TW202102667A - 用於擴增和分化供過繼性細胞治療之ｔ淋巴細胞和天然殺手（ｎｋ）細胞之方法 - Google Patents

Abstract

本發明描述用於取得供過繼性轉移治療以用於治療癌症之具有所需表型的淋巴樣細胞的方法。特別是，本發明關於透過中間親和性IL2受體來誘導優先傳信以擴增具有所需之中央記憶表型的細胞之策略。本發明之方法可用於取得用於治療癌症之腫瘤浸潤淋巴細胞、TCR或經嵌合型抗原受體工程處理之T細胞。

Description

用於擴增和分化供過繼性細胞治療之Ｔ淋巴細胞和天然殺手（ＮＫ）細胞之方法

本發明關於生物技術和免疫腫瘤學之領域。本發明關於用於取得供過繼性細胞轉移治療以用於癌症患者之具有所需中央記憶表型的淋巴樣細胞之方法，及該淋巴樣細胞於癌症患者之過繼性細胞轉移治療中的用途。

介白素2(IL2)為第一種被找到之經分子表徵的細胞因子。其主要顯示出可支持T細胞和NK細胞生長和擴增(Morgan et. al., 1976, Science, 193(4257):1007-1008)。IL2在1992年被核准用於臨床用途，但關於其受體生物學之精確描述仍在研究中(Rosenberg, 2014, J. Immunol., 192(12): 5451-8; Smith, 2006, Medical Immunology, 1476(9433):5-3)。以高劑量投予之IL2(HD IL2)係作為癌症免疫治療。全身性HD IL2治療可在黑色素瘤和腎癌患者中產生持久反應，但僅在相對小部分之患者中。再者，全身性HD IL2治療可引起顯著毒性而進一步限制其臨床適宜性(Atkins, 2006, Clin. Cancer Res., 12:2353-2358)。

IL2與淋巴樣細胞上之3種類型的受體(IL2R)交互作用：低親和性受體(Kd〜10-8M)，其僅含有IL2Rα次單位(CD25)；中間親和性受體(Kd〜10-9M)，其係由IL2Rβ和IL2Rγ次單位(CD122和CD132)形成；及高親和性受體(Kd〜10-11M)，其含有3個次單位IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ。僅有中間親和性(IL2Rβγ)和高親和性(IL2Rαβγ)受體為功能性的，能夠將信號轉導至該細胞(Stauber et. al., 2005, PNAS, 103(8):2788-2793; Wang, 2005, Science, 310 (18):1159-1163)。

IL2Rβ和IL2Rγ次單位存在於免疫系統之效應淋巴樣細胞上，但該IL2Rα次單位之組成表現為調節性T細胞(Treg)提供高親和性受體，因此在活體內會優先使用IL2(Malek, 2008, Annu. Rev. Immunol., 26:453-79)。現今，已知該全身性HD IL2治療在癌症患者中之效力有部分限制係由於IL2優先驅動Treg擴增，而這又再削弱抗腫瘤免疫力(Choo Sim et. al., 2014, J. Clin. Invest., 124(1):99-110)。

已經進行多種嘗試來提升用於癌症之全身性HD IL2治療的效力。數種研究已證明基於淋巴樣細胞上之IL2受體次單位的差別表現，令天然IL2發生突變以增加或減少其某些生物學特性是可能的(Skrombolas and Frelinger, 2014, Expert. Rev. Clin. Immunol., 10(2):207-217)。最初之研究聚焦在增進IL2對IL2Rα之親和性(Rao et al., 2003, Protein Engineering, 16(12):1081-1087)。儘管當時並不清楚，現在理解該策略導致大規模刺激Treg而確實下調活體內免疫反應。最近，Levin等人在1992年取得IL2突變體，其增強與IL2Rβ次單位之結合，而IL2Rβ次單位優先活化過度表現該中間親和性IL2受體的效應細胞(Levin et. al., 2012, Nature, 484(7395):529-33)。此稱為“超級因子(superkine)H9”之突變蛋白顯示出與天然IL2相比較提升之活體內抗腫瘤功效和較低之毒性。Carmenate等人報導在人IL2中引入四種突變，而有效降低對IL2Rα之親和性，但不會影響與二聚體型中間親和性受體(IL2Rβγ)之交互作用。當投予至活體內時，該突變蛋白避免Treg擴增而導致在小鼠模型中較天然IL2更有效且毒性更低(Carmenate et. al., 2013, J. Immunol., 190(12): 6230-8)。其他二種IL2突變蛋白，即F42K和R38A，亦大大降低IL2 對IL2Rα之結合親和性並顯示出在活體外刺激Treg之功效較差，但同時有效擴增LAK細胞(Heaton et. al., 1994, Ann. Surg. Oncol., 1(3):198-203)。

於另一改善全身性HD IL2治療之嘗試中，幾項工作聚焦在藉由將IL2聚乙二醇化或將其與抗體(Ab)之Fc部分融合來延長半衰期。確實，這些策略中有些導致活體內IL2之壽命有效增加，對整體抗腫瘤功效具有正面的影響(Zhu et. al., 2015; Cancer Cell, 27:498-501；Charych et. al., 2016, Clin. Cancer Res., 22(3):680-90)。

過繼性細胞轉移(ACT)被定義為一種治療方法，其中係從供體回收細胞，在活體外培養和/或操作，然後再將其投予患者以治療疾病。在治療癌症方面，ACT經常涉及淋巴細胞轉移(Gattinoni et. al., 2006, Nat. Rev. Immun., 6:383-393)。現今普遍使用的有3種主要治療形式：a)使用體外擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)；b)使用T細胞或NK細胞，該T細胞或NK細胞係經遺傳工程處理以表現對源自腫瘤抗原之肽具有高親和性(affinity)/親和力(avidity)的T細胞受體(TCR)；和c)使用T細胞或NK細胞，該T細胞或NK細胞係經工程處理以表現特異於腫瘤抗原之嵌合型抗原受體(CAR)。通常，後項策略係合併進一步遺傳工程處理該經轉移之淋巴細胞以增強其效應子之活體內功能；例如，將該相關細胞因子(如IL12，等)之分泌進行工程處理(Cassian Y., 2018, Curr. Opin. Immunol., 51:197-203)。

不論其誘導抗腫瘤免疫力之能力，ACT在治療癌症上的廣泛應用有數種眾所周知之侷限性。雖然腫瘤反應性T效應細胞之轉移可引起客觀反應，在人和小鼠中有強烈證據證明具有中央記憶表型之T細胞為優異之抗腫瘤反應介導子(Klebanoff et al., 2005, PNAS, 102(27):9571-6)。中央記憶T細胞為曾與抗原(CD44+)接觸過之細胞，其表現CD62L分子，對遷移至外周淋巴結是必要的(Ridell et. al., 2014, Cancer J., 20(2):141-144)。它們可在活體內持續較久，很可能是由於當它們再次遇到抗原(TCF1+)時具有較強之增殖和分泌細胞因子(如IL2)的能力。相反地，效應型記憶T細胞為曾與抗原接觸過之細胞，其具有明顯下調之CD62L分子、上調之抑制性受體(PD1、TIM3、LAG3)和減少之細胞因子釋出。它們傾向逐漸在活體內耗盡(Kishton et. al. 2017, Cell. Metab., 26(1):94-109；Klebanoff et. al., 2005, PNAS, 102(27):9571-6)。因此，促進具有中央記憶表型之細胞擴增的培養條件對發展較佳之ACT癌症免疫治療更為理想。

