他控制元件驱动的转录来确保整合的转基因的表达。例如，编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因可以在没有启动子，但是与内源恒定CD3-IgSF基因座的编码序列同框的情况下插入，使得整合的转基因的表达受到整合位点处的内源启动子和/或其他调节元件的转录的控制。在一些实施方案中，将多顺反子元件(如核糖体跳跃元件/自我切割元件(例如，2A元件或内部核糖体进入位点(IRES)))置于编码miniCAR的一部分的转基因的上游，使得多顺反子元件与恒定CD3-IgSF基因座处的内源开放阅读框的一个或多个外显子框内放置，使得编码miniCAR的转基因的表达与内源恒定CD3-IgSF基因座启动子可操作地连接。在一些实施方案中，转基因不包含编码3'UTR的序列。在一些实施方案中，在将转基因整合至内源恒定CD3-IgSF基因座中后，转基因被整合于内源恒定CD3-IgSF基因座的3'UTR的上游，使得编码miniCAR的信息含有内源恒定CD3-IgSF基因座的3'UTR，其例如来自内源恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框或其部分序列。在一些实施方案中，编码miniCAR的剩余部分的开放阅读框或其部分序列包含内源恒定CD3-IgSF基因座的3'UTR。
在一些实施方案中，将“串联”盒整合至所选位点中。在一些实施方案中，一个或多个“串联”盒编码一种或多种多肽或因子，它们各自独立地受调节元件控制或全部作为多顺反子表达系统而受控。在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，转录单元可以被工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物。可替代地，在一些情况下，单一启动子可以引导在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个多肽的RNA的表达，所述多肽通过编码自我切割肽(例如，2A序列)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶)的序列彼此隔开，如本文所述。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被处理成单独蛋白质。在一些实施方案中，“串联盒”包括盒的包含无启动子序列的第一组分、之后的转录终止序列、以及编码自主表达盒或多顺反子表达序列的第二序列。在一些实施方案中，串联盒编码两种或更多种不同的多肽或因子，例如，miniCAR的抗原结合结构域和一种或多种另外的分子。在一些实施方案中，将编码miniCAR的抗原结合结构域和一种或多种另外的分子的核酸序列作为串联表达盒或双顺反子盒或多顺反子盒引入一个靶DNA整合位点中。
在一些实施方案中，转基因(例如，外源核酸序列)还含有不是或不同于内源恒定CD3-IgSF链基因座的调节或控制元件的一个或多个异源或外源调节或控制元件(例如，顺式调节元件)。在一些实施方案中，异源或外源调节或控制元件与编码转基因的另外的组分的核酸序列可操作地连接，所述核酸序列是例如除编码miniCAR的核酸序列之外的编码另外的多肽的核酸序列。
在一些方面，异源调节或控制元件包括如启动子、增强子、内含子、隔离子、多腺苷酸化信号、转录终止序列、Kozak共有序列、多顺反子元件(例如，内部核糖体进入位点(IRES)、2A序列)、对应于信使RNA(mRNA)的非翻译区(UTR)的序列以及剪接受体或供体序列，如不是或不同于恒定CD3-IgSF链基因座处的调节或控制元件的那些。在一些实施方案中，异源调节或控制元件包括启动子、增强子、内含子、多腺苷酸化信号、Kozak共有序列、剪接受体序列和/或剪接供体序列。在一些实施方案中，转基因包含启动子，所述启动子是异源的和/或不典型地存在于靶位点处或附近，例如以控制转基因中另外的组分的表达。
在一些情况下，多顺反子元件(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致在2A序列末端与相邻下游肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004)；也称为自我切割元件)。这允许插入的转基因受整合位点处的内源启动子(如恒定CD3-IgSF链基因座启动子)的转录的控制。示例性多顺反子元件包括来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:93)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:92)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:88或89)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:90、91或94)，如美国专利公开号20070116690中所述。在一些实施方案中，模板多核苷酸包括转基因(例如，编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的核酸)上游的P2A核糖体跳跃元件(SEQ ID NO:3所示的序列)。
在一些实施方案中，编码miniCAR的抗原结合结构域的转基因和/或编码另外的分子的序列独立地包含一个或多个多顺反子元件。在一些实施方案中，一个或多个多顺反子元件在编码miniCAR的抗原结合结构域的转基因和/或编码另外的分子的序列的上游。在一些实施方案中，一个或多个多顺反子元件定位于编码miniCAR的抗原结合结构域的转基因和/或编码另外的分子的序列之间。
在一些实施方案中，编码另外的分子的序列与异源调节或控制元件可操作地连接。在一些方面，异源调节或控制元件包含异源启动子。在一些实施方案中，异源启动子选自组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子和/或组织特异性启动子。在一些实施方案中，调节或控制元件是启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子选自RNA pol I、pol II或pol III启动子。在一些实施方案中，启动子由RNA聚合酶II识别(例如CMV、SV40早期区域或腺病毒主要晚期启动子)。在一些实施方案中，启动子由RNA聚合酶III识别(例如，U6或H1启动子)。在一些实施方案中，启动子是或包含组成型启动子。示例性组成型启动子包括例如猿病毒40早期启动子(SV40)、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在一些实施方案中，异源启动子是或包含人延伸因子1α(EF1α)启动子或MND启动子或其变体。
在一些实施方案中，启动子是受调控的启动子(例如，诱导型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子或阻抑型启动子。在一些实施方案中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，或者是其类似物，或者能够被Lac阻遏子或其类似物结合或识别。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在一些情形中，启动子仅在特定细胞类型中表达(例如，T细胞或B细胞或NK细胞特异性启动子)。
在一些实施方案中，启动子是或包含组成型启动子。示例性组成型启动子包括例如猿病毒40早期启动子(SV40)、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在一些实施方案中，组成型启动子是合成或修饰的启动子。在一些实施方案中，启动子是或包含MND启动子，它是一种含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的经修饰的MoMuLV LTR的U3区的合成启动子(参见Challita等人(1995)J.Virol.69(2):748-755)。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在一些情况下，启动子仅在特定细胞类型中驱动表达(例如，T细胞或B细胞或NK细胞特异性启动子)。
在一些实施方案中，启动子是病毒启动子。在一些实施方案中，启动子是非病毒启动子。在一些情况下，启动子选自人延伸因子1α(EF1α)启动子或其修饰形式(具有HTLV1增强子的EF1α启动子)或MND启动子。在一些实施方案中，多核苷酸不包括异源或外源调节元件，例如启动子。在一些实施方案中，启动子是双向启动子(参见例如，WO2016/022994)。
在一些实施方案中，转基因还可以包括剪接受体序列。示例性的已知剪接受体位点序列包括例如CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG(SEQ ID NO:95)(来自人HBB基因)和TTTCTCTCCACAG(SEQ ID NO:96)(来自人IgG基因)。
(vii)示例性转基因
在一些实施方案中，示例性转基因按5'到3'顺序包括信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，示例性转基因按5'到3'顺序包括多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，转基因按5'到3'顺序包括多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和编码接头的核苷酸序列。
在一些实施方案中，示例性转基因按5'到3'顺序包括多顺反子元件(例如，2A元件)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列和编码抗原结合结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，示例性转基因按5'到3'顺序包括多顺反子元件(例如，2A元件)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和编码接头的核苷酸序列。
在一些实施方案中，示例性转基因按5'到3'顺序包括异源调节元件(例如，异源启动子)、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，示例性转基因按5'到3'顺序包括异源调节元件(例如，异源启动子)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列和编码抗原结合结构域的核苷酸序列。在一些实施方案中，示例性转基因按5'到3'顺序包括异源调节元件(例如，异源启动子)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和编码接头的核苷酸序列。
在一些方面，编码抗原结合结构域的示例性核苷酸序列、编码接头的核苷酸序列、信号序列、异源调节元件(例如，异源启动子)、多顺反子元件和一种或多种另外的分子包括本文所述的任一种。
b.同源臂
在一些实施方案中，模板多核苷酸在5'和3'端含有一个或多个同源序列(也称为“同源臂”)，所述同源序列与编码miniCAR的一部分、区域或结构域(如miniCAR的细胞外抗原结合结构域)的转基因连接或在所述转基因周围。在一些方面，转基因直接与一个或多个同源臂连接。同源臂允许DNA修复机制(例如，同源重组机制)识别同源性并使用模板多核苷酸作为修复的模板，并且同源臂之间的核酸序列被拷贝至被修复的DNA中，从而有效地将转基因插入或整合至基因组中同源性位置之间的整合靶位点中。
在一些实施方案中，转基因包含与一个或多个同源臂中所包含的恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的一个或多个外显子同框的核苷酸序列。在一些方面，miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)由转基因编码，而miniCAR的其余部分由内源恒定CD3-IgSF基因座编码。
在一些实施方案中，同源臂序列包括与遗传破坏(例如，恒定CD3-IgSF基因座内的靶位点)周围的基因组序列同源的序列。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含以下组分：[5'同源臂]-[转基因(异源或外源核酸序列，例如，编码miniCAR的一部分，如抗原结合结构域)]-[3'同源臂]。在一些实施方案中，5'同源臂序列包括与位于5'侧的遗传破坏附近的序列同源的连续序列。在一些实施方案中，3'同源臂序列包括与位于3'侧的遗传破坏附近的序列同源的连续序列。在一些方面，靶位点是通过能够引入遗传破坏的一种或多种药剂(例如，Cas9和靶向恒定CD3-IgSF基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)内的特定位点的gRNA)的靶向来确定的。
在一些方面，模板多核苷酸内的转基因可以用于指导靶位点和/或同源臂的定位。在一些方面，遗传破坏的靶位点可以用作设计用于HDR的模板多核苷酸和/或同源臂的指导。在一些实施方案中，遗传破坏可以被靶向于转基因的靶向整合的期望位点附近。在一些方面，同源臂被设计为靶向内源恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的外显子内的整合，并且同源臂序列是基于遗传破坏周围的期望整合位置(包括遗传破坏周围的外显子和内含子序列)确定的。在一些实施方案中，可以根据有效靶向的要求和可以使用的模板多核苷酸或载体的长度来设计靶位点的位置、一个或多个同源臂的相对位置和用于插入的转基因(异源核酸序列)。在一些方面，同源臂被设计为靶向恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的内含子内的整合。在一些方面，同源臂被设计为靶向恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的外显子内的整合。
在一些方面，恒定CD3-IgSF基因座内的靶整合位点(用于靶向整合的位点)位于内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框内。在一些实施方案中，靶整合位点在本文例如第I.A节中所述的任何靶位点处或附近。在一些方面，用于整合的靶位置在用于遗传破坏的靶位点处或周围，例如在用于遗传破坏的靶位点的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。
在一些方面，靶整合位点在内源恒定CD3-IgSF基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的开放阅读框的外显子内。在一些方面，靶整合位点在恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的内含子内。在一些方面，靶整合位点在恒定CD3-IgSF基因座的调节或控制元件(例如，启动子)内。在一些实施方案中，靶整合位点在对应于早期编码区的外显子内或紧邻其，所述外显子例如内源恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的外显子1、2、3、4或5，或者包括在外显子1、2、3、4或5内(如本文表1-表5中所述)或者在外显子1、2、3、4或5的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内的紧接转录起始位点之后的序列。在一些实施方案中，整合被靶向于内源恒定CD3-IgSF基因座的外显子2处或附近，或者在外显子2的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些方面，靶整合位点在内源恒定CD3-IgSF基因座的外显子1处或附近，例如在外显子1的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些实施方案中，靶整合位点在内源恒定CD3-IgSF基因座的外显子2处或附近，或者在外显子2的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些方面，靶整合位点在内源恒定CD3-IgSF基因座的外显子3处或附近，例如在外显子3的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些方面，靶整合位点在内源恒定CD3-IgSF基因座的外显子4处或附近，例如在外显子4的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些方面，靶整合位点在内源恒定CD3-IgSF基因座的外显子5处或附近，例如在外显子5的小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp内。在一些方面，靶整合位点在恒定CD3-IgSF基因座的调节或控制元件(例如，启动子)内。
在一些实施方案中，5'同源臂序列包括在用于遗传破坏的靶位点5’处的大约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基对的连续序列，其从内源恒定CD3-IgSF基因座的靶位点附近开始。在一些实施方案中，3'同源臂序列包括在用于遗传破坏的靶位点3’处的大约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基对的连续序列，其从内源恒定CD3-IgSF基因座的靶位点附近开始。因此，在经由HDR整合后，转基因被靶向以供整合于用于遗传破坏的靶位点(例如，内源恒定CD3-IgSF基因座的外显子或内含子内的靶位点)处或附近。
在一些方面，同源臂含有与内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框序列的一部分同源的序列。在一些方面，同源臂序列含有与内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框序列的连续部分(包括外显子和内含子)同源的序列。在一些方面，同源臂含有与内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框序列的连续部分(包括外显子和内含子)相同的序列。
在一些实施方案中，模板多核苷酸含有用于将转基因靶向整合在内源恒定CD3-IgSF基因座(本文表1-表5中所述的示例性基因组基因座序列；上文第II.A.1节中所述的示例性人mRNA序列)处的同源臂。在一些实施方案中，使用用于遗传破坏的任何药剂(例如，本文所述的靶向核酸酶和/或gRNA)引入遗传破坏。在一些实施方案中，模板多核苷酸在通过靶向核酸酶和/或gRNA引入的遗传破坏的任一侧上包含约500至1000(例如，500至900或600至700)个同源性碱基对。在一些实施方案中，模板多核苷酸包含5'同源臂序列的约500、600、700、800、900或1000个碱基对，其与恒定CD3-IgSF基因座处的遗传破坏的5'序列的500、600、700、800、900或1000个碱基对同源；转基因；以及3'同源臂序列的约500、600、700、800、900或1000个碱基对，其与恒定CD3-IgSF基因座处的遗传破坏的3'序列的500、600、700、800、900或1000个碱基对同源。
在一些方面，设计转基因与一个或多个同源臂序列之间的边界，使得在HDR和转基因的靶向整合后，转基因内编码一种或多种多肽(例如，嵌合受体的一条或多条链、一个或多个结构域或一个或多个区域)的序列与内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框序列的一个或多个外显子框内整合，和/或产生编码多肽的转基因和内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框序列的一个或多个外显子的框内融合物。在一些实施方案中，恒定CD3-IgSF基因座的基因产物的全部或一部分由内源开放阅读框的核酸序列编码，并且miniCAR的一部分(例如，抗原结合结构域)由整合的转基因编码，它们任选地由多顺反子元件(如2A元件)隔开。
在一些实施方案中，一个或多个同源臂序列包括与围绕或侧接在内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框序列内的靶位点的序列同源、基本上相同或相同的序列。在一些方面，一个或多个同源臂序列含有在内源恒定CD3-IgSF基因座处的开放阅读框的部分序列的内含子和外显子。在一些方面，5'同源臂序列和转基因的边界使得在不含有异源启动子的转基因的情况下，转基因的编码部分与内源恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的上游外显子或其部分(例如，外显子1、2、3、4或5，这取决于靶向整合的位置)框内融合。
在一些方面，5'同源臂序列和转基因的边界使得内源恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框的上游外显子或其部分(例如，外显子1、2、3、4或5)与转基因的编码部分框内融合。因此，在靶向整合、转录和翻译后，由转基因与内源恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框序列的融合DNA序列产生作为连续多肽的所编码的miniCAR。在一些方面，上游外显子或其部分编码恒定CD3-IgSF基因座的基因产物的全部或一部分。在一些方面，在靶向整合后，多顺反子元件(例如，2A元件或内部核糖体进入位点(IRES))将内源恒定CD3-IgSF基因座的开放阅读框序列与编码miniCAR的一部分的转基因隔开。在一些方面，当由经修饰的恒定CD3-IgSF基因座表达和翻译时，所述多肽被切割以产生由内源恒定CD3-IgSF基因座编码的多肽的全部或一部分和miniCAR。
在一些实施方案中，用于在内源恒定CD3-IgSF基因座CD3E处进行靶向整合的示例性5'同源臂包含SEQ ID NO:4所示的序列或者与SEQ ID NO:4展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列或者其部分序列。
在一些实施方案中，用于在内源恒定CD3-IgSF基因座CD3E处进行靶向整合的示例性3'同源臂包含SEQ ID NO:5所示的序列或者与SEQ ID NO:5展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列或者其部分序列。
在一些方面，靶位点可以决定同源臂的相对位置和序列。同源臂通常可以延伸至少远至其中可以在引入遗传破坏(例如，DSB)后通过DNA修复机制进行末端切除的区域，例如，以允许切除的单链突出端找到模板多核苷酸内的互补区。总长度可以受诸如质粒大小、病毒包装极限或构建体大小极限等参数的限制。
在一些实施方案中，同源臂在内源基因处的靶位点的任一侧上包含约500至1000(例如，600至900或700至800)个同源性碱基对。在一些实施方案中，同源臂在恒定CD3-IgSF基因座处的靶位点的5’处、在靶位点的3’处或在靶位点的5’和3’两者处包含约至少或少于或约200、300、400、500、600、700、800、900或1000个同源性碱基对。
在一些实施方案中，同源臂在恒定CD3-IgSF基因座处的靶位点的3’处包含为或约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个同源性碱基对。在一些实施方案中，同源臂在恒定CD3-IgSF基因座处的转基因和/或靶位点的3’处包含为或约100至500、200至400或250至350个同源性碱基对。在一些实施方案中，同源臂在恒定CD3-IgSF基因座的靶位点的5’处包含少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、15或10个同源性碱基对。
在一些实施方案中，同源臂在恒定CD3-IgSF基因座处的靶位点的5’处包含为或约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个同源性碱基对。在一些实施方案中，同源臂在恒定CD3-IgSF基因座处的转基因和/或靶位点的5’处包含为或约100至500、200至400或250至350个同源性碱基对。在一些实施方案中，同源臂在恒定CD3-IgSF基因座的靶位点的3’处包含少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、15或10个同源性碱基对。
在一些实施方案中，5'同源臂的3'端是与转基因的5'端相邻的位置。在一些实施方案中，5'同源臂可以从转基因的5'端向5'延伸至少为或约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个核苷酸。
在一些实施方案中，3'同源臂的5'端是与转基因的3'端相邻的位置。在一些实施方案中，3'同源臂可以从转基因的3'端向3'延伸至少为或约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个核苷酸。
在一些实施方案中，对于靶向插入，同源臂(例如，5'和3'同源臂)可以各自包含侧接最远端靶位点的序列的约1000个碱基对(bp)(例如，突变任一侧上的序列的1000bp)。
示例性同源臂长度包括至少为或约50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂长度是为或约50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000或4000-5000个核苷酸。示例性同源臂长度包括少于或少于约或为或为约50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂长度是为或约50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000或4000-5000个核苷酸。示例性同源臂长度包括从为或约100至为或约1000个核苷酸、从为或约100至为或约750个核苷酸、从为或约100至为或约600个核苷酸、从为或约100至为或约400个核苷酸、从为或约100至为或约300个核苷酸、从为或约100至为或约200个核苷酸、从为或约200至为或约1000个核苷酸、从为或约200至为或约750个核苷酸、从为或约200至为或约600个核苷酸、从为或约200至为或约400个核苷酸、从为或约200至为或约300个核苷酸、从为或约300至为或约1000个核苷酸、从为或约300至为或约750个核苷酸、从为或约300至为或约600个核苷酸、从为或约300至为或约400个核苷酸、从为或约400至为或约1000个核苷酸、从为或约400至为或约750个核苷酸、从为或约400至为或约600个核苷酸、从为或约600至为或约1000个核苷酸、从为或约600至为或约750个核苷酸或者750至为或约1000个核苷酸。
在一些任何此类实施方案中，转基因是通过引入多个T细胞中的每一个中的模板多核苷酸来整合的。在任何实施方案中的一些中，模板多核苷酸包含结构[5'同源臂]-[转基因]-[3'同源臂]。在某些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂包含与至少为或约一个靶位点周围的核酸序列同源的核酸序列。在一些实施方案中，5'同源臂包含与靶位点5’处的核酸序列同源的核酸序列。在任何实施方案中的一些中，3'同源臂包含与靶位点3’处的核酸序列同源的核酸序列。在某些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂独立地是至少为或约或至少为或约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个核苷酸，或者少于或少于约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个核苷酸。在一些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂独立地具有为或约50与为或约100之间、100与为或约250之间、250与为或约500之间、500与为或约750之间、750与为或约1000之间、1000与为或约2000之间的核苷酸。在任何此类实施方案的一些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂独立地具有为或约50与为或约100个核苷酸之间的长度、为或约100与为或约250个核苷酸之间的长度、为或约250与为或约500个核苷酸之间的长度、为或约500与为或约750个核苷酸之间的长度、为或约750与为或约1000个核苷酸之间的长度或者为或约1000与为或约2000个核苷酸之间的长度。
在任何实施方案中的一些中，5'同源臂和3'同源臂独立地具有从为或约100至为或约1000个核苷酸、从为或约100至为或约750个核苷酸、从为或约100至为或约600个核苷酸、从为或约100至为或约400个核苷酸、从为或约100至为或约300个核苷酸、从为或约100至为或约200个核苷酸、从为或约200至为或约1000个核苷酸、从为或约200至为或约750个核苷酸、从为或约200至为或约600个核苷酸、从为或约200至为或约400个核苷酸、从为或约200至为或约300个核苷酸、从为或约300至为或约1000个核苷酸、从为或约300至为或约750个核苷酸、从为或约300至为或约600个核苷酸、从为或约300至为或约400个核苷酸、从为或约400至为或约1000个核苷酸、从为或约400至为或约750个核苷酸、从为或约400至为或约600个核苷酸、从为或约600至为或约1000个核苷酸、从为或约600至为或约750个核苷酸或者从为或约750至为或约1000个核苷酸。在任何实施方案中的一些中，5'同源臂和3'同源臂独立地具有从为或约100至为或约为或约1000个核苷酸、从为或约100至为或约750个核苷酸、从为或约100至为或约600个核苷酸、从为或约100至为或约400个核苷酸、从为或约100至为或约300个核苷酸、从为或约100至为或约200个核苷酸、从为或约200至为或约1000个核苷酸、从为或约200至为或约750个核苷酸、从为或约200至为或约600个核苷酸、从为或约200至为或约400个核苷酸、从为或约200至为或约300个核苷酸、从为或约300至为或约1000个核苷酸、从为或约300至为或约750个核苷酸、从为或约300至为或约600个核苷酸、从为或约300至为或约400个核苷酸、从为或约400至为或约1000个核苷酸、从为或约400至为或约750个核苷酸、从为或约400至为或约600个核苷酸、从为或约600至为或约1000个核苷酸、从为或约600至为或约750个核苷酸或者从为或约750至为或约1000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂独立地具有为或约200、300、400、500、600、700或800个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度。在一些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂独立地具有大于为或约300个核苷酸的长度，任选地其中5'同源臂和3'同源臂独立地具有为或约400、500或600个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度。在一些实施方案中，5'同源臂和3'同源臂独立地具有大于为或约300个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，一个或多个同源臂含有与编码恒定CD3-IgSF基因座的基因产物或其片段的序列同源的核苷酸序列。在一些实施方案中，一个或多个同源臂与编码miniCAR的一部分(如抗原结合片段)的转基因框内连接(connected或linked)。
在一些实施方案中，采用替代性HDR。在一些实施方案中，在模板多核苷酸与靶位点的5'具有延伸的同源性(即，在靶位点链的5'方向上)时，替代性HDR更有效地继续进行。因此，在一些实施方案中，模板多核苷酸具有更长同源臂和更短同源臂，其中更长同源臂可以与靶位点的5'退火。在一些实施方案中，可以与靶位点的5'退火的臂距靶位点或者转基因的5'或3'端至少25、50、75、100、125、150、175、或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，可以与靶位点的5'退火的臂比可以与靶位点的3'退火的臂长至少10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，可以与靶位点的5'退火的臂比可以与靶位点的3'退火的臂长至少2x、3x、4x或5x。根据ssDNA模板是可以与完整链退火还是可以与靶向链退火，与靶位点的5'退火的同源臂分别可以位于ssDNA模板的5'端或ssDNA模板的3'端处。
类似地，在一些实施方案中，模板多核苷酸具有5'同源臂、转基因和3'同源臂，使得模板多核苷酸与靶位点的5'含有延伸的同源性。例如，5'同源臂和3'同源臂可以具有基本上相同的长度，但是转基因向靶位点5'的延伸可以远于向靶位点3'的延伸。在一些实施方案中，同源臂向靶位点5'端的延伸比向靶位点3'端的延伸远至少10％、20％、30％、40％、50％、2x、3x、4x或5x。
在一些实施方案中，在模板多核苷酸以靶位点为中心时，替代性HDR更有效地继续进行。因此，在一些实施方案中，模板多核苷酸具有两个尺寸基本上相同的同源臂。在一些实施方案中，模板多核苷酸的第一同源臂(例如，5'同源臂)的长度可以在模板多核苷酸的第二同源臂(例如，3'同源臂)的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％内。
类似地，在一些实施方案中，模板多核苷酸具有5'同源臂、转基因和3'同源臂，使得模板多核苷酸在靶位点的任一侧上延伸基本上相同的距离。例如，同源臂可以具有不同的长度，但是可以选择转基因以对此进行补偿。例如，转基因向靶位点5'的延伸可以远于其向靶位点3'的延伸，但是靶位点5'的同源臂短于靶位点3'的同源臂以进行补偿。反过来也是可能的，例如，转基因向靶位点3'的延伸可以远于其向靶位点5'的延伸，但是靶位点3'的同源臂短于靶位点5'的同源臂以进行补偿。
在一些实施方案中，包含转基因和一个或多个同源臂的模板多核苷酸的长度在或在约1000至约20,000个碱基对之间，如约1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000个碱基对。在一些实施方案中，模板多核苷酸长度受可以制备、合成或组装和/或引入细胞中的多核苷酸的最大长度或病毒载体的容量以及多核苷酸或载体的类型限制。在一些方面，模板多核苷酸的有限容量可以决定转基因和/或一个或多个同源臂的长度。在一些方面，转基因和一个或多个同源臂的组合总长度必须在多核苷酸或载体的最大长度或容量内。例如，在一些方面，模板多核苷酸的转基因部分是约1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000个碱基对，并且如果模板多核苷酸的最大长度是约5000个碱基对，则序列的剩余部分可以在一个或多个同源臂之间划分，例如，使得3'或5'同源臂可以是大约500、750、1000、1250、1500、1750或2000个碱基对。
c.示例性模板多核苷酸
在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸按5'到3'顺序包括5'同源臂、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和3'同源臂。在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸按5'到3'顺序包括5'同源臂、多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和3'同源臂。在一些实施方案中，转基因按5'到3'顺序包括5'同源臂、多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列、编码接头的核苷酸序列和3'同源臂。
在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸按5'到3'顺序包括5'同源臂、多顺反子元件(例如，2A元件)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和3'同源臂。在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸按5'到3'顺序包括5'同源臂、多顺反子元件(例如，2A元件)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列、编码接头的核苷酸序列和3'同源臂。
在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸按5'到3'顺序包括5'同源臂、异源调节元件(例如，异源启动子)、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和3'同源臂。在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸按5'到3'顺序包括5'同源臂、异源调节元件(例如，异源启动子)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列和3'同源臂。在一些实施方案中，示例性模板多核苷酸按5'到3'顺序包括5'同源臂、异源调节元件(例如，异源启动子)、编码一种或多种另外的分子的核苷酸序列、任选地多顺反子元件(例如，2A元件)、信号序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列、编码接头的核苷酸序列和3'同源臂。
在一些方面，5'同源臂的示例性序列、3'同源臂、编码抗原结合结构域的核苷酸、编码接头的核苷酸序列、信号序列、异源调节元件(例如，异源启动子)、多顺反子元件、一种或多种另外的分子包括本文所述的任一种。
3.模板多核苷酸的递送
在一些实施方案中，将多核苷酸(如含有编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的转基因序列的模板多核苷酸，例如本文第I.B.2节中所述)以核苷酸形式(例如，作为多核苷酸或载体)引入细胞中。在特定实施方案中，多核苷酸含有编码miniCAR的一部分的转基因序列和一个或多个同源臂，并且可以被引入细胞中用于同源定向修复(HDR)介导的转基因序列的整合。
在一些方面，所提供的实施方案细胞的基因工程化，通过引入能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂或其组分和模板多核苷酸，以诱导HDR和转基因序列的靶向整合。在一些方面，将一种或多种药剂和模板多核苷酸同时递送。在一些方面，将一种或多种药剂和模板多核苷酸依序递送。在一些实施方案中，在递送多核苷酸之前递送一种或多种药剂。
在一些实施方案中，除了能够诱导靶向遗传破坏的一种或多种药剂(例如，核酸酶和/或gRNA)以外，还将模板多核苷酸引入细胞中用于工程化。在一些实施方案中，可以在将能够诱导靶向遗传破坏的一种或多种药剂的一种或多种组分引入细胞中之前、同时或之后递送一种或多种模板多核苷酸。在一些实施方案中，将一种或多种模板多核苷酸与药剂同时递送。在一些实施方案中，在药剂之前，例如在模板多核苷酸之前数秒至数小时至数天，包括但不限于在药剂之前1至60分钟(或其间的任何时间)、在药剂之前1至24小时(或其间的任何时间)或在药剂之前超过24小时，递送模板多核苷酸。在一些实施方案中，在药剂之后，在模板多核苷酸之后数秒至数小时至数天，包括在递送药剂之后立即，例如在递送药剂之后在约30秒至4小时之间，如约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、6分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时或4小时，和/或优选地在递送药剂的4小时内，递送模板多核苷酸。在一些实施方案中，在递送药剂之后超过4小时递送模板多核苷酸。在一些实施方案中，模板多核苷酸是在引入一种或多种药剂之后为或约2小时引入。
在一些实施方案中，可以使用与能够诱导靶向遗传破坏的一种或多种药剂(例如，核酸酶和/或gRNA)相同的递送系统来递送模板多核苷酸。在一些实施方案中，可以使用与能够诱导靶向遗传破坏的一种或多种药剂(例如，核酸酶和/或gRNA)不同的递送系统来递送模板多核苷酸。在一些实施方案中，与一种或多种药剂同时递送模板多核苷酸。在其他实施方案中，在递送一种或多种药剂之前或之后的不同时间递送模板多核苷酸。可以使用本文在第I.A.3节中(例如，在表6和表7中)所述的用于递送能够诱导靶向遗传破坏的一种或多种药剂(例如，核酸酶和/或gRNA)中的核酸的任何递送方法来递送模板多核苷酸。
在一些实施方案中，将一种或多种药剂和模板多核苷酸以相同的形式或方法递送。例如，在一些实施方案中，一种或多种药剂和模板多核苷酸均包含于载体(例如病毒载体)中。在一些实施方案中，模板多核苷酸在与Cas9和gRNA相同的载体骨架(例如，AAV基因组、质粒DNA)上编码。在一些方面，一种或多种药剂和模板多核苷酸呈不同的形式，例如用于Cas9-gRNA药剂的核糖核酸-蛋白质复合物(RNP)以及用于模板多核苷酸的线性DNA，但它们是使用相同的方法递送。
在一些实施方案中，模板多核苷酸是线性或环状核酸分子，如线性或环状DNA或线性RNA，并且可以使用本文在第I.A.3节(例如，本文的表6和表7)中所述的用于将核酸分子递送至细胞中的任何方法来递送。
在特定实施方案中，将多核苷酸(例如，模板多核苷酸)以核苷酸形式(例如，作为非病毒载体或在非病毒载体内)引入细胞中。在一些实施方案中，非病毒载体是或包括多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸，其适合于通过用于基因递送的任何合适的和/或已知的非病毒方法进行转导和/或转染，所述非病毒方法例如但不限于显微注射、电穿孔、瞬时细胞压缩或挤压(如Lee等人(2012)Nano Lett 12:6322-27所述)、脂质介导的转染、肽介导的递送(例如，细胞穿透肽)、或其组合。在一些实施方案中，通过本文所述的非病毒方法，如本文在表7中列出的非病毒方法，将非病毒多核苷酸递送至细胞中。
在一些实施方案中，模板多核苷酸序列可以包含于载体分子中，所述载体分子包含与基因组DNA中的目的区域不同源的序列。在一些实施方案中，病毒是DNA病毒(例如，dsDNA或ssDNA病毒)。在一些实施方案中，病毒是RNA病毒(例如，ssRNA病毒)。示例性病毒载体/病毒包括例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒、或本文其他地方所述的任何病毒。可以将多核苷酸作为载体分子的部分引入细胞中，所述载体分子具有另外的序列，如例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，模板多核苷酸可以作为裸核酸来引入，作为与诸如脂质体、纳米颗粒或泊洛沙姆等材料复合的核酸来引入，或者可以通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷慢病毒(IDLV))来递送。
在一些实施方案中，可以使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将模板多核苷酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体将模板多核苷酸转移至T细胞中，如γ-逆转录病毒载体(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557)或HIV-1来源的慢病毒载体。
II.核酸、载体和递送
在一些实施方案中，提供了多核苷酸，如用于将转基因靶向于特定基因组靶位置(如在恒定的CD3-IgSF链基因座，例如CD3E、CD3D或CD3G处)的模板多核苷酸。在一些实施方案中，提供了本文在第I.B节中所述的任何模板多核苷酸。在一些实施方案中，模板多核苷酸含有转基因和用于靶向整合的同源臂，所述转基因包括编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)和任选的接头、多肽和/或因子的核酸序列。在一些实施方案中，模板多核苷酸含有转基因和用于在恒定CD3-IgSF链基因座处靶向整合的同源臂，所述转基因包括miniCAR的抗原结合结构域的核酸序列。在一些实施方案中，模板多核苷酸可以包含于载体中。
在一些实施方案中，将多核苷酸(如编码本文所述的转基因的模板多核苷酸)以核苷酸形式(如多核苷酸或载体)引入细胞中。在特定实施方案中，多核苷酸含有转基因，所述转基因包括编码结合结构域(例如，抗原结合结构域)的序列。在某些实施方案中，将用于遗传破坏的一种或多种药剂或其组分以核酸形式(如多核苷酸和/或载体)引入细胞中。在一些实施方案中，可以使用各种递送方法以各种形式递送用于工程化的组分，所述各种递送方法包括如本文在第I.A.3节以及表6和表7中所述的用于递送一种或多种药剂的任何合适的方法。还提供了编码能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂(例如，本文在第I.A节中所述的任一种)的一种或多种组分的一种或多种多核苷酸(如核酸分子)。还提供了含有转基因序列的一种或多种模板多核苷酸(例如，本文在章节I.B.2中所述的任一种)。还提供了包括一种或多种此类多核苷酸(如模板多核苷酸或编码能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂的一种或多种组分的多核苷酸)的载体(如用于基因工程化细胞以供靶向整合转基因的载体)。
在一些实施方案中，能够诱导遗传破坏的药剂可以编码于一种或多种多核苷酸中。在一些实施方案中，药剂的组分(如Cas9分子和/或gRNA分子)可以编码于一种或多种多核苷酸中，并被引入细胞中。在一些实施方案中，编码药剂的一种或多种组分的多核苷酸可以被包括在载体中。
在一些实施方案中，载体可以包含编码Cas9分子和/或gRNA分子的序列和/或模板多核苷酸。在一些方面，载体还可以包含如与Cas9分子序列融合的编码信号肽(如用于核定位、核仁定位、线粒体定位)的序列。例如，载体可以包含与编码Cas9分子的序列融合的核定位序列(如来自SV40)。在一些实施方案中，提供了用于基因工程化细胞以便靶向整合多核苷酸(如第I.B.2节中所述的模板多核苷酸)中所含有的转基因序列的载体。
在特定实施方案中，一个或多个调节/控制元件(如启动子、增强子、内含子、多腺苷酸化信号、Kozak共有序列、内部核糖体进入位点(IRES)、2A序列和剪接受体或供体)可以被包括在载体中。在一些实施方案中，启动子选自RNA pol I、pol II或pol III启动子。在一些实施方案中，启动子由RNA聚合酶II识别(如CMV、SV40早期区域或腺病毒主要晚期启动子)。在另一个实施方案中，启动子由RNA聚合酶III识别(如U6或H1启动子)。
