TW201829454A

TW201829454A - 表現禽流感病毒抗原之重組載體及其用途

Info

Publication number: TW201829454A
Application number: TW106136263A
Authority: TW
Inventors: 泰斯合麥班遜; 喬伊思普查; 大衛史威
Original assignee: 美商梅里亞有限公司; 美國農業部
Priority date: 2016-10-21
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2018-08-16
Also published as: IL266148B2; EP3528842A1; IL266148A; US11058761B2; JOP20190088A1; WO2018075977A1; EP4378528A3; MX385918B; EP4378528A2; KR20190073460A; RU2761869C2; ZA201902525B; RU2019115277A; PH12019500854A1; MA46580A; TN2019000127A1; CA3041304A1; MX2019004593A; MY191322A; CN110072548A

Abstract

本發明提供含有並表現禽病原體抗原之重組病毒載體、包含該等重組病毒載體之組合物、包含該等重組病毒載體之多價疫苗。本發明進一步提供針對多種禽病原體之疫苗接種方法及產生該等重組病毒載體之方法。

Description

表現禽流感病毒抗原之重組載體及其用途

本發明係關於插入並表現外源基因之重組病毒載體，其作為安全免疫媒劑用於抵抗多種病原體。其亦係關於多價組合物或疫苗，其包含一或多種用於抵抗多種病原體之重組病毒載體。本發明係關於製備及使用重組病毒載體之方法。

流感病毒係正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)之成員(Murphy及Webster, Orthomyxoviruses, Fields Virology，第3版，第1卷，第1397-1445頁，1996)。存在三類流感病毒，稱為A、B及C。流感病毒粒子含有分段負義RNA基因體。流感病毒粒子包括以下蛋白質：血球凝集素(HA)、神經胺酸酶(NA)、基質蛋白(M1)、質子離子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶鹼性蛋白1 (PB1)、聚合酶鹼性蛋白2 (PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)及非結構蛋白2 (NS2)。NP及基質蛋白M1用於將流感病毒分成A群、B群或C群。 HA及NA蛋白係包膜醣蛋白。HA蛋白負責病毒附接及病毒顆粒滲透至細胞中且含有用於病毒中和及保護性免疫性之主要免疫顯性表位。HA及NA蛋白皆視為預防性流感疫苗之最重要組分。迄今為止，業內已鑑別出18種不同HA亞型及11種不同NA亞型(Tong等人，2013, PLoS Pathogens，第9卷(10), New World Bats harbor diverse influenza A viruses)。在全球，流感係人類、豬、馬及家禽中經濟上最顯著之呼吸疾病。已知流感病毒之連續遺傳及抗原性變化，其阻礙病毒之有效控制。關於傳染病及流行病之預防尤其關注根據遺傳再分佈或跨物種傳播新出現之病毒新亞型。高致病性流感A病毒亞型H5N1病毒係新出現之禽流感病毒(AIV)，其已作為潛在流行威脅引起全球關注。在遍及亞洲、歐洲及非洲之越來越多的國家中，H5N1已殺死數百萬家禽。健康專家認為，人類流感病毒及禽流感病毒(尤其H5N1)之共存將為欲在物種特異性病毒之間交換之遺傳物質提供機會，可能產生容易傳播且對人類致死之新毒性流感株(Food Safety Research Information Office. 「A Focus on Avian Influenza」. 創建於2006年5月，更新於2007年11月)。US8,394,384報導使用植物表現系統製備禽流感疫苗。US7,910,112揭示針對禽流感之痘病毒載體疫苗。US8,592,558揭示含有H5蛋白之疫苗。WO2007019094研究HA分子在取代特異性HA殘基時之免疫原性。在2014年12月15日及2015年1月16日期間，美國農業部(U.S. Department of Agriculture)收到14例感染亞洲起源之高致病性禽流感A (HPAI) (包括H5N2病毒)之鳥類報告。該等報告代表美國野生或飼養鳥類中首例報導之該等病毒感染。儘管未知該等病毒在人類中已引起之疾病，但其在北美洲之出現可增加美國人類感染之可能性(Morbidity and Mortality Weekly Report, Centers for Disease Control and Prevention, 2015年2月6日/ 64(04),111；Bertran等人，2016, Virology 494, 190-197)。考慮到動物(包括人類)對AIV之易感性，預防AIV感染及保護動物之方法係必需的。因此，業內需要產生針對流感之有效疫苗之方法。

本發明係關於火雞重組疱疹病毒(HVT)載體或禽痘病毒(FPV)載體，其包含一或多種編碼並表現至少一種禽病原體抗原之異源多核苷酸。本發明提供組合物或疫苗，其包含一或多種包含一或多種編碼並表現至少一種禽病原體抗原之異源多核苷酸之重組HVT或FPV載體。本發明亦提供多價組合物或疫苗，其包含一或多種包含編碼並表現至少一種禽病原體抗原之異源多核苷酸之重組HVT或FPV載體及一或多種包含編碼並表現至少一種禽病原體抗原之異源多核苷酸之重組HVT或FPV載體。本發明係關於對動物進行疫苗接種或誘導動物中之免疫原性或保護性反應之方法，其包含本發明組合物或載體之至少一種投與。本發明顯示以下令人驚奇的結果：表現經修飾HA蛋白之重組病毒載體在禽中提供優於表現突變體HA蛋白之重組病毒載體之保護。本發明亦展示，包含病毒載體之多價組合物或疫苗可有效地保護動物免於多種禽病原體而無干擾。

相關申請案之交叉參考 本申請案主張於2016年10月21日提出申請之美國臨時申請案62/410,885之優先權。應注意，在本發明中及尤其在申請專利範圍中，諸如「包含(comprises)」、「包含(comprised)」、「包含(comprising)」及諸如此類術語可具有歸於其在美國專利法中之含義；例如，其可意指「包括(includes)」、「包括(included)」、「包括(including)」及諸如此類；且諸如「基本上由……組成(consisting essentially of)」及「基本上由……組成(consists essentially of)」等術語具有歸於其在美國專利法中之含義，例如其容許不明確列舉要素，但排除在先前技術中發現或影響本發明之基本或新穎特徵之要素。除非另外註明，否則技術術語係根據習用用法來使用。分子生物學中常用術語之定義可參見Benjamin Lewin, Genes V.，由Oxford University Press出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編輯), The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A. Meyers (編輯), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。除非上下文另有明確指示，否則單數術語「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個指示物。類似地，除非上下文另外明確指示，否則詞語「或」意欲包括「及」。詞語「或」意指特定列表之任一成員且亦包括該列表成員之任一組合。如本文所用術語「約」意指大約、在……區域中、大致或在附近。當術語「約」結合數字範圍使用時，其藉由將邊界延伸至高於及低於所述數值來修改該範圍。一般而言，本文使用術語「約」將數值修改為在所述數值上下變化10%。在一態樣中，術語「約」意指加或減與其一起使用之數字之數值之20%。因此，約50%意指在45%-55%範圍內。本文藉由終點所列舉之數值範圍包括包容在該範圍內之所有數字及分數(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4及5)。亦應理解推測所有數字及其分數經術語「約」修飾。術語「動物」用於本文中且包括所有哺乳動物、鳥類及魚。如本文所用之動物可選自由以下組成之群：馬科動物(例如，馬)、犬(例如，狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼)、貓科動物(例如，獅、虎、家貓、野貓、其他大貓及其他貓，包括獵豹及山貓)、牛族動物(例如，牛)、豬(swine) (例如，豬(pig))、羊(例如，綿羊、山羊、羊駝、野牛)、禽(例如，雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀、鷹、鴉、鴕鳥、鴯鶓及鶴鴕)、靈長類動物(例如，原猴、眼鏡猴、猴、長臂猿、猿)、人類及魚。術語「動物」亦包括所有發育階段(包括胚胎及胎兒階段)之個別動物。術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指連續胺基酸殘基之聚合物。所關注特定抗原性多肽係血球凝集素(HA)。流感血球凝集素係指一種類型之在流感病毒表面上發現之血球凝集素。其係抗原性醣蛋白且負責病毒與受感染細胞之結合。存在不同HA抗原，其中之任一者可用於本發明實踐中。所關注者係來自高致病性禽流感病毒H5N2之HA。然而，來自其他流感病毒之HA (即H1-H16)可用於本發明實踐中，包括H1、H3、H5、H6、H7、H9及諸如此類。進一步意識到，可使用任一HA蛋白之HA前體。 HA係胞外結構域由球形頭及幹區構成之同三聚體跨膜蛋白。兩個區域攜帶N-連接寡醣，其在HA之生物功能中起重要作用(Schulze, I.T., J Infect Dis, 1997. 176增刊1: 第S24-8頁；Deshpande, K.L.等人，PNAS USA, 1987, 84(1): 第36-40頁)。在流感A病毒之不同亞型中，在頭區之醣基化位點中存在顯著變化，而幹寡醣更保守且為融合活性所必需(Ohuchi, R.等人，J Virol, 1997, 71(5): 第3719-25頁)。抗原肽表位附近之聚醣干擾抗體識別(Skehel, J.J.