IL2促進T細胞和NK細胞在活體外活化和擴增，因此它在發展用於癌症之ACT治療中一直具有主要作用。在早期策略中，使用IL2來產生經淋巴因子活化之殺手(LAK)細胞。將LAK與全身性HD IL2共同投予可增加全身性單一治療之臨床反應。在其他方法中，高濃度之IL2主要用於擴增來自腫瘤萃取物之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。IL2與TCR刺激之組合使TIL在活體外更迅速擴增。將經擴增之TIL注入癌症患者中，並加上全身性HD IL2方案。該全身性HD IL2方案有助於維持該經轉移之細胞在活體內的持久性。總體結果為，使用TIL+HD IL2之治療可產生某些令人印象深刻之大的腫瘤消退，但保留全身性HD IL2治療之已知的侷限性(Rosenberg, 2014, J. Immunol., 192 (12) 5451-8)。最近之增加全身性HD IL2(作為ACT之佐劑於)之效力的嘗試研發出一種基於受體-配體正交化的方法，其使用彼此特異結合，但不與其野生型人類對應部分結合之突變體IL2細胞因子和突變體IL2受體。藉由此策略，該作者利用正交IL2細胞因子-受體將IL2之特異性重新導向經工程處理之T細胞，以選擇性擴增該經工程處理之轉移的T細胞，但僅具有有限之脫靶活性和可忽略之毒性。當用於小鼠ACT癌症模型中時，在正交IL2中擴增之正交-IL2R T細胞能有效減少腫瘤體積並增加存活(Sockolosky et. al., 2018, Science, 359(6379):1037-1042)。

不管IL2之調節與ACT相關之T細胞反應的獨特和有效的作用，IL2對記憶T細胞之擴增/分化的精確作用(正或負)尚未被完全理解。在IL2之存在下，在活體外擴增之細胞顯示出強的效應子能力，這亦縮短其在活體內之長期持續存在和存活。IL2以獨特方式促進T細胞活化和增殖，然而亦誘導由活化引起之細胞死亡(Spolski et. al., 2018, Nat. Rev. Immunol.,(18)648-659)。研究已證實活體外啟動期間減少IL2傳信可能有利於記憶CD8+T細胞之發展。IL2傳信減少已主要藉由在活體外培養期間降低IL2濃度或減少接觸時間來實現。其他作者以其他來自常見之γ鏈家族的細胞因子部分取代IL2之使用。在不同方案中，許多用於活體外活化和擴增T細胞的策略係使用IL7、IL15或IL21，但通常係與一些IL2組合(Hinrichs et .al., 2008; Blood, 111(11)5326-5333；Mueller et. al., 2008, Eur. J. Immunol., 38(10)2874-85；Zeng et. al., 2005, J. Exp. Med., 201(1)139-48；Markley and Sadelain, 2010, Blood, 115 (17)3508-3519；Zhang et. al., 2015, Clin. Cancer Res., 21 (10): 2278-88)。因此，IL2仍為ACT免疫治療中用於活化和擴增T細胞之標準物。

有趣的是，IL2/IL2R交互作用之複雜性及其對T細胞分化的影響仍不清楚。特別是，透過不同IL2R(相對於中間親和性為高親和性)優先傳信對淋巴樣細胞在活體外擴增/分化的影響仍然未知。上述IL2突變蛋白無一被用於在活體外擴增/分化用於ACT之T細胞，亦未曾使用合理修飾IL2/IL2R交互作用以透過眾所周知之一種IL2R的功能形式來指導IL2優先傳信之策略。

本申請案之發明者意外發現當使用不同作用劑/策略時的實質優點，該不同作用劑/策略係在活體外，藉由在細胞活化/擴增期間破壞IL2/IL2Rα交互作用，透過中間親和性IL2R指導IL2優先傳信。與在某些時點使用天然IL2傳信之傳統培養策略相比較，該等作用劑/策略誘導具有顯著之中樞記憶表型和大的抗原特異性殺傷能力之腫瘤特異性細胞有效擴增。將本發明用於癌症患者之過繼性轉移治療之前，本發明允許對當前在活體外擴增/分化細胞的方案進行實質性改善。

本發明提供用於在活體外或離體富集和擴增具有中央記憶表型之淋巴細胞的方法，該方法包含將從個體取得之樣品中的淋巴細胞或從該等樣品中分離出之淋巴細胞擴增，其中擴增包含活化該β/γ二聚體型IL2受體。

本發明提供用於在活體外或離體富集和擴增具有中央記憶表型之淋巴細胞的方法，該方法包含擴增在從個體取得之樣品中的淋巴細胞或從該等樣品分離出之淋巴細胞，其中擴增包含活化β/γ二聚體型IL2受體。

本發明提供用於富集和擴增用於過繼性細胞轉移治療之具有中央記憶表型的淋巴細胞之方法，其中擴增包含活化β/γ二聚體型IL2受體。

本發明關於用於擴增和/或分化可用於過繼性細胞轉移治療之具有中央記憶表型的淋巴樣細胞群之方法，該方法包含3個階段。該3個階段為： (i)從個體提取淋巴樣細胞， (ii)在活體外擴增該淋巴樣細胞或可選擇地已進一步經遺傳工程處理的該淋巴樣細胞且同時透過中間親和性IL2受體以誘導優先傳信(以下稱為IL2Rβγ偏倚之IL2傳信)和 (iii)將該經活化/擴增之細胞轉移入罹患癌症之該個體。

特別是，本方法採用不同策略以透過中間親和性IL2受體來誘導優先傳信(提供IL2Rβγ偏倚之IL2傳信)，同時活化/擴增該淋巴樣細胞。這些策略可為下列任一者： - 培養該淋巴樣細胞與可溶性IL2突變蛋白，該可溶性IL2突變蛋白透過中間親和性IL2R優先傳信。 - 將該淋巴樣細胞進行遺傳修飾以分泌IL2突變蛋白，該IL2突變蛋白透過中間親和性IL2R優先傳信。 - 培養該淋巴樣細胞與天然IL2，但： a)添加阻斷IL2-IL2Rα交互作用之藥劑，或 b)將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以分泌阻斷該IL2-IL2Rα交互作用之可溶性蛋白，或 c)將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以減少該細胞表面之IL2Rα受體次單位(CD25)的表現，或 d)將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以增加該細胞表面之中間親和性IL2受體的表現。

