TW202134264A

TW202134264A - 嵌合抗原受體及其用途

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Publication number: TW202134264A
Application number: TW109141448A
Authority: TW
Inventors: 艾達艾柏喬; 約翰布藍肯錫; 艾堤里歐波丹札; 珍妮佛布羅格登; 德秀部; 維塔瑟琳娜德; 葛玲卓納夫; 柏瑞斯安格斯; 湯尼佛雷明; 麥可Ｒ格林; 艾妮莎海克; 布萊恩霍姆柏格; 康妮洪; 綠黃; 歐賈柯德拉希; 林亨旭; 伊麗莎白朵洛希布萊帝柯; 安卓普萊斯; 阿卡西索荷尼; 安卓馬克史坦
Original assignee: 瑞士商諾華公司
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-09-16
Also published as: JP7714545B2; AR120566A1; AU2020393912A1; WO2021108661A3; KR20220105664A; BR112022010206A2; WO2021108661A2; CL2022001374A1; EP4065158A2; AU2020393912B2; CN114761037A; PH12022551291A1; MX2022006391A; US20210220404A1; US12383601B2; CA3163104A1; JP2025165962A; JP2023503163A; IL293215A

Abstract

本發明提供了表現嵌合抗原受體(CAR)的免疫效應細胞(例如T細胞、NK細胞)、及其組成物和方法。

Description

嵌合抗原受體及其用途

相關申請的交叉引用

本申請要求2019年11月26日提交的美國序號62/940509的優先權，將其全部內容藉由引用併入本文。

序列表

本申請包含按ASCII格式以電子方式提交並特此藉由引用以其全文併入的序列表。所述ASCII副本創建於2020年11月24日，名稱為N2067-7166WO_SL.txt，並且大小為598,194位元組。

本發明通常關於經工程化以表現嵌合抗原受體(CAR)的免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)及其組成物和用途。

使用T細胞(特別是用嵌合抗原受體(CAR)轉導的T細胞)的過繼性細胞轉移(ACT)療法在若干個血液癌症試驗中顯示出前景。存在對改善表現CAR的細胞治療產品的產生、提高產品品質和使產品的治療功效最大化之方法和程序的需求。

在一個方面，本發明的特徵在於包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域的細胞(例如免疫細胞，如T細胞或NK細胞)。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域。在一些實施方式中，該抗BCMA結合結構域包含本文揭露的抗BCMA結合序列(例如CDR、VH、VL)或在表3-15、19、20、22、26和31中揭露的scFv序列。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域係抗CD19結合結構域。在一些實施方式中，該抗CD19結合結構域包含本文揭露的抗CD19結合序列(例如CDR、VH、VL)或在表2、19、22和31中揭露的scFv序列。

在一些實施方式中，本發明提供了一種細胞，該細胞包含：(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和(b)第二抗原結合結構域。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在兩個嵌合抗原受體(CAR)中。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在一個CAR中。

在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、109、88、95、114和115的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、109、88、95、114和97的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：93或112的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH由SEQ ID NO：260、94或113的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：102、118或124的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VL由SEQ ID NO：261、103、119或125的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：93和102的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：112和118的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：112和124的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段包含SEQ ID NO：105、120或126的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：253、106、121或127的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中。在一些實施方式中，該第一CAR包含SEQ ID NO：107、226、122或128的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR由SEQ ID NO：259、258、108、123或129的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、46、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、68、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：78、52或70的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH由SEQ ID NO：79、53或71的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VL由SEQ ID NO：62的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：78和61的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：52和61的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：70和61的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域包含單鏈可變片段 (scFv)，該單鏈可變片段包含SEQ ID NO：80、64或72的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%的序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：81、65或73的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中。在一些實施方式中，該第一CAR包含SEQ ID NO：224、82、66或74的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR由SEQ ID NO：83、67或75的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：137、138、139、147、148和149的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：160、161、162、147、170和171的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：145或168的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH由SEQ ID NO：146或169的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：154或173的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VL由SEQ ID NO：155或174的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：145和154的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：168和173的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段包含SEQ ID NO：156或175的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：157或176的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中。在一些實施方式中，該第一CAR包含SEQ ID NO：158或177的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR由SEQ ID NO：159或178的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，本文提供了細胞，該細胞包含：(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含：(i)VH和VL，該VH包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該VL包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該VH和VL藉由連接子(linker)連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；(ii)VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：239和242的胺基酸序列，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；或(iii)scFv，該scFv包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列；和(b)第二抗原結合結構域。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在兩個嵌合抗原受體(CAR)中。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在一個CAR中。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域與抗原結合，該抗原選自：CD19，CD5，CD10，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD30，CD34，CD37，CD38，CD40，CD53，CD69， CD72，CD73，CD74，CD75，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD123，CD135，CD138，CD179，CD269，Flt3，ROR1，FcRn5，FcRn2，CS-1，CXCR4、5、7，IL-7/3R，IL7/4/3R或IL4R，視需要其中B細胞抗原選自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1、CD138、CD123、CD33、CD34、CLL-1、葉酸受體β或FLT3。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域與CD19結合。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域與抗原結合，該抗原選自：EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。

在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域與CD19結合。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域包含表19或表22中列出的抗CD19序列的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2、和/或LC CDR3，例如分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域包含表19或表22中列出的抗CD19序列的VH和/或VL，例如分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的VH和VL。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域包含表19或表22中列出的抗CD19序列的scFv，例如包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的scFv。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域佈置在第二CAR中，其中該CAR包含表19或表22中列出的抗CD19序列的CAR，例如包含SEQ ID NO：225或229的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的CAR。

在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含以下胺基酸序列：(a)SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97；(b)SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56；或(c)SEQ ID NO：44、45、46、54、55和56。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含以下胺基酸序列：(a)SEQ ID NO：93和102；(b)SEQ ID NO：78和61；或(c)SEQ ID NO：52和61。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：105、80或64的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：253、 106、81或65的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該第二抗原結合結構域由SEQ ID NO：212的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中，並且該第二抗原結合結構域佈置在第二CAR中。在一些實施方式中，該第一CAR進一步包含第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，該第二CAR進一步包含第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域。

在一些實施方式中，該第一CAR由第一核酸序列編碼，並且該第二CAR由第二核酸序列編碼，其中該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上。

在一些實施方式中，該第一CAR由第一核酸序列編碼，並且該第二CAR由第二核酸序列編碼，其中該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上。在一些實施方式中，該單個核酸分子在5'至3'方向上包含以下組態：編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-編碼第一跨膜結構域的核酸序列-編碼第一細胞內傳訊結構域的核酸序列-編碼連接子的核酸序列-編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-編碼第二跨膜結構域的核酸序列-編碼第二細胞內傳訊結構域的核酸序列。在一些實施方式中，該單個核酸分子在5'至3'方向上包含以下組態：編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-編碼第二跨膜結構域的核酸序列-編碼第二細胞內傳訊結構域的核酸序列-編碼連接子的核酸序列-編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-編碼第一跨膜結構域的核酸序列-編碼第一細胞內傳訊結構域的核酸序列。在一些實施方式中，該連接子包含自身切割位點。在一些實施方式中，該連接子包含P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點。在一些實施方式中，該連接子包含P2A位點。在一些實施方式中，該連接子由SEQ ID NO：209的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該連接子包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該單個核酸分子包含SEQ ID NO：215、217、219、221或223的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列。在一些實施方式中，該單個核酸分子編碼SEQ ID NO：214、216、218、220或222的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在一個CAR中，其中該CAR進一步包含跨膜結構域和細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域包含第一VH(VH1)和第一VL(VL1)，並且該第二抗原結合結構域包含第二VH(VH2)和第二VL(VL2)。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH2-視需要連接子1(「L1」)-VL1-視需要連接子2(「L2」)-VH1-視需要連接子3(「L3」)-VL2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VL1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1。在一些實施方式中，該 VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1。在一些實施方式中，該VH1和VL1分別包含SEQ ID NO：93和102的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該VH1和VL1分別包含SEQ ID NO：333和334的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該VH1和VL1分別包含SEQ ID NO：78和61的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該VH1和VL1分別包含SEQ ID NO：335和336的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該VH2和VL2分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該VH2和VL2分別包含SEQ ID NO：331和332的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，L1或L3包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，L2包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該CAR包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成：SEQ ID NO：321-330，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CAR包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成：SEQ ID NO：339-348，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該CAR由核酸分子編碼，該核酸分子在5'至3'方向上包含以下組態：編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-視需要編碼連接子的核酸序列-編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-編碼跨膜結構域的核酸序列-編碼細胞內傳訊結構域的核酸序列。在一些實施方式中，該CAR由核酸分子編碼，該核酸分子在5'至3'方向上包含以下組態：編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-視需要編碼連接子的核酸序列-編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-編碼跨膜結構域的核酸序列-編碼細胞內傳訊結構域的核酸序列。

在一些實施方式中，該CAR在N-至C-方向上包含以下組態：該第一抗原結合結構域-視需要連接子-該第二抗原結合結構域-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，該CAR在N-至C-方向上包含以下組態：該第二抗原結合結構域-視需要連接子-該第一抗原結合結構域-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域。

在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域或第二抗原結合結構域包含VH和VL。在一些實施方式中，該VH和VL藉由連接子連接。在一些實施方式中，該連接子包含SEQ ID NO：5、63、104或243的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域包含選自T細胞受體的α、β或ζ鏈，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137或CD154的蛋白質的跨膜結構域。在一些實施方式中，該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域由SEQ ID NO：17的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，該第一抗原結合結構域或第二抗原結合結構域藉由鉸鏈區(例如第一或第二鉸鏈區)與該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域連接。在一些實施方式中，該鉸鏈區包含SEQ ID NO：2、3或4的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該鉸鏈區由SEQ ID NO：13、14或15的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該鉸鏈區和該跨膜結構域包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該鉸鏈區和該跨膜結構域由SEQ ID NO：203或213的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含初級傳訊結構域(例如第一或第二初級傳訊結構域)。在一些實施方式中，該初級傳訊結構域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該初級傳訊結構域由SEQ ID NO：20、21或205的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含共刺激傳訊結構域(例如第一或第二共刺激傳訊結構域)。在一些實施方式中，該共刺激傳訊結構域包含源自MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK細胞受體、BTLA、Toll配位基受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、 CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB或與CD83特異性結合的配位基的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該共刺激傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該共刺激傳訊結構域由SEQ ID NO：18或204的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含源自4-1BB的功能性傳訊結構域和源自CD3ζ的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)和SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列和SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該CAR、第一CAR或第二CAR進一步包含前導序列(例如第一或第二前導序列)。在一些實施方式中，該前導序列包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該前導序列由SEQ ID NO：199或210的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，該第一前導序列和該第二前導序列由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。在一些實施方式中，該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。在一些實施方式中，該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。在一些實施方式中，該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。在一些實施方式中，該第一前導序列和該第二前導序列包含相同的胺基酸序列(例如該第一前導序列和該第二前導序列包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該第一前導序列和該第二前導序列包含不同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區包含相同的胺基酸序列(例如該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區包含不同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域包含相同的胺基酸序列(例如該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域包含不同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域包含相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域包含不同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含相同的胺基酸序列(例如該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含不同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含相同的胺基酸序列(例如該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含不同的胺基酸序列(例如該第一和第二共刺激傳訊結構域分別包含4-1BB共刺激結構域序列和CD28共刺激結構域序列；或分別包含CD28共刺激結構域序列和4-1BB共刺激結構域序列)。在一些實施方式中，該第一前導序列和該第二前導序列由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：199和210(或與其具有至少約85%、90%、 95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一前導序列和該第二前導序列由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：210和199(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：337和13(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：13和337(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：338和17(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：17和338(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：204和18(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：18和204(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：205和21(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由核酸序列編碼，該核酸序列分別包含SEQ ID NO：21和205(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)。

在一些實施方式中，該CAR、第一CAR或第二CAR由包含土撥鼠肝炎轉錄後調控元件(WPRE)的核酸分子編碼。

在一些實施方式中，本文提供了核酸分子，該核酸分子包含：(a)編碼第一抗原結合結構域的第一核酸序列，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和(b)編碼第二抗原結合結構域的第二核酸序列。

在一些實施方式中，該分離的核酸分子包含第一核酸分子和第二核酸分子，該第一核酸分子和第二核酸分子係分開的核酸分子，並且其中該第一核酸序列佈置在該第一核酸分子上，並且該第二核酸序列佈置在該第二核酸分子上。

在一些實施方式中，本文提供了核酸分子，該核酸分子包含：(a)編碼第一抗原結合結構域的第一核酸序列，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含：(i)VH和VL，該VH包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該VL包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；(ii)VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：239和242的胺基酸序列，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；或(iii)scFv，該scFv包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列；和(b)編碼第二抗原結合結構域的第二核酸序列。

在一些實施方式中，本文提供了核酸分子，該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第一CAR包含第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，並且其中該第二CAR包含第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，該第二抗原結合結構域係抗CD19結合結構域，其中(i)該第一抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列；(ii)該第一抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：93和102的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列；(iii)該第一抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列；(iv)該第一CAR包含SEQ ID NO：107或226的胺基酸序列，並且該第二CAR包含SEQ ID NO：225或229的胺基酸序列；或(v)該分離的核酸分子包含SEQ ID NO：271的核酸序列。

在一些實施方式中，本文提供了核酸分子，該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第一CAR包含第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，並且其中該第二CAR包含第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，該第二抗原結合結構域係抗CD19結合結構域，其中：(i)該第一抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56的胺基酸序列，該第二抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列；(ii)該第一抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：78和61的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列；(iii)該第一抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列；(iv)該第一CAR包含SEQ ID NO：82或224的胺基酸序列，並且該第二CAR包含SEQ ID NO：225或229的胺基酸序列；或(v)該分離的核酸分子包含SEQ ID NO：215的核酸序列。

在一些實施方式中，本文提供了多肽分子，該多肽分子由本文揭露的核酸分子編碼。

在一些實施方式中，本文提供了CAR，其中該CAR包含：(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和(b)第二抗原結合結構域。

在一些實施方式中，本文提供了CAR，其中該CAR包含：(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含：(i)VH和VL，該VH包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該VL包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；(ii)VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：239和242的胺基酸序列，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；或(iii)scFv，該scFv包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列；和(b)第二抗原結合結構域。

在一些實施方式中，本文提供了載體，該載體包含本文揭露的核酸分子或編碼本文揭露的CAR的核酸分子。在一些實施方式中，該載體選自DNA載體、RNA載體、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。在一些實施方式中，該載體包含EF-1啟動子，該EF-1啟動子包含SEQ ID NO：11的核酸序列。

在一些實施方式中，本文提供了細胞，該細胞包含本文揭露的核酸分子、編碼本文揭露的CAR的核酸分子、本文揭露的多肽、本文揭露的CAR或本文揭露的載體。在一些實施方式中，該細胞係T細胞或NK細胞。

在一些實施方式中，本文揭露了製備細胞之方法，該方法包括用本文揭露的載體轉導細胞，視需要其中該細胞係T細胞或NK細胞。在一些實施方式中，本文揭露了製備RNA工程化細胞之方法，該方法包括將體外轉錄的 RNA或合成RNA引入細胞，其中該RNA包含本文揭露的核酸分子、編碼本文揭露的CAR的核酸分子。在一些實施方式中，該細胞係T細胞或NK細胞。

在一些實施方式中，本文揭露了製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：(i)使細胞(例如T細胞，例如從冷凍或新鮮的白血球單採產物中分離的T細胞)群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或與刺激細胞表面上共刺激分子的藥劑接觸(例如結合)；(ii)使細胞(例如T細胞)群體與本文揭露的核酸分子或編碼本文揭露的CAR的核酸分子接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體；和(iii)收穫細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製細胞群體)或投與，其中：

(a)步驟(ii)與步驟(i)一起進行或在步驟(i)開始後不晚於20小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時進行，並且

步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於30(例如26)小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於24小時進行，

(b)步驟(ii)與步驟(i)一起進行或在步驟(i)開始後不晚於20小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時進行，並且

步驟(iii)在步驟(ii)開始後不晚於30小時進行，例如在步驟(ii)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時進行，或

(c)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%；

視需要其中步驟(ii)中的核酸分子在病毒載體上，視需要其中步驟(ii)中的核酸分子係病毒載體上的RNA分子，視需要其中步驟(ii)包括用病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該病毒載體包含編碼該CAR的核酸分子。

在一些實施方式中，本文揭露了製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：(1)使細胞(例如T細胞，如從冷凍的白血球單採產物分離的T細胞)群體與細胞介素(選自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、或其組合)接觸；(2)使該細胞(例如T細胞)群體與本文揭露的核酸分子或編碼本文揭露的CAR的核酸分子接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體；和(3)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製細胞群體)或投與，其中：

(a)步驟(2)與步驟(1)一起進行或在步驟(1)開始後不晚於5小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於1、2、3、4、或5小時進行，並且

步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於26小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於22、23、或24小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於24小時進行，或

(b)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%；

視需要其中步驟(2)中的核酸分子在病毒載體上，視需要其中步驟(ii)中的核酸分子係病毒載體上的RNA分子，視需要其中步驟(ii)包括用病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該病毒載體包含編碼該CAR的核酸分子。

在一些實施方式中，本文揭露了被工程化以表現CAR的細胞群體(「表現CAR的細胞群體」)，所述群體包含：(a)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，約相同百分比的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；(b)例如如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；(c)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，百分比增加的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；(d)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；(e)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；(f)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，百分比降低的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞，例如降低至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%；(g)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；(h)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；或(i)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體 β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，百分比增加的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞。在一些實施方式中，該群體包含本文揭露的細胞。在一些實施方式中，該群體包含細胞，該細胞包含本文揭露的雙CAR或雙抗體CAR。在一些實施方式中，該群體包含細胞，該細胞包含(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和(b)第二抗原結合結構域。

在一些實施方式中，本文揭露了藥物組成物，該藥物組成物包含本文揭露的細胞或本文揭露的細胞群體和藥學上可接受的運載體。

在一些實施方式中，藉由本文揭露之方法製備該細胞群體。在一些實施方式中，該群體包含：

(a)第一細胞群體，該第一細胞群體包含抗BCMA CAR但不包含抗CD19 CAR；

(b)第二細胞群體，該第二細胞群體包含抗CD19 CAR但不包含抗BCMA CAR；和

(c)第三細胞群體，該第三細胞群體包含抗BCMA CAR和抗CD19 CAR二者。

在一些實施方式中：

(i)合併的第二和第三群體中活細胞總數小於或等於合併的第一和第三群體中活細胞總數的約110%(例如小於或等於約105%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%或更少)；

(ii)合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於合併的第二和第三群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000、10000%或更多)；和/或

(iii)合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於群體中活細胞總數的約5%(例如大於或等於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)。

在一些實施方式中，該群體進一步包含第四細胞群體，該第四細胞群體不包含CAR。

在一些實施方式中：

(i)該第二群體中活細胞總數小於或等於合併的第一和第三群體中活細胞總數的約110%(例如小於或等於約105%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%或更少)；

(ii)該第二群體中活細胞總數小於或等於：約45%至約50%(例如約47%)；約50至約55%(例如約53%)；約60%至約65%(例如約63%)；或合併的第一和第三群體中活細胞總數的約80至約85%(例如約82%)。

在一些實施方式中，本文揭露了在受試者中提供抗腫瘤免疫之方法，該方法包括向受試者投與有效量的本文揭露的細胞、本文揭露的細胞群體或本文揭露的藥物組成物。在一些實施方式中，本文揭露了治療患有與BCMA表現相關的疾病的受試者之方法，該方法包括向受試者投與有效量的本文揭露的細胞、本文揭露的細胞群體或本文揭露的藥物組成物。在一些實施方式中，與BCMA表現相關的疾病係：(i)癌症或惡性腫瘤，或選自以下一者或多者的癌前病症：骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期，或(ii)與BCMA表現相關的非癌症相關適應症。在一些實施方式中，該疾病係血液癌或實體癌。在一些實施方式中，該疾病選自：急性白血病、B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生症、MALT淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良和骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、前列腺癌(例如，去勢抵抗性或治療抵抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌、肺癌、漿細胞增殖性障礙(例如，無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義未明的單株丙種球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、或POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群(Crow-Fukase syndrome)、高月病(Takatsuki disease)和PEP症候群))、或該疾病的組合。在一些實施方式中，該疾病係多發性骨髓瘤。

在一些實施方式中，將該細胞群體或藥物組成物按約1 x 10⁶至約1 x 10⁸(例如約2 x 10⁶至約5 x 10⁷、約5 x 10⁶至約2 x 10⁷、約1 x 10⁶至約1 x 10⁷、約1 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁶至約3 x 10⁶、約2 x 10⁶至約4 x 10⁶、約3 x 10⁶至約5 x 10⁶、約4 x 10⁶至約6 x 10⁶、約5 x 10⁶至約7 x 10⁶、約6 x 10⁶至約8 x 10⁶、約7 x 10⁶至約9 x 10⁶、約8 x 10⁶至約1 x 10⁷、約9 x 10⁶至約2 x 10⁷、約1 x 10⁷至約3 x 10⁷、約2 x 10⁷至約4 x 10⁷、約3 x 10⁷至約5 x 10⁷、約4 x 10⁷至約6 x 10⁷、約5 x 10⁷至約7 x 10⁷、約6 x 10⁷至約8 x 10⁷、約7 x 10⁷至約9 x 10⁷、約8 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁶、約2 x 10⁶、約3 x 10⁶、約4 x 10⁶、約5 x 10⁶、約6 x 10⁶、約7 x 10⁶、約8 x 10⁶、約9 x 10⁶、約1 x 10⁷、約2 x 10⁷、約3 x 10⁷、約4 x 10⁷、約5 x 10⁷、約6 x 10⁷、約7 x 10⁷、約8 x 10⁷、約9 x 10⁷或約1 x 10⁸)個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的劑量向受試者投與。在一些實施方式中，將該細胞群體或藥物組成物按約5 x 10⁶至約2 x 10⁷個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的劑量向受試者投與。

在一些實施方式中，將該細胞群體或藥物組成物以一個或多個(例如2、3、4或更多個)劑量向受試者投與。在一些實施方式中，將該細胞群體或藥物組成物以兩個劑量向受試者投與。在一些實施方式中，該一個或多個劑量包含第一劑量和第二劑量，其中該第一劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量高於、等於或低於該第二劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量。

在一些實施方式中，該一個或多個劑量包含第一劑量和第二劑量，其中：

(a)該第一劑量包含約1 x 10⁶至約1 x 10⁷(例如約2 x 10⁶至約8 x 10⁶、約4 x 10⁶至約6 x 10⁶、約1 x 10⁶至約5 x 10⁶、約5 x 10⁶至約1 x 10⁷、約1 x 10⁶至約3 x 10⁶、約2 x 10⁶至約4 x 10⁶、約3 x 10⁶至約5 x 10⁶、約4 x 10⁶至約6 x 10⁶、約5 x 10⁶至約7 x 10⁶、約6 x 10⁶至約8 x 10⁶、約7 x 10⁶至約9 x 10⁶、約8 x 10⁶至約1 x 10⁷、約1 x 10⁶、約2 x 10⁶、約3 x 10⁶、約4 x 10⁶、約5 x 10⁶、約6 x 10⁶、約7 x 10⁶、約8 x 10⁶、約9 x 10⁶或約1 x 10⁷)個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)；

(b)該第二劑量包含約1 x 10⁷至約1 x 10⁸(例如約2 x 10⁷至約8 x 10⁷、約4 x 10⁷至約6 x 10⁷、約1 x 10⁷至約5 x 10⁷、約5 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁷至約3 x 10⁷、約2 x 10⁷至約4 x 10⁷、約3 x 10⁷至約5 x 10⁷、約4 x 10⁷至約6 x 10⁷、約5 x 10⁷至約7 x 10⁷、約6 x 10⁷至約8 x 10⁷、約7 x 10⁷至約9 x 10⁷、約8 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁷、約2 x 10⁷、約3 x 10⁷、約4 x 10⁷、約5 x 10⁷、約6 x 10⁷、約7 x 10⁷、約8 x 10⁷、約9 x 10⁷或約1 x 10⁸)個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)；

(c)該第一劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量不超過該第二劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量的1/X，其中X係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100；和/或

(d)該第一劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量係該第二劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量的在約1%和100%之間(例如在約10%和約90%之間、在約20%和約80%之間、在約30%和約70%之間、在約40%和約60%之間、在約10%和約50%之間、在約50%和約90%之間、在約10%和約30%之間、在約20%和約40%之間、在約30%和約50%之間、在約50%和約70%之間、在約60%和約80%之間或在約70%和約90%之間)。

在一些實施方式中，該第一劑量包含約5x10⁶個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)。在一些實施方式中，該第二劑量包含約1x10⁷或約2x10⁷個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)。

在一些實施方式中，該方法還包括向受試者投與第二治療劑。在一些實施方式中，該第二治療劑選自：(i)PD-1抑制劑，視需要其中該PD-1抑制劑選自由PDR001、納武單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、MEDI0680、REGN2810、 TSR-042、PF-06801591和AMP-224組成的組；(ii)PD-L1抑制劑，視需要其中該PD-L1抑制劑選自由FAZ053、阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗和BMS-936559組成的組；(iii)LAG-3抑制劑，視需要其中該LAG-3抑制劑選自由LAG525、BMS-986016、TSR-033、MK-4280和REGN3767組成的組；(iv)TIM-3抑制劑，視需要其中該TIM-3抑制劑選自由MBG453、TSR-022和LY3321367組成的組；(v)CTLA-4抑制劑，視需要其中該CTLA-4抑制劑係伊匹單抗或曲美木單抗；(vi)白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽的組合，例如hetIL-15；(vii)白介素-12(IL-12)多肽；或(viii)mTOR抑制劑，視需要其中該mTOR抑制劑係RAD001或雷帕黴素。

在一些實施方式中，本文提供了細胞，該細胞包含：(a)第一CAR，該第一CAR包含與第一抗原結合的第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域(例如第一初級傳訊結構域和/或第一共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第一CAR進一步包含第一前導序列和/或第一鉸鏈區；和(b)第二CAR，該第二CAR包含與第二抗原結合的第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域(例如第二初級傳訊結構域和/或第二共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第二CAR進一步包含第二前導序列和/或第二鉸鏈區，其中：(i)該第一前導序列和該第二前導序列由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二前導序列包含相同的胺基酸序列；(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二鉸鏈區包含相同的胺基酸序列；(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二跨膜結構域包含相同的胺基酸序列；和/或(iv)該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，和/或該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。

在一些實施方式中，本文提供了核酸分子，該核酸分子包含：(a)編碼第一CAR的第一核酸序列，其中該第一CAR包含與第一抗原結合的第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域(例如第一初級傳訊結構域和/或第一共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第一CAR進一步包含第一前導序列和/或第一鉸鏈區；和(b)編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第二CAR包含與第二抗原結合的第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域(例如第二初級傳訊結構域和/或第二共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第二CAR進一步包含第二前導序列和/或第二鉸鏈區，其中：(i)該第一前導序列和該第二前導序列由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二前導序列包含相同的胺基酸序列；(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二鉸鏈區包含相同的胺基酸序列；(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二跨膜結構域包含相同的胺基酸序列；和/或(iv)該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域包含相同的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該第一和第二前導序列包含相同的胺基酸序列。不希望受理論束縛，這樣的核酸分子相比除其中該第一前導序列和該第二前導序列由相同的核酸序列編碼外其他類似的核酸分子表現出更少的重組。

在一些實施方式中，該第一和第二鉸鏈區包含相同的胺基酸序列。不希望受理論束縛，這樣的核酸分子相比除其中該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由相同的核酸序列編碼外其他類似的核酸分子表現出更少的重組。

在一些實施方式中，該第一和第二跨膜結構域包含相同的胺基酸序列。不希望受理論束縛，這樣的核酸分子相比除其中該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由相同的核酸序列編碼外其他類似的核酸分子表現出更少的重組。

在一些實施方式中，該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域包含相同的胺基酸序列。不希望受理論束縛，這樣的核酸分子相比除其中該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域由相同的核酸序列編碼外其他類似的核酸分子表現出更少的重組。

在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含相同的胺基酸序列。不希望受理論束縛，這樣的核酸分子相比除其中該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由相同的核酸序列編碼外其他類似的核酸分子表現出更少的重組。

在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含不同的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含相同的胺基酸序列。不希望受理論束縛，這樣的核酸分子相比除其中該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由相同的核酸序列編碼外其他類似的核酸分子表現出更少的重組。

在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含不同的胺基酸序列(例如該第一和第二共刺激傳訊結構域分別包含4-1BB共刺激結構域序列和CD28共刺激結構域序列；或分別包含CD28共刺激結構域序列和4-1BB共刺激結構域序列)。

在一些實施方式中，該第一前導序列和該第二前導序列包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一前導序列和該第二前導序列由分別包含SEQ ID NO：199和210的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)或分別包含SEQ ID NO：210和199的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼。

在一些實施方式中，該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由分別包含SEQ ID NO：337和13的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：13和337的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼。

在一些實施方式中，該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由分別包含SEQ ID NO：338和17的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、 95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：17和338的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼。

在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由分別包含SEQ ID NO：204和18的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：18和204的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼。

在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由分別包含SEQ ID NO：205和21的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：21和205的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼。

在一些實施方式中，該第一和第二抗原係不同的。在一些實施方式中，該第一或第二抗原選自：BCMA，CD19，CD5，CD10，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD30，CD34，CD37，CD38，CD40，CD53，CD69，CD72，CD73，CD74，CD75，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD123，CD135，CD138，CD179，CD269，Flt3，ROR1，FcRn5，FcRn2，CS-1，CXCR4、5、7，IL-7/3R，IL7/4/3R或IL4R，視需要其中B細胞抗原選自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1、CD138、CD123、CD33、CD34、CLL-1、葉酸受體β、FLT3、EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。在一些實施方式中，該第一或第二抗原結合結構域包含本文揭露的CDR、VH、VL或scFv，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，本文提供了CAR，該CAR包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)、第二VL(VL2)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-連接子1(「L1」)-VH2-連接子2(「L2」)-VL2-連接子3(「L3」)-VL1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VL1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL1-L1-VH2-L2-VL2-L3-VH1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VH1。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH2-L1-VH1-L2-VL1-L3-VL2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VL2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL2-L1-VH1-L2-VL1-L3-VH2。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VL2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VH2。在一些實施方式中，該L1或L3包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該L2包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CAR從N- 末端至C-末端包含以下組態：(i)VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；(ii)VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；(iii)VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；(iv)VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；(v)VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；(vi)VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；(vii)VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；或(viii)VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，該第一和第二抗原係不同的。在一些實施方式中，該第一或第二抗原選自：BCMA，CD19，CD5，CD10，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD30，CD34，CD37，CD38，CD40，CD53，CD69，CD72，CD73，CD74，CD75，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD123，CD135，CD138，CD179，CD269，Flt3，ROR1，FcRn5，FcRn2，CS-1，CXCR4、5、7，IL-7/3R，IL7/4/3R或IL4R，視需要其中B細胞抗原選自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1、CD138、CD123、CD33、CD34、CLL-1、葉酸受體β、FLT3、EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2或VL2包含本文揭露的CDR、VH或VL序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該鉸鏈區、跨膜結構域或細胞內傳訊結構域(例如初級傳訊結構域和/或共刺激傳訊結構域)包含本文揭露的鉸鏈區序列、跨膜結構域序列或細胞內傳訊結構域序列(例如初級傳訊結構域序列和/或共刺激傳訊結構域序列)，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，本文提供了編碼本文揭露的雙抗體CAR的核酸分子。在一些實施方式中，本文提供了包含核酸分子的載體，該核酸分子編碼本文揭露的雙抗體CAR。在一些實施方式中，本文提供了細胞，該細胞包含本文揭露的CAR、編碼本文揭露的雙抗體CAR的核酸分子或載體，該載體包含編碼本文揭露的雙抗體CAR的核酸分子。在一些實施方式中，本文提供了藥物組成物，該藥物組成物包含含有本文揭露的雙抗體CAR的細胞和藥學上可接受的運載體。在一些實施方式中，本文揭露了製備包含本文揭露的雙抗體CAR的細胞之方法。在一些實施方式中，本文揭露了使用包含本文揭露的雙抗體CAR的細胞治療受試者(例如患有癌症的受試者)之方法。

在一些實施方式中，本揭露內容關於製備經工程化以表現CAR的免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之方法，以及使用此類方法產生的組成物。本文揭露之方法(例如本文揭露的ARM過程或細胞介素過程)可用於製備表現本文揭露的雙CAR或雙抗體CAR的細胞。還揭露了使用此類組成物用於治療受試者的疾病(例如癌症)之方法。

在一些實施方式中，本發明的特徵在於製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：(i)使細胞(例如T細胞，例如從冷凍或新鮮的白血球單採產物中分離的T細胞)群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或與刺激細胞表面上共刺激分子的藥劑接觸(例如結合)；(ii)使細胞(例如T細胞)群體與編碼CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體，和(iii)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製細胞群體)或投與，其中：(a)步驟(ii)與步驟(i)一起進行，或在步驟(i)開始後不晚於20小時(例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時)進行，並且步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於26小時(例如在步驟(i)開始後不晚於22、23、24、或25小時，例如在步驟(i)開始後不晚於24小時)進行；(b)步驟(ii)與步驟(i)一起進行，或在步驟(i)開始後不晚於20小時(例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時)進行，並且步驟(iii)在步驟(ii)開始後不晚於30小時(例如在步驟(ii)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時)進行；或(c)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%(例如不超過10%)。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子係DNA分子。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子係RNA分子。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子在病毒載體(例如選自慢病毒載體、腺病毒載體、或逆轉錄病毒載體的病毒載體)上。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子在非病毒載體上。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子在質體上。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子不在任何載體上。在一些實施方式中，步驟(ii)包括用包含編碼CAR的核酸分子的病毒載體轉導細胞(例如T細胞)群體。在一些實施方式中，步驟(ii)與i步驟(i)一起進行。在一些實施方式中，步驟(ii)在步驟(i)開始後不晚於20小時進行。在一些實施方式中，步驟(ii)在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時進行。在一些實施方式中，步驟(ii)在步驟(i)開始後不晚於18小時進行。在一些實施方式中，步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於26小時進行。在一些實施方式中，步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於22、23、24、或25小時進行。在一些實施方式中，步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於24小時進行。在一些實施方式中，步驟(iii)在步驟(ii)開始後不晚於30小時進行。在一些實施方式中，步驟(iii)在步驟(ii)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時進行。在一些實施方式中，編碼CAR的核酸分子係本文揭露的核酸分子。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列。在一些實施方式中，該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上，例如其中該第一核酸序列和該第二核酸序列由編碼自身切割位點(例如P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點)的第三核酸序列分開。在一些實施方式中，該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼CAR的核酸序列，其中該CAR包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)、第二VL(VL2)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1、VH1-視需要 L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1、VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1、VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1、VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2、VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2、VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2、或VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。

在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體未擴增。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體擴增不超過5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體擴增不超過10%。

在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上。

在一些實施方式中，該第一和第二核酸分子在分開的病毒載體上，並且其中步驟(ii)包括用第一病毒載體和第二病毒載體轉導細胞(例如T細胞)群體，該第一病毒載體包含編碼第一CAR的核酸分子，並且該第二病毒載體包含編碼第二CAR的第二核酸分子。

在一些實施方式中，該第一CAR包含抗BCMA結合結構域(例如抗BCMA CAR)，並且該第二CAR包含抗CD19結合結構域(例如抗CD19 CAR)。

在一些實施方式中，在步驟(ii)中，使該細胞群體按如下感染複數(MOI)與第一病毒載體接觸，該感染複數高於、等於或低於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI。在一些實施方式中，在步驟(ii)中，使該細胞群體按如下感染複數(MOI)與第一病毒載體接觸，該感染複數高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI。

在一些實施方式中，在步驟(ii)中，使該細胞群體與第一MOI的該第一病毒載體接觸，並且與第二MOI的該第二病毒載體接觸，使得所得細胞群體包含第一細胞群體、第二細胞群體和第三細胞群體，該第一細胞群體包含抗BCMA CAR但不包含抗CD19 CAR，該第二細胞群體包含抗CD19 CAR但不包含抗BCMA CAR，該第三細胞群體包含抗BCMA CAR和所述抗CD19 CAR二者，其中：

(a)例如如藉由實例10所述方法測定的，合併的第二和第三群體中活細胞總數小於或等於合併的第一和第三群體中活細胞總數的約110%(例如小於或等於約105%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%或更少)；

(b)例如如藉由實例10所述方法測定的，合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於合併的第二和第三群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000%、10000%或更多)；

(c)例如如藉由實例10所述方法測定的，合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於所得群體中活細胞總數的約5%(例如大於或等於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)；

(d)例如如藉由實例10所述方法測定的，第二群體中活細胞總數小於或等於合併的第一和第三群體中活細胞總數的約110%(例如小於或等於約105%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%或更少)；或

(e)例如如藉由實例10所述方法測定的，合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於第二群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000%、10000%或更多)。在一些實施方式中，在步驟(ii)中，使該細胞群體與一定MOI(例如該MOI足夠低於該細胞群體與該第一病毒載體接觸時的MOI)的該第二病毒載體接觸，使得在所得細胞群體中：

(b)例如如藉由實例10所述方法測定的，合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於合併的第二和第三群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000%、10000%或更多；

(e)例如如藉由實例10所述方法測定的，合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於第二群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、 125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000%、10000%或更多)。

在一些實施方式中，在步驟(ii)中，使該細胞群體與第一MOI的該第一病毒載體接觸，並且使該細胞群體與第二MOI的該第二病毒載體接觸，使得所得細胞群體包含：

(e)例如如藉由實例10所述方法測定的，合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於第二群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000%、10000%或更多)。

在一些實施方式中，在步驟(ii)中，使該細胞群體與以下各項接觸：

(a)MOI為約1至約10(例如約2至約9、約3至約8、約4至約7、約5至約6、約1至約8、約1至約6、約1至約4、約8至約10、約6至約10、約4至約10、約1至約3、約2至約4、約3至約5、約4至約6、約5至約7、約6至約8、約7至約9、約8至約10、約2.5至約5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10)的該第一病毒載體；

(b)MOI為約0.1至約5(例如約0.2至約4、約0.3至約3、約0.4至約2、約0.5至約1、約0.6至約0.9、約0.7至約0.8、約0.1至約4、約0.1至約3、約0.1至約2、約0.1至約1、約0.1至約0.5、約4至約5、約3至約5、約2至約5、約1至約5、約0.5至約5、約0.2至約5、約0.1至約0.5、約0.2至約1、約0.5至約2、約1至約3、約2至約4、約3至約5、約0.5至約1、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約2、約3、約4或約5)的該第二病毒載體；

(c)如下MOI的該第一病毒載體，該MOI高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI的至少約10%(例如至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)或至少約1倍(例如至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100倍，例如約2至約50倍、約3至20倍、約5至約15倍或約8至約10倍)；和/或

(d)如下MOI的該第二病毒載體，該MOI不超過該細胞群體與該第一病毒載體接觸時的MOI的1/X，其中X係2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100。

在一些實施方式中，使該細胞群體與MOI為約2.5至約5的該第一病毒載體接觸。在一些實施方式中，使該細胞群體與MOI為約0.5至約1.0的該第二病毒載體接觸。在一些實施方式中，該第一病毒載體處於如下MOI，該MOI 高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI的約8至約10倍。在一些實施方式中，該第二病毒載體處於如下MOI，該MOI不超過該細胞群體與該第一病毒載體接觸時的MOI的1/X，其中X係6、8、10或12。

(a)MOI為約4和約5之間(例如約4.75)的該第一病毒載體；和/或

(b)MOI為約0.2和約1之間(例如約0.5)的該第二病毒載體。

在一些實施方式中，在步驟(ii)中，該細胞群體總共包含約1×10⁸至約5×10⁹(例如約2×10⁸至約2×10⁹或約4×10⁸至約1×10⁹)個活細胞。在一些實施方式中，該細胞按約1×10⁶至約1×10⁷(例如約2×10⁶至約5×10⁶或約3×10⁶至約4×10⁶)個活細胞/mL的濃度懸浮在培養基中。

在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑係刺激CD3的藥劑。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何組合的藥劑。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28的藥劑。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑不包含珠。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑不包含珠。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含抗CD3抗體。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑包含抗CD28抗體。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD3抗體。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD28抗體。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑和刺激共刺激分子的藥劑包含T細胞TransAct^TM。

在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑不包含水凝膠。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑不包含水凝膠。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑不包含海藻酸鹽。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑不包含海藻酸鹽。

在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含水凝膠。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑包含水凝膠。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含海藻酸鹽。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑包含海藻酸鹽。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑或刺激共刺激分子的藥劑包含來自闊得技術公司(Quad Technologies)的MagCloudz^TM。

在一些實施方式中，與藉由除不包括步驟(i)外其他類似之方法製備的細胞相比，步驟(i)增加來自步驟(iii)的細胞群體中表現CAR的細胞的百分比，例如來自步驟(iii)的細胞群體顯示更高百分比(例如至少10%、20%、30%、40%、50%、或60%更高)的表現CAR的細胞。

在一些實施方式中，在來自步驟(iii)的細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相同。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相差不超過3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、或12%。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，例如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相差不超過5%或10%。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體顯示出初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的更高百分比(例如至少高10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體持續超過3天(例如持續5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體顯示出初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的更高百分比(例如至少高10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。

在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相同。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相差不超過3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、或12%。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相差不超過5%或10%。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體顯示出中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的更低百分比(例如至少低10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體持續超過3天(例如持續5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體顯示出中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的更低百分比(例如至少低10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。

在一些實施方式中，如與步驟(i)開始時細胞群體中的幹細胞記憶T細胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比相比，來自步驟(iii)的細胞群體中的幹細胞記憶T細胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比增加。在一些實施方式中，如與步驟(i)開始時細胞群體中的表現CAR的幹細胞記憶T細胞(例如表現CAR的CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比相比，來自步驟(iii)的細胞群體中的表現CAR的幹細胞記憶T細胞(例如表現CAR的CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比增加。在一些實施方式中，與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞中的幹細胞記憶T細胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比相比，來自步驟(iii)的細胞群體中的幹細胞記憶T細胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比更高。在一些實施方式中，與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞中的表現CAR的幹細胞記憶T細胞(例如表現CAR的CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比相比，來自步驟(iii)的細胞群體中的表現CAR的幹細胞記憶T細胞(例如表現CAR的CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比更高。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞中的幹細胞記憶T細胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比相比，來自步驟(iii)的細胞群體中的幹細胞記憶T細胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比更高。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)其他類似之方法製備的細胞中的表現CAR的幹細胞記憶T細胞(例如表現CAR的CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比相比，來自步驟(iii)細胞群體中的表現CAR的幹細胞記憶T細胞(例如表現CAR的CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞)的百分比更高。

在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(GeneSetScore)(向上TEM對比向下TSCM)與來自步驟(i)開始時細胞群體的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約25%、50%、75%、100%、或125%。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)相比較低(例如，至少低約100%、150%、200%、250%或300%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如持續5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)相比較低(例如，至少低約100%、150%、200%、250%或300%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)與來自步驟(i)開始時細胞群體的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約25%、50%、100%、150%、或200%。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)相比較低(例如，至少低約50%、100%、125%、150%、或175%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)相比較低(例如，至少低約50%、100%、125%、150%或175%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向下幹細胞性)與來自步驟(i)開始時細胞群體的中位數基因集評分(向下幹細胞性)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約25%、50%、100%、150%、200%、或250%。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向下幹細胞性)與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似係方法製備的細胞的中位數基因集評分(向下幹細胞性)相比較低(例如，至少低約50%、100%、或125%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向下幹細胞性)與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向下幹細胞性)相比較低(例如，至少低約50%、100%、或125%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上缺氧)與來自步驟(i)開始時細胞群體的中位數基因集評分(向上缺氧)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約125%、150%、175%、或200%。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上缺氧)與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上缺氧)相比較低(例如，至少低約40%、50%、60%、70%、或80%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上缺氧)與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上缺氧)相比較低(例如，至少低約40%、50%、60%、70%、或80%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上自噬)與來自步驟(i)開始時細胞群體的中位數基因集評分(向上自噬)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約180%、190%、200%、或210%。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上自噬)與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上自噬)相比較低(例如至少低20%、30%、或40%)。在一些實施方式中，來自步驟(iii)的細胞群體的中位數基因集評分(向上自噬)與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞的中位數基因集評分(向上自噬)相比較低(例如至少低20%、30%、或40%)。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，或與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體在與表現由CAR識別的抗原的細胞一起孵育後以更高的水平(例如至少高2、4、6、8、10、12、或14倍)分泌IL-2。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體在體內投與後持續更長時間或以更高水平(例如至少高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%)擴增。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8或9天)外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體在體內投與後持續更長時間或以更高水平(例如至少高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%更高)擴增。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(iii)在步驟(i)開始後超過26小時(例如在步驟(i)關始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，或與藉由除進一步包括在步驟(ii)之後和在步驟(iii)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(iii)的細胞群體在體內投與後顯示出更強的抗腫瘤活性(例如在低劑量下具有更強的抗腫瘤活性，例如不超過0.15 x 10⁶、0.2 x 10⁶、0.25 x 10⁶、或0.3 x 10⁶個表現CAR的活細胞的劑量)。

在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，來自步驟(iii)的細胞群體中活細胞的數目較步驟(i)開始時細胞群體中的活細胞數目減少。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體擴增不超過5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%(例如不超過10%)。在一些實施方式中，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增或擴增少於0.5、1、1.5、或2小時(例如小於1或1.5小時)。

在一些實施方式中，步驟(i)和(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑、或MALT1抑制劑的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(i)和(ii)在包含IL-7、IL-21、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(i)和(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑、 MALT1抑制劑、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(i)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑或MALT1抑制劑的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑或MALT1抑制劑的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(i)在包含IL-7、IL-21、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(ii)在包含IL-7、IL-21、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(i)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑、MALT1抑制劑、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，步驟(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑、MALT1抑制劑、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。在一些實施方式中，該細胞培養基係包含血清替代物的無血清培養基。在一些實施方式中，該血清替代物係CTS^TM免疫細胞血清替代物(ICSR)。

在一些實施方式中，前述方法進一步包括在步驟(i)之前：(iv)接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的新鮮白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如新鮮全血產物、新鮮骨髓產物、或新鮮腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的新鮮產物))。

在一些實施方式中，前述方法進一步包括在步驟(i)之前：(v)從新鮮白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如新鮮全血產物、新鮮骨髓產物、或新鮮腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的新鮮產物))中分離在步驟(i)中接觸的細胞(例如T細胞，如CD8+和/或CD4+ T細胞)群體。在一些實施方式中，步驟(iii)在步驟(v)開始後不晚於35小時(例如在步驟(v)開始後不晚於27、28、29、30、31、32、33、34、或35小時，例如在步驟(v)開始後不晚於30小時)進行。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(v)結束時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%(例如不超過10%)。

在一些實施方式中，前述方法進一步包括在步驟(i)之前：接受從來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，如從全血、骨髓、或腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如胸腺切除術)中分離的冷凍保存的T細胞)中分離的冷凍保存的T細胞。

在一些實施方式中，前述方法進一步包括在步驟(i)之前：(iv)接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))。

在一些實施方式中，前述方法進一步包括在步驟(i)之前：(v)從冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))中分離在步驟(i)中接觸的細胞(例如T細胞，如CD8+和/或CD4+ T細胞)群體。在一些實施方式中，步驟(iii)在步驟(v)開始後不晚於35小時(例如在步驟(v)開始後不晚於27、28、29、30、31、32、33、34、或35小時，例如在步驟(v)開始後不晚於30小時)進行。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(v)結束時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%(例如不超過10%)。

在一些實施方式中，在測量該部分中CAR表現水平(例如測量該部分中表現CAR的活細胞的百分比，例如測量該部分中表現抗BCMA CAR的活細胞的百分比)之前，將來自步驟(iii)的細胞培養約二至約四天，例如約三天(例如在收穫後約72小時)。在一些實施方式中，測量CAR表現發生在步驟(ii)後約4天(例如96小時)。在一些實施方式中，藉由流動式細胞測量術測量CAR表現水平。

在一些實施方式中，本發明的特徵在於製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：(1)使細胞(例如T細胞，如從冷凍的白血球單採產物分離的T細胞)群體與細胞介素(選自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6、或其組合)接觸；(2)使該細胞(例如T細胞)群體與編碼CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體；和(3)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製細胞群體)或投與，其中：(a)步驟(2)與步驟(1)一起進行，或在步驟(1)開始後不晚於5小時(例如在步驟(1)開始後不晚於1、2、3、4、或5小時)進行，並且步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於26小時(例如在步驟(1)開始後不晚於22、23、24、或25小時，例如在步驟(1)開始後不晚於24小時)進行；或(b)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%(例如不超過10%)。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子係DNA分子。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子係RNA分子。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子在病毒載體(例如選自慢病毒載體、腺病毒載體、或逆轉錄病毒載體的病毒載體)上。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子在非病毒載體上。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子在質體上。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子不在任何載體上。在一些實施方式中，步驟(2)包括用包含編碼CAR的核酸分子的病毒載體轉導細胞(例如T細胞)群體。在一些實施方式中，編碼CAR的核酸分子係本文揭露的核酸分子。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列。在一些實施方式中，該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上，例如其中該第一核酸序列和該第二核酸序列由編碼自身切割位點(例如P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點)的第三核酸序列分開。在一些實施方式中，該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼CAR的核酸序列，其中該CAR包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)、第二VL(VL2)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1、VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1、VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1、VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1、VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2、VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2、VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2、或VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。

在一些實施方式中，步驟(2)與步驟(1)一起進行。在一些實施方式中，步驟(2)在步驟(1)開始後不晚於5小時進行。在一些實施方式中，步驟(2)在步驟(1)開始後不晚於1、2、3、4、或5小時進行。在一些實施方式中，步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於26小時進行。在一些實施方式中，步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於22、23、24、或25小時進行。在一些實施方式中，步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於24小時進行。

在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體不擴增。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體擴增不超過5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體擴增不超過10%。

在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-2接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-7接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-21接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-2和IL-7接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-2和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-2和IL-21接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-2和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-7和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-7和IL-21接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-7和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-21和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，步驟(1)包括使細胞(例如T細胞)群體與IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接觸。

在一些實施方式中，與藉由除進一步包括使細胞群體與例如抗CD3抗體接觸外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(3)的細胞群體顯示出在表現CAR的細胞中初始細胞的更高百分比(例如至少高10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%更高)。

在一些實施方式中，來自步驟(3)的細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比與步驟(1)開始時的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相同。在一些實施方式中，來自步驟(3)的細胞群體中的初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比與步驟(1)開始時的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相差不超過3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、或12%。在一些實施方式中，來自步驟(3)的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，例如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比與步驟(1)開始時的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相差不超過5%或10%。在一些實施方式中，如與步驟(1)開始時的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相比，來自步驟(3)的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比增加。在一些實施方式中，如與步驟(1)開始時的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相比，來自步驟(3)的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比增加至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%。在一些實施方式中，如與步驟(1)開始時的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相比，來自步驟(3)的細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比增加至少10%或20%。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(3)在步驟(1)開始後超過26小時(例如在步驟(1)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(3)的細胞群體顯示出初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的更高百分比(例如至少高10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(2)之後和在步驟(3)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(3)的細胞群體顯示出初始細胞(例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的更高百分比(例如至少高10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。

在一些實施方式中，來自步驟(3)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相同。在一些實施方式中，來自步驟(3)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比與在步驟(i)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相差不超過3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、或12%。在一些實施方式中，來自步驟(3)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比與步驟(i)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相差不超過5%或10%。在一些實施方式中，如與步驟(1)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相比，來自步驟(3)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比降低。在一些實施方式中，如與步驟(1)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相比，來自步驟(3)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比降低至少10%或20%。在一些實施方式中，如與步驟(1)開始時細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相比，在來自步驟(3)的細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比降低至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(3)在步驟(1)開始後超過26小時(例如在步驟(1)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(3)的細胞群體顯示出中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的更低百分比(例如至少低10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(2)之後和在步驟(3)之前，在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8、或9天)其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(3)的細胞群體顯示出中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞)的更低百分比(例如至少低10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%)。

在一些實施方式中，與藉由除步驟(3)在步驟(1)開始後超過26小時(例如在步驟(1)開始後超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)進行外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(3)的細胞群體在體內投與後持續更長時間或以更高水平(例如至少高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%)擴增。在一些實施方式中，與藉由除進一步包括在步驟(2)之後和在步驟(3)之前在體外擴增細胞(例如T細胞)群體超過3天(例如5、6、7、8或9天)外其他類似之方法製備的細胞相比，來自步驟(3)的細胞群體在體內投與後持續更長時間或以更高水平(例如至少高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%)擴增。

在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體不擴增。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體擴增不超過5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、或40%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體擴增不超過10%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，來自步驟(3)的細胞群體中的活細胞數目較步驟(1)開始時細胞群體中的活細胞數目減少。

在一些實施方式中，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，例如如藉由活細胞數目進行評估，來自步驟(3)的細胞群體不擴增。在一些實施方式中，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體擴增少於0.5、1、1.5、或2小時(例如少於1或1.5小時)。

在一些實施方式中，細胞群體在體外不與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸，或如果進行接觸，接觸步驟少於2小時(例如不超過1小時或1.5小時)。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑係刺激CD3的藥劑(例如抗CD3抗體)。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何組合的藥劑。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28的藥劑。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑或刺激共刺激分子的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段或scFv)、小分子或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)。

在一些實施方式中，步驟(1)和/或(2)在包含不超過5%、4%、3%、2%、1%、或0%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(1)和/或(2)在包含不超過2%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(1)和/或(2)在包含約2%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(1)和/或(2)在包含LSD1抑制劑或MALT1抑制劑的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(1)在包含不超過5%、4%、3%、2%、1%、或0%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(1)在包含不超過2%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(1)在包含約2%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(2)在包含不超過5%、4%、3%、2%、1%、或0%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(2)在包含不超過2%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(2)在包含約2%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(1)在包含LSD1抑制劑或MALT1抑制劑的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，步驟(2)在包含LSD1抑制劑或MALT1抑制劑的細胞培養基中進行。

在一些實施方式中，在步驟(i)或步驟(1)開始時的細胞群體已經富集了表現IL6R的細胞(例如對IL6Rα和/或IL6Rβ呈陽性的細胞)。在一些實施方式中，在步驟(i)或步驟(1)開始時的細胞群體包含不少於40%、45%、50%、55%、60%、65%、或70%的表現IL6R的細胞(例如對IL6Rα和/或IL6Rβ呈陽性的細胞)。

在一些實施方式中，步驟(i)和(ii)或步驟(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，例如10、15、20、或25天後，IL-15增加細胞群體擴增的能力。在一些實施方式中，IL-15增加在細胞群體中表現IL6Rβ的細胞的百分比。

在前述方法的一些實施方式中，該方法在封閉系統中進行。在一些實施方式中，T細胞分離、活化、轉導、孵育和洗滌均在封閉系統中進行。在前述方法的一些實施方式中，該方法在分開的裝置中進行。在一些實施方式中，T細胞分離、活化和轉導、孵育、和洗滌在分開的裝置中進行。

在前述方法的一些實施方式中，該方法進一步包括在細胞培養基中添加佐劑或轉導增強試劑以增強轉導效率。在一些實施方式中，該佐劑或轉導增強試劑包含陽離子聚合物。在一些實施方式中，該佐劑或轉導增強試劑選自：LentiBOOST^TM(希里安生物技術公司(Sirion Biotech))、vectofusin-1、F108、海美溴銨(聚凝胺)、PEA、普朗尼克F68、普朗尼克F127、泊洛沙姆或LentiTrans^TM。在一些實施方式中，佐劑係LentiBOOST^TM(希里安生物技術公司(Sirion Biotech))。

在前述方法的一些實施方式中，用病毒載體轉導細胞群體(例如，T細胞)包括在增強轉導效率的條件下使細胞群體和病毒載體經受離心力。在一個實施方式中，藉由離心接種(spinoculation)轉導細胞。

在前述方法的一些實施方式中，細胞(例如，T細胞)在細胞培養瓶中被活化和轉導，該細胞培養瓶在基底處包含氣體可滲透膜，其支持大的培養基體積而基本上不損害氣體交換。在一些實施方式中，藉由經由對流提供對營養物的接近，例如基本上不間斷的接近來實現細胞生長。

在前述方法的一些實施方式中，該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和細胞內傳訊結構域。

在一些實施方式中，該抗原結合結構域與抗原結合，該抗原選自：CD19、CD20、CD22、BCMA、間皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含本文揭露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含VH和VL，其中該VH和VL藉由連接子連接，視需要其中該連接子包含SEQ ID NO：63或104的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該跨膜結構域包含選自T細胞受體的α、β或ζ鏈，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154的蛋白質的跨膜結構域。在一些實施方式中，該跨膜結構域包含CD8的跨膜結構域。在一些實施方式中，該跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼跨膜結構域的核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：17的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列。

在一些實施方式中，該抗原結合結構域藉由鉸鏈區與該跨膜結構域連接。在一些實施方式中，該鉸鏈區包含SEQ ID NO：2、3、或4的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼鉸鏈區的核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：13、14、或15的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列。

在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含初級傳訊結構域。在一些實施方式中，該初級傳訊結構域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該初級傳訊結構域包括源自CD3ζ的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼初級傳訊結構域的核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：20或21的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列。

在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，該共刺激傳訊結構域包含源自MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK細胞受體、BTLA、Toll配位基受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、 CD28-4-1BB或與CD83特異性結合的配位基的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該共刺激傳訊結構域包括源自4-1BB的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該共刺激傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該核酸分子包含編碼共刺激傳訊結構域的核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：18的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列。

在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含源自4-1BB的功能性傳訊結構域和源自CD3ζ的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)和SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列和SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該CAR進一步包含前導序列，該前導序列包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。

在一些實施方式中，本發明的特徵在於藉由任何前述方法或本文揭露的任何其他之方法製備的表現CAR的細胞(例如表現CAR的自體或同種異體T細胞或NK細胞)群體。在一些實施方式中，本文揭露了包含藥物組成物，該藥物組成物包含本文揭露的表現CAR的細胞群體和藥學上可接受的運載體。

在一些實施方式中，該群體包含：

(b)第二細胞群體，該第二細胞群體包含抗CD19 CAR但不包含抗BCMA CAR；以及

在一些實施方式中：

在一些實施方式中，在使用本文所述之方法製造的最終的CAR細胞產物中，珠(例如CD4珠、CD8珠和/或TransACT珠)的總量不超過在製造過程中添加的珠的總量的0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、或0.5%。

在一些實施方式中，本發明的特徵在於表現CAR的細胞(例如表現CAR的自體或同種異體T細胞或NK細胞)群體，該細胞群體具有一個或多個以下特徵：(a)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，約相同百分比的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；(b)例如如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；(c)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，百分比增加的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；(d)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；(e)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；(f)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，百分比降低的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞，例如降低至少20%、25%、30%、35%、 40%、45%、或50%；(g)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；(h)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；或(i)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，百分比增加的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞。

在一些實施方式中，本發明的特徵在於表現CAR的細胞(例如表現CAR的自體或同種異體T細胞或NK細胞)群體，其中：(a)細胞群體的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約25%、50%、75%、100%、或125%；(b)細胞群體的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)與被工程化以表現CAR之前的細胞群體的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約25%、50%、100%、150%、或200%；(c)細胞群體的中位數基因集評分(向下幹細胞性)與被工程化以表現CAR之前的細胞群體的中位數基因集評分(向下幹細胞性)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約25%、50%、100%、150%、200%、或250%；(d)細胞群體的中位數基因集評分(向上缺氧)與被工程化以表現CAR之前的細胞群體的中位數基因集評分(向上缺氧)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約125%、150%、175%、或200%；或(e)細胞群體的中位數基因集評分(向上自噬)與被工程化以表現CAR之前的細胞群體的中位數基因集評分(向上自噬)大約相同或相差不超過(例如，增加不超過)約180%、190%、200%、或210%。

在一些實施方式中，本發明的特徵在於增加受試者中免疫應答之方法，該方法包括向受試者投與本文揭露的表現CAR的細胞群體或本文揭露的藥物組成物，從而增加受試者的免疫應答。

在一些實施方式中，本文揭露了在受試者中治療癌症之方法，該方法包括向受試者投與本文揭露的表現CAR的細胞群體或本文揭露的藥物組成物，從而在受試者中治療癌症。在一些實施方式中，該癌症係實體癌，例如選自：間皮瘤、惡性胸膜間皮瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌、大細胞肺癌、胰臟癌、胰腺導管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、前列腺癌、宮頸癌、皮膚癌、黑素瘤、腎癌(renal cancer)、肝癌、腦癌、胸腺瘤、肉瘤、癌(carcinoma)、子宮癌、腎癌(kidney cancer)、胃腸癌、尿路上皮癌、咽癌、頭頸癌、直腸癌、食道癌、或膀胱癌、或其轉移癌中的一種或多種。在一些實施方式中，該癌症係液體癌，例如選自：慢性淋巴球性白血病(CLL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、何杰金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴細胞性白血病(SLL)、B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、與慢性炎症相關的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性腫瘤、濾泡性淋巴瘤、小兒濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織的結外緣帶淋巴瘤)、緣帶淋巴瘤、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、脾緣帶淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾彌漫性紅髓小B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病變異、淋巴漿細胞性淋巴瘤、重鏈疾病、漿細胞性骨髓瘤、孤立性骨漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結節性緣帶淋巴瘤、小兒結節性緣帶淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、HHV8相關多中心卡斯特曼病中出現的大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或無法分類的淋巴瘤。

在一些實施方式中，該方法進一步包括向受試者投與第二治療劑。在一些實施方式中，該第二治療劑係抗癌治療劑，例如化學療法、放射療法或免疫調節療法。在一些實施方式中，該第二治療劑係IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))。

在一些實施方式中，本文提供了藉由本文所述之方法製備的分離的細胞或細胞群體，該分離的細胞或細胞群體包含一個或多個包含以下各項的細胞：

(a)編碼第一CAR的第一核酸分子，該第一CAR包含抗BCMA結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97的胺基酸序列；和

(b)編碼第二CAR的第二核酸分子，該第二CAR包含抗CD19結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，其中該抗CD19結合結構域包含VH和VL，該VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，並且該VL包含LC CDR1、 LC CDR2和LC CDR3，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295、304和297-300的胺基酸序列。

在一些實施方式中，本文提供了分離的細胞，該分離的細胞包含：

(b)編碼第二CAR的第二核酸分子，該第二CAR包含抗CD19結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，其中該抗CD19結合結構域包含VH和VL，該VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，並且該VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295、304和297-300的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該抗BCMA結合結構域的VH和VL分別包含SEQ ID NO：93和102的胺基酸序列。在一些實施方式中，該抗CD19結合結構域的VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列。在一些實施方式中，該抗BCMA結合結構域的VH和VL分別包含SEQ ID NO：93和102的胺基酸序列，並且該抗CD19結合結構域的VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列。在一些實施方式中，該抗BCMA結合結構域包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列。在一些實施方式中，該抗CD19結合結構域包含SEQ ID NO：293的胺基酸序列。在一些實施方式中，該抗BCMA結合結構域包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列，並且該抗CD19結合結構域包含SEQ ID NO：293的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR包含SEQ ID NO：107的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第二CAR包含SEQ ID NO：225的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR包含SEQ ID NO：107的胺基酸序列；並且該第二CAR包含SEQ ID NO：225的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR由SEQ ID NO：259、258或416的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該第二CAR由SEQ ID NO：417、355、356或354的核酸序列編碼。在一些實施方式中，該第一CAR由SEQ ID NO：259、258或416的核酸序列編碼，並且該第二CAR由SEQ ID NO：417、355、356或354的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，本文提供了藥物組成物，該藥物組成物包含如本文所述之細胞或細胞群體。

在一些實施方式中，本文提供了在受試者中提供抗腫瘤免疫或對患有與BCMA表現相關的疾病的受試者進行治療之方法，該方法包括向受試者投與有效量的如本文所述之細胞或細胞群體或藥物組成物。

在一些實施方式中，該與BCMA表現相關的疾病係血液癌或實體癌，例如本文所述之血液癌或實體癌。

在一些實施方式中，該疾病選自：急性白血病、B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生症、MALT淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良和骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、前列腺癌(例如，去勢抵抗性或治療抵抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌、肺癌、漿細胞增殖性障礙(例如，無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義未明的單株丙種球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、或POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群、高月病和PEP症候群))、或該疾病的組合。

在一些實施方式中，該疾病係多發性骨髓瘤。

雖然與本文所述之那些方法和材料類似或等同之方法和材料可以用於本發明的實踐或測試，但是以下描述合適之方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考(例如序列數據庫參考號)藉由引用以其全文而併入。例如本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如在本文的任一表中)均藉由引用而併入。當一個基因或蛋白質參考多個序列登錄號時，涵蓋所有的序列變體。

此外，材料、方法和實例僅是說明性的而不旨在限制。標題、小標題或編號或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等僅為了便於閱讀而呈現。在本文檔中使用標題或編號或字母元素不要求步驟或元素以字母循序執行，或者步驟或元素必須彼此離散。根據說明書和附圖，並且根據申請專利範圍，本發明的其他特徵、目的和優點將是顯而易見的。

[圖1A-1H]：使用自動化系統的Jurkat NFAT螢光素酶(JNL)報告基因測定法用於測試BCMA CAR的功能。在JNL報告基因測定法中評估CAR 殖株的抗原依賴性活性。將含有指定的CAR殖株的JNL細胞或未轉導的JNL細胞(UTD)與單獨的培養基(圖1G和1H)或與靶細胞系(KMS11(作為BCMA陽性細胞系)(圖1A和1C)和NALM6(作為BCMA陰性細胞系)(圖1E和1F))一起以不同比例共培養，測量螢光素酶活性，將其作為發光強度。當在存在表現抗原的細胞的情況下發光強度超過UTD細胞水平的2倍時，殖株被認為具有活性。發光讀出係對CAR刺激的直接測量。圖1B和圖1D係顯示藉由使用人重組(r)BCMA_Fc-AF647的流動式細胞測量術來檢測JNL細胞上BCMA CAR的表現水平的圖。1x或2x平臺表示接種40,000個H293細胞或80,000個H293細胞用於病毒產生。

[圖2]：原代人T細胞上BCMA CAR的表現水平。用人rBCMA_Fc-AF647試劑對細胞進行染色，並藉由流動式細胞測量術來測定。CAR+細胞的百分比和MFI如細胞培養的第5天和第9天的圖所示。數據匯總於表27中，該等數據包括針對各個CAR獲得的病毒滴定度。

[圖3A-3C]：針對表現螢火蟲螢光素酶(KMS11-luc)的KMS11靶細胞系來評估表現指定的CAR的T細胞介導細胞溶解和細胞介素產生的能力。圖3A：將CART細胞與KMS11-luc靶細胞以指定的E：T比率共培養。藉由不含效應T細胞的靶細胞(對照)和含有效應T細胞的靶細胞(實驗)之間的螢光素酶訊號的差異來確定%細胞殺傷，以對照的百分比表示。UTD表示未轉導的T細胞。圖3B：針對BCMA陰性系NALM6觀察背景殺傷。圖3C：在24小時在從該等共培養系統(E：T比率為2.5)收集的上清液中，藉由MSD測量IFNγ。所有數據均以平均值+/-標準差表示。

[圖4A-4C]：用MOI=5(由SupT1細胞中表現的第一CAR定義的病毒滴定度)轉導的T細胞中的CAR表現。圖4A係總結不同的構建體的%CAR19、%BCMA CAR、%雙陽性、%僅CAR19和%僅BCMA-CAR的表。圖 4B係一組流動式細胞測量術圖，顯示針對表面BCMA CAR表現(x軸)和表面CD19 CAR表現(y軸)的細胞的染色。圖4C係顯示BCMA CAR MFI(上部分圖)和CD19 CAR MFI(下部分圖)的一對橫條圖。

[圖5A-5C]：使用第8天的CART細胞進行的體外殺傷測定。圖5A-5C係顯示分別針對處於指定E：T比率的BCMA陽性KMS11細胞、CD19陽性Nalm6細胞或BCMA/CD19陰性細胞的%殺傷的一組圖。

[圖6A-6D]：使用第8天的CART細胞的體外細胞介素產生。圖6A-6D係一組橫條圖，顯示當與BCMA陽性KMS11細胞或CD19陽性Nalm6細胞共培養時，CART細胞的IFNγ產生。