在某些实施方案中，启动子是受调控的启动子(如诱导型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子或阻抑型启动子。在一些实施方案中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，或者是其类似物，或者能够被Lac阻遏子或四环素阻遏子或其类似物结合或识别。
在一些实施方案中，启动子是或包含组成型启动子。示例性组成型启动子包括例如猿病毒40早期启动子(SV40)、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在一些实施方案中，组成型启动子是合成或修饰的启动子。在一些实施方案中，启动子是或包含MND启动子，它是合成启动子，含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的经修饰的MoMuLV LTR的U3区(SEQ ID NO:18或126所示的序列；参见Challita等人(1995)J.Virol.69(2):748-755)。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是病毒启动子。在另一个实施方案中，启动子是非病毒启动子。在一些实施方案中，示例性启动子可以包括但不限于人延伸因子1α(EF1α)启动子(如SEQ ID NO:77或118所示)或其修饰形式(具有HTLV1增强子的EF1α启动子；如SEQ IDNO:119所示)或MND启动子(如SEQ ID NO:131所示)。在一些实施方案中，多核苷酸和/或载体不包括调节元件，例如启动子。
在特定实施方案中，将多核苷酸(例如，编码转基因的多核苷酸)以核苷酸形式(例如，作为非病毒载体或在非病毒载体内)引入细胞中。在一些实施方案中，多核苷酸是DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是双链或单链多核苷酸。在一些实施方案中，非病毒载体是或包括多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸，其适合于通过用于基因递送的任何合适的和/或已知的非病毒方法进行转导和/或转染，所述非病毒方法例如但不限于显微注射、电穿孔、瞬时细胞压缩或挤压(如Lee等人(2012)Nano Lett12:6322-27所述)、脂质介导的转染、肽介导的递送或其组合。在一些实施方案中，通过本文所述的非病毒方法，如在表7中列出的非病毒方法，将非病毒多核苷酸递送至细胞中。
在一些实施方案中，载体或递送媒介物是病毒载体(例如，用于产生重组病毒)。在一些实施方案中，病毒是DNA病毒(例如，dsDNA或ssDNA病毒)。在一些实施方案中，病毒是RNA病毒(例如，ssRNA病毒)。示例性病毒载体/病毒包括例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒、或本文其他地方所述的任何病毒。
在一些实施方案中，病毒感染分裂细胞。在另一个实施方案中，病毒感染非分裂细胞。在另一个实施方案中，病毒感染分裂和非分裂两种细胞。在另一个实施方案中，病毒可以整合至宿主基因组中。在另一个实施方案中，病毒被工程化以具有降低的免疫性，例如在人体内。在另一个实施方案中，病毒有复制能力。在另一个实施方案中，病毒是复制缺陷型的，例如另外几轮病毒体复制和/或包装所需的基因的一个或多个编码区被其他基因替代或缺失。在另一个实施方案中，出于短暂诱导遗传破坏的目的，病毒引起Cas9分子和/或gRNA分子的短暂表达。在另一个实施方案中，病毒引起Cas9分子和/或gRNA分子的长期(例如，至少1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、1年、2年)或永久表达。病毒的包装容量可以例如从至少约4kb到至少约30kb变化，例如至少约5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或50kb。
在一些实施方案中，通过重组逆转录病毒来递送含有一种或多种药剂的多核苷酸和/或模板多核苷酸。在另一个实施方案中，逆转录病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒)包含例如允许整合至宿主基因组中的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录病毒有复制能力。在另一个实施方案中，逆转录病毒是复制缺陷型的，例如另外几轮病毒体复制和包装所必需的基因的一个或多个编码区被其他基因替代或缺失。
在一些实施方案中，通过重组慢病毒来递送含有一种或多种药剂的多核苷酸和/或模板多核苷酸。例如，慢病毒是复制缺陷型的，例如不包含病毒复制所需的一个或多个基因。
在一些实施方案中，通过重组腺病毒来递送含有一种或多种药剂的多核苷酸和/或模板多核苷酸。在另一个实施方案中，腺病毒被工程化以在人体内具有降低的免疫性。
在一些实施方案中，通过重组AAV来递送含有一种或多种药剂的多核苷酸和/或模板多核苷酸。在一些实施方案中，AAV可以将其基因组掺入宿主细胞(例如，如本文所述的靶细胞)的基因组中。在另一个实施方案中，AAV是自身互补的腺相关病毒(scAAV)，例如包装一起退火以形成双链DNA的两条链的scAAV。可以用于所公开的方法中的AAV血清型包括AAV1、AAV2、修饰的AAV2(例如，在Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处的修饰)、AAV3、修饰的AAV3(例如，在Y705F、Y731F和/或T492V处的修饰)、AAV4、AAV5、AAV6、修饰的AAV6(例如，在S663V和/或T492V处的修饰)、AAV7、AAV8、AAV 8.2、AAV9、AAV.rh10、修饰的AAV.rh10、AAV.rh32/33、修饰的AAV.rh32/33、AAV.rh43、修饰的AAV.rh43、AAV.rh64R1、修饰的AAV.rh64R1，并且假型化AAV(如AAV2/8、AAV2/5和AAV2/6)也可以用于所公开的方法中。
在一些实施方案中，通过杂合病毒(例如，本文所述一种或多种病毒的杂合体)来递送含有一种或多种药剂的多核苷酸和/或模板多核苷酸。
包装细胞用于形成能够感染靶细胞的病毒颗粒。这种细胞包括可以包装腺病毒的293细胞和可以包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。用于基因疗法中的病毒载体通常由将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产细胞系产生。载体通常含有包装和随后整合至宿主或靶细胞中(如果适用)所需的最小病毒序列，并且其他病毒序列被编码要表达的蛋白质(例如，Cas9)的表达盒替代。例如，用于基因疗法中的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，所述序列为在宿主或靶细胞中进行包装和基因表达所需。失去的病毒功能由包装细胞系反式提供。
此后，将病毒DNA包装在细胞系中，所述细胞系含有编码其他AAV基因(即，rep和cap)但缺乏ITR序列的辅助质粒。所述细胞系还被作为辅助者的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺少ITR序列，辅助质粒并未被大量包装。腺病毒的污染可以通过例如热处理来减少，腺病毒对热处理比AAV更敏感。
在一些实施方案中，病毒载体具有细胞类型识别的能力。例如，病毒载体可以用不同的/替代的病毒包膜糖蛋白假型化；用细胞类型特异性受体工程化(例如，对病毒包膜糖蛋白进行基因修饰以掺入靶向配体，如肽配体、单链抗体、生长因子)；和/或工程化以具有分子桥，所述分子桥具有双重特异性，其一端识别病毒糖蛋白，并且另一端识别靶细胞表面的部分(例如，配体-受体、单克隆抗体、亲和素-生物素和化学缀合)。
在一些实施方案中，病毒载体实现细胞类型特异性表达。例如，可以构建组织特异性启动子以将能够引入遗传破坏的药剂(例如，Cas9和gRNA)的表达仅限于特定靶细胞中。载体的特异性也可以通过表达的微RNA依赖性控制来介导。在一些实施方案中，病毒载体具有增加的融合病毒载体与靶细胞膜的效率。例如，可以掺入融合蛋白(如有融合能力的血凝素(HA))，以增加病毒摄取到细胞中。在一些实施方案中，病毒载体具有核定位能力。例如，可以改变需要核膜分解(在细胞分裂期间)并因此不感染非分裂细胞的病毒，以在病毒的基质蛋白中掺入核定位肽，从而使得能够转导非增殖细胞。III.表达miniCAR的工程化细胞和细胞组合物
本文提供了含有编码免疫球蛋白超家族的恒定CD3链的经修饰基因座(恒定CD3-IgSF链基因座)的基因工程化细胞。在一些方面，内源恒定CD3-IgSF链基因座编码免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)。在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包括编码嵌合受体(如微型嵌合抗原受体，在本文中也称为miniCAR)的核酸序列。在一些实施方案中，miniCAR是含有异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白。在一些方面，基因工程化细胞中的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座含有外源核酸序列(例如，转基因序列)，其编码miniCAR的一个或多个部分、区域或结构域(如抗原结合结构域)并整合到内源恒定CD3-IgSF链基因座中。
在一些方面，所提供的工程化细胞是使用本文所述的方法产生的，例如，所述方法涉及通过采用用于诱导遗传破坏的一种或多种药剂(例如，第I.A节中所述)和作为模板的用于修复的含有转基因序列的模板多核苷酸(例如，第I.B.2中所述)进行的同源依赖性修复(HDR)。在一些方面，所提供的多核苷酸(如第I.B.2节中所述的任何模板多核苷酸)可以被靶向以供整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座，以产生含有经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座的细胞，所述基因座含有编码miniCAR的核酸序列。在一些方面，所编码的miniCAR包括异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链。在一些实施方案中，通过HDR整合到内源恒定CD3-IgSF链基因座中的模板多核苷酸包括转基因序列，例如如第I.B.2.a节中所述。
在一些实施方案中，所提供的工程化细胞表达微型嵌合抗原受体(miniCAR)。在一些实施方案中，所提供的工程化细胞含有编码miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，例如经修饰的CD3E基因座、经修饰的CD3D基因座或经修饰的CD3G基因座。在一些方面，细胞被工程化以表达例如在第III.B节中所述的miniCAR。在一些方面，miniCAR由工程化细胞中经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座处存在的核酸序列编码。在一些方面，通过经由HDR整合编码miniCAR的一部分(例如，抗原结合结构域)的转基因序列来产生细胞。在一些实施方案中，miniCAR含有结合至或识别抗原或配体(例如，与疾病或障碍相关的抗原)的异源抗原结合结构域。在一些实施方案中，与异源抗原结合结构域结合的抗原(或配体)可以被称为靶抗原(或靶配体)。
在一些方面，miniCAR含有免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的全部或一部分。在一些实施方案中，恒定CD3-IgSF链是由恒定CD3-IgSF链基因座编码的内源恒定CD3-IgSF链，其中将模板多核苷酸靶向整合到所述基因座中。因此，在一些实施方案中，miniCAR是融合蛋白，其包括与内源恒定CD3-IgSF链的全部或一部分融合的异源抗原结合结构域。
在一些实施方案中，由细胞表达的miniCAR含有与恒定CD3-IgSF链的全部或一部分融合的异源抗原结合结构域。在一些实施方案中，由细胞表达的miniCAR含有在恒定CD3-IgSF链的N末端融合的异源抗原结合结构域。在一些方面，在经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座处编码miniCAR的核酸序列包括与编码恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框或其部分序列融合(如框内融合)的外源核酸序列。在一些方面，所编码的miniCAR至少包含异源细胞外抗原结合结构域、恒定CD3-IgSF链的跨膜结构域和恒定CD3-IgSF链的细胞内区域。在一些方面，所编码的miniCAR包含可以结合靶抗原的异源细胞外抗原结合结构域，并且在结合靶抗原之后，融合的内源恒定CD3-IgSF链的一部分(如miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF的细胞内区域)经由TCR/CD3复合物诱导或传递刺激或激活信号。
在一些方面，本文所述的miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成免疫细胞(例如T细胞)的TCR/CD3复合物。在一些实施方案中，将miniCAR组装成TCR/CD3复合物导致miniCAR的抗原结合结构域存在于细胞表面上。在一些实施方案中，将miniCAR组装成TCR/CD3复合物使得miniCAR的细胞内结构域或区域(例如，恒定CD3-IgSF链的细胞内区域)与TCR/CD3复合物相互作用。在一些实施方案中，miniCAR的抗原结合结构域与靶抗原或靶配体的结合经由TCR/CD3复合物诱导信号传导，所述复合物由miniCAR组装而成。例如，通过miniCAR的结合结构域与靶抗原的结合可以至少部分地经由ITAM诱导TCR/CD3复合物信号传导，ITAM含有在恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g链)的细胞内或细胞质结构域中。因此，在一些方面，本文提供的miniCAR通过TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号，例如，刺激或激活T细胞细胞内信号传导级联。在一些情况下，miniCAR组装成TCR/CD3复合物并在其中诱导信号传导的能力给工程化细胞提供了增加的持久性和/或减少的强直信号传导。
在一些方面，与常规的嵌合抗原受体(CAR)相比(其可以包含细胞外抗原结合结构域、任选地间隔子、跨膜结构域和包含CD3ζ(CD3ζ)信号传导结构域的细胞内结构域、以及通常地共刺激信号传导结构域)，miniCAR的尺寸较小(最低限度地包含细胞外结合结构域、恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和恒定CD3-IgSF链的细胞内区域)并且不需要共刺激信号传导结构域。在一些方面，由于靶抗原与细胞外抗原结合结构域的结合，恒定CD3-IgSF链的细胞内区域可以至少部分地经由ITAM诱导或传递通过TCR/CD3复合物的信号。当miniCAR组装成TCR/CD3复合物时，细胞外抗原结合结构域与靶抗原的结合跟通过TCR/CD3复合物的激活或刺激信号直接偶联，并且不需要共刺激信号。
在一些实施方案中，本文提供的方法、组合物、制品和/或试剂盒可用于生成、制造或产生具有或含有编码miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座的基因工程化细胞，例如基因工程化T细胞。在特定实施方案中，本文提供的方法产生具有或含有经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座的基因工程化细胞。在特定实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是或含有转基因(例如，第I.B节中所述的转基因)与内源恒定CD3-IgSF链基因的开放阅读框的融合物。在某些实施方案中，转基因编码抗原结合结构域并框内插入内源恒定CD3-IgSF链基因的开放阅读框中，从而产生编码融合蛋白的经修饰的基因座，所述融合蛋白含有由插入的转基因编码的异源抗原结合结构域和由恒定CD3-IgSF链基因编码的内源恒定CD3-IgSF链。转基因在框内的插入或整合可以根据本文提供的方法(如第I.B节中所述)来完成。
在一些方面，工程化细胞是T细胞。在一些方面，T细胞被工程化以表达如本文所述的miniCAR。
还提供了含有多种工程化细胞的组合物。在一些方面，与使用其他工程化方法(如其中将编码嵌合受体的核酸序列随机引入细胞基因组中的方法)生成的细胞或细胞组合物相比，含有工程化细胞的组合物展现改进的、均匀的、同质的和/或稳定的所编码的miniCAR的表达和/或抗原结合。在一些实施方案中，与用含有相同抗原结合结构域的嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))工程化的T细胞相比，所述工程化细胞展现增加的持久性。在一些实施方案中，与用含有相同抗原结合结构域的CAR工程化的T细胞相比，所述工程化细胞展现增加的细胞溶解活性。在一些实施方案中，与用含有相同抗原结合结构域的CAR工程化的T细胞相比，所述工程化细胞展现经由内源TCR/CD3复合物的减少的强直信号传导。
在一些实施方案中，工程化细胞或包含工程化细胞的组合物可以用于疗法(例如，过继细胞疗法)中。在一些实施方案中，所提供的细胞或细胞组合物可以用于本文所述的任何治疗方法中或用于本文所述的治疗性用途。
在一些实施方案中，工程化细胞还可以表达一种或多种另外的分子，例如，标记物、另外的嵌合受体多肽、抗体或其抗原结合片段、免疫调节分子、配体、细胞因子或趋化因子。在一些方面，将编码miniCAR的一部分(例如，抗原结合结构域)的含有在多核苷酸中的转基因序列整合在工程化细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如CD3E、CD3D或CD3G基因座)中，以产生编码如本文所述的miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)。
A.经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座
在一些方面，提供了包含经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的基因工程化细胞。在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包括编码miniCAR的一部分(如抗原结合结构域)的异源核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包括编码抗原结合结构域的转基因序列，例如如本文所述的转基因(参见例如，第I.B节)，所述转基因序列任选地经由同源定向修复(HDR)已经整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座处。在一些实施方案中，核酸序列包括编码异源抗原结合结构域的转基因序列和内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的融合物。
在一些方面，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是由转基因序列(例如，如上文第I.A节所述)的遗传破坏和整合(如经由HDR方法)产生的。在一些方面，存在于经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座处的核酸序列包括如本文所述的转基因序列，其整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座中的位于编码恒定CD3-IgSF链的开放阅读框序列的全部或一部分的5’处的区域。在一些方面，存在于经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座处的核酸序列包括如本文所述的转基因序列，其整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座中的位于编码全长恒定CD3-IgSF链(如全长成熟恒定CD3-IgSF链)的序列的5’处的区域。因此，在一些实施方案中，整合如本文所述的转基因序列以避免破坏编码内源恒定CD3-IgSF链的序列。在一些实施方案中，如本文所述的转基因序列与内源恒定CD3-IgSF链的编码序列在框内整合。在一些实施方案中，如本文所述的转基因序列在框内整合并整合到编码内源恒定CD3-IgSF链的序列的上游(例如，5')。因此，在一些实施方案中，由经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座表达的miniCAR融合蛋白包括与全长(任选地成熟)恒定CD3-IgSF链的N末端融合的表达的转基因。
在一些方面，在通过HDR靶向整合转基因后，细胞的基因组含有经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述基因座含有编码融合蛋白(例如，miniCAR)的核酸序列，所述融合蛋白包括异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链。在一些实施方案中，在靶向整合后，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座含有转基因(例如如本文所述的转基因)和内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。在一些实施方案中，在靶向整合后，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座含有如本文所述的转基因，其整合到内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框内的位点中。在一些实施方案中，在靶向整合后，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座含有核酸序列(例如，DNA序列)，其编码由如本文所述的转基因编码的抗原结合结构域以及由恒定CD3-IgSF链基因座编码的内源恒定CD3-IgSF链。
在一些实施方案中，整合的转基因按5'到3'顺序包含编码多顺反子元件、抗原结合结构域和接头中的一种或多种的核苷酸序列。在一些方面，整合的转基因编码多顺反子元件和抗原结合结构域。在一些方面，整合的转基因编码多顺反子元件、抗原结合结构域和接头。在一些方面，整合的转基因编码抗原结合结构域和接头。在一些实施方案中，多顺反子元件是或包括核糖体跳跃序列。在一些实施方案中，整合的转基因含有在编码抗原结合结构域的核酸序列的上游(例如，紧接上游)的核糖体跳跃元件。在一些实施方案中，核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A元件。在一些实施方案中，核糖体跳跃序列是P2A元件。
在一些实施方案中，转基因的整合产生转基因和恒定CD3-IgSF链基因座的内源序列的基因融合物，其编码含有抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链(任选地全长、任选地成熟恒定CD3-IgSF链)的miniCAR融合蛋白。在一些实施方案中，由经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座转录的mRNA含有3'UTR，其由内源恒定CD3-IgSF链基因座编码和/或与由内源恒定CD3-IgSF链基因座转录的mRNA的3'UTR相同。在一些实施方案中，由转基因转录的mRNA含有5'UTR，其由内源基因编码和/或与由内源恒定CD3-IgSF链基因座转录的mRNA的5'UTR相同。
在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包括编码如本文所述的多顺反子元件(任选地P2A元件)的核苷酸序列、编码如本文所述的抗原结合结构域的核苷酸序列以及编码恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列(例如，来自内源恒定CD3-IgSF基因座)。在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包括编码如本文所述的多顺反子元件(任选地P2A元件)的核苷酸序列、编码如本文所述的抗原结合结构域的核苷酸序列、如本文所述的接头以及编码恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码作为融合蛋白的miniCAR，其按N末端到C末端顺序含有如本文所述的抗原结合结构域和恒定CD3-IgSF链(如全长成熟恒定CD3-IgSF链)。在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码作为融合蛋白的miniCAR，其按N末端到C末端顺序含有如本文所述的抗原结合结构域、如本文所述的接头和恒定CD3-IgSF链(如全长成熟恒定CD3-IgSF链)。
在一些实施方案中，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码的miniCAR融合蛋白是功能性的，例如能够自发地或在抗原与抗原结合结构域结合之后组装成TCR/CD3复合物，并传递或转导细胞信号，特别地在组装成TCR/CD3复合物之后。在一些实施方案中，miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物。在一些实施方案中，由经修饰的基因座编码的miniCAR与靶抗原结合。在一些实施方案中，靶抗原与和疾病、障碍或病症相关的细胞或组织相关，为和疾病、障碍或病症相关的细胞或组织所特有，和/或在和疾病、障碍或病症相关的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，由经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座编码的miniCAR是功能性融合蛋白，其在miniCAR的抗原结合结构域与靶抗原结合后经由TCR/CD3复合物诱导T细胞中的初级激活信号。
B.编码的miniCAR融合蛋白
在一些实施方案中，由本文提供的工程化细胞或根据本文提供的方法产生的工程化细胞编码的嵌合受体包括miniCAR，例如，其是含有异源抗原结合结构域和免疫球蛋白超家族内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的全部或一部分的融合蛋白。在一些方面，miniCAR的至少一部分由存在于本文提供的多核苷酸(如上文第I.B.2节中所述的任何模板多核苷酸)中的转基因序列编码。在一些方面，将含有在多核苷酸中的编码miniCAR的一部分(例如，抗原结合结构域)的转基因序列整合在工程化细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)中，以产生编码miniCAR(如本文所述的任何miniCAR)的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座。在一些方面，经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包括如本文所述的转基因和内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框序列。在一些实施方案中，提供了表达一种或多种miniCAR融合蛋白的工程化细胞，如T细胞。
在一些实施方案中，含有在miniCAR中的抗原结合结构域是或包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包括Fab片段、Fab2片段、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合结构域是如本文(例如在第III.B.1节中)所述的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，在本文提供的基因工程化细胞中编码的miniCAR通常含有细胞外抗原结合结构域(由转基因编码)、内源恒定CD3-IgSF链(例如，内源CD3e、CD3d或CD3g)的细胞外区域(由内源恒定CD3-IgSF基因座编码)、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域。在一些实施方案中，细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域是内源恒定CD3-IgSF链(例如，内源CD3e、CD3d或CD3g)的各区域，并且由内源恒定CD3-IgSF基因座编码。在一些实施方案中，所述区域是全长成熟内源恒定CD3-IgSF链(例如，全长成熟内源CD3e、CD3d或CD3g)的区域。在一些实施方案中，在本文提供的基因工程化细胞中编码的miniCAR通常含有各个区域或结构域，如抗原结合结构域、接头、内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域中的一个或多个。在一些实施方案中，miniCAR包括由转基因编码的细胞外抗原结合结构域、接头、细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域。
在一些实施方案中，在基因工程化细胞中编码的miniCAR的抗原结合结构域直接或间接连接到内源恒定CD3-IgSF链(例如，内源CD3e、CD3d或CD3g)的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域通过接头(例如，如本文所述的柔性接头)(参见例如，第III.B.2节)间接连接至内源恒定CD3-IgSF链的细胞外结构域。在一些情况下，接头分开抗原结合结构域和细胞外结构域(例如，内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域)或定位于二者之间，从而使得抗原结合结构域避免空间位阻并实现其三级结构。在一些方面，所编码的miniCAR还含有其他结构域、接头和/或调节元件。
在一些实施方案中，所编码的嵌合受体是miniCAR。示例性miniCAR序列按N末端到C末端顺序包括：抗原结合结构域、内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域。在一些实施方案中，示例性miniCAR序列按N末端到C末端顺序包括：抗原结合结构域、接头、内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域。在一些实施方案中，细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域是内源恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g)的各区域或结构域，任选地全长且成熟内源恒定CD3-IgSF链的各结构域，由内源恒定CD3-IgSF链基因座编码，其中将如本文所述的转基因整合到所述基因座中。
在一些实施方案中，编码的示例性前体miniCAR按N末端至C末端顺序包含：信号肽、抗原结合结构域、内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域，其中编码miniCAR的核酸序列存在于经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)中。在一些实施方案中，编码的示例性前体miniCAR按N末端至C末端顺序包含：信号肽、抗原结合结构域、接头、内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域，其中编码miniCAR的核酸序列存在于经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)中。在一些实施方案中，细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域是由内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)编码的内源恒定CD3-IgSF链的结构域。
在一些实施方案中，编码的示例性前体miniCAR序列按5'到至3'顺序包含：编码信号肽；多顺反子元件，任选地核糖体跳跃序列，任选地P2A序列；抗原结合结构域，任选地单链可变片段(scFv)；内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码的示例性前体miniCAR序列按5'到至3'顺序包含：编码信号肽；多顺反子元件，任选地核糖体跳跃序列，任选地P2A序列；抗原结合结构域，任选地单链可变片段(scFv)；接头，任选地具有SEQ IDNO:16所示序列的接头；内源恒定CD3-IgSF链的细胞外区域、内源恒定CD3-IgSF链的跨膜区域和内源恒定CD3-IgSF链的细胞内区域的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞外区域、跨膜区域和细胞内区域由恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)编码。所编码的前体多肽(例如前体miniCAR)可以包括通常在所编码多肽的N末端的信号肽序列。在成熟形式的所表达的miniCAR中，将信号序列从miniCAR的其余部分切割下来。
1.结合结构域
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的细胞外区域包含结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域是细胞外结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域是或包含多肽、配体、受体、配体结合结构域、受体结合结构域、抗原、表位、抗体、抗原结合结构域、表位结合结构域、抗体结合结构域、标签结合结构域或前述任一种的片段。在一些实施方案中，结合结构域是抗原结合结构域或配体结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域是抗原结合结构域。在一些方面，如上所述，miniCAR的结合结构域(例如，抗原结合结构域)由整合在恒定CD3-IgSF链基因座中的转基因编码。
在一些方面，细胞外结合结构域(如抗原结合结构域)直接或间接连接(linked或connected)至恒定CD3-IgSF链的细胞外区域或结构域。在一些实施方案中，miniCAR的抗原结合结构域经由接头连接至恒定CD3-IgSF链的细胞外区域。在一些实施方案中，接头是柔性接头，例如如下文第III.B.2节中所述的接头。在一些实施方案中，抗原结合结构域通过恒定CD3-IgSF链的细胞外区域连接至恒定CD3-IgSF链的跨膜区域或结构域和细胞内区域或结构域。在一些实施方案中，miniCAR包括布置在细胞外区域与细胞内区域之间的跨膜区域。在一些方面，结合结构域(例如，抗原结合结构域)经由接头直接或间接连接至全长成熟恒定CD3-IgSF链。
在一些实施方案中，抗原(例如，结合miniCAR的抗原结合结构域的抗原(也称为“靶抗原”))是多肽。在一些实施方案中，抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织(例如，在健康细胞或组织中)相比，抗原在疾病、障碍或病症的细胞(例如，肿瘤细胞或致病细胞)上选择性表达或过表达。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些方面，miniCAR包括选自细胞外抗原结合(或配体结合)区域或结构域中的一个或多个区域或结构域，例如，本文所述的抗体或片段中的任一种。
在一些实施方案中，miniCAR的抗原结合结构域包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)、或单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含特异性识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，抗原是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤细胞或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，由miniCAR(例如，经由抗原结合结构域)靶向的抗原包括在要经由过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的背景下表达的那些抗原。疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液恶性肿瘤、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和髓样白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，抗原或配体是肿瘤抗原或癌症标记物。在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记物中的任一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性地识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自特异性地结合CD19的抗体或抗原结合片段或者是其变体。
在一些实施方案中，抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。在一些实施方案中，示例性抗体或抗体片段包括在美国专利公开号WO 2014/031687、US 2016/0152723和WO 2016/033570中所述的那些。
在一些实施方案中，scFv源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocytetyping III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含SEQ ID NO:97和98分别所示的CDR-H1和CDR-H2，以及SEQ ID NO:99或100所示的CDR-H3；以及SEQ ID NO:101所示的CDR-L1、SEQ ID NO:102或103所示的CDR-L2和SEQ ID NO:104或105所示的CDR-L3。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:101的CDR-L1序列、SEQ ID NO:102的CDR-L2序列和SEQ ID NO:108的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:97的CDR-H1序列、SEQ ID NO:98的CDR-H2序列和SEQ ID NO:99的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:106所示的可变重链区和SEQ ID NO:107所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQID NO:109所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:110所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:110展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:111展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别如SEQ ID NO:112-114所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及分别如SEQ ID NO:115-117所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:115的CDR-L1序列、SEQ ID NO:116的CDR-L2序列和SEQ ID NO:117的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:112的CDR-H1序列、SEQ ID NO:113的CDR-H2序列和SEQ ID NO:114的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:118所示的可变重链区和SEQ ID NO:119所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQID NO:16所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:120所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:120展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗原是CD20。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD20的抗体或抗体片段是或源自利妥昔单抗的抗体，如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，抗原是CD22。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD22的抗体或抗体片段是或源自m971的抗体，如是m971 scFv。
在一些实施方案中，抗原是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327、WO 2016/090320和WO 2019/090003所示的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自US10072088和US 2017/0051068所示的抗体或抗体片段的结合结构域。在一些实施方案中，抗体或抗原结合结构域可以是例如以下文献中描述的或来源于以下文献的任何抗BCMA抗体或其抗原结合片段：Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060，WO 2016/090320，WO 2016/090327，WO 2010/104949，WO 2017/173256，WO 2017/031104，US 2020/0190205，WO 2017/025038和WO 2019/000223。
在一些实施方案中，抗原是ROR1。在一些实施方案中，scFv含有源自对ROR1具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合ROR1的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2014/031687、WO 2016/115559和WO 2020/160050所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329、WO 2016/090312和WO 2020/092854所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原是FcRL5。在一些实施方案中，scFv含有源自对FcRL5具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合FcRL5的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090337和WO 2017/096120所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原是间皮素。在一些实施方案中，scFv含有源自对间皮素具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合间皮素的抗体或抗体片段是或含有来自US 2018/0230429所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)、或单结构域抗体(sdAb)(如sdFv、纳米抗体、VHH和VNAR)。在一些实施方案中，抗原结合片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR)或片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。在一些方面，miniCAR是双特异性miniCAR，例如含有两个具有不同特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，miniCAR的抗原结合结构域与全长抗体特异性识别相同的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别地选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在一些实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所编码的miniCAR的结合结构域包括抗体片段。“抗体片段”是指包含完整抗体的一部分的不同于完整抗体的分子，其结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体(sdAb)是人单结构域抗体。在一些实施方案中，miniCAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原如癌症标记物或要靶向的细胞或疾病(如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性单结构域抗体包括纳米抗体、骆驼化抗体(例如VHH)或鲨鱼抗体(例如IgNAR)。在一些实施方案中，sdAb的可变结构域包含三个CDR和四个框架区，分别命名为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在一些实施方案中，sdAb可变结构域可以在N末端或C末端被截短，使得其仅包含部分FR1和/或FR4，或者缺少那些框架区中的一个或两个，只要sdAb可变结构域基本上维持抗原结合和特异性即可。预期根据本文所述的组合物和方法使用的示例性sdAb包括已知结合与疾病、障碍或病症相关的抗原的sdAb，包括例如WO2017/025038和WO 2019/000223中所述的sdAb。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过对天然存在的完整抗体进行酶消化产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基都源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
