TW202129000A - 含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關一種靶向含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)基因之RNAi劑，例如，雙股RNAi劑，及使用此等RNAi劑於抑制PNPLA3基因表現之方法，及治療患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)與/或PNPLA3-相關病變之個體之方法。
Description
本申請案係主張於2015年2月13日申請之第62/115,724號美國臨時專利申請案，及於2015年12月14日申請之第62/266,818號美國臨時專利申請案之優惠。從而前述申請案之各者的整體內容係藉由引用而併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，其係以ASCII格式電子提交，並從而藉由引用其整體而併入。該ASCII副本，係於2016年2月11日創建，名為121301-03220_SL.txt，且大小為529,799位元組。
本發明係有關一種靶向含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)基因之RNAi劑，及其使用方法。
在肝臟中過量三酸甘油酯的累積被稱為肝
脂肪變性(或脂肪肝)，並且與不良代謝後果，包括胰島素抗性和異常血脂症相關聯。脂肪肝常常可見於具有過量酒精攝取之對象和具有肥胖、糖尿病、或高血脂症之對象。然而，在沒有過量酒精攝取(>10公克(g)/天)下，可以發展出非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。NAFLD係指可以從簡單的脂肪肝(脂肪變性)進展成非酒精性脂肪肝炎(NASH)、進展成硬化(肝臟之不可逆的晚期結瘢)之廣系列的肝臟疾病。所有NAFLD階段具有共同點為在肝臟細胞(肝細胞)中脂肪的累積(脂肪浸潤)。
NAFLD系列從其最簡單的階段開始並進展，該最簡單的階段稱為簡單脂肪肝(脂肪變性)。簡單脂肪肝涉及在肝臟細胞中脂肪(三酸甘油酯)之累積且無發炎(肝炎)或結瘢(纖維化)。在NAFLD系列中，下一階段和嚴重程度是NASH，其涉及在肝臟細胞中脂肪的累積，以及肝臟之發炎。發炎細胞破壞肝臟細胞(肝細胞壞死)，且NASH最終導致肝臟之結瘢(纖維化)，接著是不可逆的晚期結瘢(硬化)。由NASH所造成之硬化在NAFLD系列中是最後且最嚴重的階段。
於2008年，使用肝臟的質子磁共振光譜法來評價肝脂肪含量之個體的全基因體關聯性研究，識別出肝脂肪含量與含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)基因之間有顯著關聯性(參見，如Romeo等人之(2008)Nat.Genet.,40(12)：1461-1465)。使用敲入小鼠之研究已證明，在PNPLA3中序列多樣性(rs738409，I148M)的表現造成
NAFLD，以及在脂質滴表面上之催化性失活PNPLA3累積係與肝臟中三酸甘油酯累積相關聯(Smagris等人之(2015)Hepatology,61：108-118)。具體地，PNPLA3 I148M變體係與藉由活化豪豬(hedgehog,Hh)信號傳導路徑來促進纖維生長的發展相關聯，而導致肝星狀細胞之活化與增殖以及細胞外基質之過度產生與沉積(Chen等人之(2015)World J.Gastroenterol.,21(3)：794-802)。
目前，用於NAFLD之治療係針對減重以及任何次發病症之治療，諸如胰島素抗性或異常血脂症。迄今，沒有已核准之用於NAFLD之藥理學治療。因此，有需要針對患有NAFLD對象的療法。
本發明提供iRNA組成物，其致效PNPLA3基因之RNA轉錄本(transcript)的RNA-誘導靜默複合物(RNA-induced silencing complex,RISC)介導之裂解。該PNPLA3基因可於細胞內，如於對象諸如人類內之細胞。
於一種面向中，本發明提供一種用於抑制含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股與反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸序列不多於3個核苷酸不同之至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO：2之核苷酸序列不多於3個核苷酸不同之至少15個連續核苷酸。
於一種實施態樣中，該正義股及該反義股
包含選自表3至5、7、及8之任一者中之序列的任一者所組成群組之序列。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股與反義股，該正義股包含互補性區域，其包含與表3至5、7、及8之任一者中所列該反義序列的任一者不多於3個核苷酸不同之至少15個連續核苷酸。
於一種實施態樣中，該雙股RNAi劑包含至少一個經修飾核苷酸。於另一種實施態樣中，該正義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸包含修飾。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之正義股與反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸序列不多於3個核苷酸不同之至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO：2之核苷酸序列不多於3個核苷酸不同之至少15個連續核苷酸，其中實質上該正義股的所有核苷酸及實質上該反義股的所有核苷酸係經修飾核苷酸，以及其中該正義股係接合至附接於3’-端之配體。
於一種實施態樣中，該正義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸包含修飾。於一種實施態樣中，該修飾核苷酸的至少一者選自去氧核苷酸、3’-端去
氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾核苷酸、2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧修飾核苷酸、鎖核苷酸、未鎖(unlocked)核苷酸、構形受限之核苷酸、乙基受約束核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基修飾核苷酸、2’-O-烯丙基修飾核苷酸、2’-C-烷基修飾核苷酸、2’-羥基修飾核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾核苷酸、2’-O-烷基修飾核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫吡喃修飾核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾核苷酸、環己烯基修飾核苷酸、包含硫代磷酸酯基之核苷酸、包含甲基膦酸酯基之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、以及包含5’-磷酸酯模擬體之核苷酸所組成群組。於另一種實施態樣中，該修飾核苷酸包含3’-端去氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)之短序列。
於一種實施態樣中，該互補性之區域係至少17個核苷酸長度。於另一種實施態樣中，該互補性之區域係19與21個之間核苷酸長度。於另一種實施態樣中，該互補性之區域係19個核苷酸長度。於另一種實施態樣中，各股係不多於30個核苷酸長度。
於一種實施態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸之3’突出。於另一種實施態樣中，至少一股包含至少2個核苷酸之3’突出。
於一種實施態樣中，該雙股RNAi劑進一步包含配體。於一種實施態樣中，該配體係接合至該雙股RNAi劑之該正義股的3’末端。於另一種實施態樣中，該
配體係N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。於一種實施態樣中，該配體係
於另一種實施態樣中，該雙股RNAi劑係如下方案中顯示接合至該配體：
於一種實施態樣中，該互補性之區域包含表3至5、7、及8之任一者中之該反義序列的一者。於另一種實施態樣中，該互補性之區域係由表3至5、7、及8之任一者中之該反義序列的一者所組成。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含與
編碼PNPLA3之mRNA之一部分互補之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長度，其中該雙股RNAi劑係藉式(III)表示：正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5' (III)
其中：i、j、k、及l各獨立為0或1；p、p'、q、及q'各獨立為0至6；各Na及Na'獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；各Nb及Nb'獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至10個核苷酸之寡核苷酸序列；各np、np'、nq、及nq'，其之各者可出現或可不出現，獨立表示突出核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、及Z'Z'Z'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸上之三個相同修飾的基序(motif)；在Nb之修飾與在Y之修飾不同且在Nb'之修飾與在Y'之修飾不同；且其中該正義股係接合至至少一個配體。
於一種實施態樣中，i是0；j是0；i是1；j是1；i及j都是0；或i及j都是1。於另一種實施態樣中，k是0；l是0；k是1；l是1；k及l都是0；或k及l都是1。於另一種實施態樣中，XXX與X'X'X'互補，YYY與Y'Y'Y'互補，以及ZZZ與Z'Z'Z'互補。於另一種實施態樣中，該YYY基序發生在或靠近該正義股之裂解位點。於另一種實施態樣中，該Y'Y'Y'基序發生在該反義股從5'-末端起第11、12及13位置。於一種實施態樣中，該Y'是
2'-O-甲基。
於一種實施態樣中，式(III)係藉式(IIIa)表示：正義：5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反義：3' np’-Na’-Y'Y'Y'-Na’-nq’5' (IIIa)。
於另一種實施態樣中，式(III)係藉式(IIIb)表示：正義：5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反義：3' np’-Na’-Y'Y'Y'-Nb’-Z'Z'Z'-Na’-nq’5' (IIIb)
其中各Nb及Nb'獨立表示包含1至5個修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
於另一種實施態樣中，式(III)係藉式(IIIc)表示：正義：5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
反義：3' np’-Na’-X'X'X'-Nb’-Y'Y'Y'-Na’-nq’5' (IIIc)
其中各Nb及Nb'獨立表示包含1至5個修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
於另一種實施態樣中，式(III)係藉由式(IIId)表示：正義：5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反義：3'np’-Na’-X'X'X'-Nb’-Y'Y'Y'-Nb’-Z'Z'Z'-Na’-nq’5' (IIId)
其中各Nb及Nb'獨立表示包含1至5個修飾核苷酸之寡核苷酸序列且各Na及Na’獨立表示包含2至10個修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
於一種實施態樣中，該雙股區域係15至30個核苷酸對長度。於另一種實施態樣中，該雙股區域係17至23個核苷酸對長度。於另一種實施態樣中，該雙股區域係17至25個核苷酸對長度。於另一種實施態樣中，該雙股區域係23至27個核苷酸對長度。於另一種實施態樣中，該雙股區域係19至21個核苷酸對長度。於另一種實施態樣中，該雙股區域係21至23個核苷酸對長度。
於一種實施態樣中，各股具有15至30個核苷酸。於另一種實施態樣中，各股具有19至30個核苷酸。
於一種實施態樣中，在該核苷酸之修飾係選自LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2'-羥基、及其組合所組成群組。於另一種實施態樣中，在該核苷酸之修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾。
於一種實施態樣中，該配體係一或多個透過二價或三價分枝之鏈結子附接之GalNAc衍生物。於一種實施態樣中，該配體係
於一種實施態樣中，該配體係附接至該正義股之3'末端。
於一種實施態樣中，該雙股RNAi劑係如下方案中顯示接合至該配體
於一種實施態樣中，該雙股RNAi劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。於一種實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係在一股之3’-端。於一種實施態樣中，該股係該反義股。於另一種實施態樣中，該股係該正義股。
於一種實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係在一股之5’-端。於另一種實施態樣中，該股係該反義股。於另一種實施態樣中，該股係該正義股。
於一種實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係在一股之5’-與3’-端。於另一種實施態樣中，該股係該反義股。
於一種實施態樣中，在該雙鏈體(duplex)之該反義股的5'-末端的1位的鹼基對係AU鹼基對。
於一種實施態樣中，該Y核苷酸含有2'-氟
修飾。於另一種實施態樣中，該Y'核苷酸含有2'-O-甲基修飾。於另一種實施態樣中，p'>0。於另一種實施態樣中，p'=2。於另一種實施態樣中，q’=0，p=0，q=0，及p’突出核苷酸係與該目標mRNA互補。於另一種實施態樣中，q’=0，p=0，q=0，及p’突出核苷酸係與該目標mRNA非互補。
於一種實施態樣中，該正義股具有總共21個核苷酸而該反義股具有總共23個核苷酸。
於一種實施態樣中，至少一個np '係經由硫代磷酸酯鏈結(lankage)而鏈結至相鄰核苷酸。於另一種實施態樣中，所有np '係經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸。
於一種實施態樣中，該雙股RNAi劑係選自表3至5、7、及8之任一者中所列之RNAi劑所組成群組。於另一種實施態樣中，該正義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸包含修飾。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含與編碼PNPLA3之mRNA之一部分互補之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長度，其中該雙股RNAi劑係藉式(III)表示：正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3'np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq '5' (III)
其中i、j、k、及l各獨立為0或1；p、p’、q、及q'各獨立為0至6；各Na及Na’獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；各Nb及Nb '獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至10個核苷酸之寡核苷酸序列；各np、np '、nq、及nq '，其之各者可出現或可不出現，獨立表示突出核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、及Z'Z'Z'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，且其中該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；在Nb之修飾與在Y之修飾不同且在Nb '之修飾與在Y'之修飾不同；且其中該正義股係接合至至少一個配體。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含與編碼PNPLA3之mRNA之一部分互補之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長度，其中該雙股RNAi劑係藉式(III)表示：正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3'np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq '5'(III)
其中：i、j、k、及1各獨立為0或1；各np、nq、及nq '，其之各者可出現或可不出現，獨立表示突出核苷酸；p、q、及q'各獨立為0至6；np '>0且至少一個np '係經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸；各Na及Na '獨立表示
包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；各Nb及Nb '獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至10個核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、及Z'Z'Z'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，且其中該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；在Nb之修飾與在Y之修飾不同且在Nb '之修飾與在Y'之修飾不同；且其中該正義股係接合至至少一個配體。
於另一種實施態樣中，本發明提供一種用於抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含與編碼PNPLA3之mRNA之一部分互補之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長度，其中該雙股RNAi劑係藉式(III)表示：正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3'np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq '5' (III)
其中i、j、k、及l各獨立為0或1；各np、nq、及nq '，其之各者可出現或可不出現，獨立表示突出核苷酸；p、q、及q'各獨立為0至6；np '>0且至少一個np '係經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸；各Na及Na '獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；各Nb及Nb '獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0
至10個核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、及Z'Z'Z'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，且其中該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；在Nb之修飾與在Y之修飾不同且在Nb '之修飾與在Y'之修飾不同；且其中該正義股係接合至至少一個配體，其中該配體係一個或多個透過二價或三價分枝之鏈結子附接之GalNAc衍生物。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含與編碼PNPLA3之mRNA之一部分互補之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長度，其中該雙股RNAi劑係藉式(III)表示：正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3'np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq '5' (III)
其中i、j、k、及l各獨立為0或1；各np、nq、及nq '，其之各者可出現或可不出現，獨立表示突出核苷酸；p、q、及q'各獨立為0至6；np '>0且至少一個np '係經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸；各Na及Na '獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；各Nb及Nb '獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至10個核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、及Z'Z'Z'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸
之三個相同修飾的基序，且其中該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；在Nb之修飾與在Y之修飾不同且在Nb '之修飾與在Y'之修飾不同；其中該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結；且其中該正義股係接合至至少一個配體，其中該配體係一個或多個透過二價或三價分枝之鏈結子附接之GalNAc衍生物。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含與編碼PNPLA3之mRNA之一部分互補之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長度，其中該雙股RNAi劑係藉式(III)表示：正義：5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5' (IIIa)
其中各np、nq、及nq '，其之各者可出現或可不出現，獨立表示突出核苷酸；p、q、及q'各獨立為0至6；np '>0且至少一個np '係經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸；各Na及Na '獨立表示包含其係經修飾或未經修飾或其組合之0至25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同修飾之核苷酸；YYY及Y'Y'Y'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，且其中該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；其中該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結；且其中該正義股係接合至至少一個配體，其中該配體係一個或個透過二價或三價分枝之鏈結子
附接之GalNAc衍生物。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之正義股與反義股，其中該正義股包含與該SEQ ID NO：1之核苷酸序列不多於3個核苷酸不同之至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與該SEQ ID NO：2之核苷酸序列不多於3個核苷酸不同之至少15個連續核苷酸，其中實質上該正義股的所有核苷酸包含選自2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所組成群組之修飾，其中該正義股包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結在5’-端，其中實質上該反義股的所有核苷酸包含選自2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所組成群組之修飾，其中該反義股包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結在5’-端以及二個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結在3’-端，以及其中該正義股在3’-端係接合至一個或多個透過分枝之二價或三價鏈結子附接之GalNAc衍生物。
於一種實施態樣中，該正義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸係修飾核苷酸。於另一種實施態樣中，各股具有19至30個核苷酸。
於另一種面向中，本發明提供一種細胞，其包含如本文中所述之該雙股RNAi劑。
於另一種面向中，本發明提供一種載體，其編碼雙股RNAi劑之至少一股，其中該雙股RNAi劑包含與編碼PNPLA3之mRNA之至少一部分互補之區域，其中
該雙股RNAi劑係30個鹼基對或更少之長度，以及其中該雙股RNAi劑靶向該mRNA而用於裂解。於一種實施態樣中，該互補性之區域係至少15個核苷酸長度。於另一種實施態樣中，該互補性之區域係19至21個核苷酸長度。
於另一種面向中，本發明提供一種細胞，其包含如本文中所述之載體。
於另一種面向中，本發明提供一種用於抑制PNPLA3基因表現之醫藥組成物，其包含本發明之該雙股RNAi劑。於一種實施態樣中，該雙股RNAi劑係以無緩衝之溶液給藥。於另一種實施態樣中，該無緩衝之溶液係食鹽水或水。於另一種實施態樣中，該雙股RNAi劑係以緩衝溶液給藥。於另一種實施態樣中，該緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽或其之任一組合。於另一種實施態樣中，該緩衝溶液係磷酸鹽緩衝溶液(PBS)。
於另一種面向中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之該雙股RNAi劑以及脂質製劑。於一種實施態樣中，該脂質製劑包含LNP。於另一種實施態樣中，該脂質製劑包含MC3。
於另一種面向中，本發明提供一種抑制細胞中PNPLA3表現之方法，該方法包含(a)使該細胞與本發明之該雙股RNAi劑或本發明之醫藥組成物接觸；以及(b)將步驟(a)中生產之該細胞維持足以獲得PNPLA3基因之mRNA轉錄本降解的時間，從而於該細胞中抑制該PNPLA3
基因表現。於一種實施態樣中，該細胞係於對象內。於另一種實施態樣中，該對象係人類。於一種實施態樣中，該對象係女性人類。於另一種實施態樣中，該對象係男性人類。於一種實施態樣中，該PNPLA3表現係被抑制至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%或約100%。
於另一種面向中，本發明提供一種用於治療具有將受益於PNPLA3表現減少之疾病或病症之對象之方法，該方法包含對該對象給藥治療有效量之本發明之該雙股RNAi劑或本發明之醫藥組成物，從而治療該對象。
於另一種面向中，本發明提供一種用於預防在具有將受益於PNPLA3表現減少之疾病或病症之對象中的至少一種症候之方法，該方法包含對該對象給藥預防有效量之本發明之該雙股RNAi劑或本發明之醫藥組成物，從而預防在該具有將受益於PNPLA3表現減少之病症之對象中的至少一種症候。
於一種實施態樣中，對該對象給藥該雙股RNAi造成在豪豬信號傳導路徑中之減少。
於一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係PNPLA3相關疾病。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係脂肪肝(脂肪變性)。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係非酒精性脂肪肝炎(NASH)。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係肥
胖。於一種實施態樣中，該對象係人類。於另一種實施態樣中，該對象係女性人類。於另一種實施態樣中，該對象係男性人類。於一種實施態樣中，該對象具有PNPLA3I148M突變。於一種實施態樣中，該突變係異合子(heterozygous)。於另一種實施態樣中，該突變係同合子(homozygous)。
於另一種實施態樣中，本發明進一步包含對該對象給藥抗PNPLA3抗體、或其抗原結合片段。
於一種實施態樣中，該雙股RNAi劑係以約0.01mg/kg至約10mg/kg或約0.5mg/kg至約50mg/kg的劑量給藥。於一種實施態樣中，該dsRNA劑係以約10mg/kg至約30mg/kg的劑量給藥。於另一種實施態樣中，該dsRNA劑係以選自0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、及30mg/kg所組成群組之劑量給藥。
於一種實施態樣中，每週一次對該對象給藥該雙股RNAi劑。於另一種實施態樣中，每月一次對該對象給藥該雙股RNAi劑。
於一種實施態樣中，對該對象皮下給藥該雙股RNAi劑。
於另一種實施態樣中，本發明之方法進一步包含測量在該對象中之豪豬信號傳導路徑水平。於一種實施態樣中，該豪豬(Hh)信號傳導路徑活性或表現之水平之降低指明該PNPLA3相關疾病係經治療或經預防。
本發明係藉由下列詳細描述及圖式進一步
例示性說明。
第1圖係顯示給藥0.3mg/kg、1.5mg/kg、或3.0mg/kg單劑所指明iRNA劑後，殘餘在ob/ob小鼠肝臟中之PNPLA3 mRNA百分比圖。
本發明提供iRNA組成物，其致效含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)基因之RNA轉錄本的RNA-誘導靜默複合物(RNA-induced silencing complex,RISC)介導之裂解。該基因可於細胞內，如於對象諸如人類內之細胞。使用這些iRNA使得能夠有在哺乳動物中相應基因(PNPLA3基因)之mRNA的靶向降解。
本發明之RNAi劑經設計用以靶向人類PNPLA3基因，包括該基因於其他哺乳動物物種之PNPLA3異種同源物中保守之部份。不欲受縛於理論，咸信，前述性質及在這些RNAi劑中之專一性位點及/或特定修飾之組合或次組合賦予本發明之RNAi劑改善之效能、安定性、效力、耐用性及安全性。
據此，本發明也提供用以治療具有將受益於抑制或減少PNPLA3基因表現之病症之對象之方法，該病症如PNPLA3相關疾病，諸如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，該方法係使用iRNA組成物，該iRNA組成物致效PNPLA3基因之RNA轉錄本的RNA-誘導靜默複合物
(RISC)介導之裂解。
尤其，非常低劑量之本發明iRNA可專一性地且有效率地介導RNA干擾(RNAi)，導致該相應基因(PNPLA3基因)表現之顯著抑制。
本發明之iRNA包括具有區域之RNA股(該反義股)，該區域係約30個核苷酸或更少長度，如15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸長度，該區域係實質上與PNPLA3基因之mRNA轉錄本之至少一部分互補。
下面詳細說明揭露如何製作以及使用含有iRNA之組成物來抑制血管收縮素原基因之表現，以及用以治療具有將受益於PNPLA3基因表現之抑制及/或減少之疾病與病症之對象之組成物、用途、及方法。
I.定義
為了更清晰地理解本發明，首先定義某些術語。此
外，應注意，無論何時記載參數之值或值的範圍，意欲者為於所載值中間的該等值及範圍也意欲是本發明之一部分。
本文中所使用之冠詞「一(a)」及「一(an)」係指該冠詞之文法受詞之一者或大於一者(亦即，至少一者)。例如，「元素」係意指一個元素或大於一個元素，如複數個元素。
本文中所使用之術語「包括」係意指短語「包括，但不限於」，並與後者可互換使用。
本文中所使用之術語「約」係意指於本領域中之典型公差範圍內。例如，「約」可理解成距平均值約2標準差。於某些實施態樣中，約意指±10%。於某些實施態樣中，約意指±5%。當約係出現在一系列數字或範圍前時，應理解「約」可修飾該系列或範圍中之數字之各者。
於數字或一系列數字前之術語「至少」應理解成包括與該術語「至少」相鄰之數字，以及從前後文清楚之所有邏輯上可包括之接續數字或整數。例如，核酸分子中核苷酸的數目必須為整數。例如，「21個核苷酸之核酸分子之至少18個核苷酸」意指18、19、20、或21個核苷酸具有所指明性質。當至少係出現在一系列數字或範圍前時，應理解「至少」可修飾該系列或範圍中之數字之各者。
如本文中所使用，「不多於」或「少於」應理解成與該短語相鄰之值以及從前後文邏輯上較低之值
或整數至零。如，具有「不多於2個核苷酸」之突出之雙鏈體具有2、1、或0個核苷酸之突出。當「不多於」係出現在一系列數字或範圍前時，應理解「不多於」可修飾該系列或範圍中之數字之各者。
如本文中所使用，「含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3」，其與「PNPLA3」可互換使用，係指編碼三酸甘油酯脂酶之天然出現基因，該三酸甘油酯脂酶介導脂肪細胞中三酸甘油酯水解。人類PNPLA3基因之參考序列的胺基酸與完整編碼序列可於如，基因庫登錄號GI：7196625(參考序列登錄號NM_025225.2；SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)中找到。人類PNPLA3基因之哺乳動物異種同源物可於如，基因庫登錄號GI：544461323(參考序列登錄號XM_005567051.1，石蟹獼猴；SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)；GI：544461325(參考序列登錄號XM_005567052.1，石蟹獼猴；SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)；GI：297261270(參考序列登錄號XM_001109144.2，獼猴，SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)；GI：144226244(參考序列登錄號NM_054088.3，小鼠；SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)；GI：537361027(參考序列登錄號NM_001282324.1，大鼠；SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)中找到。
PNPLA3 mRNA序列之額外實施例可使用公眾可得數據庫，如GenBank、UniProt、及OMIM而輕易獲得。
如本文中所使用，「目標序列」係指PNPLA3
基因之轉錄期間所形成之mRNA分子之核苷酸序列的連續部份，包括為初步轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。於一種實施態樣中，該序列之目標部份將至少夠長以作為在或靠近PNPLA3基因之轉錄期間所形成之mRNA分子之核苷酸序列的該部份之iRNA-導向裂解之受質。於一種實施態樣中，該目標序列係在PNPLA3之蛋白質編碼區域內。
目標序列可從約9-36個核苷酸長度，如約15至30個核苷酸長度。例如，目標序列可從約15至30個核苷酸、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸長度。於上面所載範圍或長度中間之範圍或長度也涵蓋而作為本發明之一部分。
如本文中所使用，「包含序列之股」係指寡核苷酸，其包含使用標準核苷酸命名法藉由所指序列描述之核苷酸鏈。
「G」、「C」、「A」、「T」及「U」係各自一般表示分別含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿
嘧啶作為鹼基之核苷酸。然而，應理解術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」也可指如下文進一步詳述之經修飾核苷酸、或代用置換部分體(參見，如表2)。技術領域中具有通常知識者係充分認知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可藉由其他部分體置換，而不會實質上改變包含帶有此置換部分體之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對性質。例如，但不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可鹼基配對含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之核苷酸。故，為本發明特徵之dsRNA之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤、或腺嘌呤之核苷酸可藉由含有例如肌苷之核苷酸置換。於另一種實施例中，於寡核苷酸任一處之腺嘌呤及胞嘧啶可分別以鳥嘌呤及尿嘧啶置換，以與該目標mRNA形成G-U擺動鹼基配對(Wobble base pairing)。含有此等置換部分體之序列係適合為本發明特徵之組成物及方法。
如本文中可互換使用之術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」，係指含有如本文中定義之該術語之RNA的劑，且其經由RNA-誘導靜默複合物(RISC)途徑介導RNA轉錄本的靶向裂解。iRNA係透過稱為RNA干擾(RNAi)之程序導向mRNA之序列專一性降解。該iRNA分子係調控，如抑制PNPLA3基因於細胞，如於對象諸如哺乳動物對象內之細胞中的表現。
於一種實施態樣中，本發明之RNAi劑包括單股RNAi，其係與目標RNA序列，如PNPLA3目標mRNA序列交互作用，以導向該目標RNA之裂解。不欲受縛於理
論，咸信引入細胞中之長的雙股RNA係藉由稱為切丁酶(Dicer)之III型核酸內切酶破碎為包含正義股與反義股之雙股短的干擾RNA(siRNA)(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，類核糖核酸酶-III酶，將這些dsRNA處理成具有兩個鹼基3'突出特性之19個至23個鹼基對的短干擾RNA(Bernstein等人之(2001)Nature 409：363)。隨後，將這些siRNA併入RNA-誘導靜默複合物(RISC)內，其中，一或多個解旋酶將該siRNA雙鏈體解開，使得該互補之反義股能夠導引目標辨認(Nykanen等人之(2001)Cell 107：309)。一旦結合至適宜之目標mRNA，該RISC內之一或多個核酸內切酶將該目標裂解以誘發靜默(Elbashir等人之(2001)Genes Dev.15：188)。因此，於本發明之一種面向中，係關於在細胞內產生之單股RNA(ssRNA)(siRNA雙鏈體之反義股)，且其促進RISC複合物之形成以致效目標基因，亦即PNPLA3基因之靜默。據此，本文中，術語「siRNA」也用以指如上述之RNAi。
於另一種實施態樣中，該RNAi劑可為被引入細胞或生物體中以抑制目標mRNA之單股RNA。單股RNAi劑係結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，Argonaute 2隨後裂解該目標mRNA。該等單股siRNA一般是15個至30個核苷酸且經化學修飾。單股siRNA之設計及測試係描述於美國專利第8,101,348號及Lima等人之(2012)Cell 150：883-894中，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文中。本文中描述之反義核苷酸序列之任一者可呈如
本文中描述之單股siRNA使用或呈如藉由Lima等人之(2012)Cell 150：883-894中描述之方法經化學修飾者使用。
於另一種實施態樣中，用於本發明之組成物、用途、及方法中的「iRNA」係雙股RNA，且於本文中係指稱為「雙股RNAi劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA劑」、或「dsRNA」。術語「dsRNA」係指核糖核酸分子的複合物，其係具有包含兩個反向平行且實質上互補之核酸股的雙鏈體結構，係指稱為具有相對於目標RNA，亦即，PNPLA3基因，「正義」及「反義」定向。於本發明之一些實施態樣中，雙股RNA(dsRNA)係透過轉錄後之基因靜默機制而觸發目標RNA，如mRNA的降解，該機制於本文中係指稱為RNA干擾或RNAi。
一般，dsRNA分子之各股的大多數核苷酸係核糖核苷酸，但如本文中詳細描述者，各股或兩股亦可包括一或多個非核糖核苷酸，如去氧核糖核苷酸及/或經修飾核苷酸。此外，如本說明書中使用者，「RNAi劑」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；RNAi劑可包括於多個核苷酸處之實質性修飾。如本文中所使用，術語「修飾核苷酸」係指具有，獨立地，修飾糖部分體、修飾核苷酸間鏈結、及/或修飾核鹼基之核苷酸。因此，術語「修飾核苷酸」涵蓋對核苷酸間鏈結、糖部分體、或核鹼基之如官能基或原子之取代、增加或移除。適合用於本發明之劑中之修飾，包括本文中描述或本領域中已知之所有修飾類型。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何之此等修飾，如siRNA
型分子中使用者，係為「RNAi劑」所涵蓋。
該雙鏈體區域可為任何長度，其允許透過RISC途徑之所欲目標RNA之專一性降解，且可於範圍為從約9至36個鹼基對長度，例如約15至30個鹼基對長度，例如約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36個鹼基對長度，諸如約15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對長度。於上面所載範圍或長度中間之範圍或長度也涵蓋而作為本發明之一部分。