[圖7A-7C]：使用ARM過程製造的細胞的個體CAR表現。圖7A-7B係長條圖，顯示在對使用ARM過程製造的人原代T細胞進行轉導後24h或72h，抗BCMA和抗CD19 CAR的表現模式。基於藉由上游CAR的表現確定的SupT1滴定度，研究使用的MOI為1。在圖7A和7B的每個圖中，左側部分係顯示使用rBCMA-Fc染色的直方分圖，而右側部分係顯示使用與CD19 CAR結合的抗獨特型抗體染色的直方分圖。構建體#244(「c244」)和#245(「c245」)分別是單一抗CD19 CAR和單一抗BCMA CAR。圖7C係流動式細胞測量術圖的分圖，顯示基於上游CAR滴定度，在使用MOI為1對人原代T細胞進行轉導後72h，抗BCMA和抗CD19 CAR表現模式。

[圖8A-8C]：使用如下三種小鼠模型的構建體#236(「c236」)和構建體#238(「c238」)的體內抗腫瘤活性：表現螢光素酶報告基因(KMS11-Luc)的彌散性KMS-11(BCMA+CD19-)多發性骨髓瘤模型(圖8A)、Nalm6-Luc(CD19+BCMA-)異種移植小鼠模型(圖8B)以及95% KMS-luc與5% NALM6-Luc細胞的混合模型(圖8C)。腫瘤負荷表示為全身發光(p/s)，描繪為平均腫瘤負荷+ SEM。如表30所示，在腫瘤接種後第7天或第8天，按指定劑量的BCMA CAR+或CD19 CAR+ T細胞(大致數量的CAR+ T活細胞)，用c236和c238治療小鼠。媒介物(PBS)和未經轉導的T細胞(UTD)用作陰性對照。單一抗BCMA CAR PI61和單一抗CD19 CAR CTL119也用作對照。

[圖9A-9C]：由移植物抗宿主應答引起的體重減輕。藉由測量隨時間的體重，分別監測所有小鼠的體重減輕，作為X-GvHD的讀出。體重(BWT)繪製為自基線的%變化。

[圖10A-10C]：輸注後長達4週藉由流動式細胞測量術分析外周血CD3+ T細胞的體內擴增。

[圖11A-11C]：輸注後長達4週藉由流動式細胞測量術分析CAR+T細胞(BCMA CAR+百分比)的體內擴增。

[圖12A-12C]：輸注後長達4週藉由流動式細胞測量術分析CAR+T細胞(雙CAR+計數)的體內擴增。

[圖13A-13C]：體內血漿IFN-γ動力學。在圖中繪製了按各自的CAR-T劑量，用用c236和c238以及單CAR對照治療的全部三種小鼠模型的血漿IFN-γ水平。將小鼠放血並藉由MSD測定法測量血漿細胞介素。

[圖14A和14B]：在多發性骨髓瘤異種移植小鼠模型中，使用236和c238產生的細胞的體內功效和細胞擴增。圖14A：給NSG小鼠注射表現螢光素酶報告基因的多發性骨髓瘤細胞系KMS11。腫瘤負荷表示為全身發光(p/s)，描繪為平均腫瘤負荷+ SEM。在腫瘤接種後第8天，按9e4 BCMA-CD19雙CAR+ T細胞劑量(大致數量的CAR+ T活細胞)，用c236和c238治療小鼠。媒介物(PBS)和未經轉導的T細胞(UTD)用作陰性對照。圖14B：輸注後長達4週藉由流動式細胞測量術分析外周血CAR+T細胞的擴增。在c236和c238 CAR-T Rx組中觀察到雙重抗BCMA和CD19 CAR+ T細胞擴增。

[圖15A和15B]：使用ARM過程製造的細胞的CAR表現。流動式細胞測量術圖，顯示在向使用ARM過程製造的人原代T細胞中添加病毒後96h(圖15A)和7天(圖15B)，雙陽性抗BCMA和抗CD19 CAR的表現。基於藉由雙CAR(針對PI61或R1G5殖株和CTL119呈陽性)的表現測定的SupT1滴定度，研究使用的MOI為2，該SupT1滴定度藉由與CD19CAR結合的抗獨特型抗體和與PI61或R1G5結合的重組BCMA_Fc(AF647)進行檢測。將單一抗BCMA CART PI61和R1G5和單一抗CD19 CART CTL119用作對照。

[圖16]：在第7天使用MOI為5、用TM過程進行CAR表現。流動式細胞測量術圖，顯示在向使用TM過程製造的人原代T細胞中添加病毒後第7天，雙陽性抗BCMA和抗CD19 CAR的表現。基於藉由雙CAR(針對PI61或R1G5殖株和CTL119呈陽性)的表現測定的SupT1滴定度，研究使用的MOI為5，該SupT1滴定度藉由與CD19CAR結合的抗獨特型抗體和與PI61或R1G5結合的重組BCMA_Fc(AF647)進行檢測。

[圖17A和17B]：用抗BCMACAR和CD19CAR雙抗體構建體工程化的T細胞對表現BCMA或CD19的腫瘤細胞進行的體外特異性殺傷。對表現PI61/CTL119殖株的T細胞介導針對KMS11-Luc或NALM6-Luc靶細胞系的細胞裂解的能力進行評估。按指定的E：T比率，將CART細胞與BCMA+ KMS-11-luc或BCMA- NALM6-Luc靶細胞共培養20h，並且藉由不含效應T細胞的靶細胞(對照)和含有效應T細胞的靶細胞(實驗)之間的螢光素酶訊號的差異來確定%細胞殺傷，以對照的百分比表示，測量為靶細胞裂解的替代物。UTD表示未轉導的T細胞。單PI61或CTL119用作對照。

[圖18A和18B]：用抗BCMACAR和CD19CAR雙抗體構建體工程化的T細胞的細胞介素產生響應於表現BCMA或CD19的腫瘤細胞。在來自1.25：1 的比率的殺傷測定共培養物的上清液中，藉由MSD測量IFN-γ(圖18A)和IL-2(圖18B)。

[圖19]：在第4天，雙CAR陽性群體、BCMA CAR陽性群體和CD19 CAR陽性群體的百分比。

[圖20]：流動式細胞測量術圖，顯示用rBCMA-Fc和與CD19 CAR結合的抗獨特型抗體染色細胞。

[圖21]：在第4天和第7天，在指定條件下，總的CAR陽性群體的百分比。

[圖22]：在第0、1、3和7天，在指定條件下，細胞計數(左分圖)和活細胞百分比(右分圖)。

[圖23A、23B和23C]：輸入細胞(圖23A)、第1天細胞(圖23B)和第9天細胞(圖23C)的單細胞RNA-seq數據。「nGene」圖顯示每個細胞中表現的基因的數量。「nUMI」圖顯示每個細胞中獨特分子識別符(UMI)的數量。

[圖24A、24B、24C和24D]：T分佈隨機鄰域嵌入(TSNE)圖，比較了輸入細胞(圖24A)、第1天細胞(圖24B)和第9天細胞(圖24C)的增殖特徵，該增殖特徵基於基因CCNB1、CCND1、CCNE1、PLK1和MKI67的表現確定。每個點代表該樣本中的一個細胞。顯示為淺灰色的細胞不表現增殖基因，而深色陰影的細胞表現一種或多種增殖基因。圖24D係小提琴圖，顯示基因集的基因集評分的分佈，該基因集包含表徵第1天細胞、第9天細胞和輸入細胞的靜息對比活化T細胞狀態的基因。在圖24D中，更高的基因集評分(向上靜息對比向下活化)表明靜息T細胞表型增加，而更低的基因集評分(向上靜息對比向下活化)表明活化的T細胞表型增加。與第9天和第1天細胞相比，輸入細胞總體上處於靜息狀態。第1天細胞顯示最大的活化基因集評分。

[圖25A、25B、25C、25D和25E]：輸入細胞、第1天細胞和第9天細胞的基因集分析。在圖25A中，基因集「向上TEM對比向下TSCM」的更高的基因集評分表明在該樣本中細胞的效應記憶T細胞(TEM)表型增加，而更低的基因集評分表明幹細胞記憶T細胞(TSCM)表型增加。在圖25B中，基因集「向上Treg對比向下Teff」的更高的基因集評分表明調節性T細胞(Treg)表型增加，而更低的基因集評分表明效應T細胞(Teff)表型增加。在圖25C中，基因集「向下幹細胞性」的更低的基因集評分表明幹細胞性表型增加。在圖25D中，基因集「向上缺氧」的更高的基因集評分表明缺氧表型增加。在圖25E中，基因集「向上自噬」的更高的基因集評分表明自噬表型增加。在記憶、幹細胞樣和分化特徵方面，第1天細胞看起來與輸入細胞相似。另一方面，第9天細胞顯示出更高的代謝應激富集。

[圖26A、26B和26C]：輸入細胞的基因簇分析。圖26A-26C係小提琴圖，顯示來自輸入細胞的四個簇的基因集分析的基因集評分。圖26A-26C的小提琴圖中重疊的每個點表示細胞的基因集評分。在圖26A，基因集「向上Treg對比向下Teff」的更高的基因集評分表明Treg細胞表型增加，而基因集「向上Treg對比向下Teff」的更低的基因集評分表明Teff細胞表型增加。在圖26B中，基因集「記憶細胞分化逐漸增加」的更高的基因集評分表明晚期記憶細胞T細胞表型增加，而基因集「記憶細胞分化逐漸增加」的更低的基因集評分表明早期記憶細胞T細胞表型增加。在圖26C中，基因集「向上TEM對比向下TN」的更高的基因集評分表明效應記憶T細胞表型增加，而基因集「向上TEM對比向下TN」的更低的基因集評分表明初始T細胞表型增加。簇3中的細胞顯示處於晚期記憶(進一步分化的)T細胞狀態中，與處於早期記憶的簇1和簇2中的細胞相比，呈現較低分化的T細胞狀態。簇0似乎處於中間T細胞狀態。總之，該數據示出了輸入細胞記憶體在相當水平的異質性。

[圖27A、27B和27C]：TCR定序和測量選殖型多樣性。第9天細胞具有更平坦的選殖型頻率分佈(更高的多樣性)。

[圖28A和28B]：在轉導後第4天和第7天，CAR表現的流動式細胞測量術分析。在24孔板中，用ARM過程，按不同的MOI組合，對用BCMA和CD19CAR載體共轉導細胞產生的CAR-T細胞進行的流動式細胞測量術分析。圖28A：流動式細胞測量術圖顯示，除了對照(UTD和單一一載體)，在轉導後第4天和第7天，在四種不同的MOI條件下，單一抗BCMA CAR、單一抗CD19 CAR和雙+ CAR表現。圖28B：在如圖28A所述之每種條件下，對CAR+群體的子集，包括總的抗BCMA CAR+ T細胞、總的抗CD19 CAR+ T細胞以及總的CAR+ T細胞(兩種單CAR+ T細胞和雙+ CAR T細胞的總和)的定量。顯示的數據係來自三種供體T細胞的代表，結果一致。CAR+細胞百分比在活的CD3+T細胞群體上閘控。

[圖29]：在轉導後第4天，對CAR表現進行的流動式細胞測量術分析。在轉導後第4天，對雙靶向混合物CART、單BCMACART和單CD19CART的終產物的CAR表現進行的流動式細胞測量術分析。在流動式細胞測量術染色之前，將24h收穫的每種產品的小等分試樣再培養三天。

[圖30A、30B、30C、30D和30E]：在異種移植模型中，與單BCMA CART和CD19 CART相比，雙CART的體內功效。向NSG小鼠注射表現螢光素酶報告基因的細胞系(KMS-11、或Nalm-6、或二者與5% Nalm-6-luc的混合物)。腫瘤負荷表示為全身發光(p/s)，描繪為平均腫瘤負荷+SEM。在腫瘤接種後第7天或第8天，按各自的劑量(大致數量的CAR+ T活細胞)，用雙靶向混合物CART、BCMA CART或CD19 CART治療小鼠。媒介物(PBS)和未經轉導的T細胞(UTD)用作陰性對照。對於所有組，N=5隻小鼠。使用最高劑量水平，BCMACART和CD19CART用作各自的對照。在投與CAR-T後第23天終止所有實驗。

[圖31]：圖31係橫條圖，顯示在轉導後第4天(收穫後第3天)，%單CD19 CAR+細胞、%單BCMA CAR+細胞和%雙BCMA/CD19 CAR+細胞。

[圖32]：對T細胞亞群的表徵。圖32係顯示如下內容的圖：在輸入材料、富集後材料和收穫後第1天材料中，% CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、初始T細胞(Tn)、中樞記憶T細胞(Tcm)、效應記憶T細胞(Tem)和重新表現CD45RA的效應記憶T細胞(Temra)。

[圖33A和33B]：經BCMA/CD19雙CART細胞產物、BCMA CART和CD19 CART治療的小鼠的血漿IFN-γ動力學。按各自的CAR-T劑量，用PBS、UTD、BCMA/CD19雙CART細胞產物、BCMA CART或CD19 CART治療動物。將小鼠放血並藉由MSD測定法測量血漿細胞介素。

定義

除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。

術語「一個/種(a/an)」係指一個/種或多於一個/種(即，至少一個/種)該冠詞的語法賓語。藉由舉例，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。

當指可測量的值如量、時距等時，術語「約」意在涵蓋與規定值±20%或在一些情況下±10%、或在一些情況下±5%、或在一些情況下±1%、或在一些情況下±0.1%的變化，因為此類變化適於執行所揭露之方法。

本發明的組成物和方法涵蓋具有指定序列，或與其基本上相同或相似的序列，例如與指定序列具有至少85%、90%或95%同一性或更高同一性的序列的多肽和核酸。在胺基酸序列的語境中，術語「基本上相同」在本文中用於指第一胺基酸序列含有足夠或最小數量的胺基酸殘基，該等胺基酸殘基i)與第二胺基酸序列中的比對胺基酸殘基相同，或ii)係第二胺基酸序列中比對的胺基酸殘基的保守取代，以使得第一胺基酸序列和第二胺基酸序列可以具有共同結構域和/或共同功能活性，例如含有與參考序列(例如，本文提供的序列)具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的共同結構域的胺基酸序列。

在核苷酸序列的語境中，術語「基本上相同」在本文中用於指第一核酸序列含有足夠或最小數量的核苷酸，該等核苷酸與第二核酸序列中的比對核苷酸相同，以使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列編碼具有共同功能活性的多肽，或編碼共同結構多肽結構域或共同功能多肽活性，例如與參考序列(例如，本文提供的序列)具有至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。

術語「變體」係指具有與參考胺基酸序列基本上相同的胺基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施方式中，變體係功能性變體。

術語「功能性變體」係指具有與參考胺基酸序列基本上相同的胺基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列編碼，並且能夠具有參考胺基酸序列的一種或多種活性的多肽。

術語細胞介素(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或IL-6)包括天然存在的細胞介素(包括具有至少10%、30%、50%或80%的活性(例如天然存在的細胞介素免疫調節活性)的其片段和功能變體)的全長、片段或變體，例如功能變體。在一些實施方式中，細胞介素具有與天然存在的細胞介素基本相同的胺基酸序列(例如，至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性)，或由與編碼細胞介素的天然存在的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列編碼(例如，至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性)。在一些實施方式中，如上下文所述，細胞介素進一步包含受體結構域，例如細胞介素受體結構域(例如，IL-15/IL-15R)。

如本文所用，術語「BCMA」係指B細胞成熟抗原。BCMA(也稱為TNFRSF17，BCM或CD269)係腫瘤壞死受體(TNFR)家族的成員，並且主要在終末分化的B細胞(例如記憶B細胞)和漿細胞上表現。其配位基稱為TNF家族(BAFF)的B細胞活化物和增殖誘導配位基(APRIL)。BCMA參與調節漿細胞的存活以維持長期體液免疫。BCMA的基因在16號染色體上編碼，產生長度為994個核苷酸的初級mRNA轉錄物(NCBI登錄號NM_001192.2)，其編碼184個胺基酸的蛋白質(NP_001183.2)。已經描述了源自BCMA基因座的第二反義轉錄物，其可以在調節BCMA表現中起作用。(Laabi Y.等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，1994,22：1147-1154)。已經描述了具有未知顯著性的另外的轉錄物變體(Smirnova AS等人Mol Immunol.[分子免疫學]，2008,45(4)：1179-1183)。已經鑒定出第二同種型，也稱為TV4(Uniprot標識Q02223-2)。如本文所用，「BCMA」包括含有突變例如點突變的蛋白質，全長野生型BCMA的片段、插入、缺失和剪接變體。

短語「與BCMA表現相關的疾病」包括但不限於與表現BCMA(例如野生型或突變型BCMA)的細胞相關的疾病或與表現BCMA(例如野生型或突變型BCMA)的細胞相關的病症，包括例如增殖性疾病(如癌症或惡性腫瘤)或癌前病症(如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期)；或與表現BCMA(例如野生型或突變型BCMA)的細胞相關的非癌症相關適應症。為了避免疑義，與BCMA表現相關的疾病可以包括與目前不表現BCMA(例如，因為如由於用靶向BCMA的分子(例如，本文所述之BCMA抑制劑)進行治療而導致BCMA表現下調)但曾經表現BCMA的細胞相關的病症。在一個方面，與BCMA(例如野生型或突變型BCMA)表現相關的癌症係血液癌。在一個方面，該血液癌症係白血病或淋巴瘤。在一個方面，與BCMA(例如野生型或突變型BCMA)表現相關的癌症係分化的血漿B細胞的惡性腫瘤。在一個方面，與BCMA(例如野生型或突變型BCMA)表現相關的癌症包括癌症和惡性腫瘤包括但不限於例如一種或多種急性白血病，其包括但不限於例如B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)；一種或多種慢性白血病，包括但不限於例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)。與BMCA(例如野生型或突變型BCMA)表現相關的其他癌症或血液病症包括但不限於例如B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病症、MALT淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良和骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、和「白血病前期」(這係由髓系血細胞的無效產生(或發育不良)聯合的血液病症的多樣化集合)等等。在一些實施方式中，該癌症係多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤或膠質母細胞瘤。在實施方式中，與BCMA表現相關的疾病包括漿細胞增殖性障礙，例如無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義未明的單株丙種球蛋白病(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、和POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群、高月病和PEP症候群)。與BCMA表現相關的其他疾病(例如野生型或突變型BCMA)表現包括但不限於例如非典型和/或非經典癌症、惡性腫瘤、與BCMA的表現相關的癌前病症或增殖性疾病(例如野生型或突變型BCMA)，例如本文所述之癌症，例如前列腺癌(例如去勢抵抗性或治療抵抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌、或肺癌。

與BCMA相關的非癌症相關病症(例如野生型或突變型BCMA)包括病毒感染，例如，HIV、真菌感染，例如新型隱球菌(C.neoformans)；自體免疫疾病；例如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡(SLE或狼瘡)、尋常型天皰瘡和乾燥綜合症(Sjogren's syndrome)；炎症性腸病、潰瘍性結腸炎；與黏膜免疫有關的移植相關的同種異體特異性免疫障礙；以及針對生物製劑(如因子VIII)而言不需要的免疫應答(其中體液免疫很重要)。在實施方式中，與BCMA表現相關的非癌症相關適應症包括但不限於例如自體免疫疾病(例如狼瘡)、炎性障礙(變態反應和氣喘)和移植。在一些實施方式中，表現腫瘤抗原的細胞表現或在任何時間表現編碼腫瘤抗原的mRNA。在一個實施方式中，表現腫瘤抗原的細胞產生腫瘤抗原蛋白(例如野生型或突變體)，並且腫瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一個實施方式中，表現腫瘤抗原的細胞在一個時間點產生可檢測水平的腫瘤抗原蛋白，並且隨後基本上不產生可檢測的腫瘤抗原蛋白。

術語「嵌合抗原受體」或可替代地「CAR」或「CAR分子」係指重組多肽構建體，該重組多肽構建體至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和包含源自如下定義的刺激分子的功能性傳訊結構域的胞質傳訊結構域(本文還稱為「細胞內傳訊結構域」)。在一些實施方式中，CAR多肽構建體中的結構域在同一多肽鏈中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些實施方式中，例如，如在如本文所述之RCAR中所提供，CAR多肽構建體中的結構域彼此不連續，例如在不同的多肽鏈中。

在一些實施方式中，該胞質傳訊結構域包含初級傳訊結構域(例如CD3-ζ的初級傳訊結構域)。在一些實施方式中，該胞質傳訊結構域進一步包含源自如下定義的至少一種共刺激分子的一個或多個功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，該共刺激分子選自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些實施方式中，該CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含源自刺激分子的功能傳訊結構域)。在一些實施方式中，該CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含源自共刺激分子的功能傳訊結構域和源自刺激分子的功能傳訊結構域。在一些實施方式中，該CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含源自一種或多種共刺激分子的兩個功能傳訊結構域和源自刺激分子的功能傳訊結構域。在一些實施方式中，該CAR包含嵌合融合蛋白，該嵌合融合蛋白包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含源自一種或多種共刺激分子的至少兩個功能傳訊結構域和源自刺激分子的功能傳訊結構域。在一些實施方式中，該CAR包含CAR融合蛋白的胺基-末端(N-末端)處的視需要前導序列。在一些實施方式中，該CAR還包含在細胞外抗原識別結構域的N-末端的前導序列，其中前導序列視需要在細胞加工和CAR定位至細胞膜期間從抗原識別結構域(例如，scFv)切割。

包含靶向特定腫瘤標誌物X的抗原結合結構域(例如，scFv(單結構域抗體)或TCR(例如，TCRα結合結構域或TCRβ結合結構域))的CAR也稱為XCAR(其中X可以是如本文所述之腫瘤標誌物)。例如，包含靶向BCMA 的抗原結合結構域的CAR被稱為BCMA CAR。CAR可以在任何細胞中表現，例如，如本文所述之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)。

術語「傳訊結構域」係指蛋白質的功能性部分，其藉由在細胞內傳遞資訊以藉由產生第二信使或藉由響應於此類信使而用作效應子，經由定義的傳訊途徑調控細胞活性起作用。

如本文所用，術語「抗體」係指源自免疫球蛋白分子的蛋白質或多肽序列，該蛋白質或多肽序列與抗原特異性結合。抗體可以是多株或單株、多鏈或單鏈、或完整免疫球蛋白，並且可以源自天然來源或來自重組來源。抗體可以是免疫球蛋白分子的四聚體。

術語「抗體片段」係指完整抗體或其重組變體的至少一部分，並且是指足以賦予抗體片段識別和特異性結合靶標(如抗原)的抗原結合結構域(例如完整抗體的抗原決定可變區)。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、單結構域抗體(如sdAb(VL或VH))、駱駝科VHH結構域和由如二價片段的抗體片段形成的多特異性分子，該二價片段包含在鉸鏈區藉由二硫橋連接的兩個或更多個(例如兩個)Fab片段，或所連接的抗體的兩個或更多個(例如兩個)分離的CDR或其他表位結合片段。抗體片段也可以摻入單結構域抗體、多抗體、微抗體、奈米抗體、細胞內抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、v-NAR和雙scFv中(參見例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技術]23：1126-1136,2005)。還可以將抗體片段移植到基於多肽如纖網蛋白III型(Fn3)的支架中(參見美國專利案號6,703,199，其描述了纖網蛋白多肽微型抗體)。

術語「scFv」係指融合蛋白，該融合蛋白包含至少一個包含輕鏈可變區的抗體片段和至少一個包含重鏈可變區的抗體片段，其中該輕鏈和重鏈可變區藉由短的柔性多肽連接子連續地連接，並且能夠表現為單鏈多肽，並且其中該scFv保留了衍生其的完整抗體的特異性。除非另有說明，否則如本文所用，scFv可以例如相對於多肽的N-末端和C-末端以任何順序具有VL和VH可變區，該scFv可以包含VL-連接子-VH或者可以包含VH-連接子-VL。在一些實施方式中，scFv可包含NH₂-V_L-連接子-V_H-COOH或NH₂-V_H-連接子-V_L-COOH的結構。

如本文所用，術語「互補性決定區」或「CDR」係指抗體可變區內的賦予抗原特異性和結合親和力的胺基酸的序列。例如，一般來說，每個重鏈可變區中存在三個CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，並且每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。給定CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多眾所周知的方案中的任一種來確定，該等方案包括由以下文獻描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of Immunological Interest"[具有免疫學重要性的蛋白序列]，第5版，美國國立衛生研究院，公共衛生事業部，馬里蘭州貝塞斯達市(「卡巴特」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「喬西亞」編號方案)、或其組合。在組合的卡巴特和喬西亞編號方案中，在一些實施方式中，CDR對應於為卡巴特CDR、喬西亞CDR或兩者的一部分的胺基酸殘基。

包含抗體或其抗體片段的本發明的CAR組成物的部分可以以多種形式存在，例如其中抗原結合結構域表現為多肽鏈(包括例如單結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)，或例如人或人源化抗體)的一部分(Harlow等人，1999，於：Using Antibodies：A Laboratory Manual[使用抗體：實驗室手冊]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]，NY[紐約]；Harlow等人，1989，於：Antibodies：A Laboratory Manual[抗體：實驗室手冊]，Cold Spring Harbor[冷泉港]，New York[紐約]；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]85：5879-5883；Bird等人，1988,Science[科學] 242：423-426)。在一些實施方式中，本發明的CAR組成物的抗原結合結構域包含抗體片段。在一些實施方式中，該CAR包含含有scFv的抗體片段。

如本文所用，術語「結合結構域」或「抗體分子」(在本文中也稱為「抗靶標結合結構域」)係指包含至少一個免疫球蛋白可變結構域序列的蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「結合結構域」或「抗體分子」涵蓋抗體和抗體片段。在一些實施方式中，抗體分子係多特異性抗體分子，例如其包含多個免疫球蛋白可變結構域序列，其中該多個中的第一免疫球蛋白可變結構域序列對第一表位具有結合特異性並且該多個中的第二免疫球蛋白可變結構域序列對第二表位具有結合特異性。在一些實施方式中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對不多於兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體分子的特徵在於具有對第一表位的結合特異性的第一免疫球蛋白可變結構域序列、和具有對第二表位的結合特異性的第二免疫球蛋白可變結構域序列。

術語「雙特異性抗體(bispecific antibody/bispecific antibodies)」係指在單個分子內組合兩種抗體的抗原結合位點的分子。因此，雙特異性抗體能夠同時或依次結合兩種不同的抗原。用於生產雙特異性抗體之方法係本領域已知的。用於組合兩種抗體的各種形式也是本領域已知的。如熟悉該項技術者已知的，本發明的雙特異性抗體的形式包括但不限於雙抗體、單鏈雙抗體、Fab二聚化(Fab-Fab)、Fab-scFv和串聯抗體。

術語「抗體重鏈」係指抗體分子中天然存在的構象中存在的兩種類型多肽鏈中較大的一種，並且通常決定抗體所屬的類別。

術語「抗體輕鏈」係指抗體分子中天然存在的構象中存在的兩種類型多肽鏈中較小的一種。κ(kappa)和λ(lambda)輕鏈係指兩種主要的抗體輕鏈同種型。

術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生的抗體，例如像由噬菌體或酵母表現系統表現的抗體。該術語還應解釋為意指藉由合成編碼抗體的DNA分子和表現抗體蛋白的DNA分子或指定抗體的胺基酸序列產生的抗體，其中該DNA或胺基酸序列已經使用本領域可得和熟知的重組DNA或胺基酸序列技術獲得。

術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫應答的分子。免疫應答可以涉及抗體產生或特定免疫活性細胞的活化或兩者。技術人員將理解實際上包括所有蛋白質或肽的任何大分子都可以充當抗原。此外，抗原可以源自重組或基因組DNA。技術人員將理解包含編碼引發免疫應答的蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此編碼「抗原」(當該術語在本文中使用時)。此外，熟悉該項技術者將理解抗原不需要僅由基因的全長核苷酸序列編碼。顯而易見的是，本發明包括但不限於使用多於一種基因的部分核苷酸序列，並且該等核苷酸序列以各種組合排列以編碼引發所希望的免疫應答的多肽。另外，技術人員將理解抗原根本不需要由「基因」編碼。顯而易見的是，抗原可以合成產生或可以源自生物樣本，或者可以是除多肽外的大分子。這種生物樣本可以包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞或具有其他生物組分的流體。

術語「抗腫瘤作用」和「抗癌作用」在本文中可互換使用，係指可以藉由各種手段顯現的生物學作用，包括但不限於例如腫瘤體積或癌體積減少、腫瘤細胞或癌細胞數量減少、轉移數量減少、預期壽命延長、腫瘤細胞增殖或癌細胞增殖減少、腫瘤細胞存活率或癌細胞存活率降低、或改善與癌症相關的各種生理症狀。「抗腫瘤作用」或「抗癌作用」也可以藉由本發明的肽、多核苷酸、細胞和抗體首先預防腫瘤或癌症發生的能力來表現。

術語「自體的」係指源自與後來將其重新引入個體中的同一個體的任何材料。

術語「同種異體的」係指源自與引入材料的個體相同的物種的不同動物的任何材料。當一個或多個基因座處的基因不相同時，稱兩個或更多個個體彼此係同種異體的。在一些實施方式中，來自相同物種的個體的同種異體材料可以在遺傳上充分不同以抗原性地相互作用。

術語「異種的」係指源自不同物種的動物的移植物。

如本文所用，術語「單採(apheresis)」係指本領域公認的體外過程，藉由該過程，將供體或患者的血液從該供體或患者移出並使血液穿過分離出一種或多種所選擇的特定成分的裝置，並使其餘部分返回至該供體或患者的循環(例如，藉由回輸法)。因此，在「單採樣本」的上下文中是指使用單採獲得的樣本。

術語「癌症」係指以異常細胞的快速和不受控制的生長為特徵的疾病。癌細胞可以局部或藉由血流和淋巴系統擴散到身體的其他部位。本文描述了各種癌症的實例，並且包括但不限於乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一些實施方式中，藉由本文所述之方法治療的癌症包括多發性骨髓瘤、何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤。

術語「腫瘤」和「癌症」在本文中可互換使用，例如，這兩個術語包括實體和液體，例如彌散或循環腫瘤。如本文所用，該術語「癌症」或「腫瘤」包括惡化前以及惡性癌症和腫瘤。

「源自」(當該術語在本文中使用時)表示第一分子和第二分子之間的關係。它通常是指第一分子和第二分子之間的結構相似性，並不暗示或包括對源自第二分子的第一分子的過程或來源的限制。例如，在源自CD3ζ分子的細胞內傳訊結構域的情況下，細胞內傳訊結構域保留足夠的CD3ζ結構，使得其具有所需的功能，即在適當條件下產生訊號的能力。它沒有暗示或包括對產生細胞內傳訊結構域的特定過程的限制，例如，它並不意指為了提供細胞內傳訊結構域，必須從CD3ζ序列開始並刪除不需要的序列，或強加突變，以到達細胞內傳訊結構域。

術語「保守序列修飾」係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的抗體或抗體片段的結合特徵的胺基酸修飾。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加和缺失。可以藉由本領域已知的標準技術(如定點誘變和PCR介導的誘變)將修飾引入本發明的抗體或抗體片段中。保守取代係其中胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族已在本領域中進行了定義。該等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)以及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。因此，本發明的CAR內的一個或多個胺基酸殘基可以被來自相同側鏈家族的其他胺基酸殘基替代，並且可以使用本文描述的功能測定法測試改變的CAR。

在刺激和/或共刺激分子刺激的上下文中，術語「刺激」係指藉由刺激分子(例如，TCR/CD3複合物)和/或具有其同源配位基的共刺激分子(例如，CD28或4-1BB)的結合誘導的應答，例如，首次或二次應答，由此介導訊息傳遞事件，例如但不限於經由TCR/CD3複合物的訊息傳遞。刺激可以介導某些分子的改變的表現，和/或細胞骨架結構的重構等。

術語「刺激分子」係指由T細胞表現的分子，其針對T細胞傳訊途徑的至少一些方面提供以刺激方式調節TCR複合物的初級活化的一個或多個初級胞質傳訊序列。在一些實施方式中，CAR內的含ITAM的結構域獨立於內源性TCR複合物重現初級TCR的傳訊。在一些實施方式中，初級訊號藉由例如TCR/CD3複合物與負載肽的MHC分子的結合而引發，並且其導致T細胞應答(包括但不限於增殖、活化、分化等)的介導。以刺激方式起作用的初級胞質傳訊序列(也稱為「初級傳訊結構域」)可以含有被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM的傳訊模體。在本發明中特別有用的含有ITAM的初級胞質傳訊序列的實例包括但不限於源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也稱為「ICOS」)、FcεRI和CD66d、DAP10和DAP12的那些。在本發明的特定CAR中，本發明的任何一種或多種CARS中的細胞內傳訊結構域包含細胞內傳訊序列，例如CD3-ζ的初級傳訊序列。術語「抗原呈遞細胞」或「APC」係指免疫系統細胞如輔助細胞(例如，B細胞、樹突狀細胞等)，該免疫系統細胞在其表面上展示與主要組織相容性複合物(MHC)複合的外來抗原。T細胞可以使用它們的T細胞受體(TCR)識別該等複合物。APC處理抗原並將它們呈遞給T細胞。

如本文所用的術語「細胞內傳訊結構域」係指分子的細胞內部分。在實施方式中，細胞內訊號結構域轉導效應功能訊號並指導細胞執行特化功能。雖然可以採用整個細胞內傳訊結構域，但在許多情況下不必使用整個鏈。就使用細胞內傳訊結構域的截短部分而言，可以使用這種截短部分代替完整鏈，只要截短部分可轉導效應子功能訊號即可。因此，術語細胞內傳訊結構域意指包括足以轉導效應子功能訊號的細胞內傳訊結構域的任何截短部分。

細胞內傳訊結構域產生訊號，該訊號促進含有CAR的細胞(例如CART細胞)的免疫效應子功能。免疫效應子功能的實例，例如在CART細胞中，包括細胞溶解活性和輔助活性(包括分泌細胞介素)。

在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域可以包含初級細胞內傳訊結構域。示例性初級細胞內傳訊結構域包含源自負責初級刺激、或抗原依賴性模擬的分子的那些。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域可以包含共刺激細胞內結構域。示例性共刺激細胞內傳訊結構域包含源自負責共刺激訊號、或抗原非依賴性刺激的分子的那些。例如，在CART的情況下，初級細胞內傳訊結構域可以包括T細胞受體的胞質序列，並且共刺激細胞內傳訊結構域可以包括來自共受體或共刺激分子的胞質序列。

初級細胞內傳訊結構域可以包含被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM的傳訊模體。含有ITAM的初級胞質傳訊序列的實例包括但不限於源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也稱為「ICOS」)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。

術語「ζ」或可替代地「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」係指CD247。Swiss-Prot登錄號P20963提供了示例性的人CD3ζ胺基酸序列。「ζ刺激結構域」或可替代地「CD3-ζ刺激結構域」或「TCR-ζ刺激結構域」係指CD3-ζ或其變體的刺激結構域(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。在一些實施方式中，ζ的胞質結構域包含GenBank登錄號BAG36664.1或其變體的殘基52至164(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。在一些實施方式中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」係SEQ ID NO：9或10提供的序列或其變體(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。

術語「共刺激分子」係指T細胞上的同源結合配偶體，該同源結合配偶體與共刺激配位基特異性地結合，從而介導T細胞的共刺激應答，如但不限於增殖。共刺激分子係有效免疫應答所需的除抗原受體或其配位基之外的細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK細胞受體、BTLA、Toll配位基受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、 CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB和與CD83特異性結合的配位基。

共刺激細胞內傳訊結構域係指共刺激分子的細胞內部分。

細胞內傳訊結構域可以包含其來源的分子的整個細胞內部分或整個天然細胞內傳訊結構域或其功能性片段。

術語「4-1BB」係指CD137或腫瘤壞死因子受體超家族成員9。Swiss-Prot登錄號P20963提供了示例性的人4-1BB胺基酸序列。「4-1BB共刺激結構域」係指4-1BB的共刺激結構域或其變體(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。在一些實施方式中，「4-1BB共刺激結構域」係SEQ ID NO：7提供的序列或其變體(例如，具有突變(例如，點突變)、片段、插入或缺失的分子)。

當該術語在本文中使用時，「免疫效應細胞」係指參與免疫應答(例如促進免疫效應子應答)的細胞。免疫效應細胞的實例包括T細胞，例如α/β T細胞和γ/δ T細胞、B細胞、天然殺傷(NK)細胞、天然殺傷T(NKT)細胞、肥大細胞和骨髓來源的吞噬細胞。

當該術語在本文中使用時，「免疫效應子功能或免疫效應子應答」係指例如免疫效應細胞的增強或促進靶細胞的免疫攻擊的功能或應答。例如，免疫效應子功能或應答係指促進靶細胞的殺傷或抑制生長或增殖的T或NK細胞的特性。在T細胞的情況下，初級刺激和共刺激係免疫效應子功能或應答的實例。

術語「效應子功能」係指細胞的特化功能。例如，T細胞的效應子功能可以是細胞溶解活性或輔助活性(包括細胞介素的分泌)。

術語「編碼」係指多核苷酸(如基因、cDNA、或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物過程中用於合成具有確定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或確定胺基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此產生的生物學特性。因此，如果與基因對應的mRNA的轉錄和翻譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列相同並且通常在序列表中提供)和非編碼股(用作基因或cDNA轉錄的模板)都可以稱為編碼蛋白質或者該基因或cDNA的其他產物。

除非另外說明，否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此呈簡並形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列還可以包含內含子，其程度為編碼該蛋白質的核苷酸序列可以在某些形式中含有一個或多個內含子。

術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，並且是指如本文描述的化合物、配製物、材料或組成物的有效於實現特定的生物學結果的量。

術語「內源的」係指來自生物體、細胞、組織或系統或在其內部產生的任何材料。

術語「外源的」係指從生物體、細胞、組織或系統引入或在其外部產生的任何材料。

術語「表現」係指特定核苷酸序列的轉錄和/或翻譯。在一些實施方式中，表現包括被引入細胞的mRNA的翻譯。

術語「轉移載體」係指包含分離的核酸並且可用於向細胞內部遞送該分離的核酸的物質組成物。許多載體在本領域中是已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子化合物或兩親化合物相關的多核苷酸、質體、以及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製的質體或病毒。該術語還應當解釋為進一步包括促進將核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如像聚離胺酸化合物、脂質體等。病毒轉移載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體等。

術語「表現載體」係指包含重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包含與有待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包含足夠的用於表現的順式作用元件；用於表現的其他元件可以由宿主細胞提供或在體外表現系統中提供。表現載體包括本領域已知的所有表現載體，包括摻入重組多核苷酸的黏粒、質體(例如，裸露的或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。

術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科的一個屬。慢病毒在逆轉錄病毒中是獨特的，能夠感染非分裂細胞；它們可以將顯著量的遺傳資訊遞送到宿主細胞的DNA中，因此它們係基因遞送載體的最有效方法中的一種。HIV、SIV、和FIV皆為慢病毒的實例。

術語「慢病毒載體」係指源自慢病毒基因組的至少一部分的載體，尤其包括如下提供的自滅活慢病毒載體：Milone等人，Mol.Ther.[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。可以在臨床中使用的慢病毒載體的其他實例包括但不限於例如來自牛津生物醫藥公司(Oxford BioMedica)的LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen公司的LENTIMAX^TM載體系統等。非臨床類型的慢病毒載體也是可得的並且是熟悉該項技術者已知的。

術語「同源的」或「同一性」係指兩個聚合分子之間(例如，兩個核酸分子(如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間、或兩個多肽分子之間)的亞模體列同一性。當這兩個分子中的亞基位置被相同的單體亞基佔據時；例如，如果兩個DNA分子中的每一個中的位置被腺嘌呤佔據，則它們在該位置係同源的或相同的。兩個序列之間的同源性係匹配位置或同源位置的數量的直接函數；例如，如果兩個序列中一半的位置(例如，長度為十個亞基的聚合物中的五個位置)係同源的，則這兩個序列係50%同源的；如果90%的位置(例如，10個中的9個)係匹配的或同源的，則這兩個序列係90%同源的。

非人(例如鼠)抗體的「人源化」形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合子序列)，其含有來自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多數情況下，人源化抗體及其抗體片段係人免疫球蛋白(受體抗體或抗體片段)，其中來自受體的互補決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)(如具有所希望的特異性、親和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基置換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基由相應非人殘基置換。此外，人源化抗體/抗體片段可以包含既不在受體抗體中也不在導入的CDR或框架序列中發現的殘基。該等修飾可以進一步改進和優化抗體或抗體片段性能。通常，人源化抗體或其抗體片段將包含基本上所有如下項：至少一個(典型地兩個)可變結構域，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些CDR區，且FR區的所有或顯著一部分係人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體或抗體片段還可以包含免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定區的至少一部分。有關進一步的細節，參見Jones等人，Nature[自然]，321：522-525,1986；Reichmann等人，Nature[自然]，332：323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[結構生物學現狀]，2：593-596,1992。

「完全人」係指如下免疫球蛋白，如抗體或抗體片段，其中整個分子係人起源或由與抗體或免疫球蛋白的人形式相同的胺基酸序列組成。

術語「分離的」意指從天然狀態改變的或去除的。例如，天然存在於活體動物中的核酸或肽不是「分離的」，但是與其天然狀態的共存材料部分或完全分開的相同核酸或肽係「分離的」。分離的核酸或蛋白質能以基本上純化的形式存在，或者可以存在於非天然環境(例如像，宿主細胞)中。

在本發明的上下文中，使用以下對常見核酸鹼基的縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，並且「U」係指尿苷。

術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列和異源核酸序列之間的導致後者的表現的功能性連接。例如，當第一核酸序列被放置成與第二核酸序列有功能關係時，該第一核酸序列與該第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表現，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。可操作地連接的DNA序列可以彼此鄰接，並且例如在需要連接兩個蛋白質編碼區的情況下，它們處於同一閱讀框中。

術語「腸胃外」投與免疫原性組成物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(iv.)、肌肉內(i.m.)、或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。

術語「核酸」、「核酸分子」、「多核苷酸」或「多核苷酸分子」係指單股或雙股形式的去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限定，否則該術語涵蓋含有已知的天然核苷酸類似物的核酸，該等核酸具有與參考核酸類似的結合特性並且以與天然存在的核苷酸類似的方式進行代謝。在一些實施方式中，「核酸」、「核酸分子」、「多核苷酸」或「多核苷酸分子」包括核苷酸/核苷衍生物或類似物。除非另有說明，否則特定核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如簡並密碼子取代，例如保守取代)、等位基因、異種同源物、SNP和互補序列以及明確指出的序列。具體而言，簡並密碼子取代(例如，保守取代)可以藉由產生其中一個或多個選定(或所有)密碼子的第三位置被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代的序列來實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes[分子與細胞採針]8：91-98(1994))。

術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可互換地使用，並且是指包含由肽鍵共價連接的胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，並且對可構成蛋白質或肽序列的胺基酸的最大數量沒有限制。多肽包括包含由肽鍵彼此相連的兩個或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語係指短鏈，例如其在本領域中通常也稱為肽、寡肽和寡聚體；並且還是指較長的鏈，其在本領域中通常稱為蛋白質，存在有很多類型的蛋白質。「多肽」包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽的變體、經修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、或其組合。

術語「啟動子」係指啟動多核苷酸序列的特異性轉錄所需的由細胞合成機器或引入的合成機器所識別的DNA序列。

術語「啟動子/調控序列」係指表現與啟動子/調控序列可操作地連接的基因產物所需的核酸序列。在一些情況下，該序列可以是核心啟動子序列，並且在其他情況下，該序列還可以包含增強子序列和表現基因產物所需的其他調控元件。啟動子/調控序列可以是例如以組織特異性方式表現基因產物的啟動子/調控序列。

術語「組成型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物的多核苷酸可操作地連接時，在細胞的大多數或全部生理條件下致使基因產物在細胞中產生的核苷酸序列。

術語「誘導型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物的多核苷酸可操作地連接時，基本上僅在對應於啟動子的誘導物存在於細胞中時才致使基因產物在細胞中產生的核苷酸序列。

術語「組織特異性」啟動子係指當與編碼或由基因指定的多核苷酸可操作地連接時，基本上僅在細胞係對應於啟動子的組織類型的細胞時才致使基因產物在細胞中產生的核苷酸序列。

術語「癌症相關抗原」、「腫瘤抗原」、「過度增殖性障礙抗原」、和「與過度增殖性障礙相關的抗原」可互換地指特異性過度增殖性障礙常見的抗原。在一些實施方式中，該等術語係指在癌細胞表面上完全或作為片段(例如，MHC/肽)表現的分子(典型地是蛋白質、碳水化合物或脂質)，並且其可用於優先將藥理學藥劑靶向癌細胞。在一些實施方式中，腫瘤抗原係由正常細胞和癌細胞兩者表現的標誌物，例如譜系標誌物，例如B細胞上的CD19。在一些實施方式中，腫瘤抗原係與正常細胞相比在癌細胞中過表現的細胞表面分子，例如，與正常細胞相比，1倍過表現、2倍過表現、3倍過表現或更多。在一些實施方式中，腫瘤抗原係在癌細胞中不適當合成的細胞表面分子，例如，與正常細胞上表現的分子相比含有缺失、添加或突變的分子。在一些實施方式中，腫瘤抗原將僅在癌細胞的細胞表面上完全或作為片段(例如，MHC/肽)表現，並且不在正常細胞的表面上合成或表現。在一些實施方式中，本發明的過度增殖性障礙抗原源自癌症，包括但不限於原發性或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌(例如，去勢抵抗性或治療抵抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、卵巢癌、胰臟癌等等)或者漿細胞增殖性障礙，例如無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義未明的單株丙種球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、和POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群、高月病和PEP症候群)。在一些實施方式中，本發明的CAR包括包含結合MHC呈遞的肽的抗原結合結構域(例如抗體或抗體片段)的CAR。通常，源自內源性蛋白質的肽填充主要組織相容性複合物(MHC)I類分子的口袋，並且被CD8+ T淋巴細胞上的T細胞受體(TCR)識別。MHC I類複合物由所有有核細胞組成型表現。在癌症中，病毒特異性和/或腫瘤特異性肽/MHC複合物代表用於免疫療法的獨特類別的細胞表面靶標。已經描述了在人白血球抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或腫瘤抗原的肽的TCR樣抗體(參見，例如，Sastry等人，J Virol.[病毒學雜誌]2011 85(5)：1935-1942；Sergeeva等人，Blood[血液]，2011 117(16)：4262-4272；Verma等人，J Immunol[免疫學雜誌]2010 184(4)：2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther[基因療法]2001 8(21)：1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med[科學轉化醫學]2013 5(176)：176ra33；Tassev等人，Cancer Gene Ther[癌基因療法]2012 19(2)：84-100)。例如，可以從篩選文庫(如人scFv噬菌體展示文庫)鑒定TCR樣抗體。

術語「支持腫瘤的抗原」或「支持癌症的抗原」可互換地指在細胞表面上表現的分子(典型地是蛋白質、碳水化合物或脂質)，該細胞本身不是癌性的、但例如藉由促進其生長或存活、例如對免疫細胞的抗性而支持癌細胞。這種類型的示例性細胞包括基質細胞和骨髓源性的抑制細胞(MDSC)。支持腫瘤的抗原本身不需要在支持腫瘤細胞中發揮作用，只要該抗原存在於支持癌細胞的細胞上。

如在scFv的語境中使用的術語「柔性多肽連接子」或「連接子」係指由單獨或組合使用的胺基酸(如甘胺酸和/或絲胺酸)殘基組成的，以將可變重鏈區和可變輕鏈區連接在一起的肽連接子。在一些實施方式中，柔性多肽連接子係Gly/Ser連接子並且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n係等於或大於1的正整數(SEQ ID NO：41)。例如，n=1、n=2、n=3.N=4、n=5並且n=6、n=7、n=8、n=9並且n=10。在一些實施方式中，柔性多肽連接子包括但不限於(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO：27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO：28)。在一些實施方式中，該連接子包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO：29)的多個重複。描述於WO 2012/138475中的連接子也包括在本發明的範圍內，該文獻藉由引用併入本文。

如本文所用，5'帽(也稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽)係在轉錄開始後不久添加到真核信使RNA的「前」端或5'端的經修飾的鳥嘌呤核苷酸。5'帽由與第一轉錄核苷酸連接的末端基團組成。它的存在對於被核糖體識別和被保護免於RNA酶至關重要。帽添加與轉錄偶聯，並且共轉錄地發生，使得每個都影響另一個。在轉錄開始後不久，合成的mRNA的5'端被與RNA聚合酶相關的帽合成複合物結合。這種酶複合物催化mRNA加帽所需的化學反應。合成作為多步生物化學反應進行。可以修飾加帽部分以調製mRNA的功能，如其穩定性或翻譯效率。

如本文所用，「體外轉錄的RNA」係指已在體外合成的RNA。在一些實施方式中，該RNA係mRNA。通常，體外轉錄的RNA由體外轉錄載體產生。體外轉錄載體包含用於產生體外轉錄的RNA的模板。

如本文所用，「聚(A)」係藉由聚腺苷酸化與mRNA附接的一系列腺苷。在用於暫態表現的構建體的一些實施方式中，聚(A)在50和5000之間(SEQ ID NO：30)。在一些實施方式中，聚(A)大於64個。在一些實施方式中，聚(A)大於100個。在一些實施方式中，聚(A)大於300個。在一些實施方式中，聚(A)大於400個。聚(A)序列可以經化學修飾或酶促修飾以調節mRNA功能，如定位、穩定性或翻譯效率。

如本文所用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷醯基部分或其經修飾的變體與信使RNA分子的共價連接。在真核生物中，大多數信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'多聚(A)尾係藉由酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常數百個)的長序列。在高等真核生物中，將多聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化訊號)的轉錄物上。多聚(A)尾和與其結合的蛋白質有助於保護mRNA免於被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、從細胞核輸出mRNA以及翻譯也是重要的。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA後立即在細胞核中發生，但另外也可稍後在胞質中發生。在轉錄已經終止後，藉由與RNA聚合酶締合的核酸內切酶複合物的作用切割mRNA鏈。切割位點通常被表徵為切割位點附近存在鹼基序列AAUAAA。在mRNA被切割後，腺苷殘基被添加到切割位點處的游離3'端上。

如本文所用，「暫態」係指非整合轉基因的持續數小時、數天或數週的表現，其中表現的時間段小於在整合到基因組中或包含在宿主細胞中的穩定質體複製子內的情況下基因的表現的時間段。

如本文所用，術語「治療(treat、treatment和treating)」係指減少或改善增殖性障礙的進展、嚴重程度和/或持續時間，或者改善增殖性障礙的一種或多種症狀(較佳的是，一種或多種可辨別的症狀)，這由投與一種或多種療法(例如一種或多種治療劑，如本發明的CAR)引起。在具體的實施方式中，術語「治療(treat、treatment和treating)」係指改善增殖性障礙的至少一種可測量的物理參數，如腫瘤的生長，這不一定係患者可辨別的。在其他實施方式中，術語「治療(treat、treatment和treating)」係指藉由例如穩定可辨別的症狀來物理地，或藉由例如穩定物理參數來生理地，或藉由兩者，抑制增殖性障礙的進展。在其他實施方式中，該術語「治療(treat、treatment和treating)」係指減少或穩定腫瘤大小或癌細胞計數。

術語「訊息傳遞途徑」係指在多種訊息傳遞分子之間的生物化學關係，該等訊息傳遞分子在訊號從細胞的部分傳遞至細胞的另一部分中發揮作用。短語「細胞表面受體」包括能夠接收訊號並且傳遞訊號跨過細胞膜的分子以及分子複合物。

術語「受試者」旨在包括可以在其中引發免疫應答的活生物體(例如，哺乳動物，例如，人)。

術語「基本上純化的」細胞係指本質上不含其他細胞類型的細胞。基本上純化的細胞還指已經與其天然存在狀態下正常相關的其他細胞類型分離的細胞。在一些情況下，基本上純化的細胞群體係指同質的細胞群。在其他情況下，該術語僅指已經與其天然狀態下天然相關的細胞分離的細胞。在一些實施方式中，在體外培養細胞。在一些實施方式中，不在體外培養細胞。

如本文所用的術語「治療劑」意指治療。藉由減少、抑制、緩解或根除疾病狀態來獲得治療效果。

如本文所用的術語「預防」意指對疾病或疾病狀態的預防或保護性治療。

術語「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中的過程。「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」細胞係已用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。細胞包括原代主體細胞及其後代。

術語「特異性結合」係指抗體或配位基，其識別並結合樣本中存在的同源結合配偶體(例如，存在於T細胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白質，但是其中抗體或配位基基本上不識別或結合樣本中的其他分子。

如本文所用，「可調節的嵌合抗原受體(RCAR)」係指一組多肽(在最簡單的實施方式中典型地為兩個)，當在免疫效應細胞中時該等多肽為細胞提供針對靶細胞(典型地是癌細胞)的特異性，並且具有細胞內訊號產生。在一些實施方式中，RCAR至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和胞質傳訊結構域(本文中也稱為「細胞內傳訊結構域」)，該胞質傳訊結構域包含源自刺激分子和/或本文在CAR分子的語境中定義的共刺激分子的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，RCAR中的多肽組並不是相互連續的，例如在不同的多肽鏈中。在一些實施方式中，RCAR包括二聚化開關，該二聚化開關在存在二聚化分子時可以將多肽彼此偶聯，例如可以將抗原結合結構域偶聯至細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，RCAR在如本文所述之細胞(例如免疫效應細胞)，例如表現RCAR的細胞(本文還稱為「RCARX細胞」)中表現。在一些實施方式中，RCARX細胞係T細胞，並且被稱為RCART細胞。在一些實施方式中，RCARX細胞係NK細胞，並且被稱為RCARN細胞。RCAR可以為表現RCAR的細胞提供對靶細胞(典型地是癌細胞)的特異性，並且具有可調節的細胞內訊號產生或增殖，這可以優化表現RCAR的細胞的免疫效應特性。在實施方式中，RCAR細胞至少部分地依賴於抗原結合結構域，以提供對包含由該抗原結合結構域結合的抗原的靶細胞的特異性。

當該術語在本文中使用時，「膜錨」或「膜系鏈結構域」係指足以將細胞外或細胞內結構域錨定到質膜的多肽或部分(例如肉豆蔻醯基)。

當該術語在本文中使用時(例如當提及RCAR時)，「開關結構域」係指實體(典型地是基於多肽的實體)，該實體在二聚化分子存在下與另一個開關結構域締合。該締合導致連接到(例如融合到)第一開關結構域的第一實體和連接到(例如融合到)第二開關結構域的第二實體的功能偶聯。第一開關結構域和第二開關結構域統稱為二聚化開關。在實施方式中，第一開關結構域和第二開關結構域彼此相同，例如它們係具有相同一級胺基酸序列的多肽，並且統稱為同源二聚化開關。在實施方式中，第一開關結構域和第二開關結構域彼此不同，例如它們係具有不同一級胺基酸序列的多肽，並且統稱為異源二聚化開關。在實施方式中，該開關係細胞內的。在實施方式中，該開關係細胞外的。在實施方式中，開關結構域係基於多肽(例如基於FKBP或FRB)的實體，並且二聚化分子係小分子(例如雷帕黴素類似物(rapalogue))。在實施方式中，開關結構域係基於多肽的實體(例如結合myc肽的scFv)，並且二聚化分子係多肽、其片段、或多肽的多聚體，例如結合一個或多個myc scFv的myc配位基或myc配位基的多聚體。在實施方式中，開關結構域係基於多肽的實體(例如myc受體)，並且二聚化分子係抗體或其片段，例如myc抗體。

當該術語在本文中使用時(例如當提及RCAR時)，「二聚化分子」係指促進第一開關結構域與第二開關結構域締合的分子。在實施方式中，二聚化分子不在受試者中天然發生，或者不以導致顯著二聚化的濃度發生。在實施方式中，二聚化分子係小分子，例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物，例如RAD001。

當與mTOR抑制劑(例如變構mTOR抑制劑，例如RAD001或雷帕黴素，或催化性mTOR抑制劑)聯合使用時，術語「低免疫增強劑量」係指mTOR抑制劑部分但不是完全抑制mTOR活性的劑量，例如，如藉由P70 S6激酶活性的抑制測量的。本文討論了用於評價mTOR活性之方法，例如藉由抑制P70 S6激酶。劑量不足以導致完全免疫抑制，但足以增強免疫應答。在一些實施方式中，mTOR抑制劑的低免疫增強劑量導致PD-1陽性T細胞數目的減少和/或PD-1陰性 T細胞數目的增加，或PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞的比率的增加。在一些實施方式中，低免疫增強劑量的mTOR抑制劑導致初始T細胞的數目增加。在一些實施方式中，低免疫增強劑量的mTOR抑制劑導致以下中的一個或多個：

以下標誌物中的一個或多個例如在記憶T細胞(例如，記憶T細胞先質)上的表現增加：CD62L^高、CD127^高、CD27⁺和BCL2；

KLRG1在例如記憶T細胞(例如，記憶T細胞先質)上的表現減少；並且

記憶T細胞先質，例如具有以下特徵中的任一個或組合的細胞的數目增加：增加的CD62L^高、增加的CD127^高、增加的CD27⁺、減少的KLRG1、和增加的BCL2；

其中，例如，與未治療的受試者相比，例如至少暫態地發生上述任何變化。

如本文所用的「難治性」係指對治療無應答的疾病，例如癌症。在實施方式中，難治性癌症可以在治療開始之前或治療開始時對治療具有抗性。在其他實施方式中，難治性癌症可能在治療期間變得有抗性。難治性癌症也稱為抗性癌症。

如本文所用的「復發的」或「復發」係指疾病(例如癌症)或疾病的體征和症狀(如改善或響應期之後，例如在療法(例如癌症療法)的先前治療後的癌症)的回返或再現。應答初始期可能涉及癌細胞水平降低至低於某一閾值，例如低於20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%。再現可能涉及癌細胞水平升高超過某一閾值，例如高於20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%。例如，如在B-ALL的上下文中，再現可能涉及例如在完全應答之後血液、骨髓(>5%)或任何髓外位點中的母細胞再現。在本上下文中，完全應答可能涉及<5% BM母細胞。更通常地，在一些實施方式中，應答(例如，完全應答或部分應答)可能涉及不存在可檢測的MRD(最小殘留疾病)。在一些實施方式中，初始應答期持續至少1、2、3、4、5、或6天；至少1、2、3、或4週；至少1、2、3、4、6、8、10、或12個月；或至少1、2、3、4、或5年。

範圍：貫穿本揭露內容，能以範圍形式呈現本發明的各個實施方式。應該理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便以及簡潔，不應該被理解為對本發明範圍的不靈活的限制。因此，範圍的描述應當被認為係具有確切揭露的所有可能的子範圍以及該範圍內的單獨數值。例如，如從1至6的範圍的描述應當被認為係具有確切揭露的子範圍，如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該範圍內的單獨數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作為另一個實例，如95%-99%同一性的範圍包括具有95%、96%、97%、98%、或99%同一性，並且包括如96%-99%、96%-98%、96%-97%、97%-99%、97%-98%、和98%-99%同一性的子範圍。無論範圍的寬度如何，這都適用。

當該術語在本文中使用時，「基因編輯系統」係指指導和影響由所述系統靶向的基因組DNA位點處或附近的一種或多種核酸的改變(例如缺失)的系統，例如一種或多種分子。基因編輯系統係本領域中已知的，並且在下文更全面地描述。

如本文所用，「組合」投與意指在受試者患病期間將兩種(或更多種)不同的治療遞送至受試者，例如在受試者被診斷患有病症後並且在該病症被治癒或清除前或者在由於其他原因終止治療前遞送兩種或多種治療。在一些實施方式中，當第二治療的遞送開始時，第一治療的遞送仍在進行，所以就投與而言存在重疊。這在本文中有時被稱為「同時遞送」或「並行遞送」。在其他實施方式中，一種治療的遞送在另一種治療的遞送開始前結束。在每一種情況的一些實施方式中，由於是組合投與，所以該治療更有效。例如，與不存在第一治療的條件下投與第二治療所觀察到的結果相比，第二治療更有效，例如使用更少的第二治療觀察到等效的作用，或者第二治療將症狀減少更大的程度，或者觀察到對第一治療而言類似的情況。在一些實施方式中，與不存在另一種治療的條件下遞送一種治療所觀察到的結果相比，遞送使得症狀或與該障礙相關的其他參數減少更多。兩種治療的作用可以部分累加、完全累加、或大於累加。該遞送可以使得當遞送第二治療時，遞送的第一治療的作用仍然是可檢測的。

術語「消耗(deplete)」或「耗減(depleting)」在本文中可互換使用，係指在進行例如選擇步驟(例如，陰性選擇)的過程之後，樣本中細胞、蛋白質或大分子的水平或量的降低或減少。消耗可以是細胞、蛋白質或大分子的完全或部分消耗。在一些實施方式中，消耗為與進行該過程之前樣本中的細胞、蛋白質或大分子的水平或量相比細胞、蛋白質或大分子的水平或量的降低或減少至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%。

如本文所用，「初始T細胞」係指抗原缺乏經驗的T細胞。在一些實施方式中，抗原缺乏經驗的T細胞在胸腺中而不在外周遇到其同源抗原。在一些實施方式中，初始T細胞係記憶細胞的先質。在一些實施方式中，初始T細胞表現CD45RA和CCR7，但不表現CD45RO。在一些實施方式中，初始T細胞可以藉由CD62L、CD27、CCR7、CD45RA、CD28和CD127的表現以及不存在CD95或CD45RO同種型來表徵。在一些實施方式中，初始T細胞表現CD62L、IL-7受體-α、IL-6受體和CD132，但不表現CD25、CD44、CD69或CD45RO。在一些實施方式中，初始T細胞表現CD45RA、CCR7、和CD62L，但不表現CD95或IL-2受體β。在一些實施方式中，使用流動式細胞測量術評估標誌物的表面表現水平。

術語「中樞記憶T細胞」係指人類中CD45RO陽性並表現CCR7的T細胞亞群。在一些實施方式中，中樞記憶T細胞表現CD95。在一些實施方式中，中樞記憶T細胞表現IL-2R、IL-7R和/或IL-15R。在一些實施方式中，中樞記憶T細胞表現CD45RO、CD95、IL-2受體β、CCR7和CD62L。在一些實施方式中，使用流動式細胞測量術評估標誌物的表面表現水平。

術語「幹細胞記憶T細胞(stem memory T cell)」、「幹細胞記憶T細胞(stem cell memory T cell)」、「幹細胞樣記憶T細胞」、「記憶幹細胞T細胞」、「T記憶幹細胞」、「T幹細胞記憶細胞」或「TSCM細胞」係指具有幹細胞樣能力的記憶T細胞的亞群，例如，自我更新的能力和/或重建記憶和/或效應子T細胞亞群的多潛能性能力。在一些實施方式中，幹細胞記憶T細胞表現CD45RA、CD95、IL-2受體β、CCR7和CD62L。在一些實施方式中，使用流動式細胞測量術評估標誌物的表面表現水平。在一些實施方式中，示例性的幹細胞記憶T細胞揭露於Gattinoni等人，Nat Med.[自然醫學]2017年1月06日；23(1)：18-27，將其藉由引用以其全文併入本文。

為清楚起見，除非另有說明，否則將細胞或細胞群體分類為「不表現」或具有「不存在」或對特定標誌物「陰性」可能不一定意味著標誌物的絕對缺失。熟悉該項技術者可以容易地將細胞與陽性和/或陰性對照進行比較，和/或設定預定閾值，並且當細胞具有表現水平低於預定閾值或細胞群體具有低於使用常規檢測方法(例如，使用流動式細胞測量術，例如，如本文實例中所述之)的預定閾值的總表現水平時，將細胞或細胞群體分類為不表現或對標誌物呈陰性。

如本文所用，細胞的術語「基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)」係指反映細胞顯示效應記憶T細胞(TEM)表型對比干細胞記憶T細胞(TSCM)表型的程度的分數。較高的基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)表明TEM表型增加，而較低的基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)表明TSCM表型增加。在一些實施方式中，藉由測量在TEM細胞中上調和/或在TSCM細胞中下調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：MXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、 TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY、和GFPT2。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖25A所例示的，針對每種細胞測定基因集評分(Up TEM對比Down TSCM)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)。

如本文所用，細胞的術語「基因集評分(向上Treg對比向下Teff)」係指反映細胞顯示調節性T細胞(Treg)表型對比效應T細胞(Teff)表型的程度的分數。較高的基因集評分(向上Treg對比向下Teff)表明Treg表型增加，而較低的基因集評分(向上Treg對比向下Teff)表明Teff表型增加。在一些實施方式中，藉由測量Treg細胞中上調和/或在Teff細胞中下調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向上Treg對比向下Teff)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：C12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、 HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3、和FOXP3。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖25B所例示的，測定基因集評分(向上Treg對比向下Teff)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(向上Treg對比向下Teff)。

如本文所用，術語細胞的「基因集評分(向下幹細胞性)」係指反映細胞顯示幹細胞性表型的程度的分數。較低的基因集評分(向下幹細胞性)表明幹細胞性表型增加。在一些實施方式中，藉由測量在分化幹細胞中上調而在造血幹細胞中下調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向下幹細胞性)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：ACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1、和XRCC5。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖25C所例示的，測定基因集評分(向下幹細胞性)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(向下幹細胞性)。

如本文所用，細胞的術語「基因集評分(向上缺氧)」係指反映細胞顯示高缺氧表型的程度的分數。較高的基因集評分(向上缺氧)表明缺氧表型增加。在一些實施方式中，藉由測量在經歷缺氧的細胞中上調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向上缺氧)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：ABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、 SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11、和XRCC6。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖25D所例示的，測定基因集評分(向上缺氧)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(向上缺氧)。

如本文所用，細胞的術語「基因集評分(向上自噬)」係指反映細胞顯示自噬表型的程度的分數。較高的基因集評分(向上自噬)表明自噬表型增加。在一些實施方式中，藉由測量在經歷自噬的細胞中上調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向上自噬)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：ABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、 DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、 SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNE8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593、和ZNF681。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖25E所例示的，測定基因集評分(向上自噬)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(向上自噬)。

如本文所用，細胞的術語「基因集評分(向上靜息對比向下活化)」係指反映細胞顯示靜息T細胞表型對比活化T細胞表型的程度的分數。較高的基因集評分(向上靜息對比向下活化)表明靜息T細胞表型增加，而較低的基因集評分(向上靜息對比向下活化)表明活化的T細胞表型增加。在一些實施方式中，藉由測量在靜息T細胞中上調和/或在活化T細胞中下調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向上靜息對比向下活化)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：ABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862、和ZNF91。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖24D所例示的，測定基因集評分(向上靜息對比向下活化)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(向上靜息對比向下活化)。

如本文所用，細胞的術語「基因集評分(記憶分化逐漸增加)」係指反映細胞在記憶分化中的階段的分數。基因集「記憶分化逐漸增加」的較高基因集評分表明晚期記憶T細胞表型增加，而基因集「記憶分化逐漸增加」的較低基因集評分表明早期記憶T細胞表型增加。在一些實施方式中，藉由測量在記憶分化期間上調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向上自噬)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、 SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、 PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、和KLRB1。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖26B所例示的，測定基因集評分(記憶分化逐漸增加)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(記憶分化逐漸增加)。

如本文所用，細胞的術語「基因集評分(向上TEM對比向下TN)」係指反映細胞顯示效應記憶T細胞(TEM)表型對比初始T細胞(TN)表型的程度的分數。較高的基因集評分(向上TEM對比向下TN)表明TEM表型增加，而較低的基因集評分(向上TEM對比向下TN)表明TN表型增加。在一些實施方式中，藉由測量在TEM細胞中上調和/或在TN細胞中下調的一種或多種基因的表現來確定基因集評分(向上TEM對比向下TN)，例如，選自下組的一種或多種基因，該組由以下組成：MYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、 FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK、和KLRB1。在一些實施方式中，使用RNA-seq，例如單細胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如如實例7中關於圖26C所例示的，測定基因集評分(向上TEM對比向下TN)。在一些實施方式中，藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(向上TEM對比向下TN)。

在基因集評分值(例如，中位數基因集評分值)的上下文中，當陽性基因集評分減少100%時，該值變為0。當陰性基因集評分增加100%時，該值變為0。例如在圖25A中，第1天樣本的中位數基因集評分係-0.084；第9天樣本的中位數基因集評分係0.035；並且輸入樣本的中位數基因集評分係-0.1。在圖25A中，輸入樣本的中位數基因集評分增加100%導致基因集評分值為0；並且輸入樣本的中位數基因集評分增加200%導致基因集評分值為0.1。在圖25A中，第9天樣本的中位數基因集評分降低100%導致基因集評分值為0；並且第9天樣本的中位數基因集評分降低200%導致基因集評分值為-0.035。