等人，PNAS USA, 1984, 81(6): 第1779-83頁)，且蛋白水解位點附近之聚醣調節裂解且影響流感病毒之感染性(Deshpande, K.L.等人，1987)。62個H5基因之核苷酸序列分析支持以下假說：HA球形頭內之受體結合位點附近之額外醣基化係病毒在野鳥、尤其水鳥至家禽之種間傳播後之適應(Banks, J.等人，Avian Dis, 2003, 47(3增刊): 第942-50頁)。術語「核酸」、「核苷酸」及「多核苷酸」可互換使用且係指RNA、DNA、cDNA或cRNA及其衍生物，例如含有經修飾主鏈之彼等。應瞭解，本發明提供包含與本文所述之序列互補之序列之多核苷酸。本發明中所涵蓋之「多核苷酸」包括正向鏈(5’至3’)及反向互補鏈(3’至5’)二者。本發明之多核苷酸可以不同方式(例如藉由化學合成、藉由基因選殖等)製備且可呈多種形式(例如直鏈或具支鏈、單鏈或雙鏈或其雜合體、引子、探針等)。術語「基因體DNA」或「基因體」可互換使用且係指宿主生物體之可遺傳遺傳資訊。基因體DNA包含核DNA (亦稱為染色體DNA)，但亦包含質體(例如，葉綠體)及其他細胞細胞器(例如，粒線體) DNA。本發明中所涵蓋之基因體DNA或基因體亦指病毒RNA。RNA可為正鏈或負鏈RNA。本發明中所涵蓋之術語「基因體DNA」包括含有與本文所述之序列互補之序列之基因體DNA。術語「基因體DNA」亦指信使RNA (mRNA)、互補DNA (cDNA)及互補RNA (cRNA)。術語「基因」在廣義上使用且係指多核苷酸之與生物功能相關之任一區段。因此，基因或多核苷酸包括如基因體序列中之內含子及外顯子或恰如cDNA中之編碼序列，例如開放閱讀框(ORF)，自起始密碼子(甲硫胺酸密碼子)起始且以終止信號(終止密碼子)終止。基因及多核苷酸亦可包括調控其表現(例如轉錄起始、轉譯及轉錄終止)之區域。因此，亦包括啟動子及核糖體結合區域(通常，該等調控元件在編碼序列或基因之起始密碼子上游約60與250個核苷酸之間)、轉錄終止子(通常，終止子位於編碼序列或基因之終止密碼子下游約50個核苷酸內)。基因或多核苷酸亦指表現mRNA或功能RNA或編碼具體蛋白質且包括調控序列之核酸片段。如本文所用術語「異源DNA」係指源自不同生物體(例如來自接受者之不同細胞類型或不同物種)之DNA。該術語亦指宿主DNA之同一基因體上之DNA或其片段，其中異源DNA插入基因體之不同於其起源位置之區域中。如本文所用術語「抗原」或「免疫原」意指誘導宿主動物中之特異性免疫反應之物質。抗原可包含殺死、減毒或活的完整生物體；生物體之亞單元或部分；含有具有免疫原性質之插入物之重組載體；在呈遞至宿主動物後能夠誘導免疫反應之DNA斷片或片段；多肽、表位、半抗原或其任一組合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。如本文所用術語「免疫原性蛋白或肽」包括在投與宿主後能夠立即引起針對該蛋白質之體液性及/或細胞類型之免疫反應的意義上具有免疫活性之多肽。較佳地，蛋白質片段應使得其具有與總蛋白質實質上相同之免疫活性。因此，本發明之蛋白質片段包含至少一個表位或抗原性決定子或基本上由其組成或由其組成。如本文所用「免疫原性」蛋白或多肽包括蛋白質之全長序列、其類似物或其免疫原性片段。「免疫原性片段」意指包括一或多個表位且因此引發上文所述之免疫反應之蛋白質片段。該等片段可使用任一數量之業內所熟知之表位定位技術來鑑別。舉例而言，線性表位可藉由例如在固體支撐物上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白質分子部分)並使肽與抗體反應、同時使肽仍附接至支撐物上來確定。類似地，構形表位容易地例如藉由例如x射線結晶學及2維核磁共振確定胺基酸之空間構形來鑑別。術語「免疫原性蛋白質或肽」進一步涵蓋序列之缺失、添加及取代，只要該多肽用於產生如本文所定義之免疫反應即可。術語「保守變化」表示胺基酸殘基經另一生物類似殘基替代或替代核酸序列中之核苷酸，使得經編碼胺基酸殘基不會發生變化或為另一生物生物類似殘基。就此而言，尤佳取代通常將具有保守性，即在胺基酸家族內發生之彼等取代。舉例而言，胺基酸通常分為四個家族：(1) 酸性--天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽；(2) 鹼性--離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3) 非極性--丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及(4) 不帶電極性--甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時分類為芳香族胺基酸。保守變化之實例包括用一個疏水殘基(例如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一疏水殘基或用一個極性殘基取代另一極性殘基，例如用精胺酸取代離胺酸、用麩胺酸取代天冬胺酸或用麩醯胺酸取代天冬醯胺及諸如此類；或胺基酸經對生物活性將不具主要效應之結構相關胺基酸之類似保守替代。因此，具有與參考分子實質上相同之胺基酸序列但具有少量實質上不會影響蛋白質之免疫原性之胺基酸取代之蛋白質在參考多肽之定義內。本文包括藉由該等修飾產生之所有多肽。術語「保守變化」亦包括使用經取代胺基酸替代未經取代之親代胺基酸，條件係針對經取代多肽產生之抗體亦與未經取代之多肽免疫反應。術語「表位」係指特異性B細胞及/或T細胞對其有反應之抗原或半抗原上之位點。該術語亦可與「抗原決定子」或「抗原決定子位點」互換使用。可在顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原結合之能力之簡單免疫分析中鑑別識別同一表位之抗體。針對組合物或疫苗之「免疫反應」係在針對所關注組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導之免疫反應之宿主中發生。通常，「免疫反應」包括(但不限於)以下效應中之一或多者：特異性針對包括在所關注組合物或疫苗中之抗原之抗體、B細胞、輔助T細胞及/或細胞毒性T細胞之產生。較佳地，宿主將展示治療性或保護性免疫反應，使得將增強對新感染之抗性及/或降低疾病之臨床嚴重程度。該保護將藉由通常由受感染宿主展示之症狀之減輕或缺乏、受感染宿主中之較快恢復時間及/或降低的病毒效價來證實。術語「重組」及「經遺傳修飾」可互換使用且係指呈其天然形式或結構之多核苷酸或蛋白質之任何修飾、改變或改造或呈其天然環境或周圍之多核苷酸或蛋白質之任何修飾、改變或改造。多核苷酸或蛋白質之修飾、改變或改造可包括(但不限於)一或多個核苷酸或胺基酸之缺失、整個基因之缺失、基因之密碼子最佳化、胺基酸之保守取代、一或多個異源多核苷酸之插入。術語「多價疫苗或組合物」、「組合或組合型疫苗或組合物」及「多價疫苗或組合物」可互換使用且係指含有一種以上組合物或疫苗之組合物或疫苗。多價疫苗或組合物可含有兩種、三種、四種或更多種組合物或疫苗。多價疫苗或組合物可包含重組病毒載體、活性或減毒或殺死的野生型病毒或重組病毒載體及呈活性或減毒或殺死形式之野生型病毒之混合物。本發明之一個實施例提供重組HVT病毒載體，其包含一或多種編碼並表現至少一種禽病原體抗原或多肽之異源多核苷酸。用於重組病毒載體之HVT株可為任何HVT株，包括(但不限於) HVT株FC126 (Igarashi T.等人，J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989)。本發明之另一實施例提供重組痘病毒病毒載體，其包含一或多種編碼並表現至少一種禽病原體抗原或多肽之異源多核苷酸。痘病毒可為牛痘病毒或鳥類痘病毒，例如禽痘病毒及金絲雀痘病毒。金絲雀痘病毒或禽痘病毒株可為減毒株，例如減毒重組金絲雀痘病毒，例如ALVAC (美國專利第5,756,103號)；或減毒禽痘病毒，例如TROVAC (美國專利第5,766,599號、第5,174,993號、第5,505,941號)。ALVAC及TROVAC二者包括已自ALVAC或TROVAC之親代株及/或ALVAC或TROVAC之子代或後代傳代之衍生物。在一個實施例中，可使用重組TROVAC疫苗作為禽流感疫苗。在禽痘之情形下，插入位點係ORF F7及/或F8。F8插入基因座對應於編碼Srinivasan及Tripathy (2005, Veterinary Microbiology 108: 215-223)所述之光解酶之禽痘基因。此基因亦闡述於禽痘基因體之完整序列(基因庫登錄號AF198100.1)中之名稱FPV158下。在金絲雀痘之情形下，插入位點係ORF C3、C5及/或C6；亦參見本文所引用之文件，尤其關於金絲雀痘病毒之彼等。因此，本發明中之病毒載體可為任何適宜重組病毒或病毒載體，例如痘病毒(例如，牛痘病毒、鳥類痘病毒、金絲雀痘病毒、禽痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒等)、腺病毒(例如，人類腺病毒、犬腺病毒)、疱疹病毒(例如犬疱疹病毒)、桿狀病毒、反轉錄病毒等。本發明之另一實施例提供重組NDV病毒載體，其包含一或多種編碼並表現至少一種禽病原體抗原或多肽之異源多核苷酸。NDV株可為任何NDV株，包括(但不限於) Ulster 2C、Queensland V4、Hitchner B1、F (例如，Asplin)、La Sota、株H、Mukteswar、Roakin、Beaudette C、Texas GB、NY鸚鵡70181、Italien、Milano、Herts 33/56及AVINEW^® 。編碼抗原或多肽之基因可為編碼禽流感病毒HA蛋白之彼等。抗原或多肽可為來自禽流感病毒之家禽病原體之任何抗原。禽流感病毒可為任何亞型AIV，包括(但不限於) H5、H7及H9。此外，上文所提及抗原或多核苷酸之同系物意欲在本發明範圍內。如本文所用術語「同系物」包括直向同源物、類似物及同種同源物。術語「類似物」係指具有相同或相似功能、但在不相關生物體中單獨進化之兩種多核苷酸或多肽。術語「直向同源物」係指來自不同物種、但已藉由種化自常見祖先基因進化之兩種多核苷酸或多肽。通常，直向同源物編碼具有相同或相似功能之多肽。術語「同種同源物」係指藉由在基因體內複製相關之兩種多核苷酸或多肽。同種同源物通常具有不同功能，但該等功能可相關。野生型多肽之類似物、直向同源物及同種同源物與野生型多肽之不同之處可在於轉譯後修飾、胺基酸序列差異或二者。具體而言，本發明之同系物通常將展現與上文所述抗原之多核苷酸或多肽序列之全部或一部分至少80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性，且將展現相似功能。