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TW201837054A - 抗金黃色葡萄球菌，溶血素ａ毒素之人類抗體 - Google Patents

抗金黃色葡萄球菌，溶血素ａ毒素之人類抗體 Download PDF

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TW201837054A
TW201837054A TW106146395A TW106146395A TW201837054A TW 201837054 A TW201837054 A TW 201837054A TW 106146395 A TW106146395 A TW 106146395A TW 106146395 A TW106146395 A TW 106146395A TW 201837054 A TW201837054 A TW 201837054A
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Abstract

本發明提供結合於金黃色葡萄球菌溶血素A毒素之抗體及使用方法。根據本發明之某些實施例，該等抗體為結合於溶血素A之完全人類抗體。本發明之抗體適用於抑制或中和溶血素A活性，因此提供預防或治療諸如金黃色葡萄球菌感染之溶血素A相關疾病或病症之手段。在一些實施例中，本發明之抗體用於治療金黃色葡萄球菌感染之至少一種症狀或併發症。

Description

抗金黃色葡萄球菌，溶血素A毒素之人類抗體
本發明係關於特異性結合於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)溶血素A毒素之人類抗體及其抗原結合片段，及使用此類抗體及片段之治療及診斷方法。
金黃色葡萄球菌為一種格蘭氏陽性(Gram-positive)、兼性需氧菌，其常常移生於健康個體之皮膚及鼻部。該細菌被視為機會性病原體且可在許多身體部位引起多種疾病/病狀。其在世界範圍內為血流、皮膚及軟組織及呼吸道感染之主要原因。由金黃色葡萄球菌引起之健康照護及社區相關感染之頻率已增加，且為對抗此等感染作出之努力因出現耐藥菌株，特定而言耐甲氧西林性(methicillin-resistant)或MRSA菌株而受到妨礙。
金黃色葡萄球菌表現許多幫助細菌入侵及散佈於宿主中之毒力因子(細胞表面表現及分泌)。在分泌之毒力因子中許多為毒素，其中最突出的為成孔毒素溶血素A。金黃色葡萄球菌溶血素A為一種33kDa分泌單體，其在宿主細胞之膜中寡聚化為七聚結構以形成孔隙，從而導致細胞溶解、上皮障壁破壞、炎症及組織損傷(Berube等人，(2013),Toxins 5：1140-1166)。
多種哺乳動物細胞類型被溶血素A溶解，包括血小板、單核細胞、內皮及上皮細胞。已提出此等細胞類型中之一或多者為溶血素A而非 紅血球(RBC)之生理相關目標，因為人類RBC僅在暴露於高濃度之溶血素A時易於溶解(Hildebrand等人，(1991),J.Biol.Chem.266：17195-17200；Wilke等人，(2010),Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 107：13473-13478；Berube等人，(2013),Toxins 5：1140-1166)。
已證實在金黃色葡萄球菌感染之動物模型中，溶血素A在肺炎、皮膚壞死(dermonecrosis)、心內膜炎及敗血病中起作用(Tkaczyk等人，(2012),Clin.Vaccine Immunol.19：377-385及Kennedy等人，(2010),J.Infect.Dis.202：1050-1058)。金黃色葡萄球菌為皮膚及軟組織感染之主要原因(Moran，等人(2006),N.Engl.J.Med.355：666-674))，常常引起蜂窩組織炎及皮膚膿腫。在小鼠模型中，使用非產毒形式之溶血素A的主動免疫或使用溶血素A-特異性抗血清或單株抗體(mAb)的被動免疫使皮膚病變之尺寸顯著減小，且預防由產生溶血素A之金黃色葡萄球菌菌株引起之皮膚壞死(Kennedy等人，(2010),J.Infect.Dis.202：1050-1058；Tkaczyk等人，(2012),Clin.Vaccine Immunol.19：377-385)。金黃色葡萄球菌亦為就醫患者之肺炎的主要原因(Kollef等人，(2005),Chest 128：3854-3862(Erratum in Chest 129：831)；Shorr等人，(2006),Crit.Care 10：R97)，且已顯示在肺臟感染之小鼠模型中起作用(Bubeck Wardenberg等人，(2007),Infect.Immun.75：1040-1044)。使用非產毒形式之溶血素A的主動免疫或使用溶血素A-特異性抗血清或mAb的被動免疫使肺炎小鼠模型中之發病率及死亡率顯著降低(Bubeck Wardenburg及Schneewind,(2008),J.Exp.Med.205：287-294；Hua等人，(2014),Antimicrob.Agents Chemother.58：1108-1117)。
金黃色葡萄球菌為醫院及社區中之感染的主要原因。金黃色葡萄球菌之更難以用標準類型之抗生素處理之耐抗生素性菌株(諸如耐甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA))的出現為當前臨床醫學中之問題，且需要研發 新的方法來進行抗細菌預防及治療(Kennedy等人，(2010),J.Infect.Dis.202：1050-1058)。
本發明提供特異性結合於金黃色葡萄球菌溶血素A之完全人類單株抗體(mAb)及其抗原結合片段。此類抗體可適用於中和溶血素A之活性。該等抗體可起到預防金黃色葡萄球菌感染、使其進展停止或減輕其嚴重程度；或減少感染復發之次數、持續時間或降低其嚴重程度；或改善至少一種與感染相關之症狀的作用。在一些情況下，該等抗體可用於預防或治療與金黃色葡萄球菌感染相關之病狀或適應症，諸如皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎及癤病及癰病(癤)。此類抗體可單獨或結合適合用於治療金黃色葡萄球菌感染之第二藥劑使用。在某些實施例中，對溶血素A具特異性之抗體可結合第二藥劑治療性地給予，以減輕金黃色葡萄球菌感染之嚴重程度，或減少感染復發之次數、持續時間或降低其嚴重程度，或改善至少一種與金黃色葡萄球菌感染相關之症狀。在一些情況下，組合療法可用於治療與金黃色葡萄球菌感染相關之病狀或適應症，諸如皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎及癤病及癰病(癤)。在某些實施例中，該等抗體可預防性地用作獨立療法來防止患者處於發展金黃色葡萄球菌感染的危險之中。舉例而言，某些患者群體可處於發展金黃色葡萄球菌感染的危險之中，包括年長患者、免疫系統變弱之患者或處於更大的醫院感染風險之中的患者，諸如手術後患者。當本發明 之抗體單獨或結合第二藥劑給予時，此等患者群體中之任一者可受益於使用本發明之抗體的治療。
本發明之抗體可用於治療患者之金黃色葡萄球菌感染。該等抗體可為全長的(例如IgG1或IgG4抗體)或可僅包含抗原結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可經修飾以影響功能，例如清除殘餘效應子功能(Reddy等人，(2000),J.Immunol.164：1925-1933)或增加mAb半衰期(Zalevsky等人，(2010),Nature Biotechnology 28：157-159)。本發明包括任何抗體或其抗原結合片段，其包含本文規定之鍵聯至重鏈恆定區(例如人類恆定區)之VH區中之任一者，諸如γ(例如γ-1、γ-2、γ-3或γ-4)、δ、α、μ或ε；及/或本文規定之鍵聯至輕鏈恆定區(例如人類恆定區)之任何VL區，諸如λ或κ。
因此，在第一態樣中，本發明提供一種特異性結合於溶血素A之單離完全人類單株抗體或其抗原結合片段。
在一些情況下，人類單株抗體結合於野生型溶血素A(SEQ ID NO：291)或經修飾溶血素A(SEQ ID NO：295)。
在一個實施例中，單離人類抗體或其抗原結合片段如藉由表面電漿子共振所量測以等於或小於10-7M之KD結合於溶血素A。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段展現一或多種選自由以下各項組成之群的特性：(a)如藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以小於約80nM之結合解離平衡常數(KD)結合於野生型溶血素A；(b)如藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以大於約0.5分鐘之解離半衰期(t½)結合於野生型溶血素A；(c)如藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以小於約30nM之KD結合於野生型溶血素A；(d)如藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以大於約1.5分鐘之t½結合於野生型溶血素A；(e)如藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以小於約20nM之結合解離平衡常數(KD)結合於經修飾溶血素A；(f)如藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以大於約 0.5分鐘之解離半衰期(t½)結合於經修飾溶血素A；(g)如藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以小於約10nM之KD結合於經修飾溶血素A；及(h)如藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以大於約1.5分鐘之t½結合於經修飾溶血素A。
在一些情況下，結合於溶血素A之單離人類抗體或其抗原結合片段包含如下重鏈可變區(HCVR)序列中之任一者內所含的三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1、HCDR2及HCDR3)，該等重鏈可變區序列係選自由以下各項組成之群：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282；及/或如下輕鏈可變區(LCVR)序列中之任一者內所含的三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)，該等輕鏈可變區序列係選自由以下各項組成之群：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270。用於識別HCVR及LCVR胺基酸序列內之CDR的方法及技術為此項技術中熟知的且可用於識別本文所揭示之規定之重鏈可變區(HCVR)及/或輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列內的CDR。可用於識別CDR邊界之示例性慣例包括例如Kabat定義、Chothia定義及AbM定義。一般地說，Kabat定義係基於序列可變性，Chothia定義係基於結構環區之位置，而AbM定義為Kabat及Chothia方法之間的折中方法。參見例如Kabat,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，(1997),J.Mol.Biol.273：927-948；及Martin等人，(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272。公共資料庫亦可用於識別抗體內之CDR序列。
在一些實施例中，結合於溶血素A之單離人類抗體或其抗原結合片段包含HCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282。
在一些實施例中，結合於溶血素A之單離人類抗體或其抗原結合片段包含LCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270。
在一些情況下，結合於溶血素A之單離人類抗體或其抗原結合片段包含(a)HCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282；及(b)LCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270。
在一個實施例中，結合於溶血素A之單離人類抗體或其抗原結合片段包含：(a)HCDR1結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264及284；(b)HCDR2結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266及286；(c)HCDR3結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268及288；(d)LCDR1結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252及272； (e)LCDR2結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254及274；及(f)LCDR3結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256及276。
在各個實施例中，本發明提供一種結合於溶血素A之完全人類單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段展現以下特徵中之一或多者：(i)包含HCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；(ii)包含LCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；(iii)包含HCDR3結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268及288、536、552、568及584，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及LCDR3結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256及276，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；(iv)包含HCDR1結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264及284，或其具有至少90%，至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列； HCDR2結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266及286，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；LCDR1結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252及272，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及LCDR2結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254及274，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及/或(v)如藉由表面電漿子共振所量測以等於或小於10-7M之KD結合於溶血素A。
在另一態樣中，本發明提供一種與參考抗體或抗原結合片段競爭結合於溶血素A之單離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)之互補決定區(CDR)，該重鏈可變區包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282；及輕鏈可變區(LCVR)之CDR，該輕鏈可變區包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270。
在另一態樣中，本發明提供一種與參考抗體或抗原結合片段結合溶血素A上相同之抗原決定位的單離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)之CDR，該重鏈可變區包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282；及輕鏈可變區(LCVR)之CDR，該輕鏈可變區包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270。
在一些實施例中，本發明提供一種結合溶血素A之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含選自由以下各項組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列配對：SEQ ID NO：2/10、22/30、42/50、62/70、82/90、102/110、122/130、142/150、162/170、182/190、202/210、222/230、242/250、262/270及282/270。
