TW201828957A

TW201828957A - 體幹細胞用於降低腦啡肽酶位準的用途

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Publication number: TW201828957A
Application number: TW106145400A
Authority: TW
Inventors: 俊麟王
Original assignee: 美商幹細胞生物科技股份有限公司
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-08-16
Also published as: WO2018119178A1

Abstract

一種在一個體中降低腦啡肽酶的位準的方法，其包含有：鑑定一需要它的個體；以及投藥給該個體一含有在尺寸上大於2微米並且小於6微米的小細胞的組成物；其中該等小細胞包括下列的體幹細胞：(i)多能的；和(i) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

Description

體幹細胞用於降低腦啡肽酶位準的用途

相關申請案的交互參考這個申請案主張於2016年12月23日所提申的美國臨時申請案第62/438,652號的優先權，它的內容藉此以它的整體在此被併入本案以做為參考資料。

發明領域本發明係有關於體幹細胞(somatic stem cells)用於降低腦啡肽酶(neprilysin)位準的用途。

發明背景腦啡肽酶(亦即，膜金屬肽鏈內切酶(membrane metallo-endopeptidase, MME)、中性肽鏈內切酶 (neutral endopeptidase, NEP)或分化簇10 (cluster of differentiation 10, CD10)是一種由在人類的MME 基因所編碼的酵素。腦啡肽酶是一種鋅依賴性金屬蛋白酶，其切割在疏水性殘基的胺基側的胜肽並且使數種胜肽激素(包括升糖素(glucagon)、腦啡肽(enkephalins)、物質P (substance P)、神經調壓素(neurotensin)、催產素(oxytocin)以及舒緩肽(bradykinin))失活。被顯示的是：老的NEP-缺陷小鼠展現出對學習的顯著改善能力。在老年小鼠的持續學習和記憶對應於在海馬迴和側杏仁核(lateral amygdale)的腦切片中改善的長期增益(long-term potentiation, LTP)。因此，降低NEP (CD10)表現可改善在年老個體的學習和記憶。

失智症(dementia)是一廣泛的術語，意指足以干擾日常功能的在一個人的心智能力的經常逐步降低。症狀可包括在記憶、推理、判斷、溝通、聚焦、計劃和視覺感受中的一或多者的損傷。現今沒有用於失智症的療法。藥物和非-藥物治療可能有助於管理症狀。

發明概要在一方面，在此所描述的是一種在一個體中降低腦啡肽酶的位準的方法。該方法包括鑑定一需要它的個體；以及投藥給該個體一含有在尺寸上大於2微米並且小於6微米的小細胞的組成物；其中該等小細胞包括下列的體幹細胞：(i)多能的；和(i)CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

在一些具體例中，該鑑定步驟包括偵測在一從該個體所獲得的生物樣品中的一如相較於一對照位準之升高的腦啡肽酶位準。該被鑑定的個體可具有一與升高的腦啡肽酶有關的病況或可藉由降低腦啡肽酶位準而被治療的病況。例如，該個體可具有非-阿茲海默失智症。在一些具體例中，該個體具有一年齡相關的認知損傷。

在該被投藥給該個體的組成物中的該等小細胞可進一步包括血小板。例如，75%至85%的該等小細胞可以是血小板以及20%至25%的該等小細胞可以是體幹細胞。在一些具體例中，該組成物含有1000萬至5億個體幹細胞。

在一些具體例中，該組成物藉由一包括下列的製程而被製備：提供一含有一從該個體或一捐贈個體所獲得的血液樣品和一個二價陽離子螫合劑的混合物；在一於2℃與12℃之間的溫度下儲存該混合物歷時3至72小時，藉此該混合物分離成一上層和一下層，其中該上層含有小細胞的族群；以及收集該上層，藉此該組成物被製備。每毫米的該血液樣品1.5至2.0 mg的該二價陽離子螫合劑可被混合以該血液樣品以獲得該混合物。較佳地，該二價陽離子螫合劑是EDTA。

選擇性地，在獲得該血液樣品以製備該組成物之前，一用於增加幹細胞數目的動作在該個體或捐贈個體上被執行。該動作可以是投藥一有效數量的褐藻糖膠(fucoidan)或一顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor)。

該用於製備該組成物的製程可進一步包括，在收集該上層之後，添加一藥學上可接受的賦形劑至該被收集的上層。另擇地，該製程可進一步包括，在收集該上層之後，離心該上層以獲得一細胞沉澱物。該沉澱物可進一步被清洗並且被懸浮在一藥學上可接受的賦形劑中。該藥學上可接受的賦形劑可以是沒有二價離子的一者。在一具體例中，該藥學上可接受的賦形劑是一鹽水溶液。

