TW202039587A - 供合成胜肽免疫原作為免疫刺激劑的人工混雜t輔助細胞抗原決定位 - Google Patents

Abstract

本發明是關於設計用以提供目標抗原部位之最佳免疫原性的新穎、混雜且人工的T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)。目標抗原部位可包括B細胞抗原決定位、CTL抗原決定位、胜肽半抗原(peptide hapten)、非胜肽半抗原或任何其免疫反應類似物。當揭露的Th抗原決定位於胜肽免疫原結構中被共價連接至目標抗原部位時，可引發針對目標抗原部位之強烈B細胞抗體反應或效應T細胞反應。Th抗原決定位本身為非免疫原性的，即如果有的話，很少利用胜肽免疫原結構所產生的抗體是針對Th抗原決定位，因此允許針對目標抗原部位的非常集中的免疫反應。混雜人工的Th抗原決定位提供有效且安全的胜肽免疫原，其在投予後不產生炎症性、抗自身、細胞介導的免疫反應。

Description

供合成胜肽免疫原作為免疫刺激劑的人工混雜T輔助細胞抗原決定位

本發明是關於設計用以提供目標抗原部位之最佳免疫原性的新穎、混雜且人工的T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)。

免疫反應需要抗原呈現細胞和T輔助(Th)細胞之間的協同交互作用。有效抗體反應的引發需要抗原呈現細胞辨識受試免疫原的目標抗原部位，且T輔助細胞辨識T輔助細胞抗原決定位。通常，受試免疫原上的T輔助細胞抗原決定位有別於其B細胞抗原決定位或相關效應T細胞(例如細胞毒性T淋巴球或CTL)抗原決定位。B細胞和相關效應T細胞抗原決定位是位於B細胞和相關細胞所辨識之欲求目標免疫原上的位點，其導致針對欲求目標位點之抗體或細胞因子的產生。目標的天然構型決定了抗體或相關效應T細胞直接結合的位點。Th細胞反應的引發需要Th細胞受體以辨識位於抗原呈現細胞膜上的複合物，此複合物是在目標蛋白質之經加工的胜肽片段和相關第2類主要組織相容性複合體(MHC)之間形成。因此，Th細胞反應需要目標蛋白質的胜肽加工和三向識別(three-way recognition)。難以定義三部分複合物，原因在於1)關鍵的第2類MHC接觸殘基在不同的MHC結合胜肽(Th抗原決定位)內被可變地定位；2)不同的MHC結合胜肽具有可變的長度和不同的胺基酸序列；3)第2類MHC分子可高度多樣化，此取決於宿主的遺傳構成。針對特定Th抗原決定位的免疫反應部分地是由宿主的MHC基因所決定，且Th抗原決定位的反應性在群體之個體之間有所不同。難以鑑定跨物種和單一物種內之個體的具有反應性的Th抗原決定位(即混雜的Th抗原決定位)。

T細胞辨識的每個組成步驟都需要多個因子，例如透過抗原呈現細胞的適當胜肽加工、透過遺傳決定的第2類MHC分子呈現胜肽，以及透過位於Th細胞上之受體辨識MHC分子和胜肽複合物。對於用以提供廣泛反應性之混雜Th抗原決定位辨識的要求可能難以確定。

顯然，為了誘導針對免疫反應之抗體和相關細胞因子，免疫原必須包含B細胞抗原決定位/效應T細胞抗原決定位和Th細胞抗原決定位。通常，載體蛋白(例如鎖孔帽貝血藍素；KLH)與目標免疫原偶合以提供Th反應，用以增加目標免疫原的免疫原性。然而，使用大載體蛋白來增強目標免疫原的免疫原性存在許多缺點。特別是難以製備明確、安全且有效的胜肽–載體蛋白偶合物，原因在於(a)化學偶合涉及可導致大小和組成異質性的反應，例如與戊二醛的偶合(Borras-Cuesta et al., Eur J Immunol, 1987; 17: 1213-1215)；(b)載體蛋白引入了非欲求免疫反應的可能性，例如過敏和自體免疫反應(Bixler et al., WO 89/06974)；(c)大的胜肽–載體蛋白引發無關的免疫反應，其主要是錯誤地針對載體蛋白而不是目標位點(Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 4249-4253)；且(d)載體蛋白還在先前利用包含相同載體蛋白之免疫原免疫的宿主中引入表位抑制的可能性。當宿主隨後利用另一種免疫原免疫時，其中相同的載體蛋白與不同的半抗原偶聯，對於載體蛋白而言所得到的免疫反應是增強的，但對半抗原而言所得到的免疫反應是抑制的(Schutze et al., J Immunol, 1985; 135: 2319-2322)。

為了避免上述風險，期望在不使用傳統載體蛋白的情況下引發T細胞輔助。

本揭露提供混雜人工T輔助細胞(Th)抗原決定位，用以刺激針對目標抗原的功能性定點抗體，以用於預防和治療用途。本揭露也關於含有此Th抗原決定位的胜肽免疫原結構、含有此Th抗原決定位的組成物、製備和使用此Th抗原決定位的方法，以及利用含有此Th抗原決定位的胜肽免疫原結構所產生的抗體。

揭露的人工T輔助細胞(Th)抗原決定位可透過任選的間隔子連接至B細胞抗原決定位及/或效應T細胞抗原決定位(“目標抗原部位”)以產生胜肽免疫原結構。揭露的Th抗原決定位賦予胜肽免疫原誘發強T輔助細胞介導的免疫反應的能力，產生高水平的抗體及/或針對目標抗原部位的細胞反應。利用揭露的人工Th抗原決定位(此人工Th抗原決定位是專門設計用於改善目標抗原部位的免疫原性)，揭露的胜肽免疫原結構提供胜肽免疫原中大載體蛋白和病原體衍生的T輔助細胞位點的有利替代。含有揭露的Th抗原決定位的相對短的胜肽免疫原結構可引發針對特定目標抗原部位的高水平抗體及/或效應細胞相關細胞因子，而不引起針對Th抗原決定位的顯著炎症反應或免疫反應。

可以透過以下方式調節由胜肽免疫原結構引起的免疫反應(包括抗體效價、C_max 、抗體產生的開始、反應的持續時間等)：(a)選擇與B細胞抗原決定位化學連接的Th抗原決定位，(b) B細胞抗原決定位的長度，(c)在含有胜肽免疫原結構之製劑中使用的佐劑，及/或(d)給藥方案，其包括每次免疫的劑量以及供每次免疫之初次免疫和加強免疫的時間點。因此，可以使用揭露的Th抗原決定位設計針對目標抗原部位的特異性免疫反應，其有助於訂製針對任何患者或受試者之個體特徵的個人化醫療。

可利用以下分子式代表含有本發明揭露的人工Th抗原決定位的胜肽免疫原結構： (A)_n -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 {(A)_n -(Th)_p -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_p -(A)_n -X}_m 其中： 每個A獨立地為胺基酸； 每個B獨立地為異源性間隔子； 每個Th獨立地為人工Th抗原決定位； 目標抗原部位為B細胞抗原決定位、CTL抗原決定位、胜肽半抗原、非胜肽半抗原或其免疫反應類似物； X為胺基酸、α-COOH或α-CONH₂ ； n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為1、2、3或4； o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，以及 p為0、1、2、3或4。

胜肽半抗原作為目標抗原部位的例子是β-類澱粉蛋白(Aβ)的胺基酸1-14 (Aβ_1-14 ) (SEQ ID NO: 56)。非胜肽半抗原的例子包括腫瘤相關醣類抗原(TACA)或小分子藥物。

本揭露還關於包含含有人工Th抗原決定位之胜肽免疫原結構的組成物。此種組成物能夠在接受免疫接種的宿主中引發針對欲求目標抗原部位的抗體反應。目標抗原部位可以衍生自病原性生物體、通常是非免疫原性的自身抗原，或腫瘤相關靶標。

揭露的組成物可用於許多不同的醫學和獸醫學應用，包括提供傳染病保護性免疫的疫苗、用於治療由正常生理過程失常所引起的疾病的免疫療法、用於治療癌症的免疫療法，以及在正常生理過程中和改變正常生理過程中之用於期望干預的藥劑。

可以與本發明Th抗原決定位共價連接的一些目標抗原包括以下部分：用於治療阿茲海默症的β-類澱粉蛋白(Aβ)、用於治療帕金森氏症的α-突觸核蛋白(α-Syn)、用於治療過敏性疾病的膜鑲嵌型IgE之細胞外膜近側功能區塊(或IgE EMPD)、用於治療包括阿茲海默症在內的tau蛋白病的Tau和用於治療異位性皮膚炎的介白素-31 (IL-31)，僅舉幾例。更具體地，目標抗原包括Aβ_1‑14 (如美國第9,102,752號專利所述)、α-Syn_111-132 (如第PCT/US2018/037938號國際PCT申請案所述)、IgE EMPD_1-39 (如第PCT/US2017/069174號國際PCT申請案所述)、Tau_379-408 (如第PCT/US2018/057840號國際PCT申請案所述)和IL-31_97-144 (如第PCT/US2018/065025號國際PCT申請案所述)以及在表3A和表3B中描述的那些目標抗原部位。

本揭露還提供透過向有需要的受試者投予胜肽免疫原結構(包含揭露的人工Th抗原決定位和抗原呈現抗原決定位)以預防及/或治療受試者的疾病或病症的方法。在一些實施例中，胜肽免疫原結構在受試者中產生免疫原性炎症反應，其比陽性對照組的免疫原性炎症反應低至少約3倍，如實施例12中所示。

本揭露還關於利用含有揭露的人工Th抗原決定位的胜肽免疫原結構產生的抗體。由胜肽免疫原結構產生的抗體對目標抗原部位具有高度特異性，而非人工Th抗原決定位。

參考文獻 本申請中引用的每個專利、公開案和非專利文獻在此透過引用整體併入本文，如同其各自透過引用單獨地併入。 1.  BORRAS-CUESTA, F., et al., “Engineering of immunogenic peptides by co‐linear synthesis of determinants recognized by B and T cells”,Eur. J. Immunol., 17:1213-1215 (1987). 2.  CEASE, K.B., et al., “Helper T-cell antigenic site identification in the acquired immunodeficiency syndrome virus gp120 envelope protein and induction of immunity in mice to the native protein using a 16-residue synthetic peptide”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4249-4253 (1987). 3.  CHIANG, H-L., et al., “A novel synthetic bipartite carrier protein for developing glycotope-based vaccines”, Vaccine, 30(52):7573-7581 (2012). 4.  DANISHEFSKY, S.J., et al.,“Development of Globo-H Cancer Vaccine”, Acc. Chem. Res.48(3):643-652 (2015). 5.  HUANG, C.Y., et al., “Carbohydrate microarray for profiling the antibodies interacting with Globo H tumor antigen”,Proc. Natl. Acad. Sci. 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本揭露提供混雜人工T輔助細胞(Th)抗原決定位，用以刺激針對目標抗原的功能性定點抗體，以用於預防和治療用途。本揭露也關於含有此Th抗原決定位的胜肽免疫原結構、含有此Th抗原決定位的組成物、製備和使用此Th抗原決定位的方法，以及利用含有此Th抗原決定位的胜肽免疫原結構所產生的抗體。

揭露的人工T輔助細胞(Th)抗原決定位可透過任選的間隔子連接至B細胞抗原決定位及/或效應T細胞抗原決定位(例如，細胞毒性T細胞；CTL) (“目標抗原部位”)以產生胜肽免疫原結構。揭露的Th抗原決定位賦予胜肽免疫原誘發強T輔助細胞介導的免疫反應的能力，產生高水平的抗體及/或針對目標抗原部位的細胞反應(例如，細胞因子)，以獲得治療效果。揭露的胜肽免疫原結構提供胜肽免疫原中大載體蛋白和病原體衍生的T輔助細胞位點的有利替代，其中揭露的人工Th抗原決定位專門設計用於改善目標抗原部位的免疫原性。含有揭露的Th抗原決定位的相對短的胜肽免疫原結構可引發針對特定目標抗原部位的高水平抗體及/或效應細胞相關細胞因子，而不引起針對Th抗原決定位的顯著炎症反應或免疫反應。

可以透過以下方式調節由胜肽免疫原結構引起的免疫反應(包括抗體效價、C_max 、抗體產生的開始、反應的持續時間等)：(a)選擇與B細胞抗原決定位化學連接的Th抗原決定位，(b) B細胞抗原決定位的長度，(c)在含有胜肽免疫原結構之製劑中使用的佐劑，及/或(d)給藥方案，其包括每次免疫的劑量以及供每次免疫之初次免疫和加強免疫的時間點。因此，可以使用揭露的Th抗原決定位設計針對目標抗原部位的特異性免疫反應，其有助於訂製針對任何患者或受試者之個體特徵的個人化醫療。

揭露的含有人工Th抗原決定位的胜肽免疫原結構能在接受免疫接種的宿主中引發針對欲求目標抗原部位的抗體及/或細胞因子反應。目標抗原部位可以是特定蛋白質、癌症抗原相關醣類、小分子藥物化合物或來自任何目標胜肽或蛋白質的任何胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露描述可用以提供胜肽免疫原的混雜人工Th抗原決定位，此胜肽免疫原可引發抗體，抗體靶向類澱粉蛋白β (Aβ)、口蹄疫(FMD)衣殼蛋白、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)的醣蛋白、促黃體激素釋放激素(LHRH)和任何其他胜肽或蛋白質序列。

在某些實施例中，目標抗原部位取自通常為非免疫原性的自身抗原或腫瘤相關新抗原靶標(例如Aβ、Tau、α-突觸核蛋白、二肽蛋白質、IgE EMPD、IL-6、CGRP、澱粉素(Amylin)、IL-31、新抗原等)。在表3A中顯示自身抗原和腫瘤相關新抗原位點的非限制性代表性序列。在其他實施例中，目標抗原部位取自病原性生物體(例如FMDV、PRRSV、CSFV、HIV、HSV等)。表3B顯示病原性抗原決定部位的非限制性代表性序列。

本發明胜肽或目標抗原部位可用於醫學和獸醫學應用。例如，含有揭露的人工Th抗原決定位的胜肽免疫原結構可用於疫苗組成物中以提供對傳染病或神經退化性疾病的保護性免疫、或用於治療由正常生理過程失常所引起的疾病的醫藥組成物、用於治療癌症、第二型糖尿病的免疫療法，或作為干預正常生理過程的藥劑。通則

本文使用的章節標題僅用於組織的目的，不應被理解為限制所述主題。本申請中引用的所有參考文獻或參考文獻的部分出於任何目的透過引用明確地將整體併入本文。

除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻透過引用整體併入本文。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。胜肽免疫原結構

本文使用術語“胜肽免疫原”或“胜肽免疫原結構”是指包含透過共價連接(例如，常規胜肽鍵或硫酯）在有或無異源性間隔子的狀況下共價連接至目標抗原部位之人工Th抗原決定位的分子，藉此形成單一較大的胜肽。通常，胜肽免疫原結構含有(a)異源性混雜人工Th抗原決定位；(b)目標抗原部位，例如B細胞抗原決定位或效應T細胞抗原決定位(例如CTL)；以及(c)任選的異源性間隔子。

在利用胜肽免疫原免疫接種之後在動物體內，在胜肽免疫原中呈現混雜人工Th抗原決定位可誘發強T輔助細胞介導的免疫反應和針對目標抗原部位的高水平的抗體。揭露的胜肽免疫原結構提供胜肽免疫原中大載體蛋白和病原體衍生的T輔助細胞位點的有利替代，其中揭露的人工Th抗原決定位專門設計用於改善目標抗原部位的免疫原性。含有揭露的Th抗原決定位的相對短的胜肽免疫原結構可引發針對特定目標抗原部位的高水平抗體及/或效應細胞相關細胞因子，而不引起針對Th抗原決定位的顯著炎症反應或免疫反應。

可利用以下分子式代表含有本發明揭露的人工Th抗原決定位的胜肽免疫原結構： (A)_n -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 {(A)_n -(Th)_p -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_p -(A)_n -X}_m 其中： 每個A獨立地為胺基酸； 每個B獨立地為異源性間隔子； 每個Th獨立地為人工Th抗原決定位； 目標抗原部位為B細胞抗原決定位、CTL抗原決定位、胜肽半抗原、非胜肽半抗原或其免疫反應類似物； X為胺基酸、α-COOH或α-CONH₂ ； n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為1、2、3或4； o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，以及 p 為 0、1、2、3或4。

本揭露的胜肽免疫原可包含約20至約100個胺基酸。在一些實施例中，胜肽免疫原結構含有約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95或約100個胺基酸殘基。

揭露的胜肽免疫原結構的各種組成描述如下。A– 胺基酸

本揭露之免疫原性胜肽中的每個A獨立地為異源性胺基酸。

本文使用術語“異源性”是指並非目標抗原部位(例如，B細胞抗原決定位)野生型胺基酸序列之部分或與其同源的胺基酸序列。因此，異源性胺基酸序列A含有在目標抗原部位的蛋白質或胜肽中非天然存在的胺基酸序列。由於組分A的序列對目標抗原部位而言是異源性的，當組分A與目標抗原部位共價連接時，目標抗原部位的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸。

在一些實施例中，每個A獨立地為非天然存在或天然存在的胺基酸。

天然存在的胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。

非天然存在的胺基酸包括，但不限於，ε-N離胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-胺基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、胺基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca; 6-胺基己酸)、巰基丙酸(MPA)、3-硝基酪胺酸、焦麩胺酸等。

在一些實施例中，n為0表明在分子式中的該位置不添加胺基酸。在其他實施例中，n為1並且選自任何天然或非天然的胺基酸。在某些實施例中，n大於1並且每個A獨立地是相同的胺基酸。在其他實施例中，n大於1並且每個A獨立地是不同的胺基酸。B– 任選的異源性間隔子

本揭露免疫原性胜肽中的每個B是任選的異源間隔子。組分B任選的異源性間隔子獨立地是胺基酸、‑NHCH(X)CH₂ SCH₂ CO-、-NHCH(X)CH₂ SCH₂ CO(εN)Lys-、-NHCH(X)CH₂ S-琥珀醯亞胺基 (εN)Lys-、-NHCH(X)CH₂ S-(琥珀醯亞胺基)-及/或其任意組合。間隔子可含有一個或多個天然或非天然存在的胺基酸殘基，如上文對組分A所描述。

如上所述，術語“異源性”是指並非目標抗原部位(例如，B細胞抗原決定位)野生型胺基酸序列之部分或與其同源的胺基酸序列。因此，當間隔子是胺基酸時，間隔子含有在目標抗原部位的蛋白質或胜肽中非天然存在的胺基酸序列。由於組分B的序列對目標抗原部位而言是異源性的，當組分B與目標抗原部位共價連接時，目標抗原部位的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸。

