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TW202436326A - 包含hiv th/ctl 抗原決定位胜肽的疫苗用於預防及治療hiv感染及aids患者 - Google Patents

包含hiv th/ctl 抗原決定位胜肽的疫苗用於預防及治療hiv感染及aids患者 Download PDF

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TW202436326A
TW202436326A TW113104667A TW113104667A TW202436326A TW 202436326 A TW202436326 A TW 202436326A TW 113104667 A TW113104667 A TW 113104667A TW 113104667 A TW113104667 A TW 113104667A TW 202436326 A TW202436326 A TW 202436326A
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Abstract

提供一種HIV Th/CTL疫苗組成物。HIV Th/CTL疫苗組成物包含Th/CTL胜肽。也提供一種用以於個體中治療HIV感染和AIDS的方法。此方法包括向個體投予HIV Th/CTL疫苗組成物的藥學上有效劑量。亦提供HIV疫苗組成物、通用的HIV T疫苗組成物、用以於個體中預防和治療HIV感染的方法。

Description

包含HIV　TH/CTL　抗原決定位胜肽的疫苗用於預防及治療HIV感染及AIDS患者
本揭露是關於包含HIV Th/CTL抗原決定位胜肽的疫苗，其可用以預防和治療患有HIV感染和AIDS的患者。
後天免疫缺乏症候群(AIDS)是一種由人類免疫缺乏病毒(HIV)引起的、可能危及生命的慢性疾病。HIV攻擊人體免疫系統。如果不進行治療，HIV感染將分階段進展，隨著疾病的進展，CD4+ T細胞群緩慢下降，最終導致晚期疾病，CD4 細胞耗竭，稱為AIDS。
自從過去二十年引入抗反轉錄病毒藥物治療AIDS以來，HIV相關發生率和死亡率已大幅降低，HIV感染者的長期預後也得到改善。這些藥物在HIV預防方面也發揮了關鍵作用。抗反轉錄病毒藥物治療(antiretroviral therapy, ART)有效地將病毒血症抑制在低於臨床上可檢測水平，提高生存率，改善生活質量，並減少進一步傳播。
然而，ART並不能起到治癒作用，並且定期從潛伏病毒庫(LR)中出現的HIV-1必須在患者的餘生中進行藥物控制。終身提供ART不僅帶來了重大的經濟和後勤挑戰，而且還加劇了對社會污名、不必要的毒性和病毒抗藥性出現的擔憂，特別是在如果ART的使用不理想的情況下。此外，使用ART進行暴露前預防(pre-exposure prophylaxis, PrEP)將進一步擴大其供應。 (1)
疫苗方法有可能預防人類HIV感染和治癒AIDS。然而，儘管全球進行了近40年的廣泛研究努力，目前仍沒有疫苗可以有效預防HIV感染、治療HIV感染或AIDS。HIV疫苗研究人員長期以來一直致力於(1) 透過靶向HIV gp160 Env引發廣泛中和抗體(bNAbs)，來直接地阻斷病毒進入，從而透過干擾與宿主細胞受體(CD4)或共受體(CCR5或CXCR4)的結合來預防感染；或(2) 被動投予bNAbs以預防異源性HIV感染。然而，HIV bNAb的誘導尤其具有挑戰性：bNAbs在自然HIV感染中需要數年時間才能形成，因為它們通常具有高水平的體細胞突變、插入和缺失，並且具有異常長的CDRH3區域。因此，即使實現了bNAb的疫苗誘導，對任何一種bNAb抗原決定位的反應也不太可能提供對循環中的HIV-1的通用消除性的保護。 (2)
包括人類全基因組關聯研究和在獼猴的猿猴免疫不全病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)實驗研究在內的多項證據支持這樣的觀點，即CD8+ T細胞在調節精英控制者的病毒控制中發揮重要作用。更具體地說，HIV特異性CD8+ T細胞反應的出現始終與原發性感染期間病毒複製峰值的減少有關。在急性感染中觀察到從HIV特異性CD8+ T細胞反應的快速逃脫，顯示這些細胞中至少有一部分具有抗病毒功能；且在AIDS動物模型中，在慢性SIV感染期間，SIV感染的恒河猴中CD8+淋巴細胞的消除導致病毒血症迅速而顯著增加，而病毒血症再次受到抑制，同時SIV特異性CD8+ T細胞重新出現。這些結果證實細胞調節的免疫在控制HIV-1感染中的重要性，並支持探索HIV T細胞疫苗接種方法以引發效應細胞調節的免疫 (3)。
HIV控制者無需抗反轉錄病毒藥物即可抑制病毒複製。與來自進展者的HIV特異性CD8+ T細胞相比，來自控制者的HIV 特異性 CD8+ T細胞在體外抗原刺激下具有更大的增殖能力和發展細胞溶解潛力。相較之下，來自進展者的CD8+ T細胞通常表現出強烈的離體活化，但由於耗竭和壞死細胞(necroptotic cell)死亡而無法增殖或獲得細胞溶解能力，並且儘管延長ART，這些缺陷也不會恢復。與進展者相比，HIV控制者的CD8+ T細胞反應顯示出維持長期記憶和效應潛力的能力整體增強，並且能夠在子代病毒顆粒產生之前殺死受感染的細胞，這為利用這些特徵進行治療、預防和治癒提供了明確的理由。 (4)
由於特異性CD8+ T細胞能夠在急性感染或未經治療的控制者中限制HIV-1複製，因此有效的HIV疫苗應該利用CD8+ T細胞來對抗HIV感染。鑑於HIV廣泛的遺傳多樣性，抗原多樣化對於設計有效的T細胞疫苗至關重要，以防止從免疫選擇和治療逃脫，這是當前全球HIV疫苗開發策略的主要障礙。
目前有三千七百萬人感染HIV和患有AIDS。這種情況持續對全球醫療保健和經濟產生毀滅性影響。仍迫切需要開發有效的HIV疫苗以有效預防HIV感染或治療HIV感染或AIDS。
本揭露是關於用於治療HIV感染者和AIDS患者的抗HIV疫苗系統。更具體地說，疫苗系統採用其T細胞免疫原十個定點HIV Th/CTL抗原決定位胜肽，這些胜肽在所有HIV分離株的序列中是保守的，並且在各自的HLA結合中是混雜的。它們經過高精密度設計，針對製造進行了優化，並且適合併入疫苗配方中，為疫苗提供最佳的T細胞免疫力。
參考文獻：
本申請中引用的每個專利、出版物和非專利文獻均透過引用整體併入本文，如同各個個別地透過引用併入一樣。 1. Tomas Hanke, Aiming for protective T-cell responses: a focus on the first-generation conserved region HIVconsv vaccines in preventive and therapeutic clinical trials. Expert review of vaccine 2019, Vol. 18, No. 10, 1029-1041. 2. Bette Korber et al., T cell-based strategies for HIV-1 vaccines. Vaccines Immunotherapeutics 2020, Vol.16 No. 3, 713-722. 3. Jorn E. Schmitz et al., Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science 1999, Vol 283, Is. 5403 p. 857-860. 4. David R. Collins et al., CD8+ T cells in HIV control, cure and prevention. Nature Reviews Immunology 2020, Vol. 20, 471. 5. Chang Yi Wang et al., A multitope SARS-CoV-2 vaccine provides long-lasting B cell and T cell immunity against Delta and Omicron variants J Clin Invest 2022, 132(10):e157707 6. Otto O. Yang et al., Short Conserved Sequences of HIV-1 Are Highly Immunogenic and Shift Immunodominance J. of Virology 2015 Vol. 89, Is 2, P. 1195-1204 7. Hayato Murakoshi1 et al., CD8+ T cells specific for conserved, cross-reactive Gag epitopes with strong ability to suppress HIV-1 replication. Retrovirology 2018 15:46 8. Chengcheng Zou et al., Effective Suppression of HIV-1 Replication by Cytotoxic T Lymphocytes Specific for Pol Epitopes in Conserved Mosaic Vaccine Immunogens. J.Virology 2019 Vol. 93 Is. 7