在另一態樣中，本發明提供編碼抗溶血素A抗體或其片段之核酸分子。如同藉由在容許產生抗體之條件下培養宿主細胞且回收所產生之抗體來製備抗體之方法一般，帶有本發明之核酸的重組表現載體及此類載體已引入其中之宿主細胞亦由本發明涵蓋。
在一些實施例中，本發明提供一種抗體或其片段，其包含由選自由以下各項組成之群的核酸序列編碼之HCVR：SEQ ID NO：1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261及281，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質上一致的序列。
在一些實施例中，抗體或其片段進一步包含由選自由以下各項組成之群的核酸序列編碼之LCVR：SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249及269，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質上一致的序列。
在一些情況下，本發明提供一種抗體或抗體之抗原結合片段包含由選自由以下各項組成之群的核苷酸序列編碼之HCDR3結構域：SEQ ID NO：7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267及287，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及由選自由以下各項組成之群的核苷酸序列編碼之LCDR3結構域：SEQ ID NO：15、35、55、75、95、115、135、155、175、 195、215、235、255及275，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗體或其片段，其進一步包含由選自由以下各項組成之群的核苷酸序列編碼之HCDR1結構域：SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263及283、563及579，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；由選自由以下各項組成之群的核苷酸序列編碼之HCDR2結構域：SEQ ID NO：5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265及285，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；由選自由以下各項組成之群的核苷酸序列編碼之LCDR1結構域：SEQ ID NO：11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251及271，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及由選自由以下各項組成之群的核苷酸序列編碼之LCDR2結構域：SEQ ID NO：13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253及273，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列。
在一些實施例中，如本文所描述結合於溶血素A之抗體或其抗原結合片段可鍵聯至可偵測標記，諸如放射性核素標記或MRI-可偵測標記。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含如上文或本文所描述結合於溶血素A之單離完全人類單株抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在一些實施例中，醫藥組成物包含具有上文或本文所描述之特徵中之任何一或多者的結合於溶血素A之完全人類單株抗體。在一個實施 例中，抗體以等於或小於10-7M之KD結合於溶血素A。在各個實施例中，組成物包含結合於溶血素A且具有選自由以下各項組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列配對的抗體：SEQ ID NO：2/10、22/30、42/50、62/70、82/90、102/110、122/130、142/150、162/170、182/190、202/210、222/230、242/250、262/270及282/270。本發明亦提供一種單離人類抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：(i)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：20中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：18中所示之胺基酸序列；(ii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：40中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：38中所示之胺基酸序列；(iii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：60中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：58中所示之胺基酸序列；(iv)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：80中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：78中所示之胺基酸序列；(v)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：100中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：98中所示之胺基酸序列；(vi)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：120中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：118中所示之胺基酸序列；(vii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：140中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：138中所示之胺基酸序列；(viii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：160中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：158中所示之胺基酸序列；(ix)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：180中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：178中所示之胺基酸序列；(x)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：200中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：198中所示之胺基酸序列；(xi)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：220中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：218中所示之胺基酸序列；(xii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：240中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：238中所示之胺基酸序列；(xiii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：260中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：258中所示之胺基酸序列；(xiv)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：280中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：278中所示之胺基酸序列；或(xv)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：280中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：290中所示之胺基酸序列。
在一些情況下，本發明以一種組成物為特徵，該組成物為本發明之抗體或抗體之抗原結合片段與第二治療劑之組合。第二治療劑可為小分子藥物、蛋白質/多肽、抗體、核酸分子(諸如反義寡核苷酸)或siRNA。第二治療劑可為合成的或天然衍生的。第二治療劑可為有利地與本發明之抗體或其片段組合的任何藥劑。
在某些實施例中，第二治療劑可為幫助抵消或降低與本發明之抗體或抗體之抗原結合片段相關之任何可能的副作用(若此類副作用會發生)的藥劑。
亦應瞭解，本發明之抗體及醫藥學上可接受之組成物可用於組合療法中，亦即抗體及醫藥學上可接受之組成物可與一或多種其他所需治療劑或醫學程序同時、在其之前或在其之後投與。用於組合方案中之特定療法(治療劑或程序)組合將考慮所需治療劑及/或程序與所要達成之所需治療作用的相容性。亦應瞭解，所採用之療法可針對相同病症達成所要作用(例如抗體可與用以治療相同病症之另一藥劑同時投與)，或其可達成不同作用(例如控制任何有害作用)。如本文所用，通常為治療或預防特定疾病或病狀而投與之額外治療劑適合於正在治療之疾病或病狀。如相關技術中認可的，當共投與多種治療劑時，可相應地調整劑量。
在另一態樣中，本發明提供一種預防、治療或管理由金黃色葡萄球菌引起之原發性感染，及降低、清除或預防金黃色葡萄球菌感染復發的方法。在一些情況下，本發明包括一種預防及/或治療與金黃色葡萄球菌感染相關之疾病或病症的方法，該疾病或病症為諸如皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎及癤病及癰病(癤)。在某些實施例中，本發明提供一種治療罹患金黃色葡萄球菌感染之患者，或治療至少一種與金黃色葡萄球菌感染相關之症狀或併發症，或使金黃色葡萄球菌感染之進展停止的方法，該方法包括向患者投與有效量之結合於溶血素A之抗體或其抗原結合片段；或包含有效量之結合於溶血素A之抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，使得金黃色葡萄球菌感染相關病狀或疾病得到預防，或嚴重程度減輕及/或持續時間減少，或至少一種與病狀或疾病相關之症狀或併發症得到預防或改善，或金黃色葡萄球菌感染之頻率降低及/或持續時間減少或嚴重程度降低。在上文所論述之方法的各個實施例中，金黃色葡萄球菌細菌可能對一或多種類型之抗生素治療具抗性。在一個實施例中，細菌為耐甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)。
在該方法之一些實施例中，與第二治療劑組合向患者投與包含本發明之抗體的醫藥組成物。
在本發明之實施例中，抗體或其抗原結合片段或包含抗體之醫藥組成物係經皮下、經靜脈內、經皮內、經口或經肌肉內投與。
在相關實施例中，本發明包括本發明之單離抗溶血素A抗體或抗體之抗原結合部分的用途，其用於製造用於預防或治療與金黃色葡萄球菌感染或存在溶血素A毒素有關或由其引起之疾病或病症的藥劑。本發明亦包括單離抗溶血素A抗體或其抗原結合部分用於預防或治療與金黃色葡 萄球菌感染或存在溶血素A毒素有關或由其引起之疾病或病症的用途。在各個實施例中，此等疾病或病症包括皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎及癤病及癰病(癤)。在一個實施例中，本發明包括單離抗溶血素A抗體或其抗原結合片段在用於治療金黃色葡萄球菌感染之藥劑之製造中的用途。在一些情況下，本發明包括如上文或本文所論述之抗溶血素A抗體或其抗原結合片段用於治療罹患金黃色葡萄球菌感染或處於發展金黃色葡萄球菌感染風險中之患者的用途。在一些實施例中，本發明包括如上文或本文所論述之抗溶血素A抗體或其抗原結合片段用於治療罹患皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎及癤病及癰病(癤)之患者的用途。
由隨後之詳細描述之綜述來看其他實施例將變得顯而易見。
圖1顯示抗溶血素A抗體與金黃色葡萄球菌溶血素A之結合。
圖2a、2b及2c顯示抗溶血素A抗體與金黃色葡萄球菌雙組分毒素之F亞單位之結合：圖2a顯示與LukF之結合；圖2b顯示與LukD之結合；而圖2c顯示與HlgB之結合。
圖3a、3b及3c顯示抗溶血素A抗體H1H15381P與金黃色葡萄球菌雙組分毒素之組分的結合：圖3a顯示與LukF、LukS及LukE之結合；圖3b顯示與HlgA及HlgC之結合；而圖3c顯示與δ毒素之結合。
圖4a及4b：圖4a顯示抗溶血素A抗體H1H15377P、H1H15381P或H1H15399P阻斷毒素誘導之ADAM10活性，而圖4b顯示抗溶血素A抗體H1H15377或H1H15399防止溶血素A結合於兔紅血球膜。
圖5a、5b及5c顯示在感染金黃色葡萄球菌CA-127且以5、0.5或0.125mg/kg用各種抗體(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或對照抗體)治療之小鼠中皮膚壞死病變之尺寸。
圖6a、6b及6c顯示在感染金黃色葡萄球菌Newman且以5、0.5或0.125mg/kg用各種抗體(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或對照抗體)治療之小鼠中皮膚壞死病變之尺寸。
圖7a及7b顯示投與各種抗溶血素A mAb(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或對照抗體)之小鼠的皮膚中的金黃色葡萄球菌CA-127(MRSA)或金黃色葡萄球菌Newman(MSSA)細菌計數。
圖8a及8b顯示以1.25或0.325mg/kg用各種抗體(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或對照抗體)治療之感染金黃色葡萄球菌CA-127之小鼠的肺臟中之細菌負荷。
在描述本發明方法之前，應瞭解本發明不限於特定方法及所描述之實驗條件，因而方法及條件可變化。還應瞭解，本文中所用之術語係僅用於描述特定實施例之目的，且不旨在具限制性，因為本發明之範疇將僅由隨附申請專利範圍限制。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。雖然類似或等效於本文所描述之方法及材料的任何方法及材料均可用於實踐或測試本發明，但現 描述較佳方法及材料。本文提及之所有出版物以全文引用之方式併入本文中。
定義
術語「溶血素A」及「溶血素A毒素」可互換地指由金黃色葡萄球菌分泌之33kDa單聚蛋白質，其在宿主細胞膜中寡聚化為七聚結構以形成孔隙，從而導致細胞溶解、炎症及組織損傷。野生型溶血素A之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：291中。經修飾溶血素A(H35L突變體)之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：295中。除非另外指出，否則提及溶血素A係指野生型形式。Hla-H35L為位置35之組胺酸已變成白胺酸之溶血素A。此允許毒素在宿主細胞膜上組裝直至前孔形成步驟，但未形成完全功能孔隙。此使得溶血素A為非產毒的。
如本文所用，術語「抗體」意在指包含四個多肽鏈(藉由二硫鍵相互連接之兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子(亦即，「完全抗體分子」)，以及其多聚體(例如IgM)或其抗原結合片段。各重鏈包含重鏈可變區(「HCVR」或「VH」)及重鏈恆定區(包含結構域CH1、CH2及CH3)。各輕鏈包含輕鏈可變區(「LCVR」或「VL」)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)之高變異性區域，其間散佈有稱為構架區(FR)之較保守的區域。各VH及VL由三個CDR及四個FR組成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明之某些實施例中，抗體(或其抗原結合片段)之FR可與人類生殖系序列相同，或可經天然或人工修飾。胺基酸共同序列可基於兩個或更多個CDR之並行分析來定義。
一或多個CDR殘基之取代或一或多個CDR之省略亦為可能的。科學文獻中已描述關於結合可省掉一或兩個CDR之抗體。Padlan等人(FASEB J.1995,9：133-139)基於所公開之晶體結構分析了抗體與其抗原之間 的接觸區域，且得出以下結論：僅約五分之一至三分之一的CDR殘基實際上接觸抗原。Padlan亦發現一或兩個CDR中沒有胺基酸與抗原接觸之許多抗體(亦參見Vajdos等人2002 J Mol Biol 320：415-428)。
不接觸抗原之CDR殘基可基於先前研究(例如CDRH2中之殘基H60-H65常常為不需要的)藉由分子模型化及/或根據經驗由位於Chothia CDR外部之Kabat CDR的區域來識別。若省去CDR或其殘基，則其通常用另一人類抗體序列或此類序列之共同序列中佔據對應位置之胺基酸取代。CDR內用於取代之位置及用於取代之胺基酸亦可根據經驗來選擇。經驗取代可為保守或非保守取代。
