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TW201900191A - 新城雞瘟病毒及其用途 - Google Patents

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TW201900191A
TW201900191A TW107116064A TW107116064A TW201900191A TW 201900191 A TW201900191 A TW 201900191A TW 107116064 A TW107116064 A TW 107116064A TW 107116064 A TW107116064 A TW 107116064A TW 201900191 A TW201900191 A TW 201900191A
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彼得 伯斯
阿多夫 卡西莎翠
米瑞 莎瑪琳
思維拉娜 莎蒂科瓦
瑞秋 艾利森 歐圖拉
鴛 方
布萊恩 B 海妮絲
杰德 D 烏查克
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美國西奈山伊坎醫學院
紀念斯隆凱特林癌症中心
美商默沙東藥廠
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Abstract

本文描述嵌合新城雞瘟病毒，其包含有包含編碼介白素-12之轉殖基因的包裝基因組。該嵌合新城雞瘟病毒及其組合物可與計劃性細胞死亡蛋白1 (「PD-1」)或其配位體之拮抗劑組合用於治療癌症。詳言之，本文描述用於治療癌症之方法，其包含投與嵌合新城雞瘟病毒與PD-1或其配位體之拮抗劑組合，其中該嵌合新城雞瘟病毒包含有包含編碼介白素-12之轉殖基因的包裝基因組。

Description

新城雞瘟病毒及其用途
本文中描述用於治療癌症之方法，其包含向個體投與嵌合新城雞瘟病毒(「NDV」)(或包含此類嵌合NDV之組合物)及計劃性細胞死亡蛋白1 (「PD-1」)或其配位體之拮抗劑(或包含此類拮抗劑之組合物)，其中該嵌合NDV包含有包含編碼介白素-12 (「IL-12」)之轉殖基因的包裝基因組。在一特定態樣中，本文中描述用於治療癌症之方法，其包含投與嵌合新城雞瘟病毒(或包含此類嵌合NDV之組合物)及阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體(或包含此類拮抗劑之組合物)，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12之轉殖基因的包裝基因組。在另一態樣中，本文中描述一種嵌合新城雞瘟病毒，其用於治療個體之癌症之方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12之轉殖基因的包裝基因組，其中該方法進一步包含投與阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或兩者)之間的相互作用的抗PD-1抗體。
2.1 新城雞瘟病毒
新城雞瘟病毒(NDV)係副黏病毒科(Paramyxoviridae family)中禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus genus)之成員，已顯示其感染大量禽類物種(Alexander, DJ (1988). Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. 第1-22頁)。NDV在反義鏈中具有單股RNA基因組，且不與宿主基因組或與其他病毒進行重組(Alexander, DJ (1988). Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. 第1-22頁)。基因組RNA含有呈3'-NP-P-M-F-HN-L-5'之次序的基因，以下進一步詳細描述。兩種其他蛋白質V及W藉由NDV，自P基因，藉由由RNA編輯產生之替代mRNA產生。基因組RNA亦在3'端含有前導序列。
病毒粒子之結構元件包括病毒包膜，該病毒包膜為來源於細胞質膜之脂質雙層。醣蛋白紅血球凝集素-神經胺糖酸苷酶(HN)自包膜突出，允許病毒含有紅血球凝集素(例如受體結合/促融)與神經胺糖酸苷酶活性。融合醣蛋白(F)亦與病毒膜相互作用，其首先作為非活性前驅體產生，接著在轉譯後裂解，產生兩種經二硫鍵連接之多肽。藉由促進病毒包膜與宿主細胞質膜之融合，活性F蛋白質質與NDV穿透至宿主細胞中有關。基質蛋白(M)與病毒組裝有關，且與病毒膜以及核衣殼蛋白相互作用。
核衣殼之主要蛋白子單元為賦予衣殼螺旋對稱之核衣殼蛋白(NP)。與核衣殼締合的係P及L蛋白。認為進行磷酸化之磷蛋白(P)在轉錄中起調控作用，且亦可能與甲基化、磷酸化及聚腺苷酸化有關。編碼RNA依賴性RNA聚合酶之L基因為病毒RNA合成以及P蛋白所需。佔病毒基因組編碼能力幾乎一半之L蛋白為病毒蛋白中之最大蛋白，且在轉錄與複製中起重要作用。已經顯示V蛋白抑制干擾素-α且造成NDV之毒性(Huang等人(2003). Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an Alpha Interferon Antagonist.Journal of Virology 77 : 8676-8685)。
據報導天然存在之NDV係在多種動物腫瘤模型中有效之溶瘤劑(Sinkovics, JG及Horvath, JC (2000). Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.J Clin Virol 16: 1-15；Zamarin等人，2009; Mol Ther 17: 697；Elankumaran等人，2010; J Virol 84: 3835；Schirrmacher等人，2009; Methods Mol Biol 542: 565；Bart等人，1973; Nat New Biol 245: 229)。天然存在之NDV病毒株已用於多個針對晚期人類癌症之臨床試驗中(Sinkovics, JG及Horvath, JC (2000). Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.J Clin Virol 16 : 1-15；Lorence等人(2007). Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus.Curr Cancer Drug Targets 7 : 157-167；Hotte等人(2007). An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701.Clin Cancer Res 13 : 977-985；Freeman等人(2006). Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme.Mol Ther 13 : 221-228；Pecora等人(2002). Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers.J Clin Oncol 20 : 2251-2266；Csatary等人(2004). MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas.J Neurooncol 67: 83-93)。然而，天然存在之NDV病毒株在針對晚期人類癌症之此等臨床試驗中僅獲得少數成功(Hotte等人(2007). An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701.Clin Cancer Res 13 : 977-985；Freeman等人(2006). Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme.Mol Ther 13 : 221-228；Pecora等人(2002). Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers.J Clin Oncol 20 : 2251-2266)。因而，對可用於治療癌症、尤其晚期癌症之基於NDV之療法仍然存在需求。2.2 PD-1 拮抗劑
已批准抗PD-1阻斷抗體及抗PD-L1阻斷抗體用於治療某些類型癌症。舉例而言，已批准派姆單抗(pembrolizumab)用於治療若干類型癌症，包括(1)難治性經典霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、(2)復發性或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌、(3)不可切除性或轉移性黑色素瘤、(4)局部或晚期或轉移性尿道上皮癌、(5)伴有表現計劃性死亡配位體1 (「PD-L1」)之腫瘤的復發性局部晚期或轉移性胃或胃食道腺癌、(6)在先前治療後進展且無令人滿意之替代治療選擇方案的不可切除性或轉移性、高微衛星不穩定性癌症或錯配修復缺陷實體腫瘤，或在用氟嘧啶(fluoropyrimidine)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及伊立替康(irinotecan)治療後進展的結腸直腸癌，及(7)具有表現PD-L1之腫瘤的轉移性非小細胞肺癌；且已批准納武單抗(nivolumab)用於治療不同類型癌症，包括不可切除性或轉移性黑色素瘤。雖然此等療法已顯示一定成功，但對治療癌症之療法仍然存在需求。
在一個態樣中，本發明提供包含編碼介白素-12 (「IL-12」)(例如IL-12之p35及p40次單元)或其衍生物之包裝基因組的嵌合NDV。在一特定實施例中，IL-12轉殖基因為本文所揭示之IL-12轉殖基因(參見例如章節5.2、5.2.1、5.7、5.10及6)。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 26、53、61、63、66或68中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼多肽，該多肽包含SEQ ID NO: 22、39、42或43中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，IL-12為人類IL-12。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。在一特定實施例中，嵌合NDV可用於治療例如癌症。本文所揭示之嵌合NDV意外地使表15 (參見下文章節6.3.1.14)中針對腫瘤樣品之18基因標籤之基因表現圖譜分析評分顯著增加。
在另一態樣中，本文呈現用於治療癌症之方法，其利用嵌合NDV或包含此類嵌合NDV之組合物與PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑或包含此類拮抗劑之組合物組合，其中該嵌合NDV包含編碼IL-12 (例如IL-12之p35及p40次單元)或其衍生物的包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。
本文所述之治療癌症之方法部分地基於在經瘤內投與包含經工程改造以編碼IL-12轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV (「NDV-IL-12」)與投與阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用的抗PD-1抗體組合之個體中看到的穩固抗腫瘤活性。在注射NDV-IL-12與未注射腫瘤中均觀測到所治療個體中之穩固抗腫瘤活性，因此觀測到遠端效應。本文所述之治療癌症之方法亦部分地基於在投與單獨NDV-IL-12或與阻斷PD-1與其配位體之間(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)的相互作用的抗PD-1抗體組合之個體中觀測到之基因表現。
在一個實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體投與嵌合NDV及PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。在另一實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量之嵌合NDV及有效量之PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。嵌合NDV及拮抗劑可同時或相繼投與個體。在某些實施例中，嵌合NDV及拮抗劑在相同組合物中投與。在其他實施例中，嵌合NDV及拮抗劑在不同組合物中投與。NDV及拮抗劑可藉由相同或不同投與途徑投與個體。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與個體且拮抗劑經靜脈內投與個體。
在另一實施例中，本文呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與包含嵌合NDV之第一組合物及包含PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑的第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在另一實施例中，本文呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與嵌合NDV及PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑，其中該嵌合NDV包含編碼IL-12之包裝基因組，且其中該PD-1之拮抗劑為阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體。在另一實施例中，本文呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與包含嵌合NDV之第一組合物及包含阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體的第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在一特定實施例中，本文呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與包含嵌合NDV之第一組合物及包含阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體的第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類IL-12之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼人類IL-12 p40次單元及人類IL-12 p35次單元。第一及第二組合物可藉由相同或不同投與途徑投與。在一特定實施例中，第一組合物經瘤內投與且第二組合物經靜脈內投與。關於NDV之資訊參見例如下文章節5.1、5.2及6，關於PD-1或其配位體之拮抗劑(包括PD-1阻斷抗體)之資訊參見下文章節5.5及6，關於組合物及投與途徑之資訊參見下文章節5.5.1，及關於用於治療癌症之方法的資訊參見下文章節5.7及6。
在另一態樣中，本文提供一種用於治療個體(例如人類個體)癌症之方法中的嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑。在另一實施例中，本文呈現一種用於治療個體(例如人類個體)癌症之方法中的嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與PD-1或其配位體之拮抗劑，且其中該PD-1 (例如人類PD-1)之拮抗劑為阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體。在另一實施例中，本文呈現一種用於治療個體(例如人類個體)癌症之方法中的嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體。嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑或抗PD-1抗體可藉由相同或不同投與途徑投與。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與且PD-1或其配位體之拮抗劑或抗PD-1抗體經靜脈內投與。關於NDV之資訊參見例如下文章節5.1、5.2及6，關於PD-1或其配位體之拮抗劑(包括PD-1阻斷抗體)之資訊參見下文章節5.5及6，關於組合物及投與途徑之資訊參見下文章節5.5.1，及關於用於治療癌症之方法的資訊參見下文章節5.7及6。
在另一實施例中，本文呈現一種嵌合NDV之用途，其用於製備與PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑組合用於治療個體(例如人類個體)癌症的藥劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在另一實施例中，本文呈現一種嵌合NDV之用途，其用於製備與PD-1 (例如人類PD-1)或其配位體之拮抗劑組合用於治療個體(例如人類個體)癌症的藥劑，其中該嵌合NDV包含編碼IL-12之包裝基因組，且其中該PD-1拮抗劑為阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體。在另一實施例中，本文呈現一種嵌合NDV之用途，其用於製備與阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用的抗PD-1抗體組合用於治療個體(例如人類個體)癌症的藥劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑或抗PD-1抗體可藉由相同或不同投與途徑投與。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與且PD-1或其配位體之拮抗劑或抗PD-1抗體經靜脈內投與。關於NDV之資訊參見例如下文章節5.1、5.2及6，關於PD-1或其配位體之拮抗劑(包括PD-1阻斷抗體)之資訊參見下文章節5.5及6，關於組合物及投與途徑之資訊參見下文章節5.5.1，及關於用於治療癌症之方法的資訊參見下文章節5.7及6。
嵌合NDV可具有任何NDV類型或病毒株之骨架，包括(但不限於)天然存在之病毒株、變異體或突變體、誘變病毒、重配株及/或經基因工程改造之病毒。在一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為弱毒性病毒株。在一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為中等毒性病毒株。在一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為強毒性病毒株。在一個實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼具有突變裂解位點之突變F蛋白質的核苷酸序列。在一特定實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列，在該突變F蛋白質中F蛋白質之裂解位點經突變以產生多鹼基胺基酸序列，此允許細胞內蛋白酶將該蛋白質裂解，從而使得該病毒更有效地進入細胞及形成合胞體。在另一特定實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列，在該突變F蛋白質中F蛋白質之裂解位點經含有一或兩個額外精胺酸殘基之裂解位點替換，允許突變裂解位點由廣泛表現之弗林蛋白酶家族蛋白酶活化。表現此類突變F蛋白質之NDV之特定實例包括(但不限於) rNDV/F2aa及rNDV/F3aa。關於引入NDV F蛋白質中以產生具有突變裂解位點之突變F蛋白質之突變的描述，參見例如Park等人(2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA 103: 8203-2808，其以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中，嵌合NDV包含具有NDV LaSota病毒株或細胞巨大病毒(CMV)之醣蛋白B之F蛋白質裂解位點的突變F蛋白質。在一特定實施例中，嵌合NDV包含具有來源於細胞巨大病毒之醣蛋白B之F蛋白質裂解位點的突變F蛋白質，該F蛋白質裂解位點包含胺基酸序列111 H-N-R-T-K-S/F117 (SEQ ID NO: 56)，諸如國際專利申請公開案第WO 2015/032755號中所述。在一特定實施例中，嵌合NDV包含具有具以下序列之一之F蛋白質裂解位點的突變F蛋白質：S116：111 H-N-R-T-K-S /F117 (SEQ ID NO: 56)；S116K：111 H-N- K -T-K-S/F117 (SEQ ID NO: 58)；S116m：111 H-N-R- M -K-S/F117 (SEQ ID NO: 69)；S116KM：111 H-N- K - M -S/F-I118 (SEQ ID NO: 70)；或R116：111 H-N-R-T-K- R /F-I118 (SEQ ID NO: 71)，諸如國際專利申請案第WO 2015/032755號中所述。關於可工程改造至NDV F蛋白質中之突變F蛋白質裂解位點之類型的描述，參見例如國際專利申請公開案第WO 2015/032755號，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列的包裝基因組，其中該突變F蛋白質包含胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A突變)。在特定實施例中，L289A突變F蛋白質在裂解位點中具有一個、兩個或三個精胺酸殘基。在某些實施例中，突變F蛋白質來自與骨架NDV不同之NDV類型或病毒株。在其他實施例中，突變F蛋白質來自與骨架NDV相同之NDV類型或病毒株。在一些實施例中，突變F蛋白質係除骨架NDV F蛋白質之外。在特定實施例中，突變F蛋白質替換骨架NDV F蛋白質。
與本文所述之NDV組合使用的PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.1、章節5.2、章節5.5、章節5.7及/或章節6)可為熟習此項技術者已知之PD-1或其配位體之任何拮抗劑。PD-1之配位體之特定實例包括PD-L1及PD-L2。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑阻斷(完全或部分)PD-1之天然配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)與PD-1之間的相互作用。在較佳實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑阻斷(完全或部分) PD-1之天然配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)與PD-1之間的相互作用，且預防或減少由PD-1與PD-1之天然配位體(例如PD-L1及/或PD-L2)之相互作用所誘導的抑制信號之轉導。
在一特定態樣中，PD-1或其配位體之拮抗劑為PD-1拮抗劑。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1之抗體。在特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1且阻斷(完全或部分) PD-1與PD-L1之間的相互作用之抗體。在特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1、阻斷(完全或部分) PD-1與PD-L1之間的相互作用且預防或減少抑制信號之轉導的抗體。在較佳實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1且阻斷(完全或部分) PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體。在另一較佳實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1、阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用且預防或減少抑制信號之轉導的抗體。在某些實施例中，抗體為駱駝化抗體、人類抗體或人類化抗體。在一特定實施例中，抗體為單株抗體。在另一特定實施例中，抗體為scFv。
在另一態樣中，PD-1或其配位體之拮抗劑為PD-1之配位體(例如PD-L1或PD-L2)之拮抗劑。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為PD-L1拮抗劑。在某些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-L1且阻斷(完全或部分) PD-1與PD-L1之間的相互作用之PD-L1拮抗劑。在一些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-L1、阻斷(完全或部分) PD-1與PD-L1之間的相互作用且預防或減少抑制信號之轉導的PD-L1拮抗劑。在一些實施例中，PD-L1拮抗劑亦阻斷(完全或部分) PD-L1與CD80 (B7.1)之間的相互作用。
在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為PD-L2拮抗劑。在某些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-L2且阻斷(完全或部分) PD-1與PD-L2之間的相互作用之PD-L2拮抗劑。在某些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-L2且阻斷(完全或部分) PD-1與PD-L2之間的相互作用且預防或減少抑制信號之轉導的PD-L2拮抗劑。
在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為特異性結合於PD-1之天然配位體的抗體或可溶性受體。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為特異性結合於PD-1之天然配位體且阻斷(完全或部分)該天然配位體結合PD-1及轉導抑制信號的抗體或可溶性受體。在某些特定實施例中，可溶性受體為結合於PD-1之配位體的PD-1之片段或PD-1之衍生物之片段(例如PD-1或PD-1之衍生物的細胞外域)。在一些特定實施例中，可溶性受體為包含PD-1或PD-1之衍生物之至少一部分(例如PD-1或PD-1之衍生物之細胞外域)及異源胺基酸序列的融合蛋白。在一特定實施例中，該融合蛋白包含PD-1或PD-1之衍生物之至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。在一特定實施例中，PD-1或其衍生物之一部分為例如PD-1或其衍生物之細胞外域。
在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1之天然配位體之抗體。抗體可結合於PD-L1或PD-L2。在某些實施例中，抗體為駱駝化抗體、人類抗體或人類化抗體。在一特定實施例中，抗體可為單株抗體。在另一特定實施例中，抗體可為單鏈可變片段(scFv)。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1但不轉導抑制信號之抗體或配位體。在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1但不轉導抑制信號之配位體。在某些特定實施例中，該配位體為包含PD-1之配位體或PD-1之配位體之衍生物的至少一部分及異源胺基酸序列。在特定實施例中，該融合蛋白包含PD-1之配位體或PD-1之配位體之衍生物的至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。
在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為PD-1阻斷抗體。在另一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗。在較佳實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為派姆單抗。在另一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為PD-L1阻斷抗體(例如度伐魯單抗(duralumab)或阿維魯單抗(avelumab))。
在一個態樣中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與包含嵌合新城雞瘟病毒(NDV)之第一組合物及包含人類PD-1或其配位體之拮抗劑的第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類介白素-12 (「IL-12」)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼人類IL-12 p40次單元及人類IL-12 p35次單元。在一特定實施例中，嵌合NDV之包裝基因組進一步包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列且突變F蛋白質併入至嵌合NDV之病毒粒子中，其中該突變F蛋白質包含突變裂解位點。在一特定實施例中，突變裂解位點為111 H-N-R-T-K-R/F-I118 (SEQ ID NO: 71)。在另一特定實施例中，嵌合NDV之包裝基因組進一步包含編碼具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質之核苷酸序列，其中該突變F蛋白質併入至嵌合NDV之病毒粒子中。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:26中闡述之核苷酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 40中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 23中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列且IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列且IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 42中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 22中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 43中闡述之胺基酸序列的胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列的胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 40中闡述之胺基酸序列且IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在特定實施例中，包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，第一組合物經瘤內或結節內投與個體。在另一特定實施例中，第二組合物經靜脈內投與個體。
在另一態樣中，本文提供一種嵌合NDV，其用於治療人類個體之癌症的方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類介白素-12 (「IL-12」)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼人類IL-12 p40次單元及人類IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與人類PD-1或其配位體之拮抗劑。在一特定實施例中，嵌合NDV之包裝基因組進一步包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列且突變F蛋白質併入至嵌合NDV之病毒粒子中，其中該突變F蛋白質包含突變裂解位點。在一特定實施例中，突變裂解位點為111 H-N-R-T-K-R/F-I118 (SEQ ID NO: 71)。在另一特定實施例中，嵌合NDV之包裝基因組進一步包含編碼具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質之核苷酸序列，其中該突變F蛋白質併入至嵌合NDV之病毒粒子中。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:26中闡述之核苷酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 23中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列且IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 22中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列的胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列且IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 42中闡述之胺基酸序列。在另一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 40中闡述之胺基酸序列且IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在特定實施例中，包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，包裝基因組之序列如SEQ ID NO: 51中所闡述。在一特定實施例中，包裝基因組之序列如SEQ ID NO: 52中所闡述。在一特定實施例中，第一組合物經瘤內或結節內投與個體。在另一特定實施例中，第二組合物經靜脈內投與個體。
在一特定實施例中，嵌合NDV包含弱毒性NDV骨架。在另一特定實施例中，嵌合NDV包含LaSota病毒株之NDV骨架。在另一特定實施例中，嵌合NDV包含Hitchner B1病毒株之NDV骨架。在另一特定實施例中，嵌合NDV包含r73T-R116病毒之NDV骨架。
在一特定實施例中，人類PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於人類PD-1之抗體。在另一特定實施例中，人類PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體。在較佳實施例中，抗體為派姆單抗。在另一實施例中，抗體為納武單抗或MEDI0680。在一特定實施例中，抗體包含以下：包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之可變輕鏈區(VLCR)互補決定區(CDR) 1、包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之可變重鏈區(VHCR) CDR 1、包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在另一實施例中，抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；及(b)包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR。在另一實施例中，抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)之輕鏈；及(b)包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10)之重鏈。在另一實施例中，抗體包含包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。在另一實施例中，抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR；及(b)包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR。在另一實施例中，抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15)之輕鏈；及(b)包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20)之重鏈。
在一特定實施例中，人類PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於人類PD-L1之抗體。在特定實施例中，抗體為德瓦魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗(atezolizumab)。
在一特定實施例中，在本文提供之治療癌症之方法中本文所述之嵌合NDV的投與誘導IL-12p70、IFN-ɤ表現或IL-12p70與IFN-ɤ表現。在一特定實施例中，在本文提供之治療癌症之方法中本文所述之嵌合NDV的投與增加基因表現圖譜(GEP)評分。關於GEP評分參見例如下文實例6.3。在一特定實施例中，本文提供一種增加對抗PD-1療法之反應的方法。
在一特定實施例中，根據本文所揭示之方法治療的患者展現皮膚或皮下腫瘤或淋巴結內之腫瘤。
在另一特定實施例中，癌症為黑色素瘤、腎臟癌(kidney cancer)、肺癌(例如非小細胞肺癌)、膀胱癌、卵巢癌、結腸癌、胰臟癌、腎癌(renal cancer)(例如腎細胞癌)、結腸直腸癌(例如結腸直腸癌瘤)、乳癌(例如乳癌瘤)或頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌)。在特定實施例中，癌症為選自由黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌及乳癌組成之群的實體腫瘤。在另一特定實施例中，癌症為非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。在另一特定實施例中，癌症為轉移性的。在另一特定實施例中，癌症為不可切除的。在特定實施例中，癌症包含皮膚、皮下或結節癌轉移。在一特定實施例中，癌症為難治性或復發的，或兩者。在一特定實施例中，癌症切片檢查為PD-L1陽性。在特定實施例中，切片檢查具有至少1%之腫瘤比例評分。在其他特定實施例中，癌症切片檢查為PD-L1陰性。在特定實施例中，切片檢查具有小於1%之腫瘤比例評分。
在一特定實施例中，個體對利用結合於PD-1且阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體的單一療法處理具頑抗性。在另一特定實施例中，個體對利用人類PD-1或其配位體之拮抗劑的單一療法處理具頑抗性或對其無反應。在特定實施例中，個體對利用納武單抗、AMP-224、MEDI0680、派姆單抗、德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗之單一療法具頑抗性或對其無反應。3.1 術語
如本文所使用，術語「約」或「大約」在結合數字使用時係指在所提及數字之1%、5%或10%內的任何數字。
如本文所使用，術語「促效劑」係指結合於另一分子且誘導生物反應之分子。在一特定實施例中，促效劑為結合於細胞上之受體且觸發一或多個信號轉導路徑之分子。舉例而言，促效劑包括結合於細胞上之受體且誘導一或多個信號轉導路徑的抗體或配位體。在某些實施例中，抗體或配位體結合於細胞上之受體且誘導一或多個信號轉導路徑。在其他實施例中，促效劑促進天然配位體與天然受體之相互作用。
術語「胺基酸序列一致性」係指一對所比對之胺基酸序列之間的一致性或相似性程度，通常表示為百分比。一致性百分比為在序列進行比對且必要時引入間隙以實現最大序列同源性百分比之後候選序列中與肽(或多肽或蛋白質)中對應胺基酸殘基一致(亦即在比對中給出位置處之胺基酸殘基為相同殘基)或相似(亦即在比對中給出位置處之胺基酸取代為保守取代，如下文所論述)之胺基酸殘基的百分比。
如本文所使用，術語「拮抗劑」係指在本身不引起生物反應下抑制另一分子之作用的分子。在一特定實施例中，拮抗劑為結合於細胞上之受體且阻斷或減弱促效劑之生物活性的分子。舉例而言，拮抗劑包括在不誘導一或多個信號轉導路徑下結合於細胞上之受體且阻斷或減弱天然配位體與受體之結合的抗體或配位體。拮抗劑之另一實例包括與細胞上之天然受體競爭結合於天然配位體，且因此阻斷或減弱在天然受體結合於天然配位體時所誘導之一或多個信號轉導路徑的抗體或可溶性受體。拮抗劑之另一實例包括不阻止天然受體與天然配位體之結合，但阻止藉由其他方式進行信號轉導(例如經由抑制受體多聚合)的抗體或可溶性受體。
如本文所用，術語「抗體(antibody)」及「抗體(antibodies)」係指含有抗原結合位點之分子，例如免疫球蛋白。抗體包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人類抗體、人類化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多株抗體、單域抗體、駱駝化抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接之雙特異性Fv (sdFv)、胞內抗體及抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如抗Id及針對抗體之抗抗Id抗體)及以上各者中之任一者的抗原決定基結合片段。詳言之，抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性片段。免疫球蛋白分子可具有任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。在一特定實施例中，抗體為人類或人類化抗體。在另一特定實施例中，抗體為單株抗體或scFv。在某些實施例中，抗體為人類或人類化單株抗體或scFv。在其他特定實施例中，抗體為雙特異性抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體特異性結合於免疫細胞之共刺激受體或免疫細胞之抑制受體及癌細胞上之受體。在一些實施例中，雙特異性抗體特異性結合於免疫細胞上之兩種受體，例如免疫細胞上之兩種共刺激受體、免疫細胞上之兩種抑制受體或免疫細胞上之一種共刺激受體及免疫細胞上之一種抑制受體。
「保守取代」為熟習此項技術者瞭解之術語且一般係指一類胺基酸經相同類別之另一胺基酸替換。在特定實施例中，保守取代不改變多肽之結構或功能或兩者。用於達成保守取代之目的之胺基酸類別可包括疏水性、中性親水性、酸性、鹼性、構形破壞分子及芳族。疏水性胺基酸可包括Met、Ala、Val、Leu及Ile。中性親水性胺基酸可包括Cys、Ser及Thr。酸性胺基酸可包括Asp及Glu。鹼性胺基酸可包括Asn、Gln、His、Lys及Arg。構形破壞分子胺基酸可包括Gly及Pro。芳族胺基酸可包括Trp、Tyr及Phe。
如本文所使用，術語「衍生物」在蛋白質或多肽之情況下係指：(a)與天然多肽至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致的多肽；(b)由與編碼天然多肽之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致的核酸序列編碼之多肽；(c)相對於天然多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個或2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15或15或20個胺基酸突變(亦即添加、缺失及/或取代)的多肽；(d)由可在高、中等或典型嚴格度雜交條件下與編碼天然多肽之核酸序列雜交的核酸序列編碼之多肽；(e)由可在高、中等或典型嚴格度雜交條件下與編碼具有至少10個相鄰胺基酸、至少12個相鄰胺基酸、至少15個相鄰胺基酸、至少20個相鄰胺基酸、至少30個相鄰胺基酸、至少40個相鄰胺基酸、至少50個相鄰胺基酸、至少75個相鄰胺基酸、至少100個相鄰胺基酸、至少125個相鄰胺基酸、至少150個相鄰胺基酸或10至20個、20至50個、25至75個、25至100個、25至150個、50至75個、50至100個、75至100個、50至150個、75至150個、100至150個或100至200個相鄰胺基酸之天然多肽之片段的核酸序列雜交的核酸序列編碼之多肽；或(f)天然多肽之片段。衍生物亦包括包含哺乳動物多肽之天然存在之成熟形式的胺基酸序列及異源信號肽胺基酸序列的多肽。另外，衍生物包括已藉由例如糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/封端基團衍生化、蛋白質裂解、連接於細胞配位體或其他蛋白質部分等進行化學修飾的多肽。此外，衍生物包括包含一或多個非經典胺基酸之多肽。在一個實施例中，分離衍生物。在特定實施例中，衍生物保留其衍生自之天然多肽之一或多種功能。
一致性百分比可使用熟習此項技術者已知之任何方法確定。在一特定實施例中，一致性百分比使用序列分析套裝軟體(版本10；Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin)之「Best Fit」或「Gap」程式確定。已描述關於雜交條件之資訊(例如高、中等及典型嚴格度條件)，參見例如美國專利申請公開案第US 2005/0048549號(例如段落72-73)。
如本文所使用，術語「片段」在蛋白劑(例如蛋白質)之片段的情況下係指蛋白質劑之具有8個或更多個相鄰胺基酸、10個或更多個相鄰胺基酸、15個或更多個相鄰胺基酸、20個或更多個相鄰胺基酸、25個或更多個相鄰胺基酸、50或更多個相鄰胺基酸、75或更多個相鄰胺基酸、100或更多個相鄰胺基酸、150個或更多個相鄰胺基酸、200個或更多個相鄰胺基酸，或在10至300個相鄰胺基酸、10至200個相鄰胺基酸、10至250個相鄰胺基酸、10至150個相鄰胺基酸、10至100個相鄰胺基酸、10至50個相鄰胺基酸、50至100個相鄰胺基酸、50至150個相鄰胺基酸、50至200個相鄰胺基酸、50至250個相鄰胺基酸、50至300個相鄰胺基酸、25至50個相鄰胺基酸、25至75個相鄰胺基酸、25至100個相鄰胺基酸或75至100個相鄰胺基酸的片段。在一特定實施例中，蛋白劑之片段保留蛋白劑之一或多種功能-換言之，其為功能片段。舉例而言，蛋白劑之片段保留與另一蛋白質相互作用及/或誘導、增強或活化一或多種信號轉導路徑之能力。
如本文所使用，術語「功能片段」在蛋白劑之情況下係指保留蛋白劑之一或多種活性或功能的蛋白劑之一部分。舉例而言，抑制受體之功能片段可保留結合其一或多種配位體之能力。共刺激受體之配位體之功能片段可保留結合於受體及/或誘導、增強或活化由配位體結合於其共刺激受體所介導之一或多種信號轉導路徑的能力。
如本文所使用，術語「GEP評分」係指基於表15中之18基因標籤的人類腫瘤組織培養樣品之RNA基因表現圖譜分析。各個別樣品之經分離之RNA的基因表現資料藉由HK(管家)校正來校正。對於各腫瘤樣品，原始計數為log10變換，且接著藉由減去所有管家基因之算術平均值進行各基因校正(表15)。基因表現圖譜分析(GEP)標籤評分計算為18基因上下標籤之管家校正值的加權和(表15)。各基因之管家校正值乘以來自評分權數之集合的該基因之係數，產生18基因標籤中各基因之加權RNA值，且加上加權RNA值，產生腫瘤樣品之標籤評分。
如本文所使用，術語「異源」係指在自然界中未發現的與天然存在之NDV相關(例如由其編碼及/或由其基因組表現)的實體。
如本文所使用，術語「老年人」係指65歲或更大年齡之人類。
如本文所使用，術語「成年人」係指18歲或更大年齡之人類。
如本文所使用，術語「孩子」係指1歲至18歲之人類。
如本文所使用，術語「幼兒」係指1歲至3歲之人類。
如本文所使用，術語「嬰兒」係指新生兒至1歲人類。
在某些實施例中，如本文所用，術語「高促融」及其類似術語係指NDV形成涉及大量細胞之融合細胞的能力增加。在一特定實施例中，經工程改造以表現突變F蛋白質的感染本文描述之NDV的細胞相對於感染該病毒所源自之親本病毒的細胞具有增加的形成融合細胞之能力，該親本病毒具有未突變F蛋白質。在另一特定實施例中，相對於感染該病毒所源自之具有未突變F蛋白質之親本病毒的形成融合細胞之細胞的數目，多約10%至約25%、約25%至約50%、約25%至約75%、約50%至約75%、約50%至約95%或約75%至約99%或約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的經工程改造以表現突變F蛋白質的感染本文描述之NDV的細胞形成融合細胞。在某些實施例中，融合細胞係用顯微鏡，藉由計數某段時間(例如約8小時至約12小時、約12小時至約24小時、約24小時至約36小時或約36小時至約48小時)後每個融合細胞之細胞核數目來定量。
如本文所使用，術語「干擾素拮抗劑」係指減少或抑制細胞干擾素免疫反應之藥劑。在一個實施例中，干擾素拮抗劑為減少或抑制細胞干擾素免疫反應之蛋白質藥劑。在一特定實施例中，干擾素拮抗劑為減少或抑制細胞干擾素反應之病毒蛋白或多肽。
在一特定實施例中，干擾素拮抗劑為減少或抑制干擾素表現及/或活性之藥劑。在一個實施例中，干擾素拮抗劑減少或抑制I型IFN之表現及/或活性。在另一實施例中，干擾素拮抗劑減少或抑制II型IFN之表現及/或活性。在另一實施例中，干擾素拮抗劑減少或抑制III型IFN之表現及/或活性。在一特定實施例中，干擾素拮抗劑減少或抑制IFN-α、IFN-β或兩者之表現及/或活性。在另一特定實施例中，干擾素拮抗劑減少或抑制IFN-γ之表現及/或活性。在另一實施例中，干擾素拮抗劑減少或抑制IFN-α、IFN-β及IFN-γ中之一者、兩者或所有的表現及/或活性。
在某些實施例中，如藉由本文描述或熟習此項技術者已知之技術所量測，相對於未表現或未與此類干擾素拮抗劑接觸之對照受精蛋或細胞中IFN-α、IFN-β及/或IFN-γ之表現及/或活性，干擾素拮抗劑使受精蛋或細胞中IFN-α、IFN-β及/或IFN-γ之表現及/或活性減少大約1至大約100倍、大約5至大約80倍、大約20至大約80倍、大約1至大約10倍、大約1至大約5倍、大約40至大約80倍或1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或100倍。在其他實施例中，如藉由本文描述或熟習此項技術者已知之技術所量測，相對於未表現或未與此類干擾素拮抗劑接觸之對照受精蛋或細胞中IFN-α、IFN-β及/或IFN-γ之表現及/或活性，干擾素拮抗劑使受精蛋或細胞中IFN-α、IFN-β及/或IFN-γ之表現及/或活性減少至少20%至25%、至少25%至30%、至少30%至35%、至少35%至40%、至少40%至45%、至少45%至50%、至少50%至55%、至少55%至60%、至少60%至65%、至少65%至70%、至少70%至75%、至少75%至80%、至少80%至85%、至少85%至90%、至少90%至95%、至少95%至99%或者20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
如本文所用，短語「缺乏IFN之系統」或「缺乏IFN之基質」係指不產生IFN之一種、兩種或更多種類型，或不產生任何IFN類型，或產生低水準之IFN之一種、兩種或更多種類型，或產生低水準之任何IFN (亦即與相同條件下IFN勝任系統相比任何IFN表現減少5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%或更多)，對IFN之一種、兩種或更多種類型不起反應或不太有效反應，或對任何IFN類型不起反應，對IFN之一種、兩種或更多種類型的反應延遲，及/或由IFN之一種、兩種或更多種類型誘導或由任何IFN類型誘導之抗病毒基因的活性缺乏的系統，例如細胞、細胞株及動物，諸如小鼠、雞、火雞、兔、大鼠、馬等。
「介白素-12」及「IL-12」係指熟習此項技術者已知之任何IL-12。在某些實施例中，IL-12可為人類、犬、貓、馬、豬或牛IL-12。在一特定實施例中，IL-12為人類IL-12。典型IL-12由熟習此項技術者已知之由兩種獨立基因IL-12A (p35次單元)及IL-12B (p40次單元)編碼之雜二聚體組成。GenBank™寄存編號NM_000882.3 (GI編號325974478)提供一種示例性人類IL-12A核酸序列。GenBank™寄存編號NM_002187.2 (GI編號24497437)提供一種示例性人類IL-12B核酸序列。GenBank™寄存編號NP_000873.2 (GI編號24430219)提供一種示例性人類IL-12A (p35次單元)胺基酸序列。GenBank™寄存編號NP_002178.2 (GI編號24497438)提供一種示例性人類IL-12B (p40次單元)胺基酸序列。在某些實施例中，IL-12由包含p35次單元及p40次單元之單一多肽鏈組成，p35次單元及p40次單元視情況由連接子序列(諸如SEQ ID NO: 24及46-49中之任一者)分開。在較佳實施例中，IL-12包含章節6中提供之p35及p40次單元序列，例如分別SEQ ID NO: 25及23，或分別SEQ ID NO: 41及40。在某些實施例中，IL-12由例如p35及p40之超過一條多肽鏈呈四級締合組成。如本文所用，術語「介白素-12」及「IL-12」涵蓋藉由轉譯後加工，諸如信號肽裂解、二硫鍵形成、糖基化(例如N連接之糖基化)、蛋白酶裂解及脂質修飾(例如S-棕櫚醯化)修飾之介白素-12多肽。在一些實施例中，IL-12或由單一多肽鏈組成之IL-12的次單元中之一或兩者包括信號序列。在其他實施例中，IL-12或由單一多肽鏈組成之IL-12的次單元中之一或兩者不包括信號序列。信號序列可為天然存在之信號肽序列或其變異體。在一些實施例中，信號肽為IL-12信號肽。在一些實施例中，信號肽與IL-12信號肽異源。
如本文所用，在抗體之情況下術語「免疫特異性結合」、「免疫特異性識別」、「特異性結合」及「特異性識別」為類似術語，且係指如熟習此項技術者所瞭解，特異性結合於抗原(例如抗原決定基或免疫複合體)之分子。如藉由例如免疫分析(例如ELISA)、表面電漿子共振分析(例如BIAcore®)、KinEx分析(使用例如KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments, Boise, ID))或此項技術中已知之其他分析所測定，特異性結合於抗原之分子可以較低親和力結合於其他肽或多肽。在一特定實施例中，特異性結合於一種抗原之分子結合於該抗原的解離常數(亦即Ka)為該分子結合於另一種抗原時之Ka的至少2個對數值、2.5個對數值、3個對數值、3.5個對數值、4個對數值或更大。
如本文所使用，術語「單株抗體」為此項技術之一個術語且一般係指自均質或實質上均質抗體之群體獲得的抗體，且各單株抗體將通常識別抗原上之單一抗原決定基(例如單一構形抗原決定基)。
如本文所用，短語「感染倍率」或「MOI」為每個感染細胞之病毒平均數目。MOI藉由將所添加之病毒數目(添加之毫升數×Pfu)除以添加之細胞數目(添加之毫升數×細胞/毫升)確定。
如本文所使用，術語「天然配位體」係指結合於天然存在之受體的任何天然存在之配位體。在一特定實施例中，配位體為哺乳動物配位體。在另一特定實施例中，配位體為人類配位體。
如本文所使用，在蛋白質或多肽之情況下術語「天然多肽」係指任何天然存在之胺基酸序列，包括蛋白質之不成熟或前驅體及成熟形式。在一特定實施例中，天然多肽為人類蛋白質或多肽。
如本文所使用，術語「天然受體」係指結合於天然存在之配位體的任何天然存在之受體。在一特定實施例中，受體為哺乳動物受體。在另一特定實施例中，受體為人類受體。
「計劃性細胞死亡蛋白1」、「PD1」及「PD-1」係指熟習此項技術者已知之任何PD-1。在某些實施例中，PD-1可為人類、犬、貓、馬、豬或牛PD-1。在一特定實施例中，PD-1為人類PD-1。GenBank™寄存編號NM_005018.2 (GI編號167857791)提供一種示例性人類PD-1核酸序列。GenBank™寄存編號NP_005009.2 (GI編號167857792)提供一種示例性人類PD-1胺基酸序列。PD-1配位體包括計劃性死亡配位體1 (亦稱為「PD-L1」、「PDL1」、「分化簇274」、「CD274」、「B7同源物1」及「B7-H1」)及計劃性細胞死亡1配位體2(亦稱為「PDL2」、「PD-L2」及「B7-DC」)。PD-L1係指熟習此項技術者已知之任何PD-L1。在某些實施例中，PD-L1可為人類、犬、貓、馬、豬或牛PD-L1。在一特定實施例中，PD-L1為人類PD-L1。GenBank™寄存編號NM_001314029.1、NM_001267706.1及NM_014143.3 (分別GI編號930425328、390979638及292658763)提供示例性人類PD-L1核酸序列。GenBank™寄存編號NP_001300958.1、NP_001254635.1及NP_054862.1 (分別GI編號930425329、390979639及7661534)提供示例性人類PD-L1胺基酸序列。PD-L2係指熟習此項技術者已知之任何PD-L2。在某些實施例中，PD-L2可為人類、犬、貓、馬、豬或牛PD-L2。在一特定實施例中，PD-L2為人類PD-L2。GenBank™寄存編號NM_025239.3 (GI編號190014604)提供一種示例性人類PD-L2核酸序列。GenBank™寄存編號NP_079515.2 (GI編號190014605)提供一種示例性人類PD-L2胺基酸序列。如本文所用，PD-1、PD-L1及PD-L2分別涵蓋藉由轉譯後加工，諸如信號肽裂解、二硫鍵形成、糖基化(例如N連接之糖基化)、蛋白酶裂解及脂質修飾(例如S-棕櫚醯化)修飾之PD-1、PD-L1及PD-L2多肽。在一些實施例中，PD-1、PD-L1及PD-L2分別包括具有信號序列之PD-1、PD-L1及PD-L2多肽。在其他實施例中，PD-1、PD-L1及PD-L2分別包括不包括信號序列之PD-1、PD-L1及PD-L2多肽。關於PD-1之結構的資訊，包括關於PD-1之信號序列之資訊，參見例如Ishida等人，1992, EMBO J. 11: 3887-3895及Shinohara等人，1994, Genomics 23: 704-706 (各文獻以全文引用的方式併入本文中)。當在PD-1或其配位體之抗體之情況下使用時，抗體係針對PD-1、PD-L1或PD-L2之成熟形式。
「難治」為技術公認之術語，其通常意謂對治療不起反應，亦即未收到如在「治療」下所描述之有益作用的癌症。癌症可能在治療開始時便具有抗性或其可能在治療期間變得具有抗性。
「復發」為技術公認之術語，其通常意謂在經由如下所述之治療改善時期後疾病或疾病之徵象及症狀恢復。
如本文所用，術語「個體」或「患者」可互換使用。如本文所用，術語「個體(subject)」及「個體(subjects)」係指動物。在一些實施例中，個體為哺乳動物，包括非靈長類動物(例如駱駝、驢、斑馬、牛、馬、馬、貓、犬、大鼠及小鼠)及靈長類動物(例如猴、黑猩猩及人類)。在一些實施例中，個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，個體為寵物(例如犬或貓)或農場動物(例如馬、豬或牛)。在其他實施例中，個體為人類。在某些實施例中，哺乳動物(例如人類)為0至6個月、6至12個月、1至5歲、5至10歲、10至15歲、15至20歲、20至25歲、25至30歲、30至35歲、35至40歲、40至45歲、45至50歲、50至55歲、55至60歲、60至65歲、65至70歲、70至75歲、75至80歲、80至85歲、85至90歲、90至95歲或95至100歲。在特定實施例中，個體為非禽類動物。
如本文所用，在投與療法之情況下術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指個體可從中收到有益作用，諸如減少、降低、減弱、減輕、穩定化、緩解、遏制、抑制或阻止癌症或其症狀出現或進展的治療/療法。在某些實施例中，個體接受之治療/療法產生以下作用中之至少一者或多者：(i)減少或改善癌症及/或其相關症狀之嚴重程度；(ii)減少與癌症相關之症狀之持續時間；(iii)預防與癌症相關之症狀復發；(iv)癌症及/或其相關症狀消退；(v)減少個體住院次數；(vi)減少住院時長；(vii)增加個體存活；(viii)抑制癌症及/或其相關症狀進展；(ix)增強或改善另一療法之治療效果；(x)減少或消除癌細胞群體；(xi)減少腫瘤或贅瘤生長；(xii)減小腫瘤尺寸；(xiii)減少腫瘤形成；(xiv)根除、移除或控制原發性、區域性及/或轉移癌；(xv)降低癌轉移數目或尺寸；(xvi)降低死亡率；(xvii)提高患者之無癌症存活率；(xviii)提高無復發存活率；(xix)增加緩解之患者數目；(xx)降低住院率；(xxi)如藉由熟習此項技術者可獲得之習知方法，諸如MRI、X射線、CT掃描及PET掃描所量測，在投與療法後維持腫瘤尺寸且尺寸不增加或腫瘤尺寸增加小於5%或10%；(xxii)預防癌症及/或其相關症狀出現或發作；(xxiii)增加患者中緩解時長；(xxiv)減少與癌症相關之症狀數目；(xxv)增加癌症患者之無症狀存活期；(xxvi)限制或減少癌轉移；(xxvii)總存活率；(xxviii)無進展存活期(如例如藉由RECIST v1.1.評估)；(xxix)總反應率；及/或(xxx)增加反應持續時間。在一些實施例中，個體接受之治療/療法未治癒癌症，但阻止疾病進展或惡化。在某些實施例中，個體接受之治療/療法不阻止癌症發作/出現，但可阻止癌症症狀發作。熟練技術人員已知之任何方法可用於評估個體接受之治療/療法。在一特定實施例中，根據實體腫瘤反應評估標準(「RECIST」)公開之規則評估治療/療法。在一特定實施例中，治療/療法根據2000年2月公開之RECIST規則(亦稱為「RECIST 1」)評估(參見例如Therasse等人，2000, Journal of National Cancer Institute, 92(3):205-216，其以全文引用的方式併入本文中)。在一特定實施例中，治療/療法根據2009年1月公開之RECIST規則(亦稱為「RECIST 1.1」)評估(參見例如Eisenhauer等人，2009, European Journal of Cancer, 45:228-247，其以全文引用的方式併入本文中)。在一特定實施例中，治療/療法根據熟練技術人員在評估時利用之RECIST規則評估。在一特定實施例中，治療/療法根據免疫相關之RECIST (「irRECIST」)公開之規則(參見例如Bohnsack等人，2014, ESMO Abstract 4958，其以全文引用的方式併入本文中)評估。在一特定實施例中，治療/療法根據熟練技術人員在評估時利用之irRECIST規則評估。在一特定實施例中，治療/療法根據Lugano標準評估。在一特定實施例中，治療/療法經由腫瘤相關之血清標記物，諸如CA-125、CEA、CA-19-9、PSA、AFP、抑制素A、抑制素B、HCG、CA 15-3、甲狀球蛋白、HE4之減少來評估。
如本文所使用，在向個體投與療法之情況下術語「組合」係指使用超過一種療法。使用術語「組合」不限制向個體投與療法之次序。第一療法可在向個體投與第二療法之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)投與，與其同時投與，或在其之後(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週後)投與。舉例而言，本文描述之嵌合NDV可在PD-1或其配位體之拮抗劑投與之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)投與，與其同時投與，或在其之後(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週後)投與。
如本文所用，術語「療法(therapies)」及「療法(therapy)」可指在癌症治療中可使用之任何方案、方法及/或藥劑。在某些實施例中，術語「療法(therapies)」及「療法(therapy)」係指可用於治療癌症之生物療法、支持療法、激素療法、化學療法、免疫療法及/或其他療法。在一特定實施例中，療法包括輔助療法。舉例而言，使用療法結合藥物療法、生物療法、手術及/或支持療法。在某些實施例中，術語「療法」係指本文描述之嵌合NDV。在其他實施例中，術語「療法」係指非嵌合NDV之藥劑。在某些實施例中，術語「療法」係指PD-1或其配位體之拮抗劑。在其他實施例中，術語「療法」係指非PD-1或其配位體之拮抗劑得藥劑。在某些實施例中，術語「療法」係指本文描述之嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑。在某些實施例中，術語「療法」係指既非本文描述之嵌合NDV，亦非PD-1或其配位體之拮抗劑的藥劑。
本申請案主張2017年5月12日申請之美國臨時專利申請案第62/505,759號及2017年5月17日申請之美國臨時專利申請案第62/507,690號的優先權益，其各者以全文引用的方式併入本文中。
本發明係在政府支持下在由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予的T32 CA009207及HHSN26620070010C下進行。政府在本發明中具有某些權利。
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容以引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2018年5月4日，命名為6923-272-228_SL.txt且大小為263,022位元組。
在一個態樣中，本文呈現用於治療癌症之方法，其利用本文所述之NDV (例如下文章節5.1或章節5.2中描述之NDV或嵌合NDV)或包含此類嵌合NDV之組合物。在一特定實施例中，用於治療癌症之方法包含用本文所述之嵌合NDV (例如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物感染個體中之癌細胞。在另一實施例中，用於治療癌症之方法包含向有需要之個體投與本文所述之嵌合NDV (例如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物。在特定實施例中，將有效量之本文所述之嵌合NDV (例如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)或包含有效量之本文所述之嵌合NDV的組合物投與個體以治療癌症。在一特定實施例中，嵌合NDV包含編碼IL-12 (例如IL-12 p35及IL-12 p40次單元)之包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12(例如人類IL-12)由感染嵌合NDV之細胞表現。在某些實施例中，NDV之基因組亦編碼突變F蛋白質。在某些實施例中，兩種或更多種嵌合NDV投與個體以治療癌症。