根據本揭露的一些實施例，提供了HIV Th/CTL疫苗組成物。HIV Th/CTL疫苗組成物包含Th/CTL胜肽。
根據本揭露的一些實施例，提供了用以於個體中的治療HIV感染和AIDS的方法。此方法包括向個體投予HIV Th/CTL疫苗組成物的藥學上有效劑量。
根據本揭露的一些實施例，提供了HIV疫苗組成物。HIV疫苗組成物包含表2所示量的成分。
根據本揭露的一些實施例，提供了HIV Th/CTL疫苗組成物。HIV Th/CTL疫苗組成物包含a) 基於gp160區域的蛋白，b) HIV Th/CTL胜肽的混合物，其包含：SEQ ID NOs: 1-10；以及 c) UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。
根據本揭露的一些實施例，提供了HIV Th/CTL疫苗組成物。HIV Th/CTL疫苗組成物包含上述蛋白質和藥學上可接受的載體及/或佐劑。
根據本揭露的一些實施例，提供了通用HIV T疫苗組成物。通用HIV T疫苗組成物包含Th/CTL胜肽。
根據本揭露的一些實施例，提供了通用HIV T疫苗組成物。通用HIV T疫苗組成物包含a) 選自由SEQ ID NOs:1-11及其任意組合組成的群組的Th/CTL胜肽；以及b) 藥學上可接受的賦形劑。
根據本揭露的一些實施例，提供了用以於個體中預防和治療HIV感染的方法。方法包含向個體投予上述疫苗組成物的藥學上有效劑量。
根據本揭露的一些實施例，提供了HIV Th/CTL疫苗組成物。HIV Th/CTL疫苗組成物包含表2所示量的成分。
本揭露是關於用於預防感染並治療HIV感染者和AIDS患者的抗HIV疫苗系統。更具體地說，疫苗系統採用其T細胞免疫原的一組10種胜肽，這些胜肽在所有HIV分離株的序列中是保守的，並且在各自的HLA結合中是混雜的。它們經過高精密度設計，針對製造進行了優化，並且適合併入疫苗配方中，為疫苗提供最佳的T細胞免疫力。
總之，所揭露的疫苗系統利用包括來自HIV Gag、Pol和VIF蛋白的胺基酸序列的生物資訊學來設計和製造最佳的HIV Gag、Pol和VIF衍生的抗原性Th/CTL抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs: 1-10)及其製劑，作為用以治療HIV感染和AIDS的HIV T細胞疫苗。
通則
本文使用的章節標題僅用於組織的目的，不應被理解為限制所述主題。本申請中引用的所有參考文獻或參考文獻的部分出於任何目的透過引用明確地將整體併入本文。
除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，術語“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻透過引用整體併入本文。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，本文揭露的材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。
1. Th 細胞反應所需要的目標蛋白的胜肽切割和三方辨識
免疫反應需要抗原呈現細胞和T輔助細胞之間的相互協同作用。誘發有效的抗體反應或效應T細胞反應需要抗原呈現細胞辨識研究對象免疫原的目標抗原位點，且T輔助細胞辨識T輔助細胞抗原決定位。一般來說，研究對象免疫原上的T輔助細胞抗原決定位不同於其B細胞抗原決定位或相關效應T細胞(例如，細胞毒性T淋巴細胞或CTL)抗原決定位。B細胞和相關效應T細胞(CTL)抗原決定位是可被B細胞和相關效應細胞所辨識位於欲求目標免疫原上的位點，其造成產生針對欲求目標位點的抗體或細胞因子。目標的天然構型決定了抗體或相關效應T細胞直接結合的位點。Th細胞反應的誘導需要Th細胞受體辨識抗原呈現細胞膜上的複合物，其形成於目標蛋白之加工的胜肽片段及聯合的第2類主要組織相容性複合體(MHC)之間。因此，Th細胞的反應需要目標蛋白的胜肽切割及三方辨識。由於1)關鍵的第2類MHC接觸殘基在不同的MHC結合胜肽(Th抗原決定位)內有不同的位置；2)不同的MHC結合胜肽具有多變的長度和不同的胺基酸序列；以及3)依據宿主的遺傳組成，第2類MHC分子具高度多樣性，因此難以確認此三個部份的複合物。對特定Th抗原決定位的免疫反應部份是由宿主的MHC基因所決定，且族群個體之間的Th抗原決定位反應性不同。難以鑑別跨越物種與單一物種內之個體具反應性的Th抗原決定位(即，混雜的Th抗原決定位)。
T細胞辨識的每個組成步驟需要多個因子，例如，抗原呈現細胞進行適當的胜肽加工，以遺傳性決定的第2類MHC分子呈現胜肽，以及由Th細胞上的受體辨識MHC分子或胜肽複合物。對用以提供廣泛反應性之混雜Th抗原決定位辨識的要求難以確定。
顯然地，為了誘導針對免疫反應的抗體和相關細胞因子，免疫原必須包含B細胞抗原決定位/效應CTL T細胞抗原決定位與T細胞抗原決定位。
本揭露是關於用於治療HIV感染者的針對HIV分離株的疫苗系統。更具體地說，疫苗系統採用其T細胞免疫原定點的HIV Th/CTL抗原決定位胜肽，其亦經過高精密度設計，合成以用於併入疫苗配方中，以給HIV疫苗提供最佳的T細胞免疫力。
所揭露的疫苗系統利用包括胺基酸序列的生物資訊學，以優化設計和製造HIV Gag、Pol和VIF蛋白衍生的Th/CTL抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs: 1-10)和衍生自病原體蛋白的T輔助細胞(Th)抗原決定位(例如SEQ ID NO: 11)，並將其配製作為針對HIV的疫苗。
所揭露的發明的每個方面都被更詳細地討論。
2. HIV Th/CTL 胜肽
持久的細胞反應可以增強最初的中和反應(透過記憶B細胞活化)，並在抗體效價減弱時提供更長的免疫持續時間。
為了提供免疫原來引發T細胞反應，經過廣泛的文獻檢索和數據審查，從衍生自HIV 的Gag、Pol和VIF蛋白的高度保守序列中鑑定出Th/CTL抗原決定位。選擇這些區域內的幾種胜肽並進行進一步的設計。每個選定的胜肽都含有Th或CTL抗原決定位，並且事先經過MHC I或II結合驗證，並表現出良好的可製造性特徵(最佳長度和高品質合成的適應性)。這些合理設計的Th/CTL胜肽經過進一步修飾，在各個胜肽的N端添加了Lys-Lys-Lys序列，以增加其各自的正電荷，從而促進每個胜肽隨後與帶高負電荷的CpG寡核苷酸分子透過「電荷中和」結合以形成免疫刺激複合物。十種最終胜肽的設計和序列及其各自的HPLC圖譜如 表 1 和第 1A-1E 圖 (1-1 至 1-10)所示。
為了增強免疫反應，可以將專利的胜肽UBITh®1a (SEQ ID NO: 11)添加到疫苗組成物的胜肽混合物中。UBITh®1a是一種專利的合成胜肽，其原始框架序列衍生自麻疹病毒融合蛋白(measles virus fusion protein, MVF)。此序列也被進一步修飾，以在序列內呈現迴文特徵，從而允許在這個19個胺基酸的短胜肽內容納多個MHC II類結合基序。
此類免疫刺激複合物已被證明可以增強伴隨目標免疫原的弱或中等反應(例如，WO 2020/132275A1)。CpG1旨在透過「電荷中和」將合理設計的免疫原結合在一起，從而在接受免疫接種的宿主中產生平衡的B細胞(誘導中和抗體)和Th/CTL反應。此外，已知CpG活化TLR-9訊息傳遞可促進IgA產生並有利於Th1免疫反應。UBITh®1胜肽因其「抗原決定位簇」性質而被納入Th胜肽之一，以進一步增強HIV衍生的Th和CTL抗原決定位胜肽的抗病毒活性。CpG1的核酸序列是SEQ ID NO: 12。
鑑於上述，HIV多抗原決定位T胜肽疫苗組成物可以含有一種或多種Th/CTL胜肽。Th/CTL胜肽可以包括： a. 衍生自HIV Gag-Pol的胜肽(例如，SEQ ID NOs: 1-9)； b. 衍生自HIV VIF蛋白的胜肽(例如，SEQ ID NO: 10)； c. 衍生自病原體蛋白的人工Th抗原決定位(例如，SEQ ID NO: 11)。