如本文所用，術語「珠」係指具有固體表面的離散顆粒，其尺寸範圍為直徑從約0.1μm至數毫米。珠可以是球形的(例如，微球)或具有不規則的形狀。珠可包括多種材料，包括但不限於順磁性材料、陶瓷、塑膠、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、鈦、乳膠、Sepharose^TM、纖維素、尼龍等。在一些實施方式中，珠係相對均勻的、直徑約4.5μm、球形、超順磁性聚苯乙烯珠，例如，用抗CD3抗體(例如CD3ε)和CD28的混合物塗覆，例如，共價偶聯。在一些實施方式中，珠係Dynabeads^®。在一些實施方式中，抗CD3和抗CD28抗體都與相同的珠偶聯，模擬抗原呈遞細胞對T細胞的刺激。Dynabeads^®的性質和Dynabeads^®用於細胞分離和擴增的用途係本領域熟知的，例如，參見 Neurauter等人，Cell isolation and expansion using Dynabeads[使用Dynabeads進行細胞分離和擴增]，Adv Biochem Eng Biotechnol.[生物化學工程生物技術的進展]2007；106：41-73，其全部內容藉由引用併入本文。

如本文所用，術語「奈米基質」係指包含可移動聚合物鏈基質的奈米結構。奈米基質的尺寸為1至500nm，例如10至200nm。在一些實施方式中，移動聚合物鏈的基質與一種或多種促效劑附接，該促效劑向T細胞提供活化訊號，例如促效劑抗CD3抗體和/或抗CD28抗體。在一些實施方式中，奈米基質包含附接的膠體聚合物奈米基質，例如共價附接至一種或多種刺激分子的促效劑和/或一種或多種共刺激分子的促效劑。在一些實施方式中，一種或多種刺激分子的促效劑係CD3促效劑(例如，抗CD3激動性抗體)。在一些實施方式中，一種或多種共刺激分子的促效劑係CD28促效劑(例如，抗CD28促效劑抗體)。在一些實施方式中，奈米基質藉由不存在固體表面來表徵，例如，作為促效劑的附著點，例如抗CD3抗體和/或抗CD28抗體。在一些實施方式中，奈米基質係WO2014/048920A1中揭露的奈米基質或來自美天旎生物技術公司(Miltenyi Biotcc GmbH)的MACS^® GMP T Cell TransAct^TM套組中給出的奈米基質，其藉由引用整體併入本文。MACS^® GMP T Cell TransAct^TM由共價附接至針對人CD3和CD28的人源化重組促效劑抗體的膠體聚合物奈米基質組成。

本文的組成物和方法的各個實施方式在下文進一步詳細描述。另外的定義在整個說明書中陳述。

描述

本文提供了用於使用表現一種或多種嵌合抗原受體(CAR)的細胞來治療疾病(如癌症)的物質組成物和使用方法。在一些實施方式中，本發明提供了經工程化以表現一種或多種CAR的細胞(例如免疫效應細胞，例如T 細胞或NK細胞)，其中該CAR T細胞(「CART」)或CAR NK細胞顯示抗腫瘤特性。

在一些實施方式中，該細胞表現至少兩種CAR。在一些實施方式中，該細胞表現與第一抗原結合的第一CAR和與第二抗原結合的第二CAR。在一些實施方式中，該第一抗原和該第二抗原係不同的。在一些實施方式中，該第一抗原係BCMA。在一些實施方式中，該第一CAR係抗BCMA CAR，該抗BCMA CAR包含本文揭露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，例如表3-15、19、20、22和26中揭露的序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列，例如本文揭露的抗BCMA CAR。在一些實施方式中，該第二抗原係CD19。在一些實施方式中，該第二抗原係抗CD19 CAR，該抗CD19 CAR包含本文揭露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，例如表2、19和22中揭露的序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列，例如本文揭露的抗CD19 CAR。在一些實施方式中，該第一CAR和該第二CAR由佈置在單個核酸分子上的核酸序列表現。在一些實施方式中，該編碼第一CAR的核酸序列和該編碼第二CAR的核酸序列由編碼自身切割位點(例如P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點)的核酸序列分開。在一些實施方式中，該細胞係表現本文揭露的雙CAR的細胞。在一些實施方式中，該第一CAR和該第二CAR由佈置在上分開的核酸分子上的核酸序列表現。在一些實施方式中，使用本文揭露的共轉導系統將該細胞工程化。

在一些實施方式中，該細胞表現與第一抗原和第二抗原結合的CAR。在一些實施方式中，該CAR係本文揭露的雙抗體CAR。在一些實施方式中，該CAR包含結合結構域，該結合結構域包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)和第二VL(VL2)。在一些實施方式中，該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1、VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1、VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1、VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1、VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2、VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2、VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2、或VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。

在一些實施方式中，本發明的CAR將抗原結合結構域與細胞內傳訊分子組合。例如，在一些實施方式中，該細胞內傳訊分子包括但不限於CD3-ζ鏈、4-1BB和CD28傳訊模組及其組合。

此外，本發明提供了CAR組成物及其在用於治療(在其他疾病中)癌症或任何惡性腫瘤或自體免疫疾病的藥物或方法中的用途。

嵌合抗原受體(CAR)

本發明提供了免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)，該等免疫效應細胞被工程化以含有一種或多種CAR，該一種或多種嵌合蛋白將免疫效應細胞引導至癌症。這藉由CAR上的抗原結合結構域實現，該抗原結合結構域對癌症相關抗原具有特異性。存在兩類可以藉由本文所述之CAR靶向的癌症相關抗原(腫瘤抗原)：(1)在癌細胞表面上表現的癌症相關抗原；和(2)本身在細胞內的癌症相關抗原，然而，這種抗原的片段(肽)藉由MHC(主要組織相容性複合物)呈遞在癌細胞的表面上。

因此，例如，藉由本文所述之方法獲得的免疫效應細胞可以被工程化以含有靶向以下癌症相關抗原(腫瘤抗原)之一的CAR：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、 Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、豆莢蛋白、HPV E6,E7、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺特異性蛋白(prostein)、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位中斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸接基酯酶和mut hsp 70-2。

可以作為本文所述之CAR分子的一部分的各種組分的非限制性實例的序列在表1中列出，其中「aa」代表胺基酸，「na」代表編碼相應肽的核酸。

[表1].CAR的各種組分的序列

在一些實施方式中，抗原結合結構域包含結合靶細胞表面上的相反配位基的分子的細胞外結構域、或其相反配位基結合片段。

免疫效應細胞可包含重組DNA構建體，其包含編碼CAR的序列，其中CAR包含與腫瘤抗原(例如，本文描述的腫瘤抗原)特異性結合的抗原結合結構域(例如，抗體或抗體片段，TCR或TCR片段)，和細胞內傳訊結構域。細胞內傳訊結構域可以包含共刺激傳訊結構域和/或初級傳訊結構域，例如ζ鏈。如其他地方所述，本文所述之方法可包括用編碼CAR的核酸(例如本文所述之CAR)轉導來自例如T調節性細胞耗減的細胞群體的細胞。

在一些實施方式中，CAR包含scFv結構域，其中scFv前面可以是視需要的前導序列(如SEQ ID NO：1中提供的)、並且後面係視需要的鉸鏈序列(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38中提供的)、跨膜區(如SEQ ID NO：6中提供的)、包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16的細胞內傳訊結構域和包括SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的CD3ζ序列，例如，其中該等結構域係連續的並在相同的閱讀框中以形成單一融合蛋白。

在一些實施方式中，示例性CAR構建體包含視需要的前導序列(例如，本文所述之前導序列)、細胞外抗原結合結構域(例如，本文所述之抗原結合結構域)、鉸鏈(例如，本文所述之鉸鏈區)、跨膜結構域(例如，本文所述之跨膜結構域)、和細胞內刺激結構域(例如，本文所述之細胞內刺激結構域)。在一些實施方式中，示例性CAR構建體包含視需要的前導序列(例如本文所述之前導序列)、細胞外抗原結合結構域(例如本文所述之抗原結合結構域)、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈區)、跨膜結構域(例如本文所述之跨膜結構域)、細胞內共刺激傳訊結構域(例如本文所述之共刺激傳訊結構域)和/或細胞內初級傳訊結構域(例如本文所述之初級傳訊結構域)。

示例性前導序列提供為SEQ ID NO：1。另外的示例性前導序列包括在SEQ ID NO：351中提供的或由SEQ ID NO：352或353編碼的那些前導序列。示例性鉸鏈/間隔子序列提供為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38。示例性跨膜結構域序列提供為SEQ ID NO：6。4-1BB蛋白的細胞內傳訊結構域的示例性序列提供為SEQ ID NO：7。CD27的細胞內傳訊結構域的示例性序列提供為SEQ ID NO：16。示例性CD3ζ結構域序列提供為SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。

在一些實施方式中，免疫效應細胞包括重組核酸構建體，該重組核酸構建體包含編碼CAR的核酸分子，其中核酸分子包含編碼抗原結合結構域的核酸序列，其中該序列與編碼細胞內傳訊結構域的核酸序列係連續的並在相同的閱讀框中。可用於CAR中的示例性細胞內傳訊結構域包括但不限於例如CD3-ζ、CD28、CD27、4-1BB等的一個或多個細胞內傳訊結構域。在一些情況下，所述CAR可以包含CD3-ζ、CD28、4-1BB等的任何組合。

編碼所希望分子的核酸序列可以使用本領域已知的重組方法獲得，例如藉由從表現核酸分子的細胞中篩選文庫，藉由從已知包含該核酸分子的載體中獲得核酸分子，或藉由使用標準技術直接從含有該基因的細胞和組織分離。可替代地，目的核酸可以合成產生，而不是選殖產生。

可以使用例如逆轉錄病毒或慢病毒載體構建體將編碼CAR的核酸引入免疫效應細胞。

也可以使用例如可以直接轉染到細胞中的RNA構建體將編碼CAR的核酸引入免疫效應細胞。用於產生用於轉染的mRNA之方法涉及用特別設計的引物對模板進行體外轉錄(IVT)、然後添加聚(A)以產生含有3’和5’非翻譯序列(「UTR」)(例如，本文描述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文描述的5’帽)和/或內部核糖體進入位點(IRES)(例如，本文描述的IRES)、待表現的核酸和聚A尾的構建體，典型地長度為50-2000個鹼基(例如，實例中描述的，例如，SEQ ID NO：35)。這樣產生的RNA可以有效地轉染不同類型的細胞。在一些實施方式中，模板包含針對CAR的序列。在一些實施方式中，藉由電穿孔將RNA CAR載體轉導到細胞中，例如，T細胞中。

抗原結合結構域

在一些實施方式中，多個免疫效應細胞(例如T調節性細胞耗減的細胞群體)包括編碼CAR的核酸，該CAR包含靶特異性結合元件(另外稱為抗原結合結構域)。結合元件的選擇取決於限定靶細胞表面的配位基的類型和數目。例如，可以選擇抗原結合結構域以識別在與特定疾病狀態相關的靶細胞上充當細胞表面標誌物的配位基。因此，可以作為本文所述之CAR中的抗原結合結構域的配位基的細胞表面標誌物的實例包括與病毒、細菌和寄生蟲感染、自體免疫疾病和癌細胞相關的那些。

在一些實施方式中，包含抗原結合結構域的CAR的一部分包含靶向腫瘤抗原(例如，本文所述之腫瘤抗原)的抗原結合結構域。

抗原結合結構域可以是與抗原結合的任何結構域，包括但不限於單株抗體、多株抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、及其功能片段，包括但不限於單結構域抗體(如駱駝來源的奈米抗體的重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、和可變結構域(VHH))，以及本領域已知的用作抗原結合結構域的可替代支架(如重組纖網蛋白結構域等)、T細胞受體(TCR)或其片段(例如，單鏈TCR)等。在一些情況下，抗原結合結構域源自其中最終將使用CAR的相同物種係有益的。例如，對於在人中使用，CAR的抗原結合結構域包含抗體或抗體片段的抗原結合結構域的人或人源化殘基可以是有益的。

CD19 CAR

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞係表現CD19 CAR的細胞(例如，表現與人CD19結合的CAR的細胞)。

在一些實施方式中，該CD19 CAR的抗原結合結構域具有與描述於Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫學]34(16-17)：1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的結合特異性。在一些實施方式中，該CD19 CAR的抗原結合結構域包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫學]34(16-17)：1157-1165(1997)中描述的scFv片段。

在一些實施方式中，該CD19 CAR包括根據WO 2014/153270(藉由引用併入本文)的表3的抗原結合結構域(例如，人源化抗原結合結構域)。WO 2014/153270還描述了測定多種CAR構建體的結合和功效之方法。

在一些實施方式中，親本鼠scFv序列係在PCT公開WO 2012/079000(藉由引用併入本文)中提供的CAR19構建體。在一些實施方式中，該抗CD19結合結構域係WO 2012/079000中所述之scFv。

在一些實施方式中，該CAR分子包含在PCT公開WO 2012/079000中作為SEQ ID NO：12提供的融合多肽序列，其提供特異性結合至人CD19的鼠來源的scFv片段。

在一些實施方式中，CD19 CAR包含在PCT公開WO 2012/079000中作為SEQ ID NO：12提供的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該胺基酸序列係：

(SEQ ID NO：292)，或與其基本同源的序列。

在一些實施方式中，該CD19 CAR具有USAN名稱TISAGENLECLEUCEL-T。在實施方式中，CTL019藉由T細胞的基因修飾來製備，該CTL019藉由用在EF-1α啟動子控制下含有CTL019轉基因的自身失活型複製缺陷型慢病毒(LV)載體的轉導進行穩定插入來介導。CTL019可以是轉基因陽性和陰性T細胞的混合物，其基於轉基因陽性T細胞百分比遞送至受試者。

在其他實施方式中，該CD19 CAR包括根據WO 2014/153270(藉由引用併入本文)的表3的抗原結合結構域(例如，人源化抗原結合結構域)。

對於臨床環境，鼠CD19抗體的人源化可以是所希望的，其中小鼠特異性殘基在接受CART19治療(即，用CAR19構建體轉導的T細胞治療)的患者中可以誘導人-抗-小鼠抗原(HAMA)應答。人源化CD19 CAR序列的產生、表徵和功效描述於國際申請WO 2014/153270中，將該文獻藉由引用以其全文併入本文，包括實例1-5(第115-159頁)。

在一些實施方式中，該CAR分子係人源化的CD19 CAR，其包含以下的胺基酸序列：

(SEQ ID NO：293)

(SEQ ID NO：294)

(SEQ ID NO：349)

(SEQ ID NO：350)

可以根據本揭露使用本領域任何已知的CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原結合結構域。例如，LG-740；CD19 CAR描述於以下中：美國專利案號8,399,645；美國專利案號7,446,190；Xu等人，Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2)：255-260(2012)；Cruz等人，Blood[血液]122(17)：2965-2973(2013)；Brentjens等人，Blood[血液]118(18)：4817-4828(2011)；Kochenderfer等人，Blood[血液]116(20)：4099-102(2010)；Kochenderfer等人，Blood[血液]122(25)：4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)[美國基因與細胞治療學會(ASGCT)第16屆年度會議](5月15-18日，鹽湖城)2013，文摘10。

示例性CD19 CAR包括本文所述之CD19 CAR，或描述於以下中的抗CD19 CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014)：3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液]，122.25(2013)：4129-39；Cruz等人Blood[血液]122.17(2013)：2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、 NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，該等文獻各自藉由引用以其全文併入本文。

在一些實施方式中，CD19 CAR包含以下序列，例如揭露於表2中的CDR、VH、VL、scFv、或全長CAR序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、或99%同一性的序列。

[表2].示例性抗CD19分子的胺基酸序列

BCMA CAR

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞係表現BCMA CAR的細胞(例如，表現與人BCMA結合的CAR的細胞)。示例性BCMA CAR可包括WO2016/014565的表1或16中揭露的序列，其藉由引用併入本文。BCMA CAR構建體可包括視需要的前導序列；視需要的鉸鏈結構域，例如CD8鉸鏈結構域；跨膜結構域，例如CD8跨膜結構域；細胞內結構域，例如，4-1BB細胞內結構域；和功能性傳訊結構域，例如CD3-ζ結構域。在某些實施方式中，該等結構域鄰接並在同一閱讀框中以形成單個融合蛋白。在其他實施方式中，結構域在分開的多肽中，例如，在如本文描述的RCAR分子中。

在一些實施方式中，該BCMA CAR分子包括揭露於WO 2016/014565中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一種或多種CDR、VH、VL、scFv、或全長序列，或與其基本上(例如，95%-99%)相同的序列。

可以用於抗BCMA CAR構建體的另外的示例性BCMA靶向序列揭露於WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US 2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US 2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，將其內容藉由引用併入本文。在一些實施方式中，使用來自PCT公開WO 2012/0163805(將其內容藉由引用以其全文特此併入)的VH和VL序列產生另外的示例性BCMA CAR構建體。

在一些實施方式中，BCMA CAR包含以下序列，例如揭露於表3-15中的CDR、VH、VL、scFv、或全長CAR序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、或99%同一性的序列。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含人抗體或人抗體片段。在一些實施方式中，該人抗BCMA結合結構域包含本文(例如，表3-15中)所述之人抗BCMA結合結構域的一個或多個(例如，全部三個)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或本文(例如，表3-15中)所述之人抗BCMA結合結構域的一個或多個(例如，全部三個)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些實施方式中，該人抗BCMA結合結構域包含本文(例如表3、7、11、11a和12)所述之人VL和/或本文(例如表3、7、11、11a和12)所述之人VH。在一些實施方式中，該抗BCMA結合結構域係scFv，該scFv包含表3、7、11、11a和12的胺基酸序列的VL和VH。在一些實施方式中，抗BCMA結合結構域(例如，scFv)包含：VL，該VL包含具有表3、7、11、11a和12中提供的胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代，如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代，如保守取代)的胺基酸序列，或與表3、7、11、11a和12的胺基酸序列具有95%-99%同一性的序列；和/或VH，該VH包含具有表3、7、11、11a和12中提供的胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代，如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代，如保守取代)的胺基酸序列，或與表3、7、11、11a和12的胺基酸序列具有95%-99%同一性的序列。

[表3]：示例性PALLAS來源的抗BCMA分子的胺基酸和核酸序列

[表4]：示例性PALLAS來源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

[表5]：示例性PALLAS來源的抗BCMA分子的喬西亞CDR

[表6]：示例性PALLAS來源的抗BCMA分子的IMGT CDR

[表7]：示例性B細胞來源的抗BCMA分子的胺基酸和核酸序列

[表8]：示例性B細胞來源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

[表9]：示例性B細胞來源的抗BCMA分子的喬西亞CDR

[表10]：示例性B細胞來源的抗BCMA分子的IMGT CDR

[表11]：基於PI61的示例性抗BCMA分子的胺基酸和核酸序列

[表11A]：基於PI161的另外的示例性抗BCMA結合序列

[表12]：示例性雜交瘤來源的抗BCMA分子的胺基酸和核酸序列

[表13]：示例性雜交瘤來源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

[表14]：示例性雜交瘤來源的抗BCMA分子的喬西亞CDR

[表15]：示例性雜交瘤來源的抗BCMA分子的IMGT CDR

[表20].示例性抗BCMA分子的胺基酸和核酸序列

[表26].示例性抗BCMA分子的CDR

在一些實施方式中，人抗BCMA結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。

在某些實施方式中，本文所述之CAR分子或本文所述之抗BCMA結合結構域包括：

(1)選自以下中的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO：54的LC CDR1、SEQ ID NO：55的LC CDR2和SEQ ID NO：56的LC CDR3；和/或

(2)選自以下中的一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：84的HC CDR3；(ii)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：46的HC CDR3；(iii)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：68的HC CDR3；或(iv)SEQ ID NO：44的HC CDR1、SEQ ID NO：45的HC CDR2和SEQ ID NO：76的HC CDR3。

(1)選自以下中的一者的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：131的LC CDR2和SEQ ID NO：132的LC CDR3；(ii)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：96的LC CDR2和SEQ ID NO：97的LC CDR3；(iii)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：114的LC CDR2和SEQ ID NO：115的LC CDR3；或(iv)SEQ ID NO：95的LC CDR1、SEQ ID NO：114的LC CDR2和SEQ ID NO：97的LC CDR3；和/或

(2)選自以下中的一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO：86的HC CDR1、SEQ ID NO：130的HC CDR2和SEQ ID NO：88的HC CDR3；(ii)SEQ ID NO：86的HC CDR1、SEQ ID NO：87的HC CDR2和SEQ ID NO：88的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO：86的HC CDR1、SEQ ID NO：109的HC CDR2和SEQ ID NO：88的HC CDR3。

(1)選自以下中的一者的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO：147的LC CDR1、SEQ ID NO：182的LC CDR2和SEQ ID NO：183的LC CDR3；(ii)SEQ ID NO：147的LC CDR1、SEQ ID NO：148的LC CDR2和SEQ ID NO：149的LC CDR3；或(iii)SEQ ID NO：147的LC CDR1、SEQ ID NO：170的LC CDR2和SEQ ID NO：171的LC CDR3；和/或

(2)選自以下中的一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO：179的HC CDR1、SEQ ID NO：180的HC CDR2和SEQ ID NO：181的HC CDR3；(ii)SEQ ID NO：137的HC CDR1、SEQ ID NO：138的HC CDR2和SEQ ID NO：139的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO：160的HC CDR1、SEQ ID NO：161的HC CDR2和SEQ ID NO：162的HC CDR3。

在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、46、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、68、54、55和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、84、57、58和59的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、46、57、58和59的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、68、57、58和59的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、76、57、58和59的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、85、60、58和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、51、60、58和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、69、60、58和56的胺基酸序列。在一些實施方式中，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：49、50、77、60、58和56的胺基酸序列。

在一些實施方式中，人抗BCMA結合結構域包含scFv，該scFv包含VH(例如，本文所述之VH)和VL(例如，本文所述之VL)。在一些實施方式中，VH藉由連接子(例如，本文所述之連接子，例如表1中所述之連接子)附接至VL。在一些實施方式中，人抗BCMA結合結構域包含(Gly₄-Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，較佳的是3或4(SEQ ID NO：26)。scFv的輕鏈可變區和重鏈可變區可以是例如處於以下方向中的任一個：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。

在一些實施方式中，抗BCMA結合結構域係片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一些實施方式中，抗BCMA結合結構域係Fv、Fab、(Fab')2 或雙功能(例如，雙特異性)雜合抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.[歐洲免疫學雜誌]17,105(1987))。在一些實施方式中，本發明的抗體及其片段以野生型或增強的親和力結合BCMA蛋白。

在一些情況下，可以根據本領域已知之方法製備scFv(參見例如，Bird等人，(1988)Science[科學]242：423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]85：5879-5883)。可以藉由使用柔性多肽連接子將VH和VL區連接在一起來產生ScFv分子。scFv分子包含具有優化的長度和/或胺基酸組成的連接子(例如，Ser-Gly連接子)。連接子長度可以極大地影響scFv的可變區折疊和相互作用的方式。事實上，如果採用短多肽連接子(例如，在5-10個胺基酸之間)，則可以防止鏈內折疊。還需要鏈間折疊以將兩個可變區組合在一起以形成功能性表位結合位點。對於連接子方向和大小的實例，參見例如，Hollinger等人1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]90：6444-6448，美國專利申請公開案號2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公開案號WO2006/020258和WO2007/024715(將其藉由引用併入本文)。

scFv可以在其VL與VH區之間包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多個胺基酸殘基的連接子。連接子序列可以包含任何天然存在的胺基酸。在一些實施方式中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸和絲胺酸。在一些實施方式中，連接子序列包含多組甘胺酸和絲胺酸重複序列，如(Gly₄Ser)n，其中n係等於或大於1的正整數(SEQ ID NO：25)。在一些實施方式中，連接子可以是(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO：27)或(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO：28)。連接子長度的變化可以保留或增強活性，從而在活性研究中產生優異的功效。

CD20 CAR

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞係表現CD20 CAR的細胞(例如，表現與人CD20結合的CAR的細胞)。在一些實施方式中，表現CD20 CAR的細胞包括根據WO 2016164731和WO 2018067992(將其內容藉由引用併入本文)所述之抗原結合結構域。示例性CD20結合序列或CD20 CAR序列揭露於例如WO 2018067992的表1-5中。在一些實施方式中，CD20 CAR包含WO 2018067992或WO 2016164731中揭露的CD20 CAR的CDR、可變區、scFv或全長序列。

CD22 CAR

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞係表現CD22 CAR的細胞(例如，表現與人CD22結合的CAR的細胞)。在一些實施方式中，表現CD22 CAR的細胞包括根據WO 2016164731和WO 2018067992(將其內容藉由引用併入本文)所述之抗原結合結構域。示例性CD22結合序列或CD22 CAR序列揭露於例如WO 2016164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A、和10B以及WO 2018067992的表6-10中。在一些實施方式中，CD22 CAR序列包含WO 2018067992或WO 2016164731中揭露的CD22 CAR的CDR、可變區、scFv或全長序列。

在實施方式中，該CAR分子包含結合CD22的抗原結合結構域(CD22 CAR)。在一些實施方式中，該抗原結合結構域靶向人CD22。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包括如本文所述之單鏈Fv序列。

人CD22 CAR的序列在下文提供。在一些實施方式中，人CD22 CAR係CAR22-65。

人CD22 CAR scFv序列

(SEQ ID NO：285)

人CD22 CAR重鏈可變區

(SEQ ID NO 286)

人CD22 CAR輕鏈可變區

QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNIRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO 287)

[表16]CD22 CAR的重鏈可變區CDR(CAR22-65)

[表17]CD22 CAR的輕鏈可變區CDR(CAR22-65)。該表中的LC CDR序列在卡巴特或組合定義下具有相同的序列。

在一些實施方式中，抗原結合結構域包含表16中列出的任何重鏈結合結構域胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在實施方式中，抗原結合結構域進一步包含LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3。在實施方式中，抗原結合結構域包含表17中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3胺基酸序列。

在一些實施方式中，抗原結合結構域包含表17中列出的任何輕鏈結合結構域胺基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一個、兩個或全部，以及表16中列出的任何重鏈結合結構域胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一個、兩個或全部。

在一些實施方式中，根據卡巴特編號方案、喬西亞編號方案、或其組合定義CDR。

VL和VH結構域在scFv中出現的順序可以是變化的(即，VL-VH或VH-VL方向)，並且其中「G4S」亞基(SEQ ID NO：25)(其中每個亞基包含序列GGGGS(SEQ ID NO：25)(例如，(G4S)₃(SEQ ID NO：28)或(G4S)₄)(SEQ ID NO：27))的一個、兩個、三個或四個中任一種的拷貝可連接可變結構域以創建整個scFv結構域。可替代地，CAR構建體可以包含例如包含序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：43)的連接子。可替代地，CAR構建體可以包含例如包含序列LAEAAAK(SEQ ID NO：308)的連接子。在一些實施方式中，CAR構建體不包括VL和VH結構域之間的連接子。

該等殖株均含有源自CD3ζ鏈的共刺激結構域的訊號結構域中的Q/K殘基變化。

EGFR CAR

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞係表現EGFR CAR的細胞(例如，表現與人EGFR結合的CAR的細胞)。在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞係表現EGFRvIII CAR的細胞(例如，表現與人EGFRvIII結合的CAR的細胞)。示例性EGFRvIII CAR可包括WO 2014/130657中揭露的序列，例如WO 2014/130657的表2，其藉由引用併入本文。

示例性EGFRvIII結合序列或EGFR CAR序列可包含WO 2014/130657中揭露的EGFR CAR的CDR、可變區、scFv或全長CAR序列。

間皮素CAR

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞係表現間皮素CAR的細胞(例如，表現與人間皮素結合的CAR的細胞)。示例性間皮素CAR可包括WO 2015090230和WO 2017112741中揭露的序列，例如WO 2017112741的表2、3、4和5，其藉由引用併入本文。

其他示例性CAR

在其他實施方式中，表現CAR的細胞可以特異性結合CD123，例如可以包括根據藉由引用併入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任一個)或抗原結合結構域。編碼CD123 CAR分子和抗原結合結構域(例如，包括根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)的胺基酸序列和核苷酸序列在WO 2014/130635中指定。在其他實施方式中，表現CAR的細胞可以特異性結合CD123，例如可以包括根據藉由引用併入本文的WO 2016/028896的表2、表6、和表9的CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任一個)或抗原結合結構域。編碼CD123 CAR分子和抗原結合結構域(例如，包括根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)的胺基酸序列和核苷酸序列在WO 2016/028896中指定。

在一些實施方式中，CAR分子包含本文描述的CLL1 CAR，例如描述於藉由引用併入本文的US 2016/0051651A1中的CLL1 CAR。在實施方式中，CLL1 CAR包含胺基酸，或具有藉由引用併入本文的US 2016/0051651 A1中所示的核苷酸序列。在其他實施方式中，表現CAR的細胞可以特異性結合CLL-1，例如可以包括根據藉由引用併入本文的WO 2016/014535的表2的CAR分子或抗原結合結構域。編碼CLL-1 CAR分子和抗原結合結構域(例如，包括根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)的胺基酸序列和核苷酸序列在WO 2016/014535中指定。

在一些實施方式中，該CAR分子包含本文所述之CD33 CAR，例如描述於藉由引用併入本文的US 2016/0096892 A1中的CD33 CAR。在實施方式中，CD33 CAR包含胺基酸，或具有藉由引用併入本文的US 2016/0096892 A1中所示的核苷酸序列。在其他實施方式中，表現CAR的細胞可以特異性結合CD33，例如可以包括根據藉由引用併入本文的WO2016/014576的表2或表9的CAR分子(例如CAR33-1至CAR-33-9中的任一個)或抗原結合結構域。編碼CD33 CAR分子和抗原結合結構域(例如，包括根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)的胺基酸序列和核苷酸序列在WO 2016/014576中指定。

在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含一個、兩個、三個(例如全部三個)重鏈CDR，即HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該等重鏈CDR來自本文所述之抗體(例如描述於藉由引用併入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗體)，和/或一個、兩個、三個(例如全部三個)輕鏈CDR，即LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，該等輕鏈CDR來自本文所述之抗體(例如描述於藉由引用併入本文的WO2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗體)。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含上文列出的抗體的重鏈可變區和/或可變輕鏈區。

在實施方式中，抗原結合結構域係描述於藉由引用併入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗原結合結構域。

在實施方式中，抗原結合結構域靶向BCMA並且描述於US-2016-0046724-A1中。在實施方式中，抗原結合結構域靶向CD19並且描述於US-2015-0283178-A1中。在實施方式中，抗原結合結構域靶向CD123並且描述於US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1中。在實施方式中，抗原結合結構域靶向CLL1並且描述於US 2016/0051651 A1中。在實施方式中，抗原結合結構域靶向CD33並且描述於US 2016/0096892 A1中。

可以使用表現CAR的細胞靶向的示例性靶抗原包括但不限於CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、間皮素、BCMA、和GFR α-4等，如例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO 2016/014535、和WO 2016/025880中所述，該等文獻各自藉由引用以其全文併入本文。

在其他實施方式中，表現CAR的細胞可以特異性結合GFR ALPHA-4，例如可以包括根據藉由引用併入本文的WO 2016/025880的表2的CAR分子或抗原結合結構域。編碼GFR ALPHA-4 CAR分子和抗原結合結構域(例如，包括根據卡巴特或喬西亞的一個、兩個、三個VH CDR；和一個、兩個、三個VL CDR)的胺基酸序列和核苷酸序列在WO 2016/025880中指定。

在一些實施方式中，本文所述之任何CAR分子(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、間皮素、BCMA、和GFR α-4中的任一個)的抗原結合結構域包含來自上文列出的抗體的一個、兩個、三個(例如全部三個)重鏈CDR，即HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或來自上文列出的抗原結合結構域的一個、兩個、三個(例如全部三個)輕鏈CDR，即LC CDR1、LC CDR2 和LC CDR3。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含上文列出或描述的抗體的重鏈可變區和/或可變輕鏈區。

在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含來自上文列出的抗體的一個、兩個、三個(例如全部三個)重鏈CDR，即HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或來自上文列出的抗體的一個、兩個、三個(例如全部三個)輕鏈CDR，即LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含上文列出或描述的抗體的重鏈可變區和/或可變輕鏈區。

在一些實施方式中，腫瘤抗原係2015年3月13日提交的國際申請WO2015/142675中描述的腫瘤抗原，該國際申請藉由引用以其全文併入本文。在一些實施方式中，該腫瘤抗原選自以下中的一種或多種：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也稱為CD2亞群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素樣分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)；神經節苷脂G2(GD2)；神經節苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受體家族成員B細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3(FLT3)；腫瘤相關糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受體亞基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；間皮素；白介素11受體α(IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板來源的生長因子受體β(PDGFR-β)；階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；葉酸受體α；受體酪胺酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，細胞表面相關的(MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突變的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纖維細胞活化蛋白α(FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶體(Prosome，Macropain)亞基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由斷裂點簇集區(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)組成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪胺酸酶；肝配蛋白A型受體2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis黏附分子(sLe)；神經節苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；轉麩醯胺酸酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相關抗原(HMWMAA)；鄰乙醯基-GD2神經節苷脂(OAcGD2)；葉酸受體β；腫瘤內皮標誌物1(TEM1/CD248)；腫瘤內皮標誌物7相關的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲狀腺激素受體(TSHR)；G蛋白偶聯受體C類5組，成員D(GPRC5D)；染色體X可讀框61(CXORF61)；CD97；CD179a；間變性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1(PLAC1)；globoH糖基神經醯胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒細胞受體1(HAVCR1)；腎上腺素受體β 3(ADRB3)；泛連接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶聯受體20(GPR20)；淋巴細胞抗原6複合物，基因座K 9(LY6K)；嗅覺受體51E2(OR51E2)；TCR γ替代性閱讀框蛋白(TARP)；腎母細胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相關抗原1(MAGE-A1)；ETS易位變異基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成員1A(XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相關的抗原1；腫瘤蛋白p53(p53)；p53突變體；前列腺特異性蛋白；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)、T細胞1識別的黑素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位中斷點；黑素瘤細胞凋亡抑制劑(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、絲胺酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙醯葡糖胺基轉移酶V(NA17)；配對盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受體；週期蛋白B1；v-myc禽類骨髓細胞瘤病毒致癌基因神經母細胞瘤來源的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成員C(RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2(TRP-2)；細胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-結合因子(鋅指蛋白)樣(BORIS或印記位點調節因子樣蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites))，T細胞3識別的鱗狀細胞癌抗原(SART3)；配對盒蛋白Pax-5(PAX5)；前頂體蛋白結合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；激酶錨蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X中斷點2(SSX2)；晚期糖基化終產物受體(RAGE-1)；腎遍在蛋白1(RU1)；腎遍在蛋白2(RU2)；Legumain；人乳頭狀瘤病毒E6(HPV E6)；人乳頭狀瘤病毒E7(HPV E7)；腸羧酸酯酶；突變的熱休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球相關的免疫球蛋白樣受體1(LAIR1)；IgA受體的Fc片段(FCAR或CD89)；白血球免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2(LILRA2)；CD300分子樣家族成員f(CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A(CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2(BST2)；含EGF樣模組的黏蛋白樣激素受體樣2(EMR2)；淋巴細胞抗原75(LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受體樣5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ樣多肽1(IGLL1)。

在一些實施方式中，抗腫瘤抗原結合結構域係片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一些實施方式中，如本文所述之抗癌症相關抗原結合結構域係Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如，雙特異性)雜合抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.[歐洲免疫學雜誌]17,105(1987))。在一些實施方式中，本發明的抗體及其片段以野生型或增強的親和力結合如本文描述的癌症相關抗原蛋白。

在一些情況下，可以根據本領域已知之方法製備scFv(參見例如，Bird等人，(1988)Science[科學]242：423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]85：5879-5883)。可以藉由使用柔性多肽連接子將VH和VL區連接在一起來產生ScFv分子。scFv分子包含具有優化的長度和/或胺基酸組成的連接子(例如，Ser-Gly連接子)。連接子長度可以極大地影響scFv的可變區折疊和相互作用的方式。事實上，如果採用短多肽連接子(例如，在5-10個胺基酸之間)，則可以防止鏈內折疊。還需要鏈間折疊以將兩個可變區組合在一起以形成功能性表位結合位點。對於連接子方向和大小的實例，參見例如，Hollinger等人1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]90：6444-6448，美國專利申請公開案號2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公開案號WO 2006/020258和WO 2007/024715(將其藉由引用併入本文)。

在一些實施方式中，抗原結合結構域係T細胞受體(「TCR」)或其片段，例如單鏈TCR(scTCR)。用於製備此類TCR之方法係本領域中已知的。參見例如Willemsen RA等人，Gene Therapy[基因療法]7：1369-1377(2000)；Zhang T等人，Cancer Gene Ther[癌症基因療法]11：487-496(2004)；Aggen等人，Gene Ther.[基因療法]19(4)：365-74(2012)(將參考文獻以其全文併入本文)。例如，scTCR可以被工程化為含有來自藉由連接子(例如柔性肽)連接的T細胞殖株的Vα和Vβ基因。此途徑對於本身在細胞內的與癌症相關的靶標非常有用，然而，這種抗原(肽)的片段藉由MHC呈遞在癌細胞的表面上。

跨膜結構域

關於跨膜結構域，在各種實施方式中，CAR可以設計為包含附接至CAR的細胞外結構域的跨膜結構域。跨膜結構域可以包括與跨膜區相鄰的一個或多個另外的胺基酸，例如與衍生跨膜的蛋白質細胞外區域相關的一個或多個胺基酸(例如該細胞外區域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15個胺基酸)和/或與衍生跨膜蛋白的蛋白質細胞內區域相關的一個或多個另外的胺基酸(例如該細胞內區域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15個胺基酸)。在一些實施方式中，該跨膜結構域係與所用的CAR的其他結構域之一相關的跨膜結構域。在一些情況下，可以選擇或藉由胺基酸取代修飾跨膜結構域，以避免此類結構域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結構域結合，例如以最小化與受體複合物的其他成員的相互作用。在一些實施方式中，該跨膜結構域能夠與表現CAR的細胞(例如，CART細胞)表面上的另一種CAR同源二聚化。在一些實施方式中，跨膜結構域的胺基酸序列可以被修飾或取代，以使與相同的表現 CAR的細胞(例如，CART)中存在的天然結合配偶體的結合結構域的相互作用最小化。

跨膜結構域可以源自天然來源或來自重組來源。在來源係天然的情況下，該結構域可以源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一些實施方式中，每當CAR結合靶標時，跨膜結構域能夠將傳訊至一個或多個細胞內結構域。在本發明中特別使用的跨膜結構域可以包括至少以下一個或多個跨膜區：例如T細胞受體的α、β或ζ鏈，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8(例如，CD8α，CD8β)，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。在一些實施方式中，跨膜結構域可以至少包括共刺激分子的一個或多個跨膜區，該共刺激分子為例如MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK細胞受體、BTLA、Toll配位基受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和與CD83特異性結合的配位基。

在一些情況下，跨膜結構域可以藉由鉸鏈(例如來自人蛋白質的鉸鏈)附接到CAR的細胞外區域(例如CAR的抗原結合結構域)。例如，在一些實施方式中，鉸鏈可以是人Ig(免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈)或CD8a鉸鏈。在一些實施方式中，鉸鏈或間隔子包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列(例如由其組成)。在一些實施方式中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的跨膜結構域(例如由其組成)。

在一些實施方式中，鉸鏈或間隔子包含IgG4鉸鏈。例如，在一些實施方式中，鉸鏈或間隔區包含SEQ ID NO：3的鉸鏈。在一些實施方式中，鉸鏈或間隔區包含由SEQ ID NO：14的核苷酸序列編碼的鉸鏈。

在一些實施方式中，鉸鏈或間隔子包含IgD鉸鏈。例如，在一些實施方式中，鉸鏈或間隔區包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列的鉸鏈。在一些實施方式中，鉸鏈或間隔區包含由SEQ ID NO：15的核苷酸序列編碼的鉸鏈。

在一些實施方式中，跨膜結構域可以是重組的，在這種情況下其將主要包含疏水性殘基，如白胺酸和纈胺酸。在一些實施方式中，可以在重組跨膜結構域的每個末端處發現苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。

視需要，長度在2與10個胺基酸之間的短的寡肽或多肽連接子可以在CAR的跨膜結構域與胞質區域之間形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸雙聯體提供特別適合的連接子。例如，在一些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。在一些實施方式中，連接子由SEQ ID NO：16的核苷酸序列編碼。

在一些實施方式中，鉸鏈或間隔子包含KIR2DS2鉸鏈。

胞質結構域

本發明的CAR的胞質結構域或區包括細胞內傳訊結構域。細胞內傳訊結構域通常負責活化已引入CAR的免疫細胞的至少一種正常效應子功能。

用於在本發明的CAR中使用的細胞內傳訊結構域的實例包括T細胞受體(TCR)和共受體的胞質序列(它們協同作用以在抗原受體接合後激活訊息傳遞)以及該等序列的任何衍生物或變體和任何具有相同功能性能力的重組序列。

已知僅藉由TCR產生的訊號不足以完全活化T細胞，並且還需要次級和/或共刺激訊號。因此，可認為T細胞活化係由兩種不同類別的胞質傳訊序列介導：藉由TCR啟動抗原依賴性初級活化的那些(初級細胞內傳訊結構域)和以抗原非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激訊號的那些(次級胞質結構域，例如共刺激結構域)。

初級傳訊結構域以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物的初級活化。以刺激方式起作用的初級細胞內傳訊結構域可以含有被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM的傳訊模體。

在本發明中特別有用的含有ITAM的初級胞質傳訊序列的實例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也稱為「ICOS」)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在一些實施方式中，本發明的CAR包含細胞內傳訊結構域，例如CD3-ζ的初級傳訊結構域。

在一些實施方式中，初級傳訊結構域包含修飾的ITAM結構域，例如與天然ITAM結構域相比具有改變的(例如，增加或減少的)活性的突變ITAM結構域。在一些實施方式中，初級傳訊結構域包含含有修飾的ITAM的初級細胞內傳訊結構域，例如含有優化的和/或截短的ITAM的初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，初級傳訊結構域包含一個、兩個、三個、四個或更多個ITAM模體。

在本發明中特別有用的含有初級細胞內傳訊結構域的分子的另外實例包括DAP10、DAP12、和CD32的那些。

CAR的細胞內傳訊結構域可以單獨包含初級傳訊結構域(例如，CD3-ζ傳訊結構域)，或者它可以與在本發明的CAR的上下文中有用的任何其他所希望的一種或多種細胞內傳訊結構域組合。例如，CAR的細胞內傳訊結構域可以包含初級傳訊結構域(例如，CD3ζ鏈部分)和共刺激傳訊結構域。共刺激傳訊結構域係指CAR的包含共刺激分子的細胞內結構域的部分。共刺激分子係除了抗原受體或其配位基之外的細胞表面分子，係淋巴細胞對抗原的有效應答所必需的。此類分子的實例包括MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK細胞受體、BTLA、Toll配位基受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和與CD83特異性結合的配位基等等。例如，已證明CD27共刺激可增強體外人CART細胞的擴增、效應子功能、和存活，並增加體內人T細胞持久性和抗腫瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3)：696-706)。本發明的CAR的胞質部分內的細胞內傳訊序列可以按隨機或指定的順序彼此連接。視需要，短的寡肽或多肽連接子，例如長度在2和10個胺基酸之間(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)，可以形成細胞內傳訊序列之間的連接。在一些實施方式中，甘胺酸-絲胺酸雙聯體可以用作適合的連接子。在一些實施方式中，單個胺基酸(例如丙胺酸、甘胺酸)可以用作適合的連接子。

在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域被設計成包含兩個或更多個(例如2、3、4、5、或更多個)共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，兩個或更多個(例如2、3、4、5、或更多個)共刺激傳訊結構域藉由連接子分子(例如本文描述的連接子分子)分開。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含兩個共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，連接子分子係甘胺酸殘基。在一些實施方式中，連接子係丙胺酸殘基。

在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域被設計成包含CD3-ζ的傳訊結構域和CD28的傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域被設計成包含CD3-ζ的傳訊結構域和4-1BB的傳訊結構域。在一些實施方式中，4-1BB的傳訊結構域係SEQ ID NO：7的傳訊結構域。在一些實施方式中，CD3-ζ的傳訊結構域係SEQ ID NO：9(突變型CD3ζ)或SEQ ID NO：10(野生型人CD3ζ)的傳訊結構域。

在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域被設計成包含CD3-ζ的傳訊結構域和CD27的傳訊結構域。在一些實施方式中，CD27的傳訊結構域包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列。在一些實施方式中，CD27的傳訊結構域由SEQ ID NO：19的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，細胞內被設計為包括CD3-ζ的傳訊結構域和CD28的傳訊結構域。在一些實施方式中，CD28的傳訊結構域包含SEQ ID NO： 36的胺基酸序列。在一些實施方式中，CD28的傳訊結構域由SEQ ID NO：37的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，細胞內被設計為包括CD3-ζ的傳訊結構域和ICOS的傳訊結構域。在一些實施方式中，ICOS的傳訊結構域包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列。在一些實施方式中，ICOS的傳訊結構域由SEQ ID NO：39的核酸序列編碼。

CAR組態

雙CAR

在一個實施方式中，免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)表現兩種CAR，例如與第一抗原結合的第一CAR和與第二抗原結合的第二CAR。在一個實施方式中，該第一抗原和該第二抗原係不同的。在一個實施方式中，該第一或第二抗原選自在B細胞上表現的抗原、在急性髓性白血病細胞上表現的抗原或在實性瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，該第一或第二抗原選自CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、CD79a、CD34、CLL-1、葉酸受體β、FLT3、EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、 NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。

在一個實施方式中，該第一抗原係CD19。在一個實施方式中，該第二抗原不是CD19。在一個實施方式中，該第二抗原係本文揭露的、不是CD19的抗原。

在一個實施方式中，該第一抗原係BCMA。在一個實施方式中，該第二抗原不是BCMA。在一個實施方式中，該第二抗原係本文揭露的、不是BCMA的抗原。在一個實施方式中，該第二抗原選自在B細胞上表現的抗原、在急性髓性白血病細胞上表現的抗原或在實性瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，該第二抗原選自CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、CD79a、CD34、CLL-1、葉酸受體β、FLT3、EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。在一個實施方式中，該第一抗原係BCMA，並且該第二抗原係CD19。

在一個實施方式中，該第一CAR由第一核酸序列編碼。在一個實施方式中，該第二CAR由第二核酸序列編碼。在一個實施方式中，該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上。在一個實施方式中，該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上。在一個實施方式中，該一種或多種核酸分子係DNA或RNA分子。在實施方式中，該第一和第二核酸序列以相同的定向定位，例如，該第一和第二核酸序列以相同的方向進行轉錄。在實施方式中，該第一和第二核酸序列以不同的定向定位。在實施方式中，單個啟動子控制該第一和第二核酸序列的表現。在實施方式中，編碼蛋白酶切割位點(例如，T2A、P2A、E2A或F2A切割位點)的核酸位於該第一和第二核酸序列之間。在實施方式中，以如下方式放置蛋白酶切割位點，該方式使得細胞可以表現包含該第一CAR和該第二CAR的融合蛋白，並且該融合蛋白隨後藉由蛋白水解切割而加工成兩個肽。在一些實施方式中，該第一核酸序列在該第二核酸序列的上游，或該第二核酸序列在該第一核酸序列的上游。在實施方式中，第一啟動子控制該第一核酸序列的表現，並且第二啟動子控制該第二核酸序列的表現。在實施方式中，該核酸分子係質體。在實施方式中，該核酸分子包含病毒包裝元件。在實施方式中，該免疫細胞可以包含切割T2A、P2A、E2A或F2A切割位點的蛋白酶(例如，內源或外源蛋白酶)。

在一個實施方式中，該第一CAR包含第一抗原結合結構域，並且該第二CAR包含第二抗原結合結構域。在一個實施方式中，該第一或第二抗原結合結構域包含本文揭露的CDR、VH、VL或scFv，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一個實施方式中，該第一或第二抗原結合結構域包含本文揭露的抗BCMA抗原結合結構域的CDR、VH、VL或scFv(例如表3-15、19、20、22和26中揭露的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。在一個實施方式中，該第一或第二抗原結合結構域包含本文揭露的抗CD19抗原結合結構域的CDR、VH、VL或scFv(例如表2、19和22中揭露的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。

在一個實施方式中，該第一抗原係BCMA，並且該第二抗原係CD19。在一個實施方式中，免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)表現抗BCMA CAR(例如本文所述之抗BCMA CAR)和抗CD19 CAR(例如本文所述之抗CD19 CAR)。在一個實施方式中，該免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)包含編碼抗BCMA CAR(例如本文所述之抗BCMA CAR)的第一核酸序列和編碼抗CD19 CAR(例如本文所述之抗CD19 CAR)的第二核酸序列。表19顯示雙CAR構建體的示例性胺基酸序列和核酸序列。

[表19].示例性BCMA/CD19雙CAR構建體及其組分

[表22].雙CAR的示例性組分的胺基酸序列

在一些實施方式中，本文揭露了分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含編碼第一CAR多肽的第一核酸序列和編碼第二CAR多肽的第二核酸序列，其中該第一CAR多肽包含第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域(例如人抗BCMA結合結構域)，並且其中該第二CAR多肽包含第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，該第二抗原結合結構域係抗CD19結合結構域。在一些實施方式中，該第一CAR多肽包含VH和VL，該VH包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，並且該VL包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR多肽包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：239和242的胺基酸序列，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR多肽包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第一CAR多肽包含SEQ ID NO：230或228的胺基酸序列。在一些實施方式中，該第二CAR多肽包含在表19或表22中列出的抗CD19序列的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2、和/或LC CDR3(例如分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一些實施方式中，該第二CAR多肽包含在表19或表22中列出的抗CD19序列的VH和/或VL(例如分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的VH和VL)。在一些實施方式中，該第二CAR多肽包含在表19或表22中列出的抗CD19序列的scFv(例如包含SEQ ID NO： 211的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的scFv)。在一些實施方式中，該第二CAR多肽包含在表19或表22中列出的抗CD19序列的CAR多肽(例如包含SEQ ID NO：225或229的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的CAR多肽)。在一些實施方式中，該核酸分子包含SEQ ID NO：221或223的核酸序列。在一些實施方式中，在具有或不具有SEQ ID NO：1的訊息肽的情況下，該核酸分子編碼SEQ ID NO：220或222的胺基酸序列。

多特異性CAR

在一個實施方式中，本發明的CAR係多特異性CAR。在一個實施方式中，多特異性CAR係雙特異性CAR。在一個實施方式中，雙特異性CAR包含抗原結合結構域，該抗原結合結構域係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對不多於兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體分子的特徵在於具有對第一表位的結合特異性的第一免疫球蛋白可變結構域序列、和具有對第二表位的結合特異性的第二免疫球蛋白可變結構域序列。在一個實施方式中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白質(或多聚體蛋白質的亞基)上。在一個實施方式中，第一表位和第二表位重疊。在一個實施方式中，第一表位和第二表位不重疊。在一個實施方式中，第一表位和第二表位在不同的抗原(例如，不同的蛋白質(或多聚體蛋白質的不同亞基))上。在一個實施方式中，雙特異性抗體分子包含對第一表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列以及對第二表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列。在一個實施方式中，雙特異性抗體分子包含對第一表位具有結合特異性的半抗體和對第二表位具有結合特異性的半抗體。在一個實施方式中，雙特異性抗體分子包含對第一表位具有結合特異性的半抗體或其片段，以及對第二表位具有結合特異性的半抗體或其片段。在一個實施方式中，雙特異性抗體分子包含對第一表位具有結合特異性的scFv或其片段，以及對第二表位具有結合特異性的scFv或其片段。

在一些實施方式中，本發明的CAR包含抗原結合結構域，該抗原結合結構域係多特異性(例如，雙特異性或三特異性)抗體分子。用於產生雙特異性或異源二聚體抗體分子的方案在本領域中是已知的；該等方案包括但不限於：「杵臼結構(knob in a hole)」途徑，例如在US 5731168中所述；靜電導向Fc配對，如例如在WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中所述；股交換工程化結構域(SEED)異源二聚體形成，如例如在WO 07/110205中所述；Fab臂交換，如例如在WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；雙抗體軛合物，例如使用具有胺反應性基團和巰基反應性基團的異雙官能試劑，藉由抗體交聯以產生雙特異性結構，如例如在US 4433059中所述；藉由對兩條重鏈之間的二硫鍵進行還原和氧化的循環，藉由重組來自不同抗體的半抗體(重-輕鏈對或Fab)產生的雙特異性抗體決定簇，如例如在US 4444878中所述；三功能抗體，例如藉由巰基反應性基團交聯的三個Fab'片段，如例如在US 5273743中所述；生物合成結合蛋白，例如藉由C-末端尾較佳的是藉由二硫鍵或胺反應性化學交聯作用交聯的scFv對，如例如在US 5534254中所述；雙功能抗體，例如具有不同結合特異性的Fab片段，該等Fab片段藉由已經替代恒定結構域的白胺酸拉鍊(例如，c-fos和c-jun)二聚化，如例如在US 5582996中所述；雙特異性和寡特異性單價和寡價受體，例如兩個抗體(兩個Fab片段)的VH-CH1區，該等VH-CH1區藉由在一個抗體的CH1區與另一個抗體的VH區(典型地具有相關聯的輕鏈)之間的多肽間隔區連接，如例如在US 5591828中所述；雙特異性DNA-抗體軛合物，例如抗體或Fab片段藉由DNA的雙股段交聯，如例如在US 5635602中所述；雙特異性融合蛋白，例如含有兩個scFv(它們之間具有親水性螺旋肽連接子)和一個完全恒定區的表現構建體，如例如在US 5637481中所述；多價和多特異性結合蛋白，例如具有Ig重鏈可變區結合區的第一結構域和Ig輕鏈可變區結合區的第二結構域的多肽二聚體，通常稱為雙抗體(也涵蓋更高級結構，產生雙特異性、三特異性或四特異性分子)，如例如在US 5837242中所述；具有連接的VL和VH鏈(它們進一步用肽間隔區連接至抗體鉸鏈區和CH3區)的微型抗體構建體，其可以二聚化形成雙特異性/多價分子，如例如在US 5837821所述；用短肽連接子(例如5或10個胺基酸)連接的或在任一方向上完全沒有連接子連接的VH和VL結構域，該等VH和VL結構域可以形成二聚體以形成雙特異性雙抗體；三聚體和四聚體，如例如在US 5844094中所述；VH結構域(或家族成員中的VL結構域)的串，其藉由肽鍵與C-末端的可交聯基團連接，該等可交聯基團進一步與VL結構域相關聯以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；具有經肽連接子連接的VH和VL結構域二者的單鏈結合多肽藉由非共價或化學交聯組合成多價結構，以使用scFV或雙抗體類型形式形成例如同二價、異二價、三價和四價結構，如例如在US 5869620中所述。另外的示例性多特異性和雙特異性分子及其製備方法見於例如US 5910573、US 5932448、US 5959083、US 5989830、US 6005079、US 6239259、US 6294353、US 6333396、US 6476198、US 6511663、US 6670453、US 6743896、US 6809185、US 6833441、US 7129330、US 7183076、US 7521056、US 7527787、US 7534866、US 7612181、US 2002004587 A1、US 2002076406 A1、US 2002103345 A1、US 2003207346 A1、US2 003211078 A1、US 2004219643 A1、US 2004220388 A1、US 2004242847 A1、US 2005003403 A1、US 2005004352 A1、US 2005069552 A1、US 2005079170 A1、US 2005100543 A1、US 2005136049 A1、US 2005136051 A1、US2005163782A1、US 2005266425 A1、US 2006083747 A1、US 2006120960 A1、US 2006204493 A1、US 2006263367 A1、US 2007004909 A1、US 2007087381 A1、US 2007128150 A1、US 2007141049 A1、 US 2007154901 A1、US 2007274985 A1、US 2008050370 A1、US 2008069820 A1、US 2008152645 A1、US 2008171855 A1、US 2008241884 A1、US 2008254512 A1、US 2008260738 A1、US 2009130106 A1、US 2009148905 A1、US 2009155275 A1、US 2009162359 A1、US 2009162360 A1、US 2009175851 A1、US 2009175867 A1、US 2009232811 A1、US 2009234105 A1、US 2009263392 A1、US 2009274649 A1、EP 346087 A2、WO0006605A2、WO 02072635 A2、WO 04081051 A1、WO 06020258 A2、WO 2007044887 A2、WO 2007095338 A2、WO 2007137760 A2、WO 2008119353 A1、WO 2009021754 A2、WO 2009068630 A1、WO 9103493 A1、WO 9323537 A1、WO 9409131 A1、WO 9412625 A2、WO 9509917 A1、WO 9637621 A2、WO 9964460 A1中。上述申請的內容藉由引用以其全文併入本文。

在雙特異性抗體分子的每個抗體或抗體片段(例如scFv)內，VH可以在VL的上游或下游。在一些實施方式中，上游抗體或抗體片段(例如scFv)在其VL(VL₁)上游佈置有其VH(VH₁)，並且下游抗體或抗體片段(例如scFv)在其VH(VH₂)上游佈置有其VL(VL₂)，使得整個雙特異性抗體分子具有佈置VH₁-VL₁-VL₂-VH₂。在其他實施方式中，上游抗體或抗體片段(例如scFv)在其VH(VH₁)上游佈置有其VL(VL₁)，並且下游抗體或抗體片段(例如scFv)在其VL(VL₂)上游佈置有其VH(VH₂)，使得整個雙特異性抗體分子具有佈置VL₁-VH₁-VH₂-VL₂。視需要，如果構建體被佈置為VH₁-VL₁-VL₂-VH₂則連接子設置在兩個抗體或抗體片段(例如scFv)之間，例如VL₁與VL₂之間，如果構建體被佈置為VL₁-VH₁-VH₂-VL₂則連接子設置在VH₁與VH₂之間。連接子可以是如本文所述之連接子，例如(Gly₄-Ser)n連接子，其中n係1、2、3、4、5、或6，較佳的是4(SEQ ID NO：26)。一般來說，兩個scFv之間的連接子應足夠長以避免兩個scFv的結構域之間的錯配。視需要，連接子設置在第一scFv的VL與VH之間。視需要，連接子設置在第二scFv的VL 與VH之間。在具有多個連接子的構建體中，連接子中的任何兩個或更多個可以相同或不同。因此，在一些實施方式中，雙特異性CAR在如本文描述的佈置中包含VL、VH、和視需要一個或多個連接子。

在一個方面，該雙特異性抗體分子的特徵在於第一免疫球蛋白可變結構域序列(例如scFv)和第二免疫球蛋白可變結構域序列，該scFv對BCMA具有結合特異性，例如包含如本文所述之scFv，或包含來自本文所述之BCMA scFv的輕鏈CDR和/或重鏈CDR，並且該第二免疫球蛋白可變結構域序列對不同抗原上的第二表位具有結合特異性。在一個方面，該第二免疫球蛋白可變結構域序列對在AML細胞上表現的抗原(例如除BCMA之外的抗原)具有結合特異性。例如，第二免疫球蛋白可變結構域序列對CD123具有結合特異性。作為另一個實例，第二免疫球蛋白可變結構域序列對CLL-1具有結合特異性。作為另一個實例，第二免疫球蛋白可變結構域序列對CD34具有結合特異性。作為另一個實例，第二免疫球蛋白可變結構域序列對FLT3具有結合特異性。例如，第二免疫球蛋白可變結構域序列對葉酸受體β具有結合特異性。在一些方面，第二免疫球蛋白可變結構域序列對B細胞上表現的抗原(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)具有結合特異性。

雙抗體CAR

在一些實施方式中，本發明的CAR係雙特異性CAR。在一些實施方式中，本發明的CAR係雙抗體CAR。在一些實施方式中，該雙抗體CAR包含與第一抗原和第二抗原結合的抗原結合結構域。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含VH1、VL1、VH2和VL2，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2 -視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-連接子1(「L1」)-VH2-連接子2(「L2」)-VL2-連接子3(「L3」)-VL1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VL1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-L1-VH2-L2-VL2-L3-VH1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VH1。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-L1-VH1-L2-VL1-L3-VL2。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VL2。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-L1-VH1-L2-VI1-L3-VH2。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從 N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VH2。在一些實施方式中，該可變區藉由連接子融合，該連接子包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列。在一些實施方式中，該可變區藉由連接子融合，該連接子包含GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：63)的胺基酸序列。在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。在一些實施方式中，L2包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在一些實施方式中，L3包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。在一些實施方式中，該VH1、VL1、VH2或VL2包含本文揭露的CDR、VH或VL序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，本文揭露的雙抗體包含經工程化的二硫鍵，例如以穩定雙抗體和/或促進VH和VL的正確配對。在一些實施方式中，經工程化的二硫鍵在最靠近鉸鏈區的可變區(例如，最靠近該鉸鏈區的VH或VL區)與其對應的配對伴侶(例如，對應的VL或對應的VH)之間。

在一些實施方式中，該第一抗原和該第二抗原係不同的。在一些實施方式中，該第一或第二抗原選自在B細胞上表現的抗原、在急性髓性白血病細胞上表現的抗原或在實性瘤細胞上表現的抗原。在一些實施方式中，該第一或第二抗原選自CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、CD79a、CD34、CLL-1、葉酸受體β、FLT3、EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、 CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。

在一些實施方式中，該第一抗原係BCMA，並且該第二抗原係CD19。在一些實施方式中，該CAR包含與BCMA和CD19結合的抗原結合結構域。在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含與BCMA結合的VH₁和VL₁(「BCMA VH」和「BCMA VL」)以及與CD19結合的VH₂和VL₂(「CD19 VH」和「CD19 VL」)。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VH-視需要連接子1(「L1」)-CD19 VH-視需要連接子2(「L2」)-CD19 VL-視需要連接子3(「L3」)-BCMA VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VH-視需要L1-CD19 VL-視需要L2-CD19 VH-視需要L3-BCMA VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VL-視需要L1-CD19 VH-視需要L2-CD19 VL-視需要L3-BCMA VH。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VL-視需要L1-CD19 VL-視需要L2-CD19 VH-視需要L3-BCMA VH。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VH-視需要L1-BCMA VH-視需要L2-BCMA VL-視需要L3-CD19 VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VH-視需要L1-BCMA VL-視需要L2-BCMA VH-視需要L3-CD19 VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VL-視需要L1-BCMA VH-視需要L2-BCMA VL-視需要L3-CD19 VH。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VL -視需要L1-BCMA VL-視需要L2-BCMA VH-視需要L3-CD19 VH。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VH-連接子1(「L1」)-CD19 VH-連接子2(「L2」)-CD19 VL-連接子3(「L3」)-BCMA VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VH-L1-CD19 VL-L2-CD19 VH-L3-BCMA VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VL-L1-CD19 VH-L2-CD19 VL-L3-BCMA VH。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：BCMA VL-L1-CD19 VL-L2-CD19 VH-L3-BCMA VH。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VH-L1-BCMA VH-L2-BCMA VL-L3-CD19 VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VH-L1-BCMA VL-L2-BCMA VH-L3-CD19 VL。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VL-L1-BCMA VH-L2-BCMA VL-L3-CD19 VH。在一些實施方式中，該抗原結合結構域從N-末端至C-末端具有如下排列：CD19 VL-L1-BCMA VL-L2-BCMA VH-L3-CD19 VH。在一些實施方式中，該可變區藉由連接子融合，該連接子包含SEQ ID NO：5或63的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，L1包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。在一些實施方式中，L2包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在一些實施方式中，L3包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該BCMA VH包含本文揭露的CDR或VH序列，例如在表3-15、19、20、22、26和31中揭露的CDR或VH序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該BCMA VL包含本文揭露的CDR或VL序列，例如在表3-15、19、20、 22、26和31中揭露的CDR或VL序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CD19 VH包含本文揭露的CDR或VH序列，例如在表2、19、22和31中揭露的CDR或VH序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CD19 VL包含本文揭露的CDR或VL序列，例如在表2、19、22和31中揭露的CDR或VL序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該CAR(例如雙抗體CAR)進一步包含鉸鏈區、跨膜結構域和/或細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，該鉸鏈區包含CD8鉸鏈區。在一些實施方式中，該鉸鏈區包含本文揭露的鉸鏈區序列，例如SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該跨膜結構域包含CD8跨膜結構域。在一些實施方式中，該跨膜結構域包含本文揭露的跨膜結構域序列，例如SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含4-1BB細胞內結構域。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含本文揭露的共刺激傳訊結構域序列，例如SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含CD3細胞內結構域。在一些實施方式中，該細胞內傳訊結構域包含本文揭露的初級傳訊結構域序列，例如SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的胺基酸序列。

示例性雙抗體序列揭露在表31中。在一些實施方式中，該CAR包含抗原結合結構域，該抗原結合結構域包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成：SEQ ID NO：321-330，或與其具有至少80%、85%、90%、95% 或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該CAR包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成：SEQ ID NO：339-348，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

表31.雙抗體CAR的示例性組分。

*：VH序列加底線，並且VL序列加雙底線。將CD19結合序列(VH和VL)以斜體顯示。

嵌合TCR

在一個方面，本發明的抗體和抗體片段可以接枝到T細胞受體(「TCR」)鏈(例如，TCRα或TCRβ鏈)的一個或多個恒定結構域，以產生嵌合TCR。不受理論的束縛，據信嵌合TCR在抗原結合時將藉由TCR複合物發出訊號。例如，如本文所揭露的scFv可以接枝到TCR鏈(例如TCRα鏈和/或TCRβ鏈)的恒定結構域(例如，細胞外恒定結構域、跨膜結構域和胞質結構域的至少一部分)。作為另一個實例，抗體片段(例如，本文所述之VL結構域)可以接枝到TCRα鏈的恒定結構域，並且抗體片段(例如，本文所述之VH結構域)可以接枝到TCRβ鏈的恒定結構域(或可替代地，VL結構域可以接枝到TCRβ鏈的恒定結構域，VH結構域可以接枝到TCRα鏈)。作為另一個實例，抗體或抗體片段的CDR(例如如本文所述之抗體或抗體片段的CDR)可以接枝到TCRα和/或TCRβ鏈中，以產生嵌合TCR。例如，本文揭露的LCDR可以接枝到TCR α鏈的可變結構域中，並且本文揭露的HCDR可以接枝到TCR β鏈的可變結構域，或反之亦然。此類嵌合TCR可以藉由本領域已知之方法產生(例如，Willemsen RA等人，Gene Therapy[基因療法]2000；7：1369-1377；Zhang T等人，Cancer Gene Ther[癌症基因療法]2004；11：487-496；Aggen等人，Gene Ther.[基因療法]2012年4月；19(4)：365-74)。

其他實施方式

在一個方面，本文所述之表現CAR的細胞還可以包含第二CAR，例如包含不同抗原結合結構域的第二CAR，該抗原結合結構域例如針對相同的靶標(BCMA)或不同的靶標(例如，CD19、CD20，或CS-1，或其他多發性骨髓瘤靶標，例如κ輕鏈、CD138、Lewis Y抗原或CD38(Garfall等人， Discovery Medicine[發現醫學],2014,17(91)：37-46))。在一個實施方式中，表現CAR的細胞包含第一CAR和第二CAR，該第一CAR靶向第一抗原並且包含具有共刺激傳訊結構域但不具有初級傳訊結構域的細胞內傳訊結構域，該第二CAR靶向第二不同的抗原並且包含具有初級傳訊結構域但不具有共刺激傳訊結構域的細胞內傳訊結構域。雖然不希望受到理論的束縛，但是將共刺激傳訊結構域(例如，4-1BB、CD28、CD27、ICOS或OX-40)置於第一CAR上，將初級傳訊結構域(例如，CD3ζ)置於第二CAR上，可以將CAR活性限制在表現兩個靶標的細胞中。在一個實施方式中，表現CAR的細胞包含第一BCMA CAR(該第一BCMA CAR包括BCMA結合結構域、跨膜結構域和共刺激結構域)和第二CAR(該第二CAR靶向除BCMA之外的抗原(例如在白血病或淋巴瘤細胞上表現的抗原，例如CD19、CD20、CS-1、κ輕鏈、CD139、Lewis Y抗原或CD38)並且包括抗原結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域)。在另一個實施方式中，表現CAR的細胞包含第一BCMA CAR(該第一BCMA CAR包括BCMA結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域)和第二CAR(該第二CAR靶向除BCMA之外的抗原(例如在白血病或淋巴瘤細胞上表現的抗原，例如CD19、CD20、CS-1、κ輕鏈、CD139、Lewis Y抗原或CD38)並且包括針對抗原的抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激傳訊結構域)。在一個實施方式中，表現CAR的細胞包含本文所述之BCMA CAR和靶向CD19的CAR(CD19 CAR)。