本文所揭示之完全人類抗溶血素A單株抗體可與對應生殖系序列相比在重鏈及輕鏈可變域之構架及/或CDR區中包含一或多個胺基酸取代、插入及/或缺失。可藉由將本文所揭示之胺基酸序列與可獲自例如公共抗體序列資料庫之生殖系序列相比較來輕易地確定此類突變。本發明包括衍生自本文所揭示之胺基酸序列中之任一者的抗體及其抗原結合片段，其中一或多個構架及/或CDR區內之一或多個胺基酸突變為衍生出該抗體之生殖系序列的對應殘基，或另一人類生殖系序列之對應殘基，或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此類序列變化在本文中統稱為「生殖系突變」)。一般熟習此項技術者以本文所揭示之重鏈及輕鏈可變區序列為起始物質，可容易地製備許多包含一或多個個別生殖系突變或其組合之抗體及抗原結合片段。在某些實施例中，VH及/或VL結構域內之所有構架及/或CDR殘基均突變回在衍生出該抗體之原始生殖系序列中發現之殘基。在其他實施例中，僅某些殘基突變回原始生殖系序列，例如僅在FR1之頭8個胺基酸內或FR4之最後8個胺基酸內發現之突變殘基或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現之突變殘基。在其他實施例中，構架及/或CDR殘基中之一或多者突變為不同生殖系序列(亦即，不同於最初衍生出該抗體之生殖系序列的生殖 系序列)之對應殘基。此外，本發明之抗體可含有構架及/或CDR區內之兩個或更多個生殖系突變之任何組合，例如其中某些個別殘基突變為特定生殖系序列之對應殘基，而不同於原始生殖系序列之某些其他殘基保留或突變為不同生殖系序列之對應殘基。一旦獲得含有一或多個生殖系突變之抗體及抗原結合片段，即可容易地測試其一或多種所需特性，諸如改良之結合特異性、增加之結合親和力、改良或增強之拮抗或促效生物特性(視情況而定)、降低之免疫原性等。以此一般方式獲得之抗體及抗原結合片段涵蓋於本發明內。
本發明亦包括完全人類抗溶血素A單株抗體，其包含本文所揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列中之任一者之具有一或多個保守取代的變異體。舉例而言，本發明包括具有相對於本文所揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列中之任一者含有例如10個或更少個、8個或更少個、6個或更少個、4個或更少個等保守胺基酸取代之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的抗溶血素A抗體。
如本文所用，術語「人類抗體」意在包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可例如在CDR及特定而言CDR3中包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如在活體外藉由隨機或定位誘變或在活體內藉由體細胞突變所引入之突變)。然而，如本文所用，術語「人類抗體」，不意在包括衍生自另一哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已接枝至人類FR序列上的mAb。
術語「特異性結合」或「特異性結合於」等類似術語意謂抗體或其抗原結合片段與抗原形成在生理條件下相對穩定之複合物。特異性結合之特徵可為平衡解離常數為至少約1x10-6M或更小(例如較小之KD表示較緊密之結合)。確定兩個分子是否特異性結合之方法為此項技術中熟知的 且包括例如平衡滲析、表面電漿子共振及類似方法。如本文所描述，已藉由表面電漿子共振(例如BIACORETM)識別特異性結合於溶血素A之抗體。此外，如本文所用，結合於溶血素A中之一個結構域及一或多種額外抗原之多特異性抗體或結合於溶血素A之兩個不同區之雙特異性抗體仍然被視為「特異性結合」之抗體。
術語「高親和力」抗體係指如藉由表面電漿子共振(例如BIACORETM)或溶液-親和力ELISA所量測對溶血素A具有以KD表示至少10-7M；較佳10-8M；更佳10-9M，甚至更佳10-10M，甚至更佳10-11M之結合親和力的彼等mAb。
術語「緩慢解離速率」、「K解離」或「kd」意在描述如藉由表面電漿子共振(例如BIACORETM)所測定以1 x 10-3 s-1或更小、較佳1 x 10-4 s-1或更小之速率常數自溶血素A解離的抗體。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及類似術語，包括特異性結合抗原以形成複合物之任何天然存在、酶促可獲得、合成或基因工程改造之多肽或醣蛋白。如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」係指抗體中保留結合於溶血素A之能力的一或多個片段。
在特定實施例中，本發明之抗體或抗體片段可結合至治療劑部分(「免疫結合物」)，諸如抗生素、第二抗溶血素A抗體或針對諸如IL-1、IL-6或TGF-β之細胞因子之抗體或適合用於治療疾病或病狀之任何其他治療劑部分，該疾病或病狀包括金黃色葡萄球菌感染、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎及癤病及癰病(癤)。
如本文所用，「單離抗體」意在指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體(Ab)的抗體(例如特異性結合溶血素A之單離抗體或其片段實質上不含特異性結合不是溶血素A之抗原的Ab)。
如本文所用，術語「表面電漿子共振」係指一種光學現象，其允許藉由例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden及Piscataway,N.J.)偵測生物感測器基質內之蛋白質濃度改變來分析實時生物分子相互作用。
如本文所用，術語「KD」意在指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。
術語「抗原決定位」係指與抗體分子之可變區中稱為互補位之特異性抗原結合位點相互作用的抗原決定位。單一抗原可具有超過一個抗原決定位。因此，不同抗體可結合於抗原上之不同區域且可具有不同生物效應。術語「抗原決定位」亦指抗原上B細胞及/或T細胞作出反應之位點。其亦指抗原中由抗體結合之區。抗原決定位可按結構或功能來定義。功能抗原決定位通常為結構抗原決定位之子集，且具有直接促成相互作用親和力之彼等殘基。抗原決定位亦可為構象的，其由非線性胺基酸組成。在某些實施例中，抗原決定位可包括決定位，該等決定位為諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基之分子的化學活性表面分組，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。
當提及核酸或其片段時，術語「實質一致性」或「實質上一致」表明當以適當核苷酸插入或缺失與另一核酸(或其互補鏈)最佳比對時，如藉由如下文所論述之任何熟知序列一致性算法(諸如FASTA、BLAST或GAP)所量測，在至少約90%且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基中存在核苷酸序列一致性。在某些情況下，與參考核酸分子具有實 質一致性之核酸分子可編碼與由參考核酸分子編碼之多肽具有相同或實質上類似之胺基酸序列的多肽。如適用於多肽，術語「實質相似性」或「實質上類似」意謂當諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用默認空隙權重最佳比對時，兩個肽序列擁有至少90%序列一致性，甚至更佳為至少95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不相同之殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基由側鏈(R基團)具有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之另一胺基酸殘基取代的取代。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列彼此因保守取代而不同之情況下，可調高相似百分比或程度以校正取代之保守性。用於進行此調節之手段為熟習此項技術者熟知的。參見例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，其以引用之方式併入本文中。側鏈具有類似化學性質之胺基酸群之實例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代群為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺。或者，保守置換為在以引用之方式併入本文中之Gonnet等人(1992)Science 256：1443 45中所揭示之PAM250對數似然矩陣中具有正值的任何變化。「適度保守」置換為在PAM250對數似然矩陣(log-likehood matrix)中具有非負值之任何變化。
多肽之序列相似性典型地使用序列分析軟體來量測。蛋白質分析軟體使用分配給各種取代、缺失及其他修飾(包括保守胺基酸取代)之相似性度量來匹配類似序列。舉例而言，GCG軟體含有諸如GAP及BESTFIT 之程式，其可在默認參數情況下用於測定緊密相關多肽(諸如來自不同物種之有機體的同源多肽)之間或野生型蛋白質與其突變蛋白之間的序列同源性或序列一致性。參見例如GCG版本6.1。亦可使用FASTA以默認或推薦參數比較多肽序列；GCG版本6.1中之程式。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢及檢索序列之間最佳重迭之區的比對及序列一致性百分比(Pearson(2000)同上)。當將本發明之序列與含有來自不同有機體之大量序列的資料庫相比較時，另一較佳算法為電腦程式BLAST，尤其BLASTP或TBLASTN，使用默認參數。參見例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402，其各自以引用之方式併入本文中。
在特定實施例中，用於本發明方法中之抗體或抗體片段可為單特異性、雙特異性或多特異性的。多特異性抗體可對目標多肽之不同抗原決定位具特異性或可含有對超過一種目標多肽之抗原決定位具特異性的抗原結合域。可用於本發明之背景中的示例性雙特異性抗體格式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3結構域及第二Ig CH3結構域，其中第一及第二Ig CH3結構域因至少一個胺基酸而彼此不同，且其中至少一個胺基酸差異使雙特異性抗體與蛋白質A之結合與缺乏該胺基酸差異之雙特異性抗體相比有所減少。在一個實施例中，第一Ig CH3結構域結合蛋白質A且第二Ig CH3結構域含有減少或消除蛋白質A結合之突變，諸如H95R修飾(根據IMGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包含Y96F修飾(根據IMGT；根據EU為Y436F)。可存在於第二CH3內之其他修飾包括：在IgG1 mAb之情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M及V82I(根據IMGT；根據EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；在IgG2 mAb之情況下，N44S、K52N及V82I(IMGT；根據EU為N384S、K392N及V422I)；及在IgG4 mAb之情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q及 V82I(根據IMGT；根據EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q及V422I)。上文所描述之雙特異性抗體格式之變化涵蓋於本發明範疇內。
片語「治療有效量」意謂產生投與其所要達成之所要作用的量。確切量將取決於治療目的，且將為由熟習此項技術者使用已知技術(參見例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)可確定的。
總體說明
金黃色葡萄球菌溶血素A毒素為一種所分泌之33kDa單聚蛋白質，其在宿主細胞膜中寡聚化為七聚結構以形成孔隙，從而導致細胞溶解、炎症及組織損傷。已證實溶血素A在肺炎、皮膚壞死、心內膜炎及敗血病中起作用。
本文所描述之抗體展示特異性結合於溶血素A且在一些實施例中，可適用於治療罹患金黃色葡萄球菌感染之患者，或預防此類感染。使用此類抗體可為治療罹患金黃色葡萄球菌感染之患者的有效手段，或可用於減輕金黃色葡萄球菌感染之症狀的嚴重程度。其可單獨或作為輔助療法與此項技術中已知用於治療金黃色葡萄球菌感染之其他治療劑部分或模式一起使用，該等其他治療劑部分或模式為諸如但不限於抗生素、非類固醇消炎藥(NSIAD)(或其他姑息療法)或皮質類固醇，諸如普賴松(prednisone)。其可與對不是溶血素A之抗原具特異性之額外抗體結合使用，或可與其他類型之治療組合。
在一些實施例中，本文所描述之抗體可適合用於預防、治療或管理金黃色葡萄球菌感染之疾病或病狀，包括但不限於皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、 膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎及癤病及癰病(癤)。
在某些實施例中，本發明之抗體係自用第一免疫原，諸如天然、全長溶血素A(SEQ ID NO：291)或用經修飾形式之溶血素A(SEQ ID NO：295)或溶血素A片段免疫，隨後用第二免疫原或用溶血素A之免疫原活性片段免疫的小鼠獲得。
免疫原可為溶血素A之免疫原性片段或編碼其片段之DNA。免疫原可為偶合至組胺酸標籤及/或抗體之Fc區之片段的溶血素A。
全長溶血素A之胺基酸序列如SEQ ID NO：291所示。經修飾溶血素A之全長胺基酸序列如SEQ ID NO：295所示。
在某些實施例中，特異性結合於溶血素A之抗體可使用上文提及之區的片段，或自本文所描述之區的N或C未端中任一者或兩者延伸超過指定區約5至約20個胺基酸殘基的肽來製備。在某些實施例中，上文所提及之區或其片段之任何組合可用於製備溶血素A-特異性抗體。在某些實施例中，溶血素A之上文所提及之區中的任何一或多者或其片段可用於製備單特異性、雙特異性或多特異性抗體。
抗體之抗原結合片段
除非另外特別指出，否則如本文所用，術語「抗體」應理解為涵蓋包含兩個免疫球蛋白重鏈及兩個免疫球蛋白輕鏈之抗體分子(亦即，「完全抗體分子」)以及其抗原結合片段。如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及類似術語，包括特異性結合抗原以形成複合物之任何天然存在、酶促可獲得、合成或基因工程改造之多肽或醣蛋白。如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」係指抗體中保留特異性結合於溶血素A之能力的一或多個片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR之片段或單離CDR。 抗體之抗原結合片段可使用任何適合之標準技術衍生自例如完全抗體分子，該等適合之標準技術為諸如蛋白水解消化或涉及DNA編碼抗體可變及(視情況)恆定域之操縱及表現的重組基因工程改造技術。此類DNA為已知的及/或為自例如商業來源、DNA文庫(包括例如噬菌體-抗體文庫)輕易可獲得的或可為合成的。可以化學方式或藉由使用分子生物學技術對DNA進行測序及操縱，例如以將一或多個可變及/或恆定域佈置成適合之組態，或引入密碼子；形成半胱胺酸殘基；修飾、添加或去除胺基酸等。
抗原結合片段之非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體之高變區的胺基酸殘基組成之最小識別單位(例如單離互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4肽。諸如以下之其他工程改造分子亦涵蓋於如本文所用之表述「抗原結合片段」內：結構域-特異性抗體、單-結構域抗體、結構域-缺失抗體、嵌合抗體、CDR-接枝抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(nanobody)(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模組化免疫藥物(SMIP)及鯊魚可變IgNAR結構域。
抗體之抗原結合片段將典型地包含至少一個可變域。可變域可具有任何尺寸或胺基酸組成，且通常將包含至少一個CDR，其鄰近一或多個構架序列或與其同框。在VH結構域與VL結構域相締合之抗原結合片段中，VH及VL結構域可以任何適合之排列相對於彼此定位。舉例而言，可變區可為二聚的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，抗體之抗原結合片段可含有單聚VH或VL結構域。
在某些實施例中，抗體之抗原結合片段可含有共價鍵聯至至少一個恆定域之至少一個可變域。本發明之抗體之抗原結合片段內可發現的可變及恆定域之非限制性、示例性組態包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii) VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在可變及恆定域之包括上文所列之示例性組態中之任一者的任何組態中，可變及恆定域可彼此直接鍵聯或可藉由完全或部分鉸鏈或連接子區鍵聯。鉸鏈區可由至少2(例如5、10、15、20、40、60或更多)個胺基酸組成，其在單一多肽分子中在鄰近可變及/或恆定域之間產生可撓性或半可撓性鍵聯。此外，本發明抗體之抗原結合片段可包含上文所列之可變及恆定域組態中之任一者彼此非共價締合及/或與一或多個單聚VH或VL結構域(例如藉由二硫鍵)的同二聚體或異二聚體(或其他多聚體)。