在一個實施例中，本發明提供重組HVT或FPV病毒載體，其包含一或多種編碼並表現AIV-HA抗原或多肽之異源多核苷酸。在實施例之一個態樣中，AIV-HA抗原或多肽與具有如SEQ ID NO:2、4、20、21、22、23、24、25、26、27及28中所示之序列之多肽或包含該等多肽中之一者之至少8個或至少10個連續胺基酸的保守變體、對偶基因變體、同系物或免疫原性片段或該等多肽之組合具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。AIV-HA抗原或多肽可在HA1與HA2之間自高致病性禽流感序列(多個鹼性胺基酸：RERRRKR - SEQ ID NO:14)至低致病性禽流感序列(RETR - SEQ ID NO:15)之裂解位點經修飾。在實施例之另一態樣中，異源多核苷酸編碼與具有如SEQ ID NO:2、4、20、21、22、23、24、25、26、27及28中所示之序列之多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之AIV-HA抗原或多肽。在實施例之另一態樣中，異源多核苷酸與具有如SEQ ID NO:1、3、8、9、10、12、13 17或19中所示之序列之多核苷酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。變體包括對偶基因變體。術語「對偶基因變體」係指含有引起蛋白質之胺基酸序列變化且存在於天然群體(例如，病毒物種或變化形式)內之多型性之多核苷酸或多肽。該等天然對偶基因變化通常可引起多核苷酸或多肽之1-5%變化。對偶基因變體可藉由對多個不同物種中之所關注核酸序列測序來鑑別，該測序可容易地藉由使用雜交探針鑑別彼等物種中之相同基因遺傳基因座來實施。任何及所有該等核酸變化及所得胺基酸多型性或變化(其係天然對偶基因變化之結果且不會改變所關注基因之功能活性)意欲在本發明範圍內。關於序列之術語「一致性」可指例如用具有一致核苷酸或胺基酸之位置數除以兩個序列中較短者中之核苷酸或胺基酸數，其中兩個序列之比對可根據Wilbur及Lipman算法(Wilbur及Lipman)來測定。兩個胺基酸序列之序列一致性或序列相似性或兩個核苷酸序列之間之序列一致性可使用Vector NTI軟體包(Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA)來測定。當稱RNA序列與DNA序列相似或具有一定程度之序列一致性或同源性時，認為DNA序列中之胸苷(T)與RNA序列中之尿嘧啶(U)相同。因此，RNA序列在本發明範圍內且可源自DNA序列，認為DNA序列中之胸苷(T)與RNA序列中之尿嘧啶(U)相同。本發明之多核苷酸包括因遺傳密碼(例如具體宿主之最佳化密碼子使用)簡併之序列。如本文所用之「最佳化」係指經遺傳改造以增加其在給定物種中之表現之多核苷酸。為提供編碼AIV-HA多肽之最佳化多核苷酸，AIV-HA蛋白基因之DNA序列可經修飾以1) 包含在特定物種中高表現基因偏好之密碼子；2) 包含該物種中實質上發現的核苷酸鹼基組成中之A+T或G+C含量；3) 形成該物種之起始序列；或4) 消除引起去穩定、不適當多聚腺苷酸化、RNA降解及終止或形成二級結構髮夾或RNA剪接位點之序列。該物種中增加的AIV-HA蛋白表現可藉由利用真核生物及原核生物或特定物種中之密碼子使用之分佈頻率來達成。術語「較佳密碼子使用頻率」係指在使用核苷酸密碼子指定給定胺基酸時具體宿主細胞所展現之偏好性。存在20種天然胺基酸，其中之大多數經一個以上之密碼子指定。因此，本發明包括所有簡併核苷酸序列，只要由核苷酸序列編碼之AIV-HA多肽之胺基酸序列之功能無變化即可。重組/經修飾傳染性病毒對異源多核苷酸之成功表現需要兩個條件。第一，異源多核苷酸必須插入或引入病毒基因體之區域中以使經修飾病毒保持活力。用於表現所插入異源多核苷酸之第二條件係存在容許基因在病毒背景下表現之調控序列(例如：啟動子、增強子、供體及受體剪接位點及內含子、Kozak轉譯起始共有序列、多聚腺苷酸化信號、非轉譯序列元件)。插入位點可為HVT基因體之任何非必需區域，包括(但不限於) ORF UL55之終止密碼子及UL與相鄰重複區域(基因間隔區1，IG1基因座，US5,980,906)、IG2 (基因間隔區2)基因座、IG3 (基因間隔區3)基因座、UL43基因座、US10基因座、US2基因座、SORF3/US2基因座之接合點之間的區域(參見圖2)。一般而言，有利地採用在真核細胞中起作用之強啟動子。啟動子包括(但不限於)立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子、小鼠CMV IE啟動子、天竺鼠CMV啟動子、SV40啟動子、人類疱疹病毒III型醣蛋白B (HHV3gB)啟動子、假狂犬病病毒啟動子(例如醣蛋白X啟動子)、單純疱疹病毒-1 (例如α 4啟動子)、馬立克病病毒(包括MDV-1、MDV-2及HVT)啟動子(例如驅動醣蛋白gC、gB、gE或gI表現之彼等)、傳染性喉頭氣管炎病毒啟動子(例如醣蛋白gB、gE、gI、gD基因之彼等)或其他疱疹病毒啟動子。本發明之一個實施例提供重組HVT載體，其包含編碼並表現AIV-HA抗原或多肽之異源多核苷酸。在實施例之一個態樣中，編碼AIV-HA多肽之多核苷酸可操作連接至具有如SEQ ID NO:5中所示之序列之SV40啟動子，且因此AIV-HA抗原或多肽之表現係由SV40啟動子調控。在實施例之另一態樣中，編碼AIV-HA多肽之多核苷酸可操作連接至具有如SEQ ID NO:16中所示之序列之mCMV啟動子，且因此AIV-HA抗原或多肽之表現係由mCMV啟動子調控。在實施例之另一態樣中，AIV-HA抗原或多肽之表現係由具有如SEQ ID NO:7中所示之序列之合成聚A信號調控。在實施例之另一態樣中，AIV-HA抗原或多肽之表現係由具有如SEQ ID NO:18中所示之序列之SV40聚A調控。在實施例之另一態樣中，編碼AIV-HA多肽之多核苷酸以相反定向可操作連接至具有如中SEQ ID NO:6所示之序列之HHV3gB啟動子，且因此NDV-F抗原或多肽之表現係由HHV3gB啟動子及/或SV40啟動子調控。在一態樣中，編碼AIV-HA多肽之多核苷酸經密碼子最佳化。在另一態樣中，編碼AIV-HA多肽之多核苷酸係野生型DNA。本發明之另一實施例提供重組FPV載體，其包含編碼並表現AIV-HA抗原或多肽之異源多核苷酸。在實施例之一個態樣中，編碼AIV-HA多肽之多核苷酸可操作地連接至具有如SEQ ID NO:11中所示之序列之牛痘H6 (H6)啟動子，且因此AIV-HA抗原或多肽之表現係由H6啟動子調控。在另一實施例中，本發明提供醫藥組合物或疫苗，其包含包括編碼AIV-HA抗原之多核苷酸之HVT或FPV病毒載體及視情況醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、媒劑或佐劑。在另一實施例中，本發明提供醫藥多價組合物或疫苗，其包含包括編碼AIV-HA抗原之多核苷酸之兩種或更多種病毒載體及視情況醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、媒劑或佐劑。病毒載體可為HVT載體或FPV載體。醫藥上或獸醫學上可接受之載劑或佐劑或媒劑或賦形劑為熟習此項技術者所熟知。可用於本發明方法之其他醫藥上或獸醫學上可接受之載劑或佐劑或媒劑或賦形劑包括(但不限於) 0.9% NaCl (例如，鹽水)溶液或磷酸鹽緩衝液、聚-(L-麩胺酸鹽)或聚乙烯基吡咯啶酮。醫藥上或獸醫學上可接受之載劑或媒劑或佐劑或賦形劑可為幫助投與載體(或自本發明載體活體外表現之蛋白質)或幫助轉染或感染及/或改良載體(或蛋白質)保存之任一化合物或化合物之組合。劑量及劑量體積論述於本文一般描述中且亦可由熟習此項技術者無需任何過多實驗根據本發明閱讀結合業內知識來確定。視情況，其他化合物可添加作為醫藥上或獸醫學上可接受之載劑或佐劑或媒劑或賦形劑，包括(但不限於)明礬；CpG寡核苷酸(ODN)，特別是ODN 2006、2007、2059或2135 (Pontarollo R.A.等人，Vet. Immunol. Immunopath , 2002, 84: 43-59；Wernette C.M.等人，Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236；Mutwiri G.等人，Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103)；聚A-聚U、溴化二甲基二(十八烷基)銨(DDA) (「Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach」，Michael F. Powell及Mark J. Newman編輯，Pharmaceutical Biotechnology , 6: 第03頁、第157頁)；N,N-二(十八烷基)-N’,N’-雙(2-羥基乙基)丙二胺(例如AVRIDINE^® ) (同上，第148頁)；卡波姆(carbomer)、幾丁聚醣(參見例如美國專利第5,980,912號)。本發明之醫藥組合物及疫苗可包含一或多種佐劑或基本上由其組成。適用於本發明實踐中之佐劑係(1) 丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物、馬來酸酐及烯基衍生物聚合物，(2) 免疫刺激序列(ISS)，例如具有一或多個非甲基化CpG單元之寡去氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)，(3) 水包油乳液，例如「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995出版之第147頁所述之SPT乳液及同一著作之第183頁所述之乳液MF59，(4) 含有四級銨鹽(例如DDA)之陽離子脂質，(5) 細胞介素，(6) 氫氧化鋁或磷酸鋁，(7) 皂素或(8)本申請案中所引用且以引用方式併入本申請案中之任一文件中所論述之其他佐劑，或(9) 任何組合或其混合物。在一個實施例中，佐劑可包括TS6 TS7、TS8及TS9 (US7,371,395)、LR2、LR3及LR4 (US7,691,368)、TSAP (US20110129494)、TRIGEN™ (Newport Labs)、合成dsRNAs (例如聚-IC、聚-ICLC [HILTONOL^® ])及MONTANIDE™佐劑(W/O、W/O/W、O/W、IMS及Gel；皆由SEPPIC製造)。