TW201825523A

TW201825523A - 抗因子ｘｉ之新穎抗體及其用途

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Publication number: TW201825523A
Application number: TW106132100A
Authority: TW
Inventors: 安德烈斯威爾曼; 安雅巴奇穆勒爾; 艾瑞克塔克
Original assignee: 德商拜耳製藥股份有限公司; 美商亞倫諾拉股份有限公司; 大陸商拜耳醫藥保健有限公司（中國）
Priority date: 2016-09-20
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2018-07-16
Also published as: AU2017329645A8; WO2018054813A1; RU2019111862A3; MX2019003077A; EP4413996A3; EP4413996A2; US10654941B2; BR112019005449A2; PE20191319A1; EP3515947B1; EP3515947A1; IL265383A; RU2019111862A; US20190225705A1; AR109683A1; ES2984011T3; JP2019537451A; CN110099927A; DK3515947T3; FI3515947T3

Abstract

本發明大體上是有關於新穎的結合分子，尤其是抗體以及包含該抗體之組成物和套組。該結合分子能夠結合至人類因子XI並且因而預期尤其可用於抑制血栓形成而不會危及止血。本文提供的結合分子、組成物以及套組因而特別期望用於治療血栓形成相關疾病與病況。此外，本文提供編碼本發明結合分子的聚核苷酸、包含該聚核苷酸的載體以及用以生產該聚核苷酸的宿主細胞。

Description

抗因子XI之新穎抗體及其用途

血栓栓塞性病症(包括靜脈和動脈血栓形成)在全世界是發病率和死亡率的主要病因。它們是因為正常血液凝固(止血)失調所引起，導致了纖維蛋白異常形成血塊(血栓)，最終導致組織缺血，並且在某些情況下因為血塊片段從血栓移出和遷移而導致栓塞。

在正常情況下，止血是一種透過誘導血小板活化並形成纖維蛋白來防止血管損傷部位失血的重要機制。在機制層次上，止血分兩個步驟進行。在原發性止血期間，血小板附著至創傷部位並變得活化，且最終透過彼此結合聚集而形成血小板栓。在繼發性止血(一系列涉及凝血蛋白的酶反應，又稱為凝血系統)期間，血小板栓形成被增強且被穩定，其在將纖維蛋白原轉化成纖維蛋白的蛋白酶凝血酶形成時達到最高，以便在血管壁形成密封裂口的穩定血塊。

自1964年以來，在Macfarlane(Nature.1964 May 2；202：498-9)提出關於血液凝固過程的級聯假說當時，已經發展出活體內血液凝固功能的知識。在過去幾年內，已經修訂了兩種截然不同的路徑的理論，兩種路徑即所謂的外因性路徑以及內因性路徑，它們引發凝血和匯聚至共同路徑，最終導致凝血酶產生和纖維蛋白沉積。

在目前的模型中，當血漿蛋白酶活化因子VII接觸組織因子(TF)並因此與其形成複合體時，開始發生凝血。這個組織因子-FVIIa複合體將酶原FX轉化成其活化形式FXa，FXa復而在輔因子FVa存在下切割前凝血酶(凝血因子II)以形成凝血酶(IIa)。凝血酶(凝血的關鍵角色)進而可以催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。此外，凝血酶活化由血小板表現的特異性受體，其導致血小板活化。與纖維蛋白結合的活化血小板是血塊形成所必需的，因此是正常止血的基本參與者。FVIIa-TF複合體也將FIX轉化為蛋白酶FIXa，FIXa在FVIIIa存在下活化其他FX以維持凝血酶產生。

凝血路徑涉及凝血因子XI(FXI)。已充分確認FXI像凝血級聯的其他成員那樣是一種血漿絲胺酸蛋白酶酶原，在活體內負有血液凝固橋接啟動階段和擴增階段的功能(Davie EW et al.,Biochemistry.1991 Oct 29；30(43)：10363-70、Gailani D and Broze GJ Jr.,Science.1991 Aug 23；253(5022)：909-12；Kravtsov DV et al.Blood.2009 Jul 9；114(2)：452-8.)。

有趣的是，FXI不足通常不會導致自發性出血，但與止血困難的出血風險增加有關，儘管出血的嚴重程度與FXI的血漿含量相關性不高。在人類中，嚴重的FXI不足已被報導對血栓形成性疾病(包括缺血性中風和深靜脈血栓(DVT)具有某些保護效應(Salomon O et al,Thromb Haemost.2011 Feb；105(2)：269-73；Salomon O et al,Blood.2008 Apr 15；111(8)：4113-7)。然而，高含量的FXI與血栓形成事件相關，並且已報導賦予DVT、心肌梗塞(MI)和中風更高的風險(Meijers JC et al,N Engl J Med.2000 Mar 9；342(10)：696-701)。