在另一實施例中，用於治療癌症之方法包含向有需要之個體投與感染本文所述之NDV (例如下文章節5.1及/或章節5.2中所述之NDV或嵌合NDV)或其組合物的癌細胞。在特定實施例中，在投與個體或併入組合物前癌細胞已用γ輻射處理。在另一實施例中，用於治療癌症之方法包含向有需要之個體投與來自感染嵌合NDV (例如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物之癌細胞的蛋白質濃縮物或質膜片段。 在特定實施例中，嵌合NDV包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之包裝基因組，其中IL-12由NDV表現。在某些實施例中，NDV之基因組亦編碼由NDV表現之突變F蛋白質。
在另一態樣中，本文呈現用於治療癌症之方法，其利用本文所述之NDV (例如諸如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)或包含NDV與一或多種其他療法組合之組合物。在一個實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體(例如人類個體)投與本文所述之NDV (例如諸如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)及一或多種其他療法。在另一實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體(例如人類個體)投與有效量之本文所述之NDV或包含有效量之本文所述之NDV的組合物及一或多種其他療法。在一特定實施例中，本文呈現本文所述之NDV (例如諸如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)的用途，其用於製備與一或多種其他療法組合用於治療個體(例如人類個體)之癌症的藥劑。在另一特定實施例中，本文呈現本文所述之NDV (例如諸如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)的用途，其用於治療個體(例如人類個體)之癌症之方法，其中該方法進一步包含投與一或多種其他療法。
在較佳實施例中，一或多種療法包括PD-1或其配位體之拮抗劑(例如阻斷PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之間的相互作用之抗PD-1抗體或阻斷PD-L1與PD-1之間的相互作用之抗PD-l L1抗體)。NDV及一或多種其他療法可同時或相繼投與個體。在某些實施例中，NDV及一或多種其他療法在相同組合物中投與。在其他實施例中，NDV及一或多種其他療法在不同組合物中投與。NDV及一或多種其他療法可藉由相同或不同投與途徑投與個體。
在另一態樣中，本文呈現用於治療癌症之方法，其利用本文所述之嵌合NDV (例如諸如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)或包含此類嵌合NDV之組合物與PD-1或其配位體之拮抗劑組合，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組。在一個實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體(例如人類個體)投與本文所述之嵌合NDV (例如諸如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)及PD-1或其配位體之拮抗劑，其中嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組。在另一實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體(例如人類個體)投與有效量之本文所述之嵌合NDV或包含有效量之本文所述之嵌合NDV之組合物及PD-1或其配位體之拮抗劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組。嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑可同時或相繼投與個體。在某些實施例中，嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑在相同組合物中投與。在其他實施例中，嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑在不同組合物中投與。嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑可藉由相同或不同投與途徑投與個體。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與且拮抗劑經靜脈內投與。
在一個實施例中，本文呈現嵌合NDV之用途，其用於製備本文所述之嵌合NDV與PD-1或其配位體之拮抗劑組合用於治療個體(例如人類個體)之癌症的藥劑，其中嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組。在另一實施例中，本文呈現一種嵌合NDV，其用於治療個體(例如人類個體)之癌症之方法，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12(例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，且其中該方法進一步包含投與PD-1或其配位體之拮抗劑。嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑可同時或相繼投與個體。在某些實施例中，嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑在相同組合物中投與。在其他實施例中，嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑在不同組合物中投與。嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑可藉由相同或不同投與途徑投與個體。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與且拮抗劑經靜脈內投與。
國際專利申請公開案第WO 2014/158811號及美國專利申請公開案第2016/0015760 A1號及第2014/0271677 A1號各以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，描述於例如國際專利申請公開案第WO 2014/158811號及美國專利申請公開案第2016/0015760 A1號及第2014/0271677 A1號之章節3、5.1、5.2、5.5及5.6中的概述、NDV之描述、嵌合NDV之描述、組合物之描述、投與途徑之描述及抗癌及其他用途之描述以全文引用的方式併入本文中。5.1 新城雞瘟病毒
任何NDV類型或病毒株均可用於本文所揭示之組合療法中，包括(但不限於)天然存在之病毒株、變異體或突變體、誘變病毒、重配株及/或經基因工程改造之病毒。熟習此項技術者將瞭解當經培養、繼代或繁殖時病毒可進行突變。除為達成選殖之目的而引入之突變之外，NDV可含有此等天然存在之突變。NDV可為無此等突變或具有此等突變中之一或多種突變的均質或非均質群體。在一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為天然存在之病毒株。在某些實施例中，NDV為溶解性病毒株。在其他實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為非溶解性病毒株。在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為弱毒性病毒株。在一些實施例中，NDV為中等毒性病毒株。在其他實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為強毒性病毒株。關於弱毒性、中等毒性及強毒性NDV病毒株之論述，參見例如Newcastle Disease, Avian Paramyoxvirus-1 Infection, Goose Paramyoxvirus Infection, Ranikhet disease, the Center for Food Security & Public Health, Iowa State University, Institute for International Cooperation in Animal Biologics, College of Veterinary Medicine, Iowa State University，第1-9頁 (2016年1月)，其以引用的方式併入本文中。NDV病毒株之特定實例包括(但不限於) 73-T病毒株、NDV HUJ病毒株、Ulster病毒株(參見例如GenBank No. U25837)、MTH-68病毒株、意大利病毒株(Italien strain) (參見例如GenBank No. EU293914)、希克曼病毒株(Hickman strain) (參見例如Genbank No. AF309418)、PV701病毒株、Hitchner B1病毒株(參見例如GenBank No. AF309418或NC_002617)、La Sota病毒株(參見例如GenBank No. AY845400及JF950510.1及GI No. 56799463)、YG97病毒株(參見例如GenBank No. AY351959或AY390310)、MET95病毒株(參見例如GenBank No. AY143159)、洛克病毒株(Roakin strain) (參見例如GenBank No. AF124443)及F48E9病毒株(參見例如GenBank No. AF163440及U25837)。在一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為Hitchner B1病毒株。在另一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為如藉由GenBank No. AF309418或NC_002617鑑別之B1病毒株。在另一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為藉由ATCC No.VR2239鑑別之NDV。在另一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為La Sota病毒株。在一特定實施例中，La Sota基因組之核苷酸序列如SEQ ID NO: 50中所闡述。熟習此項技術者應瞭解NDV基因組RNA序列為編碼NDV基因組之cDNA序列之反向互補序列。因此，針對反向互補序列產生核苷酸序列之任何程式可用於將編碼NDV基因組之cDNA序列轉化成基因組RNA序列(參見例如www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html, www.fr33.net/seqedit.php及DNAStar)。
在特定實施例中，如藉由技術人員已知之技術評估，本文揭示之組合療法中使用之NDV在鳥類中為非病原性的。在某些特定實施例中，如藉由向1日齡雞顱內注射病毒以及疾病發展及死亡如評分8天所評估，組合療法中使用之NDV為非病原性的。在一些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV的顱內病原性指數小於0.7、小於0.6、小於0.5、小於0.4、小於0.3、小於0.2或小於0.1。在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV的顱內病原性指數為零。
在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為經基因工程改造，以便如藉由熟習此項技術者已知之技術評估，在鳥類未被視為病原性的中等毒性病毒株。在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為經基因工程改造，以便如藉由熟習此項技術者已知之技術評估，在鳥類未被視為病原性的強毒性病毒株。
在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV表現突變F蛋白質。在一特定實施例中，組合療法中使用之NDV表現突變F蛋白質，具有高促融性，且能夠形成融合細胞。在另一特定實施例中，突變F蛋白質併入至病毒粒子中。
在一個實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV的基因組經工程改造以表現具有突變裂解位點之突變F蛋白質。在一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV經工程改造以表現突變F蛋白質，其中F蛋白質之裂解位點經突變以產生多鹼基胺基酸序列，此允許蛋白質由細胞內蛋白酶裂解，使得病毒更有效地進入細胞及形成融合細胞。在另一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV經工程改造以表現突變F蛋白質，其中F蛋白質之裂解位點經含有一或兩個額外精胺酸殘基之裂解位點置換，此允許突變裂解位點由廣泛表現之弗林蛋白酶家族蛋白酶活化。表現此類突變F蛋白質之NDV之特定實例包括(但不限於) rNDV/F2aa及rNDV/F3aa。關於引入NDV F蛋白質中以產生具有突變裂解位點之突變F蛋白質之突變的描述，參見例如Park等人 (2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA 103: 8203-2808，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV經工程改造以表現具有胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A突變)之突變F蛋白質。關於L289A突變之描述，參見例如Sergel等人 (2000) A Single Amino Acid Change in the Newcastle Disease Virus Fusion Protein Alters the Requirement for HN Protein in Fusion. Journal of Virology 74(11): 5101-5107，其以全文引用的方式併入本文中。在特定實施例中，L289A突變F蛋白質在裂解位點中具有一個、兩個或三個精胺酸殘基。在一些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為LaSota病毒株，其經工程改造以表現具有胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A突變)的突變F蛋白質。在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為LaSota病毒株，其經工程改造以表現具有胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A突變)及具有LaSota病毒株F蛋白質裂解位點(GRQGRL(SEQ ID NO: 72))的突變F蛋白質。在一些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為以下中揭示之NDV：Kim等人，2017, PLOS ONE 12(3): e0173965及Kim等人，2016, J. of General Virology 97: 1297-1303，每一者以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中，突變F蛋白質來自與骨架NDV不同之NDV類型或病毒株。在某些實施例中，突變F蛋白質來自與骨架NDV相同之NDV病毒株。在一些實施例中，突變F蛋白質係除骨架NDV F蛋白質之外。在特定實施例中，突變F蛋白質替換骨架NDV F蛋白質。在一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV包含經工程改造以表現具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質的La Sota病毒株骨架。在一特定實施例中，La Sota病毒株基因組之核苷酸序列如SEQ ID NO: 50中所闡述。
在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV包含具有NDV LaSota病毒株或細胞巨大病毒(CMV)之醣蛋白B之F蛋白質裂解位點的突變F蛋白質。在一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV包含具有具以下序列修飾中之一者的F蛋白質裂解的突變F蛋白質：S116：111 H-N-R-T-K-S /F117 (SEQ ID NO: 56)；S116K：111 H-N- K -T-K-S/F117 (SEQ ID NO: 58)；S116m：111 H-N-R- M -K-S/F117 (SEQ ID NO: 69)；S116KM：111 H-N- K - M -S/F-I118 (SEQ ID NO: 70)；或R116：111 H-N-R-T-K- R /F-I118 (SEQ ID NO: 71)，諸如國際專利申請案第WO 2015/032755號中所述。關於可工程改造至NDV F蛋白質中之突變F蛋白質裂解位點之類型的描述，參見例如國際專利申請公開案第WO 2015/032755號，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，突變F蛋白質係除骨架NDV F蛋白質之外。在特定實施例中，突變F蛋白質替換骨架NDV F蛋白質。
在另一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為國際專利申請案第WO 2015/032755號中所述之經修飾之73T病毒株，該申請案以全文引用的方式併入本文中。在另一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為國際專利申請案第WO 2015/032755號中所述之r73T-R116病毒(具有F蛋白質裂解位點111 H-N-R-T-K-R/F-I118 (SEQ ID NO: 71)之r73T病毒株)，該申請案以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中，NDV包含60、102、144、198或318 nt長之HN及L基因間非編碼序列。
在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV經減弱，使得NDV至少部分仍具感染性，且可在活體內複製，但僅僅產生低力價，使得感染之亞臨床水準為非致命性的(參見例如Khattar等人，2009, J. Virol. 83:7779-7782)。此類減弱之NDV尤其適合於其中病毒投與個體以充當免疫原，例如活疫苗之實施例。病毒可藉由此項技術中已知之任何方法減弱。在一特定實施例中，NDV基因組包含為產生子代且使感染水準為亞臨床，減弱病毒進行感染及複製所需的序列。在一特定實施例中，NDV在人類細胞中為複製勝任的。
在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV不包含NDV V蛋白編碼序列。在其他實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV表現突變V蛋白。例如突變V蛋白參見例如Elankumaran等人，2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844，其以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之中等毒性或強毒性NDV病毒株表現突變V蛋白，諸如Elankumaran等人，2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844揭示。
在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為美國專利第7,442,379號、美國專利第6,451,323號、美國專利第6,146,642號、美國專利申請公開案第2014/0271677 A1號、國際專利申請公開案第WO 2014/0158811號或美國專利申請公開案第2016/0015760 A1號中所揭示之NDV，每一者以全文引用的方式併入本文中。在一特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為美國專利申請公開案第2014/0271677 A1號、國際專利申請公開案第WO 2014/0158811號或美國專利申請公開案第2016/0015760 A1號之章節5.1中所述之NDV，每一者以全文引用的方式併入本文中。在特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV經基因工程改造以編碼及表現異源肽或蛋白質。在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為熟習此項技術者已知之嵌合NDV，或本文揭示之嵌合NDV (參見例如下文章節5.2和/或章節6)。在某些實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為美國專利申請公開案第2012/0058141號、第2012/0122185號、第2016/0015760 A1號或第2014/0271677 A1號或國際專利申請公開案第WO 2014/158811號中所揭示之嵌合NDV，每一者以全文引用的方式併入本文中。在特定實施例中，本文揭示之組合療法中使用之NDV為包含經工程改造以表現諸如IL-12之細胞介素之基因組的嵌合NDV。5.2 嵌合新城雞瘟病毒
在一個態樣中，本文描述嵌合NDV，其包含有包含編碼IL-12或IL-12衍生物(參見例如章節5.2.1)之轉殖基因的包裝基因組。換言之，NDV充當「骨架」，經工程改造以編碼IL-12或IL-12衍生物，其在感染病毒之細胞中表現。在一特定實施例中，嵌合NDV包含IL-12或其衍生物。任何NDV類型或病毒株均可充當本文所述之嵌合NDV之骨架，包括(但不限於)天然存在之病毒株、變異體或突變體、誘變病毒、重配株及/或經基因工程改造之病毒。在一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為上文章節5.1中所述之NDV。在一特定實施例中，與非癌細胞相比，嵌合NDV優先在癌細胞中複製。在一特定實施例中，嵌合NDV經減弱，但仍然至少具部分感染性且可在活體內複製，但不致命且僅僅產生低力價之NDV子代，引起亞臨床水準之感染。在一特定實施例中，嵌合NDV基因組包含為產生子代且使感染水準為亞臨床，病毒進行感染及複製所需的序列。用於減弱NDV之技術為此項技術中已知，諸如基因組內之突變或取代及NDV V蛋白之修飾或缺失，且可用以減弱本文所述之嵌合NDV。在一特定實施例中，嵌合NDV在人類細胞中為複製勝任的。
在一特定態樣中，本文描述嵌合NDV，其包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，可在感染病毒之細胞中表現。在另一特定實施例中，本文描述嵌合NDV，其包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組及編碼突變F蛋白質之核苷酸序列。在特定實施例中，突變F蛋白質為高度促融的。在一特定實施例中，突變F蛋白質具有突變裂解位點(諸如本文描述)。在一些實施例中，突變F蛋白質包含胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A突變)。在一些實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列的包裝基因組，該突變F蛋白質具有胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A取代)。在某些實施例中，突變F蛋白質來自與骨架NDV不同之NDV類型或病毒株。在其他實施例中，突變F蛋白質來自與骨架NDV相同之NDV類型或病毒株。在特定實施例中，L289A突變F蛋白質在裂解位點中具有一個、兩個或三個精胺酸殘基。在一些實施例中，突變F蛋白質係除骨架NDV F蛋白質之外。在特定實施例中，突變F蛋白質替換骨架NDV F蛋白質。在特定實施例中，突變F蛋白質併入至病毒粒子中。在一特定實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列及包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因之核苷酸序列的包裝基因組，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV為弱毒性的。在一特定實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列及包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因之核苷酸序列的包裝基因組，其中編碼突變F蛋白質之核苷酸序列替換充當嵌合NDV之骨架之NDV的基因組之F蛋白質。在一特定實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列及包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因之核苷酸序列的包裝基因組，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV為La Sota病毒株。在另一特定實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼突變NDV F蛋白質之核苷酸序列及包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因之核苷酸序列的包裝基因組，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV為La Sota病毒株，其中編碼突變F蛋白質之核苷酸序列替換充當嵌合NDV之骨架之NDV的基因組之F蛋白質，且其中突變NDV F蛋白質具有胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A取代)。在另一特定實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼突變NDV F蛋白質之核苷酸序列及包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因之核苷酸序列的包裝基因組，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV為La Sota病毒株，其中編碼突變F蛋白質之核苷酸序列替換充當嵌合NDV之骨架之NDV的基因組之F蛋白質，且其中突變NDV F蛋白質具有胺基酸突變L289A (亦即在與LaSota F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A取代)及LaSota病毒株F蛋白質裂解位點(GRQGRL (SEQ ID NO: 72))。
在一些實施例中，本文描述嵌合NDV，其包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV為Kim等人，2017, PLOS ONE 12(3): e0173965及Kim等人，2016, J. of General Virology 97: 1297-1303中所揭示之NDV，各文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本文描述嵌合NDV，其包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV包含具有SEQ ID NO:50中所闡述之序列的基因組。在特定實施例中，本文描述一種包含包裝基因組之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO:50之核苷酸序列及編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因或由其組成。在特定實施例中，轉殖基因插入兩種NDV基因之轉錄單元(例如P轉錄單元與M轉錄單元)之間。
在一些實施例中，本文描述嵌合NDV，其包含有包含以下之包裝基因組：(i)編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因及(ii)編碼突變NDV V蛋白編碼序列之核苷酸序列，諸如Elankumaran等人，2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844所揭示。在其他實施例中，包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV不包含NDV V蛋白編碼序列。在某些實施例中，嵌合NDV之親本骨架為經工程改造以編碼突變V蛋白之中等毒性或強毒性NDV病毒株，諸如Elankumaran等人，2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844所揭示。
在某些實施例中，本文提供包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因及編碼突變F蛋白質之核苷酸序列之包裝基因組的嵌合NDV，其中該突變F蛋白質具有NDV LaSota病毒株或細胞巨大病毒(CMV)之醣蛋白B之F蛋白質裂解位點。在一特定實施例中，本文提供包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因及編碼突變F蛋白質之核苷酸序列之包裝基因組的嵌合NDV，其中該突變F蛋白質具有具以下序列之一的F蛋白質裂解：S116：111 H-N-R-T-K-S /F117 (SEQ ID NO: 56)；S116K：111 H-N- K -T-K-S/F117 (SEQ ID NO: 58)；S116m：111 H-N-R- M -K-S/F117 (SEQ ID NO: 69)；S116KM：111 H-N- K - M -S/F-I118 (SEQ ID NO: 70)；或R116：111 H-N-R-T-K- R /F-I118 (SEQ ID NO: 71)，諸如國際專利申請案第WO 2015/032755號中所述。關於可工程改造至NDV F蛋白質中之突變F蛋白質裂解位點之類型的描述，參見例如國際專利申請公開案第WO 2015/032755號，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，突變F蛋白質係除骨架NDV F蛋白質之外。在特定實施例中，突變F蛋白質替換骨架NDV F蛋白質。
在某些實施例中，本文提供包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV為國際專利申請案第WO 2015/032755號中所述之經修飾之73T病毒株，該專利申請案以全文引用的方式併入本文中。在另一特定實施例中，本文提供包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV，其中充當嵌合NDV之骨架之NDV為國際專利申請案第WO 2015/032755號中所述之r73T-R116病毒(具有F蛋白質裂解位點111 H-N-R-T-K-R/F-I118 (SEQ ID NO: 71)之r73T病毒株)，該專利申請案以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中，嵌合NDV包含60個、102個、144個、198個或318個核苷酸長之HN及L基因間非編碼序列。
在一特定實施例中，嵌合NDV為下文章節6中所述之嵌合NDV。在較佳實施例中，嵌合NDV為下文章節6中所述之NDV-huIL-12。在另一較佳實施例中，嵌合NDV包含具有SEQ ID NO:51中闡述之序列的基因組。在另一實施例中，嵌合NDV包含具有SEQ ID NO:52中闡述之序列的基因組。在另一較佳實施例中，嵌合NDV包含具有SEQ ID NO:60中闡述之序列的基因組。
在一特定實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:61中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:22中闡述之胺基酸序列，其中該IL-12包含信號肽。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:26中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:43中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:63中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:68中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:42中闡述之胺基酸序列，其中該IL-12包含信號肽。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:53中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO:66中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，在本文所述之分析(例如下文章節6中所述之分析)中包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV誘導IL-12p70、IFN-ɤ表現或IL-12p70與IFN-ɤ之表現。在另一特定實施例中，用包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV處理腫瘤樣品引起基因表現圖譜(GEP)相對於用該嵌合NDV處理之前的腫瘤樣品之GEP評分增加。關於GEP評分參見例如下文實例6.3。在另一特定實施例中，諸如下文章節6中所述，用包含有包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV處理腫瘤樣品使腫瘤樣品之GEP評分相對於用該嵌合NDV處理之前的腫瘤樣品之GEP評分增加，諸如下文章節6中所述。在一個實施例中，個體之腫瘤樣品的表15之18基因標籤之基因表現圖譜(GEP)評分小於-0.318。在另一實施例中，個體之腫瘤的表15之18基因標籤之基因表現圖譜(GEP)評分超過-0.318。不受任何理論束縛，咸信GEP評分增加將引起腫瘤更可能對用諸如派姆單抗之抗PD-1抗體(例如抗PD-1阻斷抗體)治療起反應。因此，在一特定實施例中，向癌症為用抗PD-1抗體(例如抗PD-1阻斷抗體，諸如派姆單抗，或章節5.5中所述之另一抗體)治療難治、復發或無反應的患者投與包含有包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV可引起患者變成對用抗PD-1抗體(例如抗PD-1阻斷抗體，諸如派姆單抗，或章節5.5中所述之另一抗體)治療起反應。詳言之，向癌症為用派姆單抗(KEYTRUDA®, Merck & Co., Inc. Kenilworth, NJ)治療難治、復發或無反應的患者投與包含有包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV可引起患者變成對用派姆單抗治療起反應。因此，在一個實施例中，本文提供一種增加患有癌症之個體中對抗PD-1療法之反應的方法。
在另一實施例中，本文描述嵌合NDV，其包含有包含以下之包裝基因組：(i)編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因，及(ii)編碼異源干擾素拮抗劑之轉殖基因。例如經工程改造以表現異源干擾素拮抗劑之嵌合NDV，參見例如美國專利申請公開案第2012-0058141號，其以引用的方式併入本文中。
干擾素拮抗劑可使用熟習此項技術者已知之任何技術，包括例如美國專利第6,635,416、第7,060,430號及第7,442,527號中所述之技術鑑別；各專利以全文引用的方式併入本文中。在一特定實施例中，異源干擾素拮抗劑為病毒蛋白。此類病毒蛋白可獲自或來源於任何病毒且該病毒可感染任何物種(例如病毒可感染人類或非人類哺乳動物)。示例性異源干擾素拮抗劑包括(但不限於)尼帕病毒(Nipah virus) W蛋白、尼帕V蛋白、埃博拉病毒(Ebola virus) VP35蛋白、痘瘡病毒E3L蛋白、流感病毒NS1蛋白、呼吸道融合病毒(RSV) NS2蛋白、單純疱疹病毒(HSV) 1型ICP34.5蛋白、C型肝炎病毒NS3-4蛋白酶、阻斷對先天免疫性之誘導或反應的顯性陰性細胞蛋白(例如STAT1、MyD88、IKK及TBK)及先天性免疫反應之細胞調節因子(例如SOCS蛋白、PIAS蛋白、CYLD蛋白、IkB蛋白、Atg5蛋白、Pin1蛋白、IRAK -M蛋白及UBP43)。關於異源干擾素拮抗劑之額外資訊，參見例如美國專利申請公開案第2012-0058141號，其以全文引用的方式併入本文中。
任何NDV類型或病毒株均可充當包含有經工程改造以編碼IL-12 (例如人類IL-12)及在某些實施例中編碼異源干擾素拮抗劑及/或突變F蛋白質之包裝基因組之嵌合NDV的骨架，包括(但不限於)天然存在之病毒株、變異體或突變體、誘變病毒、重配株及/或經基因工程改造之病毒。在一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為章節5.1中所述之NDV。在一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為天然存在之病毒株。在某些實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為溶解性病毒株。在其他實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為非溶解性病毒株。在某些實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為弱毒性病毒株。在一些實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為中等毒性病毒株。在其他實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為強毒性病毒株。NDV病毒株之特定實例包括(但不限於) 73-T病毒株、NDV HUJ病毒株、Ulster病毒株(參見例如GenBank No. U25837)、MTH-68病毒株、意大利病毒株(參見例如GenBank No. EU293914)、希克曼病毒株(參見例如Genbank No. AF309418)、PV701病毒株、Hitchner B1病毒株(參見例如GenBank No. AF309418或NC_002617)、La Sota病毒株(參見例如GenBank No. AY845400及JF950510.1及GI No. 56799463)、YG97病毒株(參見例如GenBank No. AY351959或AY390310)、MET95病毒株(參見例如GenBank No. AY143159)、洛克病毒株(參見例如GenBank No. AF124443)及F48E9病毒株(參見例如GenBank No. AF163440及U25837)。在一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為Hitchner B1病毒株。在另一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為如藉由GenBank No. AF309418或NC_002617鑑別之B1病毒株。在另一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為藉由ATCC No.VR2239鑑別之NDV。在另一特定實施例中，充當嵌合NDV進行基因工程改造之骨架的NDV為La Sota病毒株。
在某些實施例中，需要將嵌合NDV減弱或進一步減弱，以使得該嵌合NDV至少部分仍具感染性，且可在活體內複製，但僅僅產生低力價，使得感染之亞臨床水準為非致命性的(參見例如Khattar等人，2009, J. Virol. 83:7779-7782)。在一特定實施例中，嵌合NDV藉由V蛋白缺失而減弱。此類減弱之嵌合NDV尤其可適合於其中病毒投與個體以充當免疫原，例如活疫苗之實施例。病毒可藉由此項技術中已知之任何方法減弱。
在包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV之一特定實施例中，包裝基因組亦包含一或多種其他轉殖基因，諸如免疫細胞之抑制受體之拮抗劑、免疫細胞之共刺激受體之促效劑、其他細胞介素、腫瘤抗原、促細胞凋亡分子、抗細胞凋亡分子、自殺基因或異源干擾素拮抗劑。章節5.7 6.1中提供免疫細胞之抑制受體之非限制性實例。章節5.7 6.1中提供免疫細胞之共刺激受體之非限制性實例。細胞介素之非限制性實例包括IL-2 (例如Genbank寄存編號NM_000586.3及GI No. 125661059)、IL-7 (例如Genbank寄存編號NM_000880.3、NM_001199886.1、NM_001199887.1及NM_001199888.1以及GI No. 315467865、315467866、315467868及315467870)、IL-9 (例如Genbank寄存編號NM_000590.1及GI No. 10834979)、IL-15 (例如Genbank寄存編號NM_172175.2及NM_000585.4以及GI No. 323098328及323098327)、IL-17 (例如Genbank寄存編號NM_002190.2及GI No. 27477085)、IL-21 (例如Genbank寄存編號NM_021803.3及NM_001207006.2以及GI No. 365733583及365733582)、IL-22 (例如Genbank寄存編號NM_020525.4及GI No. 41393566)、IFN-γ (例如Genbank寄存編號NM_000619.2及GI No. 56786137)、GM-CSF (例如Genbank寄存編號M11220_1及GI No. 183363)及TNF-α (例如Genbank寄存編號NM_000594.3)。腫瘤抗原之非限制性實例包括MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶-V、p-15、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1 (gp75)、酪胺酸酶、週期蛋白依賴型激酶4、β-連環蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒-E6、人類乳頭狀瘤病毒E7、CD20、癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體、MUC-1、卡斯蛋白酶-8、CD5、黏蛋白-1、Lewisx、CA-125、p185HER2、IL-2R、Fap-α、肌腱蛋白、與金屬蛋白酶相關之抗原及CAMPATH-1。腫瘤抗原之其他實例包括(但不限於) KS 1/4泛癌瘤抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸磷酸鹽、前列腺特異性抗原、黑色素瘤相關抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特異性膜抗原、CEA、多形上皮黏蛋白抗原、乳脂球抗原、結腸直腸腫瘤相關之抗原(諸如CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1及LEA)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)抗原-38.13、CD19、B-淋巴瘤抗原-CD20、CD33、黑色素瘤特異性抗原(諸如神經節苷脂GD2、神經節苷脂GD3、神經節苷脂GM2、神經節苷脂GM3)、細胞表面抗原之腫瘤特異性移植類型(TSTA) (諸如病毒誘發之腫瘤抗原，包括T-抗原DNA腫瘤病毒及RNA腫瘤病毒之包膜抗原)、癌胚抗原-α-胎蛋白(諸如結腸之CEA)、膀胱腫瘤癌胚抗原、分化抗原(諸如人類肺癌抗原L6及L20)、纖維肉瘤抗原、白血病T細胞抗原-Gp37、擬醣蛋白、鞘脂、乳癌抗原(諸如EGFR (表皮生長因子受體)、HER2抗原(p185 HER2)及HER2 neu抗原決定基)、多形上皮黏蛋白(PEM)、惡性人類淋巴細胞抗原-APO-1、分化抗原(諸如在胎兒紅血球、原內胚層中發現之I抗原、在成年人紅血球、植入前胚胎中發現之I抗原、在胃腺癌中發現之I(Ma)、在乳腺上皮細胞中發現之M18、M39、在骨髓細胞中發現之SSEA-1、在結腸直腸癌中發現之VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22 、TRA-1-85 (血型H)、在結腸腺癌中發現之C14、在肺腺癌中發現之F3、在胃癌中發現之AH6、Y半抗原、在胚胎性癌瘤細胞中發現之Ley 、TL5 (血型A)、在A431細胞中發現之EGF受體、在胰臟癌中發現之E1系列(血型B)、在胚胎性癌瘤細胞中發現之FC10.2、胃腺癌抗原、在腺癌中發現之CO-514 (血型Lea)、在腺癌中發現之NS-10、CO-43 (血型Leb)、在A431細胞之EGF受體中發現之G49、在結腸腺癌中發現之MH2 (血型ALeb/Ley)、在結腸癌中發現之19.9、胃癌黏液素、在骨髓細胞中發現之T5A7、在黑色素瘤中發現之R24、在胚胎性瘤細胞中發現之4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2及M1:22:25:8以及在4至8細胞階段胚胎中發現之SSEA-3及SSEA-4)、來自皮膚T細胞淋巴瘤之T細胞受體衍生肽、C反應蛋白(CRP)、癌症抗原-50 (CA-50)、與乳癌相關之癌症抗原15-3 (CA15-3)、癌症抗原-19 (CA-19)及與胃腸道癌症相關之癌症抗原-242、癌瘤相關抗原(CAA)、染色顆粒素A、上皮黏蛋白抗原(MC5)、人類上皮細胞特異性抗原(E1A)、路易斯(a)抗原、黑色素瘤抗原、黑色素瘤相關抗原100、25及150、黏蛋白樣癌瘤相關抗原、多藥抗性相關蛋白(MRPm6)、多藥抗性相關蛋白(MRP41)、Neu致癌基因蛋白(C-erbB-2)、神經元特異性烯醇酶(NSE)、P-醣蛋白(mdr1基因產物)、多藥抗性相關抗原、p170、多藥抗性相關抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、CD56及NCAM。促細胞凋亡分子之非限制性實例包括Bax、Bak、Bad、BID、Bcl-xS、Bim、Noxa、Puma、AIF、FasL及TRAIL。抗細胞凋亡分子之非限制性實例包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1及XIAP。自殺基因之一非限制性實例包括胸苷激酶。
在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV包含包裝基因組，該包裝基因組包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因及以下轉殖基因中之一種、兩種、三種或更多種或所有：(1)免疫細胞之共刺激信號之促效劑；(2)免疫細胞之抑制信號之拮抗劑；(3)細胞介素；(4)腫瘤抗原；(5)異源干擾素拮抗劑；(6)促細胞凋亡分子；(7)抗細胞凋亡分子；及/或(8)自殺基因。另外，包裝基因組可包含編碼突變F蛋白質(諸如本文所述之突變F蛋白質)之核苷酸序列。在特定實施例中，除包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組及在某些實施例中包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列及/或編碼異源干擾素拮抗劑之核苷酸序列之包裝基因組以外，嵌合NDV之包裝基因組包含編碼自殺基因(例如胸苷激酶)或抑制NDV複製或功能之另一分子(使NDV對抗生素或抗病毒劑敏感之基因)之轉殖基因。在一些實施例中，在某些實施例中，除包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組及在某些實施例中包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列及/或編碼異源干擾素拮抗劑之核苷酸序列之包裝基因組以外，嵌合NDV之包裝基因組包含編碼組織特異性微RNA (miRNA)標靶位點(例如由miR-21、miR-184、miR-133a/133b、miR-137及/或miR-193a 微RNA靶向之位點)之核苷酸序列。在一些實施例中，包裝基因組不包含編碼miRNA標靶位點之核苷酸序列。
在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，其中該包裝基因組不編碼異源干擾素拮抗劑。
在某些實施例中，改變嵌合NDV之趨向性。在一特定實施例中，病毒之趨向性藉由修飾待由諸如基質金屬蛋白酶(MMP)及尿激酶之組織特異性或腫瘤特異性蛋白酶識別的F蛋白質裂解位點來改變。在其他實施例中，病毒之趨向性藉由引入組織特異性miRNA標靶位點來改變。在某些實施例中，NDV HN蛋白經突變以識別腫瘤特異性受體。
在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，其中本文所述之嵌合NDV之包裝基因組不包含其他轉殖基因。在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV之包裝基因組不包含編碼異源干擾素拮抗劑之轉殖基因。在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV之包裝基因組不包含編碼以下中之一種、兩種或更多種或全部的轉殖基因：(1)編碼除IL-12外之一或多種細胞介素的轉殖基因；(2)編碼一或多種腫瘤抗原之轉殖基因；(3)編碼一或多種抗細胞凋亡分子之轉殖基因；(4)編碼自殺基因之轉殖基因；(5)編碼免疫細胞之共刺激信號之促效劑的轉殖基因；(6)編碼免疫細胞之抑制信號之一或多種拮抗劑的轉殖基因；或(7)編碼一或多種促細胞凋亡分子之轉殖基因。
在某些實施例中，嵌合NDV之基因組不包含編碼除IL-12或其衍生物(例如人類IL-12)外之異源蛋白的異源序列。在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV包含包裝基因組，其中該基因組包含在NDV中發現之基因及編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因。在一些實施例中，本文所述之嵌合NDV包含包裝基因組，其中該基因組包含在NDV中發現之基因及編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因，但不包括任何其他轉殖基因。
在特定實施例中，嵌合NDV之基因組不包含編碼除IL-12或其衍生物外之異源蛋白的異源序列及突變NDV F蛋白質，其中該突變NDV F蛋白質替換天然存在之NDV F蛋白質。在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV包含包裝基因組，其中該基因組包含：(1)在NDV中發現之除NDV F蛋白質外之基因；(2)編碼IL-12或其衍生物(例如人類IL-12)之轉殖基因；及(3)諸如本文所述之突變NDV F蛋白質，其替換NDV F蛋白質。在一些實施例中，本文所述之嵌合NDV包含包裝基因組，其中該基因組包含(1)在NDV中發現之除NDV F蛋白質外之基因；(2)編碼IL-12或其衍生物(例如人類IL-12)之轉殖基因；及(3)諸如本文所述之突變NDV F蛋白質，其替換NDV F蛋白質，但不包括任何其他轉殖基因。
在某些實施例中，以下中之一或多者由嵌合NDV在細胞中表現為嵌合蛋白或融合蛋白：(1) IL-12或其衍生物；(2)異源干擾素拮抗劑；及/或(3)突變F蛋白質。在特定實施例中，IL-12或其衍生物由嵌合NDV在細胞中表現為嵌合蛋白或融合蛋白。在特定實施例中，突變F蛋白質由嵌合NDV表現為嵌合蛋白或融合蛋白。在特定實施例中，嵌合蛋白或融合蛋白包含NDV F或NDV HN蛋白之跨膜及細胞質域或其片段及包含前一句中提及之分子之一的細胞外域。關於此類嵌合蛋白或融合蛋白之描述，參見美國專利申請案第2012-0122185號及國際申請公開案第WO 2007/064802號，各者以引用的方式併入本文中。
在本文中之實施例中，編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因可插入至骨架NDV之基因組中兩種轉錄單元之間。在一特定實施例中，編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因插入至骨架NDV之基因組中M轉錄單元與P轉錄單元之間或HN轉錄單元與L轉錄單元之間。根據本文中之其他實施例，本文所述之一或多種其他轉殖基因或核苷酸序列，諸如編碼異源干擾素拮抗劑及/或突變F蛋白質之轉殖基因或核苷酸序列，可插入至骨架NDV之基因組中兩種或更多種轉錄單元之間(例如M轉錄單元與P轉錄單元之間或HN轉錄單元與L轉錄單元之間)。
在一些實施例中，嵌合NDV為美國專利申請公開案第2014/0271677 A1號或第2016/0015760 A1號或國際專利申請公開案第WO 2014/158811號之章節5.2中所述之NDV，各者以全文引用的方式併入本文中。5.2.1 IL-12
在一個態樣中，本文提供一種包含包裝基因組之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含編碼IL-12或其衍生物(例如人類IL-12)之轉殖基因。嵌合NDV可單獨或與一或多種其他療法，諸如PD-1或其配位體之拮抗劑組合用於治療癌症。
在另一態樣中，本文呈現用於治療癌症之方法，其利用嵌合NDV或包含該嵌合NDV之組合物與PD-1或其配位體之拮抗劑或包含此類拮抗劑之組合物組合，其中該嵌合NDV包含有包含編碼介白素-12 (「IL-12」)(例如IL-12之p35及p40次單元)或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組。在特定實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 p35次單元或其衍生物之第一轉殖基因及編碼IL-12 p40次單元或其衍生物之第二轉殖基因的包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。在特定實施例中，拮抗劑為PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)。在一些實施例中，拮抗劑為PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)。
在另一態樣中，本文呈現一種用於治療個體(例如人類個體)之癌症之方法中的嵌合NDV或包含嵌合NDV之組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如IL-12之p35及p40次單元)或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，且其中該方法進一步包含投與PD-1或其配位體之拮抗劑或包含此類拮抗劑之組合物。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。在特定實施例中，拮抗劑為PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)。在一些實施例中，拮抗劑為PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)。
由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中的轉殖基因編碼之IL-12或其衍生物可為熟習此項技術者已知之任何IL-12。在某些實施例中，IL-12或其衍生物為人類、犬、貓、馬、豬或牛IL-12或其衍生物。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物為人類IL-12或其衍生物。典型IL-12由熟習此項技術者已知之由兩種獨立基因IL-12A (p35次單元)及IL-12B (p40次單元)編碼之雜二聚體組成。GenBank™寄存編號NM_000882.3 (GI編號325974478)提供一種示例性人類IL-12A核酸序列。GenBank™寄存編號NM_002187.2 (GI編號24497437)提供一種示例性人類IL-12B核酸序列。GenBank™寄存編號NP_000873.2 (GI編號24430219)提供一種示例性人類IL-12A (p35次單元)胺基酸序列。GenBank™寄存編號NP_002178.2 (GI編號24497438)提供一種示例性人類IL-12B (p40次單元)胺基酸序列。在某些實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼之IL-12或其衍生物由包含視情況由連接子序列分開之IL-12 p35次單元(亦稱為「IL-12A」)或其衍生物及IL-12 p40次單元(亦稱為「IL-12B」)或其衍生物的單一多肽鏈組成。在某些實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼的IL-12或其衍生物由兩條多肽鏈組成：(i)包含IL-12 p35次單元或其衍生物之第一多肽；及(ii)包含IL-12 p40次單元或其衍生物之第二多肽。在某些實施例中，編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因包含編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列及編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列，其中該編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列與編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列由內部核糖體進入位點分開。SEQ ID NO: 29、55及65提供編碼IL-12 p35次單元之示例性核苷酸序列。SEQ ID NO: 27、54、57、59及64提供編碼IL-12 p40次單元之示例性核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12包含分別在SEQ ID NO: 41及38中闡述之p35及p40次單元序列。在另一特定實施例中，IL-12包含SEQ ID NO: 25及38中闡述之p35及p40次單元序列。在較佳實施例中，IL-12包含章節6中提供之p35及p40次單元序列，例如分別SEQ ID NO: 25及23，或分別SEQ ID NO: 41及40。在一特定實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼的IL-12由包含SEQ ID NO: 43中闡述之胺基酸序列之單一多肽鏈組成。在一特定實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼的IL-12由包含SEQ ID NO: 42中闡述之胺基酸序列之單一多肽鏈組成。在一特定實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼的IL-12由包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列之單一多肽鏈組成。在較佳實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼的IL-12由包含章節6中提供之例如SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之單一多肽鏈組成。在一特定實施例中，轉殖基因之核苷酸序列如SEQ ID NO: 26、53、61、63、66或68中所闡述。在一特定實施例中，轉殖基因之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 26、53、61、63、66或68中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元或其衍生物直接彼此融合。在特定實施例中，包含直接彼此融合之IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元或其衍生物的多肽具有功能性(例如能夠特異性結合於IL-12受體及誘導IL-12介導之信號轉導及/或IL-12介導之免疫功能)。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元或其衍生物使用一或多種連接子間接彼此融合。適合於製備IL-12 p35次單元/p40次單元融合蛋白之連接子可包含一或多種胺基酸(例如肽)。在特定實施例中，包含使用胺基酸連接子(例如肽連接子)間接彼此融合之IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元或其衍生物的多肽具有功能性(例如能夠特異性結合於IL-12受體及誘導IL-12介導之信號轉導及/或IL-12介導之免疫功能)。在一特定實施例中，連接子足夠長以保持IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元或其衍生物形成功能性IL-12雜二聚體複合物之能力，該複合物能夠結合於IL-12受體且誘導IL-12介導之信號轉導。在一些實施例中，連接子為1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個胺基酸長之胺基酸序列(例如肽)。在一些實施例中，連接子為長度介於5個與20個或5個與15個胺基酸之間的胺基酸序列(例如肽)。在某些實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中的轉殖基因編碼之IL-12或其衍生物由超過一條多肽鏈呈四級締合，例如包含IL-12 p35次單元或其衍生物之多肽鏈與包含IL-12 p40次單元或其衍生物之多肽鏈呈四級締合組成。在某些實施例中，連接子為SEQ ID NO: 24中闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，連接子為SEQ ID NO: 46中闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，連接子為SEQ ID NO: 47中闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，連接子為SEQ ID NO: 48中闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，連接子為SEQ ID NO: 49中闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，連接子為彈性蛋白樣多肽序列。在某些實施例中，彈性蛋白樣多肽序列包含胺基酸序列VPGXG (SEQ ID NO:44)，其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸。在某些實施例中，彈性蛋白樣多肽序列包含胺基酸序列VPGXGVPGXG (SEQ ID NO:45)，其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸。在某些實施例中，連接子可為美國專利第5,891,680號中所述之連接子，其以全文引用的方式併入本文中。
在一特定實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中的轉殖基因編碼之IL-12包含表7中闡述之序列之胺基酸序列。在另一特定實施例中，由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中的轉殖基因編碼之IL-12由表7中闡述之胺基酸序列組成。在一特定實施例中，本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中編碼IL-12之轉殖基因包含表8中闡述之序列之胺基酸序列。在一特定實施例中，本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中編碼IL-12之轉殖基因由表8中闡述之序列之核苷酸序列組成。
在一特定實施例中，本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中編碼IL-12之衍生物之轉殖基因為熟習此項技術者已知之任何IL-12之衍生物。在一特定實施例中，IL-12衍生物與熟習此項技術者已知之IL-12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、98%或99%胺基酸序列一致性。在一特定實施例中，IL-12衍生物包含已知之IL-12之缺失形式，其中已知之IL-12缺失多達約20個、15個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基。本發明亦提供包含已知之IL-12之缺失形式的IL-12衍生物，其中已知之IL-12缺失約1-3個、3-5個、5-7個、7-10個、10-15個或15-20個胺基酸殘基。本文進一步提供包含已知之IL-12之改變形式的IL-12衍生物，其中已知之IL-12之多達20個、15個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基經其他胺基酸取代(例如保守取代)。在一些實施例中，IL-12衍生物包含多達約20個、15個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個1個經保守取代之胺基酸(參見例如Huang等人，2016, Preclinical validation:LV/IL-12 transduction of patient leukemia cells for immunotherapy of AML, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 3, 16074; doi:10.1038/mtm.2016.74，其以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，經保守取代之胺基酸未凸出在細胞介素/受體界面中(參見例如Huang等人，2016, Preclinical validation:LV/IL-12 transduction of patient leukemia cells for immunotherapy of AML, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 3, 16074; doi:10.1038/mtm.2016.74；Jones & Vignali, 2011, Molecular Interactions within the IL-6/IL-12 cytokine/receptor superfamily, Immunol Res., 51(1):5-14, doi:10.1007/s12026-011-8209-y，各者以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，IL-12衍生物包含具有胺基酸取代L165S (亦即IL-12衍生物中之IL-12 p35次單元之位置165處的白胺酸經絲胺酸取代)之IL-12 p35次單元。在一些實施例中，IL-12衍生物包含具有胺基酸取代C2G (亦即IL-12衍生物中不成熟IL-12 p40次單元(亦即含有信號肽之IL-12 p40次單元)之位置2處的半胱胺酸經甘胺酸取代)之IL-12 p40次單元。