就完全抗體分子來說，抗原結合片段可為單特異性或多特異性的(例如雙特異性)。抗體之多特異性抗原結合片段將典型地包含至少兩個不同的可變域，其中各可變域能夠特異性結合於單獨的抗原或相同抗原上不同的抗原決定位。任何多特異性抗體格式(包括本文所揭示之示例性雙特異性抗體格式)均可適合於使用此項技術中可用之常規技術在本發明之抗體之抗原結合片段的背景下使用。
本發明包括抗溶血素A抗體及抗原結合片段，其具有包括本文所列之胺基酸序列以及具有細胞及/或活體外轉譯後修飾之變異體的免疫球蛋白鏈。舉例而言，本發明包括特異性結合於溶血素A之抗體及其抗原結合片段，其包含本文所列之重鏈及/或輕鏈胺基酸序列(例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3)；以及一或多個胺基酸殘基經糖基化、一或多個Asn殘基經脫醯胺基化、一或多個殘基(例如Met、Trp及/或His)經氧化、N端Gln為焦麩胺酸(pyroE)及/或C端離胺酸丟失之抗體及片段。
本發明包括用於製備本發明之抗溶血素A抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈的重組方法，其包括(i)引入編碼該抗體或抗原結合片段之輕免疫球蛋白鏈及/或重免疫球蛋白鏈(例如重鏈或其VH或包含其HCDR1、HCDR2及HCDR3之免疫球蛋白及/或輕鏈或其VL或包含其LCDR1、LCDR2及LCDR3之免疫球蛋白)的一或多個聚核苷酸，例如其中聚核苷酸位於載體中及/或可操作地連接至啟動子；(ii)在有利於表現該或該等聚核苷酸之條件下培養宿主細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或畢赤酵母屬(Pichia)細胞或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)細胞)，及(iii)視情況，自宿主細胞及/或生長宿主細胞之培養基分離抗體或片段或鏈。當製備包含超過一條免疫球蛋白鏈之抗體或抗原結合片段，例如包含兩條重免疫球蛋白鏈及兩條輕免疫球蛋白鏈之抗體時，該等鏈在單一宿主細胞中共表現使得鏈例如在細胞中或在細胞表面上或在細胞外部(若此類鏈被分泌)締合，從而形成抗體或抗原結合片段分子。該等方法包括僅表現重免疫球蛋白鏈或僅表現輕免疫球蛋白鏈(例如本文所論述之彼等免疫球蛋白鏈中之任一者，包括其成熟片段及/或可變域)之彼等方法。此類鏈適合作為例如包括此類鏈之抗體或抗原結合片段之表現中的中間物。本發明包括此類表現方法之產物(例如抗體、抗原結合片段、VH或VL)。
人類抗體之製備
在轉基因小鼠中產生人類抗體之方法為此項技術中已知的。在本發明之背景下可使用任何此類已知方法來製備特異性結合於溶血素A之人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術(參見例如US 6,596,541，Regeneron Pharmaceuticals，VELOCIMMUNE®)或任何其他已知用於產生單株抗體之方法，最初分離了具有人類可變區及小鼠恆定區之針對溶血素A之高親和力嵌合抗體。VELOCIMMUNE®技術涉及產生轉基因小鼠，其基 因組包含可操作地連接至內源性小鼠恆定區基因座之人類重鏈及輕鏈可變區，使得小鼠響應於抗原刺激產生包含人類可變區及小鼠恆定區之抗體。分離編碼抗體之重鏈及輕鏈之可變區的DNA且可操作地連接至編碼人類重鏈及輕鏈恆定區之DNA。然後，使DNA在能夠表現完全人類抗體之細胞中表現。
通常，用相關抗原激發VELOCIMMUNE®小鼠，且自表現抗體之小鼠回收淋巴細胞(諸如B細胞)。淋巴細胞可與骨髓瘤細胞株融合以製備永生雜交瘤細胞株，且此類雜交瘤細胞株經篩選及選擇以識別產生對相關抗原具特異性之抗體的雜交瘤細胞株。可分離編碼重鏈及輕鏈之可變區的DNA且鍵聯至重鏈及輕鏈之所需同型恆定區。此類抗體蛋白質可在細胞(諸如CHO細胞)中產生。或者，可直接自抗原特異性淋巴細胞分離編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈和重鏈之可變域的DNA。
最初分離具有人類可變區及小鼠恆定區之高親和力嵌合抗體。如以下實驗部分中，對抗體進行表徵且針對包括親和力、選擇性、抗原決定位等所需特徵進行選擇。小鼠恆定區經所需人類恆定區置換以產生本發明之完全人類抗體，例如野生型或經修飾之IgG1或IgG4。雖然所選恆定區可根據特定用途而變化，但高親和力抗原結合及目標特異性特徵存在於可變區中。
一般而言，本發明之抗體具有極高親和力，當藉由結合於固定於固相上或液相中之抗原來量測時，典型地具有約10-12至約10-7M之KD。小鼠恆定區經所需人類恆定區置換以產生本發明之完全人類抗體。雖然所選恆定區可根據特定用途而變化，但高親和力抗原結合及目標特異性特徵存在於可變區中。
生物等效物
本發明之抗溶血素A抗體及抗體片段涵蓋胺基酸序列不同於所描述之抗體但保留結合溶血素A之能力的蛋白質。此類變異體抗體及抗體片段當與親本序列相比較時包含一或多個胺基酸添加、缺失或取代，但展現基本上等效於所描述之抗體的生物活性。同樣地，本發明之抗體編碼DNA序列涵蓋當與所揭示之序列相比較時包含一或多個核苷酸添加、缺失或取代，但編碼基本上生物等效於本發明之抗體或抗體片段之抗體或抗體片段的序列。
若例如兩種抗原結合蛋白或抗體為當在類似實驗條件下以相同莫耳劑量(單一劑量或多個劑量)投與時吸收速率及程度不顯示顯著差異之藥物等效物或藥物替代物，則其被視為生物等效的。若一些抗體在其吸收程度方面為等效的，但在其吸收速率方面不等效，則其將被視為等效物或藥物替代物，然而可被視為生物等效的，因為此類在吸收速率方面之差異為有意的且在標記中被反映出來，在例如長期使用時不是達到有效體內藥物濃度所必需的，且對於所研究之特定藥物產品而言被認為在醫學上不重要。
在一個實施例中，若兩種抗原結合蛋白在其安全性、純度及效能方面不存在臨床上有意義之差異，則其為生物等效的。
在一個實施例中，若患者可在參考產品與生物產品之間轉換一或多次而與未進行此類轉換之持續療法相比沒有包括臨床上顯著之免疫原性變化或有效性減弱之有害作用風險之預期增加，則兩種抗原結合蛋白為生物等效的。
在一個實施例中，若兩種抗原結合蛋白兩者均藉由針對使用條件之常見作用機制(在此類機制已知之情況下)起作用，則其為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內及/或活體外方法來證實。生物等效性量測包括例如(a)在人類或其他哺乳動物中之活體內測試，其中量測隨時間 變化在血液、血漿、血清或其他生物流體中抗體或其代謝產物之濃度；(b)已與人類活體內生物可利用性資料相關聯且適當預示人類活體內生物可利用性資料之活體外測試；(c)人類或其他哺乳動物中之活體內測試，其中抗體(或其目標)之適當急性藥理學作用經量測為時間的函數；及(d)在建立抗體之安全性、功效或生物可利用性或生物等效性之良好控制之臨床試驗中。
可藉由例如進行殘基或序列之各種取代或去除生物活性不需要之未端或內部殘基或序列來構築本發明之抗體的生物等效變異體。舉例而言，可去除不為生物活性所必需的半胱胺酸殘基或用其他胺基酸置換以防止在復原後形成不必要或不恰當的分子內二硫鍵。在其他情形中，生物等效抗體可包括包含胺基酸變化之抗體變異體，該等胺基酸變化改變抗體之糖基化特徵，例如清除或移除糖基化之突變。
包含Fc變異體之抗溶血素A抗體
根據本發明之某些實施例，所提供之抗溶血素A抗體包含Fc結構域，該Fc結構域包含一或多個突變，其增強或削弱例如與中性pH值相比在酸性pH值下抗體與FcRn受體之結合。舉例而言，本發明包括在Fc結構域之CH2或CH3區中包含突變之抗溶血素A抗體，其中該或該等突變使在酸性環境中(例如在pH值在約5.5至約6.0範圍內之內體中)Fc結構域對FcRn之親和力增加。此類突變可使得當投與動物時抗體之血清半衰期增加。此類Fc修飾之非限制性實例包括例如在位置250(例如E或Q)；250及428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)及256(例如S/R/Q/E/D或T)之修飾；或在位置428及/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])之修飾；或在位置250及/或428之修飾；或在位置307或308(例如308F、V308F)及434之修飾。在一個實施例中，修飾包含428L(例如M428L)及434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)及308F(例如 V308F)修飾；433K(例如H433K)及434(例如434Y)修飾；252、254及256(例如252Y、254T及256E)修飾；250Q及428L修飾(例如T250Q及M428L)；及307及/或308修飾(例如308F及/或308P)。在另一實施例中，修飾包含265A(例如D265A)及/或297A(例如N297A)修飾。
舉例而言，本發明包括包含Fc結構域之抗溶血素A抗體，該Fc結構域包含一或多個選自由以下各項組成之群的突變對或突變群：250Q及248L(例如T250Q及M248L)；252Y、254T及256E(例如M252Y、S254T及T256E)；428L及434S(例如M428L及N434S)；257I及311I(例如P257I及Q311I)；257I及434H(例如P257I及N434H)；376V及434H(例如D376V及N434H)；307A、380A及434A(例如T307A、E380A及N434A)；及433K及434F(例如H433K及N434F)。前述Fc結構域突變之所有可能的組合及本文所揭示之抗體可變域內之其他突變涵蓋於本發明範疇內。
本發明亦包括包含嵌合重鏈恆定(CH)區之抗溶血素A抗體，其中嵌合CH區包含衍生自超過一種免疫球蛋白同型之CH區的區段。舉例而言，本發明之抗體可包含嵌合CH區，該嵌合CH區包含衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH2結構域的一部分或全部與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH3結構域的一部分或全部的組合。根據某些實施例，本發明之抗體包含具有嵌合鉸鏈區之嵌合CH區。舉例而言，嵌合鉸鏈可包含衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區之「上部鉸鏈」胺基酸序列(根據EU編號自位置216至227之胺基酸殘基)與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區之「下部鉸鏈」序列(根據EU編號自位置228至236之胺基酸殘基)的組合。根據某些實施例，嵌合鉸鏈區包含衍生自人類IgG1或人類IgG4上部鉸鏈之胺基酸殘基及衍生自人類IgG2較低鉸鏈之胺基酸殘基。在某些實施例中，如本文所描述包含嵌合CH區之抗體可展現改變的Fc效應子功能，而不會不利地影響抗體之治療或藥 物動力學特性。(參見例如2013年2月1日申請之美國臨時申請案第61/759,578號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中)。
本發明亦包括包含經修飾重鏈恆定(CH)區之抗溶血素A抗體，其中已引入妨礙結合蛋白質A之一或多個取代(例如突變)。舉例而言，在一些實施例中，本發明之抗溶血素A抗體具有His435已突變至Arg之IgG1恆定區。在重鏈恆定區中存在此點突變之情況下，本發明之抗溶血素A抗體將不結合於蛋白質A。在本發明之其他實施例中，抗溶血素A抗體在重鏈恆定區中含有二肽突變H435R/Y436F(EU編號；根據IMGT為H95R/Y96F)以消除蛋白質A結合。(參見例如2010年6月25日申請之美國專利第8,586,713號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。)
抗體之生物學特徵
一般而言，本發明之抗體可藉由結合於溶血素A來起作用。在一些實施例中，本發明之抗體可結合於另一抗原(可交叉反應之抗體)。
在某些實施例中，本發明之抗體可結合於除溶血素A之外的其他細菌毒素或毒素亞單位。本發明之抗體可結合的金黃色葡萄球菌之額外毒素或毒素亞單位包括雙組分成孔白細胞毒素(例如殺白細胞素或γ溶血素)及/或此等毒素之S或F亞單位(例如LukF、LukD及/或HlgB)。在某些實施例中，本發明之抗體僅顯示顯著結合於溶血素A。在某些實施例中，本發明之抗體僅可偵測地結合於溶血素A。
在某些實施例中，本發明之抗體可為雙特異性抗體。本發明之雙特異性抗體可結合溶血素A之一個結構域中之一個抗原決定位且亦可結合第二結構域中之一個抗原決定位。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗體可結合相同結構域中之兩個不同抗原決定位。
在一個實施例中，本發明提供一種結合於溶血素A之完全人類單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段展現以下特徵中之一或 多者：(i)包含HCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；(ii)包含LCVR，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；(iii)包含HCDR3結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268及288，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及LCDR3結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256及276，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；(iv)包含HCDR1結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264及284，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；HCDR2結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266及286，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；LCDR1結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252及272，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及LCDR2結構域，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、 234、254及274，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似的序列；及(v)以等於或小於10-7之KD結合於溶血素A。
如藉由活體外或活體內分析所測定，本發明之某些抗溶血素A抗體能夠結合於溶血素A且中和其活性。本發明之抗體結合於溶血素A及中和其活性之能力可使用熟習此項技術者已知之任何標準方法來量測，包括如本文所描述之結合分析或活性分析。
用於量測結合活性之非限制性、示例性活體外分析說明於本文中之實例3及4中。在實例6中，藉由表面電漿子共振來測定人類抗溶血素A抗體之結合親和力及動力學常數，且在T200 Biacore儀器上進行量測。實例5描述使用溶血素A-特異性抗體中和金黃色葡萄球菌溶血素A。
本發明亦包括結合於以下蛋白質或肽中之任一者的至少一個生物活性片段之抗溶血素A抗體及其抗原結合片段：SEQ ID NO：291(全長野生型溶血素A)或SEQ ID NO：295(經修飾形式之溶血素A)。本文所描述之溶血素A肽中之任一者或其片段可用於產生抗溶血素A抗體。
肽可經修飾以包括某些殘基之添加或取代，用於標記或用於結合至載體分子(諸如KLH)之目的。舉例而言，可在肽之N端或C端添加半胱胺酸，或可添加連接子序列以製備用於結合至例如KLH以進行免疫之肽。
對溶血素A具特異性之抗體可不含額外標記或部分，或其可含有N端或C端標記或部分。在一個實施例中，該標記或部分為生物素。在結合分析中，標記(若有)之位置可確定肽相對於與肽結合之表面的取向。舉例而言，若表面塗有親和素，則含有N端生物素之肽將經取向使得肽之C端部分將在該表面之遠端。在一個實施例中，標記可為放射性核素、螢光 染料或MRI可偵測標記。在某些實施例中，此類標記抗體可用於診斷分析，包括成像分析。
抗原決定位定位及相關技術
本發明包括與存在於溶血素A之一或多個區內之一或多個胺基酸相互作用的抗溶血素A抗體。與抗體結合之抗原決定位可由定位於溶血素A分子之上述區中之任一者內的3或更多(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)個胺基酸之單一連續序列組成(例如結構域中之線性抗原決定位)。或者，抗原決定位可由定位於溶血素A分子之上述區中的任一者或兩者內的複數個非連續胺基酸(或胺基酸序列)組成(例如構象抗原決定位)。