更特別地： 本方法中所使用之IL2突變蛋白包含US 9,206,243中所描述者(其對應於本發明之SEQ ID NO. 1-6)；Levin等人在2012年揭示之超級因子H9(其對應於本申請案之SEQ ID NO.7)及描述於WO 2017/202786之SEQ ID NO 1中的F42突變蛋白(其對應於本發明之SEQ ID NO. 8)。但不限於這些分子(Levin et al. in: Nature(2012). 48:529-535)。

所使用之阻斷IL2-IL2Rα交互作用的藥劑係選自：與IL2Rα或IL2結合之抗體或抗體片段；與IL2Rα或IL2結合之肽或化學上界定之小分子；IL2Rα(CD25)或其經修飾之變體的可溶形式。但不限於此。

在該方法之階段(ii)中，該IL2Rβγ偏倚之IL2傳信可在淋巴樣細胞培養/擴增之不同時刻提供。IL2Rβγ偏倚之IL2傳信可在活體外培養期間內的所有時間或部分時間提供。 再者，IL2Rβγ偏倚之IL2傳信可能會或可能不會在活體內轉移細胞之後保持。

在階段(ii)中，該淋巴樣細胞擴增可能或可能無法在其他細胞因子(例如IL12、IL17、IL15和IL21)之存在下完成。

在階段(iii)中，可將該細胞轉移入階段(i)之供體個體中或轉移入不同個體中。

於一些實施態樣中，該具有中央記憶表型之淋巴細胞的擴增包含使用經優化以用於該淋巴細胞之擴增的其他激素、細胞因子和培養條件。

受該方法處理之淋巴樣細胞可為下列任一者：T細胞之混合物；純化之CD4或CD8 T細胞；NK細胞；NKT細胞。淋巴樣細胞可在階段(i)中從外周血單核細胞、腫瘤引流淋巴結或腫瘤浸潤液取得。

該方法中之淋巴樣細胞可能或可能不經進一步工程處理以表現CAR；表現具有所需特異性之TCR；在細胞膜中表現其他所欲受體；分泌所欲之不同細胞因子或可溶性蛋白。

總體而言，本發明之方法可延長該轉移之細胞的持久性，及離體、活體外和活體內之較高的抗腫瘤功效。

於某些實施態樣中，該樣品係從引流淋巴結取得。於其他實施態樣中，該樣品為未經處理之腫瘤片段、酶催化處理之腫瘤片段、分離/懸浮之腫瘤細胞、淋巴結樣品或體液(例如血液、腹水或淋巴液)樣品。

於某些實施態樣中，該個體為人類。

於另一態樣中，本文描述用於治療有此需要之個體中的腫瘤之方法，該方法包含對該個體投予有效量之藉由本文所揭示之方法製備的淋巴細胞。於某些實施態樣中，該腫瘤為實體瘤。於某些實施態樣中，該腫瘤為液體腫瘤。

本發明之另一主題為該方法於過繼性細胞轉移治療中之用途，特別是於取得腫瘤浸潤淋巴細胞或嵌合型抗原受體T之用途，更特別為於治療癌症之用途。

藉由本發明之方法取得的細胞亦為本發明之主題。 本發明之詳細描述

本發明提供用於富集和擴增具有中央記憶表型之淋巴細胞的離體方法，該方法包含擴增在從個體取得之樣品中之淋巴細胞或從該等樣品分離出之淋巴細胞，其中擴增包含活化β/γ二聚體型IL2受體。

本發明提供用於富集和擴增具有中央記憶表型之淋巴細胞的活體外方法，該方法包含擴增在從個體取得之樣品中的淋巴細胞或從該等樣品分離出之淋巴細胞，其中擴增包含活化β/γ二聚體型IL2受體。

本發明提供用於富集和擴增具有中央記憶表型之淋巴細胞以用於過繼性細胞轉移治療的方法，其中擴增包含活化該β/γ二聚體型IL2受體。

本發明依賴在離體、活體外和活體內透過T淋巴細胞上之IL2受體改變信號傳導，以用於ACT治療。本發明主要提出以IL2樣替代物取代該天然IL2(及其天然來源之信號)以用於在活體外活化並擴增淋巴樣細胞，再將該淋巴樣細胞轉移入活體內，該IL2樣替代物透過中間親和性IL2受體以誘導優先傳信(誘導IL2Rβγ偏倚之IL2信號)。換言之，IL2樣替代物指導與IL2-二聚體型受體(IL2Rβγ)交互作用並透過其優先傳信。該等替代物包括，但不限於下列者： - 培養該淋巴樣細胞與可溶性IL2突變蛋白，該可溶性IL2突變蛋白與該中間親和性IL2R(IL2Rβγ)優先交互作用並透過其優先傳信， - 將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以分泌IL2突變蛋白，該IL2突變蛋白透過該中間親和性IL2R優先傳信， - 在天然IL2之存在下培養該淋巴樣細胞，但： a)添加阻斷IL2-IL2Rα交互作用之藥劑，或 b)將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以分泌阻斷該IL2-IL2Rα交互作用之可溶性蛋白，或 c)將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以減少該細胞表面之IL2Rα受體次單位(CD25)的表現，或 d)將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以增加該細胞表面之中間親和性IL2受體的表現。

本文揭示之方法提供用於產生/擴增具有中央記憶表型之活化的淋巴樣細胞之策略，該活化之淋巴樣細胞在活體內轉移時對腫瘤控制非常有效。本發明代表對ACT治療之當前策略的實質改善。

根據本發明之方法培養淋巴樣細胞可使用合適之培養基並在用於活體外培養免疫細胞之合適的環境條件下進行。該淋巴樣細胞擴增亦可在其他細胞因子(例如IL12、IL17、IL15和IL21)之存在下完成。該淋巴樣細胞擴增可遵循在ACT之背景下報導的任何方案進行。當在這些方案中使用天然IL2時，在培養階段中係使用本文詳細描述之任何IL2樣替代物來取代天然IL2提供之信號。

該方法之淋巴樣細胞可能業已經或可能未經進一步工程處理以表現CAR；表現具有所需特異性之TCR；在細胞膜中表現其他所欲受體；分泌所欲之不同細胞因子或可溶性蛋白。

受該方法處理之淋巴樣細胞可為下列任一者：T細胞之混合物；純化之CD4或CD8 T細胞；NK細胞；NKT細胞。淋巴樣細胞可從PBMC、腫瘤引流淋巴結或腫瘤浸潤物取得。

本文中之術語“IL2突變蛋白”、“noα-突變蛋白”、“noα-IL2-突變蛋白”、“IL2突變蛋白”、“部分激動劑IL2”或“突變體IL2”可互換使用且係指突變之介白素2蛋白質，或經改質之介白素2蛋白質，其中該突變誘導β/γ二聚體型IL2受體活化，優先與IL2-二聚體型受體(IL2Rβγ)交互作用，誘導IL2Rβγ偏倚之IL2信號，對IL2Rα之親和性降低，或對β/γIL2受體具有較高之親和性。這些突變或經改質之IL2突變蛋白的非限制性實例為Seq.1至7。