疫苗組成物可含有一種或多種Th/CTL胜肽。在某些實施例中，疫苗組成物含有一種以上Th/CTL胜肽的混合物。當以混合物形式存在時，與其他一種或多種胜肽相比，每種Th/CTL胜肽可以任何量或比例存在。例如，Th/CTL胜肽可以等莫耳量、等重量量混合，或者混合物中每種胜肽的量可以不同於混合物中其他胜肽的量。如果混合物中存在兩種以上的Th/CTL胜肽，則胜肽的量可以與混合物中的任何其他胜肽相同或不同。
疫苗組成物中存在的Th/CTL胜肽的量可以根據需要或應用而變化。疫苗組成物可含有總共約0.1 µg至約100 µg的Th/CTL胜肽。在一些實施例中，疫苗組成物含有總共約1 µg至約50 µg的Th/CTL胜肽。
在某些實施例中，疫苗組成物包含SEQ ID NOs: 1-10和11的混合物。這些Th/CTL胜肽可以等莫耳量、等重量量混合，或者混合物中每種胜肽的量可以不同於混合物中其他胜肽的量。在某些實施例中，將這些Th/CTL胜肽以等重量量混合在疫苗組成物中。
藥物/疫苗製劑中Th和CTL抗原決定位的存在透過啟動抗原特異性T細胞活化來啟動於接受治療的個體的免疫反應，這與HIV感染的保護和治療有關。此外，包含精心選擇的存在於HIV蛋白質上的內源性Th抗原決定位及/或CTL抗原決定位的製劑可以產生廣泛的細胞調節的免疫，這也使得製劑可有效治療和保護具有不同基因組成的個體。
在醫藥組成物中包含一種或多種內源性HIV Th/CTL抗原決定位胜肽使得抗原決定位能夠被抗原呈現B細胞、巨噬細胞、樹突細胞等看到和加工。這些細胞加工抗原並將其呈現到表面與T細胞接觸，以觸發進一步的T細胞反應，從而幫助調節殺死病毒感染的細胞。內源性HIV CTL抗原決定位胜肽在N端含有Lys-Lys-Lys (KKK)尾部。
當用於醫藥組成物中(已利用CpG寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)將內源性Th/CTL抗原決定位胜肽SEQ ID NOs: 1-10配製進入免疫刺激複合物中)，內源性Th/CTL抗原決定位胜肽SEQ ID NOs: 1-10特別有用，原因在於陽離子KKK尾部能夠透過靜電締合與CpG ODN交互作用。在胜肽免疫原結構中使用內源性HIV Th抗原決定位可增強HIV B細胞抗原決定位胜肽的免疫原性，從而在感染後促進針對基於設計理論篩選和選擇的優化B細胞抗原決定位胜肽之特異性高效價抗體的產生。
在一些實施例中，醫藥組成物含有一種或多種HIV B抗原決定位以及一種或多種含有內源性HIV Th/CTL抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs: 1-10或其任意組合)的分離的胜肽。
3. 賦形劑
疫苗組成物還可以含有藥學上可接受的賦形劑。
本文使用術語“賦形劑(excipient)”或“賦形劑(excipients)”是指疫苗組成物中不是(a) 基於gp160區域的專門設計的蛋白或(b) Th/CTL胜肽以外的任何成分。賦形劑的例子包括載體、佐劑、抗氧化劑、黏結劑、緩衝劑、填充劑、螯合劑、著色劑、稀釋劑、崩散劑、乳化劑、界面活性劑、溶劑、填充劑、膠化劑、pH緩衝劑、防腐劑、助溶劑、穩定劑等。因此，疫苗組成物可含有藥學上有效劑量的活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient, API)，例如基於gp160區域的專門設計的蛋白及/或一種或多種Th/CTL胜肽，以及藥學上可接受的賦形劑。
疫苗組成物可含有一種或多種佐劑，其作用是加速、延長或增強針對API的免疫反應，而本身不具有任何特異性抗原作用。佐劑可包括油、油乳液、鋁鹽、鈣鹽、免疫刺激複合物、細菌和病毒衍生物、仿病毒顆粒(virosomes)、碳水化合物、細胞因子、聚合物微粒。在某些實施例中，佐劑可選自CpG寡核苷酸、明礬(磷酸鋁鉀)、磷酸鋁(例如ADJU-PHOS®)、氫氧化鋁(例如ALHYDROGEL®)、磷酸鈣、弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant, IFA)、弗氏完全佐劑、MF59、佐劑65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、EMULSIGEN®、EmulsIL-6n®、單磷酸脂質A (MPL)、Quil A、QS21、MONTANIDE® ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂質體、磷脂質、肽聚糖、脂多醣(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、親脂性磷脂質(脂質A)、γ菊糖、藻類菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、雙十八烷基二甲基溴化銨(dimethyl dioctadecyl ammonium bromide, DDA)，以及其他佐劑和乳化劑。
在一些實施例中，疫苗組成物含有ADJU-PHOS®(磷酸鋁)、MONTANIDE™ ISA 51 (由植物油和二縮甘露醇油酸酯所組成的油質佐劑組成物，用以製造油包水乳液)、TWEEN® 80 (也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意組合。在其他實施例中，醫藥組成物是以EMULSIGEN或EMULSIGEN D作為佐劑的水包油包水(即w/o/w)乳液。
在某些實施例中，多抗原決定位蛋白質/胜肽疫苗組成物含有ADJU-PHOS® (磷酸鋁)作為佐劑以改善免疫反應。磷酸鋁透過核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)樣受體蛋白3 (NLRP3)發炎體途徑作為Th2定向佐劑。此外，它具有前吞噬作用和儲存作用，具有長期的安全記錄，並具有改善針對在許多疫苗製劑中目標蛋白的免疫反應的能力。
疫苗組成物可含有pH調節劑及/或緩衝劑(例如鹽酸、磷酸、檸檬酸、醋酸、組胺酸、鹽酸組胺酸—水合物(histidine HCl•H 2O)、乳酸、三羥甲基胺基甲烷(tromethamine)、葡萄糖酸、天門冬胺酸、麩胺酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、延胡索酸、α-酮戊二酸和精胺酸鹽酸鹽(arginine HCl)。
疫苗組成物可含有界面活性劑和乳化劑(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(聚山梨糖醇酯，TWEEN®)、聚氧乙烯15羥基硬脂酸酯(聚乙二醇15羥基硬脂酸酯，SOLUTOL HS15®)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(CREMOPHOR® EL，ELP, RH 40)、聚氧乙烯硬脂酸酯(MYRJ®)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(SPAN®)、聚氧乙烯烷基醚(BRIJ®)和壬基酚聚氧乙烯醚(Polyoxyethylene nonylphenol ether，NONOXYNOL®)。
疫苗組成物可含有載體、溶劑或滲透壓保持劑(例如水、醇和鹽溶液(例如氯化鈉))。疫苗組成物可含有防腐劑(例如烷基/芳基醇(例如苯甲醇、氯丁醇、2-乙氧基乙醇)、胺基芳基酸酯(amino aryl acid esters)(例如對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸乙酯、對羥苯甲酸丙酯、對羥苯甲酸丁酯及其組合)、烷基/芳基酸(例如苯甲酸、山梨酸)、雙胍類(例如氯己定)、芳族醚類(例如苯酚、3-甲酚、2-苯氧基乙醇)、有機汞(例如硫柳汞、苯汞鹽)。
4. 製劑
疫苗組成物可配製成立即釋放或緩續釋放劑型。另外，可配製疫苗組成物用於透過免疫原包封和與微粒共同投予以誘導系統性或局部性黏膜免疫。所屬技術領域中具有通常知識者很容易判定此種遞送系統。
疫苗組成物可以以液體溶液或懸浮液型式配製成注射劑。含有疫苗組成物的液體載體也可在注射前製備。疫苗組成物可利用任何適合的用法投予，例如i.d.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，並且可在任何適合的遞送裝置中施用。在某些實施例中，可配製疫苗組成物供皮下、皮內或肌內投予。也可製備適用於其它給藥方式的疫苗組成物，包括口服和鼻內應用。