在一特定實施例中，IL-12衍生物與天然IL-12至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致(例如序列一致性)。在另一特定實施例中，IL-12衍生物為由與編碼天然IL-12之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致(例如序列一致性)之核酸序列編碼的多肽。在一特定實施例中，IL-12衍生物包含與天然IL-12 p35次單元至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致(例如序列一致性)的IL-12 p35次單元。在另一特定實施例中，IL-12衍生物為由核酸序列編碼之多肽，其中核酸序列之一部分編碼IL-12 p35次單元，其中該部分之該核酸序列與編碼天然IL-12 p35次單元之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致(例如序列一致性)。在一特定實施例中，IL-12衍生物包含與天然IL-12 p40次單元至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致(例如序列一致性)的IL-12 p40次單元。在另一特定實施例中，IL-12衍生物為由核酸序列編碼之多肽，其中核酸序列之一部分編碼IL-12 p40次單元，其中該部分之該核酸序列與編碼天然IL-12 p40次單元之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或80%至85%、80%至90%、80%至95%、90%至95%、85%至99%或95%至99%一致(例如序列一致性)。在另一特定實施例中，IL-12衍生物含有相對於天然IL-12，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個或者2至5個、2至10個、5至10個、5至15個、5至20個、10至15個或15至20個胺基酸突變(亦即添加、缺失及/或取代)。在另一特定實施例中，IL-12衍生物為由可在高、中等或典型嚴格度雜交條件下與編碼天然IL-12之核酸序列雜交的核酸序列編碼之多肽。在另一特定實施例中，IL-12衍生物為由可在高、中等或典型嚴格度雜交條件下與編碼具有至少10個相鄰胺基酸、至少12個相鄰胺基酸、至少15個相鄰胺基酸、至少20個相鄰胺基酸、至少30個相鄰胺基酸、至少40個相鄰胺基酸、至少50個相鄰胺基酸、至少75個相鄰胺基酸、至少100個相鄰胺基酸、至少125個相鄰胺基酸、至少150個相鄰胺基酸或者10至20個、20至50個、25至75個、25至100個、25至150個、50至75個、50至100個、75至100個、50至150個、75至150個、100至150個或100至200個相鄰胺基酸之天然IL-12之片段的核酸序列雜交的核酸序列編碼之多肽。在另一特定實施例中，IL-12衍生物為天然IL-12之片段。在另一特定實施例中，IL-12衍生物包含由在全長上與編碼天然次單元(例如天然p40次單元或天然p35次單元)之核苷酸雜交之核苷酸序列編碼的次單元(例如p35或p40)。在一特定實施例中，IL-12衍生物包含天然IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元之衍生物。在一特定實施例中，IL-12衍生物包含天然IL-12 p35次單元及IL-12 p40次單元之衍生物。IL-12衍生物亦包括包含天然存在之IL-12之成熟形式的胺基酸序列及異源信號肽胺基酸序列的多肽。另外，IL-12衍生物包括已藉由例如糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/封端基團衍生化、蛋白質裂解、連接於細胞配位體或其他蛋白質部分等進行化學修飾的多肽。此外，IL-12衍生物包括包含一或多個非經典胺基酸之多肽。在特定實施例中，IL-12衍生物保留其源自之天然IL-12的一種、兩種或更多種或所有功能。熟習此項技術者已知用於確定IL-12衍生物是否保留其源自之天然IL-12之一或多種功能的測試且本文提供實例。
在特定實施例中，本文所述之嵌合NDV之包裝基因組中的編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因進行密碼子優化。在一特定實施例中，編碼天然IL-12之一或兩個次單元之核苷酸序列可進行密碼子優化。編碼IL-12 p35或其衍生物之經密碼子優化之序列的一個非限制性實例包括SEQ ID NO:55。編碼IL-12 p40或其衍生物之經密碼子優化之序列的非限制性實例包括SEQ ID NO:54及59。密碼子優化之方法為此項技術中已知的，例如OptimumGene™ (GenScript®)方案及美國專利第8,326,547號，其以全文引用的方式併入本文中。5.3 NDV 之構築
本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及6)可使用反向遺傳學技術產生。反向遺傳學技術涉及製備含有反義鏈病毒RNA之非編碼區的合成重組病毒RNA，該等病毒RNA對於由病毒聚合酶識別及包裝產生成熟病毒粒子所需之信號而言為不可或缺的。重組RNA由重組DNA模板合成且在活體外與經純化之病毒聚合酶複合物重組以形成可用於轉染細胞之重組核糖核蛋白(RNP)。若在活體外或活體內在合成RNA之轉錄期間存在病毒聚合酶蛋白質，則實現更有效之轉染。合成重組RNP可在感染性病毒粒子中進行救援。上述技術描述於以下中：1992年11月24日頒予之美國專利第5,166,057號；1998年12月29日頒予之美國專利第5,854,037號；2000年11月14日頒予之美國專利第6,146,642號；1996年2月20日公開之歐洲專利公開案EP 0702085A1；美國專利申請案第09/152,845號；1997年4月3日公開之國際專利公開案PCT WO97/12032；1996年11月7日公開之WO96/34625；歐洲專利公開案EP A780475；1999年1月21日公開之WO 99/02657；1998年11月26日公開之WO 98/53078；1998年1月22日公開之WO 98/02530；1999年4月1日公開之WO 99/15672；1998年4月2日公開之WO 98/13501；1997年2月20日公開之WO 97/06270；以及1997年6月25日公開之EPO 780 475A1，各者以全文引用的方式併入本文中。
無輔助病毒之質體技術亦可用於工程改造本文所述之NDV。簡言之，構築NDV (例如Hitchner B1病毒株)之完整cDNA，插入至質體載體中且經工程改造以在兩個轉錄單元(例如NDV P及M基因；或NDV HN及L基因)之間含有獨特限制位點。編碼異源胺基酸序列之核苷酸序列(例如IL-12轉殖基因或其他序列，諸如編碼共刺激信號之促效劑及/或免疫細胞之抑制信號之拮抗劑的核苷酸序列)可在獨特限制位點處插入至病毒基因組中。可替代地，編碼異源胺基酸序列之核苷酸序列(例如IL-12轉殖基因或其他序列，諸如編碼共刺激信號之促效劑及/或免疫細胞之抑制信號之拮抗劑的核苷酸序列)可工程改造至NDV轉錄單元中，只要該插入不影響病毒感染及複製之能力即可。單一區段位於T7啟動子與肝炎δ病毒核糖核酸酶之間以自T7聚合酶產生準確的陰性或陽性轉錄物。包含所需病毒蛋白之質體載體及表現載體經轉染至細胞中，產生重組病毒粒子(參見例如國際公開案第WO 01/04333號；美國專利第7,442,379號、第6,146,642號、第6,649,372號、第6,544,785號及第7,384,774號；Swayne等人 (2003). Avian Dis. 47:1047-1050；以及Swayne等人(2001). J. Virol. 11868-11873，各者以全文引用的方式併入本文中)。
用於產生表現抗體之嵌合NDV的技術為此項技術中已知的。關於自兩種轉殖基因產生表現完全IgG之重組NDV，參見例如Puhler等人，Gene Ther. 15(5): 371-283 (2008)。
自單一mRNA產生多種蛋白質之雙順反子技術為熟習此項技術者已知。雙順反子技術允許多種蛋白質之編碼序列經由使用IRES序列工程改造成單一mRNA。IRES序列指導核糖體內部募集至RNA分子且允許以非帽依賴性方式進行下游轉譯。簡言之，一種蛋白質之編碼區插入第二蛋白質之ORF之下游。插入側接IRES及適當表現及/或功能所需之任何非轉譯信號序列。插入不能破壞第二蛋白質之開放閱讀框、聚腺苷酸化或轉錄啟動子(參見例如García-Sastre等人，1994, J. Virol. 68:6254-6261及García-Sastre等人，1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246，各者以全文引用的方式併入本文中)。
熟習此項技術者已知用於選殖嵌合NDV以編碼轉殖基因及表現由轉殖基因編碼之異源蛋白質(例如IL-12)的方法，諸如轉殖基因插入已工程改造至NDV基因組中之限制位點中；在轉殖基因中包括用於由NDVRNA依賴性RNA聚合酶識別的適當信號(例如允許NDV聚合酶識別可例如由單核苷酸基因間序列分開的先前基因之末端與轉殖基因之開始的位於轉殖基因之開放閱讀框上游之序列)；包括有效Kozak序列(例如以改善真核核糖體轉譯)；併入滿足「六的倍數規則」以選殖NDV的轉殖基因；以及包括沉默突變以移除轉殖基因內的額外基因末端及/或基因開始序列。關於六的倍數規則，熟習此項技術者應瞭解NDV (及更一般而言，副黏病毒科之大部分成員)之有效複製視基因組長度為多個六而定，稱為「六的倍數規則」(參見例如Calain, P.及Roux, L. The rule of six, a basic feature of efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993))。因此，當構築本文所述之嵌合NDV時，應注意滿足「六的倍數規則」用於選殖NDV。可使用熟習此項技術者已知之滿足六的倍數規則用於選殖NDV的方法，諸如在轉殖基因下游添加核苷酸。關於用於選殖及救援NDV (例如嵌合NDV)之方法的論述參見例如Ayllon等人，Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013)，其以全文引用的方式併入本文中。
在一特定實施例中，可根據章節6中所述之方法產生本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及6)。
在一特定實施例中，本文所述的包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV包含La Sota病毒株骨架。在一特定實施例中，La Sota病毒株骨架之基因組序列(亦即不具有轉殖基因)如SEQ ID NO:50中所闡述。在一特定實施例中，嵌合NDV包含有包含SEQ ID No:51、52或60中闡述之核苷酸序列的包裝基因組。在一特定實施例中，嵌合NDV包含具有SEQ ID No: 51、52或60中闡述之核苷酸序列的包裝基因組。在一些實施例中，包含表10中之序列中闡述之核苷酸序列的質體用於產生嵌合NDV。在特定實施例中，具有表10中之序列中闡述之核苷酸序列的質體用於產生嵌合NDV。關於可以用於使用此類質體產生嵌合NDV之技術，參見例如下文章節6。5.4 NDVS 之繁殖
本文所述之NDV (例如嵌合NDV；亦參見例如章節5.1、5.2及6)可在容許病毒生長至允許本文所述之病毒之使用的力價的任何基質中繁殖。在一個實施例中，基質允許本文所述之NDV (例如嵌合NDV)生長至與針對對應野生型病毒所測定之力價相當的力價。
本文所述之NDV (例如嵌合NDV；亦參見例如章節5.1、5.2及6)可在易感染病毒之細胞(例如禽類細胞、雞細胞等)、受精蛋(例如雞蛋或鵪鶉蛋)或動物(例如鳥類)中生長。此類方法為熟習此項技術者所熟知。在一特定實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)可在癌細胞，例如癌瘤細胞(例如乳癌細胞及前列腺癌細胞)、肉瘤細胞、白血病細胞、淋巴瘤細胞及生殖細胞腫瘤細胞(例如睪丸癌細胞及卵巢癌細胞)中繁殖。在另一特定實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)可在細胞株，例如癌細胞株，諸如HeLa細胞、MCF7細胞、THP-1細胞、U87細胞、DU145細胞、Lncap細胞及T47D細胞內繁殖。在某些實施例中，細胞或細胞株(例如癌細胞或癌細胞株)獲自及/或來源於人類。在另一實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)在雞細胞或受精蛋中繁殖。代表性雞細胞包括(但不限於)雞胚纖維母細胞及雞胚腎細胞。在一特定實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)在Vero細胞中繁殖。在另一特定實施例中，根據下文章節6中所述之方法，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)在癌細胞中。在另一特定實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)在雞蛋或鵪鶉蛋中繁殖。在某些實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)首先在受精蛋中繁殖，且接著在細胞(例如細胞株)中繁殖。
本文所述之NDV (例如嵌合NDV)可在例如6至14日齡、6至12日齡、6至10日齡、6至9日齡、6至8日齡、8至10日齡或10至12日齡之受精蛋中繁殖。幼齡或不成熟受精蛋可用於繁殖本文所述之NDV (例如嵌合NDV)。不成熟受精蛋涵蓋小於十日齡蛋、例如缺乏IFN之6至9日齡或6至8日齡蛋的蛋。不成熟受精蛋亦涵蓋由於以下而人工模擬不成熟蛋至多但小於十日齡之蛋：改變生長條件，例如變化培育溫度；用藥物處理；或產生發育延遲之蛋，使得IFN系統與十至十二日齡蛋相比未完全發育的任何其他改變。在一特定實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)在10日齡之受精雞蛋中繁殖。本文所述之NDV (例如嵌合NDV)可在受精蛋之不同位置，例如尿囊腔中繁殖。關於生長及繁殖病毒之詳細論述，參見例如美國專利第6,852,522號及美國專利第7,494,808號，兩者以全文引用的方式併入本文中。
在一特定實施例中，本文提供一種用於繁殖本文所述之NDV (例如本文所述之嵌合NDV)之方法，該方法包含培養感染NDV之基質(例如細胞株或受精蛋)。在另一特定實施例中，本文提供一種用於繁殖本文所述之NDV (例如本文所述之嵌合NDV)之方法，該方法包含：(a)培養感染NDV之基質(例如細胞株或受精蛋)；以及(b)自基質分離或純化NDV。在某些實施例中，此等方法包括在培養基質前用NDV感染基質。關於可用於繁殖本文所述之NDV (例如本文所述之嵌合NDV)的方法，參見例如下文章節6。
對於病毒分離，可通常藉由熟知之淨化程序，例如離心、深過濾及微過濾，自受精蛋或細胞培養物移除本文所述之NDV (例如嵌合NDV)且自細胞組分分離，且可視需要使用熟習此項技術者熟知之程序，例如切向流過濾(TFF)、密度梯度離心、差異提取或層析法進一步純化。
在一特定實施例中，自感染蛋(例如雞蛋)之尿囊液分離病毒開始於收穫尿囊液，使用過濾系統(包含例如1.2 µm玻璃纖維終端過濾)淨化以移除細胞及其他大量碎片，特別包含具有淨正電荷以使得宿主細胞DNA實現可量測之減少的膜。隨後藉由切向流過濾，例如藉由使用750 kD空心纖維膜處理經淨化之塊狀物，使經淨化之塊狀物濃縮大約五倍。接著抵靠四透濾體積之高鹽緩衝液，接著四透濾體積之低鹽調配物緩衝液透濾經濃縮淨化之塊狀物，且隨後濃縮大約10倍。因此，殘餘卵蛋白，例如主要卵白蛋白，及殘餘DNA減少至可接受之水準，且更換緩衝液至與用於投與個體之組合物的嵌合NDV之調配相容的緩衝液。接著所得產物經由過濾器，例如0.2 µm過濾器無菌過濾，分配至適當無菌儲存容器中，冷凍，且儲存於-70℃下。
在一特定實施例中，本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及6)根據章節6中所述之方法繁殖、分離及/或純化。在一特定實施例中，本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及6)使用章節6中所述之方法繁殖、分離或純化，或上述任兩種或所有。5.5 PD-1 或其配位體之拮抗劑
本文亦提供PD-1或其配位體之拮抗劑，其與本文所述之NDV (參見例如章節5.1、章節5.2、章節5.5、章節5.7及/或章節6)組合使用。熟習此項技術者已知之PD-1或其配位體之任何拮抗劑可用於本文所述之方法(參見例如章節5.5、章節5.7及/或章節6)中。PD-1之配位體之特定實例包括PD-L1及PD-L2。
在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為特異性結合於PD-1之配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之抗體(或抗原結合片段)或可溶性受體。在一特定實施例中，拮抗劑阻斷PD-1之配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)結合於PD-1及轉導抑制信號。在某些實施例中，可溶性受體為結合於PD-1之配位體的PD-1之片段或PD-1之衍生物之片段(例如PD-1或PD-1之衍生物的細胞外域)。在一些實施例中，可溶性受體為包含PD-1或PD-1之衍生物之至少一部分(例如PD-1或PD-1之衍生物之細胞外域)及異源胺基酸序列的融合蛋白。在特定實施例中，該融合蛋白包含PD-1或PD-1之衍生物之至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。
在特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1之配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)的抗體(或抗原結合片段)。在一特定實施例中，拮抗劑阻斷(完全或部分) PD-1之配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)與PD-1相互作用及轉導抑制信號。在某些特定實施例中，抗體為單株抗體。在一些特定實施例中，抗體為scFv。在某些特定實施例中，抗體為駱駝化抗體。在特定實施例中，抗體為人類或人類化抗體。結合於PD-1之配位體之抗體的非限制性實例包括德瓦魯單抗(亦稱為「medi-4736」；參見例如Lutzky等人，J Clin Oncol. 2014;32(增刊5S):abstr 3001)、阿維魯單抗(例如用於梅克爾細胞癌) (亦稱為「MSB0010718C」；參見例如Heery等人 J Clin Oncol. 2014;32(增刊5S):abstr 3064)、bms-936559 (參見例如Brahmer等人 N. Engl. J. Med. 2012;366, 2455-2465)及阿特珠單抗(亦稱為「mpdl3280A」或「TECENTRIQ®」；參見例如McDermott等人，J Clin Oncol. 2016; 34(8):833-842；Herbst等人，J Clin Oncol. 2013;31(增刊):abstr 3000；及Full Prescribing Information for TECENTRIQ，參考ID: 3933242)。
在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1之配位體(例如PD-L1或PD-L2)之抗體的一特定實施例中，抗體為PD-1配位體阻斷抗體。在一特定實施例中，抗PD-1配位體抗體(例如抗PD-L1或抗PD-L2抗體)特異性結合於PD-1配位體(例如PD-L1或PD-L2)。在一特定實施例中，PD-1配位體為人類PD-L1。在另一特定實施例中，PD-1配位體為人類PD-L2。在一特定實施例中，抗PD-L1或抗PD-L2抗體分別抑制或減少PD-L1或PD-L2與PD-1之間的相互作用。在一特定實施例中，抗PD-L1或抗PD-L2抗體為如下抗體，其分別結合於PD-L1或PD-L2，且分別阻斷(完全或部分)PD-L1或PD-L2與PD-1之間的相互作用，由此釋放PD-1路徑介導之對包括抗腫瘤反應之免疫反應的抑制。在一特定實施例中，完全阻斷PD-L1或PD-L2與PD-1之間的相互作用。在一特定實施例中，阻斷PD-L1或PD-L2與PD-1之間的相互作用係指如藉由熟習此項技術者已知之任何方法，諸如共免疫沈澱或共定位分析評估，分別與在陰性對照療法(例如抗IgG抗體)存在下PD-L1或PD-L2與PD-1之間的相互作用相比，PD-L1或PD-L2與PD-1之間的相互作用至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%阻斷。在一特定實施例中，抗PD-L1或抗PD-L2抗體分別抑制或減少PD-L1或PD-L2依賴性PD-1活化。在一特定實施例中，完全抑制配位體依賴性活化。在一特定實施例中，抑制配位體依賴性活化係指如藉由熟習此項技術者已知之任何方法，諸如磷酸化分析評估，與在陰性對照療法(例如抗IgG抗體)存在下配位體依賴性PD-1活化相比，配位體依賴性活化至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%抑制。
在一些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-L1、阻斷(完全或部分) PD-L1與PD-1之間的相互作用且阻斷(完全或部分)PD-L1與CD80 (B7.1)之間的相互作用的抗體。在某些實施例中，抗體為IgG1單株抗體。在一特定實施例中，抗體為德瓦魯單抗。
在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1 (例如人類PD-1)但如藉由本文所述或熟習此項技術者已知之技術所量測，不轉導抑制信號之抗體或配位體。在一特定實施例中，抗體或配位體結合於人類PD-1。在特定實施例中，抗體或配位體特異性結合於PD-1 (例如人類PD-1)。在某些特定實施例中，抗體為單株抗體。在一些特定實施例中，抗體為scFv。在某些特定實施例中，抗體為駱駝化抗體。在特定實施例中，抗體為人類或人類化抗體。結合於PD-1之抗體之非限制性實例包括派姆單抗(「KEYTRUDA®」；參見例如Hamid等人，N Engl J Med. 2013;369:134-44及Full Prescribing Information for KEYTRUDA，參考ID: 3862712)、納武單抗(「OPDIVO®」；參見例如Topalian等人，N Engl J Med. 2012;366:2443-54及Full Prescribing Information for OPDIVO (nivolumab)，參考ID: 3677021)及MEDI0680 (亦稱為「AMP-514」；參見例如Hamid等人，Ann Oncol. 2016;27(增刊6):1050PD)。在較佳實施例中，抗PD-1抗體為派姆單抗。
在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1 (例如人類PD-1)之抗體的一特定實施例中，抗體為阻斷或減少PD-1 (例如人類PD-1)與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2兩者)之間的相互作用的抗PD-1抗體。在一特定實施例中，PD-1阻斷抗體結合於PD-1且抑制或減少PD-1 (例如人類PD-1)與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或兩者)之間的相互作用。在一特定實施例中，PD-1阻斷抗體特異性結合於PD-1。在一些實施例中，抗PD-1為如下抗體，其結合於PD-1 (例如人類PD-1)，且阻斷(完全或部分) PD-1 (例如人類PD-1)與PD-L1、PD-L2或兩者之間的相互作用，由此釋放PD-1路徑介導之對包括抗腫瘤反應之免疫反應的抑制。在一特定實施例中，抗PD-1為如下抗體，其結合於PD-1 (例如人類PD-1)，且阻斷(完全或部分) PD-1 (例如人類PD-1)與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用，由此釋放PD-1路徑介導之對包括抗腫瘤反應之免疫反應的抑制。在一特定實施例中，完全阻斷PD-1 (例如人類PD-1)與PD-L1、PD-L2或兩者之間的相互作用。在一特定實施例中，阻斷PD-1 (例如人類PD-1)與PD-L1、PD-L2或兩者之間的相互作用係指如藉由熟習此項技術者已知之任何方法，諸如共免疫沈澱或共定位分析評估，與在陰性對照療法(例如抗IgG抗體)存在下PD-1 (例如人類PD-1)與PD-L1、PD-L2或兩者之間的相互作用相比，PD-1 (例如人類PD-1)與PD-L1、PD-L2或兩者之間的相互作用至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%阻斷。在一特定實施例中，抗PD-1抗體抑制PD-1 (例如人類PD-1)之配位體依賴性(例如PD-L1、PD-L2或兩者)活化。在一特定實施例中，完全抑制配位體依賴性活化。在一特定實施例中，抑制配位體依賴性活化係指如藉由熟習此項技術者已知之任何方法，諸如磷酸化分析評估，與在陰性對照療法(例如抗IgG抗體)存在下配位體依賴性PD-1 (例如人類PD-1)活化相比，配位體依賴性活化至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%抑制。
在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1 (例如人類PD-1)但不轉導抑制信號之配位體。在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1 (例如人類PD-1)但僅僅名義上轉導抑制信號之配位體。在某些特定實施例中，配位體為包含PD-1 (例如人類PD-1)之配位體或PD-1之配位體之衍生物的至少一部分及異源胺基酸序列的融合蛋白。在特定實施例中，該融合蛋白包含PD-1之配位體或PD-1之配位體之衍生物的至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。此類融合蛋白之一實例為AMP-224 (參見例如Infante等人，J Clin Oncol. 2013;31(增刊):abstr 3044)。
在一些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑(例如選擇性)抑制或減少由PD-1 (例如人類PD-1)與其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑。在特定實施例中，相對於在不存在拮抗劑下由PD-1 (例如人類PD-1)與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或兩者)中之一或多種之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，PD-1或其配位體之拮抗劑抑制或減少由PD-1 (例如人類PD-1)與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或兩者)中之一或多種之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或者在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內。在特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑：(i)相對於在不存在拮抗劑下由PD-1 (例如人類PD-1)與一種特定配位體(例如PDLI)之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，抑制或減少由PD-1 (例如人類PD-1)與一種特定配位體(例如PD-L1)之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或者在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內；以及(ii)相對於在不存在拮抗劑下由PD-1與此類一或多種其他配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，不抑制或減少，或者抑制或減少由PD-1 (例如人類PD-1)與一或多種其他配位體(例如PD-L2)之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑小於20%、15%、10%、5%或2%或在2%至5%、2%至10%、5%至10%、5%至15%、5%至20%、10%至15%或15%至20%之間的範圍內。
在特定實施例中，相對於在不存在拮抗劑下由PD-1 (例如人類PD-1)與PD-L1、PD-L2或兩者之結合誘導的一或多種信號轉導路徑，PD-1或其配位體之拮抗劑抑制或減少由PD-1 (例如人類PD-1)與PD-L1、PD-L2或兩者之結合誘導的一或多種信號轉導路徑至少 25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或者在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內。在特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑誘導、活化及/或增強一或多種免疫活性、功能或反應。一或多種免疫活性、功能或反應可呈例如抗體反應(體液反應)或細胞免疫反應形式，例如細胞介素分泌(例如干擾素-γ)、輔助細胞活性或細胞毒性。在一個實施例中，在接觸PD-1或其配位體之拮抗劑後，誘導、活化及/或增強免疫細胞上活化標記物(例如CD44、顆粒酶或Ki-67)之表現、免疫細胞上共刺激受體(例如ICOS、CD28、OX40或CD27)之表現、共刺激受體之配位體(例如B7HRP1、CD80、CD86、OX40L或CD70)之表現、細胞介素分泌、免疫細胞(例如T -淋巴細胞、B淋巴細胞及/或NK細胞)對腫瘤之浸潤、抗體產生、效應功能、T細胞活化、T細胞分化、T細胞增殖、B細胞分化、B細胞增殖及/或NK細胞增殖。在另一實施例中，在接觸PD-1或其配位體之拮抗劑後抑制骨髓衍生抑制細胞(MDSC)腫瘤浸潤及增殖、Treg腫瘤浸潤、活化及增殖、外周血液MDSC及Treg數。在另一實施例中，在接觸PD-1或其配位體之拮抗劑後誘導、活化及/或增強PD-1之配位體(例如PD-L1、PD-L2或PD-L1與PD-L2)之表現。在特定實施例中，在接觸PD-1或其配位體之拮抗劑後誘導及/或增加PD-L1之表現。在另一實施例中，在接觸PD-1或其配位體之拮抗劑後出現下文章節6中所述之一種、兩種或更多種作用。
PD-1或其配位體之拮抗劑之非限制性實例包括派姆單抗(「KEYTRUDA®」；參見例如Hamid等人，N Engl J Med. 2013; 369:134-44及Full Prescribing Information for KEYTRUDA (pembrolizumab)，參考ID: 3862712)、納武單抗(「OPDIVO®」；參見例如Topalian等人，N Engl J Med. 2012; 366:2443-54及Full Prescribing Information for OPDIVO (nivolumab)，參考ID: 3677021)、AMP-224 (參見例如Infante等人，J Clin Oncol. 2013; 31(增刊):abstr 3044)、MEDI0680 (亦稱為「AMP-514」；參見例如Hamid等人，Ann Oncol. 2016; 27(增刊6):1050PD)、德瓦魯單抗(亦稱為「medi-4736」；參見例如Lutzky等人，J Clin Oncol. 2014; 32(增刊5S):abstr 3001)、阿維魯單抗(例如用於梅克爾細胞癌)(亦稱為「MSB0010718C」；參見例如Heery等人 J Clin Oncol. 2014; 32(增刊5S):abstr 3064)、bms-936559 (參見例如Brahmer等人 N. Engl. J. Med. 2012; 366, 2455-2465)及阿特珠單抗(亦稱為「mpdl3280A」及「TECENTRIQ®」；參見例如McDermott等人，J Clin Oncol. 2016; 34(8):833-842；Herbst等人，J Clin Oncol. 2013;31(增刊): abstr 3000；及Full Prescribing Information for TECENTRIQ，參考ID: 3933242)。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為經美國FDA批准用於治療一或多種癌症之療法。經美國FDA批准用於治療癌症之PD-1或其配位體之拮抗劑的非限制性實例包括派姆單抗、納武單抗、阿特珠單抗及阿維魯單抗。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為經EMA批准用於治療一或多種癌症之療法。經EMA批准用於治療癌症之PD-1或其配位體之拮抗劑的非限制性實例包括派姆單抗、納武單抗及阿特珠單抗。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為國際專利申請公開案第WO 2008/156712號或美國專利第8,354,509號、美國專利第8,952,136號或美國專利第8,900,587號中所述之抗PD-1抗體，各者以全文引用的方式併入本文中。在較佳實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為派姆單抗。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含有包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之可變輕鏈區(VLCR)互補決定區(CDR) 1、包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之可變重鏈區(VHCR) CDR1、包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含(a)VLCR，其包含(i)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3；以及(b)VHCR，其包含(i)包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATL SCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；以及(b)VHCR，其包含(i)包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含：(a) VLCR，其包含(i)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGAS VKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在較佳實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR ASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKV SCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR。在較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含有包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之可變輕鏈區(VLCR)互補決定區(CDR) 1、包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之可變重鏈區(VHCR) CDR1、包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含(a) VLCR，其包含(i)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3；以及(b) VHCR，其包含(i) 包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGV STSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；以及(b) VHCR，其包含(i)包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3；以及(b) VHCR，其包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a) VLCR CDR1、VLCR CDR2及VLCR CDR3，其分別包含有包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR的VLCR CDR1、VLCR CDR2及VLCR CDR3之胺基酸序列；以及(b) VHCR CDR1、VHCR CDR2及VHCR CDR3，其分別包含有包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR CDR1、VHCR CDR2及VHCR CDR3的胺基酸序列。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統確定。在一特定實施例中，如根據Kabat編號系統確定，VLCR CDR1包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)，VLCR CDR2包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)，VLCR CDR3包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)，VHCR CDR1包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)，VHCR CDR2包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)，且VHCR CDR3包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)。在一些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案確定，Chothia編號方案係指免疫球蛋白結構環之位置(參見例如Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917；Al-Lazikani等人，1997, J. Mol. Biol., 273:927-948；Chothia等人，1992, J. Mol. Biol., 227:799-817；Tramontano A等人，1990, J. Mol. Biol. 215(1):175-82；以及美國專利第7,709,226號)。在某些態樣中，抗體之CDR可根據如Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136及Lefranc, M.-P.等人，1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212中所述之IMGT編號系統確定。在某些態樣中，抗體之CDR可根據MacCallum等人，1996, J. Mol. Biol., 262:732-745確定。亦參見例如Martin, A., 「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,」Antibody Engineering , Kontermann及Dübel編輯，第31章，第422-439頁, Springer-Verlag, Berlin (2001)。在某些態樣中，抗體之CDR可根據AbM編號方案確定，AbM編號方案係指AbM高變區，代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且供Oxford Molecular之AbM抗體模擬軟體使用。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
術語「Kabat編號」及類似術語為此項技術中所公認且係指將抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基編號的系統。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統確定(參見例如Kabat等人(1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391及Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版物第91-3242號)。根據Kabat編號系統，(i) VH CDR1通常存在於重鏈之胺基酸位置31至35，其可視情況在胺基酸位置35後(Kabat編號方案中稱為35A及35B)包括一個或兩個其他胺基酸；(ii) VH CDR2通常存在於重鏈之胺基酸位置50至65；且(iii)VH CDR2通常存在於重鏈之胺基酸位置95至102 (Kabat, Elvin A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983)。根據Kabat編號系統，(i) VL CDR1通常存在於輕鏈之胺基酸位置24至34；(ii) VL CDR2通常存在於輕鏈之胺基酸位置50至56；且(iii) VL CDR3通常存在於輕鏈之胺基酸位置89至97 (Kabat, Elvin A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983)。如熟習此項技術者所熟知，使用Kabat編號系統，抗體可變域之實際線性胺基酸序列可由於FR及/或CDR之縮短或延長而含有更少或額外胺基酸，且因而，胺基酸之Kabat編號並非必需與其線性胺基酸編號相同。
Chothia定義係基於結構環區域之位置(Chothia等人，(1987) J Mol Biol 196: 901-917；以及美國專利第7,709,226號)。術語「Chothia CDR」及類似術語為此項技術中公認且係指如根據 Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917之方法確定的抗體CDR序列，其在本文中稱為「Chothia CDR」(亦參見例如美國專利第7,709,226號及Martin, A., 「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」, Antibody Engineering, Kontermann及Dübel編輯，第31章，第422-439頁, Springer-Verlag, Berlin (2001))。根據Chothia編號系統，使用將VH區中之胺基酸殘基編號之Kabat編號系統，(i) VH CDR1通常存在於重鏈之胺基酸位置26至32；(ii) VH CDR2通常存在於重鏈之胺基酸位置53至55；且(iii) VH CDR3通常存在於重鏈之胺基酸位置96至101。在一特定實施例中，根據Chothia編號系統，使用將VH區中之胺基酸殘基編號之Kabat編號系統，(i) VH CDR1通常存在於重鏈之胺基酸位置26至32或34；(ii) VH CDR2通常存在於重鏈之胺基酸位置52至56 (在一個實施例中，CDR2在位置52A-56，其中52A在位置52後)；且 VH CDR3通常存在於重鏈之胺基酸位置95至102 (在一個實施例中，在編號96-100之位置不存在胺基酸)。根據Chothia編號系統，使用將VL區中之胺基酸殘基編號之Kabat編號系統，(i) VL CDR1通常存在於輕鏈之胺基酸位置26至33；(ii) VL CDR2通常存在於輕鏈之胺基酸位置50至52；且(iii) VL CDR3通常存在於輕鏈之胺基酸位置91至96。在一特定實施例中，根據Chothia編號系統，使用將VL區中之胺基酸殘基編號之Kabat編號系統，(i) VL CDR1通常存在於輕鏈之胺基酸位置24至34；(ii) VL CDR2通常存在於輕鏈之胺基酸位置50至56；且(iii) VL CDR3通常存在於輕鏈之胺基酸位置89至97(在一個實施例中，在編號96-100之位置不存在胺基酸)。此等Chothia CDR位置可視抗體而變化，且可根據此項技術中已知之方法來確定。
IMGT定義來自IMGT (「IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®網站imgt.org, 創始人及董事: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France；參見例如Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136及Lefranc, M.-P.等人，1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212，兩者均以全文引用的方式併入本文中)。根據IMGT編號系統，(i) VH CDR1通常存在於重鏈之胺基酸位置25至35；(ii) VH CDR2通常存在於重鏈之胺基酸位置51至57；且(iii) VH CDR2通常存在於重鏈之胺基酸位置93至102。根據IMGT編號系統，(i) VL CDR1通常存在於輕鏈之胺基酸位置27至32；(ii) VL CDR2通常存在於輕鏈之胺基酸位置50至52；且(iii) VL CDR3通常存在於輕鏈之胺基酸位置89至97。
在較佳實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGV STSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR。在較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVST SGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)之輕鏈；以及(b)包含有包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR的重鏈。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含有包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS KGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR的輕鏈；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKV SCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10)之重鏈。
在較佳實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTS GYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)之輕鏈；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGA SVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10)之重鏈。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含有包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含：(a)VLCR，其包含(i)包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12 )之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13 )之VLCR CDR3；以及(b)VHCR，其包含(i)包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR ASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR；以及(b) VHCR，其包含(i)包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1之抗體，該抗體包含：(a) VLCR，其包含(i)包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之結合的抗體，該抗體包含：包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a) VLCR，其包含(i)包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3；以及(b) VHCR，其包含(i) 包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之結合的抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR；以及(b) VHCR，其包含(i)包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之結合的抗體，該抗體包含：(a) VLCR，其包含(i)包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、(ii)包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2及(iii)包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在某些實施例中，抗體為人類化或嵌合抗體。在較佳實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之結合的抗體，該抗體包含：(a) VLCR CDR1、VLCR CDR2及VLCR CDR3，其分別包含有包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR的VLCR CDR1、VLCR CDR2及VLCR CDR3之胺基酸序列；以及(b) VHCR CDR1、VHCR CDR2及VHCR CDR3，其分別包含有包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGR SLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR CDR1、VHCR CDR2及VHCR CDR3的胺基酸序列。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統確定。在一些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號系統確定。在某些態樣中，抗體之CDR可根據MacCallum等人，1996, J. Mol. Biol., 262:732-745確定。在一些態樣中，抗體之CDR可根據如Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136及Lefranc, M.-P.等人，1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212中所述之IMGT編號系統確定。在某些態樣中，抗體之CDR可根據AbM編號方案確定。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之結合的抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR；以及(b)包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR。在一特定實施例中，抗體為IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗體。在較佳實施例中，抗體為IgG4抗體。在另一較佳實施例中，抗體為IgG4 κ免疫球蛋白。
在一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSV SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 15)之輕鏈；以及(b)包含有包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPG RSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR的重鏈。在另一特定實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含有包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR的輕鏈；及(b)包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20)之重鏈。
在較佳實施例中，本文提供一種結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體，該抗體包含：(a)包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQ SVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15)之輕鏈；及(b)包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCK ASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20)之重鏈。
PD-1或其配位體之拮抗劑可藉由熟習此項技術者已知之技術產生。關於可用於產生PD-1或其配位體之拮抗劑之技術的實例參見例如美國專利第9,642,298號、美國專利第8,952,136號、美國專利第8,900,587號、美國專利第8,168,757號、美國專利第7,488,802號、美國專利申請公開案第2016/0137721號及國際專利申請公開案第WO 2014/159960號。在一特定實施例中，分離PD-1或其配位體之拮抗劑。5.5.1 抗體產生
在一個態樣中，本文提供用於製造本文所述之PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑的方法。在一特定實施例中，本文所述之PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑可藉由涉及例如經由合成序列或對序列進行基因工程改造而產生的任何方式製備、表現、產生或分離。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之此類抗體或其他蛋白質拮抗劑包含由不天然存在於動物或哺乳動物(例如人類)之抗體生殖系譜系內之DNA序列編碼的序列。
在某些態樣中，用於製造本文所述之PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑的方法包含培養表現PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑之細胞(例如宿主細胞或融合瘤細胞)的步驟。在某些實施例中，用於製造本文所述之PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑的方法進一步包含純化由該細胞表現之PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑的步驟。在某些態樣中，用於製造本文所述之PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑的方法包含培養包含編碼PD-1或其配位體之抗體或其他蛋白質拮抗劑之聚核苷酸或載體的細胞(例如宿主細胞或融合瘤細胞)的步驟。在一特定態樣中，本文提供用於產生本文所述之抗體之方法，其包含自宿主細胞表現此類抗體。細胞可為初級細胞或細胞株。在特定實施例中，自其他細胞分離宿主細胞。在另一實施例中，在個體體內未發現宿主細胞。
分子生物學中之標準方法由Sambrook、Fritsch及Maniatis(1982 & 1989 第2版，2001 第3版)Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Sambrook及Russell (2001)Molecular Cloning ，第 3 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Wu (1993)Recombinant DNA ，第217卷，Academic Press, San Diego, CA)描述。標準方法亦呈現在Ausbel等人，(2001)Current Protocols in Molecular Biology ，第 1-4 卷， John Wiley and Sons, Inc. New York, NY，該文獻描述細菌細胞中之選殖及DNA突變誘發(第1卷)、哺乳動物細胞及酵母中之選殖(第2卷)、糖結合物及蛋白質表現(第3卷)及生物資訊(第4卷)。
描述用於蛋白質純化之方法包括免疫沈澱、層析法、電泳、離心及結晶(Coligan等人，(2000)Current Protocols in Protein Science ，第 1 卷， John Wiley and Sons, Inc., New York)。描述化學分析、化學改質、轉譯後修飾、融合蛋白產生、蛋白質糖基化(參見例如Coligan等人，(2000)Current Protocols in Protein Science ，第 2 卷， John Wiley and Sons, Inc., New York；Ausubel等人，(2001)Current Protocols in Molecular Biology ，第 3 卷， John Wiley and Sons, Inc., NY, NY，第16.0.5-16.22.17頁；Sigma-Aldrich, Co. (2001)Products for Life Science Research , St. Louis, MO；第45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech (2001)BioDirectory , Piscataway, N.J.，第384-391頁)。描述多株及單株抗體之產生、純化及片段化(Coligan等人，(2001)Current Protocols in Immunology ，第 1 卷， John Wiley and Sons, Inc., New York；Harlow及Lane (1999)Using Antibodies , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Harlow及Lane,上文 )。可獲得用於表徵配位體/受體相互作用之標準技術(參見例如Coligan等人，(2001)Current Protocols in Immunology ，第 4 卷， John Wiley, Inc., New York)。
在某些態樣中，本文提供表現(例如以重組方式表現)本文所述之抗體及相關表現載體之細胞(例如宿主細胞)。在另一態樣中，本文提供載體(例如表現載體)，其包含有包含編碼抗體之核苷酸序列的聚核苷酸以在宿主細胞中、較佳在哺乳動物細胞中重組表現。本文亦提供宿主細胞，其包含編碼抗體之聚核苷酸或包含編碼抗體之聚核苷酸以便以重組方式表現本文所述之抗體的載體。在一特定實施例中，本文提供一種包含兩種載體之宿主細胞，其中該第一載體包含編碼本文所述之抗體之可變重鏈區的聚核苷酸且該第二載體包含編碼抗體之可變輕鏈區的聚核苷酸，以便以重組方式表現本文所述之抗體。細胞可為初級細胞或細胞株。在特定實施例中，自其他細胞分離宿主細胞。在另一實施例中，在個體體內未發現宿主細胞。
本文所述之抗體(例如單株抗體，諸如嵌合或人類化抗體或其抗原結合片段)可藉由此項技術中已知之用於合成抗體的任何方法，例如藉由化學合成或藉由重組表現技術產生。除非另有指示，否則本文所描述之方法採用分子生物學、微生物學、遺傳分析、重組DNA、有機化學、生物化學、PCR、寡核苷酸合成及修飾、核酸雜交及此項技術內相關領域中的習知技術。此等技術描述於本文所引用之參考文獻中，且充分解釋於文獻中。參見例如Maniatis等人(1982)Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(1989),Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人 (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons (1987及年度更新)；Current Protocols in Immunology , John Wiley & Sons (1987及年度更新) Gait (編輯) (1984)Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach , IRL Press；Eckstein (編輯) (1991)Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach , IRL Press；Birren等人(編輯) (1999)Genome Analysis: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press。
單株、多株及人類化抗體可藉由此項技術中已知之技術製備(參見例如Sheperd及Dean (編輯) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY；Kontermann及Dubel (編輯) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York；Harlow及Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，第139-243頁；Carpenter等人，(2000) J. Immunol. 165:6205；He等人,(1998) J. Immunol. 160:1029；Tang等人(1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378；Baca等人(1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684；Chothia等人(1989) Nature 342:877-883；Foote及Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499；美國專利第6,329,511號)。
可使用此項技術中已知之各種技術製備單株抗體，該等技術包括使用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤技術產生，該等技術包括此項技術中已知之技術且教示於例如Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版 1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。
使用融合瘤技術製造及篩選特異性抗體之方法在此項技術中為常規且熟知的。舉例而言，在融合瘤方法中，小鼠或其他適當宿主動物，諸如綿羊、山羊、兔、大鼠、倉鼠或獼猴，經免疫接種以引發產生或能夠產生結合於用於免疫接種之蛋白質(例如PD-1)之抗體的淋巴細胞。可替代地，淋巴細胞可在活體外經免疫接種。接著使用合適融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice ，第59-103頁 (Academic Press, 1986))。另外，RIMMS (重複免疫接種多個位點)技術可用於對動物進行免疫接種(Kilptrack等人，1997 Hybridoma 16:381-9，該文獻以全文引用的方式併入本文中)。
由此製備之融合瘤接種且生長於合適培養基中，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質會阻止缺乏HGPRT之細胞生長。
特定實施例採用高效融合、支持所選產抗體細胞穩定高量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的骨髓瘤細胞。在此等骨髓瘤細胞株中，為鼠類骨髓瘤細胞株，諸如來源於MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之骨髓瘤細胞株，獲自Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, CA, USA)；及獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA)之SP-2或X63-Ag8.653細胞。亦已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株(Kozbor,J. Immunol. , 133:3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
對於針對所關注抗原(例如PD-1)之單株抗體的產生，分析其中生長融合瘤細胞之培養基。由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性藉由此項技術中已知之方法(例如免疫沈澱)或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來加以確定。