在一些具體例中，該方法進一步包括，在該投藥步驟之後，偵測在該投藥步驟之後在一從該個體所獲得的生物樣品中的一腦啡肽酶的位準。

在另一個方面，在此所描述的是一種用於在一個體中降低腦啡肽酶的位準的組成物。該組成物含有在尺寸上大於2微米並且小於6微米的小細胞，其中該等小細胞包括下列的體幹細胞：(i)多能的；和(i)CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

一或多個具體例的細節在隨文檢附的圖式和下列描述中被提出。該等具體例的其他特徵、標的和優點從描述和圖式以及從申請專利範圍將是顯而易見的。

較佳實施例之詳細說明被意外地發現的是：一種含有某些小體幹細胞(例如，Lgr5(+)或CD349(+)細胞)的組成物可在個體中降低腦啡肽酶(CD10)的位準並且改善失智症(例如，非-阿茲海默失智症)的記憶和其他心理症狀。因此，在此所描述的是用於降低腦啡肽酶位準或用於治療與升高的腦啡肽酶位準有關的病況的方法和組成物。體幹細胞

有各種不同類型的體幹細胞，包括全能幹細胞(totipotent stem cells)、多能幹細胞(pluripotent stem cells)、多潛能幹細胞(multipotent stem cells)以及先驅幹細胞(progenitor stem cells)(亦被稱為單能幹細胞(unipotent stem cells))。分裂球樣幹細胞(blastomere-like stem cells, BLSC)是全能或多能體幹細胞。極小胚胎樣幹細胞(very small embryonic-like stem cells, VSEL)是多能體幹細胞。SB細胞是多能或多潛能體幹細胞。間質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSC)和造血幹細胞(hematopoietic stem cell, HSC)是多潛能體幹細胞。

如此處所用的，一細胞(諸如一幹細胞)的尺寸(Z)可意指(1)在細胞生物學的領域或幹細胞的領域中一細胞的尺寸或代表長度的慣常定義，(2)一細胞的直徑(特別是當該細胞實質上是球形時)，(3)一細胞的長軸的長度(特別是當該細胞實質上是橢圓形時)，(4)一細胞的寬度(當該細胞的形狀具有一正方形的一近似形狀時)， (5)一細胞的長度(當該細胞的形狀具有一矩形的一近似形狀時)，或者(6)一細胞的最大橫斷面或橫向尺寸，該尺寸(Z)(不管直徑、長度、寬度或最大橫斷面或橫向尺寸)可例如使用從一光學顯微鏡或從一電子顯微鏡(例如，掃描式電子顯微鏡(SEM))所獲得的一細胞影像或使用從一流式細胞儀所獲得的細胞的數據(例如，二維點、輪廓或密度圖)而被測定或測量。從一光學顯微鏡或一電子顯微鏡所獲得的一細胞的一影像可能是該細胞的一個二維的(2D)橫斷面或三維的(3D)結構。作為一實例，細胞的尺寸(Z)可藉由在從一光學顯微鏡或一電子顯微鏡(例如，SEM)所獲得的一個2D橫斷面影像中測量細胞的最大橫斷面或橫向尺寸而被獲得。

術語“小細胞”(例如，小體幹細胞)意指一具有一尺寸小於6微米(例如，在2.0與6.0微米之間)的細胞。術語“大細胞”意指一具有一尺寸大於6微米的細胞。

CD349(+) SB細胞是多能或多潛能體幹細胞。CD349(+) SB細胞亦可以是CD9(+)、Oct4(+)和Nanog(+)，以及CD133(−)、CD90(−)、CD34(−)和Sox2(−)。CD349(+) SB細胞各個具有一相等於或小於4、5或6微米的尺寸，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間，或在1.0與4.0微米之間。較佳地，該尺寸是大於2微米並且小於6微米。

Lgr5(+) SB細胞亦是多能或多潛能體幹細胞。它們亦可以是Oct4(+)和 Nanog(+)，以及CD133(−)、CD66e(−)、CD4(−)、CD8(−)、CD9(−)、CD10(−)、CD11(−)、CD16(−)、CD17(−)、CD18(−)、CD19(−)、CD20(−)、CD21(−)、CD31(−)、CD42(−)、CD63(−)、CD34(−)、Lin(−)、CD38(−)、CD90(−)、CD45(−)、CD349(−)和Sox2(−)。一個Lgr5(+) SB細胞的尺寸可以是相等於或小於4、5或6微米，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間或在1.0與4.0微米之間。較佳地，一個Lgr5(+) SB細胞在尺寸上是大於2微米並且小於6微米。