在一個實施方式中，表現CAR的細胞包含本文所述之BCMA CAR和抑制性CAR。在一個實施方式中，抑制性CAR包含結合存在於正常細胞而非癌細胞上的抗原的抗原結合結構域。在一個實施方式中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。例如，抑制性CAR的細胞內結構域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷和TGFRβ的細胞內結構域。

在一個實施方式中，當表現CAR的細胞包含兩種或更多種不同的CAR時，不同CAR的抗原結合結構域可以使得抗原結合結構域不相互作用。例如，表現第一CAR和第二CAR的細胞可以具有第一CAR的抗原結合結構域(例如，作為片段，例如scFv)，該抗原結合結構域不與第二CAR的抗原結合結構域形成締合，例如第二CAR的抗原結合結構域係VHH。

在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含單結構域抗原結合(SDAB)分子，該單結構域抗原結合分子包括其互補決定區係單結構域多肽的一部分的分子。實例包括但不限於重鏈可變結構域、天然缺乏輕鏈的結合分子、源自常規4鏈抗體的單結構域、工程化結構域、和除抗體衍生的那些之外的單結構域支架。SDAB分子可以是任何先前技術的、或任何未來的單結構域分子。SDAB分子可以源自任何物種，包括但不限於小鼠、人、駱駝、美洲駝、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔和牛。該術語還包括來自除駱駝科和鯊魚外的物種的天然存在的單結構域抗體分子。

在一個方面，SDAB分子可以源自在魚中發現的免疫球蛋白的可變區，例如像源自在鯊魚血清中發現的稱為新穎抗原受體(NAR)的免疫球蛋白同種型的可變區。WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白質科學]14：2901-2909中描述了產生源自NAR可變區的單結構域分子(「IgNAR」)之方法。

根據另一個方面，SDAB分子係天然存在的單結構域抗原結合分子，稱為缺乏輕鏈的重鏈。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人 (1993)Nature[自然]363：446-448中揭露了此類單結構域分子。出於清楚的原因，源自天然缺乏輕鏈的重鏈分子的這種可變結構域在本文中稱為VHH或奈米抗體，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區分開。這種VHH分子可以源自駱駝科物種，例如駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和原駝。除駱駝科外的其他物種可產生天然缺乏輕鏈的重鏈分子；此類VHH在本發明的範圍內。

SDAB分子可以是重組的、CDR移植的、人源化的、駱駝化的、去免疫的和/或體外產生的(例如藉由噬菌體展示選擇的)。

還發現，具有多個嵌合膜嵌入受體(該等嵌合膜嵌入受體包含抗原結合結構域，受體的抗原結合結構域之間具有相互作用)的細胞可能是不希望的，例如，因為它抑制一個或多個抗原結合結構域結合其同源抗原的能力。因此，本文揭露了具有第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受體的細胞，該嵌合膜嵌入受體包含使這種相互作用最小化的抗原結合結構域。本文還揭露了編碼第一和第二非天然存在的嵌合膜包埋受體的核酸，該嵌合膜包埋受體包含使這種相互作用最小化的抗原結合結構域，以及製備和使用此類細胞和核酸之方法。在一個實施方式中，所述第一非天然存在的嵌合膜嵌入受體、所述第二非天然存在的嵌合膜包埋受體中的一者的抗原結合結構域包括scFv，而另一個包括單個VH結構域，例如駱駝科動物、鯊魚或七鰓鰻單個VH結構域或源自人或小鼠序列的單個VH結構域。

在一些實施方式中，要求保護的本發明包括第一CAR和第二CAR，其中所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域不包含可變輕結構域和可變重結構域。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域係scFv，而另一者不是scFv。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包含單個VH結構域，例如駱駝科、鯊魚、或七鰓鰻單個VH結構域，或源自人或小鼠序列的單個VH結構域。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包含奈米抗體。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包含駱駝科VHH結構域。

在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包括scFv，並且另一個包括單個VH結構域，例如駱駝科、鯊魚、或七鰓鰻單個VH結構域，或源自人或小鼠序列的單個VH結構域。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包括scFv，而另一者包括奈米抗體。在一些實施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原結合結構域包含scFv，而另一者包含駱駝科動物VHH結構域。

在一些實施方式中，當存在於細胞表面時，所述第一CAR的抗原結合結構域與其同源抗原的結合基本上不會因所述第二CAR的存在而降低。在一些實施方式中，在所述第二CAR存在下，所述第一CAR的抗原結合結構域與其同源抗原的結合係不存在所述第二CAR的情況下所述第一CAR的抗原結合結構域與其同源抗原的結合的85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

在一些實施方式中，當存在於細胞表面上時，所述第一CAR、所述第二CAR的抗原結合結構域彼此的締合小於兩者皆為scFv抗原結合結構域的情況下的締合。在一些實施方式中，所述第一CAR、所述第二CAR的抗原結合結構域彼此的締合比兩者皆為scFv抗原結合結構域的情況下的締合少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

在另一個方面，本文所述之表現CAR的細胞可以進一步表現另一種藥劑，例如增強表現CAR的細胞活性的藥劑。例如，在一個實施方式中，藥劑可以是對抑制性分子進行抑制的藥劑，例如本文所述之藥劑。在一些實施方式中，抑制性分子(例如，PD1)可降低表現CAR的細胞產生免疫效應子應答的能力。抑制性分子的實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷和TGFRβ。在一個實施方式中，對抑制性分子進行抑制的藥劑包含第一多肽(例如，抑制性分子)，該第一多肽與向細胞提供正訊號的第二多肽(例如本文所述之細胞內傳訊結構域)締合。在一個實施方式中，該藥劑包含例如抑制性分子的第一多肽和第二多肽，該抑制性分子如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷和TGFRβ或該等中的任一者的片段(例如，該等中的任一者的細胞外結構域的至少一部分)，該第二多肽係本文所述之細胞內傳訊結構域(例如，包括共刺激結構域(例如，41BB、CD27、ICOS或CD28，例如如本文所述)和/或初級傳訊結構域(例如，本文所述之CD3ζ傳訊結構域))。在一個實施方式中，該藥劑包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的細胞外結構域的至少一部分)和本文所述之細胞內傳訊結構域(例如，本文所述之CD28傳訊結構域和/或本文所述之CD3ζ傳訊結構域)的第二多肽。在實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞包含開關共刺激受體，例如，如WO 2013/019615(該專利藉由引用以其全文併入本文)中所述。PD1係受體的CD28家族的抑制性成員，該家族還包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B細胞、T細胞和髓系細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol[國際免疫學]8：765-75)。已經顯示PD1的兩種配位基PD-L1和PD-L2在與PD1結合後下調T細胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med[實驗醫學雜誌]192：1027-34；Latchman 等人2001 Nat Immunol[自然免疫學]2：261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol[歐洲免疫學雜誌]32：634-43)。PD-L1在人類癌症中是豐富的(Dong等人2003 J Mol Med[分子醫學雜誌]81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫學和免疫療法]54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res[臨床癌症研究]10：5094)。藉由抑制PD1與PD-L1的局部相互作用可以逆轉免疫抑制。

在一個實施方式中，該藥劑包含抑制性分子(例如，計劃性死亡1(PD1))的細胞外結構域(ECD)，可以與跨膜結構域和細胞內傳訊結構域(如41BB和CD3ζ)融合(在本文中也稱為PD1 CAR)。在一個實施方式中，PD1 CAR當與本文所述之BCMA CAR組合使用時，改善了表現CAR的細胞(例如，T細胞或NK細胞)的持久性。在一個實施方式中，該CAR係PD1 CAR，其包含PD1的細胞外結構域，如SEQ ID NO：24中加底線所指示的。在一個實施方式中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列。

在一個實施方式中，PD1 CAR包含下文提供的胺基酸序列(SEQ ID NO：22)。

在一個實施方式中，該藥劑包含編碼PD1 CAR(例如，本文所述之PD1 CAR)的核酸序列。在一個實施方式中，PD1 CAR的核酸序列提供為SEQ ID NO：23，PD1 ECD以底線標出。

在另一個方面，本發明提供表現CAR的細胞群體，例如CART細胞或表現CAR的NK細胞。在一些實施方式中，表現CAR的細胞群體包含表現不同CAR的細胞的混合物。例如，在一個實施方式中，表現CAR的細胞群體(例如，CART細胞或表現CAR的NK細胞)可以包括表現具有本文所述之抗BCMA結合結構域的CAR的第一細胞，和表現具有不同的抗BCMA結合結構域(例如，不同於第一細胞表現的CAR中的抗BCMA結合結構域的本文所述之抗BCMA結合結構域)的CAR的第二細胞。作為另一個實例，表現CAR的細胞群體可以包括表現包含例如如本文所述之抗BCMA結合結構域的CAR的第一細胞，和表現包含針對除BCMA之外的靶標(例如，CD19、CD20、CS-1、κ輕鏈、CD139、Lewis Y抗原或CD38)的抗原結合結構域的CAR的第二細胞。在一個實施方式中，表現CAR的細胞群體包括表現包含例如如本文所述之抗BCMA結合結構域的CAR的第一細胞，和表現包含靶向CD19的抗原結合結構域的CAR(CD19 CAR)的第二細胞。在一個實施方式中，表現CAR的細胞群體包括，例如表現包含初級細胞內傳訊結構域的CAR的第一細胞，和表現包含次級傳訊結構域的CAR的第二細胞。

在另一個方面，本發明提供這樣的細胞群體：其中該群體中的至少一種細胞表現具有本文所述之抗BCMA結構域的CAR，並且第二細胞表現另一種藥劑，例如增強表現CAR的細胞的活性的藥劑。例如，在一個實施方式中，藥劑可以是對抑制性分子進行抑制的藥劑。在一些實施方式中，抑制性分子例如可降低表現CAR的細胞產生免疫效應子反應的能力。抑制性分子的實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷和TGFRβ。在一個實施方式中，對抑制性分子進行抑制的藥劑包含第一多肽(例如，抑制性分子)，該第一多肽與向細胞提供正訊號的第二多肽(例如本文所述之細胞內傳訊結構域)締合。在一個實施方式中，該藥劑包括例如抑制性分子的第一多肽和第二多肽，該抑制性分子如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷和TGFRβ或該等中的任一者的片段(例如，該等中的任一者的細胞外結構域的至少一部分)，該第二多肽係本文所述之細胞內傳訊結構域(例如，包括共刺激結構域(例如，41BB、CD27、ICOS或CD28，例如如本文所述)和/或初級傳訊結構域(例如，本文所述之CD3ζ傳訊結構域))。在一個實施方式中，該藥劑包含PD1或其片段(例如PD1的細胞外結構域的至少一部分)的第一多肽，和本文描述的細胞內傳訊結構域(例如本文描述的CD28傳訊結構域和/或本文描述的CD3ζ傳訊結構域)的第二多肽。

在一個方面，本發明提供這樣之方法：該方法包括投與表現CAR的細胞群體(例如，CART細胞或表現CAR的NK細胞)，例如表現不同CAR的細胞與另一種藥劑(例如，激酶抑制劑，如本文所述之激酶抑制劑)組合的混合物。在另一個方面，本發明提供包括投與細胞群體與另一種藥劑(例如，激酶抑制劑，如本文所述之激酶抑制劑)的組合之方法，其中該群體中的至少一種細胞表現具有如本文所述之抗癌相關抗原結合結構域的CAR，並且第二細胞表現另一種藥劑(例如，增強表現CAR的細胞活性的藥劑)。

自然殺傷細胞受體(NKR)CAR

在一個實施方式中，本文所述之CAR分子包含天然殺傷細胞受體(NKR)的一種或多種組分，從而形成NKR-CAR。NKR組分可以是來自任一以下自然殺傷細胞受體的跨膜結構域、鉸鏈結構域或胞質結構域：殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然細胞毒性受體(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫細胞受體的傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受體(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受體，例如LY49A、LY49C。本文所述之NKR-CAR分子可以與銜接分子或細胞內傳訊結構域(例如DAP12)相互作用。包含NKR組分的CAR分子的示例性組態和序列描述於國際公開案號WO2014/145252中，該專利的內容藉由引用特此併入。

非抗體支架

在實施方式中，抗原結合結構域包含非抗體支架，例如，纖網蛋白、錨蛋白、結構域抗體、脂質運載蛋白、小模組免疫藥物、大抗體(maxybody)、蛋白A或affilin。非抗體支架具有與細胞上的靶抗原結合的能力。在實施方式中，抗原結合結構域係在細胞上表現的天然存在的蛋白質的多肽或其片段。在一些實施方式中，抗原結合結構域包含非抗體支架。可以使用多種非抗體支架，只要所得多肽包含至少一個特異性結合靶細胞上的靶抗原的結合區即可。

非抗體支架包括：纖網蛋白(諾華公司(Novartis)，麻塞諸塞州)、錨蛋白(分子配偶體公司(Molecular Partners AG，蘇黎世，瑞士)、結構域抗體(Domantis公司(Domantis,Ltd.)，坎布裡奇，麻塞諸塞州，和Ablynx nv，津維納拉德，比利時)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG，弗賴辛，德國)、小模組免疫藥物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，西雅圖，華盛頓州)、maxybody(Avidia,Inc.，山景城，加利福尼亞州)、蛋白質A(親合體公司(Affibody AG)，瑞典)和affilin(γ-晶體蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，哈雷，德國)。

調節嵌合抗原受體的策略

可以藉由多種方式調節CAR活性。在一些實施方式中，希望CAR活性可控制的可調節CAR(RCAR)以優化CAR療法的安全性和功效。例如，使用例如與二聚化結構域融合的半胱天冬酶誘導細胞凋亡(參見例如Di等人，N Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]2011年11月3日；365(18)：1673-1683)可用作本發明CAR療法中的安全性開關。在另一個實例中，表現CAR的細胞還可以表現誘導型半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，其在投與二聚物藥物(例如利米度塞(rimiducid)(也稱為AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))時導致激活細胞的半胱天冬酶-9和細胞凋亡。誘導型半胱天冬酶-9分子含有二聚化化學誘導物(CID)結合結構域，其在CID的存在下介導二聚化。這導致表現CAR的細胞的誘導性和選擇性耗減。在一些情況下，誘導型半胱天冬酶-9分子由與一種或多種CAR編碼載體分開的核酸分子編碼。在一些情況下，誘導型半胱天冬酶-9分子由與CAR編碼載體相同的核酸分子編碼。誘導型半胱天冬酶-9可以提供安全性開關，以避免表現CAR的細胞的任何毒性。參見例如，Song等人Cancer Gene Ther.[癌症基因療法]2008；15(10)：667-75；臨床試驗標識號NCT02107963；和Di Stasi等人N.Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]2011；365：1673-83。

用於調節本發明的CAR療法的可替代策略包括利用使CAR活性失活或關閉的小分子或抗體，例如藉由使表現CAR的細胞缺失，例如藉由誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。例如，本文所述之表現CAR的細胞還可以表現被能夠誘導細胞死亡的分子(例如ADCC或補體誘導的細胞死亡)識別的抗原。例如，本文所述之表現CAR的細胞還可以表現能夠被抗體或抗體片段靶向的受體。此類受體的實例包括EpCAM、VEGFR、整聯蛋白(例如整聯蛋白αvβ3、α4、αI¾β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族成員(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、 CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一個或多個細胞外表位但缺少在胞質結構域內的一個或多個區的形式)。例如，本文所述之表現CAR的細胞還可以表現截短的表皮生長因子受體(EGFR)，該截短的表皮生長因子受體缺乏傳訊能力但保留了被能夠誘導ADCC的分子(例如西妥昔單抗(cetuximab，ERBITUX®))識別的表位，以使得西妥昔單抗的投與誘導ADCC並且隨後耗減表現CAR的細胞(參見例如，WO 2011/056894，和Jonnalagadda等人，Gene Ther.[基因療法]2013；20(8)：853-860)。另一種策略包括表現高度緊密的標記/自殺基因，其將來自本文所述之表現CAR的細胞中的CD32和CD20抗原的靶表位組合，其結合利妥昔單抗(rituximab)，這導致表現CAR的細胞的選擇性消耗，例如藉由ADCC(參見例如，Philip等人，Blood.[血液]2014；124(8)：1277-1287)。用於耗減本文所述之表現CAR的細胞的其他方法包括投與CAMPATH®(選擇性結合和靶向成熟淋巴細胞(例如，表現CAR的細胞)的單株抗CD52抗體)以便例如藉由誘導ADCC進行破壞。在其他實施方式中，可以使用CAR配位基(例如，抗獨特型抗體)來選擇性靶向表現CAR的細胞。在一些實施方式中，抗獨特型抗體可以引起效應細胞活性，例如，ADCC或ADC活性，從而減少表現CAR的細胞的數量。在其他實施方式中，CAR配位基(例如抗獨特型抗體)可以與誘導細胞殺傷的藥劑(例如毒素)偶聯，從而減少表現CAR的細胞的數量。可替代地，CAR分子本身可以被配置成使得活性可以被調節，例如打開和關閉，如下所述。

在一些實施方式中，RCAR包含一組多肽，在最簡單的實施方式中通常為兩個，其中本文所述之標準CAR的組分，例如抗原結合結構域和細胞內傳訊結構域，被分配在分開的多肽或成員上。在一些實施方式中，該組多肽包括二聚化開關，該二聚化開關在存在二聚化分子時可以將多肽彼此偶聯，例如，可以將抗原結合結構域偶聯至細胞內傳訊結構域。本文和國際公開案號WO 2015/090229中提供了此類可調節性CAR的另外的描述和示例性組態，將該文獻藉由引用以其全文特此併入。

在一個實施方式中，RCAR包含兩個多肽或成員：1)細胞內傳訊成員，該細胞內傳訊成員包含細胞內傳訊結構域(例如，本文所述之初級細胞內傳訊結構域)和第一開關結構域；2)抗原結合成員，該抗原結合成員包含例如如本文所述靶向本文所述之腫瘤抗原的抗原結合結構域和第二開關結構域。視需要，該RCAR包含本文所述之跨膜結構域。在一個實施方式中，跨膜結構域可以佈置在細胞內傳訊成員上、抗原結合成員上、或兩者上。除非另有說明，否則當本文描述RCAR的成員或元件時，順序可以如所提供的那樣，但也包括其他順序。換句話說，在一個實施方式中，順序如文中所述，但在其他實施方式中，順序可以不同。例如，跨膜區一側上的元件的順序可以與實例不同，例如，開關結構域相對於細胞內傳訊結構域的放置可以是不同的，例如，相反的。

在一個實施方式中，第一開關結構域和第二開關結構域可以形成細胞內或細胞外二聚化開關。在一個實施方式中，二聚化開關可以是同源二聚化開關，例如，其中第一開關結構域和第二開關結構域係相同的，或異源二聚化開關，例如，其中第一開關結構域和第二開關結構域彼此不同。

在實施方式中，RCAR可以包含「多開關」。多開關可以包括異源二聚化開關結構域或同源二聚化開關結構域。多開關在第一成員(例如，抗原結合成員)和第二成員(例如，細胞內傳訊成員)上獨立地包括多個(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10個)開關結構域。在一個實施方式中，第一成員可以包含多個第一開關結構域(例如，基於FKBP的開關結構域)，並且第二成員可以包含多個第二開關結構域(例如，基於FRB的開關結構域)。在一個實施方式中，第一成員可以包含第一開關結構域和第二開關結構域(例如，基於FKBP的開關結構域和基於FRB的開關結構域)，並且第二成員可以包含第一開關結構域和第二開關結構域(例如，基於FKBP的開關結構域和基於FRB的開關結構域)。

在一個實施方式中，細胞內傳訊成員包含一個或多個細胞內傳訊結構域(例如，初級細胞內傳訊結構域)和一個或多個共刺激傳訊結構域。

在一個實施方式中，抗原結合成員可以包含一個或多個細胞內傳訊結構域，例如一個或多個共刺激傳訊結構域。在一個實施方式中，抗原結合成員包含本文所述之多個(例如，2或3個)共刺激傳訊結構域，例如，選自4-1BB、CD28、CD27、ICOS、和OX40，並且在實施方式中，沒有初級細胞內傳訊結構域。在一個實施方式中，抗原結合成員從細胞外到細胞內方向包含以下共刺激傳訊結構域：4-1BB-CD27；4-1BB-CD27；CD27-4-1BB；4-1BB-CD28；CD28-4-1BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-4-1BB；或4-1BB-CD28。在此類實施方式中，細胞內結合成員包含CD3ζ結構域。在一個此類實施方式中，RCAR包含(1)抗原結合成員，該抗原結合成員包含抗原結合結構域、跨膜結構域、和兩個共刺激結構域和第一開關結構域；和(2)細胞內傳訊結構域，該細胞內傳訊結構域包含跨膜結構域或膜系鏈結構域和至少一個初級細胞內傳訊結構域、和第二開關結構域。

一個實施方式提供了RCAR，其中抗原結合成員不與CAR細胞表面系接。這使得具有細胞內傳訊成員的細胞可以方便地與一個或多個抗原結合結構域配對，而不用編碼抗原結合成員的序列來轉化細胞。在此類實施方式中，RCAR包含：1)細胞內傳訊成員，該細胞內傳訊成員包含：第一開關結構域、跨膜結構域、細胞內傳訊結構域(例如，初級細胞內傳訊結構域)、和第一開關結構域；和2)抗原結合成員，該抗原結合成員包含：抗原結合結構域、和第二開關結構域，其中抗原結合成員不包含跨膜結構域或膜系鏈結構域，並且視需要，不包含細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，RCAR可以進一步包含3)第二抗原結合成員，該第二抗原結合成員包含：第二抗原結合結構域，例如結合不同抗原的而不是由抗原結合結構域結合的第二抗原結合結構域；和第二開關結構域。

本文還提供了RCAR，其中抗原結合成員包含雙特異性激活和靶向能力。在此實施方式中，抗原結合成員可以包含多個(例如2、3、4或5個)抗原結合結構域，例如scFv，其中每個抗原結合結構域結合靶抗原，例如不同的抗原或相同的抗原，例如，相同抗原上的相同或不同表位。在一個實施方式中，多個抗原結合結構域串聯，並且視需要，在每個抗原結合結構域之間佈置連接子或鉸鏈區。合適的連接子和鉸鏈區描述在本文中。

一個實施方式提供了具有允許開關增殖的組態的RCAR。在此實施方式中，RCAR包含：1)細胞內傳訊成員，該細胞內傳訊成員包含：視需要，跨膜結構域或膜系鏈結構域；一個或多個共刺激傳訊結構域，例如，選自4-1BB、CD28、CD27、ICOS、和OX40，以及開關結構域；和2)抗原結合成員，該抗原結合成員包含：抗原結合結構域、跨膜結構域、和初級細胞內傳訊結構域(例如，CD3ζ結構域)，其中抗原結合成員不包含開關結構域，或者不包含與細胞內傳訊結構域上的開關結構域二聚化的開關結構域。在一個實施方式中，抗原結合成員不包含共刺激傳訊結構域。在一個實施方式中，細胞內傳訊成員包含來自同源二聚化開關的開關結構域。在一個實施方式中，細胞內傳訊成員包含異源二聚化開關的第一開關結構域，並且RCAR包含第二細胞內傳訊成員，該第二細胞內傳訊成員包含異源二聚化開關的第二開關結構域。在此類實施方式中，第二細胞內傳訊成員包含與細胞內傳訊成員相同的細胞內傳訊結構域。在一個實施方式中，二聚化開關係細胞內的。在一個實施方式中，二聚化開關係細胞外的。

在本文所述之任何RCAR組態中，第一開關結構域和第二開關結構域包含如本文所述之基於FKBP-FRB的開關。

本文還提供包含本文所述RCAR的細胞。任何經工程化以表現RCAR的細胞都可以用作RCARX細胞。在一個實施方式中，RCARX細胞係T細胞，並且被稱為RCART細胞。在一個實施方式中，RCARX細胞係NK細胞，並且被稱為RCARN細胞。

本文還提供包含RCAR編碼序列的核酸和載體。編碼RCAR的各種元件的序列可以佈置在相同的核酸分子上，例如相同的質體或載體，例如病毒載體，例如慢病毒載體。在一個實施方式中，(i)編碼抗原結合成員的序列和(ii)編碼細胞內傳訊成員的序列可以存在於相同的核酸例如載體上。可以藉由例如使用單獨的啟動子或藉由使用雙順反子轉錄產物(其可以藉由裂解單個翻譯產物或藉由翻譯兩個分開的蛋白質產物來產生兩個蛋白質產物)來實現相應蛋白質的產生。在一個實施方式中，編碼可裂解肽的序列(例如，P2A或F2A序列)佈置在(i)與(ii)之間。在一個實施方式中，編碼IRES(例如，EMCV或EV71 IRES)的序列佈置在(i)與(ii)之間。在該等實施方式中，(i)和(ii)轉錄為單個RNA。在一個實施方式中，第一啟動子與(i)可操作地連接，並且第二啟動子與(ii)可操作地連接，使得(i)和(ii)轉錄為單獨的mRNA。

可替代地，編碼RCAR的各種元件的序列可以佈置在不同的核酸分子上，例如不同的質體或載體，例如病毒載體，例如慢病毒載體。例如，(i)編碼抗原結合成員的序列可以存在於第一核酸(例如，第一載體)上，並且(ii)編碼細胞內傳訊成員的序列可以存在於第二核酸(例如，第二載體)上。

二聚化開關

二聚化開關可以是非共價的或共價的。在非共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關結構域之間的非共價相互作用。在共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關結構域之間的共價相互作用。

在一個實施方式中，RCAR包含基於FKBP/FRAP或基於FKBP/FRB的二聚化開關。FKBP12(FKBP或FK506結合蛋白)係豐富的胞質蛋白，該胞質蛋白充當天然產物免疫抑制藥物(雷帕黴素)的初始細胞內靶標。雷帕黴素結合至FKBP和大型PI3K同源物FRAP(RAFT，mTOR)。FRB係FRAP的93個胺基酸部分，該胺基酸部分足以結合FKBP-雷帕黴素複合物(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.和Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue[鑒定289-kDa FKBP12-雷帕黴素相關的蛋白內的11-kDa FKBP12-雷帕黴素結合結構域並表徵關鍵的絲胺酸殘基].Proc Natl Acad Sci USA[美國國家科學院院刊]92：4947-51)。

在實施方式中，基於FKBP/FRAP(例如FKBP/FRB)的開關可以使用二聚化分子，例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物。

FKBP的示例性胺基酸序列如下：

(SEQ ID NO：275)

在實施方式中，FKBP開關結構域可以包含FKBP的片段，該FKBP的片段具有在存在雷帕黴素或雷帕黴素類似物的情況下與FRB或其片段或類似物結合的能力。在一個實施方式中，FKBP開關結構域包含以下的胺基酸序列：

(SEQ ID NO：276)

FRB的胺基酸序列如下：

(SEQ ID NO：277)

如本文所用，術語「基於FKBP/FRAP(例如，FKBP/FRB)的開關」係指二聚化開關，該二聚化開關包含：第一開關結構域，該第一開關結構域包含FKBP片段或其類似物，該FKBP片段或其類似物具有在存在雷帕黴素或雷帕黴素類似物(例如，RAD001)的情況下與FRB或其片段或類似物結合的能力，並且與SEQ ID NO：275或276的FKBP序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性，或相差不超過30個、25個、20個、15個、10個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基；和第二開關結構域，該第二開關結構域包含FRB片段或其類似物，該FRB片段或其類似物具有在存在雷帕黴素或雷帕黴素類似物的情況下與FRB或其片段或類似物結合的能力，並且與SEQ ID NO：277的FRB序列具有至少70%、75%、80%、85、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性，或相差不超過30個、25個、20個、15個、10個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基。在一個實施方式中，本文所述之RCAR包含一個包含SEQ ID NO：275(或SEQ ID NO：276)中揭露的胺基酸殘基的開關結構域，以及一個包含SEQ ID NO：277中揭露的胺基酸殘基的開關結構域。

在實施方式中，FKBP/FRB二聚化開關包含經修飾的FRB開關結構域，該經修飾的FRB開關結構域在基於FRB的開關結構域(例如，經修飾的FRB開關結構域、基於FKBP的開關結構域)與二聚化分子(例如，雷帕黴素或雷帕黴素類似物(例如RAD001))之間表現出改變的(例如增強的)複合物形成。在一個實施方式中，經修飾的FRB開關結構域包含一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)突變，該等突變選自一個或多個胺基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105和F2108的突變，其中野生型胺基酸突變為任何其他天然存在的胺基酸。在一個實施方式中，突變體FRB包含E2032處的突變，其中E2032突變為苯丙胺酸(E2032F)、甲硫胺酸(E2032M)、精胺酸(E2032R)、纈胺酸(E2032V)、酪胺酸(E2032Y)、異白胺酸(E2032I)，例如SEQ ID NO：278、或白胺酸(E2032L)，例如SEQ ID NO：279。在一個實施方式中，突變體FRB包含T2098處的突變，其中T2098突變為苯丙胺酸(T2098F)或白胺酸(T2098L)，例如SEQ ID NO：280。在一個實施方式中，突變體FRB包含E2032和T2098處的突變，其中E2032突變為任何胺基酸，並且其中T2098突變為任何胺基酸，例如SEQ ID NO：281。在一個實施方式中，突變體FRB包含E2032I和T2098L突變，例如SEQ ID NO：282。在一個實施方式中，突變體FRB包含E2032L和T2098L突變，例如SEQ ID NO：283。

[表18].對二聚化分子具有增加的親和力的示例性突變體FRB。

其他合適的二聚化開關包括基於GyrB-GyrB的二聚化開關、基於赤黴素的二聚化開關、標籤/黏合劑二聚化開關、和鹵素標籤/快速標籤二聚化開關。按照本文提供的指導，此類開關和相關的二聚化分子對於普通技術人員將是顯而易見的。

二聚化分子

藉由二聚化分子來促進開關結構域之間的締合。在二聚化分子存在下，開關結構域之間的相互作用或結合允許在與第一開關結構域締合(例如，融合)的多肽和與第二開關結構域締合(例如，融合)的多肽之間進行訊息傳遞。在非限制性水平的二聚化分子存在下，例如，如在本文所述之系統中，訊息傳遞增加了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍。

雷帕黴素和雷帕黴素類似物(rapamycin analog)(有時稱為雷帕黴素類似物(rapalogue)，例如RAD001)可用作本文所述之基於FKBP/FRB的二聚化開關中的二聚化分子。在一個實施方式中，二聚化分子可以選自雷帕黴素(西羅莫司)、RAD001(依維莫司)、佐他莫司、替西羅莫司，AP-23573(地磷莫司)、拜耳莫司(biolimus)和AP21967。適用於與基於FKBP/FRB的二聚化開關一起使用的其他雷帕黴素類似物在標題為「組合療法」的部分中或在標題為「與低(免疫增強)劑量的mTOR抑制劑組合」的小節中進一步描述。

分離的CAR

在一些實施方式中，表現CAR的細胞使用分離的CAR。分離的CAR方法在公開WO2014/055442和WO2014/055657中更詳細地描述，該公開藉由引用併入本文。簡而言之，分離的CAR系統包含表現具有第一抗原結合結構域和共刺激結構域(例如41BB)的第一CAR的細胞，並且該細胞還表現具有第二抗原結合結構域和細胞內傳訊結構域(例如CD3ζ)的第二CAR。當該細胞遇到第一抗原時，共刺激結構域被活化，並且細胞增殖。當該細胞遇到第二抗原時，細胞內傳訊結構域被活化並開始細胞殺傷活性。因此，該表現CAR的細胞僅在兩種抗原都存在下完全活化。在實施方式中，第一抗原結合結構域識別BCMA，例如包含本文所述之抗原結合結構域，並且第二抗原結合結構域識別在急性髓性白血病細胞上表現的抗原，例如CD123、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸受體β。在實施方式中，第一抗原結合結構域識別BCMA，例如包含本文所述之抗原結合結構域，並且第二抗原結合結構域識別在B細胞上表現的抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。

CAR與其他分子或藥劑的共表現

第二CAR的共表現

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞可以進一步包含第二CAR，例如包含不同的抗原結合結構域(例如，針對相同的靶標(例如，CD19)或不同的靶標(例如，除CD19以外的靶標，例如，本文所述之靶標))的第二CAR。在一些實施方式中，表現CAR的細胞包含第一CAR和第二CAR，該第一CAR靶向第一抗原並且包含具有共刺激傳訊結構域但不具有初級傳訊結構域的細胞內傳訊結構域，該第二CAR靶向第二不同的抗原並且包含具有初級傳訊結構域但不具有共刺激傳訊結構域的細胞內傳訊結構域。將共刺激傳訊結構域(例如4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置於第一CAR上，並且將初級傳訊結構域(例如CD3ζ)置於第二CAR上可以限制CAR對表現兩個靶標的細胞的活性。在一些實施方式中，表現CAR的細胞包含第一CAR(其包括抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激結構域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，並包括抗原結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域)。在一些實施方式中，表現CAR的細胞包含第一CAR(其包括抗原結合結構域、跨膜結構域和初級傳訊結構域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，並包括針對抗原的抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激傳訊結構域)。

在一些實施方式中，表現CAR的細胞包含本文所述之XCAR和抑制性CAR。在一些實施方式中，抑制性CAR包含結合在正常細胞而非癌細胞(例如也表現X的正常細胞)上發現的抗原的抗原結合結構域。在一些實施方式中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。例如，抑制性CAR的細胞內結構域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGF β)的細胞內結構域。

在一些實施方式中，當表現CAR的細胞包含兩種或更多種不同的CAR時，不同CAR的抗原結合結構域可以使得抗原結合結構域不相互作用。例如，表現第一CAR和第二CAR的細胞可以具有第一CAR的抗原結合結構域(例如，作為片段，例如scFv)，該抗原結合結構域不與第二CAR的抗原結合結構域形成締合，例如第二CAR的抗原結合結構域係VHH。

在一些實施方式中，該抗原結合結構域包含單結構域抗原結合(SDAB)分子，該單結構域抗原結合分子包括其互補決定區係單結構域多肽的一部分的分子。實例包括但不限於重鏈可變結構域、天然缺乏輕鏈的結合分子、源自常規4鏈抗體的單結構域、工程化結構域、和除抗體衍生的那些之外的單結構域支架。SDAB分子可以是任何先前技術的、或任何未來的單結構域分子。 SDAB分子可以源自任何物種，包括但不限於小鼠、人、駱駝、美洲駝、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔和牛。該術語還包括來自除駱駝科和鯊魚外的物種的天然存在的單結構域抗體分子。

在一些實施方式中，SDAB分子可以源自在魚中發現的免疫球蛋白的可變區，例如像源自在鯊魚血清中發現的稱為新穎抗原受體(NAR)的免疫球蛋白同種型的可變區。WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白質科學]14：2901-2909中描述了產生源自NAR可變區的單結構域分子(「IgNAR」)之方法。

在一些實施方式中，SDAB分子係天然存在的單結構域抗原結合分子，稱為缺乏輕鏈的重鏈。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman，C.等人(1993)Nature[自然]363：446-448中揭露了此類單結構域分子。出於清楚的原因，源自天然缺乏輕鏈的重鏈分子的這種可變結構域在本文中稱為VHH或奈米抗體，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區分開。這種VHH分子可以源自駱駝科物種，例如駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和原駝。除駱駝科外的其他物種可產生天然缺乏輕鏈的重鏈分子；此類VHH在本發明的範圍內。

還發現，具有多個嵌合膜嵌入受體(該等嵌合膜嵌入受體包含抗原結合結構域，受體的抗原結合結構域之間具有相互作用)的細胞可能是不希望的，例如，因為它抑制一個或多個抗原結合結構域結合其同源抗原的能力。因此，本文揭露了具有第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受體的細胞，該嵌合膜嵌入受體包含使這種相互作用最小化的抗原結合結構域。本文還揭露了編碼包含最小化這種相互作用的抗原結合結構域的第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受體的核酸，以及製備和使用此類細胞和核酸之方法。在一些實施方式中，第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受體中的一個的抗原結合結構域包含scFv，並且另一個包含單VH結構域，例如駱駝科動物、鯊魚、或七鰓鰻單VH結構域、或源自人或小鼠序列的單VH結構域。

在一些實施方式中，本文的組成物包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域不包含可變輕結構域和可變重結構域。在一些實施方式中，第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域係scFv，並且另一個不是scFv。在一些實施方式中，第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域包含單VH結構域，例如駱駝科動物、鯊魚、或七鰓鰻單VH結構域、或源自人或小鼠序列的單VH結構域。在一些實施方式中，第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域包含奈米抗體。在一些實施方式中，第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域包含駱駝科動物VHH結構域。

在一些實施方式中，第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域包含scFv，並且另一個包含單VH結構域，例如駱駝科動物、鯊魚、或七鰓鰻單VH結構域、或源自人或小鼠序列的單VH結構域。在一些實施方式中，第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域包含scFv，並且另一個包含奈米抗體。在一些實施方式中，第一和第二CAR中的一個的抗原結合結構域包含scFv，並且另一個包含駱駝科動物VHH結構域。

在一些實施方式中，當存在於細胞表面上時，第一CAR的抗原結合結構域與其同源抗原的結合基本上不因第二CAR的存在而降低。在一些實施方式中，存在第二CAR情況下的第一CAR的抗原結合結構域與其同源抗原的結合係不存在CAR情況下的第一CAR的抗原結合結構域與其同源抗原的結合的至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

在一些實施方式中，當存在於細胞表面上時，第一和第二CAR的抗原結合結構域彼此的相關聯小於兩者皆為scFv抗原結合結構域的情況。在一些實施方式中，第一和第二CAR的抗原結合結構域彼此的相關聯小於兩者皆為scFv抗原結合結構域的情況的至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

增強CAR活性的藥劑的共表現

在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞可以進一步表現另一種藥劑，例如增強表現CAR的細胞的活性或適合性的藥劑。

例如，在一些實施方式中，該藥劑可以是抑制調製或調節(例如抑制)T細胞功能的分子的藥劑。在一些實施方式中，調製或調節T細胞功能的分子係抑制性分子。在一些實施方式中，抑制性分子(例如，PD1)可降低表現CAR的細胞產生免疫效應子應答的能力。抑制性分子的實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、或TGF β。

在實施方式中，例如如本文所述之藥劑(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)；或例如，抑制性蛋白質或系統(例如成簇的規則間隔短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)、或鋅指核酸內切酶(ZFN))可以用於在表現CAR的細胞中抑制調製或調節(例如抑制)T細胞功能的分子的表現。在一些實施方式中，該藥劑係shRNA，例如本文所述之shRNA。在一些實施方式中，調製或調節(例如抑制)T細胞功能的藥劑在表現CAR的細胞內被抑制。例如，將抑制調製或調節(例如抑制)T細胞功能的分子表現的dsRNA分子與編碼CAR組分(例如所有組分)的核酸連接。

在一些實施方式中，對抑制性分子進行抑制的藥劑包含第一多肽(例如，抑制性分子)，該第一多肽與向細胞提供正訊號的第二多肽，例如本文所述之細胞內傳訊結構域締合。在一些實施方式中，該藥劑包含例如抑制性分子(如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、或TGF β、或該等中的任一個的片段(例如該等中的任一個的細胞外結構域的至少一部分))的第一多肽，和為本文所述之細胞內傳訊結構域(例如包含共刺激結構域(例如41BB、CD27、或CD28，例如如本文所述)和/或初級傳訊結構域(例如本文所述之CD3ζ傳訊結構域)的第二多肽。在一些實施方式中，該藥劑包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的細胞外結構域的至少一部分)和本文所述之細胞內傳訊結構域(例如，本文所述之CD28傳訊結構域和/或本文所述之CD3ζ傳訊結構域)的第二多肽。PD1係受體的CD28家族的抑制性成員，該家族還包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B細胞、T細胞和髓系細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol[國際免疫學]8：765-75)。已經顯示PD1的兩種配位基PD-L1和PD-L2在與PD1結合後下調T細胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med[實驗醫學雜誌]192：1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol[自然免疫學]2：261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol[歐洲免疫學雜誌]32：634-43)。PD-L1在人類癌症中是豐富的(Dong等人2003 J Mol Med[分子醫學雜誌]81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫學和免疫療法]54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res[臨床癌症研究]10：5094)。藉由抑制PD1與PD-L1的局部相互作用可以逆轉免疫抑制。

在一些實施方式中，該藥劑包含抑制性分子(例如，計劃性死亡1(PD1))的細胞外結構域(ECD)，可以與跨膜結構域和細胞內傳訊結構域 (如41BB和CD3ζ)融合(在本文中也稱為PD1 CAR)。在一些實施方式中，PD1 CAR與本文所述之XCAR組合使用時，改善了T細胞的持久性。在一些實施方式中，CAR係PD1 CAR，其包含PD1的細胞外結構域，如SEQ ID NO：24中加底線所指示的。在一些實施方式中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列。

在一些實施方式中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該藥劑包含編碼PD1 CAR(例如，本文所述之PD1 CAR)的核酸序列。在一些實施方式中，PD1 CAR的核酸序列提供為SEQ ID NO：23，PD1 ECD以底線標出。

在另一個實例中，在一些實施方式中，增強表現CAR的細胞活性的藥劑可以是共刺激分子或共刺激分子配位基。共刺激分子的實例包括MHC I類分子、BTLA和Toll配位基受體，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此類共刺激分子的其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及與CD83特異性結合的配位基，例如，如本文所述。共刺激分子配位基的實例包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL、和LIGHT。在實施方式中，共刺激分子配位基係不同於CAR的共刺激分子結構域的共刺激分子的配位基。在實施方式中，共刺激分子配位基係與CAR的共刺激分子結構域相同的共刺激分子的配位基。在一些實施方式中，共刺激分子配位基係4-1BBL。在一些實施方式中，共刺激配位基係CD80或CD86。在一些實施方式中，共刺激分子配位基係CD70。在實施方式中，可以進一步工程化本文所述之表現CAR的免疫效應細胞以表現一種或多種另外的共刺激分子或共刺激分子配位基。

CAR與趨化因子受體的共表現

在實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞(例如表現CD19 CAR的細胞)進一步包含趨化因子受體分子。T細胞中趨化因子受體CCR2b或CXCR2的轉基因表現增強了向分泌CCL2或CXCL1的實性瘤(包括黑素瘤和神經母細胞瘤)的運輸(Craddock等人，J Immunother.[免疫療法雜誌]2010年10月；33(8)：780-8和Kershaw等人，Hum Gene Ther.[人基因療法]2002年11月1日；13(16)：1971-80)。因此，不希望受理論的約束，據信在識別由腫瘤(例如實性瘤)分泌的趨化因子的表現CAR的細胞中表現的趨化因子受體可以改善表現CAR的細胞向腫瘤的歸巢，促進表現CAR的細胞向腫瘤的浸潤，並增強表現CAR的細胞的抗腫瘤功效。趨化因子受體分子可以包含天然存在或重組趨化因子受體或其趨化因子結合片段。適於在本文所述之表現CAR的細胞(例如CAR-Tx)中表現的趨化因子受體分子包括CXC趨化因子受體(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、或CXCR7)、CC趨化因子受體(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、或CCR11)、CX3C趨化因子受體(例如CX3CR1)、XC趨化因子受體(例如XCR1)、或其趨化因子結合片段。在一些實施方式中，基於由腫瘤分泌的一種或多種趨化因子選擇有待用本文所述CAR表現的趨化因子受體分子。在一些實施方式中，本文所述之表現CAR的細胞進一步包含(例如表現)CCR2b受體或CXCR2受體。在一些實施方式中，本文所述之CAR和趨化因子受體分子在同一載體或在兩個不同載體上。在其中本文所述CAR和趨化因子受體分子在同一載體上的實施方式中，該CAR和趨化因子受體分子各自處於兩個不同啟動子的控制下或處於同一啟動子的控制下。

編碼CAR的核酸構建體

本發明還提供免疫效應細胞，例如，藉由本文所述之方法製備的免疫效應細胞，其包括編碼本文所述之一種或多種CAR構建體的核酸分子。在一些實施方式中，該核酸分子提供為信使RNA轉錄物。在一些實施方式中，該核酸分子提供為DNA構建體。

本文描述的核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或其組合。在一些實施方式中，該核酸分子係編碼如本文所述之CAR多肽的mRNA。在其他實施方式中，該核酸分子係包括任何前述核酸分子的載體。

在一些實施方式中，本發明的CAR的抗原結合結構域(例如，scFv)由核酸分子編碼，該核酸分子的序列已進行密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現。在一些實施方式中，本發明的整個CAR構建體由核酸分子編碼，該核酸分子的整個序列已進行密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現。密碼子優化係指如下發現：在編碼DNA中同義密碼子(即編碼相同胺基酸的密碼子)的出現頻率在不同物種中有偏差。這種密碼子簡並性允許相同的多肽由各種核苷酸序列編碼。各種密碼子優化方法係本領域已知的，並且包括例如在至少美國專利案號5,786,464和6,114,148中揭露之方法。

因此，在一些實施方式中，例如藉由本文所述之方法製備的免疫效應細胞包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸分子，其中CAR包含結合本文所述腫瘤抗原的抗原結合結構域、跨膜結構域(例如，本文所述之跨膜結構域)、和細胞內傳訊結構域(例如，本文所述之細胞內傳訊結構域)(包含刺激結構域，例如共刺激傳訊結構域(例如，本文所述之共刺激傳訊結構域)和/或初級傳訊結構域(例如，本文所述之初級傳訊結構域，例如本文所述之ζ鏈))。

本發明還提供了載體，其中插入了編碼CAR的核酸分子，例如本文所述之核酸分子。源自逆轉錄病毒如慢病毒的載體係實現長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因的長期穩定整合及其在子細胞中的繁殖。慢病毒載體相對於源自腫瘤逆轉錄病毒如鼠白血病病毒的載體具有附加優點，因為它們可以轉導非增殖性細胞，例如肝細胞。它們還具有低免疫原性的附加優點。逆轉錄病毒載體還可以是例如γ逆轉錄病毒載體。γ逆轉錄病毒載體可以包括例如啟動子、包裝訊號(ψ)、引物結合位點(PBS)、一個或多個(例如兩個)長末端重複序列(LTR)、和目的轉基因(例如編碼CAR的基因)。γ逆轉錄病毒載體可能缺少病毒結構基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆轉錄病毒載體包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾臟病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的載體。其他γ逆轉錄病毒載體描述於例如Tobias Maetzig等人，「Gammaretroviral Vectors：Biology,Technology and Application[γ逆轉錄病毒載體：生物學/技術和應用]」Viruses.[病毒]2011年6月；3(6)：677-713)。

在一些實施方式中，包含編碼所希望CAR的核酸的載體係腺病毒載體(A5/35)。在一些實施方式中，編碼CAR的核酸的表現可以使用轉座子如睡美人系統、crisper、CAS9和鋅指核酸酶完成。見下文June等人2009 Nature Reviews Immunology[自然免疫學綜述]9.10：704-716，該文獻藉由引用併入本文。

簡而言之，編碼CAR的天然或合成核酸的表現典型地是藉由將編碼CAR多肽或其部分的核酸與啟動子可操作地連接、並將構建體併入到表現載體中來實現。載體可以適用於複製和整合真核生物。典型的選殖載體含有轉錄和翻譯終止子、起始序列和可用於調節所希望核酸序列表現的啟動子。

可以將核酸選殖至許多類型的載體中。例如，可以將核酸選殖到載體中，該載體包括但不限於質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和黏粒。特別感興趣的載體包括表現載體、複製載體、探針生成載體和定序載體。

此外，可以將表現載體以病毒載體的形式提供至細胞。病毒載體技術在本領域中是熟知的，並且例如描述於Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL[分子選殖：實驗室手冊]，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY[紐約冷泉港出版社]中，以及其他病毒學和分子生物學手冊中。可用作載體的病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體含有在至少一種生物體中具有複製功能的起點、啟動子序列、便利的限制性內切核酸酶位點和一種或多種選擇標誌物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美國專利案號6,326,193)。

已經開發了許多基於病毒的系統用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供了便利的平臺。可以使用本領域已知的技術將選擇的基因插入到載體中並且包裝在逆轉錄病毒顆粒中。然後可以分離重組病毒並在體內或離體遞送至受試者的細胞中。許多逆轉錄病毒系統在本領域中是已知的。在一些實施方式中，使用了腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領域中是已知的。在一些實施方式中，使用慢病毒載體。

另外的啟動子元件(例如增強子)調節轉錄起始的頻率。典型地，該等位於起始位點上游30-110bp的區中，但是已經顯示許多啟動子也含有起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔常常是靈活的，使得當元件彼此相對發生顛倒或移動時啟動子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可以在活性開始下降之前增加到相隔50bp。取決於啟動子，顯現單獨的元件可以協同或獨立地起作用以活化轉錄。示例性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。

能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR編碼核酸分子的啟動子的實例係EF1a啟動子。天然EF1a啟動子驅動延伸因子-1複合物的α亞基的表現，該複合物負責將胺醯tRNA酶促遞送至核糖體。EF1a啟動子已經廣泛用於哺乳動物表現質體，並且已經顯示出可有效地從選殖到慢病毒載體中的核酸分子驅動CAR表現。參見例如，Milone等人，Mol.Ther.[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。在一些實施方式中，EF1a啟動子包含實例中提供的序列。

啟動子的另一個實例係即時早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列係強組成型啟動子序列，能夠驅動與其可操作地連接的任何多核苷酸序列的高水平表現。然而，還可以使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、EB(Epstein-Barr)病毒即刻早期啟動子、Rous肉瘤病毒啟動子、以及人基因啟動子，如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、延伸因子-1α啟動子、血紅蛋白啟動子、和肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應限於使用組成型啟動子。誘導型啟動子也被考慮作為本發明的一部分。誘導型啟動子的使用提供了分子開關，該分子開關能夠當需要該啟動子可操作地連接的多核苷酸序列的表現時啟動這種表現，或者當不需要表現時關閉表現。誘導型啟動子的實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環素啟動子。

啟動子的另一個實例係磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在實施方式中，截短的PGK啟動子(例如當與野生型PGK啟動子序列相比時，具有一個或多個(例如1、2、5、10、100、200、300、或400個)核苷酸缺失的PGK啟動子)可能是希望的。

以下提供了示例性PGK啟動子的核苷酸序列。

WT PGK啟動子：

(SEQ ID NO：190)

示例性截短的PGK啟動子：

PGK100：

(SEQ ID NO：198)

PGK200：

(SEQ ID NO：191)

PGK300：

(SEQ ID NO：192)

PGK400：

(SEQ ID NO：193)

載體還可以包括例如促進分泌的訊息序列、多腺苷酸化訊號和轉錄終止子(例如來自牛生長激素(BGH)基因)、允許在原核生物中游離型複製和複製的元件(例如SV40起源和ColE1或本領域已知的其他元件)和/或允許選擇的元件(例如胺苄青黴素抗性基因和/或zeocin標誌物)。

為了評估CAR多肽或其部分的表現，待引入到細胞中的表現載體還可含有選擇標誌物基因或報告基因或兩者，以便於從旨在藉由病毒載體經轉染或感染的細胞群體中鑒定和選擇表現細胞。在一些實施方式中，選擇標誌物可以在單獨的DNA片段上攜帶並用於共轉染程序。選擇標誌物和報告基因二者都可以側接適當的調節序列以實現在宿主細胞中的表現。有用的選擇標誌物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。

報告基因用於鑒定可能經轉染的細胞和用於評價調節序列的功能。通常，報告基因係如下基因，該基因不存在於受體生物體或組織中或由其表現並且編碼多肽，該多肽的表現藉由一些可易於檢測的特性(例如，酶活性)表現出來。在將DNA引入到受體細胞中後的適當時間測定報告基因的表現。合適的報告基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶的基因或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters[歐洲生化學會聯合會快報]479：79-82)。合適的表現系統係熟知的，並且可以使用已知技術製備或商業獲得。通常，顯示報告基因的最高表現水平的具有最小 5'側翼區的構建體被鑒定為啟動子。此類啟動子區可以與報告基因連接，並用於評價藥劑調節啟動子驅動的轉錄的能力。

在實施方式中，載體可包含兩種或多種編碼CAR的核酸序列，例如本文所述之CAR，例如CD19 CAR，和第二CAR，例如，抑制性CAR或特異性結合CD19以外的抗原的CAR。在此類實施方式中，編碼CAR的兩種或更多種核酸序列由相同框中的單個核酸分子編碼並且作為單個多肽鏈。在一些實施方式中，兩種或更多種CAR可以例如藉由一個或多個肽切割位點分開。(例如，細胞內蛋白酶的自動切割位點或底物)。肽切割位點的實例包括T2A、P2A、E2A或F2A位點。

將基因引入到細胞中並將其在細胞中表現之方法在本領域中是已知的。在表現載體的背景下，可以藉由例如本領域的任何方法將載體容易地引入到宿主細胞，例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞中。例如，表現載體可以藉由物理、化學或生物手段轉移到宿主細胞中。

用於將多核苷酸引入到宿主細胞中的物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。產生包含載體和/或外源性核酸的細胞之方法在本領域中是熟知的。參見例如，Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL[分子選殖：實驗室手冊]，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press[冷泉港實驗出版社]，紐約)。將多核苷酸引入到宿主細胞中的適合之方法係磷酸鈣轉染。

用於將目的多核苷酸引入到宿主細胞中的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，並且尤其是逆轉錄病毒載體，已成為將基因插入哺乳動物例如人細胞中的最廣泛使用之方法。其他病毒載體可以源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺相關病毒等。參見，例如美國專利案號5,350,674和5,585,362。

用於將多核苷酸引入到宿主細胞中的化學手段包括膠體分散系統，如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠、和基於脂質的系統(包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質體)。用作體外和體內的遞送運載體的示例性膠體系統係脂質體(例如人造膜囊泡)。可獲得先前技術的靶向遞送核酸(如用靶向奈米顆粒或其他合適的亞微米大小的遞送系統遞送多核苷酸)的其他方法。

在使用非病毒遞送系統的情況下，示例性遞送運載體係脂質體。考慮使用脂質製劑以將核酸引入到宿主細胞(體外、離體或體內)中。在一些實施方式中，核酸可以與脂質締合。與脂質結合的核酸可以被包封在脂質體的水性內部，散佈在脂質體的脂質雙層內，經由與脂質體和寡核苷酸二者相關的連接分子附接至脂質體，包埋在脂質體中，與脂質體複合，分散在含有脂質的溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式包含在脂質中、包含在膠束中或與膠束複合，或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合的組成物不限於溶液中的任何特定結構。例如，它們可以以雙層結構、膠束或「塌陷」結構存在。它們也可以簡單地散佈在溶液中，可能形成大小或形狀不均勻的聚集體。脂質係脂肪物質，該等脂肪物質可以是天然存在的或合成的脂質。例如，脂質包括天然存在於細胞質中的脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、胺基醇和醛)的化合物類。

適用的脂質可以從商業來源獲得。例如，二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可以從密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司(Sigma,St.Louis,MO)獲得；磷酸二鯨蠟脂(「DCP」)可以從K & K實驗室(K & K Laboratories)(普萊恩維爾(Plainview)，紐約)獲得；膽固醇(「Choi」)可以從Calbiochem-Behring獲得；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)和其他脂質可以從阿凡提極地脂質公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)(伯明罕(Birmingham)，阿拉巴馬州)獲得。脂質在氯仿或氯仿/甲醇中的儲備溶液可以在約-20℃下儲存。氯仿用作唯一的溶劑，因為它比甲醇更容易蒸發。「脂質體」係通用術語，涵蓋藉由產生封閉的脂質雙層或聚集體形成的各種單層和多層脂質運載體。脂質體可以表徵為具有囊泡結構，該等囊泡結構具有磷脂雙層膜和內部水性介質。多層脂質體具有由水性介質分開的多個脂質層。它們係在磷脂懸浮在過量的水性溶液中時自發形成。脂質組分在形成封閉結構之前經歷自重排，並在脂質雙層之間捕獲水和溶解的溶質(Ghosh等人，1991 Glycobiology[糖生物學]5：505-10)。然而，還涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同的結構的組成物。例如，脂質可以呈現膠束結構或僅作為脂質分子的不均勻聚集體存在。還考慮了lipofectamine-核酸複合物。

無論用於將外源性核酸引入對宿主細胞中之方法還是以其他方式將細胞暴露於本發明的抑制劑，為了證實重組核酸序列在宿主細胞中的存在，可以進行多種測定。此類測定包括例如熟悉該項技術者熟知的「分子生物學」測定，如DNA印跡法和RNA印跡法、RT-PCR和PCR；「生物化學」測定，如檢測特定肽的存在或不存在，例如藉由免疫學手段(ELISA和蛋白質印跡)或藉由本文所述之測定以鑒定落入本發明範圍內的藥劑。

RNA轉染

本文揭露了用於產生體外轉錄的RNA CAR之方法。RNA CAR及其使用方法描述於例如2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第553-570段中，該文獻藉由引用以其全文併入。

免疫效應細胞可包括由信使RNA(mRNA)編碼的CAR。在一些實施方式中，將編碼本文所述CAR的mRNA導入免疫效應細胞(例如，藉由本文所述之方法製備的)用於產生表現CAR的細胞。

在一些實施方式中，體外轉錄的RNA CAR可以作為暫態轉染的形式引入細胞。使用聚合酶鏈反應(PCR)產生的模板藉由體外轉錄產生RNA。可以將來自任何來源的目的DNA直接藉由PCR轉化為模板，以使用適當的引物和RNA聚合酶體外合成mRNA。DNA的來源可以是例如基因組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合適的DNA來源。用於體外轉錄的所需模板係本文所述之CAR。例如，RNA CAR的模板可以包含含有對本文所述之腫瘤相關抗原的抗體的單鏈可變結構域的細胞外區；鉸鏈區(例如，本文所述之鉸鏈區)、跨膜結構域(例如，本文所述之跨膜結構域，例如CD8a的跨膜結構域)；以及細胞質區域，其包括細胞內傳訊結構域，例如本文所述之細胞內傳訊結構域，例如包含CD3-ζ的傳訊結構域和4-1BB的傳訊結構域。

在一些實施方式中，待用於PCR的DNA含有可讀框。DNA可以來自生物體基因組的天然存在的DNA序列。在一些實施方式中，核酸可以包括5'和/或3'非翻譯區(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外顯子和內含子。在一些實施方式中，用於PCR的DNA係人核酸序列。在一些實施方式中，用於PCR的DNA係包括5'和3'UTR的人核酸序列。可替代地，DNA可以是通常不在天然存在的生物體中表現的人工DNA序列。示例性人工DNA序列係含有基因部分的序列，該等基因部分連接在一起以形成編碼融合蛋白的可讀框。連接在一起的DNA部分可以來自單個生物體或來自多於一個的生物體。

使用PCR以產生用於體外轉錄mRNA的模板，該mRNA用於轉染。用於進行PCR之方法在本領域中是熟知的。用於PCR的引物被設計成具有與有待用作PCR模板的DNA區域基本上互補的區域。如本文所用，「基本上互補」係指其中引物序列中的大多數或所有鹼基係互補的，或者一個或多個鹼基係非互補的或錯配的核苷酸序列。基本上互補的序列能夠在用於PCR的退火條件下與預期的DNA靶標退火或雜交。可以將引物設計為與DNA模板的任何部分基本上互補。例如，可以將引物設計為擴增通常在細胞中轉錄的核酸的一部分(可讀框)，包括5'和3’UTR。還可以設計引物以擴增編碼特定的目的結構域的核酸的一部分。在一些實施方式中，設計引物以擴增人cDNA的編碼區，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用於PCR的引物可以藉由本領域熟知的合成方法產生。「正向引物」係含有核苷酸區域的引物，該等核苷酸與DNA模板上的位於待擴增DNA序列上游的核苷酸基本上互補。「上游」在本文中用於指相對於編碼股而言待擴增的DNA序列的5'位置。「反向引物」係含有核苷酸區域的引物，該核苷酸區域與待擴增的DNA序列下游的雙股DNA模板基本上互補。「下游」在本文中用於指相對於編碼股而言待擴增的DNA序列的3'位置。

可用於PCR的任何DNA聚合酶均可用於本文揭露之方法中。試劑和聚合酶可從許多來源商購獲得。

也可以使用能夠促進穩定性和/或翻譯效率的化學結構。實施方式中的RNA具有5'和3’UTR。在一些實施方式中，5'UTR的長度在1個與3000個核苷酸之間。待添加到編碼區的5'和3'UTR序列的長度可以藉由不同方法改變，該等方法包括但不限於設計與UTR的不同區退火的PCR引物。使用該途徑，熟悉該項技術者可以改變所需的5'和3'UTR長度，以在經轉錄RNA的轉染後實現最佳翻譯效率。

5'和3'UTR可以是目的核酸的天然存在的內源性5'和3'UTR。可替代地，可以藉由將對目的核酸不是內源的UTR序列併入到正向和反向引物中或藉由模板的任何其他修飾來添加該等UTR序列。使用對目的核酸係內源的UTR序列可用於改變RNA的穩定性和/或翻譯效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的穩定性。因此，可以選擇或設計3'UTR，以基於本領域熟知的UTR的特性來增加經轉錄的RNA的穩定性。

在一些實施方式中，5'UTR可以含有內源性核酸的科紮克(Kozak)序列。可替代地，當如上所述藉由PCR添加對目的核酸不是內源的 5'UTR時，可以藉由添加5'UTR序列重新設計共有科紮克序列。科紮克序列可以提高一些RNA轉錄物的翻譯效率，但似乎不是所有RNA實現高效翻譯所需要的。對許多mRNA的科紮克序列的要求在本領域中是已知的。在其他實施方式中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，該RNA病毒的RNA基因組在細胞中是穩定的。在其他實施方式中，可以在3'或5'UTR中使用各種核苷酸類似物來阻止mRNA的外切核酸酶降解。

為了在無需基因選殖的情況下實現從DNA模板合成RNA，轉錄啟動子應附接到待轉錄序列上游的DNA模板上。當將發揮RNA聚合酶啟動子功能的序列添加至正向引物的5'端時，該RNA聚合酶啟動子將併入到PCR產物中位於待轉錄的可讀框上游。在一些實施方式中，啟動子係T7聚合酶啟動子，如本文其他地方所述。其他可用的啟動子包括但不限於T3和SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3和SP6啟動子的共有核苷酸序列係本領域已知的。

在一些實施方式中，mRNA具有5'端帽和3'聚(A)尾，它們決定核糖體結合、翻譯起始和mRNA在細胞中的穩定性。在環狀DNA模板例如質體DNA上，RNA聚合酶產生長的多聯產物，該多聯產物不適於在真核細胞中表現。轉錄在3'UTR端線性化的質體DNA產生正常大小的mRNA，該mRNA即使在轉錄後進行了多腺苷酸化，在真核轉染中也是無效的。

在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可以將轉錄物的3'端延伸到模板的最後一個鹼基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13：6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[歐洲生物化學雜誌],270：1485-65(2003)。

將聚(A)/T伸展段整合到DNA模板中的常規方法係分子選殖。然而，整合到質體DNA中的聚(A)/T序列可導致質體不穩定，這就係為什麼從細菌細胞獲得的質體DNA模板經常被缺失和其他畸變高度污染的原因。這使得選殖程序不僅費力且耗時，而且通常是不可靠的。這就係為什麼非常期望允許在不進行選殖的情況下構建具有聚(A)/T 3'伸展段的DNA模板之方法。

轉錄DNA模板的聚(A)/T區段可以在PCR期間藉由使用含有聚胸腺嘧啶尾(例如100T尾)(SEQ ID NO：31)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO：32))的反向引物產生，或在PCR後藉由任何其他方法(包括但不限於DNA連接或體外重組)產生。聚(A)尾也為RNA提供穩定性並降低其降解。通常，聚(A)尾的長度與轉錄的RNA的穩定性呈正相關。在一些實施方式中，聚(A)尾在100和5000個腺苷之間(例如SEQ ID NO：33)。

在使用聚(A)聚合酶(如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))進行體外轉錄後，可以進一步延伸RNA的聚(A)尾。在一些實施方式中，將聚(A)尾的長度從100個核苷酸增加到300到400個核苷酸(SEQ ID NO：34)，導致RNA的翻譯效率增加約兩倍。另外，不同化學基團與3'端的附接可以增加mRNA穩定性。這種附接可以含有經修飾的/人工的核苷酸、適配位基和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶將ATP類似物併入到聚(A)尾中。ATP類似物還可以增加RNA的穩定性。

5'帽也為RNA分子提供穩定性。在一些實施方式中，藉由本文揭露之方法產生的RNA包括5'帽。使用本領域已知的和本文所述之技術獲得5'帽(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.[生物化學科學趨勢],29：436-444(2001)；Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化學與生物物理學研究通訊],330：958-966(2005))。

藉由本文揭露之方法產生的RNA還可以含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色體或人工設計的序列，該序列激活與帽無關的核糖體與mRNA的結合並促進翻譯的起始。可以包括適用於細胞電穿孔的任何溶質，該等溶質可以含有促進細胞通透性和活力的因子，如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑和表面活性劑。

可以使用許多不同方法中的任一種將RNA引入到靶細胞中，該等不同方法例如可商購之方法，包括但不限於：電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德國科隆的艾瑪科薩生物系統公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(麻塞諸塞州波士頓的哈佛儀器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科羅拉多州丹佛的伯樂公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德國漢堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany))；陽離子脂質體介導的轉染(使用脂質轉染)；聚合物包封；肽介導的轉染；或生物射彈顆粒遞送系統如「基因槍」(參見，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人類基因療法],12(8)：861-70(2001))。

非病毒遞送方法

在一些實施方式中，可以使用非病毒方法將編碼本文所述之CAR的核酸遞送至細胞或組織或受試者中。

在一些實施方式中，非病毒方法包括使用轉座子(也稱為轉座元件)。在一些實施方式中，轉座子係可以將自身插入基因組中一位置的一條DNA，例如，能夠自我複製並將其拷貝插入基因組的一條DNA，或者係可以從較長的核酸中剪接出並插入基因組中的另一個位置的一條DNA。例如，轉座子包含由側接基因的用於轉座的反向重複序列構成的DNA序列。

使用轉座子的核酸遞送的示例性方法包括睡美人轉座子系統(SBTS)和piggyBac^TM(PB)轉座子系統。參見例如，Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人類分子遺傳學]20.R1(2011)：R14-20；Singh等人Cancer Res.[癌症研究]15(2008)：2961-2971；Huang等人Mol.Ther.[分子療法]16(2008)：580-589；Grabundzija等人Mol.Ther.[分子療法]18(2010)：1200-1209；Kebriaei等人Blood. [血液學]122.21(2013)：166；Williams.Molecular Therapy[分子療法],16.9(2008)：1515-16；Bell等人Nat.Protoc.[自然實驗手冊]2.12(2007)：3153-65；和Ding等人Cell.[細胞]122.3(2005)：473-83，所有該等文獻均藉由引用併入本文。

SBTS包括兩個組分：1)含有轉基因的轉座子和2)轉座酶的來源。轉座酶可以將轉座子從運載體質體(或其他供體DNA)轉移到靶標DNA，如宿主細胞染色體/基因組。例如，轉座酶與運載體質體/供體DNA結合，從質體中切出轉座子(包括一個或多個轉基因)，並將它插入到宿主細胞的基因組中。參見例如，Aronovich等人，同上。

示例性轉座子包括基於pT2的轉座子。參見例如，Grabundzija等人Nucleic Acids Res.[核酸研究]41.3(2013)：1829-47；和Singh等人Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008)：2961-2971，所有該等文獻均藉由引用併入本文。示例性的轉座酶包括Tc1/海員型轉座酶(mariner-type transposase)，例如SB10轉座酶或SB11轉座酶(可以例如從巨細胞病毒啟動子表現的過度活躍的轉座酶)。參見例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有該等文獻均藉由引用併入本文。

SBTS的使用允許轉基因(例如，編碼本文所述CAR的核酸)的高效整合和表現。本文提供了產生細胞(例如，T細胞或NK細胞)之方法，該細胞例如使用轉座子系統(如，SBTS)穩定地表現本文所述之CAR。