間隔子可以是柔性鉸鏈間隔子，以增強Th抗原決定位和目標抗原部位的分離。在一些實施例中，柔性鉸鏈序列可以富含脯胺酸。在某些實施例中，柔性鉸鏈具有序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)，其模擬在免疫球蛋白重鏈中發現的柔性鉸鏈區域。其中的Xaa可以是任何胺基酸。在一些實施例中，Xaa是天門冬胺酸。在一些實施例中，由間隔子提供的構象分離可以允許呈現的胜肽免疫原與適當的Th細胞和B細胞之間更有效的交互作用。可以增強對Th抗原決定位的免疫反應以提供改善的免疫反應性。

當o>1時，每個B獨立地相同或不同。在一些實施例中，B為Gly-Gly、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)、εNLys、εNLys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)、Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)、Lys-Lys-Lys、-NHCH(X)CH₂ SCH₂ CO-、-NHCH(X)CH₂ SCH₂ CO(εNLys)-、-NHCH(X)CH₂ S-琥珀醯亞胺基-εNLys-或-NHCH(X)CH₂ S-(琥珀醯亞胺基)-及/或其任意組合。例示性的異源性間隔子顯示在表2中。目標抗原部位

目標抗原部位可包括來自任何目標胜肽或蛋白質的任何胺基酸序列，包括外源或自身胜肽或蛋白質、B細胞抗原決定位、CTL抗原決定位、胜肽半抗原、非胜肽半抗原或其免疫反應類似物。目標抗原部位可以是特定蛋白質、癌症抗原相關醣類、小分子藥物化合物或來自任何目標胜肽或蛋白質的任何胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露描述可用以提供胜肽免疫原的混雜人工Th抗原決定位，此胜肽免疫原可引發抗體，抗體靶向類澱粉蛋白β (Aβ)、口蹄疫(FMD)衣殼蛋白、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)的醣蛋白、促黃體激素釋放激素(LHRH)和任何其他胜肽或蛋白質序列。

在某些實施例中，目標抗原部位取自通常為非免疫原性的自身抗原或腫瘤相關新抗原靶標(例如Aβ、Tau、α-突觸核蛋白、二肽蛋白質、IgE EMPD、IL-6、CGRP、澱粉素、IL-31、新抗原等)。在表3A中顯示自身抗原和腫瘤相關新抗原位點的非限制性代表性序列。在其他實施例中，目標抗原部位取自病原性生物體(例如FMDV、PRRSV、CSFV、HIV、HSV等)。表3B顯示病原性抗原決定部位的非限制性代表性序列。

在具體實施例中，目標抗原部位衍生自促黃體激素釋放激素(LHRH) (例如，美國第6,025,468、6,228,987、6,559,282號專利和美國第US2017/0216418號公開案)；類澱粉蛋白β (Aβ) (例如，美國第6,906,169、7,951,909、8,232,373和9,102,752號專利)；口蹄疫衣殼蛋白(例如，美國第6,048,538、6,107,021號專利和美國第2015/0306203號公開案)；用以預防和治療HIV感染的HIV病毒顆粒抗原決定位(例如，美國第5,912,176、5,961,976和6,090,388號專利)；來自豬第二型環狀病毒(PCV2)的衣殼蛋白(例如，美國第2013/0236487號公開案)、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)的醣蛋白(例如，美國第2014/0335118號公開案)、IgE (例如，美國第7,648,701和6,811,782號專利)、α-突觸核蛋白(α-Syn) (第PCT/US2018/037938號國際PCT申請案)、膜鑲嵌型IgE之細胞外膜近側功能區塊(或IgE EMPD) (第PCT/US2017/069174號國際PCT申請案)、Tau (第PCT/US2018/057840號國際PCT申請案)和介白素-31 (IL-31) (第PCT/US2018/065025號國際PCT申請案)、用以預防瘧疾之瘧原蟲的CS抗原；用以預防和治療動脈硬化的CETP；用以預防和治療第二型糖尿病的IAPP (澱粉素)，以及任何其他胜肽或蛋白質序列的部分。所有專利和專利公開案均透過引用整體併入本文。

在其他實施例中，目標抗原部位是非胜肽半抗原，包括腫瘤相關醣類抗原(TACA)和小分子藥物化合物。TACA的例子包括GD3、GD2、Globo-H、GM2、Fucosyl GM1、GM2、PSA、Le^y 、Le^x 、SLe^x 、SLe^a 、Tn、TF和STn，如在實施例11和第16和17圖中進一步討論。Th–T 輔助細胞抗原決定位

於胜肽免疫原結構中的混雜人工T輔助細胞(Th)抗原決定位可增強目標抗原部位的免疫原性，其透過合理設計促進針對優化目標B細胞抗原決定位之特異性高效價抗體的產生。

本文使用術語“混雜的”是指具有跨越物種和跨越單一物種之個體的反應性的Th抗原決定位。

與Th抗原決定位結合使用的術語“人工”是指在自然界中未發現的胺基酸序列。因此，本揭露人工Th抗原決定位具有對目標抗原部位而言是異源性的序列。如上所述，術語“異源性的”是指衍生自並非目標抗原部位野生型序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，異源性Th抗原決定位為衍生自非天然存在於目標抗原部位之胺基酸序列的Th抗原決定位。因為Th抗原決定位對目標抗原部位而言是異源性的，當異源性Th抗原決定位共價連接至目標抗原部位時，目標抗原部位的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸。

Th抗原決定位可具有衍生自任何物種(例如人類、豬、牛、狗、大鼠、小鼠、天竺鼠等)的胺基酸序列。Th抗原決定位還可具有針對多種物種第2類MHC分子的混雜結合基序。在某些實施例中，Th抗原決定位包含多個混雜的第2類MHC結合基序，以允許T輔助細胞的最大活化，從而導致免疫反應的啟動和調節。較佳的Th抗原決定位本身為非免疫原性的(即如果有的話，很少利用胜肽免疫原結構所產生的抗體是針對Th抗原決定位)，因此允許針對目標抗原部位的非常集中的免疫反應。

Th抗原決定位的大小範圍可為約15至約50個胺基酸殘基。在一些實施例中，Th抗原決定位可具有約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50個胺基酸殘基。Th抗原決定位可共享共同的結構特徵和特定的界標序列。在一些實施例中，Th抗原決定位具有兩性螺旋，即α-螺旋結構，其具有疏水性胺基酸殘基佔據螺旋的一面，而帶電和極性殘基佔據周圍各面。

WO 1999/066957的Th抗原決定位和公開內容以及相對應的美國第6,713,301號專利透過引用整體併入本文。

混雜的Th抗原決定位可以有效地增強免疫原性差的胜肽。精心設計的混雜Th/B細胞抗原決定位嵌合胜肽可以在遺傳多樣性群體的大多數成員中引發具有針對B細胞位點的抗體反應的Th反應。在一些實施例中，可透過將胜肽-載體共價連接至充分表徵的混雜Th抗原決定位來將Th細胞提供給目標抗原胜肽。

混雜Th抗原決定位可含有額外的一級胺基酸模式。在一些實施例中，混雜Th抗原決定位可含有Rothbard序列，其中混雜Th抗原決定位含有一個帶電殘基(例如-Gly-)，然後是2至3個疏水性殘基，接著是一個帶電或極性殘基(Rothbard and Taylor, EMBO J, 1988; 7:93-101)。混雜Th抗原決定位遵守1、4、5、8規則，其中帶正電的殘基在第四、第五和第八位置跟著疏水性殘基，此與兩性螺旋1、4、5和8位置位於同一面的情形一致。在一些實施例中，疏水性和帶電和極性胺基酸的1、4、5、8模式可以在單個Th抗原決定位內重複。在一些實施例中，混雜T細胞抗原決定位可含有Rothbard序列或遵守1、4、5、8規則的抗原決定位中的至少一種。在其他實施例中，Th抗原決定位含有一個以上的Rothbard序列。

衍生自病原菌的混雜Th抗原決定位包括，但不限於：B型肝炎表面Th細胞抗原決定位(HBsAg Th)、B型肝炎核心抗原Th細胞抗原決定位(HBc Th)、百日咳毒素Th細胞抗原決定位(PT Th)、破傷風毒素Th細胞抗原決定位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白Th細胞抗原決定位(MVF Th)、砂眼衣原體主要外膜蛋白Th細胞抗原決定位(CT Th)、白喉毒素Th細胞抗原決定位(DT Th)、惡性瘧原蟲環子孢子蛋白Th細胞抗原決定位(PF Th)、曼氏血吸蟲磷酸丙糖異構酶Th細胞抗原決定位(SM Th)和大腸桿菌TraT Th細胞抗原決定位(TraT Th)、破傷風梭菌、百日咳桿菌、霍亂毒素、流行性感冒病毒MP1、流行性感冒病毒NSP1、Epstein-Barr病毒(EBV)、人類巨細胞病毒(HCMV)。表1顯示本揭露中使用的Th抗原決定位的實例。

在一些實施例中，本揭露Th抗原決定位可以是包含含有相似胺基酸序列之胜肽的混合物的組合Th抗原決定位。結構性合成抗原庫(SSALs)，也稱為組合人工Th抗原決定位，包含多個Th抗原決定位，以其胺基酸序列圍繞著一在特定位置具取代物之不變殘基的結構性架構而組成。透過保留相對不變的殘基和改變其他殘基來確定SSAL抗原決定位的序列，以提供對多種MHC限制性元素的辨識。SSAL抗原決定位的序列可以透過比對混雜Th的一級胺基酸序列、選擇和保留負責Th胜肽的獨特結構的殘基作為骨架，並根據已知的MHC限制性元素改變剩餘殘基來確定。具有MHC限制性元素之較佳胺基酸的不變和可變位置可用於獲得MHC結合基序，其可用於設計Th抗原決定位的SSAL。

作為組合序列呈現的異源性Th抗原決定位胜肽包含基於此特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽框架內的特定位置處表示的胺基酸殘基的混合物。在一些實施例中，Th抗原決定位文庫序列被設計為維持混雜Th抗原決定位的結構基序並適應對更廣範圍的單倍型的反應性。在一些實施例中，SSAL的成員可以是退化的Th抗原決定位SSAL1 Th1，其是以取自麻疹病毒之F蛋白的混雜抗原決定位為模型得到的(例如SEQ ID NOs: 1-5)。在其他實施例中，SSAL的成員可以是退化的Th抗原決定位SSAL2 Th2，其是以取自HBsAg1的混雜抗原決定位為模型得到的(例如SEQ ID NOs: 19-24)。

合成後存在於組合人工Th抗原決定位(或SSAL)的混合物中的胜肽總數可以透過將在每個可變位置處之可用選項的數量相乘來計算。例如，SEQ ID NO: 16代表32種不同胜肽的組合，因為它含有5個可變位置，其中每個可變位置具有2個不同殘基的選項(即2x2x2x2x2 = 2⁵ = 32)。類似地，SEQ ID NO: 5代表524,288種不同胜肽的組合(即2x4x2x4x2x4x4x4x2x4x2x4 = 2⁵ x4⁷ = 524,288)。組合人工Th抗原決定位序列包括(a)包含可變序列的所有胜肽的混合物和(b)在組合內含有單個序列的每個個別胜肽。

在一些實施例中，可以在位置1處添加帶電殘基Glu或Asp以增加Th的疏水面周圍的電荷。在一些實施例中，兩性螺旋的疏水面可以透過位於位置2、5、8、9、10、13和16的疏水性殘基加以維持。在一些實施例中，位於位置2、5、8、9、10和13的胺基酸殘基可被改變，以提供具有結合各種MHC限制元素能力的表面。在一些實施例中，胺基酸殘基的變化可擴大人工Th抗原決定位的免疫反應範圍。

人工Th抗原決定位可包含已知混雜Th抗原決定位的所有特性和特徵。在一些實施例中，人工Th抗原決定位是SSAL的成員。在一些實施例中，人工Th位點可與取自自身抗原和外來抗原的胜肽序列組合，以提供針對位點特異性目標的增強的抗體反應。在一些實施例中，人工Th抗原決定位免疫原可提供有效且安全的抗體反應，展現出高免疫效力，並表現出廣泛的反應性反應。

已提供理想化的人工Th抗原決定位。這些理想化的人工Th抗原決定位是以WO 95/11998揭露的兩種已知天然Th抗原決定位和SSAL胜肽原型為模型。SSALS包含組合MHC分子結合基序(Meister et al., 1995)，旨在引起遺傳多樣性群體成員之間的廣泛免疫反應。SSAL胜肽原型是基於麻疹病毒和B型肝炎病毒抗原的Th抗原決定位設計，透過引入多個MHC結合基序進行修飾。其他Th抗原決定位的設計是以其他已知Th抗原決定位為模型，透過簡化、添加及/或修飾多個MHC結合基序以產生一系列新的人工Th抗原決定位。將混雜人工Th位點合併進入具有多種目標抗原部位的合成胜肽免疫原中。得到的嵌合胜肽能夠刺激針對目標抗原部位的有效抗體反應。

表1所示的原型人工T輔助細胞(Th)抗原決定位之“SSAL1 Th1”，其為四種胜肽(SEQ ID NOs:1-4)的混合物，是以麻疹病毒F蛋白的混雜Th抗原決定位為模型的理想化Th抗原決定位(Partidos et al. 1991)。模型Th抗原決定位，如表1所示之“MVF Th (UBITh®5)” (SEQ ID NO:6)對應於麻疹病毒F蛋白的殘基288-302。根據“Rothbard規則”，透過在位置1處添加帶電殘基Glu/Asp以增加抗原決定位之疏水面周圍的電荷；添加或保留位置4、6、12和14處的帶電殘基或Gly；以及在位置7和11處添加或保留帶電殘基或Gly，以將MVF Th (SEQ ID NO:6)修飾為SSAL1 Th1原型(SEQ ID NOs:1-4)。Th抗原決定位之疏水面包含位於位置2、5、8、9、10、13和16處的殘基。通常與混雜抗原決定位相關的疏水性殘基在這些位置會被取代，以提供組合的Th SSAL抗原決定位，SSAL1 Th1 (SEQ ID NOs:1-4)。原型SSAL1 Th1 (SEQ ID NOs:1-4)的另一個重要特徵是位置1和4在位置9之一邊以迴文方式不完美地重覆，以模擬MHC結合基序。在SEQ ID NO:2 (表1)中進一步修飾SSAL1 Th1的這種“1、4、9”迴文模式，以更接近地反映原始MvF模型Th的序列(SEQ ID NO:6)。

可以簡化組合人工Th抗原決定位以提供一系列單一序列抗原決定位。例如，SEQ ID NO: 5的組合序列可簡化為SEQ ID NOs: 1-4所代表的單一序列Th抗原決定位。這些單一序列Th抗原決定位可與目標抗原部位結合以提供增強的免疫原性。

在一些實施例中，可透過利用非極性和極性不帶電的胺基酸(例如Ile和Ser)延伸胺基端並利用帶電和疏水性胺基酸(例如Lys和Phe)延伸羧基端來改善Th抗原決定位的免疫原性。另外，對Th抗原決定位添加一個離胺酸殘基或多個離胺酸殘基(例如KKK)可改善胜肽在水中的溶解度。進一步的修飾包括利用共同的MHC結合基序AxTxIL取代羧基端(Meister et al, 1995)。

人工Th抗原決定位可以是已知的天然Th抗原決定位或SSAL胜肽原型。在一些實施例中，來自SSAL的Th抗原決定位可以合併組合MHC分子結合基序，其旨在引起遺傳多樣性群體成員之間的廣泛免疫反應。在一些實施例中，可以基於麻疹病毒和B型肝炎病毒抗原的Th抗原決定位設計SSAL胜肽原型，透過引入多個MHC結合基序進行修飾。在一些實施例中，人工Th抗原決定位可簡化、添加及/或修飾多個MHC結合基序以產生一系列新的人工Th抗原決定位。在一些實施例中，可以將新改造的混雜人工Th位點合併進入具有多種目標抗原部位的合成胜肽免疫原中。在一些實施例中，得到的嵌合胜肽能夠刺激針對目標抗原部位的有效抗體反應。

本揭露人工Th抗原決定位可以是包含第2類MHC分子結合位點的天然或非天然胺基酸的連續序列。在一些實施例中，人工Th抗原決定位可增強或刺激針對目標抗原部位的抗體反應。在一些實施例中，Th抗原決定位可由連續或不連續的胺基酸片段組成。在一些實施例中，並非Th抗原決定位的每個胺基酸都參與MHC辨識。在一些實施例中，本發明Th抗原決定位可包含免疫功能同源物，例如免疫增強同源物、交叉反應性同源物及其片段。在一些實施例中，功能性Th同源物可進一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的保留性取代、添加、刪除和插入，並提供Th抗原決定位的Th刺激功能。

Th抗原決定位可直接地連接至靶點。在一些實施例中，Th抗原決定位可透過任選的異源性間隔子(例如胜肽間隔子(例如Gly-Gly或(ε-N)Lys))連接至靶點。間隔子物理性地將Th抗原決定位與B細胞抗原決定位分開，並且可破壞由於Th抗原決定位或功能同源物與目標抗原部位連接所產生的任何人工二級結構的形成，從而消除對Th及/或B細胞反應的任何干擾。

Th抗原決定位包括理想化的人工Th抗原決定位和組合理想化的人工Th抗原決定位，如表1所示。在一些實施例中，Th抗原決定位是SEQ ID NOs: 1-52的混雜Th細胞抗原決定位、其任何同源物及/或其任何免疫類似物。Th抗原決定位還包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫性Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應性類似物和任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激針對目標抗原部位的免疫反應。

Th抗原決定位胜肽的功能性免疫類似物也是有效的並且被包括作為本發明的一部分。功能性免疫Th類似物可包括在Th抗原決定位中1至約5個胺基酸殘基的保留性取代、添加、刪除和插入，其實質上未改變Th抗原決定位的Th刺激功能。如上文針對目標抗原部位所述，可以利用天然或非天然胺基酸完成保留性取代、添加和插入。表1辨識了Th抗原決定位胜肽之功能類似物的另一種變異物。具體而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs: 6和7是MvF4和MvF5 Th的SEQ ID NOs: 16和17的功能類似物，因為利用在胺基端和羧基端將各兩個胺基酸刪除(SEQ ID NOs: 6和7)或插入(SEQ ID NOs: 16和17)而使其胺基酸骨架有所區別。在類似序列的這兩個系列之間的差異並不會影響包含於此些序列中之Th抗原決定位的功能。因此，功能免疫Th類似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths (SEQ ID NOs: 6-18)和衍生自肝炎表面蛋白質HBsAg 1-3 Ths (SEQ ID NOs: 19-31)之Th抗原決定位的多種版本。