分裂球樣幹細胞(BLSC)是CD66e(+)全能或多能體幹細胞。它們各個可具有一相等於或小於4、5或6微米的尺寸，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間或在1.0與4.0微米之間。例如，一BLSC可具有一大於2微米並且小於6微米的尺寸。

極小胚胎樣幹細胞(VSEL)是多能體幹細胞，它可以是CD133(+)或CD34(+)。一VSEL亦可以是CD45(−)和 Lin(−)。例如，一VSEL可以是CD133(+)、CD45(−)和Lin(−)，或者CD34(+)、CD45(−)和Lin(−)。一VSEL的尺寸可以是相等於或小於4、5或6微米，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間或在1.0與4.0微米之間。一VSEL在尺寸上可以是大於2微米並且小於6微米。

間質幹細胞(MSC)是多潛能體幹細胞。一MSC可表現細胞表面標記CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105的一或多者。MSC構成一非常異質的族群。一些類型的MSC在尺寸上可能是相等於或小於4、5或6微米，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間或在1.0與4.0微米之間。其他類型的MSC在尺寸上可能是大於6、7或10微米。

造血幹細胞(HSC)是多潛能體幹細胞。它們可以是CD34(+)、cKit(−)、CD38(−)、Lin(−)細胞或CD150(+)、CD244(−)和CD48(−)細胞。HSC在尺寸上可以是相等於或小於4、5或6微米，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間或在1.0與4.0微米之間。用於增加幹細胞的動作