一般熟習此項技術者已知之各種技術可用於確定抗體是否「與多肽或蛋白質內之一或多個胺基酸相互作用」。示例性技術包括例如常規交叉阻斷分析，諸如描述於Antibodies,Harlow及Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)中之分析。其他方法包括丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)、肽裂解分析、結晶研究及NMR分析。此外，可採用諸如抗原決定位切除、抗原決定位萃取及抗原之化學修飾之方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)。可用於識別與抗體相互作用之多肽內之胺基酸的另一方法為藉由質譜法偵測之氫/氘交換。一般地說，氫/氘交換法涉及對相關蛋白質進行氘標記，隨後使抗體結合至經氘標記之蛋白質。接著，將蛋白質/抗體複合物轉移至水，且由抗體複合物保護之胺基酸內的可交換質子以比不為界面之一部分的胺基酸內的可交換質子慢之速率經歷氘至氫反交換。因此，形成蛋白質/抗體界面之一部分的胺基酸可保留氘，且因此與未包括在界面中之胺基酸相比展現相對較高之質量。在抗體解離之後，對目標蛋白質進行蛋白酶裂解及質譜分析，由此揭示含有與抗體相互作用之特異性胺基酸的含有氘標記殘基之 肽。參見例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen及Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
術語「抗原決定位」係指抗原上B及/或T細胞作出反應之位點。B細胞抗原決定位可均由連續胺基酸或因蛋白質之三級折迭而並列的不連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定位在暴露於變性溶劑時典型地被保留，而藉由三級折迭而形成之抗原決定位在用變性溶劑處理時典型地丟失。抗原決定位典型地包括呈獨特空間構象之至少3個，且更通常為至少5或8-10個胺基酸。
修飾輔助分型(MAP)亦稱為基於抗原結構之抗體分型(ASAP)，為一種根據各抗體對經化學或酶修飾之抗原表面之結合型態的相似性對針對相同抗原之大量單株抗體(mAb)進行分類的方法(參見US 2004/0101920，其特定而言以全文引用之方式併入本文中)。各類別可反映明顯不同於由另一類別表示之抗原決定位或與其部分重迭的獨特抗原決定位。此技術允許快速過濾遺傳上相同的抗體，使得表徵可集中於遺傳上不同的抗體。當應用於雜交瘤篩選時，MAP可有助於識別產生具有所需特徵之mAb的罕見雜交瘤純系。MAP可用於將本發明之抗體分類至結合不同抗原決定位之抗體群中。
在某些實施例中，抗溶血素A抗體或其抗原結合片段結合例示於野生型溶血素A中之如SEQ ID NO：291中所例示或經修飾溶血素A中之如SEQ ID NO：295中所例示之區中之任何一或多者內的抗原決定位或其片段。
本發明包括與本文所描述之特異性示例性抗體中之任一者或具有本文所描述之示例性抗體中之任一者之CDR序列的抗體結合於相同抗原決定位或抗原決定位之一部分的人類抗溶血素A抗體。同樣地，本發明亦包括與本文所描述之特異性示例性抗體中之任一者或具有本文所描述之示 例性抗體中之任一者之CDR序列的抗體競爭結合於溶血素A或溶血素A片段的抗溶血素A抗體。
吾人可藉由使用此項技術中已知之常規方法容易地確定抗體是否與參考抗溶血素A抗體結合於相同抗原決定位或發生競爭結合。舉例而言，為確定測試抗體是否與本發明之參考抗溶血素A抗體結合於相同抗原決定位，允許參考抗體在飽和條件下結合於溶血素A蛋白質或肽。接著，評估測試抗體結合於溶血素A分子之能力。若在與參考抗溶血素A抗體飽和結合之後測試抗體能夠結合於溶血素A，則可得出以下結論：測試抗體結合於與參考抗溶血素A抗體不同之抗原決定位。另一方面，若在與參考抗溶血素A抗體飽和結合之後測試抗體不能結合於溶血素A蛋白質，則測試抗體可結合於與由本發明之參考抗溶血素A抗體所結合的抗原決定位相同的抗原決定位。
為確定抗體是否與參考抗溶血素A抗體競爭結合，以兩種取向執行上文所描述之結合方法：在第一取向中，允許參考抗體在飽和條件下結合於溶血素A蛋白質，隨後評估測試抗體與溶血素A分子之結合。在第二取向中，允許測試抗體在飽和條件下結合於溶血素A分子，隨後評估參考抗體與溶血素A分子之結合。若在兩種取向中，僅第一(飽和)抗體能夠結合於溶血素A分子，則得出以下結論：測試抗體與參考抗體競爭結合於溶血素A。如一般熟習此項技術者將瞭解，與參考抗體競爭結合之抗體未必可與參考抗體結合於相同的抗原決定位，但可藉由結合重迭或鄰近抗原決定位在空間上阻斷參考抗體之結合。
若兩種抗體各自競爭抑制(阻斷)另一者與抗原之結合，則其結合於相同或重迭之抗原決定位。換句話說，如在競爭結合分析中所量測，1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過量之一種抗體將另一種抗體之結合抑制達至少50%，但較佳75%、90%或甚至99%(參見例如Junghans等人，Cancer Res. 1990 50：1495-1502)。或者，若抗原中基本上所有減少或清除一種抗體之結合的胺基酸突變減少或清除另一種抗體之結合，則兩種抗體具有相同抗原決定位。若一些減少或清除一種抗體之結合的胺基酸突變減少或清除另一種抗體之結合，則兩種抗體具有重迭抗原決定位。
然後可進行額外常規實驗(例如肽突變及結合分析)以證實所觀測到之測試抗體結合缺乏是否事實上歸因於與參考抗體結合於相同的抗原決定位，或者是否是空間阻斷(或另一現象)造成了所觀測到之結合缺乏。此類別之實驗可使用ELISA、RIA、表面電漿子共振、流式細胞術或此項技術中可用之任何其他定量或定性抗體結合分析來進行。
免疫結合物
本發明涵蓋一種結合至治療劑部分之人類抗溶血素A單株抗體(「免疫結合物」)，該治療劑部分為諸如能夠降低金黃色葡萄球菌感染之嚴重程度或改善至少一種與金黃色葡萄球菌感染相關之症狀或其嚴重程度之藥劑。如本文所用，術語「免疫結合物」係指化學或生物學鍵聯至放射性藥劑、細胞因子、干擾素、靶標或報告子部分、酶、毒素或治療劑之抗體。抗體可沿分子在任何位置鍵聯至放射性藥劑、細胞因子、干擾素、目標或報告子部分、酶、毒素或治療劑，只要其能夠結合其靶標即可。免疫結合物之實例為抗體藥物結合物。在一些實施例中，藥劑可為針對溶血素A或針對細胞因子(諸如IL-1、IL-6)或趨化因子(諸如TGF-β)之第二種不同的抗體。可結合至抗溶血素A抗體之治療劑部分之類型將考慮所要治療之病狀及所要達成之所需治療作用。適合用於形成免疫結合物之藥劑之實例為此項技術中已知的；參見例如，WO 05/103081。免疫結合物及免疫毒素之製備為此項技術中普遍熟知的(參見例如美國專利第4340535號)。免疫結合物詳細描述於例如US 7250492、US 7420040及US 7411046中，該等專利各自以全文併入本文中。
多特異性抗體
本發明之抗體可為單特異性、雙特異性或多特異性的。多特異性抗體可對目標多肽之不同抗原決定位具特異性或可含有對超過一種目標多肽具特異性之抗原結合域。參見例如Tutt等人，1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人，2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明之抗體可鍵聯至另一功能分子(例如另一肽或蛋白質)或與其共表現。舉例而言，抗體或其片段可功能上鍵聯(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一抗體或抗體片段，以製備具有第二結合特異性之雙特異性或多特異性抗體。舉例而言，本發明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白之一條臂對溶血素A之N端區或其片段具特異性，而免疫球蛋白之另一條臂對溶血素A之C端區或第二治療劑靶標具特異性，或結合至治療劑部分。可用於本發明之背景中的示例性雙特異性抗體格式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3結構域及第二Ig CH3結構域，其中第一及第二Ig CH3結構域因至少一個胺基酸而彼此不同，且其中至少一個胺基酸差異使雙特異性抗體與蛋白質A之結合與缺乏該胺基酸差異之雙特異性抗體相比有所減少。在一個實施例中，第一Ig CH3結構域結合蛋白質A且第二Ig CH3結構域含有減少或消除蛋白質A結合之突變，諸如H95R修飾(根據IMGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包含Y96F修飾(根據IMGT；根據EU為Y436F)。第二CH3內可發現之其他修飾包括：在IgG1抗體之情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M及V82I(根據IMGT；根據EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；在IgG2抗體之情況下，N44S、K52N及V82I(IMGT；根據EU為N384S、K392N及V422I)；及在IgG4抗體之情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q及V82I(根據IMGT；根據EU為Q355R、N384S、K392N、 V397M、R409K、E419Q及V422I)。關於上文所描述之雙特異性抗體格式之變化涵蓋於本發明範疇內。
可用於本發明之背景中的其他示例性雙特異性格式包括但不限於例如基於scFv或雙功能抗體雙特異性格式、IgG-scFv融合物、雙重可變域(DVD)-Ig、四體雜交瘤(Quadroma)、杵入臼結構、常見輕鏈(例如具有杵入臼結構之常見輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)體、白胺酸拉鏈、Duobody、IgG1/IgG2、雙重作用Fab(DAF)-IgG及Mab2雙特異性格式(關於前述格式之綜述參見例如Klein等人2012,mAbs 4：6,1-11及其中所引用之參考文獻)。雙特異性抗體亦可使用肽/核酸結合來構築，例如其中具有正交化學反應性之非天然胺基酸用於產生位點特異性抗體-寡核苷酸結合物，其然後自組裝成具有所規定之組成、價數及幾何形狀之多聚複合物。(參見例如Kazane等人，J.Am.Chem.Soc.[電子出版：2012年12月4日)。
治療劑投與及調配物
本發明提供包含如本文所論述之抗溶血素A抗體或其抗原結合片段之治療劑組成物。根據本發明之治療劑組成物可與適合之載劑、賦形劑及併入調配物中以提供改良之轉移、遞送、耐受性及類似性質之其他藥劑一起投與。在所有醫藥化學工作者已知之配方書中可發現許多適當的調配物：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。此等調配物包括例如粉劑、糊劑、膏劑、果凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(諸如LIPOFECTINTM)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳液、乳液碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含有碳蠟之半固體混合物。亦參見Powell等人「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
抗體之劑量可視所要投與之個體的年齡及塊頭、目標疾病、病狀、投藥途徑及類似因素而變化。當本發明之抗體用於預防或治療成人患者之皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎或癤病及癰病(癤)或用於預防或治療金黃色葡萄球菌感染時，通常以每公斤體重約0.1至約100mg，更佳每公斤體重約5至約100、約10至約90或約20至約70mg之單一劑量經靜脈內投與本發明之抗體為有利的。視病狀之嚴重程度而定，可調整治療之頻率及持續時間。在某些實施例中，可以初始劑量為至少約0.1mg至約800mg、約1至約500mg、約5至約300mg或約10至約200mg、至約100mg或至約50mg之形式投與本發明之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，在初始劑量之後可以與初始劑量相比可能大致相同或更小之量投與第二或複數個後續劑量之抗體或其抗原結合片段，其中後續劑量相隔至少1天至3天；至少一週、至少2週；至少3週；至少4週；至少5週；至少6週；至少7週；至少8週；至少9週；至少10週；至少12週；或至少14週。
各種遞送系統為已知的且可用於投與本發明之醫藥組成物，例如於脂質體中之封裝物、微粒、微膠囊、能夠表現突變體病毒之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入之方法包括但不限於真皮內、經真皮、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。可藉由任何方便途徑投與組成物，例如藉由輸注或快速注射、藉由通過上皮或黏膜皮膚內襯(例如口腔黏膜、直腸及腸道黏膜等)吸收且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身的或局部的。亦可在囊泡，特定而言脂質體中遞送醫藥組成物(參見例如Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
使用奈米粒子來遞送本發明之抗體亦涵蓋於本文中。抗體結合之奈米粒子可用於治療與診斷應用。抗體結合之奈米粒子及製備方法及用途由以引用之方式併入本文中之Arruebo,M.等人2009(「Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications」,J.Nanomat.第2009卷，文章編號439389,24頁，doi：10.1155/2009/439389)詳細描述。用於遞送藥物之奈米粒子亦已描述於例如US 8277812、US 8258256、US 8257740、US 8246995、US 8236330中，該等專利各自以全文併入本文中。
在某些情況下，可在控制釋放系統中遞送醫藥組成物。在一個實施例中，可使用泵。在另一實施例中，可使用聚合材料。在另一實施例中，可將控制釋放系統放置於組成物之靶標附近，因此僅需要全身劑量之一部分。
可注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。此等可注射製劑可藉由公眾已知之方法來製備。舉例而言，可例如藉由將上文所描述之抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在習知用於注射之無菌水性介質或油性介質中來製備注射製劑。作為用於注射之水性介質，存在例如生理鹽水、含有葡萄糖及其他助劑之等張溶液等，其可與諸如以下之適當之增溶劑組合使用：醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作為油性介質，存在已採用之例如芝麻油、大豆油等，其可與諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等增溶劑組合使用。因此製備之注射較佳填充於適當之安瓿中。
本發明之醫藥組成物可用標準針頭及注射器進行皮下或靜脈內遞送。此外，相對於皮下遞送，筆式遞送裝置已容易地應用於遞送本發明之醫藥組成物。此類筆式遞送裝置可為可再次使用的或拋棄式的。可再次使用之筆式遞送裝置通常利用含有醫藥組成物之可替換藥筒。一旦已投與 筒內之所有醫藥組成物且藥筒為空的，即可輕易地將空的藥筒棄去且用含有醫藥組成物之新藥筒代替。然後可再次使用該筆式遞送裝置。在拋棄式筆式遞送裝置中，沒有可替換之藥筒。相反地，拋棄式筆式遞送裝置預填充有保持在裝置內之儲集器中的醫藥組成物。一旦儲集器內之醫藥組成物用空，即將整個裝置棄去。
許多可再次使用之筆式及自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括但當然不限於(僅舉幾個例子)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM及OPTICLIKTM(Sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)。已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物之拋棄式筆式遞送裝置之實例包括但當然不限於(僅舉幾個例子)SOLOSTARTM筆(Sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park,IL)。
有利地，用於上文所描述之經口或非經腸用途之醫藥組成物係製備成呈適合於符合活性成分之劑量的單位劑量形式的劑型。此類呈單位劑量形式之劑型包括例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。上述所含抗體之量通常為每一呈單位劑量形式之劑型約5至約500mg；尤其在注射劑形式中，較佳上述所含抗體為對於其他劑型約5至約100mg及約10 至約250mg。本發明包括一種注射裝置(例如預填充注射器或預填充自動注射器)或一種小瓶(例如玻璃或塑膠小瓶)，其包含本發明之抗體或抗原結合片段或其包括醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。
抗體之治療用途
在本發明之某些實施例中，本發明抗體適用於治療金黃色葡萄球菌感染，或至少一種與金黃色葡萄球菌感染相關之症狀。在一些實施例中，抗體可適用於治療以下病狀或症狀：皮膚壞死、皮膚及軟組織感染(包括膿腫)、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎或癤病及癰病(癤)。亦涵蓋本發明之抗體在處於發展金黃色葡萄球菌感染危險之中的患者中用於預防之用途。此等患者包括老年人或因疾病或用免疫抑制治療劑治療而免疫受損之患者或處於較大之醫院感染風險中之患者，諸如手術後患者。在上文所論述之治療用途的各個實施例中，金黃色葡萄球菌細菌可能對一或多種類型之抗生素治療具抗性。在一個實施例中，細菌為耐甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)。預期本發明之抗體可單獨或與第二藥劑或第三藥劑結合使用，用於治療金黃色葡萄球菌感染，或用於緩解至少一種與金黃色葡萄球菌感染相關之症狀或併發症。第二或第三藥劑可與本發明之抗體同時遞送，或其可在本發明之抗體之前或之後分開投與。可接受本發明之抗體或抗原結合片段或其醫藥組成物之患者包括例如動物，諸如哺乳動物，諸如人類(例如年長人類，例如65歲以上)、兔、小鼠、大鼠、奶牛、豬、狗、靈長類動物、馬或綿羊。