因此，在一些实施方案中，所编码的miniCAR(包括TCR样miniCAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。在一些方面，抗体或抗原结合片段可以通过筛选多个(例如文库)抗原结合片段或分子，例如通过筛选scFv文库以结合特定抗原或配体来获得。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR是多特异性CAR，例如，含有可以结合和/或识别(例如，特异性结合)多种不同抗原的多个配体(例如，抗原)结合结构域。在一些方面，所编码的miniCAR是双特异性miniCAR，例如，其如通过含有两个具有不同特异性的抗原结合结构域来靶向两种抗原。在一些实施方案中，miniCAR含有双特异性结合结构域，例如，双特异性抗体或其片段，其含有与靶细胞上的不同表面抗原(例如，选自如本文所述的任何所列抗原，例如，CD19和CD22或CD19和CD20)结合的至少一个抗原结合结构域。在一些实施方案中，双特异性结合结构域与其每一表位或抗原的结合可以导致刺激T细胞的功能、活性和/或反应，例如，细胞毒性活性和随后对靶细胞的裂解。这种示例性双特异性结合结构域可以包括：在一些情况下经由例如柔性接头彼此融合的串联scFv分子；双抗体及其衍生物，包括串联双抗体(Holliger等人,Prot Eng 9,299-305(1996)；Kipriyanov等人,J MolBiol 293,41-66(1999))；双重亲和力重靶向(DART)分子，其可以包括具有C末端二硫桥的双抗体形式；双特异性T细胞接合器(BiTE)分子，其含有通过柔性接头融合的串联scFv分子(参见例如，Nagorsen和Bauerle,Exp Cell Res317,1255-1260(2011)；或者三功能抗体(triomab)，其包括完整杂合小鼠/大鼠IgG分子(Seimetz等人,Cancer Treat Rev 36,458-467(2010))。本文所述的任何miniCAR中可以含有此类结合结构域中的任一种。
在一些方面，所编码的miniCAR含有结合或识别(例如，特异性结合)通用标签或通用表位的抗原结合结构域。在一些方面，结合结构域可以结合分子、标签、多肽和/或表位，所述分子、标签、多肽和/或表位可以连接至识别与疾病或障碍相关的抗原的不同结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。示例性标签或表位包括染料(例如，异硫氰酸荧光素)或生物素。在一些方面，结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)与标签连接，所述标签识别与疾病或障碍相关的抗原(例如，肿瘤抗原)，且工程化细胞表达对所述标签具有特异性的miniCAR，以实现工程化细胞的细胞毒性或其他效应子功能。在一些方面，miniCAR对与疾病或障碍相关的抗原的特异性由带标签的结合分子(例如，抗体)提供，并且不同的带标签的结合分子可以用于靶向不同抗原。对通用标签或通用表位具有特异性的示例性结合结构域包括例如以下文献中所述的那些：U.S.9,233,125；WO 2016/030414；Urbanska等人,(2012)Cancer Res 72:1844-1852；和Tamada等人,(2012).Clin Cancer Res 18:6436-6445。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR含有TCR样抗体，如抗体或抗原结合片段(例如，scFv)，其特异性识别作为主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为miniCAR的一部分在细胞上表达。在一些实施方案中，含有展现针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的miniCAR也可以称为TCR样miniCAR。在一些实施方案中，miniCAR是TCR样miniCAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在MHC分子的背景下在细胞表面上被识别。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样miniCAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域经由接头、细胞外区域或结构域和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或类似通过天然抗原受体(如TCR)的信号，以及通过这种受体与共刺激受体的组合的信号。
在一些实施方案中，主要组织相容性复合物(MHC)包括含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机器加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是具有跨膜α链(在一些情况下具有三个α结构域)和非共价缔合的β2微球蛋白的异二聚体。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β构成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，所述有效部分含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所必需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，在此处MHC-肽复合物被T细胞(如通常是CD8+T细胞，但是在一些情况下是CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中肽通常被CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，它们在小鼠中统称为H-2，并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样miniCAR或其抗原结合部分)特异性识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，如用于由抗原结合结构域识别。通常，肽源自或基于更长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，肽通常具有约8至约24个氨基酸的长度。在一些实施方案中，对于MHC II类复合物中的识别，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC I类复合物中的识别，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)背景下的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样miniCAR)产生或触发激活信号至T细胞，从而诱导T细胞反应，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞反应或其他反应。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合结构域是已知的或可以通过已知方法产生(参见例如，美国专利申请公开号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US 2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际申请公开号WO 03/068201)。
在一些实施方案中，特异性地结合MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合结构域可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如本文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主施用有效量的免疫原以用于引发免疫反应，其中免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫反应的时间。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，特异性地结合MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合结构域可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参加例如，美国专利申请公开号US 20020150914、US20140294841；以及Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
2.接头
在一些方面，所编码的miniCAR包括细胞外结合结构域(例如，抗原结合结构域)和恒定CD3-IgSF链(其包括恒定CD3-IgSF链的细胞外区域的全部或一部分)。在一些实施方案中，miniCAR的结合结构域(例如，抗原结合结构域)例如经由接头间接连接至恒定CD3-IgSF链的细胞外区域。在一些方面，接头的包含改善了抗原结合结构域与其靶标(例如，靶抗原)的结合。在一些方面，接头的包含允许在结合结构域(例如，抗原结合结构域)与其靶标(例如，靶抗原)结合之后经由TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号所必需的柔性和/或构象变化。
在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与25个之间氨基酸的多肽接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在于结合结构域(例如，抗原结合结构域)与恒定CD3-IgSF链的细胞外结构域或区域之间，并且形成连接。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。接头的长度可以是2-25个氨基酸，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，接头是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，接头是长度为12至18个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，接头是长度为15至18个氨基酸的多肽。
各种多肽接头是已知的(参见例如，Chen等人(2013)Adv.Drug.Deliv.65:1357-1369；以及国际PCT公开号WO 2014/099997，WO 2000/24884；美国专利号5,258,498；美国专利号5,525,491；美国专利号5,525,491，美国专利号6,132,992)。
接头可以是天然存在的、合成的或两者的组合。特别合适的接头多肽主要包括选自甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和苏氨酸(Thr)的氨基酸残基。例如，接头可以含有至少75％(基于存在于肽接头中的残基的总数计算)，如至少80％、至少85％或至少90％的选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。接头还可以仅由Gly、Ser、Ala和/或Thr残基组成。在一些实施方案中，接头含有1-25个甘氨酸残基、5-20个甘氨酸残基、5-15个甘氨酸残基或8-12个甘氨酸残基。在一些方面，合适的肽接头通常含有至少50％甘氨酸残基，如至少75％甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽接头仅包含甘氨酸和丝氨酸残基。
接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下苏氨酸的那些。在一些实施方案中，接头包含10至20个残基，如至少或约10、15或20个残基。在一些实施方案中，接头序列包含SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列((GGGGS)n)，其中n是1与10之间的整数，包含端值。在一些实施方案中，接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:122)、GGGGGS(SEQ ID NO:128)及其组合。在一些实施方案中，接头包含(GGS)n，其中n是1至10；(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)，其中n还1至10；或(GGGGGS)n(SEQ ID NO:129)，其中n是1至4。在一些实施方案中，接头选自以下接头，其是或包含GGS、是或包含GGGGS(SEQ ID NO:122)、是或包含GGGGGS(SEQ ID NO:128)、是或包含(GGS)2(SEQ ID NO:130)、是或包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:131)、是或包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:132)、是或包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:133)、是或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:134)、是或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:135)、是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:122所示的氨基酸序列(GGGGS)。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列(GGGGSGGGGS)。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGS)。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。在一些实施方案中，接头是(G4S)3-4(SEQ ID NO:125)。在一些实施方案中，接头是(G4S)2-3(SEQ ID NO:126)或GGGAS(G4S)2(SEQ ID NO:127)。在一些实施方案中，接头序列由具有SEQ ID NO:2所示序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，接头是GGGGG(SEQ ID NO:150)。在任何以上例子中的一些中，丝氨酸可以被丙氨酸替代(例如，(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
在一些实施方案中，接头包括具有氨基酸序列GlyxXaa-Glyy-Xaa-Glyz(SEQ IDNO:151)的肽接头，其中每个Xaa独立地选自丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，并且其中x、y和z各自为范围1-5的整数。在一些实施方案中，每个Xaa独立地选自Ser、Ala和Thr。在具体的变型中，x、y和z中的每一个等于3，从而产生具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:152)的肽接头，其中每个Xaa如上所述选择。
在一些实施方案中，接头是基于(SSSSG)n(SEQ ID NO:153)基序的重复的富含丝氨酸的接头，其中n至少是1，但n可以是2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些情况下，可能希望在肽接头中提供一些刚性。这可以通过在肽接头的氨基酸序列中包括脯氨酸残基来实现。因此，在一些实施方案中，接头在肽接头的氨基酸序列中包含至少一个脯氨酸残基。例如，肽接头可以具有其中至少25％(例如，至少50％或至少75％)的氨基酸残基是脯氨酸残基的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，肽接头仅包含脯氨酸残基。
在一些方面，肽接头包含至少一个半胱氨酸残基，如一个半胱氨酸残基。例如，在一些实施方案中，接头包含至少一个半胱氨酸残基和选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基。在一些这样的实施方案中，接头包含甘氨酸残基和半胱氨酸残基，如仅甘氨酸残基和半胱氨酸残基。通常，每个肽接头将仅包括一个半胱氨酸残基。包含半胱氨酸残基的具体接头的一个例子包括具有氨基酸序列Glym-Cys-Glyn的肽接头，其中n和m各自是1-12，例如3-9、4-8或4-7的整数。在具体的变型中，这种肽接头具有氨基酸序列GGGGG-C-GGGGG(SEQ IDNO:154)。
3.亲和标签
在一些方面，所编码的miniCAR还包括亲和标签。在一些方面中，亲和标签定位于所编码的miniCAR的细胞外区域中。在一些实施方案中，亲和标签是任选的。在一些方面，除了接头之外，还包括亲和标签。在一些方面，包括亲和标签以代替接头。在一些方面，亲和标签的包含允许miniCAR的亲和标签被结合分子识别。在一些方面，亲和标签的包含和/或亲和标签与识别亲和标签的结合分子的结合可以促进细胞(如表达miniCAR的工程化T细胞)的检测、选择、分离和/或纯化。
在一些方面，亲和标签与细胞外结合结构域(例如，抗原结合结构域)的N末端融合。在一些方面，亲和标签与细胞外结合结构域(例如，抗原结合结构域)的C末端融合。在一些方面，亲和标签与接头(例如，肽接头)的N末端融合。在一些方面，亲和标签与接头(例如，肽接头)的C末端融合。在一些方面，亲和标签与miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF链的N末端(如恒定CD3-IgSF链的细胞外区域)融合。在一些方面，亲和标签与恒定CD3-IgSF链的细胞外区域的N末端融合。在一些方面，亲和标签与miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF链的跨膜区域的N末端融合。
在一些实施方案中，亲和标签具有足够的残基以提供由抗体或由非抗体结合分子识别的表位，但是，在一些方面，亲和标签足够短使得其不会干扰或空间阻断由如本文所述的miniCAR的靶抗原的表位。合适的标签多肽通常具有至少5个或6个氨基酸残基，并且通常在约8-50个氨基酸残基之间，典型地在9-30个残基之间。
在一些实施方案中，亲核标签可以是链霉亲和素结合肽，或能够与链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物特异性结合的其他分子。在一些实施方案中，亲和标签是链霉亲和素结合肽。在一些实施方案中，亲和标签被结合分子识别，所述结合分子是或包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白。
在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽含有具有SEQ ID NO:138所示通式的序列，如含有SEQ ID NO:139所示的序列。在一些实施方案中，肽序列具有SEQ ID NO:140所示的通式，如SEQ ID NO:141所示。在一个例子中，肽序列是Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称为Strep-如SEQ ID NO:136所示)。在一个例子中，肽序列是Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:149)或最小序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称为Strep-II，如SEQ ID NO:137所示)。在一些实施方案中，亲和标签含有至少两个链霉亲和素结合肽模块的顺序排列，其中在所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3至8个氨基酸并且至少含有序列His-Pro-Xaa(SEQ ID NO:138)，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，并且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，如SEQ ID NO:140所示(参见例如国际公开的PCT申请号WO 02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽含有具有SEQ ID NO:142或143中任一个所示式的序列。在一些实施方案中，亲和标签可以例如通过顺序排列两个链霉亲和素结合模块而含有双-strep-标签，如可作为双-Strep从德国哥根廷的IBA GmbH商购获得，例如含有序列(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK)(SEQ IDNO:145)。在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽具有SEQ ID NO:144-148中任一个所示的氨基酸序列。在大多数情况下，所有这些链霉亲和素结合肽结合相同的结合位点，即链霉亲和素的生物素结合位点。在一些实施方案中，示例性亲和标签(如链霉亲和素结合肽)包括例如在WO 2015/158868、WO 2017/068425、WO 2017/068419、WO 2017/068421或WO 2018/134691中所述的那些。
在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽被包含链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的结合分子识别，所述结合分子展现对所述肽的结合亲和力。在一些实施方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白对链霉亲和素结合肽的结合亲和力的平衡结合常数(KD)为小于1x 10-4M、5x 10-4M、1x 10-5M、5x 10-5M、1x 10-6M、5x 10-6M或1x 10-7M，但通常大于1x 10- 13M、1x 10-12M或1x 10-11M。例如，如美国专利号5,506,121中披露的肽序列(Strep-标签)可以用作生物素模拟物并显示对链霉亲和素的结合亲和力，例如，KD大约在10-4M与10-5M之间。在一些情况下，可以通过在链霉亲和素分子内进行突变来进一步改进结合亲和力，参见例如，美国专利号6,103,493或国际公开的PCT申请号WO 2014/076277。在一些实施方案中，可以通过已知的方法确定结合亲和力。
在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽被结合分子识别，所述结合分子是或包含链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突变蛋白或类似物(如中性抗生物素蛋白)或其混合物。在一些实施方案中，结合分子是或含有可逆地结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素的类似物或突变蛋白或抗生物素蛋白的类似物或突变蛋白。在一些实施方案中，结合分子是或包含抗生物素蛋白，所述抗生物素蛋白可以是野生型抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的突变蛋白或类似物(如中性抗生物素蛋白，所述中性抗生物素蛋白是具有经修饰的精氨酸的去糖基化的抗生物素蛋白，其通常展现更中性的pi并且可用作天然抗生物素蛋白的替代物)。通常，抗生物素蛋白的去糖基化的中性形式包括例如那些可商购获得的形式，如可通过Sigma Aldrich获得的“Extravidin”、或可从ThermoScientific或Invitrogen获得的“NeutrAvidin”。通常，链霉亲和素自然地作为四个相同亚基的四聚体存在，即它是同源四聚体，其中每个亚基含有针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的单一结合位点。在一些情况下，链霉亲和素可以作为单价四聚体存在，其中四个结合位点中只有一个是功能性的(Howarth等人(2006)Nat.Methods,3:267-73；Zhang等人(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63)；可以作为二价四聚体存在，其中四个结合位点中的两个是功能性的(Fairhead等人(2013)J.Mol.Biol.,426:199-214)；或可以以单体或二聚体形式存在(Wu等人(2005)J.Biol.Chem.,280:23225-31；Lim等人(2010)Biochemistry,50:8682-91)。在一些实施方案中，亲和标签(如链霉亲和素结合肽)被示例性结合分子识别，所述示例性结合分子是或包含例如在WO 2015/158868、WO2017/068425、WO 2017/068419、WO 2017/068421、U.S.5,168,049、U.S.5,506,121、U.S.6,022,951、U.S.6,156,493、U.S.6,165,750、U.S.6,103,493、U.S.6,368,813或WO 2014/076277中所述的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或类似物。
在一些实施方案中，结合分子是一种或多种链霉亲和素或抗生物素蛋白、或链霉亲和素的任何类似物或突变蛋白、或抗生物素蛋白的类似物或突变蛋白(例如中性抗生物素蛋白)的寡聚物或聚合物。在一些实施方案中，寡聚物由相同链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的多个单独分子(例如多个同源四聚体)生成或产生。在一些实施方案中，结合分子是一种或多种链霉亲和素或抗生物素蛋白、或链霉亲和素的任何类似物或突变蛋白、或抗生物素蛋白的类似物或突变蛋白(例如中性抗生物素蛋白)的寡聚物或聚合物。在一些实施方案中，寡聚物由相同链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白的多个单独分子(例如多个同源四聚体)生成或产生。可以与miniCAR的亲和标签结合的示例性寡聚结合分子包括例如WO 2015/158868、WO 2017/068425、WO 2017/068419或WO 2017/068421中所述的那些。
在一些实施方案中，链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签，如StrepII或双-Strep-标签)可以被作为抗体或抗原结合片段的结合分子识别。在一些实施方案中，抗体含有可以特异性结合所编码的miniCAR中的亲和标签的表位或区域。针对此类链霉亲和素结合肽的抗体是已知的，包括针对例如存在于Strep-II或双-strep-标签中的肽序列SAWSHPQFEK(SEQ ID NO:149)或最小序列WSHPQFEK(SEQ ID NO:137)的抗体(Schmidt T.和Skerra A.,Nature protocols,2007；国际专利申请公开号WO 2015/067768)。在一些实施方案中，可以使用例如可商购获得的StrepMAB-Classic(德国哥廷根的IBA)、StrepMAB-lmmo(IBA)、抗Strep标签II抗体(Genscript)、或Strep-标签抗体(Qiagen)来检测链霉亲和素结合肽(例如Strep-标签，如Strep-II或双-Strep-标签)。
在一些实施方案中，将结合分子用一种或多种可检测标记物进行标记，以促进工程化细胞的纯化、选择和/或检测。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实施方案中，结合分子可以用一种或多种可检测标记物进行标记。在一些实施方案中，将结合分子用荧光标记物进行标记。示例性标记的结合分子是已知的，或可商购的，包括例如Strep-Tactin-HRP、Strep-Tactin AP、Strep-Tactin Chromeo 488、Strep-TactinChromeo 546或Strep-Tactin Oyster 645，每种都可获自IBA(德国哥廷根)。
4.恒定CD3-IgSF链
本文提供的嵌合受体(例如，miniCAR)包括恒定CD3-IgSF链的全部或一部分。如上所述，免疫球蛋白超家族的恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链，例如CD3e、CD3d或CD3g)是免疫球蛋白超家族的含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的高度相关的细胞表面蛋白，并含有单个保守的ITAM以产生刺激或激活信号。在一些实施方案中，ITAM含有在恒定CD3-IgSF链的细胞内或细胞质区域或结构域中。因此，在一些实施方案中，miniCAR中包括的恒定CD3-IgSF链至少含有恒定CD3-IgSF链的细胞内区域或细胞内结构域或其包括ITAM的部分。
在一些实施方案中，miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF链包括胞外区域或其部分；跨膜区域或其部分；以及细胞内区域或其部分，其中所述细胞内区域或其部分包括ITAM。在一些实施方案中，miniCAR中包括的细胞内区域是恒定CD3-IgSF链的全长细胞内区域。在一些实施方案中，miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF链是全长恒定CD3-IgSF链。在一些实施方案中，miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF链是成熟恒定CD3-IgSF链，例如，没有信号肽或在信号肽切割之后。在一些实施方案中，miniCAR中含有的恒定CD3-IgSF链是CD3e、CD3d或CD3g链。
在一些情况下，例如当编码如本文所述的miniCAR的结合结构域的转基因整合在CD3E基因座处时，miniCAR的恒定CD3-IgSF链是CD3e链。在一些实施方案中，CD3e链是全长CD3e链。在一些实施方案中，CD3e链是成熟CD3e链。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链含有细胞外区或其部分(例如，SEQID NO:17的氨基酸23-126，如32-112)、跨膜区域或其部分(例如，SEQ ID NO:17的氨基酸127-152)和细胞内区域或其部分(例如，SEQ ID NO:17的氨基酸153-207，如178-205)。在一些实施方案中，细胞内区域或其部分包括SEQ ID NO:17的氨基酸178-205所示的序列。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链包括或是SEQ ID NO:17的氨基酸23-207所示的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链是或包括与SEQ ID NO:17的氨基酸23-207展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链由SEQ ID NO:17的氨基酸23-207所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链由与SEQ ID NO:17的氨基酸23-207所示的序列展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链是SEQ ID NO:17所示序列或SEQ ID NO:17的氨基酸23-207所示氨基酸序列的功能性变体，其足以在miniCAR结合结构域与靶抗原结合后，通过其组装成的TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号。在一些实施方案中，所述功能性变体具有与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:17的氨基酸23-207所示的序列展现至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约92％、至少为或约95％、或至少为或约98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链含有细胞外区或其部分(例如，SEQID NO:19的氨基酸22-120，如34-99)、跨膜区域或其部分(例如，SEQ ID NO:19的氨基酸121-145)和细胞内区域或其部分(例如，SEQ ID NO:19的氨基酸146-201)。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链包括或是SEQ ID NO:19的氨基酸22-201所示的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链是或包括与SEQ ID NO:19的氨基酸22-201展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链由SEQ ID NO:19的氨基酸22-201所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链由与SEQ ID NO:19的氨基酸22-201所示的序列展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3e链是SEQ ID NO:19所示序列或SEQ ID NO:19的氨基酸22-201所示氨基酸序列的功能性变体，其足以在miniCAR结合结构域与靶抗原结合后，通过其组装成的TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号。在一些实施方案中，所述功能性变体具有与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:19的氨基酸22-201所示的序列展现至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约92％、至少为或约95％、或至少为或约98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，例如当编码如本文所述的miniCAR的结合结构域的转基因整合在CD3D基因座处时，miniCAR的恒定CD3-IgSF链是CD3d链。在一些实施方案中，CD3d链是全长CD3d链。在一些实施方案中，CD3d链是成熟CD3d链。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链含有细胞外区或其部分(例如，SEQID NO:20的氨基酸22-105)、跨膜区域或其部分(例如，SEQ ID NO:20的氨基酸106-126)和细胞内区域或其部分(例如，SEQ ID NO:20的氨基酸127-171，如138-166)。在一些实施方案中，细胞内区域或其部分包括SEQ ID NO:20的氨基酸138-166所示的序列。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链包括或是SEQ ID NO:20的氨基酸22-171所示的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链是或包括与SEQ ID NO:20的氨基酸22-171展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链由SEQ ID NO:20的氨基酸22-171所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链由与SEQ ID NO:20的氨基酸22-171所示的序列展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链是SEQ ID NO:20所示序列或SEQ ID NO:20的氨基酸22-171所示氨基酸序列的功能性变体，其足以在miniCAR结合结构域与靶抗原结合后，通过其组装成的TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号。在一些实施方案中，所述功能性变体具有与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:20的氨基酸22-171所示的序列展现至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约92％、至少为或约95％、或至少为或约98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链包括或是SEQ ID NO:22的氨基酸22-127所示的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链是或包括与SEQ ID NO:22的氨基酸22-127展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链由SEQ ID NO:22的氨基酸22-127所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链由与SEQ ID NO:22的氨基酸22-127所示的序列展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链是SEQ ID NO:22所示序列或SEQ ID NO:22的氨基酸22-127所示氨基酸序列的功能性变体，其足以在miniCAR结合结构域与靶抗原结合后，通过其组装成的TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号。在一些实施方案中，所述功能性变体具有与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:22的氨基酸22-127所示的序列展现至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约92％、至少为或约95％、或至少为或约98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链含有细胞外区或其部分(例如，SEQID NO:24的氨基酸23-30)、跨膜区域或其部分(例如，SEQ ID NO:24的氨基酸31-53)和细胞内区域或其部分(例如，SEQ ID NO:24的氨基酸54-98)。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链包括或是SEQ ID NO:24的氨基酸23-98所示的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链是或包括与SEQ ID NO:24的氨基酸23-98展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链由SEQ ID NO:24的氨基酸23-98所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链由与SEQ ID NO:24的氨基酸23-98所示的序列展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3d链是SEQ ID NO:24所示序列或SEQ ID NO:24的氨基酸23-98所示氨基酸序列的功能性变体，其足以在miniCAR结合结构域与靶抗原结合后，通过其组装成的TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号。在一些实施方案中，所述功能性变体具有与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:24的氨基酸23-98所示的序列展现至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约92％、至少为或约95％、或至少为或约98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，例如当编码miniCAR的结合结构域的转基因整合在CD3G基因座处时，miniCAR的恒定CD3-IgSF链是CD3g链。在一些实施方案中，CD3g链是全长CD3g链。在一些实施方案中，CD3g链是成熟CD3g链。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3g链含有细胞外区或其部分(例如，SEQID NO:26的氨基酸23-116，如37-94)、跨膜区域或其部分(例如，SEQ ID NO:26的氨基酸117-137)和细胞内区域或其部分(例如，SEQ ID NO:26的氨基酸138-182，如149-177)。在一些实施方案中，细胞内区域或其部分包括SEQ ID NO:26的氨基酸149-177所示的序列。
在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3g链包括或是SEQ ID NO:26的氨基酸23-182所示的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3g链是或包括与SEQ ID NO:26的氨基酸23-182展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3g链由SEQ ID NO:26的氨基酸23-182所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3g链由与SEQ ID NO:26的氨基酸23-182所示的序列展现至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的CD3g链是SEQ ID NO:26所示序列或SEQ ID NO:26的氨基酸23-182所示氨基酸序列的功能性变体，其足以在miniCAR结合结构域与靶抗原结合后，通过其组装成的TCR/CD3复合物诱导刺激或激活信号。在一些实施方案中，所述功能性变体具有与SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:26的氨基酸23-182所示的序列展现至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约92％、至少为或约95％、或至少为或约98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如上所述的CD3e、CD3d或CD3g链的细胞外区域直接连接至miniCAR的结合结构域(例如，抗原结合结构域)。在一些实施方案中，如上所述的CD3e、CD3d或CD3g链的细胞外区域通过接头间接连接至miniCAR的结合结构域(例如，抗原结合结构域)。在一些实施方案中，接头如上文第III.B.2节所述。
C.用于基因工程化的细胞和细胞的制备
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(例如，基因工程化或修饰的细胞)和将细胞工程化的方法，所述工程化细胞包括包含经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D、CD3G基因座)的基因工程化细胞，所述基因座包含编码嵌合受体(如miniCAR)的一部分(例如，抗原结合结构域)的转基因序列。在一些实施方案中，将含有包含编码miniCAR的一部分的转基因序列的核酸序列和/或一种或多种另外的分子的多核苷酸(例如，模板多核苷酸，如本文例如在第I.B.2节中所述的任何模板多核苷酸)引入一种细胞中用于工程化(例如，根据本文所述的工程化方法)。在一些方面，使用本文提供的任何方法将细胞工程化。在一些实施方案中，工程化细胞含有经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D、CD3G基因座)，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码miniCAR的核酸序列，所述miniCAR包含抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链(例如，CD3e、CD3d或CD3g链)的全部或一部分。在一些方面，工程化细胞的经修饰的恒定CD3-IgsF链基因座包括本文在第III.A节中所述的那些。
在一些方面，多核苷酸(如模板多核苷酸，例如，本文在章节I.B.2中所述)和/或其部分中的转基因序列(外源或异源核酸序列，如本文在章节I.B.2中所述的任一种)是异源的，即，通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一生物体或细胞获得的转基因序列，所述转基因序列例如通常不在被工程化的细胞和/或衍生出这种细胞的生物体中被发现。在一些实施方案中，核酸序列不是天然存在的，如在自然界中没有发现的核酸序列，或者从在自然界中发现的核酸序列进行修饰，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸序列。