在一個實施例中，本發明提供投與治療有效量之疫苗或組合物用於遞送靶細胞中重組HVT及FPV載體。治療有效量之確定係熟習此項技術者之常規實驗。本發明之另一態樣係關於誘導動物中針對一或多種抗原之免疫反應或動物中針對一或多種禽病原體之保護性反應的方法，該方法包含用本發明之疫苗或醫藥組合物對動物接種至少一次。本發明之另一態樣係關於在初次-追加(prime-boost)投與方案中誘導動物中針對一或多種抗原之免疫反應或動物中針對一或多種禽病原體之保護性反應的方法，其包含使用至少一種常用多肽、抗原、表位或免疫原之至少一種初次投與及至少一種追加投與。用於初次投與中之免疫組合物或疫苗之性質可相同、可不同於用作追加劑之彼等。本發明之初次-追加方案包含初次投與，隨後至少第二次投與以追加反應。在本發明之初次-追加方案之一個態樣中，投與包含含有並表現活體內禽流感抗原之重組病毒載體之組合物或疫苗，然後投與包含含有並表現活體內禽流感抗原之重組病毒載體之組合物或疫苗。用於初次投與中之重組病毒載體之性質可不同於用作後期追加重組載體之彼等。用於初次投與中之病毒載體可選自HVT或FPV，且用於追加投與中之病毒載體可選自不同於用於初次投與中之病毒載體的HVT或FPV。然而應注意，初次及追加組合物或疫苗可含有相同重組載體。亦應注意，初次及追加組合物或疫苗可為可含有兩種或更多種病毒載體之多價組合物或疫苗。初次-追加方案可包含使用至少一種常用多肽或抗原之至少一次初次投與及至少一次追加投與。初次-追加方案亦可包含使用不同多肽或抗原之至少一次初次投與及至少一次追加投與。初次投與可包含一或多次投與。類似地，追加投與可包含一或多次投與。禽病原體可為新城雞瘟病毒(Newcastle Disease Virus) (NDV)、傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus) (即，IBDV或甘保羅病(Gumboro Disease)病毒)、馬立克病病毒(MDV)、傳染性喉頭氣管炎病毒(ILTV)、禽腦脊髓炎病毒、禽裡奧病毒、禽副黏液病毒、禽間質肺炎病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、禽痘病毒、禽冠狀病毒、禽輪狀病毒、禽小病毒、禽星狀病毒及雞貧血病毒球蟲病(艾美球蟲屬(Eimeria sp. ))、彎曲桿菌屬(Campylobacter sp. )、沙門桿菌屬(Salmonella sp. )、雞敗血性微漿菌(Mycoplasma gallisepticum )、滑膜微漿菌(Mycoplasma synoviae )、巴氏桿菌屬(Pasteurella sp. )、禽桿菌屬(Avibacterium sp. )、大腸桿菌(E. coli )或梭菌屬(Clostridium sp .)。通常，在一日齡時藉由皮下或肌內途徑或卵內(在17-19日齡胚胎中)實施疫苗之一次投與。第二次投與可在第一次投與後5-30天內進行。在日齡雞中可使用多種投與途徑，例如皮下或肌內、真皮內、經皮。卵內疫苗接種可在羊膜囊及/或胚胎中實施。市售卵內及SC投與裝置可用於疫苗接種。組合物或疫苗可含有在活體外或活體內自病毒載體、質體或桿狀病毒產生之約10² 至約10²⁰ 、約10³ 至約10¹⁸ 、約10⁴ 至約10¹⁶ 、約10⁵ 至約10¹² VLP (類病毒顆粒)之劑量。病毒載體可基於任何病毒滴定方法來滴定，該等方法包括(但不限於) FFA (集落形成分析)或FFU (集落形成單位)、TCID₅₀ (50%組織培養物感染劑量)、PFU (斑形成單位)及FAID₅₀ (50%螢光抗體感染劑量)，且在活體外產生之VLP可藉由血球凝集分析、ELISA及電子顯微術來滴定。亦可端視VLP之類型應用其他方法。組合物或疫苗可含有約10^2.0 至約10^10.0 pfu/劑量之病毒載體。劑量體積可介於約0.1 ml與約10 ml之間、約0.1 ml與約5 ml之間。現將藉助以下非限制性實例來進一步闡述本發明。實例使用J. Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014)所述之標準分子生物學技術實施DNA插入物、質體及重組病毒載體之構築。實例1 表現H5N2-HA之重組HVT載體之構築實例1.1 表現H5N2-HA之重組HVT501之構築研究之目標係構築重組HVT病毒，其中含有猿猴病毒40 (SV40)啟動子、禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白及合成聚A尾之表現盒插入HVT病毒中UL55之基因間位點中(圖2)。用於構築體中之親代病毒係HVT FC126。以化學方式合成(GenScript)對應於H5N2-HA序列(由經密碼子最佳化之SEQ ID NO:1編碼之SEQ ID NO:2)之禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白(命名為LPC-HA)。H5N2-HA (LPC-HA)係源自高致病性禽流感A病毒(A/雞/Washington/61-9/2014(H5N2)分離物(基因庫登錄號KP739381.1)。合成HA (LPC-HA)基因在HA1與HA2之間自高致病性禽流感序列(多個鹼性胺基酸：RERRRKR - SEQ ID NO:14)至低致病性禽流感序列(RETR - SEQ ID NO:15)之裂解位點經修飾。啟動子係猿猴病毒40 (SV40)啟動子(SEQ ID NO:5)。插入基因座係HVT中UL55 (IG1)之基因間位點(圖2)。如下文所述構築供體質體pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI (一種含有HVT病毒之UL55側接區域+SV40+合成聚A之插入質體)。雞胚胎纖維母細胞(CEF)用於活體外重組。供體質體構築 為構築供體質體pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI，使用Not I自pUC57 (藉由GeneScript合成)中之LPC-HA H5N2切除涵蓋合成H5N2-HA基因之片段且插入與含有SV40啟動子、NDV-F基因及合成聚A尾之pHVTIG2SVCaFsyn SbfI質體相同之位點中，該pHVTIG2SVCaFsyn SbfI質體亦經Not I消化及CIP處理，以用LPC-HA替代NDV-F基因。使用Qiagens凝膠提取套組凝膠提取經Not I消化之插入物(LPC-HA)及載體(pHVTIG2)且然後連接。使用Top10 Oneshot套組(目錄號C404002, Invitrogen)轉變所連接材料。使細菌群落生長於LBamp培養液中且使用Qiagens MiniSpin Prep套組提取質體。使用Sma I消化針對插入物定向篩選質體。正確的供體質體命名為pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI。將pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI mini-prep質體轉染至6孔板之一個孔上且使用針對禽流感H5N2之雞抗血清(Charles Rivers Laboratories，批號J0210)及抗雞FITC (Sigma，目錄號F8888)實施IFA。驗證瞬時表現後，立即使質體生長於較大規模培養物中且藉由使用Qiagens Maxi Prep套組進行質體提取。在pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI maxi prep及pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI maxi prep (一種先前構築且序列經驗證之質體)上實施Sbf I消化。使用Qiagens凝膠提取套組自pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI質體凝膠提取側接有Sbf I限制酶之SV40 H5N2-HA合成聚A尾表現盒。亦凝膠提取側接有Sbf I限制酶之pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI載體且進行CIP處理。將pHVTIG2SVLPC-HAsyn SbfI表現盒連接至pIG1HHV3gBCaFsyn SbfI載體中。使用Top10 Oneshot套組(目錄號C404002, Invitrogen)轉變所連接材料。使細菌群落生長於LBamp培養液中且使用Qiagens MiniSpin Prep套組提取質體。使用EcoR I+Sma I消化針對插入物定向篩選質體。選擇抗基因體定向質體，使其生長於較大規模培養物中，且藉由使用Qiagens Maxi Prep套組進行質體提取。對此質體進行序列驗證且命名為pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI (圖3)。重組產生 在標準同源重組程序後使用pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI供體質體及自HVT FC126病毒分離之病毒DNA進行次級CEF細胞之共電穿孔。使用300 µl Opti-MEM中之1×10⁷ 個2^o CEF實施共電穿孔且在150伏及950電容下在2 mm電穿孔比色管中電擊。將經轉染細胞接種至96孔板中且培育4天。然後將生長於96孔板中之細胞複製至兩個96孔板中且再培育3天。使用針對禽流感H5N2之雞多株血清將一組96孔板用於IFA以鑑別出含有重組體之陽性孔且將另一組96孔板用於自陽性孔回收受感染細胞。首先藉由96孔板複製及IFA選擇含有大多數IFA陽性斑及最少量IFA陰性斑之孔來實施重組病毒純化方法。然後收穫匹配彼等準則之孔且調節至DMEM+2% FBS中之1 ml。自1 ml原液取出5-20 ul (端視可見斑數而定)且與10 ml DMEM+2% FBS中之1×10⁷ 個CEF混合並等分至新96孔板上以嘗試具有單個HVT斑/孔。在培育3天後複製96孔板且藉由IFA及PCR測試含有斑之孔之重組HVT的存在及親代病毒之不存在藉由IFA及PCR。另外，收穫藉由比較PCR分帶結果似乎具有更多重組病毒之孔且調節至1 ml並等分至新96孔板上(同前文)。將病毒感染細胞純化三輪後，分離表現LPC-HA蛋白之重組HVT且藉由IFA及PCR測試重組病毒之純度以確認親代病毒之不存在。然後使所選重組病毒自96孔板之一個孔(P0)傳代至2×T-25燒瓶(P1)，然後傳代至2×T-75燒瓶(P2)，然後傳代至2×T-150燒瓶(P3)，且最後傳代至3×850 cm² 滾瓶(MSV前原液或P4)。