如此處所用的一動作(X)是一對於在活體內(例如，在一人類個體或非-人類個體)增加一或多個類型的幹細胞的數目可能是有效的動作。動作(X)可包括： 1.服用藥物，諸如合成藥物或衍生自自然界的化合物； 2.服用草藥或中草藥，諸如冬蟲夏草( Cordyceps sinensis)、人參(ginseng)、枸杞(Lycium Chinense Mill)、靈芝(Ganoderma lucidum)(靈芝(lingzhi))、牛樟芝(Taiwanofungus camphorates)和/或巴西蘑菇(Brazil mushroom)； 3.服用包括下列物質或元素的營養物或膳食補充物(諸如營養丸劑或粉末)：維生素(維生素A、B、B群、B₁₂ 、D、D₃ 、E等等）、常量(macro)和/或微量礦物質(trace minerals)(例如，鈣、鈉、鉀、氟、溴、鉻、碘、矽、硒、鈹、鋰、鈷、釩和/或鎳、多醣、高分子量含有海藻糖的醣蛋白(high molecular weight fucose-containing glycoproteins)、海藻(包括綠藻、藍綠藻、褐藻等等)、海藻糖、褐藻糖膠(fucoidan)(褐藻的一主要成分)、寡褐藻糖膠(oligo fucoidan)、藻類、含有褐藻糖膠的褐藻(例如，在日本沖繩生長和生產的褐藻)、日本水雲(Japanese Mozuku)、綠藻、藍綠藻(或藍藻)、褐藻(包括水雲、昆布(kelp)、裙帶菜屬(undaria)、羊栖菜(sargassum fusiforme)、裙帶菜(pinnatifida)等等)、植物性化合物(phytochemical)(例如，異黃酮(isoflavones)或植物雌激素(phytoestrogen))、茄紅素(lycopene)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、綠茶素(green tea essence)、醣質營養素(gluconutrients)(例如木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醣(Mannose )、N-乙醯基葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、N-乙醯基半乳糖胺(N-acetylgalaetosanmine)或N-乙醯神經胺酸(N-acetylneuraminic acid))、魚油、香椿(China toona)(香椿(toona sinensis))，和/或從植物、葉、果實、蔬菜、魚、海藻或藻類所萃取的營養素； 4.實行一素食飲食； 5.服用或吃健康食品或有機食品； 6.服用一另擇的(非-傳統的) 醫藥品； 7.進行一另類療法或治療，諸如格森療法(Gerson therapy)或布魯士癌症治療( Breuss cancer cure)； 8.進行針灸； 9.進行按摩(諸如足部按摩)； 10.運動，諸如行走、慢跑、跳舞、體操、瑜伽、有氧運動和/或太極拳(中國影子練習))； 11. 睡覺(為了測量睡眠品質的目的)； 12.冥想； 13.實行由一個人、一健康專業人員或一醫生所設計的一健康改善計畫或一疾病治療計畫； 14.服用一某種用於改善在一身體的一某器官的健康的營養物，例如服用茄紅素以改善攝護腺的健康； 15.採取一復建計畫以治療傷口，或治療由手術所造成的創傷，或治療一疾病； 16.服用一種從例如將一中藥或複數種中藥浸泡在液體或酒中歷時一時間的期間所做出的藥液(medicinal liquor)(或被稱為藥酒(medicinal wine)、藥液(medicated liquor)或藥酒(medicated wine))(諸如從將人參浸泡在一高酒精濃度米酒歷時1個月所做出的人參酒 )； 17. 服用一或多個由一政府部門或機關(諸如美國食品和藥物管理局(U.S. FDA))所核准用於治療一特定疾病(例如，一類型的癌症、皮膚病、腎臟疾病和/或等等)的藥物； 18. 服用或進行一由一政府部門所核准用於治療一特定疾病(例如，一類型的癌症、皮膚病或腎臟疾病)的治療或療法； 19.實行一宗教活動，諸如祈求和平或拜神； 20.直接或間接地暴露於日照或陽光下(在早晨，例如在日出前10分鐘與在日出後50分鐘之間(含有顯著數量的紅外(IR)光)；或大約中午，例如在11:30 AM至12:30 PM之間(含有顯著數量的紫外(UV)光)；或在下午，例如，在日落前50分鐘與在日落後10分鐘之間(含有顯著數量的紅外(IR)光))； 21. 暴露於燈光或發光二極體(LED)光，其可包括可見光的一全光譜、IR光、紅光、綠光、藍光或UV光，或超過上述光的一者的一組合； 22. 運動或進行用於改善身體自癒的計畫、治療、方法、裝置和/或系統，例如，一種在損傷或手術之後被執行用於改善自癒的方法或治療(例如，高壓氧治療)； 23.喝咖啡(諸如黑咖啡)； 24.喝茶(諸如綠茶、紅茶或茉莉花茶(jasmine tea))； 25.喝紅酒； 26.服用褪黑激素(melatonin)； 27.聆聽音樂(諸如莫扎特或貝多芬的交響曲)； 28.注射一含有褐藻糖膠或寡褐藻糖膠的物質(例如，一營養物或補充物)； 29.服用激素補充物或進行一激素注射； 30.注射一顆粒性白血球群落刺激因子或(G-CSF或GCSF)(它是一醣蛋白)； 31.進行GCSF注射的療程；以及 32. 服用含有下列的一營養物、一營養品、一營養流體(nutrient fluid)、一營養飲料、一營養液(nutrient liquid)或一營養食品：(1)各種不同的胺基酸(諸如精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甘胺酸，硒代半胱胺酸，丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸或色胺酸)，(2)均衡胺基酸，或(3) 9種用於人體的必需胺基酸(亦即，組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸和纈胺酸)。例如：(a)從紅、綠、黑豆的發酵所生產或萃取的產品；(b)從一水果或水果的一組合(諸如甜菜、蘋果、番石榴、奇異果、葡萄、鳳梨、紅龍果(red pitaya)(火龍果(dragon fruit))、青木瓜、番茄和/或酪梨等等)的發酵所生產的液體、流體或飲料；(c)一種從例如將一中藥或複數種中藥浸泡在液體或酒中歷時一時間的期間所做出的藥液(medicinal liquor)(或被稱為藥酒(medicinal wine)、藥液(medicated liquor)或藥酒(medicated wine))(諸如從將人參浸泡在一高酒精濃度米酒歷時1個月所做出的人參酒 )。含有幹細胞的組成物

一種含有幹細胞的組成物(例如，一含有幹細胞的溶液)可使用下列所描述的一示範方法而被製備。

一動作(X)(可以是上面所提到的動作(X)的一者)在一個體上被執行。該個體，例如，是一人類(例如，兒童、青少年、成人或老人)或一非-人類動物。一非-人類動物的實例包括一靈長類動物(例如，猴子或大猩猩)、狗、囓齒動物(例如，小鼠或天竺鼠)、貓、馬、乳牛、牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、鳥和大象。