鑑別出產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，純系可藉由限制稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice ，第59-103頁 (Academic Press, 1986))。用於此目的之合適培養基包括例如D-MEM或RPMI 1640培養基。可替代地，可使用補充有HAT (Stemcell Technologies)之半固體瓊脂分離純系細胞。另外，融合瘤細胞可在動物活體內生長為腹水腫瘤。
由次純系所分泌之單株抗體適宜藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、滲析或親和層析自培養基、腹水液或血清中分離。
在一些實施例中，小鼠(或其他動物，諸如大鼠、猴、驢、豬、綿羊、山羊、倉鼠或狗)可經抗原(例如人類PD-1)免疫接種且一旦偵測到免疫反應，例如在小鼠血清中偵測到對抗原具有特異性之抗體，則收穫小鼠脾臟且分離脾細胞。隨後藉由熟知之技術將脾細胞與任何合適之骨髓瘤細胞融合，例如來自獲自美國菌種保藏中心(ATCC® )(Manassas, VA)之細胞株SP20的細胞，以形成融合瘤。藉由有限稀釋法選擇及選殖融合瘤。在某些實施例中，收穫經免疫接種之小鼠的淋巴結且與NS0骨髓瘤細胞融合。
接著藉由此項技術中已知之方法，針對分泌能夠結合抗原(例如人類PD-1)之多肽之抗體的細胞分析融合瘤純系。腹水液通常含有大量抗體，可以藉由用陽性融合瘤純系免疫小鼠來產生。
因此，本文描述製造本文所述之抗體之方法，其藉由培養分泌抗體之融合瘤細胞。在某些實施例中，製造本文所述之抗體之方法進一步包含純化抗體之步驟。
在特定實施例中，藉由將自經所關注抗原(例如人類PD-1)免疫接種之小鼠(或其他動物，諸如大鼠、猴、驢、豬、綿羊或犬)分離的脾細胞與骨髓瘤細胞融合且接著針對分泌能夠結合於該抗原之抗體的融合瘤純系篩選由該融合物產生之融合瘤來產生融合瘤。在某些實施例中，藉由將自經所關注抗原(例如人類PD-1)免疫接種之小鼠(或其他動物，諸如大鼠、猴、驢、豬、綿羊或犬)分離的淋巴結與骨髓瘤細胞融合且接著針對分泌能夠結合於該抗原之抗體的融合瘤純系篩選由該融合物產生之融合瘤來產生融合瘤。
本文所述之抗體包括識別所關注抗原(例如人類PD-1)之抗體片段且可藉由熟習此項技術者已知之任何技術產生。舉例而言，本文所述之Fab及F(ab')2 片段可藉由免疫球蛋白分子之蛋白質裂解，使用諸如木瓜蛋白酶(以產生Fab片段)或胃蛋白酶(以產生F(ab')2 片段)之酶來產生。Fab片段對應於抗體分子之兩個相同臂中之一者，且含有與重鏈之VH及CH1域配對的完整輕鏈。F(ab')2 片段含有抗體分子中的在鉸鏈區中由二硫鍵連接之兩個抗原結合臂。
此外，本文所述之抗體亦可使用此項技術中已知之各種噬菌體呈現方法來產生。在噬菌體呈現方法中，功能抗體域呈現於攜帶編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上。詳言之，編碼VHCR及VLCR之DNA序列自動物cDNA庫(例如，受感染組織之人類或鼠類cDNA集合庫)擴增。藉由PCR用scFv連接子將編碼VHCR及VLCR之DNA重組在一起，且將其選殖至噬菌粒載體中。載體在大腸桿菌中電穿孔，且該大腸桿菌經輔助噬菌體感染。此等方法中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，包括fd及M13，且VHCR及VLCR通常以重組方式與噬菌體基因III或基因VIII融合。可用抗原，例如使用標記抗原或結合或捕捉至固體表面或珠粒之抗原選擇或鑑別表現結合於特定抗原之抗原結合域的噬菌體。可用於製備本文所述之抗體的噬菌體呈現方法之實例包括以下中所揭示之方法：Brinkman等人，1995, J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames等人，1995, J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough等人，1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic等人，1997, Gene 187:9-18；Burton等人，1994, Advances in Immunology 57:191-280；PCT公開案第PCT/GB91/O1 134號；國際公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/1 1236號、第WO 95/15982號、第WO 95/20401號及第WO97/13844號；及美國專利第號5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號。
如以上參考文獻中所述，在進行噬菌體選擇後，可自噬菌體分離抗體編碼區且用於產生全抗體，包括人類抗體，或任何其他所需抗原結合片段，且在任何所需宿主中表現，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌，例如如下所述。以重組方式產生諸如Fab、Fab'及F(ab')2 片段之抗體片段的技術亦可使用此項技術中已知之方法，諸如以下中所揭示之方法來採用：PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax等人，1992, BioTechniques 12(6):864-869；Sawai等人，1995, AJRI 34:26-34；以及Better等人，1988, Science 240:1041-1043。
在一個態樣中，為產生全抗體，包括VHCR或VLCR核苷酸序列、限制位點及保護該限制位點之側接序列的PCR引子可用於自模板(例如scFv純系)擴增VHCR或VLCR序列。利用熟習此項技術者已知之選殖技術，可將經PCR擴增之VHCR選殖至表現可變重鏈恆定區之載體中，且可將經PCR擴增之VLCR選殖至表現可變輕鏈恆定區(例如人類κ或λ恆定區)之載體中。亦可將VHCR及VLCR選殖至一個表現所需恆定區之載體中。接著使用熟習此項技術者已知之技術將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中以產生表現全長抗體，例如IgG之穩定或短暫細胞株。
對於一些用途，包括抗體在人類中之活體內使用及活體外偵測分析，可較佳使用人類、人類化或嵌合抗體。對於治療性治療人類個體而言，特別期望完全人類抗體。人類抗體可藉由此項技術中已知之各種方法，包括上文所述之噬菌體呈現方法，使用源自人類免疫球蛋白序列之抗體集合庫製得。亦參見美國專利第4,444,887號及第4,716,111號；及國際公開案第WO 98/46645號、第WO 98/50433號、第WO 98/24893號、第WO 98/16654號、第WO 96/34096號、第WO 96/33735號及第WO 91/10741號。
嵌合抗體為其中抗體之不同部分來源於不同免疫球蛋白分子的分子。舉例而言，嵌合抗體可含有小鼠單株抗體之可變區與人類抗體之恆定區融合。用於製造嵌合抗體之方法為此項技術中已知的。參見例如Morrison, 1985, Science 229:1202；Oi等人，1986, BioTechniques 4:214；Gillies等人，1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號、第4,816,397號及第6,331,415號。
在一些實施例中，產生人類化抗體。人類化抗體能夠結合於預定抗原且包含具有實質上人類免疫球蛋白之胺基酸序列的構架區及具有實質上非人類免疫球蛋白(例如鼠類免疫球蛋白)之胺基酸序列的CDR。人類化抗體可使用此項技術中已知之多種技術來產生，包括(但不限於) CDR移植(歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)、面飾(veneering)或表面再塑(resurfacing) (歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994, Protein Engineering 7(6):805-814；以及Roguska等人，1994, PNAS 91:969-973)、鏈改組(美國專利第5,565,332號)及例如以下中所揭示之技術：美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、WO 9317105；Tan等人，J. Immunol. 169:1119 25 (2002)；Caldas等人，Protein Eng. 13(5):353-60 (2000)；Morea等人，Methods 20(3):267 79 (2000)；Baca等人，J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997)；Roguska等人，Protein Eng. 9(10):895 904 (1996)；Couto等人，Cancer Res. 55 (23增刊): 5973s- 5977s (1995)；Couto等人，Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995)；Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994)及Pedersen等人，J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)。亦參見美國專利公開案第US 2005/0042664 A1號(2005年2月24日)，其以全文引用的方式併入本文中。
人類抗體可使用此項技術中已知之任何方法來產生。舉例而言，可使用不能表現功能性內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠。詳言之，可將人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物隨機或藉由同源重組而引入至小鼠胚胎幹細胞中。可替代地，除人類重鏈及輕鏈基因以外，亦可將人類可變區、恆定區及多樣性區引入至小鼠胚胎幹細胞中。可在藉由同源重組引入人類免疫球蛋白基因座的情況下使小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因分開或同時變為非功能的。詳言之，JH 區之同型接合子缺失阻止內源性抗體產生。使經修飾之胚胎幹細胞擴增且將其顯微注射入囊胚中以產生嵌合小鼠。隨後飼養嵌合小鼠以產生表現人類抗體之同型接合後代。轉殖基因小鼠以正常方式經所選抗原，例如抗原(例如人類PD-1)之全部或一部分免疫接種。針對該抗原之單株抗體可使用習知融合瘤技術自經免疫接種之轉殖基因小鼠獲得。轉殖基因小鼠含有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期間重排，且隨後經歷類別轉換及體細胞突變。因此，使用此類技術，可產生治療上適用的IgG、IgA、IgM及IgE抗體。關於用於產生人類抗體之此技術之綜述，參見Lonberg及Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93。關於用於產生人類抗體及人類單株抗體之此技術及用於產生此類抗體之方案的詳細論述，參見例如PCT公開案第WO 98/24893號、第WO 96/34096號及第WO 96/33735號；及美國專利5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號及第5,939,598號。
在一些實施例中，可使用小鼠-人類融合瘤產生人類抗體。舉例而言，經艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus；EBV)轉型之人類外周血淋巴細胞可與小鼠骨髓瘤細胞融合以產生分泌人類單株抗體之小鼠-人類融合瘤，且此等小鼠-人類融合瘤可經篩選以確定分泌結合於標靶抗原(例如B型流感病毒NA)之人類單株抗體的融合瘤。此類方法為已知且描述於此項技術中，參見例如Shinmoto等人，Cytotechnology, 2004, 46:19-23；Naganawa等人，Human Antibodies, 2005, 14:27-31。
在一些實施例中，人類抗體可藉由將編碼抗體之人類CDR (例如VLCR CDR及/或VHCR CDR)之聚核苷酸插入含有編碼人類構架區序列之核苷酸序列的表現載體中來產生。在某些實施例中，此類表現載體進一步包含編碼人類輕鏈及/或重鏈之恆定區的核苷酸序列。在一些實施例中，人類抗體可藉由將獲自噬菌體集合庫之抗體之人類CDR (例如VLCR CDR及/或VHCR CDR)插入此等人類表現載體中來產生。
在某些實施例中，人類抗體可藉由選擇與非人類抗體之非人類CDR序列同源(或實質上同源)之人類CDR序列，及選擇與非人類抗體之非人類構架序列同源(或實質上同源)之人類構架序列產生。
單域抗體(例如缺乏輕鏈之抗體)可藉由此項技術中熟知之方法產生。參見Riechmann等人，1999, J. Immunol. 231:25-38；Nuttall等人，2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263；Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4):277302；美國專利第6,005,079號；及國際公開案第WO 94/04678號、第WO 94/25591號及第WO 01/44301號。
雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之單株抗體。示例性雙特異性抗體可結合於抗原之兩個不同抗原決定基或兩個不同抗原之兩個不同抗原決定基。在特定實施例中，雙特異性抗體具有兩個不同抗原結合結構域，其中各結構域特異性結合於不同抗原。其他此類抗體可結合第一抗原(例如人類PD-1)且進一步結合第二抗原。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')：雙特異性抗體)。
製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知。(參見例如Millstein等人，Nature, 305:537-539 (1983)；Traunecker等人，EMBO J., 10:3655-3659 (1991)；Suresh等人，Methods in Enzymology, 121:210 (1986)；Kostelny等人，J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)；Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)；Gruber等人，J. Immunol., 152:5368 (1994)；美國專利4,474,893號；第4,714,681號；第4,925,648號；第5,573,920號；第5,601,81號；第95,731,168號；第4,676,980號；及第4,676,980號、WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO 92/08802；及EP 03089)。
結合於所關注抗原(例如人類PD-1)之本文所述之抗體(例如全長抗體、抗體之重鏈及/或輕鏈或本文所述之單鏈抗體)的重組表現可例如包括構築含有編碼抗體或其片段(例如VLCR及/或VHCR)之聚核苷酸的載體(例如表現載體)。一旦獲得編碼本文所述之抗體分子、抗體之重鏈及/或輕鏈或其抗原結合片段的聚核苷酸，則可使用此項技術中熟知之技術藉由重組DNA技術產生用於產生抗體分子之載體。本文描述藉由表現含有編碼核苷酸序列之抗體的聚核苷酸來製備蛋白質之方法。可使用熟習此項技術者熟知之方法構築含有抗體編碼序列及適當轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。亦提供以下可複製載體，其包含編碼本文所述之抗體分子、抗體之重鏈或輕鏈、抗體之重鏈或輕鏈可變域或其片段或者重鏈或輕鏈CDR的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接於啟動子。此類載體可例如包括編碼抗體分子之恆定區之核苷酸序列(參見例如國際公開案第WO 86/05807號及第WO 89/01036號；以及美國專利第5,122,464號)且抗體之可變域可選殖至此類載體中以表現整個重鏈、整個輕鏈或整個重鏈與輕鏈。
可獲得用於測定例如抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能結構域、糖基化位點及序列比對之套裝軟體及資料庫(參見例如GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD)；GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA)；DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada)；Menne等人，(2000)Bioinformatics 16: 741-742；Menne等人，(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren等人，(2002)Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181；von Heijne (1983)Eur. J. Biochem. 133:17-21；von Heijne (1986)Nucleic Acids Res. 14:4683-4690)。
表現載體可藉由習知技術轉移至細胞(例如宿主細胞)且接著所得細胞可藉由習知技術進行培養以產生本文所述之抗體或其片段。因此，本文提供宿主細胞，其含有編碼本文所述之抗體或其片段，或其重鏈或輕鏈，或其抗原結合片段，或本文所述之單鏈抗體之聚核苷酸，該聚核苷酸可操作地連接於啟動子以在宿主細胞中表現此類序列。在某些實施例中，例如為表現雙鏈抗體，個別地編碼重鏈與輕鏈之載體可在宿主細胞中共表現以表現整個免疫球蛋白分子，如下詳述。在某些實施例中，宿主細胞含有包含編碼本文所述之抗體之重鏈與輕鏈或其片段的聚核苷酸的載體。在特定實施例中，宿主細胞含有兩種不同載體，第一載體包含編碼本文所述之抗體之重鏈或其片段的聚核苷酸，且第二載體包含編碼本文所述之抗體之輕鏈或其片段的聚核苷酸。在其他實施例中，第一宿主細胞包含有包含編碼本文所述之抗體之重鏈或其片段的聚核苷酸的第一載體，且第二宿主細胞包含有包含編碼本文所述之抗體之輕鏈的聚核苷酸的第二載體。
多種宿主表現載體系統可用於表現本文所述之抗體分子(參見例如美國專利第5,807,715號)。此類宿主表現系統表示可產生且隨後純化所關注之編碼序列之媒劑，且亦表示可在經適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時原位表現本文所述之抗體分子的細胞。此等系統包括(但不限於)微生物，諸如經含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌)；經含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia))；經含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒，CaMV；菸草嵌紋病毒，TMV))感染或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統(例如綠藻，諸如萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或具有含有來源於哺乳動物細胞之基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子；痘瘡病毒7.5K啟動子)之啟動子的重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa及NIH 3T3細胞)。在一特定實施例中，哺乳動物表現載體為pOptiVEC™或pcDNA3.3。較佳地，諸如大腸桿菌之細菌細胞用於表現重組抗體分子，且更佳為真核細胞，尤其用於表現全重組抗體分子。舉例而言，與載體(諸如來自人類細胞巨大病毒之主要中間早期基因啟動子元件)結合之哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)為抗體之有效表現系統(Foecking等人，1986, Gene 45:101；及Cockett等人，1990, Bio/Technology 8:2)。在某些實施例中，本文所述之抗體係藉由CHO細胞或NS0細胞產生。在一特定實施例中，編碼結合於所關注抗原(例如人類PD-1)之本文所述之抗體(或其片段)的核苷酸序列的表現藉由組成性啟動子、誘導性啟動子或組織特異性啟動子調節。
在細菌系統中，多個表現載體可有利地視所表現之抗體分子的預期用途而選擇。舉例而言，當待產生大量此類蛋白質時，為產生抗體分子之醫藥組合物，可能需要導引高水準之容易純化之融合蛋白產物表現的載體。此類載體包括(但不限於)大腸桿菌表現載體pUR278 (Ruther等人，1983, EMBO 12:1791)，其中可將抗體編碼序列個別地接合至載體中與lac Z編碼區同框以產生融合蛋白；pIN載體(Inouye及Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke及Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)；及其類似載體。pGEX載體亦可用於將外源多肽表現為與麩胱甘肽5-轉移酶(GST)之融合蛋白。一般而言，此類融合蛋白為可溶的，且可藉由吸附及結合於麩胱甘肽瓊脂糖珠粒基質，繼而在游離麩胱甘肽存在下溶離而容易自溶解細胞純化。pGEX載體被設計成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點以便使得可自GST部分釋放經選殖之標靶基因產物。
在昆蟲系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)作為載體來表現外源基因。病毒於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞中生長。可將抗體編碼序列個別地選殖至病毒之非必需區(例如多角體蛋白基因)中，且置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)之控制下。
在哺乳動物宿主細胞中，可利用多種基於病毒之表現系統。在其中腺病毒用作表現載體之情況下，所關注之抗體編碼序列可接合至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三聯前導序列。此嵌合基因可隨後藉由活體外或活體內重組而插入腺病毒基因組中。在非必需區中插入病毒基因組(例如區El或E3)將產生可存活且能夠在感染之宿主中表現抗體分子的重組病毒(例如參見Logan及Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359)。為高效轉譯所插入之抗體編碼序列亦可需要特定起始信號。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必須與所需編碼序列之閱讀框架同相，以確保完整嵌段之轉譯。此等外源性轉譯控制信號及起始密碼子可為多種來源，天然與合成兩者。可藉由包括適當轉錄強化子元件、轉錄終止子等來提高表現效率(參見例如Bittner等人，1987, Methods in Enzymol. 153:51-544)。
如本文所用，術語「宿主細胞」係指任何類型細胞，例如初級細胞或來自細胞株之細胞。在特定實施例中，術語「宿主細胞」係指經聚核苷酸轉染之細胞及此類細胞之子代或潛在子代。歸因於後代中可能存在突變或環境影響或聚核苷酸整合至宿主細胞基因組中，此類細胞之後代可與用聚核苷酸轉染之母細胞不一致。
另外，可選擇調節插入序列之表現或以所需特定方式修飾及處理基因產物的宿主細胞品系。蛋白質產物之此類修飾(例如糖基化)及處理(例如裂解)對該蛋白質之功能而言可為至關重要的。不同宿主細胞具有蛋白質及基因產物之轉譯後處理及修飾的特徵及特定機制。可選擇適合細胞株或宿主系統以確保所表現之外源蛋白質之正確修飾及處理。為此，可使用具有恰當處理初級轉錄物、基因產物之糖基化及磷酸化的細胞機制之真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括(但不限於) CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0 (不內源性產生任何免疫球蛋白鏈之鼠類骨髓瘤細胞株)、CRL7O3O及HsS78Bst細胞。在某些實施例中，本文所述之人類化單株抗體在諸如CHO細胞之哺乳動物細胞中產生。
為長期高產率地產生重組蛋白，穩定表現一般係較佳。舉例而言，穩定表現抗體分子之細胞株可經工程改造。宿主細胞可經DNA轉型，由適當表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)及可選標記物控制，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。引入外源性DNA之後，可使經工程改造之細胞在富集培養基中生長1-2天，且隨後換成選擇性培養基。重組質體中之可選標記物賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長形成集落(foci)，該集落繼而可選殖及擴增至細胞株中。此方法宜用於工程改造穩定表現抗體分子之細胞株。此類經工程改造之細胞株可特別適用於篩選及評估與抗體分子直接或間接相互作用之組合物。
可使用多種選擇系統，包括(但不限於)單純性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977, Cell 11:223)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska及Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人，1980, Cell 22:8-17)基因，分別可在tk-、hgprt-或aprt-細胞中使用。另外，抗代謝物抗性可用作對以下基因進行選擇之基礎：dhfr ，其賦予針對甲胺喋呤之抗性(Wigler等人，1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hare等人，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；gpt ，其賦予針對黴酚酸之抗性(Mulligan及Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；neo，其賦予針對胺基醣苷G-418之抗性(Wu及Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；及Morgan及Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；1993年5月, TIB TECH 11(5):l55-2 15)；及hygro ，其賦予針對潮黴素之抗性(Santerre等人，1984, Gene 30:147)。在重組DNA技術之領域中通常已知之方法通常可用於選擇所需重組純系，且此類方法描述於例如Ausubel等人(編輯),Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；及第12章及第13章, Dracopoli等人(編輯),Current Protocols in Human Genetics , John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin等人，1981, J. Mol. Biol. 150:1中，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
抗體分子之表現水準可藉由載體擴增來增加(綜述參見Bebbington及Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷 (Academic Press, New York, 1987))。當表現抗體之載體系統中的標記物可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的水準增加將增加標記基因複本之數目。由於擴增區與抗體基因相關聯，抗體之產生亦將增加(Crouse等人，1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
宿主細胞可經兩種或超過兩種本文所述之表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。兩種載體可含有相同之可選標記物，其使得能夠等量表現重鏈及輕鏈多肽。
可替代地，可使用編碼且能夠表現重鏈及輕鏈多肽兩者之單個載體。在此等情形下，輕鏈應置放在重鏈之前以避免過量之有毒游離重鏈(Proudfoot, 1986, Nature 322:52；及Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199)。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。表現載體可為單順反子或多順反子。多順反子核酸構築體可編碼2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個，或介於2-5個、5-10個或10-20個範圍內之基因/核苷酸序列。舉例而言，雙順反子核酸構築體可按以下次序包含啟動子、第一基因(例如本文所述之抗體的重鏈)及第二基因及(例如本文所述之抗體的輕鏈)。在此類表現載體中，兩種基因之轉錄均可由啟動子驅動，而來自第一基因之mRNA的轉譯可藉由帽依賴性掃描機制進行，且來自第二基因之mRNA的轉譯可藉由非帽依賴性機制(例如藉由IRES)來進行。
一旦本文所述之抗體分子已藉由重組表現產生，則其可藉由此項技術中已知之用於純化免疫球蛋白分子之任何方法，例如藉由層析法(例如離子交換、親和力，尤其藉由蛋白A後針對特定抗原之親和力及篩分管柱層析法)、離心、差示溶解度或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術純化。此外，本文所述之抗體可與本文所述或此項技術中另外已知之異源多肽序列融合以便於純化。
在特定實施例中，分離或純化本文所述之抗體(例如單株抗體，諸如人類化或嵌合抗體或其抗原結合片段)。一般而言，經分離之抗體為大體上不含抗原特異性與經分離之抗體不同之其他抗體的抗體。舉例而言，在一特定實施例中，本文所述之抗體的製劑大體上不含細胞材料及/或化學前驅物。語言「大體上不含細胞材料」包括其中抗體與自其中分離或以重組方式產生該抗體之細胞的細胞組分分離的抗體製劑。因此，大體上不含細胞材料之抗體包括具有小於約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1% (以乾重計)異源蛋白質(在本文中亦稱作「污染蛋白質」)及/或抗體變異體，例如抗體之不同轉譯後修飾形式或抗體之其他不同型式(例如抗體片段)的抗體製劑。當以重組方式產生抗體時，其一般亦大體上不含培養基，亦即培養基佔蛋白質製劑體積不足約20%、10%、2%、1%、0.5%或0.1%。當藉由化學合成產生抗體時，其一般大體上不含化學前驅物或其他化學物質，亦即其與參與合成該蛋白質之化學前驅物或其他化學物質分離。因此，此類抗體製劑具有少於約30%、20%、10%或5% (以乾重計)的除所關注抗體以外之化學前驅物或化合物。在一特定實施例中，本文所述之抗體經分離或經純化。5.6 組合物及投與途徑
本文涵蓋本文所述之NDV (例如嵌合NDV；參見例如章節5.1、5.2及/或6)在組合物中之用途。本文亦涵蓋來自NDV感染細胞或感染NDV之全癌細胞之質膜片段在組合物中的用途。在一特定實施例中，組合物為醫藥組合物，諸如免疫原性調配物(例如疫苗調配物)。組合物可用於治療癌症之方法中。
在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所述之NDV (例如嵌合NDV；參見例如章節5.1、5.2及/或6)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一特定實施例中，嵌合NDV包含包裝基因組，其中該包裝基因組之基因組RNA序列如SEQ ID NO: 51、52或60中所闡述。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之本文所述之NDV (例如嵌合NDV；參見例如章節5.1、5.2及/或6)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一些實施例中，NDV (例如嵌合NDV；參見例如章節5.1、5.2及/或6)為醫藥組合物中包括之唯一活性成分。
在另一實施例中，醫藥組合物(例如溶解腫瘤疫苗)包含來自NDV感染癌細胞之蛋白質濃縮物或質膜片段製劑與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在另一實施例中，醫藥組合物(例如全細胞疫苗)包含感染NDV之癌細胞與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。
在另一實施例中，醫藥組合物包含本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)為醫藥組合物中包括之唯一活性成分。
在另一實施例中，醫藥組合物包含PD-1阻斷抗體(參見例如章節5.5)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之本文所述之PD-1阻斷抗體(參見例如章節5.5)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含本文所述之嵌合NDV (例如包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV)。在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含本文所述之嵌合NDV (例如包含有包含編碼人類IL-12之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV)。在一些實施例中，PD-1阻斷抗體(參見例如章節5.5)為醫藥組合物中包括之唯一活性成分。在一特定實施例中，PD-1阻斷抗體為納武單抗。在較佳實施例中，PD-1阻斷抗體為派姆單抗。在一特定實施例中，如根據Kabat編號系統確定，PD-1阻斷抗體包含：(a)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH之VLCR CDR1 (SEQ ID NO: 1)、(b)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、(c)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、(d)包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(e)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(f)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。在另一特定實施例中，PD-1阻斷抗體包含：(a)包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、(b)包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2、(c)包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3、(d)包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、(e)包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及(f)包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。
在另一實施例中，醫藥組合物包含PD-L1阻斷抗體(參見例如章節5.5)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之本文所述之PD-L1阻斷抗體(參見例如章節5.5)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含本文所述之嵌合NDV (例如包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV)。在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含本文所述之嵌合NDV (例如包含有包含編碼人類IL-12之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV)。在一些實施例中，PD-L1阻斷抗體(參見例如章節5.5)為醫藥組合物中包括之唯一活性成分。在一特定實施例中，PD-L1阻斷抗體為度伐魯單抗或阿維魯單抗(azelumab)。
在包含PD-1或其配位體之拮抗劑之醫藥組合物的一特定實施例中，醫藥組合物調配為凍乾粉末或餅狀物。在一特定實施例中，凍乾粉末或餅狀物包裝在一次性小瓶中以供復原。在一特定實施例中，凍乾粉末或餅狀物在L-組胺酸、聚山梨醇酯80及蔗糖及視情況選用之用於調整pH值至5.5之鹽酸及/或氫氧化鈉中調配。在一特定實施例中，藉由例如將無菌注射用水注射至包含凍乾粉末或餅狀物之小瓶中，緩慢旋轉小瓶以允許復原凍乾粉末或餅狀物且等待一段時間供凍乾粉末或餅狀物完全復原，將凍乾粉末或餅狀物用一定量之無菌注射用水復原，以實現PD-1或其配位體之拮抗劑的所需濃度。在一特定實施例中，2 mL經復原之拮抗劑含有50 mg拮抗劑且在L-組胺酸(3.1 mg)、聚山梨醇酯80(0.4 mg)及蔗糖(140 mg)及視情況選用之用於調整pH值至5.5之鹽酸及/或氫氧化鈉中調配。參見例如Full Prescribing Information for KETRUDA (pembrolizumab)，參考ID: 3862712，其以全文引用的方式併入本文中。一旦復原，醫藥組合物應儲存於室溫下，自復原時間起至多六小時，或冷藏在2℃至8℃下，自復原之時間起至多24小時。參見例如the Full Prescribing Information for KETRUDA (pembrolizumab)，參考ID: 3862712，其以全文引用的方式併入本文中。在一特定實施例中，經復原之醫藥組合物進一步調配用於靜脈內輸注。舉例而言，將所需量的經復原之PD-1或其配位體之拮抗劑轉移至含有例如適合於實現所需濃度之PD-1或其配位體之拮抗劑的體積之0.9%氯化鈉或5%右旋糖的無菌靜脈內袋中。
在包含PD-1或其配位體之拮抗劑之醫藥組合物的另一特定實施例中，醫藥組合物調配為液體溶液。在一特定實施例中，醫藥組合物進一步調配用於靜脈內輸注。舉例而言，將所需量之醫藥組合物轉移至含有例如適合於實現所需濃度之PD-1或其配位體之拮抗劑的體積之0.9%氯化鈉或5%右旋糖的無菌靜脈內袋中。參見例如the Full Prescribing Information for OPDIVO (nivolumab)，參考ID: 3677021，其以全文引用的方式併入本文中。
在另一實施例中，醫藥組合物包含(i)本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及(ii)本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之(i)本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及(ii)本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一些實施例中，NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及PD-1或其配位體之拮抗劑為醫藥組合物中包括之僅有活性成分。
在另一實施例中，醫藥組合物包含(i)包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV，及(ii)本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之(i)本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及(ii)本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之(i)包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV，及(ii)本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)，及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一些實施例中，NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及PD-1或其配位體之拮抗劑為醫藥組合物中包括之僅有活性成分。在特定實施例中，包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑為醫藥組合物中包括之僅有活性成分。
在另一實施例中，醫藥組合物包含(i)包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV及(ii) PD-1阻斷抗體(諸如例如章節5.5中所述)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之(i)本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及(ii)本文所述之PD-1阻斷抗體(參見例如章節5.5)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之(i)包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV及(ii)本文所述之PD-1阻斷抗體(諸如例如章節5.5)及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一些實施例中，NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及PD-1或其配位體之拮抗劑為醫藥組合物中包括之僅有活性成分。在特定實施例中，包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV及PD-1阻斷抗體為醫藥組合物中包括之僅有活性成分。在一特定實施例中，PD-1阻斷抗體為納武單抗。在較佳實施例中，PD-1阻斷抗體為派姆單抗。在一特定實施例中，醫藥組合物包含：(i)如根據Kabat編號系統確定，包含以下之抗體：(a)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之VLCR CDR1、(b)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、(c)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、(d)包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(e)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(f)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3；以及(ii)包含有包含SEQ ID NO: 51中所闡述之核苷酸序列之包裝基因組的嵌合NDV。在一特定實施例中，醫藥組合物包含：(i)如根據Kabat編號系統確定，包含以下之抗體：(a)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之VLCR CDR1、(b)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、(c)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、(d)包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(e)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(f)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3；以及(ii)包含有包含SEQ ID NO: 52中所闡述之核苷酸序列之包裝基因組的嵌合NDV。在一特定實施例中，醫藥組合物包含：(i)如根據Kabat編號系統確定，包含以下之抗體：(a)包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之VLCR CDR1、(b)包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、(c)包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、(d)包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之VHCR CDR1、(e)包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及(f)包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3；以及(ii)包含有包含SEQ ID NO: 60中所闡述之核苷酸序列之包裝基因組的嵌合NDV。
在另一實施例中，醫藥組合物包含(i)包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV，及(ii) PD-L1阻斷抗體(諸如例如章節5.5中所述)與醫藥學上可接受之載劑混合。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種其他預防劑或治療劑，諸如下文章節5.7.6中所述。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之(i)本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)，及(ii)本文所述之PD-L1阻斷抗體(參見例如章節5.5)，及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一特定實施例中，醫藥組合物包含有效量之(i)包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV，及(ii)本文所述之PD-L1阻斷抗體(參見例如章節5.5)，及視情況選用之一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。在一些實施例中，NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)及PD-L1或其配位體之拮抗劑為醫藥組合物中包括之僅有活性成分。在特定實施例中，包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV及PD-L1阻斷抗體為醫藥組合物中包括之僅有活性成分。在一特定實施例中，PD-L1阻斷抗體為度伐魯單抗或阿維魯單抗。
本文提供之醫藥組合物可呈允許組合物投與個體之任何形式。在一特定實施例中，醫藥組合物適於獸醫學及/或人類投藥。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出用於動物，及更具體用於人類。術語「載劑」係指醫藥組合物一起進行投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。亦可採用生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。合適賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。合適醫藥載劑之實例描述於E.W. Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。調配物應適合投藥模式。
在一特定實施例中，醫藥組合物經調配以適合於預期投與個體之途徑。舉例而言，醫藥組合物可經調配以適合於非經腸、靜脈內、動脈內、胸膜內、吸入、腹膜內、經口、皮內、結腸直腸、腹膜內、顱內及瘤內投與。在一特定實施例中，醫藥組合物可經調配以用於靜脈內、動脈內、經口、腹膜內、鼻內、氣管內、胸膜內、顱內、皮下、肌肉內、局部、肺部或瘤內投與。
在一特定實施例中，包含本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)的醫藥組合物經調配以適合於瘤內投與個體(例如人類個體)。在一特定實施例中，包括包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV的醫藥組合物經調配以適合於瘤內投與個體(例如人類個體)。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列包含SEQ ID NO: 51中闡述之序列或由其組成。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列包含SEQ ID NO: 52中闡述之序列或由其組成。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列包含SEQ ID NO: 60中闡述之序列或由其組成。
在一特定實施例中，包含本文所述之NDV (參見例如章節5.1、5.2及/或6)之醫藥組合物經調配以適合於靜脈內投與個體(例如人類個體)。在一特定實施例中，包括包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV的醫藥組合物經調配以適合於靜脈內投與個體(例如人類個體)。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 51中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 52中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 60中所闡述。
在一特定實施例中，包含本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑(參見例如章節5.5)的醫藥組合物經調配以適合於靜脈內投與個體(例如人類個體)。在一特定實施例中，包含本文所述之PD-1阻斷抗體(參見例如章節5.5)的醫藥組合物經調配以適合於靜脈內投與個體(例如人類個體)。在一特定實施例中，PD-1阻斷抗體為納武單抗。在較佳實施例中，PD-1阻斷抗體為派姆單抗。在一特定實施例中，包含本文所述之PD-L1阻斷抗體(參見例如章節5.5)的醫藥組合物經調配以適合於靜脈內投與個體(例如人類個體)。在一特定實施例中，PD-L1阻斷抗體為度伐魯單抗或阿維魯單抗。5.7 抗癌用途及其他用途 5.7.1 用 NDV-IL12 及 PD-1 或其配位體之拮抗劑治療癌症的方法
在一個態樣中，本文呈現用於利用本文所述之嵌合NDV (例如章節5.2及/或章節6中所述之嵌合NDV)或包含此類嵌合NDV與PD-1或其配位體之拮抗劑(例如章節5.5及/或章節6中所述之拮抗劑)組合的組合物或包含此類拮抗劑之組合物治療癌症的方法，其中該嵌合NDV包含編碼IL-12或其衍生物之包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。嵌合NDV或其組合物及PD-1或其配位體之拮抗劑或其組合物可用作任何路線之療法(例如第一線、第二線、第三線、第四線或第五線療法)。在一特定實施例中，治療方法進一步包含向個體投與一或多種在章節5.7.6，例如章節5.7.6.1中所述之其他療法。
在一個實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體投與嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物(例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。在另一實施例中，本文呈現用於治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量之嵌合NDV及有效量之PD-1或其配位體之拮抗劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物(例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。嵌合NDV及拮抗劑可同時或相繼投與個體。在某些實施例中，嵌合NDV及拮抗劑在相同組合物中投與。在其他實施例中，嵌合NDV及拮抗劑在不同組合物中投與。嵌合NDV及拮抗劑可藉由相同或不同投與途徑投與個體。熟習此項技術者已知或本文所述之任何途徑可用於投與嵌合NDV及拮抗劑。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與且拮抗劑經靜脈內投與。在一些實施例中，嵌合NDV及拮抗劑經靜脈內投與。
在另一態樣中，本文中呈現嵌合NDV之用途，其用於製備與PD-1或其配位體之拮抗劑組合用於治療個體(例如人類個體)之癌症的藥劑，其中嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物(例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組。在另一態樣中，本文中呈現一種嵌合NDV，其用於治療個體(例如人類個體)之癌症的方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因的包裝基因組，且其中該方法進一步包含投與PD-1或其配位體(例如人類IL-12)之拮抗劑。在一特定實施例中，IL-12或其衍生物由感染嵌合NDV之細胞表現。嵌合NDV及拮抗劑可同時或相繼投與個體。在某些實施例中，嵌合NDV及拮抗劑在相同組合物中投與。在其他實施例中，嵌合NDV及拮抗劑在不同組合物中投與。嵌合NDV及拮抗劑可藉由相同或不同投與途徑投與個體。熟習此項技術者已知或本文所述之任何途徑可用於投與嵌合NDV及拮抗劑。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與且拮抗劑經靜脈內投與。在一些實施例中，嵌合NDV及拮抗劑經靜脈內投與。在另一實施例中，嵌合NDV經結節內投與且拮抗劑經靜脈內投與。
在另一實施例中，本文中呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體(例如人類個體)投與包含嵌合NDV之第一組合物及包含PD-1或其配位體之拮抗劑的第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在另一實施例中，本文中呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體(例如人類個體)投與嵌合NDV及PD-1或其配位體之拮抗劑，其中該嵌合NDV包含編碼IL-12之包裝基因組，且其中該PD-1之拮抗劑為結合於PD-1且阻斷(完全或部分) PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或兩者)之間的相互作用的抗體(本文中有時稱為「PD-1阻斷抗體」)。在另一實施例中，本文中呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體(例如人類個體)投與包含嵌合NDV之第一組合物及包含PD-1阻斷抗體之第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在另一實施例中，本文中呈現一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與包含嵌合新城雞瘟病毒(NDV)之第一組合物及包含PD-1阻斷抗體之第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類IL-12之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼人類IL-12 p40次單元及人類IL-12 p35次單元。在一特定實施例中，包含編碼人類IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 51中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼人類IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 52中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼人類IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 60中所闡述。在較佳實施例中，PD-1阻斷抗體為派姆單抗。在其他實施例中，PD-1阻斷抗體為納武單抗、MEDI0680、PDR001或阿特珠單抗。第一及第二組合物可藉由相同或不同投與途徑投與。熟習此項技術者已知或本文所述之任何途徑可用於投與第一及第二組合物。在一特定實施例中，第一組合物經瘤內投與且第二組合物經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二組合物經靜脈內投與。關於NDV之資訊參見例如上文章節5.1及5.2及下文章節6，關於PD-1或其配位體之拮抗劑之資訊參見上文章節5.5及下文章節6，且關於組合物及投與途徑之資訊參見上文章節5.5.1。
在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV的用途，其用於製備與PD-1或其配位體之拮抗劑組合用於治療個體(例如人類個體)之癌症的藥劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV的用途，其用於製備與PD-1或其配位體之拮抗劑組合用於治療個體(例如人類個體)之癌症的藥劑，其中該嵌合NDV包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之包裝基因組，且其中該PD-1之拮抗劑為結合於PD-1 (例如人類PD-1)且阻斷(完全或部分) PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或兩者)之間的相互作用的抗體(本文中有時稱為「PD-1阻斷抗體」)。在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV的用途，其用於製備與PD-1阻斷抗體組合用於治療個體(例如人類個體)之癌症的藥劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV的用途，其用於製備與PD-1阻斷抗體組合用於治療個體(例如人類個體)之癌症的藥劑，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 51中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 52中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 60中所闡述。在一特定實施例中，轉殖基因編碼具有表7中闡述之序列的IL-12胺基酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因編碼包含表7中闡述之胺基酸序列的IL-12胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12之轉殖基因包含表8中闡述之序列之核苷酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12之轉殖基因由表8中闡述之序列組成。在較佳實施例中，PD-1阻斷抗體為派姆單抗。在其他實施例中，PD-1阻斷抗體為納武單抗、MEDI0680、PDR001或阿特珠單抗。第一及第二組合物(亦即嵌合NDV及拮抗劑)可藉由相同或不同投與途徑投與。熟習此項技術者已知或本文所述之任何途徑可用於投與第一及第二組合物(亦即嵌合NDV及拮抗劑)。在一特定實施例中，第一組合物(亦即嵌合NDV)經瘤內投與且第二組合物(亦即拮抗劑)經靜脈內投與。在另一特定實施例中，第一組合物(亦即嵌合NDV)經結節內投與且第二組合物(亦即拮抗劑)經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二組合物(亦即嵌合NDV及拮抗劑)經靜脈內投與。關於NDV之資訊參見例如上文章節5.1及5.2及下文章節6，關於PD-1或其配位體之拮抗劑之資訊參見上文章節5.5及下文章節6，且關於組合物及投與途徑之資訊參見上文章節5.5.1。
在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV，其用於治療個體(例如人類個體)之癌症的方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與PD-1或其配位體之拮抗劑。在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV，其用於治療個體(例如人類個體)之癌症的方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元，其中該方法進一步包含投與PD-1或其配位體之拮抗劑，且其中該PD-1之拮抗劑為結合於PD-1 (例如人類PD-1)且阻斷(完全或部分) PD-1與其配位體(例如PD-L1、PD-L2或兩者)之間的相互作用的抗體(本文中有時稱為「PD-1阻斷抗體」)。在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV，其用於治療個體(例如人類個體)之癌症的方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與PD-1阻斷抗體。在另一實施例中，本文中呈現一種嵌合NDV，其用於治療個體(例如人類個體)之癌症的方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類IL-12之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與PD-1阻斷抗體。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 51中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 52中所闡述。在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列如SEQ ID NO: 60中所闡述。在較佳實施例中，PD-1阻斷抗體為派姆單抗。在其他實施例中，PD-1阻斷抗體為納武單抗、PDR001、MEDI0680或阿特珠單抗。第一及第二組合物(亦即嵌合NDV及拮抗劑)可藉由相同或不同投與途徑投與。熟習此項技術者已知或本文所述之任何途徑可用於投與第一及第二組合物(亦即嵌合NDV及拮抗劑)。在一特定實施例中，第一組合物(亦即嵌合NDV)經瘤內投與且第二組合物(亦即拮抗劑)經靜脈內投與。在另一特定實施例中，第一組合物(亦即嵌合NDV)經結節內投與且第二組合物(亦即拮抗劑)經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二組合物(亦即嵌合NDV及拮抗劑)經靜脈內投與。關於NDV之資訊參見例如上文章節5.1及5.2及下文章節6，關於PD-1或其配位體之拮抗劑之資訊參見上文章節5.5及下文章節6，且關於組合物及投與途徑之資訊參見上文章節5.5.1。