在胜肽免疫原結構中的Th抗原決定位可共價連接於目標抗原部位的胺基端或羧基端以製造嵌合Th/B細胞位點胜肽免疫原。在一些實施例中，Th抗原決定位可透過化學偶合或透過直接合成共價連接至目標抗原部位。在一些實施例中，Th抗原決定位是共價連接至目標抗原部位的胺基端。在其他實施例中，Th抗原決定位是共價連接至目標抗原部位的羧基端。在某些實施例中，超過一個的Th抗原決定位共價連接至目標抗原部位。當超過一個的Th抗原決定位連接至目標抗原部位時，每一個Th抗原決定位可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列。另外，當超過一個的Th抗原決定位連接至目標抗原部位時，Th抗原決定位可以任何順序排列。例如，Th抗原決定位可連續地連接至目標抗原部位的胺基端，或連續地連接至目標抗原部位的羧基端，或當不同的Th抗原決定位共價連接至目標抗原部位的羧基端時，Th抗原決定位可共價連接至目標抗原部位的胺基端。Th抗原決定位相對於目標抗原部位的排列並無限制。

在一些實施例中，Th抗原決定位直接地共價連接至目標抗原部位。在其他實施例中，Th抗原決定位透過下文進一步詳細描述的異源性間隔子共價連接至目標抗原部位。合成的方法

可以使用化學方法合成本揭露的胜肽免疫原。在一些實施例中，可以使用固相胜肽合成來合成本揭露的胜肽免疫原。在一些實施例中，利用t-Boc或Fmoc以保護α-NH₂ 或側鏈胺基酸使用自動化美利弗德(Merrifield)固相胜肽合成法來合成本發明的胜肽。

作為組合序列呈現的異源性Th抗原決定位胜肽包含基於此特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽框架內的特定位置處表示的胺基酸殘基的混合物。透過在合成過程中在指定位置添加指定的受保護胺基酸的混合物而非一種特定胺基酸，可以在一個過程中合成組合胜肽的組裝。這種組合異源性Th抗原決定位胜肽組裝可以允許對具有不同遺傳背景之動物的廣泛Th抗原決定位覆蓋。異源性Th抗原決定位胜肽的代表性組合序列包括SEQ ID NOs: 5、10、13、16、24和27，其顯示於表1中。本發明抗原決定位胜肽對來自遺傳多樣性群體的動物和患者提供廣泛的反應性和免疫原性。

有趣的是，在Th抗原決定位、B細胞抗原決定位及/或含有Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構的合成過程中可能引入的不一致性及/或錯誤於接受治療的動物中通常不會妨礙或阻止欲求的免疫反應。事實上，胜肽合成過程中可能引入的不一致性/錯誤會伴隨目標胜肽合成產生多種胜肽類似物。這些類似物可包括胺基酸插入、刪除、取代和提前終止。如上所述，當用於免疫應用時，這些胜肽類似物適合作為胜肽製劑中的抗原性和免疫原性的貢獻者，或者作為用於免疫診斷目的的固相抗原，或作為用於疫苗接種目的的免疫原。

包含Th抗原決定位的胜肽免疫原結構在與目標抗原部位串聯的單一固相胜肽合成中同時產生。Th抗原決定位還包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫性Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應性類似物和任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激針對目標抗原部位的免疫反應。

在完成欲求胜肽免疫原的組裝後，可以處理固相樹脂以從樹脂上切割胜肽並移除胺基酸側鏈上的官能基團。可以透過HPLC純化游離胜肽並描繪其生物化學特性。在一些實施例中，使用胺基酸分析描繪游離胜肽的生物化學特性。在一些實施例中，使用胜肽序列表徵游離胜肽。在一些實施例中，使用質譜法表徵游離胜肽。

本發明胜肽免疫原可透過形成硫醚鍵使用鹵代乙醯化(haloacetylated)和半胱胺酸化(cysteinylated)胜肽來合成。在一些實施例中，可以將半胱胺酸添加至含Th胜肽的羧基端，並且半胱胺酸殘基的硫醇基可以用於與親電子基團(例如N^α 氯乙醯-修飾基團或馬來醯亞胺(maleimide)衍生的離胺酸殘基的α-或ε-NH₂ 基團)形成共價鍵。得到的合成中間物可連接至目標抗原部位胜肽的胺基端。

可以使用核酸選殖技術合成更長的合成胜肽共軛物。在一些實施例中，本發明Th抗原決定位可以透過表現重組DNA和RNA來合成。為了構建表現本發明Th/目標抗原部位胜肽的基因，可以將胺基酸序列反轉譯成核酸序列。在一些實施例中，利用對於其中具有待表現基因的生物體來說優化的密碼子將胺基酸序列反轉譯成核酸序列。可以製備編碼胜肽的基因。在一些實施例中，編碼胜肽的基因可以透過合成編碼胜肽和必要調節因子的重疊寡核苷酸來製備。可以組裝合成的基因並將其插入欲求的表現載體中。

本揭露的合成核酸序列可包括編碼本發明Th抗原決定位的核酸序列、包含Th抗原決定位的胜肽，其免疫功能同源物，以及以於非編碼序列的變化為特徵的核酸結構，其未改變胜肽或編碼的Th抗原決定位的免疫學特性。可將合成的基因插入合適的選殖載體中，並可獲得且表徵重組體。然後可以在適合於所選表現系統和宿主的條件下表現Th抗原決定位和包含Th抗原決定位的胜肽。可以純化和表徵Th抗原決定位或胜肽。醫藥組成物

本揭露還描述包含本揭露胜肽免疫原的醫藥組成物。在一些實施例中，本揭露的醫藥組成物可以用作藥學上可接受的遞送系統，供胜肽免疫原投予使用。在一些實施例中，本揭露的醫藥組成物可包含一種或多種胜肽免疫原的免疫有效劑量。

本發明胜肽免疫原可配製成免疫原性組成物。在一些實施例中，免疫原性組成物可包含佐劑、乳化劑，藥學上可接受的載體或疫苗組成物中常規提供的其他成分。可用於本發明的佐劑或乳化劑包括明礬、弗氏不完全佐劑(IFA)、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、emulsigen、單磷酸脂質A (MPL)、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)、QS21和ISA 720、ISA 51、ISA 35、ISA 206和其他有效的佐劑和乳化劑。在一些實施例中，本發明的組成物可以配製成立即釋放。在一些實施例中，可以配製本發明的組成物用於持續釋放。

醫藥組成物中使用的佐劑可包括油、鋁鹽、仿病毒顆粒(virosomes)、磷酸鋁(例如ADJU-PHOS®)、氫氧化鋁(例如ALHYDROGEL®)、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、Emulsigen®、單磷酸脂質A (MPL)、QS21、ISA 35、ISA 206、ISA 50V、ISA 51、ISA 720，以及其他佐劑和乳化劑。

在一些實施例中，醫藥組成物含有MONTANIDE™ ISA 51 (由植物油和二縮甘露醇油酸酯所組成的油質佐劑組成物，用以製造油包水乳液)、TWEEN® 80 (也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意組合。在其他實施例中，醫藥組成物是以EMULSIGEN或EMULSIGEN D作為佐劑的水包油包水(即w/o/w)乳液。

第1A圖是示意性概括的成分，其可以被包含在具有含有Th抗原決定位載體(包括UBITh®)之胜肽免疫原的製劑中。第1A圖所示的例示性製劑含有兩個個別的胜肽免疫原結構。每個胜肽免疫原結構均包含(a)訂製的功能性B細胞抗原決定位，其被設計引起針對欲求抗原決定位的高度靶向抗體；(b)幫助優化B細胞抗原決定位呈現給免疫系統以增強免疫原性的連接子，以及(c) Th抗原決定位，其本身是非免疫原性的，但其有助於驅動針對B細胞抗原決定位的強烈反應。此製劑還含有適合於特定應用的藥學上可接受的佐劑或載體，在此特定應用中使用此組成物。此外，可以使用CpG寡核苷酸(以下進一步描述)將組成物配製成穩定化的免疫刺激複合物。

第1B圖總結本文所述T輔助細胞抗原決定位平台(包括UBITh®)的數個特徵和技術優勢。例如，本文所述Th抗原決定位平台是長效的，但是在缺乏加強免疫的狀況下是可逆的。Th抗原決定位平台產生針對B細胞抗原決定位的高度特異性抗體，如果有的話，很少產生的抗體是針對連接子或Th抗原決定位序列。此外，Th抗原決定位平台可與多種B細胞抗原決定位一起使用，其允許胜肽免疫原結構的無限組合。

在一些實施例中，配製組成物用作疫苗。疫苗組成物可以透過任何方便的途徑給藥，包括皮下、口服、肌肉內、腹膜內、腸胃外或腸內給藥。在一些實施例中，免疫原以單劑量投予。在一些實施例中，免疫原以多劑量投予。

醫藥組成物可以以液體溶液或懸浮液形式配製成注射劑。含有胜肽免疫原結構的液體載體也可在注射前製備。醫藥組成物可利用任何適合的用法投予，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，並且可在任何適合的遞送裝置中施用。在某些實施例中，可配製醫藥組成物供靜脈內、皮下、皮內或肌肉內投予。也可製備適用於其他給藥方式的醫藥組成物，包括口服和鼻內應用。

本發明的組成物可含有一種或多種胜肽免疫原的有效劑量和藥學上可接受的載體。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組成物可含有受試者每公斤體重約0.5µg至約1 mg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組成物可含有受試者每公斤體重約10 µg、約20 µg、約30 µg、約40 µg、約50 µg、約60 µg、約70 µg、約80 µg、約90 µg、約100 µg、約200 µg、約300 µg、約400 µg、約500 µg、約600 µg、約700 µg、約800 µg、約900 µg或約1000 µg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組成物可含有受試者每公斤體重約100 µg、約150 µg、約200 µg、約250 µg、約300 µg、約350 µg、約400 µg、約450 µg或約500 µg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組成物可含有受試者每公斤體重約0.5 µg至約1 mg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組成物可含有約10 µg、約20 µg、約30 µg、約40 µg、約50 µg、約60 µg、約70 µg、約80 µg、約90 µg、約100 µg、約200 µg、約300 µg、約400 µg、約500 µg、約600 µg、約700 µg、約800 µg、約900 µg或約1000 µg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組成物可含有約100 µg、約150 µg、約200 µg、約250 µg、約300 µg、約350 µg、約400 µg、約450 µg或約500 µg的胜肽免疫原。

當以多劑量遞送時，組成物可以按劑量分成適當的量。在一些實施例中，劑量為約0.2 mg至約2.5 mg。在一些實施例中，劑量為約1 mg。在一些實施例中，劑量為約1 mg並透過注射施用。在一些實施例中，劑量為約1 mg並且以肌肉內方式施用。在一些實施例中，一劑之後可以是重複(加強)劑量。可根據受試者的年齡、體重和一般健康狀況優化劑量。

包含胜肽免疫原混合物的疫苗可在更廣泛的群體中提供增強的免疫功效。在一些實施例中，胜肽免疫原的混合物包含衍生自MVF Th和HBsAg Th的Th位點。在一些實施例中，包含胜肽免疫原混合物的疫苗可以提供針對目標抗原部位的改善的免疫反應。

針對Th/目標抗原部位共軛物的免疫反應可以藉由透過包埋於生物降解微粒中或於其上進行遞送而加以改善。在一些實施例中，胜肽免疫原可以在有或無佐劑的狀況下進行包封，並且這種微粒可以攜帶免疫刺激佐劑。在一些實施例中，微粒可與胜肽免疫原共同投予以增強免疫反應。免疫刺激複合物

本揭露也關於含有與CpG寡核苷酸形成免疫刺激複合物的胜肽免疫原結構的醫藥組成物。此種免疫刺激複合物特別適合作為佐劑和胜肽免疫原穩定劑。免疫刺激複合物為顆粒形式，其可有效地將胜肽免疫原呈現給免疫系統的細胞以產生免疫反應。免疫刺激複合物可配製成用於腸胃外投予的懸浮液。免疫刺激複合物還可配製成w/o乳液形式，作為與礦物鹽或原位凝膠聚合物結合的懸浮液，用於在腸胃外投予後將胜肽免疫原有效遞送至宿主免疫系統的細胞。

穩定化的免疫刺激複合物可藉由透過靜電結合將胜肽免疫原結構與陰離子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其組合複合而形成。穩定化的免疫刺激複合物可作為免疫原遞送系統併入醫藥組成物中。

在某些實施例中，將胜肽免疫原結構設計成包含陽離子部份，其於範圍為5.0至8.0的pH下帶有正電荷。胜肽免疫原結構或結構的混合物的陽離子部份的淨電荷計算是依據，每個離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)帶有+1電荷，每個天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)帶有-1電荷，以及序列中其他胺基酸所帶的電荷為0。將在胜肽免疫原結構中之陽離子部份的電荷相加，並表示為淨平均電荷。適合的胜肽免疫原具有具有淨平均正電荷為+1的陽離子部份。較佳地，胜肽免疫原具有範圍大於+2之淨正電荷。在一些實施例中，胜肽免疫原結構的陽離子部份為異源性間隔子。在某些實施例中，當間隔子序列為(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 54)時，胜肽免疫原結構的陽離子部份具有+4的電荷。

如本文所述的“陰離子型分子”是指在範圍為5.0至8.0的pH下帶有負電荷的任何分子。在某些實施例中，陰離子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的淨負電荷計算是依據，在寡聚合物中的每個磷酸二酯或硫代磷酸酯基團帶有-1電荷。適合的陰離子型寡核苷酸是具有8至64個核苷酸鹼基的單股DNA分子，其CpG基序的重複數在1至10的範圍內。較佳地，CpG免疫刺激性單股DNA分子含有18至48個核苷酸鹼基，其CpG基序的重複數在3至8的範圍內。

更佳地，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' X¹ CGX² 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X¹ 是選自由A (腺嘌呤)、G (鳥嘌呤)和T (胸腺嘧啶)組成的群組；且X² 是C (胞嘧啶)或T (胸腺嘧啶)。或者，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' (X³ )₂ CG(X⁴ )₂ 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X³ 是選自由A、T或G組成的群組；且X⁴ 是C或T。在某些實施例中，CpG寡核苷酸可以是CpG1 (SEQ ID NO: 146)、CpG2 (SEQ ID NO: 147)或CpG3 (SEQ ID NO: 148)。

所得到的免疫刺激複合物呈顆粒形式，其大小通常在1-50微米的範圍內，且是許多因素(包括交互作用成份的相對電荷化學計量和分子量)的函數。微粒免疫刺激複合物具有提供佐劑化和於體內向上調節特異性免疫反應的優點。此外，穩定化的免疫刺激複合物適用於透過各種方法(包括油包水乳液、礦物鹽懸浮液和聚合凝膠)製備醫藥組成物。應用

含有本揭露人工Th抗原決定位的胜肽免疫原可用於醫學和獸醫學應用。在一些實施例中，胜肽免疫原可用作疫苗以提供傳染病保護性免疫、用作治療由正常生理過程失常所引起的疾病的免疫療法、用作治療癌症的免疫療法，以及用作干預或改變正常生理過程的藥劑。

當與各種微生物、蛋白質或胜肽的目標B細胞抗原決定位組合時，本揭露的人工Th抗原決定位可以引發免疫反應。在一些實施例中，本揭露的人工Th抗原決定位可以與一個目標抗原部位連接。在一些實施例中，本揭露的人工Th抗原決定位可以與兩個目標抗原部位連接。

本揭露的人工Th抗原決定位可以與目標抗原部位連接以預防及/或治療各種疾病和病症。在一些實施例中，本發明的組成物可用於預防及/或治療神經退化性疾病、感染性疾病、動脈硬化、前列腺癌、預防公豬異味、動物的免疫去勢、治療子宮內膜異位症、乳癌和受性腺類固醇激素影響的其他婦科癌症，以及男性和女性的避孕藥。例如，人工Th抗原決定位可以與下列蛋白質的抗原決定部位連接： a. 體抑素(Somatostatin)以促進經濟動物的生長。 b. IgE以治療過敏性疾病。 c. Th細胞的CD4受體以治療及/或預防人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和免疫失調。 d. 口蹄疫(FMD)病毒衣殼蛋白以預防FMD。 e. HIV病毒顆粒抗原決定位以預防和治療HIV感染。 f. 惡性瘧原蟲的環子孢子蛋白抗原以預防和治療瘧疾。 g. CETP以預防和治療動脈硬化。 h. Aβ以針對阿茲海默症進行治療或疫苗接種。 i. α-突觸核蛋白以針對帕金森氏症進行治療或疫苗接種。 j. Tau以針對包括阿茲海默症在內的tau蛋白病進行治療和疫苗接種。 k. IL-31以治療異位性皮膚炎。 l. CGRP以預防和治療偏頭痛。 m. IAPP (澱粉素)以預防和治療第二型糖尿病。

已發現使用異源性人工Th抗原決定位對於靶向涉及神經退化性疾病的蛋白質(例如 Aβ、α-突觸核蛋白、Tau)特別重要。具體地，含有靶向神經退化性蛋白之內源性Th抗原決定位的胜肽免疫原在投予受試者時可引起腦部炎症。相反地，含有連接至神經退化性蛋白之抗原決定部位的異源性人工Th抗原決定位的胜肽免疫原結構不會引起腦部炎症。

第2圖是用以說明使用本申請案所述Th抗原決定位平台所獲得之理論結果的圖式。此圖式顯示含有與Th抗原決定位結合之B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構具有快速的開始時間，可迅速達到C_max 。 C_max 位在治療範圍內，其介於最小有效濃度(MEC)和最小治療濃度(MTC)之間。以下實施例表明，透過改變使用的Th抗原決定位、胜肽免疫原結構的劑量和佐劑，可以控制及/或調整C_max 、作用持續時間、開始時間和t_max 。類澱粉蛋白 β

Aβ胜肽被認為是阿茲海默症發病和進展的中心。Aβ寡聚體和Aβ纖維的毒性形式被認為是導致阿茲海默症和癡呆的病症之突觸和神經元死亡的原因。針對阿茲海默症之成功改善病程進展的治療可包括影響腦中Aβ清除的產品。

本揭露的胜肽免疫原可包含Th細胞抗原決定位和Aβ靶向胜肽。在一些實施例中，Th細胞抗原決定位是Th1或Th2。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含Th1和Th2。Aβ靶向胜肽或B細胞抗原決定位可以是Aβ_1-14 、Aβ_1-16 、Aβ_1-28 、Aβ_17-42 或Aβ_1-42 。在一些實施例中，Aβ靶向胜肽是Aβ_1-14 。如本文所用，術語Aβ_x-y 表示全長野生型Aβ蛋白的從胺基酸x至胺基酸y的Aβ序列。

本揭露的胜肽免疫原可包含一種以上的Aβ靶向胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含兩種Aβ靶向胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含一種Aβ_1-14 和一種Aβ_1-42 胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含兩種Aβ_1-14 靶向胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含兩種Aβ_1-14 靶向胜肽，每種胜肽與不同的Th細胞抗原決定位連接作為嵌合胜肽。