在一些方面，提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法涉及将任何所提供的多核苷酸(例如，本文在第I.B.2节中所述)引入在恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏的T细胞中。在一些方面，通过用于引入靶向遗传破坏的任何药剂或方法(包括本文如在第I.A节中所述的任一种)引入遗传破坏。在一些方面，所述方法产生经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码miniCAR的核酸序列，所述miniCAR包含异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链。在一些方面，提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法涉及将能够在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞中；并且将任何所提供的多核苷酸(例如，本文在第I.B.2节中所述)引入在恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏的T细胞中，其中所述方法产生经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码miniCAR的核酸序列，所述miniCAR包含抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链。在一些实施方案中，核酸序列包含编码miniCAR的一部分(例如，抗原结合结构域)的转基因序列，并且转基因序列被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座内。
在一些实施方案中，提供了产生基因工程化T细胞的方法，所述方法涉及将包含编码miniCAR的一部分的核酸序列的多核苷酸引入T细胞中，所述T细胞在T细胞的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)内具有遗传破坏，其中编码miniCAR的一部分的核酸序列被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于内源恒定CD3-IgSF链基因座内。在一些实施方案中，所述方法产生经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码miniCAR的核酸序列，所述miniCAR包含异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链。在一些实施方案中，核酸序列包含编码miniCAR的一部分的转基因序列，如本文例如在第I.B.2节中所述的任一种。
在一些实施方案中，在进行所述方法后，基因工程化T细胞中的全部(例如，整个或完整)恒定CD3-IgSF链由内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框或其部分序列编码。在一些实施方案中，核酸序列包含编码miniCAR的一部分的转基因序列，所述部分编码抗原结合结构域和任选地接头，并且其中开放阅读框或其部分序列编码整个或完整恒定CD3-IgSF链。在一些实施方案中，所编码的miniCAR的恒定CD3-IgSF链(任选地整个成熟恒定CD3-IgSF链)的至少一个片段由内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框或其部分序列编码。
细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现成的技术，细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如iPSC。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码miniCAR的抗原结合结构域和任选地接头的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如，从受试者获得或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品、以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自其的处理的样品。
在一些方面，细胞从其中来源或分离的样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(如表面标记物(例如，表面蛋白)、细胞内标记物或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记物的用于分离的方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞的一种或多种标记物(通常为细胞表面标记物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过和与此类标记物特异性地结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记物进行分离。
分离无需导致特定细胞群或表达特定标记物的细胞的100％富集或去除。例如，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要使不表达所述标记物的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要使所有此类细胞完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记物的细胞，如通过将细胞与多种结合分子(每种结合分子对被靶向用于阴性选择的标记物具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种结合分子一起孵育，可以同时对多个细胞类型进行阳性选择。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群(如对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞))通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，M-450CD3/CD28T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记物高)(标记物+)的一种或多种表面标记物特异性结合。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记物，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对更高程度表达的标记物的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中央记忆、效应记忆和/或中央记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中央记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富集TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面依序以任一顺序进行。在一些方面，将用于制备CD8+细胞群或亚群的基于CD4表达的相同选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分二者都被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+细胞的选择，其中保留阴性和阳性两种级分。然后阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记物特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L-、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+且CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-且CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑Humana Press Inc.,Totowa,NJ)。
在一些方面，将要分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如，如Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记物)特异性结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他的例子。
孵育通常在如下条件下进行，由此结合分子或者与附着于磁性颗粒或珠的此类结合分子特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于样品内的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经历另外的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁性颗粒经由对一种或多种标记物具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附着于所述细胞以向患者施用。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)进行的。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用如下系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或制备步骤中的一个或多个。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结局和/或调整。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤，例如以用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和多种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌无热原溶液中供应的、抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理单元，其允许自动洗涤和通过离心来分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培育室，其实现细胞培养方案，例如像细胞分化和扩增、抗原负载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；以及Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中流体流中携载针对多种细胞表面标记物染色的细胞。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；以及Godin等人(2008)JBiophoton.1(5):355–376。在两种情况下，可以用多种标记物来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测的标记物来标记结合分子，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记物具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记物同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个例子涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或结合基因工程化来孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或者用于培养或培育细胞的其他容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育组合物或细胞。此类条件包括设计用于在群体中诱导细胞的增殖、扩增、激活和/或存活以模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和旨在激活细胞的任何其他试剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括抗体，如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3抗体。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/mL的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，根据多种技术进行孵育，例如以下文献中所述的那些：美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，将PBMC用范围为约3000至3600拉德的γ射线辐照，以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。
用于引入基因工程化组分(例如，用于诱导遗传破坏的药剂和/或编码miniCAR的各部分的核酸)的各种方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码所述多肽或受体的核酸的那些，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子(例如，睡美人转座子系统)。基因转移方法可以包括转导、电穿孔或导致将基因转移至细胞中的其他方法，或者本文在第I.A节中所述的任何递送方法。用于转移编码重组产物的核酸的其他途径和载体是描述于例如WO 2014055668和美国专利号7,446,190中的那些。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在T细胞中引入并表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(如在Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记物的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些情境下，可能需要防止刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能潜在地导致受试者中不希望的结果或较低的功效(如受试者中与毒性相关的因素)的可能性。因此，在一些情境下，工程化细胞包括导致细胞在体内(如在过继免疫疗法中施用时)对阴性选择易感的基因区段。例如，在一些方面，将细胞工程化，使得它们可以由于施用它们的患者的体内条件的变化而被消除。阴性选择性表型可以由赋予对所施用的药剂(例如，化合物)的敏感性的基因的插入而产生。阴性选择性基因包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell 11:223,1977)，其赋予更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌胞嘧啶脱氨酶基因(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞)可以在扩增期间或之后进行工程化。例如，用于引入所需多肽或受体的基因的这种工程化可以用任何合适的逆转录病毒载体来进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如，CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物(例如，经由从头引入的受体)进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”MethodsMol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric Antigen Receptor Therapy forCancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些实施方案中，细胞在工程之后扩增。在一些实施方案中，可以培养工程化细胞，然后使用抗原特异性或抗独特型抗体扩增。在一些方面，工程化T细胞的抗原特异性扩增可以用于增加表达miniCAR的细胞的总数。在一些实施方案中，在配制成治疗性组合物之前，使用抗原特异性或抗独特型抗体扩增工程化细胞。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，如通过促进转移细胞的活力和/或功能；用于提供选择和/或评估细胞的基因标记物的基因，如以评估体内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如LuptonS.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy3:319-338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的出版物，其描述了使用由将显性阳性选择性标记物与阴性选择性标记物融合而得到的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
如本文所述，在一些实施方案中，在基因工程化之前或结合基因工程化或在基因工程化之后来孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活、扩增和/或冷冻以保存(例如，冷冻保存)。在一些方面，在用于扩增的条件下培育工程化的T细胞群体，其中培育是在引入一种或多种药剂和/或引入多核苷酸之后进行的。在一些实施方案中，在用于扩增的条件下进行培育包括将T细胞群体与抗原结合结构域的靶抗原、表达靶抗原的靶细胞或结合抗原结合结构域的抗独特型抗体一起孵育。
在一些方面，在引入用于遗传破坏的药剂和/或含有转基因的模板多核苷酸之后，培养或孵育细胞以进行扩增。在一些实施方案中，孵育可以包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在一些实施方案中，使用抗原特异性扩增方法扩增工程化细胞。例如，可以将工程化细胞与表达或被工程化以表达miniCAR的抗原结合结构域的靶抗原的细胞(如LCL细胞)共培养，以选择性地诱导表达miniCAR的工程化细胞的扩增。在一些实施方案中，抗原特异性扩增可以通过将工程化细胞与抗原表达细胞以0.5:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10的效应细胞与靶细胞比(E:T)比或任何合适的E:T共培养来诱导，以诱导选择性扩增。在一些实施方案中，用于共培养的E:T比为1:3。
在一些实施方案中，抗原特异性细胞扩增是通过将工程化细胞与抗独特型抗体一起培育或共培养来完成，所述抗独特型抗体结合miniCAR的结合结构域(例如，抗原结合结构域)并诱导表达miniCAR的细胞的扩增。
在一些实施方案中，在用于扩增工程化细胞的条件下培育细胞(如例如使用本文所述的抗原特异性扩增方法扩增工程化细胞)增加(任选地选择性地增加)表达miniCAR的工程化细胞的数量。在一些实施方案中，进行培育直至细胞实现阈值量、浓度和/或扩增时，或此时如通过收获细胞结束培育。在一些实施方案中，在用于扩增的条件下共培养的持续时间是为或约24小时、36小时、48小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20或21天。在一些实施方案中，在抗原特异性扩增条件下共培养的持续时间是为或约4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施方案中，工程化细胞群可以在用于扩增的条件下培养，直至达到miniCAR阳性细胞(例如，miniCAR+细胞)的目标数量。在一些实施方案中，工程化细胞群可以在用于扩增的条件下培养，直至达到miniCAR阳性细胞(例如，miniCAR+细胞)的目标扩增倍数。在一些实施方案中，当例如关于和/或相对于培育开始或起始时细胞密度的量，细胞实现或实现约或至少1.5倍扩增、2倍扩增、2.5倍扩增、3倍扩增、3.5倍扩增、4倍扩增、4.5倍扩增、5倍扩增、6倍扩增、7倍扩增、8倍扩增、9倍扩增、10倍扩增、15倍扩增、20倍扩增、25倍扩增、30倍扩增、35倍扩增、40倍扩增、45倍扩增、50倍扩增、60倍扩增、70倍扩增、80倍扩增、90倍扩增、100倍扩增、或大于100倍扩增时，培育结束。在一些实施方案中，阈值扩增为例如关于和/或相对于培育开始或起始时或紧邻培育开始或起始之前细胞密度的量的30倍扩增。
在一些实施方案中，当细胞在细胞群中达到一定数量或百分比的miniCAR阳性细胞时，培育结束。在一些实施方案中，进行培育直至细胞群中的至少为或约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的细胞表达miniCAR(例如是miniCAR+细胞)时，或此时如通过收获细胞结束培育。在一些实施方案中，miniCAR阳性细胞的期望或目标数量被定义或确定为用于配制为治疗剂的表达miniCAR的细胞的数量。在一些实施方案中，表达miniCAR的细胞的目标数量是本文例如在下文第IV节中所定义的细胞数量。在一些实施方案中，进行培育直至实现为或约1x106至为或约5x 108个表达miniCAR的细胞，如为或约2x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x108、1.5x 108或5x 108个或前述值中的任何两个之间的范围的总表达miniCAR的细胞时，或此时如通过收获细胞结束培育。在一些实施方案中，进行培育直至实现为或约2x 109个总表达miniCAR的细胞，如在为或约2.5x 107至为或约1.2x 109个范围内的表达miniCAR的细胞，如为或约2.5x 107、5x 107、1x 108、1.5x 108、8x 108或1.2x 109个或前述值中的任何两个之间的范围的总表达miniCAR的细胞时，或此时如通过收获细胞结束培育。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何扩增方法在用于扩增的条件下培育细胞(例如，工程化细胞)可以富集表达miniCAR的细胞和/或其特定细胞亚型。在一些实施方案中，扩增的细胞可以富集表达miniCAR的细胞，例如，miniCAR+细胞。在一些实施方案中，扩增的细胞可以富集表达miniCAR的亚型，例如，miniCAR+细胞。例如，扩增的细胞可以富集miniCAR+/CD3+、miniCAR+/CD4+、miniCAR+/CD8+及其亚型，例如如第III.C节所述。在一些实施方案中，扩增的细胞的选择性富集(例如，富集miniCAR+、miniCAR+/CD3+、miniCAR+/CD4+、miniCAR+/CD8+及其亚型)可以根据本文例如在第III.C节所述的任何细胞选择技术进行。
D.细胞的组合物
还提供了多种工程化细胞或工程化细胞的群体、含有此类细胞和/或富含此类细胞的组合物。在一些方面，所提供的工程化细胞和/或工程化细胞的组合物包括本文所述的任一种，例如，其包含含有转基因序列的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D、CD3G基因座)，包括编码抗原结合结构域的核酸序列(例如，如本文所述)，和/或通过本文所述的方法产生。在一些方面，多种工程化细胞或工程化细胞的群体含有本文例如在本文的第III.C节中所述的任何工程化细胞。在一些方面，所提供的细胞和细胞组合物可以使用本文所述的任何方法工程化，例如使用用于引入遗传破坏的一种或多种药剂或方法(例如，如本文在第I.A节中所述)和/或使用多核苷酸(如本文例如在第I.B.2节中所述的模板多核苷酸)经由同源定向修复(HDR)。在一些方面，本文提供的此类细胞群和/或组合物包含在药物组合物或用于治疗性用途或方法的组合物(例如，如本文在第V节中所述)中。
在一些实施方案中，与使用其他方法产生的细胞群和/或组合物的表达和/或抗原结合相比，含有工程化细胞的所提供的细胞群和/或组合物包括展现更加改善的、均匀的、同质的和/或稳定的miniCAR的表达和/或抗原结合(例如，展现减小的变异系数)的细胞群。在一些实施方案中，与使用其他方法(例如，编码miniCAR的序列的随机整合)产生的相应群体相比，所述细胞群和/或组合物展现降低至少为或约100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的miniCAR表达和/或miniCAR的抗原结合的变异系数。变异系数被定义为目的核酸(例如，转基因序列)在细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)群内的表达的标准差除以相应目的核酸在相应细胞群中的表达的平均值。在一些实施方案中，当在已经使用本文提供的方法工程化的CD4+和/或CD8+T细胞中测量时，所述细胞群和/或组合物展现低于为或约0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35或0.30或更低的变异系数。
在一些实施方案中，所提供的含有工程化细胞的细胞群和/或组合物包括展现最小或降低的转基因随机整合的细胞群。在一些方面，转基因随机整合至细胞基因组中可以导致不利影响或细胞死亡(由于转基因整合至基因组中不期望的位置中，例如整合至必需基因或对调节细胞活性至关重要的基因中)，和/或受体的不受调节或不受控制的表达。在一些方面，与使用其他方法产生的细胞群相比，转基因的随机整合降低至少为或约或者大于为或约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
在一些实施方案中，至少为或约或者大于为或约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％组合物中的细胞和/或在恒定CD3-IgSF链基因座处含有遗传破坏的组合物中的细胞包括转基因在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处的整合。在一些实施方案中，通过所述方法产生的多种工程化细胞中的至少为或约或者大于为或约为或约75％、80％或90％的细胞包含在恒定CD3-IgsF链基因座内至少为或约一个靶位点的遗传破坏。
在一些实施方案中，提供了包括表达miniCAR的多种工程化T细胞的细胞群和/或组合物，其中编码miniCAR的核酸序列存在于恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G)处，例如，通过经由同源定向修复(HDR)将转基因整合于恒定CD3-IgSF链基因座处。
在一些实施方案中，组合物中至少为或约或者大于为或约1％、2％、4％、8％、10％、15％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％的细胞表达miniCAR。在一些实施方案中，组合物中至少为或约或者大于为或约20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％的细胞表达miniCAR。在一些实施方案中，通过所述方法产生的多种工程化细胞中的至少或大于为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞表达miniCAR。在一些实施方案中，在表达miniCAR的细胞扩增和/或富集之后，通过所述方法产生的多种工程化细胞中的至少或大于为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞表达miniCAR。
在一些实施方案中，所提供的组合物含有细胞，如其中表达miniCAR的细胞构成组合物中的总细胞或某一类型的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一些实施方案中，所提供的组合物含有细胞，如其中表达miniCAR的细胞构成组合物中的总细胞的至少为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，所述组合物在恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处含有遗传破坏。
在一些实施方案中，所提供的组合物含有细胞，如其中表达miniCAR的细胞构成组合物中的总细胞或某一类型的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
IV.治疗方法
本文提供了治疗方法，所述治疗方法例如包括施用本文所述的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物中的任一种，所述工程化细胞例如包含经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的工程化细胞，所述基因座包含编码异源抗原结合结构域的转基因。在一些方面，还提供了将本文所述的任何工程化细胞或含有工程化细胞的组合物施用于受试者(如患有疾病或障碍的受试者)的方法。如本文所述的表达miniCAR的工程化细胞或包含其的组合物可用于多种治疗性、诊断性和预防性情形。例如，工程化细胞或含有工程化细胞的组合物可用于治疗受试者的多种疾病和障碍。此类方法和用途包括治疗性方法和用途，例如涉及将工程化细胞或含有其的组合物施用于患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者。在一些实施方案中，以有效量施用工程化细胞或包含其的组合物以实现疾病或障碍的治疗。用途包括工程化细胞或组合物在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，通过向患有或怀疑患有疾病或病症的受试者施用工程化细胞或包含其的组合物来进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法从而治疗受试者的疾病或病症或障碍。还提供了用于向受试者(例如，患者)施用细胞和组合物的治疗方法。
用于施用过继细胞疗法的细胞的方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞疗法方法描述于例如授予Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClin Oncol.8(10):577-85。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如，癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或者例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。本文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，本文所述的miniCAR的抗原结合结构域特异性结合与疾病或病症相关的抗原。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B))。
在一些实施方案中，疾病或障碍是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，施用所提供的细胞(例如，含有编码本文所述的miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的工程化细胞)可以导致受试者的疾病或病症(如MM)的治疗和/或改善。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)或Fc受体样5(FCRL5，也称为Fc受体同源物5或FCRH5))的表达相关的MM。
在一些实施方案中，疾病或障碍是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，施用所提供的细胞(例如，含有编码本文所述的miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的工程化细胞)可以导致受试者的疾病或病症(如CLL)的治疗和/或改善。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1))的表达相关的CLL。
在一些实施方案中，疾病或障碍是实体瘤或与非血液肿瘤相关的癌症。在一些实施方案中，疾病或障碍是实体瘤或与实体瘤相关的癌症。在一些实施方案中，疾病或障碍是胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫癌、胃癌、食管癌、头颈癌、黑色素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌或软组织肉瘤。在一些实施方案中，疾病或障碍是膀胱癌、肺癌、脑癌、黑色素瘤(例如，小细胞肺癌、黑色素瘤)、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、食管癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌或子宫癌。在一些实施方案中，疾病或障碍是胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫癌、胃癌、食管癌、头颈癌、黑色素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌或软组织肉瘤。
在一些实施方案中，疾病或障碍是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，施用所提供的细胞(例如，含有编码本文所述的miniCAR的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的工程化细胞)可以导致受试者的疾病或病症(如NSCLC)的治疗和/或改善。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有与肿瘤相关抗原(如受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1))的表达相关的NSCLC。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记物中的任一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些方面，如本文所述的miniCAR特异性结合至与疾病或病症相关的抗原或在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记物中的任一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30、或其组合。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些方面，如本文所述的miniCAR的抗原结合结构域特异性结合至与疾病或病症相关的抗原或在与多发性骨髓瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原。在一些方面，在多发性骨髓瘤上表达抗原，例如第二或另外抗原，如疾病特有抗原和/或相关抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，抗原包括存在于淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下中描述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US 20120189622或US 20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO2009080829或WO 2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)含有在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，疾病或障碍与G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的表达和/或B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关。
在一些实施方案中，疾病或障碍是B细胞相关障碍。在所提供方法的任何所提供的实施方案中的一些中，与BCMA相关的疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。在所提供方法的任何所提供的实施方案中的一些中，自身免疫性疾病或障碍是系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、ANCA相关性血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、查加斯病(Chagas'disease)、格雷夫斯病(Grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、寻常型天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、血管炎、糖尿病、雷诺综合征(Reynaud's syndrome)、抗磷脂综合征、古德帕斯丘病(Goodpasture's disease)、川崎病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性肾小球肾炎。
在一些实施方案中，疾病或障碍是癌症。在一些实施方案中，癌症是表达GPRC5D的癌症。在一些实施方案中，癌症是浆细胞恶性肿瘤，并且浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，抗原是ROR1，并且疾病或障碍是CLL。在一些实施方案中，抗原是ROR1，并且疾病或障碍是NSCLC。
在一些实施方案中，本文所述的miniCAR中包括的抗原结合结构域(例如scFv)特异性识别抗原，如CD19、BCMA、GPRC5D、ROR1或FcRL5。在一些实施方案中，本文所述的miniCAR中包括的抗原结合结构域(例如scFv)来源于特异性结合CD19、BCMA、GPRC5D、ROR1或FcRL5(如上文第III.B.1节所述的任一种)的抗体或抗原结合片段，或是其变体。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受细胞疗法的受试者或从源自这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将细胞施用于同一受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者与第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给药来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过例如在不超过3天的时间段内细胞的多次推注施用，或通过细胞的连续输注施用来施用。在一些实施方案中，细胞剂量或任何另外的疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的施用是经由门诊递送进行的。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于要治疗的疾病类型、细胞或嵌合受体的类型、疾病的严重程度和病程、是针对预防目的还是针对治疗目的而施用细胞、先前治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，适合将组合物和细胞一次或在一系列治疗中施用于受试者。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任何顺序依序施用。在一些实施方案中，将细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预联合施用(同时或以任何顺序依序施用)。在一些情境下，将细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种另外的治疗剂之前施用细胞。在一些实施方案中，在一种或多种另外的治疗剂之后施用细胞。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)，例如以增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括施用化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在施用之前施用化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)，例如以减小肿瘤负荷。
在一些方面，用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。因此，在一些实施方案中，所述方法包括在开始细胞疗法之前将预调理剂施用于受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在开始细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在开始细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向受试者施用预调理剂。
在一些实施方案中，用在或在约20mg/kg与100mg/kg之间、如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天、每隔一天或每三天施用。在一些实施方案中，将环磷酰胺每天施用一次，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，按以下剂量向受试者施用环磷酰胺：在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或者250mg/m2与350mg/m2之间，包含端值。在一些情况下，向受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天、每隔一天或每三天施用。在一些实施方案中，每天施用环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天向受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，当淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨时，向受试者施用剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间或24mg/m2与35mg/m2之间的氟达拉滨(包含端值)。在一些情况下，向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天、每隔一天或每三天施用。在一些实施方案中，每天施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括任何剂量或施用时间表(如本文所述的那些)下的环磷酰胺以及任何剂量或施用时间表(如本文所述的那些)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者施用60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物活性。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面，通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
在某些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，使得其治疗或预防功效增加。例如，可以将群体表达的工程化miniCAR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR)与靶向部分缀合的实践在本领域是已知的。参见例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)，和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任何顺序依序施用。在一些实施方案中，将细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预联合施用(同时或以任何顺序依序施用)。在一些情境下，将细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种另外的治疗剂之前施用细胞。在一些实施方案中，在一种或多种另外的治疗剂之后施用细胞。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)，例如以增强持久性。
在一些实施方案中，根据所提供的方法和/或用所提供的制品或组合物向受试者施用一定剂量的细胞。在一些实施方案中，剂量的大小或时间安排根据受试者的特定疾病或病症确定。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。
在一些实施方案中，细胞的剂量包含在为或约2x 105个细胞/kg与为或约2x 106个细胞/kg之间，如在为或约4x 105个细胞/kg与为或约1x 106个细胞/kg之间或在为或约6x105个细胞/kg与为或约8x 105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的剂量包含不超过2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x 105个细胞/kg、不超过或不超过约4x 105个细胞/kg、不超过或不超过约5x 105个细胞/kg、不超过或不超过约6x 105个细胞/kg、不超过或不超过约7x 105个细胞/kg、不超过或不超过约8x 105个细胞/kg、不超过或不超过约9x 105个细胞/kg、不超过或不超过约1x 106个细胞/kg或者不超过或不超过约2x 106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的剂量包含至少或至少约或为或约2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x 106个细胞/kg或者至少或至少约或为或约2x 106个细胞/kg。