例如，該個體可攝取一幹細胞-動員劑(stem cell-mobilization agent)(諸如一含有褐藻糖膠的化合物)。該含有褐藻糖膠的化合物可以是一褐藻補充物。該褐藻補充物的一丸劑含有80%的一水雲粉末、15%的結晶纖維素、3%的蔗糖脂肪酸酯以及2%的微小或細微的矽石(silica)(含有二氧化矽)。該水雲粉末可從在日本沖繩附近的海洋中生長的水雲褐藻(一種海藻)而被萃取。該水雲粉末接著被混合以結晶纖維素、蔗糖脂肪酸酯以及微小或細微的矽石(含有二氧化矽)以形成該褐藻補充物的丸劑(含有0.1克的褐藻糖膠)。該個體可攝取20或更多個丸劑(例如，至少30個丸劑)的該褐藻補充物或者2克或更多(諸如至少3克)的褐藻糖膠。在另一個實例中，該個體可被注射以一顆粒性白血球群落刺激因子(GCSF)(亦即，一動員劑)，或可進行一GCSF注射的療程。

在一動作(X)被執行之後，該個體等待歷時一時間的期間(例如，一預定的時間的期間)，諸如在15分鐘與60分鐘之間、在20分鐘與100分鐘之間、在30分鐘與4小時之間、在60分鐘與90分鐘之間、在0.5小時與3小時之間、在1小時與6小時之間、在1小時與12小時之間、在12小時與36小時之間，或在36小時與50小時之間。執行動作(X)和等待歷時一期間容許一或多個特定類型的體幹細胞(諸如SB細胞(亦即，CD349(+)和Lgr5(+) SB細胞))從例如該個體的骨髓移動至該個體的周邊血液內。該個體的周邊血液因此變得富含該一或多個特殊類型的體幹細胞。該一或多個特定類型的體幹細胞，例如，可以是或可包括一或多個該等上面所描述的體幹細胞。例如，該一或多個特定類型的體幹細胞可以是或可包括在尺寸上小於6微米並且更佳地在尺寸上大於2微米的體幹細胞，諸如CD349(+)體幹細胞和/或Lgr5(+)體幹細胞。

執行動作(X)和等待歷時一期間是選擇步驟。換句話說，要做出一含有幹細胞的組成物，一血液樣品可從一沒有首先在個體上執行任何動作(X)的個體而被獲得。

立即地在上面的等待步驟(若動作(X)和該等待步驟被進行)之後，一血液樣品被獲得自該個體的周邊血液並且被放置至一或多個含有一個二價陽離子螫合劑的容器(例如，一袋、一或多個注射器，或一或多個管子)內。該血液樣品在該容器內被混合以該二價陽離子螫合劑以形成一混合物。該二價陽離子螫合劑(例如，一抗凝劑)可以是具有一重量(例如大於70 mg (諸如在90與 900 mg之間、在120與450 mg之間或在150與400 mg之間))的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)(諸如K2 EDTA抗凝劑或K3 EDTA 抗凝劑)。另擇地，該二價陽離子螫合劑可以是具有一重量(例如，大於70 mg (諸如在90與900 mg之間、在120和 450 mg之間或在150和 400 mg之間))的檸檬酸鹽。該血液樣品含有複數個細胞，包括在尺寸上小於6微米的小細胞和在尺寸上大於6微米的大細胞。例如，該等小細胞含有血小板和在尺寸上小於6微米的小體幹細胞。例如，該等小體幹細胞含有該一或多個特定類型的體幹細胞(亦即，例如，SB細胞)、BLSC (亦即，CD66e(+)體幹細胞)以及VSEL (例如，CD133(+) 體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。例如，該等大細胞含有在尺寸上大於6微米的大體幹細胞和譜細胞(lineage cells)(諸如紅血球和白血球)。該血液樣品可具有一大於或相等於45毫升的體積，諸如在60與500毫升之間、在80與250毫升之間或在100與 200毫升之間。在一實例中，該血液樣品可在該容器中被混合以每毫升的該血液樣品1.5 mg或更多(諸如在1.6與 2.0 mg之間)的該二價陽離子螫合劑(諸如K2 EDTA、K3 EDTA或檸檬酸鹽)以形成該混合物。

其次，該混合物被處理以形成一含有幹細胞的溶液。該製程可包括用於幹細胞活化和純化/分離的步驟。如此處所用的術語“純化”或“分離”意指小細胞(例如，在尺寸上大於2微米並且小於6微米的細胞)與大細胞(例如，在尺寸上大於6微米的細胞)的實質分離。