將含有2 ml等份之瓶儲存在液氮中。藉由 PCR 分析重組體 藉由酚/氯仿提取自原液病毒提取DNA；乙醇沈澱，且重懸浮於20 mM HEPES中。PCR引子經設計以特異性鑑別H5N2-HA基因、啟動子、聚A以及來自HVT親代病毒之重組病毒之純度。使用200 µg DNA模板以及表1中所指示之指定引子對實施PCR。PCR循環條件如下(除非另外註明)：94℃ - 2 min；30個循環之94℃ - 30 sec，60℃ - 45 sec，68℃ - 2 min；68℃ - 3 min。表現分析 對於免疫螢光測試，將P4材料以1:100稀釋於培養基中。將約50 µl經稀釋病毒添加至含有1×10⁷ CEF之10 ml DMEM+2% FBS中且然後等分至96孔板中(100 µl/孔)。在37℃+5% CO₂ 下將板培育3天直至病毒斑可見。用95%冰冷丙酮將板固定3分鐘且用水溫和沖洗三次。以1:500添加針對禽流感H5N2之雞抗血清(批號J0210, Charles Rivers Laboratory)且以1:3000添加HVT Mab L78 (批號072103, Merial)並在37℃下將板培育45分鐘。培育後，用PBS將板洗滌三次且以1:500添加FITC抗雞(目錄號F8888, Sigma)並以1:300添加TRITC抗小鼠(目錄號A10037, Life Technologies)。在37℃下將板再培育45分鐘。培育後，用PBS將細胞沖洗三次且用螢光顯微鏡使用螢光黃異氰酸酯(FITC)過濾器及四甲基玫瑰紅異氰酸酯過濾器(TRITC)使其可視化。結果向供體質體pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI之核苷酸及胺基酸序列分配SEQ ID NO，如圖1中所顯示。重組產生及表現分析 將HVT FC126病毒之基因體DNA與pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI供體質體共電穿孔以使用同源重組技術產生重組HVT。藉由多輪斑純化中之免疫螢光陽性孔選擇及PCR篩選自親代HVT病毒分離重組病毒。將斑純化之表現LPC-HA H5N2蛋白之重組HVT病毒(稱為rHVT501)自組織培養物燒瓶放大至3 × 850cm² 滾瓶。在感染後約72 hr後，收穫受感染之CEF。將各等份冷凍於含有10% FBS及10% DMSO之液氮中。在CEF上實施一式三份滴定且對於rHVT501獲得5.75×10⁵ pfu/ml之效價。使用雞抗血清(批號J0210, Charles Rivers Laboratories)及特異性針對HVT之單株抗體(Merial)、隨後使用FITC標記之抗雞IgG (目錄號F8888, Sigma)及TRITC標記之抗小鼠IgG (目錄號A10037, Life Technologies)實施免疫螢光。發現rHVT501之所有所檢查斑皆表現LPC-HA H5N2蛋白(圖4)。rHVT501 之 PCR 分析藉由PCR使用特異性針對HVT側接臂之引子對、SV40啟動子、LPC-HA H5N2基因及合成聚A尾來驗證重組病毒之純度。PCR結果展示，重組病毒rHVT501攜帶預期表現盒且病毒原液不含可檢測量之親代HVT病毒(表1及圖5-6)。表1 引子及預期PCR條帶使用所有引子對之PCR反應產生預期PCR產物及分帶圖案。如上文所顯示，在rHVT501中不存在親代FC126之證據。結論基於PCR測試及免疫螢光分析，rHVT501係在SV40啟動子控制下表現H5N2-HA基因之重組HVT。rHVT501不含任何可檢測到之親代HVT病毒。實例1.2 表現H5N2-HA之重組HVT502之構築研究之目標係構築重組HVT病毒，其中含有呈相反定向(ro)之人類疱疹病毒III型醣蛋白B (HHV3gB)啟動子、猿猴病毒40 (SV40)啟動子、禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白及合成聚A尾之表現盒插入HVT病毒中UL55之基因間位點中(圖2)。用於構築體中之親代病毒係HVT FC126。以化學方式合成(GenScript)對應於H5N2-HA序列(由經密碼子最佳化之SEQ ID NO:1編碼之SEQ ID NO:2)之禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白(命名為LPC-HA)。所用啟動子係呈相反定向(ro)之人類疱疹病毒III型醣蛋白B (HHV3gB)及猿猴病毒40 (SV40)啟動子。插入基因座係HVT中UL55 (IG1)之基因間位點(圖2)。如下文所述構築供體質體pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI (一種含有HVT病毒之UL55側接區域+HHV3gBro+SV40+合成聚A之插入質體)。雞胚胎纖維母細胞(CEF)用於活體外重組。供體質體構築 為構築供體質體pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI，使用Not I自pUC57 (藉由GeneScript合成)中之LPC-HA H5N2切除涵蓋合成H5N2-HA基因之片段且插入與含有呈相反定向之HHV3gB啟動子、SV40啟動子、NDV-F基因及合成聚A尾之pHVTIG1HHV3gBroSVCaFsyn SbfI質體(一種先前構築且序列經驗證之質體)相同之位點中，該pHVTIG1HHV3gBroSVCaFsyn SbfI質體亦經Not I消化及CIP處理，以用LPC-HA替代NDV-F基因。使用Qiagens凝膠提取套組凝膠提取經Not I消化之插入物(LPC-HA)及載體(pHVTIG1)且然後連接。使用Top10 Oneshot套組(目錄號C404002, Invitrogen)轉變所連接材料。使細菌群落生長於LBamp培養液中且使用Qiagens MiniSpin Prep套組提取質體。使用Sma I消化針對插入物定向篩選質體。正確的供體質體命名為pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI。將pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI mini-prep質體轉染至6孔板之一個孔上且使用針對禽流感H5N2之雞抗血清(Charles Rivers Laboratories，批號J0210)及抗雞FITC (Sigma，目錄號F8888)實施IFA。驗證瞬時表現後，立即使質體生長於較大規模培養物中且藉由使用Qiagens Maxi Prep套組進行質體提取。對此質體進行序列驗證且命名為pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI (圖7)。重組產生 遵循如實例1.1中所述之同源重組程序來製備重組rHVT502。藉由 PCR 分析重組體 實施如實例1.1中所述之PCR分析程序以驗證rHVT502。表現分析 實施如實例1.1中所述之表現分析以分析rHVT502之表現。結果向供體質體pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI之核苷酸及胺基酸序列分配SEQ ID NO，如圖1中所顯示。重組產生及表現分析 將HVT FC126病毒之基因體DNA與pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI供體質體共電穿孔以使用同源重組技術產生重組HVT。藉由多輪斑純化中之免疫螢光陽性孔選擇及PCR篩選自親代HVT病毒分離重組病毒。斑純化之表現LPC-HA H5N2蛋白之重組HVT病毒(稱為vHVT502)自組織培養物燒瓶放大至2 × 850cm² 滾瓶。在感染後約72 hr後，收穫受感染之CEF。將各等份冷凍於含有10% FBS及10% DMSO之液氮中。在CEF上實施一式三份滴定且對於vHVT502獲得8.25×10⁵ pfu/ml之效價。使用雞抗血清(批號J0210, Charles Rivers Laboratories)及特異性針對HVT之單株抗體、隨後使用FITC標記之抗雞IgG (目錄號F8888, Sigma)及TRITC標記之抗小鼠IgG (目錄號A10037, Life Technologies)實施免疫螢光。發現vHVT502之所有所檢查斑皆表現LPC-HA H5N2蛋白(圖8)。rHVT502 之 PCR 分析藉由PCR使用特異性針對HVT側接臂之引子對、啟動子、LPC-HA H5N2基因及合成聚A尾來驗證重組病毒之純度。PCR結果展示，重組病毒rHVT502攜帶預期表現盒且病毒原液不含可檢測量之親代HVT病毒(表2及圖9-10)。表2 引子及預期PCR條帶使用所有引子對之PCR反應產生預期PCR產物及分帶圖案。如圖10中所顯示，在rHVT502中不存在親代FC126之證據。結論基於PCR測試及免疫螢光分析，rHVT502係在相反定向之HHV3gB及SV40啟動子控制下表現H5N2-HA基因之重組HVT。rHVT502不含任何可檢測到之親代HVT病毒。實例1.3 表現突變體H5N2-HA之重組HVT503之構築研究之目標係構築重組HVT病毒，其中含有猿猴病毒40 (SV40)啟動子、禽流感病毒突變體血球凝集素(HA)醣蛋白及合成聚A尾之表現盒插入HVT病毒中UL55之基因間位點中(圖2)。所用親代病毒係HVT FC126。以化學方式合成(GenScript)對應於H5N2-HA序列(由SEQ ID NO:3編碼之SEQ ID NO:4)之突變禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白(命名為Mut-HA H5N2)。H5N2-HA (Mut-HA H5N2)係源自高致病性禽流感A病毒(A/雞/Washington/61-9/2014(H5N2)分離物(基因庫登錄號KP739381.1)。改變此合成基因之合成HA醣蛋白裂解位點以匹配低致病性裂解位點序列。H5N2-HA (Mut-HA H5N2)進一步經修飾以包括三個胺基酸突變S136N、D171N、S239N (或在不含信號肽之成熟HA蛋白中，S120N、D155N及S223N，Hoffmann等人，2005, PNAS, 102(36)，第12915-12920頁)。將猿猴病毒40 (SV40)啟動子用於構築體中。插入基因座係HVT中UL55之基因間位點(參照圖2)。如下文所述製備供體質體pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI (一種含有HVT病毒之UL55側接區域+SV40+合成聚A之插入質體)。