本揭露還提供包含兩種Aβ_1-14 靶向胜肽的Aβ_1-14 胜肽疫苗，每種胜肽與不同的Th細胞抗原決定位連接作為嵌合胜肽。在一些實施例中，可以將嵌合Aβ_1-14 胜肽配製在Th1偏向遞送系統中以使T細胞炎症反應性最小化。在一些實施例中，可以將嵌合Aβ_1-14 胜肽配製在Th2偏向遞送系統中以使T細胞炎症反應性最小化。具體實施例

(1) 一種選自由SEQ ID NOs: 32 – 52組成之群組的混雜人工T輔助細胞(Th)抗原決定位。 (2) 一種利用以下分子式代表之胜肽免疫原結構： (A)_n -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 {(A)_n -(Th)_p -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_p -(A)_n -X}_m 其中： 每個A獨立地為胺基酸； 每個B獨立地為異源性間隔子； 每個Th獨立地為如(1)之混雜人工Th抗原決定位； 目標抗原部位為B細胞抗原決定位，其來自外來抗原蛋白、自身抗原蛋白，或其免疫反應類似物； X為胺基酸、α-COOH或α-CONH₂ ； n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為1、2、3或4； o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；以及 p為0、1、2、3或4。 (3) 如(2)之胜肽免疫原結構，其中目標抗原部位為B細胞抗原決定位，其來自選自由口蹄疫(FMD)衣殼蛋白、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)和單純皰疹病毒(HSV)之醣蛋白組成之群組的外來抗原蛋白。 (4) 如(2)之胜肽免疫原結構，其中目標抗原部位為B細胞抗原決定位，其來自選自由下列組成之群組的自身抗原蛋白： (a) 具有SEQ ID NO: 56、57、58、59或60之胺基酸序列的Aβ胜肽； (b) 具有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的α-Syn胜肽； (c) 具有SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的IgE EMPD胜肽； (d) 具有SEQ ID NO: 63、69、70或71之胺基酸序列的Tau胜肽； (e) 具有SEQ ID NO: 64或72之胺基酸序列的IL-31胜肽；以及 (f) 具有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的IL-6胜肽。 (5) 如(2)之胜肽免疫原結構，其中組成B之異源性間隔子是選自由胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)、Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)、Gly-Gly、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)及其任意組合組成之群組。 (6) 如(2)之胜肽免疫原結構，其中異源性間隔子是選自由(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)和Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)組成之群組。 (7) 一種包含如(2)之胜肽免疫原結構的醫藥組成物。 (8) 一種於受試者預防及/或治療疾病、症狀或病痛的方法，其包含將如(7)之醫藥組成物的藥學上有效劑量投予受試者。 (9) 如(8)之方法，其中目標抗原部位為B細胞抗原決定位，其來自選自由口蹄疫(FMD)衣殼蛋白、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)和單純皰疹病毒(HSV)之醣蛋白組成之群組的外來抗原蛋白。 (10) 如(8)之方法，其中目標抗原部位為B細胞抗原決定位，其來自選自由下列組成之群組的自身抗原蛋白： (a) 具有SEQ ID NO: 56、57、58、59或60之胺基酸序列的Aβ胜肽； (b) 具有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的α-Syn胜肽； (c) 具有SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的IgE EMPD胜肽； (d) 具有SEQ ID NO: 63、69、70或71之胺基酸序列的Tau胜肽； (e) 具有SEQ ID NO: 64 或72之胺基酸序列的IL-31胜肽；以及 (f) 具有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的IL-6胜肽。 (11) 一種利用以下分子式代表之胜肽免疫原結構： (A)_n -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 {(A)_n -(Th)_p -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_p -(A)_n -X}_m 其中： 每個A獨立地為胺基酸； 每個B獨立地為異源性間隔子； 每個Th獨立地為選自由SEQ ID NOs: 1-52組成之群組的混雜人工Th抗原決定位； 目標抗原部位為CTL抗原決定位、腫瘤相關醣類抗原(TACA)、來自新抗原的B細胞抗原決定位、小分子藥物或其免疫反應類似物； X為胺基酸、α-COOH或α-CONH₂ ； n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為1、2、3或4； o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；以及 p為0、1、2、3或4。 (12) 如(11)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為CTL抗原決定位，其具有選自由SEQ ID NOs: 76-144組成之群組的胺基酸序列。 (13) 如(12)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為來自HIV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 76-82組成之群組。 (14) 如(12)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為來自HSV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 83-106組成之群組。 (15) 如(12)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為來自FMDV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 107-123組成之群組。 (16) 如(12)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為來自PRRSV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 124-142組成之群組。 (17) 如(12)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為來自CSFV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 143-144組成之群組。 (18) 如(11)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為TACA，其選自由GD3、GD2、Globo-H、GM2、Fucosyl GM1、GM2、PSA、Le^y 、Le^x 、SLe^x 、SLe^a 、Tn、TF和STn組成之群組。 (19) 如(11)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為來自新抗原的B細胞抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 73-75組成之群組。 (20) 如(11)之胜肽免疫原，其中目標抗原部位為小分子藥物。 (21) 如(11)之胜肽免疫原結構，其中組成B之異源性間隔子是選自由胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)、Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)、Gly-Gly、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)及其任意組合組成之群組。 (22) 如(11)之胜肽免疫原結構，其中異源性間隔子是選自由(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)和Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)組成之群組。 (23) 一種包含如(11)之胜肽免疫原結構的醫藥組成物。 (24) 一種於受試者預防及/或治療疾病、症狀或病痛的方法，其包含將如(23)之醫藥組成物的藥學上有效劑量投予受試者。 (25) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為HIV且其中目標抗原部位為來自HIV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 76-82組成之群組。 (26) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為HSV且其中目標抗原部位為來自HSV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 83-106組成之群組。 (27) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為FMDV且其中目標抗原部位為來自FMDV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 107-123組成之群組。 (28) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為PRRSV且其中目標抗原部位為來自PRRSV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 124-142組成之群組。 (29) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為CSFV且其中目標抗原部位為來自CSFV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 143-144組成之群組。 (30) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為CSFV且其中目標抗原部位為來自CSFV的CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 143-144組成之群組。 (31) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為癌症且其中目標抗原部位為TACA，其選自由GD3、GD2、Globo-H、GM2、Fucosyl GM1、GM2、PSA、Le^y 、Le^x 、SLe^x 、SLe^a 、Tn、TF和STn組成之群組。 (32) 如(24)之方法，其中疾病、症狀或病痛為癌症且其中目標抗原部位為來自新抗原的B細胞抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 73-75組成之群組。 (33) 一種在受試者中調整免疫反應的方法，包含： (a) 製備一種以上如(11)之胜肽免疫原結構，其中在每一胜肽免疫原結構的目標抗原部位保持固定且Th抗原決定位為不同； (b) 製備一種以上的醫藥組成物，每種醫藥組成物包含在(a)中製備的一種胜肽免疫原結構和藥學上可接受的佐劑或載體； (c) 將在(b)中製備的每一醫藥組成物投予不同的受試者； (d)在每一受試者監測免疫反應；以及 (e)選擇產生欲求免疫反應的該醫藥組成物。 (34) 如(33)之方法，其中在每一醫藥組成物中之藥學上可接受的佐劑或載體是相同的。 (35) 如(33)之方法，其中在每一醫藥組成物中之該學上可接受的佐劑或載體是不同的。實施例 1. 胜肽和胜肽免疫原結構的製備

使用自動化固相合成法合成胜肽(包括胜肽免疫原結構)，透過預備的HPLC進行純化，並透過基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)、胺基酸分析和反相HPLC描繪特性。

Aβ疫苗(UB-311)包含兩種胜肽免疫原，每種都具有胺基端Aβ_1-14 胜肽，其透過胺基酸間隔子合成地連接至衍生自兩種病原菌蛋白質(B型肝炎表面抗原和麻疹病毒融合蛋白)的不同Th細胞抗原決定位胜肽(UBITh®抗原決定位)。具體而言，連接至麻疹病毒融合蛋白的胜肽免疫原是Aβ_1-14 -εK-KKK-MvF5 Th (SEQ ID NO: 67)，而連接至B型肝炎表面抗原的胜肽免疫原是Aβ_1-14 -εK-HBsAg3 Th (SEQ ID NO: 68)。

將UB-311配製在含有明礬的Th2偏向遞送系統中，且含有等莫耳比值的胜肽Aβ_1-14 -εK-HBsAg3 Th和Aβ_1-14 -εK-KKK-MvF5 Th。將兩種Aβ免疫原與聚陰離子CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成微米級顆粒的穩定免疫刺激複合物。將鋁礦物鹽(ADJU-PHOS®)與氯化鈉(供滲壓性使用)和0.25 % 2-苯氧基乙醇(作為防腐劑)一起加入到最終劑型中。

表3A和3B分別顯示了幾個例示性目標抗原部位(B細胞抗原決定位和CTL抗原決定位)的序列。表4中顯示了幾種例示性的胜肽免疫原結構序列，其包含Aβ_1-14 、大鼠IL-6_72-82 和IgE-EMPD_1-39 作為目標抗原部位以共價連接至Th抗原決定位。表5中顯示胜肽免疫原結構序列，其包含共價連接至各種Th抗原決定位的α-突觸核蛋白_111-132 。表6中顯示胜肽免疫原結構序列，其包含共價連接至各種Th抗原決定位的IgE-EMPD_G1-C39 。表7中顯示胜肽免疫原結構序列，其包含共價連接至各種Th抗原決定位的人類IL-6_73-83 。表9中顯示胜肽免疫原結構序列，其包含共價連接至UBITh®1的二胜肽重複(DPR)序列。表10中顯示胜肽免疫原結構序列，其包含共價連接至各種Th抗原決定位的LHRH。實施例 2. 將於 α - 突觸核蛋白 _111-132 、 IgE EMPD_1-39 和 IL-6_73-83 胜肽免疫原結構設計中用以增強這些選定的 B 細胞抗原決定位胜肽免疫原性之衍生自病原體的異源性 T 輔助細胞抗原決定位及其內含物進行排序 a. 胜肽免疫原合成

來自α-突觸核蛋白(AAs 111-132; SEQ ID NO: 61)、IgE EMPD (AAs 1-39; SEQ ID NO: 62)和IL-6 (AAs 73-83; SEQ ID NO: 145)的三個短B細胞抗原決定位胜肽，其功能特性已經被廣泛地表徵，用以作為代表性的目標抗原部位。根據以下所示的分子式將這三個B細胞抗原決定位製成胜肽免疫原結構，以評估代表性的混雜人工Th抗原決定位(選自SEQ ID NOs: 1-52)使三個個別的目標抗原部位具有免疫原性的能力： (Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-X 其中： Th選自本文揭露的人工Th抗原決定位且m為1； (B)_o 是具有SEQ ID NO: 53或54胺基酸序列的間隔子； 目標抗原部位是SEQ ID NO: 61、62或145的B細胞抗原決定位；以及 X是胺基酸-CONH₂ 。

產生的α-突觸核蛋白、IgE EMPD和IL-6胜肽免疫原結構的胺基酸序列分別顯示於表5、6和7中。b. 含有胜肽免疫原結構的製劑和免疫接種

在天竺鼠中進行代表性的免疫原性研究，以對表1中所顯示的各個異源性T輔助細胞抗原決定位的相對效力進行排序。在產生各種α-突觸核蛋白、IgE EMPD和IL-6胜肽免疫原後，如表8所示將含有相同Th抗原決定位序列之結構以1：1：1比例混合在一起。例如，將包含UBITH®1抗原決定位的α-突觸核蛋白、IgE EMPD和IL-6結構(SEQ ID NOs: 149、178和207)混合在一起以製備表8中所示的第1號製劑。將α-突觸核蛋白、IgE EMPD和IL-6胜肽免疫原結構的混合物與佐劑MONTANIDE ISA50V2混合，然後使用CpG3寡核苷酸將其配製成穩定化的免疫刺激複合物。在表8中所顯示的29個配方中的每一個均於0.5 mL的體積中含有總共135 µg胜肽(每個胜肽45 µg)。

透過肌肉內(i.m.)注射在初次免疫後(wpi)第0、3和6週將製劑投予天竺鼠(每組3隻)。在0、3、6和8 wpi時採集血清樣品以評估抗體效價水平。c. 免疫原性結果

將在初次免疫後第8週(8wpi)獲得的結果用於對不同的α-突觸核蛋白(第3圖的上圖)、IgE (第3圖的下圖)和IL-6 (表15)胜肽免疫原結構進行排名。包含在整個α-突觸核蛋白研究中獲得之免疫原性數據的圖式如第4A圖所示；包含在整個IgE-EMPD研究中獲得之免疫原性數據的圖式如第5圖所示；包含在整個IL-6研究中獲得之免疫原性數據的圖式如第6圖所示。

所有Th抗原決定位都能夠不同程度地增強三種短B細胞抗原決定位胜肽的免疫原性。具體而言，Th抗原決定位KKKMvF3 Th (SEQ ID NO: 13)、破傷風梭菌TT2 Th (SEQ ID NO: 36)、EBV EBNA-1 Th (SEQ ID NO: 42)、MvF5 Th；UBITh®1 (SEQ ID NO: 17)、EBV BHRF1 Th (SEQ ID NO: 41)、MvF4 Th；UBITh®3 (SEQ ID NO: 16)和霍亂毒素Th (SEQ ID NO: 33)較其他Th抗原決定位更能增強α-突觸核蛋白胜肽(SEQ ID NO: 61)的免疫原性(第3圖的上圖和第4A圖)。這些胜肽免疫原結構分別以表5中的第13、22、21、01、19、03和11號製劑代表。

對於IgE EMPD胜肽(SEQ ID NO: 62)而言，Th抗原決定位破傷風梭菌TT4 Th (SEQ ID NO: 38)、UBITh®1 (SEQ ID NO: 17)、UBITh®3 (SEQ ID NO: 16)、HBsAg1 Th；SSAL2 Th2 (SEQ ID NO: 24)、KKKMvF3 Th (SEQ ID NO: 13)、破傷風梭菌TT2 Th (SEQ ID NO: 36)、霍亂毒素Th (SEQ ID NO: 33)、 EBV BHRF1 Th (SEQ ID NO: 41)和HBsAg3 Th；UBITH®2 (SEQ ID NO: 28)較其他Th抗原決定位更能增強IgE EMPD的免疫原性(第3圖的下圖和第5圖)。這些胜肽免疫原結構分別以表6中的第24、01、03、14、13、22、11、19和02號製劑代表。

對於IL-6_73-83 環狀胜肽(SEQ ID NO: 145)而言，發現Th抗原決定位HBsAg3 Th；UBITH®2 (SEQ ID NO: 28)、UBITh®1 (SEQ ID NO: 17)、UBITh®3 (SEQ ID NO: 16)、 破傷風梭菌TT1 Th (SEQ ID NO: 34)和破傷風梭菌TT4 Th (SEQ ID NO: 38)最有效地去增強IL-6所得的免疫原性(表15和第6圖)。這些胜肽免疫原結構分別以表7中的第02、01、03、20和24號製劑代表。

這些結果表明，當使用本文揭露的不同人工Th抗原決定位時可以獲得針對單一目標B細胞抗原決定位不同的免疫原性。需要針對在不同物種(包括靈長類動物)中的每種胜肽免疫原結構的免疫原性進行仔細校正，以確保最終Th胜肽選擇和最終疫苗製劑開發的成功。d. 達到 C_max 的速率

針對共價連接至不同Th抗原決定位之α-突觸核蛋白胜肽免疫原結構的免疫原性數據做進一步分析顯示，以不同的速率達到特定的C_max 是取決於所使用的Th抗原決定位。第4B圖包含第4A圖中所報導免疫原性數據的子集。具體而言，利用第13和21號製劑免疫天竺鼠，製劑含有共價連接至α-突觸核蛋白胜肽(SEQ ID NO: 61)的Th抗原決定位KKKMvF3 Th (SEQ ID NO: 13)和EBV EBNA-1 Th (SEQ ID NO: 42)，其可在8 wpi達到相同的C_max ，但是是以不同的速率達到。特別地，含有KKKMvF3 Th (SEQ ID NO: 13)的α-突觸核蛋白胜肽免疫原結構比含有EBV EBNA-1 Th (SEQ ID NO: 42)的α-突觸核蛋白胜肽免疫原結構更快地達到其C_max 。類似地，含有UBITh®1 (SEQ ID NO: 17)的α-突觸核蛋白胜肽免疫原結構比含有EBV BHRF1 Th (SEQ ID NO: 41)的α-突觸核蛋白胜肽免疫原結構更快地達到其C_max ；並且含有破傷風梭菌TT1 Th (SEQ ID NO: 34)的α-突觸核蛋白胜肽免疫原結構比含有流行性感冒病毒MP1_1 Th (SEQ ID NO: 48)的α-突觸核蛋白胜肽免疫原結構更快地達到其C_max 。第4B圖中顯示的結果表明，選擇Th抗原決定位可以影響抗體效價達到其C_max 的速率。e. 摘要

此實驗的結果表明，利用胜肽免疫原結構所引起的免疫反應(包括抗體效價、C_max 、抗體產生的開始、反應的持續時間等)可以透過選擇與B細胞抗原決定位化學連接的Th抗原決定位來加以調節。因此，可以透過改變在胜肽免疫原結構中與B細胞抗原決定位結合的Th抗原決定位來設計針對目標抗原部位的特異性免疫反應，其有助於訂製針對任何患者或受試者之個體特徵的個人化醫療。實施例 3. 胜肽免疫原性結構的免疫原性取決於 B 細胞抗原決定位序列的長度

以下詳細描述三種二胜肽重複(DPR)胜肽免疫原結構的免疫和評估。a. 免疫接種和血清收集

製造三種DPR胜肽免疫原結構，如表9所示其胺基酸序列為SEQ ID NOs: 236、237和238。將每種胜肽免疫原配製於MONTANIDE™ ISA51和CpG中以在初次免疫時利用400 µg/ml劑量對天竺鼠進行免疫，並在初次免疫後(WPI) 第3、6、9和12週時以100 µg/ml劑量進行加強免疫，每個組別為3隻天竺鼠。b. 抗體效價的評估

進行ELISA試驗以評估專門設計的DPR胜肽免疫原結構的免疫原性。利用DPR B細胞抗原決定位胜肽或胜肽免疫原結構塗覆微量盤的孔洞，其作為標靶胜肽。利用10倍連續稀釋將天竺鼠免疫血清從1:100稀釋至1:100,000。利用A₄₅₀ 臨界值設為0.5之A₄₅₀ 的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log₁₀ 表示。所有胜肽免疫原均引發針對塗覆於微量盤孔洞中之B細胞抗原決定位胜肽的強免疫原性效價。c. 供抗體特異性分析之基於胜肽的 ELISA 試驗

如以下所述開發用以評估免疫血清樣品的ELISA試驗。

將用於免疫動物的相同DPR胜肽免疫原結構(即SEQ ID NOs: 236、237或238)以2 μg/mL的濃度配製於pH 9.5之10 mM碳酸氫鈉緩衝液中，把此DPR胜肽免疫原結構於37°C下作用1小時以分別地塗覆96孔盤的孔洞。d. 利用 ELISA 試驗評估針對 DPRs 的抗體反應性

