CN117904031A

CN117904031A - 一种肠道类器官外囊泡的提取方法及其应用

Info

Publication number: CN117904031A
Application number: CN202410170972.9A
Authority: CN
Inventors: 苏佳灿; 刘晗; 井莹莹; 纪宁
Original assignee: Shaoxing Institute Of Shanghai University; Suzhou Shanghai University Innovation Center; University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: Shaoxing Institute Of Shanghai University; Suzhou Shanghai University Innovation Center; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2024-02-06
Filing date: 2024-02-06
Publication date: 2024-04-19

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体提供一种肠道类器官外囊泡的提取方法及其在制备治疗炎症性肠病并发的骨质疏松症药物中的应用。根据本发明采用肠道类器官及其外囊泡用于治疗炎症性肠病，为治疗炎症性肠病并改善并发的骨质疏松症的治疗提供一种新的途径，基于肠道类器官的细胞外囊泡为炎症性肠病的治疗提供了一种创新的方法。本发明研究发现肠道类器官衍生的细胞外囊泡具有免疫调节的功能，从而减少葡聚糖硫酸钠所引起的结肠损伤，改善炎症性肠病的症状并挽救骨质流失，提高骨量，改善骨质疏松。

Description

一种肠道类器官外囊泡的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肠道类器官外囊泡的提取方法及其在用于治疗炎症性肠病并改善伴生的骨质疏松症的应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatorybowel disease,IBD)是肠道慢性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)，临床表现为慢性腹泻、腹痛、贫血和营养不良，是一系列慢性、复发性和使人衰弱的炎症性疾病，同时患者会伴发骨质疏松症。IBD发病率正飞速上升，并成为严重影响公共卫生的重大社会问题，目前美国和欧洲患者数量分别达100万和250万；预计我国2025年患者数量可达150万，给全球医疗保健带来沉重负担，影响全球数百万人。在IBD中，肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1β等炎症因子的增加会损害骨形成导致骨量降低。目前用于预防或治疗骨质疏松症的大多数疗法都集中在抑制破骨细胞活性的抗吸收药物上，而忽视了免疫细胞在骨质疏松症进展中的功能，导致治疗效果大打折扣。随着骨质疏松症研究的推进，骨质疏松症也被归类为慢性炎症性骨病。调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)和辅助性T细胞17(T helper17cells，Th17)对于维持骨稳态至关重要，尤其是Th17细胞在破骨细胞分化中的调节作用。Th17细胞的过度活化，其中分泌大量的细胞因子RANKL，促进破骨细胞表型。恢复Treg/Th17细胞的免疫稳态可以抑制骨质流失。

研究发现细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一种30～100nm的膜状载体，具有独特的纳米结构、无细胞体系、稳定的载药能力、良好的生物相容性，是一种极具临床应用潜力的新型药物递送载体，可以通过调节宿主的信号通路或将生物活性物质送入宿主细胞来调节机体功能。肠上皮细胞衍生的EVs在诱导Treg细胞中发挥重要作用，能够介导肠上皮细胞与免疫系统之间的相互作用。而肠道类器官是一种三维体外模型，包含了体内肠道组织的大部分生理相关特征，具有更接近自然组织的生理条件。因此肠道类器官分泌的肠道类器官外囊泡(Intestinal organoid extracellular vesicles,IOEVs)具有更多的数量和更好的生理效应。现有的治疗炎症性肠病并发的骨质疏松症药物效果不理想，传统的IBD治疗方案，如抗炎药或免疫抑制药，往往不能充分控制IBD症状因此也无法改善骨质流失的情况。此外，现有的静脉注射策略通常是全身性的，存在一些局限性，无法精确到达发病部位。因此，需要开发一种可以口服的新型安全药物。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肠道类器官外囊泡的提取方法及其在制备治疗炎症性肠病并发的骨质疏松症药物中的应用。根据本发明采用肠道类器官及其外囊泡用于治疗炎症性肠病，为治疗炎症性肠病并改善并发的骨质疏松症的治疗提供一种新的途径，基于肠道类器官的EVs为炎症性肠病的治疗提供了一种创新的方法。本发明研究发现肠道类器官衍生的EVs具有免疫调节的功能，从而减少葡聚糖硫酸钠所引起的结肠损伤，改善炎症性肠病的症状并挽救骨质流失，提高骨量，改善骨质疏松。

