CN119432856B - 核酸分子、病毒颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及核酸分子、病毒颗粒及其制备方法和应用。本发明提供了核酸分子，包括：核酸分子1~核酸分子4中的一种或多种。本发明提供的重组启动子的长度为260 bp左右，适用于在AAV载体中表达较大外源基因的需求，应用范围较广。同时，这些重组启动子在PR细胞中具有不同程度的表达强度，在某些对目的基因表达量要求较高的场景下也适用。

Description

核酸分子、病毒颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及核酸分子、病毒颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

感光细胞（Photoreceptor cell）是一类具有光转导能力的特殊神经上皮细胞。感光细胞能够从视野范围内吸收光子，然后经一系列特殊复杂的生物化学通路，将这些信息以膜电位改变的形式进行信号传导，最后视觉系统对这些信号信息进行处理，呈现出一个完整的视觉世界。感光细胞出现问题时，如视杆细胞发育不正常导致数量比正常人要少或者缺乏维生素A而无法正常合成视紫质时，相应的暗适应会降低，ERG a波振幅降低，进而导致人在黑暗中难以看见物体。虽然视杆细胞坏掉后还能依靠视锥细胞重新跟水平细胞和双极细胞的突触建立联系把信号传递到神经中，但暗视觉曲线的ERG a波振幅相比视杆细胞正常时减少，因此也难以在弱光下的情况看清物体。

目前已有多种遗传性眼科疾病被报道，多与视网膜病理学相关的不同基因突变相关，一旦这些基因不能正确表达，就会导致进行性的细胞死亡从而使患者失明。因此通过基因治疗的方法将外源正常基因导入靶细胞中，以纠正或代偿基因缺陷和异常引起的疾病是较为有前景的治疗方法。

特异性启动子往往只在特定的组织细胞中驱动基因表达，可以避免了外源基因在实验动物中非特异性组织细胞中持续表达而造成相应副作用，同时还能够增强在特定细胞中的外源基因表达效果。对于基因治疗而言，特异性启动子配合使用组织特异嗜性的AAV血清型使用，能够更大程度提高治疗的特异性，避免对于其他器官的影响和降低副作用。

AAV因其安全性而备受瞩目，但由于其载体容量非常小，在搭载大的功能蛋白，如Cas9蛋白等，往往容易超出其载体容量，因而出现病毒滴度大幅下降或基因组序列被截短等问题。因此获得长度比较小但同时保留了能够在特定组织或细胞类型中表达下游基因的启动子能够在一定程度上解决该问题，既能够保证目标基因的特定表达，又能使载体长度不超过AAV基因组的容量限制。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了核酸分子、病毒颗粒及其制备方法和应用。本发明提供的重组启动子的长度为260 bp左右，适用于在AAV载体中表达较大外源基因的需求，应用范围较广。同时，重组启动子在PR细胞中表达强度非常高，在某些对目的基因表达量要求较高的场景下也适用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了核酸分子，包括：核酸分子1~核酸分子4中的一种或多种；

所述核酸分子1包括：(1)~(4)中至少一种：

(1)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；

(2)、在(1)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有70%同一性的核苷酸序列；优选地，序列一致性为至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%；

(4)、与(1)、(2)或(3)中任一项部分互补或完全互补的核酸；和/或

所述核酸分子2包括：(5)~(8)中至少一种：

(5)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的核酸；

(6)、在(5)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列至少有70%同一性的核苷酸序列；优选地，序列一致性为至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%；

(8)、与(5)、(6)或(7)中任一项部分互补或完全互补的核酸；和/或

所述核酸分子3包括：(9)~(12)中至少一种：

(9)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸；

(10)、在(9)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

(11)、与(9)或(10)所示的核苷酸序列至少有70%同一性的核苷酸序列；优选地，序列一致性为至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%；