將胜肽塗覆的孔洞與250 μL配製於PBS中濃度為3重量百分比的明膠於37°C下反應1小時，以阻斷非特異性蛋白質結合位點，接著利用含有0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞三次並乾燥。利用含有20體積百分比正常山羊血清、1重量百分比明膠和0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS以1:20比例(除非另有說明)稀釋待測血清。將100 μL稀釋樣品(例如血清、血漿)加入每個孔洞並於37°C下反應60分鐘。然後利用配製於PBS中濃度為0.05體積百分比的TWEEN® 20洗滌孔洞6次，以移除未結合的抗體。使用辣根過氧化物酶(HRP)共軛物種(例如小鼠、天竺鼠或人類)特異性山羊抗IgG作為標記的示蹤劑，以在陽性孔洞中與形成的抗體/胜肽抗原複合物結合。將100微升過氧化物酶標記的山羊抗IgG (其以預滴定的最佳稀釋倍數配製於內含1體積百分比正常山羊血清與0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS中)加到每個孔洞中，並在37°C下再反應30分鐘。利用內含0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞6次以移除未結合的抗體，並與100 μL包含0.04重量百分比3’, 3’, 5’, 5’-四甲基聯苯胺(TMB)和0.12體積百分比過氧化氫於檸檬酸鈉緩衝液中的受質混合物再反應15分鐘。藉由形成有色產物利用受質混合物以偵測過氧化物酶標記。藉由加入100 μL的1.0M硫酸終止反應並測定450 nm處的吸光值(A₄₅₀ )。為了測定接受各種DPR衍生的胜肽免疫原之免疫接種動物的抗體效價，將從1:100至1:10,000之10倍連續稀釋的血清進行測試，且利用A₄₅₀ 臨界值設為0.5之A₄₅₀ 的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log₁₀ 表示。e. 免疫原性評估

依照實驗免疫接種程序收集來自動物的免疫前和免疫血清樣品，並在56°C下加熱30分鐘以使血清補體因子失活。在投予含有DPR胜肽免疫原結構的醫藥組成物後，根據程序獲得血液樣品，並評估其針對特定靶點的免疫原性。測試了連續稀釋的血清，並將稀釋倍數之倒數取對數(Log₁₀ )以表示陽性效價。藉由其能力(引發針對目標抗原內欲求抗原決定位特異性之高效價B細胞抗體反應，且同時將針對用以提供欲求B細胞反應增強之Th抗原決定位之抗體反應性維持在低至可忽略)，而評估特定醫藥組成物的免疫原性。f. 小鼠免疫血清中 DPR 水平的免疫分析

使用抗DPR抗體作為捕獲抗體，而生物素標記的抗DPR抗體作為檢測抗體，透過三明治ELISA (Cloud-clon, SEB222Mu)測定接受DPR衍生胜肽免疫原接種之小鼠的血清DPR水平。簡而言之，將抗體以100 ng/孔洞的量配製於塗覆緩衝液(15 mM碳酸鈉，35 mM碳酸氫鈉，pH 9.6)中以固定在96孔盤上，並在4˚C下隔夜反應。利用200 μL/孔洞的測定稀釋液(含0.5%牛血清白蛋白、0.05% TWEEN®-20和0.02% ProClin 300的PBS)在室溫下反應1小時以封阻塗覆的孔洞。利用200 μL/孔洞的洗滌緩衝液(內含0.05% TWEEN®-20的PBS)洗滌微量盤3次。使用純化的重組DPR在具有5%小鼠血清的測定稀釋液中產生標準曲線(透過2倍連續稀釋，範圍為156至1,250 ng/mL)。將50 μL的稀釋血清(1:20)和標準品加入塗覆的孔洞中。在室溫下反應1小時。將所有孔洞吸乾，並利用200 μL/孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次。將捕獲的DPR與100 μL的偵測抗體溶液(在測定稀釋液中內含50 ng/ml生物素標記的HP6029)在室溫下反應1小時。然後，使用鏈抗生物素蛋白(streptavidin) poly-HRP (1:10,000稀釋，Thermo Pierce)偵測結合的生物素-HP6029 1小時(100 μL/孔洞)。將所有孔洞吸乾，並利用200 μL/孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次，且透過加入100 μL/孔洞的1M硫酸終止反應。藉由使用SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)產生的4-參數羅吉特曲線擬合而產出標準曲線，並用其計算在所有試驗樣品中的DPR濃度。藉由使用Prism軟體利用學生t檢驗(Student t tests)比較數據。g. 抗 DPR 抗體的純化

利用親和性管柱(Thermo Scientific, Rockford)從由初次免疫後(WPI)第3至15週之天竺鼠或小鼠收集的血清中純化抗DPR抗體，所述天竺鼠或小鼠是利用含有不同序列之胜肽的DPR胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 236、237或238)進行免疫接種。簡而言之，在緩衝液(0.1 M磷酸鹽和0.15 M氯化鈉，pH 7.2)平衡後，將400 μL血清加入Nab Protein G Spin column中，然後翻滾式混合(end-over-end mixing) 10分鐘並以5,800 x g離心1分鐘。利用結合緩衝液(400 μL)洗滌管柱三次。隨後，將洗脫緩衝液(400 μL，0.1 M甘胺酸，pH 2.0)加入spin column中再以5,800 x g離心1分鐘後洗脫抗體。將洗脫的抗體與中和緩衝液(400 μL, 0.1 M Tris, pH 8.0)混合，並透過使用Nano-Drop於OD₂₈₀ 測定以測量這些純化抗體的濃度，以BSA (牛血清白蛋白)作為標準品。h. 結果

利用ELISA評估來自接受免疫接種之天竺鼠血清之針對DPR胜肽或胜肽免疫原的免疫原性效價。

第7圖顯示在利用3種不同DPR胜肽免疫原結構免疫的天竺鼠中在15週期間內的抗血清特性。利用10倍連續稀釋方式稀釋來自0、3、6、9、12和15 wpi的天竺鼠抗血清。利用DPR胜肽或胜肽免疫原塗覆ELISA微量盤。利用A₄₅₀ 臨界值設為0.5之A₄₅₀ 的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log₁₀ 表示。

然後將含有poly-GA胜肽的DPR胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 236、237和238)的ELISA數據繪製為如第7圖所示的圖形，其中將用於免疫動物的相同胜肽免疫原結合到ELISA微量盤上用於分析。所有DPR免疫原結構均表現出針對相對應DPR胜肽或胜肽免疫原的高免疫原性。ELISA結果顯示，在免疫之前於第0週，各組別均未觀察到可偵測的抗體效價。數據顯示DPR胜肽免疫原結構中二胜肽重複的長度對抗體效價產生中度影響。具體而言，poly-GA 10、15和25個重複的結構(分別為SEQ ID NO: 236、237和238) 彼此具有不同的免疫原性，如第7圖所示。

有趣的是，B細胞抗原決定位胜肽的長度可影響胜肽免疫原結構的免疫原性譜。第7圖(左圖)顯示GA₁₀ 胜肽免疫原結構(SEQ ID NO: 236)的免疫原性以規律增加的方式隨著時間穩定地增加，而第7圖(中圖)顯示了GA₁₅ 胜肽免疫原結構(SEQ ID NO: 237)的免疫原性在下降之前約在9 wpi達到峰值，且第7圖(右圖)顯示GA₂₅ 胜肽免疫原結構(SEQ ID NO: 238)的免疫原性以規律增加的方式隨著時間穩定地增加。

第7圖的結果表明，免疫反應可以受到影響，此取決於胜肽免疫原結構中所使用B細胞抗原決定位的長度。i. 摘要

此實驗的結果表明，利用胜肽免疫原結構所引起的免疫反應(包括抗體效價、C_max 、抗體產生的開始、反應的持續時間等)可以透過胜肽免疫原結構中所使用之B細胞抗原決定位的長度來加以調節。因此，可以透過改變在胜肽免疫原結構中之B細胞抗原決定位的長度來設計針對目標抗原部位的特異性免疫反應，其有助於訂製針對任何患者或受試者之個體特徵的個人化醫療。實施例 4. 胜肽免疫原結構的免疫原性可取決於投予胜肽的劑量和給藥方案

胜肽免疫原結構之各種劑量和給藥方案的免疫和評估在下文詳細描述。a. UB-311 疫苗 (Aβ 胜肽免疫原 )

Aβ疫苗(UB-311)包含2種胜肽免疫原，每種都具有胺基端Aβ_1-14 胜肽，其透過胺基酸間隔子合成地連接至衍生自2種病原體蛋白質(B型肝炎表面抗原及麻疹病毒融合蛋白)的不同Th細胞抗原決定位胜肽(UBITh®抗原決定位)。具體來說，與麻疹病毒融合蛋白連接的胜肽免疫原是Aβ_1-14 -εK-KKK-MvF5 Th (SEQ ID NO: 67)，而與B型肝炎表面抗原連接的胜肽免疫原是Aβ_1-14 -εK-HBsAg3 Th (SEQ ID NO: 68)。

UB-311配製於含有明礬的Th2偏向遞送系統中，並含有等莫耳比值的Aβ_1-14 -εK-HBsAg3和Aβ_1-14 -εK-KKK-MvF5 Th胜肽。將2種Aβ免疫原與聚陰離子CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成微米級顆粒的穩定免疫刺激複合物。將鋁礦物鹽(ADJU-PHOS®)加入到最終劑型中，同時加入氯化鈉調整滲壓性及0.25%的2-苯氧基乙醇作為防腐劑。b. 在天竺鼠中所使用不同劑量的 UB-311

將Aβ疫苗(UB-311)以含有0 µg、1 µg、3µg、10 µg、30 µg、100 µg、300 µg、600 µg和1,000 µg之總胜肽免疫結構的劑量在0、3和6 wpi投予天竺鼠。在0、3、5、7和9 wpi時採集血清樣品以評估抗體效價。

第8圖是顯示針對每個免疫劑量所獲得之抗體效價結果的圖式。結果顯示，免疫接種中所使用的胜肽量可以對抗體效價產生明顯的影響；但是，應針對每種劑量評估最佳技術效果。具體地，第8圖顯示，將投予胜肽的劑量從0 µg增加至600 µg直接地對應於免疫原性的增加。然而，當投予1,000 µg胜肽免疫原時，與較低劑量的胜肽免疫原結構相比(將300 µg和600 µg與1,000 µg相比)，免疫原性實際上是降低。因此，由胜肽免疫原結構所獲得的最佳免疫原性不是線性的，且應針對每種胜肽免疫原結構進行仔細評估。c. 在天竺鼠中 UB-311 的不同給藥方案可影響免疫原性

評估Aβ疫苗(UB-311)的給藥方案，以確定作為初始劑量和加強劑量投予的胜肽免疫原結構的量是否可以影響組成物的整體免疫原性。

利用不同的初始劑量和加強劑量進行投予，將UB-311疫苗在0、3和6 wpi投予天竺鼠。具體而言，一組動物在週數0 wpi投予劑量為100 µg的UB-311進行初次免疫，然後利用2個劑量之400 µg的UB-311進行加強免疫；而第二組動物在週數0 wpi投予劑量為400 µg的UB-311進行初次免疫，然後利用2個劑量之100 µg的UB-311進行加強免疫。此實驗的結果如第9圖所示。

第9圖顯示給藥方案可對UB-311組成物的免疫原性(C_max 和持續時間)產生影響。具體而言，與使用高劑量(400 µg的UB-311)進行初始免疫並使用較低劑量(100 µg的UB-311)進行加強免疫的動物相比，使用低劑量(100 µg的UB-311)進行初始免疫並使用高劑量(400 µg的UB-311) 進行加強免疫的動物獲得較高且較長的C_max 。

這項研究的結果表明，給藥方案可以影響胜肽免疫原結構的免疫原性。

第10圖提供給藥方案可以影響胜肽免疫原結構的免疫原性的另一個實例。具體而言，第10圖顯示利用Aβ疫苗(UB-311)進行關於3個月的加強免疫方案(上圖)或6個月的加強免疫方案(下圖)在利用300 µg的Aβ疫苗(UB-311)免疫人類受試者後透過ELISA獲得的抗Aβ_1-28 抗體效價。每個圖中的方框部分突出顯示研究中所有人類受試者的平均效價。

第10圖的結果表明，可以實現不同的免疫原性譜，其取決於提供給受試者的給藥方案。d. 在大鼠中所使用之 LHRH 胜肽免疫原結構的不同給藥方案

評估包含不同量之LHRH胜肽免疫原結構的製劑的給藥方案，以確定胜肽免疫原結構的總量是否可影響製劑的免疫原性。

具體而言，利用含有如表10所示的3種胜肽的LHRH組成物免疫三隻大鼠。一組大鼠是利用100 µg的3種LHRH胜肽免疫原進行免疫；而第二組大鼠則利用300 µg的3種LHRH胜肽免疫原進行免疫。評估免疫原性和睪固酮濃度，並在第11A和11B圖中報導。

第11A圖顯示利用100 µg的LHRH製劑免疫大鼠後所獲得的抗體效價和睪固酮濃度。第11B圖顯示利用300 µg的LHRH製劑免疫大鼠後所獲得的抗體效價和睪固酮濃度。第11A和11B圖表明，對於LHRH胜肽免疫原結構而言，與較低劑量的LHRH胜肽免疫原結構相比， 300 µg的較高劑量導致較高的抗LHRH效價和較高的睾固酮濃度降低。

因此，第11A和11B圖的結果表明，胜肽免疫原結構的劑量水平與所達成的技術效果之間具有直接的相關性。e. 摘要

此實驗的結果表明，利用胜肽免疫原結構所引起的免疫反應(包括抗體效價、C_max 、抗體產生的開始、反應的持續時間等)可以透過使用不同的給藥方案來加以調節。因此，可以透過改變於病人或受試者的給藥方案來設計針對目標抗原部位的特異性免疫反應，其有助於訂製針對任何患者或受試者之個體特徵的個人化醫療。實施例 5. 胜肽免疫原結構的免疫原性可取決於所使用的佐劑

如下所述，針對配製在不同佐劑中的IL-6、IgE EMPD和LHRH胜肽免疫原結構進行免疫和評估。a. IL-6 胜肽免疫原結構

評估使用不同佐劑之包含IL-6胜肽免疫原結構的製劑的免疫原性。在CIA大鼠中進行的POC研究表明，設計的胜肽免疫原結構具有高免疫原性和針對IL-6誘發的致病機轉的治療功效，此暗示其於類風濕關節炎和其他自體免疫疾病中的潛在免疫治療應用。以下研究集中在胜肽免疫原結構的優化、佐劑的選擇和於CIA Lewis大鼠中之劑量的確定。

在大鼠CIA免疫研究中，將作為不同佐劑的MONTANIDE ISA 51和ADJU-PHOS與相同的胜肽免疫原(SEQ ID NO: 243)和CpG一同配製以分別地進行評估。分為5組的每組五隻大鼠接受兩種佐劑製劑中的一種，對於這兩種不同的佐劑而言總共有10組。利用配製於0.5 ml體積中為5、15、45、150 µg的不同劑量透過i.m.途徑在第-7、7、14、21和28天進行初次免疫和加強免疫以注射治療組中的所有動物，並進行臨床觀察直至第35天。在兩個不同的無胜肽免疫原的佐劑安慰劑組中僅接受製劑中的佐劑載體的注射。

利用針對塗覆在微量盤上之大鼠IL-6重組蛋白的ELISA測定抗IL-6效價。結果顯示，透過ELISA分析，利用兩種不同佐劑載體注射的兩個安慰劑組均未發現可檢測到的抗IL-6抗體效價，而使用兩種佐劑製劑利用IL-6免疫原結構(SEQ ID NO: 243)免疫的所有治療組均產生針對大鼠IL-6的抗體。一般而言，結果顯示觀察到劑量依賴性方式，特別是對於使用ISA 51製劑的組別(第12圖)。與用ADJUPHOS佐劑製備的製劑之低於4 (log₁₀ )的免疫原性相比，ISA 51製劑在接受免疫接種的大鼠中誘導的免疫反應高於ADJUPHOS製劑， ISA 51製劑的免疫原性分別地在所有劑量下均具有超過4的Log₁₀ 數值。

第12圖顯示使用ISA 51/CpG或ADJU-PHOS/CpG配製之不同劑量的SEQ ID NO: 243免疫的大鼠在43天期間內的抗體反應動力學。利用重組大鼠IL-6塗覆ELISA微量盤。利用4倍連續稀釋將血清從1:100稀釋至1:4.19 x 10⁸ 。利用非線性回歸透過將0.45的臨界值合併到每個血清樣本的4-參數羅吉特曲線中來計算待測血清的效價，表示為Log₁₀ 。

此實驗的結果表明，佐劑的選擇可對胜肽免疫原結構的免疫原性具有顯著的技術效果。b. IgE EMPD 胜肽免疫原結構

評估使用不同佐劑之包含IgE EMPD胜肽免疫原結構的製劑的免疫原性。在獼猴中進行的POC研究表明，設計的胜肽免疫原結構具有高免疫原性和針對IgE EMPD誘發的致病機轉的治療功效，此暗示潛在免疫治療應用。以下研究集中在胜肽免疫原結構的優化和使用IgE EMPD胜肽免疫原結構之佐劑的選擇。

在獼猴免疫研究中，將作為不同佐劑的ADJU-PHOS和MONTANIDE ISA 51與相同的IgE EMPD胜肽免疫原(SEQ ID NO: 244)和CpG一同配製以進行評估。

第13A和13B圖顯示說明使用配製在不同佐劑中各種量之SEQ ID NO: 244的IgE-EMPD胜肽免疫原結構免疫獼猴後所獲得的抗IgE-EMPD抗體效價的圖式。第13A圖顯示使用ADJUPHOS作為佐劑使用CpG3配製成穩定化的免疫刺激複合物所獲得的抗體效價；而第13B圖顯示使用MONTANIDE ISA51作為佐劑使用CpG3配製成穩定化的免疫刺激複合物所獲得的抗體效價。

此實驗的結果表明，與含有ADJUPHOS的製劑相比，當與MONTANTIDE ISA51一起使用時，配製在不同佐劑中的IgE EMPD胜肽免疫原結構具有更高的免疫原性(第13A和13B圖)。因此，使用不同的佐劑可對胜肽免疫原結構產生不同的技術效果(免疫原性)。c. LHRH 胜肽免疫原結構

評估使用不同佐劑之包含LHRH胜肽免疫原結構的製劑的免疫原性。在豬隻中進行的POC研究表明，設計的胜肽免疫原結構具有高免疫原性和針對LHRH誘發的致病機轉的治療功效，此暗示潛在免疫治療應用。以下研究集中在胜肽免疫原結構的優化和使用LHRH胜肽免疫原結構之佐劑的選擇。