形成雙鏈體結構之該兩股可為一個較大RNA分子的不同部份，或他們可為分開之RNA分子。若該兩股係一個較大分子的一部分，且因此係藉由一股之3’-末端與形成該雙鏈體結構之分別的另一股之5’-末端之間的不間斷核苷酸鏈連結，則該連結RNA鏈係指稱為「髮夾回圈」。髮夾回圈可包含至少一個未配對核苷酸。於一些實
施態樣中，髮夾回圈可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少23或更多個未配對核苷酸。於一些實施態樣中，髮夾回圈可為8或更少個未配對核苷酸。於一些實施態樣中，髮夾回圈可為4至10個未配對核苷酸。於一些實施態樣中，髮夾回圈可為4至8個未配對核苷酸。
當dsRNA之兩個實施上互補之股係被包含於分開之RNA分子時，這些分子不必須但可共價連結。若該兩股係藉由除了一股之3'-末端與形成該雙鏈體結構之分別的另一股之5'-末端之間的不間斷核苷酸鏈之外的手段而共價連結，則該連結結構係指稱為「鏈結子」。該等RNA股可具有相同或不同數目之核苷酸。鹼基對之最大數目係該dsRNA之最短股中的核苷酸數減去該雙鏈體中出現之任何突出。除了雙鏈體結構之外，RNAi劑可包含一個或多個核苷酸突出。
於一種態樣中，本發明之RNAi劑係具有24個至30個核苷酸之dsRNA，其與目標RNA序列，如PNPLA3目標mRNA序列交互作用，以導向該目標RNA之裂解。不欲受縛於理論，咸信引入細胞中之長的雙股RNA係藉由稱為切丁酶之III型核酸內切酶破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，類核糖核酸酶-III酶，將這些dsRNA處理成具有兩個鹼基3'突出特性之19個至23個鹼基對的短干擾RNA(Bernstein等人之(2001)Nature 409：363)。隨後，將這些siRNA併入RNA-誘導靜默複合物
(RISC)內，其中，一或多個解旋酶將該siRNA雙鏈體解開，使得該互補之反義股能夠導引目標辨認(Nykanen等人之(2001)Cell 107：309)。一旦結合至適宜之目標mRNA，該RISC內之一或多個核酸內切酶將該目標裂解以誘發靜默(Elbashir等人之(2001)Genes Dev.15：188)。
如本文中所使用，術語「核苷酸突出」係指至少一個自iRNA，如dsRNA之雙鏈體結構伸出的未配對核苷酸。例如，當dsRNA之一股的3'-末端延伸超越另一股之5'-末端時，有核苷酸突出，或反之亦然。dsRNA可包含具至少一個核苷酸之突出；或者該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個核苷酸。核苷酸突出可包含下列或由下列所組成：核苷酸/核苷類似物，包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可在正義股、反義股或其之任何組合上。再者，突出之該(等)核苷酸可出現在dsRNA之反義或正義股的5'-末端、3'-末端或二末端。
於一種實施態樣中，dsRNA之反義股具有1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸突出在3’-末端及/或5’-末端。於一種實施態樣中，dsRNA之正義股具有1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸突出在3’-末端及/或5’-末端。於另一種實施態樣中，突出中之核苷酸的一或多者係以核苷硫代磷酸酯置換。於某些實施態樣中，在該正義股或該反義股、或在二股上之突出，可包括延伸長度長於10個核苷
酸，例如1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸、或10至15個核苷酸長度。於某些實施態樣中，延伸突出係在雙鏈體之正義股。於某些實施態樣中，延伸突出係出現在雙鏈體之正義股的3’末端。於某些實施態樣中，延伸突出係出現在雙鏈體之正義股的5’末端。於某些實施態樣中，延伸突出係在雙鏈體之反義股。於某些實施態樣中，延伸突出係出現在雙鏈體之反義股的3’末端。於某些實施態樣中，延伸突出係出現在雙鏈體之反義股的5’末端。於某些實施態樣中，突出中之核苷酸的一或多者係以核苷硫代磷酸酯置換。
「鈍」或「鈍末端」係意指該雙股RNAi劑之末端沒有未配對之核苷酸，亦即，無核苷酸突出。「鈍末端之」RNAi劑係於其整體長度為雙股之dsRNA，亦即，於該分子之任一末端無核苷酸突出。本發明之RNAi劑係包括於一個末端具有核苷酸突出(亦即，具有一個突出及一個鈍末端之劑)或於二個末端皆具有核苷酸突出之RNAi劑。需要澄清的是，「鈍末端之」dsRNA係於二末端都鈍的dsRNA，亦即，於該分子之任一末端無核苷酸突出。最常的是此類分子將於其整體長度為雙股。
術語「反義股」或「導引股」係指iRNA，如dsRNA之股，其係包括實質上與目標序列(如，PNPLA3 mRNA)互補之區域。如本文中所使用，術語「互補性之區域」係指，反義股之實質上與序列，例如目標序列，如，如本文所定義之PNPLA3核苷酸序列互補的區域。若該互
補性之區域不完全與該目標序列互補，則錯配可於該分子之內部或端區域中。一般，最可容忍之錯配係於端區域中，如於iRNA之5’-及/或3’端之5個、4個、3個、2個、或1個核苷酸內。於一種實施態樣中，本發明之雙股RNAi劑包括於反義股中之核苷酸錯配。於另一種實施態樣中，本發明之雙股RNAi劑包括於正義股中之核苷酸錯配。於一種實施態樣中，該核苷酸錯配係，例如於距iRNA之3’端5個、4個、3個、2個、或1個核苷酸內。於另一種實施態樣中，該核苷酸錯配係，例如於iRNA之3’端核苷酸中。
如本文中所使用，術語「正義股」、或「隨從股」(passenger strand)係指iRNA之包括實質上與如本文中所定義之該術語反義股之區域互補的區域之股。
如本文中所使用，術語「裂解區域」係指位於緊鄰裂解位點之區域。該裂解位點係目標上出現裂解之位點。於一些實施態樣中，該裂解區域係包含位於該裂解位點之任一末端且緊鄰該位點的三個鹼基。於一些實施態樣中，該裂解區域係包含位於該裂解位點之任一末端且緊鄰該位點的兩個鹼基。於一些實施態樣中，該裂解位點係具體地出現於被該反義股之第10個與第11個核苷酸結合之位點，且該裂解區域係包含第11個、第12個及第13個核苷酸。
如本文中所使用，除另行指明者外，當術語「互補」用以描述與第二個核苷酸序列相關之第一個核
苷酸序列時，其係指包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸於特定條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸雜交並形成雙鏈體結構的能力，此應為技術領域中具有通常知識者所理解。此等條件，例如可為嚴苛條件，其中，嚴苛條件可包括：400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，12至16小時，之後洗滌(參見，如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可施用其他條件，諸如可能於生物體內遭遇之生理性相關條件。具有通常知識者將能根據經雜交核苷酸之最終應用決定用於兩個序列互補性之測試的最適宜條件設定。
於iRNA內，如於本文中所述dsRNA內之互補序列，包括於該包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸與該包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸於一個或二個核苷酸序列之整體長度上的鹼基配對。此種序列可指稱為相對於彼此「完全互補」。然而，本文中，若第一序列係指稱為相對於第二序列「實質上互補」，則兩個序列可為完全互補，或對於至高30個鹼基對之雙鏈體，他們可在雜交後形成一或多個，但一般不多於5個、4個、3個或2個錯配鹼基對，同時保留在與它們最終應用最相關之條件下的雜交能力，如經由RISC途徑之基因表現的抑制。然而，若兩個寡核苷酸被設計為在雜交後形成一或多個單股突出，則測定互補性時，不應認為此等突出為錯配。例
如，包含一條長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一條長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中，該較長之寡核苷酸係包含與該較短之寡核苷酸完全互補之21個核苷酸的序列，則對於本文所揭示之目的，該dsRNA仍可指稱為「完全互補」。
「互補」序列，如本文中所使用，只要關於他們雜交能力之上述需求被滿足，也可包括下列、或可全自下列形成：非華森-克裡克(non-Watson-Crick)鹼基對及/或自非天然且經修飾之核苷酸形成的鹼基對。此等非華森-克裡克鹼基對係包括，但不限於，G：U擺動或霍格森(Hoogstein)鹼基配對。
本文中，術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可用於關於dsRNA之正義股與反義股之間，或iRNA劑之反義股與目標序列之間的鹼基匹配，如將可自其等用途之上下文理解之。
如本文中所使用，與信使RNA(mRNA)之「至少一部分實質上互補」的聚核苷酸係指，與感興趣mRNA(如，編碼PNPLA3基因之mRNA)的連續部分實質上互補之聚核苷酸。例如，若序列與編碼PNPLA3基因之mRNA之不間斷部分實質上互補，則該聚核苷酸係與PNPLA3 mRNA之至少一部分互補。
據此，於一些實施態樣中，本文中所述之反義聚核苷酸係與目標PNPLA3序列完全互補。於其他實施態樣中，本文中所述之反義聚核苷酸係與目標PNPLA3
序列完全互補且包含於其整個長度其係與SEQ ID NO：1之核苷酸序列之均等物區域、或與SEQ ID NO：1之片段至少約80%互補之連續核苷酸序列，該至少約80%互補係諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
於一種實施態樣中，本發明之RNAi劑包括與反義聚核苷酸實質上互補之正義股，該反義聚核苷酸反而係與目標PNPLA3序列互補，且其中該正義股聚核苷酸包含於其整個長度其係與SEQ ID NO：2之核苷酸序列之均等物區域、或與SEQ ID NO：2之片段至少約80%互補之連續核苷酸序列，該至少約80%互補係諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
於另一種實施態樣中，本發明之RNAi劑包括與反義聚核苷酸實質上互補之正義股，該反義聚核苷酸反而係與目標PNPLA3序列互補，且其中該正義股聚核苷酸包含於其整個長度其係與表3至5、7、及8之任一者中之該正義股的任一者之核苷酸序列之均等物區域、或與表3至5、7、及8之任一者中該正義股的任一者之片段至少約80%互補之連續核苷酸序列，該至少約80%互補係諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、
約98%、或約99%互補。
於本發明之一種面向中，用於本發明之方法與組成物中之劑係單股反義寡核苷酸分子，其經由反義抑制機制抑制目標mRNA。該單股反義寡核苷酸分子係與於該目標mRNA內之序列互補。該單股反義寡核苷酸可藉由與該mRNA鹼基配對並物理性地阻礙該轉譯機構而以化學計量學方式抑制轉譯，參見Dias,N.等人之(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。該單股反義寡核苷酸分子可為約15至約30個核苷酸長度，且係具有與目標序列互補之序列。例如，該單股反義寡核苷酸分子可包含來自本文中所述之反義序列之任一者之至少約15、16、17、18、19、20、或更多個連續核苷酸的序列。
如本文中所使用，「對象」係動物，諸如哺乳動物，包括靈長類(諸如人、非人靈長類，如猴、和黑猩猩)、非靈長類(如牛、豬、駱駝、美洲駝、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、天竺鼠、貓、狗、大鼠、小鼠、馬、鯨魚)、或鳥(如，鴨或鵝)。於一種實施態樣中，該對象係人類，諸如正在治療或評估將受益於PNPLA3基因表現及/或複製之減少的疾病、病症或症狀之人類；有將受益於PNPLA3基因表現減少的疾病或症狀風險之人類；具有將受益於PNPLA3基因表現減少的疾病、病症或症狀的人類；及/或正在治療將受益於PNPLA3基因表現減少的疾病、病症或症狀之人類，如本文所述。於一種實施態樣中，該對象係女性人類。於另一種實施態樣中，該對象係男性人類。
如本文中所使用，術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指有利或所欲結果，包括，但不限於一或多種與PNPLA3基因表現及/或PNPLA3蛋白質生產相關之症候，如於豪豬(Hh)信號傳導路徑中存在增加之蛋白質活性、脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟的硬化、肝臟中脂肪之累積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)之緩解或減輕。「治療」也可意指與在沒有治療下之預期存活率相比之延長存活率。
於對象中PNPLA3基因表現及/或PNPLA3蛋白質生產之水平、或疾病標記物或症候之前後文中，術語「較低」係意指該水平之統計學上顯著降低。該降低可為例如，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或更多，且較佳係低至以沒有此種病症之個體之正常範圍內被接受之水平。
如本文中所使用，術語「預防(prevention)」或「預防(preventing)」，當關於將受益於PNPLA3基因表現及/或PNPLA3蛋白質生產之減少之疾病、病症或其症狀而使用時，係指對象將發展與此種疾病、病症或症狀相關症候，如PNPLA3基因表現之症候，諸如於豪豬信號傳導路徑中存在升高之蛋白質水平、脂肪肝(脂肪變性)、非酒精
性脂肪肝炎(NASH)、肝臟的硬化、肝臟中脂肪之累積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)之可能性減少。發展疾病、病症或症狀失敗、或減少與此種疾病、病症或症狀相關症候之發展(如於該疾病或病症之臨床上可接受規模減少至少約10%)、或展現延遲(如數天、數週、數月或數年)之延遲症候係被視為有效預防。
如本文中所使用，術語「含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3相關疾病」或「PNPLA3相關疾病」係由PNPLA3基因表現或PNPLA3蛋白質生產所造成或與之相關之疾病或病症。術語「PNPLA3相關疾病」包括將受益於PNPLA3基因表現、複製、或蛋白質活性之降低之疾病、病症或症狀。PNPLA3相關疾病之非限制性實施例包括例如，脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟的硬化、肝臟中脂肪之累積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係非酒精性脂肪肝炎(NASH)。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係肝臟硬化。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係胰島素抗性。於另一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病不是胰島素抗性。於一種實施態樣中，該PNPLA3相關疾病係肥胖。
於一種實施態樣中，PNPLA3相關疾病係非
酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。如本文中所使用，與術語「NAFLD」可互換使用之「非酒精性脂肪肝疾病」，係指藉由在每天少於20公克酒精涉入存在下存在有大血管脂肪變性而定義之疾病。NAFLD是美國最常見之肝臟疾病，且係通常與胰島素抗性/第2型糖尿病及肥胖相關。NAFLD係藉由脂肪變性、脂肪肝炎、硬化、及有時肝癌表現。對NAFLD之回顧，參見Tolman與Dalpiaz之(2007)Ther.Clin.Risk.Manag.,3(6)：1153-1163，其之整體內容係藉由引用併入本文中。
「治療有效量」，如本文中所使用，係意在包括，當對患者給藥用於治療具有PNPLA3相關疾病之對象時，係足以致效該疾病之治療(如，藉由削弱、減輕或維持現有疾病、或疾病之一種或多種症候)之RNAi劑之量。取決於該RNAi劑、該劑如何給藥、疾病及其嚴重性、及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、藉由PNPLA3基因表現介導之病理過程的階段、先前或伴隨治療之種類(若有任何)、及其他個體特徵，該「治療有效量」可有變化。
「預防有效量」，如本文中所使用，係意在包括，當對尚未經歷或顯現PNPLA3相關疾病之症候但可能有內因之對象給藥時，係足以預防或減輕該疾病或該疾病之一種或多種症候之RNAi劑之量。減輕該疾病係包括延緩該疾病之進程或減少後續發展之疾病的嚴重性。取決於該RNAi劑、該劑如何給藥、疾病之風險程度、及待治
療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前或伴隨治療之種類(若有任何)、及其他個體特徵，該「預防有效量」可有變化。
「治療有效量」或「預防有效量」也包括一種RNAi劑之量，其係於任何治療可應用之合理的利益/風險比生產一些所欲之局部或全身性效果。於本發明之方法中採用的RNAi劑可於足以生產該治療可應用之利益/風險比的量而給藥。
短語「醫藥上可接受」係於本文中採用以指稱那些化合物、材料、組成物、及/或劑型，其係於健全的醫療判斷範疇內，適合用於與人類對象與動物對象之組織接觸而不會有過度毒性、刺激、過敏性反應、或其他問題或併發症，而與合理的利益/風險比相稱。
如本文中所使用之短語「醫藥上可接受之載劑」，意指醫藥上可接受之材料、組成物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、加工助劑(如，潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或鋅、或硬脂酸)、或溶劑封裝材料，其涉及攜帶或運送該標的化合物從一種器官、或身體部份至另一種器官、或身體部份。各載劑必須在與製劑的其它成分可相容並且不傷害到正在治療對象的意義上是「可接受」。可作為醫藥上可接受之載體之材料的一些實施例包括：(1)糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)澱粉，諸如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；(3)纖維素，及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；(4)粉末化黃蓍膠；
(5)麥芽；(6)明膠；(7)潤滑劑，諸如鎂狀態、月桂基硫酸鈉和滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH緩衝溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯及/或聚酐；(22)增積劑，諸如多肽和胺基酸(23)血清成分，諸如血清白蛋白、HDL和LDL；及(22)採用在醫藥製劑的其他非毒性可相容物質。
術語「樣本」，如本文中所使用，包括自對象單離之相似流體、細胞、或組織之集合，以及出現在對象內之流體、細胞、或組織。生物學流體之實施例係包括血液、血清及漿膜流體、血漿、腦脊髓流體、眼流體、淋巴液、尿液、唾液、及等等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域之樣本。例如，樣本可衍生自特定之器官、器官之某些部分、或在這些器官內之流體或細胞。於某些實施態樣中，樣本可衍生自肝臟(如，全肝臟、或肝臟之某些區段、或肝臟中某些種類的細胞，諸如，如肝細胞)、視網膜或視網膜之部分(如，視網膜色素上皮細胞)、中樞神經系統或中樞神經系統的部分(如，心室或脈絡叢)、或胰臟或胰臟的某些細胞或部分。於一些實施態樣中，「衍生自對象之樣本」係指自該對象獲得之腦脊髓流體。於較佳實
施態樣中，「衍生自對象之樣本」係指自該對象抽取之血液或血漿。於進一步之實施態樣中，「衍生自對象之樣本」係指衍生自該對象之肝臟組織(或其次成分)或視網膜組織(或其次成分)。
II.本發明之iRNA
本發明提供iRNA，其抑制PNPLA3基因表現。於一種實施態樣中，該iRNA劑包括用於抑制細胞中PNPLA3基因表現之雙股核糖核酸(RNAi)分子，諸如於對象如哺乳動物中之細胞，該哺乳動物諸如具有PNPLA3相關疾病，如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)之人類。該dsRNA包括互補性區域之反義股，該互補性區域係與PNPLA3基因表現時所形成之mRNA之至少一部分互補。該互補性之區域係約30個核苷酸或更少長度(如約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18個核苷酸或更少長度)。一旦與表現PNPLA3基因之細胞接觸，該iRNA抑制該PNPLA3基因表現(如，人類、靈長類、非靈長類、或鳥之PNPLA3基因)係至少約10%，如藉由例如，PCR或分枝DNA(bDNA)系方法、或藉由蛋白質系方法，諸如藉由免疫螢光分析，使用例如，西方點墨法或流式細胞技術所測定。
dsRNA包括兩條在其中將使用dsRNA之條件下會互補且雜交以形成雙鏈體結構之RNA股。dsRNA之一股(該反義股)包括與目標序列係實質上互補，且一般完全互補之具有互補性之區域。該目標序列可衍生自於
PNPLA3基因表現期間所形成之mRNA之序列。另一股(該正義股)包括與該反義股互補之區域，而使得當在適宜條件組合時，該兩股雜交並形成雙鏈體結構。如本文中其他處所描述以及如本領域中已知者，不同於在分開寡核苷酸上含有，dsRNA之互補序列也可呈單一核酸分子之自互補區域含有。
一般，該雙鏈體結構係在15與30個之間核苷酸長度，如在15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個之間核苷酸長度。於上面所載範圍或長度中間之範圍或長度也涵蓋而作為本發明之一部分。
相似地，對目標序列具有互補性之區域係在15與30個之間核苷酸長度，如在15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、
19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個之間核苷酸長度。於上面所載範圍或長度中間之範圍或長度也涵蓋而作為本發明之一部分。
於一些實施態樣中，該dsRNA係在約15與約23個之間核苷酸長度、或在約25與約30個之間核苷酸長度。一般，該dsRNA係夠長以作為切丁酶酵素之受質。例如，本領域已知長於約21至23個核苷酸長度之dsRNAs可作為切丁酶之受質。如本技術領域中具有通常知識者也將認知者，經靶向供裂解之RNA區域將為常為較長RNA分子，經常為mRNA分子之一部分。在相關情況，mRNA目標之一「部分」係mRNA目標之連續序列，其具有足夠長度以允許其將為RNAi-導向裂解(亦即，透過RISC途徑裂解)之受質。
本技術領域中具有通常知識者也將認知，該雙鏈體區域係dsRNA之主要官能部份，如具有約9至36個鹼基對，例如約10至36、11至36、12至36、13至36、14至36、15至36、9至35、10至35、11至35、12至35、13至35、14至35、15至35、9至34、10至34、11至34、12至34、13至34、14至34、15至34、9至33、10至33、11至33、12至33、13至33、14至33、15至33、9至32、
10至32、11至32、12至32、13至32、14至32、15至32、9至31、10至31、11至31、12至31、13至32、14至31、15至31、15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之雙鏈體區域。因此，於一種實施態樣中，當其經處理成靶向所欲供裂解RNA且具有如15至30個鹼基對之官能雙鏈體，則具有雙鏈體區域大於30個鹼基之RNA分子或RNA分子之複合物係dsRNA。因此，本技術領域中具有通常知識者將認知，於一種實施態樣中，miRNA係dsRNA。於另一種實施態樣中，dsRNA不是天然出現miRNA。於另一種實施態樣中，有用於靶向目標PNPLA3基因表現之iRNA劑不是藉由較大dsRNA之裂解而在目標細胞中產生者。
如本文中所述之dsRNA，可進一步包括一或多個單股核苷酸突出，如1、2、3、或4個核苷酸。具有至少一個核苷酸突出之dsRNA，相對於他們的鈍末端之副本，可具有意外優異的抑制性質。核苷酸突出可包含核
苷酸/核苷類似物或由核苷酸/核苷類似物所組成，該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。突出(等)可在正義股、反義股或其之任何組合。再者，突出之核苷酸(等)可出現在dsRNA之反義或正義股之任一股的5'-末端、3'-末端或二末端。
dsRNA可藉由如進一步描述於下之本領域中已知的標準方法合成，如，藉由使用自動化DNA合成儀，諸如商購自，例如Biosearch,Applied Biosystems,Inc。
本發明之iRNA化合物可使用兩步驟程序製備。首先，雙股RNA分子之個別股係分別製備。接著，成分股經降溫黏合。siRNA化合物之個別股可使用溶液相或固體相有機合成或二者製備。有機合成提供優點為包含非天然或經修飾之核苷酸之寡核苷酸股可輕易製備。本發明之單股寡核苷酸可使用溶液相或固體相有機合成或二者製備。
於一種面向中，本發明之dsRNA包括至少兩個核苷酸序列，正義序列與反義序列。該正義股係選自提供於表3至5、7、及8之任一者中之序列所組成群組，且該正義股之相應反義股係選自提供於表3至5、7、及8之任一者中之序列所組成群組。於此面向中，該兩個序列之一者係與該兩個序列之另一者互補，具有該等序列之一者係與PNPLA3基因表現中所產生之mRNA的序列實質上互補。因此，於此面向中，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸係描述為於表3至5、7、及8之任一者
中之正義股，且第二個寡核苷酸係描述為於表3至5、7、及8之任一者中之該正義股的相應反義股。於一種實施態樣中，dsRNA的該等實質上互補序列係在分開寡核苷酸上含有。於另一種實施態樣中，dsRNA的該等實質上互補序列係含有在單一寡核苷酸。
將理解，雖然表3至5、7、及8之任一者中之序列不是以經修飾及/或經接合序列描述，本發明之iRNA，如本發明之dsRNA的RNA可包含表3至5、7、及8之任一者中所列之序列的任一者、或經修飾之表3至5、7、及8之任一者中之序列、或經接合之表3至5、7、及8之任一者中之序列。換句話說，本發明涵蓋表3至5、7、及8之任一者中之dsRNA，其係如本文中所述未經修飾、未經接合、經修飾、及/或經接合。
於另一種面向中，用於抑制PNPLA3表現之本發明之雙股核糖核酸(dsRNA)包含正義股與反義股、基本上由正義股與反義股所組成、或由正義股與反義股所組成，其中該正義股包含表3至5、7、及8之任一者中之正義股之核苷酸序列，且該反義股包含表3至5、7、及8之任一者中之相應反義股之核苷酸序列。
技術領域中具有通常知識者將充分認知，具有在約20與23個之間鹼基對，如21個鹼基對之雙鏈體結構之dsRNA，已被稱讚為特別有效於誘導RNA干擾(Elbashir等人之EMBO 2001,20：6877-6888)。然而，其他人已發現較短或較長RNA雙鏈體結構也可是有效的(Chu與
Rana之(2007)RNA 14：1714-1719；Kim等人之(2005)Nat Biotech 23：222-226)。於上述實施態樣中，藉由實現表3至5、7、及8之任一者中所提供之寡核苷酸序列之本性，本文中所述之dsRNA可包括至少一股具有長度為最小21個核苷酸。可合理預期，相較於上述dsRNA，較短之雙鏈體，其具有表3至5、7、及8之任一者中之序列之一者且係在一或二末端僅減少數個核苷酸，可相似地有效。因此，具有下述序列之dsRNA係被認為是在本發明的範圍之內，該序列具有至少15、16、17、18、19、20、或更多個衍生自表3至5、7、及8之任一者中之序列之一者之連續核苷酸，且它們抑制PNPLA3基因表現能力與包含全長序列dsRNA者的抑制差異不多於約5、10、15、20、25、或30%。
此外，表3至5、7、及8之任一者中所提供之RNA識別出PNPLA3轉錄本中之一或多個位置，其係易受RISC介導之裂解影響(參見，如表9)。因此，本發明進一步以靶向於這些位置內之iRNA為特徵。如本文中所使用，若iRNA促進於特定位置內任何處之轉錄本之裂解，則該iRNA被稱作靶向RNA轉錄本之該特定位置內。此種iRNA將一般包括至少約15個來自表3至5、7、及8之任一者中所提供之序列之一者的連續核苷酸，其耦合至取自與PNPLA3基因中選定序列連續之區域之額外核苷酸序列。
當目標序列一般約15至30個核苷酸長度，於此範圍中，用於導向任何給定目標RNA之裂解之特
定序列之合適性係有廣泛變化。本文中所列各種軟體包與指南對識別出任何給定基因目標之最佳目標序列提供指導，但也可採取經驗法，其中給定大小(作為非限制性實施例，21個核苷酸)之「窗」或「罩」係字面上或形象地(包括，如虛擬)放置在目標RNA序列，以識別出在該大小範圍中可作為目標序列之序列。藉由於起始目標序列位置上游或下游以一個核苷酸逐步地移動「窗」，可識別出下一個目標序列，直到所選定任何給定目標大小之完整的可能序列組經識別。因此，當於例如表3至5、7、及8之任一者中之經識別序列表示有效目標序列，可預期抑制效率的進一步最佳化係可藉由，於給定序列上游或下游以一個核苷酸逐步地「走動窗」，以識別具有相等或較佳抑制特性之序列而達成。
再者，可預期，對於任何經識別序列，如表3至5、7、及8之任一者中者，進一步最佳化可藉由系統性添加或移除核苷酸以產生較長或較短序列，並將所產生之這些序列藉由從該點於該目標RNA向上或向下走動該較長或較短大小窗測試而達成。再次，將用以產生新候選目標之此法與iRNA有效性測試耦合，該測試基於這些目標序列於本領域已知及/或本文中所述之抑制試驗，可導致於抑制效率的進一步改善。更進一步地，此種最佳化之序列可以藉由，如，如本文中所述或本領域中已知的經修飾核苷酸之引入、於突出中之添加或改變、或如本領域中已知及/或本文中所討論的其他修飾，而進一步最佳化該分
子(如，增加血清安定性或循環半衰期、增加的熱安定性、增強跨膜遞送、靶向至特定位置或細胞種類、增加與靜默途徑酵素之相互作用、增加從胞內體釋放)作為表現抑制劑。
如本文中所述之iRNA可含有對目標序列之一或多個錯配。於一種實施態樣中，如本文中所述之iRNA可含有不多於3個錯配。若該iRNA之反義股含有對目標序列之錯配，較佳為錯配區域不是位在該互補性之區域的中心。若該iRNA之反義股含有對目標序列之錯配，較佳為錯配受限於在距該互補性之區域的5’-或3’-末端至少5個核苷酸內。例如，對於23個核苷酸之iRNA劑，該與PNPLA3基因之一區域互補之股，係一般不含有任何在中心13個核苷酸內之錯配。本文中所述之方法或本領域中已知之方法，可用於決定含有對目標序列之錯配之iRNA是否於抑制PNPLA3基因表現為有效。考量到具有錯配之iRNA於抑制PNPLA3基因表現的效能係重要，尤其是若於PNPLA3基因中該互補性之特定區域係已知在該族群內具有多形性序列變化。
III.本發明之經修飾iRNA
於一種實施態樣中，本發明之iRNA，如dsRNA的RNA係未經修飾，且不包含，如本領域中已知及本文中所述之化學修飾及/或接合。於另一種實施態樣中，本發明之iRNA，如dsRNA的RNA係經化學修飾，以增強安定性或
其他有利特性。於本發明之某些實施態樣中，實質上本發明之iRNA的所有核苷酸係經修飾。於本發明之其他實施態樣中，本發明之iRNA的所有核苷酸係其中「實質上所有核苷酸係經修飾」之本發明之經修飾iRNA係大部分但非全部經修飾且可包括不多於5、4、3、2、或1個未經修飾核苷酸。
為本發明之特徵的核酸可藉由本領域中良好建立之方法予以合成及/或修飾，諸如描述於“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.等人之(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA中之那些，從而其係藉由引用併入本文中。修飾係包括，例如，末端修飾，如5’-末端修飾(磷酸化、接合、反向鏈結)或3’-末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等等)；鹼基修飾，如以安定化鹼基、去安定化鹼基、或與夥伴之擴展譜系(expanded repertoire)鹼基配對之鹼基置換，鹼基之移除(無鹼基核苷酸)，或經接合鹼基；糖修飾(如，於2’-位置或4’-位置)或糖之置換；及/或骨幹修飾，包括磷酸二酯鏈結之修飾或置換。有用於本文中所述之實施態樣中之iRNA化合物的具體實施例係包括，但不限於，含有經修飾之骨幹或不含有天然核苷間鏈結的RNA。具有經修飾之骨幹的RNA係包括，尤其是，彼等於骨幹中不具有磷原子者。對於本說明書之目的，又如本領域中有時引用者，於他們的核苷間骨幹中不具有磷原子的經修飾RNA亦可認為是寡核苷。於一些實施態樣中，經修飾之iRNA將於其
核苷間骨幹中具有磷原子。
經修飾RNA骨幹係包括，例如，具有正常之3'-5'鏈結的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯包括3'-伸烷基膦酸酯及手性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(phosphoramidate)包括3'-胺基-胺基磷酸酯(3'-amino phosphoramidate)及胺基烷基胺基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫酮基磷醯胺(thionophosphoramide)、硫酮基烷基膦酸酯、硫酮基磷酸三酯、及硼烷基磷酸酯，此等之2'-5'鏈結類似物，以及彼等具有反向極性者，其中，相鄰核苷單元對係3'-5'鏈結至5'-3'或2'-5'鏈結至5'-2'。亦包括各種鹽、混合鹽、及遊離酸形式。
教示製備上揭含磷鏈結的代表性美國專利係包括，但不限於美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第4,476,301號；第5,023,243號；第5,177,195號；第5,188,897號；第5,264,423號；第5,276,019號；第5,278,302號；第5,286,717號；第5,321,131號；第5,399,676號；第5,405,939號；第5,453,496號；第5,455,233號；第5,466,677號；第5,476,925號；第5,519,126號；第5,536,821號；第5,541,316號；第5,550,111號；第5,563,253號；第5,571,799號；第5,587,361號；第5,625,050號；第6,028,188號；第6,124,445號；第6,160,109號；第6,169,170號；第6,172,209號；第6,239,265號；第6,277,603號；第6,326,199號；第
6,346,614號；第6,444,423號；第6,531,590號；第6,534,639號；第6,608,035號；第6,683,167號；第6,858,715號；第6,867,294號；第6,878,805號；第7,015,315號；第7,041,816號；第7,273,933號；第7,321,029號；及第US Pat RE39464號，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
其內不包括磷原子之經修飾RNA骨幹係具有藉由下列而形成之骨幹：短鏈烷基或環烷基核苷間鏈結、混合之雜原子與烷基或環烷基核苷間鏈結、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鏈結。這些係包括彼等具有下列者：N-嗎啉基鏈結者(部分係自核苷的糖部份形成)；矽氧烷骨幹；硫醚、亞碸及碸骨幹；甲醯基(formacetyl)及硫代甲醯基骨幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基骨幹；含有伸烷基之骨幹；胺基磺酸酯骨幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨幹；磺酸酯及磺醯胺骨幹；醯胺骨幹；及其他具有混合之N、O、S及CH2成分部分者。
教示製備上揭寡核苷的代表性美國專利係包括，但不限於美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,64,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號；及第5,677,439號，從而其之各者的
整體內容係藉由引用而併入本文。
於其他實施態樣中，適宜之RNA模擬體係預期用於iRNA中，其中，該等核苷酸單元之糖與核苷間鏈結(亦即，骨幹)二者皆以新穎基團置換。該等鹼基單元係經維持用於與適宜之核酸目標化合物雜交。一種此類寡聚化合物，業經顯示具有優異之雜交性質的RNA模擬體，係指稱為肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖骨幹係經含醯胺之骨幹，尤其是胺基乙基甘胺酸骨幹置換。該等核鹼基被保留並直接或間接鍵結至該骨幹之醯胺部份的氮雜基氮原子上。教示製備PNA化合物的代表性美國專利係包括，但不限於，第5,539,082號、第5,714,331號、及第5,719,262號，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文中。適用於本發明之iRNA中的其他PNA化合物係於諸如Nielsen等人之Science,1991,254,1497-1500中揭示。
為本發明特徵的一些實施態樣係包括具有硫代磷酸酯骨幹之RNA及具有雜原子骨幹之寡核苷，該骨幹尤指上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨幹]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-以及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然之磷酸二酯骨幹係表示為--O--P--O--CH2--]以及上文引用之美國專利第5,602,240號的骨幹。於某些實施態樣中，作為本文中重點的RNA係具有上文引用之美國專利第
5,034,506號的N-嗎啉基骨幹結構。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分體。該等iRNA，如為本文特徵的dsRNA，可於2'-位包括下列之一者：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；O-、S-、或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中，該烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。例示性適宜之修飾係包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中，n與m係1至約10。於其他實施態樣中，dsRNA係於2'-位包括下列之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2,、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、多烷基胺基、經取代之矽基、RNA裂解基、報導基、嵌入劑、用於改善iRNA之藥物動力學的基、或用於改善iRNA之藥效動力學的基、及其他具有相似性質之取代基。於一些實施態樣中，該修飾係包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人之Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基。另一例示性修飾係2'-二甲基胺基氧基乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基，亦稱為2'-DMAOE，以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(於本領域中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即，2'-O--CH2--O--CH2-N(CH2)2。
其他修飾係包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2-CH2-CH2-NH2)及2'-氟(2'-F)。亦可於iRNA之RNA上的其他位置，特別是3'端核苷酸或2'-5'鏈結之dsRNA中之糖的3'位，以及5'端核苷酸之5'位，作出類似之修飾。iRNA亦可具有糖模擬體如環丁基部分體來置換呋喃戊醣苷之糖。教示製備此等經修飾糖結構的代表性美國專利係包括，但不限於，第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號、及第5,700,920號，其之某些與本申請共有。從而前述之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
iRNA亦可包括核鹼基(該技術領域中往往簡稱為「鹼基」)修飾或取代。本文中，「未經修飾」或「天然」核鹼基係包括嘌呤類鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶類鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核鹼基係包括其他合成核鹼基及天然核鹼基，如去氧胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及6-其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及2-其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶及5-鹵胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及5-
丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶及6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵腺嘌呤、8-鹵鳥嘌呤、8-胺基腺嘌呤、8-胺基鳥嘌呤、8-巰基腺嘌呤、8-巰基鳥嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤、8-硫烷基鳥嘌呤、8-羥基腺嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵尿嘧啶特別是5-溴尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶特別是5-溴胞嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤、及3-去氮腺嘌呤。進一步核鹼基係包括於美國專利第3,687,808號中揭露之彼等；於Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.編輯之Wiley-VCH,2008中揭露之彼等；於The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990中揭露之彼等；由Englisch等人之Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613揭露之彼等；以及由Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302，Crooke,S.T.及Lebleu,B.編輯之CRC Press,1993揭露之彼等。此等核鹼基之某些係尤其有用於增加作為本發明特徵之寡聚性化合物的結合親和力。此等係包括5-取代之嘧啶類；6-氮雜嘧啶類；及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤類，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代業經顯示將核酸雙鏈
體之安定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.及Lebleu,B.編輯之dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)，且係例示性鹼基取代，當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時，其作用甚至更為突出。
教示製備某些上述經修飾之核鹼基及其他經修飾之核鹼基的代表性美國專利係包括，但不限於，上述指明之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號、及第7,495,088號，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
iRNA之RNA也可經修飾以包括一或多個雙環糖部分體。「雙環糖」係藉由橋接兩個原子而經修飾之呋喃糖環。「雙環核苷」(「BNA」)係具有糖部分體之核苷，該糖部分體包含連結該糖環的兩個碳原子的橋，從而形成雙環系統。於某些實施態樣中，該橋連結該糖環的4’-碳與2’-碳。因此，於一些實施態樣中，本發明之劑可包括
一或更多種鎖核酸(LNA)。鎖核酸係具有經修飾核糖部分體的核苷酸，其中，該核糖部分體係包含連結2'碳與4'碳之額外橋。換句話說，LNA係包含雙環糖部分體之核苷酸，該糖部分體包含4'-CH2-O-2'橋。此結構有效地將核糖「鎖」為3'-內型結構構型。將鎖核酸添加到siRNA中業經顯示增加siRNA於血清中的安定性，並降低脫靶效果(Elmen,J.等人之(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人之(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人之(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本發明之聚核苷酸中的雙環核苷的實施例，包括但不限於包含4'與2'核糖環原子之間的橋之核苷。於某些實施態樣中，本發明之反義聚核苷酸劑包括一或多種包含4'至2'橋之雙環核苷。此種4'至2'橋接雙環核苷之實施例，包括但不限於4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(也稱為「乙基受約束」或「cEt」)及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見如美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見，如美國專利第8,278,283號)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見，如美國專利第8,278,425號)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見，如美國專利申請公開案第2004/0171570號)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R係H、C1-C12烷基、或保護基(參見，如美國專利第7,427,672號)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見，如Chattopadhyaya等人之J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(-CH2)-2'(及其類
似物；參見，如美國專利第8,278,426號)。從而前述之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
教示製備鎖核酸核苷酸的額外代表性美國專利及美國專利申請公開案，包括但不限於下列：美國專利第6,268,490號；第6,525,191號；第6,670,461號；第6,770,748號；第6,794,499號；第6,998,484號；第7,053,207號；第7,034,133；第7,084,125號；第7,399,845號；第7,427,672號；第7,569,686號；第7,741,457號；第8,022,193號；第8,030,467號；第8,278,425號；第8,278,426號；第8,278,283號；第US 2008/0039618號；及第US 2009/0012281號，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
於一些實施態樣中，本發明之iRNA包含一或更多種係UNA(非鎖核酸)核苷酸之單體。UNA係非環狀非鎖核酸，其中該糖之鍵的任一者業經移除，形成非鎖「糖」殘基。於一種實施例中，UNA也涵蓋具有C1'-C4'之間之鍵(亦即，C1'與C4'碳之間的共價碳-氧-碳鍵)業已移除的單體。於另一種實施例中，該糖之C2'-C3'鍵(亦即，C2'與C3'碳之間的共價碳-碳鍵)業已移除(參見Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)及Fluiter等人之Mol.Biosyst.,2009,10,1039，從而其等係藉由引用而引入本文中)。
前述雙環核苷之任一者可經製備為具有一或多種立體化學糖構形，包括，例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見WO 99/14226)。
iRNA之RNA也可經修飾以包括一或更多種乙基受約束核苷酸。如本文中所使用，「乙基受約束核苷酸」或「cEt」係包含雙環糖部分體之鎖核酸，該糖部分體包含4'-CH(CH3)-0-2'橋。於一種實施態樣中，乙基受約束核苷酸係S構形，於本文中指稱為「S-cEt」。
本發明之iRNA也可包括一或多種「構形受限之核苷酸」(「CRN」)。CRN係具有連結核糖之C2’與C4’碳或核糖之C3’與-C5’碳之鏈結子之核苷酸類似物。CRN將核糖環鎖成安定構形並增加對mRNA之雜交親和力。該鏈結子係具有足夠長度以放置氧於安定性及親和力之最佳位置，導致較少核糖環起皺。
教示製備上面所指明CRN的某些者的代表性專利申請公開案，包括但不限於：美國專利申請公開案第2013/0190383號；及PCT專利申請公開案第WO 2013/036868號，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
本發明之iRNA之核苷酸的一或或多者也可包括經羥基甲基取代之核苷酸。「經羥基甲基取代之核苷酸」係非環狀2’-3’-塞科-核苷酸，也指稱為「非鎖核酸」(「UNA」)修飾。
教示製備UNA的代表性專利申請公開案，包括但不限於：美國專利第8,314,227號；及美國專利申請公開案第2013/0096289號；第2013/0011922號；及第2011/0313020號，從而其之各者的整體內容係藉由引用而
併入本文。
對RNA分子末端之有潛力安定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二碳醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)及等等。對此種修飾之揭露可於第2011/005861號PCT專利申請公開案中發現。
本發明之iRNA之核苷酸的其他修飾包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模擬體，如在RNAi劑反義股上之5’-端磷酸酯或磷酸酯模擬體。適合之磷酸酯模擬體係揭示於，例如美國專利申請公開案第2012/0157511號，從而其之整體內容係藉由引用而併入本文。
A.包含本發明之基序之經修飾iRNA
於本發明的某些面向中，本發明之雙股RNAi劑包括具有如揭示於，例如於2011年11月18日申請之美國臨時申請案第61/561,710號、或於2012年11月16日申請之PCT/US2012/065691中之化學修飾之劑，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
如本文中以及臨時申請案第61/561,710號或PCT申請案第PCT/US2012/065691號所顯示，可藉由將一或多個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序引入至RNAi劑之正義股及/或反義股中，尤其在或靠近裂解
位點，而獲得優異結果。於一些實施態樣中，RNAi劑之正義股與反義股可以它種方式完全經修飾。這些基序的引入係中斷正義及/或反義股之修飾類型，若出現的話。RNAi劑可視需要接合有GalNAc衍生物配體，例如在正義股。所得RNAi劑呈現優異的靜默活性。
更具體地，意外地發現當該雙股RNAi劑之正義股與反義股係完全經修飾，以在或靠近RNAi劑之至少一股之裂解位點具有一或多個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，該RNAi劑之基因靜默活性係優異地增強。
據此，本發明提供能夠於活體內抑制目標基因(亦即，PNPLA3基因)表現之雙股RNAi劑。該RNAi劑包含正義股與反義股。該RNAi劑之各股可於範圍從12至30個核苷酸長度。例如，各股可在14至30個之間核苷酸長度、17至30個之間核苷酸長度、25至30個之間核苷酸長度、27至30個之間核苷酸長度、17至23個之間核苷酸長度、17至21個之間核苷酸長度、17至19個之間核苷酸長度、19至25個之間核苷酸長度、19至23個之間核苷酸長度、19至21個之間核苷酸長度、21至25個之間核苷酸長度、或21至23個之間核苷酸長度。
該正義股與反義股典型形成雙鏈體雙股RNA(「dsRNA」)，也於本文中指稱為「RNAi劑」。RNAi劑之雙鏈體區域可為12至30個核苷酸對長度。例如，該雙鏈體區域可在14至30個之間核苷酸對長度、17至30
個之間核苷酸對長度、27至30個之間核苷酸對長度、17至23個之間核苷酸對長度、17至21個之間核苷酸對長度、17至19個之間核苷酸對長度、19至25個之間核苷酸對長度、19至23個之間核苷酸對長度、19至21個之間核苷酸對長度、21至25個之間核苷酸對長度、或21至23個之間核苷酸對長度。於另一種實施例中，該雙鏈體區域係選自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、及27個核苷酸長度。
於一種實施態樣中，該RNAi劑可含有一或多種突出區域及/或帽蓋基於一或兩股之3’-末端、5’末端、或二末端。突出區域可為1至6個核苷酸長度，例如2至6個核苷酸長度、1至5個核苷酸長度、2至5個核苷酸長度、1至4個核苷酸長度、2至4個核苷酸長度、1至3個核苷酸長度、2至3個核苷酸長度、或1至2個核苷酸長度。突出可係一股較長於於另一股之結果或具有相同長度之兩股係相錯開之結果。突出可與目標mRNA形成錯配或其可與經靶向基因序列互補或可為另一種序列。第一與第二股亦可，如藉由額外鹼基聯結以形成髮夾、或藉由其他非鹼基鏈結子聯結。
於一種實施態樣中，該RNAi劑之突出區域中之核苷酸可各獨立為經修飾或未經修飾核苷酸，包括但不限於2’-糖經修飾，諸如，2-F,2’-O甲基胸苷(T)、2-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其之任
何組合。例如，TT可為用於在任一股之任一末端之突出序列。突出可與目標mRNA形成錯配或其可與經靶向基因序列互補或可為另一種序列。
於該RNAi劑之正義股、反義股或兩股的5’-或3’-突出可經磷酸化。於一些實施態樣中，該(等)突出區域含有兩個核苷酸，其具有於該兩個核苷酸之間之硫代磷酸酯，其中該兩個核苷酸可相同或不同。於一種實施態樣中，突出係出現在正義股、反義股或兩股的3’-末端。於一種實施態樣中，此3’-突出係出現在反義股中。於一種實施態樣中，此3’-突出係出現在正義股中。
該RNAi劑可含有僅單一個突出，其可強化該RNAi之干擾活性而不會影響其整體安定性。例如，該單股突出可位在正義股之3'-端末端、或，替代地，在反義股之3'-端末端。RNAi也可具有鈍末端，位在反義股之5'-末端(或正義股之3’-末端)或反之亦然。一般，RNAi之反義股具有在3’-末端、及5’-末端之核苷酸突出係鈍的。不欲受縛於理論，在反義股之5'-末端之不對稱鈍末端利於指引股裝載於RISC程序中。
於一種實施態樣中，該RNAi劑係19個核苷酸長度之雙末端鈍聚物(double ended bluntmer)，其中正義股在距5’末端之位置7、8、9含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-F修飾的基序。反義股在距5’末端之位置11、12、13含有至少一個具有在三個連續核苷之三個2’-O-甲基修飾的基序。
於另一種實施態樣中，該RNAi劑係20個核苷酸長度之雙末端鈍聚物，其中正義股在距5’末端之位置7、8、9含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-F修飾的基序。反義股在距5’末端之位置11、12、13含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的基序。
於又另一種實施態樣中，該RNAi劑係21個核苷酸長度之雙末端鈍聚物，其中正義股在距5’末端之位置7、8、9含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-F修飾的基序。反義股在距5’末端之位置11、12、13含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的基序。
於一種實施態樣中，該RNAi劑包含21個核苷酸正義股與23個核苷酸反義股，其中正義股在距5’末端之位置7、8、9含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-F修飾的基序；反義股在距5’末端之位置11、12、13含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的基序，其中，該RNAi劑之一末端係鈍，而另一末端包含2個核苷酸突出。較佳，該2個核苷酸突出係在反義股之3’-末端。
當該2個核苷酸突出係在反義股之3’-末端，可能有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結在該端三個核苷酸之間，其中該三個核苷酸中的二個係該突出核苷酸，而第三個核苷酸係毗鄰該突出核苷酸之經配對核苷酸。於一
種實施態樣中，該RNAi劑在該正義股之5’末端與在反義股之5’末端二者都額外具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結在該端三個核苷酸之間。於一種實施態樣中，於該RNAi劑之正義股與反義股中的每個核苷酸，包括為該基序之一部分之核苷酸，係經修飾核苷酸。於一種實施態樣中，各殘基係獨立經2’-O-甲基或3’-氟修飾，如於交替基序中。視需要地，該RNAi劑進一步包含配體(較佳GalNAc3)。
於一種實施態樣中，該RNAi劑包含正義股與反義股，其中正義股係25至30個核苷酸殘基長度，其中從第一股之5'端核苷酸(位置1)起位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；該反義股係36至66個核苷酸殘基長度，且從3'端核苷酸起，在與正義股之位置1至23配對之位置包含至少8個核糖核苷酸，以形成雙鏈體；其中至少反義股之3'端核苷酸與正義股未配對，且至高6個連續3'端核苷酸與正義股未配對，從而形成具1至6個核苷酸之3'單股突出；其中反義股之5'端包含從10至30個連續核苷酸，其係與正義股未配對，從而形成10至30個核苷酸之5'單股突出；當正義股與反義股為了最大互補性對準時，其中至少正義股之5'端與3'端核苷酸係與反義股之核苷酸未配對，從而在正義與反義股之間形成實質上雙鏈體化區域；且沿反義股長度之至少19個核糖核苷酸，反義股係與目標RNA足夠互補，以在雙股核酸被引入到哺乳動物細胞中時減少目標基因表現；且其中正義股含有至少一個具有在三個連續核苷酸上之三個2’-F修飾的基序，其中該等基序
之至少一者係發生在或靠近裂解位點。反義股含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的基序在或靠近裂解位點。
於一種實施態樣中，該RNAi劑包含正義股與反義股，其中該RNAi劑包含具有長度其係至少25且最多29個核苷酸之第一股以及具有長度其係最多30個核苷酸且具有至少一個具有在距5’末端之位置11、12、13之三個連續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的基序之第二股；其中該第一股之3’末端與該第二股之5’末端形成鈍末端且該第二股於其3’末端較第一股長1至4個核苷酸，其中該雙鏈體區域，其係至少25個核苷酸長度，且沿該第二股長度之至少19個核苷酸，該第二股係與目標RNA足夠互補，以在該RNAi劑被引入到哺乳動物細胞中時減少目標基因表現，以及其中該RNAi劑之切丁酶裂解優先導致包含該第二股之3’末端之siRNA，從而於哺乳動物中減少該目標基因表現。視需要地，該RNAi劑進一步包含配體。
於一種實施態樣中，該RNAi劑之正義股含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，其中該等基序之一者係發生在該正義股中之裂解位點。
於一種實施態樣中，該RNAi劑之反義股也可含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，其中該等基序之一者係發生在或靠近該反義股中之裂解位點。
對於具有17至23個核苷酸長度之雙鏈體區域之RNAi劑，該反義股之裂解位點係典型在距5’末端之位置11、12、13附近。因此，該具有三相同修飾之基序可發生在該反義股之位置9、10、11；位置10、11、12；位置11、12、13；位置12、13、14；或位置13、14、15，該計數係從反義股之5’-末端自1st核苷酸起始、或該計數係從反義股之5’-末端自於該雙鏈體區域內1st經配對核苷酸起始。該反義股中之裂解位點也可根據距5’-末端該RNAi之雙鏈體區域之長度改變。
該RNAi劑之正義股可在該股之裂解位點含有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序；且該反義股可在或靠近該股之裂解位點具有至少一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序。當該正義股與該反義股形成dsRNA雙鏈體，該正義股與該反義股也可經對準而使得在該正義股的一個具有該三個核苷酸之基序與該反義股的一個具有該三個核苷酸之基序係具有至少一個核苷酸重疊，亦即，於該正義股中之該膜體的三個核苷酸之至少一者係與於該反義股中之該膜體的三個核苷酸之至少一者形成鹼基配對。替代地，至少兩個核苷酸可重疊、或三個核苷酸皆可重疊。
於一種實施態樣中，該RNAi劑之正義股可含有多於一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序。第一個基序可發生在或靠近該股之裂解位點，而其他基序可為翼修飾。本文中之術語「翼修飾」係指稱發生在
該股的另一個位置之基序，其係與該在或靠近同一股之裂解位點之基序分開。翼修飾係相鄰於該第一基序或與被至少一或多個核苷酸分開。當該等基序係彼此緊鄰時，則該等基序之化性係彼此區別，而當該等基序被至少一或多個核苷酸分開時，則該等基序之化性可相同或不同。二或更多個翼修飾可出現。例如，當出現兩個翼修飾，各翼修飾可發生在相對於該第一基序的一個末端，該第一基序係在或靠近裂解位點、或在前導基序的任一側。
像該正義股，該RNAi劑之反義股可含有多於一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序，且該基序之至少一者發生在或靠近該股之裂解位點。此反義股也可含有如該正義股可出現之翼修飾般對準之一或多個翼修飾。
於一種實施態樣中，於該RNAi劑之正義股或反義股之翼修飾典型不包括在該股之3’-末端、5’-末端或兩端的最前面一個或二個端核苷酸。
於另一種實施態樣中，於該RNAi劑之正義股或反義股之翼修飾典型不包括在該股之3’-末端、5’-末端或兩端之於雙鏈體區域內的最前面一個或二個經配對核苷酸。
當該RNAi劑之正義股或反義股個含有至少一個翼修飾時，該等翼修飾可落在該雙鏈體區域之同一末端，且具有為一個、二個或三個核苷酸之重疊。
當該RNAi劑之正義股與反義股各含有至少
兩個翼修飾，該正義股與反義股也可經對準而使得兩個修飾各形成一股落在該雙鏈體區域之一個末端，具有為一個、二個或三個核苷酸之重疊；兩個修飾各形成一股落在該雙鏈體區域之另一個末端，具有為一個、二個或三個核苷酸之重疊；兩個修飾一股落在該前導基序之各側，於該雙鏈體區域中具有為一個、二個或三個核苷酸之重疊。
於一種實施態樣中，於該RNAi劑之正義股與反義股中的每個核苷酸，包括為該基序之一部分之核苷酸，可經修飾。各核苷酸可經相同或不同修飾修飾，該修飾包括一或多個非鏈結磷酸酯氧之一或二者及/或該鏈結磷酸酯氧之一或多者的變動；該核糖糖之構成，如在該核糖的糖的2'羥基的變動；以「脫磷酸」鏈結子對該磷酸酯部分體的全面置換；天然出現鹼基之修飾或置換；及該核糖-磷酸酯骨幹之置換或修飾。
因為核酸是次單元之聚合物，許多修飾發生在於核酸內重複的位置，如鹼基、或磷酸酯部分體、或磷酸酯部分體之非鏈O的修飾。於一些例子中，修飾將發生在核酸中之所有對象位置但在許多例子中將不會。藉由例示，修飾可僅發生在3’或5’端位置、可僅發生在端區域中，如在端核苷酸之位置或在一股之最後2、3、4、5、或10個核苷酸中。修飾可發生在雙股區域中、單股區域中、或二者中。修飾可僅發生在RNA之雙股區域中或可僅發生在RNA之單股區域中。例如，在非鏈結O位置之硫代磷酸酯修飾可僅發生在一或二端、可僅發生在端區域
中，如在端核苷酸之位置或在一股之最後2、3、4、5、或10個核苷酸中、或可發生在雙股與單股區物中，尤其在端。該一或多個5’末端可經磷酸化。
於單股突出中，如於5’或3’突出中、或於二者中，係可能的，如增加安定性、包括特定鹼基於突出中、或包括經修飾核苷酸或核苷酸替代物。例如，可能為所欲者係包括嘌呤核苷酸於突出中。於一些實施態樣中，在3’或5’突出中的所有或一些鹼基可經，如本文中所述之修飾修飾。修飾可包括，如經本領域中已知之修飾在核糖的糖的2’位置使用修飾，如使用去氧核糖核苷酸、經2’-去氧-2’-氟(2’-F)修飾或經2’-O-甲基修飾而非使用核鹼基之核糖；以及於磷酸酯基中之修飾，如硫代磷酸酯修飾。突出不必是與目標序列同源。
於一種實施態樣中，正義股與反義股之各殘基係獨立經LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-去氧、2’-羥基、或2’-氟修飾。該等股可含有多於一個修飾。於一種實施態樣中，正義股與反義股之個股可獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。
至少兩個不同修飾係典型出現在該正義股與反義股。這兩個修飾可為2’-O-甲基或2’-氟修飾、或其他者。
於一種實施態樣中，Na及/或Nb包含具有交錯類型之修飾。如本文中所使用之術語「交錯基序」係指
稱具有一或多個修飾，且各修飾發生在一股之交錯核苷酸之基序。交錯核苷酸可指稱每個另一種核苷酸有一個或每三個核苷酸有一個、或類似類型。例如，若A、B及C各表示一種對核苷酸的修飾，交錯基序可為「ABABABABABAB…」、「AABAABAABAAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」、或「ABCABCABCABC…」、等等。
於交錯基序中所含有之修飾的種類可相同或不同。例如，若A、B、C、D各表示一種在核苷酸的修飾，交錯類型，亦即在每個另一種核苷酸之修飾，可相同，但正義股或反正義股之各者可經選自在交錯基序內之修飾的數種可能諸如「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」、或「CDCDCD…」、等等。
於一種實施態樣中，本發明之RNAi劑包含，在正義股之交錯基序的修飾類型係相對於在反義股之交錯基序的修飾類型位移。該位移可為使得正義股核苷酸之經修飾基會相應於反義股核苷酸之經不同修飾基，且反之亦然。例如，當正義股於dsRNA雙鏈體中與反義股鹼基配對時，在該雙鏈體區域內，正義股中之交錯基序可從該股的5’往3’以「ABABAB」起始且反義股中之交錯基序可從該股的5’往3’以「BABABA」起始。作為另一種實施例，在該雙鏈體區域內，正義股中之交錯基序可從該股的5’往3’以「AABBAABB」起始且反義股中之交錯基序可從該股的5’往3’以「BBAABBAA」起始，而使得該正
義股與該反義股之間有修飾類型的完全或部分位移。
於一種實施態樣中，該RNAi劑包含，起初在正義股之2'-O-甲基修飾與2’-F修飾的交錯基序類型係具有相對於起初在反義股之2'-O-甲基修飾與2’-F修飾的交錯基序類型之位移，亦即，在正義股之2'-O-甲基修飾係與在反義股之2’-F修飾鹼基配對且反之亦然。該正義股的位置1可以2’-F修飾起始且該反義股的位置1可以2’-O-甲基修飾起始。
將一或多個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序引入到正義股及/或反義股中，係中斷出現在正義股及/或反義股中之初始修飾類型。此藉由引入一或多個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序到正義股及/或反義股中之正義股及/或反義股之修飾類型的中斷，意外地增強對目標基因之基因靜默活性。
於一種實施態樣中，當該具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序係引入到該等股之任一者中時，毗鄰該基序之核苷酸的修飾係與該基序之修飾不同之修飾。例如，含有該基序之序列的部分係「…NaYYYNb…」其中「Y」表示該具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序之修飾，且「Na」與「Nb」表示對毗鄰該基序「YYY」之核苷酸的修飾，其與Y之修飾不同，且其中Na與Nb可為相同或不同修飾。替代地，當有翼修飾出現時，Na及/或Nb可出現或不出現。
該RNAi劑可進一步包含至少一個硫代磷酸
酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結。該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結修飾可發生在正義股或反義股或兩股且於該股之任何位置之任何核苷酸。例如，該核苷酸間鏈結修飾可發生在正義股及/或反義股的每個核苷酸；各核苷酸間鏈結修飾可發生在正義股及/或反義股之交錯類型中；或正義股或反義股可含有在交錯類型中之核苷酸間鏈結修飾。在正義股之核苷酸間鏈結修飾之交錯類型可與反義股相同或不同，且在正義股之核苷酸間鏈結修飾之交錯類型可具有相對於在反義股之核苷酸間鏈結修飾之交錯類型可之位移。於一種實施態樣中，雙股RNAi劑包含6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。於一種實施態樣中，反義股包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結在5’-端以及二個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結在3’-端，且正義股包含至少兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結在5’-端或3’-端。
於一種實施態樣中，該RNAi包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結修飾於突出區域中。例如，該突出區域可含有兩個核苷酸，且具有在該兩個核苷酸之間硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。核苷酸間鏈結修飾也可製作成將突出核苷酸與於該雙鏈體區域內之端經配對核苷酸鏈結。例如，至少2、3、4個或所有突出核苷酸可透過硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結鏈結，以及視需要地，可能有鏈結突出核苷酸與毗鄰該突出核苷酸之經配對核苷酸之額外硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。例如，可能有至少兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結在
該端三個核苷酸之間，其中該三個核苷酸中的二個係突出核苷酸，且第三個係毗鄰該突出核苷酸之經配對核苷酸。這些端三個核苷酸可在反義股之3’-末端、正義股之3’-末端、反義股之5’-末端、及/或反義股之5’末端。
於一種實施態樣中，該2個核苷酸突出係在反義股之3’-末端，且有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結在該端三個核苷酸之間，其中該三個核苷酸中的二個係該突出核苷酸，而第三個核苷酸係毗鄰該突出核苷酸之經配對核苷酸。視需要地，該RNAi劑可在該正義股之5’末端與在反義股之5’末端二者都額外具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結在該端三個核苷酸之間。
於一種實施態樣中，該RNAi劑包含與目標之一個或多個錯配，於雙鏈體內、或其組合。錯配可發生在突出區域或雙鏈體區域中。鹼基對可於它們用以促進解離或熔化之傾向的基礎上排名(如，於特定配對之關聯或解離的自由能基礎上，最簡單之法是於個別對之基礎上檢查該等對，然而下一個相鄰或類似的分析也可以使用。就促進解離而言：A：U係較之G：C為較佳者；G：U係較之G：C為較佳者；以及I：C係較之G：C為較佳者(I=肌苷)。錯配，如非典型(non-canonical)或典型以外的配對(如本文中別處所述者)係較典型(A：T、A：U、G：C)配對為較佳者；及其係包括通用鹼基之配對係較典型配對為較佳者。
於一種實施態樣中，該RNAi劑包含，距反義股之5’-末端於雙鏈體區域內之最前面1、2、3、4、或
5個鹼基對的至少一者係獨立選自下述所組成群組：A：U、G：U、I：C、及錯配配對，如非典型或典型以外的配對或其係包括通用鹼基之配對，以促進在雙鏈體之5’-末端反義股之解離。
於一種實施態樣中，於反義股中，在距5’-末端於雙鏈體區域內之位置1之核苷酸係選自A、dA、dU、U、及dT所組成群組。替代地，距反義股之5’-末端於雙鏈體區域內之最前面1、2、或3個鹼基對的至少一者係AU鹼基對。例如，距反義股之5’-末端於雙鏈體區域內之第一個鹼基對係AU鹼基對。
於另一種實施態樣中，在該正義股之3’-末端的核苷酸係去氧胸腺嘧啶(dT)。於另一種實施態樣中，在反義股之3’-末端的核苷酸係去氧胸腺嘧啶(dT)。於一種實施態樣中，有去氧胸腺嘧啶核苷酸之短序列，例如兩個dT核苷酸在正義及/或反義股之3’-末端。
於一種實施態樣中，該正義股序列可藉由式(I)表示：
5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i及j各獨立為0或1；
p及q各獨立為0至6；
各Na獨立表示包含0至25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb獨立表示包含0至10個經修飾核苷酸之寡核苷
酸序列；
各np及nq獨立表示突出核苷酸；
其中Nb及Y不具有相同修飾；及
XXX、YYY及ZZZ各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序。較佳地，YYY都是2’-F修飾核苷酸。
於一種實施態樣中，該Na及/或Nb包含交錯類型之修飾。
於一種實施態樣中，該YYY基序發生在或靠近該正義股之裂解位點。例如，當該RNAi劑具有17至23個核苷酸長度之雙鏈體區域，該YYY基序可發生在或鄰近該裂解位點(如：可發生在該正義股之位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13)，該計數係從該5’-末端自1st核苷酸起始；或視需要地，該計數係從該5’-末端自於該雙鏈體區域內1st經配對核苷酸起始。
於一種實施態樣中，i是1及j是0、或i是0及j是1、或i及j都是1。該正義股可因此藉由下列式表示：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當該正義股係藉由式(Ib)表示，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷
酸之寡核苷酸序列。各Na獨立可表示包含0至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該正義股係藉由式(Ic)表示，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立可表示包含0至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該正義股係藉由式(Id)表示，各Nb獨立表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。較佳，Nb係0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
X、Y及Z之各者可彼此相同或不同。
於其他實施態樣中，i是0及j是0，且該正義股可藉由下式表示：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當該正義股藉由式(Ia)表示，各Na獨立可表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
於一種實施態樣中，該RNAi之該反義股序列可藉由式(II)表示：5' nq’-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np'3' (II)
其中：
k及l各獨立為0或1；
p’及q’各獨立為0至6；
各Na'獨立表示包含0至25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb'獨立表示包含0至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；
各np'及nq'獨立表示突出核苷酸；
其中Nb’及Y’不具有相同修飾；以及
X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序。
於一種實施態樣中，該Na’及/或Nb’包含交錯類型之修飾。
該Y'Y'Y'基序發生在或靠近該反義股之裂解位點。例如，當該RNAi劑具有17至23個核苷酸長度之雙鏈體區域，該Y'Y'Y'基序可發生在該正義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，以該計數係從該5’-末端自1st核苷酸起始；或視需要地，該計數係從該5’-末端自於該雙鏈體區域內1st經配對核苷酸起始。較佳，該Y'Y'Y'基序發生在位置11、12、13。
於一種實施態樣中，Y'Y'Y'基序都是經2’-OMe修飾核苷酸。
於一種實施態樣中，k是1及l是0、或k是0及l是1、或k及l都是1。
該反義股可因此藉由下列式表示：
5' nq’-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np’3' (IIb)；
5' nq’-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np’3' (IIc)；或
5' nq’-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np’3' (IId)。
當該反義股係藉由式(IIb)表示，Nb ’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該反義股係藉由式(IIc)表示，Nb ’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該反義股係藉由式(IId)表示，各Nb’獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。較佳，Nb係0、1、2、3、4、5或6。
於其他實施態樣中，k是0及l是0且該反義股可藉由下式表示：
5' np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3' (Ia)。
當該反義股係藉由式(IIa)表示，各Na’獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
X'、Y'及Z'之各者可彼此相同或不同。
該正義股與反義股之各核苷酸可獨立經LNA、CRN、UNA、cET、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基、或2’-氟修飾。例如，該正義股與反義股之各核苷酸係獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。尤其，各X、Y、Z、X'、Y’及Z’可表示2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾。
於一種實施態樣中，當該雙鏈體區域係21nt，該RNAi劑之正義股可含有發生在該股之位置9、10及11之YYY基序，該計數係從該5’-末端自1st核苷酸起始、或視需要地，該計數係從該5’-末端自於該雙鏈體區域內1st經配對核苷酸起始；及Y表示2’-F修飾。該正義股可額外含有XXX基序或ZZZ基序作為在該雙鏈體區域之該相對末端之翼修飾；以及XXX及ZZZ各獨立表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
於一種實施態樣中，該反義股可含有發生在該股之位置11、12及13之Y'Y'Y'基序，該計數係從該5’-末端自1st核苷酸起始、或視需要地，該計數係從該5’-末端自於該雙鏈體區域內1st經配對核苷酸起始；及Y'表示2’-O-甲基修飾。該反義股可額外含有X'X'X'基序或Z'Z'Z'基序作為在該雙鏈體區域之該相對末端之翼修飾；以及X'X'X'及Z'Z'Z'各獨立表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
藉上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)、及(Id)表示之該
正義股與分別藉式(IIa)、(IIb)、(IIc)、及(IId)之任一者表示之反義股形成雙鏈體。
據此，用於本發明之方法的該RNAi劑可包含正義股與反義股，各股具有14至30個核苷酸，該RNAi雙鏈體係藉式(III)表示：正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np ’-Na ’-(X'X'X')k-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-(Z'Z'Z')l-Na ’-nq ’5' (III)
其中：
i、j、k、及l各獨立為0或1；
p、p'、q、及q'各獨立為0至6；
各Na及Na ’獨立表示包含0至25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb及Nb ’獨立表示包含0至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；
其中各np’、np、nq’、及nq，其之各者可出現或可不出現，各獨立表示突出核苷酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、及Z'Z'Z'各獨立表示一個具有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的基序。
於一種實施態樣中，i是0及j是0；或i是1及j是0；或i是0及j是1；或i及j都是0；或i及j都是1。於另一種實施態樣中，k是0及l是0；或k是1及l是0；k是0及l是1；或k及l都是0；或k及l都是1。
形成RNAi雙鏈體之該正義股與反義股的例示性組合包括下列式：5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3' np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Na ’nq ’5' (IIIa)