根據本文所述之方法，在一些實施方式中，將含有SBTS組分的一種或多種核酸(例如質體)遞送至細胞(例如，T或NK細胞)。例如，藉由核酸(例如，質體DNA)遞送的標準方法遞送一種或多種核酸，該等標準方法例如本文所述之方法，例如電穿孔、轉染或脂質轉染。在一些實施方式中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR的核酸)的轉座子。在一些實施方式中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR的核酸)以及編碼轉座酶的核酸序列的轉座子。在其他實施方式中，提供了具有兩種核酸的系統，例如雙質體系統，例如，其中第一質體含有包含轉基因的轉座子，而第二質體含有編碼轉座酶的核酸序列。例如，將第一核酸和第二核酸共同遞送至宿主細胞中。

在一些實施方式中，藉由使用基因插入(使用SBTS)和基因編輯(使用核酸酶(例如，鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系統、或工程化大範圍核酸酶重新工程化的歸巢內切核酸酶))的組合產生表現本文所述之CAR的細胞，例如T細胞或NK細胞。

在一些實施方式中，使用非病毒遞送方法允許細胞例如T細胞或NK細胞的重程式設計，並且將該等細胞直接輸注到受試者體內。非病毒載體的優點包括但不限於容易且相對低成本地產生滿足患者群體所需的足夠量、儲存期間的穩定性和缺乏免疫原性。

製造/生產方法

本發明還提供了製備本文揭露的細胞之方法，例如將T細胞或NK細胞工程化以表現核酸分子之方法，該核酸分子編碼本文所述之一種或多種CAR構建體。在一些實施方式中，將本文揭露的製造方法用於製造如下細胞，該細胞包含編碼本文揭露的兩種CAR(例如本文揭露的抗BCMA CAR和抗CD19 CAR)的核酸分子。在一些實施方式中，將本文揭露的製造方法用於製造如下細胞，該細胞包含編碼本文揭露的雙抗體CAR(例如本文揭露的抗BCMA/抗CD19雙抗體CAR)的核酸分子。在一些實施方式中，將本文揭露的製造方法用於製造如下細胞，該細胞包含兩種核酸分子，其各自編碼本文揭露的CAR(例如一種核酸分子編碼抗BCMA CAR，並且一種核酸分子編碼抗CD19 CAR)。在一些實施方式中，本文提供了藉由本文所述之任何製造過程製備的細胞群體(例如免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞)。

活化過程

在一些實施方式中，本文揭露之方法可以在不到24小時內製造經工程化以表現一種或多種CAR的免疫效應細胞。不希望受理論束縛，本文提供之方法在製造過程中保留T細胞的未分化表型，例如初始T細胞。該等具有未分化表型的表現CAR的細胞在輸注後可在體內持續更長時間和/或更好地擴增。在一些實施方式中，例如如使用scRNA-seq測量的(例如如使用實例7關於圖25A所述方法測量的)，與藉由傳統的製造過程產生的CART細胞相比，藉由本文提供的製造方法產生的CART細胞包含更高百分比的幹細胞記憶T細胞。在一些實施方式中，例如如使用scRNA-seq測量的(例如如使用實例7關於圖25B所述方法測量的)，與藉由傳統的製造過程產生的CART細胞相比，藉由本文提供的製造方法產生的CART細胞包含更高百分比的效應T細胞。在一些實施方式中，例如如使用scRNA-seq測量的(例如如使用實例7關於圖25C所述方法測量的)，與藉由傳統的製造過程產生的CART細胞相比，藉由本文提供的製造方法產生的CART細胞更好地保留T細胞的幹細胞性。在一些實施方式中，例如如使用scRNA-seq測量的(例如使用實例7關於圖25D所述方法測量的)，與藉由傳統的製造過程產生的CART細胞相比，藉由本文提供的製造方法產生的CART細胞顯示出更低的缺氧水平。在一些實施方式中，例如如使用scRNA-seq測量的(例如如使用實例7關於圖25E所述方法測量的)，與藉由傳統的製造過程產生的CART細胞相比，藉由本文提供的製造方法產生的CART細胞顯示更低的自噬水平。在一些實施方式中，將所述免疫效應細胞工程化以包含核酸分子，所述核酸分子編碼本文揭露的兩種CAR(例如本文揭露的抗BCMA CAR和抗CD19 CAR)。在一些實施方式中，將該免疫效應細胞工程化以包含核酸分子，該核酸分子編碼本文揭露的雙抗體CAR(例如本文揭露的抗BCMA/抗CD19雙抗體CAR)。在一些實施方式中，將該免疫效應細胞工程化以包含兩種核酸分子，該核酸分子各自編碼本文揭露的CAR(例如一種核酸分子編碼抗BCMA CAR，並且一種核酸分子編碼抗CD19 CAR)。

在一些實施方式中，本文揭露之方法不涉及使用珠，例如Dynabeads^®(例如，CD3/CD28 Dynabeads^®)，並且不涉及去珠步驟。在一些實施方式中，藉由本文揭露之方法製造的CART細胞可以以最小的離體擴增投與於受試者，例如，小於1天、小於12小時、小於8小時、小於6小時、小於4小時、小於3小時、小於2小時、小於1小時、或沒有離體擴張。因此，本文描述之方法提供了製備改進的表現CAR的細胞產物的快速製造過程，該細胞產物用於治療受試者的疾病。

在一些實施方式中，本揭露提供了製備細胞(例如T細胞)群體之方法，該細胞群體表現嵌合抗原受體(CAR)(例如一種或多種CAR，例如兩種CAR)，該方法包括：(i)使細胞(例如T細胞，例如從冷凍或新鮮的白血球單採產物中分離的T細胞)群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或與刺激細胞表面上共刺激分子的藥劑接觸；(ii)使該細胞(例如T細胞)群體與編碼CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體；和(iii)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製細胞群體)或投與，其中：(a)步驟(ii)與步驟(i)一起進行，或在步驟(i)開始後不晚於20小時(例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時)進行，並且步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於26小時(例如在步驟(i)開始後不晚於22、23、或24小時，例如在步驟(i)開始後不晚於24小時)進行；(b)步驟(ii)與步驟(i)一起進行，或在步驟(i)開始後不晚於20小時(例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時)進行，並且步驟(iii)在步驟(ii)開始後不晚於30小時(例如在步驟(ii)開始後不晚於22、23、 24、25、26、27、28、29、或30小時)進行；或(c)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子係DNA分子。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子係RNA分子。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子在病毒載體(例如選自慢病毒載體、腺病毒載體、或逆轉錄病毒載體的病毒載體)上。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子在非病毒載體上。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子在質體上。在一些實施方式中，步驟(ii)中的核酸分子不在任何載體上。在一些實施方式中，步驟(ii)包括用一種或多種包含編碼該一種或多種CAR的核酸分子的病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體。

在一些實施方式中，從受試者的單採樣本(例如，白血球單採樣本)收集細胞(例如，T細胞)群體。

在一些實施方式中，從受試者收集的單採樣本(例如，白血球單採樣本)並作為冷凍樣本(例如，冷凍保存的樣本)運輸至細胞製造設施。然後解凍冷凍的單採樣本，並從單採樣本中選擇T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)，例如，使用細胞分選機(例如，CliniMACS^® Prodigy^®裝置)。然後使用本文所述之活化過程接種所選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)用於CART製造。在一些實施方式中，選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)在接種用於CART製造之前經歷一輪或多輪凍融。

在一些實施方式中，從受試者收集的單採樣本(例如，白血球單採樣本)並作為新鮮產品(例如，不冷凍的樣本)運輸至細胞製造設施。單採樣本中選擇T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)，例如，使用細胞分選機(例如，CliniMACS^® Prodigy^®裝置)。然後使用本文所述之活化過程接種所選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)用於CART製造。在一些實施方式中，選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)在接種用於CART製造之前經歷一輪或多輪凍融。

在一些實施方式中，從受試者收集單採樣本(例如，白血球單採樣本)。單採樣本中選擇T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)，例如，使用細胞分選機(例如，CliniMACS^® Prodigy^®裝置)。然後將選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)作為冷凍樣本(例如，冷凍保存的樣本)運輸至細胞製造設施。隨後解凍所選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)並使用本文所述之活化過程接種用於CART製造。

在一些實施方式中，使細胞(例如T細胞)與抗CD3和抗CD28抗體接觸例如12小時，然後用編碼CAR(例如一種或多種CAR)的載體(例如慢病毒載體)(例如一種或多種載體)轉導。培養開始後24小時，洗滌細胞，並配製用於儲存或投與。

不希望受理論束縛，簡短的CD3和CD28刺激可以促進自我更新T細胞的有效轉導。與傳統的CART製造方法相比，本文提供的活化過程不涉及延長的離體擴增。與細胞介素過程類似，本文提供的活化過程還在CART製造期間保留未分化的T細胞。

在一些實施方式中，使細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸。

在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑係刺激CD3的藥劑。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何組合的藥劑。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28的藥劑。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑係抗體。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑係抗-CD3抗體。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係抗體。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑係抗CD28抗體。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑或刺激共刺激分子的藥劑不包含珠。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD3抗體。在一些實施方式中，刺激共刺激分子的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD28抗體。在一些實施方式中，刺激CD3/TCR複合物的藥劑和刺激共刺激分子的藥劑包含T細胞TransAct^TM。

在一些實施方式中，該基質包含聚合物或由其組成，例如，可生物降解或生物相容的惰性材料，例如，其對細胞無毒。在一些實施方式中，該基質由親水性聚合物鏈組成，由於鏈的水合作用，其在水溶液中獲得最大的移動性。在一些實施方式中，移動基質可以是膠原蛋白、純化的蛋白質、純化的肽、多糖、糖胺聚糖或細胞外基質組成物。多糖可包括例如纖維素醚、澱粉、阿拉伯樹膠、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、透明質酸、果膠、黃原膠、瓜爾膠或海藻酸鹽。其他聚合物可包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚胺、聚乙烯亞胺、聚季銨鹽聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯啶酮、嵌段共聚物或聚胺酯。在一些實施方式中，移動基質係葡聚糖的聚合物。

在一些實施方式中，使該細胞群體與編碼CAR(例如一種或多種CAR)的核酸分子(例如一種或多種核酸分子)接觸。在一些實施方式中，將細胞群體用編碼CAR(例如一種或多種CAR)的DNA分子(例如一種或多種DNA分子)轉導。

在一些實施方式中，在兩種核酸分子(例如慢病毒載體)共轉導的情況下，該核酸分子各自編碼本文揭露的CAR(例如如本文揭露的，一種核酸分子編碼抗BCMA CAR，並且一種核酸分子編碼抗CD19 CAR)，可以按不同的感染複數(MOI)將包含編碼該CAR的核酸分子的每種載體添加至反應混合物(例如含有細胞群體)。

不希望受理論束縛，據信在一些實施方式中，針對包含編碼不同CAR分子的核酸分子的載體，使用不同的MOI可能會影響細胞群體的最終組成。例如，在編碼抗BCMA CAR的慢病毒載體和編碼抗CD19 CAR的慢病毒載體共轉導的情況下，可以將不同的MOI用於使單BCMA CART細胞和BCMA/CD19雙CART細胞的百分比最大化，同時導致更少的單CD19 CART細胞和未經轉導的細胞。

在一些實施方式中，在編碼抗BCMA CAR的慢病毒載體和編碼抗CD19 CAR的慢病毒載體共轉導的情況下，使細胞群體與如下感染複數(MOI)的該第一病毒載體接觸，該感染複數高於、等於或低於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI。在一些實施方式中，使該細胞群體與如下感染複數(MOI)的該第一病毒載體接觸，該感染複數高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI。

在一些實施方式中，使該細胞群體與第一MOI的該第一病毒載體接觸，並且與第二MOI的該第二病毒載體接觸，使得所得細胞群體包含第一細胞群體、第二細胞群體和第三細胞群體，該第一細胞群體包含抗BCMA CAR但不包含抗CD19 CAR，該第二細胞群體包含抗CD19 CAR但不包含抗BCMA CAR，該第三細胞群體包含抗BCMA CAR和該抗CD19 CAR二者，其中：

在一些實施方式中，使該細胞群體與一定MOI(例如該MOI足夠低於該細胞群體與該第一病毒載體接觸時的MOI)的該第二病毒載體接觸，使得在所得細胞群體中：

在一些實施方式中，使該細胞群體與第一MOI的該第一病毒載體接觸，並且使該細胞群體與第二MOI的該第二病毒載體接觸，使得所得細胞群體包含：

在一些實施方式中，使該細胞群體與以下各項接觸：

在一些實施方式中，使該細胞群體與MOI為約2.5至約5的該第一病毒載體接觸。在一些實施方式中，使該細胞群體與MOI為約0.5至約1.0的該第二病毒載體接觸。在一些實施方式中，該第一病毒載體處於如下MOI，該MOI高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI的約8至約10倍。在一些實施方式中，該第二病毒載體處於如下MOI，該MOI不超過該細胞群體與該第一病毒載體接觸時的MOI的1/X，其中X係6、8、10或12。

(a)MOI為約4和約5之間(例如約4.75)的該第一病毒載體；和/或

(b)MOI為約0.2和約1之間(例如約0.5)的該第二病毒載體。

可以基於許多因素(包括但不限於病毒載體批次的特性，有待轉導的細胞的特性以及轉導效率)來調整或確定針對每種載體所使用的精確MOI。在一些實施方式中，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸，同時使細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0.5小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於20小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於19小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於18小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於17小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於16小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於15小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於14小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於14小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於13小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於12小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於11小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於10小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於9小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於8小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於7小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於6小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於5小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於4小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於3小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於2小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於1小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於30分鐘，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸。

在一些實施方式中，收穫細胞群體用於儲存或投與。

在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於26小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於25小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於24小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於23小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸開始後不遲於22小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。

在一些實施方式中，細胞群體不是離體擴增的。

在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、或60%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過5%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過10%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過15%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過20%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過25%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過30%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過35%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激如上所述之細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過40%。

在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小時。

在一些實施方式中，該活化過程在無血清細胞培養基中進行。在一些實施方式中，該活化過程在包含一種或多種選自以下的細胞介素的細胞培養基中進行：IL-2、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)。在一些實施方式中，hetIL-15包含

(SEQ ID NO：309)的胺基酸序列。在一些實施方式中，hetIL-15包含與SEQ ID NO：309具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，該活化過程在包含LSD1抑制劑的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，該活化過程在包含MALT1抑制劑的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，無血清細胞培養基包含血清替代物。在一些實施方式中，該血清替代物係CTS^TM免疫細胞血清替代物(ICSR)。在一些實施方式中，ICSR的水平可以是例如高達5%，例如，約1%、2%、3%、4%或5%。不希望受理論束縛，使用細胞培養基(例如，表21或表25中所示的快速培養基(Rapid Media)，包含ICSR，例如2% ICSR)可以改善本文所述製造過程中的細胞活力。

在一些實施方式中，本揭露提供了製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如，T細胞)群體之方法，該方法包括：(a)提供從受試者收集的單採樣本(例如，新鮮或冷凍保存的白血球單採樣本)；(b)從單採樣本中選擇T細胞(例如，使用陰性選擇、陽性選擇或無珠選擇)；(c)將分離的T細胞接種，例如，1 x 10⁶至1 x 10⁷個細胞/mL；(d)使T細胞與刺激T細胞的藥劑接觸，例如，刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激細胞表面上的共刺激分子的藥劑(例如，使T細胞與抗CD3和/或抗CD28抗體接觸，例如，使T細胞與TransAct 接觸)；(e)使T細胞與編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子(例如DNA或RNA分子)接觸(例如使T細胞與包含編碼一種或多種CAR的一種或多種核酸分子接觸)例如6-48小時，如20-28小時；以及(f)洗滌和收穫T細胞用於儲存(例如，在冷凍保存培養基中重新配製T細胞)或投與。在一些實施方式中，步驟(f)在步驟(d)或(e)開始後不遲於30小時進行，例如，在步驟(d)或(e)開始後不遲於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時。

在一些實施方式中，本文提供了藉由本文所述之(例如本文所述之活化過程)任何製造過程製備的細胞群體(例如免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞)。

在一些實施方式中，在製造過程結束時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程結束時)細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，例如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞)的百分比，與製造過程開始時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程開始時)細胞群體中初始細胞(例如初始T細胞，例如CD45RA+ CD45RO- CCR7+細胞)的百分比相比，(1)相同，(2)相差例如不超過4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、或15%，或(3)增加例如至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、或25%。在一些實施方式中，與藉由除持續例如超過26小時(例如持續超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在體外擴增細胞群體例如超過3天(例如在體外擴增細胞群體3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他類似之方法製造的細胞相比，製造過程結束時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程結束時)的細胞群體顯示較高百分比的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞(例如，至少高5%、6%、7%、8%、 9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%)。

在一些實施方式中，在製造過程結束時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程結束時)細胞群體中初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T細胞的百分比不少於20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、或60%。

在一些實施方式中，在製造過程結束時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程結束時)細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，例如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比，與製造過程開始時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程開始時)細胞群體中的中樞記憶細胞(例如中樞記憶T細胞，例如CD95+中樞記憶T細胞)的百分比相比，(1)相同，(2)相差例如不超過4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、或15%，或(3)降低例如至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、或25%。在一些實施方式中，與藉由除持續例如超過26小時(例如持續超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在體外擴增細胞群體例如超過3天(例如，在體外擴增細胞群體3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他類似之方法製造的細胞相比，製造過程結束時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程結束時)的細胞群體顯示較低百分比的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CD95+中樞記憶T細胞(例如，至少低5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%)。

在一些實施方式中，在製造過程結束時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程結束時)細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T 細胞，例如CD95+中樞記憶T細胞的百分比不超過40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或80%。

在一些實施方式中，與藉由除持續例如超過26小時(例如持續超過5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在體外擴增細胞群體例如超過3天(例如，在體外擴增細胞群體3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他類似之方法製造的細胞相比，製造過程結束時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程結束時)的細胞群體在體內投與後持續更長時間或以更高水平上擴增(例如，至少高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%)。

在一些實施方式中，在製造過程開始前(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程開始前)，已經富集了用於表現IL6R的細胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ陽性的細胞)的細胞群體。在一些實施方式中，在製造過程開始時(例如，在細胞介素過程或本文所述之活化過程開始時)，細胞群體包括例如不少於30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或80%的表現IL6R的細胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ陽性的細胞)。

細胞介素過程

在一些實施方式中，本揭露提供了製備細胞(例如T細胞)群體之方法，該細胞群體表現嵌合抗原受體(CAR)(例如一種或多種CAR，例如兩種CAR)，該方法包括：(1)使細胞群體與細胞介素(選自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6、或其組合)接觸；(2)使該細胞(例如T細胞)群體與編碼CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體；和(3)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製細胞群體)或投與，其中：(a)步驟(2)與步驟(1)一起進行，或在步驟(1)開始後不晚於5小時(例如，在步驟(1)開始後不晚於1、 2、3、4、或5小時)進行，並且步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於26小時(例如，在步驟(1)開始後不晚於22、23、或24小時，例如，在步驟(1)開始後不晚於24小時)進行；或(b)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%(例如，不超過10%)。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子係DNA分子。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子係RNA分子。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子在病毒載體(例如選自慢病毒載體、腺病毒載體、或逆轉錄病毒載體的病毒載體)上。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子在非病毒載體上。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子在質體上。在一些實施方式中，步驟(2)中的核酸分子不在任何載體上。在一些實施方式中，步驟(2)包括用病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該病毒載體包含編碼該一種或多種CAR的一種或多種核酸分子。在一些實施方式中，將該細胞工程化以包含編碼本文揭露的兩種CAR(例如本文揭露的抗BCMA CAR和抗CD19 CAR)的核酸分子。在一些實施方式中，將該細胞工程化以包含核酸分子，該核酸分子編碼本文揭露的雙抗體CAR，例如本文揭露的抗BCMA/抗CD19雙抗體CAR。在一些實施方式中，將該細胞工程化以包含兩種核酸分子，該核酸分子各自編碼本文揭露的CAR(例如一種核酸分子編碼抗BCMA CAR，並且一種核酸分子編碼抗CD19 CAR)。

在一些實施方式中，從受試者收集的單採樣本(例如，白血球單採樣本)並作為冷凍樣本(例如，冷凍保存的樣本)運輸至細胞製造設施。然後解凍冷凍的單採樣本，並從單採樣本中選擇T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)，例如，使用細胞分選機(例如，CliniMACS^® Prodigy^®裝置)。然後使用本文所述之細胞介素過程接種所選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)用於CART製造。在一些實施方式中，在細胞介素過程結束時，將CAR T細胞冷凍保存，然後解凍並投與受試者。在一些實施方式中，選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)在接種用於CART製造之前經歷一輪或多輪凍融。

在一些實施方式中，從受試者收集的單採樣本(例如，白血球單採樣本)並作為新鮮產品(例如，不冷凍的樣本)運輸至細胞製造設施。單採樣本中選擇T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)，例如，使用細胞分選機(例如，CliniMACS^® Prodigy^®裝置)。然後使用本文所述之細胞介素過程接種所選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)用於CART製造。在一些實施方式中，選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)在接種用於CART製造之前經歷一輪或多輪凍融。

在一些實施方式中，從受試者收集單採樣本(例如，白血球單採樣本)。單採樣本中選擇T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)，例如，使用細胞分選機(例如，CliniMACS^® Prodigy^®裝置)。然後將選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)作為冷凍樣本(例如，冷凍保存的樣本)運輸至細胞製造設施。隨後解凍所選擇的T細胞(例如，CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)並使用本文所述之細胞介素過程接種用於CART製造。

在一些實施方式中，在細胞(例如T細胞)接種後，將一種或多種細胞介素(例如選自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21或IL-6(例如IL-6/sIL-6R)中的一種或多種細胞介素)以及編碼CAR(例如一種或多種CAR)的載體(例如慢病毒載體)(例如一種或多種載體)添加至細胞中。孵育20-24小時後，洗滌細胞，並配製用於儲存或投與。

與傳統的CART製造方法不同，本文提供的細胞介素過程不涉及CD3和/或CD28刺激或離體T細胞擴增。與抗CD3和抗CD28抗體接觸並且在體外廣泛擴增的T細胞傾向於顯示向中樞記憶表型的分化。不希望受理論束縛，本文提供的細胞介素過程在CART製造期間保留或增加T細胞的未分化表型，產生可在輸注入至受試者後持續更長時間的CART產物。

在一些實施方式中，使細胞群體與一種或多種細胞介素接觸(例如，一種或多種選自IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)的細胞介素)。

在一些實施方式中，使細胞群體與IL-2接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-7接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-21接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-2和IL-7接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-2和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-2和IL-21接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-2和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-7和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-7和IL-21接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-7和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-21和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、和 IL-21接觸。在一些實施方式中，使細胞群體進一步與LSD1抑制劑接觸。在一些實施方式中，使細胞群體進一步與MALT1抑制劑接觸。

在一些實施方式中，使細胞群體與20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300U/ml的IL-2接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-7接觸。在一些實施方式中，使細胞群體與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-15接觸。

在一些實施方式中，使細胞群體與編碼CAR(例如一種或多種CAR)的核酸分子(例如一種或多種核酸分子)接觸。在一些實施方式中，將細胞群體用編碼CAR(例如一種或多種CAR)的DNA分子(例如一種或多種DNA分子)轉導。

在一些實施方式中，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的核酸分子的接觸同時使細胞群體與以上所述之一種或多種細胞介素的接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於5小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的核酸分子接觸。在一些實施方式中，在該細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於4小時，使該細胞群體與編碼CAR的核酸分子接觸。在一些實施方式中，在該細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於3小時，使該細胞群體與編碼CAR的核酸分子接觸。在一些實施方式中，在該細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於2小時，使該細胞群體與編碼CAR的核酸分子接觸。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於1小時，使細胞群體與編碼一種或多種CAR的核酸分子接觸。

在一些實施方式中，收穫細胞群體用於儲存或投與。

在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於26小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於25小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於24小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於23小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。在一些實施方式中，在細胞群體與上述一種或多種細胞介素接觸開始後不遲於22小時，收穫細胞群體用於儲存或投與。

在一些實施方式中，細胞群體不是離體擴增的。

在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、或60%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過5%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過 10%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過15%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過20%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過25%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過30%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過35%。在一些實施方式中，例如如藉由活細胞數目進行評估，與在細胞群體與一種或多種如上所述之細胞介素接觸之前的細胞群體相比，細胞群體擴增不超過40%。

在一些實施方式中，細胞群體在體外不與刺激CD3/TCR複合物的藥劑(例如抗CD3抗體)和/或刺激細胞表面上的共刺激分子的藥劑(例如抗CD28抗體)接觸，或如果進行接觸，接觸步驟少於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5小時。

在一些實施方式中，細胞群體在體外與刺激CD3/TCR複合物的藥劑(例如抗CD3抗體)和/或刺激細胞表面上的共刺激分子的藥劑(例如抗CD28抗體)接觸20、21、22、23、24、25、26、27、或28小時。

在一些實施方式中，與藉由除進一步包括使細胞群體與例如結合CD3/TCR複合物的試劑(例如，抗CD3抗體)和/或結合細胞表面上的共刺激分子的試劑(例如，抗CD28抗體)接觸外其他類似之方法製備的細胞相比，使用本文提供的細胞介素過程製造的細胞群體顯示在表現CAR的細胞中較高百分比的初始細胞(例如，至少高5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、或60%)。

在一些實施方式中，本文提供的這種細胞介素過程在包含不超過0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、或8%血清的細胞培養基中進行。在一些實施方式中，本文提供的這種細胞介素過程在包含LSD1抑制劑、MALT1抑制劑或其組合的細胞培養基中進行。

另外的示例性製造方法

在一些實施方式中，例如使用塗覆Dynabeads^®的抗CD3/抗CD28抗體將細胞(例如T細胞或NK細胞)活化，使該細胞與一種或多種編碼CAR(例如一種或多種CAR)的核酸分子接觸，並然後在體外擴增例如7、8、9、10或11天。在一些實施方式中，從新鮮的或冷凍保存的白血球單採樣本中選擇(例如使用陽性或陰性選擇)該細胞(例如T細胞或NK細胞)。在一些實施方式中，使該細胞與編碼CAR(例如一種或多種CAR)的核酸分子(例如一種或多種核酸分子)接觸。在一些實施方式中，使該細胞與編碼本文揭露的的兩種CAR(例如抗BCMA CAR和抗CD19 CAR)的核酸分子接觸。在一些實施方式中，使該細胞與兩種核酸分子接觸，一種核酸分子表現第一CAR(例如抗BCMA CAR)，並且另一種核酸分子表現第二CAR(例如抗CD19 CAR)。在一些實施方式中，使該細胞與編碼雙抗體CAR(例如本文揭露的抗BCMA/抗CD19雙抗體CAR)的核酸分子接觸。

淘洗

在一些實施方式中，本文描述之方法的特徵在於淘洗方法，其去除不需要的細胞，例如單核細胞和胚細胞，從而導致適合CAR表現的所需免疫效應細胞的富集改進。在一些實施方式中，本文所述之淘洗方法針對從先前冷凍的樣本(例如，解凍的樣本)富集適合CAR表現的所希望的免疫效應細胞進行了優化。在一些實施方式中，與從本領域已知的淘洗方案收集的細胞製劑相比，本文所述之淘洗方法提供了具有改進的純度的細胞製劑。在一些實施方式中，本文所述之淘洗方法包括使用起始樣本(例如，細胞樣本，例如，解凍的細胞樣本)優化的黏度，藉由用某些等滲溶液(例如，PBS)稀釋，並使用流速的優化組合並藉由淘洗裝置收集的每個級分的收集體積。可應用於本發明的示例性淘洗方法描述於WO 2017/117112的第48-51頁，其藉由引用整體併入本文。

密度梯度離心

過繼性細胞治療產品的製造需要使所希望的細胞(例如，免疫效應細胞)遠離外周血單採起始材料中存在的血細胞和血液成分的複雜混合物。藉由Ficoll溶液使用密度梯度離心成功分離了外周血來源的淋巴細胞樣本。然而，Ficoll不是用於分離治療用細胞的較佳的試劑，因為Ficoll不適合臨床使用。此外，Ficoll含有乙二醇，它對細胞有潛在毒性。此外，冷凍保存後解凍的單採產物的Ficoll密度梯度離心產生次優的T細胞產物，例如，如本文實例中所述。例如，在藉由Ficoll溶液的密度梯度離心分離的細胞製劑中觀察到最終產物中T細胞的損失，伴隨非T細胞的相對增加，特別是不希望的B細胞、胚細胞和單核細胞。

不希望受理論束縛，據信免疫效應細胞(例如T細胞)在冷凍保存期間脫水，變得比新鮮細胞更稠密。不希望受理論束縛，還據信免疫效應細胞(例如T細胞)比其他血細胞保持密集更久，因此與其他細胞相比，在Ficoll密度梯度分離期間更容易丟失。因此，不希望受理論束縛，與Ficoll或具有與Ficoll相同密度(例如，1.077g/mL)的其他培養基相比，認為密度大於Ficoll的培養基提供了所希望的免疫效應細胞的改進的分離。

在一些實施方式中，本文所述之密度梯度離心方法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度培養基。在一些實施方式中，密度梯度培養基包含約60%的碘克沙醇於水中的溶液。

在一些實施方式中，本文所述之密度梯度離心方法包括使用具有密度大於Ficoll的密度梯度培養基。在一些實施方式中，本文所述之密度梯度離心方法包括使用密度梯度培養基，其具有大於1.077g/mL，例如，大於1.077g/mL、大於1.1g/mL、大於1.15g/mL、大於1.2g/mL、大於1.25g/mL、大於1.3g/mL、大於1.31g/mL的密度。在一些實施方式中，該密度梯度培養基具有約1.32g/mL的密度。

密度梯度離心的另外的實施方式描述於WO 2017/117112的第51-53頁，其藉由引用整體併入本文。

藉由選擇富集

本文提供了選擇特定細胞以改進適合CAR表現的所希望的免疫效應細胞富集之方法。在一些實施方式中，選擇包括陽性選擇，例如，選擇所需的免疫效應細胞。在一些實施方式中，該選擇包括陰性選擇，例如，選擇不需要的細胞，例如，去除不需要的細胞。在實施方式中，本文所述之陽性或陰性選擇方法在流動條件下進行，例如，藉由使用流通裝置，例如本文所述之流通裝置。示例性的陽性和陰性選擇描述於WO 2017/117112的第53-57頁，其藉由引用整體併入本文。選擇方法可以在流動條件下進行，例如，藉由使用流通裝置，也稱為細胞加工系統，以進一步富集所希望的免疫效應細胞(例如，適合用於CAR表現的T細胞)的細胞製劑。示例性的流通裝置描述於WO 2017/117112的第57-70頁，其藉由引用整體併入本文。示例性細胞分離和去珠方法描述於WO 2017/117112的第70-78頁，其藉由引用整體併入本文。

選擇程序不限於WO 2017/117112的第57-70頁所述之程序。可以使用經由CD19、CD14和CD26 Miltenyi珠與柱技術(CliniMACS^® Plus或CliniMACS^® Prodigy^®)組合去除不需要的細胞進行陰性T細胞選擇，或可以使用CD4和CD8 Miltenyi珠與柱技術的組合進行陽性T細胞選擇(CliniMACS^® Plus或CliniMACS^® Prodigy^®)。可替代地，可以使用具有可釋放CD3珠的無柱技術(GE醫療集團(GE Healthcare))。

此外，還可以使用諸如ThermoGenesis X系列裝置的無珠技術。

臨床應用

本文的所有過程均可根據臨床優質生產規範(cGMP)標準進行。

該過程可用於細胞純化、富集、收穫、洗滌、濃縮或用於細胞培養基交換，特別是在製造過程開始時以及製造過程中收集原始起始原料(具體是細胞)用於選擇或擴增用於細胞療法的細胞。

該細胞可包括任意多個細胞。該細胞可以是相同的細胞類型，或混合的細胞類型。此外，該細胞可以來自一個供體，例如用於細胞療法的自體供體或單個異體供體。可以藉由例如白血球單採或單採從患者獲得細胞。該細胞可以包括T細胞，例如可以包括具有大於50% T細胞、大於60% T細胞、大於70% T細胞、大於80% T細胞、或90% T細胞的群體。

選擇過程在培養和擴增前選擇細胞時特別有用。例如，用抗CD3和/或抗CD28塗覆的順磁性顆粒可用於選擇T細胞用於擴增或用於引入編碼嵌合抗原受體(CAR)或其他蛋白質的核酸。此類過程用於產生CTL019 T細胞用於治療急性淋巴細胞性白血病(ALL)。

本文揭露的去珠過程和模組可特別用於製造用於細胞療法的細胞，例如在培養和擴增之前或之後純化細胞。例如，塗覆有抗CD3和/或抗CD28抗體的順磁性顆粒可用於選擇性擴增T細胞，例如藉由引入編碼嵌合抗原受體的核酸(CAR)或其他蛋白質被修飾的或將要被修飾的T細胞，使得CAR由T細胞表現。在製造此類T細胞期間，可以使用去珠過程或模組將T細胞與順磁性顆粒分離。這種去珠過程或模組用於產生例如用於治療急性淋巴細胞性白血病(ALL)的CTL019 T細胞。

在這裡舉例說明的一個此類過程中，經由單採(例如，白血球單採)從供體(例如，用自體嵌合抗原受體T細胞產物治療的患者)收集細胞(例如T細胞)。然後可以視需要純化收集的細胞，例如，藉由淘洗步驟、或經由靶細胞(例如，T細胞)的陽性或陰性選擇。然後可以將順磁性顆粒，例如抗CD3/抗CD28塗覆的順磁顆粒添加到細胞群體中，以擴增T細胞。該過程還可包括轉導步驟，其中將編碼一種或多種所希望的蛋白質的核酸，例如CAR，例如靶向CD19的CAR，引入細胞中。可以將核酸引入慢病毒載體中。然後可以將細胞(例如，慢病毒轉導的細胞)擴增數天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天，例如在合適的培養基存在下。在擴增之後，本文揭露的去珠過程/模組可用於將所希望的T細胞與順磁性顆粒分離。該過程可包括根據本揭露的過程的一個或多個去珠步驟。然後可以配製去珠細胞用於投與給患者。CAR T細胞的實例及其製造進一步描述於例如WO 2012/079000中，其藉由引用整體併入本文。本揭露的系統和方法可以用於WO 2012/079000中描述的或與WO 2012/079000相關的任何細胞分離/純化/去珠過程。另外的CAR T製造過程描述於例如WO 2016109410和WO 2017117112中，其藉由引用整體併入本文。

與常規系統和方法相比，本文的系統和方法可以類似地有益於其他細胞療法產品，其浪費較少的所希望的細胞，引起較少的細胞損傷，並且更可靠地從細胞中去除磁性和任何非順磁性顆粒，且較少的暴露於化學藥劑或不暴露。

儘管上文僅具體描述了本揭露的示例性實施方式，但是應當理解，在不脫離本揭露的精神和預期範圍的情況下，該等示例的修改和變化係可能的。例如，除了所描述的那些之外，磁性模組和包含它們的系統可以以各種配置來佈置和使用。此外，也可以使用非磁性模組。此外，該系統和方法可以包括未在本文具體描述的另外的元件和步驟。例如，方法可以包括預注，其中首先將流體引入組件中以去除氣泡並降低對細胞懸浮液或緩衝液移動的阻力。此外，實施方式可以僅包括本文描述的系統的一部分以與本文所述之方法一起使用。例如，實施方式可涉及可在非一次性設備中使用的一次性模組、軟管等，以形成能夠分離或去珠細胞以產生細胞產物的完整系統。

在本領域中已經描述了可以與本發明結合的另外的製造方法和過程。例如，WO 2017/117112的第86-91頁描述了改進的洗滌步驟和改進的製造過程。

免疫效應細胞的來源

該部分提供了另外之方法或步驟，用於獲得包含所希望的免疫效應細胞的輸入樣本；分離和加工所希望的免疫效應細胞(例如T細胞)；並去除不需要的物質(例如不需要的細胞)。可以將在該部分中描述的另外之方法或步驟與以下各項中的任何一種組合使用：淘洗、密度梯度離心、流動條件下的選擇、或在前述部分中描述的經改進的洗滌步驟。

可以從受試者中獲得細胞(例如T細胞或天然殺傷(NK)細胞)來源。受試者的實例包括人、猴、黑猩猩、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。T細胞可以從許多來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸膜積液、脾組織、和腫瘤。

在本揭露的一些實施方式中，可以使用任何數量的熟悉該項技術者已知的技術，和本文揭露的任何方法，按其步驟的任何組合，從自受試者收集的血液單位獲得免疫效應細胞(例如T細胞)。在一些實施方式中，藉由單採獲得來自個體的循環血液的細胞。單採產物典型地含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白血球、紅血球、和血小板。在一些實施方式中，可以洗滌藉由單採收集的細胞以去除血漿部分，並且視需要將細胞置於適當的緩衝液或培養基中用於後續加工步驟。在一些實施方式中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些實施方式中，洗滌溶液缺少鈣並且可能缺少鎂，或者可能缺少許多(如果不是全部)二價陽離子。在一些實施方式中，使用本文所述之經改進的洗滌步驟洗滌細胞。

在不存在鈣的情況下的初始活化步驟可以導致放大的活化。如熟悉該項技術者將容易理解的，洗滌步驟可以藉由熟悉該項技術者已知之方法完成，如藉由根據製造商的說明使用半自動「流通」離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate^TM、或血液細胞回收儀(Haemonetics Cell Saver)5)、高級血液細胞回收儀(Haemonetics Cell Saver Elite)(通用電氣醫療集團賽分科技(GE Healthcare Sepax)或賽菲爾公司(Sefia))、或利用旋轉膜過濾技術的裝置(費森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi)LOVO)。在洗滌後，可以將細胞重懸於多種生物相容性緩衝液中，例如像無Ca、無Mg的PBS、PlasmaLyte A、補充有人血清白蛋白(HSA)的PBS-EDTA、或含有或不含緩衝液的其他鹽溶液。可替代地，可以除去單採樣本中不希望的組分，並將細胞直接重懸於培養基中。

在一些實施方式中，藉由例如藉由PERCOLL^TM梯度離心或藉由逆流離心淘洗來裂解紅血球和耗減單核細胞，從外周血淋巴細胞中分離所希望的免疫效應細胞(例如T細胞)。

本文所述之方法可以包括例如使用例如(如本文所述之)陰性選擇技術選擇免疫效應細胞(例如T細胞)的特定亞群，該亞群係T調節性細胞耗減的細胞(例如CD25+耗減的細胞或CD25 ^高耗減的細胞)群體。在一些實施方式中，T調節性細胞耗減的細胞群體包含少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%的CD25+細胞或CD25 ^高細胞。

在一些實施方式中，使用抗CD25抗體或其片段，或CD25結合配位基(例如IL-2)，從該群體中去除T調節性細胞(例如CD25+ T細胞或CD25 ^高 T細胞)。在一些實施方式中，將抗CD25抗體或其片段或CD25結合配位基與底物(例如珠)軛合，或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一些實施方式中，抗CD25抗體或其片段與本文所述之底物軛合。

在一些實施方式中，使用來自Miltenyi^TM的CD25耗減試劑從該群體中去除T調節性細胞(例如CD25+ T細胞或CD25 ^高 T細胞)。在一些實施方式中，細胞與CD25耗減試劑的比率係1e7個細胞至20μL、或1e7個細胞至15μL、或1e7個細胞至10μL、或1e7個細胞至5μL、或1e7個細胞至2.5μL、或1e7個細胞至1.25μL。在一些實施方式中，例如對於T調節性細胞，使用大於5億個細胞/ml。在一些實施方式中，使用6億、7億、8億、或9億個細胞/ml的細胞濃度。

在一些實施方式中，有待耗減的免疫效應細胞群體包括約6 x 10⁹個CD25+ T細胞。在一些實施方式中，有待耗減的免疫效應細胞群體包括約1 x 10⁹至1 x 10¹⁰個CD25+ T細胞，以及其間的任何整數值。在一些實施方式中，所得T調節性細胞耗減的細胞群體具有2 x 10⁹個T調節性細胞，例如CD25+細胞或CD25 ^高細胞，或更少(例如1 x 10⁹、5 x 10⁸、1 x 10⁸、5 x 10⁷、1 x 10⁷個、或更少的T調節性細胞)。

在一些實施方式中，使用具有耗減管組(例如像管162-01)的CliniMAC系統從該群體中去除T調節性細胞(例如CD25+細胞或CD25 ^高細胞)。在一些實施方式中，將CliniMAC系統在耗減設置(例如像耗減2.1)上運行。

不希望受特定理論的束縛，在單採之前或在製造表現CAR的細胞產物期間降低受試者中免疫細胞的陰性調節劑水平(例如，減少不需要的免疫細胞(例如Treg細胞)的數量)可以顯著降低受試者復發的風險。例如，耗減Treg細胞之方法係本領域已知的。減少Treg細胞之方法包括但不限於，環磷醯胺、抗GITR抗體(本文所述之抗GITR抗體)、CD25-耗減、及其組合。

在一些實施方式中，製造方法包括在製造表現CAR的細胞之前降低(例如，耗減)Treg細胞的數量。例如，製造方法包括使樣本(例如單採樣本)與抗GITR抗體和/或抗CD25抗體(或其片段、或CD25結合配位基)接觸，例如以在製造表現CAR的細胞(例如T細胞、NK細胞)產物之前耗減Treg細胞。

不希望受特定理論的束縛，在單之前或在製造表現CAR的細胞產物期間降低受試者中免疫細胞的陰性調節劑水平(例如，減少不需要的免疫細胞(例如Treg細胞)的數量)可以降低受試者復發的風險。在一些實施方式中，在收集用於表現CAR的細胞產物製造的細胞之前，用一種或多種減少Treg細胞的療法預先治療受試者，從而降低受試者對表現CAR的細胞治療復發的風險。在一些實施方式中，減少Treg細胞之方法包括但不限於，向受試者投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗減、或其組合中的一種或多種。在一些實施方式中，減少Treg細胞之方法包括但不限於，向受試者投與環磷醯胺、抗GITR 抗體、CD25耗減、或其組合中的一種或多種。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗減、或其組合中的一種或多種可以在輸注表現CAR的細胞產物之前、期間或之後發生。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗減、或其組合中的一種或多種可以在輸注表現CAR的細胞產物之前、期間或之後發生。

在一些實施方式中，在收集用於表現CAR的細胞產物製造的細胞之前，用環磷醯胺預先治療受試者，從而降低受試者對表現CAR的細胞治療(例如CTL019治療)復發的風險。在一些實施方式中，在收集用於表現CAR的細胞(例如T細胞或NK細胞)產物製造的細胞之前，用抗GITR抗體預先治療受試者，從而降低受試者對表現CAR的細胞治療復發的風險。

在一些實施方式中，在製造表現CAR的細胞(例如T細胞、NK細胞)產物(例如CTL019產物)之前，修飾表現CAR的細胞(例如T細胞、NK細胞)製造過程以耗減Treg細胞。在一些實施方式中，在製造表現CAR的細胞(例如T細胞、NK細胞)產物(例如CTL019產物)之前，將CD25耗減用於耗減Treg細胞。

在一些實施方式中，有待去除的細胞群體既不是調節性T細胞或腫瘤細胞，也不是以其他方式對CART細胞的擴增和/或功能產生負面影響的細胞(例如表現CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潛在免疫抑制細胞表現的其他標誌物的細胞)。在一些實施方式中，設想將此類細胞與調節性T細胞和/或腫瘤細胞並行去除，或在該耗減之後，或以另一種順序去除。

本文所述之方法可以包括多餘一個的選擇步驟，例如多餘一個的耗減步驟。可以例如用針對陰性選擇的細胞特有的表面標誌物的抗體組合來完成藉由陰性選擇富集T細胞群體。一種方法係藉由負磁性免疫吸附或流動式細胞測量術進行細胞分選和/或選擇，該負磁性免疫吸附或流動式細胞測量術使用針對存在於陰性選擇的細胞上的細胞表面標誌物的單株抗體的混合物。例如，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物可以包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗體。

本文所述之方法可以進一步包括從表現腫瘤抗原(例如不包含CD25的腫瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群體中去除細胞，從而提供T調節性細胞耗減的(例如CD25+耗減的或CD25 ^高耗減的)和腫瘤抗原耗減的細胞群體，該細胞群體適於表現CAR(例如本文所述之CAR)。在一些實施方式中，將腫瘤抗原表現細胞與T調節(例如CD25+細胞或CD25 ^高細胞)同時去除。例如，抗CD25抗體或其片段以及抗腫瘤抗原抗體或其片段可以附接至可以用於去除細胞的同一底物(例如，珠)上；或者抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可以附接至其混合物可以用於去除細胞的分開的珠上。在其他實施方式中，T調節性細胞(例如CD25+細胞或CD25 ^高細胞)的去除和腫瘤抗原表現細胞的去除係連續的，並且可以例如以任何順序發生。

還提供了包括以下之方法：從表現檢查點抑制劑(例如本文所述之檢查點抑制劑)的群體中去除細胞(例如PD1+細胞、LAG3+細胞、和TIM3+細胞中的一種或多種)，從而提供T調節性細胞耗減的(例如CD25+耗減的)細胞和檢查點抑制劑耗減的細胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗減的細胞)群體。例如，如本文所述示例性檢查點抑制劑包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、 VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、和TGF(例如TGF β)。在一些實施方式中，將檢查點抑制劑表現細胞與T調節性細胞(例如CD25+細胞或CD25 ^高細胞)同時去除。例如，抗CD25抗體或其片段、和抗檢查點抑制劑抗體或其片段可以附接至可以用於除去細胞或抗CD25抗體或其片段、和抗檢查點抑制劑抗體或其片段的同一珠，可以附接至分開的珠(其混合物可以用於除去細胞)。在其他實施方式中，T調節性細胞(例如CD25+細胞或CD25 ^高細胞)的去除和表現檢查點抑制劑的細胞的去除係連續的，並且可以例如以任何順序發生。

本文描述之方法可以包括陽性選擇步驟。例如可以藉由與抗CD3/抗CD28(例如3x28)-軛合的珠(例如Dynabeads^® M-450 CD3/CD28 T)孵育持續足以陽性選擇所希望的T細胞的時間段來分離T細胞。在一些實施方式中，該時間段係約30分鐘。在一些實施方式中，該時間段的範圍為從30分鐘至36小時或更長以及其間的所有整數值。在一些實施方式中，該時間段係至少1、2、3、4、5、或6小時。在一些實施方式中，該時間段係10至24小時，例如24小時。與其他細胞類型相比，在存在較少T細胞的任何情況下，如從腫瘤組織或免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，可以使用更長的孵育時間來分離T細胞。此外，使用更長的孵育時間可以提高CD8+ T細胞捕獲的效率。因此，藉由簡單地縮短或延長使T細胞與CD3/CD28珠結合的時間和/或藉由增加或減少珠與T細胞的比率(如本文進一步描述的)，可以在培養起始時或在該過程期間的其他時間點優先地選擇或針對T細胞亞群。另外，藉由增加或減少抗CD3和/或抗CD28抗體在珠或其他表面上的比率，可以在培養起始時或在其他所希望的時間點優先地選擇或針對T細胞亞群。

在一些實施方式中，可以選擇表現以下中的一種或多種的T細胞群體：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B、和穿孔素、或其他適當的分子(例如其他細胞介素)。用於篩選細胞表現之方法可以例如藉由PCT公開案號：WO 2013/126712中。

為了藉由陽性或陰性選擇分離所希望的細胞群體，可以改變細胞和表面(例如顆粒，如珠)的濃度。在一些實施方式中，可能希望顯著減小其中珠和細胞混合在一起的體積(例如，增加細胞的濃度)以確保細胞和珠的最大接觸。例如在一些實施方式中，使用100億個細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml或50億/ml的濃度。在一些實施方式中，使用10億個細胞/ml的濃度。在一些實施方式中，使用7500萬、8000萬、8500萬、9000萬、9500萬、或1億個細胞/ml的細胞濃度。在一些實施方式中，可以使用1.25或1.5億個細胞/ml的濃度。

使用高濃度可以導致細胞產量增加、細胞活化、和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效地捕獲可能弱表現目的靶抗原的細胞(如CD28陰性T細胞)，或來自存在許多腫瘤細胞的樣本(例如白血病的血、腫瘤組織等)的細胞。此類細胞群體可能具有治療價值，並且是希望獲得的。例如，使用高濃度的細胞允許更有效地選擇通常具有較弱CD28表現的CD8+T細胞。

在一些實施方式中，可能希望使用較低的細胞濃度。藉由顯著稀釋T細胞和表面的混合物(例如顆粒，如珠)，使顆粒與細胞之間的相互作用最小化。這選擇了表現大量有待結合顆粒的所希望抗原的細胞。例如，CD4+ T細胞表現較高水平的CD28，並且在稀釋濃度下比CD8+ T細胞更有效地捕獲。在一些實施方式中，所使用的細胞濃度係5 x 10⁶/ml。在一些實施方式中，所使用的濃度可以是從約1 x 10⁵/ml至1 x 10⁶/ml，以及其間的任何整數值。

在一些實施方式中，可以將該等細胞在旋轉器上以不同的速度在2℃-10℃或室溫下孵育不同的時間長度。

在一些實施方式中，群體的多個免疫效應細胞不表現甘油二酯激酶(DGK)，例如是DGK缺陷型。在一些實施方式中，群體的多個免疫效應細胞不表現Ikaros(例如是Ikaros缺陷型)。在一些實施方式中，群體的多個免疫效應細胞不表現DGK和Ikaros，例如是DGK和Ikaros缺陷型。

用於刺激的T細胞也可以在洗滌步驟後冷凍。不希望受理論束縛，冷凍和隨後的解凍步驟藉由在細胞群體中去除粒細胞及在一定程度上去除單核細胞提供更均勻的產物。在除去血漿和血小板的洗滌步驟之後，可以將細胞懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數係本領域已知的並且在這種情況下將是有用的，但一種方法涉及使用含有20% DMSO和8%人血清白蛋白的PBS，或含有10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5% DMSO的培養基，或含有31.25% Plasmalyte-A、31.25%葡萄糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5% DMSO的培養基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他適合的細胞冷凍培養基，然後將細胞以每分鐘1°的速率冷凍至-80℃並儲存在液氮儲罐的氣相中。可以使用其他控制冷凍之方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷凍。

在一些實施方式中，如本文所述將冷凍保存的細胞解凍和洗滌，並允許在使用本發明之方法活化之前在室溫靜置1小時。

在本發明的上下文中還考慮了在可能需要如本文描述的擴增細胞之前的時間段從受試者收集血液樣本或單採產物。因此，可以在任何必要的時間點收集待擴增細胞的來源，並且分離和冷凍所希望的細胞(如T細胞)以便後續用於免疫效應細胞療法中，以用於將受益於免疫效應細胞療法的任意數目的疾病或病症，如本文所述之那些。在一些實施方式中，血液樣本或單採取自基本健康的受試者。在一些實施方式中，血液樣本或單採取自基本健康的受試者，該受試者處於發展疾病的風險中，但尚未患發展疾病，並且將目的細胞分離並冷凍供以後使用。在一些實施方式中，T細胞可以擴增、冷凍，並在以後使用。在一些實施方式中，在診斷如本文描述的特定疾病之後但在任何治療之前不久從患者收集樣本。在一些實施方式中，在任何數量的相關治療方式之前，從受試者的血液樣本或單採分離細胞，該等相關治療方式包括但不限於用以下進行治療：藥劑(如那他珠單抗(natalizumab)、依法珠單抗、抗病毒劑)、化療、放射、免疫抑制性劑(如環孢素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、黴酚酸酯、和FK506)、抗體或其他免疫清除劑(如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228)、和照射。

在本發明的一些實施方式中，在治療後直接從患者獲得T細胞使得受試者具有功能性T細胞。在這點上，已觀察到在某些癌症治療(特別是使用破壞免疫系統的藥物的治療)之後，在患者通常將從治療恢復期間治療後不久，所獲得的T細胞的品質因其離體擴增的能力可能是最佳或改善的。同樣地，在使用本文描述之方法進行離體操作之後，該等細胞可以處於較佳的狀態以增強植入和體內擴增。因此，在本發明的上下文中，預期在該恢復期期間收集血細胞，包括T細胞、樹突狀細胞或造血譜系的其他細胞。此外，在一些實施方式中，動員(例如用GM-CSF動員)和調整方案可以用於在受試者中產生病狀，其中特定細胞類型的再增殖、再循環、再生、和/或擴增係有利的，尤其是在治療後確定的時間窗口。例證性細胞類型包括免疫系統的T細胞、B細胞、樹突狀細胞、和其他細胞。

在一些實施方式中，表現CAR分子(例如本文所述之CAR分子)的免疫效應細胞獲自已接受低免疫增強劑量的mTOR抑制劑的受試者。在一些實施方式中，在足夠的時間後(或在足夠劑量的低免疫增強劑量的mTOR抑制劑後)收穫被工程化以表現CAR的免疫效應細胞(例如T細胞)的群體，使得受試者中或從受試者收穫的PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)的水平、或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)的比率已經至少係短暫的增加了。

在其他實施方式中，已經被或將被工程化以表現CAR的免疫效應細胞(例如T細胞)的群體可以藉由接觸一定量的mTOR抑制劑離體進行處理，該mTOR抑制劑增加PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)的數量或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)的比率。

應當認識到，本申請之方法可利用包含5%或更少(例如2%)的人AB血清的培養基條件，並使用已知的培養基條件和組成物，例如描述於以下的那些：Smith等人，「Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型無Xeno CTS^TM免疫細胞血清替代物進行過繼免疫治療的人T細胞的離體擴增]」Clinical & Translational Immunology[臨床和移植免疫學](2015)4,e31；doi：10.1038/cti.2014.31。

在一些實施方式中，本申請之方法可利用包含至少約0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、9%或10%血清的培養基條件。在一些實施方式中，該培養基包含約0.5%-5%、約0.5%-4.5%、約0.5%-4%、約0.5%-3.5%、約0.5%-3%、約0.5%-2.5%、約0.5%-2%、約0.5%-1.5%、約0.5%-1.0%、約1.0%-5%、約1.5%-5%、約2%-5%、約2.5%-5%、約3%-5%、約3.5%-5%、約4%-5%、或約4.5%-5%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約0.5%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約 0.5%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約1%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約1.5%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約2%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約2.5%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約3%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約3.5%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約4%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約4.5%血清。在一些實施方式中，該培養基包含約5%血清。在一些實施方式中，該血清包含人血清，例如人AB血清。在一些實施方式中，該血清係在收集後允許自然凝固的人血清，例如，非凝塊(OTC)血清。在一些實施方式中，該血清係血漿來源的血清人血清。血漿來源的血清可以藉由將在抗凝血劑(例如檸檬酸鈉)存在下收集的混合的人血漿脫纖維來產生。

在一些實施方式中，本申請之方法可利用包含無血清培養基的培養基條件。在一些實施方式中，無血清培養基係OpTmizer^TM CTS^TM(美國生達醫藥集團(LifeTech))、Immunocult^TM XF(幹細胞技術公司(Stemcell technologies))、CellGro^TM(CellGenix)、TexMacs^TM(美天旎公司(Miltenyi))、Stemline^TM(西格瑪公司(Sigma))、Xvivol5^TM(瑞士龍沙集團(Lonza))、PrimeXV^®(歐文科技公司(Irvine Scientific))、或StemXVivo^®(RandD系統)。無血清培養基可以補充有血清置換物，例如來自美國生達醫藥集團(LifeTech)的ICSR(免疫細胞血清替代物)。血清置換物(例如ICSR)的水平可以是例如高達5%、例如約1%、2%、3%、4%、或5%。在一些實施方式中，無血清培養基可補充有血清，例如人血清，例如人AB血清。在一些實施方式中，該血清係在收集後允許自然凝固的人血清，例如，非凝塊(OTC)血清。在一些實施方式中，該血清係血漿來源的人血清。血漿來源的血清可以藉由將在抗凝血劑(例如檸檬酸鈉)存在下收集的混合的人血漿脫纖維來產生。

在一些實施方式中，T細胞群體係甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質，或具有降低或抑制的DGK活性的細胞。DGK缺陷型細胞可以藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或預防DGK表現。可替代地，可以藉由用本文描述的DGK抑制劑處理產生DGK缺陷型細胞。

在一些實施方式中，T細胞群體係Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型細胞包括不表現Ikaros RNA、或蛋白質、或具有降低或抑制的Ikaros活性的細胞，Ikaros缺陷型細胞可以藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以減少或預防Ikaros表現。可替代地，可以藉由用Ikaros抑制劑(例如，來那度胺(lenalidomide))處理產生Ikaros缺陷型細胞。

在實施方式中，T細胞群體係DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表現DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以藉由本文描述的任何方法產生此類DGK和Ikaros缺陷型細胞。

在一些實施方式中，從受試者獲得NK細胞。在一些實施方式中，NK細胞係NK細胞系，例如NK-92細胞系(Conkwest公司)。

同種異體表現CAR的細胞

在本文所述之實施方式中，免疫效應細胞可以是同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。例如該細胞可以是同種異體T細胞，例如缺少功能性T細胞受體(TCR)和/或人白血球抗原(HLA)(例如HLA I類和/或HLA II類)表現的同種異體T細胞。

缺乏功能性TCR的T細胞可以例如被工程化以使其在其表面上不表現任何功能性TCR、工程化使得其不表現包含功能性TCR的一個或多個亞基(例如，工程化使得其不表現(或表現出降低的表現)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)、或工程化以使其在其表面上產生非常少的功能性 TCR。可替代地，T細胞可以例如藉由表現TCR的一個或多個亞基的突變或截短形式表現嚴重受損的TCR。術語「嚴重受損的TCR」意指該TCR將不在宿主中引發不利的免疫反應。

本文所述之T細胞可以例如被工程化，使得它在其表面上不表現功能性HLA。例如，本文所述之T細胞可以被工程化，使得細胞表面表現HLA(例如HLA 1類和/或HLA II類)下調。在一些實施方式中，可以藉由減少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表現來實現HLA的下調。

在一些實施方式中，T細胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I類和/或HLA II類)。

缺少功能性TCR和/或HLA表現的修飾的T細胞可以藉由任何適合的方式獲得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一個或多個亞基。例如，T細胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇的規則間隔短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)、或鋅指核酸內切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。

在一些實施方式中，同種異體細胞可以是例如藉由本文所述之任何方法不表現或以低水平表現抑制性分子的細胞。例如，該細胞可以是不表現或以低水平表現抑制性分子的細胞，該抑制性分子例如可以降低表現CAR的細胞產生免疫效應子應答的能力。抑制性分子的實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、和TGF(例如TGF β)。抑制性分子的抑制(例如藉由在DNA、RNA或蛋白質水平上的抑制)可以優化表現CAR的細胞的性能。在實施方式中，可以使用例如如本文所述之抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA(如siRNA或shRNA)、成簇的規則間隔短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)、或鋅指核酸內切酶(ZFN)。

抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA

在一些實施方式中，在細胞(例如T細胞)中，可以使用靶向編碼TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA，和/或本文所述之抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、和TGF β)來抑制TCR表現和/或HLA表現。

siRNA和shRNA的表現系統以及示例性shRNA描述於例如2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第649和650段中，該文獻藉由引用以其全文併入。

抑制TCR或HLA的CRISPR

如本文所用，「CRISPR」或「針對TCR和/或HLA的CRISPR」或「抑制TCR和/或HLA的CRISPR」係指一組成簇的規律間隔短回文重複序列，或包含這組重複序列的系統。如本文所用，「Cas」係指CRISPR相關蛋白。「CRISPR/Cas」系統係指源自CRISPR和Cas的系統，該系統可以用於在細胞(例如T細胞)中緘默或突變TCR和/或HLA基因，和/或本文所述之抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、和TGF β)。

CRISPR/Cas系統及其用途描述於例如2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第651-658段中，將其藉由引用以其全文併入。

抑制TCR和/或HLA的TALEN

「TALEN」或「針對HLA和/或TCR的TALEN」或「抑制HLA和/或TCR的TALEN」係指轉錄活化因子樣效應核酸酶，一種可以用於在細胞(例如T細胞)中編輯HLA和/或TCR基因和/或本文所述之抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、和TGF β)的人工核酸酶。

TALEN及其用途描述於例如2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第659-665段中，該文獻藉由引用以其全文併入。

抑制HLA和/或TCR的鋅指核酸酶

「ZFN」或「鋅指核酸酶」或「針對HLA和/或TCR的ZFN」或「抑制HLA和/或TCR的ZFN」係指鋅指核酸酶，一種可以用於在細胞(例如T細胞)中編輯HLA和/或TCR基因和/或本文所述之抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、和TGF β)的人工核酸酶。

ZFN及其用途描述於例如2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第666-671段中，該文獻藉由引用以其全文併入。

端粒酶表現

端粒在體細胞持久性中起關鍵作用，其長度由端粒酶(TERT)維持。CLL細胞中的端粒長度可能非常短(Roth等人，「Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia[患有ZAP-70+/CD38慢性淋巴球性白血病的患者T細胞中顯著更短的端粒]」British Journal of Haematology[英國血液學雜誌],143,383-386.,2008年8月28日)，並且在製造的表現CAR的細胞(例如CART19細胞)中可能甚至更短，限制了它們在過繼轉移至患者後其擴增的可能性。端粒酶表現可以從複製耗竭中拯救表現CAR的細胞。

儘管不希望受任何特定理論的束縛，但在一些實施方式中，由於T細胞中的端粒縮短，治療性T細胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因轉染可以延長T細胞的端粒並改善患者體內T細胞的持久性。參見Carl June,「Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic[臨床上用於癌症的過繼性T細胞療法]」，Journal of Clinical Investigation[臨床研究雜誌],117：1466-1476(2007)。因此，在一些實施方式中，免疫效應細胞(例如T細胞)異位表現端粒酶亞基(例如端粒酶的催化亞基，例如TERT，例如hTERT)。在一些實施方式中，本揭露內容提供了產生表現CAR的細胞之方法，該方法包括使細胞與編碼端粒酶亞基(例如端粒酶的催化亞基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接觸。可以使細胞在與編碼CAR的構建體接觸之前、同時或之後與該核酸接觸。

端粒酶表現可以是穩定的(例如，核酸可以整合到細胞的基因組中)或暫態的(例如，核酸不整合，並且表現在一段時間後降低，例如幾天)。藉由用編碼端粒酶亞基和選擇標誌物的DNA轉染或轉導細胞，並選擇穩定的整合子，可以實現穩定的表現。可替代地或組合地，例如使用Cre/Lox或FLP/FRT系統可以藉由位點特異性重組來完成穩定表現。

暫態表現可以涉及用核酸(例如DNA或RNA，如mRNA)轉染或轉導。在一些實施方式中，暫態mRNA轉染避免了有時與TERT穩定轉染相關聯的遺傳不穩定性。外源端粒酶活性的暫態表現描述於例如國際申請WO 2014/130909中，該申請藉由引用以其全文併入。在實施方式中，根據由現代化療法公司(Moderna Therapeutics)商業化的信使RNA Therapeutics^TM平臺進行端粒酶亞基的基於mRNA的轉染。例如，該方法可以是在美國專利案號8710200、8822663、8680069、8754062、8664194、或8680069中所述之方法。

在一些實施方式中，hTERT具有GenBank蛋白ID AAC51724.1的胺基酸序列(Meyerson等人，「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[推定的人端粒酶催化亞基基因hEST2在腫瘤細胞中且在永生化期間上調]」Cell[細胞]第90卷，第4期，1997年8月22日，第785-795頁)：

(SEQ ID NO：284)

在一些實施方式中，hTERT具有與SEQ ID NO：284的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的序列。在一些實施方式中，hTERT具有SEQ ID NO：284的序列。在一些實施方式中，hTERT在N-末端、C-末端、或兩者處包含缺失(例如不超過5、10、15、20、或30個胺基酸)。在一些實施方式中，hTERT在N-末端、C-末端、或兩者處包含轉基因胺基酸序列(例如不超過5、10、15、20、或30個胺基酸)。

在一些實施方式中，hTERT由GenBank登錄號AF018167的核酸序列編碼(Meyerson等人，「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亞基基因，在腫瘤細胞和永生化過程中上調]」Cell[細胞]第90卷，第4期，1997年8月22日，第785-795頁)。

免疫效應細胞(例如T細胞)的活化和擴增

藉由本文所述之方法產生或富集的免疫效應細胞(例如T細胞)通常可以使用如例如在美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美國專利申請公開案號20060121005中所述之方法來活化和擴增。

通常，免疫效應細胞群體可以藉由與表面接觸而擴增，該表面附接有刺激CD3/TCR複合物相關的訊號的藥劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配位基。具體地，可以如本文所描述刺激T細胞群體，如藉由與固定在表面上的抗CD3抗體或其抗原結合片段、或抗CD2抗體接觸，或藉由與結合有鈣離子載體的蛋白激酶C活化因子(例如苔蘚抑素)接觸。對於T細胞表面上輔助分子的共刺激，使用結合輔助分子的配位基。例如，可以在適於刺激T細胞增殖的條件下，使T細胞群體與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞的增殖，可以使用抗CD3抗體和抗CD28抗體。可以使用抗CD28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法國貝桑松Diaclone公司(Diaclone,Besançon,France))，還可以使用本領域公知的其他方法(Berg等人，Transplant Proc.[移植學會會報]30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.[實驗醫學雜誌]190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.[免疫學雜誌]227(1-2)：53-63,1999)。

在一些實施方式中，T細胞的初級刺激訊號和共刺激訊號可以由不同的方案提供。例如，提供每個訊號的藥劑可以在溶液中或偶聯到表面。當偶聯到表面時，藥劑可以偶聯到同一表面(即，為「順式」形成)或偶聯到分離表面(即，為「反式」形成)。可替代地，可以將一種藥劑偶聯到表面並且使另一種藥劑在溶液中。在一些實施方式中，將提供共刺激訊號的藥劑與細胞表面結合，並且使提供初級活化訊號的藥劑在溶液中或偶聯到表面。在一些實施方式中，兩種藥劑都可以在溶液中。在一些實施方式中，該等藥劑可以為可溶形式，並且然後交聯到表面，如表現Fc受體的細胞或將與該等藥劑結合的抗體或其他結合劑。在這方面，參見例如美國專利申請公開案號20040101519和20060034810的人工抗原呈遞細胞(aAPC)，其預期用於活化和擴增本發明中的T細胞。

在一些實施方式中，將兩種藥劑固定在珠上，或者在相同的珠上(即「順式」)，或者在分離的珠上(即「反式」)。藉由舉例，提供初級活化訊號的藥劑係抗CD3抗體或其抗原結合片段，並且提供共刺激訊號的藥劑係抗CD28抗體或其抗原結合片段；並且將兩種藥劑以等效分子量共固定到同一珠。在一些實施方式中，使用針對CD4+ T細胞擴增和T細胞生長的與珠結合的每種抗體的1：1的比率。在本發明的一些實施方式中，使用與珠結合的抗CD3：CD28抗體的比率，使得與使用1：1的比率觀察到的擴增相比，觀察到T細胞擴增的增加。在一些實施方式中，與使用1：1比率觀察到的擴增相比，觀察到從約1倍至約3倍的增加。在一些實施方式中，與珠結合的CD3：CD28抗體的比率範圍為從100：1至1：100以及其間的所有整數值。在一些實施方式中，與抗CD3抗體相比，更多的抗CD28抗體與顆粒結合，即，CD3：CD28的比率小於1。在一些實施方式中，與珠結合的抗CD28抗體與抗CD3抗體的比率大於2：1。在一些實施方式中，使用與珠結合的抗體的1：100 CD3：CD28比率。在一些實施方式中，使用與珠結合的抗體的1：75 CD3：CD28比率。在一些實施方式中，使用與珠結合的抗體的1：50 CD3：CD28比率。在一些實施方式中，使用與珠結合的抗體的1：30 CD3：CD28比率。在一些實施方式中，使用與珠結合的抗體的1：10 CD3：CD28比率。在一些實施方式中，使用與珠結合的抗體的1：3 CD3：CD28比率。在一些實施方式中，使用與珠結合的抗體的3：1 CD3：CD28比率。