該混合物可在一於2攝氏溫度(℃)與 12℃之間、更佳地在2℃與7℃之間或在4℃的溫度下被儲存在一適合的設備(例如冰箱或其他用於保持東西寒冷的裝置)中歷時一預定的時間的期間。該時間的期間可以是在3小時與 72小時之間，以及更佳地在3小時與6小時之間、在6小時與72小時之間、在6小時與 48小時之間、在16小時與72小時之間、在16小時與48小時之間、在36小時與60小時之間、在48小時與72小時之間，或大約48小時。在該混合物已被儲存歷時該預定的時間的期間之後，在該混合物中的該一或多個特定類型的體幹細胞(例如，SB細胞)可藉由該二價陽離子螫合劑(諸如K2 EDTA、K3 EDTA或檸檬酸鹽)而被活化，亦即，該一或多個特定類型的體幹細胞的細胞週期被活化從G0到G1。該活化可能與該二價陽離子螫合劑抑制p53的功能(大概藉由螫合Zn²⁺ )的能力有關，藉此容許該一或多個特定類型的體幹細胞(例如，SB細胞)存在從G0靜止期到細胞週期的G1期。由於該p53蛋白質需要Zn²⁺ 以適當地摺疊並且形成一功能性蛋白質，藉由該二價陽離子螫合劑螯合Zn²⁺ 可能是一關鍵步驟以活化該一或多個特定類型的體幹細胞(例如，SB細胞)。可能的是：該二價陽離子螫合劑可螯合其他二價離子(例如，Ca²⁺ )，藉此活化該一或多個特定類型的體幹細胞並且迫使它們增殖和擴展。

當該混合物被儲存時，它由於重力而分離成分離層(包括一上層和一下層)。該上層(或懸浮液)可具有一在20與 250毫升之間、在40與125毫升之間或在50與 100毫升之間的體積。該上層含有血小板、血清以及一或多個特定類型的小體幹細胞(亦即，例如，SB細胞)、BLSC (亦即，CD66e(+)體幹細胞)和VSEL (例如，CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。大多數的該血液樣品的該等含有譜細胞和大體幹細胞的大細胞(諸如大於95%、98%或99%的該血液樣品的該等大細胞)是在該下層。該懸浮液的體積比該血液樣品的體積的比率例如可在自三分之一至二分之一的範圍。

其次，實質上所有的該上層可被收集或轉移至一液體容器(諸如一袋、一注射器或一玻璃瓶)以產生一含有幹細胞的溶液或幹細胞混合物。該上層(例如，一含有幹細胞的溶液)含有包括血小板和小體幹細胞的小細胞。在該含有幹細胞的溶液中小體幹細胞的數目可以是大於或相等於1000萬(例如，大於或相等於3000萬、大於或相等於5000萬、在1000萬與5億之間、在2500萬與3億之間，或在3000萬與5億之間)。該含有幹細胞的溶液亦可含有該二價陽離子螫合劑(例如，EDTA)和/或生長因子。

此外，該含有幹細胞的溶液幾乎沒有包括或實質上排除大細胞(例如，大體幹細胞和譜細胞)。例如，在該含有幹細胞的溶液中大細胞可構成小於5% (例如，小於1%、0.5%或0.01%)的細胞的總數目。例如，在該含有幹細胞的溶液(例如，該被收集的上層)中紅血球的數目可以是每毫升小於10⁵ 或10⁴ 。較佳地，每毫升的該含有幹細胞的溶液中紅血球的數目是小於10³ 。每毫升的該含有幹細胞的溶液中白血球的數目可以是小於10⁴ (例如，小於10³ )。較佳地，每毫升的該含有幹細胞的溶液中白血球的數目是小於10² 。

在該含有幹細胞的溶液中大於95% (例如，99%或99.99%)的所有該等細胞可以是小細胞。該等小細胞可包括血小板、Lgr5(+)細胞、CD349(+)細胞、CD133(+)細胞、CD34(+)和CD66e(+)細胞。在該含有幹細胞的溶液中血小板可構成75%至85%的該等小細胞。大於4% (例如，大於5%或在4.5%與10%之間)的所有該等小細胞可以是Lgr5+體幹細胞。在該含有幹細胞的溶液中CD349(+)體幹細胞可構成大於4% (例如，大於5%或在4.5%與10%之間)的所有該等小細胞。小於2% (例如，小於1%或0.5%)的該等小細胞可以是被組合的CD133(+)細胞和CD34(+)細胞。小於6%(例如，小於5%或4.5%) 的該等小細胞可以是CD66e(+)細胞。