本发明的目的可以具体通过以下技术方案实现：

一方面，本发明提供了一种肠道类器官外囊泡的提取方法，所述方法包括如下步骤：

(1)类器官培养：使用类器官培养基对肠道类器官进行培养，每三天更换并收集一次培养基；

(3)类器官外囊泡提取：将所述培养基先进行低速离心，然后将低速离心得到的上清液通过无菌过滤器过滤，接着将收集到的浓缩液使用超滤管离心进行浓缩，随后使用密度梯度离心进行离心，离心后得到的沉淀使用PBS重悬后进行超速离心，收集沉淀，得到所述肠道类器官外囊泡；

进一步地，所述的肠道类器官外囊泡为小鼠小肠及小鼠结肠衍生的肠类器官外囊泡。

进一步地，步骤(2)中所述的低速离心条件为低速离心10000～12000g，10～30分钟，4℃；优选为10000g，30分钟，4℃。

进一步地，步骤(2)中所述的低速离心后的上清液使用0.22μm孔径的无菌滤膜进行过滤。

进一步地，步骤(2)中所述的浓缩过程所用超滤管为80～150KDa；优选为100KDa。

进一步地，步骤(2)中所述的密度梯度离心所用介质为碘克沙醇。

进一步地，步骤(2)中所述的密度梯度离心条件为120000～200000g，1～18小时，4℃；优选为150000g，3小时，4℃。

进一步地，步骤(2)中所述的超速离心条件为100000～150000g，1～3小时，4℃；优选为，100000g，1小时，4℃。

另一方面，本发明提供一种肠道类器官外囊泡在制备治疗炎症性肠病合并骨质疏松的药物中应用。

进一步地，所述肠道类器官外囊泡可用于减轻炎症性肠病所引起的结肠缩短。

进一步地，所述肠道类器官外囊泡会减轻炎症性肠病引起的骨质流失，提高骨量。

进一步地，所述炎症性肠病包括葡聚糖硫酸钠引起的炎症性肠病。

进一步地，所述外囊泡通过口服灌胃或静脉注射给药。

进一步地，所述口服灌胃给药剂量每次(1x10⁹-1x10¹¹)particles；优选为1x10¹⁰particles。

与现有技术相比，本发明具有以下效果：

本发明提供一种类器官外囊泡的提取方法及其在制备治疗炎症性肠病中药物中的应用，并改善并发的骨质疏松症，尤其是肠道类器官外囊泡在治疗葡聚糖硫酸钠引起的炎症性肠病合并骨质疏松中的新用途。通过动物实验证明了肠道类器官外囊泡对于减轻葡聚糖硫酸钠引起的炎症性肠病中的结肠缩短十分有效，同时缓解炎症性肠病中的骨质疏松症。应用类器官外囊泡进行治疗，效果显著，且有利于保存，口服灌胃给药可以减轻全身副作用的发生。因此，肠道类器官外囊泡为治疗葡聚糖硫酸钠所引起的炎症性肠病提供了新型有效的治疗手段并改善了炎症性肠病引起的骨质疏松症。

附图说明

图1.本发明制备得到的肠道类器官明场图像。

图2.本发明制备的肠道类器官外囊泡的TEM图(图a)和NTA图像(图b)。

图3.小鼠口服灌胃Cy5标记的肠道类器官外囊泡4h后，到达肠道的荧光图像。

图4.小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，结肠长度对比。

图5.小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，骨小梁数对比图。

图6.小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，骨体积分数对比图。

图7.小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，骨表面积骨体积比值对比图

图8.小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，股骨远端三维图像。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

除特别说明外，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1外囊泡提取

(1)肠道类器官培养：

使用伯桢生物科技提供的肠道类器官培养基；然后，将小鼠小肠来源的隐窝细胞种于基质胶中，加入肠道类器官培养基后置于37℃二氧化碳恒温培养箱中；每三天更换一次培养基。

(2)肠道类器官外囊泡提取：

将收集的培养基低速离心10,000g，30分钟，4℃；然后，将低速离心得到的上清液用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤；接着，将过滤后的上清液使用100KDa的超滤管进行浓缩，收集到的浓缩液使用碘克沙醇进行密度梯度离心150,000g，3小时，4℃；离心后得到的沉淀用PBS重悬后进行超速离心100,000g，1小时，4℃，用PBS收集沉淀，得到所述肠道类器官外囊泡。吸取100μl进行纳米颗粒跟踪分析技术进行计数，其余样本放入-80℃中保存。