本文中，術語“淋巴細胞”或“淋巴樣細胞”可互換使用且係指介導動物之免疫力的任何細胞，包括淋巴細胞、淋巴母細胞和漿細胞。於本發明之一些實施態樣中，該術語係指帶有可變之抗原的細胞表面受體且負責適應性免疫反應的白血球類別。其可介導先天性和適應性免疫反應。其可介導體液和細胞介導之免疫力。

本發明中提出之策略可用於癌症治療之ACT療法的治療目的。

本發明提供治療有此需要之個體中之腫瘤的方法，該方法包含對該個體投予有效量之藉由本文所揭示之方法取得的具有中央記憶表型之淋巴細胞群。於某些實施態樣中，該腫瘤為實體腫瘤(例如卵巢瘤、黑色素瘤、肺腫瘤、胃腸道腫瘤、乳腺腫瘤)。於某些實施態樣中，該腫瘤為液體腫瘤(例如白血病或淋巴瘤)。於某些實施態樣中，該腫瘤表現與至少一種包含腫瘤抗原之肽相一致的突變。於某些實施態樣中，該個體為人。使用經工程處理之源自 IL2 的細胞因子，其與中間親和性 IL2R(IL2Rβγ) 交互作用並因此透過該中間親和性 IL2R(IL2Rβγ) 優先傳信。

本發明之一實施態樣關於在T細胞活化和擴增方案期間使用IL2突變蛋白，透過中間親和性二聚體型IL2受體-IL2Rβγ特異地指導IL2傳信。該IL2突變蛋白包括，但不限於具有降低之IL2Rα交互作用親和性的變體，例如US 9,206,243中所描述者；具有增加之IL2Rβ交互作用親和性的變體，例如Levin等人，2012中描述之超級因子H9。或具有該二者(IL2Rα交互作用親和性較低，IL2Rβ交互作用親和性較高)之組合的變體。以這些突變蛋白與特異性TCR傳信、CD3/CD28活化和/或其他存活細胞因子之組合活化淋巴細胞。該IL2樣信號可在整個培養過程中持續保持，或可用於該培養之特定階段，較佳地，應在最初之活化時刻提供。突變蛋白之使用濃度可在1ng/ml至1mg/ml之範圍內。該淋巴樣細胞擴增可遵循在ACT之背景下任何報導之方案。但在培養階段，當原始方案中係使用天然IL2時，則添加IL2突變蛋白代替之。例如，其可為僅基於將細胞與抗CD3/CD28抗體和IL2突變蛋白一起培養之方案，或者其可將IL2突變蛋白與其他細胞因子(諸如IL7、IL15、IL12和IL21)組合。遺傳工程處理該淋巴樣細胞以分泌 IL2 突變蛋白，該 IL2 突變蛋白透過中間親和性 IL2R(IL2Rβγ) 優先傳信。

本發明之其他實施態樣關於遺傳修飾該淋巴樣細胞以分泌任本發明中提及之IL2突變蛋白。該淋巴樣細胞之修飾可使用在ACT技術之背景下被廣為使用之任何經充分描述的轉染或轉導方法完成。例如，此可使用基因組編輯技術或病毒載體在T細胞上引入具有該突變蛋白基因之構建體來達成。該構建體亦可含有報告蛋白，以很容易地追踪該轉導效力及抗生素抗性基因，以富集該轉導之部分。

轉染/轉導之效率應該要高。至少高至足以在活體外擴增期間授予該淋巴樣細胞提供其自身自分泌IL2Rβγ偏倚之IL2信號。此特定程序可授予該淋巴樣細胞在活體內轉移後可利用IL2Rβγ偏倚之IL2信號，以進一步促進該細胞之持久性和抗腫瘤能力。

經工程處理之淋巴樣細胞的細胞擴增可依循在ACT之背景下的任何已報告之方案，但不在培養物中添加任何天然IL2。例如，淋巴樣細胞可使用特異性TCR傳信、單獨之CD3/CD28活化和/或補充存活細胞因子(諸如IL7、IL15和IL21)而被活化。在淋巴樣細胞培養中添加擾亂 IL2-IL2Rα 交互作用之藥劑。

本發明之其他實施態樣關於當在活體外擴增用於ACT之淋巴樣細胞時，以藥理學方式擾亂IL2/IL2Rα交互作用的不同方法。添加該等藥劑可藉由阻斷IL2接近高親和性三聚體型IL2R來將天然IL2之信號轉換成IL2Rβγ偏倚之IL2信號。

該活化/擴增方案可與TCR傳信、CD3/CD28活化和其他所欲之細胞因子特異也結合性。該藥劑和IL2應始終一起使用並同時加入培養物中。所產生之IL2Rβγ偏倚之IL2信號可完全隨培養物保持或可在培養之特定階段中使用，較佳地，其應在最初之活化期間提供。該藥劑應過量使用以增強其阻斷能力。該特定量應逐例檢查阻斷IL2與CD25結合之能力實施校準。

本發明中用於阻斷該IL2-IL2Rα交互作用之藥劑包括，但不限於：與IL2Rα或IL2結合之抗體或抗體片段；與IL2Rα或IL2結合之肽或化學方式定義之小分子；IL2Rα(CD25)或其經修飾之變體的可溶形式。

在藥劑與IL2結合之情況下，應驗證該藥劑僅阻斷與IL2Rα交互作用之能力，而不影響與IL2Rβγ結合和透過IL2Rβγ信號傳導。這些作用劑可分別加至培養物中之IL2，但亦可預先與IL2混合以促進所期待之複合物的形成。

本實施態樣中之淋巴樣細胞的擴增可依循在ACT背景下報導之任何方案。但在培養期間，當在原始方案中使用天然IL2時，亦添加藥劑。例如，其可為僅基於將細胞與抗CD3/CD28 mAb和IL2+阻斷劑一起培養的方案，或者其可將IL2+阻斷劑與其他細胞因子(諸如IL7、IL15、IL12和IL21)組合。對淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以分泌阻斷 IL2 和 IL2Rα 之間的交互作用之可溶性蛋白。

本發明之其他實施態樣關於遺傳上修飾該淋巴樣細胞以分泌可溶性蛋白，該可溶性蛋白特異地阻斷IL2與IL2R之間的交互作用。該淋巴樣細胞之修飾可藉由在ACT技術之背景下廣泛使用之任何已被充分描述的轉染或轉導方法完成。例如，此可使用基因組編輯技術或病毒載體在T細胞上引入具有用於所需蛋白質之基因的構建體來實現。轉染/轉導之效率應該要高。至少足夠高至賦予該淋巴樣細胞產生足夠之可溶性蛋白以明顯阻斷IL2-I L2Rα交互作用，在活體外擴增期間授予其自身IL2Rβγ偏倚之IL2信號。