在某些實施例中，本發明抗體適用於減少個體或個體之特定組織或器官中的金黃色葡萄球菌細菌之數目。在一些實施例中，金黃色葡萄球菌細菌可能對一或多種類型之抗生素治療具抗性。在一個實施例中，細菌為耐甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)。在某些實施例中，本發明抗體 適用於降低個體中由金黃色葡萄球菌細菌產生之溶血素A之毒性活性，從而減輕由感染產生之症狀，且容許其他醫藥藥劑及/或患者之免疫系統控制感染。
在本發明之另一實施例中，本發明抗體用於製備用於治療罹患金黃色葡萄球菌感染或具有與金黃色葡萄球菌感染相關之症狀之患者的醫藥組成物。
組合療法
組合療法可包括本發明之抗溶血素A抗體及可有利地與本發明之抗體或與本發明抗體之生物活性片段組合的任何額外治療劑。
該等抗體可與諸如以下之其他療法結合使用：抗生素NSAID、抗體LTM14、抗體LC10、皮質類固醇或普賴松。
額外治療活性組分可在投與本發明之抗溶血素A抗體之前、與其同時或在其之後投與。出於本發明之目的，考慮抗溶血素A抗體「與一或多種額外治療活性組分組合」投與之此類投與方案。
抗體之診斷用途
亦可使用本發明之抗溶血素A抗體來偵測及/或量測樣品中之溶血素A，例如用於診斷目的。設想本發明之抗體中之任何一或多者可用於偵測金黃色葡萄球菌感染之存在及嚴重程度。用於溶血素A之示例性診斷分析可包括例如使獲自患者之樣品與本發明之抗溶血素A抗體接觸，其中抗溶血素A抗體經可偵測標記或報告子分子標記或用作捕獲配位體以自患者樣品選擇性分離溶血素A。或者，未經標記之抗溶血素A抗體可與本身經可偵測標記之第二抗體組合用於診斷應用。可偵測標記或報告子分子可為放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學發光部分，諸如異硫氰酸螢光素或羅丹明；或酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或螢光素酶。可用於偵測或量測樣品中之溶血素A的特定示例 性分析包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)及螢光激活細胞分選(FACS)。
可用於根據本發明之溶血素A診斷分析中之樣品包括可獲自患者之任何組織或流體樣品，其在正常或病理學條件下含有可偵測量之溶血素A或其片段。通常，將量測獲自健康患者(例如未患有金黃色葡萄球菌感染之患者)之特定樣品中之溶血素A的含量以最初建立溶血素A之基線或標準含量。然後，可將溶血素A之此基線含量與在自懷疑具有金黃色葡萄球菌感染相關病狀或與此類病狀相關之症狀的個體獲得之樣品中量測的溶血素A含量相比較。
對溶血素A具特異性之抗體可不含額外標記或部分，或其可含有N端或C端標記或部分。在一個實施例中，該標記或部分為生物素。在結合分析中，標記(若有)之位置可確定肽相對於與肽結合之表面的取向。舉例而言，若表面塗有親和素，則含有N端生物素之肽將經取向使得肽之C端部分將在該表面之遠端。在一些實施例中，標記可為可偵測標記，諸如放射性核素、螢光染料或MRI可偵測標記。可偵測標記可鍵聯至抗體，其中此類抗體可用於成像分析。
實例
公佈以下實例，以便為一般熟習此項技術者提供對如何製備及使用本發明之完整揭示內容及描述，且不欲限制本發明人視為其發明之內容的範疇。除非另有指示，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度計，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
實例1. 產生針對溶血素A之人類抗體
使用兩種免疫原來免疫小鼠：不含信號序列(胺基27-391)之全長野生型溶血素A(Hla)及全長無毒溶血素A(Hla-H35L)；兩者在大腸桿菌中 均為重組His標記蛋白表現的且經純化。在某些實施例中，可使用上文提及之區的片段或自本文所描述之區的N未端或C未端中之任一者或兩者延伸超過指定區約5至約20個胺基酸殘基的肽來製備特異性結合於溶血素A之抗體。在某些實施例中，上文所提及之區或其片段之任何組合可用於製備溶血素A特異性抗體。在某些實施例中，可使用溶血素A之上文所提及之結構域中的任何一或多者或其片段來製備單特異性、雙特異性或多特異性抗體。藉由用無毒溶血素A免疫來製備H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P及H1H15418P2；且藉由用野生型溶血素A免疫來製備H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P及H1H15420P2。
將如上文所提及用作免疫原之全長蛋白或其片段與用以刺激免疫反應之佐劑一起直接投與給包含編碼人類免疫球蛋白重及κ輕鏈可變區之DNA的VELOCIMMUNE®小鼠。藉由溶血素A-特異性免疫分析監測抗體免疫反應。當達成所需免疫反應時，如以全文引用之方式特定地併入本文中之U.S.2007/0280945A1中所描述，直接自未融合至骨髓瘤細胞之抗原陽性B細胞分離抗溶血素A抗體。使用此方法，獲得若干完全人類抗溶血素A抗體(亦即，具有人類可變域及人類恆定域之抗體)；以此方式產生之示例性抗體命名如下：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2及H1H15420P2。
根據此實例之方法產生之示例性抗體之生物特性詳細描述於下文所列之實例中。
實例2. 重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列
表1列出了對溶血素A具特異性之所選抗體的重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列配對及其對應抗體標識符。本文中典型地根據以下命名法來提及抗體：Fc字首(例如「H4H」、「H1M」、「H2M」)，隨後為數字標識符(例如如表1中所示之「5375」)，隨後為「P」或「N」後綴。因此，根據此命名法，抗體可稱為例如「H1H5375」。本文中所用之抗體名稱上之H4H、H1M及H2M字首指示抗體之特定Fc區。舉例而言，「H2M」抗體具有小鼠IgG2 Fc，而「H4H」抗體具有人類IgG4 Fc。如一般熟習此項技術者將瞭解，H1M或H2M抗體可轉化為H4H抗體，且反之亦然，但在任何情況下，由表1中所示之數字標識符指示的可變域(包括CDR)將保持相同。具有相同數字抗體名稱但字母後綴N、B或P不同之抗體指具有CDR序列相同但在超出CDR序列範圍之區中(亦即，在構架區中)具有序列變化之重鏈及輕鏈的抗體。因此，特定抗體之N、B及P變異體在其重鏈及輕鏈可變區內具有相同CDR序列，但在其構架區內彼此不同。
實例3. 人類單株抗體與金黃色葡萄球菌溶血素A毒素之結合
為確定本發明之抗體是否能夠結合於溶血素A單體，藉由ELISA來測試經純化抗體(H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2及H1H15420P2)。將MaxiSorp微量滴定板用每孔10μg/mL經純化金黃色葡萄球菌溶血素A塗佈隔夜。將發明抗體及同型匹配之對照抗體之滴定液(在50μM-1pM範圍內，1：3連續稀釋)添加至含毒素之孔中且在25℃下孵育一小時。將孔洗滌三次且然後與每孔100ng/mL抗人類HRP第二抗體一起在25℃下孵育一小時。然後添加100μL之SuperSignal ELISA Pico化學發光受質(ThermoFisher Scientific)至各孔中且偵測信號(Victor X3 plate reader,Perkin Elmer)。藉由三參數邏輯斯諦方程(three-parameter logistic equation)在12-點反應曲線(GraphPad Prism)上分析發光值。
關於結合於金黃色葡萄球菌溶血素A毒素對抗溶血素A抗體之亞萘莫耳EC50結合進行觀測(表2及圖1)。
實例4. 針對金黃色葡萄球菌溶血素A之人類mAb與雙組分毒素之結合
金黃色葡萄球菌菌株可產生額外成孔毒素：殺白細胞素及γ溶血素(Hlg)，其亦需要寡聚化以形成功能孔隙。不同於溶血素A，殺白細胞素及Hlg為由2個亞單位組成之雙組分毒素：S-亞單位及F-亞單位。當前，已識別出五種S亞單位(LukA、LukE、LukS-PV、HlgA及HlgC)及四種F亞單位(LukB、LukD、LukF-PV及HlgB)，產生五種功能毒素(LukAB、LukED、PVL、HlgAB及HlgCB)。雖然在S-亞單位及F-亞單位與溶血素A之間觀測到低序列一致性(Aman MJ及Adhikaari RP,(2014)Toxins.6：950-972)，但所有組分顯示與溶血素A之結構同源性。
為確定本發明之抗溶血素A抗體是否交叉結合於其他毒素，藉由ELISA測試了經純化之抗體(H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2及H1H15420P2)對金黃色葡萄球菌雙組分毒素之交叉反應性。將MaxiSorp微量滴定板用每孔10μg/mL之金黃色葡萄球菌雙組分毒素個別F-組分塗佈隔夜。重組毒素組分係獲自IBT BioServices(Gaithersburg,MD)或由GenScript(Piscataway Township,NJ)生產。將發明抗體及同型匹配之對照抗體之滴定液(在50μM-100pM範圍內，1：3稀釋)添加至含毒素之孔中且在25℃下孵育1小時。將孔洗滌3次且然後與每孔100ng/mL抗人類HRP第二抗體一起在25℃下孵育一小時。添加100μL之SuperSignal ELISA Pico化學發光受質(ThermoFisher Scientific)至各孔中且偵測信號(Victor X3 plate reader,Perkin Elmer)。藉由三參數邏輯斯諦方程在11-點反應曲線 (GraphPad Prism)上分析發光值。包括同型匹配之不相關對照抗體及金黃色葡萄球菌δ毒素作為對照。
本發明中對15種抗體對雙組分毒素之交叉反應性的測試揭示一種mAb(H1H15381P)展示結合於F-組分LukF、LukD及HlgB，不過親和力比在溶血素A情況下所見到的低2個對數或3個對數(表3及圖2a-c)。當測試H1H15381P對S-組分LukS、LukE、HlgA及HlgC之交叉反應性時，結合親和力與同F-組分之結合相比顯著更低(圖3a-c)。H1H15381P結合對溶血素A及雙組分毒素而言為特異性的，因為其不顯示與不展示任何與雙組分毒素組分之結合的金黃色葡萄球菌δ毒素同型匹配對照抗體的結合。
實例5. 在THP-1細胞毒性分析中金黃色葡萄球菌溶血素A之中和
使用人類單核細胞細胞株THP-1測試經純化之mAb防止溶血素A介導之溶解的能力。將含於RPMI(補充有1%熱滅活FBS、L-麩醯胺及非必需胺基酸)中之總共2.5x105個THP-1細胞接種至96-孔透明底-黑色經組織培養物處理之板中且在37℃加5% CO2下孵育1小時。將經純化之抗體(H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2及H1H15420P2)或同型匹配對照抗體之滴定液(在範圍內10-0μM，於培養基中1：3連續稀釋)與10nM經純化之溶血素A一起在96孔板中在25℃下在振盪器上孵育30分鐘，然後添加至塗鋪之細胞中。亦將不含抗體之經純化溶血素A之滴定液(1.5-0μM，1：3稀釋)單獨與細胞一起孵育。
然後將含有毒素：抗體或單獨毒素之細胞孵育三小時(37℃，5% CO2)，且使用CytoTox-Glo分析套組(Promega)量測細胞死亡。使用讀板儀(Victor X3,Perkin Elmer)偵測發光。本發明之所有抗體對溶血素A展示類似中和活性，而同型匹配之抗體不對溶血素A展示任何中和活性。參見表4。
實例6. 使用兔RBC溶血分析來進行在培養物上清液中金黃色葡萄球菌溶血素A之中和
使用兔紅血球(rRBC)評估使用金黃色葡萄球菌培養物上清液之經純化mAb之溶血素A中和效能。藉由在37℃下將金黃色葡萄球菌菌株(American Type Culture Collection,Manassas,VA)在TSB中孵育16h(在振盪下)來獲得培養物上清液，藉由離心移除細菌且過濾含毒素培養基。將經純化之抗體H1H15399P或同型匹配對照抗體之滴定液(在10-0μM範圍內，於1X PBS中1：2連續稀釋)與經無菌過濾之金黃色葡萄球菌培養物上清液(其將產生80%細胞溶解)在96孔板中在25℃下在振盪器上一起孵育30分鐘。在30分鐘孵育之後，100μl之培養物上清液：mAb混合物在1x PBS中添加至含有100μl之4% rRBC的96孔圓底板中(Colorado Serum Company,Denver,CO)。在37℃下孵育1h之後，將板離心5min，將100μl之上清液輕輕移至新的微量滴定板，且使用讀板儀(SpectraMax i3x,Molecular Devices)讀取發光。本發明之所有抗體對溶血素A展示類似中和活性，而同型匹配之抗體不對溶血素A展示任何中和活性。參見表5。
實例7. 人類抗溶血素A單株抗體之Biacore結合親和力及動力學常數
在Biacore T200儀器上使用實時表面電漿子共振生物感測器分析測定野生型及突變體(Hla-H35L)溶血素A結合於經純化抗溶血素A抗體之結合締合及解離速率常數(分別為k a及k d)、平衡解離常數及解離半衰期(分別為K D 及t½)。Biacore感測器表面經衍生化具有單株選殖小鼠抗人類Fc抗體(BR-1008-39，GE Healthcare)以捕獲約150-360 RU之經表現具有人類Fc之抗溶血素A單株抗體。在Biacore T200上在抗溶血素A單株抗體捕獲表面上以50μL/min之流速注射在100nM至1.56nM範圍內之不同濃度之溶血素A毒素。用HBS-ET(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v表面活性劑P20)作為操作緩衝液監測溶血素A毒素在25℃及37℃下與所捕獲之單株抗體之結合4分鐘且監測自抗體之解離10分鐘。
藉由使用Scrubber 2.0c曲線擬合軟體對數據進行處理並擬合至1：1結合模型來測定動力學締合(k a)及解離(k d)速率常數。然後由動力學速率常數如下計算結合解離平衡常數(K D )及解離半衰期(t1/2)：K D (M)=k d/k a，且t½(min)=[ln2/(60*k d)]。
野生型溶血素A及突變體溶血素A與不同抗溶血素A單株抗體在25℃及37℃下之結合的結合動力學參數在表6-9中列出。如表6中所示，在25℃下，本發明之所有抗溶血素A抗體以在171pM至26.2nM範圍內之K D值結合於野生型溶血素A。如表7中所示，在37℃下，本發明之所有抗溶血素A抗體以在260pM至76.3nM範圍內之K D值結合於溶血素A。如表8中所示，在25℃下，本發明之所有抗溶血素A抗體以在52.3pM至8.89 nM範圍內之K D值結合於突變體溶血素A。如表9中所示，在37℃下，本發明之所有抗溶血素A抗體以在74.7pM至18.7nM範圍內之K D值結合於突變體溶血素A。
實例8. 抗溶血素A mAb阻斷活性之機制
為確定溶血素A mAb是否藉由阻斷毒素與其特異性受體ADAM10之相互作用而發揮其功能，使用與溶血素A一起孵育之A549細胞使用螢光肽受質分析來量測宿主細胞相關金屬蛋白酶活性。將溶血素A mAb(H1H15377P、H1H15381P及H1H15399P)之滴定液與3nM經純化之溶血素A一起在37℃下預孵育15min，然後在漢姆氏F-12K(補充有10%熱滅活FBS及L-麩醯胺)中添加至含有2.5x104個A549細胞之96孔板中。在37℃下孵育60min之後，添加5μM螢光肽受質(Mca-PLAVQ-Dpa-RSSSR-NH2,R&D Systems,Minneapolis,MN)，在37℃下孵育15min且使用讀板儀(激發過濾器為320nm且發射過濾器405nm，SpectraMax i3x,Molecular Devices)讀取螢光強度且以相對螢光單位表示。本發明之抗體阻斷毒素誘導之ADAM10活性增加，而同型匹配之抗體不展示對毒素誘導之ADAM10活性增加之任何影響(圖4a)。此表明本發明之抗體阻斷溶血素A與其受體之相互作用。
為進一步證實溶血素A mAb阻止毒素結合於宿主細胞膜，在存在溶血素A mAb之情況下使用兔RBC(rRBC)進行膜結合實驗，且藉由西 方墨點分析(Western blot analysis)偵測毒素與rRBC膜之締合。為避免rRBC溶解，在4℃下進行結合實驗。將溶血素A mAb(H1H15377P及H1H15399P)之滴定液與10nM溶血素A在37℃下預孵育15min，然後添加至經洗滌之rRBC(10%，於250μl PBS中)中且在4℃下孵育60min。使rRBC形成團塊，移除上清液且藉由再懸浮於1ml之ddH2O中，在25℃下孵育10min且以16,100xg離心之三次循環來溶解細胞。將膜溶解於10mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、1% Triton X-100及1%脫氧膽酸鈉中。將溶解之樣品還原，煮沸且在轉移至PVDF膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)之4-12% SDS-PAGE凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上分離，且用pAb(IBT BioServices,Rockville,MD)偵測溶血素A單體。本發明之抗體阻止溶血素A結合於rRBC膜，而同型匹配之抗體不展示任何作用(圖4b)。