在一特定實施例中，嵌合NDV包含有包含編碼人類IL-12轉殖基因之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼IL-12 p40次單元及IL-12 p35次單元。關於IL-12轉殖基因之實例參見例如章節5.2.1、5.7及6。在一特定實施例中，嵌合NDV包含LaSota病毒株之NDV骨架。在一特定實施例中，嵌合NDV包含弱毒性NDV骨架。在一特定實施例中，包裝基因組包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列且該突變F蛋白質由嵌合NDV表現，其中該突變F蛋白質包含突變裂解位點。在一特定實施例中，包裝基因組包含編碼具有胺基酸突變L289A (亦即在與NDV La Sota病毒株F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A突變)之突變F蛋白質的核苷酸序列，其中該突變F蛋白質由嵌合NDV表現。在一特定實施例中，嵌合NDV包含作為LaSota病毒株之NDV骨架，且其中包裝基因組編碼具有胺基酸突變L289A (亦即在與NDV La Sota病毒株F蛋白質之L289相對應的胺基酸位置處L至A突變)之突變F蛋白質，其中該突變F蛋白質由嵌合NDV表現。關於編碼IL-12或其衍生物之嵌合NDV之實例，參見例如章節5.2及6。在一特定實施例中，嵌合NDV包含具有SEQ ID NO: 51、52或60中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為章節5.5及/或6中所述之拮抗劑。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為特異性結合於PD-1之配位體的抗體(或抗原結合片段)或可溶性受體。在某些實施例中，可溶性受體為特異性結合於PD-1之配位體的PD-1之片段或PD-1之衍生物之片段(例如PD-1或PD-1之衍生物之細胞外域)。在一些實施例中，可溶性受體為包含PD-1或PD-1之衍生物之至少一部分(例如PD-1或PD-1之衍生物之細胞外域)及異源胺基酸序列的融合蛋白。在特定實施例中，該融合蛋白包含PD-1或PD-1之衍生物之至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。在特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為特異性結合於PD-1之配位體的抗體(或抗原結合片段)。在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1，但不轉導抑制信號之抗體(或抗原結合片段)或配位體。在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1但不轉導抑制信號之配位體。在某些特定實施例中，該配位體為包含PD-1之配位體或PD-1之配位體之衍生物的至少一部分及異源胺基酸序列。在特定實施例中，該融合蛋白包含PD-1之配位體或PD-1之配位體之衍生物的至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。PD-1或其配位體之拮抗劑之非限制性實例包括派姆單抗(「KEYTRUDA®」；參見例如Hamid等人，N Engl J Med. 2013;369:134-44及Full Prescribing Information for KEYTRUDA (pembrolizumab)，參考ID: 3862712)、納武單抗(「OPDIVO®」；參見例如Topalian等人，N Engl J Med. 2012;366:2443-54及Full Prescribing Information for OPDIVO (nivolumab)，參考ID: 3677021)、AMP-224 (參見例如Infante等人，J Clin Oncol. 2013;31(增刊):abstr 3044)、MEDI0680 (亦稱為「AMP-514」；參見例如Hamid等人，Ann Oncol. 2016;27(增刊6):1050PD)、德瓦魯單抗(亦稱為「medi-4736」；參見例如Lutzky等人，J Clin Oncol. 2014;32(增刊5S):abstr 3001)、阿維魯單抗(例如用於梅克爾細胞癌)(亦稱為「MSB0010718C」；參見例如Heery等人 J Clin Oncol. 2014;32(增刊5S):abstr 3064)、bms-936559 (參見例如Brahmer等人 N. Engl. J. Med. 2012;366, 2455-2465)及阿特珠單抗(亦稱為「mpdl3280A」及「TECENTRIQ®」；參見例如McDermott等人，J Clin Oncol. 2016; 34(8):833-842；Herbst等人，J Clin Oncol. 2013;31(增刊):abstr 3000；及Full Prescribing Information for TECENTRIQ，參考ID: 3933242)。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為經美國FDA批准用於治療一或多種癌症之療法。經美國FDA批准用於治療癌症之PD-1或其配位體之拮抗劑的非限制性實例包括派姆單抗、納武單抗、阿特珠單抗及阿維魯單抗。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為經EMA批准用於治療一或多種癌症之療法。經EMA批准用於治療癌症之PD-1或其配位體之拮抗劑的非限制性實例包括派姆單抗、納武單抗及阿特珠單抗。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗、MEDI0680或派姆單抗。在較佳實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為派姆單抗。在另一實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗、AMP-224、MEDI0680、PDR001、德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗。
在一特定實施例中，IL-12轉殖基因編碼SEQ ID NO: 42中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12轉殖基因之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 53中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間，其中該包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 40中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 54中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 55中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，IL-12轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 43中闡述之胺基酸序列的胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12轉殖基因之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 63中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間，其中該包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 59中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列如SEQ ID NO: 55中所闡述。
在一特定實施例中，IL-12轉殖基因編碼SEQ ID NO: 22中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12轉殖基因之核苷酸序列如SEQ ID NO: 26中所闡述。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間，其中該包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 23中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 27中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列如SEQ ID NO: 29中所闡述。
在一特定實施例中，IL-12轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 39中闡述之胺基酸序列的胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12轉殖基因之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 61中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間，其中該包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 57中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，IL-12轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 42中闡述之胺基酸序列的胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12轉殖基因之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 66中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間，其中該包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 40中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 64中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 65中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，IL-12轉殖基因編碼包含SEQ ID NO: 43中闡述之胺基酸序列的胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12轉殖基因之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 68中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間。在一特定實施例中，轉殖基因插入包裝基因組之兩個轉錄單元之間，其中該包裝基因組之兩個轉錄單元為NDV P基因及NDV M基因之轉錄單元。在一特定實施例中，IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 57中闡述之核苷酸序列。在一特定實施例中，IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。在一特定實施例中，編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 65中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列包含SEQ ID NO: 51中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列包含SEQ ID NO: 52中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，包含編碼IL-12之轉殖基因之包裝基因組的序列包含SEQ ID NO: 60中闡述之核苷酸序列。
在一特定實施例中，嵌合NDV (或包含嵌合NDV之組合物)經由章節5.5.1及/或章節6中所述之途徑投與個體。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與個體。在一特定實施例中，瘤內投與為皮下的。在另一特定實施例中，嵌合NDV經結節內投與個體。在另一實施例中，嵌合NDV經靜脈內投與個體。
在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑(或包含拮抗劑之組合物)經由章節5.5.1及/或章節6中所述之途徑投與個體。在一特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑(或包含拮抗劑之組合物)經靜脈內投與個體。
在一特定實施例中，所治療之癌症為章節5.7.5及/或章節6中所述之癌症。在一特定實施例中，癌症為黑色素瘤、腎癌、肺癌、膀胱癌或頭頸癌。在一特定實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在一特定實施例中，頭頸癌為頭頸部之鱗狀細胞癌。在一特定實施例中，癌症為子宮癌、胃癌、食道癌、肝癌、腦癌或肉瘤。在一特定實施例中，癌症為復發性的或復發。在一特定實施例中，癌症為轉移性的。在一特定實施例中，癌症為不可切除的。在一特定實施例中，癌症包含皮膚、皮下或結節癌轉移。在一特定實施例中，如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查為PD-L1陽性。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤比例評分(TPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為至少1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%. 90%、95%、98%或100%，則切片檢查為PD-L1陽性。在另一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤比例評分(TPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為1%至100%、25%至50%、25%至100%、50%至75%、50%至100%或75%至100%，則切片檢查為PD-L1陽性。在其他實施例中，如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查為PD-L1陰性。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤比例評分(TPS)小於1%，則切片檢查為PD-L1陰性。
在一特定實施例中，個體為章節5.7.3及/或章節6中所述之個體。在一特定實施例中，個體對利用PD-1或其配位體之拮抗劑處理具頑抗性。在一特定實施例中，個體對利用納武單抗、AMP-224、MEDI0680、派姆單抗、德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗具頑抗性。在一特定實施例中，個體對利用單獨派姆單抗處理具頑抗性。在一特定實施例中，個體對利用單獨派姆單抗治療無反應。
在一特定實施例中，個體復發癌症且對利用PD-1或其配位體之拮抗劑處理具頑抗性。在一特定實施例中，個體復發癌症且對利用納武單抗、AMP-224、MEDI0680、派姆單抗、德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗之處理具頑抗性。在一特定實施例中，個體復發癌症且對利用派姆單抗處理具頑抗性。5.7.2 其他方法
在一個態樣中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)可用於治療癌症。在一個實施例中，本文提供用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物。在一特定實施例中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物。
在一特定實施例中，用於治療癌症之嵌合NDV包含編碼IL-12之包裝基因組(參見例如章節5.2及/或章節6)。
用於治療癌症之方法中所用的本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞癌症疫苗可用作任何路線之療法(例如第一線、第二線、第三線、第四線或第五線療法)。
在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)為投與治療癌症之唯一活性成分。在特定實施例中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)為投與治療癌症之組合物中的唯一活性成分。
嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物可局部或全身性投與個體。舉例而言，嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物可非經腸(例如靜脈內、動脈內或皮下)、瘤內、結節內、胸膜內、鼻內、腹膜內、腔內、顱內、經口、經直腸、藉由吸入、肌肉內、局部或皮內投與個體。在一特定實施例中，嵌合NDV經由肝動脈，藉由例如肝動脈注射投與，此可藉由介入性放射學或經由置放動脈輸注泵進行。在另一特定實施例中，嵌合NDV在手術中、藉由腹腔鏡、藉由內窺鏡或藉由影像指導來投與。在一特定實施例中，嵌合NDV之腹膜內投藥藉由直接注射、經由導管輸注或在腹腔鏡檢查期間注射來進行。在一特定實施例中，嵌合NDV經瘤內投與。在某些實施例中，影像指導用於投與嵌合NDV。在一特定實施例中，嵌合NDV經靜脈內投與。在另一特定實施例中，嵌合NDV經結節內投與。
在某些實施例中，本文所述之方法包括治療無治療方案可用之癌症。在一些實施例中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物作為其他習知療法之替代方法投與個體以治療癌症。
在一個實施例中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物及一或多種其他療法，諸如下文章節5.7.6中所述。在特定實施例中，一或多種療法與本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物組合投與個體以治療癌症。在一特定實施例中，其他療法係當前正用於，已用於或已知可用於治療癌症。在另一實施例中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)或其組合物與支持性療法、疼痛緩解療法或對癌症無治療作用之其他療法組合投與個體。在一特定實施例中，與本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)組合投與的一或多種其他療法為下文章節5.7.6.1中所述一或多種療法。在某些實施例中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)及一或多種其他療法在相同組合物中投與。在其他實施例中，嵌合NDV及一或多種其他療法在不同組合物中投與。
在某些實施例中，兩種、三種或多種NDV (包括本文所述之一種、兩種或更多種嵌合NDV，諸如上文章節5.2中所述之一種、兩種或更多種嵌合NDV)投與個體以治療癌症。根據包含向個體投與兩種、三種或多種NDV以治療癌症之本文所述之方法使用的第二或更多種嵌合NDV可為天然存在之嵌合NDV或經工程改造以表現異源胺基酸序列(例如細胞介素)之經工程改造之嵌合NDV。第一及第二嵌合NDV可為相同醫藥組合物或不同醫藥組合物之一部分。在某些實施例中，第一嵌合NDV及第二嵌合NDV藉由相同投藥途徑投與(例如兩者均經瘤內或經靜脈內投與)。在其他實施例中，第一嵌合NDV及第二嵌合NDV藉由不同投與途徑投與(例如一種經瘤內投與且另一種經靜脈內投與)。
在另一態樣中，本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)可與諸如本文在下文章節5.7.6 (例如下文章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法組合用於治療癌症。在一個實施例中，本文提供用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)或其組合物及諸如本文在下文章節5.7.6 (例如章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法。在一特定實施例中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)或其組合物及有效量之諸如下文章節5.7.6 (例如章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法。在某些實施例中，本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)及諸如下文章節5.7.6 (例如章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法在相同組合物中投與。在其他實施例中，NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)及一或多種其他療法在不同組合物中投與。
與一或多種其他療法組合使用之NDV可全身性或局部投與。舉例而言，NDV或其組合物可非經腸(例如靜脈內、動脈內或皮下)、瘤內、結節內、胸膜內、鼻內、腹膜內、顱內、經口、經直腸、藉由吸入、肌肉內、局部或皮內投與個體。在一特定實施例中，NDV經由肝動脈，藉由例如肝動脈注射投與，此可藉由介入性放射學或經由置放動脈輸注泵進行。在另一特定實施例中，NDV在手術中、藉由腹腔鏡或藉由內窺鏡來投與。在一特定實施例中，NDV之腹膜內投藥藉由直接注射、經由導管輸注或在腹腔鏡檢查期間注射來進行。
與諸如本文在下文章節5.7.6中所述之一或多種其他療法組合的本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞癌症疫苗可用作任何路線之療法(例如第一線、第二線、第三線、第四線或第五線療法)用於根據本文所述之方法治療癌症。
在另一態樣中，感染本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)的全癌細胞可用於治療癌症。在一特定實施例中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)可與癌細胞或癌細胞群體接觸且受感染之癌細胞或癌細胞群體可投與個體以治療癌症。在一個實施例中，癌細胞在感染本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)前經受γ輻射。在另一實施例中，癌細胞在感染本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)後經受γ輻射。在特定實施例中，癌細胞在投與個體前進行處理，從而使得癌細胞無法在個體中繁殖。在一特定實施例中，癌細胞無法在個體中繁殖且病毒無法感染個體。在一個實施例中，癌細胞在投與個體前經受γ輻射。在另一實施例中，癌細胞在投與個體前進行音波處理。在另一實施例中，癌細胞在投與個體前用絲裂黴素C (mitomycin C)處理。在另一實施例中，癌細胞在投與個體前藉由冷凍及解凍進行處理。在另一實施例中，癌細胞在投與個體前用熱處理進行處理。癌細胞可局部或全身性投與個體。舉例而言，癌細胞可非經腸(例如靜脈內或皮下)、瘤內、結節內、鼻內、經口、藉由吸入、胸膜內、局部或皮內投與個體。在一特定實施例中，癌細胞經瘤內投與個體之皮膚(例如皮內)。所用之癌細胞可為自體或同種異體。在一特定實施例中，嵌合NDV之骨架為非溶解性病毒株。癌細胞可單獨或與其他療法組合投與個體。癌細胞較佳在醫藥組合物中。在某些實施例中，癌細胞與諸如下文章節5.7.6中所述之一或多種其他療法組合投與。在某些實施例中，癌細胞及一或多種其他療法在相同組合物中投與。在其他實施例中，癌細胞及一或多種其他療法在不同組合物中投與。
在另一態樣中，感染本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)的全癌細胞可與下文章節5.7.6中所述之一或多種其他療法組合用於治療癌症。在一個實施例中，本文提供用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與感染本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)的全癌細胞與下文章節5.7.6中所述之一或多種其他療法組合。在一特定實施例中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之感染本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)的全癌細胞與有效量之下文章節5.7.6中所述之一或多種其他療法組合。在某些實施例中，感染本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)的全癌細胞及下文章節5.7.6.1中所述之一或多種其他療法在相同組合物中投與。在其他實施例中，感染本文所述之NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)的全癌細胞及一或多種其他療法在不同組合物中投與。
在另一態樣中，來自感染嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)之溶解癌細胞的蛋白質濃縮物或質膜製劑可用於治療癌症。在一個實施例中，包含來自感染本文所述之嵌合NDV之癌細胞的片段的質膜製劑可用於治療癌症。在另一實施例中，來自感染本文所述之嵌合NDV之癌細胞的蛋白質濃縮物可用於治療癌症。熟習此項技術者已知之技術可用於產生蛋白質濃縮物或質膜製劑。在一特定實施例中，本文所述之嵌合NDV (例如上文章節5.2中所述之嵌合NDV)可與癌細胞或癌細胞群體接觸且受感染之癌細胞或癌細胞群體可使用熟習此項技術者已知之技術溶解以獲得感染NDV之癌細胞的蛋白質濃縮物或質膜片段，且感染NDV之癌細胞的蛋白質濃縮物或質膜片段可投與個體以治療癌症。蛋白質濃縮物或質膜片段可局部或全身性投與個體。舉例而言，蛋白質濃縮物或質膜片段可非經腸、瘤內、結節內、鼻內、胸膜內、經口、藉由吸入、局部或皮內投與個體。在一特定實施例中，此類蛋白質濃縮物或質膜製劑經瘤內投與或投與個體皮膚(例如皮內)。用於產生蛋白質濃縮物或質膜製劑之癌細胞可為自體或同種異體。在一特定實施例中，嵌合NDV之骨架為溶解性病毒株。蛋白質濃縮物或質膜製劑可單獨或與其他療法組合投與個體。蛋白質濃縮物或質膜製劑較佳在醫藥組合物中。在某些實施例中，蛋白質濃縮物或質膜製劑與諸如下文章節5.7.6 (例如章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法組合投與。在某些實施例中，蛋白質濃縮物或質膜製劑及一或多種其他療法在相同組合物中投與。在其他實施例中，蛋白質濃縮物或質膜製劑及一或多種其他療法在不同組合物中投與。
在另一態樣中，來自感染NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)之溶解癌細胞的蛋白質濃縮物或質膜製劑可與諸如本文在下文章節5.7.6 (例如章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法組合用於治療癌症。在一個實施例中，本文提供用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與來自感染NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)之溶解癌細胞的蛋白質濃縮物或質膜製劑與諸如本文在下文章節5.7.6 (例如章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法組合。在一特定實施例中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之來自感染NDV (例如上文章節5.1中所述之NDV)之溶解癌細胞的蛋白質濃縮物或質膜製劑與有效量之諸如下文章節5.7.6 (例如章節5.7.6.1)中所述之一或多種其他療法組合。在某些實施例中，蛋白質濃縮物或質膜製劑及諸如下文章節5.7.6中所述之一或多種其他療法在相同組合物中投與。在其他實施例中，蛋白質濃縮物或質膜製劑及一或多種其他療法在不同組合物中投與。
在某些實施例中，用於治療癌症之方法包括國際專利申請公開案第WO 2014/158811號及美國專利申請公開案第2016/0015760 A1號及第2014/0271677 A1號之章節5.6中所述的方法，各者以全文引用的方式併入本文中。5.7.3 患者群體
在一些實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與罹患癌症之個體。在其他實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與傾向於患上或易患癌症之個體。在一些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與經診斷患有癌症之個體。本文中描述癌症類型之特定實例(參見例如章節5.7.5及章節6)。在一實施例中，個體患有轉移癌。在另一實施例中，個體患有1期、2期、3期或4期癌症。在另一實施例中，個體處於緩解中。在另一實施例中，個體復發癌症。
在某些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與0至6個月、6至12個月、6至18個月、18至36個月、1至5歲、5至10歲、10至15歲、15至20歲、20至25歲、25至30歲、30至35歲、35至40歲、40至45歲、45至50歲、50至55歲、55至60歲、60至65歲、65至70歲、70至75歲、75至80歲、80至85歲、85至90歲、90至95歲或95至100歲之人類。在特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與例如1歲、2歲、3歲、4歲、5歲、6歲、7歲、8歲、9歲、10歲、11歲、12歲、13歲、14歲、15歲、16歲或17歲之兒科患者。在某些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與1至5歲、2至5歲、1至10歲、2至10歲、5至10歲、1至18歲、2至18歲、5至18歲或10至18歲之兒科患者。在一些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與嬰兒。在其他實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與幼兒。在其他實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與兒童。在一些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與18歲以上之成人患者。在其他實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與成年人。在其他實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與老年人。在一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與展現皮膚或皮下腫瘤或淋巴結內腫瘤之患者。
在某些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與處於免疫功能降低狀態或免疫抑制狀態或者處於變得免疫功能降低或免疫抑制之風險下的個體。在某些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與接受免疫抑制療法或自免疫抑制療法恢復之個體。在某些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與患有癌症或處於患上癌症之風險下的個體。在某些實施例中，個體正、將或已經受手術、化學療法及/或放射線療法。在某些實施例中，患者已經受手術以移除腫瘤或贅瘤。在特定實施例中，在移除腫瘤或或贅瘤之手術後向患者投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法。在其他實施例中，在進行移除腫瘤或或贅瘤之手術前向患者投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法。在某些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與具有、將具有或曾具有組織移植、器官移植或輸注之個體。
在一些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實難以用除嵌合NDV或其組合物、腫瘤溶解劑、全細胞疫苗或組合療法外之療法治療，但不再進行此等療法的患者。在一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實難以用化學療法治療之患者。在一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實為用PD-1或其配位體之拮抗劑治療難治或無反應的患者。在一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的患者。在一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實為用PD-1阻斷抗體(例如派姆單抗或納武單抗)治療難治或無反應的患者。在一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實為用PD-1阻斷抗體(例如派姆單抗或納武單抗)之單一療法治療難治或無反應的患者。在一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實為用PD-L1阻斷抗體(例如阿特珠單抗)治療難治或無反應的患者。在另一特定實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與已證實為用PD-L1阻斷抗體(例如阿特珠單抗)單一療法治療難治或無反應的患者。在一特定實施例中，患者已證實難治之療法為組合療法之一部分。舉例而言，在一特定實施例中，患者已證實難以用PD-1或其配位體之拮抗劑治療；然而，不束縛於任何特定理論，患者對用PD-1或其配位體之拮抗劑與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法組合治療起反應。可藉由此項技術中已知之任何方法確定癌症是否難治。在某些實施例中，難治患者為難以用標準療法治療之患者。在一些實施例中，癌症患者最初對療法起反應，但隨後變得難治。
在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用除嵌合NDV或其組合物、溶解腫瘤、全細胞疫苗或組合療法外之療法治療後復發的患者。在一些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-1或其配位體之拮抗劑治療後復發的患者。在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療後復發的患者。在一些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-1阻斷抗體(例如派姆單抗或納武單抗)治療後復發的患者。在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-1阻斷抗體(例如派姆單抗或納武單抗)單一療法治療後復發的患者。在一些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-L1阻斷抗體(例如阿特珠單抗)治療後復發的患者。在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-L1阻斷抗體(例如阿特珠單抗)單一療法治療後復發的患者。
在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用除嵌合NDV或其組合物、腫瘤溶解劑、全細胞疫苗或組合療法外之療法治療後復發且為用PD-1或其配位體之拮抗劑治療難治或無反應的患者。在一些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-1或其配位體之拮抗劑治療後復發且為用PD-1或其配位體單一療法治療難治或無反應的患者。在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-1阻斷抗體(例如派姆單抗或納武單抗)治療後復發且為用PD-1阻斷抗體單一療法治療難治或無反應的患者。在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為在用PD-L1阻斷抗體(例如阿特珠單抗)治療後復發且為用PD-L1阻斷抗體單一療法治療難治或無反應的患者。
在某些實施例中，待根據本文所述之方法治療的患者為已用抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑或其他生物療法/免疫療法或抗癌療法治療之患者。此等患者尤其為難治患者及過於年輕而無法用習知療法治療之患者。在一些實施例中，投與NDV (例如嵌合NDV)、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的個體在投與嵌合NDV或組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗或組合療法前尚未接受療法。
在一些實施例中，向患者投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法以預防處於顯現癌症之風險下的患者中癌症發作。在一些實施例中，化合物投與容易對習知療法產生不良反應之患者。
在一些實施例中，投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的個體未曾接受先前療法。在其他實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法投與在投與嵌合NDV (例如嵌合NDV)或組合物、腫瘤溶解劑、全細胞疫苗或組合療法前已接受療法的個體。在一些實施例中，投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的個體經歷對先前療法之不良副作用或先前療法由於對個體不可接受之毒性水準而中斷。
在一特定實施例中，投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的個體患有一或多種PD-L1陽性腫瘤或惡性病。在一特定實施例中，腫瘤或惡性病為PD-L1陽性。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之腫瘤比例評分(TPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為至少1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%. 90%、95%、98%或100%，則腫瘤或惡性病為PD-L1陽性。在另一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之腫瘤比例評分(TPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為1%至100%、25%至50%、25%至100%、50%至75%、50%至100%或75%至100%，則腫瘤或惡性病為PD-L1陽性。
在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之組合陽性評分(CPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為至少1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%，則腫瘤或惡性病為PD-L1陽性。在另一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之組合陽性評分(CPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為1%至100%、25%至50%、25%至100%、50%至75%、50%至100%或75%至100%，則腫瘤或惡性病為PD-L1陽性。為確定CPS，確定來自個體之腫瘤組織樣品中可存活PD-L1陽性腫瘤細胞之數目、可存活PD-L1陰性腫瘤細胞之數目及可存活PD-L1陽性單核發炎細胞(MIC)之數目，且接著使用下式計算組合陽性評分(CPS)：CPS=(PD-L1陽性腫瘤細胞之數目+PD-L1陽性單核發炎細胞(MIC)之數目/PD-L1陽性腫瘤細胞+PD-L1陰性腫瘤細胞之數目)×100%。關於組合陽性評分(CPS)之描述，參見例如美國專利申請公開案第2017/0285037號及Kulangara等人，Journal of Clinical Oncology 2017 35:15_增刊, e14589-e14589，各者以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的個體患有一或多種PD-L1陰性腫瘤或惡性病。在一特定實施例中，腫瘤或惡性病為PD-L1陰性。在一特定實施例中，如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查為PD-L1陰性。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之腫瘤比例評分(TPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比小於1%，則腫瘤或惡性病為PD-L1陰性。
在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之組合陽性評分(CPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比小於1%，則腫瘤或惡性病為PD-L1陰性。
在一特定實施例中，投與NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗或本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的個體患有一或多種具有低水準PD-L1之腫瘤或惡性病。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之腫瘤比例評分(TPS)介於1%至50%或1%至40%、1%至30%、1%至25%、1%至15%或1%至10%之間，則腫瘤或惡性病具有低PD-L1表現水準。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之腫瘤比例評分(TPS)小於50%但大於或等於1%，則腫瘤或惡性病具有低PD-L1表現水準。
在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之組合陽性評分(CPS)介於1%至50%或1%至40%、1%至30%、1%至25%、1%至15%或1%至10%之間，則腫瘤或惡性病具有低PD-L1表現水準。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，腫瘤或惡性病之切片檢查之組合陽性評分(CPS)小於50%但大於或等於1%，則腫瘤或惡性病具有低PD-L1表現水準。
在一特定實施例中，ELISA用於確定腫瘤細胞是否為PD-L1陽性及/或確定腫瘤或惡性病是否具有低水準PD-L1。在一特定實施例中，免疫組織化學用於確定腫瘤細胞是否為PD-L1陰性、PD-L1陽性及/或腫瘤或惡性病是否具有低水準PD-L1。在一特定實施例中，根據經美國食品與藥物管理局批准用於確定PD-L1水準之一或多種分析，確定腫瘤或惡性病(或其切片檢查)為PD-L1陰性、PD-L1陽性及/或具有低水準PD-L1。美國食品與藥物管理局批准用於確定PD-L1水準之分析的非限制性實例包括PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Dako North America, Inc.製造)及Ventana PD-L1 (SP142)分析(Ventana Medical Systems, Inc.製造)。在另一特定實施例中，根據在臨床實驗室改進法案修正案(Clinical Laboratory Improvement Amendments)認證之實驗室中進行的實驗室發展之測試，確定腫瘤或惡性病(或其切片檢查)中之PD-L1水準。5.7.4 劑量及頻率
有效治療癌症之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗之量將視癌症性質、投藥途徑、個體整體健康等而定，且應根據行醫者之判斷來決定。標準臨床技術，諸如活體外分析，可視情況用於幫助鑑別最佳劑量範圍。然而，用於投與之NDV的合適劑量範圍一般為約102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu，且最佳為約104 至約1012 、106 至1012 、108 至1012 、109 至1012 或109 至1011 pfu，且可常常根據需要在時間間隔下投與個體一次、兩次、三次、四次或更多次。用於投與之溶解腫瘤疫苗之劑量範圍可包括0.001 mg、0.005 mg、0.01 mg、0.05 mg. 0.1 mg. 0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg. 3.0 mg、4.0 mg、5.0 mg、10.0 mg、0.001 mg至10.0 mg、0.01 mg至1.0 mg、0.1 mg至1 mg及0.1 mg至5.0 mg，且可常常根據需要在時間間隔下投與個體一次、兩次、三次或更多次。用於投與之全細胞疫苗之劑量範圍可包括102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 個細胞，且可常常根據需要在時間間隔下投與個體一次、兩次、三次或更多次。在某些實施例中，類似於NDV、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗當前用於臨床試驗中之劑量投與個體。可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推出有效劑量。
在某些實施例中，NDV (例如嵌合NDV)或其組合物以單次劑量投與個體，接著在1至6週、1至5週、1至4週、1至3週、1至2週後投與第二劑量。根據此等實施例，可在第二次接種後以6至12個月時間間隔向個體投與追加接種。在某些實施例中，溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗以單次劑量投與個體，接著在1至6週、1至5週、1至4週、1至3週、1至2週後投與第二劑量。
在某些實施例中，相同NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗之投與可重複且投與可分開至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。在其他實施例中，相同NDV (例如NDV)或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗之投與可重複且投與可分開1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3個月、3至6個月、3至12個月或6至12個月。在一些實施例中，第一NDV (例如第一嵌合NDV)或其組合物投與個體，接著投與第二NDV (例如第二嵌合NDV)或其組合物。在某些實施例中，第一及第二NDV (例如第一及第二嵌合NDV)或其組合物可分開至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。在其他實施例中，第一及第二NDV (例如第一及第二嵌合NDV)或其組合物可分開1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3個月、3至6個月、3至12個月或6至12個月。
在某些實施例中，NDV或其組合物或者溶解腫瘤疫苗或者全細胞疫苗與一或多種其他療法，諸如下文章節5.7.6中所述之療法組合投與個體。一或多種其他療法之劑量將視多種因素而定，該等因素包括例如療法、癌症性質、投藥途徑、個體之整體健康等，且應根據行醫者之判斷來決定。在特定實施例中，其他療法之劑量為針對根據本文所揭示之方法所用，用作單一藥劑之療法所推薦的療法之投與劑量及/或頻率。在其他實施例中，其他療法之劑量為比針對根據本文所揭示之方法所用，用作單一藥劑之療法所推薦低的療法劑量及/或更不頻繁之投與。經批准療法之推薦劑量可見於Physician's Desk Reference中。
在某些實施例中，NDV或其組合物或者溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗與投與一或多種其他療法同時投與個體。在其他實施例中，NDV或其組合物或者溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗每3至7天、1至6週、1至5週、1至4週、2至4週、1至3週或1至2週投與個體，且一或多種其他療法(諸如下文章節5.7.6中所述)每3至7天、1至6週、1至5週、1至4週、1至3週或1至2週投與。在某些實施例中，NDV或其組合物或者溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗每1至2週投與個體且一或多種其他療法(諸如下文章節5.7.6中所述)每2至4週投與。在一些實施例中，NDV或其組合物或者溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗每週投與個體且一或多種其他療法(諸如下文章節5.7.6中所述)每2週投與。
用於治療個體之PD-1或其配位體之拮抗劑的劑量將視多種因素而定，該等因素包括例如療法、癌症性質、投藥途徑、個體整體健康等，且應根據行醫者之判斷來決定。在特定實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑之劑量為針對根據本文所揭示之方法所用，用作單一藥劑之PD-1或其配位體之拮抗劑所推薦的PD-1或其配位體之拮抗劑之投與劑量及/或頻率。在一些實施例中，PD-1或其配位體之拮抗劑之劑量為比針對根據本文所揭示之方法所用，用作單一藥劑之PD-1或其配位體之拮抗劑所推薦低的療法劑量及/或更不頻繁之投與。經批准療法之推薦劑量可見於Physician's Desk Reference中。
在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗的一特定實施例中，納武單抗之劑量可為作為靜脈內輸注，在一段時間、例如30分鐘內每兩週240 mg。參見例如Full Prescribing Information for OPDIVO，2018年4月修訂，其以全文引用的方式併入本文中。在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗的另一特定實施例中，納武單抗之劑量可為作為靜脈內輸注，在一段時間、例如30分鐘內每四週480 mg。同上。在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗的另一特定實施例中，納武單抗之劑量可為作為靜脈內輸注，在一段時間、例如60分鐘內每兩週3 mg/kg。參見例如Full Prescribing Information for OPDIVO，參考ID: 3677021，其以全文引用的方式併入本文中。在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為派姆單抗的另一特定實施例中，派姆單抗之劑量可為作為靜脈內輸注，在一段時間、例如30分鐘內每三週200 mg。參見例如Full Prescribing Information for KEYTRUDA，2017年11月修訂，其以全文引用的方式併入本文中。在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為派姆單抗的另一特定實施例中，派姆單抗之劑量可為作為靜脈內輸注，在一段時間、例如30分鐘內每三週2 mg/kg。參見例如Full Prescribing Information for KEYTRUDA，參考ID: 3862712，其以全文引用的方式併入本文中。在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為派姆單抗的另一特定實施例中，派姆單抗之劑量可為作為靜脈內輸注，在一段時間、例如30分鐘內每三週2 mg/kg與至多200 mg/kg之間。參見例如Full Prescribing Information for KEYTRUDA，參考ID: 3862712，其以全文引用的方式併入本文中。在其中PD-1或其配位體之拮抗劑為阿特珠單抗的一特定實施例中，阿特珠單抗之劑量可為作為靜脈內輸注，在一段時間、例如60分鐘內每三週1,200 mg。參見例如Full Prescribing Information for TECENTRIQ，參考ID: 4000525，其以全文引用的方式併入本文中。5.7.5 癌症類型
可根據本文所述之方法治療的癌症之特定實例包括(但不限於)：白血病，諸如(但不限於)急性白血病、急性淋巴球性白血病、急性骨髓細胞性白血病(諸如骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核細胞性、單核細胞性及紅細胞系白血病)及骨髓發育不良症候群；骨髓纖維化、慢性白血病(諸如(但不限於)慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病、慢性淋巴球性白血病、毛細胞白血病)；真性紅細胞增多症；淋巴瘤，諸如(但不限於)霍奇金病(Hodgkin disease)、非霍奇金病；多發性骨髓瘤，諸如(但不限於)鬱積型多發性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、漿細胞白血病、孤立漿細胞瘤及髓外漿細胞瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症；意義未明之單株丙種球蛋白病；良性單株丙種球蛋白病；重鏈病；骨骼及結締組織肉瘤，諸如(但不限於)骨骼肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、惡性巨細胞瘤、骨骼纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(血管肉瘤)、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神經鞘瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤；腦瘤，諸如(但不限於)神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、室管膜瘤、少突神經膠質瘤、非膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、聽神經瘤、顱咽管瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、松果體細胞瘤、松果體母細胞瘤、原發性腦淋巴瘤；乳癌，包括(但不限於)三陰性乳癌、ER+/HER2-乳癌、導管癌、腺癌、小葉(癌細胞)癌、管內癌、髓樣乳癌、黏液性乳癌、管狀乳癌、乳頭狀乳癌、佩吉特氏病(Paget's disease)及發炎性乳癌；腎上腺癌，諸如(但不限於)嗜鉻細胞瘤及腎上腺皮質癌；甲狀腺癌，諸如(但不限於)乳頭狀或濾泡狀甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌及未分化甲狀腺癌；胰臟癌，諸如(但不限於)胰島素瘤、胃泌素瘤、升糖素瘤、血管活性腸肽瘤、分泌生長抑素腫瘤及類癌或胰島細胞腫瘤；垂體癌，諸如但限於庫欣氏病(Cushing's disease)、分泌促乳素腫瘤、肢端肥大症及尿崩症；眼癌，諸如(但不限於)眼部黑色素瘤，諸如虹膜黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤及睫狀體黑色素瘤及視網膜母細胞瘤；陰道癌，諸如鱗狀細胞癌、腺癌及黑色素瘤；外陰癌，諸如鱗狀細胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底細胞癌、肉瘤及佩吉特氏病；子宮頸癌，諸如(但不限於)鱗狀細胞癌及腺癌；子宮癌，諸如(但不限於)子宮內膜癌及子宮肉瘤；卵巢癌，諸如(但不限於)卵巢上皮癌、交界性腫瘤、生殖細胞腫瘤及基質腫瘤；食管癌，諸如(但不限於)鱗狀癌、腺癌、腺樣囊性癌症、黏液表皮樣癌、腺鱗癌、肉瘤、黑色素瘤、漿細胞瘤、疣狀癌及燕麥細胞(癌細胞)癌；胃癌，諸如(但不限於)腺癌、真菌樣(息肉樣)、潰瘍型、表面擴展型、彌漫性擴展型、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤及癌肉瘤；結腸癌；直腸癌；肝癌，諸如(但不限於)肝細胞癌及肝母細胞瘤；膽囊癌，諸如腺癌；膽管癌，諸如(但不限於)乳頭狀、結節狀及彌漫性；肺癌，諸如非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌(表皮樣癌)、腺癌、大細胞癌及癌細胞肺癌；睪丸癌，諸如(但不限於)胚胎腫瘤、精原細胞瘤、未分化、經典(典型)、精母細胞型、非精原細胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、絨膜癌(卵黃囊瘤)；前列腺癌，諸如(但不限於)前列腺上皮內贅瘤、腺癌、平滑肌肉瘤及橫紋肌肉瘤；陰莖癌；口腔癌，諸如(但不限於)鱗狀細胞癌；基底癌；唾液腺癌，諸如(但不限於)腺癌、黏液表皮樣癌及腺樣囊性癌；咽癌，諸如(但不限於)鱗狀細胞癌及疣狀；皮膚癌，諸如(但不限於)基底細胞癌、鱗狀細胞癌及黑色素瘤、淺表擴散性黑素瘤、結節狀黑色素瘤、雀斑痣樣惡性黑色素瘤、肢端雀斑痣樣黑色素瘤；腎臟癌，諸如(但不限於)腎細胞癌、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細胞癌(腎盂及/或輸尿管)；威爾姆斯氏腫瘤(Wilms'tumor)；膀胱癌，諸如(但不限於)移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括黏液肉瘤、骨原性肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、間皮瘤、滑膜瘤、血管母細胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支氣管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌及乳頭狀腺癌(關於此類病症之評述，參見Fishman等人，1985, Medicine，第2版，J.B. Lippincott Co., Philadelphia及Murphy等人，1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America)。
在一特定實施例中，本文所述之嵌合NDV或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗、本文中之全細胞疫苗或本文所述之組合療法可適用於治療多種癌症及異常增生性疾病，包括(但不限於)以下：癌瘤，包括膀胱、乳房、結腸、腎臟、肝臟、肺、卵巢、胰臟、胃、子宮頸、甲狀腺及皮膚之癌瘤；包括鱗狀細胞癌；淋巴系之造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤；骨髓系之造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞性白血病；源自間葉細胞之腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周邊神經系統之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；源自間葉細胞之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎癌。
在一些實施例中，與細胞凋亡異常相關之癌症根據本文所述之方法治療。此類癌症可包括(但不限於)：濾泡淋巴瘤、具有p53突變之癌瘤、乳房、前列腺及卵巢之激素依賴性腫瘤以及諸如家族性腺瘤性息肉病及骨髓發育不良症候群之癌變前病變。在特定實施例中，惡性病或增殖異常變化(諸如化生及發育不良)或皮膚、肺、肝臟、骨骼、腦、胃、結腸、乳房、前列腺、膀胱、腎臟、胰臟、卵巢及/或子宮之過度增殖性病症根據本文所述之方法治療。在其他特定實施例中，肉瘤或黑色素瘤根據本文所述之方法治療。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)。可根據本文所述之方法治療的白血病及其他血源性癌症之特定實例包括(但不限於)急性淋巴母細胞白血病「ALL」、急性淋巴母細胞性B細胞白血病、急性淋巴母細胞性T細胞白血病、急性骨髓母細胞白血病「AML」、急性前髓細胞性白血病「APL」、急性單核母細胞性白血病、急性紅白血病、急性巨核母細胞性白血病、急性骨髓單核細胞性白血病、急性非淋巴細胞性白血病、急性未分化白血病、慢性骨髓細胞性白血病「CML」、慢性淋巴球性白血病「CLL」及毛細胞白血病。
可根據本文所述之方法治療的淋巴瘤之特定實例包括(但不限於)霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(諸如彌漫性大B細胞淋巴瘤)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、重鏈病及真性紅細胞增多症。
在另一實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為實體腫瘤。可根據本文所述之方法治療的實體腫瘤之實例包括(但不限於)纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、胰臟癌、骨癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝瘤、膽管癌瘤、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、癌細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、皮膚癌、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。在另一實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為轉移性的。在另一實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為惡性的。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為黑色素瘤(例如晚期黑色素瘤)、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、經典霍奇金淋巴瘤、晚期尿道上皮癌、微衛星不穩定性高癌症或胃或胃食道連接部腺癌。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為子宮癌、胃癌、食道癌、肝癌、腦癌或肉瘤。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為(1)難治性經典霍奇金淋巴瘤、(2)復發性或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌、(3)不可切除性或轉移性黑色素瘤、(4)局部或晚期或轉移性尿道上皮癌、(5)伴有表現計劃性死亡配位體1 (「PD-L1」)之腫瘤(例如CPS ≥1之腫瘤)的復發性局部晚期或轉移性胃或胃食道腺癌、(6)在先前治療後進展且無令人滿意之替代治療選擇方案的不可切除性或轉移性、高微衛星不穩定性癌症或錯配修復缺陷實體腫瘤，或在用氟嘧啶、奧沙利鉑及伊立替康治療後進展的結腸直腸癌，及(7)具有表現PD-L1之腫瘤(例如TPS≥1%或50%之腫瘤)的轉移性非小細胞肺癌。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸癌(HNSCC頭頸部鱗狀細胞癌)、尿道上皮癌、三陰性乳癌、胃癌、經典霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、間皮瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛門癌、膽道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷癌症(組織未定性)或具有高腫瘤突變負荷之腫瘤(組織未定性)。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為具有不良預後及/或對諸如化學療法及放射線之習知療法的反應不良的癌症。在另一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為惡性黑色素瘤、惡性神經膠質瘤、腎細胞癌、胰腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺腺癌、肺小細胞癌瘤、肺鱗狀細胞癌、未分化甲狀腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌。在另一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為下文章節6中所述之癌症類型。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為難治性霍奇金淋巴瘤、復發性或轉移性頭頸部鱗狀細胞癌、不可切除性或轉移性黑色素瘤或者轉移性非小細胞肺癌。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為PD-L1陽性。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中腫瘤比例評分(TPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為至少1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%. 90%、95%、98%或100%，則癌症為PD-L1陽性。在另一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中TPS，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為至少1%或1%至100%，則癌症為PD-L1陽性。在另一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中TPS，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為1%至100%、25%至50%、25%至100%、50%至75%、50%至100%或75%至100%，則癌症為PD-L1陽性。在一特定實施例中，使用TPS評分確定為PD-L1陽性之癌症為非小細胞肺癌。
在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中組合陽性評分(CPS)，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為至少1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%. 90%、95%、98%或100%，則癌症為PD-L1陽性。在另一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中CPS，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為至少1%或1%至100%，則癌症為PD-L1陽性。在另一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中CPS，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比為1%至100%、25%至50%、25%至100%、50%至75%、50%至100%或75%至100%，則癌症為PD-L1陽性。在一特定實施例中，使用CPS評分確定為PD-L1陽性之癌症為胃癌(例如復發性局部晚期轉移性胃或胃食道連接部腺癌)。