本發明中可用於阻斷IL2-IL2Rα交互作用之蛋白質包括，但不限於：與IL2Rα或IL2結合之抗體或抗體片段；IL2Rα(CD25)或任何經修飾之變體的可溶形式。

本實施態樣中淋巴樣細胞之擴增可依循在ACT背景下報告之任何方案。在此情況中，並無任何不同，除了那些對工程處理細胞而言絕對必要者外。例如，將該細胞與抗CD3/CD28抗體和IL2一起培養，或者其可組合IL2與其他細胞因子(諸如IL7、IL15、IL12和IL21)。遺傳工程處理該淋巴樣細胞以降低細胞表面上 IL2Rα 受體次單位 (CD25) 之表現。

本發明之另一實施態樣關於遺傳修飾該淋巴樣細胞以減少IL2R在細胞表面上之表現。在細胞工程處理方面，可使用幾種策略，包括，但不限於干擾RNA、基因組編輯技術和剔除策略。該淋巴樣細胞之修飾可藉由在ACT技術之背景下被廣泛使用之任何已充分描述的轉染或轉導方法完成。例如，減少或完全抑制淋巴樣細胞上之CD25表現可使用病毒載體在細胞上引入構建體來實現，該構建體具有靶向用於CD25之基因的shRNA。

本實施態樣中之淋巴樣細胞的擴增可依循在ACT背景下報導之任何方案。在此情況中，並無任何不同，除了那些對遺傳工程處理細胞而言絕對必要者外。例如，該經工程處理之細胞可與抗CD3/CD28抗體和IL2一起培養，或者其可組合IL2與其他細胞因子(諸如IL7、IL15、IL12和IL21)。遺傳工程處理該淋巴樣細胞以增加該細胞表面上中間親和性 IL2 受體之表現

本發明之另一實施態樣關於經遺傳工程修飾該淋巴樣細胞以增加該細胞表面上二聚體型受體IL2Rβγ之表現。此可使用病毒載體在T細胞上引入構建體來實現，該構建體具有受組成型表現啟動子控制之CD122(IL2Rβ鏈)基因或CD132(IL2Rγ鏈)基因。或者，在此策略方面，可對T細胞進行修飾以表現突變之CD122(IL2Rβ鏈)，其具有增加之IL2親和性，而非天然CD122。此可使用基因組編輯技術或病毒載體將構建體引至淋巴樣細胞上來實現，該構建體具有用於突變或野生型CD122之基因。

在所描述之策略方面，該構建體亦可含有報告蛋白以容易地追踪轉導效力，並可含有抗生素抗性基因以富集該經轉導之部分。

本實施態樣中之淋巴樣細胞的擴增可依循在ACT背景下報導之任何方案。在此情況中，並無任何不同，除了那些對遺傳工程處理細胞而言絕對必要者外。例如，該經工程處理之細胞可與抗CD3/CD28抗體和IL2一起培養，或者其可組合IL2與其他細胞因子(諸如IL7、IL15、IL12和IL21)。治療方法

在相關態樣中，本文揭示用於治療有此需要之個體中的腫瘤之方法，該方法包含對該個體投予有效量之藉由本文所揭示之方法產生的淋巴細胞群。於某些實施態樣中，該腫瘤為實體腫瘤。於某些實施態樣中，該腫瘤為液體腫瘤(例如血癌)。

實施例 1. 以透過 IL2Rβγ 優先傳信之 IL2- 突變蛋白取代天然 IL2 可保留淋巴細胞存活力並賦予中央記憶樣表型。

從天然OT-1小鼠脾臟中分離出CD8+T細胞。以經抗CD3/抗CD28塗層之小珠作為TCR刺激共7天，與天然IL2或IL2突變蛋白一起培養10天(後者係從分子免疫學中心獲得(批號1201602)，其揭示於專利案US 9,206,243之SEQ ID NO 6中)。每二天擴增培養一次，以保持密度為1×10⁶ 並隨新鮮培養基添加細胞因子。在二種培養條件下均成功擴增大量T細胞，且觀察到細胞數之倍數增加類似。第1A圖顯示與天然IL2相比較，當使用IL2突變蛋白時培養物之存活力提高(p＜0.0001)。另外，藉由流式細胞術測量記憶細胞之數量和抑制性標記之表現。與天然IL2相比較，當使用IL2突變蛋白時細胞中可觀察到明顯較高之具有中央記憶樣表型(藉由CD62L+/CD44+定義)之細胞的百分比(第1B圖)。對PD-1、Lag-3、Tim-3和Tigit標記之表型分析顯示由IL2-突變蛋白活化之細胞會抑制該免疫檢查點配體(PD-1、Lag-3、Tim-3、Tigit)之表現(表1)。

就存活力方面描述之功效(第2A圖)，在天然IL2和IL2-突變蛋白二者之大劑量範圍內的PD1表現(第2B圖)和CD62L表現(第2C圖)相一致。

綜合這些結果表明以具有IL2Rβγ的IL2-突變蛋白取代天然IL2可促進中央記憶表型，而非由天然IL2誘導之被充分描述的效應子表型。IL2-突變蛋白較天然IL2更能賦予淋巴再循環(較多CD62L表現)和對抗衰竭(較少PD1表現)之潛力，此為活體內轉移之較理想的表型。實施例 2. 在與 IL7 和 IL15 組合之培養方案中以透過 IL2Rβγ 優先傳信之 IL2- 突變蛋白取代天然 IL2 有利於中央記憶表型。

如其他作者先前所述，當與單獨之IL2相比較，IL7和IL15與IL2之組合可改善T細胞適合性(Redeker and Arens, 2016, Front Immunol. 6(7):345)。在我們的實驗中，在培養中將天然IL2或IL2-突變蛋白與IL7和IL15組合以用於OT-1 T細胞活化/擴增方案。

在此策略中，使用與實例1中描述之相同TCR刺激。在培養開始時添加天然IL2或IL2-突變蛋白直到第5天，然後將細胞保持在IL7/IL15中10天。在此情況下，二種培養條件在培養中提供類似之細胞密度、高存活力(第3A圖)，並有利於記憶細胞佔大多數，而非效應細胞。然而，如第3B圖所示，與天然IL2相比較，使用IL2-突變蛋白顯示出培養中具有較高比例之中央記憶細胞(p＜0.0015)。

同時，如表2所示，與突變蛋白一起培養之細胞顯示出較低之耗竭標記表現。

對培養中與IL7/IL15組合之不同濃度的天然IL2和IL2-突變蛋白的評估證明：就存活力(第4A圖)、PD1表現(第4B圖)和中央記憶樣表型(第4C圖)而言，上述功效在大範圍之劑量內是一致的。