任何特定的小細胞亦可使用流式細胞術或其他慣常技術(例如抗體為基礎的技術(諸如抗體-結合的珠粒))而從該被收集的上層被進一步分離或消耗。

該被收集的上層可被使用作為一含有幹細胞的溶液(例如，被投藥給一個體或儲存)或被進一步處理。例如，它可進一步被純化(例如，過濾)或被混合以一或多個額外的組分。一具有一體積(例如，大於400毫升(諸如在500與900毫升之間))的沒有Ca²⁺ 的適合的細胞介質或溶液可被添加至該被收集的上層以做出一含有幹細胞的溶液。該沒有Ca²⁺ 的適合的介質或溶液(諸如一含有NaCl的溶液)可進一步沒有任何二價離子(包括 Mg²⁺ )。例如，該含有NaCl的溶液可以是正常的鹽水(例如，一具有0.90% w/v的NaCl，約300 mOsm/L或每升9.0克)。

該含有幹細胞的溶液可被儲存在一冷凍儲存溫度，例如，相等於或少於-70℃或-80℃ (例如，在-75℃與-85℃之間)歷時一延長的時間期間(例如，超過1週、1個月或1年)。當準備使用時，該冷凍的含有幹細胞的溶液可被快速地解凍並且，選擇性地，被混合以上述沒有Ca²⁺ 的適合的介質或溶液(例如，0.9% NaCl)。治療方法

該藉由上面所描述的操作程序所生產的含有幹細胞的組成物可被使用以在一個體中降低腦啡肽酶位準。例如，它可被使用以治療一與升高的腦啡肽酶位準有關的病況或可以一腦啡肽酶拮抗劑或藉由降低腦啡肽酶位準而被治療的病況。

腦啡肽酶位準可意指在從一個體所獲得的任何生物樣品(例如，血液樣品、骨髓樣品、尿樣品或實體組織樣品)中的一腦啡肽酶蛋白質位準、mRNA位準、cDNA或酵素位準。一升高的腦啡肽酶位準是一要比在健康個體或沒有一與升高的腦啡肽酶位準有關的病況的個體中被發現的位準或位準的範圍更高的位準。測量蛋白質、mRNA、cDNA和酵素位準的方法是本技藝所熟知，例如，ELISA、西方墨點法以及即時PCR。

在該含有幹細胞的組成物被投藥給一個體之前，該個體是否具有一升高的腦啡肽酶位準可被測定。另擇地或此外，在該組成物被投藥之後，在該個體中的腦啡肽酶位準可被測定以監測治療效力和做出治療決策。選擇性地，在該個體中的一疾病參數或症狀(例如，記憶或學習能力)可在投藥之前和/或之後被評估。

人類和其他哺乳動物腦啡肽酶序列是本技藝所知曉，例如，NCBI登錄編號NP_001341571 (人類)、NP_001341572 (人類)、NP_001276391 (小鼠)，以及NP_036740 (大鼠)。

在此所描述的該含有幹細胞的組成物可經由任何的投藥途徑而被投藥給一需要它的個體，例如，靜脈內的、關節內的、結膜的、顱內的、腹膜內的、胸膜內的、肌肉內的、椎管內的或皮下的投藥途徑。該組成物可含有在1000萬與5億之間的小體幹細胞。自體的或同種異體的體幹細胞可被使用。該組成物可例如每1-14天、每2-4週、每1-6個月或每2-12個月被投藥給一個體歷時一治療期間(例如，1-36個月或2-10年)或無論何時需要的。

可以該含有幹細胞的組成物而被治療的病況包括非-阿茲海默失智症(例如，血管型失智症)、疼痛、心理疾患、與正常的老化有關的降低認知能力(例如，記憶、學習、聚焦或推理)。如此處所用的，失智症是一種關於喪失記憶和其他心智能力嚴重到足以干擾日常生活的一般術語。該喪失要比正常老化所預期者更多。失智症的症狀可變化很大。一熟練的醫師將能夠決定一個體是否具有失智症。

一“個體”意指一人類或一非-人類動物。“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指投藥一化合物或組成物給一具有一疾患的個體，具有治療、減輕、緩解、補救、延緩疾患的發作，或改善疾患、疾患的症狀、繼發於疾患的疾病狀態或關於疾患的素因的目的。一”有效數量”意旨能夠在一經治療之個體中產生醫學上所欲之結果的化合物或組成物的量。該治療方法可被單獨執行或是與其他藥物或療法一併執行。