在豬隻免疫研究中，將作為不同佐劑的Emulsigen D和MONTANIDE ISA50V與相同濃度之相同的LHRH胜肽免疫原(SEQ ID NOs: 239-241)一同配製以進行評估。

第14A和14B圖顯示說明使用配製在不同佐劑中各種量之SEQ ID NOs: 239-241的LHRH胜肽免疫原結構免疫豬隻後所獲得的抗LHRH抗體效價的圖式。第14A圖顯示使用Emulsigen D作為佐劑所獲得的抗體效價；而第14B圖顯示使用MONTANIDE ISA50V作為佐劑所獲得的抗體效價。

此實驗的結果表明，與含有Emulsigen D的製劑相比，當與MONTANTIDE ISA50V一起配製時，配製在不同佐劑中的LHRH胜肽免疫原結構具有不同的技術效果(睪固酮濃度下降)(第14A和14B圖)。因此，使用不同的佐劑可對胜肽免疫原結構產生不同的技術效果(作用持續時間，即，在此案例為免疫去勢)。d. 摘要

此實驗的結果表明，利用胜肽免疫原結構所引起的免疫反應(包括抗體效價、C_max 、抗體產生的開始、反應的持續時間等)可以透過選擇製劑(此製劑含有相同濃度的胜肽免疫原結構)中所使用的佐劑來加以調節。因此，可以透過改變化學連接至B細胞抗原決定位的Th抗原決定位或製劑中所使用的佐劑來設計針對目標抗原部位的特異性免疫反應，其有助於訂製針對任何患者或受試者之個體特徵的個人化醫療。實施例 6 . 於天竺鼠體內靶向 AΒETA 胜肽而非 Th 抗原決定位 之胜肽免疫原結構的獨特免疫原性

利用以等莫耳比值配製在一起的胜肽免疫原結構Aβ_1-14 -εK-KKK-MvF5 Th (SEQ ID NO: 67)和Aβ_1-14 -εK-HBsAg3 Th (SEQ ID NO: 68)在第0週和第4週免疫接種六隻天竺鼠。在第8週，將動物放血並收集血清樣品，以利用ELISA試驗測定抗Aβ胜肽和抗Th抗原決定位抗體效價(log₁₀ )。所有6隻天竺鼠的抗體反應特異性地靶向Aβ_1-42 胜肽而非兩種人工Th抗原決定位(MvF5 Th和HBsAg3 Th)，如表11所示。實施例 7 . 於來自利用 UB-311 疫苗免疫接種之動物的狒狒和食蟹獼猴周邊血液單核球細胞 (PBMC) 培養的細胞免疫反應

利用Ficoll-hypaque梯度離心分離來自利用UB-311免疫接種之狒狒和食蟹獼猴的周邊血液單核球細胞(PBMC)。針對胜肽誘導的增生和細胞因子產生，將細胞(每個孔洞含有2×10⁵ 個細胞)單獨培養，或將細胞與添加的個別胜肽功能區塊(包括Aβ_1–14 、Aβ_1–42 、UBITh®和不相關的胜肽)一起培養。以有絲分裂促進劑(PHA、PWM、Con A)作為陽性對照組(於培養物中體積百分比為1% (v/v)，濃度為10 µg/ mL)。在第6天，將1 µCi的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)加入三個重複培養孔洞中的每一個孔洞內。培養18小時後，收穫細胞並測定3H-TdR嵌合。刺激指數(S.I.)表示抗原存在下的cpm除以抗原不存在時的cpm；S.I. > 3.0被認為是顯著的。

來自食蟹獼猴PMBC培養物的細胞因子分析(IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、TNFα、IFNγ)是在僅有培養基或在胜肽功能區塊或有絲分裂促進劑存在下的等分試樣上進行。根據試劑盒說明將猴特異性細胞因子三明治ELISA試劑盒(U-CyTechBiosciences, Utrecht, The Netherlands)用於測定個別細胞因子的濃度。

在免疫動物的第15、21和25.5週從由獼猴收集的全血中分離PMBCs。在各種Aβ胜肽(Aβ_1-14 和Aβ_1-42 )存在下培養分離的PBMCs。

當在培養基中加入Aβ_1-14 胜肽時，未觀察到淋巴細胞的增生反應。然而，當將Aβ_1-42 胜肽加入PBMC培養物時，發現了陽性增生反應。

還在Aβ胜肽或PHA有絲分裂促進劑存在下針對細胞因子分泌測試在第15、21和25.5週收集的PBMC樣品。如表12所示，三種細胞因子(IL-2、IL-6、TNFα)顯示出對於全長Aβ_1–42 胜肽而非Aβ_1–14 胜肽反應之可檢測的分泌；與安慰劑疫苗樣品相比，在UBITh® AD疫苗處理的樣品中未檢測到細胞因子分泌的向上調節。在Aβ胜肽存在下測試的三種其他細胞因子(IL-10、IL-13、IFNγ)在所有PBMC培養物中低於試驗檢測極限。

利用僅具有具有外源T輔助細胞抗原決定位的胺基端Aβ_1-14 胜肽免疫原的UB-311疫苗免疫食蟹獼猴，其沒有Aβ_17-42 胜肽功能區塊，表明在Aβ_1-42 胜肽存在下於PBMC培養物中所注意到的陽性增生結果與UB-311疫苗反應無關，而是對天然全長Aβ的背景反應。

這些結果支持僅具有Aβ_1-14 和外源T輔助細胞抗原決定位的UB-311疫苗的安全性，表明它不會對正常食蟹獼猴中的天然全長Aβ胜肽產生潛在的炎症性抗自身細胞介導的免疫反應。相反，在AN-1792疫苗臨床試驗研究中與腦炎相關的不良事件部分歸因於在此疫苗的單體或纖維/聚集的Aβ_1-42 免疫原中包含T細胞抗原決定位。實施例 8. 來自利用 UB311 疫苗免疫之阿茲海默症病人的 PBMC 的淋巴細胞增生分析及細胞因子分析

利用Ficoll-hypaque梯度離心分離來自患有阿茲海默症的患者的周邊血液單核球細胞(PBMC)。針對胜肽誘導的增生和細胞因子產生，以三重複的方式，將細胞(每個孔洞含有2.5×10⁵ 個細胞)單獨培養，或將細胞與添加的個別胜肽功能區塊(終濃度為10 μg/mL)一起培養，胜肽功能區塊包括Aβ_1–14 (SEQ ID NO: 56)、Aβ_1–16 (SEQ ID NO: 57)、Aβ_1–28 (SEQ ID NO: 59)、Aβ_17–42 (SEQ ID NO: 58)、Aβ_1–42 (SEQ ID NO: 60)和不相關的38-mer胜肽(p1412)。將培養物於具有5%二氧化碳之環境在37°C下培養72小時，然後從每個孔洞中取出100 μL上清液並在-70℃冷凍供細胞因子分析。在每個孔洞中加入10 μL含有0.5 μCi的³ H-胸腺嘧啶核苷(³ H-TdR, Amersham, Cat No. TRK637)的培養基，並培養18小時，然後利用液體閃爍計數器檢測放射性同位素嵌合。有絲分裂促進劑植物凝集素(PHA)作為淋巴細胞增生的陽性對照組。沒有Aβ胜肽或含有PHA有絲分裂促進劑之單獨培養的細胞作為陰性和陽性對照組。刺激指數(S.I.)計算為具有Aβ胜肽之三重複實驗培養物的每分鐘計數(cpm)平均值除以三重複陰性控制組培養物的平均cpm；SI > 3.0被認為是顯著的增生反應。a. 增生分析

由從接種UB-311疫苗之患有阿茲海默症的患者在第0週(基線)和第16週(接種第三劑後4週)收集的全血中分離出周邊血液單核球細胞樣品，然後在缺乏或存在各種Aβ胜肽的情況下進行培養。如表13所示，當在培養基中加入Aβ_1–14 、其他Aβ胜肽或p1412 (不相關的控制組胜肽)時，未觀察到淋巴細胞的顯著增生反應。如所預期的，當將PHA有絲分裂促進劑加入培養基時，可注意到陽性增生反應。在UB-311免疫接種之前和之後觀察到對PHA的類似反應(p=0.87)表明研究受試者的免疫功能沒有顯著改變(表13)。

統計分析。透過配對t檢定檢查第0週和第16週之間淋巴細胞增生的差異。透過雙尾檢定測定統計顯著性水平(p >0.05)。R版本2.14.1用於所有統計分析。b. 細胞因子分析

來自PBMC培養物的細胞因子分析(IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)是在僅具有細胞或在Aβ胜肽功能區塊或PHA存在下的培養基等分試樣上進行。根據製造商的說明書將人類特異性細胞因子三明治ELISA試劑盒(U-CyTech Biosciences, Utrecht, The Netherlands)用於測定個別細胞因子的濃度(pg/mL) (Clin Diag Lab Immunol. 5(1):78-81 (1998))。

將在第0週和第16週從接種UB-311疫苗之阿茲海默症患者收集的PBMC樣品也用於測試細胞因子分泌，其在僅有細胞(陰性控制組)或存在Aβ胜肽、p1412 (不相關的胜肽)或PHA有絲分裂促進劑(陽性控制組)的情況下培養3天後進行測試。試劑盒的可定量範圍介於5和320 pg/mL之間。低於5 pg/mL或高於320 pg/mL的任何測量濃度分別表示為低於定量極限(BQL)或高於定量極限(AQL)。但是，出於統計考量，BQL或AQL分別用較低(5 pg/mL)或較高(320 pg/mL)的可量化限值替換。在第0週和第16週的每種細胞因子的平均濃度顯示於表14中。如所預期的，除了IL-2之外，在PHA存在下(陽性對照組)細胞因子產生顯著增加。在基線(第0週)和第16週可觀察到對利用Aβ_1–14 或其他Aβ胜肽刺激反應的細胞因子的產生，但是出現的大多數值與相對應的陰性對照組(僅有細胞)相似。

為了評估免疫接種後細胞介導的免疫反應的變化，將從基線到第16週平均細胞因子濃度的變化與陰性對照組進行比較，並透過配對Wilcoxon符號秩檢驗(paired Wilcoxon signed-rank test)進行檢定。在對全長Aβ_1–42 胜肽反應中顯示出四種細胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)的分泌顯著增加；此觀察結果可能是由於Aβ_1–42 聚集體的構型抗原決定位。在Aβ_1–14 或其他Aβ胜肽中未檢測到細胞因子分泌的向上調節。c. 摘要

UB-311疫苗含有兩種胜肽免疫原，每種都具有分別與MvF5 Th和HBsAg3 Th抗原決定位合成連接的胺基端Aβ_1-14 胜肽。體外淋巴細胞增生和細胞因子分析用於評估UB-311疫苗免疫接種對細胞免疫反應的影響。當將Aβ_1–14 胜肽或任何其他Aβ胜肽加到培養基中時，沒有觀察到淋巴細胞的增生反應，如表13所示。除了Aβ_1–42 以外，在利用Aβ_1–14 和其他Aβ胜肽處理後未檢測到UB-311疫苗接種患者淋巴細胞之細胞因子分泌的向上調節，當與處理前第0週的水平相比時，Aβ_1–42 在UB-311免疫接種後於第16週引起4種細胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)明顯增加(表14)。透過Th2型T細胞反應的細胞因子釋放的增加更可能與UB-311疫苗反應無關，因為單獨使用Aβ_1–14 沒有檢測到向上調節。懷疑對Aβ_1–42 的反應是對天然Aβ的背景反應，其可能與Aβ_1-42 上鑑定的天然T輔助細胞抗原決定位有關。觀察到在對PHA的反應中缺乏IL-2產生，這與利用正常人PBMC在相似的實驗條件下於Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5:78-81中由Katial RK等人報導的結果一致。總之，這些結果表明，UB-311疫苗在參與第I期臨床試驗的輕度至中度阿茲海默症患者中未產生潛在的炎症性抗自身、細胞介導的免疫反應，從而進一步證明UB-311疫苗的安全性。實施例 9 . 相較於陰性控制組在具有中度免疫炎症反應之正常血液供體中的初始周邊血液單核球細胞 (PBMC) 內可以檢測到混雜人工 Th 反應細胞

ELISpot試驗用於檢測在正常血液供體中之初始周邊血液單核球細胞內的混雜人工Th反應細胞，以評估當與強效有絲分裂促進劑植物凝集素(PHA)和陰性對照組相比時其引發炎症反應的效力。

ELISpot試驗採用三明治酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)技術。為檢測T細胞活化，檢測IFN-γ或相關細胞因子作為分析物。將對所選分析物具有特異性的單株或多株抗體預先塗覆在以PVDF (聚偏氟乙烯)膜為底的微量盤上。將適當刺激的細胞移液到孔洞中，並將微量盤置於加濕的37°C CO₂ 培養箱中一段特定的時間。在培養期間，緊鄰分泌細胞的固定化抗體與分泌的分析物結合。在洗去任何細胞和未結合的物質後，將對所選分析物具有特異性的生物素化多株抗體加入孔洞中。在洗滌以移除任何未結合的生物素化抗體後，加入與鏈黴親和素蛋白結合的鹼性磷酸酶。隨後透過洗滌移除未結合的酵素，並加入受質溶液(BCIP/NBT)。形成藍黑色沉澱並在細胞因子定位的位點處出現斑點，每個個別的斑點代表個別分析物分泌細胞。利用自動ELISpot圖像分析儀系統或利用立體顯微鏡手動計數計算斑點的數目。

在進行的體外研究中，將PHA濃度為10µg/mL的培養物作為陽性對照組。針對呈現於定期正常血液供體中周邊血液單核球細胞內的反應細胞數目，測試UBITh®1 (SEQ ID NO:17)和UBITh®5 (SEQ ID NO:6)胜肽。製備具有SEQ ID NOs: 33至52混雜人工Th抗原決定位胜肽的混合物作為另一陽性對照組。單獨培養基作為在標準T細胞刺激細胞培養條件中的陰性對照組。簡而言之，將利用有絲分裂促進劑(濃度為10µg/mL的PHA)或Th抗原(UBITh®1、UBITh®5或多個Ths混合物，濃度為10µg/mL)刺激的PBMCs (體積為100µL/孔洞，含2x10⁵ 個細胞)在37°C下於CO₂ 培養箱中培養48小時。收集來自孔洞/微量盤的上清液。洗滌微量盤上的細胞並處理以檢測目標分析物，IFN-γ。

如第15圖所示，針對其對混雜人工UBITh®1或UBITh®5抗原決定位胜肽的反應細胞，將代表性供體1、2和3進行測試。利用初始供體總是偵測到壓倒性的IFN-γ ELISPOT數目(利用PHA培養PBMCs ；數量太多而無法計數)，而利用對照組培養基培養的PBMCs給出介於5到50之間的背景IFN-γ ELISPOT數目。針對利用UBITh®1或UBITh®5培養的初始供體PBMCs檢測到介於20至約120的中等ELISPOT數目。具有SEQ ID NOs: 33-52之多種Th胜肽的混合物也可與初始供體PBMCs培養以用於與ELISPOT數目(如同預期，其數目為20至約300)進行比較。相較於陰性對照組，此種由UBITh®1或UBITh®5胜肽引發的刺激反應約為3至5倍。

總而言之，在初始供體PBMCs中可以容易地偵測到混雜人工Th反應細胞，所述初始供體PBMCs準備好透過分泌特徵性細胞因子來產生免疫反應以幫助B細胞抗體產生和相對應的效應T細胞反應。在此使用IFN-γ作為實例說明這些Th抗原決定位胜肽的這種刺激性質。然而，這種刺激性炎症反應足夠適度的去產生合適的效應細胞反應(用於抗體產生的B細胞，用於殺死目標抗原細胞的細胞毒性T細胞)，以便在疫苗接種過程中不引起不利的炎症病理生理反應。實施例 10 . 用於個人化癌症免疫療法之基於新抗原決定位 (NEO-EPITOPE) 的胜肽免疫原結構及其製劑

我們正處於癌症治療的T細胞革命之中。在過去幾年中，諸如免疫檢查點抑制劑(ICI)和過繼細胞療法(如嵌合抗原受體T細胞(CAR-Ts))等新療法為數百萬罹患癌症的人們提供了新的希望。ICI藥物有助於克服癌症所構建的天然屏障，此屏障是用以防止我們自己的免疫系統(且特別是我們的T細胞)抵抗癌症。例如，CAR-T療法設計患者的T細胞以產生針對某些腫瘤細胞的免疫反應。這些新療法帶來了未來的療法，旨在“教育”T細胞以更高的準確度攻擊腫瘤。

個人化或新抗原的癌症疫苗越來越令人興奮，其為數百萬罹患癌症的人們提供了新的希望。新抗原是個人化的腫瘤突變，其被大多數人的免疫系統視為外來的。因此，個人化疫苗針對這些新抗原，其教育免疫系統發現並殺死腫瘤。

生物資訊學、蛋白質體學、基於細胞的分析和非標準方法已被廣泛應用於有效鑑定真正的新抗原。在微衛星和外顯子的剪接錯誤(mis-splicing)中由INDELs (即短的插入和刪除)形成的RNA框移突變 (RNA frameshift (FS))變異體是高免疫原性新抗原的豐富來源。

含有所有可能的(例如400K) FS(框移突變)腫瘤衍生胜肽的陣列可用於檢測來自一滴患者血液的抗體反應性，從而為癌症診斷和新抗原CTL抗原決定位的鑑定提供了傑出的工具。

可以使用RNAseq進行MHC分型(MHC typing)，而NetMHC和NetMHCpan可以用於預測新抗原結合親和力。

在體外HLA agnostic assay中，代表來自患者腫瘤的每個鑑定的突變的多胜肽被分別地遞送到它們自己的抗原呈現細胞(APCs)中，然後將其加工並在細胞表面上呈現胜肽，在此它們被各種效應T細胞所辨識。如果T細胞辨識並結合胜肽，將引發細胞因子反應。測量真實抗原並裁定其為“好”(即刺激性)或“壞”(即抑制性)。可以鑑定出患者的T細胞-CD4⁺ (輔助T細胞)和CD8⁺(殺手T細胞)二者反應的實際抗原，並選擇其作為新抗原決定位以用於設計新抗原決定位胜肽免疫原結構。

透過包括憑經驗證實的新抗原，患者對此新抗原具有已經存在的反應，因此開發了針對已經引發患者免疫系統的個人化癌症疫苗。

簡而言之，使用本揭露所描述的設計原理，使得衍生自特定經驗證實之新抗原(新抗原包含B或CTL新抗原決定位)的新抗原決定位胜肽可具有高免疫原性。具有共價連接至選擇之新抗原決定位的混雜人工Th抗原決定位的參與，此種新抗原決定位胜肽免疫原結構可以促進針對新抗原的抗體的誘導和維持，和誘導效應CTL功能，以及產生B和CTL記憶細胞，導致持續的B細胞和CTL反應與強大的抗腫瘤免疫力。