(12)、与(9)、(10)或(11)中任一项部分互补或完全互补的核酸；和/或

所述核酸分子4包括：(13)~(16)中至少一种：

(13)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸；

(14)、在(13)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有70%同一性的核苷酸序列；优选地，序列一致性为至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%；

(16)、与(13)、(14)或(15)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:1的序列为：TCTCTGTTCCCTTCCCTGGGCTTTCATTGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGCCCTAGCTCTGGCCTACCTCCTCAGGGAAAAGTGAGGCGGCCCTGCTGGACCCCCACTTCATAGGGCAATTCGTCCGGGGCTGACACAGCACCAGGCTAAATCCCAGCCGGGGTCACGGAGGACGCTTAGGAGTGGCAAGAAGGTGCTAGAAAAAGACAATCCCCTGAGCTGCTTGGAATCCGATTAGATCATTCTGCCC（RCB8启动子（289bp））。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:2的序列为：TCTCTATTGCTGGTCCCCCCTGGGATTTCATTGGCCCAGAAGCCTGGTGGAGATTCTCGTGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGCCCTAGCTCTGGCCTACCTCCTCAGGGAAAAGTGAGGCGGCCCTGCTGGACCCCCACTTCATAGGGCAATTCGTCCGGGGCTGACACAGCACCAGGCTAAATCCCAGCCGGGGTCACGGAGGACGTTGACCTGACAGTGGCAAGAAGGTTTTGACGGCGACAATCCCCTGAGCTGCTTGGAATCCGATTAGAATGAGGCTGCCC（RCB8V1启动子（286bp））。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:3的序列为：TGGACGTTCCCTGTAAGCTGGGTTGGAATTGGGTGGCGGCAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGCCCTAGCTCTGGCCTACCTCCTCAGGGAAAAGTGAGGCGGCCCTGACCCGGGGCTGACACAGCACCAGGCTAAATCCCAGCCGGGGTCACGGAGGACGCTTAGGAGTGGCAAGAAGGTGCTAGAAAAAGACAATCCCCTGAACGCCTTAGGACGAATCCGATTAGATCTA（RCB8V2启动子（262bp））。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:4的序列为：GAAGGGAACAGAGACCTGGGCTTTCATTGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGGCCGCCTCACTTTTCCCTTGGATGAGGCGGAAAAGTGAGGCGGCCCTGCTGGACCCCCACTTCATAGGGCAATTCGTCCGGGGCTGACACAGCACCAGGCTAAATCCCAGCCGGGGTCACGGAGGACGCTTAGGAGTGGCAAGAAGGTGCTAGAAAAAGAGTCCAGTC（RCB8V3启动子（236bp））。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:5的序列为：TAGAAAAAGACAATCCCCTGAGCTGCTTGAGGGCTAACAGAAGATCAAGTCCCATTTTAGCCTCCCTAGCTCTGGCCTACCTCCTCAGTTAGAAAAAGACAATCCCCTGAGCTGCTTGGAATCCGATTAGATCCCTGGCTCATCTCTCAGGATGCCTATCTTGTCCTTAGCACGATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGCTAGAAAAAGACAATCCCCGCCTGGCCCGGATCACTTATCCGTTGCCTTTGTGTATTTGGAGGCTGGGAGGCCAGCTGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGATGCTAGAAAAAGACAATCCCCTGAGCTGCTTGGAATCCGATTA（对比例启动子（373bp））。

在本发明的一些实施方案中，术语“核酸”是由各核苷酸组成的多聚物，即多核苷酸。它指天然发生的，或部分或完全非天然发生的核酸，其例如编码可重组产生的多肽。核酸可由通过化学手段分离的或合成的DNA片段构成。核酸可整合到另一核酸中，例如整合到表达质粒或宿主细胞的基因组/染色体中。质粒包括穿梭和表达载体。通常，所述质粒还将包含原核增殖单位，其包含分别用于在细菌中载体复制和选择的复制起始区(例如ColE1的复制起始区)和选择性标记(例如，青霉素或四环素抗性基因)。