下列的特定實施例僅被解釋為例示說明，並且無論如何沒有以任何方式限制本揭示的剩餘部分。沒有進一步詳細闡述，被相信的是：一熟習此技藝者可根據在此的描述，利用本揭示至它的最大程度。實施例

100至150 ml的周邊血液樣品是從4位具有失智症的病患而被獲得。含有該等血液樣品的EDTA-塗佈的管子被儲存在4℃歷時6至48小時直到血液分離成2個不同的層。該含有SB細胞的頂層被收集並且經由靜脈內注射被自體地輸送回該等病患內。

在該治療之前和之後藉由比較在血液樣品中腦啡肽酶(亦即，CD10)表現的位準，一顯著的降低在治療後24小時和/或1週被觀察到。參見圖1。此外，在該治療之後，根據他們家屬的每日觀察，3位病患(病患#80、#165和#131)顯示在記憶和學習的顯著改善。其他具體例

在這個說明書所揭示的所有特徵可呈任何組合而被組合。在這個說明書所揭示的各個特徵可藉由一提供相同、等效或相似目的的另擇特徵而被取代。因此，除非另有明確地說明，被揭示的各個特徵僅是一系列的等效或相似特徵的一實例。

從上面的描述，一熟習此技藝者可容易地確定該等被描述的具體例的必要特徵，並且沒有背離其精神和範疇，可做出該等具體例的各種不同的變化和修飾以使它適應各種不同的用途和病況。因此，其他具體例亦在申請專利範圍內。

圖1是一顯示在被治療以一幹細胞組成物的失智症病患中的腦啡肽酶(CD10)位準的圖。

Claims

一種在一個體中降低腦啡肽酶的位準的方法，其包含有：鑑定一需要它的個體；以及投藥給該個體一含有在尺寸上大於2微米並且小於6微米的小細胞的組成物；其中該等小細胞包括下列的體幹細胞：(i)多能的；以及(i) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。
如請求項1的方法，其中該鑑定步驟包括偵測在一從該個體所獲得的生物樣品中的相較於一對照位準之升高的腦啡肽酶位準。
如請求項2的方法，其中該生物樣品是一血液樣品。
如請求項1的方法，其中該個體具有一非-阿茲海默失智症。
如請求項1的方法，其中該個體具有一年齡相關的認知損傷。
如請求項1-5的任一項的方法，其中該等小細胞進一步包括血小板。
如請求項6的方法，其中75%至85%的該等小細胞是該等血小板以及20%至25%的該等小細胞是該等體幹細胞。
如請求項7的方法，其中該組成物含有1000萬至5億的該等體幹細胞。
如請求項8的方法，其中該組成物是藉由一包括下列的製程而被製備：提供一含有從該個體或一捐贈個體所獲得的一血液樣品和一個二價陽離子螫合劑的混合物；在一於2℃與12℃之間的溫度下儲存該混合物歷時3至72小時，藉此該混合物分離成一上層和一下層，其中該上層含有小細胞的族群；以及收集該上層，藉此該組成物被製備。
如請求項9的方法，其中該二價陽離子螫合劑是EDTA。
如請求項10的方法，其中每毫米該血液樣品1.5至2.0 mg的二價陽離子螫合劑與該血液樣品混合以獲得該混合物。
如請求項10的方法，其中在獲得該血液樣品之前，一用於增加幹細胞數目的動作在該個體或捐贈個體上被執行。
如請求項12的方法，其中該動作是投藥一有效數量的褐藻糖膠(fucoidan)或一顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor)。
如請求項10的方法，其中該用於製備該組成物的製程進一步包括，在收集該上層之後，添加一藥學上可接受的賦形劑至該被收集的上層。
如請求項10的方法，其中該用於製備該組成物的製程進一步包括，在收集該上層之後，離心該上層以獲得一細胞沉澱物。
如請求項15的方法，其中該用於製備該組成物的製程進一步包括在一藥學上可接受的賦形劑中清洗該沉澱物以及懸浮該沉澱物。
如請求項15或16的方法，其中該藥學上可接受的賦形劑是沒有二價離子。
如請求項17的方法，其中該藥學上可接受的賦形劑是一鹽水溶液。
如請求項1-18的任一項的方法，其中該組成物被靜脈內地投藥。
如請求項1-19的任一項的方法，其進一步包含有，在該投藥步驟之後，偵測在該投藥步驟之後在一從該個體所獲得的生物樣品中的一腦啡肽酶的位準。