疫苗組成物也可以適合的劑量單位形式配製。在一些實施例中，疫苗組成物含有約1 µg至約1,000 µg的API (例如基於gp160區域的專門設計的蛋白及/或一種或多種的Th/CTL胜肽)。疫苗組成物的有效劑量取決於許多不同的因素，包括投予方式、靶點、個體的生理狀態、個體是人類或動物、投予的其它藥物，以及處理是供預防還是治療。通常，個體是人類，但也可治療非人類哺乳類動物。當以多劑量遞送時，疫苗組成物可以方便地分成每個劑量單位形式的適當量。如治療領域眾所周知的，投予的劑量取決於個體的年齡、體重和一般健康狀況。
在一些實施例中，疫苗組成物在具有添加劑及/或賦形劑的製劑中含有基於gp160區域的專門設計的蛋白或胜肽，以及一種或多種的Th/CTL胜肽。在某些實施例中，疫苗組成物在具有添加劑及/或賦形劑的製劑中含有基於gp160區域的專門設計的蛋白和一種以上的Th/CTL胜肽。含有一種以上Th/CTL胜肽之混合物的疫苗組成物可提供組成物的免疫功效的協同性增強。相較於僅含有專門設計的蛋白質或一種Th/CTL胜肽的組成物，疫苗組成物在具有添加劑及/或賦形劑的製劑中含有基於gp160區域的專門設計的蛋白和一種以上的Th/CTL胜肽可在更大的遺傳群體中更為有效，這是由於廣泛的第2類MHC覆蓋，因此提供針對疫苗組成物之經改善的免疫反應。
當疫苗組成物含有基於gp160區域的專門設計的蛋白和一種或多種的Th/CTL胜肽作為API時，專門設計的蛋白質和Th/CTL胜肽的相對量可以是以相對於彼此的任何量或比例存在。例如，專門設計的蛋白質和Th/CTL胜肽可以等莫耳量、等重量量混合，或者專門設計的蛋白質和Th/CTL胜肽的量可為不同。另外，如果混合物中存在一種以上的Th/CTL胜肽，則專門設計的蛋白質和每種Th/CTL胜肽的量可以彼此相同或不同。在一些實施例中，存在於組成物中的專門設計的蛋白質的莫耳量或重量量大於Th/CTL胜肽的量。在其他實施例中，存在於組成物中的專門設計的蛋白質的莫耳量或重量量小於Th/CTL胜肽的量。專門設計的蛋白質與Th/CTL胜肽的比例(重量：重量)可以根據需要或應用而變化。在一些情況下，專門設計的胜肽與Th/CTL胜肽的比例(w:w)可為70:30、80:20或90:10。
5. 方法
本揭露也關於用以製備和使用疫苗組成物及其製劑的方法。
a. 基於 gp160 區域的專門設計的蛋白和 Th/CTL 胜肽的製造方法
所揭露的Th/CTL胜肽可以根據實施例1中描述的方法來製造。
b. 疫苗組成物的使用方法
在治療應用中，可將揭露的多抗原決定位蛋白質/胜肽疫苗組成物投予感染HIV和患有AIDS的個體，藉此消除或降低風險，從而減輕疾病嚴重程度，或是延緩疾病的發作。
足以達成預防性治療的疫苗組成物的量定義為預防有效劑量。可以單一或多劑量方式將揭露的多抗原決定位蛋白質/胜肽疫苗組成物投予個體，以產生足夠的免疫反應，以預防或治療HIV感染。通常會監控免疫反應，且如果免疫反應開始減弱則給予重複劑量。
疫苗組成物可配製成立即釋放或緩續釋放劑型。另外，可配製疫苗組成物用於透過免疫原包封和與微粒共同投予以誘導系統性或局部性黏膜免疫。所屬技術領域中具有通常知識者很容易判定此種遞送系統。
疫苗組成物可以以液體溶液或懸浮液型式配製成注射劑。含有疫苗組成物的液體載體也可在注射前製備。疫苗組成物可利用任何適合的用法投予，例如i.d.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，並且可在任何適合的遞送裝置中施用。在某些實施例中，可配製疫苗組成物供皮下、皮內或肌內投予。也可製備適用於其它給藥方式的疫苗組成物，包括口服和鼻內應用。
疫苗組成物的劑量可根據個體和特定的給藥方式而變化。所需劑量可根據本領域技術人員已知的許多因素而變化，包括但不限於個體的物種和大小。劑量可以是專門設計的蛋白質和Th/CTL胜肽的總重量的1 μg至1,000 μg。劑量可以是專門設計的蛋白質和Th/CTL胜肽的總重量的約1 μg至約1 mg、約10 μg至約500 μg、約20 μg至約200 μg。此劑量，透過專門設計的蛋白質和Th/CTL胜肽的總重量測定，為約10 μg、約20 μg、約30 μg、約40 μg、約50 μg、約60 μg、約70 μg、約80 μg、約90 μg、約100 μg、約110 μg、約120 μg、約130 μg、約140 μg、約150 μg、約160 μg、約170 μg、約180 μg、約190 μg、約200 μg、約250 μg、約300 μg、約400 μg、約500 μg、約600 μg、約700 μg、約800 μg、約900 μg、約1,000 μg。專門設計的蛋白質和Th/CTL胜肽的比例(重量：重量)可根據需要和應用而變化。在一些情況下，專門設計的蛋白和Th/CTL胜肽的比例(w:w)可為70:30、80:20或90:10。在特定實施例中，疫苗組成物含有 表 2中所示的成分。
疫苗組成物可以單劑量方式投予、在一段時間內以多劑量方式投予，或是透過連續輸注投予。疫苗組成物可以連續方式或根據特定的劑量方案投予。可由從動物模型獲得之劑量-反應曲線外推有效劑量。在一些實施例中，疫苗組成物是以單次投予的形式提供給個體。在其他實施例中，疫苗組成物是以多次投予(兩次或更多次)的形式提供給個體。當以多次投予形式提供時，給藥之間的期間可以根據應用或需求而變化。在一些實施例中，將第一劑的疫苗組成物投予個體，並在第一劑後約1週至約12週投予第二劑。在某些實施例中，第二劑是在第一次投予後約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週、約12週投予。在具體實施例中，在第一次投予後約4週投予第二劑。
可以在初始疫苗接種方案後投予個體疫苗組成物的加強劑量，以增加針對HIV的免疫力。在一些實施例中，在初始疫苗接種方案後約6個月至約10年投予個體疫苗組成物的加強劑量。在某些實施例中，疫苗組成物的加強劑量是在初始疫苗接種方案後或在最後一次加強劑量後約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年或約10年投予。
具體實施例 (1) 一種包含Th/CTL胜肽的HIV Th/CTL疫苗組成物。 (2) 如(1)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中Th/CTL胜肽為衍生自HIV Gag-pol蛋白的SEQ ID NOs: 1-9、 SEQ ID NO: 10的衍生自VIF蛋白的HIV CTL胜肽、病原體蛋白，或其任意組合。 (3) 如(2)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中 a).衍生自HIV Gag-pol蛋白的Th/CTL胜肽為SEQ ID NOs: 1-9； b).衍生自病原體蛋白的Th胜肽是選自由SEQ ID NO: 11組成的群組。 (4) 如(3)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，進一步包含SEQ ID NOs: 1-11的Th/CTL胜肽的混合物。 (5) 如(4)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中每種Th/CTL胜肽以等重量的量存在於混合物中。 (6) 如(5)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中基於gp160區域的蛋白與Th/CTL胜肽的混合物的總重量的比例(w:w)為89:11。 (7) 如(5)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中藥學上可接受的賦形劑為佐劑、緩衝液、界面活性劑、乳化劑、pH調節劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。 (8) 如(5)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中藥學上可接受的賦形劑選自由CpG寡核苷酸、ADJUPHOS (磷酸鋁)、組胺酸、鹽酸組胺酸—水合物(histidine HCl•H 2O)、精胺酸鹽酸鹽(arginine HCl)、TWEEN 80 (聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇、水及其任意組合組成的群組。 (9) 一種用以於個體中治療HIV感染和AIDS的方法，包括向個體投予如(8)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物的藥學上有效劑量。 (10) 如(9)所述之方法，其中疫苗組成物的藥學上有效劑量是以兩劑投予個體。 (11) 如(10)所述之方法，其中向個體投予疫苗組成物的第一劑，並且在第一劑後約4週向個體投予疫苗組成物的第二劑。 (12) 一種HIV疫苗組成物，其包含表2所示量的成分。 (13) 一種HIV Th/CTL疫苗組成物，包含： a) 基於gp160區域的蛋白， b) HIV Th/CTL胜肽的混合物，其包含：SEQ ID NOs: 1-10； 以及 c) UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。 (14) 一種HIV Th/CTL疫苗組成物，其包含如(13)所述之蛋白質和藥學上可接受的載體及/或佐劑。 (15) 如(14)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其進一步包含HIV Th/CTL胜肽，此HIV Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NOs: 1-10及其任意組合組成的群組。 (16) 如(15)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，進一步包含UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。 (17) 如(16)所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其進一步包含： a) HIV Th/CTL胜肽，此HIV Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NOs: 1-10及其任意組合組成的群組； 以及 b) UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。 (18) 如(13-18)任一所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中藥學上可接受的載體及/或佐劑為CpG1 (SEQ ID NO: 12)。 (19) 一種包含Th/CTL胜肽的通用HIV T疫苗組成物。 (20) 如(19)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中Th/CTL胜肽衍生自HIV Gag-pol蛋白、HIV VIF蛋白和病原體蛋白或其任意組合。 (21) 如(20)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中 a). 衍生自HIV Gag-Pol的Th/CTL胜肽是SEQ ID NO: 1-9； b). 衍生自HIV VIF蛋白的Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NO: 10組成的群組； c). 衍生自病原體蛋白的Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NOs: 11組成的群組。 (22) 如(21)所述之通用T疫苗組成物，其中Th/CTL胜肽是SEQ ID NOs: 1-11的混合物。 (23) 如(22)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中每種Th/CTL胜肽以等重量的量存在於混合物中。 (24) 如(23)所述之通用HIV T疫苗組成物，進一步包含藥學上可接受的賦形劑，其中藥學上可接受的賦形劑為佐劑、緩衝液、pH調節劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。 (25) 如(24)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中藥學上可接受的賦形劑選自由CpG寡核苷酸、ALUM (磷酸鋁或Alhydrogel)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇、水及其任意組合組成的群組。 (26) 一種通用HIV T疫苗組成物，包含： a). Th/CTL胜肽，其選自由SEQ ID NOs:1-11及其任意組合組成的群組； b). 藥學上可接受的賦形劑。 (27) 如(26)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中(a)中的Th/CTL胜肽是選自由SEQ ID NOs: 1-11及其任意組合組成的群組。 (28) 如(27所述之通用HIV T疫苗組成物，其中每種Th/CTL胜肽以等重量的量存在。 (29) 如(28)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中藥學上可接受的賦形劑為佐劑、緩衝液、pH調節劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。 (30) 如(29)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中藥學上可接受的賦形劑選自由CpG寡核苷酸、ALUM (磷酸鋁或氫氧化鋁)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇、水及其任意組合組成的群組。 (31) 如(30)所述之通用HIV T疫苗組成物，其中Th/CTL胜肽是SEQ ID NOs: 1-11的混合物，其中每種胜肽以等重量的量存在於混合物中；藥學上可接受的賦形劑是CpG1寡核苷酸、ALUM (磷酸鋁或氫氧化鋁)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇於水中的組合。 (32) 一種用以於個體中預防和治療HIV感染的方法，包含向個體投予如(31)所述之疫苗組成物的藥學上有效劑量。 (33) 一種HIV Th/CTL疫苗組成物，其包含表2所示量的成分。
實施例 1
HIV 相關胜肽的合成
描述了合成供疫苗開發作為免疫原之HIV相關Th和CTL胜肽的方法。胜肽可以小量合成以用於血清學測定、實驗室先導研究或田野調查，胜肽也能以大量(公斤等級)合成以供商業化生產醫藥組成物使用。設計並選擇大量具有長度為約9至40個胺基酸的序列的HIV相關Th/CTL抗原決定位胜肽作為疫苗製劑中使用的胜肽免疫原結構。
表 1提供了衍生自HIV Gag-pol和VIF蛋白的Th/CTL胜肽的序列(SEQ ID NOs: 1-10)，其具有已知的MHC結合活性，作為專門設計的胜肽(例如，以KKK作為N端的連接子以增加其正電荷以獲得更好的配方)及其各自的HPLC圖譜( 第 1A-1E 圖 (1-1 至 1-10))，以便包含在最終的HIV疫苗製劑中。
所有可用於免疫原性研究或相關測試的胜肽均可透過應用生物系統胜肽合成儀430A、431及/或433型利用F-moc化學小規模合成。每個胜肽可以通過在固相載體上獨立合成產生，具有位於N端的F-moc保護以及三官能胺基酸的側鏈保護基團。合成後，將胜肽從固相載體上切割下來，並利用90%三氟乙酸(TFA)移除側鏈保護基團。利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀評估合成的胜肽產物以確定正確的分子量和胺基酸組成。利用反相HPLC (RP-HPLC)評估各個合成胜肽以確認產物的合成樣態與濃度。儘管嚴格控制合成過程(包括逐步地監測偶合效率)，由於在延長循環中某些意外事件，包括胺基酸的插入、刪除、取代及提前終止，仍會產生胜肽類似物。因此，合成產物一般包括多種胜肽類似物(儘管數量很少)與目標胜肽。
儘管包含此類非預期的胜肽類似物，但所得合成胜肽產物仍適合用於免疫學應用和作為胜肽免疫原。通常，只要開發出有辨別力的QC程序來監控製造和評估過程，以確保使用這些胜肽的最終產品的再現性和功效，此類胜肽類似物通常與純化的胜肽一樣有效。可在客製的自動胜肽合成儀UBI2003以15 mmole至150 mmole的規模進行數百至數千克級的大規模胜肽合成。
對於供臨床試驗或商業用途之最終醫藥組成物使用的活性成分，可利用預備的RP-HPLC於淺洗提梯度（shallow elution gradient）下純化胜肽免疫原結構，並利用MALDI-TOF質譜、胺基酸分析和RP-HPLC描繪純度與一致性的特性。
實施例 2
用以製造針對 HIV 分離株的專門設計的 HIV T 細胞疫苗的複合過程