本发明还提供了上述核酸分子作为启动子中的应用。

在本发明的一些实施方案中，术语“启动子”指核酸，即多核苷酸序列，其控制有效连接的核酸的转录。启动子可包括RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所用一个或多个启动子在宿主细胞的细胞类型中将是有功能的，在所述宿主细胞中涉及有效连接核酸的表达。大量启动子，包括来自多种不同来源的组成型、诱导型和阻抑型启动子为本领域所熟知(并在数据库如GenBank中得以鉴定)。

本发明还提供了表达盒，包括：上述核酸分子。

在本发明的一些实施方案中，术语“表达盒”指核酸，其含有宿主细胞中至少含有的结构基因进行表达和分泌所需的元件。核酸的特征同样在于其由单个核苷酸组成的序列，或由核酸分子编码的氨基酸序列。

本发明还提供了表达载体，包括：上述核酸分子和/或上述表达盒和目的基因。

在本发明的一些实施方案中，上述表达载体还包括：荧光蛋白。

在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中，所述荧光蛋白包括：入核红色荧光蛋白。

本发明还提供了病毒颗粒，转化和/或转染上述表达载体。

在本发明的一些实施方案中，AAV（腺相关病毒）三质粒包装系统是一种常用的基因转移工具，主要用于在细胞和动物模型中转入基因，研究基因功能或开发基因治疗方案。AAV的三质粒包装系统通常包括以下三个质粒：

载体质粒（Transfer plasmid）：包含目的基因序列（即希望转入细胞的基因）以及AAV的反向末端重复序列（ITRs），ITRs是AAV基因组的两端序列，负责包装和整合功能。AAV没有自己的复制蛋白，所以ITRs序列的存在可以让目的基因在病毒包装时被识别并嵌入病毒颗粒中。

包装质粒（Packaging plasmid）：包含AAV病毒的主要结构蛋白基因，如Rep和Cap。其中Rep蛋白是AAV的复制蛋白，负责AAV基因组的复制和包装；Cap蛋白是AAV的衣壳蛋白，用于病毒颗粒的组装。这些基因的表达让细胞产生必要的蛋白质来组装和包装病毒颗粒，但不包含在最终包装的AAV基因组中。

辅助质粒（Helper plasmid）：包含腺病毒的某些关键基因，如E1A、E1B、E2A、E4和VA基因，这些基因会提供额外的辅助因子，帮助AAV的复制和包装。这些基因来自腺病毒，但并不会导致完整的腺病毒生成，只是为了支持AAV的生产过程。

本发明还提供了上述病毒颗粒的制备方法，取所述表达载体进行病毒包装后，收毒，纯化，获得所述病毒颗粒。

在本发明的一些实施方案中，当上述三个质粒共同转染到包装细胞（如HEK293细胞）中时，各自表达相应的蛋白和基因元件，实现AAV病毒的包装。载体质粒上的目的基因在ITRs的帮助下形成一个完整的AAV基因组，包装质粒中的cap和rep基因表达相应的AAV蛋白，rep蛋白负责复制AAV基因组，而cap蛋白形成AAV的衣壳，辅助质粒中的腺病毒辅助基因提供包装所需的支持，增强AAV的复制和包装效率。

在这个系统中，AAV基因组被包裹在由cap蛋白形成的衣壳中，形成完整的AAV颗粒。

最终产生的AAV颗粒中，仅包含目的基因的序列，没有包装质粒和辅助质粒中的其他基因，因此AAV颗粒具有较高的安全性和稳定性。这些AAV颗粒可以感染目标细胞并将目的基因转入，但因为AAV为复制缺陷型病毒，通常不会引起致病性。

本发明还提供了上述核酸分子、上述表达盒、上述表达载体、上述病毒颗粒和/或上述制备方法获得的病毒颗粒在制备特异性表达视网膜结构的细胞的产品中的应用。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述视网膜结构包括：光感受器。