5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3' np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na ’nq ’5' (IIIb)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3' np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Na ’-nq ’5' (IIIc)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3' np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na-nq ’5' (IIId)
當該RNAi劑係藉由式(IIIa)表示，各Na獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該RNAi劑係藉由式(IIIb)表示，各Nb獨立表示包含1至10、1至7、1至5、或1至4個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該RNAi劑係藉由式(IIIc)表示，各Nb、
Nb’獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該RNAi劑係藉由式(IIId)表示，各Nb、Nb’獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na、Na ’獨立表示包含2至20、2至15、或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb及Nb ’之各者獨立包含交錯類型之修飾。
於式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及(IIId)中，X、Y及Z之各者可可彼此相同或不同。
當該RNAi劑係藉式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及(IIId)表示時，該Y核苷酸之至少一者可與該Y'核苷酸之一者形成鹼基配對。替代地，該Y核苷酸之至少二者可與該相應Y'核苷酸形成鹼基配對；或該Y核苷酸之所有三者都與該相應Y'核苷酸形成鹼基配對。
當該RNAi劑係藉由式(IIIb)或(IIId)表示時，該Z核苷酸之至少一者可與該Z'核苷酸之一者形成鹼基配對。替代地，該Z核苷酸之至少二者可與該相應Z'核苷酸形成鹼基配對；或該Z核苷酸之所有三者都與該相應Z’核苷酸形成鹼基配對。
當該RNAi劑係藉由式(IIIc)或(IIId)表示時，該X核苷酸之至少一者可與該X'核苷酸之一者形成鹼
基配對。替代地，該X核苷酸之至少二者可與該相應X'核苷酸形成鹼基配對；或該X核苷酸之所有三者都與該相應X'核苷酸形成鹼基配對。
於一種實施態樣中，該Y核苷酸上之修飾係與該Y’核苷酸上之修飾不同，該Z核苷酸上之修飾係與該Z’核苷酸上之修飾不同，及/或該X核苷酸上之修飾係與該X’核苷酸上之修飾不同。
於一種實施態樣中，當該RNAi劑係藉由式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾。於另一種實施態樣中，當該RNAi劑係藉由式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾以及np'>0且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結子鏈結至相鄰核苷酸。於又另一種實施態樣中，當該RNAi劑係藉由式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結子鏈結至相鄰核苷酸，以及該正義股係接合至一或多個透過二價或三價分枝之鏈結子附接之GalNAc衍生物(如下所述)。於另一種實施態樣中，當該RNAi劑係藉由式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結子鏈結至相鄰核苷酸，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及該正義股係接合至一或多個透過二價或三價分枝之鏈結子附接之GalNAc衍生物。
於一種實施態樣中，當該RNAi劑係藉由式(IIIa)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0
且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結子鏈結至相鄰核苷酸，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及該正義股係接合至一或多個透過二價或三價分枝之鏈結子附接之GalNAc衍生物。
於一種實施態樣中，該RNAi劑係含有至少兩個藉由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及(IIId)表示之雙鏈體之多聚體，其中該等雙鏈體係藉由鏈結子連結。該鏈結子可為可裂解或非可裂解。視需要地，該多聚體進一步包含配體。該等雙鏈體之各者可靶向相同基因或兩個不同基因；或該等雙鏈體之各者可靶向相同基因於兩個不同目標位點。
於一種實施態樣中，該RNAi劑係含有三、四、五、六或更多個藉由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及(IIId)表示之雙鏈體之多聚體，其中該等雙鏈體係藉由鏈結子連結。該鏈結子可為可裂解或非可裂解。視需要地，該多聚體進一步包含配體。該等雙鏈體之各者可靶向相同基因或兩個不同基因；或該等雙鏈體之各者可靶向相同基因於兩個不同目標位點。
於一種實施態樣中，兩個藉由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及(IIId)表示之RNAi劑係彼此鏈結在該5’末端、以及該3’末端之一或二者，且係視需要接合至配體。該等劑之各者可靶向相同基因或兩個不同基因；或該等劑之各者可靶向相同基因於兩個不同目標位點。
有多種描述可用於本發明方法之多聚RNAi
劑公開本。此種公開本包括WO2007/091269、美國專利第7858769號、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文中。
如下面更詳細描述者，含有接合至RNAi劑之一或多個碳水化合物部分體之該RNAi劑可最佳化該RNAi劑之一或多個性質。於許多例子中，該碳水化合物部分體將附接至該RNAi劑之經修飾次單元。例如，dsRNA劑之一或多個核糖核苷酸次單元的核糖的糖可經另一種部分體置換，如非碳水化合物(較佳環狀)載體，其係附接有碳水化合物配體。核糖核苷酸次單元，其中該次單元之核糖的糖係經如是置換，於本文中係指稱為核糖置換修飾次單元(RRMS)。環狀載體可為碳環狀環系統，亦即，所有環原子係碳原子、或雜環狀環系統，亦即，一或多個環原子可為雜原子，如氮、氧、硫。該環狀載體可為單環狀環系統、或可含有兩個或更多個環，如稠合環。該環狀載體可為完全飽和環系統、或其可含有一或多個雙鍵。
該配體可經由載體附接至該聚核苷酸。該載體包括(i)至少一個「骨幹附接點」，較佳兩個「骨幹附接點」以及(ii)至少一個「繫鏈附接點」。如本文中所用之「骨幹附接點」係指稱官能基，如羥基、或一般地，可用且係適合用於將該載體併入至該骨幹中之鍵，如核糖核酸之磷酸酯、或經修飾磷酸酯，如含硫，骨幹。「繫鏈附接點」(TAP)於一些實施態樣中係指稱連結所選定部分體之該環
狀載體之構成環原子，如碳原子或雜原子(與其係提供骨幹附接點之原子有區別)。該部分體可為，如碳水化合物，如單糖；雙醣、三醣、四醣、寡糖及多醣。視需要地，該所選定部分體係藉由中間繫鏈連結至該環狀載體。因此，該環狀載體將經常包括官能基，如胺基、或一般地，提供鍵，其係適合用於將另一種化學實體，如配體併入或繫鏈至該構成環。
該RNAi劑可經由載體接合至配體，其中該載體可為環狀基或非環狀基；較佳，該環狀基係選自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊烷、噁唑啶基、異噁唑啶基(isoxazolidinyl)、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹噁啉基、嗒嗪酮基(pyridazinonyl)、四氫呋喃基及萘烷；較佳，該非環狀基係選自絲胺醇骨幹或二乙醇胺骨幹。
於某些具體實施態樣中，用於本發明之RNAi劑係選自表3至5、7、及8之任一者中所列劑之群組之劑。這些劑可進一步包含配體。
IV.接合至配體之iRNA
本發明之iRNA之RNA的另一種修飾，係涉及將一或多個增強該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取之配體、部分體或接合體化學鏈結至該RNA。此種部分體包括但不限於脂質部分體，諸如膽固醇部分體(Letsinger等人之Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)、膽酸(Manoharan
等人之Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)、硫醚，如己基-S-三苯甲基硫醇(beryl-S-tritylthiol)(Manoharan等人之Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan等人之Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫基膽固醇(Oberhauser等人之Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538)、脂族鏈，如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人之EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov等人之FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk等人之Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂質，如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等人之Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea等人之Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人之Nucleosides &Nucleotides,1995,14：969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人之Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚基部分體(Mishra等人之Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)、或十八胺或己基胺基-羰基氧基膽固醇部分體(Crooke等人之J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
於一種實施態樣中配體變更其所併入之iRNA劑之分佈、靶向或壽命。於較佳實施態樣中，配體係對所選定目標，如分子、細胞或細胞種類、腔室如細胞腔室或器官腔室、身體之組織、器官或區域，當例如相較於缺乏該配體之物種時，提供增強之親和力。較佳配體將不參與在雙鏈體化核酸中之雙鏈體配對。
配體可包括天然出現物質，諸如蛋白質(如，人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(如，聚葡糖、聚三葡萄糖、幾丁質、幾丁聚糖、菊糖、環糊精、N-乙醯半乳糖胺、或玻尿酸)；或脂質。該配體也可為重組或合成分子，諸如合成聚合物，如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實施例係包括聚胺基酸係聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪(polyphosphazine)。多胺之實施例係包括：聚乙烯亞胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、亞精胺、聚胺、假肽-聚胺、擬肽聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子性脂質、陽離子性紫質、聚胺之四級鹽、或α螺旋肽。
配體亦可包括靶向基，如細胞或組織靶向劑，如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質如抗體，其係結合至特定之細胞種類如腎細胞。靶向基可為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、介面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯葡萄糖胺多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯(bisphosphonate)、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽酸、葉酸鹽、維生素B12、維生素A、生物素、或RGD肽或擬RGD
肽。
配體之其他實施例係包括染料、嵌入劑(如，吖啶)、交聯劑(如，補骨脂素(psoralene)、絲裂黴素C)、紫質類(TPPC4、德克薩卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多環芳烴(如，啡嗪、二氫啡嗪)、人工核酸內切酶(如，EDTA)、親脂性分子(如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-苝丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷腦、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或啡噁嗪)及肽接合體(如，觸角足肽、Tat肽)、烷化劑、磷酸酯、胺基、巰基、PEG(如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射性標記之標記物、酵素、半抗原(如，生物素)、運輸/吸收促進子(如，阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合體、四氮雜巨環之Eu3+複合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可為蛋白質如糖蛋白、或肽，如具有對輔配體之專一親和力的分子、或抗體如結合至專一細胞種類如肝細胞的抗體。配體也可包括激素及激素受體。他們也可包括非肽性物種，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯葡萄糖胺多價甘露糖、或多價果糖。該配體可為，例如，脂多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κ B
之活化劑。
該配體可為物質如藥物，其可增加細胞對iRNA劑之攝取，例如，藉由擾亂細胞之細胞骨架如藉由擾亂細胞之微管、微絲及/或中間絲而達成。該藥物可為，例如，塔松(taxon)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼、細胞弛緩素、諾考達唑(nocodazole)、加斯諾麗(japlakinolide)、拉春庫林(latrunculin A)、鬼傘素(phalloidin)、史溫後利A(swinholide A)、茚達諾辛(indanocine)、或肌基質蛋白(myoservin)。
於一些實施態樣中，如本文中所述附接至iRNA之配體作用為藥物動力學調控劑(PK調控劑)。PK調控劑係包括親脂體、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。例示性PK調控劑係包括，但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經脂質、萘普生(naproxen)、伊布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素等。也已知包含大量硫代磷酸酯鏈結之寡核苷酸係結合至血清蛋白質，故，預期骨幹中包含多個硫代磷酸酯鏈結之短寡核苷酸，如具有約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸，亦係作為配體(如，作為PK調控配體)而符合本發明。此外，結合血清組分(如，血清蛋白質)之適配體也可適合作為本文中所述之實施態樣中的PK調配體。
本發明之接合有配體之寡核苷酸，也可藉由使用帶有側接反應性官能性之寡核苷酸，諸如自將鏈結
分子附接至該寡核苷酸所衍生者(描述於下)合成。此反應性寡核苷酸可直接與商業上可得配體、經合成為帶有各式保護基之任一者之配體、或具有附接至其之鏈結部分體之配體反應。
用於本發明之接合體中之寡核苷酸可經由熟知之固體相合成技術而傳統地且常規地製作。此種合成之儀器係由數個廠商販售，包括例如，應用生物系統(Applied Biosystems)(福斯特市，加利福尼亞州)。本領域中已知之用於此種合成之任何其他手段可額外或替代採用。也已知使用類似技術以製備其他寡核苷酸，諸如硫代磷酸酯及烷化衍生物。
於本發明之接合有配體之寡核苷酸及配體-帶有序列專一性經鏈結核苷之分子中，該寡核苷酸與寡核苷可使用標準核苷酸或核苷前驅物、或已帶有該鏈結部分體之核苷酸或核苷接合體前驅物、已帶有該配體之配體-核苷酸或核苷-接合體前驅物、或帶有非核苷配體之構築塊於適合之DNA合成器組裝。
當使用已帶有該鏈結部分體之核苷酸接合體前驅物，該序列專一性經鏈結核苷之合成係典型完成，且該配體分子接著與該鏈結部分體反應以形成該接合有配體之寡核苷酸。於一些實施態樣中，本發明之寡核苷酸或經鏈結核苷係藉由自動化合成器合成，其除了使用標準亞磷醯胺(phosphoramidite)及商業上可得且常規用於寡核苷酸合成中之非標準亞磷醯胺之外，還使用衍生自配體-核苷
接合體亞磷醯胺。
A.脂質接合體
於一種實施態樣中，該配體或接合體係脂質或脂質系分子。此種脂質或脂質系分子較佳係結合血清蛋白質，如人類血清白蛋白(HSA)。HSA結合性配體允許該接合體分佈至目標組織，如身體之非腎臟目標組織。例如，該目標組織可為肝臟，包括肝臟之實質細胞。可結合HSA之其他分子也可用作配體。例如，可使用萘普生(naproxen)或阿斯匹靈。脂質或脂質系配體可(a)增加該接合體之抗降解性、(b)增加靶向或運輸入目標細胞或細胞膜、及/或(c)可用以調整對於血清蛋白質，如HSA之結合。
脂質系配體可用以抑制，如控制該接合體對於目標組織之結合。例如，更強地結合至HSA之脂質或脂質系配體將較不可能被靶向到腎臟，並因此較不可能自身體中清除。較弱地結合至HSA之脂質或脂質系配體可用以將該接合體靶向至腎臟。
於較佳實施態樣中，該脂質系配體係結合HSA。較佳地，其係以足夠的親和力結合HAS，而使得該接合體將較佳地分佈至非腎臟組織。然而，較佳係該親和力不夠強到讓該HAS-配體結合不可逆。
於另外較佳之實施態樣中，該脂質系配體弱結合或不結合HSA，而使得該接合體將較佳地分佈至腎臟。也可使用靶向至腎臟細胞之其他部份體替代該脂質系
配體，或除了該脂質系配體之外也含有該其他部份體。
於另一種面向，該配體係部份體，如維生素，其係被目標細胞，如增殖細胞攝取。這些係特別有用於治療以非所欲之細胞增殖，如惡性或非惡性種類細胞增殖，如癌細胞為特徵的病症。例示性維生素係包括維生素A、E、及K。其他例示性維生素係包括B族微生素，如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他維生素、或被目標細胞諸如肝臟細胞攝取之營養物。也包括HAS及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞穿透劑
於另一種面向中，該配體係細胞穿透劑，較佳係螺旋形細胞穿透劑。較佳地，該劑係兩親性。例示性劑係肽諸如tat或觸角足(antennopedia)。若該劑為肽，則其可經修飾，包括擬肽物、反轉異構物、非肽或假肽鏈結，以及D-胺基酸之使用。該螺旋形劑較佳係α-螺旋形劑，其較佳係具有親脂相及疏脂相。
該配體可為肽或擬肽物。擬肽物(本文中也指稱為寡擬肽物)係能夠折疊成類似於天然肽之已定義三維結構的分子。將肽或擬肽物附接至iRNA劑可，諸如藉由增強細胞辨識及吸收，而致效該iRNA之藥物動力學分佈。該肽或擬肽物部份體為約5個至50個胺基酸長，如為約5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、或50個胺基酸長。
肽或擬肽物可為，例如細胞穿透肽、陽離子性肽、兩親性肽、或疏水性肽(如，主要由Tyr、Trp、或Phe所組成)。該肽部份體可為樹枝狀肽、受限肽或交聯肽。於另一種替代物中，該肽部份體可包括疏水性膜易位序列(MTS)。例示性含疏水性MTS之肽係具有胺基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：13)之RFGF。含有疏水性MTS之RFGF類似物(如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：14))也可為靶向部份體。該肽部份體可為「遞送」肽，其可跨細胞膜運載極性大分子，包括肽、寡核苷酸及蛋白質。例如，業經發現來自HIV Tat蛋白質(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：15)及果蠅(Drosophila)觸角足蛋白質(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：16))之序列能夠作為遞送肽。肽或擬肽物可藉由DNA之隨機序列編碼，諸如自噬菌體顯現庫(phage-display library)或一珠一化合物(one-bead-one-compound，OBOC)組合庫(Lam等人之Nature,354：82-84,1991)中識別之肽。用於細胞靶向目的之經由經併入之單體單元而繫鏈至dsRNA劑之肽或擬肽物的實施例係，精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)-肽、或RGD模擬物。肽部份體之長度範圍可為約5個胺基酸至約40個胺基酸。該等肽部份體可具有結構性修飾，以諸如增加安定性或導向構形性質。可使用下面所述之結構性修飾的任一者。
用於本發明之組成物與方法中之RGD肽可為線性或環狀，且可經修飾，如經糖基化或甲基化，以促
進靶向至一或多個特定組織。含RGD之肽及擬肽物可包括D-胺基酸，以及以及合成RGD模擬物。除了RGD，吾人也可使用其他靶向整合素配體的部份體。此配體的較佳接合體係靶向PECAM-1或VEGF。
「細胞穿透肽」係能夠穿透細胞，如微生物細胞諸如細菌或真菌細胞、或哺乳動物細胞諸如人類細胞。微生物細胞穿透肽可為，例如，α-螺旋線性肽(如，LL-37或天蠶抗菌肽P1(Ceropin P1))、含雙硫鍵之肽(如，α-防禦素(defensin)、β-防禦素或抗菌肽(bactenecin))、或僅含有一個或兩種優勢胺基酸的肽(如，PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。細胞穿透肽也可包括核定位訊號(NLS)。例如，細胞穿透肽可為由雙房兩性肽，如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41與SV40大T抗原之NLS的融合肽結構域(Simeoni等人之Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合體
於本發明之組成物與方法的一些實施態樣中，iRNA寡核苷酸進一步包含碳水化合物。接合有碳水化合物之iRNA係有利於核酸，以及適合活體內治療性用途之組成物之活體內遞送，如本文中所述。如本文中所使用，「碳水化合物」係指稱化合物，其係為本身由一個或多個單糖單元組成之碳水化合物，該單糖單元具有至少6個碳原子(其可以是線性、分枝或環狀)與鍵結到各碳化合物原子之氧、氮或硫原子；或具有作為其之一部分之碳水化合物部分體之化合
物，該碳水化合物由一個或多個各具有至少6個碳原子(其可以是線性、分枝或環狀)與鍵結到各碳化合物原子之氧、氮或硫原子之單糖單元組成。代表性的碳水化合物包括糖類(單糖、二醣、三醣及含有約4、5、6、7、8、或9個單糖單元之寡醣)、及多醣諸如澱粉、肝糖、纖維素和多醣膠。具體單糖包括HBV和更高(如，HBV、C6、C7、或C8)糖類；二醣和三醣包括具有兩個或3個單糖單元(如，HBV、C6、C7、或C8)糖類。
於一種實施態樣中，用於本發明之組成物與方法之碳水化合物接合體係單糖。於一種實施態樣中，該單糖係N-乙醯半乳糖胺，諸如
於另一種實施態樣中，用於本發明之組成物與方法之碳水化合物接合體係選自下列所組成群組：
用於本文中所述之實施態樣中的另一種代表性碳水化合物接合體，包括但不限於，
(式XXIII)，當X或Y之一者係寡核苷酸，另一者係氫。
於一些實施態樣中，該碳水化合物接合體進一步包含一或多個額外的如上所述配體，諸如但不限於PK調控劑及/或細胞穿透肽。
適合用於本發明之額外的碳水化合物接合體包括彼等描述於PCT專利申請公開案WO 2014/179620
號及WO 2014/179627號，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文中。
D.鏈結子
於一些實施態樣中，本文中所述之接合體或配體可經各式鏈結子，其係可為可裂解或非可裂解，附接至iRNA寡核苷酸。
術語「鏈結子」或「鏈結基」意指有機部分體，其連結化合物的兩個部分，如共價附接化合物的兩個部分。鏈結子典型包含直接鍵或原子諸如氧或硫、單元諸如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子鏈，諸如但不限於經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷
基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其一或多個亞甲基可被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環中斷或終止；其中R8係氫、醯基、脂族或經取代之脂族。於一種實施態樣中，該鏈結子係於1至24個原子之間、2至24、3至24、4至24、5至24、6至24、6至18、7至18、8至18個原子之間、7至17、8至17、6至16、7至16、或8至16個原子之間。
可裂解鏈結基一種其於細胞外係足夠安定，但其一單進入到目標細胞中會裂解以釋放被該鏈結子保持在一起的兩個部分。於較佳實施態樣中，於目標細胞中或在第一參考條件(其可，如經選定以模擬或代表細胞內條件)，該可裂解鏈結基脂裂解係至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍、或至少約100倍快於在對象之血液中、或在第二參考條件(其可，如經選定以模擬或代表在血液或血漿中之條件)。
可裂解鏈結基係易受裂解劑影響，如pH、氧化還原電位或降解性分子之出現。一般，裂解劑在細胞中較血漿或血液中更普遍或以更高水平或活性被發現。此種降解性劑之實施例包括：氧化還原劑，其係經選定用於特定受質或其不具有受質專一性，包括如氧化性或還原性酵素或還原劑諸如硫醇，出現在細胞中，其可藉由還原而降解氧化還原可裂解鏈結基；酯酶；胞內體或可創建酸性
環境之劑，如彼等導致5或更低之pH者；藉由作為一般酸而可水解或降解酸可裂解鏈結基之酵素、肽酶(其可為受質專一性)、及磷酸酶。
可裂解鏈結基，諸如二硫化物鍵可易受pH影響。人類血清之pH係7.4，而平均細胞內pH係稍低，範圍從約7.1至7.3。胞內體具有更酸性pH，於範圍5.5至6.0中，且溶酶體具有在5.0附近之甚至更酸性pH。一些鏈結子將具有會在較佳pH裂解之可裂解鏈結基，從而從細胞內部之配體釋放陽離子性脂質、或釋放陽離子性脂質入該細胞之所欲腔室。
鏈結子可包括會被特定酵素裂解之可裂解鏈結基。併入鏈結子之可裂解鏈結基的種類可取決於待靶向細胞。例如，靶向肝臟之配體可透過包括酯基之鏈結子鏈結至陽離子性脂質。肝臟細胞係富含酯酶，且因此該鏈結子將會在肝臟中比在不是富含酯酶之細胞種類中更有效率地裂解。其他富含酯酶之細胞種類包括肺臟、腎皮質、及睪丸之細胞。
當靶向富含肽酶之細胞種類時，諸如肝臟細胞及滑液細胞，可使用含有肽鍵之鏈結子。
一般，候選可裂解鏈結基之適合性可藉由測試降解性劑之能力而評價。也為所欲者係，也為了血液中或當與其他分目標組織接觸時之抗裂解能力，測試候選可裂解鏈結基。因此，吾人可決定第一與第二條件之間對於裂解之相對易受影響性，其中該第一係選定為於目標細
胞中裂解之指示且該第二係選定為於其他組織或生物學流體，如血液或血清中裂解之指示。該評價可於無細胞系統中、於細胞中、於器官或組織培養物中、或於整個動物中進行。於無細胞或培養物條件中製作初始評價以及藉由於整個動物中進一步評價而確認之係有用。於較佳實施態樣中，與血液或血漿(或於經選定用於模擬細胞外條件之活體外條件)相比，有用候選化合物係在細胞中(或於經選定用於模擬細胞內條件之活體外條件)至少2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或約100約倍更快地裂解。
i.氧化還原可裂解鏈結基
於一種實施態樣中，可裂解鏈結基係於還原或氧化時被裂解之氧化還原可裂解鏈結基。還原性可裂解鏈結基之實施例係二硫化物鏈結基(-S-S-)。決定是否候選可裂解鏈結基係適合「還原性可裂解鏈結基」或例如係適合用於與特定iRNA部分體及特定靶向劑合用，吾人可期待本文中所述之方法。例如，候選物可藉由使用本領域中已知之試劑與二硫蘇糖醇(DTT)、或其他還原劑一起培育而評價，其模擬將於細胞中觀察到的裂解速率，如於目標細胞中。該等候選物也可於經選定用於模擬血液或血清條件之條件評價。於一種中，於血液中候選化合物係裂解最多約10%。於其他實施態樣中，與血液(或於經選定用於模擬細胞外條件之活體外條件)相比，有用候選化合物係在細胞中(或於經選定用於模擬細胞內條件之活體外條件)至少約2、4、
10、20、30、40、50、60、70、80、90、或約100約倍更快地降解。候選化合物之裂解速率可使用標準酵素動力學試驗，於經選定用於模擬細胞內媒質之條件並與經選定用於模擬細胞外媒質之條件相比而決定。
ii 磷酸酯系可裂解鏈結基
於另一種實施態樣中，可裂解鏈結子包含磷酸酯系可裂解鏈結基。磷酸酯系可裂解鏈結基係被會降解或水解磷酸酯基之劑裂解。於細胞中，會裂解磷酸酯基之劑的實施例諸如細胞中之磷酸酶。磷酸酯系鏈結基之實施例係-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。較佳實施態樣係-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。較佳實施態樣係-O-P(O)(OH)-O-。這些候選物可使用類似上面所述的那些方法評價。
iii 酸可裂解鏈結基
於另一種實施態樣中，可裂解鏈結子包含酸可裂解鏈
結基。酸可裂解鏈結基係會於酸性條件裂解之鏈結基。於較佳實施態樣中，酸可裂解鏈結基可在具有pH為約6.5或更低(如約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0、或更低)之酸性條件中裂解、或可被劑諸如可作為一般酸之酵素裂解。於細胞中，特別低pH的胞器，諸如胞內體及溶媒體可提供用於酸可裂解鏈結基之裂解環境。酸可裂解鏈結基之實施例包括但不限於腙、酯、及胺基酸之酯。酸可裂解基可具有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。較佳實施態樣係當附接至酯(烷氧基)之氧的碳係芳基、經取代之烷基、或三級烷基諸如二甲基戊基或第三丁基。這些候選物可使用類似上面所述的那些方法評價。
iv.酯系鏈結基
於另一種實施態樣中，可裂解鏈結子包含酯系可裂解鏈結基。酯系可裂解鏈結基係被酵素諸如酯酶及醯胺酶裂解。酯系可裂解鏈結基之實施例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯。酯可裂解鏈結基具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。這些候選物可使用類似上面所述的那些方法評價。
v.肽系可裂解基
於又另一種實施態樣中，可裂解鏈結子包含肽系可裂解鏈結基。肽系可裂解鏈結基係被酵素諸如細胞中之肽酶及蛋白酶裂解。肽系可裂解鏈結基係形成在胺基酸之間用
以產出寡肽(如，二肽、三肽等等)及多肽之肽鍵。肽系可裂解基不包括醯胺基(-C(O)NH-)。醯胺基可在任何伸烷基、伸烯基及伸炔基之間形成。肽鍵係一種形成在胺基酸之間用以產出肽及蛋白之特別種類之醯胺鍵。肽系裂解基係一般限於形成在胺基酸之間以產出肽及蛋白之該肽鍵(該醯胺鍵)。肽系可裂解鏈結基具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB係兩個相鄰胺基酸之R基。這些候選物可使用類似上面所述的那些方法評價。
於一種實施態樣中，本發明之iRNA係透過鏈結子接合至碳水化合物。具有本發明之組成物與方法之鏈結子之iRNA碳水化合物接合體的非限制性實施例，包括但不限於，
當X或Y之一者係寡核苷酸，另一者係氫。
於本發明之組成物與方法的某些實施態樣中，配體係一或多個透過二價或三價分枝之鏈結子附接之「GalNAc」(N-乙醯半乳糖胺)衍生物。
於一種實施態樣中，本發明之dsRNA係接合至選自顯示於式(XXXII)至(XXXV)之任一者之結構所組成群組之二價或三價分枝之鏈結子：
每次出現時，q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C獨立表示0至20，以及其中該重複單元可為相同或不同；
每次出現時，P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C各獨立為CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
每次出現時，Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C各獨立為伸烷基、經取代之伸烷基，其中一或多個亞甲基可被O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)之一或多者中斷或終止；
每次出現時，R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C各獨立為NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、
NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
、
、
、
，
或雜環
基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示該配體；亦即每次出現時，各獨立為單糖(諸如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡糖、或多醣；以及Ra係H或胺基酸側鏈。三價接合GalNAc衍生物係特別有用於與用於抑制目標基因表現之RNAi劑，諸如彼等具有式(XXXV)者一起使用：
適合之用於接合GalNAc衍生物之二價及三價分枝之鏈結子基之實施例，包括但不限於上面所載如式II、VII、XI、X、及XIII之結構。
教示製備RNA結合體的代表性美國專利係包括，但不限於美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717號；第5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第
4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號及第5,688,941號；第6,294,664號；第6,320,017號；第6,576,752號；第6,783,931號；第6,900,297號；第7,037,646號；第8,106,022，從而其之各者的整體內容係藉由引用而併入本文。
不必於給定化合物中的所有位置是均一地經修飾，而事實上前述修飾之大於一者可併入至單個化合物中或甚至併入至在iRNA內之單個核苷。本發明也包括為嵌合化合物之iRNA化合物。
於本發明之上下文中之「嵌合」iRNA化合物或「嵌合物」，係iRNA化合物，較佳dsRNAs，其係含有兩個或更多個化學上區別區域，各由至少一種單體單元，亦即於dsRNA化合物之例子中之核苷酸，所組成。這些iRNA典型含有至少一個區域，其中該RNA經修飾而使得當該iRNA增加對核酸酶降解之抗性時，賦予增加之細
胞攝取、及/或對該目標核酸之增加之結合親和力。該iRNA之額外區域可做為能夠裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜合體之酵素之受質。藉由例示，RNase H係細胞內切酶，其裂解RNA：DNA雙鏈體之RNA股。因此，RNase H之活化造成該RNA目標之裂解，從而大大地增進iRNA抑制基因表現之效率。據此，與雜交到同一目標區域之硫代磷酸酯去氧dsRNA相比，當使用嵌合dsRNA時，可經常獲得與較短iRNA可相比擬之結果。該RNA目標之裂解可藉由凝膠電泳以及，若有需要，本領域中已知之核酸雜交相關技術而常規偵測。
於某些情況中，iRNA之RNA可經非配體基修飾。已有多種非配體基分子經接合至iRNA，以用於增進該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取，且用於執行此種接合之程序係於科學文獻中可得。此種非配體部分體已包括脂質部分體，諸如膽固醇(Kubo,T.等人之Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger等人之Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan等人之Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)、硫醚，如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人之Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan等人之Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫基膽固醇(Oberhauser等人之Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂族鏈，如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人之EMBO J.,1991,10：111；Kabanov等人之FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk等人
之Biochimie,1993,75：49)、磷脂質，如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等人之Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea等人之Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人之Nucleosides &Nucleotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人之Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基部分體(Mishra等人之Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八胺或己基胺基-羰基氧基膽固醇部分體(Crooke等人之J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示製備此種RNA接合體的代表性美國專利已列舉如上。典型接合方案係涉及帶有胺基鏈結子在該序列之一或多個位置之RNA之合成。接著使用適當耦合或活化試劑，將該胺基與該待接合分子反應。該接合反應係以該RNA仍鍵結至該固體撐體或在該RNA裂解後，於溶液相中執行。藉由HPLC之該RNA接合體之純化點性給出純接合體。
V.本發明之iRNA的遞送
將本發明之iRNA劑遞送至細胞，如對象(諸如人對象(如，有此需求之對象，諸如具有PNPLA3基因表現相關疾病、病症或症狀之對象))內之細胞，可藉由多種不同方式達成。例如，可藉由使細胞與本發明之iRNA於活體外或活體內接觸而施行遞送。活體內遞送也可藉由將包含iRNA，如dsRNA之組成物給藥至對象而直接施行之。此等
替代方案係進一步討論於下。
一般，可採用遞送核酸分子的任一方法(活體外或活體內)(參見，如，Akhtar S.與Julian RL.之(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其係藉由引用而以它們的整體併入本文)與本發明之iRNA合用。對於活體內遞送，為了遞送iRNA分子而慮及之因子係包括，例如，所遞送之分子的生物學安定性、非專一性效果之防止、以及所遞送之分子於目標組織內的累積。可藉由局部給藥(例如，藉由直接注射或植入組織或外用給藥)製劑，而最小化iRNA之非專一性效果。局部給藥至治療位點係最大化該劑之局部濃度，限制該劑曝露至不然可被該劑傷害或可降解該劑之全身性組織，以及容許待給藥之iRNA分子的較低總劑量。若干研究業經顯示，當局部給藥iRNA時，基因產品的成功剔除(knockdown)。例如，藉由玻璃體內注射於食蟹獼猴中(Tolentino,MJ.等人之(2004)Retina 24：132-138T)以及藉由視網膜下注射於小鼠中(Reich,SJ.等人之(2003)Mol.Vis.9：210-216)的VEGF dsRNA眼內遞送，二者皆顯示於老年黃斑部退化之實驗模型內防止新血管產生。此外，於小鼠中dsRNA之直接腫瘤內注射，減少了腫瘤體積(Pille,J.等人之(2005)Mol.Ther.11：267-274)並可延長荷瘤小鼠的存活時間(Kim,WJ.等人之(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.等人之(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干擾亦業經顯示，藉由直接注射而成功地局部遞送至CNS(Dorn,G.等人之(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.