在某些实施方案中，将细胞或细胞亚型的单独群体按以下施用于受试者：在为或约10万至为或约1000亿个细胞的范围和/或每公斤受试者体重该量的细胞，如例如为或约10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下，为或约1亿个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约1.2亿个细胞、为或约2.5亿个细胞、为或约3.5亿个细胞、为或约6.5亿个细胞、为或约8亿个细胞、为或约9亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，这些值是指表达miniCAR的细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指施用的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，剂量包括少于约5x 108个总表达miniCAR的细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在为或约1x 106至为或约5x 108个此类细胞的范围内，如为或约2x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、1.5x 108或5x 108个总此类细胞，或者在任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，剂量包括多于或多于约1x 106个总表达miniCAR的细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)并且少于或少于约2x 109个总表达miniCAR的细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在为或约2.5x 107至为或约1.2x 109个此类细胞的范围内，如为或约2.5x107、5x 107、1x 108、1.5x 108、8x 108或1.2x 109个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x 105至为或约5x108个总表达miniCAR(miniCAR+)的T细胞、从为或约1x 105至为或约2.5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 105至为或约1x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 105至为或约5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 105至为或约2.5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x105至为或约1x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 105至为或约5x 106个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 105至为或约2.5x 106个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 105至为或约1x106个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 106至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 106至为或约1x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 106至为或约5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 106至为或约2.5x107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x106至为或约1x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x106至为或约5x 106个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 106至为或约2.5x 106个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 106至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 106至为或约2.5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 106至为或约1x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 106至为或约5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 106至为或约2.5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 106至为或约1x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x106个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 106至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 106至为或约2.5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 106至为或约1x108个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 106至为或约5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 106至为或约1x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 107至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 107至为或约2.5x108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 107至为或约1x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x107至为或约5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 107至为或约2.5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 107至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 107至为或约2.5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 107至为或约1x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 107至为或约5x 107个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 107至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 107至为或约2.5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约5x 107至为或约1x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 108至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约1x 108至为或约2.5x 108个总miniCAR+T细胞、从为或约2.5x 108至为或约5x 108个总miniCAR+T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约2.5x 107至为或约1.5x 108个总miniCAR+T细胞，如从或从约5x 107至为或约1x 108个总miniCAR+T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少为或约1x 105个miniCAR+细胞、至少为或约2.5x 105个miniCAR+细胞、至少为或约5x 105个miniCAR+细胞、至少为或约1x 106个miniCAR+细胞、至少为或约2.5x 106个miniCAR+细胞、至少为或约5x 106个miniCAR+细胞、至少为或约1x 107个miniCAR+细胞、至少为或约2.5x 107个miniCAR+细胞、至少为或约5x 107个miniCAR+细胞、至少为或约1x 108个miniCAR+细胞、至少为或约1.5x 108个miniCAR+细胞、至少为或约2.5x 108个miniCAR+细胞或者至少为或约5x108个miniCAR+细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x 105至或至约5x 108个总表达miniCAR的细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，从或从约5x 105至或至约1x 107个总表达miniCAR的细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)或者从或从约1x 106至或至约1x 107个总表达miniCAR的细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量的细胞，所述剂量包含如下数量的细胞：至少或至少约1x 105个总表达miniCAR的细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少1x 106、至少或至少约1x 107、至少或至少约1x 108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于表达miniCAR的(例如，miniCAR+)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x 105至或至约5x 108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+表达miniCAR的细胞、从或从约5x 105至或至约1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+表达miniCAR的细胞、或从或从约1x 106至或至约1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+表达miniCAR的细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x 105至或至约5x 108个总CD3+/miniCAR+或CD8+/miniCAR+细胞、从或从约5x 105至或至约1x 107个总CD3+/miniCAR+或CD8+/miniCAR+细胞或者从或从约1x 106至或至约1x 107个总CD3+/miniCAR+或CD8+/miniCAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量的CD8+T细胞(包括在包含CD4+和CD8+T细胞的剂量中)包括在为或约1x 106与为或约5x 108个之间的总表达miniCAR的CD8+细胞，例如，在以下范围内：从为或约5x 106至为或约1x 108个此类细胞，如1x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108、1.5x 108或5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或从约1x 107至或至约0.75x108个总表达miniCAR的CD8+T细胞、从或从约1x 107至或至约5x 107个总表达miniCAR的CD8+T细胞、从或从约1x 107至或至约0.25x 108个总表达miniCAR的CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用为或约1x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x108、1.5x 108、2.5x 108或5x 108个总表达miniCAR的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，将细胞(例如，表达miniCAR的T细胞)的剂量作为单一剂量施用于受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。在过继细胞疗法的情况下，施用给定“剂量”涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情境下，剂量是指定数量的细胞的单次或连续施用，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情况下，所述剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式施用，如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指如下剂量，其被分割使得在超过一天的时间内施用所述剂量。这种类型的给药涵盖在本发明方法中并且被认为是单一剂量。
因此，细胞的剂量可以作为分割剂量施用，例如随时间施用的分割剂量。例如，在一些实施方案中，剂量可以在2天或3天内施用于受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用33％的剂量，并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过施用多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来施用，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地施用各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多个组合物。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别包括富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达miniCAR的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的施用包括施用第一组合物，其包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞；以及施用第二组合物，其包含另一剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，组合物或剂量的施用(例如，多种细胞组合物的施用)涉及分开施用细胞组合物。在一些方面，分开施用同时或按任何顺序依序进行。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且将第一组合物和第二组合物相隔从为或约0至为或约12小时、相隔从为或约0至为或约6小时或相隔从为或约0至为或约2小时施用。在一些实施方案中，开始施用第一组合物和开始施用第二组合物是相隔不超过或不超过约2小时、不超过或不超过约1小时或不超过或不超过约30分钟，相隔不超过或不超过约15分钟、不超过或不超过约10分钟或不超过或不超过约5分钟进行的。在一些实施方案中，开始和/或完成施用第一组合物和完成和/或开始施用第二组合物是相隔不超过或不超过约2小时、不超过或不超过约1小时或不超过或不超过约30分钟，相隔不超过或不超过约15分钟、不超过或不超过约10分钟或不超过或不超过约5分钟进行的。
在一些组合物中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，第一组合物在第二组合物之前施用。
在一些实施方案中，细胞的剂量或组合物包括限定或目标比率的表达miniCAR的CD4+细胞与表达miniCAR的CD8+细胞和/或限定或目标比率的CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1)的组合物或剂量的施用涉及施用含有一种群体的细胞组合物，然后施用包含另一种群体的单独细胞组合物，其中施用是以或大致以目标或所需比率来进行。在一些方面，以限定比率施用细胞的剂量或组合物导致改进的T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量在第一剂量后约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天施用。在一些实施方案中，在第一剂量后施用多个连续剂量，使得在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量向受试者施用的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外的一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如，化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或miniCAR的宿主免疫反应)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的施用与连续剂量的施用之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，连续剂量的施用是在施用第一剂量后大于约14天且小于约28天的时间点。在一些方面，第一剂量与连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在施用先前剂量后至少约14天且小于约28天施用另外的一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量之后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)施用另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不施用剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不施用剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，表达miniCAR的细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双剂量)，包含第一剂量的T细胞和连续剂量的T细胞，其中第一剂量和第二剂量中之一或两者包括施用分割剂量的T细胞。
在一些实施方案中，细胞的剂量通常足够大以有效降低疾病负荷。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞的剂量基于细胞总数(或每kg体重的数量)和单独群体或亚型的所需比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞的剂量基于单独群体中的细胞或单独细胞类型的所需总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方案中，剂量基于此类特征的组合，此类特征如所需的总细胞数量、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如所需剂量的T细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内施用细胞的群体或亚型，如CD8+和CD4+T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于细胞的最小数量或每单位体重细胞的最小数量。在一些方面，在以所需剂量施用的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定耐受差异或误差内。
在一些实施方案中，细胞以细胞的一种或多种单独群体或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)来施用，或在所述耐受差异内施用。在一些方面，所需剂量是亚型或群体的细胞的所需数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的此类细胞的所需数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于群体或亚型的细胞的最小数量或每单位体重群体或亚型的细胞的最小数量。
因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比率，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如，各自)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于T细胞的所需固定剂量或最小剂量以及CD4+与CD8+细胞的所需比率，和/或基于CD4+和/或CD8+细胞的所需固定剂量或最小剂量。
在一些实施方案中，细胞在多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率的耐受范围下或耐受范围内施用。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)是在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)、或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5)。在一些方面，耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％，包括这些范围之间的任何值。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指表达miniCAR(例如，miniCAR+)的细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如，化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或miniCAR的宿主免疫反应)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用一个或多个另外的剂量的表达miniCAR的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高，如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低，如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量的施用基于以下来确定：受试者对初始治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫反应)的可能性或发生率。
V.药物组合物和配制品
还提供了组合物，如用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。在一些方面，药物组合物含有任何本文所述的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物，例如，其包括含有如本文所述的转基因序列的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)。在一些实施方案中，包含用如本文所述的miniCAR工程化的细胞的细胞剂量作为组合物或配制品(如药物组合物或配制品)来提供。此类组合物可以根据所提供的方法来使用和/或与所提供的制品或组合物一起使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或者用于检测、诊断和预后方法中。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分地由特定细胞或药剂和/或通过施用方法确定。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
配制品或组合物还可含有多于一种活性成分，其可用于用细胞或药剂预防或治疗的特定适应证、疾病或病症，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以组合形式适当地存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包含其他药物活性剂或药物，如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，药剂或细胞以盐(例如药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗功效或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，重复进行治疗直至发生所希望的对疾病症状的抑制。然而，其他施用方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送。
药剂或细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下注射(subconjectval)、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给药来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，其是通过例如在不超过3天的时间段内对细胞或药剂的多次推注施用或通过细胞或药剂的连续输注施用来施用。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于待治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或miniCAR的类型、疾病的严重程度和病程、施用药剂或细胞是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，组合物适合一次或在一系列治疗中施用于受试者。
可以使用标准施用技术、配制品和/或设备施用细胞或药剂。提供了用于储存和施用组合物的配制品和装置，如注射器和小瓶。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。在一些方面，将细胞从受试者分离，工程化，并施用于同一受试者。在其他方面，将细胞从一名受试者分离，工程化，并施用于另一名受试者。例如，免疫反应细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且施用于同一受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫反应细胞或其后代(例如，体内、离体或体外来源的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫反应细胞或治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用药剂或细胞群。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者施用药剂或细胞群。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至所选pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更易于制备。另外，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将所述药剂或细胞掺入溶剂中，如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
VI.试剂盒和制品
还提供了可用于进行所提供的实施方案的制品、系统、设备和试剂盒。在一些实施方案中，所提供的制品或试剂盒含有能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂的一种或多种组分和/或一种或多种模板多核苷酸(例如，含有如本文所提供的转基因的模板多核苷酸)。在一些实施方案中，制品或试剂盒可以用于将T细胞工程化以表达嵌合受体(例如，miniCAR)和/或其他分子的方法中，所述方法如经由通过同源依赖性修复(HDR)而整合转基因序列，例如，以产生包含经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)的工程化细胞，所述基因座含有编码miniCAR的核酸序列，其中所述miniCAR是包括异源抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白。
在一些实施方案中，制品或试剂盒包括可用于进行所提供的方法的多肽、核酸、载体和/或多核苷酸。在一些实施方案中，制品或试剂盒包括能够在例如恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)处诱导遗传破坏的一种或多种药剂(如本文在第I.A节中所述的那些)。在一些实施方案中，制品或试剂盒包括一种或多种核酸分子(例如，质粒或DNA片段)，其编码能够诱导遗传破坏的所述一种或多种药剂的一种或多种组分和/或包含例如用于在经由HDR将转基因序列靶向至细胞中使用的一种或多种模板多核苷酸(如本文在第I.B.2节中所述的那些)。在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有对照载体。
在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有一种或多种药剂，其中所述一种或多种药剂中的每一种独立地能够诱导恒定CD3-IgSF链基因座(例如，CD3E、CD3D或CD3G基因座)内的靶位点的遗传破坏；以及模板多核苷酸，所述模板多核苷酸包含抗原结合受体和任选地接头的转基因，其中所述转基因被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于靶位点处或附近。在一些方面，能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂是本文所述的任一种。在一些方面，一种或多种药剂是包含Cas9/gRNA复合物的核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些方面，RNP中所包括的gRNA靶向恒定CD3-IgSF链基因座中的靶位点，如本文所述的任何靶位点。在一些方面，模板多核苷酸是本文所述的任何模板多核苷酸。
在一些实施方案中，制品或试剂盒包括一个或多个容器(通常是多个容器)、包装材料和位于所述一个或多个容器和/或包装上或与所述容器和/或包装关联的标签或包装说明书，所述标签或包装说明书通常包括使用说明书，例如用于将组分引入细胞中以供工程化的说明书。
本文提供的制品含有包装材料。用于在包装所提供材料中使用的包装材料是熟知的。参见例如，美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，将其各自以其整体并入本文。包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、一次性实验室用品(例如，移液管尖端和/或塑料板)或瓶子。制品或试剂盒可以包括装置，以便有助于分配材料或有助于以高通量或大规模方式使用，例如以有助于在机器人设备中使用。通常，包装不与其中所含的组合物反应。
在一些实施方案中，能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂和/或一种或多种模板多核苷酸是分开包装的。在一些实施方案中，每个容器可以具有单一区室。在一些实施方案中，制品或试剂盒的其他组分是分开包装的，或者一起包装于单一区室中。
还提供了可用于施用所提供的细胞和/或细胞组合物以例如用于在疗法或治疗中使用的制品、系统、设备和试剂盒。在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有T细胞和/或T细胞组合物，如本文所述的任何T细胞和/或T细胞组合物。在一些方面，本文提供的制品或试剂盒可以用于施用T细胞或T细胞组合物，并且可以包括使用说明书。
在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有T细胞和/或T细胞组合物，如本文所述的任何T细胞和/或T细胞组合物。在一些实施方案中，T细胞和/或T细胞组合物任何修饰的T细胞使用本文所述的筛选方法。在一些实施方案中，本文提供的制品或试剂盒含有对照或未经修饰的T细胞和/或T细胞组合物。在一些实施方案中，制品或试剂盒包括用于施用工程化细胞和/或细胞组合物以用于疗法的一个或多个说明书。
含有用于疗法的细胞或细胞组合物的制品和/或试剂盒可以包括容器以及在所述容器上或与所述容器关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。在一些实施方案中，容器容纳组合物，所述组合物自身或与另一种组合物组合地有效治疗、预防和/或诊断病症。在一些实施方案中，容器具有无菌入口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶(包括具有可被注射针刺穿的塞子的那些溶液袋、小瓶)或用于口服给药剂的瓶子或小瓶。标签或包装说明书可以指示将组合物用于治疗疾病或病症。制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括表达miniCAR的工程化细胞；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括第二药剂。在一些实施方案中，制品可以包括(a)其中含有第一组合物的第一容器，其中所述组合物包括表达miniCAR的工程化细胞的亚型；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括表达miniCAR的工程化细胞的不同亚型。制品还可以包括包装说明书，其指示组合物可以用于治疗特定病症。可替代地或另外，制品还可以包括另一种或相同的容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲剂。它还可以包括其他材料，如其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和/或注射器。
VII.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或用辞意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的含义有实质性差异。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“至少一个/一种”或“一个/一种或多个/多种”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所陈述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。在一些实施方案中，“约”可以指代±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(如序列表所示)是指，在使用标准比对算法(例如，GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，可以例如使用保守且相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应残基。一般来说，为了鉴定对应位置，将氨基酸序列比对以使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,New.Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已将其引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒)和慢病毒载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
如本文所用，细胞或细胞群体针对特定标记物呈“阳性”的陈述是指，特定标记物(通常是表面标记物)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记物呈“阴性”的陈述是指，特定标记物(通常是表面标记物)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以各种已知方式来实现，在一些实施方案中，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
在一些实施方案中，“可操作地连接”可以包括组分(如DNA序列，例如异源核酸)与一个或多个调节序列的缔合，所述缔合的方式允许在适当分子(例如，转录激活蛋白)与所述调节序列结合时进行基因表达。因此，它意味着，所述组分所处的关系允许它们以其预期方式起作用。
氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入目的结合分子(例如抗体)、和针对所希望的活性(例如，保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员更换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
VIII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种工程化T细胞，其包含经修饰的恒定CD3-免疫球蛋白超家族(恒定CD3-IgSF)链基因座，所述基因座包含编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的核酸序列，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3链的融合蛋白，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
2.一种表达微型嵌合抗原受体(miniCAR)的工程化T细胞，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的融合蛋白。
3.一种工程化T细胞，其包含编码抗原结合结构域的转基因，所述转基因框内插入编码免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的基因座的开放阅读框，其中所述工程化T细胞表达包含异源抗原结合结构域和所述内源恒定CD3-IgSF链的miniCAR融合蛋白。
4.根据实施方案2或3所述的工程化T细胞，其中所述miniCAR由包含编码所述miniCAR的核酸序列的经修饰的恒定CD3-免疫球蛋白超家族(恒定CD3-IgSF)链基因座表达，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的工程化T细胞，其中所述恒定CD3-IgSF链是CD3ε(CD3e)链。
6.根据实施方案1-4中任一项所述的工程化T细胞，其中所述恒定CD3-IgSF链是CD3δ(CD3d)链。
7.根据实施方案1-4中任一项所述的工程化T细胞，其中所述恒定CD3-IgSF链是CD3γ(CD3g)链。
8.根据实施方案1或4所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的经修饰的CD3ε(CD3E)基因座、编码CD3d链的经修饰的CD3δ(CD3D)基因座或编码CD3g链的经修饰的CD3γ(CD3G)基因座。
9.根据实施方案1、4、5和8中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的经修饰的CD3E基因座。
10.根据实施方案1、4、5和8中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3d链的经修饰的CD3D基因座。
11.根据实施方案1、4、5和8中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3g链的经修饰的CD3G基因座。
12.一种工程化T细胞，其包含经修饰的CD3E基因座，所述基因座包含编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的核酸序列，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和内源CD3e链的融合蛋白，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述CD3e链的内源CD3E基因座的开放阅读框。
13.一种表达微型嵌合抗原受体(miniCAR)的工程化T细胞，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和内源CD3e链的融合蛋白。
14.一种工程化T细胞，其包含编码抗原结合结构域的转基因，所述转基因框内插入编码内源CD3e链的基因座的开放阅读框，其中所述工程化T细胞表达包含异源抗原结合结构域和所述内源CD3e链的miniCAR融合蛋白。
15.根据实施方案13或14所述的工程化T细胞，其中所述miniCAR由包含编码所述miniCAR的核酸序列的经修饰的CD3E链基因座表达，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述CD3e链的内源CD3E基因座的开放阅读框。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的工程化T细胞，其中所述结合结构域是或包含抗体或其抗原结合片段。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域是或包含Fab片段、Fab2片段、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域是scFv。
19.根据1、4、5和8所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述异源抗原结合结构域和所述内源恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。
20.根据实施方案9、12和15中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的CD3E基因座按5'到3'顺序包含编码所述异源抗原结合结构域和所述内源CD3e链的核苷酸序列。
21.根据实施方案1-11和16-19中任一项所述的工程化T细胞，其中所述异源抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链直接连接。
22.根据实施方案1-11和16-19中任一项所述的工程化T细胞，其中所述异源抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链经由接头间接连接。
23.根据实施方案12-18和20中任一项所述的工程化T细胞，其中所述异源抗原结合结构域和所述CD3e链直接连接。
24.根据实施方案12-18和20中任一项所述的工程化T细胞，其中所述异源抗原结合结构域和所述CD3e链经由接头间接连接。
25.根据实施方案1、3-12和14-24中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因还包含编码接头的核酸序列。
26.根据实施方案25所述的工程化T细胞，其中所述接头定位于所述抗原结合结构域的3'处。
27.一种工程化T细胞，其包含经修饰的CD3E基因座，所述基因座包含编码miniCAR的核酸序列，所述miniCAR包含异源抗原结合结构域和内源CD3e链，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列和编码接头的序列的转基因，其中所述抗原结合结构域是scFv，和(ii)编码所述CD3e链的内源CD3E基因座的开放阅读框。
28.根据实施方案25-27中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因序列按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列和编码所述接头的核苷酸序列。
29.根据实施方案25或26中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域、所述接头和所述恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。
30.根据实施方案25-29中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是多肽接头。
31.根据实施方案25-30中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。
32.根据实施方案25-31中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。
33.根据实施方案25-31中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是长度为12至18个氨基酸的多肽。
34.根据实施方案25-31中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是长度为15至18个氨基酸的多肽。
35.根据实施方案25-31中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:122)、GGGGGS(SEQ ID NO:128)及其组合。
36.根据实施方案25-30中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头包含(GGS)n，其中n是1至10；(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)，其中n是1至10；或(GGGGGS)n(SEQ ID NO:129)，其中n是1至4。