總而言之，先前研究表明，FXI在維持止血方面有較少的支持作用，但對於血栓形成的發病機制來說卻是一個關鍵促成因素，從而使得FXI成為抗血栓形成的一個有希望之標靶。這是因為，儘管血栓形成和止血不是完全相同的分子過程，但它們有夠相似，目前使用的抗血栓形成藥物無意中都是靶定這兩者。當前可供使用的抗血栓形成藥物不是靶定血栓建構塊(纖維蛋白和血小板)就是抑制分子(凝血因子)和細胞(血小板)參與血栓形成過程。抗血小板，促纖維蛋白溶解劑和抗凝血劑在幾十年來一直都是治療和預防血栓栓塞性疾病的支柱，且是臨床實務中最常用的處方藥之一。當投與有效劑量時，大多數的這些藥劑還是可以完全阻斷血栓形成並止血。

到目前為止，用於展現治療效力的抗FXI抗體的幾個例子之一是如Tucker等人所公開的鼠類抗體1A6(也稱為aXIMab)(Prevention of vascular graft occlusion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI.Erik I.Tucker,Ulla M.Marzec,Tara C.White,Sawan Hurst,Sandra Rugonyi,Owen J.T.McCarty,David Gailani,András Gruber,and Stephen R.Hanson.Blood.2009 Jan 22；113(4)：936-944)。抗體1A6也揭示在專利申請案WO 2009/067660 A2中，還公告為美國專利9,125,895，其透過全文引用的方式併入本文中。然而，由於抗體1A6是鼠類抗體，它不適合人類療法，特別是長期施用(諸如抗血栓形成療法)。將鼠類抗體轉化為可接受治療性抗體的一種方法是所謂的人類化(humanization)。習於本技藝者可使用標準技術，諸如那些在O’Brien and Jones,Humanising Antibodies by CDR Grafting，第40章；Antibody Engineering,Part of the series Springer Lab Manuals pp 567-590；R.Kontermann et al.(eds.),Antibody Engineering；Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001及Hwang,Almagro,Buss,Tan,and Foote(2005)Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization.Methods,May；36(1)：35-42與其內引用之文獻中所述的技術。為了進一步降低人類化抗體的固有免疫原性可能性，需要進一步進行序列最佳化和生殖系化(germlining)。

當申請人將這些標準方法應用於人類化並最佳化非經腸抗體1A6時，一些所得抗體在生化分析中展現出與非經腸1A6媲美的結合活性，然而，在基於血漿的分析中顯示出明顯活性喪失，並且在活體內凝血模型中不足。迄今為止，未能輕易解釋為什麼親本鼠類抗體1A6和人類化變體兩者相當的生化概貌並沒有轉化成有效的抗血栓形成活性。出乎意料的是，已經透過引入更多的序列變化而產生親本鼠類抗體1A6的人類化變體(抗體TPP-3583)，其在活體內顯示出相當的生化概貌和抗血栓形成效力。

使用本發明的抗體，已經產生治療性分子，其具有降低的免疫原性風險和有效地阻斷血栓形成而且不會削弱止血，從而使得抗血栓形成療法更為安全，並因此擴大抗血栓形成療法可應用的臨床適應症和方案的範圍。

在第一個態樣中，本發明提供一種結合分子，其包含輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)；輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)；輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)；重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)；重鏈的CDR2，包含序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)；以及重鏈的CDR3，包含序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)。

該結合分子可包含如SEQ ID NO：17中所示的VL區及/或如SEQ ID NO：18中所示的VH區。

預期該結合分子能夠結合至因子XI及/或因子XIa，尤其是結合至人類或非人類靈長類動物因子XI或人類或非人類靈長類動物因子XIa。

具體而言，預期結合分子結合在對應因子XI之A3結構域的胺基酸序列內，該A3結構域包含SEQ ID NO：7的胺基酸200至283，且特別是對應於以下之胺基酸序列內的結構域：a)SEQ ID NO：7的胺基酸200至215；b)SEQ ID NO：7的胺基酸221至222；c)SEQ ID NO：7的胺基酸252至254；d)SEQ ID NO：7的胺基酸259至261；e)SEQ ID NO：7的胺基酸270至272；以及f)SEQ ID NO：7的胺基酸276至278。在此，人類因子XI的胺基酸編號包括訊號序列，始於位置1的甲硫胺酸。預期該結合分子可以是抗體，且具體而言是人類化單株抗體或其抗原結合片段，實例為IgG抗體。