等人之(2005)基因Ther.12：59-66；Makimura,H.等人之(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.等人之(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.等人之(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.等人之(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)，以及藉由鼻內給藥而成功地局部遞送至肺臟(Howard,KA.等人之(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.等人之(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.等人之(2005)Nat.Med.11：50-55)。對於全身性給藥iRNA而治療疾病，該RNA可經修飾或使用藥物遞送系統遞送；兩種方法皆作動以防止藉由活體內之核酸內切酶及核酸外切酶造成的dsRNA之快速降解。對RNA或醫藥載劑之修飾亦可容許該iRNA組成物靶向至目標組織，並避免非所欲之脫靶效果。iRNA分子可藉由化學接合至親脂性基諸如膽固醇而修飾之，以增進細胞攝取並防止降解。例如，將接合至親脂性膽固醇部分體之經指向針對ApoB的iRNA全身性注射給藥至小鼠，導致於肝臟及空腸二者中apoB mRNA之剔除(Soutschek,J.等人之(2004)Nature 432：173-178)。iRNA與適體之接合業經於前列腺癌小鼠模型中顯示，抑制腫瘤生長並介導腫瘤消退(McNamara,JO.等人之(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。於另種實施態樣中，可使用藥物遞送系統如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子性遞送系統來遞送該iRNA。荷正電之陽離子性遞送系統係促進與iRNA分子(荷負電)之結合，也提升在荷負電之細胞膜上的
相互反應，以容許該細胞對iRNA的有效攝取。陽離子性脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可鍵結至iRNA或經誘導，以形成包裹住iRNA之運載劑或微胞(參見，如，Kim SH.等人之(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。運載劑或微胞之形成係進一步防止當全身性給藥時該iRNA的降解。製作及給藥陽離子性iRNA複合物的方法係完全於技術領域中具有通常知識者之能力範圍內(參見，如，Sorensen,DR.等人之(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.等人之(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS等人之(2007)J.Hypertens.25：197-205，該等參考文獻係藉由引用而以其整體併入本文)。有用於iRNA之全身遞送之藥物遞送系統的一些非限制性實施例係包括DOTAP(Sorensen,DR.等人之(2003)，同上出處；Verma,UN.等人之(2003)，同上出處)、Oligofectamine，「固體核酸脂質粒子」(Zimmermann,TS.等人之(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.等人之(2005)Cancer基因Ther.12：321-328；Pal,A.等人之(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亞胺(Bonnet ME.等人之(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)、及聚醯胺基胺類(Tomalia,DA.等人之(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.等人之(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於一些實施態樣中，iRNA係與用於全身給藥之環糊精形成複合物。iRNA與環糊精之給藥
方法及藥物組成物可於第7,427,605號美國專利中發現，其係藉由引用而以其整體併入本文。
A.編碼有本發明之iRNA之載體
可自插入到DNA或RNA載體中之轉錄單元表現靶向PNPLA3基因之iRNA(參見，如Couture,A等人之TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.等人之國際PCT專利申請公開案第WO 00/22113號、Conrad之國際PCT專利申請公開案第WO 00/22114號、及Conrad之美國專利第6,054,299號)。表現可為暫時(數小時至數週規模)或持續(數週至數月或更長)，取決於所用之特定建構體及目標組織或細胞種類。這些轉植基因可呈線性建構體、環狀質體、或病毒載體引入，其可為整合或非整合載體。該轉殖基因也可經建構以容許其作為染色體外質體被遺傳(Gassmann等人之Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
iRNA之個別股或多股可從於表現載體之啟動子轉錄。當兩個分開之股待經表現以產生，例如dsRNA，兩個分開之表現載體可為共引入(如，藉由轉染或感染)到目標細胞中。替代地，dsRNA之各個別股可藉由二者皆位在同一表現質體之啟動子轉錄。於一種實施態樣中，dsRNA經表現成藉由鏈結子聚核苷酸序列聯結之反向重複聚核苷酸，而使得該dsRNA具有莖與環結構。
iRNA表現載體一般係DNA質體或病毒載體。表現載體與真核細胞可相容，較佳彼等與脊椎動物細
胞可相容者，可用於生產用於如本文中所述之iRNA之表現的重組建構體。真核細胞表現載體係為本領域所熟知且可得自多種商業來源。典型地，此種載體經提供為含有傳統限制位點，以用於所欲核酸片段之插入。iRNA表現載體之遞送可為全身性，諸如藉由靜脈內或肌肉給藥、藉由給藥至從患者移植出之目標細胞，接著再引入至該患者中、或藉由任何其他允許引入至所欲目標細胞之手段。
iRNA表現質體可呈與陽離子性脂質載劑(如，Oligofectamine)或非陽離子性脂質系載劑(如，Transit-TKOTM)之複合物轉染至目標細胞中。本發明也預期用於iRNA-介導剔除之多個脂質轉染，其係於一週或更長之時期靶向目標RNA之不同區域。可使用各式已知方法監測成功引入載體至宿主細胞中。例如，瞬時轉染可以報導子(reporter)，諸如螢光標記物，諸如綠素螢光蛋白質(GFP)為信號。離體之細胞安定轉染可使用提供經轉染細胞對特定環境因子(如，抗體及藥物)之抗性，諸如潮黴素B抗性之標記物確保之。
病毒載體系統，其可與本文中所述之方法與組成物一起利用，包括但不限於(a)腺病毒載體；(b)反轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼氏鼠類白血病病毒、等等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純性疱疹病毒載體；(e)SV40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體諸如正痘，如牛痘病毒載體、或鳥類痘，如金絲雀痘或家禽痘；及(j)
協助者依賴性(helper-dependent)或無病毒基因(gutless)腺病毒。複製缺陷性病毒也可是有利的。不同載體將會或將不會變成併入到細胞的基因體中。若為所欲，該建構體可包括病毒序列以用於轉染。替代地，該建構體可併入到能夠附加型複製(episomal replication)之載體中，如EPV及EBV載體。用於iRNA之重組表達之建構體將一般需要常規元件，如，啟動子、促進子等等，以確保於目標細胞中該iRNA之表現。對於載體與建構體所慮及之其他面向系進一步描述於下。
有用於iRNA遞送之載體將包括足夠用於在所欲目標細胞或組織中表現該iRNA之常規元件(啟動子、促進子、等等)。該常規元件可經選擇以提供或自發性(constitutive)或經調控/可誘導表現。
該iRNA之表現可經精確調控，例如藉由使用可誘導調控序列，其對某些生理調控子敏感，如，循環葡萄糖水平或激素(Docherty等人之1994,FASEB J.8：20-24)。此種可誘導表現系統，適於在細胞中或在哺乳動物中dsRNA表現之控制，包括，例如藉由蛻皮素調控、藉由雌激素、妊娠素、四環素，二聚化之化學誘導劑、及異丙基-β-D'1-硫代半乳哌喃糖苷(IPTG)。基於該iRNA轉殖基因之意欲用途，技術領域中具有通常知識者將能夠選擇適當調節性/啟動子序列。
可使用含有編碼iRNA之核苷酸序列之病毒載體。例如可使用反轉錄病毒載體(參見Miller等人之
Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。這些反轉錄病毒載體含有正確對象病毒基因體以及整合至宿主細胞DNA所需之組分。該編碼iRNA之核苷酸序列係選殖到一或多個載體中，該載體促進該核酸遞送至患者中。更詳細關於反轉錄病毒載體可於，例如Boesen等人之Biotherapy 6：291-302(1994)中找到，其描述反轉錄病毒載體遞送mdr1基因至造血幹細胞，以使該幹細胞更抗化學療法之用途。其他說明參考文件反轉錄病毒載體於基因療法中之用途係：Clowes等人之J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem等人之Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons及Gunzberg之Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；及Grossman及Wilson之Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。慢病毒載體預期用於包括，例如描述於美國專利第6,143,520號；第5,665,557號；及第5,981,276號中之HIV系載體，其等係藉由引用而併入本文中。
腺病毒也預期用於本發明之iRNA之遞送。腺病毒係尤其有吸引力的運載物，如，用於遞送基因至呼吸上皮。腺病毒天然感染呼吸上皮，於該處他們造成輕微疾病。腺病毒系遞送系統之其他目標為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞、及肌肉。腺病毒具有能夠感染不分裂細胞之優點。Kozarsky及Wilson之Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)呈現腺病毒系基因療法之回顧。Bout等人之Human Gene Therapy 5：3-10(1994)證實腺病毒將基因轉移至獼猴得呼吸上皮之用途。
腺病毒於基因療法中之用途的其他例子可在Rosenfeld等人之Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld等人之Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli等人之J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT專利申請公開案WO94/12649；以及Wang等人之Gene Therapy 2：775-783(1995)中找到。用於表現為本發明特徵之iRNA的適合AV載體、用以建構該重組AV載體之方法以及用以遞送該載體進入到目標細胞之方法，係描述於Xia H等人之(2002),Nat.Biotech.20：1006-1010中。
腺相關病毒(AAV)載體也可用於遞送本發明之iRNA(Walsh等人之Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美國專利案第5,436,146號)。於一種實施態樣中，該iRNA可表現成來自AAV載體之兩個分開且互補之單股RNA分子，該AAV載體具有，例如或U6或H1之RNA啟動子或細胞巨大病毒(CMV)啟動子。用以表現為本發明特徵之dsRNA之適合AAV載體、以及用以遞送該載體進入到目標細胞之方法係描述於Samulski R等人之(1987),J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J等人之(1996),J.Virol,70：520-532；Samulski R等人之(1989),J.Virol.63：3822-3826；美國專利案第5,252,479號；美國專利案第5,139,941號；國際專利申請案第WO 94/13788號；及國際專利申請案第WO 93/24641號中，其等之整體內容係藉由引用而併入本文中。
另一種適合本發明iRNA之遞送的病毒載
體係痘病毒諸如牛痘病毒，例如減毒牛痘諸如經修飾病毒安哥拉(MVA)或NYVAC、鳥類痘諸如金絲雀痘或家禽痘。
病毒載體之組織趨性可經修飾，係藉由以外套膜蛋白或來自其他病毒之其他表面抗原將該載體假性化、或藉由取代不同病毒殼蛋白質，當適當時，例如可將慢病毒載體以來自水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病、伊波拉、蒙古拉(Mokola)，及等等病毒之表面抗原假性化。AAV載體可藉由工程化該載體以表現不同殼蛋白質亞型，而被製作成靶向不同細胞；參見，如Rabinowitz J E等人之(2002),J Virol 76：791-801，其之整體內容係藉由引用而併入本文中。
載體之醫藥製劑可包括該載體於可接受之稀釋劑中、或可包括緩釋基質，其中係埋有基因遞送運載物。替代地，其中可從重組細胞完好生產完全基因遞送載體，如反轉錄病毒載體，該醫藥製劑可包括一或多種細胞，其生產該基因遞送系統。
VI.發明之醫藥組成物
本發明也包括醫藥組成物及製劑，其係包括本發明之iRNA。於一種實施態樣中，本文所提供者係含有如本文中所述之iRNA以及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。含有該iRNA之醫藥組成物係有用於治療與PNPLA3基因表現或活性相關之疾病或病症。
此種醫藥組成物係基於遞送模式而配製。
一個實施例係經配製用於經由非經口遞送，如經皮下(SC)、肌肉(IM)、或靜脈(IV)遞送而全身給藥的組成物。另一個實施例係經配製用於直接遞送到腦實質中，如經輸注到腦中，諸如藉由連續泵輸注的組成物。本發明之醫藥組成物可以足以抑制PNPLA3基因表現之劑量給藥。
本發明之醫藥組成物可以足以抑制PNPLA3基因表現之劑量給藥。通常，本發明之iRNA的適合劑量將為每天每公斤(kg)接受者體重約0.001至約200.0毫克(mg)之範圍。例如，該dsRNA可在每單劑約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約1.5mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約10mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約40mg/kg、或約50mg/kg給藥。重複劑制度(regimine)可包括在規則之基礎上給藥治療量iRNA，諸如每隔一天或一年一次。於某些實施態樣中，該iRNA係約每月一次至約每季一次(亦即，約每三個月一次)給藥。在初始治療制度後，該治療可在較不頻繁之基礎上給藥。
技術領域中具有通常知識者將理解，某些因子可影響有效治療對象所需之劑量與時點，包括但不限於疾病或病症之嚴重度、先前治療、對象之一般健康及/或年齡、及所出現之其他疾病。此外，以治療有效量之組成物治療對象係包括單一治療或一系列治療。如本領域中已知，本發明所涵蓋之個別iRNA的有效劑量及活體內半衰期之估算值，可使用傳統方法學或在使用適當動物模型之活體內測試之基礎上製作。
於小鼠遺傳學的進展已經產生了多種小鼠模型用於各種人類疾病研究，諸如將受益於PNPLA3表現減少的病症。此種模型可用劑的活體內測試，以及用於決定治療有效劑量。合適的膳食和遺傳小鼠模型回顧在Kanuri及Bergheim(Int.J.Mol.Sci.(2013)14：11963-11980)中。
本發明之醫藥組成物也可以多種方式給藥，取決於局部或全身性治療係所欲者以及取決於待治療區域。給藥可為局部(如，藉由穿皮貼劑)、肺部，如藉由吸入或粉末或氣溶膠，包括藉由噴霧器的吹入；氣管內、鼻內、表皮和穿皮、口服或非經口。非經口給藥包括靜脈、動脈、皮下、腹膜內或肌肉注射或輸注；皮下，如，經由植入之裝置；或顱內，如，經實質內、鞘內或腦室內給藥。
該iRNA可以靶向特定組織諸如肝臟(如，肝臟的肝細胞)之方式遞送。
用於局部給藥之醫藥組合物及製劑，可包括穿皮貼劑、軟膏、洗劑、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。傳統醫藥載體；水性、粉末或油性基底；增稠劑等可能是必要或所欲者。經塗覆保險套、手套等也可能是有用的。適當之局部製劑包括彼等其中為本發明特徵之iRNA係呈與局部遞送劑之混合物，局部遞送劑諸如脂類、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑。適當之脂質和脂質體包括中性(如，二油醯基磷脂醯基(DOPE)乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼(DMPC)、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼)、陰性(如，二肉荳蔻
醯基磷脂醯基甘油(DMPG))及陽離子性(如，二油醯基四甲基胺丙基(DOTAP)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOTMA))。為本發明特徵之iRNA可被包封在脂質體內或可形成複合至脂質體，特別是複合至陽離子性脂質體之複合物。替代地，iRNA可複合至脂質，特別是陽離子脂質。適當之脂肪酸及酯包括但不限於花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸單甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單辛酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或C1-20烷基酯(如肉荳蔻酸異丙酯(IPM))、單酸甘油脂、二酸甘油酯或其醫藥上可接受的鹽)。局部製劑係詳細說明於美國專利案第6,747,014號中，其係藉由引用而併入本文中。
A.包含膜性分子集合體(Membranous Molecular Assemblies)之iRNA製劑
用於本發明之組成物與方法中之iRNA，可經配製用以於膜性分子集合體，如脂質體或微胞中遞送。如本文中所使用，術語「脂質體」係指稱由排列成至少一個雙層，如一個雙層或複數個雙層之兩親脂質所組成的囊泡。脂質體包括具有由親脂性材料形成之膜和水性內部之單層或多層囊泡。水性部分含有該iRNA組成物。該親脂性材料隔離該水性內部與水性外部，該水性外部典型不包括該iRNA組成物，雖然在一些例子中，其可包括。脂質體有用於轉
移和遞送活性成分到作用位點。因為脂質體膜係結構上類似於生物學膜，當脂質體應用於組織時，脂質體雙層與細胞膜的雙層融合。由於脂質體與細胞的合併進展，包括該iRNA之內部水性內容物被遞送到該細胞中，其中該iRNA可專一性地結合到目標RNA並且可介導iRNA。在一些粒子中，該脂質體也專一性地被靶向，如，將該iRNA指向到特定細胞種類。
含有iRNA劑之脂質體可從各式方法製備。於一種實施例中，脂質體之脂質組分係溶解於清潔劑中以致微胞係與該脂質組分形成。例如該脂質組分可為兩親性陽離子性脂質或脂質接合體。清潔劑可具有高臨界微胞濃度且可為非離子性。例示性清潔劑包括膽酸鹽、CHAPS、辛基葡萄糖苷、去氧膽酸鹽、及月桂醯基肌胺酸。該iRNA劑製品接著添加至該包括脂質組分之微胞。在該脂質之陽離子性基係與該iRNA劑交互作用並在該iRNA劑附近濃縮而形成脂質體。濃縮後，該清潔劑被移除，藉由透析，以產出iRNA劑之脂質體製品。
若有需要，輔助縮合之載劑化合物可在縮合反應期間添加，如，藉由受控添加。例如，該載劑化合物可為除核酸以外之聚合物(如，精胺或亞精胺)。也可調整pH以利於縮合。
用於生產安定聚寡核苷酸遞送運載物，其係併入聚寡核苷酸/陽離子性脂質複合物作為該遞送運載物之結構組分，之方法，係進一步描述於如，WO 96/37194
中，其之整體內容係藉由引用而併入本文中。脂質體之形成也可包括描述於Felgner,P.L.等人之Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8：7413-7417,1987；美國專利案第4,897,355號；美國專利案第5,171,678號；Bangham等人之M.Mol.Biol.23：238,1965；Olson等人之Biochim.Biophys.Acta 557：9,1979；Szoka等人之Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194,1978；Mayhew等人之Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984；Kim等人之Biochim.Biophys.Acta 728：339,1983；及Fukunaga等人之Endocrinol.115：757,1984中之例示性方法的一或多個面向。用以製備用於作為遞送運載物之具合適大小的脂質聚集物的常用技術包括超音波及凍融加擠壓(參見，如Mayer等人之Biochim.Biophys.Acta 858：161,1986)。當一致地小(50至200nm)且相對地均一的聚集物為所欲者時，可使用微流體化(Mayhew等人之Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984)。這些方法容易適應包裝iRNA劑製品到脂質體中。
脂質體落在兩個廣的類別中。陽離子性脂質體係帶正電脂質體，其與帶負電核酸分子交互作用以形成安定複合物。帶正電核酸/脂質體複合物結合到帶負電細胞表面且被內化到胞內體中。由於胞內體內的酸性pH，該等脂質體裂開，釋放他們的內容物至細胞的細胞質中(Wang等人之Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
為pH-敏感或帶負電之脂質體，係捕獲核酸
而不是與之複合。由於核酸與該脂質係類似地帶電，發生排斥而不是形成複合物。僅管如此，一些核酸被捕獲在這些脂質體的水性內部內。pH-敏感脂質體已用於遞送編碼胸苷激酶基因之核酸到培養細胞單層中。於目標細胞中偵測到該外源性基因之表現(Zhou等人之Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
一種主要種類的脂質體組成物包括除天然衍生磷脂醯基膽鹼以外的磷脂質。中性脂質體組成物，例如可從二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼(DMPC)或二棕櫚醯基磷脂醯基膽鹼(DPPC)形成。陰離子性脂質體組成物一般係從二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油形成，而陰離子性膜融合(fusogenic)脂質體係從二油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)形成。另一種類的脂質體組成物係從磷脂醯基膽鹼(PC)諸如，例如大豆PC、以及蛋PC形成。另一種類係從磷脂質及/或磷脂醯基膽鹼及/或膽固醇形成。
活體內及活體外引入脂質體至細胞中的其他方法之實施例包括美國專利案第5,283,185號；美國專利案第5,171,678號；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner之J.Biol.Chem.269：2550,1994；Nabel之Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307,1993；Nabel之Human Gene Ther.3：649,1992；Gershon,Biochem.32：7143,1993；以及Strauss之EMBO J.11：417,1992。
非離子性脂質體系統也已經檢視，以決定他們於遞送藥物至皮膚之利用性，特別是包含非離子性表
面活性劑及膽固醇之系統。包含NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體製劑係用於遞送環胞素-A到小鼠皮膚之真皮中。結果指明此種非離子性脂質體系統於促進將環胞素A沉積至皮膚之不同層中係有效(Hu等人之S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4(6)466)。
脂質體也包括「立體上安定之」脂質體，一種術語其，如本文中所使用，係指包含一或多個特化脂質之脂質體，該特化脂質當併入到脂質體中時，導致相對於缺乏此種特化脂質之脂質體有增進之循環壽命。立體上安定之脂質體的實施例為，彼等其中該脂質體之形成囊泡脂質部分的局部(A)包含一或多個醣脂質，諸如單唾液酸神經節苷酯GM1、或(B)係以一或多個親水性聚合物衍生之，該親水性聚合物諸如聚乙二醇(PEG)部分體。雖不欲受縛於理論，本領域中認為至少對於含有神經節苷酯、神經鞘磷脂、或PEG-衍生脂質之立體上安定之脂質體，這些立體上安定之脂質體的該增進之循環壽命係衍生自減少攝取至網狀內皮系統(RES)之細胞中(Allen等人之FEBS Letters,1987,223,42；Wu等人之Cancer Research,1993,53,3765)。
包含一或多個醣脂質之各式脂質體係本領域中已知。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)已報導單唾液酸神經節苷酯GM1、硫酸半乳糖腦苷酯(galactocerebroside sulfate)及磷脂醯基肌醇用以改善脂
質體之血液半衰期的能力。這些發現係論述於Gabizon等人之(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)。皆為Allen等人之美國專利第4,837,028號及WO 88/04924，係揭示包含(1)神經鞘磷脂及(2)神經節苷酯GM1或硫酸半乳糖腦苷酯酯之脂質體。美國專利第5,543,152號(Webb等人)係揭示包含神經鞘磷脂之脂質體。包含1,2-sn-二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼之脂質體係揭示於WO 97/13499(Lim等人)中。
於一種實施態樣中，係使用陽離子性脂質體。陽離子性脂質體具備能夠融合至細胞膜之優點。非陽離子性脂質體雖然不能夠有效率地與原生質膜融合，其係於活體內被巨噬細胞攝取且可用於遞送iRNA劑至巨噬細胞。
脂質體之進一步優點包括：自天然磷脂質所獲得之脂質體係生物可相容且生物可降解；脂質體可併入廣泛範圍之水及脂質可溶藥物；脂質體可保護經包封的iRNA劑於他們的內部腔室中使其免於代謝及降解(Rosoff之"Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,volume 1,p.245)。於脂質體製劑之製備中的重要考量為該脂質表面電荷、囊泡大小及該脂質體之水性體積。
帶正電合成陽離子性脂質，N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)可用於形成小脂質體，其自發地與核酸交互作用而形成脂質-核酸複合
物，該複合物能夠與組織培養細胞之細胞膜之帶負電脂質融合，導致遞送iRNA劑(參見，如Felgner,P.L.等人之Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8：7413-7417,1987及美國專利案第4,897,355號對DOTMA及其與DNA之合用的描述)。
DOTMA類似物，1,2-雙(油醯基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可用於與磷脂質組合，以形成DNA-複合性囊泡。LipofectinTM Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)係用於遞送高度陰離子性核酸至包含帶正電DOTMA脂質體之活的組織培養細胞中之有效劑，該帶正電DOTMA脂質體自發地與帶負電聚核苷酸交互作用而形成複合物。當使用足夠之帶正電脂質體，所得複合物的淨電荷也為正。以此方式製備之帶正電複合物自發地附接至帶負電細胞表面，與原生質膜融合，且有效率地遞送官能性核酸到，例如組織培養細胞中。另一種商業上可得之陽離子性脂質，1,2-雙(油醯基氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷("DOTAP")(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)，其與DOTMA差異在該油醯基部分體係藉由酯而非醚鏈結子鏈結。
其他已報導陽離子性脂質化和物包括那些已接合至各式部分體者，該部分體包括，例如羧基精胺，其已接合至兩種脂質之一者且包括化合物諸如5-羧基精胺基甘胺酸二八油醯基醯胺(5-carboxyspermylglycine dioctaoleoylamide,「DOGS」)(TransfectamTM,Promega,Madison,Wisconsin)及二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇胺5-羧基
精胺基-醯胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamine 5-carboxyspermyl-amide,「DPPES」)(參見，如美國專利案第5,171,678號)。
另一種陽離子性脂質接合體包括脂質與膽固醇之衍生物(「DC-Chol」)，其與DOPE組合而經配製到脂質體中(參見，Gao,X.及Huang,L.之Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280,1991)。藉由接合聚離胺酸至DOPE製作之脂聚離胺酸，已報導係有效用於在血清存在下轉染(Zhou,X.等人之Biochim.Biophys.Acta 1065：8,1991)。對於某些細胞系，據說這些含有經接合陽離子性脂質之脂質體展現較低的毒性，並提供比含有DOTMA組合物更有效的轉染。其它商業上可得陽離子性脂質產品包括DMRIE及DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)以及Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。適合遞送寡核苷酸的其他陽離子性脂質係描述於WO 98/39359及WO 96/37194中。
脂質體製劑特別適合用於局部給藥，脂質表現幾個優於其他製劑之優點。此等優點包括與經給藥藥物的高全身性吸收相關副作用之減少、經給藥藥物在所欲目標累積之增加、以及用以投予iRNA劑進入皮膚的能力。在一些實施方式中，脂質體係用於遞送iRNA劑至表皮細胞，且也增進iRNA劑穿透到真皮組織中，如到皮膚中。例如，脂質體可局部施用。局部遞送經配製成脂質體之藥物到皮膚已被記錄(參見，如Weiner等人之Journal of Drug Targeting,1992,vol.2,405-410及du Plessis等人之Antiviral Research,18,1992,259-265；Mannino,R.J.及Fould-Fogerite,S.之Biotechniques 6：682-690,1988；Itani,T.等人之Gene 56：267-276.1987；Nicolau,C.等人之Meth.Enz.149：157-176,1987；Straubinger,R.M.及Papahadjopoulos,D.之Meth.Enz.101：512-527,1983；Wang,C.Y.及Huang,L.之Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855,1987)。
非離子性脂質體系統也已經檢視，以決定他們於遞送藥物至皮膚之利用性，特別是包含非離子性表面活性劑及膽固醇之系統。包含NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體製劑係用於遞送藥物到小鼠皮膚之真皮中。此種具有iRNA劑之製劑係有用於治療皮膚病症。
包括iRNA之脂質體可製作成高度可變形。此種變形性可使得脂質體能夠穿透通過比脂質體的平均半徑小的孔。例如，傳遞體是一種可變形脂質體。傳遞體可藉由添加表面邊緣活化劑，通常為表面活性劑，至標準脂質體組合物而製作。藉由感染，包括iRNA劑之傳遞體可，例如皮下遞送，可以於皮膚中遞送iRNA劑至角質細胞。為了跨越完整哺乳動物皮膚，脂質囊泡必須於適當的穿皮梯度影響下，穿通過一系列細孔，各具有直徑小於50nm。此外，由於該脂質性質，這些傳遞體可以是自最適化(自適應如，皮膚中孔的形狀)、自修復、及可常常達到他們的目
標而不破碎，並經常自加載。
適合於本發明之其他製劑係描述於美國臨時申請案2008年1月2日申請之第61/018,616號；2008年1月2日申請之第61/018,611號；2008年3月26日申請之第61/039,748號；2008年4月22日申請之第61/047,087號及2008年5月8日申請之第61/051,528號。2007年10月3日申請之PCT申請案編號PCT/US2007/080331也描述適合於本發明之製劑。
傳遞體是又另一種類脂質體，並且是高度可變形脂質聚集體，其係藥物遞送運載物之有吸引力的候選。傳遞體可經描述為脂質滴，其係如此高度可變形，而使得它們容易能夠穿透過比液滴小之孔。傳遞體是適合於在它們被使用的環境，如它們是自最適化(自適應皮膚中孔的形狀)、自修復、常常達到他們的目標而不片段化、及經常自加載。為了製作傳遞體，可以添加表面邊緣活化劑，通常為表面活性劑，至標準脂質體組合物。傳遞體已用於遞送血清白蛋白到皮膚。已顯示傳遞體介導之血清白蛋白遞送係如皮下注射含有血清白蛋白之溶液般有效。
表面活性劑在製劑諸如乳液(包括微乳液)和脂質體中有廣泛的應用。分類和排序許多不同種類表面活性劑，天然和合成二者，之性質的最常見的方式係，藉由使用親水/親油平衡(HLB)。親水性基(也稱為「頭」)的天性提供了最有用的手段，以用於分類製劑中所使用的不同表面活性劑(Rieger,in "Pharmaceutical Dosage Forms",
Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
若表面活性劑分子不是經離子化者，其被歸類為非離子性表面活性劑。非離子性表面活性劑在醫藥和化妝品產品中有廣泛應用，並且係在很廣範圍之pH值使用。一般，取決於它們的結構，它們的HLB值範圍從2至約18。非離子性表面活性劑包括非離子性酯諸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨醇酯、蔗糖酯、及乙氧基化酯。非離子性烷醇醯胺及醚諸如脂肪醇乙氧化物、丙氧基化醇、乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括在這個類別中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子性表面活性劑類別的最流行的成員。
若當表面活性劑分子溶解或分散在水中時，其係攜帶負電荷，該表面活性劑被歸類為陰離子性。陰離子性表面活性劑包括羧酸酯諸如肥皂、醯基乳酸酯、胺基酸的醯基醯胺、硫酸之酯諸如硫酸烷酯及乙氧基化硫酸烷酯、磺酸酯諸如苯磺酸烷酯、醯基羥乙磺酸酯、醯基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯、及磷酸酯。陰離子性表面活性劑類別的最重要成員是硫酸烷酯和肥皂。
若當表面活性劑分子溶解或分散在水中時，其係攜帶正電荷，該表面活性劑被歸類為陽離子性。陽離子性表面活性劑包括四級銨鹽和乙氧基化胺。四級銨鹽是這個類別最常用成員。
若表面活性劑分子具有攜帶或正或負電荷的能力，該表面活性劑被歸類為兩性。兩性表面活性劑包
括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯胺、N-烷基甜菜鹼和磷脂。
表面活性劑在藥物產品、製劑及乳液中之用途已回顧於(Rieger之“Pharmaceutical Dosage Forms”,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用於本發明方法中的iRNA也可呈微胞製劑提供。「微胞」在本文中定義為特定種類之分子集合體，其中兩親性分子被排列成球狀結構，而使得該分子的所有疏水部分朝內指向，留下親水部分與周圍的水性相接觸。若環境是疏水性，則存在相反的排列。
適合用於遞送通過透皮膜之混合的微胞製劑可藉由混合該siRNA組合物之水溶液、鹼金屬C8至C22烷基硫酸酯、及微胞形成性化合物來製備。例示性微胞形成性化合物包括卵磷脂、玻尿酸、玻尿酸之醫藥上可接受的鹽、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、黃瓜提取物、油酸、亞油酸、亞麻酸、油酸單甘油酯、單油酸酯、單月桂酸酯、琉璃苣油、晚櫻草油、薄荷醇、三羥基側氧基膽烷基甘氨酸(trihydroxy oxo cholanyl glycine)及其醫藥上可接受的鹽、甘油、聚甘油、離胺酸、聚離胺酸、三油醯甘油、聚氧乙烯醚及其類似物、聚多卡醇烷基醚及其類似物、鵝去氧膽酸鹽、去氧膽酸鹽、及其混合物。微胞形成性化合物可在相同時間或在添加鹼金屬烷基硫酸酯後加入。以實質上任何種類混合組分都將形成混合的微胞，但劇烈混合以提供較小大小之微胞。
在一種方法中，係製備第一微胞組合物，其含有該siRNA組合物以及至少該鹼金屬烷基硫酸酯。接著，該第一微胞組合物係與至少三種微胞形成性化合物混合，以形成混合的微胞組合物。在另一種方法中，微胞組合物係藉由混合該siRNA組合物、該鹼金屬烷基硫酸酯以及該微胞形成性化合物中的至少一者，隨後加入剩餘的微胞形成性化合物，伴隨劇烈混合而製備。
酚及/或間甲酚可添加到該混合的微胞組合物，以安定製劑並保護其對抗細菌生長。替代地，酚及/或間甲酚可與微胞形成性組分一起添加。也可以在形成該混合的微胞組合物之後添加等滲劑諸如甘油。
為了呈噴霧劑遞送微胞製劑，該製劑可以被放入到氣溶膠分配器且該分配器填充有推進劑。推進劑，其是在壓力下，在分配器中係呈液體形式。調整各組分的比，以便水性相及推進劑相變成一體，亦即，出現一個相。若有兩個相，有必要在分配內容物，如通過計量閥之前，將搖動該分配器。醫藥劑的分配劑量是從計量閥推進呈細噴霧劑。
推進劑可以包括含有氫之氯氟碳化物、含氫之氟碳化物、二甲醚及二乙醚。於某些實施態樣中，可以使用的HFA134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
必要組分的具體濃度可以藉由相對簡單的實驗來決定。對於透過口腔吸收，經常所欲為或增加，如至少二倍或三倍，該透過注射或透過胃腸道給藥劑量。
B.脂質粒子
本發明中之iRNA，如dsRNA可完全包封於脂質製劑，如LNP、或其他核酸-脂質粒子中。術語「脂質奈米粒子」或「LNP」係囊泡，其包含對象醫藥上活性分子之脂質層，該醫藥上活性分子諸如和酸分子，如iRNA或從其轉錄出iRNA之質體。LNP係描述於，例如美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號、及第8,058,069號，從而其之整體內容係藉由引用而併入本文中。
LNP典型含有陽離子脂質、非陽離子脂質、及防止粒子聚集之脂質(如，PEG-脂質接合體)。LNP係極為有用於全身性應用中，因為他們展現於靜脈(i.v.)注射後之延長循環壽命且累積在遠端位點(如，與給藥位點物理上分開之位點)。LNP包括「PSPL」，其包括經包封之縮合劑-核酸複合物，如PCT專利申請案公開第WO00/03683號中闡述。本發明之粒子典型具有平均直徑為約50nm至約150nm，更典型地約60nm至約130nm，更典型地約70nm至約110nm，最典型為約70nm至約90nm，並且係實質上非毒性。此外，當該核酸存在於本發明之核酸-脂質粒子中時，係在水溶液中對以核酸酶降解具有抗性。該核酸-脂質粒子及其製備方法係描述於，如美國專利第5976567號；第5981501號；第6534484號；第6586410號；第6815432號；美國專利申請案公開第2010/0324120號和PCT專利申請案公開第WO 96/40964。
於一種實施態樣中，該脂質對藥物比(質量/質量比)(如，脂質對dsRNA比)將在範圍從約1：1至約50：1、從約1：1至約25：1、從約3：1至約15：1、從約4：1至約10：1、從約5：1至約9：1、或約6：1至約9：1。於上面所載範圍中間之範圍也預期為本發明之一部分。
該陽離子性脂質可為，
