TW201902911A - 用於治療ｃｎｇｂ１關聯之視網膜色素病變的基因療法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及包含啟動子和至少一種轉基因的多核苷酸，所述啟動子包含人光感受器特異性啟動子元件、核心啟動子。此外，本發明提供了包含所述多核苷酸的質體、包含所述多核苷酸的病毒載體和包含所述多核苷酸的醫藥組合物。本發明還涉及質體、病毒載體或醫藥組合物，用作藥物，特別是用於視網膜疾病的療法。
Description
視網膜色素變性(RP)是用於指遺傳上多種多樣的一組影響光感受器的遺傳性視網膜變性性疾病的術語。遺傳突變係關於僅僅或主要在視桿光感受器(rod photoreceptor)中表達的基因。因而，疾病的特徵在於視桿功能和結構的原發性損害或喪失。視桿的退化繼之以視錐的繼發性變性。視網膜變性的發作和時間過程分別從早發性和快速進展形式變化到晚髮型和緩慢進展形式。RP的最常見的症狀是夜盲、視野的進行性收縮、和視網膜中色素沉著的異常積累。臨床特徵包括特徵性形狀的色素沉積物和視網膜血管的進行性弱化。在許多情况下，RP最終導致法定盲(legal blindness)。RP的總體流行性估計為1：4,000。RP是遺傳學上非常異質的，並且鑒定的RP基因的數目接近50(Daiger SP，等(1998)Investigative Ophthalmology and Visual Science(Supplement)39：S295)。許多疾病基因編碼光檢測和處理需要的蛋白質(例如視紫質)或維持桿細胞形態需要的蛋白質(例如外周蛋白-2)。10-25%的RP病例顯示常染色體顯性遺傳模式(adRP)，6-18%為X連鎖的(xRP)，並且20-30%為常染色體隱性遺傳的(arRP)。另40-50%是散發性arRP，並且是遺傳學上最多種多樣的RP亞群，並且已知的疾病基因並不具有超過15%的相對頻率。最普遍的arRP基因是EYS(5-12%)、USH2A(5-15%)、CRB1(約5%)和PDE6B(4-10%)。然而，最可能由於建立者效應，這些數值在不同的亞群之間和不同地區間變化。
CNGB1編碼視桿環狀核苷酸閘控(CNG)通道(RP45基因座)的β次單 元。在arRP病例的2-4%中發現RP45基因座中分別引起所謂的CNGB1連鎖的RP或45型RP的突變(Hartong DT等(2006)Lancet 368(9549)：1795-1809)。因此，CNGB1連鎖的arRP患者的估計數目在德國為約900人，並且在歐盟為5,000人。認為視覺障礙是具有高度臨床和社會經濟意義的最重要的非致死性殘障之一。RP患者貫穿其壽命的廣泛期間遭受嚴重的生活質量損失。不幸的是，不存在RP的治愈或症狀治療。臨床專家和衛生組織將RP列為基因療法的頂級候選者之一。以前，可證明基因補充療法通過使用重組AAV2/8載體在視網膜色素變性CNGB1(-/-)小鼠模型中恢復視覺並且延遲變性(Koch S，等(2012)Hum Mol.Genet.21(20)：4486-96)，所述重組AAV2/8載體包含在小鼠視紫質(Rho)啟動子控制下的小鼠Cngb1基因：AAV2/8(Y733F)-Rho-Cngb1。將載體注射到編碼Cngb1的基因的外顯子26中具有遺傳缺失的小鼠(Cngb1 KO)的眼中。注射增强光感受器的存活並改善視網膜功能。然而，幾項問題使此方法對於治療患有由於CNGB1連鎖的RP所致的視網膜變性的人不太有前景：(a)rAAV順式載體基因組大小(5.0kb)高於野生型AAV基因組的大小(<4.7kb)；(b)使用鼠視紫質(Rho)基因啟動子；並且(c)使用鼠Cngb1基因序列。
Petersen-Jones等(2016)Invest.Ophthalmol.57：1842描述了rAAV2/5載體，其包含在人視紫質激酶1(hGRK1)啟動子控制下的犬Cngb1基因(cCngb1)的編碼序列：AAV5-hGRK1-cCngb1。將載體注射到在Cngb1基因的外顯子26中具有突變的犬的眼中。注射改善視網膜功能。但是，以下問題使得這種方法對於治療患有由於CNGB1連鎖的RP所致的視網膜變性的人不太有前景：(a)此方法中使用的hGRK1啟動子驅動視桿中的表達，而且還驅動視錐感受器中的脫靶表達。此種脫靶表達可以對視網膜功能和形態具有負面影響；並且 (b)使用犬Cngb1基因序列。
因此，本領域需要鑒定轉基因元件，所述轉基因元件具有小尺寸而不會負面影響或喪失其在體內情况中的活性。
本發明基於令人驚訝的發現，即人視桿啟動子的短部分在體內將視桿光感受器特異性表達轉移到與此啟動子元件可操作連接的轉基因。當在體內背景中使用本文中定義的啟動子元件時，觀察到穩定的轉基因表達。表達水平適合於改善用包含轉基因的腺相關病毒載體感染的測試動物的視覺能力。此令人驚訝的發現特別提供相對於現有技術的以下優點：(i)導入細胞中的構建體的大小降低，(ii)轉基因對病毒載體的包裝效率的增加，(iii)體內發生重組事件的幾率降低，(iv)將轉基因導入靶細胞，特別是導入靶細胞的核中的效率增加；(v)人患者中對於治療視桿相關疾病合適的表達水平，(vi)視網膜功能的保留及/或改善和(vii)視覺的保留及/或改善。
在第一態樣，本發明涉及多核苷酸，所述多核苷酸依次包含：a)啟動子，所述啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，所述人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體，實質上由根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體組成，或由根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體組成；和b)與a)的啟動子可操作連接的至少一種轉基因(TG)；其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83、和87至94外部的一種或多種核酸取代，並且其中啟動子的長度特別是350個鹼基或更小。
在某些示例性的實施方案中，hRPSPE的5’端在SEQ ID NO：2或其變體的1至160的核酸位置處，並且3’端在290至310位的核酸位置處。
在某些示例性的實施方案中，CP包含TATA盒及/或起始子(Inr)。
在某些示例性的實施方案中，啟動子的5’端在SEQ ID NO：2或其變體的1至160的核酸位置處，並且3’端在340至350的核酸位置處。
在某些示例性的實施方案中，轉基因包含編碼維持或改善視桿的生理功能的蛋白質的核酸。
在某些示例性的實施方案中，轉基因：(i)包含編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片段或變體的核酸；編碼靶向mRNA的miRNA或shRNA的核酸，所述mRNA編碼其顯性負性突變體；及/或編碼抗體或抗體結合片段的核酸，所述抗體或抗體結合片段特異性結合其顯性負性突變體；或(ii)包含編碼抑制桿細胞增殖的蛋白質的核酸，較佳毒素；前藥轉化酶，例如胸苷激酶；細胞週期抑制劑，例如視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21CIP1、p27KIP1和p57KIP2；包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的mRNA；及/或包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的核酸。
在某些示例性的實施方案中，hCNGB1包含根據SEQ ID NO：3、40或41的胺基酸序列或其變體。
在某些示例性的實施方案中，多核苷酸包含選自由下列組成之群組的一種或多種另外的核苷酸序列元件：(i)聚腺苷酸化信號(PAS)；及/或(ii)一個或兩個反向末端重複(ITR)序列；及/或(iii)形成感染性病毒載體，較佳腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒、或疱疹病毒載體，特別是單純疱疹病毒(HSV)載體所必需的病毒核苷酸序列。
在某些示例性的實施方案中，聚腺苷酸化信號包含猿病毒40 PAS，實質上由猿病毒40 PAS組成，或由猿病毒40 PAS組成。
在某些示例性的實施方案中，聚腺苷酸化信號包含根據SEQ ID NO：4 的核酸或其功能變體，實質上由根據SEQ ID NO：4的核酸或其功能變體組成，或由根據SEQ ID NO：4的核酸或其功能變體組成。
在某些示例性的實施方案中，ITR序列是腺相關病毒(AAV)ITR。
在某些示例性的實施方案中，AAV是AVV血清型2、5、8或9。
在某些示例性的實施方案中，啟動子和轉基因在其5’端側翼有L-ITR並且在其3’端側翼有R-ITR。
在某些示例性的實施方案中，L-ITR包含根據SEQ ID NO：5的序列或其變體，實質上由根據SEQ ID NO：5的序列或其變體組成，或由根據SEQ ID NO：5的序列或其變體組成；及/或R-ITR包含根據SEQ ID NO：6的序列或其變體，實質上由根據SEQ ID NO：6的序列或其變體組成，或由根據SEQ ID NO：6的序列或其變體組成。
在某些示例性的實施方案中，多核苷酸的總長度為5200個鹼基或更少，較佳5100個鹼基或更少，更佳5000個鹼基或更少。
在第二態樣，本發明還涉及質體，其包含第一態樣的多核苷酸。
在某些示例性的實施方案中，質體包含根據SEQ ID NO：7、42-44的核酸序列或其變體。
本發明的第三態樣涉及病毒載體，其包含本發明的第一態樣的多核苷酸。
在某些示例性的實施方案中，病毒選自由下列組成之群組：AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其變體。
本發明的第四態樣涉及根據本發明的第一態樣的多核苷酸、本發明的第二態樣的質體及/或根據本發明的第三態樣的病毒載體，用作藥物。
本發明的第五態樣涉及醫藥組合物，其包含根據本發明的第一態樣的多核苷酸、本發明的第二態樣的質體及/或根據本發明的第三態樣的病毒載體和藥學可接受載劑。
本發明的第六態樣涉及根據本發明的第一態樣的多核苷酸、根據本發明的第二態樣的質體及/或根據本發明的第三態樣的病毒載體，其用於視網 膜疾病，特別是視網膜變性的療法。
在某些示例性的實施方案中，投予路徑選自眼內、球內、玻璃體內或視網膜下。
在某些示例性的實施方案中，視網膜變性與遺傳突變、取代及/或缺失有關。
在某些示例性的實施方案中，視網膜變性選自：夜盲、失明、視網膜變性、視網膜營養不良和視網膜色素變性。
在某些示例性的實施方案中，視網膜色素變性是CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)。
本發明的第七態樣涉及多核苷酸，所述多核苷酸依次包含：a)包含根據SEQ ID NO：9的核酸序列或其變體的人視紫質啟動子；和b)與a)的啟動子可操作連接的至少一種轉基因(TG)。
在某些示例性的實施方案中，轉基因包含編碼維持或改善視桿的生理功能的蛋白質的核酸。
在某些示例性的實施方案中，轉基因：(i)包含編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片段或變體的核酸；編碼靶向mRNA的miRNA或shRNA的核酸，所述mRNA編碼其顯性負性突變體；及/或編碼抗體或抗體結合片段的核酸，所述抗體或抗體結合片段特異性結合其顯性負性突變體；或(ii)包含編碼抑制桿細胞增殖的蛋白質的核酸，較佳毒素；前藥轉化酶，例如胸苷激酶；細胞週期抑制劑，例如視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21CIP1、p27KIP1和p57KIP2；包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的mRNA；及/或包含編碼其細胞週期抑制劑的顯 性負性突變體的核酸。
在某些示例性的實施方案中，多核苷酸包含選自由下列組成之群組的一種或多種另外的核苷酸序列元件：(i)聚腺苷酸化信號(PAS)；(ii)一個或兩個反向末端重複(ITR)序列；和(iii)形成感染性病毒載體，較佳腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒、或疱疹病毒載體，特別是單純疱疹病毒(HSV)載體必需的病毒核苷酸序列。
在某些示例性的實施方案中，聚腺苷酸化信號包含猿病毒40 PAS。
在某些示例性的實施方案中，ITR序列是腺相關病毒(AAV)ITR。
在某些示例性的實施方案中，AAV是AVV血清型2、5、8或9。
本發明的第八態樣涉及病毒載體，其包含根據本發明的第七態樣的多核苷酸。
在某些示例性的實施方案中，病毒選自由下列組成之群組：AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其變體。
本發明的第九態樣涉及用於治療有此需要的受試者中的視網膜變性的方法，其包括對所述受試者投予治療有效量的根據本發明的第七態樣的多核苷酸或根據本發明的第八態樣的病毒載體。
在某些示例性的實施方案中，多核苷酸或病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
本發明的第十態樣涉及用於治療有此需要的受試者中的視網膜色素變性的方法，其包括對所述受試者投予治療有效量的根據本發明的第七態樣的多核苷酸或根據本發明的第八態樣的病毒載體。
在某些示例性的實施方案中，多核苷酸或病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
本發明的第十一態樣涉及用於治療有此需要中的受試者的視網膜變性的方法，其中所述視網膜變性的特徵在於所述受試者的視網膜細胞中 CNGB1的缺陷或缺乏，所述方法包括對所述受試者投予治療有效量的病毒載體，所述病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
在某些示例性的實施方案中，視網膜變性是CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)。
本發明的第十二態樣涉及用於治療有此需要的受試者中的CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)的方法，其包括對受試者視網膜下投予治療有效量的病毒載體，所述病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
本發明的第十三態樣涉及多核苷酸，其依次包含：a)啟動子，所述啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，所述人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體；和b)與a)的啟動子可操作連接的轉基因，所述轉基因編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)，其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83和87至94外部的一個或多個核酸取代。