顆粒與細胞的比率為從1：500至500：1以及其間的任何整數值可以用於刺激T細胞或其他靶細胞。如熟悉該項技術者可以容易地理解的，顆粒與細胞的比率可以取決於相對於靶細胞的粒度。例如，小尺寸的珠僅可以結合少量細胞，而較大的珠可以結合許多細胞。在一些實施方式中，範圍從1：100至100：1以及其間的任何整數值的細胞與顆粒的比率和在一些實施方式中包括1：9至9：1的比率以及其間的任何整數值也可以用於刺激T細胞。如以上所指出，導致T細胞刺激的抗CD3和抗CD28偶聯顆粒與T細胞的比率可以變化，然而某些適合的值包括1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、和15：1，其中一個適合的比率係每個T細胞至少1：1個顆粒。在一些實施方式中，使用1：1或更小的顆粒與細胞比率。在一些實施方式中，適合的顆粒與細胞的比率為1：5。在一些實施方式中，顆粒與細胞的比率可以根據刺激日而變化。例如，在一些實施方式中，顆粒與細胞的比率在第一天為從1：1至10：1，並且將另外的顆粒在之後每天或每隔一天加入到細胞中持續最長10天，最終比率為從1：1至1：10(基於添加當天的細胞計數)。在一些實施方式中，在刺激的第一天，顆粒與細胞的比率為1：1，並且在刺激的第三天和第五天調整為1：5。在一些實施方式中，基於在第一天的最終比率為1：1並且在刺激的第三天和第五天為1：5，每天或每隔一天添加顆粒。在一些實施方式中，在刺激的第一天，顆粒與細胞的比率為2：1，並且在刺激的第三天和第五天調整為1：10。在一些實施方式中，基於在第一天的最終比率為1：1並且在刺激的第三天和第五天為1：10，每天或每隔一天添加顆粒。熟悉該項技術者將理解，各種其他比率可適用於本發明。具體地，比率將根據粒度和細胞大小和類型而變化。在一些實施方式中，在第一天用於使用的最典型比率係1：1、2：1和3：1附近。

在一些實施方式中，將細胞(如T細胞)與藥劑包被的珠組合，隨後將該等珠和該等細胞分離，並且然後培養細胞。在一些實施方式中，在培養之前，不將藥劑包被的珠和細胞分開而是一起培養。在一些實施方式中，首先藉由施加力(如磁力)濃縮珠和細胞，導致細胞表面標誌物的連接增加，從而誘導細胞刺激。

藉由舉例，可以藉由使抗CD3和抗CD28所附接的順磁珠(3x28個珠)接觸T細胞來連接細胞表面蛋白。在一些實施方式中，將細胞(例如，10⁴至10⁹個T細胞)和珠(例如，比率為1：1的Dynabeads^® M-450 CD3/CD28 T順磁珠)在緩衝液(例如PBS(不含二價陽離子(如鈣和鎂))中組合。同樣，熟悉該項技術者可易於理解可以使用任何細胞濃度。例如，靶標細胞在樣本中可以非常稀少，僅占樣本的0.01%，或者整個樣本(即100%)可以包含目的靶標細胞。因此，任何細胞數量都在本發明的上下文內。在一些實施方式中，可能希望顯著減小其中顆粒和細胞混合在一起的體積(即增加細胞的濃度)，以確保細胞和顆粒的最大接觸。例如，在一些實施方式中，使用約100億個細胞/ml、90億個細胞/ml、80億個細胞/ml、70億個細胞/ml、60億個細胞/ml、50億個細胞/ml、或20億個細胞/ml的濃度。在一些實施方式中，使用大於1億個細胞/ml。在一些實施方式中，使用1000萬、1500萬、2000萬、2500萬、3000萬、3500萬、4000萬、4500萬、或5000萬個細胞/ml的細胞濃度。在一些實施方式中，使用7500萬、8000萬、8500萬、9000萬、9500萬、或1億個細胞/ml的細胞濃度。在一些實施方式中，可以使用1.25或1.5億個細胞/ml的濃度。使用高濃度可以導致細胞產量增加、細胞活化、和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效地捕獲可能弱表現目的靶抗原的細胞，如CD28陰性T細胞。此類細胞群體可能具有治療價值，並且在一些實施方式中是希望獲得的。例如，使用高濃度的細胞允許更有效地選擇通常具有較弱CD28表現的CD8+T細胞。

在一些實施方式中，例如藉由本文所述之方法擴增用編碼CAR(例如本文所述之CAR，例如本文所述之CD19 CAR)的核酸轉導的細胞。在一些實施方式中，使細胞在培養物中擴增數小時(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小時)至約14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1l、12、13或14天)。在一些實施方式中，使細胞擴增4至9天的一段時間。在一些實施方式中，使細胞擴增8天或更短(例如7、6或5天)的一段時間。在一些實施方式中，使細胞在培養物中擴增5天，並且所得細胞比在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞更有效。效力可以例如藉由各種T細胞功能來定義，例如增殖、靶細胞殺傷、細胞介素產生、活化、遷移、表面CAR表現、CAR定量PCR、或其組合。在一些實施方式中，與在相同的培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞相比，擴增5天的細胞(例如，本文所述之CD19 CAR細胞)顯示抗原刺激後細胞倍增方面至少一倍、兩倍、三倍或四倍的增加。在一些實施方式中，使細胞(例如，本文所述之表現CD19 CAR的細胞)在培養物中擴增5天，與在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞相比，所得的細胞表現出更高的促炎細胞介素產生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些實施方式中，與在相同培養條件下在培養物中擴增9天的相同細胞相比，擴增5天的細胞(例如本文所述之CD19 CAR細胞)顯示促炎細胞介素產生(例如IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml增加至少一、二、三、四、五、十倍或更多。

還可能希望進行幾個刺激循環，使得T細胞的培養時間可以是60天或更長。適於T細胞培養的條件包括適當的培養基(例如，最低基礎培養基(Minimal Essential Media)、α-MEM、RPMI培養基1640、AIM-V、DMEM、F-12、或X-vivo 15(龍沙公司(Lonza))、X-Vivo 20、OpTmizer、和IMDM)，該培養基可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰島素、IFNγ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNFα或熟悉該項技術者已知用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長的其他添加劑包括但不限於表面活性劑、人血漿蛋白製品、和還原劑(如N-乙醯基-半胱胺酸和2-巰基乙醇)。培養基可以包括但不限於RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、X-Vivo 20、OpTmizer、和IMDM，其中添加胺基酸、丙酮酸鈉、和維生素，無血清或補充有適當量的血清(或血漿)或一組確定的激素、和/或足以使T細胞生長和擴增的一定量細胞介素。抗生素(例如青黴素和鏈黴素)僅包含在實驗培養物中，而不包含在有待注入受試者的細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所必需的條件下，例如，適當的溫度(例如，37℃)和大氣(例如空氣加5% CO₂)。

在一些實施方式中，使細胞在包括一種或多種白介素的適當培養基(例如本文描述的介質)中擴增，該白介素導致在14天的擴增期間細胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如藉由本文描述之方法(如流動式細胞測量術)測量。在一些實施方式中，將細胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下擴增。

在實施方式中，本文所述之方法(例如表現CAR的細胞製造方法)包括例如使用抗CD25抗體或其片段，或CD25結合配位基，IL-2從細胞群體中去除T調節性細胞(例如CD25+ T細胞或CD25 ^高 T細胞)。從細胞群體中去除T調節性細胞(例如CD25+ T細胞或CD25 ^高 T細胞)之方法係本文所述之。在實施方式中，該等方法(例如製造方法)進一步包括使細胞群體(例如，其中T調節性細胞，如CD25+ T細胞或CD25 ^高 T細胞已經被耗減的細胞群體；或先前已接觸抗CD25抗體其片段，或CD25結合配位基的細胞群體)與IL-15和/或IL-7接觸。例如，使細胞群體(例如先前已接觸抗CD25抗體、其片段，或CD25結合配位基)在IL-15和/或IL-7存在下擴增。

在一些實施方式中，在例如離體製造表現CAR的細胞過程中，使本文所述之表現CAR的細胞與包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受體α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)兩者的組合的組成物接觸。在實施方式中，在例如離體製造表現CAR的細胞過程中，使本文所述之表現CAR的細胞與包含IL-15多肽的組成物接觸。在實施方式中，在例如離體製造表現CAR的細胞過程中，使本文所述之表現CAR的細胞與包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽兩者的組合的組成物接觸。在實施方式中，在例如離體製造表現CAR的細胞過程中，使本文所述之表現CAR的細胞與包含hetIL-15的組成物接觸。

在一些實施方式中，在離體擴增過程中，使本文所述之表現CAR的細胞與包含hetIL-15的組成物接觸。在一些實施方式中，在離體擴增過程中，使本文所述之表現CAR的細胞與包含IL-15多肽的組成物接觸。在一些實施方式中，在離體擴增過程中，本文所述之表現CAR的細胞與包含L-15多肽和IL-15Ra多肽兩者的組成物接觸。在一些實施方式中，該接觸導致淋巴細胞亞群(例如CD8+ T細胞)的存活和增殖。

已暴露於不同刺激時間的T細胞可以表現出不同的特徵。例如，典型的血液或外周血單核細胞產物具有輔助T細胞群體(TH，CD4+)，其大於細胞毒性或抑制性T細胞群體(TC，CD8+)。藉由刺激CD3和CD28受體離體擴增T細胞產生T細胞群體，該T細胞群體在約8-9天之前主要由TH細胞組成，而在約8-9天之後，該T細胞群體包含越來越多的TC細胞群體。因此，取決於治療目的，向受試者輸注主要包含TH細胞的T細胞群體可能是有利的。類似地，如果已分離了TC細胞的抗原特異性子集，則將該子集擴增到更大程度可能是有益的。

此外，在細胞擴增過程中，除CD4和CD8標誌物之外，其他表型標誌物顯著地，但在很大程度上，可重複地變化。因此，這種可重複性使得能夠針對特定目的定制活化的T細胞產物。

一旦構建本文描述的CAR，可以使用各種測定來評價分子的活性，如但不限於在抗原刺激後擴增T細胞、在不存在再刺激的情況下維持T細胞擴增的能力，以及在適當的體外和動物模型中的抗癌活性。用於評價本發明的CAR的作用的測定進一步詳細描述於下文。

可以將初始T細胞中CAR表現的蛋白質印跡分析用於檢測單體和二聚體的存在，例如，如2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第695段，該申請藉由引用以其全文併入本文。

可以藉由流動式細胞測量術測量抗原刺激後CAR⁺ T細胞的體外擴增。例如將CD4⁺和CD8⁺ T細胞的混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激，隨後用在待分析的啟動子的控制下表現GFP的慢病毒載體轉導。示例性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。藉由流動式細胞測量術，在培養的第6天在CD4⁺和/或CD8⁺ T細胞亞群中評估GFP螢光。參見，例如Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。可替代地，在第0天將CD4⁺和CD8⁺ T細胞的混合物用被αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，並在第1天使用表現CAR連同eGFP(使用2A核糖體跳躍序列)的雙順反子慢病毒載體用CAR轉導。在抗CD3和抗CD28抗體(K562-BBL-3/28)的存在下，將培養基用如本文所述之癌症相關抗原⁺ K562細胞(表現與如本文所述之癌症相關聯的抗原的K562)、野生型K562細胞(K562野生型)或表現hCD32和4-1BBL的K562細胞再刺激。每隔一天以100IU/ml向培養基中添加外源IL-2。使用基於珠的計數藉由流動式細胞測量術計算GFP⁺ T細胞。參見，例如Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。

還可以測量在沒有再刺激的情況下持續的CAR⁺ T細胞擴增。參見，例如Milone等人，Molecular Therapy[分子療法]17(8)：1453-1464(2009)。簡而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR轉導後，使用Coulter Multisizer III顆粒計數器或更高版本、耐克龍細胞計數儀(Nexcelom Cellometer Vision)、密理博賽普特計數器(Millipore Scepter)或其他細胞計數器在培養的第8天測量平均T細胞體積(f1)。

還可以將動物模型用於測量表現CAR的細胞活性，例如如描述於2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第698段，該申請藉由引用以其全文併入。

例如如在2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第699段所描述，可以評估劑量依賴性CAR治療反應，該申請藉由引用以其全文併入。

先前已經描述了細胞增殖和細胞介素產生的評估，如描述於2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第700段中，該申請藉由引用以其全文併入。

藉由標準51Cr釋放測定可以評估細胞毒性，例如如在2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第701段所述，該申請藉由引用以其全文併入。也可以使用替代性的非放射性方法。

例如使用xCELLigence即時細胞分析儀(RTCA)，還可以藉由測量貼壁細胞的電阻抗中的變化來評估細胞毒性。在一些實施方式中，在多個時間點處測量細胞毒性。

在攜帶腫瘤的動物模型中可以將成像技術用於評估CAR的特定運輸和增殖，例如如在2015年3月13日提交的國際申請WO2015/142675的第702段所述，該申請藉由引用以其全文併入本文中。

其他測定，包括本文實例部分中描述的那些測定以及本領域中已知的那些測定也可以用於評價本文描述的CAR。

可替代地，或者與本文揭露之方法組合的，揭露了用於以下的一種或多種之方法和組成物：表現CAR的細胞的檢測和/或定量(例如，體外或體內(例如，臨床監測))；免疫細胞擴增和/或活化；和/或涉及使用CAR配位基的CAR特異性選擇。在一些實施方式中，該CAR配位基係結合CAR分子的抗體，例如結合CAR的細胞外抗原結合結構域的抗體(例如，結合抗原結合結構域的抗體，例如抗獨特型抗體；或與細胞外結合結構域的恒定區結合的抗體)。在其他實施方式中，該CAR配位基係CAR抗原分子(例如本文所述之CAR抗原分子)。

在一些實施方式中，揭露了用於檢測和/或定量表現CAR的細胞之方法。例如，該CAR配位基可用於體外或體內檢測和/或定量表現CAR的細胞(例如，臨床監測患者中的表現CAR的細胞，或給患者給藥)。該方法包括：提供CAR配位基(視需要，標記的CAR配位基，例如包含標籤、珠、放射性或螢光標記的CAR配位基)；獲得表現CAR的細胞(例如，獲得含有表現CAR的細胞的樣本，如製造樣本或臨床樣本)；

在發生結合的條件下使表現CAR的細胞與CAR配位基接觸，從而檢測存在的表現CAR的細胞的水平(例如，量)。可以使用標準技術如FACS、ELISA等檢測表現CAR的細胞與CAR配位基的結合。

在一些實施方式中，揭露了擴增和/或活化細胞(例如免疫效應細胞)之方法。該方法包括：提供表現CAR的細胞(例如，表現第一CAR的細胞或暫態表現CAR的細胞)；在發生免疫細胞擴增和/或增殖的條件下，使所述表現CAR的細胞與CAR配位基(例如，如本文所述之CAR配位基)接觸，從而產生活化的和/或擴增的細胞群體。

在某些實施方式中，CAR配位基存在於底物(例如，固定或附接至底物上，如非天然存在的底物)上。在一些實施方式中，底物係非細胞底物。非細胞底物可以是選自例如板(例如微量滴定板)、膜(例如硝酸纖維素膜)、基質、晶片或珠的固體支持物。在實施方式中，CAR配位基存在於底物中(例如在底物表面上)。CAR配位基可以與底物共價或非共價(例如，交聯)固定、附接、或締合。在一些實施方式中，CAR配位基與珠附接(例如共價附接)。在前述實施方式中，免疫細胞群體可以在體外或離體擴增。該方法可以進一步包括在CAR分子的配位基存在下培養免疫細胞的群體，例如，使用本文所述之任何方法。

在其他實施方式中，擴增和/或活化細胞之方法還包括添加第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配位基和第二刺激分子可以固定在底物(例如一個或多個珠)上，從而提供增加的細胞擴增和/或活化。

在一些實施方式中，提供了用於選擇或富集表現CAR的細胞之方法。該方法包括使表現CAR的細胞與如本文所述之CAR配位基接觸；以及根據CAR配位基的結合選擇細胞。

在其他實施方式中，提供了用於消耗、減少和/或殺傷表現CAR的細胞之方法。該方法包括使表現CAR的細胞與如本文所述之CAR配位基接觸；並且基於CAR配位基的結合靶向細胞，從而減少表現CAR的細胞的數量和/或殺傷表現CAR的細胞。在一些實施方式中，CAR配位基與毒性劑(例如，毒素或細胞消融藥物)偶聯。在一些實施方式中，抗獨特型抗體可以導致效應細胞活性(例如ADCC或ADC活性)。

可用於本文揭露之方法的示例性抗CAR抗體描述於例如WO 2014/190273和Jena等人，「Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD 19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受體(CAR)特異性單株抗體檢測臨床試驗中CD19特異性T細胞]」,PLOS[公共科學圖書館綜合]2013年3月8：3 e57838中，該文獻的內容藉由引用併入。

在一些實施方式中，本文的組成物和方法針對特定T細胞亞群進行了優化，例如，如2015年7月31日提交的美國序號PCT/US2015/043219中所述，該專利的內容藉由引用以其全文併入本文。在一些實施方式中，與對照T細胞(例如，表現相同構建體的不同類型的T細胞(例如，CD8+或CD4+))相比，優化的T細胞亞群顯示了增強的持久性。

在一些實施方式中，CD4+ T細胞包含本文所述之CAR，該CAR包含適合於(例如，優化，例如，導致增強的持久性)CD4+ T細胞(例如ICOS結構域)的細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，CD8+ T細胞包含本文所述之CAR，該CAR包含適合於(例如，優化，例如，導致增強的持久性)CD8+ T細胞(例如，4-1BB結構域、CD28結構域，或ICOS結構域以外的其他共刺激結構域)的細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，本文所述之CAR包含本文所述之抗原結合結構域，例如包含抗原結合結構域的CAR。

在一些實施方式中，本文描述了治療受試者之方法，例如患有癌症的受試者。該方法包括向所述受試者投與有效量的：

1)包含CAR(CARCD4+)的CD4+ T細胞，該CAR包含：

抗原結合結構域，例如本文所述之抗原結合結構域；

跨膜結構域；以及

細胞內傳訊結構域，例如第一共刺激結構域，例如ICOS結構域；以及

2)包含CAR(CARCD8+)的CD8+ T細胞，該CAR包含：

抗原結合結構域，例如本文所述之抗原結合結構域；

跨膜結構域；以及

細胞內傳訊結構域，例如第二共刺激結構域，如4-1BB結構域、CD28結構域、或除ICOS結構域的另一種共刺激結構域；

其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。

視需要，該方法進一步包括投與：

3)包含CAR(第二CARCD8+)的第二CD8+ T細胞，該CAR包含：

抗原結合結構域，例如本文所述之抗原結合結構域；

跨膜結構域；以及

細胞內傳訊結構域，其中第二CARCD8+包含細胞內傳訊結構域，例如共刺激傳訊結構域，不存在於CARCD8+上，並且視需要不包含ICOS傳訊結構域。

生物聚合物遞送方法

在一些實施方式中，如本文所揭露的一種或多種表現CAR的細胞可以經由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)投與或遞送至受試者。生物聚合物支架可以支持或增強本文所述之表現CAR的細胞的遞送、擴增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不誘導炎性或免疫應答)和/或可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述於例如2015年3月13日提交的國際申請WO 2015/142675的第1004-1006段中，該申請藉由引用以其全文併入。

藥物組成物和治療

在一些實施方式中，本揭露提供了治療患者之方法，該方法包括投與如本文所述產生的表現CAR的細胞，視需要與一種或多種其他的療法組合。在一些實施方式中，本揭露提供了治療患者之方法，該方法包括投與包含如本文所述之表現CAR的細胞的反應混合物，視需要與一種或多種其他的療法組合。在一些實施方式中，本揭露提供了運送或接收反應混合物之方法，該反應混合物包含如本文所述之表現CAR的細胞。在一些實施方式中，本揭露提供了治療患者之方法，該方法包括接收如本文所述產生的表現CAR的細胞，並且進一步包括向患者投與表現CAR的細胞，視需要與一種或多種其他的療法組合。在一些實施方式中，本揭露提供了治療患者之方法，該方法包括產生如本文所述之表現CAR的細胞，並且進一步包括向患者投與表現CAR的細胞，視需要與一種或多種其他的療法組合。其他的療法可以是例如癌症療法(例如化療)。

在一些實施方式中，與降低Treg細胞群體的分子組合向受試者投與表現本文所述CAR的細胞。減少(例如耗減)Treg細胞數量之方法係本領域已知的，並且包括例如CD25耗減、環磷醯胺投與、調製GITR功能。不希望受理論的束縛，據信在單採之前或投與本文所述之表現CAR的細胞之前減少受試者中的Treg細胞數量減少了腫瘤微環境中不需要的免疫細胞(例如，Treg)的數量，並降低受試者的復發風險。

在一些實施方式中，將本文所述之療法(例如表現CAR的細胞)與靶向GITR和/或調整GITR功能的分子組合投與受試者，如耗減調節性T細胞(Treg)的GITR促效劑和/或GITR抗體。在實施方式中，將表現本文所述CAR的細胞與環磷醯胺組合投與於受試者。在一些實施方式中，GITR結合分子和/或調整GITR功能的分子(例如GITR促效劑和/或Treg耗減GITR抗體)在表現CAR的細胞之前投與。例如在一些實施方式中，GITR促效劑可以在細胞的單採之前投與。在實施方式中，在投與(例如輸注或再輸注)表現CAR的細胞之前或在細胞的單採之前向受試者投與環磷醯胺。在實施方式中，在投與(例如，輸注或再輸注)表現CAR的細胞之前或在細胞的採集之前，向受試者投與環磷醯胺和抗GITR抗體。在一些實施方式中，受試者患有癌症(例如，實體癌或血液學癌症，如ALL或CLL)。在一些實施方式中，受試者患有CLL。在實施方式中，受試者患有ALL。在實施方式中，受試者患有實體癌，例如本文所述之實體癌。示例性GITR促效劑包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗體(例如二價體抗GITR抗體)，例如像描述於以下中的GITR融合蛋白：美國專利案號：6,111,090、歐洲專利案號：090505B1、歐洲專利案號：8,586,023、PCT公開案號：WO 2010/003118和2011/090754，或該抗GITR抗體，例如在美國專利案號：7,025,962、歐洲專利案號：1947183B1、美國專利案號：7,812,135、美國專利案號：8,388,967、美國專利案號：8,591,886、歐洲專利案號：EP 1866339、PCT公開案號：WO 2011/028683、PCT公開案號：WO 2013/039954、PCT公開案號：WO 2005/007190、PCT公開案號：WO 2007/133822、PCT公開案號：WO 2005/055808、PCT公開案號：WO 99/40196、PCT公開案號：WO 2001/03720、PCT公開案號：WO99/20758、PCT公開案號：WO2006/083289、PCT公開案號：WO 2005/115451、美國專利案號：7,618,632、和PCT公開案號：WO 2011/051726中。

在一些實施方式中，將本文所述之CAR表現細胞與GITR促效劑(例如本文所述之GITR促效劑)組合投與受試者。在一些實施方式中，在表現CAR的細胞之前投與GITR促效劑。例如在一些實施方式中，可以在細胞的單採之前投與GITR促效劑。在一些實施方式中，受試者患有CLL。

本文所述之方法可以進一步包括在藥物組成物中配製表現CAR的細胞。藥物組成物可以包含表現CAR的細胞(例如如本文所述之多種表現CAR的細胞)，以及一種或多種藥學上或生理學上可接受的運載體、稀釋劑或賦形劑。此類組成物可以包含緩衝液，如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；以及防腐劑。可以配製組成物，例如，用於靜脈內投與。

在一些實施方式中，藥物組成物基本上不含，例如不存在可檢測水平的例如選自以下群組的污染物，該群組由以下組成：內毒素、支原體、複製型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗體、合併的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體包裝細胞或質體組分、細菌和真菌。在一些實施方式中，細菌係選自下組的至少一種，該組由以下組成：糞產鹼菌、白色念珠菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、以及釀膿鏈球菌A組。

當指示「免疫有效量」、「抗癌症有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，醫生可以考慮到年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移的程度以及患者(受試者)的狀況的個體差異來確定待投與的本發明組成物的精確量。通常可以說，可以將包含本文描述的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)的藥物組成物以10⁴至10⁹個細胞/kg體重、在一些情況下10⁵至10⁶個細胞/kg體重(包括那些範圍內的所有整數值)的劑量投與。還可以將T細胞組成物以該等劑量多次投與。可以藉由使用在免疫療法中通常已知的輸注技術來投與細胞(參見例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.[新英格蘭醫學雜誌]319：1676,1988)。

示例性BCMA/CD19 CART藥物組成物

在一些實施方式中，藉由用兩種獨特的載體共轉導，產生BCMA/CD19雙CART細胞組成物。因此，在一些實施方式中，該細胞組成物包含異質的細胞群體。在一些實施方式中，該異質的細胞組成物包括未經轉導的T細胞、單BCMA特異性CART細胞、單CD19特異性CART細胞、以及表現BCMA特異性CAR分子和CD19特異性CAR分子的雙CART細胞。該等不同的細胞群體在治療受試者的疾病的上下文中可能表現出不同的活性。

不希望受理論束縛，在治療多發性骨髓瘤的情況下，例如BCMA特異性CART細胞的活化可能是患者抗腫瘤反應中的主要因素，而CD19特異性活性可以在消除不太普遍的CD19陽性腫瘤細胞中發揮作用。

在一些實施方式中，可以評估細胞組成物以評價四種不同的細胞群體的相對百分比，例如以相比單CD19特異性CAR細胞，選擇含有更高百分比的BCMA特異性CAR細胞(例如單BCMA特異性CAR細胞和BCMA/CD19雙CAR細胞)的細胞組成物。

在一些實施方式中，該細胞組成物包含：

在一些實施方式中：

在一些實施方式中，該細胞組成物進一步包含第四細胞群體，該第四細胞群體不包含CAR。在一些實施方式中，該細胞組成物包含單CD19特異性CAR細胞的群體，該群體小於或等於BCMA特異性CAR細胞的數量(例如單BCMA特異性CAR細胞和BCMA/CD19雙CAR細胞的總數)的110%(例如小於或等於約105%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%或更少)。在一些實施方式中，該細胞組成物包含單CD19 CAR+細胞的群體，該群體包含BCMA特異性CART細胞的數量的約45%至約50%(例如約47%)。在一些實施方式中，該細胞組成物包含單CD19 CAR+細胞的群體，該群體包含BCMA特異性CART細胞的數量的約60%至約65%(例如約63%)。在一些實施方式中，該細胞組成物包含單CD19 CAR+細胞的群體，該群體包含BCMA特異性CART細胞的數量的約50%至約55%(例如約53%)。在一些實施方式中，該細胞組成物包含單CD19 CAR+細胞的群體，該群體包含BCMA特異性CART細胞的數量的約82%。

在一些實施方式中，可以評價細胞組成物以評估CAR陽性活細胞的百分比，從而考慮足夠的給藥。因此，在一些實施方式中，該細胞組成物包含大於或等於該細胞組成物中活細胞總數約5%(例如大於或等於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%)的BCMA特異性CAR細胞群體(例如單BCMA特異性CAR細胞和BCMA/CD19雙CAR細胞的總數)。

在一些實施方式中，該BCMA特異性CAR細胞係BCMA特異性CART細胞。在一些實施方式中，該單BCMA特異性CAR細胞係單BCMA 特異性CART細胞。在一些實施方式中，該CD19特異性CAR細胞係CD19特異性CART細胞。在一些實施方式中，該單CD19特異性CAR細胞係單CD19特異性CART細胞。在一些實施方式中，該BCMA/CD19雙CAR細胞係BCMA/CD19雙CART細胞。

給藥

在一些實施方式中，CAR細胞(例如CD19 CAR細胞)的劑量包括約1 x 10⁶、1.1 x 10⁶、2 x 10⁶、3.6 x 10⁶、5 x 10⁶、1 x 10⁷、1.8 x 10⁷、2 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁸、2 x 10⁸、或5 x 10⁸個細胞/kg。在一些實施方式中，CAR細胞(例如CD19 CAR細胞)的劑量包括至少約1 x 10⁶、1.1 x 10⁶、2 x 10⁶、3.6 x 10⁶、5 x 10⁶、1 x 10⁷、1.8 x 10⁷、2 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁸、2 x 10⁸、或5 x 10⁸個細胞/kg。在一些實施方式中，CAR細胞(例如CD19 CAR細胞)的劑量包括高達約1 x 10⁶、1.1 x 10⁶、2 x 10⁶、3.6 x 10⁶、5 x 10⁶、1 x 10⁷、1.8 x 10⁷、2 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁸、2 x 10⁸、或5 x 10⁸個細胞/kg。在一些實施方式中，CAR細胞(例如CD19 CAR細胞)的劑量包括約1.1 x 10⁶-1.8 x 10⁷個細胞/kg。在一些實施方式中，CAR細胞(例如CD19 CAR細胞)的劑量包括約1 x 10⁷、2 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁸、2 x 10⁸、5 x 10⁸、1 x 10⁹、2 x 10⁹、或5 x 10⁹個細胞。在一些實施方式中，CAR細胞(例如CD19 CAR細胞)的劑量包括至少約1 x 10⁷、2 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁸、2 x 10⁸、5 x 10⁸、1 x 10⁹、2 x 10⁹、或5 x 10⁹個細胞。在一些實施方式中，CAR細胞(例如CD19 CAR細胞)的劑量包括高達約1 x 10⁷、2 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁸、2 x 10⁸、5 x 10⁸、1 x 10⁹、2 x 10⁹、或5 x 10⁹個細胞。

在一些實施方式中，可能希望向受試者投與活化的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)，並且然後隨後重抽血液(或進行單採)，從其活化免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)，並用該等活化和擴增的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)回輸患者。該過程可以每隔幾週進行多次。在一些實施方式中，可以將來自從10cc至400cc抽血的免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)活化。在一些實施方式中，將來自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效應細胞(例如T細胞、NK細胞)活化。

可以按任何方便的方式進行受試者組成物的投與。可以向患者經動脈、皮下、真皮內、瘤內、結內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內(i.v.)注射、或者腹膜內(例如，藉由皮內或皮下注射)投與本文描述的組成物。可以將免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)的組成物直接注射到腫瘤、淋巴結或感染部位中。

T細胞耗減

在一些實施方式中，本文揭露之方法進一步包括在用細胞處理後投與T細胞耗減劑(例如，如本文所述之免疫效應細胞)，從而減少(例如，消耗)表現CAR的細胞(例如，表現CD19 CAR的細胞)。此類T細胞耗減劑可用於有效消耗表現CAR的細胞(例如，表現CD19 CAR的細胞)以減輕毒性。在一些實施方式中，表現CAR的細胞根據本文之方法製造，例如，根據本文之方法測定(例如，在轉染或轉導之前或之後)。

在一些實施方式中，在投與細胞後一週、兩週、三週、四週或五週投與T細胞耗減劑，例如本文所述之免疫效應細胞群體。

在一些實施方式中，T細胞耗減劑係消耗表現CAR的細胞的藥劑，例如，藉由誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體誘導的細胞死亡。例如，本文所述之表現CAR的細胞還可以表現被能夠誘導細胞死亡(例如ADCC或補體誘導的細胞死亡)的分子識別的抗原(例如靶抗原)。例如，本文所述之表現CAR的細胞還可以表現能夠被抗體或抗體片段靶向的靶蛋白(例如受體)。此類靶蛋白的實例包括但不限於EpCAM、VEGFR、整聯蛋白(例如整聯蛋白αvβ3、α4、αI3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族成員(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一個或多個細胞外表位但缺少在胞質結構域內的一個或多個區的形式)。

在一些實施方式中，該CAR表現細胞共表現CAR和靶蛋白，例如，天然表現靶蛋白或被工程化以表現靶蛋白。例如，該細胞(例如免疫效應細胞群體)可包括含有CAR核酸(例如，如本文所述之CAR核酸)的核酸(例如，載體)和編碼靶蛋白的核酸。

在一些實施方式中，T細胞耗減劑係CD52抑制劑，例如抗CD52抗體分子，例如阿侖單抗。

在其他實施方式中，該細胞，例如免疫效應細胞群體，表現如本文所述之CAR分子(例如，CD19CAR)和由T細胞耗減劑識別的靶蛋白。在一些實施方式中，靶蛋白係CD20。在實施方式中，其中靶蛋白係CD20，T細胞耗減劑係抗CD20抗體，例如利妥昔單抗。

在任何上述方法的另外的實施方式中，該方法進一步包括將細胞(例如造血幹細胞)或骨髓移植到哺乳動物中。

在一些實施方式中，本發明的特徵在於一種在細胞移植前調節哺乳動物之方法。該方法包括給哺乳動物投與有效量的包含CAR核酸或多肽的細胞，例如CD19 CAR核酸或多肽。在一些實施方式中，細胞移植係幹細胞移植(例如造血幹細胞移植)或骨髓移植。在其他實施方式中，在細胞移植前調節受試者，包括減少受試者中表現靶細胞的數量，例如表現CD19的正常細胞或表現CD19的癌細胞。

給藥方案

在一些實施方式中，表現CAR的活細胞(例如表現CD19、BCMA、CD20或CD22 CAR的活細胞)或包含該細胞的藥物組成物的劑量包括約1 x 10⁶至約1 x 10⁸(例如約2 x 10⁶至約5 x 10⁷、約5 x 10⁶至約2 x 10⁷、約1 x 10⁶至約1 x 10⁷、約1 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁶至約3 x 10⁶、約2 x 10⁶至約4 x 10⁶、約3 x 10⁶至約5 x 10⁶、約4 x 10⁶至約6 x 10⁶、約5 x 10⁶至約7 x 10⁶、約6 x 10⁶至約8 x 10⁶、約7 x 10⁶至約9 x 10⁶、約8 x 10⁶至約1 x 10⁷、約9 x 10⁶至約2 x 10⁷、約1 x 10⁷至約3 x 10⁷、約2 x 10⁷至約4 x 10⁷、約3 x 10⁷至約5 x 10⁷、約4 x 10⁷至約6 x 10⁷、約5 x 10⁷至約7 x 10⁷、約6 x 10⁷至約8 x 10⁷、約7 x 10⁷至約9 x 10⁷、約8 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁶、約2 x 10⁶、約3 x 10⁶、約4 x 10⁶、約5 x 10⁶、約6 x 10⁶、約7 x 10⁶、約8 x 10⁶、約9 x 10⁶、約1 x 10⁷、約2 x 10⁷、約3 x 10⁷、約4 x 10⁷、約5 x 10⁷、約6 x 10⁷、約7 x 10⁷、約8 x 10⁷、約9 x 10⁷或約1 x 10⁸)個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)。在一些實施方式中，表現CAR的活細胞(例如表現CD19、BCMA、CD20、或CD22 CAR的活細胞)的劑量包括約0.5 x 10⁶個表現CAR的活細胞至約1.25 x 10⁹個表現CAR的活細胞(例如0.5 x 10⁶個表現CAR的活細胞至1.25 x 10⁹個表現CAR的活細胞)。在一些實施方式中，表現CAR的活細胞(例如表現CD19、BCMA、CD20、或CD22 CAR的活細胞)的劑量包括約1 x 10⁶、約2.5 x 10⁶、約5 x 10⁶、約1.25 x 10⁷、約2.5 x 10⁷、約5 x 10⁷、約5.75 x 10⁷、或約8 x 10⁷個表現CAR的活細胞。

在一些實施方式中，基於藉由在轉導後第4天(96h)(收穫後第3天(72h))流動式細胞測量術測量的BCMA-CAR+ T活細胞(例如單陽性BCMA CAR細胞加上雙陽性BCMA+/CD19+ CAR細胞)的數量計算劑量，如本文所述。在一些實施方式中，表現CAR的活細胞(例如BCMA/CD19雙CART細胞產物)的劑量包括約5 x 10⁶至約2 x 10⁷個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)。

在一些實施方式中，以一個或多個(例如2、3、4或更多個)劑量向受試者投與一個劑量的表現CAR的活細胞(例如表現CD19、BCMA、CD20或CD22 CAR的活細胞)或包含所述細胞的藥物組成物。在一些實施方式中，以兩個劑量向受試者投與該細胞或藥物組成物。在一些實施方式中，該一個或多個劑量包含第一劑量和第二劑量，其中該第一劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量高於、等於或低於該第二劑量中CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的數量。

(b)該第二劑量包含約1 x 10⁷至約1 x 10⁸(例如約2 x 10⁷至約8 x 10⁷、約4 x 10⁷至約6 x 10⁷、約1 x 10⁷至約5 x 10⁷、約5 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁷ 至約3 x 10⁷、約2 x 10⁷至約4 x 10⁷、約3 x 10⁷至約5 x 10⁷、約4 x 10⁷至約6 x 10⁷、約5 x 10⁷至約7 x 10⁷、約6 x 10⁷至約8 x 10⁷、約7 x 10⁷至約9 x 10⁷、約8 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁷、約2 x 10⁷、約3 x 10⁷、約4 x 10⁷、約5 x 10⁷、約6 x 10⁷、約7 x 10⁷、約8 x 10⁷、約9 x 10⁷或約1 x 10⁸)個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)；

在一些實施方式中，在隨後的投與中，CAR陽性細胞的劑量可以從起始劑量開始增加。例如患者可以接受約1x10⁶至約1x10⁷(例如約5x10⁶)個CAR陽性活細胞的起始劑量，並且可以接受約1x10⁷至約1x10⁸(例如約1x10⁷或約2x10⁷)個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的第二劑量。

患者選擇

在本文揭露的治療受試者的任何方法或使用的組成物的一些實施方式中，受試者患有癌症(例如血液癌)。在一些實施方式中，該癌症選自淋巴細胞性白血病(CLL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、何杰金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴細胞性白血病(SLL)、B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、與慢性炎症相關的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性腫瘤、濾泡性淋巴瘤、小兒濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織的結外緣帶淋巴瘤)、緣帶淋巴瘤、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、脾緣帶淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾彌漫性紅髓小B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病變異、淋巴漿細胞性淋巴瘤、重鏈疾病、漿細胞性骨髓瘤、孤立性骨漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結節性緣帶淋巴瘤、小兒結節性緣帶淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、HHV8相關多中心卡斯特曼病中出現的大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或無法分類的淋巴瘤。在一些實施方式中，該癌症係復發性和/或難治性癌症。

在本文揭露的治療受試者的任何方法或所使用的組成物的一些實施方式中，受試者患有CLL或SLL。在一些實施方式中，患有CLL或SLL的受試者先前已經被投與BTK抑制劑療法(例如依魯替尼)持續至少1-12個月(例如6個月)。在一些實施方式中，BTK抑制劑療法(例如依魯替尼療法)係第二線療法。在一些實施方式中，受試者具有部分響應，或響應於BTK抑制劑療法患有穩定的疾病。在一些實施方式中，受試者對BTK抑制劑療法不響應。在一些實施方式中，受試者產生抗性，例如產生依魯替尼抗性突變。在一些實施方式中，依魯替尼抗性突變包括在編碼BTK的基因和/或編碼PLCg2的基因中的突變。在一些實施方式中，受試者係成人，例如至少18歲。

在本文揭露的治療受試者的任何方法或所使用的組成物的一些實施方式中，受試者患有DLBCL，例如復發性和/或難治性DLBCL。在一些實施方式中，患有DLBCL(例如復發性和/或難治性DLBCL)的受試者先前已經被投與至少2線化療，例如抗CD20療法和/或基於蒽環類的化療。在一些實施方式中，受試者先前已經接受幹細胞療法(例如自體幹細胞療法)並對該幹細胞療法免疫有響應。在一些實施方式中，受試者不適合進行幹細胞療法(例如自體幹細胞療法)。在一些實施方式中，受試者係成人，例如至少18歲。

治療應用

BCMA相關疾病和/或障礙

在一個方面，本發明提供治療與BCMA表現相關的疾病之方法。在一個方面，本發明提供治療疾病之方法，其中部分腫瘤對BCMA呈陰性，部分腫瘤對BCMA呈陽性。例如，本發明的CAR可用於治療已經歷與BCMA表現升高相關的疾病的治療的受試者，其中已經歷BCMA水平升高的治療的受試者表現出與BCMA水平升高相關的疾病。在實施方式中，本發明的CAR可用於治療已經歷與BCMA表現相關的疾病的治療的受試者，其中已經歷與BCMA表現相關的治療的受試者表現出與BCMA表現相關的疾病。

在一個實施方式中，本發明提供治療疾病之方法，其中BCMA在正常細胞和癌細胞上表現，但在正常細胞上以較低水平表現。在一個實施方式中，該方法還包括選擇以這樣的親和力結合的本發明的CAR：該親和力允許BCMA CAR結合並殺傷表現BCMA的癌細胞，但小於30%、25%、20%、15%、 10%、5%或更少的表現BCMA的正常細胞被殺傷，例如如藉由本文所述之測定所確定。例如，可以使用殺傷測定法，如基於Cr51 CTL的流動式細胞測量術。在一個實施方式中，BCMA CAR具有抗原結合結構域，該抗原結合結構域對於靶抗原具有10^-4M至10^-8M，例如10^-5M至10^-7M，例如10^-6M或10^-7M的結合親和力KD。在一個實施方式中，BCMA抗原結合結構域的結合親和力比參考抗體(例如，本文所述之抗體)低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。

在一個方面，本發明關於包含BCMA CAR的載體(其可操作地連接至啟動子)，用於在哺乳動物免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)中表現。在一個方面，本發明提供表現BCMA CAR的重組免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)，用於治療表現BCMA的腫瘤，其中表現BCMA CAR的重組免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)被稱為表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR的NK細胞)。在一個方面，本發明的表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR的NK細胞)能夠使腫瘤細胞接觸其表面上表現的本發明的至少一種BCMA CAR，以使得該表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR的NK細胞)靶向腫瘤細胞並抑制腫瘤的生長。

在一個方面，本發明關於抑制表現BCMA的腫瘤細胞生長之方法，該方法包括使腫瘤細胞接觸本發明的表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR的NK細胞)，以使得表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR的NK細胞)響應於抗原而激活並靶向癌細胞，其中腫瘤的生長受到抑制。

在一個方面，本發明關於治療受試者的癌症之方法。該方法包括將本發明的表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR 的NK細胞)投與於受試者，從而治療受試者中的癌症。可以藉由本發明的表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR的NK細胞)治療的癌症的實例係與BCMA表現相關的癌症。

本發明包括一種類型的細胞療法，其中免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)，並且將表現BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART或表現BCMA CAR的NK細胞)輸注給有需要的受體。輸注的細胞能夠殺傷受體中的腫瘤細胞。與抗體療法不同，CAR修飾的細胞(例如，T細胞或NK細胞)能夠在體內複製，產生可導致持續腫瘤控制的長期持久性。在各個方面，在將細胞(例如，T細胞或NK細胞)投與於患者之後，投與於患者或其後代的細胞(例如，T細胞或NK細胞)在患者中持續至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年或五年。

本發明還包括一種類型的細胞療法，其中免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)經修飾(例如，藉由體外轉錄的RNA)以暫態表現嵌合抗原受體(CAR)，並且將免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)輸注給有需要的受體。輸注的細胞能夠殺傷受體中的腫瘤細胞。因此，在各個方面，在將免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)投與於患者之後，投與於患者的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)存在少於一個月，例如三週、兩週、一週。

不希望受理論的束縛，CAR修飾的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)引發的抗腫瘤免疫應答可以是主動或被動免疫應答，或者可以是由於直接與間接免疫應答。在一個方面，該CAR轉導的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)表現出響應於表現BCMA的人癌細胞的特異性促炎細胞介素分泌和有效的細胞溶解活性，抵抗可溶性BCMA抑制，介導旁觀者殺傷和介導已建立的人類腫瘤的消退。例如，在表現BCMA的腫瘤的異質區域內的無抗原腫瘤細胞可能易受BCMA重定向免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)的間接破壞，該BCMA重定向免疫效應細胞先前已經與鄰近的抗原陽性癌細胞發生反應。

在一個方面，本發明的完全人CAR修飾的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)可以是用於哺乳動物離體免疫和/或體內治療的一類疫苗。在一個方面，哺乳動物係人。

關於離體免疫，在將細胞投與於哺乳動物中之前，在體外進行以下中的至少一者：i)擴增細胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細胞，或iii)冷凍保存細胞。

離體程序係本領域熟知的，並在下文更全面地討論。簡而言之，從哺乳動物(例如，人)分離細胞，並用表現本文揭露的CAR的載體進行遺傳修飾(即，體外轉導或轉染)。可以將CAR修飾的細胞投與於哺乳動物受體以提供治療益處。哺乳動物受體可以是人，並且CAR修飾的細胞可以相對於受體係自體的。可替代地，相對於受體，細胞可以是同種異體的、同基因的或異種異體的。

造血幹細胞和祖細胞的離體擴增程序描述於美國專利案號5,199,942(藉由引用併入本文)中，可以應用於本發明的細胞。其他合適之方法係本領域已知的，因此本發明不限於離體擴增細胞的任何具體方法。簡而言之，對T細胞的離體培養和擴增包括：(1)從哺乳動物收集來自外周血收穫物或骨髓外植體的CD34+造血幹細胞和祖細胞；以及(2)離體擴增此類細胞。除了美國專利案號5,199,942中描述的細胞生長因子外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配位基也可以用於培養和擴增細胞。

除了在離體免疫方面使用基於細胞的疫苗之外，本發明還提供了用於體內免疫以引發針對患者中的抗原的免疫應答的組成物和方法。

通常，如本文描述活化和擴增的細胞可以用於治療和預防免疫受損個體中出現的疾病。例如，本發明的CAR修飾的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)用於治療與BCMA表現相關的疾病、障礙和病症。在一些方面，本發明的細胞用於治療處於患上與BCMA表現相關的疾病、障礙和病症風險的患者。因此，本發明提供了治療或預防與BCMA表現相關的疾病、障礙和病症之方法，該方法包括將治療有效量的本發明的CAR修飾的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)投與於有需要的受試者。

在一個方面，本發明的表現CAR的細胞(例如，CART細胞或表現CAR的NK細胞)可用於治療增殖性疾病(如癌症或惡性腫瘤)或者癌前病症(如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期。在一個方面，該癌症係血液學癌症。血液學癌症病症係影響血液、骨髓和淋巴系統的癌症類型，如白血病和惡性淋巴組織增生病症。在一個方面，該血液癌症係白血病或血液學癌症。與BCMA相關的疾病或障礙的實例係多發性骨髓瘤(也稱為MM)(參見Claudio等人，Blood.[血液]2002,100(6)：2175-86；和Novak等人，Blood.[血液]2004,103(2)：689-94)。多發性骨髓瘤，也稱為漿細胞骨髓瘤或卡勒氏(Kahler)病，係以骨髓中異常或惡性血漿B細胞積聚為特徵的癌症。通常，癌細胞侵入鄰近的骨骼，破壞骨骼結構並導致骨痛和骨折。大多數骨髓瘤病例的特徵還在於副蛋白(也稱為M蛋白或骨髓瘤蛋白)的產生，該副蛋白係惡性漿細胞的選殖增殖過量而產生的異常免疫球蛋白。根據國際骨髓瘤工作組(International Myeloma Working Group,IMWG)的診斷標準，血清副蛋白水平超過30g/L即診斷為多發性骨髓瘤(參見Kyle等人，(2009),Leukemia.[白血病]23：3-9)。多發性骨髓瘤的其他症狀或體征包括腎功能減退或腎功能衰竭、骨病變、貧血、高鈣血症和神經症狀。

國際骨髓瘤工作組已經確定了區分多發性骨髓瘤與其他漿細胞增殖性障礙的標準(參見Kyle等人，(2009)，Leukemia.[白血病]23：3-9)。必須滿足以下所有三個標準：

- 選殖骨髓漿細胞

10%

- 存在血清和/或尿單株蛋白(除真正的非分泌性多發性骨髓瘤患者之外)

- 可歸因於潛在漿細胞增殖性障礙的終末器官損害的證據，具體為：

o 高鈣血症：血清鈣

11.5mg/100ml

o 腎機能不全：血清肌酸酐>1.73mmol/l

o 貧血：正常色素性正常紅血球貧血，血紅蛋白值>2g/100ml，低於正常下限，或血紅蛋白值<10g/100ml

o 骨病變：溶骨性病變、嚴重骨質減少或病理性骨折。

可以藉由本文所述之組成物和方法治療的其他漿細胞增殖性障礙包括但不限於無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義未明的單株丙種球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、和POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群、高月病和PEP症候群)。

將兩種分期系統用於進行多發性骨髓瘤的分期：國際分期系統(ISS)(參見Greipp等人，(2005),J.Clin.Oncol.[臨床腫瘤學雜誌]23(15)：3412-3420)和迪裡-薩蒙(Durie-Salmon)分期系統(DSS)(參見Durie等人，(1975),Cancer[癌症]36(3)：842-854)。

多發性骨髓瘤的第三個分期系統稱為修訂版國際分期系統(R-ISS)(參見Palumbo A,Avet-Loiseau H,Oliva S等人，Journal of clinical oncology：official journal of the American Society of Clinical Oncology[年美國臨床腫瘤學會官方雜誌]2015；33：2863-9，藉由引用以其全文併入本文)。R-ISS I期包括ISS I期(血清β2-微球蛋白水平<3.5mg/L，血清白蛋白水平

3.5g/dL)，無高風險CA[del(17p)和/或t(4；14)和/或t(14；16)]和正常LDH水平(小於正常範圍的上限)。R-ISS III期包括ISS III期(血清β2-微球蛋白水平>5.5mg/L)和高風險CA或高LDH水平。R-ISS II期包括所有其他可能的組合。

可以根據IMWG 2016標準確定患者的反應，如Kumar S，Paiva B，Anderson KC等人，International Myeloma Working Group consensus ciiteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma[國際骨髓瘤工作組多發性骨髓瘤的反應和最小殘留疾病評估的共識標準].The Lancet Oncology[柳葉刀腫瘤學]；17(8)：e328-e346揭露的，將其藉由引用以其全文併入本文。

多發性骨髓瘤和相關疾病的標準治療包括化療、幹細胞移植(自體或同種異體)、放療和其他藥物療法。經常使用的抗骨髓瘤藥物包括烷基化劑(例如，苯達莫司汀、環磷醯胺和美法侖(melphalan))、蛋白酶體抑制劑(例如，硼替佐米(bortezomib))、皮質類固醇(例如，地塞米松和潑尼松)和免疫調節劑(例如，沙利度胺(thalidomide)和來那度胺或Revlimid®)或其任何組合。雙膦酸鹽藥物也經常與標準抗MM治療組合投與以預防骨質流失。年齡超過65-70歲的患者不太可能進行幹細胞移植。在某些情況下，雙自體幹細胞移植係年齡不超過60歲且對第一次移植反應不佳的患者的選擇。本發明的組成物和方法可以與多發性骨髓瘤的任何目前處方治療組合投與。

與BCMA相關的疾病或病症的另一個實例係何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤(參見Chiu等人，Blood.[血液]2007,109(2)：729-39；He等人，J Immunol.[免疫學雜誌]2004,172(5)：3268-79)。

何杰金氏淋巴瘤(HL)也稱為霍奇金病，係起源於白血球或淋巴細胞的淋巴系統癌症。構成淋巴瘤的異常細胞稱為裡德-斯德伯格(Reed-Sternberg)細胞。在何杰金氏淋巴瘤中，癌症從一個淋巴結組擴散到另一個淋巴結組。根據裡德-斯德伯格細胞形態和裡德-斯德伯格細胞周圍的細胞組成(藉由淋巴結生檢確定)，何杰金氏淋巴瘤可細分為四種病理亞型：結節性硬化HL、混合細胞亞型、淋巴細胞富集或淋巴細胞優勢、淋巴細胞耗減。一些何杰金氏淋巴瘤也可以是結節性淋巴細胞優勢型何杰金氏淋巴瘤，或者可以是未指明的。何杰金氏淋巴瘤的症狀和體征包括頸部、腋窩或腹股溝的淋巴結無痛性腫脹、發燒、盜汗、體重減輕、疲勞、瘙癢或腹痛。

非何杰金氏淋巴瘤(NHL)包括多種血癌，血癌包括除何杰金氏淋巴瘤之外的任何類型的淋巴瘤。非何杰金氏淋巴瘤的亞型主要藉由細胞形態學、染色體畸變和表面標誌物來分類。NHL亞型(或NHL相關癌症)包括B細胞淋巴瘤，如但不限於柏基特氏淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病(B-CLL)、B細胞前淋巴球白血病(B-PLL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，血管內大B細胞淋巴瘤和原發性縱隔B細胞淋巴瘤)、濾泡性淋巴瘤(例如，濾泡中心淋巴瘤、濾泡小裂細胞)、毛細胞白血病、高級B細胞淋巴瘤(柏基特樣)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症)、被套細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤(例如，結外邊緣區B細胞淋巴瘤或黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤和脾邊緣區B細胞淋巴瘤)、漿細胞瘤/骨髓瘤、先質B淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤(PB-LBL/L)、原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤、原發性眼內淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)；和T細胞淋巴瘤，如但不限於間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T細胞淋巴瘤/白血病(例如，冒煙型、慢性、急性和淋巴瘤性)、血管中心性淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(例如，蕈樣肉芽腫、塞紮裡(Sezary)綜合症等)、結外自然殺傷/T細胞淋巴瘤(鼻型)、腸病型腸T細胞淋巴瘤、大顆粒淋巴球性白血病、先質T淋巴母細胞性淋巴瘤/白血病(T-LBL/L)、T細胞慢性淋巴球性白血病/幼淋巴細胞性白血病(T-CLL/PLL)、和未指明的外周T細胞淋巴瘤。何杰金氏淋巴瘤的症狀和體征包括頸部、腋窩或腹股溝的淋巴結無痛性腫脹、發燒、盜汗、體重減輕、疲勞、瘙癢、腹痛、咳嗽或胸痛。

何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤的分期係相同的，係指體內癌細胞的擴散程度。在I期中，淋巴瘤細胞位於一個淋巴結組中。在II期中，淋巴瘤細胞存在於至少兩個淋巴結組中，但兩組均位於膈肌的同一側，或組織或器官的一部分以及膈肌的同一側的器官附近的淋巴結。在III期中，淋巴瘤細胞位於隔膜兩側的淋巴結中，或該等淋巴結組附近或脾臟中的組織或器官的一部分。在IV期中，淋巴瘤細胞存在於至少一個器官或組織的幾個部分，或淋巴瘤細胞位於器官中和隔膜的另一側的淋巴結中。除羅馬數字分期名稱之外，分期也可以用字母A、B、E和S來描述，其中A係指無症狀的患者，B係指有症狀的患者，E係指其中淋巴瘤存在於淋巴系統外的組織中的患者，S係指其中淋巴瘤存在於脾臟中的患者。

何杰金氏淋巴瘤通常用放療、化療或造血幹細胞移植來治療。非何杰金氏淋巴瘤最常見的治療方法係R-CHOP，它由四種不同的化療藥物(環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼和潑尼松龍)和利妥昔單抗(Rituxan®)組成。通常用於治療NHL的其他療法包括其他化學治療劑、放療、幹細胞移植(自體或同種異體骨髓移植)或生物療法，如免疫療法。生物治療劑的其他實例包括但不限於利妥昔單抗(Rituxan®)、托西莫單抗(tositumomab)(Bexxar®)、依帕珠單抗(epratuzumab)(LymphoCide®)和阿侖單抗(alemtuzumab)(MabCampath®)。本發明的組成物和方法可以與何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤的任何目前處方治療組合投與。

BCMA表現也與瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)(也稱為淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL))相關聯。(參見Elsawa等人，Blood.[血液]2006,107(7)：2882-8)。瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症以前被認為與多發性骨髓瘤相關聯，但最近被歸類為非何杰金氏淋巴瘤的亞型。WM的特徵在於不受控制的B細胞淋巴細胞增殖，導致貧血並產生過量的副蛋白或免疫球蛋白M(IgM)，該副蛋白使血液變稠並導致高黏滯綜合症。WM的其他症狀或體征包括發燒、盜汗、疲勞、貧血、體重減輕、淋巴結病變或脾腫大、視力模糊、頭暈、鼻出血、牙齦出血、不常見的瘀傷、腎功能損傷或衰竭、澱粉樣變性或周圍神經病變。

WM的標準治療包括化療，特別是利妥昔單抗(Rituxan®)。其他化學治療藥物(如苯丁酸氮芥(Leukeran®)、環磷醯胺(Neosar®)、氟達拉濱(Fludara®)、克拉屈濱(cladribine)(Leustatin®)、長春新鹼和/或沙利度胺)可以組合使用。皮質類固醇(如潑尼松)也可以與化療組合投與。血漿去除術或血漿交換通常在患者的整個治療過程中使用，以藉由從血液中除去副蛋白來緩解一些症狀。在某些情況下，幹細胞移植係一些患者的選擇。

與BCMA相關的疾病或病症的另一個實例係腦癌。具體而言，BCMA的表現與星形細胞瘤或膠質母細胞瘤有關(參見Deshayes等人，Oncogene.[癌基因]2004,23(17)：3005-12,Pelekanou等人.,PLoS One.[公共科學圖書館：綜合]2013,8(12)：e83250)。星形細胞瘤係由星形膠質細胞產生的腫瘤，星形膠質細胞係腦中的一種神經膠質細胞類型。膠質母細胞瘤(也稱為多形性膠質母細胞瘤或GBM)係星形細胞瘤的最惡性形式，並且被認為係腦癌的最晚期(IV 期)。膠質母細胞瘤有兩種變體：巨細胞膠質母細胞瘤和神經膠質肉瘤。其他星形細胞瘤包括幼年毛細胞星形細胞瘤(JPA)、纖維性星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤(PXA)、胚胎發育不良性神經上皮瘤(DNET)和退行性星形細胞瘤(AA)。

與膠質母細胞瘤或星形細胞瘤相關的症狀或體征包括腦部壓力增加、頭痛、癲癇發作、記憶喪失、行為改變、身體一側運動或感覺喪失、語言功能障礙、認知缺損、視力缺損、噁心、嘔吐以及手臂或腿部虛弱。

手術移除腫瘤(或切除)係盡可能多地除去神經膠質瘤而不損傷或對正常周圍腦損傷最小的標準治療。通常在手術後使用放療和/或化療來抑制和減緩來自任何其餘癌細胞或衛星病灶的復發疾病。放射治療包括全腦放療(常規體外束輻射)、靶向三維適形放射治療和靶向放射性核素。通常用於治療膠質母細胞瘤的化療劑包括替莫唑胺(temozolomide)、吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)和順鉑。血管生成抑制劑(如貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin®))通常也與化療和/或放療組合使用。

支持性治療經常也用於緩解神經症狀和改善神經功能，並且與本文所述之任何癌症療法組合投與。主要支持性藥劑包括抗驚厥藥和皮質類固醇。因此，本發明的組成物和方法可以與任何標準或支持性治療組合使用，以治療膠質母細胞瘤或星形細胞瘤。

與BCMA表現相關的非癌症相關疾病和病症也可以藉由本文揭露的組成物和方法治療。與BCMA表現相關的非癌症相關疾病和病症的實例包括但不限於：病毒感染；例如，HIV、真菌感染，例如新型隱球菌(C.neoformans)；腸易激綜合症；潰瘍性結腸炎和與黏膜免疫有關的疾病。

本發明的CAR修飾的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)可以單獨投與，或作為藥物組成物與稀釋劑和/或與其他組分(如IL-2或其他細胞介素或細胞群)組合投與。

本發明提供用於治療癌症的組成物和方法。在一個方面，該癌症係血液癌，包括但不限於作為白血病或淋巴瘤的血液癌。在一個方面，本發明的表現CAR的細胞(例如表現CART細胞或CAR的NK細胞)可用於治療癌症和惡性腫瘤，如但不限於例如急性白血病，包括但不限於例如B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)；一種或多種慢性白血病，包括但不限於例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌或血液病症，包括但不限於例如B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生症、MALT淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良和骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、和「白血病前期」(這係由髓系血細胞的無效產生(或發育不良)聯合的血液病症的多樣化集合)等等。此外，與BCMA表現相關的疾病包括但不限於例如表現BCMA的非典型和/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌前病症或增殖性疾病。

在實施方式中，本文描述的組成物可用於治療疾病，包括但不限於漿細胞增殖性障礙(例如，無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤))、意義未明的單株丙種球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、和POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群、高月病和PEP症候群)。

在實施方式中，本文描述的組成物可用於治療疾病，包括但不限於癌症，例如本文所述之癌症，例如前列腺癌(例如，去勢抵抗性或治療抵抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌、肺癌。

本發明還提供用於抑制表現BCMA的細胞群體增殖或減少表現BCMA的細胞群體之方法，該方法包括使包含表現BMCA的細胞的細胞群體與本發明的表現抗BCMA CAR的細胞(其結合表現BCMA的細胞)(例如，BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)接觸。在一個具體方面，本發明提供用於抑制表現BCMA的癌細胞群體增殖或減少表現BCMA的癌細胞群之方法，該方法包括使表現BCMA的癌細胞群體與本發明的表現抗BCMA CAR的細胞(其結合表現BCMA的細胞)(例如，BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)接觸。在一個方面，本發明提供用於抑制表現BCMA的癌細胞群體增殖或減少表現BCMA的癌細胞群體之方法，該方法包括使表現BMCA的癌細胞群與本發明的表現抗BCMA CAR的細胞(其結合表現BCMA的細胞)(例如，BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)接觸。在一些方面，相對於陰性對照，本發明的表現抗BCMA CAR的細胞(例如，BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)使髓性白血病或與表現BCMA的細胞相關的另一種癌症的受試者或動物模型中的細胞和/或癌細胞的數量(quantity/number)、量或百分比減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個方面，受試者係人。

本發明還提供了用於預防、治療和/或控制與表現BCMA的細胞相關的疾病(例如表現BCMA的血液癌或非典型癌症)之方法，該方法包括向有需要的受試者投與本發明的表現抗BCMA CAR的細胞(其結合表現BCMA的細胞)(例如BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)。在一個方面，受試者係人。與表現BCMA的細胞相關的病症的非限制性實例包括病毒或真菌感染，以及與黏膜免疫相關的病症。

本發明還提供用於預防、治療和/或控制與表現BCMA的細胞相關的疾病之方法，該方法包括向有需要的受試者投與本發明的表現抗BCMA CAR的細胞(其結合表現BCMA的細胞)(例如，BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)。在一個方面，受試者係人。

本發明提供用於預防與表現BCMA的細胞相關的癌症復發之方法，該方法包括向有需要的受試者投與本發明的表現抗BCMA CAR的細胞(其結合表現BCMA的細胞)(例如，BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)。在一個方面，該方法包括向有需要的受試者投與有效量的本文所述之表現抗BCMA CAR的細胞(其結合表現BCMA的細胞)(例如，BCMA CART細胞或表現BCMA CAR的NK細胞)與有效量的另一種療法的組合。

組合療法

本文所述之表現CAR的細胞可以與其他已知的藥劑和療法組合使用。可以將本文所述之表現CAR的細胞和至少一種另外的治療劑同時(以相同或分開的組成物)、或依序投與。對於依次投與，可以首先投與本文所述之表現CAR的細胞並且可以其次投與另外的藥劑，或者可以顛倒投與順序。可以將CAR療法和/或其他治療劑、程序或方式在活性障礙期間，或在緩解期或活性較低的疾病期間投與。可以將CAR療法在其他治療之前、與治療並行、治療後或在障礙緩解期投與。當組合投與時，可以將CAR療法和另外的藥劑(例如，第二藥劑或第三藥劑)或全部以比單獨使用(例如，作為單一療法)的每種藥劑的量或劑量更高、更低或相同的量或劑量投與。在一些實施方式中，CAR療法、另外的藥劑(例如第二藥劑或第三藥劑)、或全部的投與量或劑量比單獨使用(例如作為單一療法)的每種藥劑的量或劑量低(例如低至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%)。在其他實施方式中，CAR療法、另外的藥劑(例如第二藥劑或第三藥劑)、或全部的導致期望效果(例如治療癌症)的量或劑量比單獨使用(例如作為單一療法)的每種藥劑實現相同治療效果所需的量或劑量低(例如低至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%)。在其他方面，可以在治療方案中將本文所述之表現CAR的細胞與外科手術、化學療法、放射、免疫抑制劑組合使用。可以與本文所述之表現CAR的細胞組合使用的示例性藥劑和療法在WO 2016164731的第266-313頁上揭露，將其藉由引用以其全文併入本文。

用於評估CAR有效性的生物標誌物

在一些實施方式中，本文揭露了在受試者(例如患有癌症的受試者，例如血液癌)中評估或監測表現CAR的細胞療法(例如CD19或BCMA CAR療法)的有效性之方法。該方法包括獲得CAR療法有效性的值，其中所述值指示表現CAR的細胞療法的有效性或適合性。

在實施方式中，在患有CLL或SLL的受試者中對CAR療法具有有效性的值包括以下參數中的一、二、三種或全部的測量值：

(i)樣本(例如單採樣本或製造的表現CAR的細胞產物樣本)中編碼BTK的基因的突變；

(ii)樣本(例如單採樣本或製造的表現CAR的細胞產物樣本)中編碼PLCg2的基因的突變；

(iii)例如如藉由CD8、CD4、CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD43、CD79b、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、Tim-3、和/ 或CD81的水平和/或活性評估的微小殘留病；或如藉由免疫球蛋白深度定序評估；在樣本中(例如來自受試者的單採樣本或腫瘤樣本)；或

(iv)樣本(例如來自受試者的單採樣本)中選自IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1a的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十種或全部的細胞介素的水平或活性。

在實施方式中，在患有DLBCL(例如復發性和/或難治性DLBCL)的受試者中對CAR療法具有有效性的值包括以下參數中的一種或兩種的測量值：

(i)例如如藉由CD8、CD4、CAR19、CD3、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、和/或Tim-3的水平和/或活性評估的微小殘留病；或如藉由免疫球蛋白深度定序評估；在樣本中(例如來自受試者的單採樣本或腫瘤樣本)；或

(ii)樣本(例如來自受試者的單採樣本)中選自IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1a的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十種或全部的細胞介素的水平或活性。

在其他實施方式中，對CAR療法具有有效性的值進一步包括以下參數中的一、二、三、四、五、六或更多種(全部)的測量值：

(i)樣本(例如單採樣本或製造的表現CAR的細胞產物樣本)中，靜息T_EFF細胞、靜息T_REG細胞、較年輕的T細胞(例如初始T細胞(例如初始CD4或CD8 T細胞、初始γ/δ T細胞)、或幹細胞記憶T細胞(例如幹細胞記憶CD4或CD8 T細胞、或幹細胞記憶γ/δ T細胞)、或早期記憶T細胞中的一、二、三種或更多種(全部)、或其組合的水平或活性；

(ii)樣本(例如單採樣本或製造的表現CAR的細胞產物樣本)中活化T_EFF細胞、活化T_REG細胞、較老的T細胞(例如較老的CD4或CD8細胞)、或晚期記憶T細胞中的一、二、三種、或更多種(例如全部)、或其組合的水平或活性；

(iii)樣本(例如單採樣本或製造的表現CAR的細胞產物樣本)中免疫細胞耗竭標誌物，例如免疫檢查點抑制劑(例如PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT和/或LAG-3)中的一、二、或更多種的水平或活性。在一些實施方式中，免疫細胞具有耗竭表型，例如共表現至少兩種耗竭標誌物，如共表現PD-1和TIM-3。在其他實施方式中，免疫細胞具有耗竭表型，例如共表現至少兩種耗竭標誌物，如共表現PD-1和LAG-3；

(iv)樣本(例如單採樣本或製造的表現CAR的細胞產物樣本)中CD27和/或CD45RO-(例如CD27+ CD45RO-)免疫效應細胞，例如CD4+活CD8+ T細胞群體中的水平或活性；

(v)選自CCL20、IL-17a、IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1的生物標誌物中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一種或全部的水平或活性；