第 2A 圖和第 2B 圖描述蛋白質/胜肽HIV T細胞疫苗的成分和製造複合過程。更具體地說， 第 2A 圖描述HIV Th/CTL疫苗的成分，其中任選的基於gp160區域的蛋白作為B免疫原。HIV T細胞疫苗組成物含有十種合成的Th/CTL胜肽(SEQ ID NOs: 1-10)，其針對第I類和第II類MHC分子，衍生自HIV Th/CTL Gag/Pol/VIF蛋白，以及作為T細胞活化的催化劑的UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。這些成分與CpG1 (SEQ ID NO: 12)混合，CpG1透過偶極交互作用與帶正電(設計的)的胜肽結合並且還充當佐劑，然後其與明礬佐劑結合以構成疫苗組成物。 第 2B 圖描述用以製造針對HIV分離株的HIV Th/CTL疫苗的複合過程，並任選包含基於gp160區域的蛋白作為B免疫原。為了生產疫苗組成物，依序添加胜肽、CpG1、明礬佐劑，最後添加蛋白質成分。具體而言，將專門設計的Th/CTL胜肽加入WFI中，然後在混合物中加入CpG1，形成胜肽/CpG1複合物。此後，將蛋白質緩衝液、明礬和氯化鈉加入現在含有胜肽/CpG1/明礬/氯化鈉的溶液中。最後，將基於gp160區域的蛋白溶液添加到溶液混合物中以獲得最終的疫苗產品。
實施例 3
用於評估疫苗中 Th 和 CTL 活性的特殊 T 細胞測定
利用 ELISPOT 檢測 T 細胞反應
利用人類周邊血液單核細胞(PBMCs)檢測T細胞反應。使用人類IFN-γ ELISpotPLUS試劑盒(ALP) (MABTECH)以ELISpot方法進行抗原特異性γ-干擾素(IFN-γ)測量，以評估細胞(T細胞)免疫反應。ELISpot測定也可以使用人類IFN-γ/IL-4 FluoroSpot PLUS試劑盒 (MABTECH)進行。將250,000個PBMCs等分樣本接種到每個孔洞中並進行刺激，分別使用10 μg/mL (每種刺激劑)的蛋白質溶液、Th/CTL，或不含UBITh1a (HIV Th/CTL胜肽)的Th/CTL池進行刺激，並以單獨以培養基培養的PBMCs作為每個微量盤的陰性對照，在37°C含有5% CO 2環境下培養24小時。分析是根據製造商的說明進行的。透過減去陰性對照孔洞來計算每百萬個細胞的斑點形成單位(SFU)。
細胞內細胞因子染色 (Intracellular cytokine staining ， ICS)
使用細胞內細胞因子染色與流氏細胞術(flow cytometry)來評估CD4 +與CD8 +T細胞反應。PBMCs分別以蛋白質加HIV Th/CTL胜肽池、僅HIV Th/CTL胜肽池、PMA + 離子黴素(作為陽性對照)進行刺激，或以單獨以培養基培養的PBMCs作為陰性對照，在37°C含有5% CO 2環境下培養6小時。刺激後，清洗細胞並於室溫以活性染料(viability dye)染色20分鐘，之後於室溫進行表面染色20分鐘，於室溫以BD cytofix/cytoperm試劑盒(Catalog # 554714)進行細胞固定與透化處理(permeabilization)20分鐘，且之後於室溫進行細胞內染色20分鐘。使用IFN-γ、IL-2與IL-4之細胞內細胞因子染色來評估CD4 +T細胞反應。使用IFN-γ、IL-2、CD107a和顆粒酶B (Granzyme B)的細胞內細胞因子染色來評估CD8 +T細胞反應。染色完成後，使用BD FACSDiva軟體在 FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)中分析細胞。
實施例 4
用以治療 HIV 感染和 AIDS 之高精密度專門設計的 HIV T 細胞疫苗 ( 使用 HIV Th/CTL 抗原決定位胜肽和作為 B 免疫原的任選的基於 gp160 區域的蛋白 )
UBI HIV 多抗原決定位 Th/CTL T 細胞疫苗的基本原理
疫苗方法有可能預防人類HIV感染和治癒AIDS。然而，儘管全球進行了近40年的廣泛研究努力，目前仍沒有疫苗可以有效預防HIV感染、治療HIV感染或AIDS。HIV疫苗研究人員長期以來一直致力於(1) 透過靶向HIV gp160 Env引發廣泛中和抗體(bNAbs)，來直接地阻斷病毒進入，從而透過干擾與宿主細胞受體(CD4)或共受體(CCR5或CXCR4)的結合來預防感染；或(2) 被動投予bNAbs以預防異源性HIV感染。然而，HIV bNAb的誘導尤其具有挑戰性：bNAbs在自然HIV感染中需要數年時間才能形成，因為它們通常具有高水平的體細胞突變、插入和缺失，並且具有異常長的CDRH3區域。因此，即使實現了bNAb的疫苗誘導，對任何一種bNAb抗原決定位的反應也不太可能提供對循環中的HIV-1的通用消除性的保護。 (2)
包括人類全基因組關聯研究和在獼猴的猿猴免疫不全病毒(SIV)實驗研究在內的多項證據支持這樣的觀點(即CD8+ T細胞在調節精英控制者的病毒控制中發揮重要作用)，證據包括：(1) HIV特異性CD8+ T細胞反應的出現始終與原發性感染期間病毒複製峰值的減少有關；(2) 在急性感染中觀察到從HIV特異性CD8+ T細胞反應的快速逃脫，顯示這些細胞中至少有一部分具有抗病毒功能；(3) 在AIDS動物模型中，在慢性SIV感染期間，SIV感染的恒河猴中CD8+淋巴細胞的消除導致病毒血症迅速而顯著增加，而病毒血症再次受到抑制，同時SIV特異性CD8+ T細胞重新出現。這些結果證實細胞調節的免疫在控制HIV-1感染中的重要性，並支持探索疫苗接種方法以引發這些效應細胞調節的免疫 (3)。
HIV控制者無需抗反轉錄病毒藥物即可抑制病毒複製。與來自進展者的HIV特異性CD8+ T細胞相比，來自控制者的HIV 特異性 CD8+ T細胞在體外抗原刺激下具有更大的增殖能力和發展細胞溶解潛力。相較之下，來自進展者的CD8+ T細胞通常表現出強烈的離體活化，但由於耗竭和壞死細胞(necroptotic cell)死亡而無法增殖或獲得細胞溶解能力，並且儘管延長ART，這些缺陷也不會恢復。與進展者相比，HIV控制者的CD8+ T細胞反應顯示出維持長期記憶和效應潛力的能力整體增強，並且能夠在子代病毒顆粒產生之前殺死受感染的細胞，這為利用這些特徵進行治療、預防和治癒提供了明確的理由。 (4)
由於特異性CD8+ T細胞能夠在急性感染或未經治療的控制者中限制HIV-1複製，因此有效的HIV疫苗應該利用CD8+ T細胞來對抗HIV感染。鑑於HIV廣泛的遺傳多樣性，抗原多樣化對於設計有效的T細胞疫苗至關重要，以防止從免疫選擇和治療逃脫，這是當前全球HIV疫苗開發策略的主要障礙。
疫苗免疫原設計對於引發增強的CD8+ T細胞免疫和體液反應非常重要。我們仔細評估了最近進行的兩項重要研究，其中一項研究使用含有來自保守的HIV-1蛋白區域的四種小胜肽的疫苗，這些小胜肽佔對照疫苗中相對應完整Gag/Env/NEF蛋白的不到五分之一。與對照疫苗中包含的相對應完整Gag/Env/NEF蛋白相比，基於胜肽的疫苗能夠在接種者中引發相等的抗原特異性CD4+和CD8+ T淋巴細胞反應總量。這些數據表明，這些選自保守區域的小胜肽的免疫原性可以作為疫苗中的有效免疫原，以將免疫優勢轉向保守抗原決定位。 (6)第二項研究還涉及第二代保守區域疫苗，tHIVconsvX疫苗，此疫苗採用計算策略來確定從HIV蛋白質組中選擇的多個T細胞抗原決定位作為T細胞嵌合疫苗免疫原的潛力。重要的是，tHIVconsvX疫苗由衍生自保守的Gag和Pol區域的六種胜肽組成，已證明在疫苗接種者中發現針對衍生自這些疫苗免疫原之胜肽的T細胞反應，其與臨床試驗中感染HIV-1、未接受治療(treatment-naive)的日本個體的較低的血漿病毒量和較高的CD4+ T細胞數顯著相關。在這項研究中，特異性針對tHIVconsvX中5個Gag和6個Pol保守抗原決定位的T細胞已證明其能夠抑制HIV-1感染者中循環病毒的複製，並在221名HIV-1感染者中改善了臨床結果，包括具有相同限制性HLA等位基因的有反應者和無反應者的詳細比較。 (7)這些臨床試驗結果表明，xtHIVconsvX疫苗能夠誘導Gag和Pol特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，此反應與感染個體中HIV-1複製的控制和CD4+ T細胞數的增加有關。
為了開發基於T細胞的HIV疫苗，我們設計了一組10種合成胜肽，其含有衍生自Gag、Pol和VIF蛋白的不同長度(9–43個胺基酸)的免疫顯性CTL或Th抗原決定位。抗原決定位選擇和胜肽設計是基於高度序列保守性和廣泛HLA關聯的覆蓋。將Lys-Lys-Lys序列加入每個專門設計的Th/CTL胜肽的N端，從而增加其正電荷，以便其後續與高負電荷的CpG寡核苷酸分子和佐劑Alhydrogel®或Adju-Phos®結合以透過「電荷中和」形成免疫刺激複合物。為了便於在GMP條件下滿足化學製造控制標準的操作，進一步合成並分析這些胜肽的可擴展性和易於操作性。最終10種專門設計胜肽通過了我們嚴格的篩選過程，其各自的序列如表1所示，其各自的HPLC圖譜如第1A-1E圖(1-1至1-10)所示，其被選為胜肽免疫原成分於我們的HIV Th/CTL疫苗中使用，此疫苗的目標是在台灣進行廣泛的臨床試驗。