在一些特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為PD-L1陰性。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中TPS，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比小於1%，則癌症為PD-L1陰性。在一特定實施例中，使用TPS評分確定為PD-L1陰性之癌症為非小細胞肺癌。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中TPS，亦即針對PD-L1染色之細胞百分比介於1%至50%或1%至40%、1%至30%、1%至25%、1%至15%或1%至10%之間，則癌症具有低PD-L1表現水準。在一特定實施例中，若如藉由此項技術中已知或本文所述之技術，諸如免疫組織化學或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies Inc.)評估，癌症之切片檢查中TPS，亦即針對PDL1染色之細胞百分比小於50%但大於或等於1%，則癌症具有低PD-L1表現水準。
在一特定實施例中，ELISA用於確定癌症之切片檢查是否為PD-L1陽性、PD-L1陰性及/或具有低PD-L1表現水準。在一特定實施例中，免疫組織化學用於確定癌症之切片檢查是否為PD-L1陽性、PD-L1陰性及/或具有低PD-L1表現水準。在一特定實施例中，根據經美國食品與藥物管理局批准用於確定PD-L1水準之一或多種分析，確定腫瘤或惡性病(或其切片檢查)為PD-L1陽性、PD-L1陰性及/或具有低PD-L1表現水準。美國食品與藥物管理局批准用於確定PD-L1水準之分析的非限制性實例包括PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Dako North America, Inc.製造)及Ventana PD-L1 (SP142)分析(Ventana Medical Systems, Inc.製造)。在另一特定實施例中，根據在臨床實驗室改進法案修正案認證之實驗室中進行的實驗室發展之測試，確定腫瘤或惡性病(或其切片檢查)中之PD-L1水準。在另一特定實施例中，使用PCR確定腫瘤或惡性病(或其切片檢查)中之PD-L1水準。在另一特定實施例中，藉由使用來自NanoString Technologies之套組，評估某些腫瘤相關基因之基因表現圖譜，確定腫瘤或惡性病(或其切片檢查)中之PD-L1水準。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為用PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)單一療法治療難治或無反應的。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為用PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)單一療法治療難治或無反應的。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為PD-L1陰性且為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為PD-L1陰性且為用PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)單一療法治療難治或無反應的。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為PD-L1陰性且為用PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)單一療法治療難治或無反應的。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準且為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準且為用PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)單一療法治療難治或無反應的。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準且為用PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)單一療法治療難治或無反應的。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症復發。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症復發且為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的。在另一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症復發且為用PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)單一療法治療難治或無反應的。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症復發且為用PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)單一療法治療難治或無反應的。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為PD-L1陰性且復發。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準且復發。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症復發，為PD-L1陰性且為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症復發，為PD-L1陰性且為用PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)單一療法治療難治或無反應的。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症復發，為PD-L1陰性且為用PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)單一療法治療難治或無反應的。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準，且復發且為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準，且復發且為用PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)單一療法治療難治或無反應的。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症具有低PD-L1表現水準，且復發且為用PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)單一療法治療難治或無反應的。
在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為用PD-1或其配位體之拮抗劑單一療法治療難治或無反應的。在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為用PD-1阻斷抗體(例如納武單抗或派姆單抗)單一療法治療難治或無反應的。在特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為用PD-L1阻斷抗體(例如阿維魯單抗)單一療法治療難治或無反應的。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為轉移性癌症。在一特定實施例中，癌症包含皮膚、皮下或結節癌轉移。在一特定實施例中，癌症包含腹膜或胸膜癌轉移。在一特定實施例中，癌症包含內臟器官癌轉移，諸如肝臟、腎臟、脾臟或肺癌轉移。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為復發/難治性實體腫瘤類型，諸如黑色素瘤、肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌(SSCHN)、具有皮膚癌轉移之乳癌及伴有可及皮膚/SC/結節癌轉移之其他惡性病。
在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療的癌症為不可切除性癌症。熟練技術人員已知之任何方法可用於確定癌症是否為不可切除的。5.7.6 其他療法
可與本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗組合用於治療癌症之其他療法包括(但不限於)小分子、合成藥物、肽(包括環狀肽)、多肽、蛋白質、核酸(例如DNA及RNA核苷酸，包括(但不限於)反義核苷酸序列、三重螺旋、RNAi及編碼生物活性蛋白質、多肽或肽之核苷酸序列)、抗體、合成或天然無機分子、模擬劑及合成或天然有機分子。在一特定實施例中，其他療法為化學治療劑。
在一些實施例中，本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗與包含使用x射線、γ射線及其他放射線來源破壞癌細胞之放射線療法組合使用。在特定實施例中，放射線療法呈外部射束放射線或遠隔療法投與，其中放射線自遠端源導入。在其他實施例中，放射線療法呈內部療法或近接療法投與，其中放射性來源置放在體內靠近癌細胞及/或腫瘤塊處。
在某些實施例中，本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗與授受性T細胞療法組合使用。在一特定實施例中，用於授受性T細胞療法中之T細胞為已自個體分離之腫瘤浸潤性淋巴細胞且特定T細胞或純系已擴增以供使用。在一些實施例中，用於授受性T細胞療法中之T細胞為在患者接受癌症疫苗且在使用之前在活體外擴增後獲自患者血液的T細胞。在另一特定實施例中，用於授受性T細胞療法中之T細胞為已用於有效地識別及侵襲腫瘤之T細胞。在另一特定實施例中，用於授受性T細胞療法中之T細胞已經基因修飾以表現腫瘤抗原特異性T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)。在一特定實施例中，所用授受性T細胞療法類似於國際公開案第WO 2014/158811號及美國專利申請公開案第2016/0015760號之章節6.2中所述的授受性T細胞療法，各者以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗與細胞介素組合使用。在一特定實施例中，本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗與干擾素(例如IFN-γ)組合使用。
當前可用之癌症療法及其劑量、投與途徑及推薦用途為此項技術中已知且已描述於諸如Physician's Desk Reference (第67版，2013)之文獻中。
可與本文所述之NDV或其組合物組合使用的抗癌劑之特定實例包括：激素劑(例如芳香酶抑制劑、選擇性雌激素受體調節劑(SERM)及雌激素受體拮抗劑)、化學治療劑(例如微管拆卸阻斷劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑及DNA交聯劑或破壞劑)、抗血管生成劑(例如VEGF拮抗劑、受體拮抗劑、整合素拮抗劑、血管靶向劑(VTA)/血管破壞劑(VDA))、放射線療法及習知手術。
可與本文所述之NDV或其組合物組合使用的激素劑之非限制性實例包括芳香酶抑制劑、SERM及雌激素受體拮抗劑。作為芳香酶抑制劑之激素劑可為類固醇或非類固醇。非類固醇激素劑之非限制性實例包括來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、胺魯米特(aminoglutethimide)、法屈唑(fadrozole)及伏羅唑(vorozole)。類固醇激素劑之非限制性實例包括阿諾新(aromasin)(依西美坦(exemestane))、福美司坦(formestane)及睾內酯(testolactone)。作為SERM之激素劑之非限制性實例包括他莫昔芬(tamoxifen)(商標為/作為Nolvadex®出售)、阿非昔芬(afimoxifene)、阿佐昔芬(arzoxifene)、巴多昔芬(bazedoxifene)、克羅米芬(clomifene)、芬瑪瑞(femarelle)、拉索昔芬(lasofoxifene)、奧美昔芬(ormeloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)及托瑞米芬(toremifene)。作為雌激素受體拮抗劑之激素劑之非限制性實例包括氟維司群(fulvestrant)。其他激素劑包括(但不限於)阿比特龍(abiraterone)及洛納瑞森(lonaprisan)。
可與本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗組合使用的化學治療劑之非限制性實例包括微管拆卸阻斷劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑及DNA交聯劑或破壞劑。作為微管拆卸阻斷劑之化學治療劑包括(但不限於)紫杉類(taxenes)(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(商標為/作為TAXOL®出售)、多烯紫杉醇(docetaxel)、阿布拉生(abraxane)、拉洛他賽(larotaxel)、奧他賽(ortataxel)及替司他賽(tesetaxel))；埃博黴素(epothilones)(例如伊沙匹隆(ixabepilone))；以及長春花生物鹼(例如長春瑞賓(vinorelbine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春新鹼(vincristine)(商標為/作為ONCOVIN®出售))。
作為抗代謝物之化學治療劑包括(但不限於)葉酸抗代謝物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、胺基喋呤(aminopterin)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed))；嘌呤抗代謝物(例如克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、氟達拉賓(fludarabine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、噴司他丁(pentostatin)、硫鳥嘌呤(thioguanine))；嘧啶抗代謝物(例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR® )、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他濱(decitabine)、氟尿苷(floxuridine)、喃氟啶(tegafur))；以及去氧核糖核苷酸抗代謝物(例如羥基脲(hydroxyurea))。
作為拓樸異構酶抑制劑之化學治療劑包括(但不限於) I類(喜樹屬(camptotheca))拓樸異構酶抑制劑(例如拓朴替康(topotecan) (商標為/作為HYCAMTIN® 出售)、伊立替康(irinotecan)、盧比替康(rubitecan)及貝洛替康(belotecan))；II類(鬼臼類(podophyllum))拓樸異構酶抑制劑(例如依託泊苷(etoposide)或VP-16及替尼泊苷(teniposide))；蒽環黴素(anthracycline) (例如小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、多希(Doxil)、阿克拉黴素(aclarubicin)、胺柔比星(amrubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、伐柔比星(valrubicin)及左柔比星(zorubicin))；以及蒽二酮(例如米托蒽醌(mitoxantrone)及匹蒽醌(pixantrone))。
作為DNA交聯劑(或DNA破壞劑)之化學治療劑包括(但不限於)烷基化劑(例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、異環磷醯胺(ifosfamide) (商標為/作為IFEX® 出售)、曲磷胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、潑尼氮芥(prednimustine)、苯達莫司汀(bendamustine)、烏拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀(estramustine)、卡莫司汀(carmustine) (商標為/作為BiCNU®出售)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、鏈脲菌素(streptozocin)、白消安(busulfan)、甘露舒凡(mannosulfan)、曲奧舒凡(treosulfan)、卡波醌(carboquone)、N,N'N'-三伸乙基硫代磷醯胺、三亞胺醌(triaziquone)、三伸乙基三聚氰胺(triethylenemelamine))；類烷基化劑(例如卡鉑(carboplatin) (商標為/作為PARAPLATIN® 出售)、順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、四硝酸三鉑(triplatin tetranitrate)、賽特鉑(satraplatin)、吡鉑(picoplatin))；非經典DNA交聯劑(例如丙卡巴肼(procarbazine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide) (商標為/作為TEMODAR® 出售)、六甲蜜胺(altretamine)、二溴甘露醇(mitobronitol))；以及插入劑(例如放射菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、絲裂黴素(mitomycin)及普卡黴素(plicamycin))。5.7.6.1 免疫調節劑
在特定實施例中，本文所述之NDV (例如嵌合NDV)或其組合物、溶解腫瘤疫苗或全細胞疫苗與以下中之一或多者組合投與個體：熟習此項技術者已知的免疫細胞(諸如T淋巴細胞、NK細胞或抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞))之共刺激信號之任何促效劑及/或免疫細胞(諸如T淋巴細胞、NK細胞或抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞))之抑制信號之任何拮抗劑。
在特定實施例中，促效劑及/或拮抗劑為免疫細胞之人類共刺激信號之促效劑及/或免疫細胞之人類抑制信號之拮抗劑。
在某些實施例中，共刺激信號之促效劑為在諸如T-淋巴細胞(例如CD4+或CD8+ T-淋巴細胞)、NK細胞及/或抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞)之免疫細胞上發現之共刺激分子(例如共刺激受體)的促效劑。共刺激分子之特定實例包括糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(GITR)、誘導性T細胞共刺激分子(ICOS或CD278)、OX40 (CD134)、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD40、淋巴毒素α (LTα)、LIGHT (淋巴毒素樣，展現誘導性表現，且與單純疱疹病毒醣蛋白D競爭HVEM，HVEM為由T淋巴細胞表現之受體)、CD226、細胞毒性及調節性T細胞分子(CRTAM)、死亡受體3 (DR3)、淋巴毒素-β受體(LTBR)、跨膜活化因子及CAML相互作用子(TACI)、B細胞活化因子受體(BAFFR)及B細胞成熟蛋白(BCMA)。在特定實施例中，促效劑為免疫細胞之人類共刺激受體之促效劑。在某些實施例中，共刺激受體之促效劑不為ICOS之促效劑。
在一特定實施例中，共刺激受體之促效劑為特異性結合於共刺激受體之抗體或其抗原結合片段。共刺激受體之特定實例包括GITR、ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、LTα、LIGHT、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR及BCMA。在某些特定實施例中，抗體為單株抗體。在其他特定實施例中，抗體為sc-Fv。在其他特定實施例中，抗體為駱駝化抗體。在一特定實施例中，抗體為結合於免疫細胞上之兩種受體的雙特異性抗體。在其他實施例中，雙特異性抗體結合於免疫細胞上之受體及癌細胞上之另一受體。在特定實施例中，抗體為人類或人類化抗體。在一些實施例中，抗體表現為具有NDV F蛋白質或其片段或NDV HN蛋白或其片段之嵌合蛋白。關於嵌合F或嵌合HN蛋白之產生的描述，參見例如美國專利申請公開案第2012/0122185號，其以引用的方式併入本文中。
在另一實施例中，共刺激受體之促效劑為共刺激受體之配位體。在某些實施例中，配位體為天然配位體之片段。天然配位體之特定實例包括ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、疱疹病毒進入介體(HVEM)、CD80及CD86。編碼天然配位體之核苷酸序列以及天然配位體之胺基酸序列為此項技術中已知。舉例而言，在GenBank中可找到B7RP1 (另稱為ICOSL；GenBank人類：NM_015259.4、NP_056074.1，鼠類：NM_015790.3、NP_056605.1)、CD137L(GenBank人類：NM_003811.3、NP_003802.1，鼠類：NM_009404.3、NP_033430.1)、OX40L(GenBank人類：NM_003326.3、NP_003317.1，鼠類：NM_009452.2、NP_033478.1)、CD70(GenBank人類：NM_001252.3、NP_001243.1，鼠類：NM_011617.2、AAD00274.1)、CD80(GenBank人類：NM_005191.3、NP_005182.1，鼠類：NM_009855.2、NP_033985.3)及CD86(GenBank人類：NM_005191.3、CAG46642.1，鼠類：NM_019388.3、NP_062261.3)之核苷酸及胺基酸序列。在其他實施例中，配位體為天然配位體之衍生物。在一些實施例中，配位體為包含特異性結合於共刺激受體之天然配位體或天然配位體之衍生物的至少一部分及異源胺基酸序列的融合蛋白。在特定實施例中，融合蛋白包含特異性結合於共刺激受體之天然配位體或天然配位體之衍生物的至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。配位體融合蛋白之一實例為4-1BB配位體與免疫球蛋白之Fc部分融合(由Meseck M等人，J Immunother. 2011 34:175-82描述)。
在一些實施例中，拮抗劑為在諸如T-淋巴細胞(例如CD4+或CD8+ T-淋巴細胞)、NK細胞及/或抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞)之免疫細胞上發現的抑制分子(例如抑制受體)之拮抗劑。抑制分子之特定實例包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4或CD52)、計劃性細胞死亡蛋白1 (PD-1或CD279)、B及T淋巴細胞衰減因子(BTLA)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、淋巴細胞活化基因3 (LAG3)、T細胞膜蛋白3 (TIM3)、CD160、腺苷A2A受體(A2aR)、具有免疫球蛋白及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、白細胞相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)及CD160。在特定實施例中，拮抗劑為免疫細胞之人類抑制受體之拮抗劑。在一特定實施例中，抑制分子之拮抗劑為PD-1或其配位體之拮抗劑(諸如上文章節5.5中所述)。
在另一實施例中，抑制受體之拮抗劑為特異性結合於該抑制受體之天然配位體且阻斷天然配位體結合於抑制受體及轉導抑制信號的抗體(或抗原結合片段)或可溶性受體。抑制受體之天然配位體之特定實例包括PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9及腺苷。結合於天然配位體之抑制受體之特定實例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3及A2aR。
在特定實施例中，抑制受體之拮抗劑為特異性結合於該抑制受體之天然配位體且阻斷天然配位體結合於抑制受體及轉導抑制信號的可溶性受體。在某些實施例中，可溶性受體為特異性結合於天然配位體的天然抑制受體之片段或天然抑制受體之衍生物之片段(例如天然抑制受體或抑制受體之衍生物的細胞外域)。在一些實施例中，可溶性受體為包含天然抑制受體或天然抑制受體之衍生物之至少一部分(例如天然抑制受體或天然抑制受體之衍生物之細胞外域)及異源胺基酸序列的融合蛋白。在特定實施例中，融合蛋白包含天然抑制受體或天然抑制受體之衍生物之至少一部分及免疫球蛋白或其片段之Fc部分。可溶性受體融合蛋白之一實例為LAG3-Ig融合蛋白(由Huard B等人，Eur J Immunol. 1995 25:2718-21描述)。
在特定實施例中，抑制受體之拮抗劑為特異性結合於抑制受體之天然配位體且阻斷天然配位體結合於抑制受體及轉導抑制信號的抗體(或抗原結合片段)。在某些特定實施例中，抗體為單株抗體。在其他特定實施例中，抗體為scFv。在特定實施例中，抗體為人類或人類化抗體。針對抑制配位體之抗體之一特定實例為抗PD-L1抗體(Iwai Y等人，PNAS 2002; 99:12293-12297)。
在另一實施例中，抑制受體之拮抗劑為結合於抑制受體但不轉導抑制信號之抗體(或抗原結合片段)或配位體。抑制受體之特定實例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3及A2aR。在某些特定實施例中，抗體為單株抗體。在其他特定實施例中，抗體為scFv。在特定實施例中，抗體為人類或人類化抗體。針對抑制受體之抗體之一特定實例為抗CTLA-4抗體(Leach DR等人，Science 1996; 271: 1734-1736)。針對抑制受體之抗體之另一實例為抗PD-1抗體(Topalian SL, NEJM 2012; 28:3167-75)。
在某些實施例中，抑制受體之拮抗劑為CTLA-4之拮抗劑，諸如伊派利單抗(Ipilimumab)或曲美單抗(Tremelimumab)。在某些實施例中，抑制受體之拮抗劑為PD-1之拮抗劑，諸如MDX-1106 (BMS-936558)、MK3475、CT-011、AMP-224或MDX-1105。在某些實施例中，抑制受體之拮抗劑為LAG3之拮抗劑，諸如IMP321。在某些實施例中，抑制受體之拮抗劑為結合於B7-H3之抗體(例如單株抗體或其抗原結合片段或scFv)，諸如MGA271。在特定實施例中，共刺激受體之促效劑為抗CD28 scvFv、ICOSL、CD40L、OX40L、CD137L、GITRL及/或CD70。
在某些實施例中，免疫細胞之共刺激信號之促效劑誘導(例如選擇性誘導)由共刺激受體與其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑。在特定實施例中，相對於在不存在促效劑下，由共刺激受體與一或多種其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，共刺激受體之促效劑誘導由共刺激受體與一或多種其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內。在特定實施例中，共刺激受體之促效劑：(i)相對於在不存在促效劑下由共刺激受體與一種特定配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，誘導由共刺激受體與該特定配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或者在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內；以及(ii)相對於在不存在促效劑下由共刺激受體與此類一或多種其他配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，不誘導，或者誘導由共刺激受體與一或多種其他配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑小於20%、15%、10%、5%或2%或在2%至5%、2%至10%、5%至10%、5%至15%、5%至20%、10%至15%或15%至20%之間的範圍內。
在某些實施例中，免疫細胞之共刺激信號之促效劑活化或增強(例如選擇性活化或增強)由共刺激受體與其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑。在特定實施例中，相對於在不存在促效劑下，由共刺激受體與一或多種其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，共刺激受體之促效劑活化或增強由共刺激受體與一或多種其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內。在特定實施例中，共刺激受體之促效劑：(i)相對於在不存在促效劑下由共刺激受體與一種特定配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，共刺激信號之促效劑活化或增強由共刺激受體與該特定配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或者在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內；以及(ii)相對於在不存在促效劑下由共刺激受體與此類一或多種其他配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，不活化或增強，或者活化或增強由共刺激受體與一或多種其他配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑小於20%、15%、10%、5%或2%或在2%至5%、2%至10%、5%至10%、5%至15%、5%至20%、10%至15%或15%至20%之間的範圍內。
在一些實施例中，免疫細胞之抑制信號之拮抗劑(例如選擇性)抑制或減少由抑制受體與其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑。在特定實施例中，相對於在不存在拮抗劑下，由抑制受體與一或多種其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，抑制受體之拮抗劑抑制或減少由抑制受體與一或多種其配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內。在特定實施例中，抑制受體之拮抗劑：(i)相對於在不存在拮抗劑下由抑制受體與一種特定配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，抑制或減少由抑制受體與一種特定配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑至少 25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或者在25%至50%、25%至75%、50%至75%、50%至95%、75%至95%或75%至100%之間的範圍內；以及(ii)相對於在不存在拮抗劑下由抑制受體與此類一或多種其他配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑，不抑制或減少，或者抑制或減少由抑制受體與一或多種其他配位體之結合所誘導的一或多種信號轉導路徑小於20%、15%、10%、5%或2%或在2%至5%、2%至10%、5%至10%、5%至15%、5%至20%、10%至15%或15%至20%之間的範圍內。
在特定實施例中，免疫細胞之共刺激信號之促效劑及/或免疫細胞之抑制信號之拮抗劑誘導、活化及/或增強一或多種免疫活性、功能或反應。一或多種免疫活性、功能或反應可呈例如抗體反應(體液反應)或細胞免疫反應形式，例如細胞介素分泌(例如干擾素-γ)、輔助細胞活性或細胞毒性。在一個實施例中，在接觸免疫細胞之共刺激信號之促效劑及/或免疫細胞之抑制信號之拮抗劑後誘導、活化及/或增強免疫細胞上活化標記物(例如CD44、顆粒酶、或Ki-67)之表現、免疫細胞上共刺激受體(例如ICOS、CD28、OX40或CD27)之表現、共刺激受體之配位體(例如B7HRP1、CD80、CD86、OX40L或CD70)的表現、細胞介素分泌、免疫細胞(例如T-淋巴細胞、B淋巴細胞及/或NK細胞)對腫瘤之浸潤、抗體產生、效應功能、T細胞活化、T細胞分化、T細胞增殖、B細胞分化、B細胞增殖及/或NK細胞增殖。在另一實施例中，在接觸免疫細胞之共刺激信號之促效劑及/或免疫細胞之抑制信號之拮抗劑後抑制骨髓衍生抑制細胞(MDSC)腫瘤浸潤及增殖、Treg腫瘤浸潤、活化及增殖、外周血液MDSC及Treg數。5.8 生物分析
在某些實施例中，下文章節6中所述之分析用於表徵/評估例如嵌合NDV之產生、由嵌合NDV表現之IL-12之表現、功能或兩者或者本文所述之方法之功效。5.8.1 活體外病毒分析
病毒分析包括使用此項技術中所熟知之方法，間接量測活體外培養細胞中病毒複製(如例如藉由空斑形成所確定)或病毒蛋白(如例如藉由西方墨點分析所確定)或病毒RNA (如例如藉由RT-PCR或北方墨點分析所確定)之產生的分析。
本文所述之NDV之生長可藉由此項技術中已知或本文所述之任何方法評估(例如在細胞培養物(例如雞胚胎腎細胞之培養物或雞胚胎纖維母細胞(CEF)之培養物中)(參見例如章節6)。病毒力價可藉由將本文所述之NDV之連續稀釋液接種至細胞培養物(例如CEF、MDCK、EFK-2細胞、Vero細胞、初級人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、H292人類上皮細胞株或HeLa細胞)、雞胚胎或活動物(例如禽類)中來測定。培育病毒歷時規定時間之後，使用標準方法分離病毒。病毒力價之物理定量可使用應用於病毒上清液之PCR (Quinn及Trevor, 1997；Morgan等人，1990)、血球凝集分析、組織培養物感染劑量(TCID50)或蛋感染劑量(EID50)進行。評估病毒力價之一種例示性方法描述於以下章節6中。
編碼異源肽或蛋白質(例如細胞介素、突變F蛋白質、突變V蛋白或miRNA標靶位點)之核苷酸序列併入本文所述之嵌合NDV之基因組中可藉由此項技術中已知或本文所述之任何方法評估(例如在細胞培養物、動物模型或病毒培養物中在受精蛋中)。舉例而言，來自受精蛋之尿囊液之細胞培養物的病毒粒子可藉由經蔗糖墊離心來純化且隨後使用此項技術中熟知之方法藉由西方墨點法分析融合蛋白表現。
基於免疫螢光法之方法亦可用以偵測病毒及評估病毒生長。此類方法為熟習此項技術者所熟知，例如螢光顯微法及流動式細胞量測術(參見下文章節6)。可獲得用於流動式細胞量測術之方法，包括螢光活化之細胞分選(FACS)(參見例如Owens等人，(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice , John Wiley and Sons, Hoboken, NJ；Givan (2001)Flow Cytometry ，第 2 版 ; Wiley-Liss, Hoboken, NJ；Shapiro (2003)Practical Flow Cytometry , John Wiley and Sons, Hoboken, NJ)。可獲得用作例如診斷試劑之適用於修飾核酸，包括核酸引子及探針、多肽及抗體之螢光試劑(Molecular Probesy (2003)Catalogue , Molecular Probes, Inc., Eugene, OR；Sigma-Aldrich (2003)Catalogue , St. Louis, MO)。
描述免疫系統之組織學之標準方法(參見例如Muller-Harmelink (編輯) (1986)Human Thymus: Histopathology and Pathology , Springer Verlag, New York, NY；Hiatt等人，(2000)Color Atlas of Histology , Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA；Louis等人，(2002)Basic Histology: Text and Atlas , McGraw-Hill, New York, NY)。5.8.2 IFN 分析
可使用熟習此項技術者已知或本文所述之技術(參見例如章節6)測定本文所述之NDV對IFN誘導及釋放。舉例而言，在感染本文所述之NDV後細胞中誘導之IFN之量可使用免疫分析(例如ELISA或西方墨點分析)來測定以量測IFN表現或量測表現由IFN誘導之蛋白質的表現。可替代地，誘導之IFN之量可藉由諸如北方墨點法及定量RT-PCR之熟習此項技術者已知之分析在RNA層面下量測。在特定實施例中，釋放之IFN之量可使用ELISPOT分析來量測(參見例如以下章節6中所述之方法)。此外，細胞介素及/或干擾素刺激之基因的誘導及釋放可藉由例如免疫分析或ELISPOT分析在蛋白質層面下及/或藉由定量RT-PCR或北方墨點法在RNA層面下來測定。關於量測細胞介素及/或干擾素刺激之基因之誘導及釋放的分析參見下文章節6。5.8.3 活化標記物分析
用於評估免疫細胞對活化標記物、共刺激分子、配位體或抑制分子之表現的技術為熟習此項技術者已知。舉例而言，免疫細胞(例如T淋巴細胞或NK細胞)對活化標記物、共刺激分子、配位體或抑制分子之表現可藉由流動式細胞量測術評估。在一特定實施例中，下文章節6中所述之技術用於評估免疫細胞對活化標記物、共刺激分子、配位體或抑制分子之表現。5.8.4 免疫細胞浸潤分析
用於評估免疫細胞浸潤之技術為熟習此項技術者已知。在一特定實施例中，下文章節6中所述之技術用於評估免疫細胞浸潤。5.8.5 毒性研究
在一些實施例中，測試本文所述之NDV或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗、本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法在哺乳動物、較佳人類細胞株中的細胞毒性(參見例如下文章節6中所述之細胞毒性分析)。在某些實施例中，在以下細胞株之非限制性實例中之一或多者中評估細胞毒性：U937，一種人類單核球細胞株；初級外周血單核細胞(PBMC)；Huh7，一種人類肝母細胞瘤細胞株；HL60細胞、HT1080、HEK 293T及293H、MLPC細胞、人類胚胎腎細胞株；人類黑色素瘤細胞株，諸如SkMel2、SkMel-119及SkMel-197；THP-1，單核球性細胞；HeLa細胞株；以及神經母細胞瘤細胞株，諸如MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y及BE(2)-C。在某些實施例中，在多種癌細胞中評估細胞毒性。在一些實施例中，ToxLite分析用於評估細胞毒性。
此項技術中熟知之許多分析可用於評估在感染本文所述之NDV或其組合物或用本文所述之溶解腫瘤疫苗、本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法治療後細胞或細胞株之活力，因此，測定NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗、全細胞疫苗或組合療法之細胞毒性。舉例而言，細胞增殖可藉由量測溴去氧尿苷(BrdU)併入、(3 H)胸苷併入、藉由直接細胞計數或藉由偵測諸如原癌基因(例如fos、myc)之已知基因或細胞週期標記物(Rb、cdc2、週期素A、D1、D2、D3、E等)之轉錄、轉譯或活性的變化來分析。此類蛋白質及mRNA及活性之水準可藉由此項技術中熟知之任何方法測定。舉例而言，可藉由已知之免疫診斷方法(諸如ELISA、西方墨點法或免疫沈澱)使用抗體(包括市售抗體)來對蛋白質進行定量。可使用此項技術中熟知且常規之方法，例如使用北方雜交分析(northern analysis)、RNA酶保護或與反轉錄結合之聚合酶鏈反應來對mRNA進行定量。可藉由使用錐蟲藍染色或此項技術中已知之其他細胞死亡或活力標記物來評估細胞活力。在一特定實施例中，量測細胞ATP之水準以確定細胞活力。在較佳實施例中，本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗、全細胞疫苗或組合療法殺死癌細胞，但不殺死健康(亦即非癌性)細胞。在一個實施例中，本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗、全細胞疫苗或組合療法優先殺死癌細胞，但不殺死健康(亦即非癌性)細胞。
在特定實施例中，在三天及七天時間段內使用此項技術中標準之分析，諸如量測細胞內ATP水準之CellTiter-Glo分析套組(Promega)來量測細胞活力。細胞ATP之降低指示細胞毒性作用。在另一特定實施例中，可在中性紅吸收分析中量測細胞活力。在其他實施例中，關於形態變化之目測可包括擴大、粒度、具有粗糙邊緣之細胞、膜狀外觀、圓化、自孔表面脫離或其他變化。
可測試本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗、全細胞疫苗或組合療法在動物模型中之活體內毒性(參見例如以下章節6中所述之動物模型)。舉例而言，用於測試化合物對癌症之作用的本文所述之動物模型及/或此項技術中已知之其他動物模型亦可用於測定本文所述之NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗、全細胞疫苗或組合療法之活體內毒性。舉例而言，向動物投與一系列pfu之本文所述之NDV (例如下文章節5.2中所述之嵌合NDV)。隨後，隨時間推移監測動物之致死率、體重減輕或體重增加失敗及/或可指示組織破壞之血清標記物之水準(例如如指示整體組織破壞之肌酸磷酸激酶水準、如指示可能肝臟損傷之麩胺酸乙二酸轉胺酶或丙酮酸轉胺酶之水準)。此等活體內分析亦可適用於測試除劑量之外多種投與模式及/或方案之毒性。
本文所述之NDV或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗、本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法發毒性及/或功效可藉由細胞培養物或實驗動物中之例如用於測定LD50 (群體50%致死劑量)及ED50 (在群體50%中治療有效之劑量)的標準醫藥程序測定。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數且其可以比率LD50/ED50表示。展現大治療指數之療法為較佳。雖然可使用展現毒性副作用之療法，但應注意設計一種使此類療法靶向受影響組織之部位以將對非癌性細胞之潛在破壞降至最低且由此降低副作用的遞送系統。
自細胞培養分析法及動物研究獲得之資料可用於調配適用於個體之療法的劑量範圍。此類藥劑之劑量較佳處於循環濃度之範圍內，包括具有極少毒性或無毒性之ED50。劑量可視所採用劑型及所利用投與途徑而在此範圍內變化。對於本文所述之任何療法，治療有效劑量最初可自細胞培養分析估算。劑量可在動物模型中調配以獲得包括如在細胞培養中確定之IC50 (亦即實現症狀半最大抑制之嵌合NDV之濃度)的循環血漿濃度。此類資訊可用於更準確地確定適用於個體之劑量。血漿中之含量可例如藉由高效液相層析法量測。5.8.6 抗癌研究
可使用癌症動物模型(參見例如章節6)測試本文所述之NDV或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗、本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的生物活性。此類動物模型系統包括(但不限於)大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔等。在一特定實施例中，在小鼠模型系統中測試本文所述之NDV或組合療法之抗癌活性。此類模型系統廣泛使用且為熟練技術人員熟知，諸如SCID小鼠模型或轉殖基因小鼠。
本文所述之NDV或其組合物、本文所述之溶解腫瘤疫苗、本文所述之全細胞疫苗或本文所述之組合療法的抗癌活性可藉由向動物模型投與NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗、全細胞疫苗或組合療法且驗證NDV或其組合物、溶解腫瘤疫苗、全細胞疫苗或組合療法在該動物模型中有效降低癌症嚴重程度、減少癌症症狀、減少癌轉移及/或減小腫瘤尺寸(參見例如以下章節6)來確定。癌症動物模型之實例一般包括(但不限於)用PD-1或其配位體之拮抗劑治療難治或無反應的動物模型，諸如B16F10小鼠模型(例如如章節6中所述)及伴侶動物之自然存在之腫瘤(參見例如Vail及MacEwen, 2000, Cancer Invest 18(8):781-92)。肺癌動物模型之實例包括(但不限於)由Zhang及Roth (1994, In-vivo 8(5):755-69)描述之肺癌動物模型及具有破壞之p53功能的轉殖基因小鼠模型(參見例如Morris等人，1998, J La State Med Soc 150(4): 179- 85)。乳癌動物模型之一實例包括(但不限於)過度表現週期素D1之轉殖基因小鼠(參見例如Hosokawa等人，2001, Transgenic Res 10(5):471-8)。結腸癌動物模型之一實例包括(但不限於)TCR b及p53雙重基因敲除小鼠(參見例如Kado等人，2001, Cancer Res. 61(6):2395-8)。胰臟癌動物模型之實例包括(但不限於)PancO2鼠類胰腺癌之轉移模型(參見例如Wang等人，2001, Int. J. Pancreatol. 29(1):37-46)及在皮下胰臟腫瘤中產生之nu-nu小鼠(參見例如Ghaneh等人，2001, Gene Ther. 8(3):199-208)。非霍奇金淋巴瘤動物模型之實例包括(但不限於)嚴重合併性免疫缺失(「SCID」)小鼠(參見例如Bryant等人，2000, Lab Invest 80(4):553-73)及IgHmu-HOX11轉殖基因小鼠(參見例如Hough等人，1998, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95(23):13853-8)。食道癌動物模型之一實例包括(但不限於)針對人類乳頭狀瘤病毒類型16 E7致癌基因轉殖基因之小鼠(參見例如Herber等人，1996, J. Virol. 70(3):1873-81)。結腸直腸癌動物模型之實例包括(但不限於)Apc小鼠模型(參見例如Fodde及Smits, 2001, Trends Mol Med 7(8):369 73及Kuraguchi等人，2000)及ID8卵巢癌模型。在一特定實施例中，下文章節6中所述之癌症動物模型用於評估NDV或其組合物、溶解腫瘤、全細胞疫苗或組合療法之功效。5.8.7 IL-12 之表現
測試感染包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV之細胞中IL-12或其衍生物之表現的分析可使用此項技術中已知之任何分析，諸如西方墨點法、免疫螢光法及ELISA或本文所述之任何分析(參見例如章節6)進行。
在一特定態樣中，ELISA用於偵測感染包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV之細胞中IL-12或其衍生物之表現。舉例而言，將細胞(例如Vero細胞)在組織培養盤(例如96孔盤)中在補充有2%麩醯胺酸(例如Corning, 目錄號25-005-CI)之不含血清之培養基(例如OptiPRO不含血清之培養基(Gibco, 目錄號12309-019))中以適當濃度(例如每個96孔盤之孔1×104 個Vero細胞)接種，且在標準條件(例如37±2℃、5±2% CO2 )下培育一段時間(例如大約24小時)。嵌合NDV之測試樣品在還原血清培養基(例如Opti-MEM (1X)還原血清培養基(Gibco, 目錄號31985-070))中預稀釋至所需力價(例如2×104 pfu/mL)。將一定體積之預稀釋之測試樣品(例如300 µL)添加至例如一列0.5 mL分析阻斷液(Costar, 目錄號3956)中且藉由將一定體積之樣品轉移至一定體積之還原血清培養基中(例如150 µL樣品轉移至150 µL Opti-MEM (1X)還原血清培養基中)，在各列中進行連續稀釋(例如2倍連續稀釋)。每個樣品可製備兩個複製品。在接種一段時間後(例如大約接種24小時後)自培育箱移除含有細胞(例如Vero細胞)之組織培養盤(例如96孔盤)，且自盤移除消耗之培養基。將細胞接種一定體積(例如100 µL)之連續稀釋之測試樣品且在標準條件(例如37℃、5% CO2 )下培育。在培育一段時間(例如大約24小時)後，將一定體積之上清液流體(例如90 µL)自感染盤移除，轉移至預塗有抗人類IL-12 p70捕捉抗體(例如Affymetrix eBioscience, 目錄號14-7128-68)之ELISA盤中且培育一段時間(例如在室溫下兩小時)。將捕捉huIL-12用抗人類IL-12 p70偵測抗體(例如Affymetrix eBioscience, 目錄號33-8261-68A)及例如抗生物素蛋白-HRP偵測且根據供應商程序(Affymetrix eBioscience, 人類IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go! ELISA套組, 目錄號88-7126-88)，用例如HRP受質TMB目測。在一特定實施例中，使用諸如下文章節6.3.1.19中所述之ELISA，定量人類IL-12。
在一個實施例中，藉由使用此項技術中已知之針對抗體-抗原相互作用之任何分析測試特異性地結合於抗IL-12抗體之能力，分析由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼的IL-12或其衍生物的適當摺疊及功能性。在另一實施例中，藉由使用此項技術中已知之任何方法，諸如NMR、X射線結晶學方法或二級結構預測方法，例如圓二色性，確定IL-12或其衍生物之結構或構形，分析由本文所述之嵌合NDV之包裝基因組編碼的IL-12或其衍生物的適當摺疊。
測試感染包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV之細胞中IL-12或其衍生物之功能的分析可使用此項技術中已知之任何分析，諸如PathHunter®生物分析偵測套組(DiscoverX, 目錄號93-0933)進行。舉例而言，為評估感染包含有包含編碼IL-12或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV之細胞中由該嵌合NDV產生之huIL-12的功能，將細胞(例如vero細胞)接種在盤(例如每個6孔組織培養盤之孔5×105 個vero細胞)中且在熟練技術人員已知之關於細胞類型之標準條件(例如37℃、5% CO2 )下培育一段時間，例如24小時。將嵌合NDV之測試樣品在還原血清培養基(例如Opti-MEM (1X)還原血清培養基)中稀釋(例如至1×106 pfu/mL)且將多種量之稀釋樣品轉移至細胞盤中以使得目標MOI介於0.03-1之間。接著將培養基添加至各孔，至適合於組織培養盤之尺寸的最終體積(例如每個6孔組織培養盤之孔2 mL)。將感染之細胞盤在37℃、5% CO2 下培育24小時且使用PathHunter®生物分析偵測套組(DiscoverX, 目錄號93-0933)根據製造商之說明書，分析上清液中所產生之huIL-12或其衍生物的功能。簡言之，將U2OS IL12RB1/IL12RB2細胞接種在96孔細胞盤(例如以5×103 個細胞/孔)中且在標準條件(例如37℃、5% CO2 )下培育一段時間(例如4-6小時)。將來自感染嵌合NDV之盤之各盤的一定體積之上清液(例如60 µL)轉移至96孔樣品稀釋盤之第二行且在AssayComplete細胞塗鋪試劑(DiscoverX，93-0563R5A)中進行3倍連續稀釋。將一部分(例如10 µL)各稀釋上清液轉移至U2OS細胞盤且盤在標準條件(例如在37℃、5% CO2 下)下培育一段時間(例如16-20小時)。將偵測試劑1 (例如10 µL)添加至各孔且盤在室溫下培育一段時間(例如15分鐘).將偵測試劑2 (例如40 µL)添加至各孔且盤在室溫下進一步培育一段時間(例如60分鐘)。使用盤式讀取器(例如SpectraMax M5盤式讀取器)偵測化學發光信號。在一特定實施例中，使用下文章節6.3.1.18中所述之分析評估人類IL-12之功能性。5.9 套組
在一個態樣中，本文提供一種醫藥包裝或套組，其包含一或多個填充有本文所述之組合物(例如醫藥組合物)之一或多種成分的容器。在一特定實施例中，本文提供一種醫藥包裝或套組，其包含第一容器及第二容器，其中該第一容器包含如本文所述之PD-1或其配位體之拮抗劑或包含該拮抗劑之醫藥組合物，且該第二容器包含包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV或包含該嵌合NDV之醫藥組合物。在另一特定實施例中，本文提供一種醫藥包裝或套組，其包含第一容器及第二容器，其中該第一容器包含如本文所述之PD-1阻斷抗體或包含該PD-1阻斷抗體之醫藥組合物，且該第二容器包含包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV或包含該嵌合NDV之醫藥組合物。在一個實施例中，PD-1阻斷抗體為納武單抗。在較佳實施例中，PD-1阻斷抗體為派姆單抗。在另一特定實施例中，本文提供一種醫藥包裝或套組，其包含第一容器及第二容器，其中該第一容器包含如本文所述之PD-L1阻斷抗體或包含該PD-L1阻斷抗體之醫藥組合物，且該第二容器包含包含有包含編碼IL-12 (例如人類IL-12)或其衍生物之轉殖基因之包裝基因組的嵌合NDV或包含該嵌合NDV之醫藥組合物。在某些實施例中，PD-L1阻斷抗體為度伐魯單抗或阿維魯單抗。視情況與此類容器相關聯的可為呈由管理醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之通知，該通知反映由人類投與之製造、使用或銷售機構之批准。5.10 序列
表 1. 例示性p40序列(胺基酸)
表 2. 例示性p40序列(核酸)
表 3. 例示性p35序列(胺基酸)
表 4. 例示性p35序列(核酸)
表 5. 例示性連接子序列(胺基酸)
表 6. 例示性連接子序列(核酸)
表 7. 例示性IL-12轉殖基因序列(胺基酸)
表 8. 例示性IL-12轉殖基因序列(核酸)
表 9. 例示性嵌合NDV基因組RNA序列
表 10. 編碼嵌合NDV之例示性質體序列(核酸)
表 11. NDV質體序列
表 12. 例示性抗體相關之序列
表 13. 引子序列
表 15. 裂解序列 6. 實例
國際專利申請公開案第WO 2014/158811號(亦即國際專利申請公開案第WO 2014/158811號之章節6及7)及美國專利申請公開案第2016/0015760 A1號(亦即美國專利申請公開案第2016/0015760 A1號之章節6)及第2014/0271677 A1號(亦即美國專利申請公開案第2014/0271677 A1之章節6及7)的工作實例以全文引用之方式併入本文中。6.1 實例 1
本實例展示NDV療法與具有免疫刺激性之免疫檢查點調節劑組合治療癌症之治療功效。6.1.1 材料與方法 6.1.1.1 小鼠
自Jackson Laboratory購得BALB/c小鼠(6-8週齡)及WT C57BL/6小鼠。將所有小鼠維持在微小隔離籠中且根據NIH及美國實驗動物護理條例協會處理。此研究之所有小鼠程序及實驗經紀念斯隆-凱特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)機構動物護理及使用委員會批准。6.1.1.2 細胞株
黑色素瘤(B16F10)及結腸癌(CT26及MC38)之鼠類癌細胞株維持在補充有10%胎牛血清及青黴素與鏈黴素之RPMI培養基中。鼠類前列腺癌細胞株TRAMP-C2維持在補充有5%胎牛血清(FCS；Mediatech, Inc.)、5% Nu Serum IV (BD Biosciences) HEPES、2-ME、pen/strep、L-glut、5 μg/mL胰島素(Sigma)及10 nmol/L DHT (Sigma)之DMEM培養基中。6.1.1.3 抗體
藉由BioXcell產生治療性抗PD-1 (純系RMP1-14)及抗PD-L1單株抗體。用於流動式細胞量測術之抗體自eBioscience、Biolegend、Invitrogen及BD Pharmingen購得。6.1.1.4 病毒及選殖
重組弱毒性NDV LaSota病毒株用於所有實驗。使用先前描述之方法，自cDNA回復病毒，且藉由逆轉錄PCR定序測定嵌段保真性。藉由連續稀釋及免疫螢光法，在Vero細胞中測定病毒力價。6.1.1.5 活體外感染實驗
評估NDV對表面MHC-I、MHC-II及ICAM-1之上調及評估ICOSL轉殖基因由NDV-ICOSL病毒進行之表面表現，在6孔培養皿中，以MOI 2一式三份感染B16F10細胞。二十四小時後，藉由機械刮擦來收穫細胞，且進行處理，以進行表面標記，及藉由流動式細胞量測術進行定量。對於病毒生長曲線實驗，將B16F10細胞在室溫下與病毒一起在6孔培養皿中，依所指示MOI培育，總體積為100 μl。培育一小時後，抽吸感染培養基，且將細胞在37℃下在1 ml含有10%雞尿囊液之DMEM中培育。24、48及72小時後，收集上清液且如上測定病毒力價。對於活體外細胞毒性實驗，以類似方式進行感染。在感染24、48、72及96小時後，洗滌細胞且與1% Triton X-100一起在37℃下培育30分鐘。使用Promega CytoTox 96分析套組，根據製造商之說明書，測定溶胞物中之LDH活性。6.1.1.6 腫瘤攻擊存活實驗
建立兩側腰窩腫瘤模型以監測在注射腫瘤與全身腫瘤中之治療功效。針對各腫瘤模型，建立治療時程及細胞劑量以達到NDV或抗PD-1作為單一藥劑之10-20%腫瘤清除率。評估野生型NDV (NDV-WT)與免疫檢查點阻斷之組合療法的實驗時，藉由在第0天將2×105 個B16F10細胞皮內注射在右側腰窩中及在第4天將5×104 個細胞注射在左側腰窩中，來植入B16F10腫瘤。在第7、10、13及16天，使用4次總體積為100 µl的含2×107 pfu NDV之PBS之瘤內注射處理小鼠。同時，在第7、10、13及16天，小鼠接受4次抗PD-1抗體之腹膜內注射(250 µg)。對照組接受對應劑量之腹膜內注射同型抗體及瘤內注射PBS。藉由用測徑規量測，隨時間推移監測腫瘤尺寸及發生率。
對於TRAMP-C2模型，在第0天將5×105 個細胞植入右側腰窩中，且在第8天將5×105 個細胞植入左側腰窩中。在第11、14、17及20天，以與上述類似之方式，進行處理。
對於CT26模型，藉由在第0天將1×106 個CT26細胞皮內注射在右側腰窩中及在第2天將1×106 個細胞注射在左側腰窩中，來植入腫瘤。在第6、9及12天，如上進行處理。6.1.1.7 腫瘤浸潤性淋巴細胞之分離
藉由在第0天將2×105 個B16F10細胞皮內注射於右側腰窩中，且在第4天將2×105 個細胞注射於左側腰窩中，來植入B16F10腫瘤。在第7、10及13天，在規定下，小鼠用2×107 pfu NDV之3次瘤內注射及250 µg腹膜內抗PD-1抗體處理。在第15天，藉由吸入CO2 處死小鼠。使用鉗子及手術剪刀移除腫瘤及腫瘤引流淋巴結且稱重。將來自各組之腫瘤用剪刀剪碎，接著與1.67 Wünsch U/mL Liberase及0.2 mg/mL DNA酶一起在37℃下培育30分鐘。藉由重複移液使腫瘤均質化，且經由70 μm耐綸過濾器過濾。將細胞懸浮液用完全RPMI洗滌一次，且在Ficoll梯度上純化以消除死細胞。藉由經由70 μm耐綸過濾器研磨淋巴結，分離來自腫瘤引流淋巴結之細胞。6.1.1.8 流動式細胞量測術
對自腫瘤或腫瘤引流淋巴結分離之細胞進行處理，以用若干抗體組染色CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、PD-1、ICOS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C及Ly6G進行表面標記。可固定活力染料eFluor780 (eBioscience)用於區分活細胞。使用FoxP3固定及滲透套組(eBioscience)進一步滲透細胞且針對Ki-67、FoxP3、顆粒酶B、CTLA-4及IFNγ染色。使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)獲得資料且使用FlowJo軟體(Treestar)分析。6.1.1.9 DC 純化及裝載
分離來自未處理小鼠之脾臟且在37℃下用1.67 Wünsch U/mL Liberase及0.2 mg/mL DNA酶消化30分鐘。所得細胞懸浮液經由70 μm耐綸過濾器過濾且用完全RPMI洗滌一次。藉由使用Miltenyi磁性珠粒進行陽性選擇來純化CD11c+樹突狀細胞。用重組GM-CSF及B16F10腫瘤溶胞物培養分離之樹突狀細胞隔夜且在Ficoll梯度上純化。6.1.1.10 細胞介素產生之分析
將來自腫瘤或腫瘤引流淋巴結之細胞懸浮液彙集且使用Miltenyi T細胞純化套組針對T細胞進行富集。對分離之T細胞計數且在20 U/ml IL-2 (R及D)加Brefeldin A (BD Bioscience)存在下與裝載有B16F10腫瘤細胞溶胞物之樹突狀細胞共同培養8小時。再刺激後，如上處理淋巴細胞以用於流動式細胞量測術。6.1.1.11 統計學 .
藉由雙尾史都登氏t檢驗分析資料，且P＜0.05視為統計學上顯著的。6.1.2 結果
為表徵由新城雞瘟病毒(NDV)感染誘導之抗腫瘤免疫反應，評估活體外感染細胞之表面上MHC I及MHC II分子以及ICAM-1之表現。如圖1中所示，B16黑色素瘤細胞中之NDV感染誘導MHCI類及II類分子以及黏附分子ICAM-1之上調，認為其皆對腫瘤特異性淋巴細胞之募集及抗腫瘤免疫反應之活化具有重要意義。隨後，在鼠類黑色素瘤模型及允許監測在注射病毒之腫瘤以及未接受該病毒之遠端腫瘤中之反應的已建立之雙腰窩模型中評估活體內藉由NDV感染誘導之抗腫瘤免疫反應。如圖2A-2E中所示，感染病毒之腫瘤顯示顯著浸潤免疫細胞，諸如NK細胞、巨噬細胞及CD8及CD4細胞，但無調節T細胞。因為此免疫反應之一部分可能是對病毒而非腫瘤之反應，所以評估關於對側腫瘤之免疫反應(圖3A-3C)。有趣地，此等腫瘤顯示類似程度增加之CD8及CD4效應細胞，但無Treg浸潤。此等細胞之分析揭露其上調活化、增殖及溶解標記物(圖4A-4C)。NDV單一療法有效控制所治療腫瘤(圖5A)，但僅僅略減緩對側腫瘤之生長(圖5B)。然而，清除腫瘤之小鼠顯示一定程度抵抗進一步腫瘤攻擊(圖5C-5D)，此表明NDV療法可誘導持續免疫性。
隨後，評估是否其他機制可能增強由NDV產生之抗腫瘤作用。來自注射NDV及未注射腫瘤的腫瘤浸潤性淋巴細胞的表徵揭露淋巴細胞上抑制受體CTLA-4上調(圖5E-F)。
為確定靶向免疫檢查點與NDV療法組合是否可能有益，評估NDV感染後對PD-1-PD-L1路徑之作用。如圖6A-6C中所示，活體外與活體內NDV感染之腫瘤細胞均上調抑制PD-L1配位體在細胞表面上之表現。此作用不僅僅為直接病毒感染之結果，而在未感染細胞用來自病毒感染細胞之UV滅活之上清液(圖6B)處理時及在對側未感染腫瘤(圖6C)中亦看到。此促使測試與NDV及抗PD-1抗體之組合療法。在侵襲性B16黑色素瘤模型中NDV療法與抗PD-1組合治癒大部分動物，此為與增加之腫瘤浸潤與活化之效應淋巴細胞相關之作用(圖7A-7F)。
在進行之研究中，當使用較大腫瘤攻擊時組合療法之治療功效降低。隨後，評估可預測更佳反應且可用於進一步提高治療功效之活化標記物。先前已顯示ICOS上調與用針對惡性黑色素瘤之抗CTLA-4療法治療之患者中更耐久之治療反應及增加之存活相關。
總體而言，此等研究說明NDV與免疫檢查點調節抗體之組合可用作避開溶瘤病毒療法與抗體療法之限制的策略。此發現具有臨床應用。6.2 實例 2
此實例展示由溶瘤NDV誘導之抗腫瘤免疫反應及由NDV誘導之抗腫瘤反應與PD-1阻斷組合。6.2.1 材料與方法 6.2.1.1 小鼠
自Jackson Laboratory購得C57BL/6J及Balb/C小鼠。C57BL/6J背景之IFNAR-/-小鼠為Dr. Eric Pamer所贈。已報導Pmel-1及Trp-1 TCR轉殖基因小鼠(Overwijk等人，2003, J. Exp. Med, 198:568；Muransky等人，2008, Blood 112:362)且由N. Restifo (National Cancer Institute, Bethesda, MD)提供。Trp1小鼠與由MD Anderson Cancer Center (Houston, TX)之Patrick Hwu提供的CD2:螢光素酶小鼠雜交，產生Trp1螢光素酶+ (Trp1-Fluc)小鼠。將所有小鼠維持在微小隔離籠中且根據NIH及美國實驗動物護理條例協會處理。此研究之所有小鼠程序及實驗經紀念斯隆-凱特琳癌症中心機構動物護理及使用委員會批准。6.2.1.2 細胞株
黑色素瘤(B16F10)及結腸癌(CT26及MC38)之鼠類癌細胞株維持在補充有10%胎牛血清及青黴素與鏈黴素之RPMI培養基中。鼠類前列腺癌細胞株TRAMP-C2維持在補充有5%胎牛血清(FCS；Mediatech, Inc.)、5% Nu Serum IV (BD Biosciences) HEPES、2-ME、pen/strep、L-glut、5 μg/mL胰島素(Sigma)及10 nmol/L DHT (Sigma)之DMEM培養基中。6.2.1.3 抗體
治療性抗PD-1 (純系RMP1-14)、抗PD-L1(純系9G2)、抗CD8 (純系2.43)、抗CD4 (純系GK1.5)、抗IFN-γ (純系XMG1.2)及抗NK1.1 (純系PK136)單株抗體由BioXcell產生。用於流動式細胞量測術之抗體自eBioscience、Biolegend、Invitrogen及BD Pharmingen購得。6.2.1.4 病毒及選殖
重組弱毒性NDV LaSota病毒株用於所有實驗。使用先前描述之方法，自cDNA拯救病毒，且藉由逆轉錄PCR測序以求嵌段保真性。病毒力價藉由連續稀釋及免疫螢光法在Vero細胞中測定。6.2.1.5 活體外感染實驗
對於細胞表面標記，在6孔培養皿中以MOI 2 (B16F10)或MOI 5 (TRAMP C2)一式三份地感染細胞。二十四小時後，藉由刮擦來收穫細胞，且進行處理以進行表面標記及藉由流動式細胞量測術進行定量。對於活體外細胞毒性實驗，細胞以所指示MOI感染且在37℃下在無血清培養基中在250 ng/ml TPCK胰蛋白酶存在下培育。在感染24、48、72及96小時後，洗滌細胞且與1% Triton X-100一起在37℃下培育30分鐘。使用Promega CytoTox 96分析套組，根據製造商之說明書，測定溶胞物中之LDH活性。6.2.1.6 腫瘤攻擊存活實驗