例如N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(I-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3二油基氧基)丙基胺(DODMA)、1,2-二亞麻仁油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻仁油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亞麻仁油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞麻仁油基氧基-3-(二甲基胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞麻仁油基氧基-3-N-嗎啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞麻仁油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞麻仁油基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞麻仁油醯基-2-亞麻仁油基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞麻仁油基氧基-3-三甲基胺基丙烷氯化物鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞麻仁油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯化物鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞麻仁油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)，或3-(N,N-二
亞麻仁油基胺基)-1,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亞麻仁油基側氧基-3-(2-N,N-二甲基胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二次亞麻仁油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亞麻仁油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊烯并[d][1,3]二氧雜環戊烷-5-胺(ALN100)、4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)、或其混合物。該陽離子性脂質可包含從出現在該粒子中之總脂質的約20莫耳%(mol%)至約50mol%或約40mol%。
於另一種實施態樣中，化合物2,2-亞麻仁油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷可用於製備脂質-siRNA粒子。2,2-亞麻仁油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷之合成係描述於2008年10月23日申請之美國臨時專利申請案第61/107,998號，其係藉由引用併入本文中。
於一種實施態樣中，該脂質-siRNA粒子包括40%之2,2-亞麻仁油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧環戊烷：10%之DSPC：40%之膽固醇：10%之PEG-C-DOMG(莫耳百分比)，具有粒子大小為63.0±20nm
以及0.027之siRNA/脂質比。
該可離子化/非陽離子性脂質可為陰離子性脂質或中性脂質，包括但不限於二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯基膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯基膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯基甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯基甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯基膽鹼(POPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯基乙醇胺(POPE)、二油醯基磷脂醯基乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基)-環己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯基乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、膽固醇、或其組合。該若包括膽固醇，該非陽離子性脂質可從出現在該粒子中之總脂質的約5mol%至約90mol%、約10mol%、或約58mol%。
抑制粒子聚集之經結合脂質可為，例如聚乙二醇(PEG)-脂質，包括但不限於PEG-二醯基甘油(DAG)、PEG-二烷基氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂質、PEG-神經醯胺(Cer)、或其混合物。該PEG-DAA接合體可為，例如PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉荳蔻基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕櫚基氧基丙基(Ci6)、或PEG-二硬脂基氧基丙基(Ci8)。該抑制粒子聚集之經接合脂質可為，從出現在該粒子中之總脂質的0mol%至約20mol%或約2mol%。
於一些實施態樣中，該核酸-脂質粒子進一步包括膽固醇為，例如出現在該粒子中之總脂質的約10mol%至約60mol%或約48mol%。
於一種實施態樣中，利匹哆異德(lipidoid)ND98˙4HCl(MW 1487)(參見美國專利申請案第12/056,230號，2008年3月26日申請，其係藉由引用併入本文中)、膽固醇(Sigma-Aldrich)、及PEG-神經醯胺C16(Avanti Polar Lipids)可用於製備脂質-dsRNA奈米粒子(亦即，LNP01粒子)。各者於乙醇之原液係製備如下：ND98，133mg/ml；膽固醇，25mg/ml；PEG-神經醯胺C16，100mg/ml。接著，ND98、膽固醇、及PEG-神經醯胺C16原液可以，如42：48：10之莫耳比組合。經組合脂質溶液可與水性dsRNA(如，於乙酸鈉中，pH 5)混合，而使得最終乙醇濃度為約35至45%以及最終乙酸鈉濃度為約100至300mM。脂質-dsRNA奈米粒子典型於混合時自發地形成。取決於所欲粒子大小分佈，所得奈米粒子混合物可使用例如，熱桶擠壓機，諸如Lipex擠壓機(Northern Lipids,Inc)擠壓通過聚碳酸酯膜(如，100nm切分)。於一些例子中，擠壓步驟可省略。乙醇移除及同時之緩衝液交換可藉由，例如透析或切向流動過濾完成。緩衝液可以例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)於約pH 7，例如約pH 6.9、約pH 7.0、約pH 7.1、約pH 7.2、約pH 7.3、或約pH 7.4交換。
LNP01製劑係描述於，如國際專利申請公開案第WO2008/042973號，其係藉由引用併入本文中。
額外之例示性脂質-dsRNA製劑係描述於表1中。
表1
DSPC：二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼
DPPC：二棕櫚醯基磷脂醯基膽鹼
PEG-DMG：PEG-二肉豆蔲醯基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(PEG平均分子量為2000)
PEG-DSG：PEG-二硬脂基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(PEG平均分子量為2000)
PEG-cDMA：PEG-胺甲醯基-1,2-二肉荳蔻基氧丙基胺(PEG平均分子量為2000)
包含SNALP(1,2-二亞麻基氧-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA))之調配物說明於國際公告案案號WO2009/127060(申請日：2009年4月15日)，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。
包含XTC之調配物說明於例如，美國臨時申請案號61/148,366(申請日2009年1月29日)；美國臨時申請案號61/156,85(申請日2009年3月2日)；美國臨時申請案號(申請日2009年6月10日)；美國臨時申請案號61/228,373(申請日2009年7月24日)；美國臨時申請案號61/239,686(申請日2009年9月3日)；及國際申請案案號PCT/US2010/022614(申請日2010年1月29日)；其揭示內容已以引用之方式併入本文中。
包含MC3之調配物說明於例如，美國公開案案號2010/0324120(申請日2010年6月10日)，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
包含ALNY-100之調配物說明於例如，國際專利申請案案號PCT/US09/63933(申請日2009年11月10日)，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。
包含C12-200之調配物說明於美國臨時申請案號61/175,770(申請日2009年5月5日)；及國際申請案案號PCT/US10/33777(申請日2010年5月5日)，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。
供經口投藥組成物與調配物包括粉劑或粒劑、微粒、奈米粒、含於水性或非水性介質中之懸浮液或
溶液、膠囊、明膠囊、藥包、錠劑或迷你錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或結合劑。有些具體實施例中，經口調配物為彼等其中由如本發明所說明特徵之dsRNA與一或多種滲透加強劑界面活性劑及螯合劑組合投藥。合適界面活性劑包括脂肪酸與/或酯類或其鹽類、膽汁酸與/或其鹽類。合適膽汁酸/鹽類包括鵝去氧膽酸(CDCA)與熊去氧鵝去氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、葡膽酸、甘膽酸、去氧甘膽酸、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉與醣二氫褐黴酸鈉。合適脂肪酸包括花生四烯酸、十一碳烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二碳烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或單酸甘油脂、二酸甘油脂或其醫藥上可接受之鹽(例如，鈉鹽)。有些具體實施例中，可使用滲透加強劑之組合，例如，脂肪酸/鹽類與膽汁酸/鹽類之組合。其中一種組合實例為月桂酸鈉鹽、癸酸與UDCA之組合。其他滲透加強劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。如本發明所說明特徵之dsRNA可呈包括噴霧乾燥之粒子或複合形成微粒或奈米粒子之粒型經口傳遞。DsRNA複合劑包括聚-胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧雜環丁烷(oxethane)、聚烷基氰基丙烯酸酯；陽離子化明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)與澱粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE-衍生
之聚亞胺、短梗黴多醣(pollulans)、纖維素與澱粉。合適複合劑包括幾丁聚醣、N-三甲基幾丁聚醣、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺、魚精蛋白，聚乙烯吡啶、聚硫二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如，對胺基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白與DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸鹽、與聚乙二醇(PEG)。dsRNA之口服調配物與其製法詳細說明於美國專利案第6,887,906號、美國公開案案號20030027780與美國專利案第6,747,014號，其揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
供非經腸式、(腦)實質內、鞘內、腦室內或肝內投藥之組成物與調配物可包括無菌水溶液，其中亦可包含緩衝劑、稀釋劑與其他合適添加劑，如，(但不限於)：滲透加強劑、載劑化合物與其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
本發明醫藥組成物包括但不限於，溶液、乳液與包含脂質體之調配物。此等組成物可由各種不同組份產生，包括但不限於，預成型液體、自行乳化之固體與自行乳化之半固體。當治療肝病變(如肝癌瘤)時，特別佳為靶向肝臟之調配物。
適合呈單位劑型之本發明醫藥調配物可依據醫藥業習知技術製備。此等技術包括組合活性成份與醫藥載劑(群)或賦形劑(群)之步驟。通常，調配物之製法為均勻且密切組合活性成份與液態載劑或細碎固態載劑或二者，然後若必要時，使產物成型。
本發明組成物可調配成許多可能劑型中之任一種，如(但不限於)，錠劑、膠囊、明膠囊、液態糖漿、軟明膠囊、栓劑與灌腸劑。本發明組成物亦可於水性、非水性或混合介質中調配成懸浮液。水性懸浮液可進一步包含可提高該懸浮液黏度之物質，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇與/或葡聚糖。該懸浮液亦可包含安定劑。
C.其他調配物
i.乳液
本發明組成物可製造並調配成乳液。乳液為其中一種液體呈直徑通常超過0.1μm之液滴型態勻散在另一種液體中之典型不均相系統(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於“Pharmaceutical Dosage Forms”，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199；Rosoff述於“Pharmaceutical Dosage Forms”，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,
N.Y.，第一冊，p.245；Block述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第2冊，p.335；Higuchi等人述於"Remington's Pharmaceutical Sciences",Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常為雙相系統，其包含兩個彼此密切混合與分散之不可混溶之液相。通常，乳液可為油包水(w/o)型或水包油(o/w)型。當水相分成小液滴均勻分佈且分散在大體積之油相中時，所得組成物稱為油包水性(w/o)乳液。或者，當油相分成小液滴均勻分佈且分散在大體積之水相中時，所得組成物稱為水包油性(o/w)乳液。乳液中除了分散相外，可再包含其他組份，且活性藥物可呈溶液存在於水相、油相或本身另呈一相。需要時，乳液中亦可包含醫藥賦形劑，如：乳化劑、安定劑、染劑、與抗氧化劑。醫藥乳液亦可為由超過兩相組成之多相乳液，如，例如，以油包水包油性(o/w/o)與水包油包水性(w/o/w)乳液為例。此等複合調配物經常提供單純二元乳液沒有之某些優點。其中o/w乳液之個別油滴包埋小水滴之多相乳液即構成w/o/w乳液。同樣地，由油滴包埋在於油連續相中安定化之水球中，提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於很低或沒有熱動力學安定性。通常，乳液之分散相或不連續相均勻分佈在外相或連續相內，並利用乳化劑或調配物之黏度維持此型式。乳液之任一相可以為半固體或固體，如乳液型油膏基質與乳霜。其他安定乳液方式可以使用乳化劑，引進乳液之任一
相中。乳化劑可廣義分為四類：合成性界面活性劑、天然乳化劑、吸收基質、與均勻分散之固體(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於"Pharmaceutical Dosage Forms",Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。
合成性界面活性劑亦已知為表面活性劑，已廣泛用於調配乳液，且已於文獻中說明(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.285；Idson述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第一冊，p.199)。界面活性劑通常為兩親性，其包含親水性與疏水性部份。界面活性劑之親水性對疏水性性質之比值稱為親水物/親脂物平衡值(HLB)，係在製備調配物時用於分類及選擇界面活性劑之有利工具。界面活性劑可依據親水性基團性質分成不同類型：非離子性、陰離子性、陽離子性、與兩親性(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery
Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.、第一冊，p.285)。
用於乳液調配物之天然乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂與阿拉伯膠。吸收性基質具有親水性性質，因此可吸收水形成w/o乳液，但仍保留其半固態堅實度，如無水羊毛脂與親水性石蠟。亦可使用細碎固體作為良好乳化劑，尤其與界面活性劑組合及用於黏性製劑中時。此等包括極性無機固體，如：重金屬氫氧化物、非膨脹性黏土，如皂土、矽鎂土、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫土、膠體矽酸鋁與膠體矽酸鎂鋁、色素、與非極性固體，如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液調配物中亦可包括許多種不同之非乳化材料，其可賦與乳液性質。此等物質包括脂肪、油類、蠟類、脂肪酸、脂肪醇類、脂肪酯類、保濕劑、親水性膠體、防腐劑與抗氧化劑(Block述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.、第一冊，p.335；Idson述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。
親水性膠體或水膠體包括天然膠質與合成
性聚合物，如多醣類(例如，阿拉伯膠、洋菜、藻酸、鹿角菜膠、關華豆膠、卡拉膠與黃蓍膠)、纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素與羧丙基纖維素)、與合成性聚合物(例如，卡波姆(carbomers)、纖維素醚與羧乙烯基聚合物)。此等物質於水中分散或膨脹，形成膠體溶液，藉由在分散相之液滴周圍形成強力介面膜並提高外相之黏度，而安定該乳液。
由於乳液經常包含許多如碳水化合物、蛋白質、固醇類、與磷脂之成份，很容易支持微生物生長，因此此等調配物經常添加防腐劑。常包括於乳液調配物中之防腐劑包括對羥基苯甲酸甲基酯、對羥基苯甲酸丙基酯、四級銨鹽類、氯化苄二甲烴銨、對羥基苯甲酸之酯類、與硼酸。亦經常添加抗氧化劑至乳液調配物中，以防止調配物劣化。所使用之抗氧化劑可為游離基清除劑，如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯，或還原劑，如抗壞血酸與偏亞硫酸氫鈉，與抗氧化促效劑，如檸檬酸、酒石酸與卵磷脂。
乳液調配物經由皮膚、口、與非經腸式途徑之用途與其製造方法已有文獻說明(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。用於經口傳遞之乳液調配物因為容易調
配，且從吸收效力與生體可用率觀點，已極廣泛使用(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245；Idson述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。基於礦物油之緩瀉劑、油溶性維生素與高脂肪營養製劑為常用於呈o/w乳液經口投藥之材料。
ii.微乳液
本發明一項具體實施例中，iRNA與核酸之組成物係調配成微乳液。微乳液之定義為由水、油與兩親物形成單一之光學上各向同性且熱動力學上安定之液體溶液之系統(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245)。典型微乳液為先讓油分散在水性界面活性劑溶液中，然後添加足量之第四組份所形成之系統，通常添加中鏈長醇類，以形成透明系統。因此，微乳
液亦稱為兩種不混溶液體之動力學上安定之各向同性透明分散液，其係利用表面活性分子之界面膜安定化(Leung與Shah述於："Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate System"，Rosoff,M.編輯，1989,VCH Publishers,New York,p.185-215)。微乳液通常係由3至5種組份組合製成，其包括油、水、界面活性劑、輔界面活性劑與電解質。該微乳液為油包水(w/o)或水包油(o/w)型端賴所使用油與界面活性劑之性質及界面活性劑分子之極性頭端與烴尾端之結構與幾何堆疊而定(Schott述於"Remington's Pharmaceutical Sciences"，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相態圖之現象學方法已有深入研究，且已產生大量知識，讓熟悉此相關技術者了解如何調配微乳液(參見例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.，2004，Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245；Block述於"Pharmaceutical Dosage Forms"，Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.335)。相較於一般乳液，微乳液之優點在於可在自發性形成之熱動力學上安定之液滴之調配物中溶解水不溶性藥物。
製備微乳液時所使用之界面活性劑包括但
不限於，離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚類、聚甘油脂肪酸酯類、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)，其可單獨使用或與輔界面活性劑組合使用。輔界面活性劑通常為短鏈醇，如乙醇、1-丙醇、與1-丁醇，其藉由滲透至界面活性劑膜中，在界面活性劑分子之間產生空隙，因此造成無序膜，而提高界面流動性。然而不需要使用輔界面活性劑亦可製備微乳液，且相關技藝上已知不含醇之可自行乳化之微乳液系統。典型之水相為但不限於，水、藥物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、與乙二醇之衍生物。該油相可包括但不限於，下列材料，如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯類、中鏈(C8-C12)單酸-、二酸-、與三酸甘油酯、聚氧乙基化甘油基脂肪酸酯類、脂肪醇類、聚二醇化甘油酯類、飽和聚二醇化C8-C10甘油酯類、植物油與矽酮油類。
從藥物溶解度與加強藥物吸收性之觀點而言，微乳液特別值得注意。已提出基於脂質之微乳液(包括o/w與w/o)來加強藥物(包括肽)之口服生體可用率(參見例如，美國專利案第6,191,105號；第7,063,860號；第7,070,802號；第7,157,099號；Constantinidos等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel之Meth.Find.Exp. Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供之優點為改善藥物溶解性、保護藥物免於酵素水解、可能基於界面活性劑誘發改變膜流動性與通透性而加強藥物吸收性、容易製備、比固態劑型容易經口投藥、改善臨床效力、及降低毒性(參見例如，美國專利案第6,191,105號；第7,063,860號；第7,070,802號；第7,157,099號；Constantinides等人，Pharmaceutical Researchh,1994,11,1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當於環境溫度下將微乳液組份組合在一起時，經常可自發性形成微乳液。當調配對熱敏感之藥物、肽、或iRNA時，微乳液特別有利。微乳液亦可在化妝品與醫藥用途上有效地穿皮式傳遞活性組份。預期本發明微乳液組成物與調配物將可促進胃腸道提高iRNA與核酸之全身吸收性，並改善局部細胞吸收iRNA與核酸。
本發明微乳液亦可包含其他組份與添加劑，如：山梨糖醇酐單硬脂酸酯(Grill 3)、聚乙二醇-8-辛酸/癸酸酯(Labrasol)與滲透加強劑，以改善調配物性質，及加強本發明iRNA與核酸之吸收性。本發明微乳液所採用之滲透加強劑可分為1至5大類-界面活性劑、脂肪酸，膽汁鹽類、螯合劑與非螯合性非界面活性劑(Lee等人，"Critical Reviews in Therapeutic Drag Carrier Systems”,1991,p.92)。此等類別已分別如上述討論。
iii.微粒子
本發明iRNA劑可以併至粒子，例如，微粒子中。微
粒子可由噴霧乾燥法產生，但亦可採用其他方法，包括冷凍乾燥、蒸發、流化床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv.滲透加強劑
一項具體實施例中，本發明使用各種不同滲透加強劑，讓核酸(特定言之iRNA)有效傳遞至動物皮膚。大多數藥物在溶液中係呈離子化與非離子化型。然而，通常僅有脂質可溶性或親脂性藥物容易通過細胞膜。已發現，若膜經過滲透加強劑處理時，即使非親脂性藥物亦可穿過該細胞膜。此外，為了協助非親脂性藥物擴散通過細胞膜，滲透加強劑亦可加強親脂性藥物之通透性。
滲透加強劑可分成1至5大類，亦即界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽類、螯合劑、與非螯合性非界面活性劑(參見例如，Malmsten,M.之"Surfactants and polymers in drug delivery",Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人之"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)",1991,p.92)。上述各類滲透加強劑將更詳細說明於下文中。
界面活性劑(或「表面活性劑」)為一種在溶於水溶液中時可以降低溶液之表面張力或水溶液與另一種液體之間之界面張力之化學物質，結果將加強iRNA通過黏膜之吸收性。除了膽汁鹽類與脂肪酸外，此等滲透加強劑包括例如，月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚與聚氧
乙烯-20-鯨蠟基醚(參見例如，Malmsten,M.之"Surfactants and polymers in drug Delivery",Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人之"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1991,p.92)；與全氟化學乳液，如FC-43。Takahashi等人，J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
作為滲透加強劑之各種不同脂肪酸與其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔲酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯(1-單油基-消旋性-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二碳烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(例如，甲基酯、異丙基酯與第三丁基酯)、及其單酸-與二酸甘油酯(亦即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯等等)(參見例如，Touitou,E.等人之"Enhancement in Drug Delivery",CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等人，"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1991,p.92；Muranishi之"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1990,7,1-33；El Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁之生理性角色包括促進脂質與脂溶性維生素分散與吸收(參見例如，Malmsten,M.之"Surfactants and polymers in drug Delivery",Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton述於：Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutic"，第9版，第38章，
Hardman等人編輯，McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。各種不同天然膽汁鹽類與其合成性衍生物均可作為滲透加強劑。因此術語「膽汁鹽類」包括膽汁之任何天然組份及其任何合成性衍生物。合適膽汁鹽包括例如，膽酸(或其醫藥上可接受之鈉鹽、膽酸鈉)、去氫膽酸(去氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸鈉)、葡膽酸(葡膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、去氧甘膽酸(去氧甘膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺去氧膽酸(牛磺去氧膽酸鈉)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉(STDHF)、甘胺二氫褐黴酸鈉與聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(參見例如，Malmsten,M.之"Surfactants and polymers in drug delivery",Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人之"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1991,p.92；Swinyard述於："Remington's Pharmaceutical Sciences"，第18版，第39章，Gennaro編輯，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,p.782-783；Muranishi之"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1990,7,1-33；Yamamoto等人，J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita等人，J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
本發明所使用之螯合劑可定義為可與溶液中金屬離子形成複合物而藉以排除之化合物，結果可以藉此加強iRNA通過黏膜之吸收性。螯合劑在本發明中作為滲透加強劑之相關用法中，其附加價值在於亦可作為
DNase抑制劑，因為大多數已判別特徵之DNA核酸酶均需要二價金屬離子，供進行催化作用，因此可被螯合劑抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。合適螯合劑包括但不限於，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽與高碳香蘭酸鹽)、膠原蛋白之N-醯基衍生物、月桂基醚-9與β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺類)(參見例如，Katdare,A.等人之"Excipient development for pharmaceutical,biotechnology，and drug delivery)",CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等人，"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1991,p.92；Muranishi之"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1990,7,1-33；Buur等人，J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
本文所採用非螯合性非界面活性劑滲透加強化合物可定義為已證實沒有顯著螯合劑或界面活性劑之活性，但仍可加強iRNA通過消化道黏膜吸收之化合物(參見例如，Muranishi之"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1990,7,1-33)。此類滲透加強劑包括例如，不飽和環狀脲類、1-烷基-與1-烯基氮雜環-烷酮類衍生物(Lee等人，"Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems",1991,p.92)；及非類固醇消炎劑，如雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、吲哚美辛(indomethacin)與苯丁吡唑酮(phenylbutazone)(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
亦可添加可在細胞層級上加強吸收iRNA之製劑至本發明醫藥與其他組成物中。亦已知例如，陽離子性脂質，如微脂體(lipofectin)(Junichi等人，美國專利案第5,705,188號)、陽離子性甘油衍生物、與聚陽離子性分子，如：聚離胺酸(Lollo等人，PCT申請案WO 97/30731)可加強細胞吸收dsRNA。可自商品取得之轉染劑實例包括例如，LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、293fectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、CellfectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、DMRIE-CTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、FreeStyleTM MAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM 2000 CD(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、iRNAMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OligofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OptifectTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、X-tremeGENE Q2轉染劑(Roche；Grenzacherstrasse，瑞士)、DOTAP脂質體轉染劑(Grenzacherstrasse，瑞士)、DOSPER脂質體轉染劑(Grenzacherstrasse，瑞士)、或Fugene(Grenzacherstrasse，瑞士)、Transfectam®試劑(Promega；Madison,WI)、TransFastTM轉染劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-20試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-50試劑(Promega；Madison,WI)、DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille，法國)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille，法國)、TransPassa D1轉染劑(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA)、
LyoVecTM/LipoGenTM(Invitrogen；San Diego,CA,USA)、PerFectin轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、NeuroPORTER轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER 2轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、Cytofectin轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、BaculoPORTER轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、TroganPORTERTM轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、RiboFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、PlasFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)、SureFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)，或HiFectTM(B-Bridge International,Mountain View,CA,USA)等等。
其他可用於為所投與核酸加強滲透之製劑包括二醇類如乙二醇與丙二醇、吡咯類如2-吡咯、氮酮類與萜烯類，如檸檬烯與薄荷酮。
v.載劑
某些本發明組成物亦可在調配物中納入載劑化合物。本文所採用「載劑化合物」或「載劑」可指核酸或其類似物，其係惰性(亦即本身沒有生物活性)，但仍可在活體內過程中被辨識為核酸，該過程係藉由例如，降解生物活性核酸或促進其從循環過程中排出，而降低該具有生物
活性之核酸之生體可用率。共同投與核酸與載劑化合物(後者物質通常使用過量)可以大幅降低肝臟、腎臟或其他外循環器官之核酸回收量，可能歸因於載劑化合物與核酸競爭共用受體所致。例如，當與聚肌苷酸、葡聚糖硫酸鹽、聚胞苷酸或4-乙醯胺基-4'異硫氰醯基-芪-2,2'-二磺酸共同投藥時，可減少肝臟組織回收部份硫代磷酸dsRNA(Miyao等人，DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura等人，DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183。
vi.賦形劑
與載劑化合物相反，「醫藥載劑」或「賦形劑」為供傳遞一或多種核酸至動物體之醫藥上可接受之溶劑、懸浮劑或任何其他醫藥惰性媒劑。賦形劑可呈液態或固態，並依計畫之投藥方式選擇，以在與核酸與指定之醫藥組成物中其他組份組合時提供所需之填充體積、堅實度等等。典型醫藥載劑包括但不限於，結合劑(例如，預糊化玉米澱粉、聚乙烯吡啶咯酮或羥基丙基甲基纖維素等等)；填料(例如，乳糖與其他糖類、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、矽石、膠體二氧化矽、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等等)；崩解劑(例如，澱粉、澱粉乙醇酸鈉等等)；與濕化劑(例如，月桂基硫酸鈉等等)。
亦可使用適合非-非經腸式投藥且不會與核
酸有不利反應之醫藥上可接受之有機或無機賦形劑來調配本發明組成物。合適之醫藥上可接受之載劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮等等。
供局部表面投與核酸之調配物可包括無菌與非無菌水溶液、於常用溶劑(如醇類)中之非水性溶液、或含核酸之液態或固態油基質溶液。溶液中亦可包含緩衝劑、稀釋劑與其他合適添加劑。可使用適合非-非經腸式投藥且不會與核酸有不利反應之醫藥上可接受之有機或無機賦形劑。