與單獨之天然IL2相比較，雖然天然IL2與IL7和IL15之組合提升培養條件，但在IL2-突變蛋白方面，當使用組合方案時並未觀察到改善，因為單獨之IL2-突變蛋白在保持T細胞存活力及誘導中央記憶表型上高度有效。另外，單獨之IL2-突變蛋白在誘導經活化之T細胞上的中央記憶表型樣方面與IL2、IL7和IL15之組合一樣有效(第5圖)。實施例 3. 產生 IL2- 突變蛋白 ( 其透過 IL2Rβγ 優先傳信 ) 之經遺傳工程處理的 T 細胞獲得中央記憶表型。

為了在活體外和活體內產生持續之細胞因子支持源，吾人對T細胞進行遺傳工程處理，以產生優先活化中間親和性IL2受體之IL2-突變蛋白。使用編碼該經增強之綠色螢光蛋白(eGFP)和天然IL2或IL2-突變蛋白的逆轉錄病毒構建體。該轉導程序係藉由以抗CD3/抗CD28塗層之小珠和天然IL2或IL2-突變蛋白刺激剛分離出之天然OT-1 T細胞起始。在24和48小時將濃縮之逆轉錄病毒載體上清液加入具有該細胞之經重組人纖維連接片段(retronectin)塗層的盤中。轉導後，將使用抗CD3/抗CD28塗層之小珠進行的TCR刺激保持7天，再與IL7和IL15一起培養7天。藉由eGFP表現證實轉導效率，且二種構建體均高於80%(第6A圖)。藉由ELISA檢測分泌出之分子(天然IL2或IL2-突變蛋白)。

當將OT-1 T細胞與可溶性IL2突變蛋白一起培養時可觀察到類似情況，與經工程處理以產生天然IL2之細胞(其主要為效應細胞)相比較，該經工程處理以產生IL2-突變蛋白之細胞具有較高百分比之記憶表型(p＜0.0001)(第6B圖)。再者，與經工程處理以產生天然IL2之細胞相比較，經工程處理以產生IL2-突變蛋白之細胞具有較少之耗竭標記表現(表3)。

綜合這些結果證實以下假設：藉由此新培養方法，當IL2-樣傳信固定且持續時，使用IL2-突變蛋白透過IL2Rβγ來刺激可有利於中央記憶分化。實施例 4. 進行遺傳工程處理以下調 CD25 表現有利於使用天然 IL2 擴增之 T 細胞上的中央記憶表型。

為了阻斷IL2α鏈gen(CD25)之表現，使用編碼eGFP和靶向il2ra 之小髮夾RNA(shRNA)的載體。該轉導程序係藉由以經抗CD3/抗CD28塗層之小珠和天然IL2刺激剛分離出之天然OT-1 T細胞起始。使用3種不同之用於shRNA的構造，基於CD25之表面表現取得可變之剔除效率。使用含有加擾shRNA之慢病毒進行轉導以作為對照組。經過二輪轉導後，將細胞與天然IL2(50 U/ml)一起培養5天。藉由流式細胞術評估使用不同構建體轉導後CD25表面表現的降低程度(第7A圖)。當CD25下調達到較佳之情況時，使用天然IL2刺激5天後之中央記憶細胞的百分比較優(第7B圖)。

下調T細胞上之CD25可提供在培養中使用天然IL2優先刺激中間親和性受體IL2Rβγ之情形。在這些條件下，有利於CD8+T分化成中央記憶樣表型。實施例 5. 當使用天然 IL2 刺激細胞，但同時以添加在培養物中之藥劑阻斷 CD25 交互作用時可獲得中央記憶表型。

在指導天然IL2透過中間親和性受體IL2Rβγ優先傳信的另一種嘗試中，在活體外T細胞活化期間，將藥劑與天然IL2一起加入培養中。該藥劑係以高濃度加入培養中以確保阻斷功效。將OT-1 T細胞與經抗CD3/抗CD28塗層之小珠、50 IU/ml之IL2和10 μg/ml之抗CD25單株抗體(BioLegend選殖株3C7)一起培養。從第0天開始添加抗CD25，並在每二天添加帶有天然IL2之新鮮培養基時更新。使用具有不相關特異性之抗體作為同種型對照組。培養10天後之細胞表型分型揭露出相較於該同種型對照組，在天然IL2活化期間加入抗CD25可增加細胞存活力(第8A圖)和該中央記憶樣群體(第8B圖)(p＜0.0001)。此外，當使用抗體破壞天然IL2與CD25之交互作用時，獲得之耗竭標記的表現較少(表4)。

綜合這些結果表明藉由破壞與CD25之交互作用，指導天然IL2透過IL2Rβγ傳信可將細胞定向為中央記憶表型，此中央記憶表型更適合用於過繼性細胞治療。實施例 6. 接受透過二聚體型受體 IL2Rβγ 活化之 OT-1 T 細胞為多功能性且在活體外顯示出有效之 T 細胞抗原特異性細胞毒性。

為了評估該透過IL2Rβγ優先活化之中央記憶T細胞的功能性能力，進行細胞毒性分析。以同源肽SIINFEKL刺激該依實施例1、3中之描述活化的OT-1細胞16小時，並進行流式細胞計數分析以測定產生之粒酶β。為了評估OT-1 T細胞之滅殺能力，將細胞與經轉導以在表面表現OVA名義抗原(B16-OVA)之B16黑色素瘤細胞以1：1之比例共同培養。使用未經轉導之B16黑色素瘤細胞作對照組。加入IncuCyteCytotox試劑，並在60小時內每二小時評估一次該滅殺能力。由於在對照細胞中未觀察到細胞溶解，該靶細胞之細胞溶解為抗原特異性的。

以透過IL2Rβγ優先傳信之IL2突變蛋白活化的OT-1細胞顯示出離體有效之直接細胞溶解活性，表明當信號係透過IL2Rβγ傳信時，該細胞分化成有效之殺手細胞。(第9A和B圖)實施例 7. 當在黑色素瘤模型中用於 ACT 時，接受透過二聚體型受體 IL2Rβγ 優先活化之 T 細胞顯示出較佳之抗腫瘤活性。

該OT-1模型加上B16/OVA腫瘤細胞株為最常用的模型之一且代表ACT之相關臨床前近似值。C57BL/6受體小鼠在第0天及接種腫瘤細胞接種後10天接受皮下注射1×10⁶ 個表現OVA之黑色素瘤細胞；對小鼠進行亞致死劑量之放射照射(5Gy)。 第1組：未接受治療(對照組)。 第2組：接受以天然IL2活化之OT-1 T細胞(如實施例1)。 第3組：接受以IL2-突變蛋白活化之OT-1 T細胞(如實施例1)。 第4組：接受以天然IL2+IL7+IL15活化之OT-1 T細胞(如實施例2)。

如第10圖中所示，與經天然IL2活化之細胞相比較，使用以IL2-突變蛋白啟動之細胞的ACT在控制腫瘤的生長上較佳。綜合這些結果表明，藉由IL2-突變蛋白活化獲得之最初誘導的具有低耗竭標記表現之記憶表型為用於活體內控制腫瘤的有效組合。實施例 8. 當用於 ACT 時，經工程處理以分泌透過 IL2Rβγ 優先傳信之 IL2- 突變蛋白的 T 細胞顯示出強大之抗腫瘤活性。