建立兩側腰窩腫瘤模型以監測在注射腫瘤與全身腫瘤中之治療功效。針對各腫瘤模型，建立治療時程及細胞劑量以實現NDV之10-20%腫瘤清除率。對於評估NDV與抗PD-1抗體之組合療法的實驗，藉由在第0天將2×105 個B16F10F10細胞皮內注射在右側腰窩中及在第4天將5×104 個細胞注射在左側腰窩中，來植入B16F10腫瘤。在第7、9、11及13天，將小鼠用總體積為100 µl的含2×107 pfu NDV之PBS之瘤內注射處理。同時，在第7、9、11及13天，小鼠接受抗PD-1抗體(250 μg)或抗PD-L1抗體(250 μg)之腹膜內(腹膜內)注射。對照組接受對應劑量之腹膜內同型抗體及PBS之瘤內注射。針對痛苦徵象或當總腫瘤體積達到1000 mm3 時，處死動物。為耗盡免疫細胞，在腫瘤攻擊之前的一天及之後的兩天向小鼠腹膜內注射500 μg針對CD8+、CD4+、NK1.1或IFNγ之單株抗體，接著在整個實驗中每5天注射250 μg。對於TRAMP-C2模型，在第0天將1×106 個細胞植入右側腰窩中，且在第4天將5×105 個細胞植入左側腰窩中。在第7、10、13及16天，以與上述類似之方式，進行處理。對於CT26模型，藉由在第0天將1×106 個CT26細胞皮內注射在右側腰窩中及在第2天將1×106 個細胞注射在左側腰窩中，來植入腫瘤。在第6、9及12天，如上進行處理。分離Trp1及Pmel淋巴細胞及授受性轉移。
分離來自轉殖基因小鼠之脾臟及淋巴結且經由70 μm耐綸過濾器研磨。藉由使用Miltenyi磁性珠粒進行陽性選擇來純化CD4+及CD8+細胞。
以所指示時程，分別以每隻小鼠2.5×104 個細胞及每隻小鼠1×106 個細胞，經由尾部靜脈將分離之Trp1或Pmel細胞注射至接受動物中。6.2.1.7 血清轉移實驗
將各組負載腫瘤小鼠用NDV或PBS之單次注射瘤內處理。在第4天，藉由終末抽血來收集血液，且藉由離心分離血清。自各組彙集血清，且在Stratalinker 1800中用300 mJ/cm2 UV光之六次脈衝進行UV處理，以使可能存在之任何病毒不活化。將非經稀釋之100 μl血清瘤內注射至未處理B16F10負載腫瘤小鼠中，每隔一天給與，總共注射3次。在最後一次注射後3天移除腫瘤，且如下所述，進行處理以分離腫瘤浸潤性淋巴細胞。6.2.1.8 生物發光成像
在第6天開始，每2-3天，使小鼠成像。將小鼠經後眼眶注射50 μl含40 mg/ml D-螢光素(Caliper Life Sciences)之PBS且使用IVIS成像系統(Caliper Life Sciences)立即成像。使用The Living Image 4.0版(Caliper Life Sciences)軟體覆蓋，將灰度攝影圖像及生物發光彩色影像疊加。在腫瘤上手動選擇相關區域(ROI)且ROI面積保持恆定。6.2.1.9 腫瘤浸潤性淋巴細胞之分離
藉由在第0天將2×105 個B16F10細胞皮內注射於右側腰窩中，且在第4天將2×105 個細胞注射於左側腰窩中，來植入B16F10腫瘤。在第7、9及11天，在規定下，小鼠用2×107 pfu NDV之瘤內注射及腹膜內抗PD-1抗體處理。死於腫瘤負荷之稀少動物(始終在未經處理之對照組中)或完全清除腫瘤之動物(始終在處理組中)不用於分析。在第15天，處死小鼠且使用鉗子及手術剪刀移除腫瘤及腫瘤引流淋巴結且稱重。將來自各組之腫瘤用剪刀剪碎，接著與1.67 Wünsch U/mL Liberase及0.2 mg/mL DNA酶一起在37℃下培育30分鐘。藉由重複移液使腫瘤均質化，且經由70 μm耐綸過濾器過濾。將細胞懸浮液用完全RPMI洗滌一次，且在Ficoll梯度上純化以消除死細胞。藉由經由70 μm耐綸過濾器研磨淋巴結，分離來自腫瘤引流淋巴結之細胞。6.2.1.10 流動式細胞量測術
對自腫瘤或腫瘤引流淋巴結分離之細胞進行處理，以用若干抗體組染色CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、ICOS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C及Ly6G進行表面標記。可固定活力染料eFluor506 (eBioscience)用於區分活細胞。使用FoxP3固定及滲透套組(eBioscience)進一步滲透細胞且針對Ki-67、FoxP3、顆粒酶B、CTLA-4及IFNγ染色。使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)獲得資料且使用FlowJo軟體(Treestar)分析。6.2.1.11 DC 純化及裝載
分離來自未處理小鼠之脾臟且在37℃下用1.67 Wünsch U/mL Liberase及0.2 mg/mL DNA酶消化30分鐘。所得細胞懸浮液經由70 μm耐綸過濾器過濾且用完全RPMI洗滌一次。藉由使用Miltenyi磁性珠粒進行陽性選擇來純化CD11c+ DC。用重組GM-CSF及B16F10腫瘤溶胞物培養分離之DC隔夜且在Ficoll梯度上純化。6.2.1.12 細胞介素產生之分析
將來自腫瘤或腫瘤引流淋巴結之細胞懸浮液彙集且使用Miltenyi T細胞純化套組針對T細胞進行富集。對分離之T細胞計數且在20 U/ml IL-2 (R and D)加Brefeldin A (BD Bioscience)存在下與裝載有B16F10腫瘤細胞溶胞物之DC共同培養8小時。再刺激後，如上處理淋巴細胞以用於流動式細胞量測術。6.2.1.13 免疫螢光法及顯微法
自小鼠切開腫瘤，在PBS中洗滌，在4%三聚甲醛中固定，且根據先前描述之方案進行處理以用石蠟包埋。使用薄片切片機切割切片，安裝在載片上，且進行處理以用蘇木精及伊紅(H&E)或用抗CD3及抗FoxP3抗體染色。在Zeiss Axio 2寬視場顯微鏡上，使用10x及20x物鏡，分析載片。6.2.1.14 統計學
藉由雙尾史都登氏t檢驗(比較2組)及適當時ANOVA分析資料。藉由對數秩(Mantel-Cox)檢驗分析存活資料。雙側p ＜ 0.05視為統計學上顯著的(P £ 0.05 (*)，P £ 0.01 (**)，P ＜ 0.001 (***)，P＜0.0001 (****))。6.2.2 結果 6.2.2.1 NDV 複製限於注射腫瘤位點
對瘤內及全身投與NDV之病毒分佈動力學進行表徵。瘤內注射表現螢火蟲螢光素酶報導子(NDV-Fluc)之重組NDV在注射之腰窩腫瘤中產生持續螢光素酶信號，而全身投與該病毒在腫瘤中未產生可偵測之螢光素酶信號(圖8A)。因為有限之全身病毒遞送不太可能誘導足夠腫瘤溶解及免疫反應，所以探索瘤內NDV注射作為一種引發抗腫瘤免疫反應之可克服全身OV療法之限制的方式。因而，為進行進一步研究，藉由使用兩側腰窩B16F10腫瘤模型來模擬模型化轉移性疾病(圖10A)。NDV-Fluc投與右側腰窩腫瘤中在注射腫瘤內產生病毒複製，其中長達96小時可偵測到螢光素酶信號(圖8B-8D)。藉由發光成像，藉由受精蛋中之繼代，或RT-PCR，在對側(左側腰窩)腫瘤中未偵測到病毒(圖8B-8D)。因此此系統允許表徵注射病毒之腫瘤與未直接受NDV影響之遠端腫瘤中的免疫反應。6.2.2.2 NDV 療法增加局部及遠端腫瘤淋巴細胞浸潤且延遲腫瘤生長
如表現白細胞常見抗原CD45之細胞的浸潤增加所證明，注射病毒之腫瘤之分析揭露發炎反應(圖9A-9B)。免疫浸潤之特徵為包括骨髓細胞、NK細胞及NKT細胞(圖9C)之先天性免疫隔室及包括CD8+及CD4+FoxP3- (Tconv) T細胞之習知適應性隔室增加，引起CD8及Tconv與調節(Treg)T細胞比率顯著增加(分別p=0.0131及p=0.0006)(圖9D-9F)。顯著地，對側腫瘤之分析揭露發炎性浸潤類似增加(圖10B及10C)，其特徵為先天性免疫細胞(圖10D)與效應T細胞(圖10E及10G)之數目增加。值得注意地，雖然Treg之絕對數目無重大變化(圖10G)，但其相對百分比相當大地減小(圖10E、10F及10H)，其中CD8及Tconv與Treg比率顯著增強(分別p=0.002及p=0.0021)(圖10I)。自遠端腫瘤分離之效應T細胞分別表現出增加之活化、增殖及溶解標記物ICOS、Ki-67及顆粒酶B (圖10J及10K)。如前，病毒或病毒RNA無法自遠端腫瘤分離，此表明在遠端腫瘤微環境中觀測到之變化並非由直接病毒感染引起。為進一步排除不可偵測之局部病毒擴散的可能性，將腫瘤植入其他遠端部位，諸如兩側後足墊，此產生類似發現(圖11A-11E)。
與觀測到發炎作用一致，瘤內投與NDV不僅延遲注射腫瘤之生長，且亦延遲對側腫瘤之生長，從而延長動物存活(圖10L及10M)。為確定此作用是否為暫時的且持久抗腫瘤保護是否可能，將負載單一腰窩B16F10腫瘤之小鼠瘤內用NDV處理，且在相對之腰窩上用B16F10細胞注射長期存活者。大部分動物顯示腫瘤生長延遲，且30%動物完全排斥再攻擊之細胞，此表明利用NDV之瘤內療法實際上可誘導保護性抗腫瘤記憶反應(圖13)。6.2.2.3 NDV 誘導腫瘤特異性淋巴細胞之腫瘤浸潤及擴增
為確定抗腫瘤免疫反應是否視注射NDV之腫瘤類型而定或為由NDV感染產生之非特異性炎症之結果，用在相對腰窩植入之異源腫瘤(MC38結腸癌及B16F10黑色素瘤)進行實驗(圖12A)。為追蹤腫瘤特異性淋巴細胞，將識別黑色素瘤分化抗原gp100 (Pmel)及Trp1 (Trp1)的經T細胞受體-轉殖基因先天性標記之CD8+ (Pmel)細胞或經螢光素酶標記之CD4+ (Trp1)細胞授受性轉移(Muranski等人，2008, Blood, 112: 362；Overwijk等人，2003, J Exp Med, 198: 569)。生物發光成像用於量測授受性轉移之Trp1細胞之分佈及擴增動力學。Trp1細胞轉移至經PBS處理之腫瘤負載動物中未能引起腫瘤中Trp1累積，突出在此模型中腫瘤微環境之高免疫抑制性(圖12B-12D)。NDV注射至B16F10腫瘤中引起注射腫瘤內螢光素酶信號顯著增加(圖12B-12D)，此表明Trp1 T細胞擴增(曲線下面積(AUC) p=0.0084)。顯著地，在對側腫瘤中看到類似擴增，儘管有所延遲(p=0.0009)(圖12B-12D)。相比之下，NDV注射至MC38腫瘤中未能誘導Trp1大量浸潤至注射之MC38腫瘤或遠端B16F10腫瘤中(圖12B-12D)，此表明遠端腫瘤特異性淋巴細胞浸潤可能視注射腫瘤之抗原特性而定。類似地，NDV之瘤內注射引起遠端腫瘤中Pmel細胞之浸潤增加，此在注射腫瘤為B16F10而非MC38時更為顯著(圖12E)。
有趣地，雖然授受性轉移之淋巴細胞對遠端B16F10腫瘤的浸潤視注射腫瘤特性而定，但即使當主要注射腫瘤為MC38時遠端腫瘤亦展現免疫浸潤增加(圖12F)，此表明非特異性發炎反應組分亦可能起作用。實際上，當瘤內注射至未處理之B16F10腫瘤負載小鼠中時，來自NDV處理之動物的用UV照射處理以使任何潛在病毒不活化的血清誘導腫瘤白細胞浸潤(圖12G及12H)，其中主要在NK及CD8+隔室中看到增加(分別p=0.0089及p=0.0443)(圖12I)。6.2.2.4 NDV 上調腫瘤浸潤性 T 細胞上之 CTLA-4
儘管在遠端腫瘤中看到顯著之發炎反應及生長延遲，但僅僅在大約10%動物中看到完全對側腫瘤排斥反應與長期存活率(圖10M)，此表明腫瘤微環境中之活性免疫抑制機制。注射NDV之腫瘤及遠端腫瘤的表徵揭露腫瘤浸潤性T細胞上CTLA-4之上調(圖14)。6.2.2.5 NDV 療法引起腫瘤細胞上及腫瘤浸潤性白細胞上 PD-L1 之上調。
為確定靶向其他免疫檢查點與NDV療法組合是否可能有益，評估NDV感染後對PD-1-PD-L1路徑之作用。如圖15中所示，在活體外與活體內NDV感染之腫瘤細胞上調細胞表面上抑制性PD-L1配位體之表現(圖15A)，此在遠端未感染腫瘤中亦看到。PD-L1之上調不僅僅限於腫瘤細胞，在先天性與適應性免疫譜系之腫瘤浸潤性白細胞上亦看到(圖15B)。6.2.2.6 NDV 與 PD-1 及 PD-L1 阻斷抗體之組合療法提高抗腫瘤免疫性及長期動物存活率
在上述兩側腰窩黑色素瘤模型中評估NDV與阻斷PD-1之抗體的組合及NDV與阻斷PD-L1之抗體的組合。NDV療法與抗PD-1或抗PD-L1抗體組合提高動物存活率(圖16A-16D及圖17A-17D)。對來自用NDV與抗PD-1抗體之組合處理之動物的遠端腫瘤進行表徵。如自圖18A-18E可見，瘤內NDV與全身PD-1阻斷組合引起免疫細胞顯著浸潤遠端腫瘤，其中腫瘤浸潤性CD8細胞增加為最顯著之發現。浸潤細胞分別上調增殖及溶解標記物Ki67及顆粒酶B(圖19A-19B)。6.2.2.7 NDV 誘導注射病毒之腫瘤及遠端腫瘤及腫瘤引流淋巴結 (TDLN) 中 CD4 及 CD8 細胞上 ICOS 之腫瘤免疫浸潤上調
以上發現證明瘤內NDV與全身免疫檢查點阻斷之組合引起兩種治療性方法之間的顯著協同作用。為進一步證實此等發現，對經由相關共刺激路徑增強腫瘤微環境內之T細胞效應功能可驅動更佳抗腫瘤免疫反應進行研究。先前研究確定作為患者中對CTLA-4阻斷之反應的強指示物的T細胞上之誘導性共刺激因子(ICOS)持續上調(Carthon等人，2010, Clin. Canc. Res., 16:2861)。ICOS為在活化T細胞之表面上上調的CD28同源物，其已顯示對於所有T輔助亞群之T細胞依賴性B淋巴細胞反應及發展為關鍵的(Simpson等人，2010 Curr Opin Immunol. 22:326)。近來藉由小鼠研究證實ICOS在CTLA-4阻斷之抗腫瘤功效中之作用，其中缺乏ICOS之小鼠在發展CTLA-4阻斷之抗腫瘤反應中嚴重受損(Fu等人，2011, Cancer Res., 71:5445)。
對用NDV處理之兩側腰窩腫瘤模型中ICOS之表現進行表徵以確定受體是否可充當此治療方法中之標靶。為表徵瘤內NDV療法之局部及遠端效應，利用兩側腰窩B16F10黑色素瘤模型，其中病毒投與單側腫瘤(圖20A)。評估可預測更佳反應且可用於進一步提高治療功效之活化標記物。本實例聚焦於ICOS，因為持續ICOS上調先前已顯示與用針對惡性黑色素瘤之抗CTLA-4療法治療之患者中更持久之治療反應及增加之存活相關。自腫瘤及腫瘤-引流淋巴結分離之淋巴細胞之分析確定作為活化標記物之一的共刺激分子ICOS在經處理之動物中上調(圖20B及20C)。6.2.3 結論
為引發免疫原性腫瘤細胞死亡及發炎反應，採用非病原性NDV，其儘管具有相對較弱之溶解活性，但已顯示為I型IFN及DC成熟之強誘導劑(Wilden等人，2009, Int J Oncol 34: 971；Kato等人，2005, Immunity 23: 19)。利用以先前顯示不受伴隨免疫性影響之時程錯開植入腫瘤的兩側腰窩黑色素瘤模型(Turk等人，2004, J Exp Med 200: 771)。本實例證實NDV之瘤內注射在缺乏遠端病毒擴散下引起遠端腫瘤免疫浸潤。值得注意地，此作用與Treg之數目相對減少及CD4及CD8效應細胞與Treg比率之顯著增強相關，先前已顯示其為對免疫療法之良好免疫反應的標記物(Quezada等人，2006, J Clin Invest 116: 1935；Curran等人，2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107: 4275)。
本實例中之資料證實NDV增強腫瘤特異性淋巴細胞之腫瘤浸潤，此為視注射病毒之腫瘤之特性而定的作用。授受性轉移之淋巴細胞之腫瘤浸潤及擴增增強進一步表明溶瘤病毒療法與利用授受性T細胞轉移之治療方法之間的協同作用。似乎合理的係腫瘤特異性淋巴細胞在初始病毒感染位點進行活化及擴增，接著其遷移至其他腫瘤位點，此可能視趨化因子及淋巴細胞歸巢受體而定(Franciszkiewicz等人，2012, Cancer Res 72: 6325)。本實例中之資料亦證實遠端腫瘤免疫浸潤在某種程度上為非特異性的，且可藉由NDV感染異源腫瘤或藉由血清自經處理之動物轉移至未處理之負載腫瘤小鼠誘導。藉由諸如IL-6之發炎性細胞介素誘導的血管滲透性增加可強烈地引起腫瘤血管之活化及淋巴細胞募集至腫瘤中(Fisher等人，2011, The Journal of clinical investigation 121: 3846)。
儘管TIL顯著增加，但NDV單一療法在遠端腫瘤中之治療作用實際上適中，突出此等腫瘤之微環境的免疫抑制性(Spranger等人，2013, Sci Transl Med 5)。
概言之，本實例證實利用NDV之B16黑色素瘤之局部瘤內療法誘導發炎反應，在無遠端病毒擴散下引起遠端(未注射病毒)腫瘤中之淋巴球性浸潤及抗腫瘤作用。發炎作用與腫瘤特異性CD4+及CD8+ T細胞之遠端腫瘤浸潤一致，此視注射病毒之腫瘤之特性而定。本實例證實利用溶瘤NDV之局部療法在遠端腫瘤中誘導發炎性免疫浸潤，使其容易用免疫調節抗體進行全身療法。6.3 實例 3
本實例證實編碼IL-12之NDV之瘤內投與與抗PD-1抗體之投與組合在注射NDV-IL-12之腫瘤與未注射腫瘤中產生穩固抗腫瘤活性。如下文所示，此抗腫瘤活性與免疫基因之誘導及CD3+ T細胞之浸潤相關。6.3.1 材料與方法 6.3.1.1 病毒之選殖及拯救
NDV基因組含有編碼核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、紅血球凝集素-神經胺糖酸苷酶(HN)及大病毒聚合酶蛋白(L)之六個開放閱讀框架。將由編碼IL-12 p40次單元、GGGGGGS (SEQ ID NO: 24)連接子及IL-12 p35次單元之核酸序列組成的人類IL-12轉殖基因(SEQ ID NO: 26)插入至pT7NDV-LS-L289A質體(圖21；SEQ ID NO: 21)中P基因與M基因之間的SacII選殖位點中。所得到之含有人類IL-12轉殖基因(SEQ ID NO: 31)之pT7NDV-LS-L289A質體在本實例中稱為「NDV-huIL-12」或「pT7NDV-LS-L289A-huIL-12」。如圖21中所示，pT7NDV-LS-L289A質體含有在T7啟動子之轉錄控制下的弱毒性NDV LaSota序列。質體在編碼NDV F蛋白質之序列中含有L289A突變。已報導與野生型F蛋白質相比，NDV F蛋白質中之L289A突變致使F蛋白質更促融，且促進溶瘤活性。參見例如Sergel等人，2000, J. Virol. 74:5101；Altomonte等人，2010, Mol. Ther. 18:275。
為產生用於插入至pT7NDV-LS-L289A質體中之人類IL-12轉殖基因，牢記「六的倍數規則」，設計正向及反向引子(SEQ ID NO: 32及33)，且此等引子用於產生與pT7NDV-LS-L289A質體中之SacII選殖位點具有同源性的末端具有15個鹼基對的PCR片段。因為NDV之成功拯救要求具有轉殖基因之基因組遵循「六的倍數規則」，所以在引子設計期間考慮「六的倍數規則」且在需要時證實及校正。在37℃下將pT7NDV-LS-L289A質體用SacII (NEB，目錄號R0157S)消化隔夜，接著在37℃下鹼性磷酸酶(NEB，目錄號M0289S)處理30分鐘以防止質體再環化。消化及鹼性磷酸酶處理後，使用NucleoSpin清除套組(Macherey-Nagel，目錄號740609.250)純化線性化質體。接著使用來自Takara Clontech之Infusion HD選殖套組將PCR片段及切割質體浸漬在一起。所得質體轉型至Max Efficiency Stbl2勝任細胞(Life Technologies，目錄號10268-019)中。陽性純系藉由菌落PCR及序列證實來鑑別。為證實序列，利用在選殖區域外面黏接之引子(TCGATCGAGGAAATCAGG (SEQ ID NO: 36)及GTACAGCCCAATTGTCC (SEQ ID NO: 37))。隨後，使用PureLink HiPure Midi製備型套組(Invitrogen，目錄號K210004)產生無內毒素之中量製劑。
與上文關於NDV-huIL-12構築體所描述類似的策略用於選殖及拯救編碼鼠類IL-12轉殖基因(SEQ ID NO: 30)之NDV。亦即，牢記「六的倍數規則」，設計正向及反向引子(SEQ ID NO: 34及35)，且該等引子用於產生與pT7NDV-LS-L289A質體中之SacII選殖位點具有同源性的末端具有15個鹼基對的PCR片段。使用上述技術將PCR片段選殖至pT7NDV-LS-L289A質體中且如上所述選擇陽性純系。含有鼠類IL-12轉殖基因(SEQ ID NO: 31)之pT7NDV-LS-L289A質體在本實例中稱為「NDV-muIL-12」或pT7NDV-LS-L289A-muIL-12。
使用TransIT®-LT1轉染劑(Mirrus，目錄號MIR2300)，將表現T7 RNA聚合酶之幼倉鼠腎(BHK)衍生細胞(BSR-T7)用編碼L、NP、P及T7 RNA聚合酶蛋白質之質體及pT7NDV-LS-L289A-huIL-12質體或pT7NDV-LS-L289A-muIL-12轉染。詳言之，對於回復轉染而言，每孔使用30 µL Trans-IT LT1試劑及150 µL OptiMEM，質體濃度如下(6孔盤中微克/孔)：4.0 µg pT7NDV-LS-L289A-huIL-12或pT7NDV-LS-L289A-muIL-12質體；2.0 µg N質體、1.0 µg P質體；1.0 µg L質體；2.0 µg T7opt質體(Addgene質體#65974，Benhur Lee lab贈與)。為產生NDV-WT，以與pT7NDV-LS-L289A (亦即，缺乏huIL-12轉殖基因之pT7NDV-LS-L289A-huIL-12質體)類似之方式進行回復轉染。關於自cDNA回復重組NDV之方法的描述，參見例如Ayllon等人，2013, J. of Visualized Experiments, 80:e50830。在轉染48小時後，收集(使用細胞刮刀)上清液以及細胞，且保持在冰上，直至注射至9-10日齡之受精雞蛋之尿囊腔中。經注射之蛋在37℃下培育2天，接著在4℃下培育隔夜。接著收穫尿囊液。為收穫尿囊液，將蛋殼在無菌條件下敞開破裂，使用移液管擷取尿囊液，且轉移至保持在冰上之無菌falcon管中，且藉由離心(15×g)清除細胞碎片。為證實病毒生長，接著在血球凝集分析中使用此尿囊液之樣品。接著病毒等分且直接冷凍(-80℃)，直至使用。
在引入鼠類或人類IL-12轉殖基因至NDV中的情況下，未觀測到可觀測之病毒力價差異。在蛋中培養後如下列出代表性病毒力價：NDV-huIL12，1.40×108 ；NDV-wt，3×108 ；以及NDV-mIL12，1.7×108 。6.3.1.2 血球凝集 (HA) 分析
使用V形底微量滴定盤進行HA分析。除了第一列，將50 µL 1X PBS添加至盤中之每個孔。第一列接受100 µL載有病毒之純(亦即未經稀釋)尿囊液。接著在整列中病毒懸浮液進行兩倍連續稀釋。在最後一列後丟棄過量50 µL。所有孔均具有50 µL之最終體積。接著50 µL 0.5%火雞紅血球懸浮液添加至每個孔且輕輕敲打盤。盤在4℃下培育20-30分鐘，以使紅血球沈降。認為展示完全血球凝集之樣品為對病毒呈陽性。觀測到陰性結果為盤底部之清晰紅色集結粒。6.3.1.3 IL-12 表現
藉由來自R&D systems之市售套組-人類IL-12 Quantikine ELISA套組(D2050)及小鼠IL-12 Quantikine ELISA套組(M1270)證實huIL-12及muIL-12表現。6.3.1.4 NDV-huIL-12 之分析
使用以全文引用的方式併入本文中之Vlasak等人，Vaccine 34(2016) 2321-2328中描述的技術，藉由流動式細胞量測術定量及表徵NDV-huIL-12。
另外，藉由在還原條件下之SDS-PAGE，分析六個NDV蛋白(F、HN、NP、L、P及M)之表現。詳言之，使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠(ThermoFisher Scientific，目錄號NP0321BOX)，在MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸))緩衝基質，進行SDS-PAGE分析。使用十二烷基硫酸鋰(LDS)及二硫蘇糖醇(DTT)還原樣品，且在70℃下熱處理10分鐘。使用GelCode 藍染劑(ThermoFisher Scientific，目錄號24590) 將凝膠染色隔夜，用水脫色，接著使用Molecular Dynamics Personal Densitometer SI and ImageQuant軟體成像。
此外，如以全文引用的方式併入本文中之Newcastle disease virus: propagation, quantification, and storage. Curr. Protoc Microbiol. 2006年6月，第15章: Unit 15F.2中所述，藉由在胰蛋白酶存在下，用Vero細胞進行空斑分析，來測定NDV力價。6.3.1.5 小鼠
自Jackson Laboratory購得WT C57BL/6小鼠。將所有小鼠維持在微小隔離籠中且根據NIH及美國實驗動物護理條例協會處理。此研究之所有小鼠程序及實驗均經默克研究實驗室(Boston及Palo Alto)機構動物護理及使用委員會批准。6.3.1.6 細胞株
黑色素瘤(B16F10)之鼠類癌細胞株維持在補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中。6.3.1.7 抗體
抗小鼠PD-1單株抗體(muDX400)及小鼠IgG1同型對照抗體(小鼠×[HEXON_腺病毒] (TC31.27F11.C2) IgG1)藉由默克研究實驗室產生。6.3.1.8 病毒及選殖
重組弱毒性NDV LaSota病毒株用於所有實驗。使用先前描述之方法，自cDNA回復病毒，且藉由逆轉錄PCR測序以求嵌段保真性。病毒力價藉由連續稀釋及免疫螢光法在Vero細胞中測定。6.3.1.9 腫瘤攻擊實驗
建立兩側腰窩腫瘤模型以監測在注射腫瘤與全身腫瘤中之治療功效。針對各腫瘤模型，建立治療時程及細胞劑量以實現NDV或抗PD-1作為單一藥劑之10-20%腫瘤清除率。對於評估野生型NDV (NDV-WT)或表現小鼠IL-12之NDV (NDV-muIL-12)與PD-1阻斷之組合療法的實驗，藉由分別將2×105 個及1×105 個B16F10細胞皮下(SC)注射在右側腰窩及左側腰窩中，來植入B16F10腫瘤。在腫瘤植入後7-9天，開始給藥。第0天指示第一天給藥。在第0、2、4及6天，將小鼠用腫瘤右側腹中總體積為100 µl的含1×107 pfu NDV-WT或NDV-muIL-12之PBS的4次瘤內注射處理(稱為注射腫瘤)。左側腰窩中之腫瘤稱為未注射腫瘤。同時，在第0、4及8天或在第0及6天(視研究設計而定)，小鼠接受抗PD-1抗體(10 mg/kg)之3或2次腹膜內注射。對照組接受對應劑量之腹膜內同型抗體及PBS之瘤內注射。藉由用測徑規量測，隨時間推移監測腫瘤尺寸及發生率。在處死動物後，收穫腫瘤且使用液氮速凍以分離RNA及進行基因表現分析，或固定在10%中性緩衝福馬林中48小時，轉移至70%乙醇且包埋於石蠟塊中以進行免疫組織化學。6.3.1.10 免疫組織化學
對4 µm厚之經福馬林固定之石蠟包埋的組織切片進行小鼠CD3染色。將該等切片去石蠟且在乙醇系列中復水。載片經受熱誘導之抗原決定基修復及內源性過氧化酶之阻斷，接著與初級抗體抗小鼠CD3大鼠mAb純系CD3-12 (AbD Serotec, 目錄號MCA1477)一起以1:1000之工作稀釋在室溫下培育60分鐘。接著切片與二級抗體預吸附之兔抗大鼠IgG H&L (Abcam, ab102248)一起培育15分鐘，接著ImmPRESS™ HRP抗兔IgG (過氧化酶)聚合物偵測套組(Vector Laboratories, 目錄號MP-7401)15分鐘。使用3,3-二胺基聯苯胺(Dako, 目錄號K3468)目測抗原-抗體結合。切片用邁耶爾之蘇木精(Mayer's Hematoxylin)(Poly Scientific, 目錄號S216-1GL)對比染色，脫水且滑動蓋子。6.3.1.11 人類腫瘤組織培養
根據州及聯邦條例，自商業來源(BioOptions, Boston BioSource (Tufts), Folio Biosciences, and Tissue Solutions)及學術合作者(University of Rochester)獲得來自患有腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌及頭頸部鱗狀細胞癌之患者的人類腫瘤樣品。在手術後1小時內收集新鮮腫瘤組織以自患者移除腫瘤，置於AQIX運輸培養基中且在4℃下隔夜運輸至默克研究實驗室(Palo Alto, CA)。將腫瘤包埋於1%低熔點凝膠中，且使用Mcllwain組織切碎機切割成400 μm切片。將腫瘤切片安置於含有1 mL達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)、10% FBS、100 U/mL青黴素及100 μg/mL鏈黴素之6孔培養皿中的Millicell-CM嵌段上。在此等實驗中,評估腎細胞癌(「RCC」；n=4)之5個樣品、結腸直腸癌之3個樣品、乳癌之2個樣品及頭頸部鱗狀細胞癌之一個樣品。將腫瘤切片與3×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL-12一起培育且在空氣培養基界面處在37℃下在具有5% CO2 之氛圍中培養24或48小時。對於某些實驗而言，將樣品速凍(亦即樣品置於管中且下降至液氮中，直至冷凍，且接著在乾冰上運輸且儲存於-80℃下)且如以下章節6.3.1.13中所述自樣品分離RNA。
對於其他實驗而言，使用多種套組，分析來自組織樣品之培養基的細胞介素及趨化因子。使用人類促炎性9叢組織培養套組(Meso Scale Discovery, 目錄號K15007B-2)分析GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1-β、IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α。使用人類IFN-α組織培養套組(Meso Scale Discovery, 目錄號K151ACB-4)分析IFN-α-2a；且使用人類IFN-β組織培養套組(Meso Scale Discovery, 目錄號K151ADB-4)分析IFN-β。使用V-PLEX趨化因子組1 (人類)套組(Meso Scale Discovery, 目錄號K15047D-2)分析伊紅趨素、伊紅趨素-3、IL-8、IP-10、MCP-1、MCP-4、MIP-1a、MIP-1b、MDC及TARC。6.3.1.12 人類全血分析
自Conversant Bio (Huntsville, AL)獲得具有實體腫瘤之患者(n=5)的全血，且經由默克研究實驗室內部獻血方案獲得來自健康供體(n=5)之全血。使用以下兩種實驗條件。(1) 1 mL全血未經處理或用3×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL-12處理48小時。收集血漿以使用上文針對人類腫瘤組織培養研究所述之套組評估多種細胞介素及趨化因子之蛋白質濃度。(2) 4 mL全血未經處理或用3×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL-12處理24小時。將全血收集至PAXgene血液RNA管(BD Biosciences目錄號762165)中，且在分離RNA後，使用Fluidigm RTqPCR平台(參見章節6.3.1.13)分析免疫基因組之基因表現。6.3.1.13 提取 RNA 及實時定量聚合酶鏈反應 (RTqPCR)
自小鼠B16F10腫瘤(章節6.3.1.9)、人類腫瘤樣品(章節6.3.1.11)及人類全血(章節6.3.1.12)分離RNA。藉由使用polytron均質器在RNA STAT-60 (Tel-Test Inc., Friendswood, TX))中均質化，來分離總RNA。根據製造商之方案提取總RNA。在用異丙醇沈澱後，將總RNA用苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)使用鎖相光管再提取。
使用QuantiTect逆轉錄(Qiagen, 目錄號2015310)，根據製造商之方案，將經DNA酶處理之總RNA反轉錄。自Life Technologies獲得引子：
在Fluidigm Biomark序列偵測系統上，根據製造商之方案(Fluidigm, Foster City, CA)，在TAQMAN™ RTqPCR反應(Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA)中，使用各900 nM之未標記之引子與250 nM之經FAM標記之探針，在來自各樣品之10 ng cDNA上進行實時定量聚合酶鏈反應(RTqPCR)。在另一反應中量測泛素水準且藉由Δ-Δ Ct法用於校正資料。使用各樣品之泛素及相關基因的平均循環閾值(Ct)，以下等式用於獲得校正值：1.8(Ct泛素- Ct相關基因) × 104 。6.3.1.14 Nanostring 基因表現分析
對於下文章節6.3.2.6中進行之分析，使用NanoDrop ND1000光譜儀(Thermo Fisher Scientific)定量RNA。在NanoString nCounter基因表現平台(NanoString Technologies)上進行基因表現分析。使用由與T細胞生物學、免疫調節及腫瘤浸潤性淋巴細胞及腫瘤相關之巨噬細胞之細胞標記物相關的800基因小組組成的常規代碼集。每個樣品，將最終體積為5 µL之50 ng 總RNA與3ʹ生物素化捕捉探針及經來自常規基因表現代碼集之螢光條碼標記之5ʹ報導探針混合。根據製造商之建議，探針及標靶轉錄物在65℃下雜交隔夜，歷時12-16小時。在NanoString nCounter製備台上，使用高靈敏度方案，操作雜交樣品，其中移除過量捕捉及報導探針，且轉錄物-特異性三元複合物固定在抗生蛋白鏈菌素塗佈之套筒上。在nCounter數位分析器上在最大掃描解析度下掃描樣品。各個別樣品之基因表現資料藉由HK(管家)校正來校正。對於各腫瘤樣品，原始計數為log10變換，且接著藉由減去所有管家基因之算術平均值進行各基因校正(表15)。基因表現圖譜分析(GEP)標籤評分計算為18基因上下標籤之管家校正值的加權和(表15)。各基因之管家校正值乘以來自評分權數之集合的該基因之係數，產生18基因標籤中各基因之加權RNA值，且加上加權RNA值，產生腫瘤樣品之標籤評分。參見Ayers等人，2017, J of Clinical Investigation 127: 2930-2940及WO2016094377。
表15： 6.3.1.15 細胞活力分析
將細胞(10,000個/孔/200 µL補充有10% FBS之DMEM或RPMI)重複塗鋪在8至96孔盤中，且在具有5% CO2 之氛圍中在37℃下培育18小時以允許細胞附接。在感染NDV-huIL-12前自孔移除細胞培養基。重複8次，細胞以於20 µL無血清培養基(DMEM + 0.3% BSA + 青黴素/鏈黴素)中MOI 2 (20,000 pfu)或6 (60,000 pfu)感染NDV-huIL-12。不具有病毒之培養基(模擬感染)或具有10 µM嘌呤黴素之培養基(或其媒劑DMSO)添加在平行孔中。盤在平坦表面上在室溫下培育1小時，接著抽吸培養基。將具有10%血清之細胞培養基(100 µL)添加至各孔，且盤在具有5% CO2 之氛圍中在37℃下培育48小時。收集上清液且儲存於-80℃下以分析細胞介素及趨化因子。接著根據製造商之說明書，使用Cell Titer Glo分析套組(Promega, 目錄號G7573)分析盤。6.3.1.16 來自人類腫瘤細胞株之細胞介素及趨化因子之分析
分析來自26個感染NDV-huIL-12 (MOI 2，重複4次)之細胞株的上清液的多種細胞介素及趨化因子。使用人類常規生物標記物套組(Meso Scale Discovery, 目錄號K15067L-2)分析IL-10、IL-1β、IL-2、MCP-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、MIP-1b及TNF-α。使用Human Interferon Combo套組(Meso Scale Discovery, 目錄號K15094K-2)分析IFN-α2a、IFN-β、IFN-γ及IL-29/IFN-λ1。6.3.1.17 統計學
腫瘤體積：個別動物之追蹤可能因為過度腫瘤負荷或其他原因而在早期終止。視原因及最後一次量測時之腫瘤尺寸而定，在該動物之隨後所有天，最後一個觀測到之腫瘤體積作為體積下限處理(右側截尾資料)。
為在給定天比較兩個處理組，使用允許右側截尾資料之非參數曼-惠特尼(Mann-Whitney)(或威爾科克森秩和(Wilcoxon rank sum))檢驗的一般化形式：格漢-佈雷斯洛檢驗(Gehan-Breslow test)之Peto及Peto版本。自比較之兩個處理之間的20,000個動物隨機再分配估計雙側p值。為控制給出之一對處理在所有時間點中的族系誤差率，藉由霍爾姆法(Holm's method)多重調整p值。小於0.05之p值用於界定統計顯著性。
來自腫瘤攻擊研究之基因表現資料：為在給定天比較兩個處理組，使用非參數曼-惠特尼檢驗。小於0.05之p值用於界定統計顯著性。
來自人類腫瘤組織培養及全血研究的細胞介素/趨化因子及/或基因表現資料：為在給定天比較兩個處理組，使用非參數威爾卡遜符號秩檢驗。小於0.05之p值用於界定統計顯著性。6.3.1.18 IL-12 生物分析
為評估NDV-huIL-12感染細胞中由NDV-huIL-12產生之huIL-12的功能性，將Vero細胞以5×105 個細胞/孔接種於6孔組織培養盤中且在37℃、5% CO2 下培育24小時。將NDV-huIL-12病毒之測試樣品在Opti-MEM (1X)還原血清培養基中稀釋至1 × 106 pfu/mL，且多種量之稀釋樣品轉移至細胞盤以實現0.03-1之間的MOI。接著Opti-MEM (1X)還原血清培養基添加至各孔至2 mL之最終體積。將感染之細胞盤在37℃、5% CO2 下培育24小時。使用PathHunter®生物分析偵測套組(DiscoverX, 目錄號93-0933)分析上清液中所產生之huIL-12之功能。
PathHunter ® U2OS IL12RB1/IL12RB2細胞經工程改造以共表現人類IL-12受體β1及β2。一種受體與酶供體(ED)融合，且另一受體與酶接受體(EA)融合。在功能huIL-12結合時，兩個受體二聚，迫使ED與EA互補而形成功能性β-半乳糖苷酶，該β-半乳糖苷酶使受質水解，產生化學發光信號。將U2OS IL12RB1/IL12RB2細胞以5×103 個細胞/孔接種於96孔細胞盤中且在37℃、5% CO2 下培育4-6小時。將來自感染Vero盤之各孔的總共60 µL上清液轉移至96孔樣品稀釋盤之第二行且在AssayComplete細胞塗鋪試劑(DiscoverX，93-0563R5A)中在各列中進行3倍連續稀釋。將總共10 µL各稀釋上清液轉移至U2OS細胞盤中且在37℃、5% CO2 下培育盤16-20小時。接著將10 µL偵測試劑1添加至各孔且盤在室溫下培育15分鐘。接著將40 µL偵測試劑2添加至各孔且盤在室溫下進一步培育60分鐘。使用SpectraMax M5盤式讀取器偵測化學發光信號。6.3.1.19 藉由 ELISA 定量 huIL-12
將Vero細胞於補充有2%麩醯胺酸(Corning, 目錄號25-005-CI)之Opti-PRO無血清培養基(Gibco, 目錄號12309-019)中以1 × 104 個細胞/孔接種於96孔組織培養盤中，且在37 ± 2℃、5 ± 2% CO2 下培育大約24小時。將NDV-huIL-12病毒之測試樣品(批A及B批)在Opti-MEM (1X)還原血清培養基(Gibco, 目錄號31985-070)中預稀釋以實現2 × 104 pfu/mL。將總共300 µL各預稀釋之測試樣品添加至0.5 mL分析阻斷液(Costar, 目錄號3956)之第一列，且藉由轉移150 µL樣品至150 µL Opti-MEM (1X)還原血清培養基中，在各列中進行2倍連續稀釋。每個樣品製備兩個複製品。在接種後大約24小時自培育箱移除含有Vero細胞之96孔盤且自盤移除消耗培養基。將細胞用100 µL連續稀釋之測試樣品接種且在37℃、5% CO2 下培育。培育大約24小時後，自感染盤移除90 µL上清液，轉移至預塗有抗人類IL-12 p70捕捉抗體之ELISA盤(Affymetrix eBioscience, 目錄號14-7128-68)且在室溫下培育兩小時。將捕捉huIL-12用抗人類IL-12 p70偵測抗體(Affymetrix eBioscience, 目錄號33-8261-68A)及抗生物素蛋白-HRP偵測且根據供應商程序(Affymetrix eBioscience, 人類IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go! ELISA套組, 目錄號88-7126-88)，用HRP受質TMB目測。將MOI依賴性huIL-12表現曲線與NDV-huIL-12參考標準相比(圖34)。6.3.1.20 純化
使用由以下單元操作組成之方法自收穫之尿囊液純化NDV-huIL-12：(1)澄清、(2)切向流過濾及(3)無菌過濾。使用1.2 µm玻璃纖維終端過濾移除細胞及其他大量碎片，使收穫之尿囊液澄清。用於此步驟之膜含有淨正電荷，引起宿主細胞DNA之可量測之減少。澄清塊(CB)隨後藉由切向流過濾(TFF)，使用750 kD空心纖維膜處理。在此步驟期間，批料濃縮約5倍且針對4透濾體積(DV)高鹽緩衝液、接著4 DV低鹽調配物緩衝液透濾，且接著濃縮約10倍。此單元操作構成主要純化步驟，由此殘餘蛋之蛋白質、主要卵白蛋白及殘餘DNA減少至可接受之水準。該步驟亦用以將緩衝液交換此與調配物相容之緩衝液。接著TFF產物(TFFP)經由0.2 µm過濾器無菌過濾且分配至適當無菌儲存容器中。接著冷凍經純化之病毒塊(PVB)且儲存於-70℃下。6.3.2 結果 6.3.2.1 在同基因型小鼠 B16F10 兩側腫瘤模型中 NDV-muIL-12 與抗 muPD-1 mAb 組合之抗腫瘤功效及作用機制
B16F10腫瘤未充分地浸潤T細胞且對抗PD-1療法具抗性。B16F10腫瘤顯示極具侵襲性之生長且代表高桿模型。因此，選擇B16F10模型來與未武裝之NDV (「NDV野生型」(「NDV-WT」))相比，評估編碼小鼠IL-12轉殖基因之NDV載體。在兩個腫瘤負載C57BL/6小鼠中評估NDV載體以評估遠端效應(亦即未投與NDV之腫瘤中的抗腫瘤功效)。
與小鼠IgG1同型對照(第1組)相比，投與單獨muDX400(第2組)未引起注射腫瘤(p=1.0)或未注射腫瘤(p=0.475)之腫瘤體積的顯著減小(圖22)。與NDV-WT(第3組)相比，投與單獨NDV- muIL-12(第5組)引起注射腫瘤之腫瘤體積顯著減小(p=0.027)，但未注射腫瘤之腫瘤體積未顯著減小(p=1.0)(圖22)。然而，與NDV- muIL-12 (第5組)相比，NDV-muIL-12與muDX400 (第6組)組合引起注射腫瘤(p=0.047)與未注射腫瘤(p=0.020)之腫瘤體積的顯著減小(圖22A-22D)。另外，NDV-muIL-12與muDX400組合分別引起注射腫瘤及未注射腫瘤中十分之六完全消退(CR)及十分之五CR (圖22A-22D)。此等結果可在獨立實驗中重現，與證實小鼠臨床前模型中NDV破壞對免疫檢查點阻斷之抗性的先前發現相一致(Zamarin等人，2014, Sci. Transl. Med. 6:226ra32 (2014))。對於注射腫瘤而言，完全消退之數目如下：第1組：0；第2組：0；第3組：1；第4組：1；第5組：2；以及第6組：6。對於未注射腫瘤而言，完全消退之數目如下：第1組：0；第2組：1；第3組：1；第4組：3；第5組：0；以及第6組：5。
在同一研究中，在第14天收穫腫瘤以評估多種免疫基因之表現。圖23及圖24分別顯示注射腫瘤及未注射腫瘤中T細胞標記物(圖23A及圖24A)、細胞介素(圖23B及圖24B)、IFN誘導性基因(圖23C及圖24C)及PD-1路徑(圖23D及圖24D)之代表性基因的mRNA表現。僅僅在投與NDV-muIL-12之動物之注射腫瘤(第5組及第6組)中偵測到Il-12p35之mRNA表現。此結果表明NDV本身不誘導IL-12。在第5組及第6組之未注射腫瘤中未偵測到Il-12p35之mRNA表現亦支持NDV限於注射NDV之腫瘤的先前發現(Zamarin等人，2014, Sci. Transl. Med. 6:226ra32 (2014)。如圖23A-23D中所示，注射腫瘤中CD3-ε、CD8-β、Gzmb、IL-12p35、IL-15、IFN-γ、Irf7、Mx1、Oas1a、PD-1及PD-L1之mRNA表現隨以下處理次序增加：對照(第1組)、muDX400單一療法(第2組)、NDV-WT單一療法(第3組)、muDX400與NDV-WT之組合(第4組)、NDV-muIL-12單一療法(第5組)及muDX400與NDV-muIL-12之組合(第6組)，且在第3組與第5組及第4組與第6組之間的增加為統計學上顯著的(p＜0.05)。在對照(第1組)與muDX400與NDV-WT (第4組)或NDV-muIL-12 (第6組)之組合之間未注射腫瘤中此等基因之增加為統計學上顯著的(圖24A-24D)。自獨立實驗獲得類似結果。
在另一獨立兩側B16F10研究中，小鼠B16F10細胞皮下植入免疫活性C57BL/6J小鼠之右側腰窩(2×105 個細胞)及左側腰窩(1×105 個細胞)中。在植入(第0天)後7天，基於右側腰窩(注射腫瘤)中之腫瘤體積(TV)，將動物分成6組，其中中值TV=56 mm3 。左側腰窩(未注射腫瘤)中之中值TV為38 mm3 。在第0天開始給藥。每4天經腹膜內投與小鼠IgG1同型對照及10 mg/kg muDX400，總共3劑。每2天PBS、NDV-WT及NDV-muIL-12以1×107 pfu投與右側腰窩上之腫瘤中，總共4劑。追蹤動物，直至第54天。當注射及未注射腫瘤之體積總和≥2000 mm3 或體重損失≥20%時，處死動物。各組10隻動物。如圖25A-25B中所示，用瘤內NDV-muIL-12與muDX400組合處理使動物總存活期最長。
在另一兩側B16F10研究中，小鼠B16F10細胞皮下植入免疫活性C57BL/6J小鼠之右側腰窩(2×105 個細胞)及左側腰窩(1×105 個細胞)中。在植入(第0天)後9天，基於右側腰窩(注射腫瘤)中之腫瘤體積(TV)，將動物分成6組，其中中值TV=108 mm3 。左側腰窩(未注射腫瘤)中之中值TV為83 mm3 。在第0天開始給藥。每4天經腹膜內投與小鼠IgG1同型對照及10 mg/kg muDX400，總共2劑。每2天PBS、NDV-WT及NDV-muIL-12以1×107 pfu投與右側腰窩上之腫瘤中，總共4劑。在第8天收穫注射及未注射腫瘤(n=3/組)，且藉由免疫組織化學分析CD3表現。如圖26A-26B中所示，用瘤內NDV-muIL-12與muDX400組合處理引起注射與未注射腫瘤中CD3+T細胞之浸潤驚人得高。流動式細胞量測術分析表明大部分浸潤性CD3+細胞為活化CD8或CD4效應細胞(未顯示)。
另外，評估在兩側B16F10中用IL-12對比其他細胞介素(IL-23、IL-27及IL-2)武裝NDV與抗muPD-1單株抗體(muDX400)組合的抗腫瘤功效。在比較NDV-muIL-12與NDV-muIL-23及muIL-27之研究中，與muDX400組合，用NDV-muIL-12 + muDX400處理在注射及未注射腫瘤中引起最高數目之消退(完全及部分)(圖37A-37N)，但注射或未注射腫瘤的腫瘤體積未顯著減小(p＞0.05)。在此研究中，與抗muDX400與NDV-muIL-23或NDV-muIL-27之組合相比，NDV-muIL-12與muDX400之組合在注射腫瘤及未注射腫瘤中引起更高數目之完全消退(圖37G及37N)。此外，在比較NDV-muIL-12與NDV-mIL-2之研究中，與muDX400組合，兩個處理對注射腫瘤之作用為相當的，引起完全及部分消退之數目相當及第18天中值TV及68%信賴區間相當(參見圖38C、38D及38I)。對於未注射腫瘤(圖38G、38H及38J)，雖然在兩個處理之間第18天腫瘤體積之減小不顯著(p＞0.05)，但與NDV-muIL-2 + muDX400 (中值TV = 255與68%信賴區間(207，1036 mm3 ))相比，NDV-muIL-12 + muDX400引起中值TV = 130 mm3 及更緊密68%信賴區間(102，244 mm3 )。在此研究中，NDV-muIL-12與muDX400之組合在未注射腫瘤中引起比muDX400與NDV-muIL-IL-2之組合更高數目的完全消退(圖38J)。6.3.2.2 人類腫瘤細胞株中 NDV-huIL-12 之溶解活性
在一組26個人類癌細胞株中在2及6之感染倍率(MOI)下在感染48小時後評估NDV-huIL-12之溶解活性(圖27A)。該組包括7種癌症類型：黑色素瘤、HNSCC (頭頸部鱗狀細胞癌)、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌及胰臟癌。在病毒感染48小時後藉由基於ATP之定量方法評估細胞活力(圖27A)。對於各細胞株，NDV-huIL-12 (MOI 2及6)之溶解活性表示為相對於模擬感染細胞之活力百分比；10 µM嘌呤黴素(陽性對照)之溶解活性表示為相對於媒劑(DMSO)處理之細胞的活力百分比。
在單鹼基F蛋白質裂解位點下，NDV-huIL-12限於腫瘤細胞中之單一複製週期。在此考慮因素下，對NDV-huIL-12之靈敏度的準則設定在MOI 2下細胞活力減少＞20%下。藉由此準則，26個細胞株中之22個容易由NDV-huIL-12溶解。在MOI 6下，所有細胞株均容易由NDV-huIL-12溶解(細胞活力減少＞20%)。總之，在一系列人類腫瘤細胞株中證實NDV-huIL-12之溶解活性。6.3.2.3 用 NDV-huIL-12 處理誘導人類腫瘤細胞株中之細胞介素及趨化因子
在48小時自分析NDV-huIL-12 (MOI 2)之溶解活性或模擬感染之26個人類腫瘤細胞株收穫細胞培養上清液，且藉由免疫分析來分析多種細胞介素及趨化因子。IL-12p70、IFN-β及IP-10之平均濃度呈現在圖27B中。NDV-huIL-12誘導除肺癌細胞株H322外之所有細胞株中超過免疫分析中偵測上限之水準之IL-12p70的分泌。NDV-huIL-12未誘導任一細胞株中之IFN-γ (資料未示)；預期此係因為IL-12受體主要由活化T細胞及NK細胞表現。NDV-huIL 12僅僅在2個細胞株(乳房SK BR-3，HNSCC SCC15；資料未示)中誘導IFN-α-2a，但在三分之一細胞株中誘導IFN-β。另外，NDV-huIL-12誘導20個細胞株中中等/高水準之IP-10。6.3.2.4 用 NDV-huIL-12 處理誘導人類腫瘤組織培養物及全血中之免疫基因
人類腫瘤組織培養法允許在藥物存在下培養完整新鮮癌症組織長達48小時。可評估藥物對腫瘤樣品中之癌細胞及預先存在之免疫細胞的作用。在此平台中評估NDV-WT及NDV-huIL-12對細胞介素及趨化因子(蛋白質表現)及免疫基因(基因表現)之誘導。在此等研究中，腎細胞癌(RCC)之4個樣品、結腸直腸癌(CRC)之3個樣品、乳癌之2個樣品及HNSCC之1個樣品用3×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL至12處理長達48小時。在24及48小時時間點，自組織培養物收集上清液且藉由免疫分析來分析多種細胞介素及趨化因子，且將腫瘤速凍且分離RNA以供免疫基因之分析。IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70及IFN-γ及IP-10之平均濃度呈現於圖28中，且IFN誘導性基因IRF7、IFIT2及MX2、趨化因子CXCL9、CXCL10 (IP-10)及CXCL11、IL-12P40、IFN-γ及PD-L1之基因表現基因表現呈現於圖29A-29D中。NDV-WT與NDV-huIL-12均誘導IFN-α-2a及IP-10之分泌；均不誘導IFN-β之分泌。僅僅NDV-huIL 12誘導IL-12p70及IFN-γ。多種免疫基因之基因表現之分析顯示NDV-huIL-12在多種腫瘤類型中誘導強烈1型IFN及IL-12反應以及誘導趨化因子及PD-L1。
類似地，在來自患有實體腫瘤惡性病之患者(n=5)與正常供體(n=5)的全血中評估NDV-WT及NDV-huIL-12對細胞介素及趨化因子(蛋白質表現)(圖30)及免疫基因(基因表現)之誘導(圖31A-31D)。雖然癌細胞可存在於來自癌症患者之全血中，但用NDV-WT及NDV-huIL-12活化免疫之模式在來自兩組供體之血液之間的為相當的。IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70及IFN-γ及IP-10之誘導模式及IFN誘導性基因、趨化因子、Il-12p40、IFN-γ及Pd l1之基因表現類似於人類腫瘤組織培養物中所觀測，此表明NDV-huIL-12在某種程度上作用於完整腫瘤組織中之免疫細胞。6.3.2.5 鑑別 NDV-huIL-12 反應特徵
人類腫瘤組織培養平台用於鑑別在用3×107 pfu NDV-huIL-12處理長達48小時後調節至少2倍(p＜0.01)之基因。藉由RNA測序分析基因表現。在其他腫瘤樣品(n=14)中藉由RTqPCR分析證實包括干擾素誘導性基因(例如GBP4、IFIT1、IFIT2、IFIT3、OAS3及OASL)、趨化因子(例如CXCL10及CXCL11)及PD-L1之反應特徵(圖39)。6.3.2.6 GEP 陰性與 GEP 陽性腫瘤中 NDV-huIL-12 反應特徵之誘導
使用來自經抗PD-1派姆單抗處理之患者之基線腫瘤樣品的RNA，鑑別將臨床益處與派姆單抗相關聯的免疫相關之基因表現圖譜(GEP)(Ayers等人，2017, J of Clinical Investigation 127: 2930-2940)。T細胞發炎之GEP含有與抗原呈遞、趨化因子表現、細胞毒活性及適應性免疫抗性相關的IFN-γ反應性基因。GEP陰性患者很少對派姆單抗起反應。在人類腫瘤組織培養平台中證實對於腫瘤處理(n=19)而言，與NDV-WT相比，NDV-huIL-12之GEP評分之增加更高。另外，與培養基對照相比，用3×107 pfu NDV-huIL-12處理的GEP評分具有統計學上顯著之增加(P＜0.0001)，包括GEP陰性評分轉變(GEP評分＜-0.318)成GEP陽性評分(GEP評分＞-0.318)。(圖40A-B)。6.3.2.7 NDV-huIL12 之分析型發展及表徵
根據章節6.3.1.1中提供之方法產生NDV-huIL12。可藉由流動式細胞量測術(FV，流式細胞儀用於分析及定量個別粒子)定量及表徵NDV-huIL-12。關於流動式細胞量測術之描述，參見例如Vlasak等人，2016, Vaccine 34:2321-2328。FV分析顯示大部分粒子可用小鼠抗NDV HN抗體7B1 (ISMMS)標記，此表明大部分粒子為NDV-huIL-12病毒(圖32)。NDV-huIL-12展示多形性粒徑分佈，與報導之副黏病毒相一致(Goff等人，2012, J Virol. 86(19):10852-6)。
NDV含有六種蛋白質：F、HN、NP、L、P及M。在還原條件下SDS-PAGE分析可分離6種蛋白質(F1 (約47 kDa)、HN (約63 kDa)、NP (約53 kDa)、L (約250 kDa)、P (約42 kDa)及M (約40 kDa))且充當定性純度分析。藉由SDS-PAGE分析經純化之NDV-huIL-12(圖33)。其顯示與其他報導之NDV類似的蛋白質結合模式，此表明疫苗中之大部分蛋白質為病毒蛋白。
藉由感染Vero細胞且定量在感染24小時後收穫之培養基中的IL-12來證實人類IL-12藉由NDV-huIL-12之產生。藉由ELISA分析IL-12 (圖34)。圖34展示與參考批次之NDV-huIL-12相比，MOI依賴性huIL-12表現。
在基於細胞之功能分析中，使用來自DiscoverX之PathHunter二聚分析量測表現之huIL-12之活性(圖35)。此分析偵測工程改造之細胞中huIL-12誘導之受體二聚。在以MOI 0.1-1感染NDV-huIL-12之Vero細胞的上清液中偵測到功能性huIL-12(圖35)。基於細胞之分析經優化以表徵經純化之病毒。
基於細胞之分析經優化以表徵經純化之病毒。6.4 實例 4 ： 臨床研究
本文所述之臨床前資料支持NDV-huIL-12之瘤內投與與免疫檢查點抑制劑PD-1之阻斷之全身性靜脈內共同投與的組合(參見例如章節6.3)。在臨床試驗中評估具有晚期實體腫瘤與可及皮膚及皮下惡性病變之患者中派姆單抗與NDV-huIL-12之組合以允許NDV-huIL-12之瘤內投與。此等實體腫瘤包括復發/難治性實體腫瘤類型，諸如黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌(SSCHN)、乳癌、子宮癌、胃癌、食道癌、肝癌、腦癌、具有皮膚癌轉移之肉瘤以及具有可及皮膚/SC/結節癌轉移之其他惡性病。對於批准抗PD-1/PD L1療法之適應症，在研究中包括此等療法難治或復發之患者以及對此等藥劑無預期反應之患者的治療。亦評估具有復發、難治性及/或復發及難治性腫瘤類型及通常對抗PD-1/PD-L1不起反應但能夠進行瘤內注射之腫瘤的患者。考慮影像指導可及之其他腫瘤類型，諸如具有肝臟癌轉移之腫瘤。6.4.1 NDV-huIL-12 之產生及病毒之純化
可在受精蛋或細胞培養物中產生NDV-huIL-12。在受精蛋中，可在不含特定病原體之受精雞蛋之尿囊腔中繁殖NDV-huIL-12。可使用諸如上文章節6.3.1.20中描述之方法純化NDV-huIL-12。NDV-huIL-12臨床藥品(DP)可提供於無菌溶液中以供注射。
NDV-huIL-12可包含有包含編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列的包裝基因組，該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 40中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 54或64中所闡述之核苷酸序列。NDV-huIL-12可包含有包含編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列的包裝基因組，該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 57或59中所闡述之核苷酸序列。NDV-huIL-12可包含有包含編碼IL-12 p40次單元之核苷酸序列的包裝基因組，該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 23中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 27中所闡述之核苷酸序列。
NDV-huIL-12可包含有包含編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列的包裝基因組，該IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 55或65中所闡述之核苷酸序列。NDV-huIL-12可包含有包含編碼IL-12 p35次單元之核苷酸序列的包裝基因組，該IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 29中所闡述之核苷酸序列。
NDV huIL-12可包含有包含SEQ ID NO: 51中所闡述之核苷酸序列的包裝基因組。可替代地，NDV huIL-12可包含有包含SEQ ID NO: 52中所闡述之核苷酸序列的包裝基因組。可替代地，NDV huIL-12可包含有包含SEQ ID NO: 60中所闡述之核苷酸序列的包裝基因組。
NDV-huIL-12可包含有包含編碼胺基酸序列之轉殖基因的包裝基因組，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 42中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 53或66中所闡述之核苷酸序列。NDV-huIL-12可包含有包含編碼胺基酸序列之轉殖基因的包裝基因組，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 43中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 63或68中所闡述之核苷酸序列。NDV-huIL-12可包含有包含編碼胺基酸序列之轉殖基因的包裝基因組，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 22中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 26中所闡述之核苷酸序列。NDV-huIL-12可包含有包含編碼胺基酸序列之轉殖基因的包裝基因組，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 39中所闡述之胺基酸序列，視情況其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 61中所闡述之核苷酸序列。6.5 實例 5 ： BSRT7 細胞及尿囊液中之 rNDV-muIL12 表現
評估感染rNDV-muIL-12之BSRT7細胞中muIL-12之表現。如章節6.3.1.1中所述產生rNDV-muIL-12。BSRT7細胞以感染倍率(「MOI」) 3或10感染rNDV-muIL-12(亦稱為「NDV-muIL 12」)且在感染24或48小時後收集上清液。使用小鼠IL-12p70 Quantikine ELISA套組(R&D Systems, 目錄號M1270)來量測所收集之上清液中的muIL-12濃度。在測試條件下感染rNDV-muIL-12之BSRT7細胞得到可偵測水準之muIL-12 (圖36)。不受任何特定理論束縛，假設與以較低MOI感染之細胞相比以較高MOI感染之細胞中muIL-12之較低濃度係由於與以較低MOI感染之產生muIL-12之活細胞之數目相比，以較高MOI感染之產生muIL-12之活細胞的數目較低(資料未示)。
亦在1:100000稀釋下來自先前繼代的感染100 µl rNDV-muIL-12之10日齡受精蛋之尿囊液中偵測到muIL-12。蛋在37℃下培育2天，之後根據先前所描述之方法自蛋收集尿囊液(圖36)。使用小鼠IL-12p70 Quantikine ELISA套組(R&D Systems, 目錄號M1270)來量測尿囊液中的muIL-12濃度。7. 實施例