合適之醫藥上可接受之賦形劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮等等。
vii.其他組份
本發明組成物可再包含醫藥組成物中常用且相關技藝上已建立用量之其他輔助組份。因此例如，組成物可再包含其他可相容之醫藥活性材料，如例如，止癢劑、收斂劑、局部麻醉藥或消炎劑，或可包含其他適用於物理性調配本發明組成物各種不同劑型之材料，如染劑、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、不透明劑、增稠劑與安定劑。然而，當添加此等材料時，不應不當干擾本發明組成物中組份之
生物活性。調配物可經過殺菌，且若需要時，可與不會與調配物之核酸(群)出現不良交互作用之輔劑混合，例如，潤滑劑、防腐劑、安定劑、濕化劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、調味劑與/或芳香物質等等。
水性懸浮液可包含提高懸浮液黏度之物質，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇與/或葡聚糖。該懸浮液亦可包含安定劑。
有些具體實施例中，如本發明所說明特徵之醫藥組成物包括(a)一或多種iRNA化合物與(b)一或多種其功能為非iRNA機轉且適用於治療溶血病症之製劑。此等製劑實例包括但不限於，消炎劑、抗脂肪變性劑、抗病毒劑、與/或抗纖維變性劑。
此外，常用於保護肝臟之物質，如水飛薊素(silymarin)亦可與本文說明之iRNA併用。其他適用於治療肝病之製劑包括喜必福(telbivudine)、恩替卡韋(entecavir)、與蛋白酶抑制劑，如特拉匹韋(telaprevir)與其他揭示於例如Tung等人之美國申請案公開案號2005/0148548、2004/0167116、與2003/0144217；及Hale等人之美國申請案公開案號2004/0127488中者。
此等化合物之毒性與醫療效力可採用標準醫藥製程，於細胞培養中或實驗動物中測定，例如，測定LD50(造成50%族群死亡時之劑量)與ED50(有效醫療50%族群時之劑量)。毒性與醫療效應之間之劑量比值即為醫療指數，以LD50/ED50比值表示。以醫療指數高之化合物較
佳。
可採用由細胞培養分析法與動物研究得到之數據來調配用於人類之劑量範圍。如本發明所說明特徵之組成物之劑量通常落在包括極低或無毒性之ED50之循環濃度範圍內。劑量可依所採用劑型及所利用之投藥途徑，在此範圍內變化。用於如本發明所說明特徵之方法所使用之任何化合物之醫療有效劑量可先從細胞培養分析法估測。可在動物模式中調配劑量，以使該化合物或若適當時使標靶序列之多肽產物之循環血漿濃度範圍達到(例如，降低多肽濃度達到)包括細胞培養物所決定IC50(亦即試驗化合物使症狀達到一半最大抑制性時之濃度)在內之範圍。此等資訊可用於更精確決定適用於人類之劑量。可藉由例如，高效液相層析法測定血漿中濃度。
除了如上述投藥法外，如本發明所說明特徵之iRNA可與其他已知可有效治療受PNPLA3表現介導之病理過程之製劑組合投藥。任何情況下，投藥之醫師均可依據採用相關技藝上已知或本文所說明標準效力測定法所觀察到之結果來調整iRNA之投藥量與投藥時間。
VII.抑制PNPLA3表現之方法
本發明亦提供一種抑制細胞中PNPLA3基因表現之方法。該方法包括由細胞與抑制細胞中PNPLA3表現有效量之RNAi劑(例如，雙股RNAi劑)接觸，藉以抑制細胞中PNPLA3表現。
細胞與RNAi劑(例如，雙股RNAi劑)接觸之方式可於活體內或活體外進行。細胞於活體內與RNAi劑之接觸法包括由個體(例如，人類個體)內之細胞或細胞群與RNAi劑接觸。亦可能組合活體外與活體內之細胞接觸法。細胞接觸法可為如上述之直接或間接法。此外，細胞接觸法可藉由靶向配體來完成，包括本文說明或相關技藝上已知之任何配體。較佳具體實施例中，靶向配體為碳水化合物部份體，例如，GalNAc3配體，或可主導RNAi劑至所需位點之任何其他配體。
一項具體實施例中，細胞與iRNA之接觸法包括藉由促進或促使細胞攝入或吸收而「引進」或「遞送」iRNA至細胞內。iRNA可透過無助力之擴散或主動細胞過程，或利用輔劑或裝置進行攝入或吸收。可於活體外與/或活體內引進iRNA至細胞內。例如，於活體內引進時，可注射iRNA至組織位點或經全身投藥。於活體外引進至細胞包括相關技藝上已知之方法，如電穿孔法與脂染法。其他方法說明於下文中及/或係相關技藝上已知者。
本文所採用術語「抑制」可與「降低」、「靜默」、「下調」、「壓制」及其他類似術語交換使用，且包括任何程度之抑制作用。
片語「抑制PNPLA3表現」係指抑制任何PNPLA3基因(如例如，小鼠PNPLA3基因、大鼠PNPLA3基因、猴PNPLA3基因、或人類PNPLA3基因)及PNPLA3基因之變異體或突變體之表現。因此，PNPLA3基因可為
野生型PNPLA3基因、突變PNPLA3基因(如造成類澱粉蛋白沉積之突變PNPLA3基因)、或在遺傳操作細胞、細胞群或生物體中之轉殖基因PNPLA3基因。
「抑制PNPLA3基因表現」包括對PNPLA3基因之任何抑制程度，例如，至少部份壓制PNPLA3基因表現。PNPLA3基因之表現可依據與PNPLA3基因表現相關之任何變數之程度、或程度之變化來分析，例如，PNPLA3mRNA含量、PNPLA3蛋白質含量、或類澱粉蛋白之數量或程度。此程度可於個別細胞中或細胞群中分析，包括例如，來自個體之檢體。
可由與PNPLA3表現相關之一或多種變數與對照組比較其絕對或相對下降程度，來分析抑制性。對照組含量可能為相關技藝上採用之任何型態之對照含量，例如，投藥前之基線值或由未處理或接受對照物(如例如，僅使用緩衝劑之對照物或含無活性劑之對照物)處理之類似個體、細胞或檢體所測得之含量。
本發明方法之有些具體實施例中，PNPLA3基因表現受到抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
對PNPLA3基因表現之抑制性可由其中PNPLA3基因已轉錄且已接受處理(例如，由細胞或細胞群與本發明RNAi劑接觸，或對含有該細胞或細胞群之個體投與本發明RNAi劑)之第一細胞或細胞群(此等細胞可能存在於例如，源自個體之檢體)之mRNA表現量之下降程度來表示，因此當與實質上與該第一細胞或細胞群相同，但未曾接受處理之第二細胞或細胞群(對照組細胞(群))比較時，PNPLA3基因表現已受到抑制。較佳具體實施例中，採用下列公式，由處理組細胞中之mRNA表現量相對於對照組細胞中mRNA量之百分比來分析抑制性。
或者，對PNPLA3基因表現之抑制性可藉由在功能上與PNPLA3基因表現相關之參數之下降程度來分析，例如，PNPLA3蛋白質表現或刺猬(Hedgehog)途徑蛋白質活性。可於任何經過組成性表現或經過基因組工程處理而表現PNPLA3之細胞中，採用相關技藝上已知分析法測定PNPLA3基因靜默。
對PNPLA3蛋白質表現之抑制性可由細胞或細胞群之PNPLA3蛋白質表現之下降程度來分析(例如，源自個體之檢體中之蛋白質表現量)。如上文中mRNA抑制性分析法之說明，處理組細胞或細胞群之蛋白質表現量之
抑制性同樣可由相對於對照組細胞或細胞群之蛋白質含量之百分比表示。可用於分析PNPLA3基因表現之抑制性之對照組細胞或細胞群包括未曾與本發明RNAi劑接觸之細胞或細胞群。例如，對照組細胞或細胞群可能源於接受RNAi劑治療前之個體(例如，人類或動物個體)。
細胞或細胞群之PNPLA3 mRNA表現量或循環中之PNPLA3 mRNA含量可採用相關技藝上已知用於分析mRNA表現之任何方法測定。一項具體實施例中，測定檢體中PNPLA3表現量時，係檢測轉錄之聚核苷酸或其一部份，例如，PNPLA3基因之mRNA。可能採用RNA萃取技術，包括例如，使用酸苯酚/胍異硫氰酸酯萃取法(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasy RNA製備套組(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix，瑞士)，從細胞中萃取RNA。利用核糖核酸雜交法之典型分析法包括核連綴分析法(nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNase保護分析法(Melton等人，Nuc.Acids Res.12：7035)、北方墨點法、原位雜交法、與微陣列分析法。循環中之PNPLA3 mRNA可採用PCT/US2012/043584說明之方法檢測，其完整內容已以引用之方式併入本文中。
一項具體實施例中，使用核酸探針測定PNPLA3表現量。本文所採用術語「探針」係指可以選擇性結合專一性PNPLA3之任何分子。探針可由熟悉此相關技術者合成，或衍生自適當之生物製劑。探針可能特別設計帶有標記物。可用為探針之分子實例包括但不限於，
RNA、DNA、蛋白質、抗體與有機分子。
單離之mRNA可用於雜交或擴增分析法，其包括但不限於，南方或北方分析法、聚合酶鏈反應(PCR)分析法與探針陣列法。其中一種測定mRNA含量之方法涉及由單離之mRNA與可與PNPLA3 mRNA雜交之核酸分子(探針)接觸。一項具體實施例中，mRNA係固定在固態表面上，並與探針接觸，例如，讓單離之mRNA流經瓊脂凝膠，讓mRNA從凝膠轉移至膜(如硝基纖維素)上。另一項具體實施例中，由探針(群)固定在固態表面上，讓mRNA與探針(群)接觸，例如，使用Affymetrix基因晶片陣列。熟悉此相關技術者很容易擷用已知之mRNA檢測法來測定PNPLA3 mRNA含量。
另一種測定檢體中PNPLA3表現量之方法涉及例如，檢體中mRNA之核酸擴增與/或逆轉錄酶過程(製備cDNA)，例如，RT-PCR(述於Mullis之1987年美國專利案第4,683,202號之實驗實施例)、連接酶鏈反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自主序列複製(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(Lizardi等人，美國專利案第5,854,033號)或任何其他核酸擴增方法，然後採用熟悉此相關技術者習知之技術檢測擴增之分子。若核酸分子含量極低時，此等檢測程序特別適用於檢測此等
核酸分子。本發明特別態樣中，由定量性產螢光式RT-PCR(亦即TaqManTM系統)測定PNPLA3表現量。
可使用膜墨點(如用於雜交分析之如北方、南方、斑點等等分析法)，或顯微分析孔、樣本試管、凝膠、珠粒或纖維(或任何包含已結合核酸之固態擔體)追蹤PNPLA3 RNA之表現量。參見美國專利案第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號與第5,445,934號，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。亦包括於溶液中使用核酸探針測定PNPLA3表現量。
較佳具體實施例中，採用分支DNA(bDNA)分析法或實時PCR(qPCR)分析mRNA表現量。此等方法之用法舉例說明於本文所出示之實例中。
可採用相關技藝上已知用於測定蛋白質含量之任何方法測定PNPLA3蛋白質表現量。此等方法包括例如，電泳法、毛細管電泳法、高效液相層析法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、高擴散性層析法、液相或凝膠沉澱反應、吸光光譜分析計、比色分析法、光譜光度分析法、流式細胞計、免疫擴散法(單相或雙向)、免疫電泳、西方墨點、放射免疫分析法(RIA)、酵素-聯結免疫吸附分析法(ELISA)、免疫螢光分析法、電化學發光分析法等等。
有些具體實施例中，可檢測或追蹤PNPLA3疾病症狀之減少程度來追蹤本發明方法之效力，如減輕四肢、臉部、喉頭、上呼吸道、腹部、軀體、與生殖器之水腫程度、前驅症狀；喉頭腫大；非癢性皮疹；反胃；嘔吐；
或腹痛。此等症狀可於活體外或活體內採用相關技藝上已知方法分析。
有些本發明方法之具體實施例中，對該個體投與RNAi劑，使RNAi劑傳遞至該個體內之特定部位。可在衍生自該個體特定部位之流體或組織之檢體中測定PNPLA3 mRNA或PNPLA3蛋白質含量或含量變化，來分析對PNPLA3表現之抑制性。較佳具體實施例中，該部位係選自下列各者所組成之群組中：肝臟、脈絡叢、視網膜、與胰臟。該部位亦可為上述任何一個部位之細胞之小部份或子群。該部位可能亦包括表現特定受體型態之細胞。
VIII.治療或預防PNPLA3-相關疾病之方法
本發明提供一種治療及預防方法，其包括對患有PNPLA3-相關疾病、病變、與/或病症，或容易發展出PNPLA3-相關疾病、病變、與/或病症之個體投與包含iRNA劑之組成物、或包含iRNA劑之醫藥組成物、或包含本發明iRNA之載體。PNPLA3-相關疾病之無限制實例包括例如，脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化、肝脂肪累積、肝發炎、肝細胞壞死、肝纖維變性、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。一項具體實施例中，PNPLA3-相關疾病為NAFLD。另一項具體實施例中，PNPLA3-相關疾病為NASH。另一項具體實施例中，PNPLA3-相關疾病為脂肪肝(脂肪變性)。另一項具體實施例中，PNPLA3-相關疾病為胰島素抗性。另一項具體實施例中，
PNPLA3-相關疾病不為胰島素抗性。
本發明方法適用用於治療患有PNPLA3-相關疾病之個體，例如，可因降低PNPLA3基因表現與/或PNPLA3蛋白質生產而受益之個體。一項態樣中，本發明提供一種為患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)之個體降低含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)基因表現量之方法。另一項態樣中，本發明提供為患有NAFLD之個體降低PNPLA3蛋白質含量之方法。本發明亦提供一種為患有NAFLD之個體降低刺猬途徑活性程度之方法。
另一項態樣中，本發明提供一種治療患有NAFLD之個體之方法。一項態樣中，本發明提供一種治療患有PNPLA3-相關疾病，例如，脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化、肝脂肪累積、肝發炎、肝細胞壞死、肝纖維變性、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)之個體之方法。本發明治療方法(與用法)包括對該個體(例如，人類)投與醫療有效量之靶向PNPLA3基因之本發明iRNA劑或包含靶向PNPLA3基因之本發明iRNA劑之醫藥組成物、或包含靶向PNPLA3基因之iRNA劑之本發明載體。
一項態樣中，本發明提供一種為患有NAFLD之個體預防至少一種症狀之方法，例如，出現刺猬訊號傳導途徑升高、疲勞、虛弱、體重下降、食慾下降、反胃、腹痛、蜘蛛狀血管、皮膚與眼睛發黃(黃疸)、發癢、腿部積水與腫大(水腫)、腹部腫大(腹水)、與精神錯亂。該
等方法包括對該個體投與醫療有效量之本發明iRNA劑(例如，dsRNA)、醫藥組成物、或載體，藉以為罹患可能因降低PNPLA3基因表現而受益之病變之個體預防至少一種症狀。
另一項態樣中，本發明提供一種以醫療有效量之本發明iRNA劑於治療個體，例如，可能因降低及/或抑制PNPLA3基因表現而受益之個體上之用途。
另一態樣中，本發明提供一種以靶向PNPLA3基因之本發明iRNA劑(例如，dsRNA)或包含靶向PNPLA3基因之iRNA劑之醫藥組成物於製造醫藥上之用途，供治療個體，例如，可能因降低及/或抑制PNPLA3基因表現及/或PNPLA3蛋白質生產而受益之個體，如：罹患可能因降低PNPLA3基因表現而受益之病變(例如，PNPLA3-相關疾病)之個體。
另一項態樣中，本發明提供一種以本發明iRNA(例如，dsRNA)為罹患可能因降低及/或抑制PNPLA3基因表現及/或PNPLA3蛋白質生產而受益之病變之個體預防至少一種症狀之方法。
另一態樣中，本發明提供一種以本發明iRNA劑於製造醫藥上之用途，供為罹患可能因降低及/或抑制PNPLA3基因表現及/或SCAP蛋白質生產而受益之變病(如：PNPLA3-相關疾病)之個體預防至少一種症狀。
一項具體實施例中，對患有PNPLA3-相關疾病(例如，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD))之個體投與靶向
PNPLA3之iRNA劑，使得當對個體投與dsRNA劑時，例如，個體之細胞、組織、血液、或其他組織或流體中之PNPLA3基因表現降低至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、62%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或以上。
本發明之方法與用途包括投與本文說明之組成物，以使標靶PNPLA3基因之表現降低，如：持續約1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、或約80小時。一項具體實施例中，可使標靶PNPLA3基因之表現長期降低，例如，至少約2、3、4、5、6、7天或更久，例如，約1週、2週、3週、或約4週、或更久。
根據本發明之方法與用途投與dsRNA可以使罹患PNPLA3-相關疾病(例如，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD))之患者降低此等疾病或病變之嚴重性、癥狀、症狀、與/或標記物。本文中「降低」意指使此等程度出現統計上顯著降低。其可降低例如，至少約5%、10%、15%、
20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或約100%。
治療或預防疾病之效力之評估法可為例如，測定疾病進展、疾病消退、症狀嚴重性、疼痛減輕、生活品質、需要維持治療效果時之醫藥劑量、適合該所治療疾病或預防目標之疾病標記物含量或任何其他可測量之參數。熟悉此相關技術者均有能力藉由測定其中任一種參數或任何參數組合，來追蹤治療或預防之效力。例如，可能藉由例如，定期追蹤NAFLD症狀、肝脂肪含量、或下游基因表現來評估NAFLD之治療效力。由後來之讀數與原始之讀數比較，即可指示醫師該治療是否有效。熟悉此相關技術者均有能力藉由測定其中任一種參數或任何參數組合，來追蹤治療或預防之效力。在投與靶向PNPLA3之iRNA或其醫藥組成物之相關內容中，「有效對抗」PNPLA3相關疾病係指依臨床上適當方式投藥時，可以讓至少統計上顯著比例之患者得到有利效應，如改善症狀、治癒、減輕疾病、延長壽命、改善生活品質或熟悉治療NAFLD與/或PNPLA3-相關疾病及相關病因之醫師通常認定為正向之其他效應。
當一或多種疾病狀態之參數出現統計上顯著改善時，或不會再惡化或發展出原本預期之症狀時，即證實該治療或預防效果。例如，疾病之可測定參數之有利變化為至少10%，較佳為至少20%、30%、40%、50%或更高，表示為有效之治療。針對特定iRNA藥物或該藥物之
調配物之效力亦可採用相關技藝上已知針對該疾病之實驗動物模式來判斷。當採用實驗動物模式時，當觀察到標記物或症狀在統計學上顯著下降時，即證實有治療效力。
個體可接受投與醫療量之iRNA，如約0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg dsRNA、2.6mg/kg dsRNA、2.7mg/kg dsRNA、2.8mg/kg dsRNA、2.9mg/kg dsRNA、3.0mg/kg dsRNA、3.1mg/kg dsRNA、3.2mg/kg dsRNA、3.3mg/kg dsRNA、3.4mg/kg dsRNA、3.5mg/kg dsRNA、3.6mg/kg dsRNA、3.7mg/kg dsRNA、3.8mg/kg dsRNA、3.9mg/kg dsRNA、4.0mg/kg dsRNA、4.1mg/kg dsRNA、4.2mg/kg dsRNA、4.3mg/kg dsRNA、4.4mg/kg dsRNA、4.5mg/kg dsRNA、4.6mg/kg dsRNA、4.7mg/kg dsRNA、4.8mg/kg dsRNA、4.9mg/kg dsRNA、5.0mg/kg dsRNA、5.1mg/kg dsRNA、5.2mg/kg dsRNA、5.3mg/kg dsRNA、5.4mg/kg dsRNA、5.5mg/kg dsRNA、5.6mg/kg dsRNA、5.7mg/kg dsRNA、5.8mg/kg dsRNA、5.9mg/kg dsRNA、6.0mg/kg dsRNA、6.1mg/kg dsRNA、6.2mg/kg
dsRNA、6.3mg/kg dsRNA、6.4mg/kg dsRNA、6.5mg/kg dsRNA、6.6mg/kg dsRNA、6.7mg/kg dsRNA、6.8mg/kg dsRNA、6.9mg/kg dsRNA、7.0mg/kg dsRNA、7.1mg/kg dsRNA、7.2mg/kg dsRNA、7.3mg/kg dsRNA、7.4mg/kg dsRNA、7.5mg/kg dsRNA、7.6mg/kg dsRNA、7.7mg/kg dsRNA、7.8mg/kg dsRNA、7.9mg/kg dsRNA、8.0mg/kg dsRNA、8.1mg/kg dsRNA、8.2mg/kg dsRNA、8.3mg/kg dsRNA、8.4mg/kg dsRNA、8.5mg/kg dsRNA、8.6mg/kg dsRNA、8.7mg/kg dsRNA、8.8mg/kg dsRNA、8.9mg/kg dsRNA、9.0mg/kg dsRNA、9.1mg/kg dsRNA、9.2mg/kg dsRNA、9.3mg/kg dsRNA、9.4mg/kg dsRNA、9.5mg/kg dsRNA、9.6mg/kg dsRNA、9.7mg/kg dsRNA、9.8mg/kg dsRNA、9.9mg/kg dsRNA、9.0mg/kg dsRNA、10mg/kg dsRNA、15mg/kg dsRNA、20mg/kg dsRNA、25mg/kg dsRNA、30mg/kg dsRNA、35mg/kg dsRNA、40mg/kg dsRNA、45mg/kg dsRNA、或約50mg/kg dsRNA。一項具體實施例中，個體可接受投與0.5mg/kg之dsRNA。該所引用數值之間之數值與範圍亦計畫成為本發明之一部份。
投與iRNA可使例如，患者之細胞、組織、血液、尿液或其他部份中之PNPLA3蛋白質含量降低至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、
45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或以上。
投與全劑量iRNA之前，患者先接受投與較小劑量，如5%輸液，並追蹤不良效應，如過敏反應。另一項實例中，可以追蹤患者不期望之免疫刺激效應，如細胞激素(例如，TNF-α或INF-α)含量升高。
由於根據本發明組成物或由其製成之醫藥組成物對PNPLA3表現具有抑制效力，因此可以加強生活品質。
本發明iRNA可呈「裸」型投藥，其中係由經修飾或未修飾之iRNA劑直接懸浮於水性或合適緩衝溶劑中，呈「游離iRNA」。游離iRNA係在沒有醫藥組成物之存在下投藥。游離iRNA可含於合適緩衝溶液中。緩衝溶液可能包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任何組合。一項具體實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。可以調整包含iRNA之緩衝溶液之pH與滲透壓以便適合投與個體。
或者，本發明iRNA可呈醫藥組成物投藥，如：dsRNA脂質體調配物。
可能因降低與/或抑制PNPLA3基因表現而
受益之個體為彼等罹患非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)與/或本文所說明PNPLA3-相關疾病或病變之個體。
可能因降低及/或抑制PNPLA3基因表現而受益之個體之治療法包括醫療性與預防性治療法。
本發明進一步提供一種以iRNA劑或其醫藥組成物，與其他醫藥與/或其他療法(例如，已知醫藥及/或已知療法，如，例如，彼等目前用於治療此等病變者)組合，於治療可能因降低與/或抑制PNPLA3基因表現而受益之個體(例如，罹患PNPLA3相關疾病之個體)之方法與用途。
例如，某些具體實施例中，靶向PNPLA3基因之iRNA係與例如，適用於治療本文所說明PNPLA3相關疾病之製劑組合。例如，適用於治療可能因降低PNPLA3表現而受益之個體(例如，罹患PNPLA3相關疾病之個體)之其他療法及醫療方法，包括靶向不同之PNPLA3基因部份之iRNA劑、用於治療PNPLA3-相關疾病之醫療劑及/或程序，或上述之任何組合。
某些具體實施例中，靶向PNPLA3基因之第一iRNA劑係與靶向不同PNPLA3基因部份之第二iRNA劑組合投藥。例如，第一RNAi劑包含形成雙股區之第一正義股及第一反義股，其中該第一正義股之實質上所有核苷酸及該第一反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，其中該第一正義股係接合附接在3’-端之配體，且其中該配體為利用二價或三價分支之鏈結體附接之一或多種
GalNAc衍生物；及該第二RNAi劑包含形成雙股區之第二正義股及第二反義股，其中第二正義股之實質上所有核苷酸及第二反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，其中第二正義股係接合附接在3’-端之配體，且其中該配體為利用二價或三價分支之鏈結體附接之一或多種GalNAc衍生物。
一項具體實施例，第一與第二正義股之所有核苷酸及/或第一與第二反義股之所有核苷酸均包含一種修飾。
一項具體實施例中，至少一個經修飾之核苷酸係選自下列各者所組成之群組中：3’-端去氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構形受限之核苷酸、乙基受約束核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基-修飾之核苷酸、2’-C-烷基-修飾之核苷酸、2’-羥基-修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基-修飾之核苷酸、嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫哌喃修飾之核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基之核苷酸、包含甲基膦酸酯基之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、及包含5’、磷酸酯擬似物之核苷酸。
某些具體實施例中，靶向PNPLA3基因之第一iRNA劑係與靶向不同於該PNPLA3基因之基因之第二
iRNA劑組合投藥。例如，該靶向PNPLA3基因之iRNA劑可與靶向SCAP基因之iRNA劑組合投藥。靶向PNPLA3基因之第一iRNA劑及靶向不同於該PNPLA3基因之基因(例如，SCAP基因)之第二iRNA劑可作為同一種醫藥組成物之一部份投藥。或者，靶向PNPLA3基因之第一iRNA劑及靶向不同於該PNPLA3基因之基因(例如，SCAP基因)之第二iRNA劑可作為不同醫藥組成物之一部份投藥。
iRNA劑與另一種醫療劑與/或治療法可能在相同時間及/或相同組合中投藥，例如，非經腸式，或該另一種醫療劑成為分開組成物之一部份或在分開時間點與/或採用相關技藝上已知或本文說明之另一種方法投藥。
本發明亦提供一種使用本發明iRNA劑與/或包含本發明iRNA劑之組成物於降低與/或抑制細胞中PNPLA3表現之方法。其他態樣中，本發明提供一種本發明iRNA與/或包含本發明iRNA之組成物，用於降低與/或抑制細胞中PNPLA3基因表現。再一項態樣中，提供一種以本發明iRNA與/或包含本發明iRNA之組成物於製造供降低與/或抑制細胞中PNPLA3基因表現之醫藥上之方法。再另一項態樣中，本發明提供一種本發明iRNA及/或包含本發明iRNA之組成物，用於降低及/或抑制細胞中之PNPLA3蛋白質生產。再另一項態樣中，提供一種以本發明iRNA及/或包含本發明iRNA之組成物於製造用於降低及/或抑制細胞中PNPLA3蛋白質生產之醫藥上之用途。該等方法及用途包括由細胞與本發明iRNA(例如，dsRNA)接
觸並維持細胞一段足以達到PNPLA3基因之mRNA轉錄本降解之時間，藉以抑制細胞中PNPLA3基因表現或抑制細胞中之PNPLA3蛋白質生產。
可採用相關技藝上已知之任何方法分析基因表現之降低。例如，測定PNPLA3表現之降低之方法可能為採用熟悉此相關技術者習知之方法測定PNPLA3之mRNA表現量(例如，北方墨點法、qRT-PCR)，採用熟悉此相關技術者習知之方法測定PNPLA3之蛋白質含量(如西方墨點法、免疫技術，流式細胞計方法、ELISA)，及/或測定PNPLA3之生物活性。
本發明方法與用途中，細胞可能於活體外或活體內(亦即細胞可能在個體內)接觸。
適合使用本發明方法處理之細胞可為任何表現PNPLA3基因之細胞。例如，來自患有NAFLD之個體之細胞或或包含含有PNPLA3基因或PNPLA3基因之一部份之表現載體之細胞。適合用於本發明方法與用途之細胞可為哺乳動物細胞，例如，靈長類細胞(如人類細胞或非人類靈長類細胞，例如，猴細胞或黑猩猩細胞)、非靈長類細胞(如牛細胞、豬細胞、駱駝細胞、駱馬細胞、馬細胞、山羊細胞、兔子細胞、綿羊細胞、倉鼠細胞、天竺鼠細胞、貓細胞、狗細胞、大鼠細胞、小鼠細胞、獅子細胞、老虎細胞、熊細胞或水牛細胞)、鳥細胞(例如，鴨細胞或鵝細胞)、或鯨魚細胞。一項具體實施例中，細胞為人類細胞。
可使細胞中PNPLA3基因表現受抑制至少
約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
可使細胞中之PNPLA3蛋白質生產受抑制至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
本發明之活體內方法與用途可包括對該個體投與包含iRNA之組成物，其中該iRNA所包括之核苷酸序列可與所治療哺乳動物之PNPLA3基因之RNA轉錄本之
至少一部份互補。當所治療之生物體為人類時，該組成物可採用相關技藝上已知之任何方式投藥，包括但不限於，經皮下、經靜脈內、經口、經腹膜內、或非經腸式途徑，包括經顱內(例如，腦室內、實質內與鞘內)、經肌內、穿皮式、呼吸道(氣霧劑)、經鼻、直腸與局部(包括頰與舌下)投藥。某些具體實施例中，該組成物係經皮下或經靜脈內輸注或注射投藥。一項具體實施例中，該組成物係經皮下注射投藥。
有些具體實施例中，係經由儲積式注射法投藥。儲積式注射可依持續方式長期釋放iRNA。因此儲積式注射法可減少為了達到所需效果(例如，需要抑制PNPLA3，或醫療或預防效應)時之投藥頻率。儲積式注射法亦可提供更穩定之血清濃度。儲積式注射法可包括經皮下注射或經肌內注射。較佳具體實施例中，儲積式注射法為皮下注射法。
有些具體實施例中，係利用幫浦投藥。該幫浦可能為體外幫浦或手術植入之幫浦。某些具體實施例中，該幫浦為經皮下植入之滲透壓幫浦。其他具體實施例中，該幫浦為輸注幫浦。該輸注幫浦可能用於經靜脈內、經皮下、動脈或硬膜外輸注。較佳具體實施例中，該輸注幫浦為皮下輸注幫浦。其他具體實施例中，該幫浦為手術植入之幫浦，其可傳遞iRNA至個體。
投藥模式可依據是否需要局部或全身性治療，且依據所治療之區域來選擇。可選擇投藥途徑與部位
來加強靶向性。
一項態樣中，本發明亦提供一種抑制哺乳動物(例如，人類)之PNPLA3基因表現之方法。本發明亦提供一種包含靶向哺乳動物細胞中PNPLA3基因之iRNA(例如，dsRNA)之組成物，用於抑制哺乳動物之PNPLA3基因表現。另一項態樣中，本發明提供一種靶向哺乳動物細胞之PNPLA3基因之iRNA(例如，dsRNA)之用途，供製造抑制哺乳動物之PNPLA3基因表現之醫藥。
該等方法與用途包括對哺乳動物(例如，人類)投與包含靶向哺乳動物細胞之PNPLA3基因之iRNA(例如，dsRNA)之組成物，並維持該哺乳動物一段足以達到PNPLA3基因之mRNA轉錄本降解之時間，藉以抑制哺乳動物之PNPLA3基因表現。
可採用相關技藝上已知之任何方法，例如，本文說明之qRT-PCR，來分析該接受iRNA投藥之個體之周邊血液檢體之基因表現之降低。可採用相關技藝上已知之任何方法及採用本文說明之方法，例如，ELISA或西方墨點法，分析蛋白質產物之降低。一項具體實施例中，可採用組織檢體作為組織材料，來追蹤PNPLA3基因與/或蛋白質表現之降低。另一項具體實施例中，以血液檢體作為組織材料，來追蹤PNPLA3基因與/或蛋白質表現之降低。
一項具體實施例中，採用相關技藝上已知5’-RACE或其修改程序來證實投與iRNA劑後，RISC於活
體內介導裂解標靶(Lasham A等人(2010)Nucleic Acid Res.,38(3)p-e19)(Zimmermann等人(2006)Nature 441：111-4)。
本發明利用下列實例進一步說明，此等實例不應構成限制性實例。本文所摘錄所有參考文獻、專利案與公開之專利申請案，及序列表之揭示內容均已以引用之方式併入本文中。
[實例]
實例1. iRNA合成法
試劑來源
若本文中未明確說明試劑來源時，則此等試劑可得自任何分子生物學試劑供應商，依分子生物學應用之品質/純度標準。
轉錄本
siRNA設計
採用訂製之R and Python指令稿設計一組靶向人類PNPLA3「含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3」(RefSeq登錄號NM_025225,GI：17196625；SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2)與來自毒物學物種之PNPLA3直系同源物(例如，GenBank登錄號GI：544461323(REFSEQ登錄號XM_005567051.1，馬來猴；SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8)；GI：544461325(RefSeq登錄號XM_005567052.1，馬來猴；SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12)；GI：297261270(RefSeq登錄號XM_001109144.2，普
通獼猴，SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10)；GI：144226244(RefSeq登錄號NM_054088.3，小鼠；SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4)；GI：537361027(RefSeq登錄號NM_001282324.1，大鼠；SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6))之iRNA。
人類PNPLA3 RefSeq mRNA之長度為2805個鹼基。iRNA組設計之基本原理與方法如下：採用依據靶向大量脊椎動物基因之超過20,000種獨特iRNA設計之資料預測mRNA擊弱之直接測定值之線性模式來決定來自人類PNPLA3 mRNA之位置1至位置2805(包含編碼區)之每一個可能之19聚體iRNA之預期效力。設計一小組PNPLA3 iRNA，在人類與馬來猴之間有完美或幾近完美匹配。設計另一小組則與小鼠及大鼠PNPLA3直系同源物有完美或幾近完美匹配。iRNA之每一股則採用訂製之Python指令稿，在強力搜索下測定iRNA與標靶物種轉錄組中所有可能比對物之間之錯配數量與位置。在種子區(此時界定在反義寡核苷酸之位置2至9)及iRNA之裂解位點(此時界定在反義寡核苷酸之位置10至11)中指定錯配之額外加權。錯配之相對加權中，種子錯配為2.8，裂解位點錯配為1.2，及從其他位置至反義位置19之錯配則為1。第一個位置之錯配可忽略。由各加權錯配數值總和來計算各股之特異性指數。較佳iRNA係在人類與馬來猴中之反義指數大於或等於3.0者，且預期效力大於或等於70%擊弱PNPLA3轉錄本。亦設計、合成及篩選一組包含結構-活性修飾之iRNA，其包括各種不同2’-O-甲基與2’-氟取代型態。
未修飾之PNPLA3正義與反義股序列之詳細列表示於表3。
siRNA合成法
PNPLA3 iRNA序列係依1μmol規模，於Mermade 192合成儀(BioAutomation)上，使用固態擔體媒介之亞胺基磷酸酯化學所合成。該固態擔體為加載訂製之GalNAc配體之控制孔徑之玻璃(500A)或通用之固態擔體(AM biochemical)。Ancillary合成試劑、2’-F與2’-O-甲基RNA及去氧亞胺基磷酸酯得自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)及Hongene(China)。利用對應之亞胺基磷酸酯引進2’F 2’-O-甲基、GNA(二醇核酸)、5’磷酸酯及其他修飾。與3’GalNAc接合之單股之合成法係於經GalNAc修飾之CPG擔體上進行。採用訂製之CPG通用固態擔體來合成反義單股。所有亞胺基磷酸酯(100mM乙腈溶液)使用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑(0.6M乙腈溶液)之偶合時間為5分鐘。使用50mM 3-((二甲基胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，得自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))於無水乙腈/吡啶(1：1 v/v)中之溶液產生硫代磷酸酯鏈結基。氧化時間為3分鐘。所有序列在最後脫除DMT基團(「去除DMT」)後即合成。
當完成固相合成法時，從固態擔體上裂解寡核糖核苷酸，並於密封之96-深孔盤中，於60℃使用200μL甲基胺水溶液試劑20分鐘，以脫除保護基。針對使用
第三丁基二甲基矽基(TBDMS)保護之含2’核糖殘基(2’-OH)之序列，係使用TEA.3HF(三乙基胺-三氫氟酸鹽)試劑進行第二個脫除保護基步驟。在脫除保護基之甲基胺溶液中添加200μL二甲亞碸(DMSO)與300μL TEA.3HF試劑，該溶液再於60℃培養20分鐘。裂解步驟及脫除保護基步驟結束後，讓合成盤回升室溫，添加1mL乙腈：乙醇混合物(9：1)讓沉澱析出。分析盤於-80℃冷卻2小時，藉助多注吸管小心傾析上清液。寡核苷酸集結塊再懸浮於20mM NaOAc緩衝液中，使用5mL HiTrap分子篩析管柱(GE Healthcare)，於加裝A905自動取樣器與Frac 950溶出液收集器之AKTA純化系統上脫鹽。於96-孔盤中收集脫鹽之樣本。採用LC-MS分析來自各序列之樣本，判別同一性，以UV(260nm)定量，及採用IEX層析法測定所選擇一組樣本之純度。
於Tecan液體自動操作器上黏合PNPLA3單股。於96孔盤中組合正義與反義單股之等莫耳混合物並黏合。互補之單股組合後，密封96-孔盤，於100℃烘箱中加熱10分鐘，並經過2-3小時慢慢回至室溫。於1X PBS中校正各雙螺旋濃度至10μM。
表2. 所出示核酸序列中所採用之核苷酸單體縮寫。咸了解，此等單體當存在於寡核苷酸中時，係利用5'-3'-磷酸二酯鍵彼此互相鏈結。
表3. PNPLA3 RNAi劑之未修飾之正義與反義股序列
實例2. iRNA合成法
試劑來源
若本文中未明確說明試劑來源時，則此等試劑可得自任何分子生物學試劑供應商，依分子生物學應用之品質/純度標準。
轉錄本
siRNA設計
採用訂製之R and Python指令稿設計一組靶向人類PNPLA3(人類：NCBI refseqID NM_025225；NCBI GeneID：80339)及毒物學物種PNPLA3直系同源物(馬來猴：XM_005567051；小鼠：NM_054088；大鼠：XM_006242109)之iRNA。人類PNPLA3 REFSEQ mRNA之長度為2805個鹼基。siRNA組設計之基本原理與方法如下：採用來自靶向大量脊椎動物基因之超過20,000種獨特iRNA設計推算mRNA擊弱直接測定值之線性模式來決定來自位置174至位置2805(編碼區與3’UTR)之每一個可能之19聚體iRNA之預期效力。設計一小組PNPLA3 iRNA，在人類與馬來猴之間有完美或幾近完美匹配。設計另一小組與小鼠及大鼠PNPLA3直系同源物有完美或幾近完美匹配。再設計另一小組與人類、馬來猴、小鼠、及大鼠PNPLA3直系同源物有完美或幾近完美匹配。iRNA之每一股則採用訂製之Python指令稿，在強力搜索下測定iRNA與標靶物種轉錄
組中所有可能比對物之間之錯配數量與位置。在種子區(例如，反義寡核苷酸之位置2至9)及siRNA之裂解位點(例如，反義寡核苷酸之位置10至11)中指定錯配之額外加權。種子錯配、裂解位點、及從其他位置至反義位置19之錯配相對加權分別為2.8、1.2與1。第一個位置之錯配可忽略。由各加權錯配數值總和來計算各股之特異性指數。較佳iRNA係在人類與馬來猴中之反義指數>=3.0者，且預期效力>=70%擊弱PNPLA3轉錄本。
未修飾之PNPLA3正義與反義股序列之詳細列表示於表4。經修飾之PNPLA3正義與反義股序列詳細列表示於表5。
活體外篩選
細胞培養與轉染
Hep3b細胞之轉染法為在384孔盤，每孔添加4.9μl Opti-MEM加0.1μl脂染胺(Lipofectamine)RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.目錄編號13778-150)至每孔5μl iRNA雙螺旋中，於室溫培養15分鐘。再添加40μl含~5 x103個細胞之EMEM至iRNA混合物中。細胞先培養24小時後，再進行RNA純化。在20nM最終雙螺旋濃度下進行單劑量實驗。
使用DYNABEADS mRNA單離套組單離總RNA
採用自動化過程單離RNA，其係於BioTek-EL406平台上，使用DYNABEADs(Invitrogen，目錄編號61012)進行。