本发明还提供了上述核酸分子、上述表达盒、上述表达载体、上述病毒颗粒和/或上述制备方法获得的病毒颗粒在制备治疗和/或预防视网膜疾病的产品中的应用。

本发明还提供了产品，包括：上述核酸分子、上述表达盒、上述表达载体、上述病毒颗粒和/或上述制备方法获得的病毒颗粒。

本发明提供的重组启动子的长度为260 bp左右，适用于在AAV载体中表达较大外源基因的需求，应用范围较广。且本发明提供的重组启动子在PR细胞中表达强度非常高，在某些对目的基因表达量要求较高的场景下也适用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示用于病毒包装的表达载体结构示意图，主要由上游的启动子和下游的红色荧光蛋白基因构成；

图2示眼睛切片图；其中左侧第一张为40x放大倍数、1000ms曝光时间下拍摄的红色荧光照片，第二张为红色荧光和免疫荧光染色后拍照获得两张照片的合并图（各通道拍摄的曝光时间有所调整）；第三张为红色荧光、免疫荧光染色后拍照以及DAPI染色后拍照获得的三张照片的合并图（各通道拍摄的曝光时间有所调整）；

图3示根据对切片荧光亮度进行半定量的数据绘制获得的柱状图；

图4示RCB8启动子的突变体RCB8V1、RCB8V2和RCB8V3对应的眼睛切片图；其中左侧第一张为100x放大倍数、500ms曝光时间下拍摄的红色荧光照片，第二张为红色荧光和DAPI染色后拍照获得的两张照片的合并图（各通道拍摄的曝光时间有所调整）。

具体实施方式

本发明公开了核酸分子、病毒颗粒及其制备方法和应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。

本发明实施例1和实施例2中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 表达载体构建和启动子活性验证

1、通过人工重组的方法获得了RCB8启动子序列，基于VB900129-0788gfe载体(内部构建，见https://en.vectorbuilder.com/vector/VB900129-0788gfe.html，如图1所示)，通过常规的酶切连接方法将CAG启动子分别替换为RCB8和对比例启动子（如SEQ IDNO:5所示），构建上游分别为RCB8和对比例启动子，下游为入核红色荧光蛋白(NLS-mCherry)基因的表达载体，载体框架如图1所示。

2、按照常规的病毒包装方法，将上述含有RCB8和对比例启动子的表达载体分别与AAV包装的其余两个辅助载体质粒(分别携带Rep\Capsid基因和E2\E4\VA基因)混匀后转染至293T细胞中进行病毒包装，收获病毒后进行氯化铯纯化，最终获得用于动物体内验证实验用的病毒颗粒(AAV8型)。

3、以1E+10GC/只眼睛的病毒注射剂量进行小鼠(C57BL/6J，6-8周龄，购自广东省医学实验动物中心)视网膜下腔注射，注射2周后取材进行切片和免疫荧光染色：免疫荧光过程中使用的一抗是兔抗鼠多克隆抗-Arrestin C抗体(购自Sigma-Aldrich，目录号AB15282)，其能够特异性地结合感光细胞(PR)层中的视锥细胞表面蛋白，进而对视锥细胞所在的感光细胞层进行标记。二抗使用了带绿色荧光的山羊抗兔IgG(购自Thermofisher，目录号A-11008)。同时使用DAPI对各层细胞的细胞核进行染色，成像为蓝色。

4、对切片进行拍照，最终获得RCB8和对比例启动子的表达切片图，如图2所示；切片图结果说明：展示了在40x放大倍数、1000ms曝光时间下拍摄的照片，每个结果从左至右共有三张图片。左侧第一张为1000ms曝光时间下拍摄的片子，主要用于单独观察红色荧光的表达情况；第二张为细胞表达荧光和免疫荧光染色后拍照获得两张照片的合并图（各通道拍摄的曝光时间有所调整）；第三张为细胞表达荧光、免疫荧光染色后拍照以及DAPI染色后拍照获得的三张照片的合并图（各通道拍摄的曝光时间有所调整）。