本文提供以下示例性實施例：1. 一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之人類個體投與包含嵌合新城雞瘟病毒(NDV)之第一組合物及包含人類PD-1或其配位體之拮抗劑的第二組合物，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類介白素-12 (「IL-12」)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼人類IL-12 p40次單元及人類IL-12 p35次單元。 2. 實施例1之方法，其中該嵌合NDV包含弱毒性NDV骨架。 3. 實施例1或2之方法，其中該嵌合NDV包含LaSota病毒株之NDV骨架。 4. 實施例1或2之方法，其中該嵌合NDV包含Hitchner B1病毒株之NDV骨架。 5. 實施例1或2之方法，其中該包裝基因組包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列且該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中，其中該突變F蛋白質包含突變裂解位點。 6. 實施例5之方法，其中該突變裂解位點為111 H-N-R-T-K-R/F-I118 (SEQ ID NO: 71)。 7. 實施例1之方法，其中該嵌合NDV包含r73T-R116病毒之NDV骨架。 8. 實施例1至4中任一項之方法，其中該包裝基因組包含編碼具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質之核苷酸序列，其中該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中。 9. 實施例1至8中任一項之方法，其中該IL-12包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列。 10. 實施例9之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 61中闡述之核苷酸序列。 11. 實施例1至8中任一項之方法，其中該IL-12包含SEQ ID NO:22中闡述之胺基酸序列。 12. 實施例11之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 26中闡述之核苷酸序列。 13. 實施例1至8中任一項之方法，其中該IL-12包含SEQ ID NO:43中闡述之胺基酸序列。 14. 實施例13之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 63中闡述之核苷酸序列。 15. 實施例13之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 68中闡述之核苷酸序列。 16. 實施例1至8中任一項之方法，其中該IL-12包含SEQ ID NO:42中闡述之胺基酸序列。 17. 實施例16之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 53中闡述之核苷酸序列。 18. 實施例16之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 66中闡述之核苷酸序列。 19. 實施例1至8中任一項之方法，其中該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列。 20. 實施例1至8中任一項之方法，其中該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 23中闡述之胺基酸序列。 21. 實施例19或20之方法，其中該IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。 22. 實施例19或20之方法，其中該IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。 23. 實施例1至22中任一項之方法，其中該轉殖基因插入該包裝基因組之兩個轉錄單元之間。 24. 實施例23之方法，其中該包裝基因組包含NDV NP基因之轉錄單元、NDV P基因之轉錄單元、NDV M基因之轉錄單元、NDV F基因之轉錄單元、NDV HN基因之轉錄單元及NDV L基因之轉錄單元。 25. 實施例24之方法，其中該包裝基因組之該兩個轉錄單元為該NDV P基因之轉錄單元及該NDV M基因之轉錄單元。 26. 實施例1之方法，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 51中闡述之核苷酸序列。 27. 實施例1之方法，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 52中闡述之核苷酸序列。 28. 實施例1之方法，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 60中闡述之核苷酸序列。 29. 實施例1至28中任一項之方法，其中該人類PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於人類PD-1之抗體。 30. 實施例29之方法，其中該抗體阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用。 31. 實施例29或30之方法，其中該抗體為派姆單抗。 32. 實施例29或30之方法，其中該抗體為納武單抗或MEDI0680。 33. 實施例29或30之方法，其中該抗體包含以下：包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之可變輕鏈區(VLCR)互補決定區(CDR) 1、包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之可變重鏈區(VHCR) CDR 1、包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。 34. 實施例29或30之方法，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVST SGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTF TNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR。 35. 實施例29或30之方法，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVST SGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)之輕鏈；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTF TNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10)之重鏈。 36. 實施例29或30之方法，其中該抗體包含以下：包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。 37. 實施例29或30之方法，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSV SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGI TFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR。 38. 實施例29或30之方法，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15)之輕鏈；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFS NSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20)之重鏈。 39. 實施例1至28中任一項之方法，其中該人類PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於人類PD-L1之抗體。 40. 實施例39之方法，其中該抗體為德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗。 41. 實施例1至40中任一項之方法，其中該第一組合物經瘤內或結節內投與該個體。 42. 實施例41之方法，其中該個體展現皮膚或皮下腫瘤或淋巴結內之腫瘤。 43. 實施例1至42中任一項之方法，其中該第二組合物經靜脈內投與該個體。 44. 實施例1至42中任一項之方法，其中該第二組合物經皮下投與該個體。 45. 實施例1至44中任一項之方法，其中該癌症為黑色素瘤、腎臟癌(kidney cancer)、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肝細胞癌、胰臟癌、腎癌(renal cancer)、結腸直腸癌、乳癌或頭頸癌。 46. 實施例1至44中任一項之方法，其中該癌症為非小細胞肺癌、經典霍奇金淋巴瘤、高微衛星不穩定性癌症、黑色素瘤、胃癌、尿道上皮癌或頭頸部鱗狀細胞癌。 47. 實施例1至44中任一項之方法，其中該癌症為彌漫性大B細胞淋巴瘤或子宮頸癌。 48. 實施例1至44中任一項之方法，其中該癌症為黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸癌(HNSCC頭頸部鱗狀細胞癌)、尿道上皮癌、三陰性乳癌、胃癌、胃食管連接部腺癌、經典霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、間皮瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛門癌、膽道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷癌症(組織未定性)或具有高腫瘤突變負荷之腫瘤(組織未定性)。 49. 實施例45之方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌。 50. 實施例45之方法，其中該頭頸癌為頭頸部鱗狀細胞癌，該腎癌為腎細胞癌，該結腸直腸癌為結腸直腸癌，或該乳癌為乳癌瘤、三陰性乳癌或ER+/HER2-乳癌。 51. 實施例1至44中任一項之方法，其中該癌症為選自由以下組成之群的實體腫瘤：黑色素瘤、肉瘤、子宮癌、胃癌、食道癌、肝癌、腦癌、頭頸部鱗狀細胞癌及乳癌瘤。 52. 實施例1至44中任一項之方法，其中該癌症為非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。 53. 實施例1至52中任一項之方法，其中該癌症為轉移性的。 54. 實施例1至51中任一項之方法，其中該癌症為不可切除的。 55. 實施例1至52中任一項之方法，其中該癌症包含皮膚、皮下或結節癌轉移。 56. 實施例1至55中任一項之方法，其中該癌症為難治性或復發的，或兩者。 57. 實施例1至56中任一項之方法，其中該癌症之切片檢查為PD-L1陽性。 58. 實施例57之方法，其中該切片檢查具有至少1%之腫瘤比例評分。 59. 實施例57之方法，其中該切片檢查具有至少1之組合陽性評分。 60. 實施例1至56中任一項之方法，其中該癌症之切片檢查為PD-L1陰性。 61. 實施例60之方法，其中該切片檢查具有小於1%之腫瘤比例評分。 62. 實施例60之方法，其中該切片檢查具有小於1之組合陽性評分。 63. 實施例1至62中任一項之方法，其中該個體對利用結合於PD-1且阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體的單一療法處理具頑抗性。 64. 實施例63之方法，其中該嵌合NDV之投與誘導IL-12p70表現、IFN-ɤ表現或IL-12p70與IFN-ɤ表現。 65. 實施例63之方法，其中該嵌合NDV之投與增加表15之18基因標籤之基因表現圖譜分析(GEP)評分。 66. 實施例1至62中任一項之方法，其中該個體對利用人類PD-1或其配位體之拮抗劑的單一療法處理具頑抗性或對其無反應。 67. 實施例66之方法，其中該PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗、AMP-224、MEDI0680、派姆單抗、德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗。 68. 一種包含包裝基因組之嵌合NDV，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列。 69. 實施例68之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:61中闡述之核苷酸序列。 70. 一種包含包裝基因組之嵌合NDV，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:22中闡述之胺基酸序列。 71. 實施例70之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:26中闡述之核苷酸序列。 72. 一種包含包裝基因組之嵌合NDV，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:43中闡述之胺基酸序列。 73. 實施例72之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:63中闡述之核苷酸序列。 74. 實施例72之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:68中闡述之核苷酸序列。 75. 一種包含包裝基因組之嵌合NDV，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:42中闡述之胺基酸序列。 76. 實施例75之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:53中闡述之核苷酸序列。 77. 實施例75之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:66中闡述之核苷酸序列。 78. 實施例68至77中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含弱毒性NDV骨架。 79. 實施例68至78中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含LaSota病毒株之NDV骨架。 80. 實施例68至78中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含Hitchner B1病毒株之NDV骨架。 81. 實施例68至78中任一項之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列且該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中，其中該突變F蛋白質包含突變裂解位點。 82. 實施例81之嵌合NDV，其中該突變裂解位點為111 H-N-R-T-K-R/F-I118 (SEQ ID NO: 71)。 83. 實施例68至77中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含r73T-R116病毒之NDV骨架。 84. 實施例68至80中任一項之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含編碼具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質之核苷酸序列，其中該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中。 85. 實施例68至71中任一項之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 51中闡述之核苷酸序列。 86. 實施例72、73、75或76之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 52中闡述之核苷酸序列。 87. 實施例72、74、75或77之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 60中闡述之核苷酸序列。 88. 實施例68至84中任一項之嵌合NDV，其中該轉殖基因插入該包裝基因組之兩個轉錄單元之間。 89. 實施例88之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含NDV NP基因之轉錄單元、NDV P基因之轉錄單元、NDV M基因之轉錄單元、NDV F基因之轉錄單元、NDV HN基因之轉錄單元及NDV L基因之轉錄單元。 90. 實施例89之嵌合NDV，其中該包裝基因組之該兩個轉錄單元為該NDV P基因之轉錄單元及該NDV M基因之轉錄單元。 91. 一種嵌合NDV，其用於治療人類個體之癌症的方法中，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類介白素-12 (「IL-12」)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼人類IL-12 p40次單元及人類IL-12 p35次單元，且其中該方法進一步包含投與人類PD-1或其配位體之拮抗劑。 92. 實施例‎91之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含弱毒性NDV骨架。 93. 實施例91或92之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含Hitchner B1之NDV骨架。 94. 實施例91或92之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含LaSota病毒株之NDV骨架。 95. 實施例91或92之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含編碼突變F蛋白質之核苷酸序列且該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中，其中該突變F蛋白質包含突變裂解位點。 96. 實施例95之嵌合NDV，其中該突變裂解位點為111 H-N-R-T-K- R /F-I118 (SEQ ID NO: 71)。 97. 實施例91之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含r73T-R116病毒之NDV骨架。 98. 實施例91至94中任一項之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含編碼具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質之核苷酸序列，其中該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中。 99. 實施例91至98中任一項之嵌合NDV，其中該IL-12包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列。 100. 實施例99之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 61中闡述之核苷酸序列。 101. 實施例91至98中任一項之嵌合NDV，其中該IL-12包含SEQ ID NO:22中闡述之胺基酸序列。 102. 實施例101之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 26中闡述之核苷酸序列。 103. 實施例91至98中任一項之嵌合NDV，其中該IL-12包含SEQ ID NO:43中闡述之胺基酸序列。 104. 實施例103之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 63中闡述之核苷酸序列。 105. 實施例103之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 68中闡述之核苷酸序列。 106. 實施例91至98中任一項之嵌合NDV，其中該IL-12包含SEQ ID NO:42中闡述之胺基酸序列。 107. 實施例106之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 53中闡述之核苷酸序列。 108. 實施例106之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 66中闡述之核苷酸序列。 109. 實施例91至98中任一項之嵌合NDV，其中該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38中闡述之胺基酸序列。 110. 實施例91至98中任一項之嵌合NDV，其中該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 40中闡述之胺基酸序列。 111. 實施例109或110之嵌合NDV，其中該IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41中闡述之胺基酸序列。 112. 實施例109或110之嵌合NDV，其中該IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 25中闡述之胺基酸序列。 113. 實施例91至112中任一項之嵌合NDV，其中該轉殖基因插入該包裝基因組之兩個轉錄單元之間。 114. 實施例113之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含NDV NP基因之轉錄單元、NDV P基因之轉錄單元、NDV M基因之轉錄單元、NDV F基因之轉錄單元、NDV HN基因之轉錄單元及NDV L基因之轉錄單元。 115. 實施例114之嵌合NDV，其中該包裝基因組之該兩個轉錄單元為該NDV P基因之轉錄單元及該NDV M基因之轉錄單元。 116. 實施例91之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 51中闡述之核苷酸序列。 117. 實施例91之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 52中闡述之核苷酸序列。 118. 實施例91之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO: 60中闡述之核苷酸序列。 119. 實施例91至118中任一項之嵌合NDV，其中該人類PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於PD-1之抗體。 120. 實施例119之嵌合NDV，其中該抗體阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用。 121. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體為派姆單抗。 122. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體為納武單抗或MEDI0680。 123. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體包含以下：包含胺基酸序列RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO: 1)之可變輕鏈區(VLCR)互補決定區(CDR) 1、包含胺基酸序列LASYLES (SEQ ID NO: 2)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 3)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NYYMY (SEQ ID NO: 6)之可變重鏈區(VHCR) CDR 1、包含胺基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 7)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 8)之VHCR CDR3。 124. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVST SGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYT FTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR。 125. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGV STSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)之輕鏈；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGY TFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10)之重鏈。 126. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體包含以下：包含胺基酸序列RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 11)之VLCR CDR1、包含胺基酸序列DASNRAT (SEQ ID NO: 12)之VLCR CDR2、包含胺基酸序列QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 13)之VLCR CDR3、包含胺基酸序列NSGMH (SEQ ID NO: 16)之VHCR CDR1、包含胺基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 17)之VHCR CDR2及包含胺基酸序列NDDY (SEQ ID NO: 18)之VHCR CDR3。 127. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGIT FSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR。 128. 實施例119或120之嵌合NDV，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15)之輕鏈；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGI TFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20)之重鏈。 129. 實施例91至118中任一項之嵌合NDV，其中該人類PD-1或其配位體之拮抗劑為結合於人類PD-L1之抗體。 130. 實施例129之嵌合NDV，其中該抗體為德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗。 131. 實施例91至130中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV經瘤內或結節內投與該個體。 132. 實施例131之嵌合NDV，其中該個體展現皮膚或皮下腫瘤或淋巴結內之腫瘤。 133. 實施例91至131中任一項之嵌合NDV，其中該人類PD-1或其配位體之拮抗劑經靜脈內投與該個體。 134. 實施例91至131中任一項之嵌合NDV，其中該人類PD-1或其配位體之拮抗劑皮下投與該個體。 135. 實施例91至134中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為黑色素瘤、腎癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肝細胞癌、胰臟癌、腎癌、結腸直腸癌、乳癌或頭頸癌。 136. 實施例91至134中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為非小細胞肺癌、經典霍奇金淋巴瘤、高微衛星不穩定性癌症、黑色素瘤、胃癌、尿道上皮癌或頭頸部鱗狀細胞癌。 137. 實施例91至134中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為彌漫性大B細胞淋巴瘤或子宮頸癌。 138. 實施例91至134中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸癌(HNSCC頭頸部鱗狀細胞癌)、尿道上皮癌、三陰性乳癌、胃癌、胃食管連接部腺癌、經典霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、間皮瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛門癌、膽道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷癌症(組織未定性)或具有高腫瘤突變負荷之腫瘤(組織未定性)。 139. 實施例135之嵌合NDV，其中該肺癌為非小細胞肺癌。 140. 實施例135之嵌合NDV，其中該頭頸癌為頭頸部鱗狀細胞癌，該腎癌為腎細胞癌，該結腸直腸癌為結腸直腸癌，或該乳癌為乳癌瘤、三陰性乳癌或ER+/HER2-乳癌。 141. 實施例91至134中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為選自由以下組成之群的實體腫瘤：黑色素瘤、肉瘤、子宮癌、胃癌、食道癌、肝癌、腦癌、頭頸部鱗狀細胞癌及乳癌瘤。 142. 實施例91至134中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。 143. 實施例91至142中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為轉移性的。 144. 實施例91至141中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為不可切除的。 145. 實施例91至142中任一項之嵌合NDV，其中該癌症包含皮膚、皮下或結節癌轉移。 146. 實施例91至145中任一項之嵌合NDV，其中該癌症為難治性、復發或兩者。 147. 實施例91至145中任一項之嵌合NDV，其中該癌症之切片檢查為PD-L1陽性。 148. 實施例147之嵌合NDV，其中該切片檢查具有至少1%之腫瘤比例評分。 149. 實施例147之嵌合NDV，其中該切片檢查具有至少1之組合陽性評分。 150. 實施例91至146中任一項之嵌合NDV，其中該癌症之切片檢查為PD-L1陰性。 151. 實施例150之嵌合NDV，其中該切片檢查具有小於1%之腫瘤比例評分。 152. 實施例150之嵌合NDV，其中該切片檢查具有小於1之組合陽性評分。 153. 實施例91至152中任一項之嵌合NDV，其中該個體對利用結合於PD-1且阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體的單一療法處理具頑抗性。 154. 實施例153之嵌合NDV，其中該嵌合NDV之投與誘導IL-12p70表現、IFN-ɤ表現或IL-12p70與IFN-ɤ表現。 155. 實施例153之嵌合NDV，其中該嵌合NDV之投與增加表15之18基因標籤之GEP評分。 156. 實施例91至152中任一項之嵌合NDV，其中該個體對利用PD-1或其配位體之拮抗劑的單一療法處理具頑抗性或對其無反應。 157. 實施例156之嵌合NDV，其中該PD-1或其配位體之拮抗劑為納武單抗、AMP-224、MEDI0680、派姆單抗、德瓦魯單抗、阿維魯單抗、bms-936559或阿特珠單抗。
本發明之範疇不受本文中所描述之具體實施例限制。實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此類修改意欲處於隨附申請專利範圍之範疇內。
本文中引用之所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中且用於達成所有目的，其引用的程度如同具體地且單獨地指示每一個別出版物或者專利或專利申請案以全文引用的方式併入用於達成所有目的一般。
圖 1. NDV感染上調活體外感染之B16F10細胞之表面上的MHC I、MHC II及ICAM-1之表現(感染後24小時)。
圖 2A-2E. 瘤內NDV治療引起巨噬細胞、NK細胞、CD8及CD4效應細胞浸潤且降低Tregs頻率。圖2A)總體研究方案。圖2B)總CD45+浸潤。圖2C)總免疫細胞浸潤。圖2D)相對CD4FoxP3+及FoxP3-亞群之代表性流動式細胞量測點陣圖。圖2E) Teff/Treg及CD8/Treg比率。
圖 3A-3C. 利用NDV之療法對遠端腫瘤之腫瘤微環境展現良好作用。圖3A)相對CD4 FoxP3+及FoxP3-亞群之代表性流動式細胞量測點陣圖。圖3B)每公克腫瘤之CD4效應、Treg及CD8細胞之絕對數目。FIG. 3C) Teff/Treg及CD8/Treg比率。
圖 4A-4C. 浸潤遠端腫瘤之淋巴細胞上調活化、溶解及增殖標記物。圖4A)顯示對於CD44，CD4效應細胞(頂部)上之代表性表現曲線圖及CD4效應、CD8、Tregs (底部)中之對應百分比，圖4B)顯示顆粒酶B，且圖4C)顯示Ki-67。
圖 5A-D. NDV單一療法延遲遠端腫瘤之生長且一定程度上預防腫瘤再攻擊。兩側腰窩腫瘤如圖2A中所述來建立，且對動物進行處理且針對存活進行追蹤。圖5A)右側腰窩(經處理)腫瘤之生長。圖5B)左側腰窩(未經處理)腫瘤之生長。圖5C)總存活率。方框中之數目指示無腫瘤之動物的百分比。圖5D)在第75天經B16F10黑素瘤細胞再攻擊之由NDV治癒B16F10黑色素瘤之動物的存活率。兩次不同實驗之代表性結果，每組10隻小鼠。
圖 5E-5F. 來自經處理及未經處理之腫瘤的腫瘤浸潤性淋巴細胞回應於NDV療法而上調CTLA-4。圖5E)右側(經處理)腫瘤中CD8、CD4效應及Tregs中CTLA-4表現之代表性點陣圖。圖5F)左側(未經處理)腫瘤中CD8、CD4效應及Tregs中CTLA-4表現之代表性點陣圖。
圖 6A-6C. NDV感染上調B16F10腫瘤中PD-L1之表現。圖6A)感染NDV 24小時之B16F10細胞上的表面PD-L1表現。圖6B)用來自感染之B16F10細胞的UV滅活之上清液處理的B16F10細胞上之表面PD-L1表現。圖6C)自來自如圖2A中處理之動物的注射及遠端腫瘤分離的腫瘤細胞之表面上PD-L1之上調(2個左側圖-代表性流動式細胞量測曲線圖，右側圖-每組5隻小鼠之計算平均值)。
圖 7A-7F. 利用NDV及抗PD-1之組合療法全身性地有效針對B16黑色素瘤且增加T細胞浸潤且上調活化標記物。圖7A)總存活率。動物如圖2A中所述，在有或無抗PD-1抗體下處理。圖7B)腫瘤中CD45、CD3、CD8及CD4效應細胞之絕對數目。圖7C)腫瘤浸潤性淋巴細胞中調節T細胞之相對百分比。圖7D及圖7E)分離來自遠端腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞且針對ICOS (圖7D)及顆粒酶B (圖7E)之表現染色。圖7F)腫瘤浸潤性淋巴細胞用負載腫瘤溶胞物之樹突狀細胞再刺激且藉由細胞內細胞介素染色來評估IFNγ之表現。
圖 8A-8D. NDV感染限於注射腫瘤。圖8A)重組NDV-Fluc經瘤內(IT)或靜脈內(IV)投與負載CT26腫瘤之Balb/C動物且在隨後72小時內獲得影像。圖8B) NDV-Fluc投與負載兩側B16F10黑色素瘤之C57BL/6小鼠且監測動物120小時。顯示代表性發光影像。圖8C)相當於背景發光校正的來自腫瘤位點之發光的定量。圖8D)自圖(圖8C)中之資料計算的曲線下面積(AUC)。資料展示來自每組3-5隻小鼠之3個獨立實驗中之1個的代表性結果。***p＜0.001 (p＜0.05指示統計顯著性)。
圖 9A-9F. NDV感染增加注射病毒之腫瘤中的腫瘤白細胞浸潤。動物根據圖10A中描述之方案處理。在第15天切除腫瘤，且對TIL進行標記且藉由流動式細胞量測術分析。圖9A)浸潤腫瘤之CD45+及CD3+細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖9B)每公克腫瘤之CD45+細胞之絕對數目。圖9C)每公克腫瘤之先天性免疫細胞之絕對數目。圖9D) CD4+FoxP3+ (Treg)及CD4+FoxP3- (T conv)細胞之百分比之代表性圖。圖9E)每公克腫瘤之習知及調控CD4+細胞及CD8+細胞之絕對數目。圖9F)來自腫瘤之計算之Tconv/Treg及CD8+/Treg比率。資料表示來自每組3-5隻小鼠之3個獨立實驗之累積結果。顯示平均值+/-SEM。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
圖 10A-10M. NDV增加遠端腫瘤淋巴細胞浸潤且延遲腫瘤生長。圖10A)治療方案。圖10B)浸潤腫瘤之CD45+及CD3+細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖10C)每公克腫瘤之CD45+細胞之絕對數目。圖10D)每公克腫瘤之先天性免疫細胞之絕對數目。圖10E)來自遠端腫瘤之腫瘤切片用H&E染色(上圖)或針對CD3及FoxP3進行標記(底圖)且藉由顯微法分析。由箭頭表示之區域指示壞死及發炎性浸潤之區域。比例尺表示200 µm。圖10F) CD4+FoxP3+ (Treg)及CD4+FoxP3- (Tconv)細胞之百分比之代表性流動式細胞量測圖。圖10G)自流動式細胞量測術計算之每公克腫瘤之習知及調控CD4+細胞及CD8+細胞的絕對數目。圖10H) CD45+細胞中Tregs之相對百分比。圖10I)計算之Tconv/Treg及CD8+/Treg比率。(圖10J及圖10K)浸潤腫瘤之Tconv (圖10J)及CD8+細胞(圖10K)上ICOS、顆粒酶B及Ki-67之上調。圖10L)注射NDV之腫瘤及遠端腫瘤之生長。圖10M)總動物存活率。資料表示來自每組n=3-5之3個(圖10B-10K)或2個(圖10L-10M)獨立實驗的累積結果。顯示平均值+/-SEM。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
圖 11A-11E. NDV療法增加兩側腳墊黑色素瘤模型中之遠端腫瘤淋巴細胞浸潤。負載兩側腳墊黑色素瘤之動物根據圖10A中描述之方案處理。在第15天切除遠端腫瘤，且對TIL進行標記且藉由流動式細胞量測術分析。圖11A)浸潤腫瘤之CD45+及CD3+細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖11B) CD4+FoxP3+及CD4+FoxP3-細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖11C)每公克腫瘤之習知及調控CD4+細胞及CD8+細胞之絕對數目。圖11D及圖11E)浸潤腫瘤之CD8+ (圖11D)及Tconv (圖11E)淋巴細胞上ICOS、顆粒酶B及Ki-67之上調。資料展示來自每組5隻小鼠之2個獨立實驗中之1個的代表性結果。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
圖 12A-12I. NDV誘導授受性轉移之腫瘤特異性淋巴細胞之浸潤且促進腫瘤炎症。圖12A)治療方案。圖12B)來自用NDV及授受性轉移之Trp1-Fluc淋巴細胞處理之動物的代表性發光影像。圖12C)來自腫瘤位點之平均發光之定量。圖12D)自圖12C中之資料計算的曲線下面積(AUC)。圖12E)自流動式細胞量測術計算之來自遠端腫瘤之Pmel淋巴細胞的絕對數目。圖12F)根據圖12A中之治療方案處理之動物的浸潤遠端腫瘤之CD45+及CD3+細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖12G)來自在瘤內經NDV或PBS單次注射處理之動物的血清轉移之實驗方案。圖12H)浸潤注射血清之腫瘤的CD45+及CD3+細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖12I)自流動式細胞量測術計算之注射血清之腫瘤中所指示細胞亞群之絕對數目。圖12B-12E之資料表示每組n=4-5之3個實驗中之1個。圖12G-12I之資料表示來自每組n=5之2個獨立實驗之彙集資料。顯示平均值 +/- SEM。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
圖 13. 瘤內NDV預防腫瘤再攻擊。在第75天用1×105 個B16F10黑素瘤細胞注射藉由NDV治癒B16F10黑色素瘤之動物，監測腫瘤生長，且當腫瘤達到1000 mm3 時處死。顯示總動物存活率。資料展示來自每組10隻小鼠之2個獨立實驗中之1個的累積結果。****p＜0.0001。
圖 14A-14B. 回應於NDV療法，浸潤腫瘤之CD8+淋巴細胞上調CTLA-4。經NDV處理(圖14A)及遠端(圖14B)腫瘤中CD8+細胞中之CTLA-4表現之代表性點陣圖(左側)及累積結果(右側)。來自每組3隻小鼠之3個實驗中之1個的代表性結果。*p＜0.05。
圖 15A-15B. NDV療法引起腫瘤及浸潤腫瘤之白細胞上PD-L1上調。圖15A)注射病毒之腫瘤及遠端腫瘤中活體外感染(左圖)及活體內之B16F10細胞上的PD-L1表現。頂部為來自腫瘤之B16F10細胞上PD-L1表現的代表性流動式細胞量測柱狀圖，底部為平均中值螢光強度(MFI)。圖15B)自遠端腫瘤分離的浸潤腫瘤之白細胞之表面上的PD-L1表現。頂部：代表性流動式細胞量測柱狀圖，底部：每個細胞亞群之計算之平均MFI。
圖 16A-16D. NDV與阻斷PD-1之抗體的組合療法增強兩側腰窩B16黑色素瘤模型中之抗腫瘤功效。圖16A)治療方案。圖16B)右側腰窩(注射NDV)腫瘤生長。圖16C)左側腰窩(遠端)腫瘤生長。圖16D)總存活率。
圖 17A-17D. NDV與阻斷PD-L1之抗體的組合療法增強兩側腰窩B16黑色素瘤模型中之抗腫瘤功效。圖17A)治療方案。圖17B)右側腰窩(注射NDV)腫瘤生長。圖17C)左側腰窩(遠端)腫瘤生長。圖17D)總存活率。
圖 18A-18E. 利用NDV及抗PD-1療法之組合療法增加效應而非調節T細胞之遠端腫瘤浸潤。圖18A)腫瘤中CD4+及CD8+細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖18B) Tconv (CD4+FoxP3-)及Treg (CD4+FoxP3+)細胞之百分比之代表性流動式細胞量測圖。圖18C)自流動式細胞量測術計算的每公克腫瘤之T細胞亞群的絕對數目。圖18D)來自CD4+ T細胞之Tregs之相對百分比。圖18E)計算之Tconv/Treg及CD8+/Treg比率。
圖 19A-19B . 來自用NDV與抗PD-1療法組合處理之動物中之遠端腫瘤的TIL上調溶解及增殖標記物。圖19A)對顆粒酶B及Ki67呈陽性之Tconv及CD8淋巴細胞之百分比的代表性流動式細胞量測圖。圖19B)對顆粒酶B及Ki67呈陽性之Tconv及CD8+ T細胞之百分比。
圖 20A-20C. 在注射病毒之腫瘤及遠端腫瘤中NDV誘導CD4及CD8細胞上之腫瘤免疫浸潤及ICOS上調。圖20A)治療方案。圖20B)自注射NDV (右側腰窩)之腫瘤分離的浸潤腫瘤之CD4+FoxP3-及CD8+細胞上之ICOS的表現。顯示代表性流動式細胞量測圖(頂部)及中值螢光強度(MFI)(底部)。圖20C)自遠端(左側腰窩)腫瘤分離之浸潤腫瘤之CD4+FoxP3-及CD8+細胞上的ICOS之表現。顯示代表性流動式細胞量測圖(頂部)及中值螢光強度(MFI)(底部)。
圖 21 ： pT7NDV-LS-L289A質體之示意圖。
圖 22A-22D ： 在B16F10兩側腫瘤模型中在瘤內NDV-muIL-12與抗muPD-1 mAb muDX400組合下增強之抗腫瘤功效。將小鼠B16F10細胞皮下植入免疫活性C57BL/6J小鼠之右側腰窩(2×105 個細胞)及左側腰窩(1×105 個細胞)中。在植入(第0天)後9天，基於右側腰窩(注射腫瘤)中之腫瘤體積(TV)，將動物分組，其中中值TV=65 mm3 。6組之左側腰窩(未注射腫瘤)中的中值TV在31至38 mm3 範圍內。在第0天開始給藥。每4天經腹膜內投與小鼠IgG1同型對照及10 mg/kg muDX400，總共3劑。每2天PBS、NDV WT及NDV-muIL-12以1×107 pfu投與右側腰窩上之腫瘤中，總共4劑。各組10隻動物。圖22A-22B：分別呈現注射腫瘤及未注射腫瘤的生長曲線。腫瘤體積(「TV」)呈現為具有68%信賴區間之中值。圖22C及22D：分別呈現注射腫瘤及未注射腫瘤的第13天個別動物TV。點線指示第0天中值TV。指示關鍵比較之p值(p＜0.05指示統計顯著性)。第1組：mIgG1對照 + PBS；第2組：muDX400 + PBS；第3組：mIgG1對照 + NDV-WT；第4組：muDX400 + NDV-WT；第5組：mIgG1對照 + NDV-muIL-12；第6組：muDX400 + NDV-muIL-12。對於注射腫瘤，完全消退之數目如下：第1組：0；第2組：0；第3組：1；第4組：1；第5組：2；以及第6組：6。對於未注射腫瘤，完全消退之數目如下：第1組：0；第2組：1；第3組：1；第4組：3；第5組：0；以及第6組：5。
圖 23A-23D ： 圖例如針對圖22A-22D所述，在B16F10兩側腫瘤模型中瘤內NDV-muIL 12與抗muPD-1 mAb muDX400組合之注射腫瘤中免疫基因之誘導。實驗設計描述於章節6.3.1.9及6.3.1.13中。第14天收穫腫瘤，且藉由RTqPCR評估腫瘤組織中之基因表現，且相對於泛素校正。呈現注射腫瘤中T細胞標記物(圖23A)、細胞介素(圖23B)、IFN誘導性基因(圖23C)及Pd-1及Pd-l1(圖23D)之基因的個別動物表現量。線表示平均值。對於第3組與第5組、第4組與第6組及第5組與第6組之間的比較，指示p值＜0.05。
圖 24A-24D ： 圖例如針對圖22A-22D所述，在B16F10兩側腫瘤模型中瘤內NDV-muIL 12與抗muPD-1 mAb muDX400組合之未注射腫瘤中免疫基因之誘導。實驗設計描述於章節6.3.1.9及6.3.1.13中。第14天收穫腫瘤，且藉由RTqPCR評估腫瘤組織中之基因表現，且相對於泛素校正。呈現未注射腫瘤中T細胞標記物(圖24A)、細胞介素(圖24B)及IFN誘導性基因(圖24C)及Pd-1及Pd-l1(圖24D)之基因的個別動物表現量。線表示平均值。指示p值＜0.05。
圖 25A 及 25B ： 用NDV-muIL 12與抗muPD-1 mAb muDX400組合處理增加負載B16F10之動物之存活率。將小鼠B16-F10細胞皮下植入免疫活性C57BL/6J小鼠之右側腰窩(2×105 個細胞)及左側腰窩(1×105 個細胞)中。在植入(第0天)後7天，基於右側腰窩(注射腫瘤)中之腫瘤體積(TV)，將動物分組，其中中值TV=56 mm3 。左側腰窩(未注射腫瘤)中之中值TV為38 mm3 。在第0天開始給藥。每4天經腹膜內投與小鼠IgG1同型對照及10 mg/kg muDX400，總共3劑。每2天PBS、NDV-WT及NDV-muIL-12以1×107 pfu投與右側腰窩上之腫瘤中，總共4劑。追蹤動物，直至第54天。當注射及未注射腫瘤之體積總和≥2000 mm3 或體重損失≥20%時，處死動物。各組10隻動物。圖25A展示第1組(mIgG1對照 + PBS)、第3組(mIgG1對照 + NDV-WT)及第5組(mIgG1對照 + NDV-muIL-12)之存活曲線。圖25B展示第2組(muDX400 + PBS)、第4組(muDX400 + NDV-WT)及第6組(muDX400 + NDV-muIL-12)之存活曲線。
圖 26A 及 26B ： 在B16F10兩側腫瘤模型中用瘤內NDV-muIL-12與抗muPD-1 mAb muDX400組合注射及未注射腫瘤中CD3+T細胞之浸潤增加。將小鼠B16F10細胞皮下植入免疫活性C57BL/6J小鼠之右側腰窩(2×105 個細胞)及左側腰窩(1×105 個細胞)中。在植入(第0天)後8天，基於右側腰窩(注射腫瘤)中之腫瘤體積(TV)，將動物分組，其中平均TV=108 mm3 。左側腰窩中之平均TV=63 mm3 。在第0天開始給藥。每6天經腹膜內投與小鼠IgG1同型對照及10 mg/kg muDX400，總共2劑。每2天PBS、NDV WT及NDV-muIL-12以1×107 pfu投與右側腰窩上之腫瘤中，總共4劑。實驗設計描述於章節6.3.1.9及6.3.1.10中。顯示第8天注射腫瘤(圖26A)及未注射腫瘤(圖26B)的代表性影像。
圖 27A ： 一組26種人類癌細胞株中NDV-huIL-12之溶解活性：黑色素瘤(n = 3)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC，n = 4)、肺癌(n = 4)、乳癌(n = 3)、卵巢癌(n = 3)、結腸癌(n = 4)及胰臟癌(n = 5)。在2及6之MOI下細胞感染NDV-huIL-12，且在感染後48小時測定細胞活力。活力表示為相對於未感染細胞，感染細胞中之活細胞百分比。包括用DMSO中10 µM嘌呤黴素處理為細胞殺死之陽性對照；活力表示為相對於用DMSO處理之活細胞百分比。值呈現為8個複本之平均值±平均值之標準誤差。點線指示細胞活力中減少20%之截止值。DMSO=二甲亞碸。MOI=感染倍率。
圖 27B ： 一組26種人類癌細胞株中IL-12p70、IFN-γ及IP-10之誘導。在一系列人類腫瘤細胞株中在模擬感染(白色條柱)或感染NDV-huIL-12 (MOI = 2) (黑色條柱)後48小時收穫上清液黑色素瘤(n = 3)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC，n = 4)、肺癌(n = 4)、乳癌(n = 3)、卵巢癌(n = 3)、結腸癌(n = 4)及胰臟癌(n = 5)。使用免疫分析，測試上清液之多種細胞介素及趨化因子之蛋白質濃度。顯示IL-12p70 (頂部)、IFN-β (中間)及IP-10 (底部)之4個複本之平均值±平均值之標準誤差。點線指示LLOQ及ULOQ：IL 12p70 (LLOQ = 5 pg/mL及ULOQ = 5580 pg/mL)、IFN-β (LLOQ = 98 pg/mL)及IP-10 (LLOQ = 2 pg/mL及ULOQ = 9040 pg/mL)。LLOQ=定量下限；MOI=感染倍率；以及ULOQ=定量上限。
圖 28 ： 用NDV-huIL-12處理之人類腫瘤組織培養物中IFN-α-2a、IL-12、IFN-γ及IP-10之誘導。腎細胞癌(RCC，n=4)、結腸直腸癌(CRC，n=3)、乳癌(n=2)及頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC；n=1)之樣品未經處理(培養基)或用3×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL-12處理48小時。自組織培養物收集上清液以使用免疫分析評估多種細胞介素及趨化因子之蛋白質濃度。顯示IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、IFN-γ及IP-10之平均值±平均值之標準誤差(威爾科克森符號秩檢驗，指示p值＜0.05)。點線指示LLOQ值：IFN-α-2a = 2.4 pg/mL，IFN-β = 24 pg/mL，IL-12p70 = 2.4 pg/mL。除IP-10之外，在24小時收集上清液且以1:15稀釋分析的情況下，顯示在48小時時間點收集之未經稀釋之上清液的資料。LLOQ=定量下限。
圖 29A-29D ： 在用NDV-huIL-12處理之人類腫瘤組織培養物中IFN誘導性基因、趨化因子、Il-12p40、Ifn-γ及Pd-l1(編碼PD-L1之基因)之基因表現的誘導。腎細胞癌(RCC，n=4)、結腸直腸癌(CRC，n=3)、乳癌(n=2)及頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC；n=1)之樣品未經處理(培養基)或用3×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL-12處理48小時。將樣品速凍，且在分離RNA後，使用Fluidigm RTqPCR平台分析一組免疫基因之基因表現。顯示48小時時間點，IFN誘導性基因(圖29A)、趨化因子(圖29B)、Il-12p40及Ifn-γ (圖29C)及Pd-l1(圖29D)的相對於泛素校正之值的平均值±平均值之標準誤差(威爾科克森符號秩檢驗，指示p值＜0.05)。
圖 30 ： 在用NDV-huIL 12處理之人類全血中IFN-α-2a、IL-12p70、IFN-γ及IP-10之誘導。來自患有固體癌症之患者(n=5)及正常健康供體(n=5)的全血(1 mL)未經處理(培養基)或用3×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL-12處理48小時。收集血漿，以使用免疫分析，評估多種細胞介素及趨化因子之蛋白質濃度。顯示IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、IFN-γ及IP-10之平均值±平均值之標準誤差(威爾科克森符號秩檢驗，指示p值＜0.05)。點線指示LLOQ或ULOQ值：IFN-α-2a (LLOQ) = 2.4 pg/mL，IFN-β (LLOQ) = 24 pg/mL，IP-10 (ULOQ) = 2610 pg/mL。顯示在48小時時間點收集之非經稀釋之上清液的值。LLOQ=定量下限；ULOQ=定量上限。
圖 31A-31D ： 在用NDV-huIL 12處理之人類全血中IFN誘導性基因、趨化因子、Il-12p40、Ifn-γ及Pd-l1之基因表現之誘導。來自患有固體癌症之患者(n=5)及正常健康供體(n=5)的全血(4 mL)未經處理(培養基)或用12×107 pfu NDV-WT或NDV-huIL-12處理24小時。將全血收集至PAXgene血液RNA管中，且在分離RNA後，使用Fluidigm RTqPCR平台分析一組免疫基因之基因表現。顯示24小時時間點，IFN誘導性基因(圖31A)、趨化因子(圖31B)、Il-12p40及Ifn-γ (圖31C)及Pd-l1(圖31D)的相對於泛素校正之值的平均值±平均值之標準誤差(威爾科克森符號秩檢驗，指示p值＜0.05)。
圖 32 ： 藉由流動式細胞量測術分析NDV-huIL-12。
圖 33 ： 藉由還原性SDS-PAGE分析NDV-huIL-12。MW：分子量標記物；CB：澄清塊；以及SFP：無菌過濾產物。
圖 34 ： 在NDV-huIL-12感染Vero細胞24小時後的MOI依賴性huIL-12表現曲線。
圖 35 ： 使用PathHunter®生物分析偵測套組，huIL-12誘導受體二聚。各曲線表示在以所指示MOI進行NDV-huIL-12感染24小時後藉由Vero細胞產生之huIL-12的滴定。
圖 36 ： BSRT7細胞及尿囊液中之rNDV-mIL12表現。Y軸為如使用市售ELISA套組(小鼠IL-12p70 Quantikine ELISA套組, R&D Systems, 目錄號M1270)測定之muIL-12之濃度，以pg/mL為單位。自左至右：感染NDV-WT (陰性對照)、NDV-muIL-12 (MOI = 3，24 hpi)、NDV-muIL-12 (MOI = 10，24 hpi)、NDV-muIL-12 (MOI = 3，48 hpi)或NDV-muIL-12 (MOI = 10，48 hpi)之BSRT7細胞，或來自感染NDV-muIL-12之卵的尿囊液。MOI=感染倍率。Hpi=感染後小時數。
圖 37A-37N ： 在B16F10兩側腫瘤模型中在NDV-muIL-12對比NDV-muIL-23或NDV-muIL-27與抗muPD-1 mAb muDX400組合下增強之抗腫瘤功效。將小鼠B16F10細胞皮下植入免疫活性C57BL/6J小鼠之右側腰窩(2×105 個細胞)及左側腰窩(1×105 個細胞)中。在植入(第0天)後9天，基於右側腰窩(注射腫瘤)中之腫瘤體積(TV)，將動物分組，其中中值TV=65 mm3 。6組之左側腰窩(未注射腫瘤)中的中值TV在31至43 mm3 範圍內。在第0天開始給藥。每4天經腹膜內投與小鼠IgG1同型對照及10 mg/kg muDX400，總共3劑。每2天PBS、NDV-WT、NDV-muIL-12、NDV-muIL-23及NDV-muIL-27以1×107 pfu投與右側腰窩上之腫瘤中，總共5劑。各組10隻動物。呈現注射情況下個別動物生長曲線：第1組：mIgG1對照 + PBS (圖37A)；第2組：muDX400 + PBS (圖37B)；第3組：muDX400 + NDV-WT (圖37C)；第4組：muDX400 + NDV-muIL-12 (圖37D)；第5組：muDX400 + NDV-muIL-23 (圖37E)；第6組：muDX400 + NDV-muIL-27 (圖37F)。圖37G中呈現注射腫瘤的第14天腫瘤體積(具有68%信賴區間之中值)及完全及部分消退數目。呈現未注射情況下個別動物生長曲線：第1組：mIgG1對照 + PBS (圖37H)；第2組：muDX400 + PBS (圖37I)；第3組：muDX400 + NDV-WT (圖37J)；第4組：muDX400 + NDV-muIL-12 (圖37K)；第5組：muDX400 + NDV-muIL-23 (圖37L)；第6組：muDX400 + NDV-muIL-27 (圖37M)。圖37N中呈現未注射腫瘤的第14天腫瘤體積(具有68%信賴區間之中值)及完全及部分消退數目。
圖 38A-38J ： 在B16F10兩側腫瘤模型中在NDV-muIL-12對比NDV-muIL-2與抗muPD-1 mAb muDX400下增強之抗腫瘤功效。將小鼠B16F10細胞皮下植入免疫活性C57BL/6J小鼠之右側腰窩(2×105 個細胞)及左側腰窩(1×105 個細胞)中。在植入(第0天)後10天，基於右側腰窩(注射腫瘤)中之腫瘤體積(TV)，將動物分組，其中中值TV=55 mm3 。左側腰窩(未注射腫瘤)中之中值TV為34 mm3 。在第0天開始給藥。每4天經腹膜內投與小鼠IgG1同型對照及10 mg/kg muDX400，總共5劑。每2天PBS、NDV-WT、NDV-muIL-12及NDV-muIL-2以1×107 pfu投與右側腰窩上之腫瘤中，總共4劑。各組12隻動物。呈現注射下之個別動物生長曲線：第1組：mIgG1對照 + PBS (圖38A)；第2組：muDX400 + NDV-WT (圖38B)；第3組：muDX400 + NDV-muIL-12 (圖38C)；第4組：muDX400 + NDV-muIL-2 (圖38D)。呈現未注射下之個別動物生長曲線：第1組：mIgG1對照 + PBS (圖38E)；第2組：muDX400 + NDV-WT (圖38F)；第3組：muDX400 + NDV-muIL-12 (圖38G)；第4組：muDX400 + NDV-muIL-2 (圖38H)。對於注射及未注射腫瘤，圖38I及圖38J中分別呈現最後一次量測之腫瘤體積(具有68%信賴區間之中值)及完全及部分消退之數目。
圖 39 ： 用NDV-huIL-12處理之人類腫瘤組織培養物中NDV-huIL-12反應特徵之誘導。腎細胞癌(RCC，n=7)及結腸直腸癌(CRC，n=7)之樣品未經處理(培養基)或用3×107 pfu NDV-huIL-12處理長達48小時。將樣品速凍，且在分離RNA後，使用Fluidigm Biomark RTqPCR平台分析一組免疫基因之基因表現。顯示6、24及48小時NDV-huIL-12與未經處理(培養基)之間的表現平均變化倍數；相對於泛素校正之值用於計算變化倍數。
圖 40A-B ： 在GEP陰性與GEP陽性腫瘤中，在NDV及NDV-huIL-12下T細胞發炎之IFN-γ相關基因標籤(18-GEP)評分之誘導。腎細胞癌(RCC，n=10)、結腸直腸癌(CRC，n=4)、乳癌(n=2)、非小細胞肺癌(n=2)及頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC，n=1)之樣品未經處理(培養基)或用3×107 pfu NDV-WT或3×107 pfu NDV-huIL-12處理長達24小時。將樣品速凍，且在分離RNA後，使用NanoString平台分析18基因GEP特徵。顯示平均GEP評分與標準偏差及p值(ANOVA弗里德曼檢驗(Friedman Test)，接著鄧恩多重比較檢驗(Dunn's multiple comparison test))(圖40A)及個別GEP評分(圖40B)。

Claims (42)

  1. 一種第一組合物之用途，其用於製造供治療人類個體之癌症的藥劑，其中該第一組合物包含嵌合新城雞瘟病毒(NDV)，其中該嵌合NDV包含有包含編碼人類介白素-12 (「IL-12」)之轉殖基因的包裝基因組，其中該轉殖基因編碼人類IL-12 p40次單元及人類IL-12 p35次單元，且其中該藥劑與第二組合物一起投與，其中該第二組合物包含結合於人類PD-1且阻斷人類PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體。
  2. 如請求項1之用途，其中該嵌合NDV包含LaSota病毒株之NDV骨架。
  3. 如請求項1之用途，其中該嵌合NDV包含La Sota病毒株之NDV骨架且該包裝基因組包含編碼具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質的核苷酸序列，其中該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該IL-12包含SEQ ID NO:39中闡述之胺基酸序列。
  5. 如請求項4之用途，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 61中闡述之核苷酸序列。
  6. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該IL-12包含SEQ ID NO:22中闡述之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之用途，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 26中闡述之核苷酸序列。
  8. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該IL-12包含SEQ ID NO:43或42中闡述之胺基酸序列。
  9. 如請求項8之用途，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 63、68、53或66中闡述之核苷酸序列。
  10. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該IL-12 p40次單元包含SEQ ID NO: 38或23中闡述之胺基酸序列且該IL-12 p35次單元包含SEQ ID NO: 41或25中闡述之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之用途，其中該包裝基因組包含NDV NP基因之轉錄單元、NDV P基因之轉錄單元、NDV M基因之轉錄單元、NDV F基因之轉錄單元、NDV HN基因之轉錄單元及NDV L基因之轉錄單元，且其中該轉殖基因插入該包裝基因組之該NDV P基因與該NDV M基因之間。
  12. 如請求項1之用途，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO:51中闡述之核苷酸序列。
  13. 如請求項1之用途，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO:52或60中闡述之核苷酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該抗體為派姆單抗(pembrolizumab)。
  15. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該抗體為納武單抗(nivolumab)。
  16. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該抗體為MEDI0680。
  17. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVST SGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)之VLCR；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGY TFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9)之VHCR。
  18. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKG VSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)之輕鏈；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASG YTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10)之重鏈。
  19. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該抗體包含 (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQS VSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)之VLCR；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASG ITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)之VHCR。
  20. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該抗體包含： (a) 包含胺基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSV SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15)之輕鏈；及 (b) 包含胺基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGI TFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20)之重鏈。
  21. 如請求項1至20中任一項之用途，其中該藥劑經瘤內或結節內投與該個體，且該第二組合物經靜脈內投與該個體。
  22. 如請求項21之用途，其中該個體出現皮膚或皮下腫瘤或淋巴結內之腫瘤。
  23. 如請求項1至22中任一項之用途，其中該癌症為黑色素瘤、腎臟癌(kidney cancer)、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肝細胞癌、胰臟癌、腎癌(renal cancer)、結腸直腸癌、乳癌、頭頸癌、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)或霍奇金淋巴瘤，或選自由黑色素瘤、肉瘤、子宮癌、胃癌、食道癌、肝癌、腦癌、頭頸部鱗狀細胞癌及乳癌瘤組成之群的實體腫瘤。
  24. 如請求項23之用途，其中該肺癌為非小細胞肺癌，該頭頸癌為頭頸部鱗狀細胞癌，該腎癌為腎細胞癌，該結腸直腸癌為結腸直腸癌，或該乳癌為乳癌瘤。
  25. 如請求項1至22中任一項之用途，其中該癌症為黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸癌(HNSCC頭頸部鱗狀細胞癌)、尿道上皮癌、三陰性乳癌、胃癌、胃食管連接部腺癌、經典霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、間皮瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛門癌、膽道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷癌症(組織未定性)或具有高腫瘤突變負荷之腫瘤(組織未定性)。
  26. 如請求項1至25中任一項之用途，其中該癌症為不可切除。
  27. 如請求項1至25中任一項之用途，其中該癌症包含皮膚、皮下或結節轉移。
  28. 如請求項1至27中任一項之用途，其中該癌症之切片檢查為PD-L1陽性。
  29. 如請求項28之用途，其中該切片檢查具有至少1%之腫瘤比例評分。
  30. 如請求項28之用途，其中該切片檢查具有至少1之組合陽性評分。
  31. 如請求項1至30中任一項之用途，其中該個體對利用結合於PD-1且阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用之抗體的單一療法處理具頑抗性或復發性。
  32. 如請求項1至30中任一項之用途，其中該個體對利用結合於PD-1且阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2之間相互作用之抗體的單一療法處理具頑抗性。
  33. 如請求項31或32之用途，其中該結合PD-1之抗體為派姆單抗。
  34. 如請求項1至30中任一項之用途，其中該個體對利用針對PDL-1之抗體的單一療法處理具頑抗性或復發性。
  35. 一種包含包裝基因組之嵌合NDV，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:39或22中闡述之胺基酸序列。
  36. 如請求項35之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:61中闡述之核苷酸序列。
  37. 一種包含包裝基因組之嵌合NDV，該包裝基因組包含編碼人類IL-12之轉殖基因，其中該IL-12包含SEQ ID NO:43或42中闡述之胺基酸序列。
  38. 如請求項37之嵌合NDV，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO:63、68、53或66中闡述之核苷酸序列。
  39. 如請求項35至38中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV包含La Sota病毒株之NDV骨架且該包裝基因組包含編碼具有胺基酸突變L289A之突變F蛋白質的核苷酸序列，其中該突變F蛋白質併入至該嵌合NDV之病毒粒子中。
  40. 如請求項35至39中任一項之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含NDV NP基因之轉錄單元、NDV P基因之轉錄單元、NDV M基因之轉錄單元、NDV F基因之轉錄單元、NDV HN基因之轉錄單元及NDV L基因之轉錄單元，且其中該轉殖基因插入該包裝基因組之該NDV P基因與該NDV M基因之間。
  41. 如請求項35之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO:51中闡述之核苷酸序列。
  42. 如請求項37之嵌合NDV，其中該包裝基因組包含SEQ ID NO:52或60中闡述之核苷酸序列。
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