雞胚胎纖維母細胞(CEF)用於活體外重組。供體質體構築 使用Not I自pUC57 (藉由GeneScript合成)中之3 Mut-HA H5N2切除涵蓋合成H5N2-HA基因之片段且插入與含有SV40啟動子、NDV-F基因及合成聚A尾之pHVTIG2SVCaFsyn SbfI質體相同之位點中，該pHVTIG2SVCaFsyn SbfI質體亦經Not I消化及CIP處理，以用3 Mut-HA替代NDV-F基因。使用Qiagens凝膠提取套組凝膠提取經Not I消化之插入物(3 Mut-HA)及載體(pHVTIG2)且然後連接。使用Top10 Oneshot套組(目錄號C404002, Invitrogen)轉變所連接材料。使細菌群落生長於LBamp培養液中且使用Qiagens MiniSpin Prep套組提取質體。使用Sma I消化針對插入物定向篩選質體。正確的供體質體命名為pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI。將pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI mini-prep質體轉染至6孔板之一個孔上且使用針對禽流感H5N2之雞抗血清(Charles Rivers Laboratories)及抗雞FITC (Sigma，目錄號F8888)實施IFA。驗證瞬時表現後，立即使質體生長於較大規模培養物中且藉由使用Qiagens Maxi Prep套組進行質體提取。在pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI maxi prep及pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI maxi prep (一種先前構築且序列經驗證之質體)上實施Sbf I消化。使用Qiagens凝膠提取套組自pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI質體凝膠提取側接有Sbf I限制酶之SV40 H5N2-HA合成聚A尾表現盒。亦凝膠提取側接有Sbf I限制酶之pIG1HHV3gBroCaFoptsyn SbfI載體且進行CIP處理。將pHVTIG2SVMut-HAsyn SbfI表現盒連接至pIG1HHV3gBCaFsyn SbfI載體。使用Top10 Oneshot套組(目錄號C404002, Invitrogen)轉變所連接材料。使細菌群落生長於LBamp培養液中且使用Qiagens MiniSpin Prep套組提取質體。使用EcoR I+Sma I消化針對插入物定向篩選質體。選擇抗基因體定向質體，使其生長於較大規模培養物中，且藉由使用Qiagens Maxi Prep套組進行質體提取。對此質體進行序列驗證且命名為pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI (圖11)。重組產生 遵循實例1.1中所述之同源重組程序來製備重組rHVT503。藉由 PCR 分析重組體 實施實例1.1中所述之PCR程序來驗證rHVT503。表現分析 使用實例1.1中所述之表現分析程序。結果向供體質體pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI之核苷酸及胺基酸序列分配SEQ ID NO，如圖1中所顯示。重組產生及表現分析 將HVT FC126病毒之基因體DNA與pHVTIG1HHV3gBroSVMut-HAsyn SbfI供體質體共電穿孔以使用同源重組技術產生重組HVT。藉由多輪斑純化中之免疫螢光陽性孔選擇及PCR篩選自親代HVT病毒分離重組病毒。將斑純化之表現3 Mut-HA H5N2蛋白之重組HVT病毒(稱為vHVT503)自組織培養物燒瓶放大至2 × 850cm² 滾瓶。在感染後約72 hr後，收穫受感染之CEF。將各等份冷凍於含有10% FBS及10% DMSO之液氮中。在CEF上實施一式三份滴定且對於vHVT503獲得3×10⁵ pfu/ml之效價。使用雞抗血清(批號J0210, Charles Rivers Laboratories)及特異性針對HVT之單株抗體、隨後使用FITC標記之抗雞IgG (目錄號F8888, Sigma)及TRITC標記之抗小鼠IgG (目錄號A10037, Life Technologies)實施免疫螢光。發現vHVT503之所有所檢查斑皆表現LPC-HA H5N2蛋白(圖12)。rHVT503 之 PCR 分析藉由PCR使用特異性針對HVT側接臂之引子對、SV40啟動子、3 Mut-HA H5N2基因及合成聚A尾來驗證重組病毒之純度。PCR結果展示，重組病毒vHVT503攜帶預期表現盒且病毒原液不含可檢測量之親代HVT病毒(表3及圖13-14)。表3 引子序列及預期PCR條帶使用所有引子對之PCR反應產生預期PCR產物及分帶圖案。如圖14中所顯示，在rHVT503中不存在親代FC126之證據。結論基於PCR測試及免疫螢光分析，rHVT503係在SV40啟動子控制下表現H5N2-HA基因之重組HVT。rHVT503不含任何可檢測到之親代HVT病毒。實例1.4 表現突變體H5N2-HA之重組HVT510之構築研究之目標係構築重組HVT病毒，其中含有mCMV啟動子、禽流感病毒突變體血球凝集素(HA)醣蛋白及SV40聚A尾之表現盒插入HVT病毒中UL55之基因間位點中(圖2)。用於構築體中之親代病毒係HVT FC126。以化學方式合成(GenScript)對應於H5N2-HA序列(由未經密碼子最佳化之野生型DNA SEQ ID NO:17編碼之SEQ ID NO:2)之禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白(命名為LPC-HA)。啟動子係mCMV啟動子(SEQ ID NO:16)。插入基因座係HVT中UL55 (IG1)之基因間位點(圖2)。如下文所述構築供體質體pCD046-H5N2 HA，其係一種含有HVT病毒之UL55側接區域+ mCMV啟動子+ SV40聚A (SEQ ID NO:18)之插入質體。雞胚胎纖維母細胞(CEF)用於活體外重組。在此構築體中，H5N2-HA之表現係由mCMV啟動子驅動且H5N2-HA基因係未經密碼子最佳化之野生型DNA。強啟動子(如CMV)及密碼子最佳化導致構築體之遺傳不穩定性。供體質體構築 藉由基因合成(GenScript)產生「pUC57-H5N2 HA」質體(4424 bp)之H5N2 HA基因(基因庫登錄號-KP739381) (1704 bp)且將其選殖至pUC57之Eco RV位點中。用Not I消化供體質體pCD046且進行CIP處理，並凝膠提取6.6 kb片段。亦用Not I消化pUC57-H5N2 HA且凝膠提取含有H5N2 HA之1.7 kb片段。將6.6 kb及1.7 kb片段連接以產生pCD046-H5N2 HA (參見圖15)。重組產生 遵循實例1.1中所述之同源重組程序來製備重組rHVT510。rHVT510 之 PCR 分析實施實例1.1中所述之PCR程序來驗證rHVT510。表現分析 使用實例1.1中所述之表現分析程序。結果向供體質體pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI之核苷酸及胺基酸序列分配SEQ ID NO，如圖1中所顯示。重組病毒 在兩輪斑純化後，分離純的重組病毒(rHVT510)。藉由IFA及PCR測試rHVT510以驗證適宜轉基因插入物以及無殘餘親代病毒。遺傳穩定性分析結果顯示，rHVT510在大於12代後穩定。rHVT510 之 PCR 分析 PCR引子經設計以鑑別AIV H5N2 HA、mCMV啟動子、SV40聚A尾、HVT病毒之側接重組臂之存在。使用約200 ng DNA模板以及表3.1及圖15B中所指示之引子對實施PCR擴增。表3.1 引子序列及預期PCR條帶使用表3.1中所列示之多個引子之PCR擴增確認，rHVT510具有預期擴增圖譜及擴增子(圖15C)。確認rHVT510係在mCMV啟動子控制下表現H5N2-HA基因之重組HVT。rHVT510不含任何可檢測到之親代HVT病毒。實例2 表現H5N2-HA之重組禽痘病毒載體之構築實例2.1 表現H5N2-HA之重組FPV3003之構築研究之目標係構築重組禽痘病毒，其中表現盒含有牛痘H6啟動子及禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白替代禽痘病毒中之FPV158 CDS (亦稱為F8) (圖16)。用於構築體中之親代病毒係減毒禽痘病毒(TROVAC)。以化學方式合成(GenScript)對應於H5N2-HA序列(由SEQ ID NO:1編碼之SEQ ID NO:2)之禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白。改變此合成基因之HA醣蛋白裂解位點以匹配低致病性裂解位點序列。啟動子係牛痘H6 (H6)啟動子(SEQ ID NO:11)。插入基因座係FPV158 CDS (F8)替代物。如下文所述構築供體質體pF8 H6pLPC-HA H5N2 (一種含有禽痘病毒之FPV158 (F8)側接區域+H6之質體)。雞胚胎纖維母細胞(CEF)用於活體外重組。供體質體構築 使用Nru I及Xho I自pUC57 (藉由GeneScript合成)中之LPC-HA H5N2切除涵蓋合成H5N2-HA基因之片段且插入與含有H6啟動子之pF8 H6p質體(一種先前構築且序列經驗證之質體，Merial)相同之位點中(圖17)，該pF8 H6p質體亦經Nru I及Xho I消化。使用Qiagens凝膠提取套組凝膠提取經Nru I及Xho I消化之插入物(LPC-HA)及載體(pF8 H6)且然後連接。使用Top10 Oneshot套組(目錄號C404002, Invitrogen)轉變所連接材料。使細菌群落生長於LBamp培養液中且使用Qiagens MiniSpin Prep套組提取質體。使用Sma I消化針對插入物篩選6個miniprep質體。所有miniprep質體皆具有預期限制內核酸酶圖譜。使1號miniprep生長於較大規模培養物中且藉由使用Qiagens Maxi Prep套組進行質體提取。對此質體進行序列驗證且命名為pF8 H6pLPC-HA H5N2。重組產生 遵循如實例1.1中所述之同源重組程序來製備重組rFPV3003。藉由 PCR 分析重組體 實施如實例1.1中所述之PCR分析程序以驗證rFPV3003。