我們最新的疫苗開發工作(UB612)採用了類似的多抗原決定位疫苗配方方法，其包含SARS-CoV-2 Th/CTL抗原決定位胜肽，以抵禦SARS-CoV-2，並在安全性、可製造性和臨床功效方面取得了巨大成功。整體來說，結合UB612的三項臨床試驗，包括延長追加第三劑，我們已經證明UB-612疫苗接種可以誘導大量的病毒中和抗體，其半衰期較長(＞187天，同類中最好)，與持久的細胞免疫並行。由於記憶B和T細胞在感染的繼發反應中至關重要，因此成功的疫苗必須產生並維持免疫記憶，並在自然暴露或疫苗加強時快速回憶有效的體液和細胞反應。UB-612透過這些臨床研究證明如此重要的疫苗設計特徵。特別值得注意的是，UB612中有5個精確設計的T細胞抗原決定位胜肽，分別代表來自N、M和S2蛋白的嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒(Sarbecovirus)區域的輔助T細胞(Th)和細胞毒性T細胞(CTL)抗原決定位。這些抗原決定位胜肽在包括Delta和Omicron在內的所有關注變異體中高度保守，並且是混雜的抗原決定位，允許誘導廣泛的記憶回憶、T細胞活化和效應器功能。因此，除了在UB-612加強劑第3劑後產生有效的抗Delta和抗Omicron作用外，持久且強大的T細胞免疫還可以有效對抗包括Omicron在內的所有VoCs (5)。
整體設計
針對病毒感染的有效免疫反應取決於體液免疫和細胞免疫。更具體地說，高精密度專門設計預防性疫苗的潛力將採用專門設計免疫原(胜肽或蛋白質)作為活性藥物成分，用於(1) 透過利用病毒蛋白上的B細胞抗原決定位誘導中和抗體，此蛋白參與病毒與其目標細胞上受體的結合；(2) 透過使用內源性Th和CTL抗原決定位誘導針對入侵病毒抗原的細胞反應，包括初代和記憶B細胞以及CD8 +T細胞反應。此類疫苗可與ALHYDROGEL、ADJUPHOS、MONTANIDE ISA、CpG等佐劑和其他賦形劑一起配製，以增強高精密度專門設計免疫原的免疫原性。
代表性專門設計的HIV Th/CTL疫苗任選地採用基於gp160區域的蛋白來充當B免疫原。這種蛋白質的設計和製備是為了引發針對HIV感染的中和抗體。然而，這種HIV Th/CTL疫苗的重要作用是採用包含內源性HIV Th和CTL抗原決定位胜肽的專門設計胜肽的混合物，其能夠促進宿主特異性Th細胞調節的免疫，從而促進針對HIV的病毒特異性初代和記憶B細胞以及CTL反應，以預防和治療HIV感染。有效的疫苗需要啟動記憶T細胞和B細胞，以便在病毒感染/攻擊時快速回憶。為了提高所揭露專門設計免疫原的有效性，兩種代表性佐劑製劑採用明礬(ALHYDROGEL/CpG、ADJU-PHOS®/CpG和MONTANIDE™ ISA/CpG)來誘導最佳的抗HIV B和T免疫反應。
明礬(ADJUPHOS和ALHYDROGEL)普遍被認為是人類疫苗的佐劑。此佐劑透過提高抗原呈現細胞(APCs)對專門設計免疫原的吸引和攝取來誘導Th2反應。MONTANIDE™ ISA 51是一種油，其與水相專門設計胜肽/蛋白質免疫原混合時形成乳液，可引發針對HIV的有效免疫反應。CpGs寡核苷酸是TLR9激動劑，可改善抗原呈現以及疫苗特異性細胞和體液反應的誘導。一般來說，帶負電的CpG分子與帶正電的專門設計免疫原結合，形成適合抗原呈現的免疫刺激複合物，以進一步增強免疫反應。
相較於使用滅活的病毒裂解物而具有更複雜的免疫原內容的疫苗或是使用其他特徵較少的免疫原的疫苗的弱或不適當的抗體呈現，所揭露高精密度專門設計的HIV T細胞疫苗(任選地包含基於gp160區域的蛋白作為B免疫原)具有產生高度特異性免疫反應的優點。此外，HIV疫苗開發中還存在與抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement，ADE)機制相關的潛在缺陷。具體來說，ADE是一種病毒與非中和抗體結合增強其進入宿主細胞的現象，有時還增強其複製。在蚊媒黃病毒和冠狀病毒中觀察到了這種導致傳染性和毒力增加的機制。所揭露的高精密度專門設計的HIV疫苗旨在透過監測抗體反應的質和量來避免疫苗誘導的疾病增強(藉由包含定位聚焦的基於gp160區域的B免疫原)，或是透過投予單株抗體(例如UB421，其對於CD4+ T細胞的HIV進入抑制非常有效)， 它們將決定有效的功能結果。
表1. 用於HIV TH/CTL疫苗配方的HIV CTL/Th抗原決定位胜肽
SEQ ID NO 胜肽號碼 HIV蛋白質和位置 抗原決定位 胜肽序列
1 3K5838 Gag-pol 567-599 CTL KKK-PTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPVKL
2 3K5839 Gag-pol 703-737 CTL/Th KKK-FSVPLDKEFRKYTAFTIPSTNNETPGIRYQYNVLP
3 3K5841 Gag-pol 1199-1240 CTL/Th KKK-GQVDCSPGIWQLDCTHLEGKIILVAVHVASGYIEAEVIPAET
4 3K5845 Gag-pol 659-679 CTL KKK-RKLVDFRELNKRTQDFWEVQL
5 3K5848 Gag-pol 396-405 CTL KKK-HIARNCRAPR
6 3K5849 Gag-pol 427-440 CTL KKK-TERQANFLGKIWPS
7 3K5851 Gag-pol 928-936 CTL KKK-IYQEPFKNL
8 3K5852 Gag-pol 1175-1183 CTL KKK-LPPVVAKEI
9 3K5854 Gag-pol 1325-1333 CTL KKK-MAVFIHNFK
10 3K5856 VIF 114-129 CTL KKK-CFADSAIRKAILGHIV
11 MvF Th KKK-ISITEIKGVIVHRIETILF
12 CpG1 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT TTg TCg TT 3' (完全硫代磷酸酯化)
表2. 通用HIV Th/CTL疫苗11 μg/mL的成分
敘述 SEQ ID NO 單位數量/mL 功能 品質等級
基於gp160區域的蛋白 N/A 任選的 免疫原 (GMP) 1
Th/CTL胜肽 1 1 μg Th/CTL T-免疫原 (GMP) 1
2 1 μg
3 1 μg
4 1 μg
5 1 μg
6 1 μg
7 1 μg
8 1 μg
9 1 μg
10 1 μg
11 1 μg
 CpG1 12 10 μg 佐劑 (GMP) 1
 鋁膠 -- 1.2 mg 佐劑 GMP
 鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調節劑 Ph Eur, BP, JP, NF
 氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
 2-苯氧基乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
 注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於臨床試驗的材料根據cGMP製造
無
透過閱讀隨後結合附圖的詳細描述和實施例，可以更全面地理解本發明，其中： 第 1A-1E 圖 (1-1 至 1-10)：具有SEQ ID NOs: 1至10的純化的HIV Th/CTL胜肽的HPLC圖譜。如實施例1所述合成、純化專門設計胜肽。只有能夠透過製備型HPLC純化至高純度和合理產率的專門設計胜肽才會被選擇作為胜肽免疫原。 第 2A 圖和第 2B 圖描述蛋白質/胜肽HIV T細胞疫苗的成分和製造複合過程。更具體地說， 第 2A 圖描述HIV Th/CTL疫苗的成分，其中任選的基於gp160區域的蛋白作為B免疫原。HIV T細胞疫苗組成物含有十種合成的Th/CTL胜肽(SEQ ID NOs: 1-10)，其針對第I類和第II類MHC分子，衍生自HIV Th/CTL Gag/Pol/VIF蛋白，以及作為T細胞活化的催化劑的UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。這些成分與CpG1 (SEQ ID NO: 12)混合，CpG1透過偶極交互作用與帶正電(設計的)的胜肽結合並且還充當佐劑，然後其與明礬佐劑結合以構成疫苗組成物。 第 2B 圖描述用以製造針對HIV分離株的HIV Th/CTL疫苗的複合過程，並任選包含基於gp160區域的蛋白作為B免疫原。為了生產疫苗組成物，依序添加胜肽、CpG1、明礬佐劑，最後添加蛋白質成分。具體而言，將專門設計的Th/CTL胜肽加入WFI中，然後在混合物中加入CpG1，形成胜肽/CpG1複合物。此後，將蛋白質緩衝液、明礬和氯化鈉加入現在含有胜肽/CpG1/明礬/氯化鈉的溶液中。最後，將基於gp160區域的蛋白溶液添加到溶液混合物中以獲得最終的疫苗產品。