本發明的第十四態樣涉及醫藥組合物，所述醫藥組合物包含多核苷酸和藥學可接受載劑，所述多核苷酸依次包含：a)啟動子，所述啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，所述人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體；和b)與a)的啟動子可操作連接的轉基因，所述轉基因編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)，其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83和87至94外部的一個或多個核酸取代。
本發明的第十五態樣涉及醫藥組合物，其包含病毒載體和藥學可接受載劑，所述病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
SEQ ID NO：1 包含核心組織特異性元件的人視紫質啟動子的99個核苷酸的長片段的序列；SEQ ID NO：2 包含組織特異性元件和轉錄起始位點的人視紫質啟動子的350個核苷酸的長片段的序列；SEQ ID NO：3 人CNGB1蛋白的序列；SEQ ID NO：4 聚腺苷酸化信號SV40的序列；SEQ ID NO：5 左反向末端重複(L-ITR)的序列；SEQ ID NO：6 右反向末端重複(R-ITR)的序列；SEQ ID NO：7 載體構建體pGL2.0-hRho194-hCNGB1a-SV40的序列；SEQ ID NO：8 人CNGB1基因的序列；SEQ ID NO：9 人視紫質啟動子194bp片段的序列；SEQ ID NO：10 人Abca4蛋白的序列；SEQ ID NO：11 人AIPL1蛋白的序列；SEQ ID NO：12 人BEST1蛋白的序列；SEQ ID NO：13 人CACNA1F蛋白的序列；SEQ ID NO：14 人CLN3蛋白的序列；SEQ ID NO：15 人CLRN1蛋白的序列；SEQ ID NO：16 人CNGA1蛋白的序列；SEQ ID NO：17 人CEP290蛋白的序列；SEQ ID NO：18 人CRB1蛋白的序列；SEQ ID NO：19 人CRB2蛋白的序列；SEQ ID NO：20 人CRX蛋白的序列；SEQ ID NO：21 人GPR98蛋白的序列；SEQ ID NO：22 人GUCA1A蛋白的序列； SEQ ID NO：23 人GUCA1B蛋白的序列；SEQ ID NO：24 人MYO7A蛋白的序列；SEQ ID NO：25 人NRL蛋白的序列；SEQ ID NO：26 人PDE6A蛋白的序列；SEQ ID NO：27 人PDE6B蛋白的序列；SEQ ID NO：28 人PRPH2蛋白的序列；SEQ ID NO：29 人PROM1蛋白的序列；SEQ ID NO：30 人RHO蛋白的序列；SEQ ID NO：31 人ROM1蛋白的序列；SEQ ID NO：32 人RP1蛋白的序列；SEQ ID NO：33 人RP2蛋白的序列；SEQ ID NO：34 人RPGR蛋白的序列；SEQ ID NO：35 人SAG蛋白的序列；SEQ ID NO：36 人USH1C蛋白的序列；SEQ ID NO：37 人USH1G蛋白的序列；SEQ ID NO：38 人USH2A蛋白的序列；SEQ ID NO：39 人NR2E3蛋白的序列；SEQ ID NO：40 人CNGB1蛋白的序列(下一代測序；NGS)；SEQ ID NO：41 人CNGB1蛋白的序列(GenBank NG_016351)；SEQ ID NO：42 5’ITR-hRHO啟動子-CNGB1a-SV40polyA-3’ITR的序列；SEQ ID NO：43 5’ITR-hRHO啟動子-CNGB1a-SV40polyA-3’ITR(NGS)的序列；SEQ ID NO：44 5’ITR-hRHO啟動子-CNGB1a-SV40polyA-3’ITR(GenBank)的序列；和SEQ ID NO：45 人RPE65蛋白的序列。
在下面詳細描述本發明之前，應該理解的是，本發明不限於本文所述的具體方法、方案和試劑，因為這些可以變化。還應該理解，本文中使用的術語僅僅是為了描述具體實施方案的目的，而並不意圖限制僅由所附申請專利範圍限定的本發明的範圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同的含義。
在本說明書的整個文本中引用了幾個文獻。本文中引用的每篇文獻(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、用法說明等)，無論在上文還是在下文，均在此通過引用整體併入。本文中的任何內容都不應解釋為承認憑藉先前的發明，本發明沒有資格早於此類公開。本文中引用的一些文獻表徵為「通過引用併入」。在此類併入的參考文獻的定義或教導與本說明書中引用的定義或教導之間衝突的情况下，則本說明書的文本優先。
在下文中，將描述本發明的要素。這些要素與具體的實施方案一起列出，然而，應該理解的是，它們可以以任何方式和任意數目組合以創建另外的實施方案。不應將各種描述的實例和較佳實施方案解釋為將本發明限於僅明確描述的實施方案。本描述應當理解為支持並涵蓋將明確描述的實施方案與任何數目的公開及/或較佳要素組合的實施方案。此外，除非上下文另有指示，應該認為本申請的描述公開了本申請中所有描述的要素的任何排列和組合。
定義
為了實施本發明，除非另有指示，使用在本領域文獻中解釋的化學、生物化學和重組DNA技術的常規方法(參見例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，J.Sambrook等編，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，提供了本說明書中經常使用的術語的一些定義。這些術語 在其使用的每個實例中將在說明書的剩餘部分中具有相應定義的含義和較佳含義。
如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用，除非內容另有明確規定，單數形式「一個」、「一種」和「該/所述」包括複數指稱。
如本說明書中使用，術語「核酸」包括對於所有已知的生命形式必需的聚合或寡聚大分子或大生物分子。包括DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的核酸由稱為核苷酸的單體生成。大多數天然存在的DNA分子由兩個彼此纏繞以形成雙螺旋的互補生物聚合物鏈組成。DNA鏈也稱為由核苷酸組成的多核苷酸。每個核苷酸由含氮核鹼基以及稱作脫氧核糖或核糖的單糖和磷酸基團組成。天然存在的核鹼基包含鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。核苷酸通過一個核苷酸的糖與下一個核苷酸的磷酸之間的共價鍵在鏈中彼此連接，產生交替的糖-磷酸酯主鏈。如果糖是脫氧核糖，則聚合物是DNA。如果糖是核糖，則聚合物是RNA。通常，多核苷酸通過單獨的核苷酸單體之間的磷酸二酯鍵形成。在本發明的上下文中，術語「核酸」包括但不限於核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)及其混合物，如例如RNA-DNA雜合物(在一條鏈內)、以及cDNA、基因組DNA、重組DNA、cRNA和mRNA。核酸可由整個基因或其部分組成，核酸也可為miRNA、siRNA、piRNA或shRNA。miRNA是短的核糖核酸(RNA)分子，其長度平均為22個核苷酸但是可更長，並且可在所有真核細胞，即在植物、動物和一些病毒中發現，其在基因表達的轉錄和轉錄後調節中發揮功能。miRNA是轉錄後調節物，其結合靶信使RNA轉錄物(mRNA)上的互補序列，通常導致翻譯阻抑和基因沉默。小干擾RNA(siRNA)，有時稱為短干擾RNA或沉默RNA，是長度為20-25個核苷酸的短核糖核酸(RNA分子)。它們參與RNA干擾(RNAi)途徑，其中它們干擾特定基因的表達。也稱為小髮夾RNA的短髮夾RNA(shRNA)是具有緊密髮夾轉角的人工RNA分子，所述髮夾轉角可用於通過RNA干擾(RNAi)沉默靶基因表達。通常通過遞送質體或通過病毒載體完成細胞中的shRNA 表達。
術語「多核苷酸」當在本發明的上下文中使用時指不限於長度為特定核苷酸數目的核酸。
在本發明的上下文中使用的術語「人視桿光感受器」指特殊類型的細胞，即光感受器細胞。人眼的視網膜含有兩種類型的光感受器：視桿和視錐。平均地，人視網膜中約有9000萬個視桿細胞。視桿比視錐更靈敏。但是，它們對顏色不靈敏。它們負責暗適應或暗視視覺。通常發現視桿在視網膜的外邊緣聚集並用於周邊視覺。因此，周邊視覺是更為光靈敏的，使得能够在周邊視野中看到較昏暗的物體。視桿細胞比視錐細胞更靈敏，並且幾乎完全負責暗視覺。視桿采用稱為視紫質的靈敏的光色素。光感受器是高度特化的光敏性神經元，並且設計用於捕獲觸發細胞膜電位變化的光量子。視桿光感受器實現暗光視覺，而視錐光感受器介導顏色視覺和較亮光條件下的高視敏度。僅一類視桿光感受器(携帶視紫質視覺色素)存在於脊椎動物視網膜中，包括在小鼠和人中。當處於其「準備激活」狀態時，每個視蛋白分子與光敏性生色團11-順式視黃醛共價結合。在光子捕獲後，生色團異構化為全反式視黃醛，引起視紫質的構象變化並激活為間視紫質II。這啟動了光轉導過程，即生物化學事件的級聯，所述生物化學事件最終導致光感受器的細胞膜超極化中的離子通道關閉和通過調控突觸終端的神經遞質釋放將信號傳遞到內視網膜中的二階神經元。光感受器的完整性和功能對於視覺來說絕對是至關重要的，並且影響光感受器功能或存活的突變破壞光轉導過程，導致視覺喪失。
本發明的上下文中的術語「啟動子」指包含轉錄控制所需要的兩種元件的核苷酸序列，包括轉錄激活物和阻遏物蛋白的結合位點和啟動轉錄的元件。轉錄激活物及/或阻遏物蛋白的結合位點通常直接在核心啟動子內包含的轉錄起始位點的上游或5’端。因此，RNA聚合酶和必需的轉錄因子結合啟動子序列並啟動轉錄。啟動子序列限定轉錄方向，並指出哪條DNA鏈將被轉錄；此鏈稱為有義鏈。本發明的啟動子轉移轉基因上的視 桿-光感受器特異性，所述轉基因位於啟動子下游，即在3’端。
術語「核心啟動子」(CP)在本文中以其常規含義用於指包括DNA調控序列的核苷酸區域，其中調控序列源自能够結合RNA聚合酶並啟動下游(3’方向)編碼序列轉錄的基因。因此，核心啟動子是正確啟動基因轉錄所需要的啟動子的最小部分，並含有RNA聚合酶(RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III)的結合位點。CP的RNA聚合酶結合位點在轉錄TSS上游(5’)的約25至35個鹼基。核心啟動子可包含所謂的TATA盒(也稱為Goldberg-Hogness盒)，其是經常在古細菌和真核生物中的基因的啟動子區中發現的DNA序列(順式調控元件)。TATA盒具有核心DNA序列5’-TATAAA-3’或其變體，其通常後面有三個或更多個腺嘌呤鹼基。TATA盒通常位於轉錄起始位點上游的25-35個鹼基對。核心啟動子也可為無TATA盒的。相反，缺乏TATA盒的基因使用起始子元件或下游核心啟動子。核心啟動子也可以包含起始子(Inr)。Inr由起始子基序組成，並且在功能上與TATA盒類似。Inr元件促進與轉錄因子II D(TFIID)的結合。
如本發明的上下文中使用的，術語「人視桿光感受器特異性啟動子元件」(hRPSPE)指僅在視桿細胞中，特別是在人視桿細胞中介導下游轉基因轉錄的啟動子元件。組織特異性啟動子的使用允許蛋白質或功能性RNA在人眼的視網膜細胞中組織特異性表達。hRPSPE僅包含天然存在的人視桿光感受器啟動子序列的部分或片段。
術語「基因」或「編碼序列」或「編碼」特定蛋白質或肽的序列在本發明的上下文中用於指當置於適當的調控序列的控制下時體外或體內轉錄(在DNA的情况下)並且翻譯(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。基因的邊界由5’(即胺基)端的起始密碼子和3’(即羧基)端的翻譯終止密碼子決定。術語基因包括但不限於原核或真核mRNA、cDNA、來自原核或真核DNA的基因組DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列通常位於基因序列的3’。
術語「轉基因」在本發明的上下文中用於指從其天然背景中取出並置 於異源啟動子表達控制下的基因。本發明的轉基因的一個例子是編碼視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元的「視桿環狀核苷酸閘控通道β」(CNGB1)基因。在進一步的實施方案中，轉基因可包含人蛋白質：ATP結合盒亞家族A成員4(ABCA4)、芳基烴受體相互作用蛋白樣1(AIPL1)、Bestrophin 1(BEST1)、鈣電壓-閘控通道次單元α 1 F(CACNA1F)、蠟樣質-脂褐素增多症神經元(Ceroid-Lipofuscinosis Neuronal)3(CLN3)、Clarin 1(CLRN1)、環狀核苷酸閘控通道α 1(CNGA1)、中心體蛋白290(CEP290)、Crumbs 1(CRB1)、Crumbs 2(CRB2)、錐-桿同源盒(CRX)、G蛋白偶聯受體98(GPR98)、鳥苷酸環化酶激活物1A(GUCA1A)、鳥苷酸環化酶激活物1B(GUCA1B)、肌球蛋白VIIA(MYO7A)、核受體亞家族2組E成員3(NR2E3)、神經視網膜亮胺酸拉煉(NRL)、磷酸二酯酶6A(PDE6A)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、外周蛋白2(PRPH2)、Prominin 1(PROM1)、視紫質(RHO)、視網膜外段膜蛋白1(ROM1)、視網膜色素變性1蛋白(RP1)、視網膜色素變性2蛋白(RP2)、視網膜色素上皮特異性蛋白65(RPE65)、視網膜色素變性GTP酶調節物(RPGR)、S-抗原視覺抑制蛋白(SAG)、烏謝爾綜合征1C型蛋白(USH1C)、烏謝爾綜合征1G型蛋白(USH1G)、烏謝爾綜合征2A型蛋白(USH2A)或其功能性片段或變體。上述蛋白質的具體實施方案的胺基酸序列在SEQ ID NO：10至41和45中指示。功能片段是維持視桿光感受器的正常功能中相應蛋白質的功能的那些片段。類似地，變體也維持視桿光感受器中相應蛋白質的功能。具有長胺基酸序列的蛋白質，例如人CACNA1F、CEP290、GPR98、MYO7A、RP1和USH2A蛋白質，其太長而不能由可通過相應選擇的載體系統，特別是AAV載體遞送的轉基因編碼。為了適應AAV載體的尺寸限制，可使用「兩分載體」技術，其使用用於基因療法的內蛋白介導的二分系統的開發。通過使用兩分內蛋白，可繞開AAV的包裝限制。因此，可將感興趣的每個半份轉基因與相應的兩分內蛋白部分融合，並且僅在共表達時發生內蛋白介導的反式剪接，並且重建完全的轉基因蛋白質。因此，可能構建兩種編碼轉基因蛋白的片段 的載體，所述載體在共轉導後會在靶細胞中裝配成全長功能蛋白。