(vi)表現CAR的細胞產物樣本，例如表現CLL-1的細胞產物樣本中的細胞介素水平或活性(例如細胞介素譜系的品質)；或

(vii)製造的表現CAR的細胞產物樣本中表現CAR的細胞的轉導效率。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，表現CAR的細胞療法包括多個(例如，一個群體)表現CAR的免疫效應細胞，例如多個(例如，一個群體)T細胞或NK細胞或其組合。在一些實施方式中，表現CAR的細胞療法係CD19 CAR療法。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，本文揭露的參數中的一種或多種的測量值從得自受試者的單採樣本獲得。可以在輸注或再輸注之前評估單採樣本。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，本文揭露的參數中的一種或多種的測量值從得自受試者的腫瘤樣本獲得。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，本文揭露的參數中的一種或多種的測量值獲得自製造得表現CAR的細胞產物樣本(例如CD19 CAR-表現細胞產物樣本)。可以在輸注或再輸注之前評估製造的表現CAR的細胞產物。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，在接受表現CAR的細胞療法之前、期間或之後評估受試者。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，本文揭露的參數中的一種或多種的測量值評估基因表現、流動式細胞測量術或蛋白質表現中的一種或多種的特徵。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，該方法進一步包括基於本文揭露的參數中的一種或多種的測量值，將受試者鑒定為反應者、無反應者、復發者或無復發者。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，與參考值(例如無反應者CD8+ T細胞的百分比)相比，反應者(例如完全反應者)具有或被鑒定為具有更高的(例如，統計學上顯著更高的)CD8+ T細胞百分比。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，與參考值(例如無反應者數量的CD27+ CD45RO-免疫效應細胞)相比，反應者(例如完全反應者)具有或被鑒定為具有更高的CD27+ CD45RO-免疫效應細胞(例如在CD8+群體中)百分比。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，與參考值(例如無反應者CD4+ T細胞的百分比)相比，反應者(例如完全反應者或部分反應者)具有或被鑒定為具有更高的(例如統計學上顯著更高的)CD4+ T細胞百分比。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，與參考值(例如無反應者數量的靜息T_EFF細胞、靜息T_REG細胞、較年輕的T細胞、或早期記憶T細胞)相比，反應者(例如完全反應者)具有或被鑒定為具有更高的靜息T_EFF細胞、靜息T_REG細胞、較年輕的T細胞、或早期記憶T細胞中的一、二、三種或更多種(例如全部)或其組合的百分比。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，與參考值(例如反應者數量的活化T_EFF細胞、活化T_REG細胞、較老的T細胞(例如較老的CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞相比，無反應者具有或被鑒定為具有更高的活化T_EFF細胞、活化T_REG細胞、較老的T細胞(例如較老的CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞中一、二、三種或更多種(例如全部)、或其組合的百分比。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，無反應者具有或被鑒定為具有更高免疫細胞耗竭標誌物(例如一、二、或更多種免疫檢查點抑制劑(例如PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT和/或LAG-3))的百分比。在一些實施方式中，與來自反應者的表現PD-1或LAG-3的免疫效應細胞的百分比相比，無反應者具有或被鑒定為具有更高的表現PD-1、PD-L1、或LAG-3的免疫效應細胞(例如CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞)(例如表現CAR的CD4+細胞和/或CD8+ T細胞)的百分比。

在一些實施方式中，無反應者具有或被鑒定為具有更高的具有耗竭表型的免疫細胞(例如共表現至少兩種耗竭標誌物(例如共表現PD-1、PD-L1和/或TIM-3)的免疫細胞)的百分比。在其他實施方式中，無反應者具有或被鑒定為具有更高的具有耗竭表型的免疫細胞(例如共表現至少兩種耗竭標誌物(例如共表現PD-1和LAG-3)的免疫細胞)的百分比。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，在表現CAR的細胞群體(例如CLL-1 CAR+細胞群體)中，與表現CAR的細胞療法的反應者(例如完全反應者)相比，無反應者具有或被鑒定為具有更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞的百分比。

在本文揭露的任何方法的一些實施方式中，反應者(例如，完全或部分反應者)具有以下特徵中的一、二、三或更多種(或全部)：

(i)與參考值(例如無反應者數量的CD27+免疫效應細胞)相比，具有更多數量的CD27+免疫效應細胞；

(ii)與參考值(例如無反應者數量的CD8+ T細胞)相比，具有更多數量的CD8+ T細胞；

(iii)與參考值(例如無反應者數量的表現一種或多種檢查點抑制劑的細胞)相比，具有更少數量的表現一種或多種檢查點抑制劑(例如選自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、或KLRG-1、或其組合的檢查點抑制劑)的免疫細胞；或

(iv)與參考值(例如無反應者數量的靜息T_EFF細胞、靜息T_REG細胞、初始CD4細胞、未刺激的記憶細胞、或早期記憶T細胞的)相比，具有更多數量的靜息T_EFF細胞、靜息T_REG細胞、初始CD4細胞、未刺激的記憶細胞、或早期記憶T細胞中的一、二、三、四種或更多種(全部)、或其組合。

在實施方式中，受試者係可以根據臨床標準進一步評估由本文之方法鑒定的反應者、無反應者、復發者或無復發者。例如，完全反應者具有或被鑒定為具有疾病(例如，癌症)的受試者，該受試者表現出對治療的完全反應，例如完全緩解。例如，使用NCCN指南(NCCN Guidelines^®)、或如在Hallek M等人，Blood[血液](2018)131：2745-2760「iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment,response assessment,and supportive management of CLL[針對診斷、治療適應症、反應評估和CLL的支持性管理的iwCLL指南],」中揭露的國際慢性淋巴球性白血病研討會(International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia(iwCLL))2018指南可以鑒定完全的反應，該文獻的完整內容藉由引用以其全文併入本文。部分反應者具有或被鑒定為具有疾病(例如，癌症)的受試者，該受試者表現出對治療的部分反應，例如部分緩解。例如使用如本文所述之NCCN指南(NCCN Guidelines^®)或iwCLL 2018標準可以鑒定部分響應。無反應者具有或被鑒定為具有疾病(例如，癌症)的受試者，該受試者未表現出對治療的反應，例如患者病情穩定或疾病進展。例如使用如本文所述之NCCN指南(NCCN Guidelines^®)或iwCLL 2018標準可以鑒定無反應者。

可替代地，或與本文揭露之方法組合，響應於所述值，執行以下一者、二者、三者或更多者：

例如向反應者或無復發者投與表現CAR的細胞療法；

投與改變劑量的表現CAR的細胞療法；

改變表現CAR的細胞療法的排程或時程；

例如，將另外的藥劑與表現CAR的細胞療法(例如檢查點抑制劑，例如本文所述之檢查點抑制劑)組合投與於無反應者或部分反應者；

在用表現CAR的細胞療法治療之前，將增加受試者中的較年輕的T細胞的數量的療法投與於無反應者或部分反應者；

修改表現CAR的細胞療法的製造方法，例如在引入編碼CAR的核酸之前富集較年輕的T細胞，或例如針對被鑒定為無反應者或部分反應者的受試者而言，增加轉導效率；

例如針對無反應者或部分反應者或復發者，投與替代療法；或

如果受試者為或被鑒定為無反應者或復發者，則例如藉由CD25耗減、投與環磷醯胺、抗GITR抗體中的一者或多者或它們的組合來減少T_REG細胞群體和/或T_REG基因特徵。

實例

藉由參考以下實驗實例進一步詳細描述本發明。提供該等實例僅用於說明的目的，除非另有說明，否則不應旨在係限制性的。因此，本發明決不應被解釋為限於以下實例，而是應該被解釋為涵蓋由於本文提供的傳授內容而變得明顯的任何和所有變化。

實例1：人BCMA CAR的體外表徵

將一組完全人單鏈可變片段(scFv)選殖至具有CD3ζ鏈和4-1BB刺激分子的下列慢病毒CAR表現載體中：R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-10、B61-02、Hy03和Hy52。最初使用自動化細胞報告測定法來篩選構建體，然後根據原代T細胞上的表現以及響應於BCMA表現(「BCMA+」或「BCMA陽性」)靶標的效應T細胞(「BCMA CART」或「BCMA CAR T細胞」)的數量和品質來進行最佳殖株選擇。效應T細胞應答包括但不限於細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生和靶細胞殺傷或細胞溶解活性(脫粒)。

BCMA CAR慢病毒的產生

使用所有上述編碼scFv的慢病毒轉移載體來產生包裝在VSVg假型慢病毒顆粒中的基因組物質。將編碼CAR的慢病毒轉移載體DNA與三種包裝組分VSVg、gag/pol和rev混合，並與lipofectamine試劑組合，以轉染Lenti-X 293T細胞(克羅泰克公司(Clontech))，然後在12-18h後更換培養基。在培養基更換後30小時，收集培養基，過濾並儲存在-80℃下。

使用自動化系統進行BCMA CAR JNL和JNL篩選報告基因測定法

對於報告基因測定法，在96孔板中以自動化小規模方式在HEK293細胞中以兩種不同的細胞密度(40,000個細胞(1×H293)或80,000個細胞(2×H293))產生編碼BCMA CAR的慢病毒，其中在轉染後48小時收穫含病毒上清液，無需冷凍即可使用新鮮的上清液來轉導Jurkat T細胞報告基因細胞系。Jurkat NFAT螢光素酶(JNL)報告基因細胞系係基於急性T細胞白血病系Jurkat。修飾該系以在激活T細胞核因子(NFAT)響應元件的控制下表現螢光素酶。對於用BCMA CAR轉導，用50μl新鮮的45μm過濾的含病毒上清液轉導10,000個JNL細胞/孔的96孔板。培養平板5天，然後與靶細胞一起共培養。

為了評估BCMA CAR活化JNL細胞的功能性能力，將它們與靶癌細胞一起以不同的效應物與靶細胞的比率(E：T比率)共培養，以藉由定量螢光素酶表現來讀出它們的活化。對基於scFv的CAR R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-10、B61-02、Hy03和Hy52進行評估。CD19 JNL CAR細胞用作靶標特異性對照，並且單獨的不含靶細胞的培養基用作陰性對照。

將上述五天轉導的JNL CAR細胞與BCMA陽性多發性骨髓瘤(MM)細胞系KMS11或NALM6(急性淋巴球性白血病細胞系)一起共培養，用作BCMA陰性對照。藉由流動式細胞測量術評估其餘的JNL CAR T細胞的BCMA CAR表現。在384孔板中以4：1、2：1、1：1和0.5：1的效應物與靶標(E：T)比率建立共培養物，並孵育24小時，其後藉由Bright-Glo^TM螢光素酶測定系統(威斯康辛州麥迪森的普洛麥格公司(Promega,Madison,WI))定量活化的JNL CAR T細胞的螢光素酶表現。從每個孔發射的光量(發光)係相應的CAR活化JNL的直接讀出。當發光水平等於或大於UTD細胞的兩倍時，JNL細胞被認為係活化的。BCMA+KMS11細胞系導致表現R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-10、B61-02、Hy03和Hy52的JNL細胞的活化(圖1A和1C)。所有的BCMA CAR 均未顯示出被BCMA陰性系NALM6活化(圖1E和圖1F)。單獨的不含靶細胞的培養基不活化任何測試的CAR轉導的JNL(圖1G和圖1H)。FACS分析表明，在轉導的JNL中檢測到不同程度的BCMA-CAR表現；CAR%通常與最具活性的JNL CART中的KMS11細胞的JNL活化正相關(圖1B和圖1D)。

BCMA CAR T細胞的產生

選擇以下8個CAR進行原代T細胞中的CAR表現、穩定性和效果的分析：R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-10、B61-02、Hy03和Hy52。BCMA CAR T細胞從健康的單採血液成分供體的血液開始產生，該等供體的T細胞(CD4+和CD8+淋巴細胞)藉由針對CD3+ T細胞的陰性選擇獲得。藉由在T細胞培養基(RPMI1640，10%熱滅活的胎牛血清(FCS)、2mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、10mM Hepes和55μM 2-巰基乙醇)中以1：3(T細胞與珠)的比率加入CD3/CD28珠(Dynabeads®人T擴增劑CD3/CD28，賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific))來活化該等細胞。將T細胞以24孔板每孔1mL培養基中0.5×10⁶個T細胞在37℃、5% CO₂下培養。24小時後，當T細胞分裂(blasting)時，將T細胞用感染複數(MOI)為5的BCMA CAR病毒進行轉導。T細胞開始以對數生長模式分裂，藉由測量每mL的細胞計數來監測T細胞，並且每兩天在新鮮培養基中稀釋T細胞，在第9天進行脫珠和收穫用於進一步分析。將T細胞的等分試樣染色以在FACS Fortessa(BD)上藉由流動式細胞測量術測量第5天和第9天的CAR表現。所有BCMA CAR T細胞均在研究級(即，非臨床級)製造條件下製備。

藉由使用rBCMA_Fc-AF647染色的細胞的流式細胞分析測量第5天和第9天的CAR%和MFI(平均螢光強度)來評估BCMA-CAR表面表現及其穩定性(圖2和表27)。第9天最終產物中的BCMA CAR表現在構建體之間各不相同，範圍為18%至42.4%，MFI為672至5238。來自PALLAS來源的殖株R1F2、R1B6 和R1G5的構建體以及雜交瘤殖株Hy03，從第5天至第9天顯示出CAR減少約30%至50%，而PI61、B61-10和-02以及Hy52就CAR表現的百分比而言相對穩定，但是所有CAR構建體從第5天到第9天顯示出MFI減小，這可能是由於第9天靜息期T細胞的尺寸較小。CAR T細胞培養物的細胞計數表明，與未轉導的T細胞(「UTD」)相比，未檢測到攜帶人scFv的BCMA CAR對細胞正常擴增的能力具有負面影響。

[表27].CAR表現分析

評估BCMA CAR重定向T細胞的功能性

為了評估BCMA CAR-T細胞的功能性能力，建立了具有BCMA陽性和陰性癌症系的共培養物。將CAR-T細胞解凍，計數，並與靶細胞共培養，以讀出它們的殺傷能力和細胞介素分泌。測試BCMA CAR殖株R1B6、R1F2、R1G5、B61-02、B61-10、PI61、Hy03和Hy52。將未轉導的T細胞(UTD)用作非靶向T細胞對照。

藉由將CART細胞與KMS11-Luc和NALM6-Luc靶細胞以不同的E：T比率共培養20小時來進行CART細胞殺傷。在接種前，將CAR T細胞群標準化為CAR陽性細胞的等價百分比。使用Meso Scale Discovery(MSD；馬里蘭州蓋瑟斯堡(Gaithersburg，MD))測量CAR-T細胞與靶細胞的20小時共培養物(效應物與靶標的比率為2.5：1)的上清液中細胞介素IFNγ，並使用已知的標準計算每種細胞介素的結果(單位為pg/ml)。所有測定均從單一來源的供體細胞一式兩份進行。殺傷數據顯示，所有BCMA CAR殖株均有效殺傷KMS11癌細胞(圖3A)。對照靶細胞NALM6未被任何該等BCMA特異性CAR殺傷(圖3B)。還測試了該等CAR與KMS11一起培養時產生IFN-γ的能力(圖3C)。BCMA CAR R1F2、R1G5和PI61導致產生最高量的IFN-γ。在暴露於對照NALM6細胞後，BCMA CART產生的細胞介素的水平低(圖3C)，表明BCMA CAR未導致非特異性活化。

結論

在CAR T細胞的背景下測試新的BCMA結合scFv。在JNL報告基因測定法以及原代T細胞中測定8種CAR：R1B6、R1F2、R1G5、B61-02、B61-10、PI61、Hy03和Hy52。所有八種CAR-T細胞均顯示出靶標特異性殺傷。表現R1F2、R1G5或PI61的T細胞在存在靶細胞的情況下產生最高量的IFN-γ。總之，BCMA CAR轉移至原代T細胞誘導了抗BCMA CAR反應性，但沒有脫靶功能。

實例2：抗BCMA和抗CD19雙CART的雙CAR表現和體外活性

在慢病毒載體中，將一組包含兩個全長CAR(嵌合抗原受體)鏈的雙順反子構建體(一個針對BCMA，並且另一個針對CD19)工程化(表28)。CAR表現由EF1α啟動子驅動。此類CAR(duBCMA.4、PI61、R1G5和R1B6)包含一組靶向BCMA的人單鏈可變片段(scFv)。在所有構建體中將靶向CD19的相同人源化的scFv工程化。在每個scFv的N-末端，源自CD8α的訊息肽將CAR靶向分泌途徑。預期這樣的訊息肽被共翻譯地切割，並因此不存在於細胞表面上展示的成熟形式的CAR中。在每個scFv的C-末端係CD8α的鉸鏈和跨膜結構域，它們與4-1BB的細胞內結構域融合，然後與CD3ζ的細胞內結構域融合。在兩種CAR之間，更準確地說係在第一CD3ζ結構域的最後一個胺基酸與後續CAR的訊息肽之間，將連接子(GSG(SEQ ID NO：206))工程化，然後將來自豬捷申病毒-1 2A的2A自切割肽(即P2A序列)工程化。也可以使用其他連接子和/或自切割肽。這種設計可從單個mRNA轉錄物中提供兩種獨立的CAR的表現。為使潛在的重組最小化，編碼兩種CAR之間重疊區(訊息肽、鉸鏈、跨膜結構域、4-1BB和CD3ζ)的DNA序列彼此不同。

[表28].構建體概述。

該構建體用於製備載體材料，該載體材料用於感染人原代T細胞。藉由流動式細胞測量術評估CAR表現。還測量了響應於BCMA表現(「BCMA+」或「BCMA陽性」)和CD19+腫瘤靶標的效應T細胞應答(「BCMA-CD19雙CART」或「T細胞」)的數量和品質。效應T細胞應答包括但不限於細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生和靶細胞殺傷或細胞溶解活性(脫粒)。

慢病毒產生和滴定度測定

上述編碼雙BCMA/CD19 CAR的五種構建體用於產生包裝到VSVg假型慢病毒顆粒中的基因組材料。兩種構建體用作對照：一種編碼針對BCMA的單CAR(duBCMA.4)，並且另一種編碼針對CD19的單CAR。所有七種構建體都在相同的質體主鏈中被工程化。將該等DNA中的每個與三個包裝組分VSVg、gag/pol和rev與lipofectamine試劑的組合混合以轉染Lenti-X 293T 細胞(克羅泰克公司(Clontech))，然後在12-18h後更換培養基。在培養基更換後30小時，收集培養基，過濾並儲存在-80℃下。

藉由使用重組人Alexa-647-Fc標記的BCMA蛋白(BCMA-Fc)和抗ID-duCD19.1抗體(PE)評估在經轉導的Sup-T1細胞上的BCMA-CD19雙CAR的表面表現來確定慢病毒滴定度。用3倍連續稀釋的病毒上清液(其中起始稀釋度為1：3)轉導Sup-T1細胞。四天後評估表現CAR的細胞(CAR+細胞)的百分比。根據以下公式，使用上游CAR陽性或雙陽性CAR群體計算病毒滴定度：

(% CAR+)x(接種的Sup-T1細胞數量)x(稀釋度)/(病毒量(mL))

在5%和25%的CAR+細胞之間給出的線性範圍內，從最中心稀釋點計算病毒滴定度(表29)。

[表29].supT1滴定度。

使用常規的10天生產過程，產生BCMA-CD19 CAR T細胞

使用在處理來自健康單採供體的血液後藉由經由Prodigy進行陰性選擇或陽性選擇而獲得的人原代T細胞(CD4+和CD8+淋巴細胞)來產生BCMA-CD19雙或單BCMA或單CD19 CART細胞。在轉導之前，在T細胞培養基(RPMI1640，10%熱滅活的胎牛血清(FCS)、2mM L-麩醯胺酸、1x青黴素/鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、10mM Hepes和55μM 2-巰基乙醇)中以1：3(T細胞與珠)的比率使用CD3/CD28珠(Dynabeads^®人T擴增劑CD3/CD28，賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific))來活化該 T細胞。在24孔板中，在37℃、5% CO₂下，按0.5x10⁶/mL培養基/孔的密度培養該細胞。24小時後，當T細胞分裂時，將該T細胞用基於上游CAR滴定度的、感染複數(MOI)為5的病毒轉導。T細胞開始以對數生長模式分裂，藉由測量每mL的細胞計數來監測T細胞，並且每兩天在新鮮培養基中稀釋T細胞，在第8天或更長時間根據細胞大小進行脫珠和收穫用於進一步分析。將T細胞的等分試樣染色以在FACS Fortessa(BD)上藉由流動式細胞測量術測量在第7天或第8天的CAR表現。

藉由使用rBCMA_Fc-AF647和抗ID-duCD19.1(PE)染色的細胞的流動式細胞測量術分析測量在第8天的CAR%和MFI(平均螢光強度)來評估BCMA-CAR和CD19-CAR表面表現(圖4A-4C)。三種雙CAR載體(包含R1G5、R1B6或PI61)導致類似的雙陽性CAR百分比(約10%)，其中構建體236(R1G5/duCD19.1)表現出針對BMCA和CD19 CAR的最高MFI水平(圖4A)。在不同的構建體中，單duCD19.1(構建體244)顯示出針對CAR19的最高MFI(圖4B)。

評估雙BCMA-CD19 CAR重定向D8 T細胞產物的體外和體內功能性

為評估雙BCMA-CD19 CART細胞內每種CAR的抗腫瘤功效，用BCMA陽性(KMS11)、CD19陽性(NALM6)和BCMA/CD19陰性癌症系(CD19KO；NALM6來源的)建立共培養。將CART細胞解凍，計數，並與靶細胞共培養，以讀出它們的殺傷能力和細胞介素分泌。將未轉導的T細胞(UTD)用作非靶向T細胞對照。

藉由將CART細胞與表現螢光素酶的靶細胞按不同的E：T比率共培養20小時來進行體外細胞毒性測定。在鋪板之前，根據針對各個腫瘤的CAR，將CART細胞群體標準化為CAR陽性細胞的等量百分比(即，當CART與KMS11細胞共培養時，基於BCMA CAR進行標準化；並且當CART與NALM6 共培養時，基於CAR19進行標準化)。使用Meso Scale Discovery(MSD；蓋瑟斯堡，馬里蘭州)，在20小時共培養物(對應於1.25：1或2.5：1(CAR-T細胞：靶細胞)的目標比率)的上清液中測量細胞介素IFNγ。使用已知標準以pg/mL計算結果。所有測定均從單一來源的供體細胞一式兩份進行。殺傷數據表明，所有雙CAR殖株針對BCMA陽性KMS11細胞和CD19陽性Nalm6細胞係有效的(分別為圖5A和5B)。僅觀察到針對BCMA/CD19陰性腫瘤細胞的背景殺傷(圖5C)。如使用兩種不同的E：T比率所評估的，當與KMS11或Nalm6共培養時，該等雙CAR產生IFN-γ的能力係類似的(圖6A-6D)。

在NSG小鼠中，使用混合的異種移植腫瘤模型(5% Nalm6和95% KMS11)，分析該等D8 CART的體內抗腫瘤活性。

使用活化的快速製造(ARM)過程，第1天抗BCMA-CD19雙CART的產生和測量

在一些實施方式中，該ARM過程以冷凍的或新鮮的白血球單採產物開始。在獲得用於計數和QC的樣本之後，將產品與細胞分選機(例如，安裝的CliniMACS Prodigy裝置套組)附接並且開始程式。將細胞洗滌並與微珠一起孵育，該等微珠結合所希望的表面標誌物(例如CD4和CD8)。藉由使細胞通過磁柱來選擇珠標記的細胞。將分離的細胞再次洗滌，並將分離緩衝液交換為細胞培養基。然後將純化的T細胞進行培養或冷凍保存以備後用。藉由流動式細胞測量術評估，分離的T細胞的純度將藉由QC步驟。將冷凍保存的細胞解凍，在預熱的細胞培養基中洗滌，並重懸浮於細胞培養基中。直接將新鮮的細胞添加至培養物中。將該細胞按0.4-1.2e6個細胞/cm²的膜接種到膜生物反應器上，添加活化試劑(例如抗CD3/抗CD28珠/聚合物、奈米顆粒、或奈米膠體)，並且將細胞培養基添加至最終體積為0.25-2ml/cm²的膜中。對於體外CAR表現動力學研究，使用24孔Grex。使用Grex100、燒瓶或中心室(centricult)來測試該製造過程是否可擴展，並測試體內抗腫瘤功效。在鋪板時，用感染複數(MOI)為1或2的、編碼BCMA-CD19雙CAR的慢病毒載體轉導細胞。基於在SupT1細胞中獲得的病毒滴定度確定MOI，該病毒滴定度基於在2A序列上游工程化的CAR的滴定度。在24小時，在染色之前將細胞洗滌以去除不需要的試劑，從而藉由流動式細胞測量術測量CAR表現並在冷凍保存培養基中重新配製為用於體內研究的「第1天CART產物」。在所有情況下，在轉導後72小時收穫等分試樣的細胞以用於體外測量CAR表現動力學。第1天CART反應包括但不限於，體內細胞溶解活性和擴增。

圖7A-7B顯示在使用ARM過程、使用MOI為1(基於僅藉由上游CAR的表現確定的SupT1滴定度)製造的人原代T細胞進行轉導後24h和72h，抗BCMA和抗CD19 CAR二者的表現模式。轉導後二十四小時，在流動式細胞測量術分析中觀察到，整個活CD3+T細胞群體以不同程度向右移動(圖7A)。該表現模式不同於經轉導以表現CAR的細胞的典型流動式細胞測量術長條圖，其中CAR陽性群體與陰性群體明顯分離。該等數據表明，可以藉由rBCMA_Fc流動式細胞測量術染色試劑檢測「假轉導或暫態表現」。先前已經報導，從載體添加時至在CD34+細胞中24小時以及在293細胞中72小時，觀察到慢病毒假轉導(Haas DL，等人Mol Ther.[分子療法]2000.291：71-80)。整合酶缺陷型慢病毒載體在CD34+細胞中引起暫態eGFP表現持續長達10天，並且在293細胞中持續長達14天。儘管在T細胞轉導後第1天觀察到的CAR表現可能歸因於假轉導，然而在第3天，出現了兩個清晰的群體，一個係rBCMA_Fc陽性，另一個係抗ID duCD19.1陽性(圖7B和圖7C)。此外，在使用雙構建體c235、c236、c237和c238工程化的細胞中，有20%至30%的細胞為單BCMACAR陽性(CD19CAR陰性)(圖7C)。總之，該等結果表明，當將R1G5、R1B6和PI61與duCD19.1組合使用時，兩種CAR在雙CART系統中均良好表現。病毒轉導後72h可以作為用於測量針對體內給藥策略的CAR表現的替代時間點。

評估第1天ARM加工的BCMA CART的功能性

使用如下三種小鼠模型，對使用中心室或燒瓶系統產生的第1天CART檢測其體內抗腫瘤活性：彌散性KMS-11-luc(BCMA+CD19-)多發性骨髓瘤模型、Nalm6-Luc(CD19+BCMA-)異種移植小鼠模型以及95% KMS-luc與5% NALM6-Luc細胞的混合模型。這項體內研究的目的係三方面的：(1)證明雙CART的BCMA和CD19臂的功效；(2)將該混合模型(包含BCMA+腫瘤細胞和CD19+腫瘤細胞)與該KMS-11-luc多發性骨髓瘤模型(BCMA+CD19-)進行比較，以瞭解CD19靶標對雙CART的潛在活化；和(3)在單獨的Nalm6模型(CD19+BCMA-)中測試雙CART以測試CD19臂的活性。每週兩次進行BLI測量。在第6、13、20和27天採集外周血用於流動式細胞測量術分析。在先前提及的幾天以及第2天收集血漿用於細胞介素分析。表30匯總了研究設計和劑量資訊。

[表30].體內研究設計和劑量方案

在研究過程中，5e4的劑量的雙CART清除了混合腫瘤(BCMA+CD19+)，並且1e4的劑量抑制但沒有完全消除腫瘤(圖8C)。PI61和CTL119均不能控制混合的腫瘤(圖8C)。在KMS11和Nalm6模型中，與單對應物相比，雙c236和c238均顯示出相似或優越的功效(圖8A和8B)。研究期間，在所有三個模型中，體重均增加(圖9A-9C)。在KMS11和NALM6研究結束時，可能由於GVHD，體重略有下降。

T細胞擴增從第6天到第20天發生，並然後從第20天到第27天變得平坦(圖10A-10C)。在所有三個模型中，擴增與劑量有關(圖11A-11C)。與較高劑量下的混合模型相比，KMS11模型顯示出高出3-4倍的擴增(圖10A和10C)。雙c236和c238顯示出比單CART更高的擴增(圖10A-10C)。

總BCMA CAR+百分比在第13天達到峰值，並然後在第27天開始下降(圖11A-11C)。在混合模型中，第13天後與1e4組相比，5e4組顯示更低的BCMA CAR+百分比(圖11C)。雙CAR+百分比與總CD3+細胞的流入有關，這可以是GVHD的可能跡象。在所有三個模型中，在c236和c238 CART Rx組中觀察到雙重抗BCMA和CD19 CAR+ T細胞擴增(圖12A-12C)。

在所有模型中，IFNγ的誘導係劑量響應性的(圖13A-13C)。在混合模型中兩種劑量下的雙對應物在峰值處產生比單獨的KMS11模型高約3至4倍的IFNγ(圖13A和13C)。在所有模型中的大多數組中，在13天內觀察到峰值誘導(第20天和第27天的峰值很可能歸因於GVHD)(圖13A-13C)。

在單獨的研究中，使用彌散性KMS-11-luc多發性骨髓瘤模型檢測了使用Grex100和6孔Grex系統產生的第1天CART的體內抗腫瘤活性。螢光素酶報告基因允許藉由定量生物發光成像(BLI)監測疾病負擔。簡言而之，在攜帶腫瘤的小鼠中投與如上所述製造的第1天CART。每週採集血樣以測量外周血CART擴增，並藉由流動式細胞測量術進行分析。用構建體#236和構建體#238工程化的T細胞在體內展示出對KMS11(BCMA+ CD19-)模型的有效抗腫瘤活性(圖14A)和良好CART擴增(圖14B)。

實例3：對雙抗體CART的表徵

該實例描述了對雙抗體CAR JL1至JL10的表徵。JL1至JL8係PI61/CTL119雙抗體構建體，並且JL9至JL10係R1G5/CTL119雙抗體構建體。表31揭露了JL1至JL10的序列資訊。

使用活化的快速製造(ARM)過程，第1天抗BCMA-CD19雙抗體CART的產生和測量

在一些實施方式中，該ARM過程以冷凍的或新鮮的白血球單採產物開始。在獲得用於計數和QC的樣本之後，將產品與細胞分選機(例如，安裝的CliniMACS Prodigy裝置套組)附接並且開始程式。將細胞洗滌並與微珠一起孵育，該等微珠結合所希望的表面標誌物(例如CD4和CD8)。藉由使細胞通過磁柱來選擇珠標記的細胞。將分離的細胞再次洗滌，並將分離緩衝液交換為細胞培養基。然後將純化的T細胞進行培養或冷凍保存以備後用。藉由流動式細胞測量術評估，分離的T細胞的純度將藉由QC步驟。將冷凍保存的細胞解凍，在預熱的細胞培養基中洗滌，並重懸浮於細胞培養基中。直接將新鮮的細胞添加至培養物中。將冷凍的Pan T分離的細胞的等分試樣在37℃水浴中解凍，放入Optimizer CM(含有補充物+100U/mL人IL2的Gibco Optimizer培養基)中，並以1500rpm旋轉5分鐘。對細胞計數，並以3e6/mL、1mL/孔鋪板到24孔板中。將TransAct以1/100(10μL/孔)添加至每個孔中。

對於用ARM過程進行的體外CAR表現動力學研究，使用24孔板。在鋪板時，用感染複數(MOI)為2的、編碼BCMA-CD19雙抗體CAR的慢病毒載體轉導細胞。基於雙陽性CAR表現，根據SupT1細胞中獲得的病毒滴定度確定MOI。培養24小時後，收穫細胞，並在PBS+1% HSA中洗滌三次。然後對細胞計數，並按1e6/mL的終濃度重新鋪板在24孔板中。重新鋪板後72小時，收穫細胞，計數並從每個樣本中取出5e5細胞的等分試樣用於流動式細胞測量術分析。72小時後，在一天的七個時間點重複該過程。

圖15A和15B顯示在雙抗體病毒添加至使用ARM過程、用MOI為2製造的人原代T細胞中後96h(圖15A)或7天(圖15B)，抗BCMA和抗CD19 CAR的表現模式。總而言之，該等結果表明，在病毒添加後第4天(圖15A)或第7天(圖15B)當R1G5或PI61與duCD19.1組合使用時，兩種CAR均在雙抗體CART系統中良好表現。JL1-JL4、JL9和JL10顯示雙陽性CAR的線性表現，而JL5-JL8顯示向CD19+群體的輕微移動，這可能是由於CAR與其各自檢測試劑的結合差異。此處顯示了來自兩個供體之一的數據。

使用傳統的製造過程產生CAR-T細胞

傳統製造(TM)過程係這樣的過程，其中T細胞在活化和轉導後、在收穫前離體擴增8至9天。將經Prodigy處理的T細胞重懸浮於溫熱的RPMI完全T細胞培養基(RPMI、10%熱滅活的FBS、2mM L-麩醯胺酸、100U/mL Pen/Strep、1x NEAA、1mM丙酮酸鈉、10mM HEPES和55μM β-巰基乙醇)中，並按每孔0.5e⁶個細胞/mL在24孔板中鋪板。在37℃下將T細胞與人T-Expander CD3/CD28珠按珠與細胞的3：1比率孵育過夜。

在第1天，基於SUP-T1滴定度，添加MOI為5的慢病毒。未向未轉導的對照(UTD)中添加病毒。將T細胞在37℃下孵育過夜，然後添加1mL完全T細胞培養基/孔，之後將它們在37℃下孵育過夜。對於培養擴增的剩餘六天，將T細胞轉移至組織培養燒瓶中，並每兩天用完全T細胞培養基稀釋，目標濃度為0.5e⁶個細胞/mL。在擴增階段，典型的分裂比率範圍在從1：2至1：4。

在第7天，將T細胞去珠，收穫，並在CryoStor CS10冷凍培養基中冷凍保存，在-80℃下在酷賽細胞冷凍儀(CoolCell Cell Freezing Containers)(百思順生物公司(Biocision))中冷凍，並在第二天轉移至LN₂。將T細胞的小的等分試樣染色用於CAR表現。包括單色控制以進行補償。在流式細胞儀(BD LSRFortessa公司)上測量樣本，並用FlowJo軟體分析數據。

圖16表明在第7天使用MOI為5、用TM過程進行CAR表現。TM產物顯示與ARM產物類似的表現模式(圖15A、15B和16)。

體外殺傷測定

藉由將CART細胞與靶細胞以2倍E：T比率以20：1開始的稀釋度孵育，對用響應於表現BCMA或CD19的靶細胞的各種雙抗體構建體工程化的T細胞的殺傷潛力進行評估。將靶細胞的數量固定為2.5 x 10⁵個細胞/孔，並且在96孔平底平板中培養細胞。效應細胞係使用傳統製造藉由用雙抗體轉導T細胞而產生的CART細胞。靶細胞包括BCMA陽性KMS11-luc細胞或BCMA陰性NALM6-luc細胞。對於該測定，藉由向BCMA CART中添加UTD來標準化CAR-T細胞的%轉導。這允許比較每個樣本中相同數量的CART和相同的總T細胞數。

在細胞接種後16h，使用Bright-Glo底物測量由細胞殺傷引起的螢光素酶訊號損失，並根據下式計算特異性裂解：

特異性裂解(%)=100-(樣本發光/平均最大發光)* 100

圖17A和17B表明PI61/CTL119的不同的雙抗體有效殺傷特異性靶細胞系NALM-6(CD19+，BCMA-)(圖17A)或KMS-11(CD19-，BCMA+)(圖17B)的能力。數據表明，殖株JL6、JL5、JL3和JL8均殺傷了兩種靶細胞。

細胞介素分泌測定

孵育20h後，從以上殺傷測定中使用的共培養物(比率為1.25：1)中收集上清液，以用於MSD V-PLEX人IFN-γ和IL-2分析。響應於用KMS11或NALM6細胞的刺激，觀察到經雙抗體轉導的細胞對IFN-γ或IL-2的不同程度的靶特異性誘導(圖18A和18B)。UTD細胞未顯示出響應於任一靶細胞的任何非特異性IFN-γ分泌(圖18A)。與來自殺傷測定的結果一致，響應於靶細胞，殖株JL6、JL5、JL3和JL8產生更多的細胞介素(圖18A和18B)。

實例4：BCMA CAR和CD19 CAR的共轉導

將冷凍的Pan T分離的細胞的等分試樣在37℃水浴中解凍，放入Optimizer CM(含有補充物+100U/mL人IL2的Gibco Optimizer培養基)中，並以1500rpm旋轉5分鐘。對細胞計數，並以3e6/mL、1mL/孔鋪板到24孔板中。將TransAct以1/100(10μL/孔)添加至每個孔中。基於針對PI61的SupT1滴定度或針對CTL119的qPCR滴定度，添加不同感染複數(MOI)的病毒。按MOI為2或1，使用PI61，並與三種不同的CTL119 MOI：1、0.5和0.25配對。按針對PI61的MOI為1或2，並且按針對CTL119的MOI為1，添加單CAR，並且鋪板UTD對照。培養24小時後，收穫細胞，並在PBS+1% HSA中洗滌三次。然後對細胞計數，並按1e6/mL的終濃度重新鋪板在24孔板中。

重新鋪板後72小時，收穫細胞，計數並從每個樣本中取出5e5細胞的等分試樣用於流動式細胞測量術分析。將細胞用Live/Dead Aqua(BV510)以100μl/孔染色15分鐘，然後洗滌兩次。然後在4℃下按50μl/孔將抗體MM(表32)添加25分鐘。將細胞再次洗滌兩次，然後在100μl/孔PBS中的1.6% PFA中固定15分鐘。固定後，如前所述洗滌細胞，並以150μl/樣本的最終體積重懸浮於流動式細胞測量術緩衝液中。在BD LSRFortessa(BD生物科學公司(BD Biosciences)，聖荷西市，加利福尼亞州)上的每個樣本的活CD3陽性門上獲得5e4細胞，並使用FlowJo v.10軟體(亞什蘭，俄勒岡州)分析數據。72小時後，在一天的七個時間點重複該過程。

[表32].抗體和其他試劑。

在病毒添加後的第四天，流動式細胞測量術分析顯示在BCMA CAR MOI 2條件下，相比CAR19陽性群體和雙CAR陽性群體，單BCMA CAR+群體的顯著更高的百分比(圖19和20)。這在兩個供體中是一致的。當按MOI為1添加PI61時，觀察到所有群體的良好滴定(圖19和20)。隨著CD19 CAR MOI從1降低到0.25，CAR19+群體以及雙CAR+群體減少(圖19)。當以較低的量添加編碼CTL119的病毒時，BCMA CAR+群體增加(圖19)。總CAR+群體的百分比與添加至每個孔的總MOI相關(圖21)。總BCMA CAR和CAR19百分比也相關。從第四天到第七天，所有趨勢皆為穩定的(圖21)。存活率和擴增率與添加的總MOI無關(圖22)。此處顯示了來自四個供體之一的數據。

實例5：活化的快速製造(ARM)過程的說明

在一些實施方式中，使用連續活化快速製造(ARM)過程超過近似2天製造CART細胞，這將潛在地允許更多數量的較低分化的T細胞(T初始和T_SCM(幹細胞中樞記憶T)細胞)返回患者用於進行體內細胞擴增。較短的製造時間允許早期分化的T細胞特徵在體內增殖以達到其所希望的末端分化狀態，而不是在離體培養容器中。

在一些實施方式中，使用冷凍保存的白血球單採來源材料(例如非動員的自體外周血白血球單採(LKPK)材料)製造CART細胞。冷凍保存的來源材料藉由抗CD4/抗CD8免疫磁系統在生產的第一天(第0天)經歷T細胞富集的加工步驟。然後將陽性部分接種在G-rex培養容器中，用抗CD3/CD28系統(TransACT)活化，並在同一天用編碼CAR的慢病毒載體(LV)轉導。在第二天，在轉導20-28小時後，收穫T細胞，洗滌四次，在冷凍培養基中配製，並然後藉由控速冷凍儀(Controlled Rate Freezer(CRF))冷凍。從第0天的過程開始到第二天收穫開始，在第0天接種後用目標為24小時將細胞培養20-28小時。

根據表21製備第0天的培養基。

[表21]：在CART製造過程中培養基類型和使用點

將冷凍保存的白血球單採材料解凍。用快速緩衝液稀釋解凍細胞(表21)，並在CliniMACS^® Prodigy^®裝置上洗滌。藉由CliniMACS^® CD4和CD8微珠選擇T細胞。一旦程式完成T細胞選擇(大約3小時40分鐘至4小時40分鐘)，將包含懸浮在快速培養基中的細胞的再應用袋轉移到轉移包中(表21)。獲取樣本用於活力和細胞計數。將來自陽性部分袋的細胞計數和活力數據用於確定當接種培養容器用於活化和載體轉導時的細胞濃度。

在藉由CliniMACS^®微珠(CD4和CD8)陽性選擇T細胞後，將細胞接種在培養容器G-Rex中。一旦接種細胞，就將活化試劑(TransACT)添加至培養容器中。在目標MOI為1.0(0.8-1.2)時，然後用編碼CAR的慢病毒載體轉導細胞。載體添加後，將培養容器轉移至培養箱中，在標稱溫度為37℃(操作範圍36℃-38℃)，其中標稱5% CO₂(操作範圍4.5%-5.5%)下降培養容器孵育目標為24小時(操作範圍20-28小時)。孵育後，將細胞用收穫洗滌溶液(表21)洗滌四次，以去除任何未整合的載體和殘留的病毒顆粒，以及任何其他與過程相關的雜質。然後，將細胞洗脫下來，並且取出用於細胞計數和活力的樣本用於測試，並且將結果用於確定重懸浮細胞用於與CryoStor^® CS10最終配製物中需要的體積。然後將細胞離心以去除收穫洗滌溶液並進行冷凍保存。

在一些實施方式中，在CART細胞中表現的CAR結合CD19。在一些實施方式中，快速培養基(RM)中使用的IL-2(表21)可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。

在一些實施方式中，在CART細胞中表現的CAR結合BCMA。在一些實施方式中，快速培養基(RM)中使用的IL-2(表21)可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。

在一些實施方式中，該CART細胞表現本文揭露的雙CAR，例如本文揭露的抗BCMA/抗CD19雙CAR。在一些實施方式中，該CART細胞表現本文揭露的雙抗體CAR，例如本文揭露的抗BCMA/抗CD19雙抗體CAR。在一些實施方式中，使用如本文揭露的共轉導，將該CART細胞工程化以表現抗BCMA CAR和抗CD19 CAR。

實例6：使用活化的快速製造(ARM)過程製造CART細胞

CART細胞的ARM過程始於如表25中概述的培養基的製備。

將冷凍保存的白血球單採產物用作起始材料並加工用於T細胞富集。如果可行，利用單採文件來定義T細胞百分比。在單採文件上沒有T細胞百分比數據的情況下，對進入的冷凍保存的白血球單採產物進行哨兵小瓶測試以獲得用於單採的T細胞百分比目標。T細胞百分比的結果確定了ARM過程第0天解凍的袋數。

[表25]：在CART製造過程中培養基和緩衝液類型以及使用點

將冷凍保存的白血球單採解凍、洗滌，然後使用CliniMACS®微珠技術進行T細胞選擇和富集。用TransACT(美天旎公司生物技術公司(Miltenyi Biotec))活化活的有核細胞(VNC)，並用編碼CAR的慢病毒載體轉導。將用Miltenyi微珠選擇的活細胞接種到Prodigy^®上的中心室(centricult)中，其係非濕潤的孵育室。在培養過程中，將細胞懸浮在快速培養基中，這係一種基於OpTmizer^TM CTS^TM的培養基，這種培養基在其成分中含有CTS^TM補充劑(賽默飛世爾公司(ThermoFisher))、Glutamax、IL-2和2%免疫細胞血清替代品，以促進T細胞活化和轉導。在將TransACT添加到培養基中的稀釋細胞後，在接種當天進行一次慢病毒轉導。慢病毒載體將在接種當天使用前即刻解凍，在室溫下最多30分鐘。

從第0天的過程開始到培養物洗滌和收穫開始，將CART細胞從接種後培養20-28小時。培養後，細胞懸浮液在中心室(美天旎公司生物技術公司(Miltenyi Biotec))內進行兩次培養洗滌和一次收穫洗滌。

在第1天在CliniMACS^® Prodigy^®上收穫洗滌後，對細胞懸浮液進行取樣以確定活細胞計數和活力。然後將細胞懸浮液轉移到離心機中以手動沈澱。除去上清液，將細胞沈澱重懸於CS10(BioLife溶液)中，得到最終DMSO濃度為約10.0%的產物配置品。在收穫結束時配製活細胞計數用於給藥。然後將劑量分配到各個冷凍袋中並分析取樣到冷凍瓶中。

冷凍保存的產品儲存在受監控的安全、出入受限的區域的LN2儲罐中直至最終釋放和運輸。

實例7：表現抗BCMA CAR和抗CD19 CAR的CART細胞的製造

CART細胞的快速製造過程始於如表33中概述的培養基的製備。

[表33]：在CART製造過程中培養基類型和使用點

將冷凍保存的白血球單採物解凍。用快速緩衝液(表33)稀釋解凍細胞，並在CliniMACS^® Prodigy^®裝置上洗滌。藉由CliniMACS^® CD4和CD8微珠選擇T細胞。一旦完成了用於T細胞選擇的程式(大約3h 40min至4h 40min)，就使再應用袋包含懸浮於快速緩衝液(表33)中的細胞。獲取樣本用於活力和細胞計數。將來自陽性部分袋的細胞計數和活力數據用於確定當接種培養容器用於活化和載體轉導時的細胞濃度。

在經由CliniMACS^®微珠(CD4和CD8)對T細胞陽性選擇後，將細胞接種到Prodigy^®的中心室的培養皿中，目標為總共4.0×10⁸-1.0×10⁹個活細胞，目標濃度為約4.0×10⁶個活細胞/mL。一旦接種細胞，就將活化試劑(TransAct)添加至培養容器中。

然後用編碼抗BCMA CAR的慢病毒載體和編碼抗CD19 CAR的慢病毒載體轉導細胞。在陽性選擇後，基於BCMA CAR慢病毒載體的目標感染複數(MOI)為4.75和CD19 CAR慢病毒載體的目標MOI為0.5，來計算用於轉導T細胞的載體體積。

在37℃的溫度和標稱5%的CO₂下孵育目標24小時(工作範圍20-28小時)後，將細胞處理以進行收穫洗滌。

孵育後，將細胞用收穫洗滌溶液(表33)洗滌三次，以去除任何未整合的載體和殘留的病毒顆粒，以及任何其他與過程相關的雜質。然後，將細胞洗脫下來，並且取出用於細胞計數和活力的樣本用於測試，並且將結果用於確定重懸浮細胞用於與CryoStor^® CS10最終配製物中需要的體積。然後將細胞離心以去除收穫洗滌溶液並進行冷凍保存。

實例8：使用ARM過程製造的CART細胞的基因特徵分析

方法

單細胞RNAseq

使用10倍基因組學鉻控制器和支持文庫構建套組(kit)生成單細胞RNAseq文庫。

將冷凍保存的細胞解凍，計數並流式分選(如果研究問題需要)，然後載入到10倍基因組學儀器上。將各個細胞載入到液滴中，並經由GemCode珠對各個液滴內的RNA進行條碼化。條碼RNA從液滴中釋放並轉化為整個轉錄組Illumina相容的定序文庫。

在Illumina HiSeq儀器上對生成的文庫進行定序，並使用10倍基因組學分析過程和Loupe Cell Browser軟體進行分析。

單細胞免疫細胞分析

使用整個轉錄組10倍基因組學單細胞文庫作為模板材料以產生免疫細胞譜和譜系分析。從Chromium Single Cell 5'文庫中PCR擴增T細胞受體序列，並在Illumina定序儀器上分析。

分析過程

單細胞RNAseq數據藉由Cell Ranger分析過程從FASTQ檔開始處理。有關Cell Ranger分析過程的詳細說明，請存取：support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger。一般過程包括比對、過濾、條碼計數和UMI計數。細胞條碼用於產生基因條碼矩陣、確定簇，並進行基因表現分析。使用Seurat Bioconductor包將基因表現計數數據標準化。丟棄來自具有少於200個表現基因的分析的細胞。丟棄來自僅在2個細胞或更少的細胞中表現的分析的基因。使用比例因子10,000，使用Seurat對數標準化方法對剩餘數據進行標準化。藉由回歸每個細胞檢測到的分子數來縮放數據。藉由獲取基因集中所有基因的平均對數標準化基因表現值來計算基因集評分(基因集評分)。每個基因的z評分標準化，使得基因在樣本上的平均表現為0，標準差為1。然後將基因集評分計算為基因集中基因標準化值的平均值。以下描述示例性基因集評分計算。

對於該基因集評分計算的實例，表23中提供了六(6)個基因的兩(2)個樣本的標準化基因表現。出於該示例性計算的目的，基因集由基因1-4組成。因此，樣本1和2的基因集評分均為0。

[表23]：用於基因集評分計算的示例性數據集

基因集「向上TEM對比向下TSCM」包括以下基因：MXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY、和GFPT2。

基因集「向上Treg對比向下Teff」包括以下基因：C12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、 ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3、和FOXP3。

基因集「向下幹細胞性」包括以下基因：ACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1、和XRCC5。

基因集「向上缺氧」包括以下基因：ABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、 PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11、和XRCC6。

基因集「向上自噬」包括以下基因：ABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、 FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNF8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、 SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593、和ZNF681。

基因集「向上靜息對比向下活化」包括以下基因：ABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、 NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862、和ZNF91。

基因集「記憶分化逐漸增加」包括以下基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、 ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、 NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、和KLRB1。

基因集「向上TEM對比向下TN」包括以下基因：MYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK、和KLRB1。

描述相似過程和/或特徵的其他基因集也可用於表徵上述細胞表型。

細胞Ranger VDJ用於為每個單細胞5'文庫產生單細胞VDJ序列和注釋。Loupe Cell Browser軟體和Bioconductor套裝軟體用於數據分析和視覺化。

結果

該實施方式旨在使用單細胞RNA序列(scRNA序列)比較用作輸入細胞的純化T細胞、使用ARM過程製造的CART細胞(標記為「第1天」細胞)和使用TM過程製造的CART細胞(標記為「第9天」)之間的T細胞狀態。此外，進行單細胞TCR序列(scTCR序列)以研究選殖性並跟蹤從輸入到製造後材料的細胞分化。

如圖23A-23C所示，輸入細胞具有更少的表現基因和UMI，表明該等細胞沒有轉錄活性並且處於靜息狀態。第1天和第9天細胞表現更多基因，第9天細胞係最具轉錄活性的。類似的結果示出於圖24A-24D中。輸入細胞不表現增殖基因(圖24A和24D)。

另外的基因集分析數據示出於圖25A-25E中。使用中位數基因集評分比較不同的細胞群體。第1天細胞和輸入細胞處於較年輕的、更多幹細胞樣記憶狀態(圖25A-25C)。在圖25A中，第1天細胞、第9天細胞和輸入細胞的中位數基因集評分(向上TEM對比向下TSCM)值分別是-0.084、0.035和-0.1。在圖25B中，第1天細胞、第9天細胞和輸入細胞的中位數基因集評分(向上Treg對比向下Teff)值分別是-0.082、0.087和-0.071。在圖25C中，第1天細胞、第9天細胞和輸入細胞的中位數基因集評分(向下幹細胞性)值分別是-0.062、0.14和-0.081。

另外，與第9天細胞相比，第1天細胞處於更理想的代謝狀態(圖25D和25E)。在圖25D中，第1天細胞、第9天細胞和輸入細胞的中位數基因集評分(向上缺氧)值分別是0.019、0.11和-0.096。在圖25E中，第1天細胞、第9天細胞和輸入細胞的中位數基因集評分(向上自噬)值分別是0.066、0.11和-0.09。

基於基因表現，輸入細胞包含四個簇。簇0的特徵在於LMNA、S100A4等的高表現。簇1的特徵在於RP913、PRKCQ-AS1等的高表現。簇2的特徵在於PR11-291B21.2、CD8B等的高表現。簇3的特徵在於NKG7、GZMH、CCL5、CST7、GNLY、FGFBP2、GZMA、CCL4、CTSW、CD8A等的高表現。在輸入細胞的T分佈隨機鄰域嵌入(TSNE)圖中，簇3從其他細胞中脫穎而出，並且簇1和簇2難以區分。

根據圖26A-26C中所示的基因集分析，與富集T效應表型的簇1和簇2相比，簇0和簇3富集T調節性表型。簇3由晚期記憶/效應記憶(TEM)細胞支配，簇1和簇2由早期記憶和幼稚細胞支配，群集0在中間。大多數輸入細胞處於早期記憶、初始狀態。不希望受理論束縛，該等細胞在製造過程中可以做到最好。

在第1天細胞和第9天細胞中觀察到較少的轉錄異質性(數據未顯示)。

與輸入群體一樣，第1天細胞在TSNE圖中顯示出大的早期記憶細胞簇和較小的晚期記憶細胞簇。類似於輸入細胞的簇3所見的。相反，第9天細胞在TSNE圖中未顯示出明顯的早期記憶細胞簇。這意味著到第9天，細胞變得更均勻。

對TCR進行定序並測量選殖型多樣性。總體而言，種選殖型譜非常平坦-大多數殖株僅被挑選一次(圖27A-27C和表24)。表24中的香農熵測量分佈的平坦度。輸入細胞中的顯性殖株係晚期記憶細胞。第1天的細胞看起來與輸入細胞相似，但開始均勻。到第9天，主導殖株基本上已經均勻，分佈更加平坦。多樣性測量在第9天係最高的，因為在第9天細胞中比在輸入細胞或第1天細胞中具有更均勻和平坦的分佈。

[表24]：TCR多樣性的測量

概述

第1天和第9天產物之間存在顯著的T細胞狀態差異。第1天細胞與輸入細胞更相似，並且具有幹細胞性特徵的富集，表明產物更有效。

實例9：BCMA CAR和CD19 CAR的共轉導，對MOI的評估和功效研究

該實例描述了對藉由用編碼BCMA CAR的慢病毒載體和編碼CD19 CAR的慢病毒載體共轉導T細胞而產生的CART細胞的表徵。該BCMA CAR包含SEQ ID NO：107的胺基酸序列，並且該CD19 CAR包含SEQ ID NO：225的胺基酸序列。

細胞製備和CAR轉導

以24孔板規格測試在轉導T細胞中BCMA和CD19 CAR的四種不同的MOI組合。按MOI分別為5和1(在圖28A和28B中5/1)；分別為5和0.5(在圖28A和28B中5/0.5)；分別為2.5和1(在圖28A和28B中2.5/1)；或分別為2.5和0.5(在圖28A和28B中2.5/0.5)使用BCMA CAR慢病毒載體和CD19 CAR慢病毒載體。將藉由Prodigy純化的T細胞按3e⁶/mL、1mL/孔接種到24孔板中，並如上所述以不同的MOI添加BCMA和CD19 CAR載體。接種後，添加TransAct(美天旎公司生物技術公司(Miltenyi Biotec))(一種與抗CD3和抗CD28促效劑軛合的聚合物奈米基質)。在收穫之前，在37℃和5% CO₂下，將細胞在含有100IU/mL人重組IL-2(普羅米修士公司(Prometheus)，聖地牙哥，加利福尼亞州)和2% ICRS(生命技術公司(Life Technologies))的OpTmizer完全T細胞培養基中孵育24小時。

然後用3x體積的PBS+1% HAS將細胞洗滌三次。在培養和收穫洗滌後，評估活力和細胞計數，以確定載體滴定對最終產物的影響。

然後將細胞以1 x 10⁶VNC/mL在24孔板中重新培養，並且再孵育6天。在轉導後第4和7天(收穫後3天和6天)進行FACS分析以評價抗BCMA CAR表現。

CAR表現分析

在流式細胞儀(BD LSRFortessa公司)上測量樣本，並用FlowJo軟體分析數據。對於ARM過程，由於CAR可能無法在24小時內完全整合並離體表現，因此，當CAR穩定表現時，病毒添加後96小時可作為體外和體內給藥策略的替代時間點。對於雙靶向混合物CAR測量，採用了相同的策略。

FACS分析表明BCMA和CD19 CAR在T細胞中的共轉導形成了三個不同的CAR+亞群，並且它們的比例在經測試的四個不同的MOI組合中變化(圖28A)，這表明可以藉由BCMA和CD19 CAR的共轉導成功生成混合物CAR-T產物。按MOI為5/0.5，單一抗BCMA CAR+(抗CD19 CAR陰性)最高，(為20.7%)，隨後是雙+CAR(16.2%)和單一抗CD19 CAR+(10.5%)。總BCMA CAR+被計算為雙+CAR%加上單一抗BCMA CAR+，為36.9%，而總CD19 CAR+為26.7%(圖28A和28B)。2.5/0.5和2.5/1的MOI比率導致相比雙+%和單一抗BCMA CAR+%更多的單CD19 CAR+%。而且，雙+CAR%與總MOI使用呈正相關(圖28B)。總CAR+%在MOI 5/1和MOI 5/0.5之間係類似的。從轉導後第4天到第7天觀察到每個群體中的CAR表現相對穩定，該群體包括經BCMA或CD19 CAR轉導的T細胞(圖28A和28B)。三個供體之間的數據係一致的。在一些實施方式中，將用於共轉導的BCMA CAR(MOI為4至5)和CD19 CAR(MOI為0.5)用於產生雙靶向的混合物CART產物。

此外，完全在CliniMACS Prodigy上進行了大規模的運行實驗，從T細胞富集、T細胞接種、活化、轉導和培養開始，至在中心室中收穫洗滌液，然後配製和冷凍保存。使用MOI為4/0.5或4.75/0.5的BCMA/CD19CAR。這項研究使用的接種密度為總共250mL的7.5e⁸個總細胞中3e⁶/mL。在24小時收穫細胞，用PBS+1% HAS洗滌3次，並冷凍保存用於下游應用。收集剩餘的T細胞以產生各自的對照組，如UTD、BCMACART和CD19CART。取等分試樣並以1e⁶/mL在24孔板中再培養用於流動式細胞測量術分析，以評估轉導後第4天的BCMA-CAR表現。

圖29顯示了在轉導後第4天，雙靶向混合物CART包含11.8%單一抗BCMA CART細胞、4.31%雙CART細胞和約9%的單一抗CD19 CART細胞。在這項研究中，總的抗BCMA CAR+%被計算為雙CAR+%加上單一抗BCMA CAR+%，為16%；而總的抗CD19 CAR+%被計算為雙CAR+%加上單一抗CD19 CAR+%，為13.4%。

在以下三個異種移植小鼠模型中分析了雙混合物CART的體內活性：1)多發性骨髓瘤的KMS-11-luc模型(該表現BCMA的模型標記有螢光素酶報告基因構建體，可藉由生物發光成像系統地在骨髓中對該疾病進行系統監測)；2)混合的腫瘤模型，該模型藉由將95%的KMS-11-luc骨髓瘤細胞與5%的CD19+腫瘤(例如Nalm-6-luc)混合以模擬MM患者的異質性而建立；和3)Nalm-6-luc模型，用於評估CD19靶向的特異性以及雙靶向混合物CART的雙陽性CART群體的進一步擴增。BCMACART和CD19CART用作針對其各自的模型的對照。對於CAR-T細胞劑量的計算，對於模型1和2在轉導後第4天測量總抗BCMA CAR+%，而對於模型3在轉導後第4天測量總抗CD19 CAR+%。UTD劑量反映了相應過程中最高的總T細胞劑量。

三個模型中所有組的腫瘤消退曲線顯示在圖30A-30E中。在KMS-11-luc模型中，如圖30A所示，雙靶向混合物CART和BCMACART均以劑量依賴性方式誘導腫瘤消退。在1e⁴劑量下，雙靶向混合物CART和BCMACART均以相似的速度顯示出延遲的腫瘤抑制作用，並且都能夠在研究結束時清除腫瘤。在5e⁴劑量下，雙靶向混合物CART表現出比BCMACART更有效的腫瘤清除率，其中雙靶向混合物CART在CAR-T輸注後第14天清除了腫瘤，而BCMACART顯示至少一週的延遲效應。在重複研究中，藉由使用來自同一批次的剩餘細胞產物，涵蓋了更寬的劑量範圍(1e⁴、5e⁴、1.5e⁵)(圖30B)，藉由雙靶向混合物CART在腫瘤消退中確認了劑量依賴性。在1.5e⁵、5e⁴下的雙靶向混合物CART和在1.5e⁵下的BCMACART的回歸曲線重疊。儘管在CAR-T輸注後14天的過程中，相同劑量的雙靶向混合物CART的腫瘤消退速度稍慢，但在該組小鼠中，在CAR-T輸注後第14天，在5e⁴下的BCMACART能夠消除腫瘤。在1e⁴劑量下，雙靶向混合物CART顯示比BCMACART更好的功效。簡而言之，使用KMS-11-luc模型證明，雙靶向混合物CART能夠特異性靶向BCMA，在殺傷BCMA+多發性骨髓瘤腫瘤中顯示與BCMACART一樣有效，並且在較低劑量下甚至比BCMACART更有效。

接下來，當BCMA和CD19存在於「混合」模型中時，對雙靶向混合物CART的功效進行了評估，其中將與5%的Naml-6-luc細胞混合的KMS-11-luc細胞植入小鼠。在如圖30C所示的混合腫瘤模型中，僅在5e⁴和1e⁴下的雙靶向混合物CART以劑量依賴性方式顯示部分腫瘤抑制，而BCMACART和CD19CART均未在5e⁴劑量下顯示任何作用。在如圖30D所示的覆蓋較高劑量組的重複研究中，證明了在1.5e⁵下的雙靶向混合物CART能夠在CAR-T輸注後第14天消除混合腫瘤，並且腫瘤遏制係劑量依賴性的。相反，當同時存在BCMA和 CD19時，在此混合模型中，在1.5e⁵下的BCMACART和CD19CART僅顯示部分腫瘤抑制。

最後，使用Nalm-6-luc模型顯示雙靶向混合物CART是否可以特異性靶向CD19+腫瘤。如圖30E所示，雙靶向混合物CART也能夠以劑量依賴性方式消除Nalm-6-luc腫瘤，與更高劑量的單CD19CART相當，並且比更低劑量的單CD19CART更好。

實例10：評估用於製造BCMA/CD19 CART細胞產物的MOI

基於qPCR滴定度，進行BCMA-CAR病毒的滴定，以確定BCMA-CAR/CD19-CAR的最佳載體比率。簡而言之，將T細胞解凍並以3 x10⁶VNC/mL或6 x 10⁶VNC/mL的密度重懸浮。對於經測試的每個MOI，將1mL的細胞懸液鋪在24孔板中，在時間0處轉導，並孵育20-24小時。然後將每1mL培養物用3 x 2mL的PBS+1% HSA手動洗滌。在培養和收穫洗滌後，評估活力和細胞計數，以確定載體滴定對最終產物的影響。然後將收穫的細胞以1x10⁶VNC/mL鋪板於培養基中，並在收穫後72小時和144小時(收穫後(PH)第3天和第6天(轉導後第4天和第7天)，表34和圖31)測量CAR(BCMA和CD19)表現。

表34 BCMA/CD19雙CART細胞產物GMP載體滴定的轉導

在一些實施方式中，將轉導後4天(或收穫後3天)藉由流動式細胞測量術測量的BCMA CAR+ T活細胞的總數用於劑量相關計算。在一些實施方式中，將T細胞按約4e6VNC/mL的密度在中心室中接種。在一些實施方式中，按MOI為4.75使用BCMA CAR載體，並且按MOI為0.5使用CD19 CAR載體。

在單獨的研究中，使用以上所述之共轉導快速製造方法在自動封閉系統設備CliniMACS Prodigy上按大規模製造BCMA/CD19 CART細胞。簡而言之，該過程始於從冷凍保存的白血球中選擇T細胞。使用CD4和CD8微珠對T細胞進行陽性選擇。選擇後，將T細胞洗脫到再應用袋中，並取出樣本以評估細胞濃度、活力和純度。然後用編碼抗BCMA CAR的慢病毒載體和編碼抗CD19 CAR的慢病毒載體活化和轉導細胞。如圖32所示，來自Prodigy的輸出中的T細胞亞群與單採的輸入沒有區別。

實例11：工程化已表現抗BCMA CAR和抗CD19 CAR的T細胞的進一步表徵

該實例描述了如實例9所述產生的BCMA/CD19 CART細胞產物的進一步表徵。該細胞產物包含三個不同的CAR+群體：單一抗BCMA CAR-T細胞、單一抗CD19 CAR-T細胞和雙陽性抗BCMA/抗CD19 CAR-T細胞。另外，該細胞產物還包含未經轉導的T細胞群體。

經BCMA/CD19雙CART細胞產物治療的小鼠的血漿IFN-γ

IFN-γ係響應於靶標參與的CAR-T細胞活化的標誌。在實例9中所述之體內研究中分析了血漿IFN-γ的動力學。如圖33A和33B所示，所有CAR-T治療組在第2天顯示出低水平的循環IFN-γ(10-50pg/ml)，並且此後繼續增加IFN-γ的分泌。

在輸注後長達3週，藉由流動式細胞測量術分析外周血中BCMA/CD19雙CART細胞產物(包括單一抗BCMA、單一抗CD19或雙陽性抗BCMA/抗CD19 CAR-T細胞)的擴增，並且與KMS-11-luc模型中的基準的BCMA CART進行比較。在所有的CAR-T治療組中觀察到CD3+ T細胞和CAR+ T細胞擴增。針對雙或單CAR+ T細胞群體中BCMA/CD19雙CART細胞產物，觀察到劑量依賴性細胞擴增。基於兩項研究的數據，如與BCMA CART相比，BCMA/CD19雙CART細胞產物顯示靶向BCMA的CAR+ T細胞和總的CAR+ T細胞的略高擴增。

藉由評估三個模型(KMS-11、Nalm-6和混合)中CAR+ T細胞的擴增，表明BCMA/CD19雙CART細胞產物的抗原依賴性擴增。在表現BCMA的KMS-11異種移植模型中，雙陽性抗BCMA/抗CD19和單一抗BCMA CAR+ T細胞廣泛擴增，而在表現CD19的Nalm-6異種移植模型中，雙陽性抗BCMA/抗CD19和單一抗CD19 CAR+ T細胞廣泛擴增。雙陽性CAR-T細胞群體能夠由於單獨的BCMA或CD19抗原活化而擴增。在KMS-11模型中，雙陽性抗BCMA/抗CD19和單一抗BCMA CAR+ T細胞的初始擴增速率係相當的，在Nalm-6模型中，雙陽性CAR和單一抗CD19 CAR+ T細胞的初始擴增速率也是相當的。

結論

BCMA/CD19雙CART細胞產物係使用快速製造過程產生的新穎的抗BCMA和抗CD19雙靶向CAR-T細胞產物，可保留T細胞幹性。

在該三個異種移植小鼠模型(KMS-11、Nalm-6和混合)中，BCMA/CD19雙CART細胞產物藉由以抗原依賴性和劑量依賴性方式控制腫瘤生長、誘導CAR-T擴增和細胞介素產生而表現出有效的體內藥理學作用。

藉由使用雙靶向的BCMA/CD19 CART細胞產物(以劑量依賴性方式增加腫瘤消退)實現了混合模型中的腫瘤消除。在混合模型中，單BCMA CART和單CD19 CART均未顯示出腫瘤消退。此外，BCMA/CD19雙CART細胞產物顯示延長的CAR-T體內擴增，而雙陽性CAR群體由於單獨的BCMA或CD19活化而擴增。在針對多發性骨髓瘤的KMS-11-luc-模型中，與BCMA CART相比， BCMA/CD19雙CART細胞產物顯示在經測試的較高劑量水平下的腫瘤生長控制的改善，和在經測試的較低劑量水平下的更好的腫瘤生長控制。

該等結果支持，BCMA/CD19雙CART細胞產物作為雙靶向CAR-T可以藉由BCMA-/CD19+幹細胞/祖細胞對多發性骨髓瘤復發的潛在作用來改變臨床結果，從而可能提供比傳統製造的或靶向單抗原BCMA的CAR-T更深且更持久的反應。

實例12：使用ARM過程製造的抗BCMA CART細胞的I期臨床試驗

本實例描述了一項開放標籤的I期研究，以評估使用ARM過程製造的抗BCMA CART細胞療法在患有復發性和/或難治性多發性骨髓瘤的成年患者中的安全性和耐受性。

主要結果量度包括：投與抗BCMA CAR-T細胞後的前28天內劑量限制毒性(DLT)的發生率和性質；以及不良事件(AE)和嚴重不良事件(SAE)的發生率和嚴重程度，包括投與抗BCMA CAR-T細胞後的實驗室值、ECG和生命體征的變化。