代表性公共新抗原，其具有用於黑色素瘤新抗原之選定目標抗原決定位序列、用於神經膠質瘤的組蛋白3變異體H3.3K27M和用於大腸直腸癌的KRAS (具有G變成D的突變體)，分別在表3A中顯示為SEQ ID NOs: 73、74和75。

本揭露設計的新抗原決定位胜肽免疫原結構及其製劑可以在臨床試驗中進一步評估安全性、免疫原性和功效，其由三部分組成： 1) 於沒有疾病跡象但具有很高的復發風險之癌症患者作為單一藥物治療的安全性和免疫原性的研究。 2) 於具有晚期或轉移性實體腫瘤患者將新抗原決定位疫苗與FDA批准的免疫檢查點抑制劑合併使用的安全性、免疫原性和功效的研究。 3) 於具有復發或難治性實體腫瘤的患者，其在使用免疫檢查點抑制劑治療後未能反應或癌症已經進展，將新抗原決定位疫苗作為單一藥物治療的安全性、免疫原性和功效的研究。

符合條件的患者(其針對皮膚黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)或泌尿上皮癌已完成治療(例如手術切除、術前輔助性及/或輔助性化療，及/或放射治療)，且CT或MRI無疾病證據)可參與這些癌症免疫治療。實施例 11. 用於癌症免疫治療的腫瘤相關醣類抗原 (TACA)-B 細胞抗原決定位免疫原結構及其製劑

腫瘤細胞的特徵在於異常的醣基化模式，其導致表面寡醣的異質性、截斷和過度表達。三種主要類別的醣類結構已被確認為潛在的腫瘤相關醣類抗原(TACAs)，顯示為GD3、GD2、Globo-H、GM2、Fucosyl GM1、PSA、Le^y 、Le^x 、SLe^x 、SLe^a 和STn，如第16圖所示。 (1)  黏液素(Mucin)相關的o-聚醣：Tn、TF和STn (2) 醣神經鞘脂質(Glyco-sphingolipids)：包括神經節苷脂(ganglioside) GM3、GM2、GD2、GD3、岩藻糖GM1神經節苷脂(fucosyl GM1)和中性紅細胞糖苷脂(globoside) globo H (3) 血型抗原：SLe^x 、Le^y Le^x 、SLe^a 和Le^y

Globol H在乳癌細胞表面表現作為醣脂並且是有吸引力的腫瘤標誌物。使用烯糖組裝方法合成Globol H六醣以進行寡醣合成。Globa H作為B-半抗原並且可以在還原末端配備官能基團以允許與表2中所示的Th輔助細胞胜肽共價固定以形成免疫原性胜肽結構。如Danishefsky和Livingston先前所述(網站：glycopedia.eu/Hetero-TACA-vaccines-based-on-protein-carriers)，比起使用KLH或別的常規載體蛋白的其他方法，在這類應用中使用所揭露的Th抗原決定位更加通用。

每個多胜肽的胺基端或於蛋白質的離胺酸(K)殘基側鏈中的一級胺在pH 7-9下可用以作為N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)類型之交聯連接子試劑的目標，以形成穩定的醯胺鍵，以及釋放N-羥基琥珀醯亞胺離去基。此外，m-順丁烯二醯亞胺苄醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) (MBS) (H.L. Chiang, et al.Vaccine. 2012 30(52), 7573–7581)、對硝基苯酯(PNP) (S.J. Danishefsky, et al. Acc. Chem. Res. 2015, 48(3), 643-652)以及不同鏈長的連接子也可以作為對於表2所示Th輔助細胞胜肽而言重要的TACA結合連接子。

本揭露人工Th抗原決定位可用於癌症疫苗組成物，其包含：(a)免疫原性組成物，其包含基本上為Globol H或其免疫原性片段的聚醣；(b)與表2所示的混雜人工T輔助細胞抗原決定位胜肽共價連接的免疫原性片段。從羧基端到胺基端利用去保護/偶聯透過固相胜肽合成(SPPS)和Fmoc化學逐步分別製備表2所示的Th抗原決定位胜肽(例如，UBITh®)。相應地構建目標胜肽序列。

利用透過Kaiser試驗監測的偶聯反應，透過在固相樹脂上直接形成醯胺鍵，使聚醣可以利用或不利用間隔子而與人工Th抗原決定位胜肽連接。兩種策略可以用於這種偶聯：(1)製備具有活化離去基的聚醣衍生物，然後與結合連接Th胜肽之間隔子的樹脂進行偶聯，其中胺基端具有游離胺或(2)將樹脂結合的胺基端胺基轉化成為活化酯，然後與聚醣進行偶聯反應。聚醣與樹脂結合和間隔子-Th胜肽的直接偶聯將允許與位在樹脂結合的游離胺基團上的活化基團進行更有效的偶聯反應，然後透過標準樹脂釋放裂解反應從樹脂釋放偶聯聚醣胜肽。兩個游離大分子(例如多醣和長鏈胜肽)之間的立體阻礙將使聚醣–胜肽偶聯反應更困難，因此效率更低且產率低。

在一些方面，B-半抗原連接的T輔助載體是表2描述的間隔子連接的Th-胜肽。

在一些實施例中，連接子是對硝基苯基連接子、N-羥基琥珀醯亞胺連接子、對硝基苯酯(PNP酯)或N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS酯)。NHS酯可以在pH 7-9下與一級胺反應以形成穩定的醯胺鍵，同時釋放N-羥基琥珀醯亞胺離去基。

在此實施例中使用以下縮寫：PNP：對硝基苯酯；NPC：N-硝基苯基氯甲酸酯；DSS (雙琥珀醯亞胺辛二酸酯)；和NHS：N-羥基琥珀醯亞胺；MBS：m-順丁烯二醯亞胺苄醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯。

包括以下化學反應和製備步驟(第17至21圖)以說明各種實施例。1. 利用對硝基苯基 (PNP) 基團製備活化的 UBITh®

可以透過自動化固相合成和Fmoc化學合成人工Th抗原決定位(例如，UBITh®)載體。在對延伸胜肽鏈上的胺基端胺基酸進行Fmoc-去保護後，透過利用配製於含有10％三乙胺的DMF溶液中的4-硝基苯基氯甲酸酯(NPC, 10 eq)處理，可以將游離胺基轉化為活性4-硝基苯基基團。可以利用DCM溶液洗滌得到的胜肽-樹脂混合物以移除試劑和4-硝基苯酚殘餘物。可以獲得具有對硝基苯基基團之欲求的活化UBITh®，用於進一步與聚醣共軛。2. 利用 N- 羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 基團製備活化的 UBITh®

可以利用自動化固相合成和Fmoc化學合成UBITh®胜肽載體。在對延伸胜肽鏈上的胺基端胺基酸進行Fmoc-去保護後，透過利用配製於DMF溶液中的DSS處理，可以將游離胺基轉化為活性N-羥基琥珀醯亞胺。可以利用DCM溶液洗滌得到的胜肽-樹脂以移除試劑殘餘物。可以獲得具有N-羥基琥珀醯亞胺基團之欲求的活化UBITh®，用於進一步與聚醣共軛。3. Globol H 共軛 UBITh® 胜 肽的合成

具有末端胺基的Globol H六醣類似物(2)的製備可以透過遵循一鍋合成策略來實現(C.Y. Huang, et al., Proc. Natl Acad Sci USA 2006, 103, 15-20)。簡而言之，可以將Globol H溶液引入活化的UBITh®-樹脂中，然後輕輕混合3小時。在從樹脂上裂解並完全去保護後，可透過預備的高效液相層析儀(HPLC)純化粗Globol H共軛UBITh®胜肽，並透過基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)和反相HPLC分析描繪特性。4. Globol H 活化酯的製備

可將Globol H己胺(2)溶解在無水DMF溶液中。然後加入p-Nitrophenyl adipate diester並在室溫下攪拌2-4小時。可以利用TLC和Kaiser試驗監測反應，以檢查游離胺基團的消失。可在減壓而不加熱狀況下移除DMF溶劑，然後可將所得殘餘物利用二氯甲烷和含0.5％醋酸的水進行萃取三次。可以將得到的水溶液濃縮並透過逆相管柱(RP-C18)層析法進行純化(利用MeOH/含有1%醋酸的H₂ O進行等度沖提)。5. GM3 活化酯的製備

先前已經描述了GM3神經節苷脂類似物的合成和純化(Jacques S, et al.,J. Am. Chem. Soc., 2012 134(10):4521-4)。可將GM3類似物胺X (4.5 mg；5.2 µmol)溶解在二甲基甲醯胺(1.5 mL)中並加入三乙胺(3.0 eq.)。然後可加入p-Nitrophenyl adipate diester (10.0 eq.)。透過TLC (CH₂ Cl₂ –MeOH–H₂ O–AcOH; 4 : 5 : 1 : 0.5)監測，反應可被完成。利用醋酸將反應的pH調整至5.0，然後與甲苯(3×)共蒸發。可濃縮殘餘物，並且利用MeOH–含有1％醋酸之H₂ O的梯度透過HPLC (Beckman C18-矽膠半製備管柱)純化獲得的殘餘物。可以在CD₃ OD中獲得1H NMR光譜。6. Tn 活化酯的製備

可以基於先前的報導(T. Toyokuni, et al., Bioorg Med Chem. 1994, 11, 1119-32; and S.D. Scott, et al.,J. Am. Chem. Soc., 1998, 120(48), 12474–85)合成醣類Tn。將配製於無水CH₂ Cl₂ (25 mL)中的Tn類似物(6 mmol)、NHS (160 mg，1.39 mmol)和EDC (268 mg，1.40 mmol)在室溫下攪拌1小時。將混合物利用預冷的H₂ O (3x 30 mL)洗滌、乾燥(Na₂ SO₄ )並濃縮，以得到succinimide-ester衍生物(7)，其為無色漿狀物。7. 唾液酸化的路易斯寡糖 -X 抗原 (sLe^x ) 活性酯 (9) 的製備

可利用公開的合成策略(G. Kuznik, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7(5):577-580, 1997)達成sLe^x 四糖衍生物(8)的製備。將化合物(8)加入到加熱至室溫配製於DMF/DCM內的NPC (2 eq.)溶液中，並再攪拌30分鐘。可利用DCM和水溶液洗滌濃縮的粗混合物。可在減壓狀況下處理所得水溶液並利用RP C18管柱純化。8. 產生糖共軛物的一般程序

各個聚醣與各個樹脂結合間隔子合併的Th胜肽的標準偶聯反應是遵循標準胜肽鍵形成偶聯程序，其透過碳二亞胺偶聯反應利用常規固相胜肽合成儀而進行。

根據標準胜肽合成方法可將樹脂結合的聚醣–胜肽由樹脂移除，且回收、沈澱並凍乾。

可以利用自動化固相合成和Fmoc化學合成T細胞胜肽抗原決定位(例如UBITh®)載體。在對延伸胜肽鏈上的胺基端胺基酸進行Fmoc-去保護後，可以製造游離胺基提供給進一步的共軛反應。具有活化離去基修飾的Globo H、Tn、GM3、SLe^x 等的合成糖類類似物可溶解在DMF溶液中並加入到SPPS系統內以與UBITh®胜肽胺基端的胺進行反應。可以利用Kaiser試驗監測反應。在從樹脂上裂解並完全去保護後，可透過預備的高效液相層析儀(HPLC)純化醣類共軛UBITh®胜肽，並透過基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)和反相HPLC分析描繪特性。

總之，在此實施例中，詳細描述各個聚醣與表2所示的各個Th輔助細胞抗原決定位胜肽的有效共軛，以允許此種醣類–胜肽免疫原結構被有效地製備以用於後續的疫苗製劑。使用人工Th抗原決定位的這些醣類疫苗製劑可提供針對目標醣類抗原(此目標醣類抗原通常存在於癌細胞上)的聚焦抗體反應，以允許在臨床試驗中對癌症患者進行免疫療法。實施例 12 . 透過將混雜人工 T 輔助細胞抗原決定位連接至效應細胞抗原決定位（例如 CTL 抗原決定位）增強效應 T 細胞功能以及其用以開發針對病毒感染之通用 T 細胞疫苗的製劑 介紹

T輔助細胞攜帶表面標誌物CD4並表現稱為T細胞受體的表面受體，其由多胜肽異二聚體(稱為例如α/β)組成。T輔助細胞辨識與第2類MHC蛋白質結合的病毒胜肽，第2類MHC蛋白質通常位在抗原呈現細胞(APC)的表面。這些交互作用導致T輔助細胞活化、增生和分化，提供足夠高的結合親和力。

T輔助細胞(CD4⁺ T細胞)為先天和後天免疫系統的細胞提供可溶性介質和受體-配體交互作用，觸發和調節它們的效應功能。這些細胞是異源群體，迄今為止，已經描繪了幾個亞群的特性，包括：Th1、Th2、Th17和T濾泡輔助(Tfh)細胞。還有調節性CD4⁺ T細胞(Tregs)，其抑制T輔助細胞和細胞毒性亞群的生長和功能。

每種類型的效應T細胞是由關鍵轉錄調節因子所控制，表現不同的細胞表面分子陣列，並分泌“特徵”細胞因子，其共同促進T細胞亞群在免疫系統內的特定作用。

Tfh細胞與其他輔助細胞亞群的區別在於它們具有歸巢到B細胞濾泡的獨特能力，並可為抗原特異性B細胞(抗原特異性B細胞正在經歷其Ig V區基因的體細胞超突變(SHM)和改變其對抗原的親和力)提供幫助。Tfh細胞分泌細胞因子IL-21，其為B細胞分化和針對病毒之高親和力、類別轉換的抗體反應發展所必需。Tfh介導的訊息可確保選擇對免疫抗原具有更高親和力的B細胞，然後其可分化成為長壽漿細胞或記憶B細胞。由於透過SHM過程可能出現自身反應性B細胞殖株和所選殖株的長壽，因此存在嚴格的耐受性機制以控制從Tfh細胞向B細胞遞送正選擇訊息是至關重要的。

Th1細胞主要參與增強細胞毒性反應。這些細胞透過刺激細胞毒性T細胞前體的成熟，部分透過分泌細胞因子IL-2和IFN-γ，以促進針對病毒感染之細胞介導的反應。Th1細胞還分泌腫瘤壞死因子(TNF)、介導延遲性過敏反應，並促進IgG2a抗體的產生。Th1細胞透過活化位於病毒感染部位的巨噬細胞和其他T細胞而大大增強免疫反應。這種反應是延遲性過敏反應的基礎，延遲性過敏反應是許多病毒感染致病機轉的公認部分。

其他Th細胞，包括Th2和Th17細胞，也透過促進炎症或產生特異性抗體同型而有助於針對病毒感染的免疫反應。

一些T細胞可向下調節其他T細胞及/或B細胞反應。CD4⁺ T細胞的不同亞群稱為調節性T細胞(T-regs)。有兩種基本類型的T-regs：(1)在負選擇期間於胸腺中產生的tTregs，並且被認為主要涉及控制自體免疫疾病；(2)在免疫反應期間誘導的iTregs，且其參與終止免疫反應並使免疫系統恢復至持恆狀態。T-reg細胞還可以幫助維持保護和免疫介導的病理之間的平衡。

輔助T細胞在胜肽疫苗接種中的影響是巨大的。CD4⁺ T輔助細胞在活化後可透過同源T輔助細胞抗原決定位的包含物提供強烈的可持續CD8⁺ T細胞反應。鑑於CD4 T細胞的局部免疫調節功能，較佳活化衍生自靶向病毒或腫瘤之抗原位於目標組織中的同源幫助(cognate help)。外來抗原以及甚至腫瘤相關蛋白質通常含有免疫原性強度 (Th抗原決定位)，其作為免疫系統的熱點。如同在本發明中設計和描述的胜肽免疫原結構，其透過將選擇的混雜人工Th抗原決定位共價連接至目標B或效應T細胞(例如CTL)抗原決定位，可以促進APC、CD4和CD8 T細胞的緊密交互作用，以誘導最佳和保護性CD8 T細胞反應。用於併入病毒特異性通用 T 細胞疫苗中之作為目標抗原部位的 CTL 抗原決定位胜肽的實例 1. HIV CTL 疫苗成分

儘管有抗反轉錄病毒療法(ART)，人類免疫缺陷病毒(HIV)-1仍然存在於穩定的潛伏病毒庫中，主要存在於靜默記憶CD4+ T細胞中。此病毒庫是治癒HIV-1感染的主要障礙。為了清除病毒庫，已經在體外和體內測試潛伏HIV-1的藥理學再活化。一個關鍵剩餘的問題是病毒特異性免疫機制(包括細胞毒性T淋巴球(CTLs))是否可以在潛伏逆轉後在ART治療患者中清除感染細胞。在廣泛的資料探勘之後，鑑定出在測試的每個慢性感染患者中可辨識來自未突變潛伏HIV-1之抗原決定位的CTL，其利用被併入通用HIV T細胞疫苗設計中如表3B (SEQ ID NOs: 76-82)所示的此種CTL抗原決定位的特定胜肽代表。慢性感染的患者保留廣譜病毒特異性CTL反應。預期透過這種HIV通用T細胞疫苗(此疫苗將這些具有與本發明混雜人工Th抗原決定位(SEQ ID NOs: 1-52)分別共價連接的CTL抗原決定位胜肽併入)適當加強這種反應，而導致潛伏病毒庫的消除。2. HSV CTL 疫苗成分

單純皰疹病毒感染高百分比的世界人口並建立潛伏感染，其中病毒基因組保留在感覺神經元中，但不產生病毒粒子。病毒從這種潛伏狀態的週期性再活化會導致病變，其可以影響口腔和嘴唇、生殖道和眼角膜的粘膜表面，並且不太頻繁地影響皮膚和腦。HSV-2對從產道中獲取HSV-2的新生兒可能是致命的；角膜HSV-1感染是導致失明的主要傳染因素；並且腦部HSV-1感染佔病毒性腦炎病例的大約四分之一，其可能致命。已經進入臨床試驗的HSV-1疫苗主要設計用於抗體生產，並且效果不大。有證據表明CD8⁺ T細胞在控制小鼠和人類的HSV感染中具有重要作用。

第1型HSV (HSV-1)表現其基因順序為立即早期(α)、早期(β)、滲漏晚期(γ1)和真正晚期(γ2)，其中病毒DNA合成僅對γ2基因表現而言是絕對先決條件。γ1蛋白質醣蛋白B (gB)含有強免疫顯性CD8⁺ T細胞抗原決定位(gB_498–505 )，其被50％位於急性感染三叉神經節(TG)的CD8⁺ 效應T細胞和位於潛伏感染TG的CD8⁺ 記憶T細胞所辨識。