如在本申請的上下文中使用的，術語「CNGB1」指基因或由CNGB1基因編碼的蛋白質，即視桿光感受器cGMP閘控陽離子通道，其幫助響應光誘導的胞內cGMP水平的變化而調節離子流入視桿光感受器外段中。此通道由兩個次單元α和β組成，由此基因編碼的蛋白質代表β次單元。與CNGB1和此基因中的缺陷相關的疾病包括視網膜色素變性45和CNGB1相關的視網膜色素變性。環狀核苷酸閘控通道的CNGB1次單元在視覺和嗅覺信號轉導兩者中起重要作用。當與CNGA1相關時，它參與響應光誘導的胞內cGMP水平變化而調節離子流入視桿光感受器外段(ROS)中。
如本文中使用的，術語「增殖」指由細胞生長和細胞分裂所致的細胞數目增加，其可以導致升高或降低的細胞增殖。廣泛的細胞增殖伴隨過度增殖性病症發生，其中細胞的細胞分裂相對於正常組織增加。此類病症的特徵在於異常增殖(生成)，即細胞的過度生成。過度增殖性病症包括腫瘤疾病。腫瘤疾病可以包括良性或惡性腫瘤，其中惡性腫瘤疾病稱為癌症。術語過度增殖性病症包括癌症以及癌前病症。在具體的實施方案中，過度增殖性病症是視桿細胞的過度增殖性病症，特別是視網膜母細胞瘤。
術語「胺基酸」通常指包含取代或未取代的胺基、取代或未取代的羧基、和一種或多種側鏈或基團、或任何這些基團的類似物的任何單體單元。如本文中所使用的，術語「胺基酸」包括以下20種天然或遺傳編碼的α-胺基酸：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、穀胺醯胺(Gln或Q)、谷胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異亮胺酸(Ile或I)、亮胺酸(Leu或L)、賴胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)和纈胺酸(Val或V)。在「X」殘基未定義的情况下，這些應當定義為「任何胺基酸」。這20種天然胺基酸的結構顯示於例如Stryer等，Biochemistry，第5版，Freeman and Company(2002)。也可在遺傳上編碼 另外的胺基酸，如硒代半胱胺酸和吡咯賴胺酸(Stadtman(1996)“Selenocysteine,”Annu Rev Biochem.65：83-100和Ibba等(2002)“Genetic code：introducing pyrrolysine,”Curr Biol.12(13)：R464-R466)。可通過肽鍵連接胺基酸以形成肽或多肽。
在本發明的上下文中，術語「肽」指通過肽鍵連接的胺基酸的短聚合物。它具有與蛋白質相同的化學(肽)鍵，但通常長度較短。最短的肽是由通過單一肽鍵連接的兩個胺基酸組成的二肽。還可以存在有三肽、四肽、五肽等。通常，肽具有多達8、10、12、15、18或20個胺基酸的長度。肽具有胺基端和羧基端，除非它是環肽。
在本發明的上下文中，術語「多肽」指通過肽鍵鍵合在一起的胺基酸的單一綫性鏈，並且通常包含至少約21個胺基酸。多肽可以是由超過一條鏈組成的蛋白質的一條鏈，或者如果蛋白質由一條鏈組成，則它可以是蛋白質自身。
如本文中使用的，術語「片段」指天然存在的片段(例如剪接變體)以及人工構建的片段，特別指通過基因技術手段獲得的片段。通常，片段與親本多肽相比在其N端及/或其C端及/或內部，較佳在其N端、其N和C端、或在其C端具有多達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300個核苷酸的缺失。
如本文中使用的，術語「變體」應當理解為與其來源的多肽或多核苷酸相比在其長度或序列上相差一個或多個變化的多肽或多核苷酸。衍生出多肽或多核苷酸變體的多肽或多核苷酸也稱為親本多肽或多核苷酸。術語「變體」包含親本分子的「片段」或「衍生物」。通常，「片段」在長度或大小上比親本分子小，而「衍生物」與親本分子相比在其序列中表現出一種或多種差異。還涵蓋經修飾的分子，如但不限於翻譯後修飾的蛋白質(例如糖基化、生物素化、磷酸化、泛素化、棕櫚醯化或蛋白水解切割的蛋 白質)和經修飾的核酸，如甲基化的DNA。術語「變體」涵蓋不同分子的混合物，如但不限於RNA-DNA雜合物。通常，較佳通過基因技術手段人工構建變體，而親本蛋白質或多核苷酸是野生型蛋白質或多核苷酸或其共有序列。然而，如本文中使用的，也理解術語「變體」涵蓋天然存在的變體。此外，可用於本發明的變體還可以源自親本分子的同系物、直向同系物或側向同系物或源自人工構建的變體，條件是變體表現出親本分子的至少一種生物學活性，即是功能活性的。
具體地，術語「肽變體」或「多肽變體」應當理解為與其來源的肽、多肽或蛋白質相比在胺基酸序列上相差一種或多種變化的肽、多肽或蛋白質。衍生肽、多肽或蛋白質變體的肽、多肽或蛋白質也稱為親本肽、多肽或蛋白質。此外，可用於本發明的變體也可以源自親本肽、多肽或蛋白質的同系物、直向同系物或側向同系物或源自人工構建的變體，條件是變體表現出親本肽、多肽或蛋白質的至少一種生物學活性。胺基酸序列中的變化可為胺基酸交換、插入、缺失、N端截短或C端截短，或這些變化的任何組合，其可在一個或幾個位點處發生。肽、多肽或蛋白質變體可以表現出胺基酸序列中總數目多達200(多達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200)個變化(即交換、插入、缺失、N端截短及/或C端截短)。胺基酸交換可為保守的及/或非保守的。或者/另外，如本文中使用的，「變體」可通過與其來源的親本肽、多肽或蛋白質的一定程度的序列同一性來表徵。更確切地，在本發明的上下文中的肽、多肽或蛋白質變體與其親本肽、多肽或蛋白質表現出至少80%的序列同一性。肽、多肽或蛋白質變體的序列同一性在20、30、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸的連續區段上。
通過在比較窗口內比較兩個最佳比對的序列來測定「序列同一性的百分比」，其中比較窗口中的序列部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)以實現兩個序列的最佳比對。如下計算百 分比：通過測定這兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數目，以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口內的位置的總數目，並將結果乘以100以產生序列同一性的百分比。
在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中，術語「相同的」指兩個或更多個相同的序列或亞序列，即包含相同的核苷酸或胺基酸序列。當如使用以下序列比較算法之一或通過手動比對和目視檢查量測，在比較窗或指定區域內，為了最大對應性而比較和比對時，若序列具有相同的核苷酸或胺基酸殘基的規定百分比(例如，在比對區域內至少70%、至少75%、至少80、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性)，則序列是彼此「實質上相同的」。這些定義也指測試序列的互補物。因此，在整個說明書中關於多肽和多核苷酸序列比較使用術語「至少80%的序列同一性」。此表述較佳指與相應的參考多肽或相應的參考多核苷酸的至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列同一性。
術語「序列比較」指與測試序列比較的過程，其中一個序列作用為參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機，若必要的話，指定亞序列坐標，並指定序列算法程序參數。通常使用缺省程序參數，或者可以指定備選參數。然後，序列比較算法基於程序參數計算測試序列相對於參考序列的百分比序列同一性或相似性。在比較兩個序列並且沒有規定要計算序列同一性百分比所比較的參考序列的情况下，序列同一性要參考要比較的兩個序列中的較長者計算，若沒有另外明確指出的話。若指定參考序列，則序列同一性基於由SEQ ID指示的參考序列的全長測定，若沒有另外明確指出的話。
如在本發明的上下文中使用的，「可操作連接」指元件的排列，其中如此描述的組件配置為進行它們的通常功能。當核酸置於與另一核酸序列的功能關係中時，核酸是「可操作連接」的。例如，若啟動子影響一種或多種轉基因的轉錄，則其與一種或多種轉基因可操作連接。此外，與編碼序列可操作連接的控制元件能够實現編碼序列的表達。控制元件不需要與編碼序列連續，只要它們發揮功能以指導其表達。因此，例如，居間的未翻譯但轉錄的序列可存在於啟動子序列和編碼序列之間，並且仍然可認為啟動子序列與編碼序列「可操作連接」。
如本文中使用的，術語「聚腺苷酸化信號」(PAS)指參與用於翻譯的成熟信使RNA(mRNA)產生的過程的序列。因此，它形成基因表達的較大過程的一部分。多聚腺苷酸化過程隨基因的轉錄終止而開始。新生成的前mRNA的最3’區段首先被一組蛋白切割；這些蛋白質隨後在RNA的3’端合成聚(A)尾部。在一些基因中，這些蛋白質在幾個可能的位點之一處添加聚(A)尾部。因此，聚腺苷酸化可以從單一基因生成超過一種轉錄物(備選聚腺苷酸化)，類似於可變剪接。聚(A)尾部對mRNA的核輸出、翻譯和穩定性是重要的。尾部隨時間而縮短，並且當它足够短時，mRNA受到酶促降解。然而，在幾種細胞類型中，貯存具有短的聚(A)尾部的mRNA，用以後來通過胞質溶膠中的再聚腺苷酸化而活化。本發明的PAS可包含編碼短猿病毒40(SV40)聚腺苷酸化信號(SV 40 PAS)的核酸。多核苷酸的此種修飾具有如下優點：光感受器細胞中的感興趣基因，例如hCNGB1的表達顯著增强。通過納入SV40 PAS實現的長期表達使多核苷酸能够用作活性基因治療劑。特別地，PAS可包含根據SEQ ID NO：4的核酸序列。
如本說明書中使用的，術語「載體」，也稱為表達構建體，通常是為細胞中的蛋白質表達而設計的病毒。術語「載體」指能够導入細胞中或者將其中包含的蛋白質及/或核酸導入細胞中的蛋白質或多核苷酸或其混合物。載體的實例包括但不限於質體、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。具體地，使用載體將本發明的啟動子和轉基因轉移到合適的宿主細胞中。載體 可以含有促進載體在宿主細胞中自主複製的「複製子」多核苷酸序列。外來DNA定義為異源DNA，其是非天然存在於宿主細胞中的DNA，其例如複製載體分子，編碼選擇標志物或篩選標志物，或編碼轉基因。一旦在宿主細胞中，載體可不依賴於宿主染色體DNA或與宿主染色體DNA一致複製，並且可產生載體及其插入的DNA的幾個拷貝。此外，載體還可含有允許插入的DNA轉錄成mRNA分子或以其它方式引起插入的DNA複製成多個RNA拷貝的必要元件。載體可進一步涵蓋調控感興趣基因表達的「表達控制序列」。通常，表達控制序列是多肽或多核苷酸，如但不限於啟動子、增强子、沉默子、絕緣子或阻遏物。在包含編碼一種或多種感興趣基因產物的超過一種多核苷酸的載體中，可通過一種或多種表達控制序列一起或分開控制表達。更具體地，載體上包含的每個多核苷酸可以由分開的表達控制序列控制，或者載體上包含的所有多核苷酸可以由單一表達控制序列控制。在由單一表達控制序列控制的單一載體上包含的多核苷酸可以形成開讀框。另外，一些表達載體含有與插入的DNA相鄰的序列元件，其增加表達的mRNA的半衰期及/或允許mRNA翻譯成蛋白質分子。因此，可快速合成由插入的DNA編碼的mRNA和多肽的許多分子。
如在本發明的上下文中使用的，術語「AAV載體」指完整的病毒顆粒，即包括與AAV殼體蛋白外殼結合的綫性單鏈AAV核酸基因組。就此而言，可將任何互補有義(即「有義」或「反義」鏈)的單鏈AAV核酸分子包裝入任何一種AAV病毒體中；兩條鏈是相等感染性的。本發明的AAV載體也可為由AAV蛋白質殼構成的感染性和複製缺陷型病毒，該病毒包囊感興趣的異源DNA分子(例如hCNGB1)，其可在兩側上側翼有AAV ITR。示例性AAV 5’ ITR具有根據SEQ ID NO：5的核酸序列，並且示例性AAV 3’ ITR具有SEQ ID NO：6的互補物的核酸序列。可在合適的宿主細胞中生成本發明的AAV載體，所述宿主細胞已經具有其中引入的AAV載體、AAV輔助功能和附屬功能。以此種方式，使宿主細胞能够編碼AAV多肽，所述AAV多肽對於將AAV基因組(即，含有感興趣的重組核 苷酸序列)包裝入重組病毒體顆粒中用於隨後基因遞送是需要的。
已經鑒定出腺相關病毒(AAV)的各種天然存在的血清型，包括12種人血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12)和來自非人靈長類的幾種血清型。不同的AAV血清型在其基因組序列中，例如在反向末端重複(ITR)序列或編碼殼體的序列中也不同。如在本發明的上下文中使用的，術語「AAV基因組」指源自腺相關病毒血清型的任何核酸序列，所述腺相關病毒血清型包括但不限於AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-9、AAV-7等。AAV基因組可具有全部或部分缺失的一種或多種AAV野生型基因，較佳Rep及/或Cap基因，但保留功能性側翼反向末端重複(「ITR」)序列。功能性ITR序列通常對於AAV基因組的拯救、複製和包裝是必需的。因此，AAV基因組在本文中定義為至少包含對於病毒的複製和包裝(例如功能性ITR)以順式需要的那些序列。ITR不需要是野生型核苷酸序列，並且可改變(例如，通過核苷酸的插入、缺失或取代)，只要序列提供功能性拯救、複製和包裝。ITR可包含根據SEQ ID NO：5及/或SEQ ID NO：6的序列。
如在本發明的上下文中使用的，「抗體」是屬免疫球蛋白超家族的糖蛋白；術語抗體和免疫球蛋白經常可互換使用。抗體指由漿細胞產生的蛋白質分子，並且由免疫系統用來鑒定並中和外來物體如細菌和病毒。抗體識別外來靶物的獨特部分，即其抗原。
如本文中使用的，術語「抗體結合片段」指保留特異性結合抗原的能力的一種或多種抗體片段。在術語「抗體結合片段」內涵蓋的結合片段的實例包括片段抗原結合(Fab)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、重鏈抗體、單域抗體(sdAb)、單鏈片段可變區(scFv)、片段可變區(Fv)、VH域、VL域、單域抗體、納米抗體、IgNAR(免疫球蛋白新抗原受體)、di-scFv、雙特異性T細胞銜接物(BITE)、雙重親和力再靶向(DART)分子、三重體(triple body)、雙抗體、單鏈雙抗體、備選支架蛋白、和其融合蛋白。