次要結果量度包括：製造成功率(定義為用計畫的靶劑量治療的受試者的數量除以經治療的受試者的總數)；ORR(如由當地研究人員使用IMWG標準確定的，在第3和6個月具有sCR+CR+VGPR+PR的最佳總體響應(BOR)的受試者比例(Kumar等人，Lancet Oncol.[柳葉刀腫瘤學]2016年8月；17(8)：e328-e346，將其藉由引用以其全文併入本文))；CRR(如由當地研究人員使用IMWG標準確定的，在第3個月具有sCR+CR的BOR的受試者比例)；如由當地研究人員評價的DOR(從達到sCR+CR+VGPR+PR至復發或由於MM死亡的時間)；在外周血和骨髓中，CART的經qPCR檢測的轉基因濃度隨時間的變化；以及先前存在和治療誘導的BCMA CAR-T細胞療法的免疫原性(細胞和體液)的匯總。

入選標準如下：

對至少2種先前治療方案具有復發性和/或難治性、並且具有疾病進展的書面證據(IMWG標準)的MM受試者，該治療方案包括IMiD(例如來那度胺或泊馬度胺)、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米、卡非佐米)和獲批的抗CD38抗體(例如達雷木單抗)(如果可用)；

如藉由方案定義的可測量疾病；

篩選時的ECOG體能狀態為0或1；

足夠的血液學數值；並且

必須具有可接受的用於製造的非固定細胞的白血球單採材料。

排除標準如下：

在投與經基因修飾的細胞產物之前，包括先前的BCMA CAR-T療法。不排除已經接受過先前BCMA指導的雙特異性抗體或抗體-藥物軛合物(ADC)的患者；

在入選前6週內或同種異體基因造血幹細胞移植(HSCT)的任何既往史之前進行自體HSCT；

在單採前2週內進行化學療法或任何伴隨的抗癌療法(方案規定的淋巴細胞清除術(LD)化學療法除外)；

在單採收集後2週或5個半衰期(以較短者為准)內，用小分子靶向抗腫瘤藥治療；並且

在單採收集前4週內已接受抗體或免疫療法(除達雷木單抗以外)。單採收集前3週內進行達雷木單抗治療。

實例13：對BCMA/CD19雙抗體CART的評估

使用NALM-6螢光素化模型評估CD19抗原應答元件在新穎的單鏈雙抗體CART中的功效。在CART給藥的第-7天，通過側尾靜脈注射而植入1 x 10⁶個NALM-6 Luc細胞。稱體重，並且每週進行兩次體內生物發光成像(BLI)以評估腫瘤進展。每週兩次對動物進行測量，並且一旦腫瘤負荷達到3x10⁶個光子通量(光子/秒)，就將動物隨機分為特定組(第-1天)。在第0天，將雙抗體CAR-T從液氮中移出並解凍用於進行注射。通過側尾靜脈注射1x10⁶個雙CAR陽性細胞。在數週的過程中進行了實驗評估以藉由評估BLI隨時間的減少來確定哪種構建體具有最佳功能性功效。

等同物

本文引用的每一個專利、專利申請和出版物的揭露內容據此藉由引用以其全文併入本文。雖然已經參照某些實施方式揭露了本發明，但是本領域其他技術人員可以在不偏離本發明的真實精神以及範圍的情況下設想本發明的另外的實施方式以及變化。所附請求項旨在理解為包括所有這類實施方式以及等同變化。

<110> 瑞士商諾華公司(NOVARTIS AG)

<120> 嵌合抗原受體及其用途

<130> N2067-7166TW

<140>

<141>

<150> 62/940,509

<151> 2019-11-26

<160> 417

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 1

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<213> 智人

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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

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<223> 人工序列的描述：合成多肽

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<221> 尚未歸類的特徵

<222> (1)..(30)

<223> 此序列可以包含1-6個"Gly Gly Gly Gly Ser” 重複單元

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<223> 參見所提交的說明書中替換和優選實施例的詳細描述

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<221> 尚未歸類的特徵

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<223> 此序列可以包含50-5000個核苷酸

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<221> 尚未歸類的特徵

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<221> 尚未歸類的特徵

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<223> 此序列可以包含1-10個"Gly Gly Gly Ser” 重複單元

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 54

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 55

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 56

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 57

<210> 58

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 58

<210> 59

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 59

<210> 60

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 60

<210> 61

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 61

<210> 62

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 62

<210> 63

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 63

<210> 64

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 64

<210> 65

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 65

<210> 66

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 66

<210> 67

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 67

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 68

<210> 69

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 69

<210> 70

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 70

<210> 71

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 71

<210> 72

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 72

<210> 73

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 73

<210> 74

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 74

<210> 75

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 75

<210> 76

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 76

<210> 77

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 77

<210> 78

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 78

<210> 79

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 79

<210> 80

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 80

<210> 81

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 81

<210> 82

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 82

<210> 83

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 83

<210> 84

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (4)..(4)

<223> V或缺失

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (5)..(5)

<223> P或缺失

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> W或Y

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (7)..(7)

<223> G、Y或D

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (8)..(8)

<223> E、D或V

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (9)..(9)

<223> S或D

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (11)..(11)

<223> L或Y

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (12)..(12)

<223> F或L

<400> 84

<210> 85

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> V或缺失

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (7)..(7)

<223> P或缺失

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (8)..(8)

<223> W或Y

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (9)..(9)

<223> G,Y，或D

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (10)..(10)

<223> E、D或V

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (11)..(11)

<223> S或D

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (13)..(13)

<223> L或Y

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (14)..(14)

<223> F或L

<400> 85

<210> 86

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 86

<210> 87

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 87

<210> 88

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 88

<210> 89

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 89

<210> 90

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 90

<210> 91

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 91

<210> 92

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 92

<210> 93

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 93

<210> 94

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 94

<210> 95

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 95

<210> 96

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 96

<210> 97

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 97

<210> 98

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 98

<210> 99

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 99

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 100

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 101

<210> 102

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 102

<210> 103

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 103

<210> 104

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 104

<210> 105

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 105

<210> 106

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 106

<210> 107

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 107

<210> 108

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 108

<210> 109

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 109

<210> 110

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 110

<210> 111

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 111

<210> 112

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 112

<210> 113

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 113

<210> 114

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 114

<210> 115

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 115

<210> 116

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 116

<210> 117

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 117

<210> 118

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 118

<210> 119

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 119

<210> 120

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 120

<210> 121

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 121

<210> 122

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 122

<210> 123

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 123

<210> 124

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 124

<210> 125

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 125

<210> 126

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 126

<210> 127

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 127

<210> 128

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 128

<210> 129

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 129

<210> 130

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (5)..(5)

<223> D或K

<400> 130

<210> 131

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (1)..(1)

<223> D或E

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> P或L

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (7)..(7)

<223> S或R

<400> 131

<210> 132

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (8)..(8)

<223> T或A

<400> 132

<210> 133

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> D或K

<400> 133

<210> 134

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (1)..(1)

<223> D或E

<400> 134

<210> 135

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> T或A

<400> 135

<210> 136

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (4)..(4)

<223> D或K

<400> 136

<210> 137

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 137

<210> 138

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 138

<210> 139

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 139

<210> 140

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 140

<210> 141

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 141

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 142

<210> 143

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 143

<210> 144

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 144

<210> 145

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 145

<210> 146

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 146

<210> 147

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 147

<210> 148

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 148

<210> 149

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 149

<210> 150

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 150

<210> 151

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 151

<210> 152

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 152

<210> 153

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 153

<210> 154

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 154

<210> 155

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 155

<210> 156

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 156

<210> 157

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 157

<210> 158

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 158

<210> 159

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 159

<210> 160

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 160

<210> 161

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 161

<210> 162

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 162

<210> 163

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 163

<210> 164

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 164

<210> 165

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 165

<210> 166

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 166

<210> 167

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 167

<210> 168

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 168

<210> 169

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 169

<210> 170

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 170

<210> 171

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 171

<210> 172

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 172

<210> 173

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 173

<210> 174

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 174

<210> 175

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 175

<210> 176

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 176

<210> 177

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 177

<210> 178

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 178

<210> 179

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (1)..(1)

<223> G或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> W或R

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (5)..(5)

<223> S或N

<400> 179

<210> 180

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (1)..(1)

<223> N或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> K或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (4)..(4)

<223> Q或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (5)..(5)

<223> D或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> G或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (8)..(8)

<223> E或Y

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (9)..(9)

<223> K或I

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (12)..(12)

<223> V或A

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (16)..(16)

<223> R或K

<400> 180

<210> 181

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (1)..(1)

<223> A或W

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> D或S

<400> 181

<210> 182

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (4)..(4)

<223> Y或F

<400> 182

<210> 183

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (1)..(1)

<223> T或M

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (4)..(4)

<223> L或I

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (5)..(5)

<223> E或G

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (8)..(8)

<223> S或缺失

<400> 183

<210> 184

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> G或S

<400> 184

<210> 185

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (1)..(1)

<223> K或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (2)..(2)

<223> Q或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> D或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (4)..(4)

<223> G或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> E或Y

<400> 185

<210> 186

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (2)..(2)

<223> L或I

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> E或G

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> S或缺失

<400> 186

<210> 187

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (6)..(6)

<223> G或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (8)..(8)

<223> W或R

<400> 187

<210> 188

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (2)..(2)

<223> K或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> Q或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (4)..(4)

<223> D或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (5)..(5)

<223> G或S

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (7)..(7)

<223> E或Y

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (8)..(8)

<223> K或I

<400> 188

<210> 189

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (3)..(3)

<223> A或W

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (5)..(5)

<223> D或S

<400> 189

<210> 190

<211> 521

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述： PGK啟動子序列

<400> 190

<210> 191

<211> 221

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 191

<210> 192

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 192

<210> 193

<211> 422

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 193

<210> 194

<400> 194

000

<210> 195

<400> 195

000

<210> 196

<400> 196

000

<210> 197

<400> 197

000

<210> 198

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 198

<210> 199

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 199

<210> 200

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 200

<210> 201

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 201

<210> 202

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 202

<210> 203

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 203

<210> 204

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 204

<210> 205

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 205

<210> 206

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 206

<210> 207

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 207

<210> 208

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 208

<210> 209

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 209

<210> 210

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 210

<210> 211

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 211

<210> 212

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 212

<210> 213

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 213

<210> 214

<211> 1000

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 214

<210> 215

<211> 3000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 215

<210> 216

<211> 1001

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 216

<210> 217

<211> 3003

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 217

<210> 218

<211> 1002

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 218

<210> 219

<211> 3006

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 219

<210> 220

<211> 991

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 220

<210> 221

<211> 2973

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 221

<210> 222

<211> 991

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 222

<210> 223

<211> 2973

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 223

<210> 224

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 224

<210> 225

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 225

<210> 226

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 226

<210> 227

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 227

<210> 228

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 228

<210> 229

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 229

<210> 230

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 230

<210> 231

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 231

<210> 232

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 232

<210> 233

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 233

<210> 234

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 234

<210> 235

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 235

<210> 236

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 236

<210> 237

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 237

<210> 238

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 238

<210> 239

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 239

<210> 240

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 240

<210> 241

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 241

<210> 242

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 242

<210> 243

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 243

<210> 244

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 244

<210> 245

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 245

<210> 246

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 246

<210> 247

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 247

<210> 248

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 248

<210> 249

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 249

<210> 250

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 250

<210> 251

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 251

<210> 252

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 252

<210> 253

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 253

<210> 254

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 254

<210> 255

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 255

<210> 256

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 256

<210> 257

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 257

<210> 258

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 258

<210> 259

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 259

<210> 260

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 260

<210> 261

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 261

<210> 262

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 262

<210> 263

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 263

<210> 264

<400> 264

000

<210> 265

<400> 265

000

<210> 266

<400> 266

000

<210> 267

<400> 267

000

<210> 268

<400> 268

000

<210> 269

<400> 269

000

<210> 270

<400> 270

000

<210> 271

<400> 271

000

<210> 272

<400> 272

000

<210> 273

<400> 273

000

<210> 274

<400> 274

000

<210> 275

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 275

<210> 276

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 276

<210> 277

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 277

<210> 278

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 278

<210> 279

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 279

<210> 280

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 280

<210> 281

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (12)..(12)

<223> 任何胺基酸

<220>

<221> 經修飾的殘基

<222> (78)..(78)

<223> 任何胺基酸

<400> 281

<210> 282

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 282

<210> 283

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 283

<210> 284

<211> 1132

<212> PRT

<213> 智人

<400> 284

<210> 285

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 285

<210> 286

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 286

<210> 287

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 287

<210> 288

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 288

<210> 289

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 289

<210> 290

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 290

<210> 291

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 291

<210> 292

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 292

<210> 293

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 293

<210> 294

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 294

<210> 295

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 295

<210> 296

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 296

<210> 297

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 297

<210> 298

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 298

<210> 299

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 299

<210> 300

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 300

<210> 301

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 301

<210> 302

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 302

<210> 303

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 303

<210> 304

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 304

<210> 305

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 305

<210> 306

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 306

<210> 307

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 307

<210> 308

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 308

<210> 309

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 309

<210> 310

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 310

<210> 311

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 311

<210> 312

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 312

<210> 313

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 313

<210> 314

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 314

<210> 315

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 315

<210> 316

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 316

<210> 317

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 317

<210> 318

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 318

<210> 319

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 319

<210> 320

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 320

<210> 321

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 321

<210> 322

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 322

<210> 323

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 323

<210> 324

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 324

<210> 325

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 325

<210> 326

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 326

<210> 327

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 327

<210> 328

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 328

<210> 329

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 329

<210> 330

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 330

<210> 331

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 331

<210> 332

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 332

<210> 333

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 333

<210> 334

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 334

<210> 335

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 335

<210> 336

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 336

<210> 337

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 337

<210> 338

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 338

<210> 339

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 339

<210> 340

<211> 714

<212> PRT

<213> A工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 340

<210> 341

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 341

<210> 342

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 342

<210> 343

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 343

<210> 344

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 344

<210> 345

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 345

<210> 346

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 346

<210> 347

<211> 708

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 347

<210> 348

<211> 708

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 348

<210> 349

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 349

<210> 350

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 350

<210> 351

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 351

<210> 352

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 352

<210> 353

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 353

<210> 354

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 354

<210> 355

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 355

<210> 356

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 356

<210> 357

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 357

<210> 358

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 358

<210> 359

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 359

<210> 360

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 360

<210> 361

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 361

<210> 362

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 362

<210> 363

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 363

<210> 364

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 364

<210> 365

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 365

<210> 366

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 366

<210> 367

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 367

<210> 368

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 368

<210> 369

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 369

<210> 370

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 370

<210> 371

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 371

<210> 372

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 372

<210> 373

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 373

<210> 374

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 374

<210> 375

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 375

<210> 376

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 376

<210> 377

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 377

<210> 378

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 378

<210> 379

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 379

<210> 380

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 380

<210> 381

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 381

<210> 382

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 382

<210> 383

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 383

<210> 384

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 384

<210> 385

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 385

<210> 386

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 386

<210> 387

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 387

<210> 388

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 388

<210> 389

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 389

<210> 390

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 390

<210> 391

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 391

<210> 392

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 392

<210> 393

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 393

<210> 394

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 394

<210> 395

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 395

<210> 396

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 396

<210> 397

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 397

<210> 398

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 398

<210> 399

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 399

<210> 400

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 400

<210> 401

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 401

<210> 402

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 402

<210> 403

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 403

<210> 404

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 404

<210> 405

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 405

<210> 406

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 406

<210> 407

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 407

<210> 408

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 408

<210> 409

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 409

<210> 410

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 410

<210> 411

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 411

<210> 412

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 412

<210> 413

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 413

<210> 414

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 414

<210> 415

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 415

<210> 416

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 416

<210> 417

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 417

Claims

一種分離的細胞，該分離的細胞包含：

(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；

(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或

(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和

(b)第二抗原結合結構域。
如請求項1所述之分離的細胞，其中：

該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在兩個嵌合抗原受體(CAR)中，或

該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在一個CAR中。
如請求項1或2所述之分離的細胞，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132的胺基酸序列。
如請求項3所述之分離的細胞，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97；

(ii)SEQ ID NO：86、109、88、95、114和115；或

(iii)SEQ ID NO：86、109、88、95、114和97。
如請求項3或4所述之分離的細胞，其中：

(i)該VH包含SEQ ID NO：93或112的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該VH由SEQ ID NO：260、94或113的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項3-5中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該VL包含SEQ ID NO：102、118或124的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該VL由SEQ ID NO：261、103、119或125的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項3-6中任一項所述之分離的細胞，其中該VH和VL分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：93和102；

(ii)SEQ ID NO：112和118；或

(iii)SEQ ID NO：112和124。
如請求項3-7中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該第一抗原結合結構域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段包含SEQ ID NO：105、120或126的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：253、106、121或127的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項3-8中任一項所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中，其中：

(i)該第一CAR包含SEQ ID NO：107、226、122或128的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該第一CAR由SEQ ID NO：259、258、108、123或129的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項1或2所述之分離的細胞，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56的胺基酸序列。
如請求項10所述之分離的細胞，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56；

(ii)SEQ ID NO：44、45、46、54、55和56；或

(iii)SEQ ID NO：44、45、68、54、55和56。
如請求項10或11所述之分離的細胞，其中：

(i)該VH包含SEQ ID NO：78、52或70的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該VH由SEQ ID NO：79、53或71的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項10-12中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該VL包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該VL由SEQ ID NO：62的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項10-13中任一項所述之分離的細胞，其中該VH和VL分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：78和61；

(ii)SEQ ID NO：52和61；或

(iii)SEQ ID NO：70和61。
如請求項10-14中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該第一抗原結合結構域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段包含SEQ ID NO：80、64或72的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：81、65或73的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項10-15中任一項所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中，其中：

(i)該第一CAR包含SEQ ID NO：224、82、66或74的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該第一CAR由SEQ ID NO：83、67或75的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項1或2所述之分離的細胞，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183的胺基酸序列。
如請求項17所述之分離的細胞，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：137、138、139、147、148和149；或

(ii)SEQ ID NO：160、161、162、147、170和171。
如請求項17或18所述之分離的細胞，其中：

(i)該VH包含SEQ ID NO：145或168的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該VH由SEQ ID NO：146或169的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項17-19中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該VL包含SEQ ID NO：154或173的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該VL由SEQ ID NO：155或174的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項17-20中任一項所述之分離的細胞，其中該VH和VL分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：145和154，或

(ii)SEQ ID NO：168和173。
如請求項17-21中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該第一抗原結合結構域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段包含SEQ ID NO：156或175的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；

(ii)該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：157或176的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項17-22中任一項所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中，其中：

(i)該第一CAR包含SEQ ID NO：158或177的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(iii)該第一CAR由SEQ ID NO：159或178的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
一種分離的細胞，該分離的細胞包含：

(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含：

(i)VH和VL，該VH包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該VL包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；

(ii)VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：239和242的胺基酸序列，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；或

(iii)scFv，該scFv包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列；和

(b)第二抗原結合結構域。
如請求項24所述之分離的細胞，其中：

該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在兩個嵌合抗原受體(CAR)中，或

該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在一個CAR中。
如請求項1-25中任一項所述之分離的細胞，其中該第二抗原結合結構域與抗原結合，該抗原選自：CD19，CD5，CD10，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD30，CD34，CD37，CD38，CD40，CD53，CD69，CD72，CD73，CD74，CD75，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD123，CD135，CD138，CD179，CD269，Flt3，ROR1，FcRn5，FcRn2，CS-1，CXCR4、5、7，IL-7/3R，IL7/4/3R或IL4R，視需要其中該B細胞抗原選自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1、CD138、CD123、CD33、CD34、CLL-1、葉酸受體β或FLT3，視需要其中該第二抗原結合結構域與CD19結合。
如請求項1-25中任一項所述之分離的細胞，其中該第二抗原結合結構域與抗原結合，該抗原選自：EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。
如請求項1-25中任一項所述之分離的細胞，其中該第二抗原結合結構域與CD19結合，視需要其中：

(i)該第二抗原結合結構域包含表19或表22中列出的抗CD19序列的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2、和/或LC CDR3，例如分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3；

(ii)該第二抗原結合結構域包含表19或表22中列出的抗CD19序列的VH和/或VL，例如分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的VH和VL；

(iii)該第二抗原結合結構域包含表19或表22中列出的抗CD19序列的scFv，例如包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的scFv；和/或

(iv)該第二抗原結合結構域佈置在第二CAR中，其中該CAR包含表19或表22中列出的抗CD19序列的CAR，例如包含SEQ ID NO：225或229的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列的CAR。
如請求項1-25或28中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該第一抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含以下胺基酸序列：

(a)SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97；

(b)SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56；或

(c)SEQ ID NO：44、45、46、54、55和56，

並且該第二抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列；

(ii)該第一抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含以下胺基酸序列：

(a)SEQ ID NO：93和102；

(b)SEQ ID NO：78和61；或

(c)SEQ ID NO：52和61，

並且該第二抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列；

(iii)該第一抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：105、80或64的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列；或

(iv)該第一抗原結合結構域由SEQ ID NO：253、106、81或65的核酸序列編碼，並且該第二抗原結合結構域由SEQ ID NO：212的核酸序列編碼。
如請求項1-29中任一項所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域佈置在第一CAR中，並且該第二抗原結合結構域佈置在第二CAR中，其中該第一CAR進一步包含第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，和/或該第二CAR進一步包含第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域。
如請求項30所述之分離的細胞，其中該第一CAR由第一核酸序列編碼，並且該第二CAR由第二核酸序列編碼，其中該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上。
如請求項30所述之分離的細胞，其中該第一CAR由第一核酸序列編碼，並且該第二CAR由第二核酸序列編碼，其中該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上。
如請求項32所述之分離的細胞，其中該單個核酸分子在5'至3'方向上包含以下組態：

(i)編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-編碼第一跨膜結構域的核酸序列-編碼第一細胞內傳訊結構域的核酸序列-編碼連接子的核酸序列-編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-編碼第二跨膜結構域的核酸序列-編碼第二細胞內傳訊結構域的核酸序列；或

(ii)編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-編碼第二跨膜結構域的核酸序列-編碼第二細胞內傳訊結構域的核酸序列-編碼連接子的核酸序列-編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-編碼第一跨膜結構域的核酸序列-編碼第一細胞內傳訊結構域的核酸序列，

視需要其中該連接子包含自身切割位點，視需要其中該連接子包含P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點，視需要其中該連接子包含P2A位點，視需要其中：

該連接子由SEQ ID NO：209的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼，或

該連接子包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項32或33所述之分離的細胞，其中：

(i)該單個核酸分子包含SEQ ID NO：215、217、219、221或223的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列；或

(ii)該單個核酸分子編碼SEQ ID NO：214、216、218、220或222的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項1-29中任一項所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域佈置在一個CAR中，其中該CAR進一步包含跨膜結構域和細胞內傳訊結構域。
如請求項35所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域包含第一VH(VH1)和第一VL(VL1)，並且該第二抗原結合結構域包含第二VH(VH2)和第二VL(VL2)，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：

(i)VH2-視需要連接子1(「L1」)-VL1-視需要連接子2(「L2」)-VH1-視需要連接子3(「L3」)-VL2；

(ii)VH1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VL1；

(iii)VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2；

(iv)VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2；

(v)VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2；

(vi)VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1；

(vii)VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1；或

(viii)VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1。
如請求項36所述之分離的細胞，其中：

(i)該VH1和VL1分別包含以下胺基酸序列：

(a)SEQ ID NO：93和102(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)；

(b)SEQ ID NO：333和334(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)；

(c)SEQ ID NO：78和61(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)；或

(d)SEQ ID NO：335和336(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)，和/或

(ii)該VH2和VL2分別包含以下胺基酸序列：

(a)SEQ ID NO：250和251(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)；或

(b)SEQ ID NO：331和332(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)。
如請求項36或37所述之分離的細胞，其中L1或L3包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，和/或L2包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。
如請求項35-38中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該CAR包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成：SEQ ID NO：321-330，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(ii)該CAR包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成：SEQ ID NO：339-348，或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項35-39中任一項所述之分離的細胞，其中該CAR由核酸分子編碼，該核酸分子在5'至3'方向上包含以下組態：

(i)編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-視需要編碼連接子的核酸序列-編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-編碼跨膜結構域的核酸序列-編碼細胞內傳訊結構域的核酸序列；或

(ii)編碼該第二抗原結合結構域的核酸序列-視需要編碼連接子的核酸序列-編碼該第一抗原結合結構域的核酸序列-編碼跨膜結構域的核酸序列-編碼細胞內傳訊結構域的核酸序列。
如請求項35-40中任一項所述之分離的細胞，其中該CAR在N-至C-方向上包含以下組態：

(i)該第一抗原結合結構域-視需要連接子-該第二抗原結合結構域-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；或

(ii)該第二抗原結合結構域-視需要連接子-該第一抗原結合結構域-跨膜結構域-該細胞內傳訊結構域。
如請求項1-41中任一項所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域或第二抗原結合結構域包含VH和VL，其中該VH和VL藉由連接子連接，視需要其中該連接子包含SEQ ID NO：5、63、104或243的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項30-42中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域包含選自T細胞受體的α、β或ζ鏈，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137或CD154的蛋白質的跨膜結構域；

(ii)該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(iii)該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域由SEQ ID NO：17的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項30-43中任一項所述之分離的細胞，其中該第一抗原結合結構域或第二抗原結合結構域藉由鉸鏈區(例如第一或第二鉸鏈區)與該跨膜結構域、第一跨膜結構域或第二跨膜結構域連接，視需要其中：

(i)該鉸鏈區包含SEQ ID NO：2、3或4的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；

(ii)該鉸鏈區由SEQ ID NO：13、14或15的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼；

(iii)該鉸鏈區和該跨膜結構域包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(iv)該鉸鏈區和該跨膜結構域由SEQ ID NO：203或213的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項30-44中任一項所述之分離的細胞，其中該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含初級傳訊結構域(例如第一或第二初級傳訊結構域)，視需要其中：

(i)該初級傳訊結構域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d的功能性傳訊結構域；

(ii)該初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(iii)該初級傳訊結構域由SEQ ID NO：20、21或205的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項30-45中任一項所述之分離的細胞，其中該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含共刺激傳訊結構域(例如第一或第二共刺激傳訊結構域)，視需要其中：

(i)該共刺激傳訊結構域包含源自MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK細胞受體、BTLA、Toll配位基受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、 NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB或與CD83特異性結合的配位基的功能性傳訊結構域；

(ii)該共刺激傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(iii)該共刺激傳訊結構域由SEQ ID NO：18或204的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項30-46中任一項所述之分離的細胞，其中該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含源自4-1BB的功能性傳訊結構域和源自CD3ζ的功能性傳訊結構域，視需要其中該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)和SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)，視需要其中該細胞內傳訊結構域、第一細胞內傳訊結構域或第二細胞內傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列和SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列。
如請求項30-47中任一項所述之分離的細胞，其中該CAR、第一CAR或第二CAR進一步包含前導序列(例如第一或第二前導序列)，其中：

(i)該前導序列包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(ii)該前導序列由SEQ ID NO：199或210的核酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列編碼。
如請求項30-34或42-48中任一項所述之分離的細胞，其中：

(i)該第一前導序列和該第二前導序列由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼；

(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼；

(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼；和/或

(iv)該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，和/或該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。
如請求項49所述之分離的細胞，其中：

(i)該第一前導序列和該第二前導序列包含相同的胺基酸序列(例如該第一前導序列和該第二前導序列包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)或包含不同的胺基酸序列；

(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區包含相同的胺基酸序列(例如該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)或包含不同的胺基酸序列；

(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域包含相同的胺基酸序列(例如該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)或包含不同的胺基酸序列；和/或

(iv)該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域包含相同的胺基酸序列或包含不同的胺基酸序列，

視需要其中該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含相同的胺基酸序列(例如該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)或包含不同的胺基酸序列，和/或

該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含相同的胺基酸序列(例如該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列)或包含不同的胺基酸序列(例如該第一和第二共刺激傳訊結構域分別包含4-1BB共刺激結構域序列和CD28共刺激結構域序列；或分別包含CD28共刺激結構域序列和4-1BB共刺激結構域序列)。
如請求項49或50所述之分離的細胞，其中：

(i)該第一前導序列和該第二前導序列由分別包含SEQ ID NO：199和210的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：210和199的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；

(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由分別包含SEQ ID NO：337和13的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：13和337的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；

(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由分別包含SEQ ID NO：338和17的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：17和338的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；

(iv)該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由分別包含SEQ ID NO：204和18的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：18和204的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；和/或

(v)該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由分別包含SEQ ID NO：205和21的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：21和205的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼。
如請求項30-51中任一項所述之分離的細胞，其中該CAR、第一CAR或第二CAR由包含土撥鼠肝炎轉錄後調控元件(WPRE)的核酸分子編碼。
一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含：

(a)編碼第一抗原結合結構域的第一核酸序列，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；

(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或

(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和

(b)編碼第二抗原結合結構域的第二核酸序列。
如請求項53所述之分離的核酸分子，其中該核酸分子包含第一核酸分子和第二核酸分子，該第一核酸分子和第二核酸分子係分開的核酸分子，並且其中該第一核酸序列佈置在該第一核酸分子上，並且該第二核酸序列佈置在該第二核酸分子上。
一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含：

(a)編碼第一抗原結合結構域的第一核酸序列，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含：

(i)VH和VL，該VH包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該VL包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；

(ii)VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：239和242的胺基酸序列，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；或

(iii)scFv，該scFv包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列；和

(b)編碼第二抗原結合結構域的第二核酸序列。
一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第一CAR包含第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，並且其中該第二CAR包含第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，該第二抗原結合結構域係抗CD19結合結構域，其中：

(i)該第一抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含EQ ID NO：86、87、88、95、96和97的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列；

(ii)該第一抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：93和102的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列；

(iii)該第一抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列；

(iv)該第一CAR包含SEQ ID NO：107或226的胺基酸序列，並且該第二CAR包含SEQ ID NO：225或229的胺基酸序列；或

(v)該分離的核酸分子包含SEQ ID NO：271的核酸序列。
一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第一CAR包含第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，並且其中該第二CAR包含第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，該第二抗原結合結構域係抗CD19結合結構域，其中：

(i)該第一抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR分別包含SEQ ID NO：44、45、76、54、55和56的胺基酸序列，該第二抗原結合結構域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295和245-249的胺基酸序列；

(ii)該第一抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：78和61的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列；

(iii)該第一抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列，並且該第二抗原結合結構域包含scFv，該scFv包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列；

(iv)該第一CAR包含SEQ ID NO：82或224的胺基酸序列，並且該第二CAR包含SEQ ID NO：225或229的胺基酸序列；或

(v)該分離的核酸分子包含SEQ ID NO：215的核酸序列。
一種分離的多肽分子，該分離的多肽分子由如請求項53-57中任一項所述之核酸分子編碼。
一種分離的CAR，其中該CAR包含：

(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2) 和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；

(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或

(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和

(b)第二抗原結合結構域。
一種分離的CAR，其中該CAR包含：

(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含：

(i)VH和VL，該VH包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，該VL包含在表20或26中列出的抗BCMA序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；

(ii)VH和VL，該VH和VL分別包含SEQ ID NO：239和242的胺基酸序列，其中該VH和VL藉由連接子連接，該連接子包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列；或

(iii)scFv，該scFv包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列；和

(b)第二抗原結合結構域。
一種載體，該載體包含如請求項53-57中任一項所述之核酸分子、或編碼如請求項59或60所述之CAR的核酸分子，視需要其中該載體選自DNA載體、RNA載體、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。
如請求項61所述之載體，該載體進一步包含EF-1啟動子，該EF-1啟動子包含SEQ ID NO：11的核酸序列。
一種分離的細胞，該分離的細胞包含如請求項53-57中任一項所述之核酸分子、如請求項58所述之多肽分子、如請求項59或60所述之CAR或如請求項61或62所述之載體。
如請求項1-52或63中任一項所述之分離的細胞，其中該細胞係T細胞或NK細胞。
一種製備細胞之方法，該方法包括用如請求項62或63所述之載體轉導細胞，視需要其中該細胞係T細胞或NK細胞。
一種製備RNA工程化細胞之方法，該方法包括將體外轉錄的RNA或合成RNA引入細胞，其中該RNA包含如請求項53-57中任一項所述之核酸分子、或編碼如請求項59或60所述之CAR的核酸分子，視需要其中該細胞係T細胞或NK細胞。
一種製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：

(i)使細胞(例如T細胞，例如從冷凍或新鮮的白血球單採產物中分離的T細胞)群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或與刺激細胞表面上共刺激分子的藥劑接觸(例如結合)；

(ii)使該細胞(例如T細胞)群體與如請求項53-57中任一項所述之核酸分子、或編碼如請求項59或60所述之CAR的核酸分子接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體，以及

(iii)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製該細胞群體)或投與，其中：

(a)步驟(ii)與步驟(i)一起進行或在步驟(i)開始後不晚於20小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時進行，並且

步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於30(例如26)小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於24小時進行，

(b)步驟(ii)與步驟(i)一起進行或在步驟(i)開始後不晚於20小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時進行，並且

步驟(iii)在步驟(ii)開始後不晚於30小時進行，例如在步驟(ii)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時進行，或

(c)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%；

視需要其中步驟(ii)中的核酸分子在病毒載體上，視需要其中步驟(ii)中的核酸分子係病毒載體上的RNA分子，視需要其中步驟(ii)包括用病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該病毒載體包含編碼該CAR的核酸分子。
如請求項67所述之方法，其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑係刺激CD3的藥劑(例如抗CD3抗體)，並且其中該刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何組合的藥劑；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑或該刺激共刺激分子的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑或該刺激共刺激分子的藥劑不包含珠；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含抗CD3抗體，並且該刺激共刺激分子的藥劑包含抗CD28抗體；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD3抗體，並且該刺激共刺激分子的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD28抗體；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑和該刺激共刺激分子的藥劑包含T細胞TransAct^TM。
如請求項67或68所述之方法，其中步驟(i)和/或(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑、MALT1抑制劑、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。
如請求項67-69中任一項所述之方法，其中步驟(i)和/或(ii)在包含血清替代物的無血清細胞培養基中進行，視需要其中該血清替代物係CTS^TM免疫細胞血清替代物(ICSR)。
如請求項67-70中任一項所述之方法，該方法進一步包括在步驟(i)之前：

(iv)(視需要)接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的新鮮白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，如新鮮全血產物、新鮮骨髓產物、或新鮮腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的新鮮產物))，和

(v)從新鮮白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，如新鮮全血產物、新鮮骨髓產物、或新鮮腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的新鮮產物))中分離在步驟(i)中接觸的細胞(例如T細胞，如CD8+和/或CD4+ T細胞)群體，視需要其中：

步驟(iii)在步驟(v)開始後不晚於35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於27、28、29、30、31、32、33、34、或35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於30小時進行，或

例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(v)結束時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%。
如請求項67-70中任一項所述之方法，該方法進一步包括在步驟(i)之前：接受從來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，如從全血、骨髓、或腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如胸腺切除術)中分離的冷凍保存的T細胞)中分離的冷凍保存的T細胞。
如請求項67-70中任一項所述之方法，該方法進一步包括在步驟(i)之前：

(iv)(視需要)接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))，和

(v)從冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))中分離在步驟(i)中接觸的細胞(例如T細胞，例如CD8+和/或CD4+ T細胞)群體，視需要其中：

步驟(iii)在步驟(v)開始後不晚於35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於27、28、29、30、31、32、33、34、或35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於30小時進行，或

例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(v)結束時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%。
如請求項67-73中任一項所述之方法，該方法進一步包括步驟(vi)：

將來自步驟(iii)的細胞群體的一部分培養至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超過7天，並且測量在該部分中的CAR表現水平(例如測量該部分中表現CAR的活細胞的百分比)，視需要其中：

步驟(iii)包括收穫和冷凍該細胞(例如T細胞)群體，並且步驟(vi)包括將來自步驟(iii)的細胞群體的一部分解凍，將該部分培養至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超過7天，並且測量該部分中的CAR表現水平(例如測量該部分中表現CAR的活細胞的百分比)。
一種製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：

(1)使細胞(例如T細胞，如從冷凍的白血球單採產物分離的T細胞)群體與細胞介素接觸，該細胞介素選自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、或其組合；

(2)使該細胞(例如T細胞)群體與如請求項53-57中任一項所述之核酸分子、或編碼如請求項59或60所述之CAR的核酸分子接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體，以及

(3)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製該細胞群體)或投與，其中：

(a)步驟(2)與步驟(1)一起進行或在步驟(1)開始後不晚於5小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於1、2、3、4、或5小時進行，並且

步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於26小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於22、23、或24小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於24小時進行，或

(b)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%；

視需要其中步驟(2)中的核酸分子在病毒載體上，視需要其中步驟(ii)中的核酸分子係病毒載體上的RNA分子，視需要其中步驟(ii)包括用病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該病毒載體包含編碼該CAR的核酸分子。
如請求項75所述之方法，其中該細胞群體在體外不與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸，或如果進行接觸，接觸步驟少於2小時，例如不超過1小時或1.5小時。
如請求項76所述之方法，其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑係刺激CD3的藥劑(例如抗CD3抗體)，並且其中該刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何組合的藥劑，視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑或該刺激共刺激分子的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)。
如請求項75-77中任一項所述之方法，其中步驟(1)和/或(2)在細胞培養基中進行，該細胞培養基包含：

不超過5%、4%、3%、2%、1%、或0%血清，視需要其中步驟(1)和/或(2)在細胞培養基中進行，該細胞培養基包含約2%血清、或

LSD1抑制劑或MALT1抑制劑。
如請求項75-78中任一項所述之方法，該方法進一步包括接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))。
如請求項67-79中任一項所述之方法，其中：

在步驟(i)或步驟(1)開始時的細胞群體已經富集了表現IL6R的細胞(例如對IL6Rα和/或IL6Rβ呈陽性的細胞)；或

在步驟(i)或步驟(1)開始時的細胞群體包含不少於50%、60%、或70%的表現IL6R的細胞(例如對IL6Rα和/或IL6Rβ呈陽性的細胞)。
如請求項67-80中任一項所述之方法，其中步驟(i)和(ii)或步驟(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的細胞培養基中進行。
一種細胞群體，該細胞群體藉由如請求項67-81中任一項所述之方法製備。
一種被工程化以表現CAR的細胞群體(「一種表現CAR的細胞群體」)，該群體包含：

(a)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，約相同百分比的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；

(b)例如如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；

(c)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，百分比增加的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；

(d)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；

(e)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；

(f)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，百分比降低的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞，例如降低至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%；

(g)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；

(h)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；或

(i)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，百分比增加的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞，

其中該群體包含細胞，該細胞包含：

(a)第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域係抗BCMA結合結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含以下胺基酸序列：

(i)SEQ ID NO：86、130、88、95、131和132；

(ii)SEQ ID NO：44、45、84、54、55和56；或

(iii)SEQ ID NO：179、180、181、147、182和183；和

(b)第二抗原結合結構域。
一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1-52、63或64中任一項所述之細胞，或如請求項82或83所述之細胞群體，以及藥學上可接受的運載體。
一種在受試者中提供抗腫瘤免疫之方法，該方法包括向該受試者投與有效量的如請求項1-52、63或64中任一項所述之細胞，如請求項82或83所述之細胞群體，或如請求項84所述之藥物組成物。
一種對患有與BCMA表現相關的疾病的受試者進行治療之方法，該方法包括向該受試者投與有效量的如請求項1-52、63或64中任一項所述之細胞，如請求項82或83所述之細胞群體，或如請求項84所述之藥物組成物。
如請求項86所述之方法，其中該與BCMA表現相關的疾病係：

(i)癌症或惡性腫瘤，或選自以下一者或多者的癌前病症：骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期，或

(ii)與BCMA表現相關的非癌症相關適應症。
如請求項86或87所述之方法，其中該疾病係血液癌或實體癌。
如請求項86-88中任一項所述之方法，其中該疾病選自：急性白血病、B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生症、MALT淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良和骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、前列腺癌(例如，去勢抵抗性或治療抵抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌、肺癌、漿細胞增殖性障礙(例如，無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義未明的單株丙種球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、或POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群、高月病和PEP症候群))、或該疾病的組合。
如請求項86-89中任一項所述之方法，其中該疾病係多發性骨髓瘤。
如請求項85-90中任一項所述之方法，其中將該細胞群體或藥物組成物按約1 x 10⁶至約1 x 10⁸(例如約2 x 10⁶至約5 x 10⁷、約5 x 10⁶至約2 x 10⁷、約1 x 10⁶至約1 x 10⁷、約1 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁶至約3 x 10⁶、約2 x 10⁶至約4 x 10⁶、約3 x 10⁶至約5 x 10⁶、約4 x 10⁶至約6 x 10⁶、約5 x 10⁶ 至約7 x 10⁶、約6 x 10⁶至約8 x 10⁶、約7 x 10⁶至約9 x 10⁶、約8 x 10⁶至約1 x 10⁷、約9 x 10⁶至約2 x 10⁷、約1 x 10⁷至約3 x 10⁷、約2 x 10⁷至約4 x 10⁷、約3 x 10⁷至約5 x 10⁷、約4 x 10⁷至約6 x 10⁷、約5 x 10⁷至約7 x 10⁷、約6 x 10⁷至約8 x 10⁷、約7 x 10⁷至約9 x 10⁷、約8 x 10⁷至約1 x 10⁸、約1 x 10⁶、約2 x 10⁶`約3 x 10⁶、約4 x 10⁶、約5 x 10⁶、約6 x 10⁶、約7 x 10⁶、約8 x 10⁶、約9 x 10⁶、約1 x 10⁷、約2 x 10⁷、約3 x 10⁷、約4 x 10⁷、約5 x 10⁷、約6 x 10⁷、約7 x 10⁷、約8 x 10⁷、約9 x 10⁷或約1 x 10⁸)個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的劑量向該受試者投與，

視需要其中將該細胞群體或藥物組成物按約5 x 10⁶至約2 x 10⁷個CAR陽性活細胞(例如BCMA CAR+ T細胞)的劑量向該受試者投與。
如請求項85-91中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該受試者投與第二治療劑，視需要其中該第二治療劑選自：

(i)PD-1抑制劑，視需要其中該PD-1抑制劑選自由PDR001、納武單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591和AMP-224組成的組；

(ii)PD-L1抑制劑，視需要其中該PD-L1抑制劑選自由FAZ053、阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗和BMS-936559組成的組；

(iii)LAG-3抑制劑，視需要其中該LAG-3抑制劑選自由LAG525、BMS-986016、TSR-033、MK-4280和REGN3767組成的組；

(iv)TIM-3抑制劑，視需要其中該TIM-3抑制劑選自由MBG453、TSR-022和LY3321367組成的組；

(v)CTLA-4抑制劑，視需要其中該CTLA-4抑制劑係伊匹單抗或曲美木單抗；

(vi)白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽的組合，例如hetIL-15：

(vii)白介素-12(IL-12)多肽；或

(viii)mTOR抑制劑，視需要其中該mTOR抑制劑係RAD001或雷帕黴素。
一種分離的細胞，該分離的細胞包含：

(a)第一CAR，該第一CAR包含與第一抗原結合的第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域(例如第一初級傳訊結構域和/或第一共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第一CAR進一步包含第一前導序列和/或第一鉸鏈區；和

(b)第二CAR，該第二CAR包含與第二抗原結合的第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域(例如第二初級傳訊結構域和/或第二共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第二CAR進一步包含第二前導序列和/或第二鉸鏈區，其中：

(i)該第一前導序列和該第二前導序列由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二前導序列包含相同的胺基酸序列；

(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二鉸鏈區包含相同的胺基酸序列；

(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二跨膜結構域包含相同的胺基酸序列；和/或

(iv)該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，

視需要其中該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，和/或

該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。
一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含：

(a)編碼第一CAR的第一核酸序列，其中該第一CAR包含與第一抗原結合的第一抗原結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域(例如第一初級傳訊結構域和/或第一共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第一CAR進一步包含第一前導序列和/或第一鉸鏈區；和

(b)編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第二CAR包含與第二抗原結合的第二抗原結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域(例如第二初級傳訊結構域和/或第二共刺激傳訊結構域)，視需要其中該第二CAR進一步包含第二前導序列和/或第二鉸鏈區，其中：

(i)該第一前導序列和該第二前導序列由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二前導序列包含相同的胺基酸序列；

(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，視需要其中該第一和第二鉸鏈區包含相同的胺基酸序列；

(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或 100%)編碼，視需要其中該第一和第二跨膜結構域包含相同的胺基酸序列；和/或

(iv)該第一細胞內傳訊結構域和該第二細胞內傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，

視需要其中該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼，和/或

該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由不同的核酸序列(例如相差至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%)編碼。
如請求項93所述之分離的細胞或如請求項94所述之分離的核酸分子，其中該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含相同的胺基酸序列或包含不同的胺基酸序列，和/或該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含相同的胺基酸序列或包含不同的胺基酸序列(例如該第一和第二共刺激傳訊結構域分別包含4-1BB共刺激結構域序列和CD28共刺激結構域序列，或分別包含CD28共刺激結構域序列和4-1BB共刺激結構域序列)。
如請求項93或95所述之分離的細胞或如請求項94或95所述之分離的核酸分子，其中：

(i)該第一前導序列和該第二前導序列包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；

(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；

(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；

(iv)該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(v)該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項93、95或96中任一項所述之分離的細胞，或如請求項94-96中任一項所述之分離的核酸分子，其中：

(i)該第一前導序列和該第二前導序列由分別包含SEQ ID NO：199和210的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：210和199的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；

(ii)該第一鉸鏈區和該第二鉸鏈區由分別包含SEQ ID NO：337和13的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：13和337的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；

(iii)該第一跨膜結構域和該第二跨膜結構域由分別包含SEQ ID NO：338和17的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：17和338的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；

(iv)該第一共刺激傳訊結構域和該第二共刺激傳訊結構域由分別包含SEQ ID NO：204和18的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：18和204的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼；和/或

(v)該第一初級傳訊結構域和該第二初級傳訊結構域由分別包含SEQ ID NO：205和21的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)，或分別包含SEQ ID NO：21和205的核酸序列(或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的核酸序列)編碼。
如請求項93或95-97中任一項所述之分離的細胞，或如請求項94-97中任一項所述之分離的核酸分子，其中該第一或第二抗原選自：BCMA，CD19，CD5，CD10，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD30，CD34，CD37，CD38，CD40，CD53，CD69，CD72，CD73，CD74，CD75，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD123，CD135，CD138，CD179，CD269，Flt3，ROR1，FcRn5，FcRn2，CS-1，CXCR4、5、7，IL-7/3R，IL7/4/3R或IL4R，視需要其中B細胞抗原選自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1、CD138、CD123、CD33、CD34、CLL-1、葉酸受體β、FLT3、EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、 PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。
如請求項93或95-98中任一項所述之分離的細胞，或如請求項94-98中任一項所述之分離的核酸分子，其中該第一或第二抗原結合結構域包含本文揭露的CDR、VH、VL或scFv，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。
一種分離的CAR，其中該CAR包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)、第二VL(VL2)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：

(i)VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1；

(ii)VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1；

(iii)VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1；

(iv)VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1；

(v)VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2；

(vi)VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2；

(vii)VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2；或

(viii)VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。
如請求項100所述之分離的CAR，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：

(i)VH1-連接子1(「L1」)-VH2-連接子2(「L2」)-VL2-連接子3(「L3」)-VL1；

(ii)VH1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VL1；

(iii)VL1-L1-VH2-L2-VL2-L3-VH1；

(iv)VL1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VH1；

(v)VH2-L1-VH1-L2-VL1-L3-VL2；

(vi)VH2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VL2；

(vii)VL2-L1-VH1-L2-VL1-L3-VH2；或

(viii)VL2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VH2。
如請求項100或101所述之分離的CAR，其中L1或L3包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，和/或L2包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。
如請求項100-102中任一項所述之分離的CAR，其中該CAR從N-末端至C-末端包含以下組態：

(i)VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；

(ii)VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；

(iii)VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；

(iv)VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；

(v)VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；

(vi)VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；

(vii)VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域；或

(viii)VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2-視需要鉸鏈區-跨膜結構域-細胞內傳訊結構域。
如請求項100-103中任一項所述之分離的CAR，其中該第一和第二抗原係不同的，並且該第一或第二抗原選自：BCMA，CD19，CD5，CD10，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD30，CD34，CD37，CD38，CD40，CD53，CD69，CD72，CD73，CD74，CD75，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD123，CD135，CD138，CD179，CD269，Flt3，ROR1，FcRn5，FcRn2，CS-1，CXCR4、5、7，IL-7/3R，IL7/4/3R或IL4R，視需要其中B細胞抗原選自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1、CD138、CD123、CD33、CD34、CLL-1、葉酸受體β、FLT3、EGFRvIII、間皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受體α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆莢蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相關抗原、嗜中性球彈性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人絨毛膜促性腺激素、AFP、甲狀腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、腸羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈遞的該等抗原的任一個的肽。
如請求項100-104中任一項所述之分離的CAR，其中：

(i)該VH1、VL1、VH2或VL2包含本文揭露的CDR、VH或VL序列，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該鉸鏈區、跨膜結構域或細胞內傳訊結構域(例如初級傳訊結構域和/或共刺激傳訊結構域)包含本文揭露的鉸鏈區序列、跨膜結構域序列或細胞內傳訊結構域序列(例如初級傳訊結構域序列和/或共刺激傳訊結構域序列)，或與其具有至少約85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。
一種分離的核酸分子，該核酸分子編碼如請求項100-105中任一項所述之CAR。
一種分離的載體，該載體包含如請求項106所述之核酸分子。
一種分離的細胞，該分離的細胞包含如請求項100-105中任一項所述之CAR、如請求項106所述之核酸分子、或如請求項107所述之載體。
一種製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：

(i)使細胞(例如T細胞，例如從冷凍或新鮮的白血球單採產物中分離的T細胞)群體與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或與刺激細胞表面上共刺激分子的藥劑接觸(例如結合)；

(ii)使該細胞(例如T細胞)群體與編碼該CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體，和

(iii)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製該細胞群體)或投與，其中：

(a)步驟(ii)與步驟(i)一起進行或在步驟(i)開始後不晚於20小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時進行，並且

步驟(iii)在步驟(i)開始後不晚於30(例如26)小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於24小時進行，

(b)步驟(ii)與步驟(i)一起進行或在步驟(i)開始後不晚於20小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於12、13、14、15、16、17、或18小時進行，例如在步驟(i)開始後不晚於18小時進行，並且

步驟(iii)在步驟(ii)開始後不晚於30小時進行，例如在步驟(ii)開始後不晚於22、23、24、25、26、27、28、29、或30小時進行，或

(c)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(i)開始時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增，或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%；

視需要其中步驟(ii)中的核酸分子在病毒載體上，視需要其中步驟(ii)中的核酸分子係病毒載體上的RNA分子，視需要其中步驟(ii)包括用病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該病毒載體包含編碼該CAR的核酸分子，

其中：

(I)該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中：

該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上，例如其中該第一核酸序列和該第二核酸序列由編碼自身切割位點(例如P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點)的第三核酸序列分開，或

該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上；或

(II)該核酸分子包含編碼CAR的核酸序列，其中該CAR包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)、第二VL(VL2)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1、VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1、VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1、VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1、VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2、VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2、VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2、或VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。
如請求項109所述之方法，其中該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上。
如請求項110所述之方法，其中該第一和第二核酸分子在分開的病毒載體上，並且其中步驟(ii)包括用第一病毒載體和第二病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該第一病毒載體包含編碼該第一CAR的核酸分子，並且該第二病毒載體包含編碼該第二CAR的第二核酸分子。
如請求項111所述之方法，其中該第一CAR包含抗BCMA結合結構域(例如抗BCMA CAR)，並且該第二CAR包含抗CD19結合結構域(例如抗CD19 CAR)。
如請求項112所述之方法，其中在步驟(ii)中，使該細胞群體按與如下感染複數(MOI)的該第一病毒載體接觸，該感染複數高於、等於或低於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI，

視需要其中在步驟(ii)中，使該細胞群體與如下感染複數(MOI)的第一病毒載體接觸，該感染複數高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI。
如請求項112或113所述之方法，其中在步驟(ii)中，使該細胞群體與第一MOI的該第一病毒載體接觸，並且與第二MOI的該第二病毒載體接觸，使得所得細胞群體包含第一細胞群體、第二細胞群體和第三細胞群體，該第一細胞群體包含抗BCMA CAR但不包含抗CD19 CAR，該第二細胞群體包含抗CD19 CAR但不包含抗BCMA CAR，該第三細胞群體包含抗BCMA CAR和抗CD19 CAR二者，其中：

(i)合併的第二和第三群體中活細胞總數小於或等於合併的第一和第三群體中活細胞總數的約110%(例如小於或等於約105%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%或更少)；

(ii)合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於合併的第二和第三群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000%、10000%或更多)；和/或

(iii)合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於所得群體中活細胞總數的約5%(例如大於或等於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)，

例如如藉由實例10中所述之方法測定的。
如請求項112或113所述之方法，其中在步驟(ii)中，使該細胞群體與以下各項接觸：

(a)MOI為約1至約10(例如約2至約9、約3至約8、約4至約7、約5至約6、約1至約8、約1至約6、約1至約4、約8至約10、約6至約10、約4至約10、約1至約3、約2至約4、約3至約5、約4至約6、約5至約7、約6至約8、約7至約9、約8至約10、約2.5至約5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10)的該第一病毒載體，

視需要其中使該細胞群體與MOI為約2.5至約5的該第一病毒載體接觸；

(b)MOI為約0.1至約5(例如約0.2至約4、約0.3至約3、約0.4至約2、約0.5至約1、約0.6至約0.9、約0.7至約0.8、約0.1至約4、約0.1至約3、約0.1至約2、約0.1至約1、約0.1至約0.5、約4至約5、約3至約5、約2至約5、約1至約5、約0.5至約5、約0.2至約5、約0.1至約0.5、約0.2至約1、約0.5至約2、約1至約3、約2至約4、約3至約5、約0.5至約1、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約2、約3、約4或約5)的該第二病毒載體，

視需要其中使該細胞群體與MOI為約0.5至約1.0的該第二病毒載體接觸；

(c)如下MOI的該第一病毒載體，該MOI高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI的至少約10%(例如至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)或至少約1倍(例如至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100倍，例如約2至約50倍、約3至20倍、約5至約15倍或約8至約10倍)；

視需要其中該第一病毒載體處於如下MOI，該MOI高於該細胞群體與該第二病毒載體接觸時的MOI的約8至約10倍；和/或

(d)如下MOI的該第二病毒載體，該MOI不超過該細胞群體與該第一病毒載體接觸時的MOI的1/X，其中X係2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100，

視需要該第二病毒載體處於如下MOI，該MOI不超過該細胞群體與該第一病毒載體接觸時的MOI的1/X，其中X係6、8、10或12。
如請求項113-115中任一項所述之方法，其中在步驟(ii)中，使該細胞群體與以下各項接觸：

(a)MOI為約4和約5之間(例如約4.75)的該第一病毒載體；和/或

(b)MOI為約0.2和約1之間(例如約0.5)的該第二病毒載體。
如請求項109-116中任一項所述之方法，其中在步驟(ii)中，該細胞群體總共包含約1×10⁸至約5×10⁹(例如約2×10⁸至約2×10⁹或約4×10⁸至約1×10⁹)個活細胞，

視需要其中將該細胞按約1×10⁶至約1×10⁷(例如約2×10⁶至約5×10⁶或約3×10⁶至約4×10⁶)個活細胞/mL的濃度懸浮在培養基中。
如請求項109-117中任一項所述之方法，其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑係刺激CD3的藥劑(例如抗CD3抗體)，並且其中該刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何組合的藥劑；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑或該刺激共刺激分子的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑或該刺激共刺激分子的藥劑不包含珠；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含抗CD3抗體，並且該刺激共刺激分子的藥劑包含抗CD28抗體；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD3抗體，並且該刺激共刺激分子的藥劑包含與膠體聚合物奈米基質共價附接的抗CD28抗體；視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑和該刺激共刺激分子的藥劑包含T細胞TransAct^TM。
如請求項109-118中任一項所述之方法，其中步驟(i)和/或(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制劑、MALT1抑制劑、或其組合的細胞培養基(例如無血清培養基)中進行。
如請求項109-119中任一項所述之方法，其中步驟(i)和/或(ii)在包含血清替代物的無血清細胞培養基中進行，視需要其中該血清替代物係CTS^TM免疫細胞血清替代物(ICSR)。
如請求項109-120中任一項所述之方法，該方法進一步包括在步驟(i)之前：

(iv)(視需要)接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的新鮮白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，如新鮮全血產物、新鮮骨髓產物、或新鮮腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的新鮮產物))，和

(v)從新鮮白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，如新鮮全血產物、新鮮骨髓產物、或新鮮腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的新鮮產物))中分離在步驟(i)中接觸的細胞(例如T細胞，如CD8+和/或CD4+ T細胞)群體，視需要其中：

步驟(iii)在步驟(v)開始後不晚於35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於27、28、29、30、31、32、33、34、或35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於30小時進行，或

例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(v)結束時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%。
如請求項109-120中任一項所述之方法，該方法進一步包括在步驟(i)之前：接受從來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，如從全血、骨髓、或腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如胸腺切除術)中分離的冷凍保存的T細胞)中分離的冷凍保存的T細胞。
如請求項109-120中任一項所述之方法，該方法進一步包括在步驟(i)之前：

(iv)(視需要)接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))，和

(v)從冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))中分離在步驟(i)中接觸的細胞(例如T細胞，例如CD8+和/或CD4+ T細胞)群體，視需要其中：

步驟(iii)在步驟(v)開始後不晚於35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於27、28、29、30、31、32、33、34、或35小時進行，例如在步驟(v)開始後不晚於30小時進行，或

例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(v)結束時的細胞群體相比，來自步驟(iii)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%。
如請求項109-123中任一項所述之方法，該方法進一步包括步驟(vi)：

將來自步驟(iii)的細胞群體的一部分培養至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超過7天，並且測量在該部分中的CAR表現水平(例如測量該部分中表現CAR的活細胞的百分比)，視需要其中：

步驟(iii)包括收穫和冷凍該細胞(例如T細胞)群體，並且步驟(vi)包括將來自步驟(iii)的細胞群體的一部分解凍，將該部分培養至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超過7天，並且測量該部分中的 CAR表現水平(例如測量該部分中表現CAR的活細胞的百分比，例如測量該部分中表現抗BCMA CAR的活細胞的百分比)。
如請求項124所述之方法，其中在測量該部分中CAR表現水平(例如測量該部分中表現CAR的活細胞的百分比，例如測量該部分中表現抗BCMA CAR的活細胞的百分比)之前，將來自步驟(iii)的細胞培養約二至約四天，例如約三天(例如在收穫後約72小時)。
如請求項125所述之方法，其中測量CAR表現發生在步驟(ii)後約4天(例如96小時)。
如請求項124-126中任一項所述之方法，其中藉由流動式細胞測量術測量CAR表現水平。
一種製備表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞(例如T細胞)群體之方法，該方法包括：

(1)使細胞(例如T細胞，如從冷凍的白血球單採產物分離的T細胞)群體與細胞介素接觸，該細胞介素選自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、或其組合；

(2)使該細胞(例如T細胞)群體與編碼該CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接觸，從而提供包含該核酸分子的細胞(例如T細胞)群體；和

(3)收穫該細胞(例如T細胞)群體用於儲存(例如在冷凍保存培養基中重新配製該細胞群體)或投與，其中：

(a)步驟(2)與步驟(1)一起進行或在步驟(1)開始後不晚於5小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於1、2、3、4、或5小時進行，並且

步驟(3)在步驟(1)開始後不晚於26小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於22、23、或24小時進行，例如在步驟(1)開始後不晚於24小時進行，或

(b)例如如藉由活細胞數目進行評估，與步驟(1)開始時的細胞群體相比，來自步驟(3)的細胞群體不擴增或擴增不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%，例如不超過10%；

視需要其中步驟(2)中的核酸分子在病毒載體上，視需要其中步驟(ii)中的核酸分子係病毒載體上的RNA分子，視需要其中步驟(ii)包括用病毒載體轉導該細胞(例如T細胞)群體，該病毒載體包含編碼該CAR的核酸分子，

其中：

(I)該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中：

該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上，例如其中該第一核酸序列和該第二核酸序列由編碼自身切割位點(例如P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點)的第三核酸序列分開，或

該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上；或

(II)該核酸分子包含編碼CAR的核酸序列，其中該CAR包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)、第二VL(VL2)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1、VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1、VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1、VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1、VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2、VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2、VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2、或VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。
如請求項128所述之方法，其中該細胞群體在體外不與刺激CD3/TCR複合物的藥劑和/或刺激細胞表面上的共刺激分子的藥劑接觸，或如果進行接觸，接觸步驟少於2小時，例如不超過1小時或1.5小時。
如請求項129所述之方法，其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑係刺激CD3的藥劑(例如抗CD3抗體)，並且其中該刺激共刺激分子的藥劑係刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何組合的藥劑，視需要其中該刺激CD3/TCR複合物的藥劑或該刺激共刺激分子的藥劑選自抗體(例如單結構域抗體(例如重鏈可變結構域抗體)、肽體、Fab片段、或scFv)、小分子、或配位基(例如天然存在的配位基、重組配位基、或嵌合配位基)。
如請求項128-130中任一項所述之方法，其中步驟(1)和/或(2)在細胞培養基中進行，該細胞培養基包含：

不超過5%、4%、3%、2%、1%、或0%血清，視需要其中步驟(1)和/或(2)在細胞培養基中進行，該細胞培養基包含約2%血清、或

LSD1抑制劑或MALT1抑制劑。
如請求項128-131中任一項所述之方法，該方法進一步包括接受來自實體，例如實驗室、醫院或醫療保健提供者的冷凍保存的白血球單採產物(或造血組織的替代性來源，例如冷凍保存的全血產物、冷凍保存的骨髓產物、或冷凍保存的腫瘤或器官生檢物或摘除物(例如來自胸腺切除術的冷凍保存的產物))。
如請求項109-132中任一項所述之方法，其中：

在步驟(i)或步驟(1)開始時的細胞群體已經富集了表現IL6R的細胞(例如對IL6Rα和/或IL6Rβ呈陽性的細胞)；或

在步驟(i)或步驟(1)開始時的細胞群體包含不少於50%、60%、或70%的表現IL6R的細胞(例如對IL6Rα和/或IL6Rβ呈陽性的細胞)。
如請求項109-133中任一項所述之方法，其中步驟(i)和(ii)或步驟(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的細胞培養基中進行。
一種細胞群體，該細胞群體藉由如請求項109-134中任一項所述之方法製備。
一種細胞群體，該細胞群體藉由如請求項112-114中任一項所述之方法製備。
如請求項136所述之細胞群體，其中該群體包含：

第一細胞群體，該第一細胞群體包含抗BCMA CAR但不包含抗CD19 CAR；

第二細胞群體，該第二細胞群體包含抗CD19 CAR但不包含抗BCMA CAR；以及

第三細胞群體，該第三細胞群體包含抗BCMA CAR和抗CD19 CAR二者。
如請求項137所述之細胞群體，其中：

(i)合併的第二和第三群體中活細胞總數小於或等於合併的第一和第三群體中活細胞總數的約110%(例如小於或等於約105%、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%或更少)；

(ii)合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於合併的第二和第三群體中活細胞總數的約90%(例如大於或等於約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、1000%、2000%、5000%、10000%或更多)；和/或

(iii)合併的第一和第三群體中活細胞總數大於或等於群體中活細胞總數的約5%(例如大於或等於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)。
如請求項137或138所述之細胞群體，該細胞群體進一步包含第四細胞群體，該第四細胞群體不包含CAR。
一種被工程化以表現CAR的細胞群體(「一種表現CAR的細胞群體」)，該群體包含：

(a)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，約相同百分比的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；

(b)例如如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞；

(c)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+細胞的百分比相比，百分比增加的初始細胞，例如初始T細胞，如CD45RO- CCR7+ T細胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；

(d)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；

(e)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%內的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞；

(f)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞的百分比相比，百分比降低的中樞記憶細胞，例如中樞記憶T細胞，如CCR7+CD45RO+ T細胞，例如降低至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%；

(g)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，約相同百分比的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；

(h)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，變化在約5%至約10%的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞；或

(i)如與被工程化以表現CAR之前的相同細胞群體中的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞的百分比相比，百分比增加的幹細胞記憶T細胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受體β+CCR7+CD62L+ T細胞，

其中該群體包含細胞，該細胞包含編碼該CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)，其中：

(I)該核酸分子包含編碼第一CAR的第一核酸序列和編碼第二CAR的第二核酸序列，其中：

該第一和第二核酸序列佈置在單個核酸分子上，例如其中該第一核酸序列和該第二核酸序列由編碼自身切割位點(例如P2A位點、T2A位點、E2A位點或F2A位點)的第三核酸序列分開，或

該第一和第二核酸序列佈置在分開的核酸分子上；或

(II)該核酸分子包含編碼CAR的核酸序列，其中該CAR包含第一VH(VH1)、第一VL(VL1)、第二VH(VH2)、第二VL(VL2)、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，其中該VH1和VL1與第一抗原結合，並且該VH2和VL2與第二抗原結合，其中該VH1、VL1、VH2和VL2從N-末端至C-末端按以下組態排列：VH1-視需要連接子1(「L1」)-VH2-視需要連接子2(「L2」)-VL2-視需要連接子3(「L3」)-VL1、VH1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VL1、 VL1-視需要L1-VH2-視需要L2-VL2-視需要L3-VH1、VL1-視需要L1-VL2-視需要L2-VH2-視需要L3-VH1、VH2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VL2、VH2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VL2、VL2-視需要L1-VH1-視需要L2-VL1-視需要L3-VH2、或VL2-視需要L1-VL1-視需要L2-VH1-視需要L3-VH2。
一種如請求項112-114中任一項所述之方法製備的分離的細胞或細胞群體，該細胞或細胞群體包含一個或多個細胞，該細胞包含：

(a)編碼第一CAR的第一核酸分子，該第一CAR包含抗BCMA結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97的胺基酸序列；和

(b)編碼第二CAR的第二核酸分子，該第二CAR包含抗CD19結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，其中該抗CD19結合結構域包含VH和VL，該VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，並且該VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295、304和297-300的胺基酸序列。
一種分離的細胞，該分離的細胞包含：

(a)編碼第一CAR的第一核酸分子，該第一CAR包含抗BCMA結合結構域、第一跨膜結構域和第一細胞內傳訊結構域，其中該抗BCMA結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)和重鏈互補決定區3(HC CDR3)，並且輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：86、87、88、95、96和97的胺基酸序列；和

(b)編碼第二CAR的第二核酸分子，該第二CAR包含抗CD19結合結構域、第二跨膜結構域和第二細胞內傳訊結構域，其中該抗CD19結合結構域包含VH和VL，該VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，並且該VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中該HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分別包含SEQ ID NO：295、304和297-300的胺基酸序列。
如請求項141或142所述之分離的細胞或細胞群體，其中：

(i)該抗BCMA結合結構域的VH和VL分別包含SEQ ID NO：93和102的胺基酸序列；

(ii)該抗CD19結合結構域的VH和VL分別包含SEQ ID NO：250和251的胺基酸序列；

(iii)該抗BCMA結合結構域包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列；

(iv)該抗CD19結合結構域包含SEQ ID NO：293的胺基酸序列；

(v)該第一CAR包含SEQ ID NO：107的胺基酸序列；和/或

(vi)該第二CAR包含SEQ ID NO：225的胺基酸序列。
一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項141-143中任一項所述之細胞或細胞群體。
一種在受試者中提供抗腫瘤免疫或對患有與BCMA表現相關的疾病的受試者進行治療之方法，該方法包括向該受試者投與有效量的如請求項141-143中任一項所述之細胞或細胞群體、或如請求項144所述之藥物組成物。
如請求項145所述之方法，其中該與BCMA表現相關的疾病係血液癌或實體癌。
如請求項145或146所述之方法，其中該疾病選自：急性白血病、B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、B細胞前淋巴球白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生症、MALT淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良和骨髓發育不良症候群、非何杰金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、前列腺癌(例如，去勢抵抗性或治療抵抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌、肺癌、漿細胞增殖性障礙(例如，無症狀性骨髓瘤(冒煙型多發性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意義未明的單株丙種球蛋白血症(MGUS)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如，漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤和多發性漿細胞瘤)、全身性澱粉樣蛋白輕鏈澱粉樣變性、或POEMS症候群(也稱為克羅-富克斯症候群、高月病和PEP症候群))、或該疾病的組合。
如請求項145-147中任一項所述之方法，其中該疾病係多發性骨髓瘤。