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Claims (33)

  1. 一種包含一Th/CTL胜肽的HIV Th/CTL疫苗組成物。
  2. 如請求項1所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中該Th/CTL胜肽為衍生自HIV Gag-pol蛋白的SEQ ID NOs: 1-9、SEQ ID NO: 10的衍生自VIF蛋白的HIV CTL胜肽、病原體蛋白，或其任意組合。
  3. 如請求項2所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中 a) .衍生自該HIV Gag-pol蛋白的該Th/CTL胜肽為SEQ ID NOs: 1-9； 以及 b). 衍生自一病原體蛋白的該Th胜肽是選自由SEQ ID NO: 11組成的群組。
  4. 如請求項3所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，進一步包含SEQ ID NOs: 1-11的Th/CTL胜肽的一混合物。
  5. 如請求項4所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中每種Th/CTL胜肽以等重量的量存在於該混合物中。
  6. 如請求項5所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中該基於gp160區域的蛋白與Th/CTL胜肽的該混合物的總重量的比例(w:w)為89:11。
  7. 如請求項5所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中該藥學上可接受的賦形劑為佐劑、緩衝液、界面活性劑、乳化劑、pH調節劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。
  8. 如請求項5所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中該藥學上可接受的賦形劑選自由CpG寡核苷酸、ADJUPHOS (磷酸鋁)、組胺酸、鹽酸組胺酸—水合物(histidine HCl•H 2O)、精胺酸鹽酸鹽(arginine HCl)、TWEEN 80 (聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇、水及其任意組合組成的群組。
  9. 一種用以於一個體中治療HIV感染和AIDS的方法，包括向該個體投予如請求項8所述之HIV Th/CTL疫苗組成物的一藥學上有效劑量。
  10. 如請求項9所述之方法，其中該疫苗組成物的該藥學上有效劑量是以兩劑投予該個體。
  11. 如請求項10所述之方法，其中向該個體投予該疫苗組成物的一第一劑，並且在該第一劑後約4週向該個體投予該疫苗組成物的一第二劑。
  12. 一種HIV疫苗組成物，其包含表2所示量的成分。
  13. 一種HIV Th/CTL疫苗組成物，包含： a) 一基於gp160區域的蛋白， b) HIV Th/CTL胜肽的一混合物，其包含：SEQ ID NOs: 1-10； 以及 c) 一UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。
  14. 一種HIV Th/CTL疫苗組成物，其包含如請求項13所述之蛋白質和一藥學上可接受的載體及/或佐劑。
  15. 如請求項14所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其進一步包含一HIV Th/CTL胜肽，該HIV Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NOs: 1-10及其任意組合組成的群組。
  16. 如請求項15所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，進一步包含UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。
  17. 如請求項16所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其進一步包含： a) 一HIV Th/CTL胜肽，該HIV Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NOs: 1-10及其任意組合組成的群組； 以及 b) 一UBITh®1a胜肽(SEQ ID NO: 11)。
  18. 如請求項13-18任一所述之HIV Th/CTL疫苗組成物，其中該藥學上可接受的載體及/或佐劑為CpG1 (SEQ ID NO: 12)。
  19. 一種包含一Th/CTL胜肽的通用HIV T疫苗組成物。
  20. 如請求項19所述之通用HIV T疫苗組成物，其中該Th/CTL胜肽衍生自HIV Gag-pol蛋白、HIV VIF蛋白和一病原體蛋白或其任意組合。
  21. 如請求項20所述之通用HIV T疫苗組成物，其中 a). 衍生自HIV Gag-Pol的該Th/CTL胜肽是SEQ ID NO: 1-9； b). 衍生自HIV VIF蛋白的該Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NO: 10組成的群組； c). 衍生自病原體蛋白的該Th/CTL胜肽選自由SEQ ID NOs: 11組成的群組。
  22. 如請求項21所述之通用T疫苗組成物，其中該Th/CTL胜肽是SEQ ID NOs: 1-11的一混合物。
  23. 如請求項22所述之通用HIV T疫苗組成物，其中每種Th/CTL胜肽以等重量的量存在於該混合物中。
  24. 如請求項23所述之通用HIV T疫苗組成物，進一步包含一藥學上可接受的賦形劑，其中該藥學上可接受的賦形劑為佐劑、緩衝液、pH調節劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。
  25. 如請求項24所述之通用HIV T疫苗組成物，其中該藥學上可接受的賦形劑選自由CpG寡核苷酸、ALUM (磷酸鋁或Alhydrogel)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇、水及其任意組合組成的群組。
  26. 一種通用HIV T疫苗組成物，包含： a). 一Th/CTL胜肽，其選自由SEQ ID NOs:1-11及其任意組合組成的群組；以及 b). 一藥學上可接受的賦形劑。
  27. 如請求項26所述之通用HIV T疫苗組成物，其中(a)中的該Th/CTL胜肽是選自由SEQ ID NOs: 1-11及其任意組合組成的群組。
  28. 如請求項27所述之通用HIV T疫苗組成物，其中每種Th/CTL胜肽以等重量的量存在。
  29. 如請求項28所述之通用HIV T疫苗組成物，其中該藥學上可接受的賦形劑為佐劑、緩衝液、pH調節劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。
  30. 如請求項29所述之通用HIV T疫苗組成物，其中該藥學上可接受的賦形劑選自由CpG寡核苷酸、ALUM (磷酸鋁或氫氧化鋁)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇、水及其任意組合組成的群組。
  31. 如請求項30所述之通用HIV T疫苗組成物，其中該Th/CTL胜肽是SEQ ID NOs: 1-11的一混合物，其中每種胜肽以等重量的量存在於該混合物中；該藥學上可接受的賦形劑是CpG1寡核苷酸、ALUM (磷酸鋁或氫氧化鋁)、鹽酸、氯化鈉、2-苯氧基乙醇於水中的一組合。
  32. 一種用以於一個體中預防和治療HIV感染的方法，包含向該個體投予如請求項31所述之疫苗組成物的一藥學上有效劑量。
  33. 一種HIV Th/CTL疫苗組成物，其包含表2所示量的成分。
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