實例9. 在皮膚壞死小鼠模型中預防性投與之人類抗溶血素A mAb之活體內功效
為確定本發明之抗溶血素A mAb是否能夠減輕或預防金黃色葡萄球菌誘導之皮膚病變，使用雌性BALB/c小鼠(n=3-5)在活體內皮膚壞死模型中對經純化之抗體進行預防性測試(Bubeck Wardenburg等人，(2008)J.Infect.Dis.198：1166-1170)。在感染之前兩天，藉由剃毛及施加毛髮移除洗劑自腹部區域將毛移除。在感染之前一天，在腹部左側為小鼠腹膜內注射5mg/kg或0.5mg/kg之單一劑量之各個別抗體：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2、H1H15420P2或同型匹配對照抗體。在感染當天，用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並懸 浮於PBS中之金黃色葡萄球菌CA-127(每個小鼠約1-2 x 108個CFU)在腹部右側對小鼠進行皮下激發。在感染後第2天用數位卡尺量測小鼠病變。
本發明之所有抗體在兩種所測試劑量下均為有效的。當以5mg/kg投與時，所有抗體顯示類似功效，當與同型匹配對照抗體相比時使皮膚壞死病變減少80-90%(表10)。類似地，當與用同型匹配抗體治療之彼等動物相比時，當以0.5mg/kg投與動物時，本發明之所有抗體(除H1H15410P外)顯示病變尺寸減小(表10)。然而，病變尺寸減小在40-80%範圍內，H1H15410P在此劑量下顯示無效。當以0.5mg/kg投與時抗體H1H15380P、H1H15381P、H1H15405P及H1H15414P最有效，病變尺寸減小>80%。5mg/kg及0.5mg/kg組之比較顯示劑量依賴性作用：與以0.5mg/kg劑量接受相同抗體之小鼠相比，以5mg/kg劑量接受抗體之小鼠具有較小病變。
為進一步考查抗溶血素A mAb減小病變尺寸之能力，以三種不同劑量預防性投與mAb且與兩種其他抗溶血素A mAb相比較：LTM14(參見例如美國專利第8715673號-SEQ ID NO：1及2；或Foletti等人，Mechanism of Action and In Vivo Efficacy of a Human-Derived Antibody against Staphylococcus α-Hemolysin,J.Mol.Biol.425：1641-1654(2013))及LC10(參見例如WO2012/109285-SEQ ID NO：57及58)。在感染之前兩天時如上文所描述自雌性BALB/c小鼠將毛移除。在感染之前一天，在腹部左側為小鼠(n=每組5個)腹膜內注射5mg/kg、0.5mg/kg或0.125mg/kg之單一劑量之各個別抗體：H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或同型匹配對照抗體。在感染當天，在腹部右側用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌CA-127(MRSA菌株；每個小鼠2.5 x 108個CFU)或金黃色葡萄球菌Newman(MSSA菌株；每個小鼠2.5 x 108個CFU)對小鼠進行皮下激發。在感染後第2天用數位卡尺量測小鼠病變。
本發明之所有抗體在使用MRSA與MSSA金黃色葡萄球菌菌株之所有三種所測試劑量下均為有效的。當以5mg/kg投與時，所有抗體(包括LC10及LTM14)對金黃色葡萄球菌CA-127(圖5a)與Newman(圖6a)顯示類似功效，當與同型匹配對照抗體相比時使病變減小85%。類似地，當以0.5mg/kg投與小鼠時，當與用同型匹配抗體治療之彼等小鼠相比時，所有抗體顯示50-60%之類似病變尺寸減小(圖5b及6b)。然而，與H1H15381P、LC10及LTM14相比在H1H15377P及H1H15399P情況下病變尺寸減小更大，與用同型匹配抗體治療之彼等小鼠相比，當使用金黃色 葡萄球菌CA-127(圖5c)與Newman(圖6c)以0.125mg/kg投與時在30-40%範圍內。對於所有抗體，5mg/kg、0.5mg/kg及0.125mg/kg組之比較顯示劑量依賴性作用：以較高濃度接受抗體之小鼠具有較小病變(5mg/kg劑量病變<0.5mg/kg劑量病變<0.125mg/kg劑量病變)。
實例10. 預防性投與抗溶血素A mAb之小鼠皮膚中的細菌計數
在皮膚壞死模型中測試本發明之三種經純化抗體H1H15377P、H1H15381P及H1H15399P，以確定是否存在任何在用抗體預防性治療之小鼠皮膚中觀測到之細菌負荷的變化。亦將本發明之抗體與兩種其他抗溶血素A mAb(LC10及LTM14)相比較。在感染之前兩天，藉由剃毛及施加毛髮移除洗劑自雌性BALB/c小鼠之腹部區域將毛移除。在感染之前一天，在腹部左側為小鼠腹膜內注射5mg/kg之單一劑量之各個別抗體：H1H15377P、H1H15381P及H1H15399P、LTM14、LC10或同型匹配對照抗體。在感染當天，在腹部右側用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌CA-127(MRSA菌株；每個小鼠2.5 x 108個CFU)或Newman(MSSA菌株；每個小鼠2.9 x 108個CFU)對小鼠(n=每組5個)進行皮下激發。在感染後2天時藉由麻醉將小鼠安樂死，使用8-mm皮膚活檢穿孔器切去病變區域(及周圍皮膚)並均質化。將皮膚溶解產物之連續稀釋液塗鋪於TSA板上。將板在37℃下孵育隔夜(16-18小時)且在測定細菌負荷之次日對細菌菌落進行計數。
抗體H1H15377P及H1H15399P使感染金黃色葡萄球菌CA-127(圖7a)與Newman(圖7b)之小鼠皮膚中之細菌負荷降低；特定而言，與關於用同型匹配對照抗體治療之動物所測定之細菌負荷水準相比，5mg/kg之任一抗體產生1-1.5個對數之皮膚細菌負荷降低。相同劑量之H1H15381P、LTM14或LC10產生0-0.5個對數之皮膚細菌負荷降低。結果表明H1H15377P及H1H15399P在降低感染小鼠皮膚中之細菌負荷方面最有效。
實例11. 治療性投與之抗溶血素A mAb的活體內功效
為確定若在感染之後投與本發明中之mAb是否亦可減小病變尺寸，在活體內皮膚壞死模型中使用雌性BALB/c小鼠(n=5)對經純化抗體進行治療性測試。在感染之前兩天，藉由剃毛及施加毛髮移除洗劑自腹部區域將毛移除。在感染當天，用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並再懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌CA-127(每個小鼠約1-2 x 108個CFU)在腹部右側對小鼠進行皮下激發。在感染之後兩小時，在腹部左側為小鼠腹膜內注射0.5mg/kg之單一劑量之各個別抗體：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2、H1H15420P2或同型匹配對照抗體。在感染後第2天用數位卡尺量測小鼠病變。
當感染之後兩小時時以0.5mg/kg投與動物時本發明之所有抗體有效減小病變尺寸(表11)。皮膚壞死病變尺寸減小在50-83%範圍內。抗體中有八個(H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15399P、H1H15418P2及H1H15420P2)顯示>70%之病變尺寸減小。
實例12. 在使用甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)菌株之急性肺炎模型中抗溶血素A mAb之活體內功效
以5mg/kg預防性投與抗體之小鼠的存活率。為確定當預防性投與時mAb對MSSA菌株之功效，在使用金黃色葡萄球菌Newman之急性肺炎模型中選擇以下抗體進行研究：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P及H1H15414P(自Bubeck Wardenburg等人，(2007)Infect.Immun.75：1040-1044修改)。為雌性C57BL/6小鼠(n=5)腹膜內注射5mg/kg之單一劑量之H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配對照抗體。在mAb注射後一天，用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並再懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌Newman(每個小鼠1.7 x 108個CFU)對小鼠進行氣管內激發。在感染後監測小鼠之存活率總共六天。
如表12所示，投與抗體H1H15375P、H1H15376P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P或H1H15414P產生100%存活率。投與H1H15377P至第6天時產生80%存活率。當在急性肺炎 感染模型中以5mg/kg預防性給予時，本發明之所有抗體均使感染金黃色葡萄球菌MSSA菌株之小鼠的存活率增加。
以2.5mg/kg預防性投與抗體之小鼠的存活率。為確定在針對MSSA菌株之急性肺炎模型中在較低劑量下抗體是否亦將有效，為C57BL/6雌性小鼠(n=5)腹膜內注射2.5mg/kg之單一劑量之H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配抗體。在mAb注射後一天，用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並再懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌Newman(每個小鼠7.5 x 107個CFU)對小鼠進行氣管內激發。在感染後監測小鼠之存活率總共六天。
如表12所示，投與抗體H1H15376P、H1H15377P、H1H15379P、H1H15381P、H1H15399P或H1H15414P至第6天時產生100%存活率，而 投與抗體H1H15378P或H1H15380P產生80%存活率。抗體H1H15375P當與其他抗體相比時不太有效，僅提供60%保護作用(表13)。
結果表明在使用金黃色葡萄球菌MSSA菌株之鼠急性肺炎模型中，即使當以較低劑量投與mAb時，抗體H1H15375P、H1H15376P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P及H1H15377P亦有效降低溶血素A之細胞毒性作用且增加存活率。
實例13. 在使用甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株之急性肺炎模型中抗溶血素A mAb之活體內功效
以5mg/kg預防性投與抗體之小鼠的存活率。為確試mAb對MRSA菌株之功效，在使用金黃色葡萄球菌CA-127之預防性急性肺炎模型中選擇以下抗體進行研究：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P及H1H15414P。為雌性C57BL/6小鼠(n=5)腹膜內注射5mg/kg之單一劑量之 H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配對照抗體。在mAb注射後一天，用50μl含有已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並再懸浮於PBS中之2.2 x 108個CFU(低接種體)或4.8 x 108個CFU(高接種體)之金黃色葡萄球菌CA-127對小鼠進行氣管內激發。在感染後監測小鼠之存活率總共六天。
當用低接種體對小鼠進行激發時，九種發明抗體中有八個顯示功效。特定而言，抗體H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P及H1H15399P同等有效，至第6天時產生100%存活率(表14)。投與抗體H1H15414P產生80%存活率。H1H15376P不展示保護作用，因為接受此抗體之小鼠至第6天時不存活。至第6天時用同型匹配抗體治療之動物無一存活(表13)。
在較高接種體下，在本發明抗體之間的功效中觀測到更大的區別。如表13所示，抗體H1H15377P及H1H15399P在所測試之抗體中為最有效的，至第6天時產生100%存活率。投與抗體H1H15414P、H1H15378P、H1H15379P及H1H15381P至第6天時產生60%存活率，而用同型匹配對照抗體治療之組中之動物至第6天時無一存活。抗體H1H15375P、H1H15376P及H1H15380P與所測試之其他發明抗體相比具有較低功效，至第6天時分別產生20%、0%或40%存活率(表13)。
結果表明當在感染金黃色葡萄球菌MRSA菌株之較低接種體之急性肺炎模型中以5mg/kg預防性給予時，H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P及H1H15414P有效降低溶血素A之細胞毒性作用且增加存活率。當此模型中使用金黃色葡萄球菌MRSA菌株之較高接種體時，兩種抗體H1H15377P及H1H15399P亦100%有效。
以2.5mg/kg預防性投與抗體之小鼠的存活率. 為確定在針對MRSA菌株之急性肺炎模型中在較低劑量下抗體是否亦將有效，為C57BL/6雌性小鼠(n=5)腹膜內注射2.5mg/kg之單一劑量之H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配對照抗體。在mAb注射後一天，用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並再懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌CA-127(每個小鼠3.0 x 108個CFU)對小鼠進行氣管內激發。在感染後監測小鼠之存活率總共六天。
所測試之所有發明抗體(H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P或H1H15414P)同等有效，至第6天時產生100%存活率，而用同型匹配對照抗體治療之組中的動物到第6天無一存活(表15)。結果表明當在感染金黃色葡萄球菌MRSA菌株之急性肺炎模型中以2.5mg/kg預防性給予時， H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P及H1H15414P有效降低溶血素A之細胞毒性作用且增加存活率。
預防性投與H1H15399P及H1H15376P之小鼠肺臟中之細菌計數. 在急性肺炎研究中測試本發明之兩種經純化抗體H1H15399P及H1H15376P，以確定是否存在任何在用抗體預防性治療之小鼠肺臟中觀測到之細菌負荷變化。為各組雌性C57BL/6小鼠(n=5)腹膜內注射三個劑量中之一者之H1H15399P、單一劑量之H1H15376P或同型匹配對照抗體(5mg/kg)。在mAb注射後一天，用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並再懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌CA-127(每個小鼠1.6x 108個CFU)對小鼠進行氣管內激發。在感染後18小時時藉由麻醉將小鼠安樂死且提取肺臟並均質化。將肺臟溶解產物之連續稀釋液塗鋪於TSA板上。將板在37℃下孵育隔夜(16-18小時)且在測定細菌負荷之次日對細菌菌落進行計數。
抗體H1H15399P降低感染小鼠肺臟中之細菌負荷(表16)；特定而言，與關於用同型匹配對照抗體治療之動物所測定之細菌負荷水準相比，所測試之所有三個劑量之H1H15399P產生1至1.5個對數之肺臟細菌負荷降低。此外，此肺臟細菌負荷降低為劑量依賴性的。抗體H1H15376P在此模型中不展示任何功效，顯示肺臟細菌肺臟負荷類似於同型匹配抗體。結果表明H1H15399P能夠降低感染小鼠肺臟中之細菌負荷。
為進一步考查抗溶血素A mAb降低肺臟中之細菌負荷的能力，以兩種不同劑量預防性投與已證實增加存活率之三種mAb(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P)且與兩種其他抗溶血素A mAb(LC10及LTM14)相比較。為各組雌性C57BL/6小鼠(n=5)腹膜內注射1.25mg/kg或0.325mg/kg之單一劑量之各個別抗體：H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或同型匹配對照抗體。在mAb注射後一天，用50μl之已在TSB中在37℃下生長至對數期(OD600 1)、經洗滌並再懸浮於PBS中之金黃色葡萄球菌CA-127(每個小鼠1.3x 108個CFU)對小鼠進行氣管內激發。在感染後18小時時藉由麻醉將小鼠安樂死且提取肺臟並均質化。將肺臟溶解產物之連續稀釋液塗鋪於TSA板上。將板在37℃下孵育隔夜(16-18小時)且在測定細菌負荷之次日對細菌菌落進行計數。
與LTM14、LC10及同型匹配對照抗體相比，當以1.25mg/kg投與時所測試之本發明之所有三種抗體均為有效的，使肺臟中之細菌負荷降低1個對數(圖8a)。當以0.325mg/kg投與時H1H15399P亦有效降低細菌負荷(圖8b)。所測試之所有其他溶血素A mAb在此較低劑量下不顯著減少小鼠肺臟中之細菌(圖8b)。
實例14. 使用預複合方式得到之不同抗溶血素A單株抗體之間的Octet交叉競爭