37.根据实施方案25-30中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头选自以下接头，其是或包含GGS、是或包含GGGGS(SEQ ID NO:122)、是或包含GGGGGS(SEQ ID NO:128)、是或包含(GGS)2(SEQ ID NO:130)、是或包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:131)、是或包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:132)、是或包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:133)、是或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:134)、是或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:135)、是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
38.根据实施方案25-31和37中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
39.根据实施方案1、3-12和14-38中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因还包含编码一种或多种多顺反子元件的核酸序列，任选地其中所述一种或多种多顺反子元件是或包含核糖体跳跃序列，任选地其中所述核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A元件。
40.根据实施方案39所述的工程化T细胞，其中所述P2A元件包含SEQ ID NO:3所示的序列。
41.根据实施方案39或40所述的工程化T细胞，其中所述一种或多种多顺反子元件中的至少一种定位于所述抗原结合结构域5'处。
42.根据实施方案39-41中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因序列按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件任选地P2A元件、所述抗原结合结构域和所述接头的核苷酸序列。
43.根据实施方案1、3-12和14-42中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因还包含编码亲和标签的核酸序列。
44.根据实施方案43所述的工程化T细胞，其中所述亲和标签是链霉亲和素结合肽。
45.根据实施方案44所述的工程化T细胞，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:137)、Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:136)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:146)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:147)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:148)。
46.根据实施方案39-45中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件任选地P2A元件、所述抗原结合结构域、所述接头和所述恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。
47.根据实施方案39-45中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的CD3E基因座按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件任选地P2A元件、所述抗原结合结构域、所述接头和所述CD3e链的核苷酸序列。
48.根据实施方案1、3-11、16-19、21、22、25、26和28-47中任一项所述的工程化T细胞，其中所述内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框编码全长成熟恒定CD3-IgSF链。
49.根据实施方案1、4-11、16-19、21、22、25、26和28-48中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含所述内源基因座的可操作地连接的启动子和/或调节或控制元件，以控制编码所述miniCAR的核酸序列的表达。
50.根据实施方案1、4-11、16-19、21、22、25、26和28-48中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含一种或多种可操作地连接的异源调节或控制元件，以控制所述miniCAR或其一部分的表达。
51.根据实施方案1-50中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
52.根据实施方案51所述的工程化T细胞，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
53.根据实施方案51或52所述的工程化T细胞，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的工程化T细胞，其中所述miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物。
55.根据实施方案5和8-54中任一项所述的工程化T细胞，其中所述miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF CD3e链组装成TCR/CD3复合物。
56.根据实施方案54或55所述的工程化T细胞，其中靶抗原与所述miniCAR的异源抗原结合结构域的结合诱导经由所述TCR/CD3复合物的抗原依赖性信号传导。
57.根据实施方案54-56中任一项所述的工程化T细胞，其中与用包含相同抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述miniCAR展现经由所述TCR/CD3复合物的降低的强直信号传导。
58.根据实施方案1-57中任一项所述的工程化T细胞，其中与用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述工程化T细胞展现增加的持久性，所述CAR包含相同的抗原结合结构域和异源CD3ζ(CD3z)信号传导结构域、以及任选地共刺激信号传导结构域。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的工程化T细胞，其中与用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述工程化T细胞展现增加的细胞溶解活性，所述CAR包含相同的抗原结合结构域和异源CD3ζ(CD3z)信号传导结构域、以及任选地共刺激信号传导结构域。
60.根据实施方案1-59中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞是源自受试者的原代T细胞。
61.根据实施方案60所述的工程化T细胞，其中所述受试者是人。
62.根据实施方案1-61中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞或其亚型，或者CD4+T细胞或其亚型。
63.根据实施方案1、3-12和14-42中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述转基因经由同源定向修复(HDR)整合在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座处。
64.一种多核苷酸，其包含：
(a)编码抗原结合结构域的核酸序列；和
(b)与所述核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与T细胞的免疫球蛋白超家族恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
65.根据实施方案64所述的多核苷酸，其中所述一个或多个同源臂包含与所述恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座、编码CD3d链的CD3D基因座或编码CD3g链的CD3G基因座。
66.根据实施方案64或65所述的多核苷酸，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座。
67.根据实施方案64或65所述的多核苷酸，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3d链的CD3D基因座。
68.根据实施方案64或65所述的多核苷酸，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3g链的CD3G基因座。
69.一种多核苷酸，其包含：
(a)编码抗原结合结构域的核酸序列；和
(b)与编码转基因的核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与编码CD3e链的CD3E基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列。
70.根据实施方案64-69中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合片段。
71.根据实施方案64-70中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是或包含Fab片段、Fab2片段、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
72.根据实施方案64-71中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是scFv。
73.根据实施方案64-72中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含编码可操作地与所编码的抗原结合结构域连接的接头的核苷酸，其中所述接头定位于所述抗原结合结构域的3'处。
74.一种多核苷酸，其包含：
(a)编码单链可变片段(scFv)的核酸序列和编码接头的序列；和
(b)与所述核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与编码CD3e链的CD3E基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列。
75.根据实施方案73或74所述的多核苷酸，其中所编码的接头是多肽编码接头。
76.根据实施方案73-75中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的多肽。
77.根据实施方案73-76中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。
78.根据实施方案73-76中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头是长度为12至18个氨基酸的多肽。
79.根据实施方案73-76中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头是长度为15至18个氨基酸的多肽。
80.根据实施方案73-76中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:122)、GGGGGS(SEQ ID NO:128)及其组合。
81.根据实施方案73-75中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头包含(GGS)n，其中n是1至10；(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)，其中n是1至10；或(GGGGGS)n(SEQ ID NO:129)，其中n是1至4。
82.根据实施方案73-75中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头选自以下编码的接头，其是或包含GGS、是或包含GGGGS(SEQ ID NO:122)、是或包含GGGGGS(SEQ ID NO:128)、是或包含(GGS)2(SEQ ID NO:130)、是或包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:131)、是或包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:132)、是或包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:133)、是或包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:134)、是或包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:135)、是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
83.根据实施方案73-76和82中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头是或包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
84.根据实施方案73-83中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列和编码所述接头的核苷酸序列。
85.根据实施方案64-84中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含编码一种或多种多顺反子元件的核苷酸，任选地其中所述一种或多种多顺反子元件是或包含核糖体跳跃序列，任选地其中所述核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A元件。
86.根据实施方案85所述的多核苷酸，其中所述P2A元件包含SEQ ID NO:3所示的序列。
87.根据实施方案85或86所述的多核苷酸，其中所述核酸序列按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件任选地P2A元件、所述抗原结合结构域和所述接头的核苷酸序列。
88.根据实施方案64-87中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含编码亲和标签的核酸序列。
89.根据实施方案88所述的多核苷酸，其中所述亲和标签是链霉亲和素结合肽。
90.根据实施方案89所述的多核苷酸，其中所述链霉亲和素结合肽是或包含序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:137)、Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:136)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:146)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Tr p-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:147)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:148)。
91.根据实施方案64-90中任一项所述的多核苷酸，其中所述一个或多个同源臂包含5'同源臂和3'同源臂，并且所述多核苷酸包含结构[5'同源臂]-[(a)的核酸序列]-[3'同源臂]。
92.根据实施方案91所述的多核苷酸，其中所述5'同源臂和所述3'同源臂独立地具有为或约100、200、300、400、500、600、700或800个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度；或者具有大于为或约100个核苷酸的长度，任选地为或约100、200或300个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度。
93.根据实施方案91或92所述的多核苷酸，其中所述5'同源臂包含(i)SEQ ID NO:4所示的序列，或(ii)与SEQ ID NO:4展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列，或(ii)(i)或(ii)的部分序列。
94.根据实施方案91-93中任一项所述的多核苷酸，其中所述3'同源臂包含(i)SEQID NO:5所示的序列，或(ii)与SEQ ID NO:5展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列，或(iii)(i)或(ii)的部分序列。
95.根据实施方案64-94中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的抗原结合结构域与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
96.根据实施方案95所述的多核苷酸，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
97.根据实施方案95或96所述的多核苷酸，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
98.根据实施方案64-68和70-97中任一项所述的多核苷酸，其中将所述多核苷酸引入T细胞的基因组中产生编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，其中所述miniCAR是包含由所述多核苷酸的核酸编码的抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白，并且其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码所述抗原结合结构域的核酸，其与编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框同框。
99.根据实施方案98所述的多核苷酸，其中所述内源恒定CD3-IgSF链是CD3e链、CD3d链或CD3g链。
100.根据实施方案98或99所述的多核苷酸，其中所述内源恒定CD3-IgSF链是CD3e链。
101.根据实施方案98或99所述的多核苷酸，其中所述内源恒定CD3-IgSF链是CD3d链。
102.根据实施方案98或99所述的多核苷酸，其中所述内源恒定CD3-IgSF链是CD3g链。
103.根据实施方案98-102中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物。
104.根据实施方案64-103中任一项所述的多核苷酸，其是线性多核苷酸，任选地双链多核苷酸或单链多核苷酸。
105.根据实施方案64-103中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含于载体中。
106.根据实施方案64-105中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有为或约500与为或约3000个核苷酸之间、为或约1000与为或约2500个核苷酸之间或者为或约1500个核苷酸与为或约2000个核苷酸之间的长度。
107.一种载体，其包含根据实施方案64-103、105和106中任一项所述的多核苷酸。
108.根据实施方案107所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
109.根据实施方案108所述的载体，其中所述病毒载体是AAV载体，任选地其中所述AAV载体是AAV2或AAV6载体。
110.根据实施方案108所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体，任选地慢病毒载体。
111.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将根据实施方案64-106中任一项所述的多核苷酸引入T细胞群体中，其中所述群体的T细胞在内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
112.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将根据实施方案107-110中任一项所述的载体引入T细胞群体中，其中所述群体的T细胞在内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
113.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将能够在所述群体中的T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体中，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链；和
(b)将根据实施方案64-106中任一项所述的多核苷酸引入所述T细胞群体中，其中所述群体中的T细胞在所述内源恒定CD3 IgSF链基因座处包含遗传破坏。
114.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将能够在所述群体中的T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体中，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链；和
(b)将根据实施方案107-110中任一项所述的载体引入所述T细胞群体中，其中所述群体中的T细胞在所述内源恒定CD3 IgSF链基因座处包含遗传破坏。
115.根据实施方案111-114中任一项所述的方法，其中将所述多核苷酸的核酸序列经由同源定向修复(HDR)整合到所述内源恒定CD3-IgSF链基因座中。
116.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将能够在内源CD3E基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入包含T细胞的群体中；和
(b)将根据实施方案66和69-106中任一项所述的多核苷酸引入包含T细胞的群体中，其中所述群体中的T细胞在所述内源CD3E基因座处包含遗传破坏。
117.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将能够在内源CD3E基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入包含T细胞的群体中；和
(b)将根据实施方案107-110中任一项所述的载体引入包含T细胞的群体中，其中所述群体中的T细胞在所述内源CD3E基因座处包含遗传破坏。
118.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将根据实施方案66和69-106中任一项所述的多核苷酸引入包含T细胞的群体中，其中所述群体的T细胞在内源CD3E基因座内包含遗传破坏，其中将具有所述多核苷酸的转基因经由同源定向修复(HDR)整合到内源CD3E基因座中。
119.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将根据实施方案107-110中任一项所述的载体引入包含T细胞的群体中，其中所述群体的T细胞在内源CD3E基因座内包含遗传破坏，其中将具有所述多核苷酸的转基因经由同源定向修复(HDR)整合到内源CD3E基因座中。
120.根据实施方案111-119中任一项所述的方法，其中通过将在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体来进行所述遗传破坏。
121.根据实施方案111-120中任一项所述的方法，其中所述方法在T细胞群体的T细胞中产生经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码miniCAR的核酸序列，其中所述miniCAR是包含由引入的多核苷酸编码的抗原结合结构域和所述内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白。
122.根据实施方案121所述的方法，其中所编码的miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成TCR/CD3复合物。
123.根据实施方案113-122中任一项所述的方法，其中所述能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含特异性结合至或杂交至所述靶位点的DNA结合蛋白或DNA结合核酸、包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或RNA指导的核酸酶，任选地其中所述一种或多种药剂包含特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)或和CRISPR-Cas9组合。
124.根据实施方案113-123中任一项所述的方法，其中所述一种或多种药剂中的每一种包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。
125.根据实施方案124所述的方法，其中所述一种或多种药剂是作为包含所述gRNA和Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物来引入的，任选地其中所述RNP是经由电穿孔、粒子枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压，任选地经由电穿孔来引入的。
126.根据实施方案125所述的方法，其中所述RNP的浓度是为或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.2、2.5、3、4、5μg/106个细胞，或者由任两个前述值限定的范围，任选地其中所述RNP的浓度是为或约1μg/106个细胞。
127.根据实施方案124-126中任一项所述的方法，其中所述RNP中gRNA与Cas9分子的摩尔比是为或约为或约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，或者由任两个前述值限定的范围，任选地其中所述RNP中gRNA与Cas9分子的摩尔比是为或约2:1。
128.根据实施方案124-127中任一项所述的方法，其中所述gRNA具有靶向结构域序列UUGACAUGCCCUCAGUAUCC(SEQ ID NO:8)。
129.根据实施方案111-128中任一项所述的方法，其中所述T细胞群体包含源自受试者的原代T细胞，任选地其中所述受试者是人。
130.根据实施方案111-129中任一项所述的方法，其中所述T细胞包含CD8+T细胞或其亚型或者CD4+T细胞或其亚型。
131.根据实施方案111、113、115、116、118和120-130中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是线性多核苷酸，任选地双链多核苷酸或单链多核苷酸。
132.根据实施方案111、113、115、116、118和120-130中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含在载体中。
133根据实施方案113-132中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种药剂和所述多核苷酸或载体同时或按任何顺序依序引入。
134.根据实施方案113-133中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种药剂和所述多核苷酸或载体同时引入。
135.根据实施方案113-133中任一项所述的方法，其中在引入所述一种或多种药剂之后引入所述多核苷酸或载体。
136.根据实施方案135所述的方法，其中在引入所述一种或多种药剂之后立即，或者在引入所述一种或多种药剂之后约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、6分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时或4小时内引入所述多核苷酸或载体。
137.根据实施方案113-136中任一项所述的方法，其中在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之前，所述方法包括在刺激或激活群体的一个或多个T细胞的条件下将所述T细胞群体与一种或多种刺激剂在体外一起孵育，任选地其中所述一种或多种刺激剂包含抗CD3和/或抗CD28抗体，任选地是抗CD3/抗CD28珠，任选地其中所述珠与细胞的比率为或为约1:1，或是包含抗CD3和/或抗CD28抗体的寡聚颗粒试剂。
138.根据实施方案113-137中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之前、期间或之后，将所述T细胞群体与一种或多种重组细胞因子一起孵育，任选地其中所述一种或多种重组细胞因子选自IL-2、IL-7和IL-15，任选地其中将所述一种或多种重组细胞因子以选自以下的浓度添加：从为或约10U/mL至为或约200U/mL、任选地为或约50IU/mL至为或约100U/mL的浓度的IL-2；0.5ng/mL至50ng/mL、任选地为或约5ng/mL至为或约10ng/mL的浓度的IL-7；和/或0.1ng/mL至20ng/mL、任选地为或约0.5ng/mL至为或约5ng/mL的浓度的IL-15。
139.根据实施方案137或138所述的方法，其中所述孵育是在引入所述一种或多种药剂和引入所述多核苷酸或载体之后进行的，并且其中所述孵育持续至多或大约24小时、36小时、48小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，任选地至多或约7天。
140.根据实施方案113-139中任一项所述的方法，其还包括在用于扩增的条件下培育所述T细胞群体，其中所述培育是在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之后进行的。
141.根据实施方案140所述的方法，其中在用于扩增的条件下进行培育包括将所述T细胞群体与所述抗原结合结构域的靶抗原、表达所述靶抗原的靶细胞或结合所述抗原结合结构域的抗独特型抗体一起孵育。
142.根据实施方案140或141所述的方法，其中在用于扩增的条件下进行培育持续长达或大约24小时、36小时、48小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20或21天，任选地长达或约7天。
143.根据实施方案111-142中任一项所述的方法，其中所述方法导致至少或大于为或约75％、80％或90％的所述T细胞群体中的细胞包含所述恒定CD3-IgSF链基因座内的至少一个靶位点的遗传破坏。
144.根据实施方案111-143中任一项所述的方法，其中所述方法导致至少或大于为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或更多通过所述方法生成的T细胞群体中的T细胞表达所述miniCAR。
145.一种群体，其包含通过根据实施方案111-144中任一项所述的方法产生的工程化T细胞。
146.一种T细胞，其包含含有微型嵌合抗原受体(CAR)的TCR/CD3复合物，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述TCR/CD3复合物的免疫球蛋白超家族内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的融合蛋白。
147.根据实施方案146所述的T细胞，其中所述miniCAR由所述T细胞的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座表达，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码所述miniCAR的核酸序列。
148.根据实施方案147所述的T细胞，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是CD3ε(CD3E)、CD3δ(CD3D)或CD3γ(CD3G)基因座。
149.根据实施方案147所述的T细胞，其中述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
150.一种T细胞，其包含含有微型嵌合抗原受体(miniCAR)的TCR/CD3复合物，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述TCR/CD3复合物的内源CD3e链的融合蛋白。
151.根据实施方案150所述的T细胞，其中所述miniCAR由包含编码所述miniCAR的核酸序列的经修饰的CD3E基因座表达。
152.一种组合物，其包含根据实施方案1-63中任一项所述的工程化T细胞、根据实施方案145所述的包含工程化T细胞的群体或根据实施方案146-151中任一项所述的T细胞。
153.一种组合物，其包含通过根据实施方案111-144中任一项所述的方法产生的工程化T细胞。
154.根据实施方案152或153所述的组合物，其中所述组合物包含CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
155.根据实施方案154所述的组合物，其中所述组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且CD4+与CD8+T细胞的比率为从或从约1:3至3:1，任选地1:1。
156.根据实施方案152-155中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多种表达所述miniCAR的T细胞。
157.根据实施方案152-156中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含为或约1x106、1.5x 106、2.5x 106、5x 106、7.5x 106、1x 107、1.5x 107、2x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108、1.5x 108、2.5x 108或5x 108个总T细胞。
158.根据实施方案152-157中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含为或约1x105、2.5x 105、5x 105、6.5x 105、1x 106、1.5x 106、2x 106、2.5x 106、5x 106、7.5x 106、1x 107、1.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108或2.5x 108个表达所述miniCAR的T细胞。
159.根据实施方案156-158中任一项所述的组合物，其中T细胞在表达所述miniCAR的组合物中的频率是为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％或更多的在所述组合物中的总细胞，或在所述组合物中的总CD4+T细胞或CD8+T细胞，或在内源恒定CD3-IgSF链基因座内包含遗传破坏的组合物中的总细胞。
160根据实施方案152-159中任一项所述的组合物，其是药物组合物。
161根据实施方案152-160中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
162根据实施方案152-161中任一项所述的组合物，其还包含冷冻保护剂。
163.一种治疗方法，其包括向患有疾病或障碍的受试者施用根据实施方案1-63中任一项所述的工程化T细胞、根据实施方案145所述的包含工程化T细胞的群体、根据实施方案146-151中任一项所述的T细胞或根据实施方案153-162中任一项所述的组合物。
164.根据实施方案1-63中任一项所述的工程化T细胞、根据实施方案145所述的包含工程化T细胞的群体、根据实施方案146-151中任一项所述的T细胞或根据实施方案153-162中任一项所述的组合物用于治疗疾病或障碍的用途。
165.根据实施方案1-63中任一项所述的工程化T细胞、根据实施方案145所述的包含工程化T细胞的群体、根据实施方案146-151中任一项所述的T细胞或根据实施方案153-162中任一项所述的组合物在制造用于治疗疾病或障碍的药物中的用途。
166.根据实施方案1-63中任一项所述的工程化T细胞、根据实施方案145所述的包含工程化T细胞的群体、根据实施方案146-151中任一项所述的T细胞或根据实施方案153-162中任一项所述的组合物，用于在治疗疾病或障碍中使用。
167.根据实施方案152-166中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中与所述疾病或障碍相关的细胞或组织表达被所述抗原结合结构域识别的靶抗原。
168.根据实施方案152-167中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述疾病或障碍是癌症或肿瘤。
169.根据实施方案168所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症或所述肿瘤是血液恶性肿瘤，任选地淋巴瘤、白血病或浆细胞恶性肿瘤。
170.根据实施方案168或169所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症是淋巴瘤，并且所述淋巴瘤是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、滤泡性淋巴瘤、小无裂细胞性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤、结节单核细胞样B细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、肺B细胞血管中心淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。
171.根据实施方案168-170中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症是白血病，并且所述白血病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、浆细胞白血病或急性淋巴细胞白血病(ALL)。
172.根据实施方案168-170中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症是浆细胞恶性肿瘤，并且所述浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)。
173.根据实施方案168所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症或肿瘤是实体瘤，任选地其中所述实体瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)或头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
174.一种试剂盒，其包含：
能够在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及
根据实施方案64-106中任一项所述的多核苷酸。
175.一种试剂盒，其包含：
能够在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及
根据实施方案64-106中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于靶位点处或附近；以及
用于进行根据实施方案56-88b中任一项所述的方法的说明书。
176.根据实施方案174或175所述的试剂盒，其中所述内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座、编码CD3d链的CD3D基因座或编码CD3g链的CD3G基因座。
177.根据实施方案174-176中任一项所述的试剂盒，其中所述内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座。
178.根据实施方案174-176中任一项所述的试剂盒，其中所述内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3d链的CD3D基因座。
179.根据实施方案174-176中任一项所述的试剂盒，其中所述内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3g链的CD3G基因座。
180.一种试剂盒，其包含：
能够在T细胞的CD3E基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及
根据实施方案64-106中任一项所述的多核苷酸。
181.一种试剂盒，其包含：
能够在T细胞的CD3E基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及
根据实施方案64-106中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于靶位点处或附近；以及
用于进行根据实施方案111-144中任一项所述的方法的说明书。
182.根据实施方案174-181中任一项所述的试剂盒，其中所述能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含特异性结合至或杂交至所述靶位点的DNA结合蛋白或DNA结合核酸、包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或RNA指导的核酸酶，任选地其中所述一种或多种药剂包含特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)或和CRISPR-Cas9组合。
183.根据实施方案174-182中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种药剂中的每一种包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。
184.根据实施方案183所述的试剂盒，其中所述gRNA具有靶向结构域序列UUGACAUGCCCUCAGUAUCC(SEQ ID NO:8)。
IX.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1将编码scFv的转基因序列靶向整合于T细胞中的内源CD3ε(CD3E)基因座 处
将人T细胞工程化以表达含有异源抗原结合结构域(如单链可变片段(scFv))的微型嵌合抗原受体(miniCAR)，所述异源抗原结合结构域与CD3复合物的内源组分连接。该实施例例示了miniCAR的产生，其中异源scFv经由柔性肽接头与T细胞的内源CD3ε链间接连接。
为了产生工程化T细胞，编码异源scFv和肽接头的核酸序列被靶向以供经由同源依赖性修复(HDR)整合于编码CD3复合物的亚基的内源基因座，例如内源CD3ε(CD3E)基因座(编码CD3e)处。所得的工程化T细胞含有编码miniCAR融合蛋白的经修饰的CD3E基因座，所述miniCAR融合蛋白由scFv和与CD3e融合的接头组成。
图1A描绘了显示示例性CD3复合物的示意图，所述示例性CD3复合物包括由所得的经修饰的CD3E基因座编码的miniCAR融合蛋白。
A.通过HDR产生工程化T细胞
产生含有编码示例性抗CD19 scFv(SEQ ID NO:1)和示例性肽接头序列(GGGGS)3(SEQ ID NO:2)的核酸序列的线性双链模板多核苷酸以进行HDR介导的靶向，所述线性双链模板多核苷酸侧接5'和3'同源序列以靶向整合于T细胞的内源CD3ε(CD3E)基因座处。所编码的抗CD19 scFv源自鼠抗体(源自FMC63的可变区，VL-接头-VH取向)。所述多核苷酸还在编码scFv的序列的上游含有P2A核糖体跳跃序列(SEQ ID NO:3)，以允许插入的核酸序列在插入位点处的内源CD3E启动子的控制下表达。
为了靶向CD3E基因座，所述核酸序列侧接大约100至300个碱基对的5'和3'同源臂(分别如SEQ ID NO:4和5所示)。
示例性线性模板多核苷酸的一般结构如下：[5'同源臂]-[scFv]-[接头]-[3'同源臂]。示例性线性模板多核苷酸如SEQ ID NO:6所示。
对原代人CD4+和CD8+T细胞进行刺激，培养并使用核糖核蛋白(RNP)复合物和示例性线性模板多核苷酸(SEQ ID NO:6)(用于在CD3E基因座处HDR介导靶向编码scFv-接头的核酸)进行一步式电穿孔，所述RNP复合物含有靶向CD3E的gRNA(UUGACAUGCCCUCAGUAUCC，如SEQ ID NO:8所示)。具体地，通过与含有抗CD3/抗CD28 Fab抗体片段的试剂一起孵育来刺激T细胞。将细胞洗涤并悬浮在电穿孔混合物中。将含有靶向CD3E的gRNA和Cas9蛋白的预组装RNP复合物(1μg/1x106个细胞)与0.7μg、1.2μg或1.4μg的示例性线性多核苷酸混合，然后添加到经刺激的细胞悬浮液中。将细胞电穿孔，然后在培养基中孵育5天。将模拟电穿孔细胞、用含有靶向T细胞受体α恒定区(TRAC)基因的gRNA(AGAGUCUCUCAGCUGGUACA，如SEQ IDNO:10所示；TRAC KO；导致没有抗CD3抗体染色)的RNP进行电穿孔的细胞、或用仅含有靶向CD3E的gRNA的RNP(没有模板多核苷酸；CD3E KO)进行电穿孔的细胞用作对照。电穿孔后五天(初始刺激后7天)，在用靶向CD3e链的抗CD3抗体(OKT3克隆；Kjer-Nielsen等人,PNAS2004年5月18日101(20)7675-7680)、抗CD4抗体以及抗独特型抗体染色以检测示例性抗CD19 scFv的表达后，通过流式细胞术评估细胞，例如如国际专利申请公开WO 2018/023100中所述。