在提升ACT之有效性的努力中，我們對T細胞進行遺傳工程處理以產生IL2-突變蛋白。插入該基因以允許T細胞上存在連續且持續之IL2-突變蛋白信號，不僅在活體外，活體內亦然。C57BL/6受體小鼠在第0天和腫瘤細胞接種後第10天接受皮下注射1×10⁶ 個表現OVA之黑色素瘤細胞；對小鼠進行亞致死劑量之放射照射(5Gy)。將動物分成3個治療組且令小鼠在第11天和第15天接受1×10⁶ 個靜脈內轉移之T細胞，該T細胞係來自如下述之OT-1小鼠： 第1組：未接受治療(對照組)。 第2組：接受天然IL2_工程處理之OT-1 T細胞(如實施例3中描述之轉導方案)。 第3組：接受IL2-突變蛋白_工程處理之OT-1 T細胞(如實施例3中描述之轉導方案)。

如第11圖中所示，該接受經工程處理以產生IL2-突變蛋白之OT-1 T細胞的小鼠對已建立之腫瘤控制良好(第11A圖)且具有較高之存活力(第11B圖)。實施例 9. 使用 IL2- 突變蛋白產生 TIL 。

由於ACT治療可使用TIL進行，吾人評估IL2-突變蛋白對TIL擴增的影響。為了研究β/γ二聚體型IL2受體活化在腫瘤浸潤淋巴細胞中的作用，在接種腫瘤細胞後第19至21天，從C57BL/6小鼠分離出MC38腫瘤。將腫瘤經機械分解並在IL2或IL2-突變蛋白之存在下培養14至16天。吾人發現，當在培養條件下使用IL2-突變蛋白時，TIL之擴增程度較高。與此一致地，就ki67標記而言，IL2-突變蛋白增加TIL之增殖率(第12A和B圖)。再者，與對照組相比較，與IL2-突變蛋白在離體一起培養的TIL顯示出中央記憶樣T細胞顯著擴增(第12C圖)。總體而言，這些數據表明IL2-突變蛋白誘導CD8+TIL擴增，有利於中央記憶分化表型。實施例 10. 使用突變體 IL2 擴增之 TIL 為多功能性且顯示出活化和衰竭標記減少。

在擴增前，對以實施例9之方法獲得的TIL進行功能和表型表徵，在抗CD3和抗CD2抗體之存在下，在4小時之期間內對該TIL進行刺激。

吾人發現與使用天然IL2擴增之TIL相比較，使用IL2-突變蛋白擴增之TIL中的抑制性受體PD-1、Lag-3和Tim-3顯著減少(第13A圖)。亦分析TIL之功能。(第13B圖)。綜合來說，這些數據證明IL2-突變蛋白可在不損害TIL功能之情況下可擴增TIL並富集具有中央記憶樣表型之TIL的能力。實施例 11. 使用突變體 IL2 從 TIL 產生 NK 細胞。

為了研究β/γ二聚體型IL2受體之活化對全部擴增之TIL中的NK細胞之比例的作用，在腫瘤細胞接種後第19至21天從C57BL/6小鼠中分離出MC38腫瘤。以機械方式分離腫瘤，並在天然IL2或IL2-突變蛋白之存在下培養14至16天。就總數之比例而言(第14A圖)和就絕對數量(第14B圖)而言，與天然IL2相比較，與IL2-突變蛋白在離體一起培養之TIL顯示出NK細胞顯著擴增。

[第1圖]當與天然IL2或與透過IL2Rβγ優先傳信之IL2突變蛋白一起培養時所取得之T細胞表型的比較。A)培養物之存活率，B)記憶細胞和效應細胞之百分比。

[第2圖]當與較寬之劑量範圍內的天然IL2或與透過中間親和性受體IL2Rβγ優先傳信之IL2突變蛋白一起培養時，T細胞上恢復之表型的比較。A)培養物存活率，B)PD1陽性細胞之百分比，和C)具有中央記憶樣表型之細胞的百分比。

[第3圖]當與天然IL2或與透過中間親和性受體IL2Rβγ優先傳信之IL2突變蛋白一起培養，並結合IL7和IL15細胞因子時，T細胞上恢復之表型的比較。A)培養物存活率，B)記憶細胞和效應細胞之百分比。

[第4圖]當與較寬之劑量範圍內的天然IL2或與透過中間親和性受體IL2Rβγ優先傳信之IL2突變蛋白一起培養，並結合IL7和IL15細胞因子時，T細胞上恢復之表型的比較。A)培養物存活率，B)PD1陽性細胞之百分比，和C)具有中央記憶樣表型之細胞的百分比。

[第5圖]當僅使用IL2或IL2-突變蛋白刺激，或使用IL2或IL2-突變蛋白與IL7和IL15之組合刺激時，T細胞上恢復之表型的比較。

[第6A圖]顯示eGFP陽性細胞之百分比的直方圖，其測量T細胞中IL2或IL2突變蛋白之轉導效率。

[第6B圖]當T淋巴細胞經轉導產生天然IL2或IL2突變蛋白時，從培養物中恢復之具有中央記憶和效應記憶表型的細胞之百分比的比較。

[第7A圖]顯示以不同shRNA構建體轉導後CD25下調之效率的直方圖。

[第7B圖]當T淋巴細胞之CD25表現降低時，具有中央記憶和效應記憶表型之細胞的百分比。

[第8圖]較當在CD8+T細胞上採用抗CD25抗體時，提供IL2Rβγ偏倚之IL2傳信的功效。A)培養物存活率和B)記憶和效應細胞之百分比。

[第9圖]CD8+T細胞與單獨之IL2、IL2+ IL15+IL7、單獨之IL2-突變蛋白或IL2-突變蛋白+IL15+IL7的功能能力。A)由使用肽SIINFEKL再刺激之OT-1 CD8+T細胞產生的粒酶β，B)針對與單獨之IL2、IL2-突變蛋白或與IL7和IL15組合之IL2、IL2-突變蛋白一起培養的OT-1細胞之B16-OVA細胞的腫瘤滅殺力。

[第10圖]接受與天然IL2或IL2突變蛋白一起培養之OT-1細胞的MB16OVA腫瘤攜帶動物中的腫瘤體積測量。

[第11圖]經轉導以產生天然IL2或透過中間親和性受體IL2Rβγ優先傳信之IL2突變蛋白的OT-1 T細胞之活體內抗腫瘤功效的比較。A)腫瘤體積，B)隨時間推移之存活率。

[第12圖]CD8+TIL與IL2或IL2突變蛋白一起培養之前和之後的表徵：A)擴增量，B)TIL之Ki-67表現百分比，和C)天然T細胞(CD62L+CD44-)、中央記憶(CD62L+CD44+)和(CD62L-CD44+)之分佈。