结合各重组启动子的切片结果来看：注射病毒后，RCB8重组启动子只在小鼠视网膜下的感光细胞层表达红色荧光，其他细胞层未见有荧光表达，显示其高表达特异性。

5、使用Image J软件对各组切片亮度进行半定量，绘制图如图3所示；以上图中RCB8启动子表达红色荧光蛋白的亮度趋势与其对应的切片结果较为一致。如表1所示，其中，RCB8启动子的表达强度显著优于对比例启动子，且均表现出非常强的PR细胞表达特异性。综合全部切片结果来看，RCB8启动子表现出了比早前的对比例启动子更强的表达活性，且启动子的表达特异性高，可以根据不同的应用需求选择使用不同的重组启动子。

表1

实施例2 RCB8启动子的功能性变体

在证实了RCB8启动子的表达特异性后，分别对RCB8启动子进行随机突变和删减替换，构建RCB8启动子变体序列RCB8V1、RCB8V2和RCB8V3进行实验，RCB8及其变体两两间的序列同一性如表2所示：

表2

按照实施例1的方法，构建上游启动子分别为变体启动子RCB8V1、RCB8V2和RCB8V3，下游为入核红色荧光蛋白(NLS- mCherry)基因的表达载体，进行病毒包装和纯化，在小鼠中验证启动子活性，最终获得启动子的表达切片图，如图4所示。

切片图结果说明：展示了在100x放大倍数、500ms曝光时间下拍摄的照片，每个结果从左至右共有两张图片。左侧第一张为注释的曝光时间（500ms）下拍摄的片子，主要用于单独观察红色荧光表达的情况；第二张为细胞表达红色荧光以及DAPI染色后拍照获得的两张照片的合并图（各通道拍摄的曝光时间有所调整）。

从切片结果图可以看出，具有一定同源性的变体启动子均能够保持在感光细胞中驱动表达，虽然个别变体驱动表达的能力弱于突变前的启动子，但是均保留了其基本的表达特异性和表达能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.核酸分子，其特征在于，为核酸分子1~核酸分子4中的任意一种；

所述核酸分子1的序列为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；

所述核酸分子2的序列为如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的核酸；

所述核酸分子3的序列为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸；

所述核酸分子4的序列为如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸。

2.如权利要求1所述的核酸分子作为启动子中的应用。

3.表达盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的核酸分子。

4.表达载体，其特征在于，包括：如权利要求1所述的核酸分子和/或如权利要求3所述的表达盒和目的基因。

5.病毒颗粒，其特征在于，其通过转化和/或转染如权利要求4所述的表达载体获得。

6.如权利要求5所述病毒颗粒的制备方法，其特征在于，取所述表达载体进行病毒包装后，收毒，纯化，获得所述病毒颗粒。

7.如权利要求1所述的核酸分子、如权利要求3所述的表达盒、如权利要求4所述表达载体、如权利要求5所述的病毒颗粒和/或如权利要求6所述制备方法获得的病毒颗粒在制备特异性表达视网膜结构的细胞的产品中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述视网膜结构包括：光感受器。

9.如权利要求1所述的核酸分子、如权利要求3所述表达盒、如权利要求4所述表达载体、如权利要求5所述的病毒颗粒和/或如权利要求6所述制备方法获得的病毒颗粒在制备治疗和/或预防视网膜疾病的产品中的应用。

10.产品，其特征在于，包括：如权利要求1所述的核酸分子、如权利要求3所述表达盒、如权利要求4所述表达载体、如权利要求5所述的病毒颗粒和/或如权利要求6所述制备方法获得的病毒颗粒。