B.示例性scFv的表达
如图2A所示，CD3(而不是scFv)在模拟转导细胞的表面上表达(图2A，左小图)，TRAC KO细胞显示CD3在细胞表面上的表达显著降低并且没有抗独特型抗体染色(图2A，中小图)，并且CD3E KO细胞显示CD3在细胞表面上的表达降低且没有抗独特型抗体染色(图2A，右小图)。相反，图2B中的结果显示在刺激后7天，用靶向CD3E的RNP复合物和示例性模板多核苷酸进行电穿孔的细胞导致CD3的细胞表面表达降低(图2B，上小图)，并且导致表达scFv的细胞，如通过在MiniCAR CD3E scFv KI组中的scFv+细胞的存在所观察到的(图2B，下小图)。图3A显示用含有靶向CD3E的gRNA的RNP和模板多核苷酸(MiniCAR CD3E scFv KI)或用仅含有靶向CD3E的gRNA的RNP在没有模板多核苷酸的情况下(CD3E KO)进行电穿孔导致在超过70％的细胞中敲除CD3e的细胞表面表达。图3B表明含有靶向CD3E的gRNA的RNP和模板多核苷酸的电穿孔(MiniCAR CD3E scFv KI)导致示例性scFv的细胞表面表达，如抗独特型抗体染色所证明的。
这些结果与通过HDR将编码示例性scFv和接头的转基因序列整合到CD3E基因座中、以及scFv和接头作为与CD3e的融合蛋白在工程化T细胞表面上的表达是一致的。
C.工程化T细胞的抗原特异性扩增和富集
为了评估由经修饰的CD3E基因座表达抗CD19 scFv的工程化T细胞的抗原特异性扩增，将来自每个实验组的电穿孔细胞在与经辐照的表达CD19的LCL细胞以1:3的效应细胞与靶细胞比(E:T)共培养之后扩增。将细胞共培养5天并通过流式细胞术评估，并且用抗CD3抗体、抗CD4抗体和抗独特型抗体染色以检测示例性抗CD19 scFv的表达。
如图4A所示，缺少(敲除)CD3的表达的细胞的百分比保持相对不变，在工程化细胞扩增5天后CD3阴性的细胞的百分比仅有最小减少。然而，如图4B所示，在共培养后5天，观察到scFv+细胞的百分比显著增加，如抗独特型抗体染色所证明的，这表明miniCAR工程化的scFv+细胞的抗原特异性扩增。结果表明，不表达miniCAR的细胞(模拟转导的或CD3E KO)的倍数扩增没有增加，并且已被工程化以表达含有抗CD19 scFv的工程化miniCAR的细胞的数量增加了约30倍至约40倍。
这些结果与由编码示例性scFv的经修饰的CD3E基因座编码的miniCAR融合蛋白促进miniCAR工程化细胞的抗原特异性细胞扩增并在扩增的组合物中富集表达miniCAR的细胞的能力相一致。
D.工程化T细胞的细胞溶解活性
评估了表达示例性miniCAR的扩增的工程化T细胞的细胞溶解活性，所述示例性miniCAR由经由接头与CD3e连接的异源scFv组成。测量了与板粘附的表达CD19的靶人胚胎肾(HEK)细胞以10:1的效应细胞与靶细胞比(E:T)共培养期间，阻抗随着时间的变化。将仅HEK-CD19+细胞(不与工程化T细胞共培养)、与未用miniCAR工程化的模拟T细胞共培养的HEK-CD19+细胞、或仅培养基用作对照。
如图5所示，与对照组相比，miniCAR+T细胞展现显著的细胞溶解活性，如通过阻抗随时间的降低所证明的。
为了进一步评估随着靶细胞滴定增加而产生的杀伤活性，以10:1、5:1、2.5:1和1.25:1的E:T比将miniCAR+T细胞与HEK-CD19+细胞共培养，并通过阻抗随时间的变化来测量细胞溶解活性。如图6所示，与在没有工程化T细胞的情况下培养的HEK-CD19细胞相比，在每个E:T比下观察到细胞溶解活性，如通过阻抗随时间的降低所证明的；在5:1和10:1的最高E:T比下观察到最大的杀伤活性。
这些结果与具有编码miniCAR的经修饰的CD3E基因座的工程化细胞杀伤表达抗原的靶细胞的能力相一致，所述miniCAR由与CD3e连接的异源scFv组成。
实施例2将编码scFv的转基因序列靶向整合于T细胞中的内源CD3ε(CD3E)基因座 或TCRα链(TRAC)基因座处
将人T细胞工程化以表达miniCAR，所述miniCAR由以下组成：直接与CD3复合物的内源组分(如CD3e)连接的异源单链可变片段(scFv)，或直接与内源TCR组分(如TCRα链)连接的异源单链可变片段(scFv)。
与实施例1所述的方法类似，将miniCAR工程化到T细胞中，不同之处在于将scFv整合以用于与CD3e直接融合(不经接头)。图1B描绘了显示包括由所得经修饰的CD3E基因座编码的miniCAR融合蛋白的示例性CD3复合物的示意图。通常如实施例1所述，将相同的示例性scFv经由HDR整合到编码TCRα链的内源TRAC基因座中，以产生融合蛋白，其中scFv与TCRα链直接融合(不经接头)。图1C描绘了显示包括由所得经修饰的TRAC基因座编码的融合蛋白的示例性TCR复合物的示意图。评估了所编码的融合蛋白的表达。
A.通过HDR产生工程化T细胞
通常如以上实施例1中所述，通过编码scFv的核酸序列的靶向整合，将T细胞工程化以由经修饰的CD3E基因座表达示例性抗CD19 scFv，但具有以下差异：示例性线性模板多核苷酸的一般结构如下：[5'同源臂]-[scFv]-[3'同源臂]。用于在CD3E基因座处整合的示例性线性模板多核苷酸如SEQ ID NO:7所示。所得的工程化T细胞含有编码miniCAR融合蛋白的经修饰的CD3E基因座，所述miniCAR融合蛋白由直接与CD3e融合的scFv组成。
如实施例1所述，scFv在TRAC基因座处的整合是通过用核糖核蛋白(RNP)复合物和编码示例性抗CD19 scFv(SEQ ID NO:1)的示例性线性模板多核苷酸电穿孔T细胞来完成的，所述RNP复合物含有靶向TRAC的gRNA(AGAGUCUCUCAGCUGGUACA，如SEQ ID NO:10所示)。示例性线性多核苷酸包括用于在TRAC基因座处整合的5'和3'同源臂(分别为SEQ ID NO:13和14)。用于在TRAC基因座处整合的示例性线性模板多核苷酸如SEQ ID NO:15所示。所得的工程化T细胞含有编码与TRAC融合的scFv的经修饰的TRAC基因座。
将表达示例性全长抗CD19嵌合抗原受体(CAR，包含scFv、接头、跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z结构域，经由HDR在内源TRAC基因座处整合)的细胞用作对照。一般如以上实施例1中所述，通过用核糖核蛋白(RNP)复合物和编码全长抗CD19 CAR的示例性线性模板多核苷酸(SEQ ID NO:12)进行电穿孔而产生对照细胞，所述RNP复合物含有靶向TRAC的gRNA(AGAGUCUCUCAGCUGGUACA，如SEQ ID NO:10所示)。示例性全长CAR序列包括编码示例性全长CAR的多核苷酸，所述示例性全长CAR包括用于在TRAC基因座处整合的5'和3'同源臂(分别为SEQ ID NO:13和14)。
电穿孔后5天(初始刺激后7天)，在用抗独特型抗体染色以检测抗CD19 scFv的表达后，通过流式细胞术评估细胞，例如如国际专利申请公开WO 2018/023100中所述。
B.示例性scFv的表达
图7显示在TRAC基因座处修饰的在细胞表面上表达示例性scFv的细胞的百分比，如通过抗独特型抗体染色所证明的。与用靶向TRAC的gRNA和编码示例性抗CD19scFv的模板多核苷酸进行电穿孔的细胞(TRAC scFv)、仅用靶向TRAC的gRNA进行电穿孔的对照细胞、或仅用示例性CAR模板进行电穿孔的对照细胞相比，具有在TRAC基因座处整合的全长CAR的对照细胞(TRAC CAR)显示在细胞表面上表达示例性scFv的细胞的更高百分比。
如图8A所示，表达由异源抗CD19 scFv和CD3e组成的示例性miniCAR的细胞(MiniCAR CD3E scFv)的百分比高于表达示例性全长CAR的细胞或模拟电穿孔细胞(阴性对照)，所述示例性全长CAR包含与由经修饰的TRAC基因座表达的结合结构域相同的抗CD19scFv。图8B显示由经修饰的TRAC基因座表达全长CAR的代表性直方图剖面图(右小图)和由经修饰的CD3E基因座表达示例性miniCAR的代表性直方图剖面图(左小图)，显示与由经修饰的TRAC基因座表达全长CAR相比，由经修饰的CD3E表达示例性miniCAR的细胞表面表达增加。
这些结果与通过HDR将编码示例性scFv的转基因序列整合到CD3E基因座中以在工程化T细胞上表达miniCAR(其由scFv与CD3e的融合蛋白组成)相一致。与实施例1中的结果一起，这些结果证明了通过将抗原结合结构域(例如scFv)直接或间接(使用接头)融合到TCR复合物的CD3组分(如CD3e)产生miniCAR的可行性。此外，所提供的结果表明，与由经修饰的TRAC基因座表达含有相同scFv的全长CAR的替代性工程化细胞或表达与TRAC连接的相同scFv的细胞相比，含有与TCR复合物的CD3组分(如CD3e)融合的细胞外scFv抗原结合结构域的miniCAR的表达得以改善。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
SEQUENCE LISTING
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> 从经修饰的恒定CD3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 5' homology arm
<400> 13
gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc agaaccctga 60
ccctgccgtg 70
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 3' homology arm
<400> 14
taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttg 58
<210> 15
<211> 1049
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC minicar without linker
<400> 15
gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc agaaccctga 60
ccctgccgtg ggaagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga 120
gaatcccggc ccaatgctgc tgctggtgac cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc 180
cgcctttctg ctgatccccg acatccagat gacccagacc acctccagcc tgagcgccag 240
cctgggcgac cgggtgacca tcagctgccg ggccagccag gacatcagca agtacctgaa 300
ctggtatcag cagaagcccg acggcaccgt caagctgctg atctaccaca ccagcaggtt 360
gcacagcggc gtccccagtc gcttctcagg aagtggatca gggaccgatt acagtctgac 420
catctccaac ctggaacagg aagatatcgc cacctacttt tgccagcagg gcaacacact 480
gccctacacc tttggcggcg gaacaaagct ggaaatcacc ggcagcacct ccggcagcgg 540
caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa gggcgaggtg aagctgcagg aaagcggccc 600
tggcctggtg gcccccagcc agagcctgag cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct 660
gcccgactac ggcgtgagct ggatcaggca gccccccagg aagggcctgg aatggctggg 720
cgtgatctgg ggcagcgaga ccacctacta caacagcgcc ctgaagagcc ggctgaccat 780
catcaaggac aacagcaaga gccaggtgtt cctgaagatg aacagcctgc agaccgacga 840
caccgccatc tactactgcg ccaagcacta ctactacggc ggcagctacg ccatggacta 900
ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagcggaggc ggttctggag gtggaagcgg 960
tggctctatc cagaaccccg accctgctgt ttatcagctc agggattcta aatccagtga 1020
caagtctgtc tgcctattca ccgattttg 1049
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G4Sx3 linker
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3epsilon CD3e isoform 1
NCBI: NP_000724.1
<400> 17
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 18
<211> 1361
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3epsilon CD3e
NCBI: NM_000733
<400> 18
agaaaccctc ctcccctccc agcctcaggt gcctgcttca gaaaatgaag tagtaagtct 60
gctggcctcc gccatcttag taaagtaaca gtcccatgaa acaaagatgc agtcgggcac 120
tcactggaga gttctgggcc tctgcctctt atcagttggc gtttgggggc aagatggtaa 180
tgaagaaatg ggtggtatta cacagacacc atataaagtc tccatctctg gaaccacagt 240
aatattgaca tgccctcagt atcctggatc tgaaatacta tggcaacaca atgataaaaa 300
cataggcggt gatgaggatg ataaaaacat aggcagtgat gaggatcacc tgtcactgaa 360
ggaattttca gaattggagc aaagtggtta ttatgtctgc taccccagag gaagcaaacc 420
agaagatgcg aacttttatc tctacctgag ggcaagagtg tgtgagaact gcatggagat 480
ggatgtgatg tcggtggcca caattgtcat agtggacatc tgcatcactg ggggcttgct 540
gctgctggtt tactactgga gcaagaatag aaaggccaag gccaagcctg tgacacgagg 600
agcgggtgct ggcggcaggc aaaggggaca aaacaaggag aggccaccac ctgttcccaa 660
cccagactat gagcccatcc ggaaaggcca gcgggacctg tattctggcc tgaatcagag 720
acgcatctga ccctctggag aacactgcct cccgctggcc caggtctcct ctccagtccc 780
cctgcgactc cctgtttcct gggctagtct tggaccccac gagagagaat cgttcctcag 840
cctcatggtg aactcgcgcc ctccagcctg atcccccgct ccctcctccc tgccttctct 900
gctggtaccc agtcctaaaa tattgctgct tcctcttcct ttgaagcatc atcagtagtc 960
acaccctcac agctggcctg ccctcttgcc aggatattta tttgtgctat tcactccctt 1020
ccctttggat gtaacttctc cgttcagttc cctccttttc ttgcatgtaa gttgtccccc 1080
atcccaaagt attccatcta cttttctatc gccgtcccct tttgcagccc tctctgggga 1140
tggactgggt aaatgttgac agaggccctg ccccgttcac agatcctggc cctgagccag 1200
ccctgtgctc ctccctcccc caacactccc taccaacccc ctaatcccct actccctcca 1260
ccccccctcc actgtaggcc actggatggt catttgcatc tccgtaaatg tgctctgctc 1320
ctcagctgag agagaaaaaa ataaactgta tttggctgca a 1361
<210> 19
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3epsilon CD3e isoform 2
Uniprot: E9PSH8
<400> 19
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ala Tyr Lys Val
20 25 30
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
35 40 45
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
50 55 60
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
65 70 75 80
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
85 90 95
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
100 105 110
Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val
115 120 125
Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr
130 135 140
Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala
145 150 155 160
Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro
165 170 175
Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu
180 185 190
Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200
<210> 20
<211> 171
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3delta CD3d isoform 1
Uniprot: P04234-1
<400> 20
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 21
<211> 771
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3delta CD3d isoform 1
GenBank: NM_000732.4
<400> 21
agagaagcag acatcttcta gttcctcccc cactctcctc tttccggtac ctgtgagtca 60
gctaggggag ggcagctctc acccaggctg atagttcggt gacctggctt tatctactgg 120
atgagttccg ctgggagatg gaacatagca cgtttctctc tggcctggta ctggctaccc 180
ttctctcgca agtgagcccc ttcaagatac ctatagagga acttgaggac agagtgtttg 240
tgaattgcaa taccagcatc acatgggtag agggaacggt gggaacactg ctctcagaca 300
ttacaagact ggacctggga aaacgcatcc tggacccacg aggaatatat aggtgtaatg 360
ggacagatat atacaaggac aaagaatcta ccgtgcaagt tcattatcga atgtgccaga 420
gctgtgtgga gctggatcca gccaccgtgg ctggcatcat tgtcactgat gtcattgcca 480
ctctgctcct tgctttggga gtcttctgct ttgctggaca tgagactgga aggctgtctg 540
gggctgccga cacacaagct ctgttgagga atgaccaggt ctatcagccc ctccgagatc 600
gagatgatgc tcagtacagc caccttggag gaaactgggc tcggaacaag tgaacctgag 660
actggtggct tctagaagca gccattacca actgtacctt cccttcttgc tcagccaata 720
aatatatcct ctttcactca gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 771
<210> 22
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3delta CD3d isoform 2
Uniprot: P04234-2
<400> 22
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Thr Ala Asp Thr Gln
85 90 95
Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp
100 105 110
Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
115 120 125
<210> 23
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3delta CD3d isoform 2
GenBank: NM_001040651.1
<400> 23
agagaagcag acatcttcta gttcctcccc cactctcctc tttccggtac ctgtgagtca 60
gctaggggag ggcagctctc acccaggctg atagttcggt gacctggctt tatctactgg 120
atgagttccg ctgggagatg gaacatagca cgtttctctc tggcctggta ctggctaccc 180
ttctctcgca agtgagcccc ttcaagatac ctatagagga acttgaggac agagtgtttg 240
tgaattgcaa taccagcatc acatgggtag agggaacggt gggaacactg ctctcagaca 300
ttacaagact ggacctggga aaacgcatcc tggacccacg aggaatatat aggtgtaatg 360
ggacagatat atacaaggac aaagaatcta ccgtgcaagt tcattatcga actgccgaca 420
cacaagctct gttgaggaat gaccaggtct atcagcccct ccgagatcga gatgatgctc 480
agtacagcca ccttggagga aactgggctc ggaacaagtg aacctgagac tggtggcttc 540
tagaagcagc cattaccaac tgtaccttcc cttcttgctc agccaataaa tatatcctct 600
ttcactcaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 639
<210> 24
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3delta CD3d isoform 3 Uniprot: E9PMT5
<400> 24
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala
20 25 30
Gly Ile Ile Val Thr Asp Val Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly
35 40 45
Val Phe Cys Phe Ala Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala
50 55 60
Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg
65 70 75 80
Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg
85 90 95
Asn Lys
<210> 25
<211> 297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3delta CD3d isoform 3 GenBank: JN392069.1
<400> 25
atggaacata gcacgtttct ctctggcctg gtactggcta cccttctctc gcaagtgtgc 60
cagagctgtg tggagctgga tccagccacc gtggctggca tcattgtcac tgatgtcatt 120
gccactctgc tccttgcttt gggagtcttc tgctttgctg gacatgagac tggaaggctg 180
tctggggctg ccgacacaca agctctgttg aggaatgacc aggtctatca gcccctccga 240
gatcgagatg atgctcagta cagccacctt ggaggaaact gggctcggaa caagtga 297
<210> 26
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3gamma CD3g isoform 1
Uniprot: P09693
<400> 26
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
180
<210> 27
<211> 1311
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3delta CD3d isoform 1
GenBank: NM_NM_000073.2
<400> 27
agtctagctg ctgcacaggc tggctggctg gctggctgct aagggctgct ccacgctttt 60
gccggaggac agagactgac atggaacagg ggaagggcct ggctgtcctc atcctggcta 120
tcattcttct tcaaggtact ttggcccagt caatcaaagg aaaccacttg gttaaggtgt 180
atgactatca agaagatggt tcggtacttc tgacttgtga tgcagaagcc aaaaatatca 240
catggtttaa agatgggaag atgatcggct tcctaactga agataaaaaa aaatggaatc 300
tgggaagtaa tgccaaggac cctcgaggga tgtatcagtg taaaggatca cagaacaagt 360
caaaaccact ccaagtgtat tacagaatgt gtcagaactg cattgaacta aatgcagcca 420
ccatatctgg ctttctcttt gctgaaatcg tcagcatttt cgtccttgct gttggggtct 480
acttcattgc tggacaggat ggagttcgcc agtcgagagc ttcagacaag cagactctgt 540
tgcccaatga ccagctctac cagcccctca aggatcgaga agatgaccag tacagccacc 600
ttcaaggaaa ccagttgagg aggaattgaa ctcaggactc agagtagtcc aggtgttctc 660
ctcctattca gttcccagaa tcaaagcaat gcattttgga aagctcctag cagagagact 720
ttcagcccta aatctagact caaggttccc agagatgaca aatggagaag aaaggccatc 780
agagcaaatt tgggggtttc tcaaataaaa taaaaataaa aacaaatact gtgtttcaga 840
agcgccacct attggggaaa attgtaaaag aaaaatgaaa agatcaaata accccctgga 900
tttgaatata attttttgtg ttgtaatttt tatttcgttt ttgtataggt tataattcac 960
atggctcaaa tattcagtga aagctctccc tccaccgcca tcccctgcta cccagtgacc 1020
ctgttgccct cttcagagac aaattagttt ctcttttttt tttttttttt tttttttttg 1080
agacagtctg gctctgtcac ccaggctgaa atgcagtggc accatctcgg ctcactgcaa 1140
cctctgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgggcag ctgggattac 1200
aggcacacac taccacacct ggctaatttt tgtattttta gtagagacag ggttttgctc 1260
tgttggccaa gctggtctcg aactcctgac ctcaagtgat ccgcccgcct c 1311
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 1
<400> 28
tgccatagta tttcagatcc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 2
<400> 29
ctggattacc tcttgccctc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 3
<400> 30
agggcatgtc aatattactg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 4
<400> 31
tattatgtct gctaccccag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 5
<400> 32
agataaaagt tcgcatcttc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 6
<400> 33
agatgcagtc gggcactcac 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 7
<400> 34
ttactttact aagatggcgg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 8
<400> 35
gatggagact ttatatgctg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 9
<400> 36
gatgtccact atgacaattg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 10
<400> 37
caacacaatg ataaaaacat 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA target sequence 11
<400> 38
tgaggatcac ctgtcactga 20
<210> 39
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 1
<400> 39
ugccauagua uuucagaucc 20
<210> 40
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 2
<400> 40
cuggauuacc ucuugcccuc 20
<210> 41
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 3
<400> 41
agggcauguc aauauuacug 20
<210> 42
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 4
<400> 42
uauuaugucu gcuaccccag 20
<210> 43
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 5
<400> 43
agauaaaagu ucgcaucuuc 20
<210> 44
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 6
<400> 44
agaugcaguc gggcacucac 20
<210> 45
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 7
<400> 45
uuacuuuacu aagauggcgg 20
<210> 46
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 8
<400> 46
gauggagacu uuauaugcug 20
<210> 47
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 9
<400> 47
gauguccacu augacaauug 20
<210> 48
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 10
<400> 48
caacacaaug auaaaaacau 20
<210> 49
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3E gRNA sequence 11
<400> 49
ugaggaucac cugucacuga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 1
<400> 50
aaacgcatcc tggacccacg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 2
<400> 51
acttcgataa tgaacttgca 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 3
<400> 52
tagccttacc ttgcgagaga 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 4
<400> 53
ccgacacaca agctctgttg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 5
<400> 54
caacgctcac ctgatagacc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 6
<400> 55
gaacatagca cgtttctctc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 7
<400> 56
gacaatgatg ccagccacgg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA target sequence 8
<400> 57
ttgcaatacc agcatcacat 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 1
<400> 58
aaacgcaucc uggacccacg 20
<210> 59
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 2
<400> 59
acuucgauaa ugaacuugca 20
<210> 60
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 3
<400> 60
uagccuuacc uugcgagaga 20
<210> 61
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 4
<400> 61
ccgacacaca agcucuguug 20
<210> 62
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 5
<400> 62
caacgcucac cugauagacc 20
<210> 63
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 6
<400> 63
gaacauagca cguuucucuc 20
<210> 64
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 7
<400> 64
gacaaugaug ccagccacgg 20
<210> 65
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3D gRNA sequence 8
<400> 65
uugcaauacc agcaucacau 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 1
<400> 66
ttacactgat acatccctcg 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 2
<400> 67
actttggccc agtcaatcaa 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 3
<400> 68
gtgtatgact atcaagaaga 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 4
<400> 69
ttctcctacc tttgattgac 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 5
<400> 70
cttgaagaag aatgatagcc 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 6
<400> 71
cagagactga catggaacag 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 7
<400> 72
tacactgata catccctcga 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 8
<400> 73
cagaagccaa aaatatcaca 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA target sequence 9
<400> 74
aaagagaaag ccagatatgg 20
<210> 75
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 1
<400> 75
uuacacugau acaucccucg 20
<210> 76
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 2
<400> 76
acuuuggccc agucaaucaa 20
<210> 77
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 3
<400> 77
guguaugacu aucaagaaga 20
<210> 78
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 4
<400> 78
uucuccuacc uuugauugac 20
<210> 79
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 5
<400> 79
cuugaagaag aaugauagcc 20
<210> 80
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 6
<400> 80
cagagacuga cauggaacag 20
<210> 81
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 7
<400> 81
uacacugaua caucccucga 20
<210> 82
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 8
<400> 82
cagaagccaa aaauaucaca 20
<210> 83
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3G gRNA sequence 9
<400> 83
aaagagaaag ccagauaugg 20
<210> 84
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 84
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 85
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 85
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 alpha signal peptide
<400> 86
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 87
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 87
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atcccc 66
<210> 88
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A peptide
<400> 88
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A peptide
<400> 89
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 90
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A peptide
<400> 90
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 91
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A peptide
<400> 91
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A peptide
<400> 92
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 93
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A peptide
<400> 93
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 94
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A peptide
<400> 94
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human HBB gene splice acceptor
<400> 95
ctgacctctt ctcttcctcc cacag 25
<210> 96
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG gene splice acceptor
<400> 96
tttctctcca cag 13
<210> 97
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 97