实施例2动物模型实验

小鼠模型：选取9周龄的C57BL/6雄性SPF级小鼠，体重为18～22g，均从Slack实验动物公司购买。自由进食水，维持昼夜节律。

分组实验：将C57BL/6SPF级小鼠随机分为3空白组(Sham组)，造模组(IBD组)以及给药组(IOEVs组)，每组7～10只，进行实验。

Sham组：每次灌胃0.3ml的PBS，每周7次，间隔一周重复进行。

IBD组：每次灌胃0.3ml的PBS，每周7次，间隔一周重复进行；饮用水中添加3％的葡聚糖硫酸钠，每2天更换一次，持续7天，随后更换正常水，间隔一周重复进行。

IOEVs组：每次灌胃0.3ml的IOEVs，每周7次，间隔一周交替进行；饮用水中添加3％的葡聚糖硫酸钠，每2天更换一次，持续7天，随后更换正常水，间隔一周重复进行。

对IBD、IOEVs组的饮用水中添加3％的葡聚糖硫酸钠，每2天更换一次，持续7天，Sham组仅进行灌胃。随后更换正常水，按上述方案给药，交替进行一个月。脱臼处死小鼠，采集结肠组织、股骨等标本，检测结肠长度变化，Micro-CT分析股骨。

图1为制备得到的肠道类器官明场图像，图2是肠道类器官外囊泡TEM(a)、NTA图像(b)；其中右图NTA图像中，横坐标表示大小，纵坐标表示纳米粒子数。图3是小鼠口服灌胃CY5标记的工程化细菌外囊泡4h后，肠道中的荧光分布图；其中，CY5组表示没有与肠道类器官外囊泡相结合的染料组，IOEVs组表示用CY5标记了的肠道类器官外囊泡。从图中可以看出，本发明提供的肠道类器官外囊泡给药方法成功到达肠道，并在肠道中具有更高的积累量。图4是小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，结肠长度对比。从图中可以看出，肠道类器官外囊泡可以减轻葡聚糖硫酸钠带来的结肠缩短。图5是小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，骨小梁数对比图。从图中可以看出，口服肠道类器官外囊泡后，骨小梁数量比对照组有明显提升。图6是小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，骨体积分数对比图。从图中可以看出，口服肠道类器官外囊泡后，骨体积分数比对照组有明显提升。图7是小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，骨表面积骨体积比值对比图。从图中可以看出，口服肠道类器官外囊泡后，骨表面积骨体积比值比对照组有明显提升，说明提升了骨量。图8是小鼠口服灌胃肠道类器官外囊泡后，小鼠股骨远端三维图像。从图中可以看出，口服肠道类器官外囊泡后，骨量有明显提升，说明改善了骨质疏松。

从图1～8中可以看出，该提取方法可以成功提取肠道类器官外囊泡，口服给药的方法可以成功到达肠道部分并提高在肠道的积累量。IOEVs组结肠长度有所增加，股骨远端骨小梁数增加、骨体积分数提高、骨表面积骨体积比提高，说明IOEVs具有显著的保护作用，可以用于炎症性肠病的治疗中，同时减少骨量丢失，改善炎症性肠病引起的骨质疏松症。

Claims

1.一种肠道类器官外囊泡的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：

(2)类器官外囊泡提取：将所述培养基先进行低速离心，然后将低速离心得到的上清液通过无菌过滤器过滤，接着将收集到的浓缩液使用超滤管离心进行浓缩，随后使用密度梯度离心进行离心，离心后得到的沉淀使用PBS重悬后进行超速离心，收集沉淀，得到所述类器官外囊泡。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的肠道类器官外囊泡为小鼠小肠及小鼠结肠衍生的肠类器官外囊泡。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的低速离心条件为10000～12000g，10～30分钟，4℃。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的低速离心后的上清液使用0.22μm孔径的无菌滤膜进行过滤。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的浓缩过程所用超滤管为80～150KDa。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的密度梯度离心所用介质为碘克沙醇；步骤(2)中所述的密度梯度离心条件为120000～200000g，1～18小时，4℃；步骤(2)中所述的超速离心条件为100000～150000g，1～3小时，4℃。

7.一种肠道类器官外囊泡在制备治疗炎症性肠病并发的骨质疏松的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肠道类器官外囊泡可用于减轻炎症性肠病所引起的结肠缩短。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肠道类器官外囊泡可用于减轻炎症性肠病引起的骨质流失，提高骨量。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病包括葡聚糖硫酸钠引起的炎症性肠病。