表現分析 實施如實例1.1中所述之表現分析以分析rFPV3003之表現。結果向供體質體pF8 H6pLPC-HA H5N2之核苷酸及胺基酸序列分配SEQ ID NO，如圖1中所顯示。使用如上文所述之免疫螢光技術，發現重組斑表現H5N2之血球凝集素基因。藉由PCR使用特異性針對禽痘側接臂之引子對(圖18)來驗證重組病毒之純度。PCR結果證明重組病毒rFP3003攜帶預期表現盒且病毒原液不含可檢測量之親代禽痘病毒(圖19)。結論基於PCR測試及免疫螢光分析，rFPV3003係在牛痘H6啟動子控制下表現H5N2-HA基因之重組FPV。 rFPV3003不含任何可檢測之親代FPV。實例2.2 表現突變體H5N2-HA之重組FP3004之構築研究之目標係構築重組禽痘病毒，其中表現盒含有牛痘H6啟動子及禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白替代禽痘病毒中之FPV158 CDS (圖16)。所用親代病毒係減毒禽痘病毒(TROVAC)。以化學方式合成(GenScript)對應於突變體H5N2-HA序列(由SEQ ID NO:3編碼之SEQ ID NO:4)之禽流感病毒血球凝集素(HA)醣蛋白。改變此合成基因之HA醣蛋白裂解位點以匹配低致病性裂解位點序列。使用牛痘H6 (H6)啟動子於構築體中。插入基因座係FPV158 CDS替代物(F8)。如下文所述製備供體質體pF8 H6p3Mut-HA H5N2 (一種含有禽痘病毒之FPV158 (F8)側接區域+H6之質體)。使用雞胚胎纖維母細胞(CEF)於活體外重組。供體質體構築 使用Nru I及Xho I自pUC57 (由GeneScript合成)中之3 Mut-HA H5N2切除涵蓋合成突變體H5N2-HA基因之片段且插入與含有H6啟動子之pF8 H6p質體(Merial)相同位點中(圖20)，該pF8 H6p質體亦經Nru I及Xho I消化。使用Qiagens凝膠提取套組以凝膠提取Nru I及Xho I消化之插入物(3 Mut-HA)及載體(pF8 H6)及然後接合。使用Top10 Oneshot套組(目錄號C404002, Invitrogen)轉變接合物質。使細菌群落生長於LBamp培養液中且使用Qiagens MiniSpin Prep套組提取質體。使用Sma I消化針對插入物篩選6個miniprep質體。所有miniprep質體皆具有預期限制內核酸酶圖譜。使1號miniprep生長於較大規模培養物中，且藉由使用Qiagens Maxi Prep套組進行質體提取。對此質體進行序列驗證且命名為pF8 H6p3Mut-HA H5N2。重組產生 遵循如實例1.1中所述之同源重組程序來製備重組rFP3004。藉由 PCR 分析重組體 實施如實例1.1中所述之PCR分析程序以驗證rFP3004。表現分析 實施如實例1.1中所述之表現分析以分析rFP3004之表現。結果向供體質體pF8 H6p3Mut-HA H5N2之核苷酸及胺基酸序列分配SEQ ID NO，如圖1中所顯示。使用如上文所述之免疫螢光技術，發現重組斑皆表現H5N2之血球凝集素基因。藉由PCR使用特異性針對禽痘側接臂之引子對(圖21)來驗證重組病毒之純度。PCR結果展示，重組病毒rFP3004攜帶預期表現盒且病毒原液不含可檢測量之親代禽痘病毒(圖22)。結論基於PCR測試及免疫螢光分析，rFPV3004係在牛痘H6啟動子控制下表現突變體H5N2-HA基因之重組FPV。rFPV3004不含任何可檢測到之親代FPV。實例3 SPF雞中之免疫原性及激發研究在無特定病原體(SPF)之雞中實施免疫原性及激發研究，該等雞在一日齡時用HVT-AIV重組疫苗以0.2 ml/雞、3100 pfu/劑量經皮下疫苗接種。將20隻雞分配至每一疫苗組(參見表4)。包括僅經稀釋劑疫苗接種之雞作為激發對照。表4 疫苗接種方案 ^a rHVT-501：研究1^b rHVT-502; rHVT-503：研究2激發研究根據表4對一日齡雞進行疫苗接種。在4週齡時，用Tk/MN/12582/15 H5N2以10^6.0 EID₅₀ /雞激發雞。激發後，每日觀察雞之發病率及死亡率，且將患病之雞計數為感染流感。在激發後(DPC)第2及第4天在1.5 ml含有抗微生物化合物(100 μg/mL慶大黴素(gentamicin)、100單位/mL青黴素(penicillin)及5 μg/mL兩性黴素(amphotericin) B)之腦心浸液(BHI)培養基(Becton-Dickinson, Sparks, MD)中收集口咽拭子以測定來自呼吸道之激發病毒脫落。在42日齡及56日齡時對所有組之剩餘雞採血以收集血清。在56日齡時用靜脈內戊巴比妥鈉(100 mg/kg體重)對鳥實施安樂死。如表5及6中所顯示，對於用Tk/MN/12582/15 H5N2激發之組，令人驚奇的是，表現H5N2 HA (LPC-HA H5N2)之rHVT501在雞中提供優於含有突變體H5N2 HA基因之rHVT503之保護。rHVT501給予針對臨床疾病之100%保護，而rHVT502及rHVT503分別給予針對臨床疾病之45-50%及15%保護。與對照相比，所有三種rHVT重組疫苗提供針對禽流感病毒感染之保護。表5 rHVT-AIV效能之結果 - 在激發後存活之鳥數量表6 rHVT-AIV效能之結果 - 激發後之存活% 在2及4 dpc時使用定量RT-PCR測試對取自存活鳥之口咽及泄殖腔拭子樣品研究病毒脫落。藉由定量即時反轉錄酶聚合酶鏈式反應(qRRT-PCR)測試拭子之禽流感病毒，且基於使用激發病毒稀釋系列產生之迴歸線將qRRT-PCR循環臨限值轉化成雞受精卵中之等效感染效價(Lee等人，Journal of Virological Methods 119(2):151-158)。簡言之，藉由將250 μl拭子培養基添加至750 μl Trizol LS (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)中、然後經由渦旋混合、在室溫下培育10 min且然後添加200 μl氯仿自口咽拭子材料提取RNA。將樣品再渦旋，在室溫下培育10 min，且然後在約12,000×g下離心15 min。收集水相且用MagMAX AI/ND病毒RNA分離套組(Ambion, Inc. Austin TX)根據套組說明書使用KingFisher磁性顆粒處理系統(Thermo Scientific, Waltham, MA)分離RNA。使用禽流感病毒激發株產生用於定量標準之RNA。將尿囊液病毒原液稀釋於BHI培養液(Becton-Dickinson)中且在雞受精卵中在稀釋時根據標準方法滴定(Swayne等人，2008, Avian influenza. Isolation and Identification of Avian Pathogens.第5版，第128-134頁)。自如針對拭子材料所述之滴定病毒之10倍稀釋物提取全病毒RNA。如先前所述實施流感基質基因之qRRT-PCR (Lee等人，2004)。基於藉由Smart Cycler II (Cepheid, Inc. Sunnyvale, CA)軟體計算或標準曲線等式外推之標準曲線計算樣品中之病毒效價。除提供針對臨床疾病之100%保護外，rHVT501亦顯著減少病毒脫落，如藉由10 ul拭子材料中之病毒拷貝數所測定，如圖23中所顯示。實例4 SPF雞中針對同源及異源AIV激發之免疫原性及激發研究研究之目標係測定投與一日齡SPF雞之rHVT501及rHVT510對用兩種(同源及異源)高致病性禽流感病毒(HPAIV)株激發之效能。將72隻一日齡雞分成6組(參見表7)。根據表8中所概述之時間線實施研究。表7 研究組 * 在研究日28時用兩株HPAIV H5中之一者藉由後鼻孔內途徑以約10^6.0 EID₅₀ /劑量激發鳥：「同源」 A/火雞/Minnesota/12582/2015; 分枝2.3.4.4; [Minnesota/12582]；或「異源」 - (A/Egypt/N04915/2014, H5N1)。表8 研究時間線 *僅在研究日30及32自在該等天活著之所有鳥亦及自在該等具體研究日發現死亡之鳥收集拭子樣品。不對在任何其他研究日發現死亡或安樂死之任何其他鳥取樣。觀察所有鳥之典型HPAIV臨床體徵，包括激發後14天之死亡率。臨床體徵包括：嚴重抑鬱症、神經或呼吸系統體徵及/或死亡。在觀察時段結束時(研究日42)，將對存活者採血用於血清學且終止。將在激發前及後收集之血清用於血球凝集抑制(HI)分析以測定針對所選AIV株之抗體含量。亦將激發前血清等份用於交叉中和測試。藉由即時RT-PCR在所收集拭子中遵循常規程序測試HPAIV病毒負荷。使用MagMAX™-96 AI/ND病毒RNA分離套組® (Ambion, Inc.)遵循製造商之說明書提取病毒RNA。藉由靶向流感基質基因之一步qRRT-PCR使用7500 FAST即時PCR系統(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)量化所得病毒RNA提取物。利用自激發病毒之相同滴定原液之稀釋物提取之RNA建立病毒RNA量化之標準曲線。對於分析，認為所有陰性樣品低於對每一病毒建立之檢測限值。結果死亡率結果顯示於下表9中。結果展示，rHVT501及rHVT510二者提供針對同源AIV激發之100%保護，rHVT510提供針對異源AIV激發之100%保護且rHVT501提供針對異源AIV激發之90%保護。表9 每組中對HPAIV呈陽性之鳥數量及保護/感染% * 在研究日28時藉由後鼻孔內途徑用A/火雞/Minnesota/12582/2015; 分枝2.3.4.4; [Minnesota/12582]以10^6.9 EID₅₀ /劑量(組1-3)或用A/Egypt/N04915/2014, H5N1, 分枝2.2.1; [Egypt/2014]以10^5.7 EID₅₀ /劑量(組4-6)激發所有鳥。血清學結果顯示於圖23B及23C及表10及11中。表10 血球凝集抑制(HI)分析結果 - A/火雞/Minnesota/12582/2015 (H5N2)同源激發陽性*：大於4 log2 GMT視為陽性。 -**：鳥未存活於激發。表11 血球凝集抑制(HI)分析結果 - A/Egypt/N04915/2014 (H5N1)異源激發 HI結果顯示，對於激發前反應，總共12隻鳥具有rHVT501組中之大於截止值對rHVT510組中之10的HI效價，且對於激發後反應，各別數值為18及14。異源激發後反應之差異指示極少鳥在rHVT510組中反應，此乃因疫苗已充分控制激發病毒之複製。