如本申請中使用的，術語「醫藥組合物」包括活性化合物或成分，即本發明的多核苷酸、質體及/或載體的配製劑，並且指用於鑒定、預防、維持或治療組織狀態或疾病的物質及/或物質組合。將醫藥組合物配製成適於投予於患者以預防及/或治療疾病及/或維持生理狀態。此外，醫藥組合物指活性劑與惰性或活性載體的組合，使組合物適用於治療用途。醫藥組合物可以根據它們的化學和物理性質配製用於口服、胃腸外、局部、吸入、直腸、舌下、經皮、皮下或陰道投予路徑。醫藥組合物包含固體、半固體、液體、經皮治療系統(TTS)。固體組合物選自由下列組成之群組：片劑、包衣片劑、粉劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、泡騰片劑或經皮治療系統。還包括液體組合物，其選自由下列組成之群組：溶液、糖漿劑、輸注劑、提取物、用於靜脉內投予的溶液、用於輸注的溶液或本發明的載體系統的溶液。可以在本發明的背景中使用的半固體組合物包含乳劑、懸浮液、乳膏、洗劑、凝膠、球劑、口含片劑和栓劑。
「藥學可接受的」意指由聯邦或州政府的管理機構批准或在美國藥典或其它公認的藥典中列出用於在動物中並且更特別在人中使用。
如在本說明書內提及的，「載體」包括能够將試劑遞送至人體的期望區室(例如某種細胞類型)的組合物，並且在通過選擇的投予路徑和方案投予後可用於提供和控制藥物的釋放。
如本文中使用的，投予路徑描述人體中攝取異生素並且根據施加異生素的位置進行分類。包含多核苷酸及/或病毒載體的醫藥組合物(特別是在治療方法中)選自眼內、球內、玻璃體內或視網膜下。
術語「疾病」指異常狀况，特別是異常醫學狀况，如疾病或損傷，其中細胞、組織、器官或個體不再能够有效履行其功能。通常但不一定，疾病與指示存在此類疾病的特定症狀或體征有關。因此，此類症狀或體征的存在可以指示患有疾病的細胞、組織、器官或個體。這些症狀或體征的改變可以指示此類疾病的進展。疾病進展通常特徵在於此類症狀或體征的增加或减少，這可以指示疾病「惡化」或「改善」。疾病的「惡化」以降低 細胞、組織、器官或個體/患者有效履行其功能的能力為特徵，而疾病的「改善」通常以細胞、組織、器官或個體/患者有效履行其功能的能力增加為特徵。對疾病「易感」的細胞、組織、器官或個體處於健康狀態，但特別容易出現疾病，例如由於遺傳素因、缺乏疫苗接種、發育不良或免疫力不成熟、營養狀况差等。
在本發明的上下文中的「視網膜疾病」指但不限於任何種類的視網膜變性。屬視網膜變性的組的視網膜營養不良是廣泛的一組不同嚴重性且具有不同的遺傳模式的遺傳性視網膜疾病。視網膜營養不良屬色素性視網膜病組。視網膜色素變性是最常見的視網膜營養不良，並且特徵在於眼底檢查時可見的視網膜色素沉積物和視桿光感受器細胞的原發性喪失，接著是視錐光感受器的繼發性喪失。患者通常具有夜視失明和中等周邊視野損失。隨著疾病狀况進展，患有疾病的患者喪失其遠端周邊視野並最終也喪失中心視覺。視網膜變性可以與遺傳突變、取代及/或缺失有關。視網膜變性選自由下列組成之群組：夜盲、失明、視網膜變性、視網膜營養不良和視網膜色素變性。視網膜色素變性可以是CNGB1連鎖的視網膜色素變性或視網膜色素變性45型(RP45)。
視網膜病症的其它實例包括但不限於RPE65介導的視網膜病症、黃斑變性(例如年齡相關性黃斑變性)、遺傳性青少年黃斑變性(例如斯塔加特(Stargardt)病)、視桿-視錐營養不良、視錐-視桿營養不良、小口氏病(Oguchi disease)、Malattia Leventinese等等。
如本文中使用的，「CNGB1連鎖的視網膜色素變性」指涉及視網膜進行性變性的一類疾病，通常在中間周邊開始並朝向斑和凹前進(Ferrani等(2011)Curr.Genomics 12(4)：238)。典型的表型症狀包括夜盲，接著是降低視野，導致隧道視覺並最終導致法定盲，或者在許多情况下完全失明。在細胞水平上，這與主要受影響的視桿光感受器系統相關。在後期階段中，疾病可以進一步影響視錐光感受器，最終引起完全失明。患病的光感受器經歷雕亡，這在視網膜內外核層厚度减少以及眼底中的病變及/或視網膜色 素沉積物中反映。在經歷視敏度的喪失前，患者可以喪失其光感受器的相當大部分。臨床表型標志包括但不限於：(i)具有骨-骨針沉積物和减弱的視網膜血管的異常眼底；(ii)視網膜電圖(ERG)中異常、减少或缺乏的a波和b波；和(iii)視野减小。症狀通常在青少年早期開始，並且到40至50歲時出現嚴重視覺損傷。
已知對視網膜色素變性致病的遺傳變異的實例是CNGB1基因外顯子32的供體位點(3444+1G-A)處的純合剪接位點突變，其導致最後28個胺基酸的移碼和截短。已知對視網膜色素變性致病的遺傳變異的另一個實例是CNGB1基因的外顯子30中的純合2978G-T顛換，其預測導致蛋白質的第993位的甘胺酸至纈胺酸取代(G993V)。CNGB1的甘胺酸993是保守殘基。已知對視網膜色素變性致病的遺傳變異的另一個實例是CNGB1基因中的純合c.1589C-G顛換，導致CNGB1蛋白質的第530位的脯胺酸至精胺酸的取代(P530R)。對視網膜色素變性致病的另一種已知遺傳變異包括CNGB1基因中的c.2128C-T變化，導致CNGB1蛋白質的第710位的穀胺醯胺至終止的取代(Q710Stop)。對於視網膜色素變性致病的其它遺傳變異可見於人在綫孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)數據庫和由國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)維護的ClinVar數據庫，通過引用將其完整併入本文用於所有目的。
可以用本領域中已知檢測本文中所述的一種或多種表型體征及/或CNGB1基因中的一種或多種遺傳變異的方法鑒定CNGB1連鎖的視網膜色素變性。任何導致CNGB1保守殘基改變的遺傳變異對於視網膜色素變性可以是致病的。
如本文中使用的，疾病或病症的「治療」或「療法」指實現以下一項或多項：(a)降低病症的嚴重性；(b)限制或預防治療的病症的特徵性症狀的形成/發展；(c)抑制治療的病症的特徵性症狀的惡化；(d)限制或預防先前已經具有病症的個體中病症的復發；(e)限制或預防先前有病症症狀的個體 中症狀的復發。
在下文中，描述了本說明書中包含的圖的內容。在此背景下，還請參考上面及/或下面對本發明的詳細描述。
圖1顯示了rAAV hRHO194.hCNGB1載體基因組的結構。
圖2顯示了pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40順式載體質體圖。
圖3A-3B描繪了在用表達eGFP而非hCNGB1的載體形式處理的野生型小鼠中顯示天然eGFP螢光的代表性共焦圖像。這些代表性共焦圖像顯示在來自在4周時用rAAV.hRHO194.eGFP載體視網膜下處理的8周齡野生型小鼠的視網膜橫截面中的天然eGFP螢光。在處理的動物中觀察到强烈的且視桿特異性的eGFP信號(圖3A)，但在未注射的對照中缺乏(圖3B)。
圖4A-4B顯示了來自用根據本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠的代表性ERG量測；來自用根據本發明的載體在一隻眼中處理的CNGB1(-/-)小鼠的視網膜電描記術(ERG)量測數據。(圖4A)在4.4cd/m2單次閃光刺激時獲得的代表性ERG迹綫。陰影迹綫來自處理後4個月時CNGB1(-/-)小鼠的經處理的眼，而黑色迹綫來自未處理的眼。(圖4B)匯總圖，其顯示在相同條件下從野生型小鼠(灰色)、經處理的CNGB1(-/-)小鼠(深灰色)和未處理的CNGB1(-/-)小鼠(黑色)量測的ERG b波幅度。* p<0.05，學生t檢驗，N=4。
圖5A-5C顯示了來自用根據本發明的載體在一隻眼中處理的CNGB1(-/-)小鼠的光感受器層厚度的光學相干斷層攝影術(OCT)量測。(圖5A-5B)來自經處理的(圖5A)和未處理的眼(圖5B)的代表性OCT掃描。用垂直黑色棒標記光感受器層的厚度。使用OCT對光感受器層厚度的量化(圖5C)。*** p<0.001，單因素ANOVA，N=9。
圖6A-6B描繪了來自用根據本發明的載體處理的(圖6A)或未處理的(圖6B)CNGB1(-/-)小鼠中hCNGB1的免疫組織學染色的代表性共焦圖像。
圖7描繪了顯示根據本發明的通用載體設計的示意圖。
圖8A-8B顯示了來自用本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠的代表性ERG量測(圖8A)。處理前野生型和CNGB1(-/-)小鼠中的代表性ERG量測(圖8B)。
圖9A-9B描繪了來自用本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠(圖9A)和未處理的小鼠(圖9B)中hCNGB1的免疫組織學染色的代表性共焦圖像。
圖10A-10C描繪了揭示視網膜變性的顯著延遲的OCT分析。根據本發明的載體的一般注射日程表(圖10A)。在用根據本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠(圖10B)和未處理的小鼠(圖10C)中在9個月時收集的OCT圖像。
圖11A-11E描繪了用本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠中將視桿功能恢復兩個月。用本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠和未處理的小鼠(圖11A)中的代表性ERG B波量測。匯總圖，其顯示了在用根據本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠或未處理的小鼠中響應-0.5 log(cd s/m2)的光刺激量測的ERG b-波幅度(圖11B)。來自用根據本發明的載體處理的CNGB1(-/-)小鼠(圖11C)和未處理的小鼠(圖11D)的光感受器層厚度的OCT量測。使用OCT對光感受器層厚度的量化(圖11E)。N=6。
圖12A-12B描繪了使用視桿特異性刺激(圖12A)和閃爍響應(圖12B)，在用本發明的載體處理的CNGB1(-/-)犬和未處理的犬的眼中觀察到的明顯的ERG挽救。
圖13A-圖13B顯示了視覺測試數據，其顯示用根據本發明的載體處理的CNGB1(-/-)犬具有視桿介導的視覺和改善的視覺測試性能。通過正確出口選擇(圖13A)和至出口時間(time to exit)(圖13B)中改善的表現指示恢復的視桿視覺。
圖14描繪了顯示用根據本發明的載體處理的CNGB1(-/-)犬中的A波和B波幅度改善的ERG量測。發現A波幅度指示的治療眼中響應閾值的改善大於1.5個對數單位(圖14A)。發現B波幅度指示的治療眼中響應閾值的改善大於2個對數單位(圖14B)。
在下文中，更詳細限定本發明的不同態樣。除非明確相反指示，如此限定的每個態樣可以與任何一個或多個態樣組合。特別地，指示為較佳或有利的任何特徵可以與指示為較佳或有利的任何其它特徵組合。
在將核酸導入細胞中以例如提升表達、替換缺陷基因、及/或抑制缺陷基因表達的基因治療及/或基因矯正療法中，通常期望所有轉基因元件都是小的。儘管如此，經常難以鑒定轉基因元件，所述轉基因元件的大小可以在體內情况下不負面實現或喪失其活性的情况下縮小。通常，體外實驗不適合於指示元件的體內行為，使得可能的大小縮小的確定變得困難且不可預測。在導致本發明的工作中，令人驚訝地顯示了人視桿啟動子的短部分(即小於200個鹼基的元件)可以在體內轉移與此啟動子元件可操作連接的轉基因上的視桿-光感受器特異性表達。當在體內背景中使用本文中定義的啟動子元件時，觀察到轉基因的穩定整合和表達。表達水平適合於改善用包含轉基因的腺相關病毒載體轉染的測試動物的視覺能力。
此令人驚訝的發現特別提供相對於現有技術的以下優點：(i)導入細胞中的構建體的大小縮小，(ii)轉基因對病毒載體的包裝效率增加，(iii)在體內發生重組事件的幾率降低；(iv)增加轉基因對靶細胞，特別對靶細胞的核的導入效率；(v)人患者中對於治療視桿相關疾病的合適的表達水平，(vi)體內視網膜功能的保留及/或改善及/或(vii)體內視覺保留及/或改善。
在第一態樣，本發明涉及多核苷酸，所述多核苷酸依次包含：a)啟動子，所述啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，所述人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體，實質上由根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體組成，或由根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體組成；和b)與a)的啟動子可操作連接的至少一種轉基因(TG)； 其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83和87至94外部的一種或多種核酸取代，並且其中所述啟動子的長度特別是350個鹼基或更少。提供一種或多種上述優點的啟動子也可以長於350個鹼基，例如，600bp或更少，500bp或更少，或400bp或更少。在具體的實施方案中，啟動子具有300個鹼基或更少的長度，在其它實施方案中，它具有300個鹼基或更少的長度，在其它實施方案中，它具有250個鹼基或更少的長度，在其它實施方案中，它具有200個鹼基或更少的長度，在其它實施方案中，它具有194個鹼基或更少的長度。
嘗試使導入患者中的異源鹼基的總體長度最小化，多核苷酸不包含除上述a)中明確定義以外的其它人視桿啟動子及/或基因核苷酸序列。
要在SEQ ID NO：1的變體中保留指示的核苷酸，因為本發明人認為這些核苷酸序列有助於對hRPSPE賦予視桿光感受器特異性表達。在推定的轉錄因子結合序列(TFB)外部，可以突變或插入1個或更多個核苷酸。如果插入核苷酸，那麽插入1至70個核苷酸是有利的數目，其中7的倍數是特別有利的，因為此數目維持TFB的相對旋轉位置。然而，在不改變TFB之間的距離以避免轉錄因子與啟動子元件結合的旋轉移位時是有利的。因此，在根據SEQ ID NO：1的99bp長的序列內，允許突變位置1至5、14至31、41至69、84至86和95至99處的一個或多個核苷酸。因此，最大程度上可以在SEQ ID NO：1內突變50個核苷酸。因此，特定變體包含1至50個突變，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。其它特定變體包含5至40、10至30或20至25個突變。包含hRPSPE變體的啟動子與下述啟動子一樣顯示視桿光感受器特異性表達水平，所述啟動子包含含有根據SEQ ID NO：1的核酸序列的hRPSPE，較佳由SEQ ID NO：2的核苷酸155至350或155至348組成的啟動子。在變體顯示由SEQ ID NO：2的核苷酸155至350或155至348 組成的啟動子的至少10%的表達水平時是有利的。其它有利的表達水平為至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。根據相應的治療方法，不同的表達水平可以是有利的，特別地若轉基因的較高表達水平過度補償缺陷或導致有害效應，則比用SEQ ID NO：2的核苷酸155至350組成的啟動子獲得的表達水平更低的表達水平可以是有利的。