簡言之，添加50μl溶胞/結合緩衝液與25μl溶胞緩衝液(含3μl磁珠)至含細胞之分析盤中。分析盤於電磁性振盪器上，於室溫培養10分鐘，然後捕捉磁珠，排除上清液。與磁珠結合之RNA經過150μl洗滌緩衝液A洗滌2次，使用洗滌緩衝液B洗滌一次。再使用150μl溶離緩衝液洗滌磁珠，再度捕捉及排除上清液。
使用ABI高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA，目錄編號4368813)合成cDNA
每個反應添加10μl含1μl 10X緩衝液、0.4μl 25X dNTP、1μl 10X隨機引子、0.5μl反轉錄酶、0.5μl RNase抑制劑與6.6μl H2O之母混合物至上述單離之RNA中。分析盤密封，混合，於電磁性振盪器上，於室溫培養10分鐘，然後於37℃培養2h。
實時PCR
在384孔分析盤(Roche，目錄編號04887301001)中，每孔添加2μl cDNA至包含0.5μl GAPDH TaqMan探針(Hs99999905)、0.5μl PNPLA3探針(Hs00228747_m1)與5μl Lightcycler 480探針母混合物(Roche目錄編號04887301001)之母混合物中。於LightCycler480實時PCR系統(Roche)中進行實時PCR。各雙螺旋進行四次獨立轉染試驗。
計算相對倍數變化時，使用△△Ct法分析實時數據並經過使用經2.0nM AD-1955轉染之細胞或偽轉染
之細胞所進行之分析法校正。分析所得結果示於表6。
表4. PNPLA3 RNAi劑之未修飾之正義與反義股序列
表5. PNPLA3 RNAi劑之經修飾之正義與反義股序列
表6. 於Hep3B細胞中之PNPLA3單劑量篩選法數據係以相對於非靶向性雙螺旋對照物AD-1955殘留之訊息百分比表示。
實例3. iRNA合成法
試劑來源
若本文中未明確說明試劑來源時，則此等試劑可得自任何分子生物學試劑供應商，依分子生物學應用之品質/純度標準。
轉錄本
siRNA設計
採用訂製之R and Python指令稿設計一組靶向人類
PNPLA3(人類：NCBI refseqID NM_025225；NCBI GeneID：80339)，及毒物學物種PNPLA3直系同源物(馬來猴：XM_005567051；小鼠：NM_054088；大鼠：XM_006242109)之iRNA。人類PNPLA3 REFSEQ mRNA之長度為2805個鹼基。iRNA組設計之基本原理與方法如下：採用來自靶向大量脊椎動物基因之超過20,000種獨特iRNA設計推算mRNA擊弱直接測定值之線性模式來決定來自位置174至位置2805(編碼區與3’UTR)之每一個可能之19聚體iRNA之預期效力。設計一小組PNPLA3 iRNA，在人類與馬來猴之間有完美或幾近完美匹配。設計另一小組與小鼠及大鼠PNPLA3直系同源物有完美或幾近完美匹配。再設計另一小組與人類、馬來猴、小鼠、及大鼠PNPLA3直系同源物有完美或幾近完美匹配。iRNA之每一股則採用訂製之Python指令稿，在強力搜索下測定iRNA與標靶物種轉錄組中所有可能比對物之間之錯配數量與位置。在種子區(此時界定在反義寡核苷酸之位置2至9)及iRNA之裂解位點(此時界定在反義寡核苷酸之位置10至11)中指定錯配之額外加權。種子錯配、裂解位點、及從其他位置至反義位置19之錯配相對加權分別為2.8、1.2與1。第一個位置之錯配可忽略。由各加權錯配數值總和來計算各股之特異性指數。較佳iRNA係在人類與馬來猴中之反義指數>=3.0者，且預期效力>=70%擊弱PNPLA3轉錄本。
未修飾之PNPLA3正義與反義股序列之詳細列表示於表7。經修飾之PNPLA3正義與反義股序列詳細列表示於
表8。表9提供表8所提供經修飾之PNPLA3劑之mRNA標靶序列。
活體外篩選
細胞培養與轉染
Hep3b細胞、小鼠、與馬來猴初代肝細胞之各分別獨立轉染法為在384孔盤中，每孔添加4.9μl Opti-MEM加0.1μl脂染胺(Lipofectamine)RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.目錄編號13778-150)至每孔5μl iRNA雙螺旋中，於室溫培養15分鐘。再添加40μl含約5 x103個Hep3b細胞之EMEM或40μl含約5 x103個小鼠初代肝細胞或馬來猴初代肝細胞之威廉式培養基(William’s media)至iRNA混合物中。細胞先培養24小時後，再進行RNA純化。以10nM與0.1nM最終雙螺旋濃度進行兩項單劑量實驗，並使用8,6倍連續稀釋液，在最終雙螺旋濃度10nM至36fM進行劑量效應實驗。
使用DYNABEADS mRNA單離套組單離總RNA
採用自動化過程單離RNA，其係於BioTek-EL406平台上，使用DYNABEADs(Invitrogen，目錄編號61012)進行。簡言之，添加50μl溶胞/結合緩衝液與25μl溶胞緩衝液(含3μl磁珠)至含細胞之分析盤中。分析盤於電磁性振盪器上，於室溫培養10分鐘，然後捕捉磁珠，排除上清液。與磁珠結合之RNA經過150μl洗滌緩衝液A洗滌2次，
使用洗滌緩衝液B洗滌一次。再使用150μl溶離緩衝液洗滌磁珠，再度捕捉及排除上清液。
使用ABI高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA，目錄編號4368813)合成cDNA
每個反應添加10μl含1μl 10X緩衝液、0.4μl 25X dNTP、1μl 10X隨機引子、0.5μl反轉錄酶、0.5μl RNase抑制劑與6.6μl H2O之母混合物至上述單離之RNA中。分析盤密封，混合，於電磁性振盪器上，於室溫培養10分鐘，然後於37℃培養2h。
實時PCR
在384孔分析盤(Roche，目錄編號04887301001)中，每孔添加2μl cDNA至包含0.5μl GAPDH TaqMan探針(Hs99999905)、0.5μl PNPLA3探針與5μl Lightcycler 480探針母混合物(Roche目錄編號04887301001)之母混合物中。Hep3b qPCR所使用之探針為GAPDH TaqMan探針(Hs99999905)與PNPLA3探針(Hs00228747_m1)。小鼠初代肝細胞qPCR所使用之探針為Mouse GAPDH TaqMan探針(Mm03302249_g1)與Mouse PNPLA3 Taqman探針(Mm00504420_m1)。馬來猴初代肝細胞qPCR所使用之探針為訂製之Cynomolgus GAPDH探針與訂製之Cynomolgus PNPLA3探針(5’-AGCGGGGUCUGAAGUCAU-3’(SEQ ID NO：1207))。於LightCycler480實時PCR系統(Roche)中，
採用△△Ct(RQ)分析法進行實時PCR。各雙螺旋進行四次獨立轉染試驗。
計算相對倍數變化時，使用△△Ct法分析實時數據並經過使用經20nM AD-1955(係一種非靶向性iRNA對照物)轉染之細胞或偽轉染之細胞所進行之分析法校正。AD-1955之正義與反義序列為：正義：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：1208)；反義：UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO：1209)。
活體外Dual-Glo®篩選法
細胞培養與轉染法
取Cos7細胞(ATCC,Manassas,VA)於37℃與5% CO2蒙氣下，於補充10% FBS之DMEM(ATCC)中生長至接近匯合，然後使用胰蛋白酶處理，從培養盤釋出細胞。在包含約2.8kb(人類)PNPLA3序列(SEQ ID NO：18)之psiCHECK2質體中產生Dual-Glo®螢光素構築體。使用脂染胺(Lipofectamine)RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.目錄編號13778-150)，讓Dual-螢光素酶質體與siRNA共轉染至15x103個細胞中。在96孔盤之各孔中，添加0.2μl脂染胺至含10ng質體載體與iRNA之15μl Opti-MEM中，並於室溫複合15分鐘。然後添加混合物至已再懸浮於80μl新鮮完全培養基中之細胞中。細胞培養48小時後，測定螢光素酶。以10nM及0.1nM最終雙螺旋濃度進行兩項單劑量實驗，並使用8,6倍連續稀釋液，在最終雙螺旋濃度10nM
至36fM下進行劑量效應實驗。
Dual-Glo®螢光素酶分析法
siRNA轉染48小時後，測定螢火蟲(轉染對照組)與海腎(Rinella)(與PNPLA3標靶序列3’UTR融合)螢光素酶。首先，排除細胞之培養基。然後在各孔中添加等於培養基體積之75μl Dual-Glo®螢光素酶試劑並混合，來測定螢火蟲螢光素酶活性。於室溫培養混合物30分鐘後，於Spectramax(Molecular Devices)上測定發光度(500nm)，以檢測螢火蟲螢光素酶訊號。海腎螢光素酶活性測定法為添加75μl室溫之Dual-Glo®Stop & Glo®試劑至各孔中，分析盤培養10至15分鐘後，再度測定發光度，以測定海腎螢光素酶訊號。以Dual-Glo®Stop & Glo®試劑中止螢火蟲螢光素酶訊號，並維持海腎螢光素酶反應之發光。以各孔之海腎(PNPLA3)訊號相對於螢火蟲(對照組)訊號校正，測定iRNA活性。然後相對於經過相同載體轉染但未經過iRNA處理之細胞或經過非靶向性iRNA處理之細胞分析siRNA活性程度。所有轉染法均進行三重複。
表10顯示經過所指定經修飾之RNAi劑轉染之Hep3B細胞之單劑量10nM篩選與單劑量0.1nM篩選結果。數據係以相對於未處理組細胞之訊息殘留百分比表示。
表11顯示經過所指定經修飾之RNAi劑轉染之馬來猴初代肝細胞之單劑量10nM篩選與單劑量0.1
nM篩選結果。數據係以相對於未處理組細胞之訊息殘留百分比表示。
表12顯示經過所指定經修飾之RNAi劑轉染之馬來猴初代肝細胞之劑量效應。所指示之IC50值代表相對於未處理組細胞之IC50值。
表13顯示經過所指定經修飾之RNAi劑轉染之小鼠初代肝細胞之單劑量10nM篩選與單劑量0.1nM篩選結果。數據係以相對於未處理組細胞之訊息殘留百分比表示。
表14顯示經過所指定經修飾之RNAi劑轉染之小鼠初代肝細胞之劑量效應。所指示之IC50值代表相對於未處理組細胞之IC50值。
表15顯示經過所指定經修飾之PNPLA3 RNAi劑轉染之Cos7細胞之單劑量10nM篩選與單劑量0.1nM篩選結果。數據係以相對於未處理組細胞之mRNA殘留百分比表示。
表16顯示經過所指定經修飾之RNAi劑轉染之Cos7細胞之劑量效應。所指示之IC50值代表相對於未處理組細胞之IC50。
表7. PNPLA3未修飾之序列
表8. PNPLA3經修飾之序列
表9. 表8中經修飾之PNPLA3劑之PNPLA3 mRNA標靶序列
表10. Hep3B PNPLA3內因性活體外10nM與0.1nM單劑量篩選法
表11. 馬來猴PNPLA3內因性活體外10nM與0.1nM單劑量篩選法
表12. 馬來猴PNPLA3內因性活體外劑量效應篩選法
表13. 小鼠PNPLA3內因性活體外10nM與0.1nM單劑量篩選法
表14. 小鼠PNPLA3內因性活體外劑量效應篩選法
表15.人類PNPLA3 Dual-Glo®活體外10nM與0.1nM單劑量篩選法
表16.人類PNPLA3 Dual-Glo®活體外劑量效應篩選法
實例4. 投與單劑量PNPLA3 iRNA劑之活體內效應
Ob/ob小鼠於肝中強力表現PNPLA3。因此，對Ob/ob小鼠(B6.Cg-Lepob/J)經皮下投與單劑量0.3mg/kg、1.5mg/kg、或3.0mg/kg之AD-67525、AD-67526、AD-67528、AD-65731、AD67533、AD-67538、或AD-67544、或單獨PBS(作為對照組)。投藥後96小時，殺死動物並取出肝臟，採用RT-qPCR定量PNPLA3 mRNA含量。
如第1圖所示，投與單劑量1.5mg/kg之AD-67526或單劑量3.0mg/kg之AD-67533時，在所分析之製劑與劑量下，對肝PNPLA3具有最強力之抑制性。
同等物
熟悉此相關技術者咸了解，或採用例行實驗即可確認許多本文所說明之專一性具體實施例中及方法之同等物。此等同等物均計畫包括在下列申請專利範圍中。
由於本案的圖為試驗數據，並非本案的代表圖，故本案無指定代表圖。
Claims (107)
- 一種抑制含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：1核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸，以及該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：2核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸。
- 一種抑制含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股與反義股，該反義股包含含有至少15個連續核苷酸之互補區，其與表3至5、7與8中任一個表中所列任一反義序列之差異不多於3個核苷酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之雙股RNAi劑，其中該正義股與該反義股包含選自表3至5、7與8中任一個表中任何序列所組成群組中之序列。
- 一種抑制含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股與反義股，以及其中該雙股RNAi劑靶向由表3、4、7與9中任一個表中所列任一個PNPLA3轉錄本標靶位點所組成群組中之PNPLA3轉錄本中之位點。
- 如申請專利範圍第1、2或4中任一項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含至少一個經修飾之核苷 酸。
- 如申請專利範圍第1、2或4中任一項所述之雙股RNAi劑，其中該正義股之所有核苷酸與該反義股之所有核苷酸均包含修飾。
- 一種抑制含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域3(PNPLA3)表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：1核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸，及該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：2核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸，其中該正義股之實質上所有核苷酸與該反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，及其中該正義股係接合附接在3’-端之配體。
- 如申請專利範圍第7項所述之雙股RNAi劑，其中該正義股之所有核苷酸與該反義股之所有核苷酸均包含修飾。
- 如申請專利範圍第5或7項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中至少一個該經修飾之核苷酸係選自下列各者所組成之群組中：去氧-核苷酸、3’-端去氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構形受限之核苷酸、乙基受約束核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基-修飾 之核苷酸、2’-C-烷基-修飾之核苷酸、2’-羥基-修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基-修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫哌喃修飾之核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基之核苷酸、包含甲基膦酸酯基之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、及包含5’-磷酸酯擬似物之核苷酸。
- 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi劑，其中該經修飾之核苷酸包含3’-端去氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)之短序列。
- 如申請專利範圍第2項所述之雙股RNAi劑，其中該互補區之長度為至少17個核苷酸。
- 如申請專利範圍第2項所述之雙股RNAi劑，其中該互補區之長度為19至21個核苷酸之間。
- 如申請專利範圍第12項所述之雙股RNAi劑，其中該互補區之長度為19個核苷酸。
- 如申請專利範圍第1、2、4或7項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中各股之長度為不超過30個核苷酸。
- 如申請專利範圍第1、2、4或7項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中至少一股包含含有至少1個核苷酸之3’突出。
- 如申請專利範圍第1、2、4或7項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中至少一股包含含有至少2個核苷酸 之3’突出。
- 如申請專利範圍第1、2或4項中任一項所述之雙股RNAi劑，係進一步包含配體。
- 一種抑制PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含編碼PNPLA3之一部份mRNA之互補區，其中各股之長度為約14至約30個核苷酸，其中該雙股RNAi劑係由式(III)表示：正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'(III)其中：i、j、k與l分別獨立為0或1；p、p'、q與q'分別獨立為0至6；各Na與Na'分別獨立表示包含0至25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb與Nb'分別獨立表示包含0至10個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；各np、np'、nq與nq'，其分別可能存在或可能不存在，分別獨立表示突出核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'與Z'Z'Z'分別獨立表示一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序；Nb之修飾不同於Y之修飾，及Nb'之修飾不同於Y'之修飾；及其中該正義股係接合至少一個配體。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中i為0；j為0；i為1；j為1；i與j二者均為0；或i與j二者均為1。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中k為0；l為0；k為1；l為1；k與l二者均為0；或k與l二者均為1。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中XXX係與X'X'X'互補，YYY係與Y'Y'Y'互補，及ZZZ係與Z'Z'Z'互補。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中該YYY基序出現在或接近該正義股之裂解位點。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中該Y'Y'Y'基序出現在該反義股之5'-末端起之11、12與13位置。
- 如申請專利範圍第23項所述之雙股RNAi劑，其中該Y'為2'-O-甲基。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中式(III)係由式(IIIa)表示：正義：5' np-Na-YYY-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'(IIIa)。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中式 (III)係由式(IIIb)表示：正義：5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5'(IIIb)其中各Nb與Nb'分別獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中式(III)係由式(IIIc)表示：正義：5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'(IIIc)其中各Nb與Nb'分別獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中式(III)係由式(IIId)表示：正義：5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5'(IIId)其中各Nb與Nb'分別獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，及各Na與Na'分別獨立表示包含2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中該Y核苷酸包含2'-氟修飾。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中該Y'核苷酸包含2'-O-甲基修飾。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中p'>0。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中p'=2。
- 如申請專利範圍第32項所述之雙股RNAi劑，其中q'=0，p=0，q=0及p'突出核苷酸係與標靶mRNA互補。
- 如申請專利範圍第32項所述之雙股RNAi劑，其中q'=0，p=0，q=0及p'突出核苷酸不與標靶mRNA互補。
- 如申請專利範圍第7或18項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股區之長度為15至30對核苷酸。
- 如申請專利範圍第35項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股區之長度為17至23對核苷酸。
- 如申請專利範圍第35項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股區之長度為17至25對核苷酸。
- 如申請專利範圍第35項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股區之長度為23至27對核苷酸。
- 如申請專利範圍第35項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股區之長度為19至21對核苷酸。
- 如申請專利範圍第7或18項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股區之長度為21至23對核苷酸。
- 如申請專利範圍第1、2、4、7或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中各股具有15至30個核苷酸。
- 如申請專利範圍第1、2、4、7或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中各股具有19至30個核苷酸。
- 如申請專利範圍第5、7或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中該核苷酸之修飾係選自下列各者所組成 之群組中：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2'-羥基與其組合。
- 如申請專利範圍第43項所述之雙股RNAi劑，其中該核苷酸之修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾。
- 如申請專利範圍第7、17或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中該配體為利用雙價或三價分支鏈結體附接之一或多種GalNAc衍生物。
- 如申請專利範圍第45項所述之雙股RNAi劑，其中該配體為
- 如申請專利範圍第17或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中該配體係附接該正義股之3'末端。
- 如申請專利範圍第47項所述之雙股RNAi劑，其中該RNAi劑係接合如下方案所示之配體
- 如申請專利範圍第1、2、4、7或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結基。
- 如申請專利範圍第49項所述之雙股RNAi劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結基係在一股3’-端。
- 如申請專利範圍第50項所述之雙股RNAi劑，其中該股為反義股。
- 如申請專利範圍第50項所述之雙股RNAi劑，其中該股為正義股。
- 如申請專利範圍第49項所述之雙股RNAi劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結基係在一股之5’-端。
- 如申請專利範圍第53項所述之雙股RNAi劑，其中該股為反義股。
- 如申請專利範圍第53項所述之雙股RNAi劑，其中該股為正義股。
- 如申請專利範圍第49項所述之雙股RNAi劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鏈結基係在一 股之5’-與3’-端。
- 如申請專利範圍第56項所述之雙股RNAi劑，其中該股為反義股。
- 如申請專利範圍第1、2、4、7或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中在雙螺旋反義股之5'-末端之1位置之鹼基對為AU鹼基對。
- 如申請專利範圍第1、2、4、7或18項中任一項所述之雙股RNAi劑，其中該正義股共具有21個核苷酸，及該反義股共具有23個核苷酸。
- 如申請專利範圍第19項所述之雙股RNAi劑，其中至少一個np'係利用硫代磷酸酯鏈結基鏈結相鄰之核苷酸。
- 如申請專利範圍第60項所述之雙股RNAi劑，其中所有np'均利用硫代磷酸酯鏈結基鏈結相鄰之核苷酸。
- 如申請專利範圍第18項所述之雙股RNAi劑，其中該正義股之所有核苷酸與該反義股之所有核苷酸均包含修飾。
- 如申請專利範圍第2項所述之雙股RNAi劑，其中該互補區包含表3至5、7與8中任一個表中之任一反義序列。
- 如申請專利範圍第2項所述之雙股RNAi劑，其中該互補區係由表3至5、7與8中任一個表中任一反義序列組成。
- 如申請專利範圍第1、2、4、7或18項中任一項所述 之雙股RNAi劑，其中該RNAi劑係選自表3至5、7與8中任一個表所列RNAi劑所組成之群組中。
- 一種抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含編碼PNPLA3之一部分mRNA之互補區，其中各股之長度為約14至約30個核苷酸，其中該雙股RNAi劑係由式(III)表示：正義：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)其中：i、j、k與l分別獨立為0或1；p、p'、q與q'分別獨立為0至6；各Na與Na'分別獨立表示包含0至25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb與Nb'分別獨立表示包含0至10個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；各np、np'、nq與nq'，其分別可能存在或不存在，分別獨立表示突出核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'與Z'Z'Z'分別獨立表示一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序，及其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb之修飾不同於Y之修飾，及Nb'之修飾不同於 Y'之修飾；及其中該正義股係接合至少一個配體。
- 一種抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含編碼PNPLA3之一部分mRNA之互補區，其中各股之長度為約14至約30個核苷酸，其中該雙股RNAi劑係由式(III)表示：正義：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'(III)其中：i、j、k與l分別獨立為0或1；各np、nq與nq'，其分別可能存在或可能不存在，分別獨立表示突出核苷酸；p、q與q'分別獨立為0至6；np'>0，且至少一個np'係利用硫代磷酸酯鏈結基鏈結相鄰之核苷酸；各Na與Na'分別獨立表示包含0至25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb與Nb'分別獨立表示包含0至10個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'與Z'Z'Z'分別獨立表示一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基 序，以及其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb之修飾不同於Y之修飾，及Nb '之修飾不同於Y'之修飾；及其中該正義股係接合至少一個配體。
- 一種抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含編碼PNPLA3之一部分mRNA之互補區，其中各股之長度為約14至約30個核苷酸，其中該雙股RNAi劑係由式(III)表示：正義：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5'(III)其中：i、j、k與l分別獨立為0或1；各np、nq與nq'，其分別可能存在或可能不存在，分別獨立表示突出核苷酸；p、q與q'分別獨立為0至6；np'>0，且至少一個np'係利用硫代磷酸酯鏈結基鏈結相鄰之核苷酸；各Na與Na'分別獨立表示包含0至25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb與Nb'分別獨立表示包含0至10個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'與Z'Z'Z'分別獨立表示一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序，以及其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb之修飾不同於Y之修飾，及Nb'之修飾不同於Y'之修飾；及其中該正義股係接合至少一個配體，其中該配體係利用雙價或三價分支鏈接體附接之一種或多種GalNAc衍生物。
- 一種抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含編碼PNPLA3之一部分mRNA之互補區，其中各股之長度為約14至約30個核苷酸，其中該雙股RNAi劑係由式(III)表示：正義：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)其中：i、j、k與l分別獨立為0或1；各np、nq與nq'，其分別可能存在或可能不存在，分別獨立表示突出核苷酸；p、q與q'分別獨立為0至6；np'>0，且至少一個np'係利用硫代磷酸酯鏈結基鏈結相鄰之核苷酸；各Na與Na'分別獨立表示包含0至25個經修飾或 未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb與Nb'分別獨立表示包含0至10個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'與Z'Z'Z'分別獨立表示一個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序，以及其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb之修飾不同於Y之修飾，及Nb'之修飾不同於Y'之修飾；其中該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結基；及其中該正義股係接合至少一個配體，其中該配體係利用雙價或三價分支鏈接體附接之一種或多種GalNAc衍生物。
- 一種抑制細胞中PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含編碼PNPLA3之一部分mRNA之互補區，其中各股之長度為約14至約30個核苷酸，其中該雙股RNAi劑係由式(III)表示：正義：5' np-Na-YYY-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'(IIIa)其中：各np、nq與nq'，其分別可能存在或可能不存在，分別獨立表示突出核苷酸；p、q與q'分別獨立為0至6；np'>0，且至少一個np'係利用硫代磷酸酯鏈結基鏈結相鄰之核苷酸；各Na與Na'分別獨立表示包含0至25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；YYY與Y'Y'Y'分別獨立表示一個在三個連續核苷酸有三個相同修飾之基序，以及其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；其中該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結基；及其中該正義股係接合至少一個配體，其中該配體係利用雙價或三價分支鏈接體附接之一種或多種GalNAc衍生物。
- 一種抑制PNPLA3表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：1核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸，及該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NO：2核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸，其中該正義股之實質上所有核苷酸包含選自由2’-O-甲基修飾與2’-氟修飾所組成群組中之修飾，其中該正義股在5’-末端包含兩個硫代磷酸酯之 核苷酸間鏈結基，其中該反義股之實質上所有核苷酸包含選自由2’-O-甲基修飾與2’-氟修飾所組成群組中之修飾，其中該反義股在5’-端包含兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結基，及在3’-端包含兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鏈結基，及其中該正義股係在3’-端利用雙價或三價鏈結體接合一種或多種GalNAc衍生物。
- 如申請專利範圍第71項所述之雙股RNAi劑，其中該正義股之所有核苷酸與該反義股之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
- 如申請專利範圍第71項所述之雙股RNAi劑，其中各股具有19至30個核苷酸。
- 一種包含如申請專利範圍第1、2、4、7、18或66至71項中任一項所述之雙股RNAi劑之細胞。
- 一種編碼雙股核糖核酸(RNAi)劑之至少一股之載體，其中該雙股RNAi劑包含編碼PNPLA3之至少一部份mRNA之互補區，其中該雙股RNAi劑之長度為30對或更少對鹼基，以及其中該雙股RNAi劑靶向要裂解之該mRNA。
- 如申請專利範圍第75項所述之載體，其中該互補區之長度為至少15個核苷酸。
- 如申請專利範圍第75項所述之載體，其中該互補區之長度為19至21個核苷酸。
- 一種包含如申請專利範圍第75項所述之載體之細胞。
- 一種用於抑制PNPLA3基因表現之醫藥組成物，係包含如申請專利範圍第1、2、4、7、18或66至71項中任一項所述之雙股RNAi劑或如申請專利範圍第75項所述之載體。
- 如申請專利範圍第79項所述之醫藥組成物，其中該雙股RNAi劑係於未緩衝之溶液中投藥。
- 如申請專利範圍第80項所述之醫藥組成物，其中該未緩衝之溶液為生理食鹽水或水。
- 如申請專利範圍第79項所述之醫藥組成物，其中該雙股RNAi劑係使用緩衝液投藥。
- 如申請專利範圍第82項所述之醫藥組成物，其中該緩衝液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任何組合。
- 如申請專利範圍第82項所述之醫藥組成物，其中該緩衝液為磷酸鹽緩衝液(PBS)。
- 一種醫藥組成物，係包含如申請專利範圍第1、2或4項中任一項所述之雙股RNAi劑與脂質調配物。
- 如申請專利範圍第85項所述之醫藥組成物，其中該脂質調配物包含LNP。
- 如申請專利範圍第85項所述之醫藥組成物，其中該脂質調配物包含MC3。
- 一種抑制細胞中PNPLA3表現之方法，該方法包括：(a)將該細胞與如申請專利範圍第1、2、4、7、18、 或66至71項中任一項所述之雙股RNAi劑或如申請專利範圍第79或85項所述之醫藥組成物接觸；及(b)將步驟(a)所產生之該細胞維持一段足以達到PNPLA3基因之mRNA轉錄本降解之時間，藉以抑制該細胞中PNPLA3基因之表現。
- 如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該細胞係在個體內。
- 如申請專利範圍第89項所述之方法，其中該個體為人類。
- 如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該PNPLA3表現係受到抑制至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%或約100%。
- 一種治療患有可能因降低PNPLA3表現而受益之疾病或病變之個體之方法，該方法包括對該個體投與醫療有效量之如申請專利範圍第1、2、4、7、18或66至71項中任一項所述之雙股RNAi劑或如申請專利範圍第79或85項所述之醫藥組成物，藉以治療該個體。
- 一種為患有可能因降低PNPLA3表現而受益之疾病或病變之個體預防至少一種病症之方法，該方法包括對該個體投與預防有效量之如申請專利範圍第1、2、4、7、18或66至71項中任一項所述之雙股RNAi劑或如申請專利範圍第79或85項所述之醫藥組成物，藉以為患有可能因降低PNPLA3表現而受益之疾病或病變之個體預防至少一種病症。
- 如申請專利範圍第92或93項所述之方法，其中對個體投與雙股RNAi劑造成刺猬訊號傳導途徑下降。
- 如申請專利範圍第92或93項所述之方法，其中該病變為PNPLA3相關疾病。
- 如申請專利範圍第95項所述之方法，其中該PNPLA3相關疾病為非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
- 如申請專利範圍第95項所述之方法，其中該PNPLA3相關疾病為脂肪肝(脂肪變性)。
- 如申請專利範圍第95項所述之方法，其中該PNPLA3相關疾病為非酒精性脂肪肝炎(NASH)。
- 如申請專利範圍第92或93項所述之方法，其中該個體為人類。
- 如申請專利範圍第92或93項所述之方法，係進一步包括對該個體投與抗-PNPLA3抗體、或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第92或93項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之投藥劑量為約0.01mg/kg至約10mg/kg或約0.5mg/kg至約50mg/kg。
- 如申請專利範圍第101項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之投藥劑量為約10mg/kg至約30mg/kg。
- 如申請專利範圍第101項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之投藥劑量係選自0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg與30mg/kg所組成之群組中。
- 如申請專利範圍第101項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係每週一次投與該個體。
- 如申請專利範圍第101項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係一個月一次投與該個體。
- 如申請專利範圍第92或93項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係經皮下投與該個體。
- 如申請專利範圍第92或93項所述之方法，係進一步包括測定該個體中之刺猬訊號傳導途徑程度。
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