在另一個態樣中，本發明提供一種編碼如本文所定義之結合分子的聚核苷酸，以及一種包含該聚核苷酸的載體，尤其是表現載體。本發明亦有關於包含該載體或聚核苷酸的宿主細胞。

在另一個態樣中，提供如本文所述之用於生產結合分子的方法，該方法包含在允許該結合分子表現的條件下培養如本文所定義的宿主細胞，以及視情況從培養物回收所生產之結合分子。

此外，本發明有關於包含如本文所定義之結合分子、聚核苷酸，載體及/或宿主細胞以及視情況醫藥上可接受之賦形劑的藥物組成物。該藥物組成物可包含額外活性劑，特別是抗血栓形成劑及/或抗凝血劑，或作為組合療法的一部分與額外活性劑一起投與。

根據本發明，結合分子、聚核苷酸、載體，宿主細胞或醫藥組成物可用於在個體體內抑制血液凝固、血小板聚集及/或血栓形成的方法中，因此被預期用於治療及/或預防病症，特別是心血管病症，尤其是血栓形成性或血栓栓塞性病症及/或血栓形成性或血栓栓塞性併發症。

本文進一步提供結合分子在血液樣品、血液保存品、血漿製品、生物樣品或醫藥添加物中作為抗凝血劑，或作為醫學裝置上之塗層的用途。

此外，本發明是有關於包含如本文所述之結合分子、聚核苷酸、載體，宿主細胞或醫藥組成物的套組。

圖1：抗FXI抗體TPP-3583的序列。

圖2：鼠類抗FXI抗體1A6對人類凝血因子XI(FXI)的結合活性(EC50值)。

圖3：人類化及生殖系化抗FXI抗體TPP-3585的結合活性(EC50值)，包含SEQ ID NO：17的可變輕鏈結構域胺基酸序列以及SEQ ID NO：18的可變重鏈胺基酸序列。

圖4：人類化及生殖系化抗FXI抗體TPP-3577的結合活性(EC50值)，包含SEQ ID NO：19的可變輕鏈結構域胺基酸序列以及SEQ ID NO：20的可變重鏈胺基酸序列。

圖5：人類化及生殖系化抗FXI抗體TPP-3290的結合活性(EC50值)，包含SEQ ID NO：21的可變輕鏈結構域胺基酸序列以及SEQ ID NO：22的可變重鏈胺基酸序列。

圖6：人類化及生殖系化抗FXI抗體TPP-3238的結合活性(EC50值)，包含SEQ ID NO：23的可變輕鏈結構域胺基酸序列以及SEQ ID NO：24的可變重鏈胺基酸序列。

圖7：抗體TPP-3583透過競爭性ELISA分析的結構域分析。

圖8：FXI透過本發明抗體轉化成其活化形式FXIa的功能性中和作用。抑制FXIIa會誘發FXI轉化成其活性形式FXIa。人類化及生殖系化抗FXI抗體TPP-3583的抑制活性(IC50值)。

圖9：某些抗體的EC50值與aPTT值的列表。

圖10：在TPP3583 i.v.施用之後，血小板沉積對於經膠原蛋白塗佈之血管移植物的活體內測量。

圖11：在TPP3583 i.v.施用之後，纖維蛋白沉積對於經膠原蛋白塗佈之血管移植物的活體內測量。

抑制FXI在病理性血栓形成的發展中被歸因為一個關鍵作用，但對生理學止血的效用有限(或無效)，而抑制FXI在開發新穎抗血栓形成劑以增進效益風險比的過程中是一個有希望的新方法。本發明尤其是提供能夠特異地結合至FXI，從而抑制FXI轉化成其活化形式FXIa的新穎結合分子。此外，結合分子也已顯示結合至FXIa。因此，本文提供的結合分子被認為會阻斷參與血塊凝塊和血栓形成的下游參與者活化。具體而言，發明人提供了鼠類1A6抗FXI抗體的人類化形式，其以與1A6相媲美的高結合親和力有利地結合至FXI以及FXIa。此外，結合分子有效地減少血塊凝塊，如依據其在低濃度下延長活化部分凝血激酶時間(aPTT)的能力所指出般。因此，本發明的結合分子是有希望的新穎藥劑用於有效治療及/或預防血栓形成性或血栓栓塞性病症及/或血栓形成性或血栓栓塞性併發症，且更被認為在不會嚴重危及止血的情況下仍有效，從而將出血風險降至最低。