還考慮本發明的多核苷酸包含與a)的啟動子可操作連接的兩個或更多個轉基因。在此類情况下，可以通過兩個轉基因之間插入允許兩個轉基因分開翻譯的核苷酸序列(例如，編碼內部核糖體進入位點(IRES))來獲得兩個或更多個轉基因的分開表達。
在本發明的第一態樣的一個實施方案中，在a)的啟動子中包含的hRPSPE的5’端在SEQ ID NO：2或其變體的1至160的核酸位置處，並且3’端在290至310的核酸位置處。在具體的實施方案中，hRPSPE的5’端在以下核酸位置之一處：SEQ ID NO：2的1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、145、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160。在具體的實施方案中，hRPSPE的3’端在以下核酸位置之一處：SEQ ID NO：2的290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、或310。因此，根據具體實施方案，在a)的啟動子中包含的hRPSPE跨越SEQ ID NO：2的核酸位置1至310、10至309、20至308、30至307、40至306、50至305、60至304、70至303、80至302、90至301、100至300、110至299、120至298、130至297、140至296、150至295、151至294、152至293、153至292、154至291或155至290。術語「hRPSPE的變體」具有上文概述的含義。因此，本段中指示的片段的變體具有分別指示的5’和3’端，並且可以另外包含在上文參考SEQ ID NO：1指示的序列外部的突變。
在本發明的第一態樣的一個實施方案中，CP包含TATA盒及/或起始 子(Inr)。在具體實施方案中，人rho啟動子的TATA盒和Inr。在一個具體的實施方案中，在a)的啟動子中包含的CP的5’端在SEQ ID NO：2的核苷酸位置300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314，並且3’端在SEQ ID NO：2的330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、342、343、344、345、346、347、348、349或350的核酸位置。因此，根據具體的實施方案，在a)的啟動子中包含的CP跨越SEQ ID NO：2的核酸位置300至350、301至350、302至350、303至350、304至349、305至349、306至349、307至349、308至348、309至348、310至348、311至348、312至348、313至348、或314至348。在本發明的第一態樣的一個實施方案中，啟動子的5’端在SEQ ID NO：2或其變體的1至160的核酸位置處，並且3’端在340至350的核酸位置處。在一個具體的實施方案中，啟動子的5’端在以下核酸位置之一：1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、145、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160。在一個具體的實施方案中，啟動子的3’端在以下核酸位置之一處：SEQ ID NO：2的330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、342、343、344、345、346、347、348、349或350。因此，根據具體的實施方案，a)的啟動子跨越SEQ ID NO：2的核酸位置1至350、10至350、20至350、30至350、40至350、50至350、60至350、70至350、80至350、90至349、100至349、110至349、120至349、130至349、140至348、150至348、151至348、152至348、153至348、154至348或155至348。在一個具體的實施方案中，啟動子包含SEQ ID NO：9，實質上由SEQ ID NO：9組成，或由SEQ ID NO：9組成。
在本發明的第一態樣的一個實施方案中，轉基因包含編碼蛋白質的核酸，實質上由編碼蛋白質的核酸組成或由編碼蛋白質的核酸組成，所述蛋白質維持或改善視桿細胞的生理功能及/或抑制視桿細胞的增殖。通常，在健康的視桿細胞中天然表達此類基因。技術人員知道大量在視桿細胞中表 達的參與視桿細胞生理功能的基因。此功能特別包括響應一個或多個光子的檢測的光子檢測和神經脉衝產生。
在本發明的第一態樣的一個實施方案中，轉基因：(i)包含編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片段或變體的核酸；編碼靶向mRNA的miRNA或shRNA的核酸，所述mRNA編碼其顯性負性突變體；及/或編碼抗體或抗體結合片段的核酸，所述抗體或抗體結合片段特異性結合其顯性負性突變體；或(ii)包含編碼抑制桿細胞增殖的蛋白質的核酸，較佳毒素；前藥轉化酶，例如胸苷激酶；細胞週期抑制劑，例如視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21CIP1、p27KIP1和p57KIP2；包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的mRNA；及/或包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的核酸。
視桿細胞的一些疾病的特徵在於維持或改善視桿細胞功能或防止過度增殖的一種或多種基因，特別是編碼(i)或(ii)中指示的蛋白質的基因中的隱性突變。在此類情况下，若將編碼功能性蛋白質的轉基因導入視桿細胞中(特別是使用載體)，則經常足以治愈或至少改善疾病。然而，若疾病是由顯性負性突變引起的，則提供編碼功能性蛋白質或其功能性片段的轉基因經常不足以治愈或改善疾病。在此類情况下，較佳在細胞中减少(即敲低)顯性負性突變體蛋白的表達或功能。可以通過表達編碼特異性降低顯性負性突變體蛋白表達的抑制性RNA的轉基因或通過編碼特異性結合並失活顯性負性突變體蛋白並且不顯著地結合相應的功能蛋白的抗體或其片段的一種或多種轉基因影響此類敲减。熟練技術人員完全知道如何設計對編碼相應顯性負性突變體蛋白的mRNA特異性的此類抑制性RNA。類似地， 技術人員知道如何產生僅結合顯性負性突變體蛋白而非野生型蛋白的抗體。抗體在其天然形式中包含兩條不同的蛋白質鏈。因此，若表達抗體的兩條蛋白質鏈以敲低蛋白質，則一個轉基因可以包含通過內部核糖體進入位點(IRES)連接的編碼輕鏈的核苷酸和另一個編碼重鏈的轉基因。以此方式，可以從單一mRNA表達兩條抗體鏈。對技術人員顯而易見的是，可以在不影響視桿細胞內抗體表達的情况下反轉輕鏈和重鏈的次序。或者，單鏈抗體可以由轉基因編碼。
在一個具體的實施方案中，要治療的疾病的特徵在於維持或改善視桿細胞功能或促進過度增殖的一種或多種基因，特別是在AIPL1、BEST1、NR2E3、NRL、PRPH2、RHO、ROM1及/或RP1中一種或多種中的顯性負性突變。在此情况下，較佳敲除由顯性負性突變體基因編碼的蛋白質的表達及/或功能，並且轉基因編碼功能性蛋白質或其功能性片段。若相應的載體的大小限制允許，則較佳多核苷酸包含編碼功能性蛋白質或其功能性片段的轉基因和編碼抑制性RNA或抑制性抗體或其片段的轉基因兩者。若這兩種轉基因都編碼蛋白質，則它們可以在相同啟動子的控制下並且使用兩個轉基因之間的IRES序列，或者若一個轉基因編碼蛋白質，而另一個編碼抑制性RNA，則每個轉基因可以與根據本發明的第一態樣的i)的不同啟動子可操作連接。
術語「功能性片段」指不導致相應蛋白質的視桿細胞特異性功能的喪失的相應蛋白質的N端及/或C端缺失。術語「其變體」指與相應指示的人野生型蛋白質，特別是根據SEQ ID NO：3，10-41、和45的蛋白質具有至少70%序列同一性的蛋白質。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：3具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：10具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性， 且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：11具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：12具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：13具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：14具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：15具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：16具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：17具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：18具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：19具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性， 且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：20具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：21具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：22具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：23具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：24具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：25具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：26具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：27具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：28具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性， 且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：29具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：30具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：31具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：32具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：33具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：34具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：35具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：36具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：37具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性， 且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：38具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：39具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：40具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。在一個具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：45具有至少70%序列同一性，特別地75%序列同一性，更特別地80%序列同一性，更特別地85%序列同一性，更特別地90%序列同一性，且更特別地95%序列同一性。
上文指示的蛋白質的功能性片段是那些在正常發揮功能的視桿光感受器中，特別是在檢測光子及/或傳輸關於檢測光子的信息中維持相應蛋白質的功能的片段。類似地，變體也維持正常發揮功能的視桿光感受器中相應蛋白質的功能。
在本發明的第一態樣的實施方案中，由轉基因編碼的hCNGB1包含根據SEQ ID NO：3的胺基酸序列或其變體。在本發明的第一態樣的實施方案中，由轉基因編碼的hCNGB1包含根據SEQ ID NO：40的胺基酸序列或其變體。在本發明的第一態樣的一個實施方案中，由轉基因編碼的hCNGB1包含根據SEQ ID NO：41的胺基酸序列或其變體。
在本發明的第一態樣的一個實施方案中，多核苷酸包含一種或多種選自以下的另外的核苷酸序列元件： (i)聚腺苷酸化信號(pA)；及/或(ii)一個或兩個反向末端重複(ITR)序列；及/或(iii)形成感染性病毒載體，較佳腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒、或疱疹病毒載體，特別是單純疱疹病毒(HSV)載體所必需的病毒核苷酸序列。
對於形成相應類型的感染性病毒載體必需的病毒核苷酸序列在本文中是公知的。任何這些元件可以包含在本發明的第一態樣的多核苷酸中。
在本發明的第一態樣的一個實施方案中，聚腺苷酸化信號包含猿病毒40 PAS，實質上由猿病毒40 PAS組成，或由猿病毒40 PAS組成。