通過廣泛的資料探勘和全面的數據分析，將C57BL/6小鼠中的整個HSV特異性CD8⁺ T細胞庫納入以用於HSV CTL疫苗設計考量。此外，發現不同組的HSV-1 gB抗原決定位被來自有症狀的和無症狀之個體的CD4⁺ T細胞所辨識。其中，gB_166-180 、gB_661-675 和gB_666-680 被CD4⁺ CTLs靶向，其裂解自體HSV-1-和牛痘病毒(表現gB [VVgB])-感染的LCLs。gB_166-180 和gB_666-680 似乎優先被來自HSV-1-血清反應陽性健康“無症狀”個體的CD4⁺ T細胞辨識，而gB_661-675 似乎優先被來自嚴重“有症狀”個體的CD4⁺ T細胞辨識。一種有效的免疫治療性皰疹疫苗將排除潛在“有症狀的”gB_661-675 抗原決定位。此外，還鑑定了三個在無症狀個體中被高度辨識的VP11/12 CD8⁺ 抗原決定位，發現它們在眼部皰疹的“人源化”HLA-A*02:01基因轉殖小鼠模型中引發強烈的保護性免疫。

具有如表3B (SEQ ID NOs:83-106)所示此種CTL抗原決定位之特定胜肽代表的一系列HSV CTL抗原決定位被鑑定出來，其被併入本發明的設計中以用於開發基於通用多抗原決定位的HSV T細胞疫苗。3. 養猪產業中的 FMDV 、 PRRSV 和 CSFV 通用 T 細胞疫苗

口蹄疫病毒(FMDV)、豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)是養猪產業中導致生物體衰弱的病原體。開發針對這些病原體的有效疫苗在養猪產業中具有實際意義。

儘管接種疫苗後誘導的中和抗體在控制疾病和病毒傳播方面非常有效，但它們不會賦予跨亞型保護，並且可能由於抗原變化而變得無效。細胞免疫反應，尤其是細胞毒性T淋巴球(CTL)的產生，由於它們在開發針對各種病毒的有效和交叉保護性胜肽疫苗的潛力而受到很多關注。例如，CTL抗原決定位胜肽可用於開發交叉保護性人類流行性感冒疫苗(包括重組病毒載體和胜肽疫苗)；鑑定出針對FMDV之O血清型的CTL抗原決定位胜肽與其他FMDV血清型交叉反應。然而，大多數分析僅限於特定的病毒蛋白，並且僅能識別少數CTL抗原決定位。

在廣泛的資料探勘、設計、合成、勞動密集和耗時的免疫原性和功能測定程序之後，對大量精心設計CTL胜肽的評估允許驗證衍生自各種FMDV、PRRSV和CSFV病毒蛋白質的選定病毒特異性CTL抗原決定位。代表這些抗原決定位的選定的CTL胜肽顯示在表3B中，具有SEQ ID NOs:107-145。

在我們的選擇和鑑定的過程中，整合了生物資訊管道分析豬病毒序列以解決若干挑戰：(1)遺傳變異，(2)特定表面蛋白質的不完全篩選，以及(3)基於非豬白血球抗原的不適當預測。將CTL抗原決定位胜肽與混雜人工Th抗原決定位胜肽的適當連接所產生之本發明胜肽免疫原結構併入，其導致具有持續記憶和長持續時間CTL反應之T細胞疫苗的開發。這種針對FMDV、PRRSV、CSFV和其他經常破壞養猪產業之病毒感染基於高精確性有效胜肽的豬疫苗的商業開發對畜牧業至關重要。

表1. 用於胜肽免疫原結構設計包括理想化人工Th抗原決定位之病原體蛋白衍生的Th抗原決定位的胺基酸序列

表2. 任選的異源性間隔子和CpG寡核苷酸的例子

表3A. 目標抗原部位(B細胞抗原決定位)的例子 ^* 利用半胱胺酸取代的胺基酸劃有底線。

表3B. 目標抗原部位(CTL抗原決定位)的例子

表4. 例示性胜肽免疫原結構

表5. 第3、4A和4B圖中所使用的α-突觸核蛋白結構

表6. 第5圖中所使用的IgE-EMPD結構

表7. 第3和6圖中所使用的IL-6結構

表8. 用以評估29種不同Th抗原決定之免疫原性的投予天竺鼠的胜肽免疫原混合物

表8. (接續)

表9. 第7圖中所使用的二胜肽重複(DPR)結構

表10. 第13和14圖中所使用的LHRH結構

表11. 於天竺鼠體內靶向Aβ胜肽而非Th抗原決定位之Aβ_1-14 免疫原的獨特免疫原性

表12. 於15、21和25.5 wpi收集的接受UB311接種或正常食蟹獼猴周邊血液單核球細胞(PBMCs)中在利用Aβ_1-14 、Aβ_1-42 胜肽或PHA (植物凝集素)有絲分裂促進劑刺激後之細胞因子濃度的測定 ^a 結果顯示為平均值±標準偏差^b BDL，低於檢測水平

表13. 評估來自19名阿茲海默症患者PBMCs的刺激指數

表14. 評估來自19名患者之周邊血液單核球細胞(PBMC)在利用Aβ胜肽或PHA有絲分裂促進劑刺激後的細胞因子濃度^{1 1} 測定的可定量範圍為5至320 pg/mL² > 90％受試者的濃度高於量化限制上限(AQL>320 pg/mL)³ 1名患者有AQL值⁴ 6名患者有AQL值⁵ 8名患者有AQL值⁶ 4名患者有AQL值⁷ 在對PHA有絲分裂促進劑反應中觀察到缺乏IL-2產生與在類似實驗條件下報導的數據一致

表15. 具有來自病原體蛋白之傑出的異源性Th抗原決定位胜肽的IL-6 B細胞抗原決定位胜肽(C73-C83) (SEQ ID NO: 145)的免疫原性增強

無

第1A和1B圖顯示本文所述T輔助細胞抗原決定位平台之例示性製劑和特徵的示意圖。第1A圖是示意性概括的成分，其可以被包含在具有含有Th抗原決定位載體(包括UBITh®)之胜肽免疫原的製劑中。第1B圖總結本文所述T輔助細胞抗原決定位平台(包括UBITh®)的數個特徵和技術優勢。

第2圖顯示用以說明使用本文所述T輔助細胞抗原決定位平台可獲得之理論結果的圖式。

第3圖顯示利用所選個別Th抗原決定位胜肽和衍生自α突觸核蛋白(上圖)和IgE EMPD (下圖)之短的非免疫原性B細胞抗原決定位胜肽的胜肽免疫原結構的免疫原性增強。α突觸核蛋白之條形圖(上圖)下方的數字對應表5所述胜肽免疫原結構。而IgE EMPD之條形圖(下圖)下方的數字對應表6所述胜肽免疫原結構。

第4A和4B圖顯示用以說明利用如表8所示含有共價連接至個別Th抗原決定位之α-Syn (G111-G132)、IgE-EMPD (G1-C39)和IL-6 (C73-C83)的三種個別胜肽免疫原結構之混合物在免疫接種天竺鼠後所獲得利用ELISA測定之抗α-突觸核蛋白抗體效價的圖式。第4A圖包含評估的所有胜肽免疫原結構的抗體效價數據。第4B圖包含第4A圖中所示數據的子集合以強調不同的胜肽免疫原結構能夠以不同的速率達到相似的C_max 值。

第5圖顯示用以說明利用如表8所示含有共價連接至個別Th抗原決定位之α-Syn (G111-G132)、IgE-EMPD (G1-C39)和IL-6 (C73-C83)的三種個別胜肽免疫原結構之混合物在免疫接種天竺鼠後所獲得利用ELISA測定之抗IgE EMPD抗體效價的圖式。將在這些圖中評估的特異性IgE EMPD胜肽免疫原結構總結於表6中。

第6圖顯示用以說明利用如表8所示含有共價連接至個別Th抗原決定位之α-Syn (G111-G132)、IgE-EMPD (G1-C39)和IL-6 (C73-C83)的三種個別胜肽免疫原結構之混合物在免疫接種天竺鼠後所獲得利用ELISA測定之抗IL-6抗體效價的圖式。將在這些圖中評估的特異性IL-6胜肽免疫原結構總結於表7中。

第7圖顯示用以說明利用如表9所示胜肽免疫原結構在免疫接種天竺鼠後所獲得利用ELISA測定之抗DPR (二胜肽重複)抗體效價的圖式。

第8圖顯示用以說明利用不同量的Aβ疫苗(UB-311) (Aβ疫苗(UB-311)含有Aβ_1-14 -εK-KKK-MvF5 Th (SEQ ID NO: 67)和Aβ_1-14 -εK-HBsAg3 Th (SEQ ID NO: 68)兩種胜肽免疫原)在免疫接種天竺鼠後所獲得利用ELISA測定之抗Aβ_1-28 抗體效價的圖式。

第9圖顯示用以說明利用Aβ疫苗(UB-311) (Aβ疫苗(UB-311)含有Aβ_1-14 -εK-KKK-MvF5 Th (SEQ ID NO: 67)和Aβ_1-14 -εK-HBsAg3 Th (SEQ ID NO: 68)兩種胜肽免疫原)的不同初次免疫和加強免疫劑量在免疫接種天竺鼠後所獲得利用ELISA測定之抗Aβ_1-28 抗體效價的圖式。

第10圖顯示用以說明在3個月加強免疫方案(上圖)或6個月加強免疫方案(下圖)中利用Aβ疫苗(UB-311)在免疫接種人類受試者後所獲得利用ELISA測定之抗Aβ_1-28 抗體效價的圖式。在每個圖式中的方框部分強調在此研究中所有人類受試者的平均效價。

第11A和11B圖顯示用以說明利用MONTANIDE ISA50V作為佐劑利用不同量之如表10所示LHRH胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 239-241)的混合物在免疫接種豬隻後所獲得抗LHRH抗體效價和睾固酮濃度的圖式。第11A圖顯示在利用100 µg LHRH製劑免疫接種大鼠後所獲得抗體效價和睾固酮濃度。第11B圖顯示在利用300 µg LHRH製劑免疫接種大鼠後所獲得抗體效價和睾固酮濃度。

第12圖顯示用以說明利用在含有不同佐劑(即MONTANIDE ISA51或ADJUPHOS)之製劑中不同量SEQ ID NO: 243之IL-6胜肽免疫原結構或安慰劑控制組在免疫接種大鼠後所獲得利用ELISA測定之抗IL-6抗體效價的圖式。

第13A和13B圖顯示用以說明利用不同量SEQ ID NO: 244之IgE-EMPD胜肽免疫原結構在免疫接種獼猴後所獲得抗IgE-EMPD抗體效價的圖式。第13A圖顯示使用ADJUPHOS作為佐劑使用CpG3配製成穩定化的免疫刺激複合物所獲得的抗體效價。第13B圖顯示使用MONTANIDE ISA51作為佐劑使用CpG3配製成穩定化的免疫刺激複合物所獲得的抗體效價。

第14A和14B圖顯示用以說明利用不同佐劑利用不同量之如表10所示LHRH胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 239-241)的混合物在免疫接種豬隻後所獲得抗LHRH抗體效價和睾固酮濃度的圖式。第14A圖顯示使用Emulsigen D作為佐劑所獲得的抗體效價。第14B圖顯示使用MONTANIDE ISA50V作為佐劑所獲得的抗體效價。

第15圖顯示在正常供體之初始(naïve)周邊血液單核細胞中混雜和人工Th胜肽反應性T細胞的檢測。

第16圖顯示腫瘤相關醣類抗原(TACA)的結構：GD3、GD2、Globo-H、GM2、Fucosyl GM1、PSA、Le^y 、Le^x 、SLe^x 、SLe^a 和STn。

第17至21圖顯示透過固相胜肽合成方案例示性逐步合成聚醣共軛的UBITh®胜肽。

Claims (35)

1. 一種選自由SEQ ID NOs: 32 – 52組成之群組的混雜人工T輔助細胞(Th)抗原決定位。
2. 一種利用以下分子式代表之胜肽免疫原結構： (A)_n -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 {(A)_n -(Th)_p -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_p -(A)_n -X}_m 其中： 每個A獨立地為一胺基酸； 每個B獨立地為一異源性間隔子； 每個Th獨立地為如請求項1所述之混雜人工Th抗原決定位； 該目標抗原部位為一B細胞抗原決定位，其來自一外來抗原蛋白、一自身抗原蛋白，或一其免疫反應類似物； X為一胺基酸、一α-COOH或α-CONH₂ ； n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為1、2、3或4； o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；以及 p為1、2、3或4。
3. 如請求項2所述之胜肽免疫原結構，其中該目標抗原部位係一B細胞抗原決定位，其來自選自由口蹄疫(FMD)衣殼蛋白、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)和單純皰疹病毒(HSV)之一醣蛋白組成之群組的一外來抗原蛋白。
4. 如請求項2所述之胜肽免疫原結構，其中該目標抗原部位係一B細胞抗原決定位，其來自選自由下列組成之群組的一自身抗原蛋白： (a) 具有SEQ ID NO: 56、57、58、59或60之胺基酸序列的一Aβ胜肽； (b) 具有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的一α-Syn胜肽； (c) 具有SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的一IgE EMPD胜肽； (d) 具有SEQ ID NO: 63、69、70或71之胺基酸序列的一Tau胜肽； (e) 具有SEQ ID NO: 64或72之胺基酸序列的一IL-31胜肽；以及 (f) 具有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的一IL-6胜肽。
5. 如請求項2所述之胜肽免疫原結構，其中組成B之該異源性間隔子係選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)、Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)、Gly-Gly、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)及其任意組合組成之群組。
6. 如請求項2所述之胜肽免疫原結構，其中該異源性間隔子係選自由(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)和Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)組成之群組。
7. 一種包含如請求項2所述之胜肽免疫原結構的醫藥組成物。
8. 一種於一受試者預防及/或治療一疾病、症狀或病痛的方法，其包含將如請求項7所述之醫藥組成物的一藥學上有效劑量投予該受試者。
9. 如請求項8所述之方法，其中該目標抗原部位係一B細胞抗原決定位，其來自選自由口蹄疫(FMD)衣殼蛋白、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)和單純皰疹病毒(HSV)之一醣蛋白組成之群組的一外來抗原蛋白。
10. 如請求項8所述之方法，其中該目標抗原部位係一B細胞抗原決定位，其來自選自由下列組成之群組的一自身抗原蛋白： (a) 具有SEQ ID NO: 56、57、58、59或60之胺基酸序列的一Aβ胜肽； (b) 具有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的一α-Syn胜肽； (c) 具有SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的一IgE EMPD胜肽； (d) 具有SEQ ID NO: 63、69、70或71之胺基酸序列的一Tau胜肽； (e) 具有SEQ ID NO: 64 或72之胺基酸序列的一IL-31胜肽；以及 (f) 具有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列的一IL-6胜肽。
11. 一種利用以下分子式代表之胜肽免疫原結構： (A)_n -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(A)_n -X 或 (A)_n -(Th)_m -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_m -(A)_n -X 或 {(A)_n -(Th)_p -(B)_o -(目標抗原部位)-(B)_o -(Th)_p -(A)_n -X}_m 其中： 每個A獨立地為一胺基酸； 每個B獨立地為一異源性間隔子； 每個Th獨立地為選自由SEQ ID NOs: 1-52組成之群組的一混雜人工Th抗原決定位； 該目標抗原部位為一CTL抗原決定位、一腫瘤相關醣類抗原(TACA)、來自一新抗原的一B細胞抗原決定位、一小分子藥物或一其免疫反應類似物； X為一胺基酸、α-COOH或α-CONH₂ ； n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為1、2、3或4； o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；以及 p為1、2、3或4。
12. 如請求項11所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係一CTL抗原決定位，其具有選自由SEQ ID NOs: 76-144組成之群組的一胺基酸序列。
13. 如請求項12所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係來自HIV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 76-82組成之群組。
14. 如請求項12所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係來自HSV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 83-106組成之群組。
15. 如請求項12所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係來自FMDV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 107-123組成之群組。
16. 如請求項12所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係來自PRRSV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 124-142組成之群組。
17. 如請求項12所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係來自CSFV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 143-144組成之群組。
18. 如請求項11所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係一TACA，其選自由GD3、GD2、Globo-H、GM2、Fucosyl GM1、GM2、PSA、Le^y 、Le^x 、SLe^x 、SLe^a 、Tn、TF和STn組成之群組。
19. 如請求項11所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係來自一新抗原的一B細胞抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 73-75組成之群組。
20. 如請求項11所述之胜肽免疫原，其中該目標抗原部位係一小分子藥物。
21. 如請求項11所述之胜肽免疫原結構，其中組成B之該異源性間隔子係選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)、Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)、Gly-Gly、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)及其任意組合組成之群組。
22. 如請求項11所述之胜肽免疫原結構，其中該異源性間隔子係選自由(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)和Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 54)組成之群組。
23. 一種包含如請求項11所述之胜肽免疫原結構的醫藥組成物。
24. 一種於一受試者預防及/或治療一疾病、症狀或病痛的方法，其包含將如請求項23所述之醫藥組成物的一藥學上有效劑量投予該受試者。
25. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為HIV且其中該目標抗原部位係來自HIV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 76-82組成之群組。
26. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為HSV且其中該目標抗原部位係來自HSV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 83-106組成之群組。
27. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為FMDV且其中該目標抗原部位係來自FMDV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 107-123組成之群組。
28. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為PRRSV且其中該目標抗原部位係來自PRRSV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 124-142組成之群組。
29. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為CSFV且其中該目標抗原部位係來自CSFV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 143-144組成之群組。
30. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為CSFV且其中該目標抗原部位係來自CSFV的一CTL抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 143-144組成之群組。
31. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為癌症且其中該目標抗原部位係一TACA，其選自由GD3、GD2、Globo-H、GM2、Fucosyl GM1、GM2、PSA、Le^y 、Le^x 、SLe^x 、SLe^a 、Tn、TF和STn組成之群組。
32. 如請求項24所述之方法，其中該疾病、症狀或病痛為癌症且其中該目標抗原部位係來自一新抗原的一B細胞抗原決定位，其選自由SEQ ID NOs: 73-75組成之群組。
33. 一種在一受試者中調整一免疫反應的方法，包含： (a) 製備一種以上如請求項11所述之胜肽免疫原結構，其中在每一胜肽免疫原結構的該目標抗原部位保持固定且該Th抗原決定位為不同； (b) 製備一種以上的醫藥組成物，每種醫藥組成物包含在(a)中製備的一種胜肽免疫原結構和一藥學上可接受的佐劑或載體； (c) 將在(b)中製備的每一醫藥組成物投予不同的受試者； (d) 在每一受試者監測該免疫反應；以及 (e) 選擇產生一欲求免疫反應的該醫藥組成物。
34. 如請求項33所述之方法，其中在每一醫藥組成物中之該藥學上可接受的佐劑或載體是相同的。
35. 如請求項33項所述之方法，其中在每一醫藥組成物中之該藥學上可接受的佐劑或載體是不同的。

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