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 98
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 99
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 100
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 101
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 102
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 103
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 104
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 105
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 106
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH peptide
<400> 106
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL peptide
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 108
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 109
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 109
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 110
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence encoding scFv
<400> 110
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 111
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 112
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 113
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 114
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 115
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 116
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 117
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH peptide
<400> 118
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL peptide
<400> 119
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 120
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 120
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be present in repeats of any integer up to and
including 10
<400> 121
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 124
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 124
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be present in repeats of 3 or 4
<400> 125
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be present in repeats of 2 or 3
<400> 126
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 127
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 127
Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 128
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 128
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 129
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(6)
<223> Can be present in repeats of any integer up to and
including 4
<400> 129
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 130
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 130
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 131
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 132
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 133
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 133
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 134
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 134
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 135
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 135
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin binding peptide
<400> 136
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin binding peptide II
<400> 137
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 138
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = Glu, Asp or Met
<400> 138
His Pro Xaa
1
<210> 139
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<400> 139
His Pro Gln Phe
1
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Trp, Lys or Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = GLy or Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = Gly, Lys or Arg
<400> 140
Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 141
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = Gly or Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = Gly, Lys or Arg
<400> 141
Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa is present in numbers of 8 or 12
<400> 142
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
1 5 10 15
Lys
<210> 143
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> 9-12
<223> Is present in repeats of 2 or 3
<400> 143
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro
1 5 10 15
Glu Pro Phe Glu Lys
20
<210> 144
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 144
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 145
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 145
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 146
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 146
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 147
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 147
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 148
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 148
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin binding peptide II
<400> 149
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 150
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 150
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<220>
<221> VARIANT
<222> 2, 4
<223> Xaa = Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly,
Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg, His, Asp
and Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> 1, 3, 5
<223> Can be present in repeats of any integer up to and
including 5
<400> 151
Gly Xaa Gly Xaa Gly
1 5
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> VARIANT
<222> 4, 8
<223> Xaa = Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly,
Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg, His, Asp
and Glu
<400> 152
Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 153
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be present in repeats of any integer
<400> 153
Ser Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 154
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 154
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10

Claims (128)

1.一种工程化T细胞，其包含经修饰的恒定CD3-免疫球蛋白超家族(恒定CD3-IgSF)链基因座，所述基因座包含编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的核酸序列，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链基因座的内源恒定CD3链的融合蛋白，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
2.一种表达微型嵌合抗原受体(miniCAR)的工程化T细胞，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的融合蛋白。
3.一种工程化T细胞，其包含编码抗原结合结构域的转基因，所述转基因框内插入编码免疫球蛋白超家族的内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的基因座的开放阅读框，其中所述工程化T细胞表达包含异源抗原结合结构域和所述内源恒定CD3-IgSF链的miniCAR融合蛋白。
4.根据权利要求2或3所述的工程化T细胞，其中所述miniCAR由包含编码所述miniCAR的核酸序列的经修饰的恒定CD3-免疫球蛋白超家族(恒定CD3-IgSF)链基因座表达，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列的转基因和(ii)编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框。
5.根据权利要求1或4所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的经修饰的CD3ε(CD3E)基因座、编码CD3d链的经修饰的CD3δ(CD3D)基因座或编码CD3g链的经修饰的CD3γ(CD3G)基因座。
6.根据权利要求1、4或5中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的经修饰的CD3E基因座。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域包含Fab片段、Fab2片段、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
9.根据权利要求1或5-8中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述异源抗原结合结构域和所述内源恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链直接连接。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域和所述恒定CD3-IgSF链经由接头间接连接。
12.根据权利要求1或3-11中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因还包含编码接头的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的工程化T细胞，其中所述接头定位于所述抗原结合结构域的3'处。
14.一种工程化T细胞，其包含经修饰的CD3E基因座，所述基因座包含编码miniCAR的核酸序列，所述miniCAR包含异源抗原结合结构域和内源CD3e链，其中：
所述核酸序列包含以下项的框内融合：(i)包含编码所述抗原结合结构域的序列和编码接头的序列的转基因，其中所述抗原结合结构域是scFv，和(ii)编码所述CD3e链的内源CD3E基因座的开放阅读框。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因序列按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列和编码所述接头的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域、所述接头和所述恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是多肽接头。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:122)、GGGGGS(SEQ ID NO:128)及其组合。
20.根据权利要求12-18中任一项所述的工程化T细胞，其中所述接头包含(GGS)n，其中n是1至10；(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)，其中n是1至10；或(GGGGGS)n(SEQ ID NO:129)，其中n是1至4。
21.根据权利要求1或3-20中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因还包含编码一种或多种多顺反子元件的核酸序列。
22.根据权利要求21所述的工程化T细胞，其中P2A元件包含SEQ ID NO:3所示的序列。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的工程化T细胞，其中所述一种或多种多顺反子元件中的至少一种定位于所述抗原结合结构域5'处。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因序列按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件任选地P2A元件、所述抗原结合结构域和所述接头的核苷酸序列。
25.根据权利要求1或3-24中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因还包含编码亲和标签的核酸序列。
26.根据权利要求25所述的工程化T细胞，其中所述亲和标签是链霉亲和素结合肽。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件、所述抗原结合结构域、所述接头和所述恒定CD3-IgSF链的核苷酸序列。
28.根据权利要求1、3-13或15-27中任一项所述的工程化T细胞，其中所述内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框编码全长成熟恒定CD3-IgSF链。
29.根据权利要求1、4-13或15-28中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含所述内源基因座的可操作地连接的启动子和/或调节或控制元件，以控制编码所述miniCAR的核酸序列的表达。
30.根据权利要求1、4-13或15-28中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含一种或多种可操作地连接的异源调节或控制元件，以控制所述miniCAR或其一部分的表达。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的工程化T细胞，其中所述抗原结合结构域与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
32.根据权利要求31所述的工程化T细胞，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
33.根据权利要求31或32所述的工程化T细胞，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的工程化T细胞，其中所述miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成所述TCR/CD3复合物。
35.根据权利要求5-34中任一项所述的工程化T细胞，其中所述miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF CD3e链组装成所述TCR/CD3复合物。
36.根据权利要求34或35所述的工程化T细胞，其中靶抗原与所述miniCAR的异源抗原结合结构域的结合诱导经由所述TCR/CD3复合物的抗原依赖性信号传导。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的工程化T细胞，其中与用包含相同抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述miniCAR展现经由所述TCR/CD3复合物的降低的强直信号传导。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的工程化T细胞，其中与用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述工程化T细胞展现增加的持久性，所述CAR包含相同的抗原结合结构域和异源CD3ζ(CD3z)信号传导结构域。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的工程化T细胞，其中与用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞相比，所述工程化T细胞展现增加的细胞溶解活性，所述CAR包含相同的抗原结合结构域和异源CD3ζ(CD3z)信号传导结构域。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞是源自受试者的原代T细胞。
41.根据权利要求40所述的工程化T细胞，其中所述受试者是人。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞或其亚型，或者CD4+T细胞或其亚型。
43.根据权利要求1、2或4-42中任一项所述的工程化T细胞，其中将所述转基因经由同源定向修复(HDR)整合在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座处。
44.一种多核苷酸，其包含：
(a)编码抗原结合结构域的核酸序列；和
(b)与所述核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与T细胞的免疫球蛋白超家族恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
45.根据权利要求44所述的多核苷酸，其中所述一个或多个同源臂包含与所述恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座、编码CD3d链的CD3D基因座或编码CD3g链的CD3G基因座。
46.一种多核苷酸，其包含：
(a)编码抗原结合结构域的核酸序列；和
(b)与编码转基因的核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与编码CD3e链的CD3E基因座的开放阅读框的一个或多个区域同源的序列。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含Fab片段、Fab2片段、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含编码可操作地与所编码的抗原结合结构域连接的接头的核苷酸，其中所述接头定位于所述抗原结合结构域的3'处。
50.根据权利要求49所述的多核苷酸，其中所编码的接头是长度为3至18个氨基酸的多肽。
51.根据权利要求49或50中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头包含GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:122)、GGGGGS(SEQ ID NO:128)及其组合。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头包含(GGS)n，其中n是1至10；(GGGGS)n(SEQ ID NO:121)，其中n是1至10；或(GGGGGS)n(SEQ ID NO:129)，其中n是1至4。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的接头选自以下编码的接头，其包含GGS、包含GGGGS(SEQ ID NO:122)、包含GGGGGS(SEQ ID NO:128)、包含(GGS)2(SEQ ID NO:130)、是或包含GGSGGSGGS(SEQ ID NO:131)、包含GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:132)、包含GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:133)、包含GGGGGSGGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:134)、包含GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:135)、包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列按5'到3'顺序包含编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列和编码所述接头的核苷酸序列。
55.根据权利要求44-54中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列还包含编码一种或多种多顺反子元件的核苷酸。
56.根据权利要求55所述的多核苷酸，其中所述多顺反子元件包含P2A元件，其中所述P2A元件包含SEQ ID NO:3所示的序列。
57.根据权利要求55或56所述的多核苷酸，其中所述核酸序列按5'到3'顺序包含编码所述多顺反子元件任选地P2A元件、所述抗原结合结构域和所述接头的核苷酸序列。
58.根据权利要求44-57中任一项所述的多核苷酸，其中所述一个或多个同源臂包含5'同源臂和3'同源臂，并且所述多核苷酸包含结构[5'同源臂]-[(a)的核酸序列]-[3'同源臂]。
59.根据权利要求58所述的多核苷酸，其中所述5'同源臂和所述3'同源臂独立地具有为或约100、200、300、400、500、600、700或800个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度；或者具有大于为或约100个核苷酸的长度，任选地为或约100、200或300个核苷酸或任何前述值之间的任何值的长度。
60.根据权利要求58或59所述的多核苷酸，其中所述5'同源臂包含展现至少85％的序列
61.根据权利要求58-60中任一项所述的多核苷酸，其中所述3'同源臂包含与SEQ IDNO:5展现至少85％序列同一性的序列。
62.根据权利要求44-61中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的抗原结合结构域与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
63.根据权利要求62所述的多核苷酸，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
64.根据权利要求62或63所述的多核苷酸，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
65.根据权利要求44-45和47-64中任一项所述的多核苷酸，其中将所述多核苷酸引入T细胞的基因组中产生编码微型嵌合抗原受体(miniCAR)的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座，其中所述miniCAR是包含由所述多核苷酸的核酸编码的抗原结合结构域和内源恒定CD3-IgSF链的融合蛋白，并且其中所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码所述抗原结合结构域的核酸，其与编码所述恒定CD3-IgSF链的内源恒定CD3-IgSF链基因座的开放阅读框同框。
66.根据权利要求65所述的多核苷酸，其中所述内源恒定CD3-IgSF链是CD3e链、CD3d链或CD3g链。
67.根据权利要求65-66中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的miniCAR取代TCR/CD3复合物的相应内源恒定CD3-IgSF链组装成所述TCR/CD3复合物。
68.根据权利要求44-67中任一项所述的多核苷酸，其是线性多核苷酸。
69.根据权利要求44-68中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含于载体中。
70.根据权利要求44-69中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有约500与约3000个核苷酸之间、约1000与约2500个核苷酸之间或者约1500个核苷酸与约2000个核苷酸之间的长度。
71.一种载体，其包含根据权利要求44-67和69-70中任一项所述的多核苷酸。
72.根据权利要求71所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
73.根据权利要求72所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
74.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求44-73中任一项所述的多核苷酸引入T细胞群体中，其中所述群体的T细胞在内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
75.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求71-73中任一项所述的载体引入T细胞群体中，其中所述群体的T细胞在内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链。
76.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将能够在所述群体中的T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体中，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链；和
(b)将根据权利要求44-70中任一项所述的多核苷酸引入所述T细胞群体中，其中所述群体中的T细胞在所述内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏。
77.一种产生基因工程化T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将能够在所述群体中的T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入T细胞群体中，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座编码恒定CD3-IgSF链；和
(b)将根据权利要求71-73中任一项所述的载体引入所述T细胞群体中，其中所述群体中的T细胞在所述内源恒定CD3-IgSF链基因座处包含遗传破坏。
78.根据权利要求74-77中任一项所述的方法，其中将所述多核苷酸的核酸序列经由同源定向修复(HDR)整合到所述内源恒定CD3-IgSF链基因座中。
79.根据权利要求74-78中任一项所述的方法，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3ε(CD3E)基因座、编码CD3d链的CD3δ(CD3D)基因座或编码CD3g链的CD3γ(CD3G)基因座。
80.根据权利要求74-79中任一项所述的方法，其中通过将在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂引入所述T细胞群体来进行所述遗传破坏。
81.根据权利要求76-80中任一项所述的方法，其中所述能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含特异性结合至或杂交至所述靶位点的DNA结合蛋白或DNA结合核酸、包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或RNA指导的核酸酶，任选地其中所述一种或多种药剂包含特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)或和CRISPR-Cas9组合。
82.根据权利要求76-81中任一项所述的方法，其中所述一种或多种药剂中的每一种包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述一种或多种药剂是作为包含所述gRNA和Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物来引入的，任选地其中所述RNP是经由电穿孔、粒子枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压，任选地经由电穿孔来引入的。
84.根据权利要求82-83中任一项所述的方法，其中所述gRNA具有靶向结构域序列UUGACAUGCCCUCAGUAUCC(SEQ ID NO:8)。
85.根据权利要求74-84中任一项所述的方法，其中所述T细胞群体包含源自受试者的原代T细胞。
86.根据权利要求74-85中任一项所述的方法，其中所述T细胞包含CD8+T细胞或其亚型，或者CD4+T细胞或其亚型。
87.根据权利要求74和76-86中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是线性多核苷酸。
88.根据权利要求74和76-86中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含于载体中。
89.根据权利要求76-88中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种药剂和所述多核苷酸或载体同时或按任何顺序依序引入。
90.根据权利要求89所述的方法，其中在引入所述一种或多种药剂之后立即，或者在引入所述一种或多种药剂之后约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、6分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时或4小时内引入所述多核苷酸或载体。
91.根据权利要求76-90中任一项所述的方法，其中在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之前，所述方法包括在刺激或激活所述群体中的一种或多种T细胞的条件下，用一种或多种刺激剂在体外孵育所述T细胞群体。
92.根据权利要求76-91中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之前、期间或之后，将所述T细胞群体与一种或多种重组细胞因子一起孵育。
93.根据权利要求91或92所述的方法，其中所述孵育是在引入所述一种或多种药剂和引入所述多核苷酸或载体之后进行的，并且其中所述孵育持续至多21天，任选地至多或约7天。
94.根据权利要求76-92中任一项所述的方法，其还包括在用于扩增的条件下培育所述T细胞群体，其中所述培育是在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸或载体之后进行的。
95.根据权利要求93所述的方法，其中在用于扩增的条件下进行培育包括将所述T细胞群体与所述抗原结合结构域的靶抗原、表达所述靶抗原的靶细胞或结合所述抗原结合结构域的抗独特型抗体一起孵育。
96.根据权利要求93或94所述的方法，其中在用于扩增的条件下进行所述培育，持续至多21天。
97.根据权利要求74-95中任一项所述的方法，其中所述方法导致至少75％的所述T细胞群体中的细胞包含所述恒定CD3-IgSF链基因座内的至少一个靶位点的遗传破坏。
98.根据权利要求74-96中任一项所述的方法，其中所述方法导致至少或大于25％的通过所述方法生成的T细胞群体中的T细胞表达所述miniCAR。
99.一种群体，其包含通过根据权利要求74-97中任一项所述的方法产生的工程化T细胞。
100.一种T细胞，其包含含有微型嵌合抗原受体(CAR)的TCR/CD3复合物，其中所述miniCAR是包含异源抗原结合结构域和所述TCR/CD3复合物的免疫球蛋白超家族内源恒定CD3链(恒定CD3-IgSF链)的融合蛋白。
101.根据权利要求99所述的T细胞，其中所述miniCAR由所述T细胞的经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座表达，所述经修饰的恒定CD3-IgSF链基因座包含编码所述miniCAR的核酸序列。
102.根据权利要求100所述的T细胞，其中所述恒定CD3-IgSF链基因座是CD3ε(CD3E)、CD3δ(CD3D)或CD3γ(CD3G)基因座。
103.一种组合物，其包含根据权利要求1-44中任一项所述的工程化T细胞、根据权利要求98所述的包含工程化T细胞的群体或根据权利要求99-101中任一项所述的T细胞。
104.一种组合物，其包含通过根据权利要求74-97中任一项所述的方法产生的工程化T细胞。
105.根据权利要求102或权利要求103所述的组合物，其中所述组合物包含CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
106.根据权利要求104所述的组合物，其中所述组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且CD4+与CD8+T细胞的比率是从约1:3至3:1。
107.根据权利要求102-105中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多种表达所述miniCAR的T细胞。
108.根据权利要求102-106中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约1x 106、1.5x 106、2.5x 106、5x 106、7.5x 106、1x 107、1.5x 107、2x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x107、1x 108、1.5x 108、2.5x 108或5x 108个总T细胞。
109.根据权利要求102-107中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约1x 105、2.5x 105、5x 105、6.5x 105、1x 106、1.5x 106、2x 106、2.5x 106、5x 106、7.5x 106、1x 107、1.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108或2.5x 108个表达所述miniCAR的T细胞。
110.根据权利要求102-108中任一项所述的组合物，其中T细胞在表达所述miniCAR的组合物中的频率是为或约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％或更多的在所述组合物中的总细胞，或在所述组合物中的总CD4+T细胞或CD8+T细胞，或在内源恒定CD3-IgSF链基因座内包含遗传破坏的组合物中的总细胞。
111.根据权利要求102-109中任一项所述的组合物，其是药物组合物。
112.一种治疗方法，其包括向患有疾病或障碍的受试者施用根据权利要求1-43中任一项所述的工程化T细胞、根据权利要求98所述的包含工程化T细胞的群体、根据权利要求99-101中任一项所述的T细胞或根据权利要求102-110中任一项所述的组合物。
113.根据权利要求1-43中任一项所述的工程化T细胞、根据权利要求98所述的包含工程化T细胞的群体、根据权利要求99-101中任一项所述的T细胞或根据权利要求102-110中任一项所述的组合物用于治疗疾病或障碍的用途。
114.根据权利要求1-43中任一项所述的工程化T细胞、根据权利要求98所述的包含工程化T细胞的群体、根据权利要求99-101中任一项所述的T细胞或根据权利要求102-110中任一项所述的组合物在制造用于治疗疾病或障碍的药物中的用途。
115.根据权利要求1-43中任一项所述的工程化T细胞、根据权利要求98所述的包含工程化T细胞的群体、根据权利要求99-101中任一项所述的T细胞或根据权利要求102-110中任一项所述的组合物，用于在治疗疾病或障碍中使用。
116.根据权利要求110-114中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中与所述疾病或障碍相关的细胞或组织表达被所述抗原结合结构域识别的靶抗原。
117.根据权利要求110-115中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述疾病或障碍是癌症或肿瘤。
118.根据权利要求116所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症或所述肿瘤是淋巴瘤、白血病或浆细胞恶性肿瘤。
119.根据权利要求116或117所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症是淋巴瘤，并且所述淋巴瘤是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、滤泡性淋巴瘤、小无裂细胞性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤、结节单核细胞样B细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、肺B细胞血管中心淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。
120.根据权利要求117-118中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症是白血病，并且所述白血病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、浆细胞白血病或急性淋巴细胞白血病(ALL)。
121.根据权利要求117-118中任一项所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症是浆细胞恶性肿瘤，并且所述浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)。
122.根据权利要求116所述的方法、用途、用于所述用途的工程化T细胞、工程化T细胞的群体、T细胞或组合物，其中所述癌症或所述肿瘤是实体瘤，任选地其中所述实体瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)或头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
123.一种试剂盒，其包含：
能够在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及
根据权利要求44-70中任一项所述的多核苷酸。
124.一种试剂盒，其包含：
能够在T细胞的内源恒定CD3-IgSF链基因座内的靶位点处诱导遗传破坏的一种或多种药剂；以及
根据权利要求44-70中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸被靶向以供经由同源定向修复(HDR)整合于靶位点处或附近；以及
用于进行根据权利要求71-96中任一项所述的方法的说明书。
125.根据权利要求122或123所述的试剂盒，其中所述内源恒定CD3-IgSF链基因座是编码CD3e链的CD3E基因座、编码CD3d链的CD3D基因座或编码CD3g链的CD3G基因座。
126.根据权利要求122-124中任一项所述的试剂盒，其中所述能够诱导遗传破坏的一种或多种药剂包含特异性结合至或杂交至所述靶位点的DNA结合蛋白或DNA结合核酸、包含DNA靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或RNA指导的核酸酶，任选地其中所述一种或多种药剂包含特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)或和CRISPR-Cas9组合。
127.根据权利要求122-125中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种药剂中的每一种包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)。
128.根据权利要求126所述的试剂盒，其中所述gRNA具有靶向结构域序列UUGACAUGCCCUCAGUAUCC(SEQ ID NO:8)。
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