在本發明的第一態樣的實施方案中，聚腺苷酸化信號包含根據SEQ ID NO：4的核酸或其功能變體，實質上由根據SEQ ID NO：4的核酸或其功能變體組成，或者由根據SEQ ID NO：4的核酸或其功能變體組成。
在本發明的第一態樣的實施方案中，ITR序列是腺相關病毒(AAV)ITR。
在本發明的第一態樣的實施方案中，AAV ITR是AVV血清型2、5、8或9的。
在本發明的第一態樣的實施方案中，啟動子和轉基因在其5’端側翼有L-ITR並且在其3’端側翼有R-ITR。在一個具體實施方案中，元件按照以下順序以5’至3’方向排列：L-ITR-啟動子-轉基因-R-ITR、L-ITR-轉基因-啟動子-R-ITR、R-ITR-啟動子-轉基因-L-ITR、或R-ITR-轉基因-啟動子-L-ITR。在另一個具體的實施方案中，元件按照以下順序以5’至3’方向排列：L-ITR-啟動子-轉基因-PAS-R-ITR、L-ITR-PAS-轉基因-啟動子-R-ITR、R-ITR-啟動子-轉基因-PAS-L-ITR或R-ITR-PAS-轉基因-啟動子-L-ITR。
在本發明的第一態樣的實施方案中，L-ITR包含根據SEQ ID NO：5的序列或其變體，實質上由根據SEQ ID NO：5的序列或其變體組成，或由根據SEQ ID NO：5的序列或其變體組成；及/或R-ITR包含SEQ ID NO：6的序列或其變體，實質上由SEQ ID NO：6的序列或其變體組成，或由根 據SEQ ID NO：6的序列或其變體組成。
根據使用的病毒載體，可以在病毒載體中有效包裝的核酸的長度較大變化。一些載體如腺病毒載體可以容納大的核酸插入物，而另一些載體如腺病毒相關載體有效包裝具有4700個鹼基或更少的長度的多核苷酸。無論載體的核酸包裝能力如何，通常希望使導入患者中的任何異源核酸的長度最小化，特別是在將異源核酸穩定引入基因組中時。因此，在本發明的第一態樣的實施方案中，多核苷酸的總長度為5200個鹼基或更少，特別是5100個鹼基或更少，特別是5000個鹼基或更少，特別是4900個鹼基或更少，特別是4800個鹼基或更少，且更特別是4700個鹼基或更少。
在本發明的第一態樣的具體實施方案中，多核苷酸以5’至3’方向包含以下核酸元件，實質上由以下核酸元件組成：L-ITR-啟動子-轉基因-SV40 PAS-R-ITR、L-ITR-SV40 PAS-轉基因-啟動子-R-ITR、R-ITR-啟動子-轉基因-SV40 PAS-L-ITR、或R-ITR-SV40 PAS-轉基因-啟動子-L-ITR，其中轉基因包含編碼SEQ ID NO：3的hCNGB1蛋白的核苷酸序列，實質上由編碼SEQ ID NO：3的hCNGB1蛋白的核苷酸序列組成，或由編碼SEQ ID NO：3的hCNGB1蛋白的核苷酸序列組成，PAS包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列，實質上由SEQ ID NO：4的核苷酸序列組成，或由SEQ ID NO：4的核苷酸序列組成，所述L-ITR包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列，實質上由SEQ ID NO：5的核苷酸序列組成，或由SEQ ID NO：5的核苷酸序列組成，R-ITR包含核苷酸序列SEQ ID NO：6，實質上由核苷酸序列SEQ ID NO：6組成，或由核苷酸序列SEQ ID NO：6組成，並且啟動子包含跨越SEQ ID NO：1的核苷酸155至348的核苷酸序列，實質上由跨越SEQ ID NO：1的核苷酸155至348的核苷酸序列組成，或由跨越SEQ ID NO：1的核苷酸155至348的核苷酸序列組成。還有，在此實施方案中，多核苷酸的總長度是5200個鹼基或更少，特別是5100個鹼基或更少，特別是5000個鹼基或更少，特別是4900個鹼基或更少，特別是4800個鹼基或更少，且更特別是4700個鹼基或更少。
本發明的第二態樣涉及包含本發明的第一態樣的多核苷酸的質體。質體是可以在細菌中複製的環狀DNA。
在本發明的第二態樣的實施方案中，質體包含根據SEQ ID NO：7的核酸序列或其變體，實質上由根據SEQ ID NO：7的核酸序列或其變體組成，或由根據SEQ ID NO：7的核酸序列或其變體組成。在本發明的第二態樣的實施方案中，質體包含根據SEQ ID NO：42的核酸序列或其變體，實質上由根據SEQ ID NO：42的核酸序列或其變體組成，或由根據SEQ ID NO：42的核酸序列或其變體組成。在本發明的第二態樣的實施方案中，質體包含根據SEQ ID NO：43的核酸序列或變體，實質上由根據SEQ ID NO：43的核酸序列或變體組成，或由根據SEQ ID NO：43的核酸序列或變體組成。在本發明的第二態樣的實施方案中，質體包含根據SEQ ID NO：44或其變體的核酸序列，實質上由根據SEQ ID NO：44或其變體的核酸序列組成，或由根據SEQ ID NO：44或其變體的核酸序列組成。
本發明的第三態樣涉及包含本發明的第一態樣的多核苷酸的病毒載體。在一個具體的實施方案中，病毒載體是AAV、腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒、或疱疹病毒載體，特別是單純疱疹病毒(HSV)載體。在一個具體的實施方案中，病毒載體是AAV。
在本發明的第三態樣的一個實施方案中，病毒選自由下列組成之群組：AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其變體。
本發明的第四態樣涉及根據本發明的第一態樣的多核苷酸、本發明的第二態樣的質體及/或根據本發明的第三態樣的病毒載體，其用作藥物。
本發明的第五態樣涉及醫藥組合物，其包含根據本發明的第一態樣的多核苷酸、本發明的第二態樣的質體及/或根據本發明的第三態樣的病毒載體，和藥學可接受載劑。
本發明的第六態樣涉及根據本發明的第一態樣的多核苷酸、根據本發明的第二態樣的質體及/或根據本發明的第三態樣的病毒載體，其用於視網膜疾病的療法。
有利地，根據本發明的第一態樣的多核苷酸、本發明的第二態樣的質體及/或根據的本發明第三態樣的病毒載體可以用於與視桿光感受器功能損失或異常視桿光感受器功能相關的疾病，特別是視桿細胞的視網膜變性或過度增殖，特別是成視網膜細胞瘤。雖然通過本發明的第一態樣的多核苷酸的啟動子獲得轉基因的組織特異性表達，並且因此治療性多核苷酸、質體或病毒載體的系統性投予可以是缺乏系統性的並且仍會限於視桿受體，但是在將本發明的治療性多核苷酸、質體或病毒載體直接投予於患者的眼時是更有效的。因此，特定的投予路徑選自眼內、球內、玻璃體內或視網膜下投予。
在本發明的第六態樣的實施方案中，視網膜變性與遺傳突變、取代及/或缺失有關。
在本發明的第六態樣的實施方案中，視網膜變性與遺傳突變、取代及/或缺失有關。
在本發明的第六態樣的實施方案中，變性選自由下列組成之群組：夜盲、失明、視網膜變性、視網膜營養不良和視網膜色素變性。
在本發明的第六態樣的實施方案中，視網膜色素變性是CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)。
本發明的第七態樣涉及多核苷酸，其依次包含：a)包含根據SEQ ID NO：9的核酸序列或其變體的人視紫質啟動子；和b)與a)的啟動子可操作連接的至少一種轉基因(TG)。
在本發明的第七態樣的實施方案中，轉基因包含編碼維持或改善視桿生理功能的蛋白質的核酸。
在本發明的第七態樣的實施方案中，轉基因：(i)包含編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、 SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片段或變體的核酸；編碼靶向mRNA的miRNA或shRNA的核酸，所述mRNA編碼其顯性負性突變體；及/或編碼抗體或抗體結合片段的核酸，所述抗體或抗體結合片段特異性結合其顯性負性突變體；或(ii)包含編碼抑制桿細胞增殖的蛋白質的核酸，較佳毒素；前藥轉化酶，例如胸苷激酶；細胞週期抑制劑，例如視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21CIP1、p27KIP1和p57KIP2；包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的mRNA；及/或包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的核酸。
在本發明的第七態樣的實施方案中，多核苷酸還包含一種或多種選自由下列組成之群組的核苷酸序列元件：(i)聚腺苷酸化信號(PAS)；(ii)一個或兩個反向末端重複(ITR)序列；和(iii)形成感染性病毒載體，較佳腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒、或疱疹病毒載體，特別是單純疱疹病毒(HSV)載體所必需的病毒核苷酸序列。
在本發明的第七態樣的實施方案中，聚腺苷酸化信號包含猿病毒40 PAS。
在本發明的第七態樣的實施方案中，ITR序列是腺相關病毒(AAV)ITR。
在本發明的第七態樣的實施方案中，AAV是AVV血清型2、5、8或9。
本發明的第八態樣涉及包含本發明的第七態樣的多核苷酸的病毒載體。
在本發明的第八態樣的實施方案中，病毒選自由下列組成之群組：AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其變體。
包含可操作連接至轉基因(例如CNGB1)的人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)或其變體和核心啟動子(CP)的本發明的多核苷酸，或包含 可操作連接至轉基因(例如CNGB1)的人視紫質啟動子的多核苷酸可用於基因治療及/或基因矯正療法。在此類療法中，將多核苷酸導入細胞中以提升表達，替換缺陷基因及/或抑制缺陷基因的表達。
因此，本發明的第九態樣涉及用於治療有此需要的受試者中的視網膜變性的方法，所述方法包括對所述受試者投予治療有效量的根據本發明的第七態樣的多核苷酸或根據本發明的第八態樣的病毒載體。
在本發明第九態樣的實施方案中，多核苷酸或病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
本發明的第十態樣涉及用於治療有此需要的受試者中的視網膜色素變性的方法，其包括對受試者投予治療有效量的根據本發明的第七態樣的多核苷酸或根據本發明的第八態樣的病毒載體。
在本發明的第十態樣的一個實施方案中，多核苷酸或病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
本發明的第十一態樣涉及用於治療有此需要的受試者中的視網膜變性的方法，其中所述視網膜變性的特徵在於所述受試者的視網膜細胞中CNGB1缺陷或缺乏，所述方法包括對所述受試者投予治療有效量的包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列的病毒載體。
在本發明的第十一態樣的實施方案中，視網膜變性是CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)。
本發明的第十二態樣涉及用於治療有此需要的受試者中的CNGB1連鎖的視網膜色素變性或視網膜色素變性45型(RP45)的方法，其包括對受試者視網膜下投予治療有效量的病毒載體，所述病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
本發明的第十三態樣涉及多核苷酸，其依次包含：a)啟動子，所述啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，所述人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體；和 b)與a)的啟動子可操作連接的轉基因，所述轉基因編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)，其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83和87至94外部的一個或多個核酸取代。
本發明的第十四態樣涉及醫藥組合物，所述醫藥組合物包含多核苷酸和藥學可接受載劑，所述多核苷酸依次包含：a)啟動子，所述啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，所述人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體；和b)與a)的啟動子可操作連接的轉基因，所述轉基因編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)，其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83和87至94外部的一個或多個核酸取代。
本發明的第十五態樣涉及醫藥組合物，其包含病毒載體和藥學可接受載劑，所述病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
實施例1：核酸載體
在本示例性實施方案中，rAAV.hCNGB1載體是携帶編碼視桿光感受器環狀核苷酸閘控(CNG)通道的B次單元的人CNGB1基因的cDNA的基於AAV的雜合載體。hCNGB1 cDNA表達處於視桿特異性視紫質啟動子(hRHO)的控制下並且使用SV40 pA序列增强。表達盒側翼有AAV血清型2反向末端重複(ITR)，並且將重組基因組在AAV血清型8殼體中包裝。表達盒包含以下元件：
‧人視紫質基因的啟動子：0.194Kb
‧視桿光感受器cGMP的人CNGB1a次單元的cDNA磷酸二酯酶：3.74Kb
‧猿病毒40(SV40)的聚腺苷酸化信號：0.23Kb
‧AAV血清型2反向末端重複(ITR)：0.13Kb。圖1中描繪了rAAV.hRHO194.hCNGB1載體基因組的結構。
實施例2：pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40順式載體質體
在一個示例性實施方案中，使用具有SEQ ID No.7中所示的核苷酸序列的pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40順式載體質體，其含有包含194bp視桿光感受器特異性人視紫質(hRHO)啟動子和全長(3738bp)人CNGB1 cDNA的表達盒。表達盒還含有227bp猿病毒40多聚腺苷酸化信號(SV40 pA)。含有卡那黴素抗性(KanR)的5591bp載體主鏈位於距L-ITR為1943bp和距R-ITR為2853bp和距pUC18 ori為2024bp。在人胚腎293 T細胞(HEK293T)中使用順式載體質體和反式輔助質體的瞬時共轉染生成rAAV.hCNGB1載體，所述反式輔助質體編碼rep和cap序列和腺病毒基因。使用標準純化方法，例如氯化銫梯度超速離心、離子交換層析及/或切向流過濾從培養基及/或細胞裂解物收穫rAAV.hRHO194.hCNGB1。然後，將所得的rAAV.hRHO194.hCNGB1載體懸浮液無菌過濾，裝填，並且作為 藥物產品貯存。