[第13圖]CD8+TIL與IL2或IL2突變蛋白一起培養之前和之後的表徵：A)抑制性標記之表現百分比，和B)IFNγ、TNFα和粒酶β。

[第14圖]與IL2或IL2突變蛋白一起培養之TIL中之NK細胞的擴增：A)NK細胞之百分比，和B)NK細胞之數量。

Claims (30)

1. 一種用於分化和擴增可用於過繼性細胞轉移治療之具有中央記憶表型的T淋巴細胞和天然殺手(NK)細胞之方法，該方法包含3個階段： (i)從個體提取淋巴樣細胞， (ii)在活體外擴增和分化已經進一步之遺傳工程處理的T淋巴細胞和NK細胞且同時透過中間親和性IL2受體(IL2Rβγ)以誘導優先傳信，和 (iii)將經活化之細胞轉移至罹患癌症之該個體。
2. 如請求項1之方法，其中該透過中間親和性IL2受體(IL2Rβγ)以誘導優先傳信且同時擴增該淋巴樣細胞之策略係選自包含下列之群組： - 培養該淋巴樣細胞與可溶性IL2突變蛋白，該可溶性IL2突變蛋白與該中間親和性IL2R(IL2Rβγ)優先交互作用並透過其傳信， - 將該淋巴樣細胞進行遺傳工程處理以分泌IL2突變蛋白，該IL2突變蛋白與該中間親和性IL2R優先交互作用並透過其傳信， - 在天然IL2和阻斷IL2-IL2Rα交互作用之藥劑的存在下培養T淋巴細胞和NK細胞， - 在天然IL2之存在下培養T淋巴細胞和NK細胞並將該等細胞進行遺傳工程處理以分泌阻斷該IL2-IL2Rα交互作用之可溶性蛋白， - 在天然IL2之存在下培養T淋巴細胞和NK細胞並將該等細胞進行遺傳工程處理以減少該IL2Rα受體次單位在細胞表面之表現， - 在天然IL2之存在下培養T淋巴細胞和NK細胞並將該等細胞進行遺傳工程處理以增加該中間親和性IL2受體在細胞表面之表現。
3. 如請求項2之方法，其中該IL2突變蛋白係選自由下列所組成之群組： - SEQ ID NO.1， - SEQ ID NO.2， - SEQ ID NO.3， - SEQ ID NO.4， - SEQ ID NO.5， - SEQ ID NO.6，和 - SEQ ID NO.7。
4. 如請求項2之方法，其中該阻斷IL2-IL2Rα交互作用之藥劑係選自由下列所組成之群組： - 與IL2Rα或IL2結合之抗體或抗體片段， - 與IL2Rα或IL2結合之肽或化學上界定之小分子， - IL2Rα或其經修飾之變體的可溶形式。
5. 如請求項1之方法，其中該階段(iii)可在相同供體或不同供體中進行。
6. 如請求項2之方法，其中該階段(ii)中藉由中間親和性IL2受體之傳信可在細胞培養的不同時刻發生，或者該傳信可保持在活體外和活體內。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其係用於延長該經轉移之細胞的持久性及較高之活體外和活體內抗腫瘤功效。
8. 如請求項1至6中任一項之方法，其係與選自包含下列群組的其他細胞因子組合： - IL12， - IL17， - IL15，和 - IL21。
9. 如請求項1之方法，其中受該方法處理之淋巴樣細胞可為下列任一者：T細胞之混合物；純化之CD4或CD8 T細胞；NK細胞；NKT細胞。
10. 如請求項1之方法，其中該T淋巴細胞和NK細胞可在階段(i)中從外周血單核細胞、腫瘤引流淋巴結或腫瘤浸潤物取得。
11. 如請求項1之方法，其中該方法之淋巴樣細胞可業已經進一步之工程處理以表現CAR；表現具有所需特異性之TCR；在細胞膜中表現所欲之其他受體；分泌不同的細胞因子或所欲之可溶性蛋白。
12. 一種如請求項1至11中任一項之方法於過繼性細胞轉移治療之用途。
13. 如請求項9之用途，其係用於取得腫瘤浸潤淋巴細胞或嵌合型抗原受體T細胞。
14. 如請求項11或12之用途，其係用於治療癌症。
15. 一種細胞，其係藉由如請求項1至11中任一項之方法取得。
16. 一種用於活體外富集和擴增具有中央記憶表型之淋巴細胞之方法，其包含： (a)從個體取得淋巴細胞群， (b)在活化β/γ二聚體型IL2受體之條件下培養該細胞以擴增該淋巴細胞。
17. 如請求項16之方法，其中該步驟(b)係藉由使用至少一種IL2突變蛋白實施。
18. 如請求項16之方法，其中該步驟(b)係藉由調節該IL2受體之至少一種次單位的表現實施。
19. 如請求項18之方法，其中該IL2受體之次單位為α(CD25)、β或γ次單位。
20. 如請求項16之方法，其中該步驟(b)係藉由抑制IL2受體與其同源蛋白之交互作用實施。
21. 如請求項20之方法，其中IL2受體與其同源蛋白之交互作用的抑制係藉由下調該IL2受體之α次單位或藉由上調β和γ次單位發生。
22. 如請求項20之方法，其中IL2受體與其同源蛋白之交互作用的抑制係藉由培育該細胞與抗CD25抗體發生。
23. 如請求項16之方法，其中該步驟(b)係藉由以編碼突變體IL2序列之表現和分泌的核酸轉導淋巴細胞實施。
24. 一種細胞組成物，該細胞係藉由如請求項16至23中任一項之方法取得。
25. 一種治療有需要癌症治療之個體的癌症之方法，該方法包含投予具有中央記憶表型之淋巴細胞，該方法包含： a.從個體獲得淋巴細胞群； b.藉由活化該淋巴細胞之β/γ二聚體型IL2受體以擴增該淋巴細胞群；和 c.對該個體投予治療有效劑量之來自步驟(b)的淋巴細胞。
26. 如請求項25之方法，其中活化該β/γ二聚體型IL2受體包含培育該淋巴細胞與突變體IL2。
27. 如請求項25之方法，其中活化該β/γ二聚體型IL2受體包含將編碼突變體IL2之核苷酸序列引入該淋巴細胞。
28. 如請求項25之方法，其中活化該β/γ二聚體型IL2受體包含引入核苷酸序列以上調該淋巴細胞之IL2受體的β/γ次單位之表現並培育該淋巴細胞與野生型IL2。
29. 如請求項25之方法，其中活化該β/γ二聚體型IL2受體包含引入核苷酸序列以下調該淋巴細胞之IL2受體的α次單位之表現並培育該淋巴細胞與野生型IL2。
30. 如請求項25之方法，其中活化該β/γ二聚體型IL2受體包含培育該淋巴細胞與野生型IL2和抗CD25抗體。

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