為評估兩種抗體是否彼此競爭結合溶血素A(自金黃色葡萄球菌純化)上之抗原決定位，在Octet RED384生物感測器(Pall ForteBio Corp.)上使用實時、不含標記生物層干涉術分析測定抗溶血素A單株抗體之間的結合競爭。在25℃下在0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v吐溫-20(Tween-20)、1.0mg/mL BSA(Octet HBS-ET緩衝液)中在以1000rpm之速度振盪板的同時進行整個實驗。首先藉由將Octet生物感測器端部(Pall ForteBio Corp.,# 18-5060)浸入含有抗溶血素A單株抗體(mAb-1)之50μg/mL溶液的孔中兩分鐘來將約1.5-2.5nm之抗溶血素A單株抗體捕獲至抗hFc抗體塗佈之端部上。然後藉由浸入含有阻斷性mAb之100μg/mL溶液之孔中三分鐘來將捕獲了抗體之生物感測器端部用阻斷性H4H同型對照單株抗體(阻斷性mAb)飽和。然後，隨後將生物感測器端部浸入含有先前與1μM之第二抗溶血素A單株抗體(mAb-2)一起孵育2小時之100nM溶血素A之孔中四分鐘。在每個實驗步驟之間在Octet HBS-ET緩衝液中洗滌生物感測器端部。在實驗過程期間監測實時結合反應且在每個步驟結束時記錄結合反應。針對背景結合對預複合了mAb-2之溶血素A結合於mAb-1之反應進行校正，比較且確定不同抗溶血素A單株抗體之競爭性/非競爭性性質。表17明確定義了在兩個方向上競爭之抗體的關係，不管結合順序如何。
本發明之範疇不受本文所描述之特定實施例限制。實際上，除本文所描述之彼等之外，由前述描述及附圖，本發明之各種修改型式將對熟習此項技術者而言變得顯而易見。此類修飾旨在屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
<110> 美商再生元醫藥公司Regeneron Pharmaceuticals,Inc.
<120> 抗金黃色葡萄球菌，溶血素A毒素之人類抗體HUMAN ANTIBODIES TO S.AUREUS HEMOLYSIN A TOXIN
<130> 10268WO01
<150> 62/441,786
<151> 2017-01-03
<160> 290
<170> 用於Windows版本4.0之FastSEQ
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
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<212> PRT
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<212> DNA
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<212> PRT
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<212> DNA
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Claims (22)

  1. 一種單離人類單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於溶血素A，其中該抗體或抗原結合片段展現一或多種選自由以下各項組成之群的特性：(a)藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以小於約80nM之結合解離平衡常數(K D)結合於野生型溶血素A；(b)藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以大於約0.5分鐘之解離半衰期(t½)結合於野生型溶血素A；(c)藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以小於約30nM之K D結合於野生型溶血素A；(d)藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以大於約1.5分鐘之t½結合於野生型溶血素A；(e)藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以小於約20nM之結合解離平衡常數(K D)結合於經修飾之溶血素A；(f)藉由表面電漿子共振所量測，在37℃下以大於約0.5分鐘之解離半衰期(t½)結合於經修飾之溶血素A；(g)藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以小於約10nM之K D結合於經修飾之溶血素A；(h)藉由表面電漿子共振所量測，在25℃下以大於約1.5分鐘之t½結合於經修飾之溶血素A；(i)藉由選自由以下各項組成之群的金黃色葡萄球菌菌株來抑制溶血素A介導之兔紅血球溶血：GA201；CA-127；TCH1516；GA229；8：03；27-05；94：1013；及7031；以及 (j)阻斷溶血素A與ADAM10之間的相互作用。
  2. 一種單離人類抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於溶血素A，其中該抗體或抗原結合片段包含選自由以下各項組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列中任一者所含的三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1、HCDR2及HCDR3)：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282；及選自由以下各項組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列中任一者所含的三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270。
  3. 如請求項1至2中任一項之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含HCVR，該HCVR包含選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282所組成群組的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含LCVR，該LCVR包含選自由SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270所組成群組的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：(a)HCVR，其包含選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282 所組成群組的胺基酸序列；及(b)LCVR，其包含選自由SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270所組成群組的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：(a)HCDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264及284所組成群組的胺基酸序列；(b)HCDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO：6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266及286所組成群組的胺基酸序列；(c)HCDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268及288所組成群組的胺基酸序列；(d)LCDR1結構域，其包含選自由SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252及272所組成群組的胺基酸序列；(e)LCDR2結構域，其包含選自由SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254及274所組成群組的胺基酸序列；及/或(f)LCDR3結構域，其包含選自由SEQ ID NO：16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256及276所組成群組的胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之單離人類抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO：2/10、22/30、42/50、62/70、82/90、102/110、122/130、142/150、162/170、182/190、202/210、222/230、242/250、262/270及282/270所組成群組的HCVR/LCVR胺基酸序列配對。
  8. 如請求項1至7中任一項之單離人類抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：(i)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：20中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：18中所示之胺基酸序列；(ii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：40中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：38中所示之胺基酸序列；(iii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：60中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：58中所示之胺基酸序列；(iv)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：80中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：78中所示之胺基酸序列；(v)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：100中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：98中所示之胺基酸序列；(vi)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：120中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：118中所示之胺基酸序列；(vii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：140中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：138中所示之胺基酸序列；(viii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：160中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：158中所示之胺基酸序列； (ix)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：180中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：178中所示之胺基酸序列；(x)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：200中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：198中所示之胺基酸序列；(xi)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：220中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：218中所示之胺基酸序列；(xii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：240中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：238中所示之胺基酸序列；(xiii)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：260中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：258中所示之胺基酸序列；(xiv)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：280中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：278中所示之胺基酸序列；及/或(xv)輕鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：280中所示之胺基酸序列，及重鏈免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：290中所示之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab片段、F(ab') 2片段、Fd片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)分子或dAb片段。
  10. 一種與參考抗體結合溶血素A上之相同抗原決定位的單離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)之互補決定區(CDR)，該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282所組成群組的胺基酸序列；及輕鏈可變區(LCVR)之CDR，該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：10、30、50、 70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270所組成群組的胺基酸序列。
  11. 一種與參考抗體競爭結合於溶血素A的單離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)之互補決定區(CDR)，該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262及282所組成群組的胺基酸序列；及輕鏈可變區(LCVR)之互補決定區(CDR)，該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250及270所組成群組的胺基酸序列。
  12. 一種製備如請求項1至11中任一項之抗體或抗原結合片段的方法，其包括：(i)將編碼該抗體或片段之輕免疫球蛋白鏈及該抗體或片段之重免疫球蛋白鏈的一或多個聚核苷酸引入宿主細胞中；(ii)在生長培養基中於有利該等聚核苷酸表現之條件下培養該宿主細胞；及(iii)視情況，自該宿主細胞及/或該宿主細胞在其中生長之培養基分離出該抗體或片段。
  13. 一種抗體或抗原結合片段，其為如請求項12之方法的產物。
  14. 一種注射裝置或容器，其包含如請求項1至11及13中任一項之抗體或抗原結合片段。
  15. 一種醫藥組成物，其包含如請求項第1項至第11項及第13項中任一項之結合於溶血素A的單離人類抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑；及視情況存在之一或多種額外治療劑。
  16. 如請求項15之醫藥組成物，其包含該額外治療劑，該額外治療劑為抗生素、NSAID、皮質類固醇、LC10、LTM14及/或普賴松(prednisone)。
  17. 一種預防或治療有需要之患者的金黃色葡萄球菌感染的方法，其包括向該患者投與有效量之如請求項1至11及13中任一項之抗體或其抗原結合片段；或如請求項15至16中任一項之醫藥組成物。
  18. 如請求項17之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係經皮下、經靜脈內、經皮內、經口或經肌肉內投與。
  19. 如請求項17至18中任一項之方法，其中該金黃色葡萄球菌感染產生選自由以下各項組成之群的病狀：皮膚壞死、皮膚及軟組織感染、膿腫、手術部位感染、人工關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克症候群、乳房炎、癤病、癰病、癤；且該抗體或抗原結合片段之投與治療該病狀或降低該病狀之一或多種症狀的嚴重程度。
  20. 如請求項1至11及13中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係用於治療患有金黃色葡萄球菌感染之患者。
  21. 一種包含一或多種如請求項1至11及13中任一項之抗體或其抗原結合片段的組成物，其係用於治療金黃色葡萄球菌感染。
  22. 一種如請求項1至11及13中任一項之單離抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製造用以治療患有金黃色葡萄球菌感染之患者的藥劑。
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