實施例3：hRHO194啟動子的活性和特異性
為了驗證新型hRHO194啟動子的活性和特異性，本發明人構建含有eGFP cDNA而不是hCNGB1 cDNA的AAV順式載體形式。在圖2中顯示了所得的pGL2.0-hRHO194-eGFP-SV40順式載體質體圖。將rAAV.hRHO194.eGFP載體遞送到4周齡野生型小鼠的視網膜下空間中導致僅在視桿光感受器中在注射後4周eGFP蛋白的强烈表達(圖3A)，由此證實此啟動子的視網膜細胞類型特異性。代表性的結果見圖3A-3B。rAAV.hRHO194.eGFP載體處理導致經處理的眼中强烈的eGFP蛋白表達，其由僅在視桿光感受器中的天然eGFP螢光反映。
實施例4：由rAAV.hRHO194.hCNGB1賦予的生物學活性和轉基因表達
為了驗證生物活性和轉基因表達，發明人將AAV.hRHO194.hCNGB1載體遞送到4周齡CNGB1(-/-)小鼠的視網膜下空間中。遞送程序與Koch等，Gene therapy restores vision and delays degeneration in the CNGB1(-/-)mouse model of retinitis pigmentosa.Hum Mol Genet.2012；21(20)：4486-96.PubMed PMID：22802073中描述的程序相似。小鼠在經治療的眼(TE)中接受視網膜下注射，而另一隻未處理的眼(UE)充當對照。在注射後4個月依靠視網膜電描記術(ERG)(一種客觀功能性體內測定法)評估載體效力(圖4A和4B)。CNGB1(-/-)小鼠缺乏正常的視桿光感受器功能。繼發於視桿，不受影響的視錐光感受器也變性，導致疾病晚期階段時視錐功能的喪失。因此，專門測試視桿和視錐功能的ERG方案適合作為CNGB1功能和rAAV hRHO194.hCNGB1載體的生物學活性評估(BAA)的間接量測。
實施例5：用於測定BAA的體內光學相干斷層攝影術(OTC)
在另一組實驗中，通過體內光學相干斷層攝影術(OCT)成像，接著量 化光感受器層厚度來測定BAA。為此，小鼠在經治療的眼(TE)中接受視網膜下注射，而另一隻未處理的眼(UE)充當對照。在注射後4個月依靠OCT進行光感受器層厚度量測(圖5A-5C)。CNGB1(-/-)小鼠的視桿光感受器隨時間變性，導致光感受器層變薄(圖5B和5C)。因此，可以通過使用OCT測定經處理的CNGB1(-/-)小鼠中的光感受器層厚度來間接量測rAAV.hRHO194.hCNGB1載體的生物學活性(BAA)。rAAV.hRHO194.hCNGB1載體處理導致經處理的眼中清楚的治療效果，其由光感受器層厚度的保持反映。具體地，觀察到光感受器層厚度的超過45%增加(圖5C)。
實施例6：Cngb1 -/- 小鼠中體內CNGB1基因提升
在4周齡時用AAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40或AAV5-hRHO194-hCNGB1-SV40的1 x 1010個病毒基因組(1 e 10 vgs)視網膜下處理Cngb1 -/- 小鼠。結構結果量測包括注射後1個月和3個月時的SD-OCT、組織學、和免疫組織化學。
圖7中顯示了通用載體設計。在4周齡Cngb1 -/- 小鼠(出生後4周；PW4)中視網膜下注射1μl中的1 e 10總病毒基因組。
發現AAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40基因提升導致Cngb1 -/- 小鼠中視網膜下注射後的視桿功能恢復。發現效力持續到處理後8個月。發現暗適應的ERG B波幅度在經處理的小鼠中顯著改善(圖8A-8B)。在圖8A中顯示了在9個月時(經處理的小鼠中處理後8個月)視桿特異性刺激Cngb1 -/- 的暗視視網膜電描記術(ERG)。處理前野生型和Cngb1 -/- 小鼠的ERG顯示ERG B波在注射時在Cngb1 -/- 小鼠中缺乏(圖8B)。發現視桿外部節段中的CNGB1通道表達得到恢復(圖9A-9B)。將識別人CNGB1a的胺基酸1078-1168的兔多克隆抗CNGB1抗體(Sigma-Aldrich)用於轉基因表達測定法。在9個月時在用AAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40處理的Cngb1 -/- 小鼠(處理後8個月；圖9A)中及未處理的Cngb1 -/- 小鼠(圖9B)中進行免疫組織化學， 並且顯示經處理的Cngb1 -/- 小鼠中CNGB1通道表達的恢復。OCT分析揭示了視網膜變性顯著延遲(圖10A-10C)。圖10A中顯示了通用注射日程表。在9個月時在用AAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40處理的Cngb1 -/- 小鼠(處理後8個月；圖10B)中及未處理的Cngb1 -/- 小鼠(圖10C)中收集體內光學相干斷層攝影術(OCT)圖像。如圖10中所示，發現在9個月時，與未處理的Cngb1 -/- 小鼠相比經處理的Cngb1 -/- 小鼠具有更厚的光感受器層。
發現AAV5-hRHO194-hCNGB1-SV40基因提升在Cngb1 -/- 小鼠中導致視桿功能的恢復直到視網膜下注射後兩個月。發現暗適應的ERG B波幅度在經處理的小鼠中顯著改善(圖11A-11E)。在經處理的和未處理的Cngb1 -/- 小鼠中在3個月齡時(經處理的小鼠中視網膜下處理後2個月)量測暗視ERG，並且圖11A中顯示了結果。圖11B中顯示了經處理的和未處理的Cngb1 -/- 小鼠(n=8)中在3個月齡時(經處理的小鼠中視網膜下處理後2個月)量測的響應於-0.5 log(cd s/m2)光刺激的B波幅度。OCT分析揭示了視網膜變性的顯著延遲。用AAV5-hRHO194-hCNGB1-SV40處理的Cngb1 -/- 小鼠(處理後2個月；圖11C)和未處理的Cngb1 -/- 小鼠(圖11D)中在3個月時收集體內光學相干斷層攝影術(OCT)圖像。光感受器層厚度的量測顯示與野生型Cngb1 -/- 小鼠相比，3個月時(處理後2個月)的經處理的Cngb1 -/- 小鼠中視網膜變性的顯著延遲(n=6；圖11E)。
實施例7：突變體犬研究設計
Cngb1 -/- 犬具有外顯子26中的突變，所述突變導致截短的且非功能性的蛋白質，導致視桿功能喪失和視網膜變性。在3個月齡時在兩隻眼中用AAV5-hRHO194-hCNGB1a視網膜下處理三隻Cngb1 -/- 犬。對於每只動物，以5 e 11 vgs(力求達到2 x 100ul水泡；「低劑量」)的劑量處理眼1，並且以1 e 12 vgs(力求達到2 x 100ul水泡；「高劑量」)的劑量處理眼2。結構結果量測包括注射後1和3個月的SC-OCT、組織學和免疫組織化學。功能性結果量測包括注射後1和3個月的視覺測試和ERG。
實施例8：突變犬研究的結果
發現AAV5-hRHO194-hCNGB1a-SV40基因提升導致Cngb1 -/- 犬中視桿功能的恢復直到視網膜下注射後一個月。
發現暗適應的ERG波形在評估的兩種劑量的處理後顯著改善。在兩隻眼中進行相當的注射。使用視桿特異性刺激(圖12A)和閃爍響應(圖12B)兩者，與未處理的犬相比，在經處理的犬的兩隻眼中觀察到明顯的ERG挽救。在用較高劑量處理的眼中觀察到較大的ERG幅度。
視覺測試顯示經處理的犬具有視桿介導的視覺和四選擇視覺測試裝置中改善的表現。圖13A-13B顯示了注射後1個月時的經處理的犬和未處理的犬的視覺測試的結果。使用四選擇視覺測試裝置。發現未處理的Cngb1 -/- 犬在此階段時具有正常的視錐視覺，但缺乏視桿介導的視覺。未處理的Cngb1 -/- 犬在較低光水平(例如，5.7 e-2cd/m2)時失明，並且做出較少的正確出口選擇並且花費較長時間以從測試裝置中出去。發現這兩個處理組(高劑量和低劑量)都已經恢復了視桿視覺，如通過在最低光照水平時正確出口選擇(圖13A)和至出口時間(圖13B)的顯著改善表現所指示的。
發現高劑量組的均值ERG A波和B波幅度高於低劑量組。發現經處理的眼中的A波和B波幅度為野生型水平的約80%。圖14A-14B顯示了在每個處理組和未處理組中注射後一個月的ERG幅度量測。與未處理的對照相比，觀察到這兩個處理組的A波幅度的高度顯著增加。發現經治療的眼中響應閾值的改善大於1.5個對數單位(圖14A)。與未處理的對照相比，發現高劑量組中的所有階段的B波幅度的高度顯著增加以及低劑量組的所有除了第二和第三强的刺激。發現在經處理的眼中響應閾值的改善大於2個對數單位(圖14B)。
<110> 路德維希-馬克西米利安-慕尼黑大學 Ludwig-Maximilians-Universit酹M chen
<120> 用於治療CNGB1關聯之視網膜色素病變的基因療法 Gene therapy for the treatment of CNGB1-linked retinitis pigmentosa
<130> 589-272
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未歸類的特徵(misc_feature)
<222> (1)..(99)
<223> 人RHO啟動子片段
<400> 1
<210> 2
<211> 350
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(350)
<223> 人RHO啟動子片段
<400> 2
<210> 3
<211> 1245
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1245)
<223> 人CNGB1蛋白
<400> 3
<210> 4
<211> 227
<212> DNA
<213> simian virus 40
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(227)
<223> SV40多聚腺苷酸化信號
<400> 4
<210> 5
<211> 130
<212> DNA
<213> 腺伴隨病毒2
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> L-ITR
<400> 5
<210> 6
<211> 131
<212> DNA
<213> 腺伴隨病毒2
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> R-ITR
<400> 6
<210> 7
<211> 10243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40載體分子
<400> 7
<210> 8
<211> 3738
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> 人類CNGB1基因
<400> 8
<210> 9
<211> 194
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(194)
<223> 人RHO啟動子片段
<400> 9
<210> 10
<211> 1065
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1065)
<223> Abca4(ATP結合盒亞家族A成員4)
<400> 10
<210> 11
<211> 384
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(384)
<223> AIPL1(芳基-烴-相互作用蛋白-樣1)
<400> 11
<210> 12
<211> 585
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(585)
<223> BEST1(Best rophin-1)，同種型1
<400> 12
<210> 13
<211> 1977
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1977)
<223> CACNA1F電壓依賴性L型鈣通道亞基alpha-1F)，同種型1
<400> 13
<210> 14
<211> 438
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(438)
<223> CLN3(Battenin)，同種型1
<400> 14
<210> 15
<211> 232
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(232)
<223> CLRN1(Clarin-1)
<400> 15
<210> 16
<211> 690
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(690)
<223> CNGA1(cGMP門控陽離子通道alpha-1)，同種型1
<400> 16
<210> 17
<211> 2479
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(2479)
<223> CEP290(290 kDa中心體蛋白a)，同種型1
<400> 17
<210> 18
<211> 1406
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1406)
<223> CRB1(蛋白質crumbs同源物1)，同種型1
<400> 18
<210> 19
<211> 1285
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1285)
<223> CRB2(蛋白質crumbs同源物2)
<400> 19
<210> 20
<211> 299
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(299)
<223> CRX(視錐視杆同源框蛋白)
<400> 20
<210> 21
<211> 6306
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(6306)
<223> GPR98(G-蛋白偶聯受體98)
<400> 21
<210> 22
<211> 201
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(201)
<223> GUCA1A(鳥苷醯基環化酶活化蛋白1)