與rHVT501組相比rHVT510組中HI效價之較低值亦指示激發病毒不能容易地複製。病毒脫落結果顯示於圖23D及23E及表12及13中。表12 病毒脫落結果 - A/火雞/Minnesota/12582/2015 (H5N2)同源激發 *：2.0 = 檢測下限. 陰性值為1.9 表13 病毒脫落結果 - A/Egypt/N04915/2014 (H5N1)異源激發 *: 1.7 = 檢測下限. 陰性值為1.6 表12-13及圖23D-23E展示，rHVT501及rHVT510二者減少疫苗接種鳥中之病毒脫落。在同源及異源激發研究二者中，rHVT501及rHVT510組中之平均病毒脫落遠低於假組中之病毒脫落。病毒脫落結果顯示，在A/火雞/Minnesota/12582/2015 (H5N2)同源激發研究中，在2dpc及4dpc時rHVT510組中之鳥皆未(0/10)脫落任何病毒，且在2dpc及4dpc時rHVT501組中分別有一隻(1/10)及四隻(4/10)鳥脫落病毒。假組中之所有(10/10)皆脫落病毒。病毒脫落結果確認rHVT510已充分控制激發病毒之複製以使得激發病毒不能容易地複製之HI結果。實例5 含有母源性抗體(MDA)之童子雞中之免疫原性及激發研究研究之目標係評估在MDA陽性童子雞中兩種異源疫苗之初次-追加投與(兩次投與)或兩種異源疫苗之同時投與(一次投與)以克服MDA且增加免疫反應。異源疫苗可為不同類型之疫苗，例如HVT AIV-HA疫苗或FPV AIV-HA疫苗。用單獨rHVT501對含有AI H5 MDA之童子雞進行卵內或一日齡疫苗接種且在3週後用表現流感HA之重組NDV (rNDV-H5)進行追加免疫以確定該兩種候選疫苗之間存在協同作用。在追加免疫後3週(6週齡)用Tk/MN/12582/15 H5N2以10^6.0 EID₅₀ /雞藉由鼻內途徑激發鳥。在2及4 DPC時獲取泄殖腔及口咽拭子以評估對病毒脫落之影響，如先前所述。 *** 鑒於已詳細闡述本發明之較佳實施例，應理解，由上述實例界定之本發明並不限於上文描述中所述之具體細節，此乃因在不背離本發明精神或範圍下其許多明顯變化形式係可能的。本文所引用或提及之所有文件(「本文引用文件」)及本文引用文件中所引用或提及之所有文件以及用於本文所提及任何產品或以引用方式併入本文中之任何文件中之任何製造商之說明書、描述、產品說明及產品圖表皆以引用方式併入本文中，且可用於本發明實踐中。

藉助實例給出且不欲將本發明限於所述特定實施例之以下詳細描述可結合以引用方式併入本文中之附圖來理解，其中：圖1A及1B繪示顯示分配至每一DNA及蛋白質序列之SEQ ID NO之表。圖2繪示HVT之基因體結構及其插入位點。顯示UL55插入位點。圖3繪示pHVTIG1SVLPC-HAsyn SbfI質體圖譜。圖4繪示表現LPC-HA H5N2蛋白之重組vHVT501病毒之雙重免疫螢光染色。圖5繪示引子結合位點之示意圖。圖6繪示鑑別rHVT501之PCR結果。圖7繪示pHVTIG1HHV3gBroSVLPC-HAsyn SbfI質體圖譜。圖8繪示表現LPC-HA H5N2蛋白之重組vHVT502病毒之雙重免疫螢光染色。圖9繪示引子結合位點之示意圖。圖10繪示鑑別rHVT502之PCR結果。圖11繪示pHVTIG1SVMut-HAsyn SbfI質體圖譜。圖12繪示表現3 Mut-HA H5N2蛋白之重組vHVT503病毒之雙重免疫螢光染色。圖13繪示引子結合位點之示意圖。圖14繪示鑑別rHVT503之PCR結果。圖15A繪示pCD046-H5N2 HA質體圖譜。圖15B繪示引子結合位點之示意圖。圖15C繪示鑑別rHVT510之PCR結果。圖16繪示禽痘病毒(TROVAC)基因體內之F8插入位點之位置之示意圖。圖17繪示禽痘病毒供體質體pF8 H6pLPC-HA H5N2之選殖步驟。圖18繪示質體pF8 H6pLPC-HA H5N2之引子結合位點之示意圖。圖19繪示鑑別rFPV3003之PCT結果。圖20繪示禽痘病毒供體質體pF8 H6p3Mut-HA H5N2之選殖步驟。圖21繪示質體pF8 H6p3Mut-HA H5N2之引子結合位點之示意圖。圖22繪示鑑別rFPV3004之PCT結果。圖23A繪示rHVT-H5病毒脫落數據，以RNA拷貝數/10 ul表示。圖23B繪示A/火雞/Minnesota/12582/2015 (H5N2)同源激發之血清學結果。圖23C繪示A/Egypt/N04915/2014 (H5N1)異源激發之血清學結果。圖23D繪示A/火雞/Minnesota/12582/2015 (H5N2)同源激發之病毒脫落結果。圖23E繪示A/Egypt/N04915/2014 (H5N1)異源激發之病毒脫落結果。圖24A-24G繪示DNA及蛋白質序列比對。

Claims

一種疫苗，其包含一或多種重組病毒載體，該等重組病毒載體包含至少一或多種編碼並表現至少一種禽流感病毒抗原之異源多核苷酸。
如請求項1之疫苗，其中該重組病毒載體係火雞疱疹病毒(HVT)或禽痘病毒(FPV)。
如請求項1之疫苗，其中該重組病毒載體包含編碼並表現HA抗原之異源多核苷酸，該HA抗原與如SEQ ID NO:2、4、20、21、22、23、24、25、26、27或28中所示之胺基酸序列具有至少80%序列一致性。
如請求項1之疫苗，其中該重組病毒載體包含與如SEQ ID NO:1、3、8、9、10、12、13、17或19中所示之序列具有至少70%序列一致性之異源多核苷酸。
如請求項1之疫苗，其中編碼HA抗原之多核苷酸可操作地連接至選自由以下組成之群之啟動子：立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子、天竺鼠CMV啟動子、SV40啟動子、人類疱疹病毒III型醣蛋白B (HHV3gB)啟動子、假狂犬病病毒啟動子(諸如醣蛋白X啟動子之假狂犬病病毒啟動子)、單純疱疹病毒-1 α 4啟動子、馬立克病(Marek's Disease)病毒醣蛋白A (或gC)啟動子、馬立克病病毒醣蛋白B啟動子、馬立克病病毒醣蛋白E啟動子、馬立克病病毒醣蛋白I啟動子、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白B、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白E啟動子、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白D啟動子、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白I啟動子、牛痘H6及其組合。
如請求項1之疫苗，其中編碼HA抗原之多核苷酸插入選自由以下組成之群之區域中：HVT或FPV基因體上之IG1基因座(UL55)、IG2基因座、IG3基因座、UL43基因座、US10基因座、SORF3/US2基因座、F7基因座、F8基因座。
如請求項1之疫苗，其中該禽流感抗原包含具有如SEQ ID NO:15中所示序列之突變HA裂解區。
如請求項1之疫苗，其中組合物進一步包含第二病毒載體，其包含編碼並表現至少一種禽流感病毒抗原之異源多核苷。
如請求項8之疫苗，其中該第二病毒載體選自火雞疱疹病毒(HVT)或禽痘病毒(FPV)。
如請求項8之疫苗，其中該第二病毒載體包含編碼並表現HA抗原之異源多核苷酸，該HA抗原與如SEQ ID NO:2、4、20、21、22、23、24、25、26、27或28中所示之胺基酸序列具有至少80%序列一致性。
如請求項8之疫苗，其中該第二病毒載體包含與如SEQ ID NO:1、3、8、9、10、12、13、17或19中所示之序列具有至少70%序列一致性之異源多核苷酸。
如請求項1之疫苗，其中組合物或疫苗進一步包含醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、媒劑或佐劑。
一種重組病毒載體，其包含一或多種編碼並表現至少一種禽流感病毒抗原之異源多核苷酸。
如請求項13之重組病毒載體，其中該重組病毒載體係火雞疱疹病毒(HVT)或禽痘病毒(FPV)。
如請求項13之重組病毒載體，其中該重組病毒載體包含編碼並表現HA抗原之異源多核苷酸，該HA抗原與SEQ ID NO:2、4、16、17、18、19、20、21、22、23或24中所示之胺基酸序列具有至少80%序列一致性。
如請求項13之重組病毒載體，其中該重組病毒載體包含與SEQ ID NO:1、3、8、9、10、12、13、17或19中所示之序列具有至少70%序列一致性之異源多核苷酸。
如請求項13之重組病毒載體，其中編碼HA抗原之多核苷酸可操作地連接至選自由以下組成之群之啟動子：立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子、小鼠CMV IE啟動子、天竺鼠CMV啟動子、SV40啟動子、人類疱疹病毒III型醣蛋白B (HHV3gB)啟動子、假狂犬病病毒啟動子(諸如醣蛋白X啟動子之假狂犬病病毒啟動子)、單純疱疹病毒-1 α 4啟動子、馬立克病病毒醣蛋白A (或gC)啟動子、馬立克病病毒醣蛋白B啟動子、馬立克病病毒醣蛋白E啟動子、馬立克病病毒醣蛋白I啟動子、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白B、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白E啟動子、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白D啟動子、傳染性喉頭氣管炎病毒醣蛋白I啟動子、牛痘H6及其組合。
如請求項13之重組病毒載體，其中編碼HA抗原之多核苷酸插入選自由以下組成之群之區域中：該HVT或FPV基因體上之IG1基因座(UL55)、IG2基因座、IG3基因座、UL43基因座、US10基因座、SORF3/US2基因座、F7基因座、F8基因座。
如請求項13之重組病毒載體，其中該禽流感抗原包含具有如SEQ ID NO:15中所示序列之突變HA裂解區。
一種如請求項1之組合物或如請求項13之載體之用途，其用於製造用來對動物進行疫苗接種或用來誘導動物針對禽流感病原體之免疫原性或保護性反應的藥劑。
如請求項20之用途，其中該藥劑之投與包含初次-追加(prime-boost)投與方案。
如請求項21之用途，其中該初次-追加投與包含初次投與包含一或多種選自由HVT及FPV組成之群之病毒載體之組合物或疫苗或多價組合物或疫苗，及追加投與包含一或多種選自由HVT及FPV組成之群之病毒載體之組合物或疫苗或多價組合物或疫苗，用於該加強投與之病毒載體與用於該初次投與之病毒載體相同或不同。
如請求項20之用途，其中該動物係禽。