<400> 22
<210> 23
<211> 200
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(200)
<223> GUCA1B(鳥苷醯基環化酶活化蛋白2)
<400> 23
<210> 24
<211> 2213
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(2213)
<223> MYO7A(非常規肌球蛋白-VIIa)，同種型1
<400> 24
<210> 25
<211> 237
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(237)
<223> NRL(中性視網膜特異性亮氨酸拉煉蛋白)，同種型1
<400> 25
<210> 26
<211> 860
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(860)
<223> PDE6A(視杆cGMP特異性3',5'-環狀磷酸二酯酶亞基alpha)
<400> 26
<210> 27
<211> 854
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(854)
<223> PDE6B(視杆cGMP特異性3',5'-環狀磷酸二酯酶亞基beta)，同種型1
<400> 27
<210> 28
<211> 346
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(346)
<223> PRPH2(外周蛋白-2)
<400> 28
<210> 29
<211> 865
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(865)
<223> PROM1(prominin-1)，同種型1
<400> 29
<210> 30
<211> 348
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(348)
<223> RHO
<400> 30
<210> 31
<211> 351
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(351)
<223> ROM1(視杆外部段膜蛋白1)
<400> 31
<210> 32
<211> 2156
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(2156)
<223> RP1(氧調節蛋白1)
<400> 32
<210> 33
<211> 350
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(350)
<223> RP2(蛋白XRP2)
<400> 33
<210> 34
<211> 1020
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1020)
<223> RPGR(X連鎖的視網膜色素變性GTP酶調節物)，同種型1
<400> 34
<210> 35
<211> 405
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(405)
<223> SAG(S-抑制蛋白)
<400> 35
<210> 36
<211> 552
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(552)
<223> USH1C(烏斯赫爾綜合征1型C蛋白)，同種型1
<400> 36
<210> 37
<211> 461
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(461)
<223> USH1G(烏斯赫爾綜合征1G型蛋白)
<400> 37
<210> 38
<211> 5202
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(5202)
<223> USH2A(Usherin)，同種型1
<400> 38
<210> 39
<211> 410
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(410)
<223> NR2E3(光感受器特異性核受體)，同種型長
<400> 39
Claims (44)
- 一種多核苷酸，其依次包含：a)一啟動子，該啟動子包含一人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和一核心啟動子(CP)，該人視桿光感受器特異性啟動子元件包含、實質上由或由根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體所組成；和b)可操作連接至a)的啟動子的至少一種轉基因(TG)；其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83、和87至94外部的一個或多個核酸取代。
- 如請求項1的多核苷酸，其中該hRPSPE的5’端在SEQ ID NO：2或其變體的1至160的核酸位置處，並在3’端在290至310位的核酸位置處。
- 如請求項1或2的多核苷酸，其中該CP包含TATA盒及/或起始子(Inr)。
- 如請求項1至3中任一項的多核苷酸，其中該啟動子的5’端在SEQ ID NO：2或其變體的1至160的核酸位置處，並且3’端在340至350的核酸位置處。
- 如請求項1至4中任一項的多核苷酸，其中該轉基因包含編碼維持或改善視桿生理功能蛋白質的核酸。
- 如請求項1至5中任一項的多核苷酸，其中該轉基因：(i)包含編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片段或變體的核酸；編碼靶向編碼其顯性負性突 變體之mRNA的miRNA或shRNA的核酸；及/或編碼特異性結合至其顯性負性突變體的抗體或抗體結合片段的核酸，；或(ii)包含編碼抑制桿細胞增殖的蛋白質的核酸，較佳為一毒素；前藥轉化酶，例如胸苷激酶；細胞週期抑制劑，例如視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21 CIP1、p27 KIP1和p57 KIP2；包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的mRNA；及/或包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的核酸。
- 如請求項6的多核苷酸，其中該hCNGB1包含根據SEQ ID NO：3、40或41的胺基酸序列或其變體。
- 如請求項1至7中任一項的多核苷酸，其包含選自由下列組成之群組的一種或多種另外的核苷酸序列元件：(i)聚腺苷酸化信號(PAS)；及/或(ii)一個或兩個反向末端重複(ITR)序列；及/或(iii)形成感染性病毒載體，較佳腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒、或疱疹病毒載體，特別是單純疱疹病毒(HSV)載體所必需的病毒核苷酸序列。
- 如請求項8的多核苷酸，其中該聚腺苷酸化信號包含猿病毒40 PAS，實質上由或由猿病毒40 PAS組成。
- 如請求項9的多核苷酸，其中該聚腺苷酸化信號包含、實質上由或由根據SEQ ID NO：4的核酸或其功能變體所組成。
- 如請求項8的多核苷酸，其中該ITR序列是腺相關病毒(AAV)ITR。
- 如請求項11的多核苷酸，其中該AAV是AVV血清型2、5、8或9。
- 如請求項11的多核苷酸，其中該啟動子和該轉基因在其5’端側翼有L-ITR並且在其3’端側翼有R-ITR。
- 如請求項13的多核苷酸，其中該L-ITR包含、實質上由或由根據SEQ ID NO：5的序列或其變體所組成，及/或該R-ITR包含、實質上由或由根據SEQ ID NO：6的序列或其變體所組成。
- 如請求項1至14中任一項的多核苷酸，其中該多核苷酸的總長度為5200個鹼基或更少，較佳為5100個鹼基或更少，更佳5000個鹼基或更少。
- 一種質體，其包含請求項1-15中任一項的多核苷酸。
- 如請求項16的質體，其包含根據SEQ ID NO：7、42-44的核酸序列或其變體。
- 一種病毒載體，其包含請求項1至15中任一項的多核苷酸。
- 如請求項18的病毒載體，其中該病毒選自由下列組成之群組：AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其變體。
- 如請求項1-15中任一項的多核苷酸、請求項16或17的質體及/或請求項18或19的病毒載體，其用作藥物。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項的多核苷酸、如請求項16或17的質體及/或如請求項18或19的病毒載體和藥學可接受載劑。
- 一種如請求項1至14中任一項的多核苷酸、請求項15或16的質體及/或請求項17或18的病毒載體，其用於視網膜疾病，特別是視網膜變性的療法。
- 如請求項22的多核苷酸、質體及/或病毒載體，其中該投予路徑選自眼內、球內、玻璃體內或視網膜下。
- 如請求項22的多核苷酸、質體或病毒載體，其中該視網膜變性與遺傳突變、取代及/或缺失有關。
- 如請求項22的多核苷酸、質體或病毒載體，其中該視網膜變性選自：夜盲、失明、視網膜變性、視網膜營養不良和視網膜色素變性。
- 如請求項23的多核苷酸、質體或病毒載體，其中該視網膜色素變性是CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸依次包含：a)包含根據SEQ ID NO：9的核酸序列或其變體的人視紫質啟動子； 和b)可操作連接至a)的啟動子的至少一種轉基因(TG)。
- 如請求項27的多核苷酸，其中該轉基因包含編碼維持或改善視桿的生理功能的蛋白質的核酸。
- 如請求項27或28的多核苷酸，其中該轉基因：(i)包含編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A或其功能片段或變體的核酸；編碼靶向編碼其顯性負性突變體之mRNA的miRNA或shRNA的核酸；及/或編碼特異性結合其顯性負性突變體之抗體或抗體結合片段的核酸；或(ii)包含編碼抑制桿細胞增殖的蛋白質的核酸，較佳毒素；前藥轉化酶，例如胸苷激酶；細胞週期抑制劑，例如視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)、p53、p21 CIP1、p27 KIP1和p57 KIP2；包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的mRNA；及/或包含編碼其細胞週期抑制劑的顯性負性突變體的核酸。
- 如請求項27至29中任一項的多核苷酸，其包含選自由下列組成之群組的一種或多種另外的核苷酸序列元件：(i)聚腺苷酸化信號(PAS)；(ii)一個或兩個反向末端重複(ITR)序列；和(iii)形成感染性病毒載體，較佳腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒、或疱疹病毒載體，特別是單純疱疹病毒(HSV)載體所必需的病毒核苷酸序列。
- 如請求項30的多核苷酸，其中該聚腺苷酸化信號包含猿病毒40 PAS。
- 如請求項30的多核苷酸，其中該ITR序列是腺相關病毒(AAV)ITR。
- 如請求項32的多核苷酸，其中該AAV是AVV血清型2、5、8或9。
- 一種病毒載體，其包含請求項27至33中任一項的多核苷酸。
- 如請求項34的病毒載體，其中該病毒選自由下列組成之群組：AAV2、AAV5、AAV8、AVV9或其變體。
- 一種用於治療有此需要的受試者中的視網膜變性的方法，其包括對該受試者投予治療有效量的如請求項27至33中任一項的多核苷酸或如請求項34或35的病毒載體。
- 一種用於治療有此需要的受試者中的視網膜色素變性的方法，其包括對該受試者投予治療有效量的如請求項27至33中任一項的多核苷酸或如請求項34或35的病毒載體。
- 如請求項36或37的方法，其中該多核苷酸或病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
- 一種用於治療有此需要中的受試者的視網膜變性的方法，其中該視網膜變性的特徵在於該受試者的視網膜細胞中CNGB1的缺陷或缺乏，該方法包括對該受試者投予治療有效量的病毒載體，該病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
- 如請求項39的方法，其中該視網膜變性是CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)。
- 一種用於治療有此需要的受試者中的CNGB1連鎖的視網膜色素變性或45型視網膜色素變性(RP45)的方法，其包括對受試者視網膜下投予治療有效量的病毒載體，該病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
- 一種多核苷酸，其依次包含：a)一啟動子，該啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，該人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體；和b)與a)的啟動子可操作連接的轉基因，該轉基因編碼人視桿環狀核 苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)，其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83和87至94外部的一個或多個核酸取代。
- 一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含多核苷酸和藥學可接受載劑，該多核苷酸依次包含：a)啟動子，該啟動子包含人視桿光感受器特異性啟動子元件(hRPSPE)和核心啟動子(CP)，該人視桿光感受器特異性啟動子元件包含根據SEQ ID NO：1的核酸序列或其變體；和b)與a)的啟動子可操作連接的轉基因，該轉基因編碼人視桿環狀核苷酸閘控通道β次單元(hCNGB1)，其中SEQ ID NO：1的變體包含在SEQ ID NO：1的核苷酸位置6至13、32至40、70至83和87至94外部的一個或多個核酸取代。
- 一種醫藥組合物，其包含病毒載體和藥學可接受載劑，該病毒載體包含SEQ ID NO：43中所示的核酸序列。
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