結合分子

本發明的結合分子是透過將如WO 2009/067660 A2中所揭示的鼠類抗FXI抗體1A6予以人類化並且隨後CDR最佳化而獲得。出乎意料的是發明人發現到，與1A6 CDR相比，在其CDR區中包含數個胺基酸置換的結合分子顯示出有利的性質。本發明的結合分子能夠以與1A6媲美的結合親和力結合至FXI，並抑制其轉化成其活化形式FXIa，且有效地降低血塊凝塊。相反地，具有較少或更多個胺基酸置換的其他候選結合分子沒有表現出相同的有利性質。因此，在第一個態樣中，本發明是有關於能夠特異地結合至因子XI的結合分子，該結合分子包含下列互補決定區(CDR)：a)輕鏈的CDR1：KASQSVDYDGDSYLN(SEQ ID NO：1)，b)輕鏈的CDR2：AASNLES(SEQ ID NO：2)，c)輕鏈的CDR3：QQSNGDPWT(SEQ ID NO：3)，d)重鏈的CDR1：TSGMGVG(SEQ ID NO：4)，e)重鏈的CDR2：HIWWDDDKYYNPSLKS(SEQ ID NO：5)，以及f)重鏈的CDR3：KRSSVVAHYYAMD(SEQ ID NO：6)，其中該等CDR的特徵在於至少兩個CDR累計包含10、11、12、13或14個胺基酸置換。

術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」通常是指在其技藝中具有公認定義的胺基酸，諸如選自由以下組成之群的胺基酸：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺酸(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(GIn或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；和纈胺酸(Val或V)，儘管可以根據需要使用經修飾的，合成的或稀有的胺基酸。通常，胺基酸可以分組為具有非極性側鏈(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；帶負電側鏈(如Asp，Glu)；帶正電側鏈(如Arg、His、Lys)；或不帶電極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr，Trp和Tyr)。

置換的數目及分布

胺基酸置換通常可以以任何方式分布於CDR內，即一個CDR可以例如包含一個交換，而第二個CDR可以包含9、10、11、12或13個置換。或者兩個CDR可以包含5個胺基酸置換，或者所有六個CDR皆可以包含胺基酸置換，例如每個CDR有兩個置換。本文特別預期結合分子在輕鏈的CDR1、CDR2及/或CDR3中包含至少5個胺基酸置換，在重鏈的CDR1、CDR2及/或CDR3中包含至少5個胺基酸置換。通常，胺基酸置換實際上可以以任何方式分布，只要與1A6 CDR胺基酸序列相比，累積胺基酸置換的數目在10和14之間(即包括10、11、12、13或14)，且較佳不會消除結合分子結合至因子XI的能力。

置換的類型

大體上，在CDR中胺基酸置換的任何組合相比於1A6都是可想到的，只要它不會消除本發明結合分子的有利特性即可。胺基酸交換可以是保守的(即，一類或一群胺基酸與上列同一類或同一群的另一個胺基酸交換)或非保守的(即，一類/群胺基酸交換成另一類/群胺基酸)。

依據本發明，預期特定胺基酸置換包括下列：(a)就SEQ ID NO：1而言，D₉→L₉，D₁₁→S₁₁及/或S₁₄→N₁₄；(b)就SEQ ID NO：2而言，N₆→T₆；(c)就SEQ ID NO：3而言，S₅→Y₅；(d)就SEQ ID NO：4而言，G₁₂→C₁₂； (e)就SEQ ID NO：5而言，W₅→D₅，N13→Sl3；(f)就SEQ ID NO：6而言，K₃→I₃,，V₈→Y₈，A₁₃→G₁₃及/或Y₁₆→V₁₆較佳取代產生本發明的結合分子，其在0.03μM或更低、或0.015μM或更低，或0.01μM或更低的濃度下延長aPTT達1.5倍(如本文他處所述)

具體而言，本發明結合分子包含下列CDR：(a)輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)或KSSQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：14)，其中SEQ ID NO：8較佳；及/或(b)輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)；及/或(c)輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)；及/或(d)重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)；及/或(e)重鏈的CDR2，包含序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)或HIDWDDDKYYSTSLKS(SEQ ID NO：15)，其中SEQ ID NO：12較佳；及/或(f)重鏈的CDR3，包含序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)或IRSSVYAHYYGMDV(SEQ ID NO：16)，其中SEQ ID NO：13較佳。

從上文可以看出，本發明的結合分子可以包含一或多個上述CDR，視情況呈組合的方式。本發明之較佳結合分子可以是單株抗體或其抗原結合片段，其包含下列CDR：輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)；輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)；輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)；重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)；重鏈的CDR2，包含序列 HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)；以及重鏈的CDR3，包含序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)。本發明的尤佳結合分子可以是單株抗體或其抗原結合片段，其包含下列CDR：輕鏈的CDR1，由序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)組成；輕鏈的CDR2，由序列AASTLES(SEQ ID NO：9)組成；輕鏈的CDR3，由序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)組成；重鏈的CDR1，由序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)組成；重鏈的CDR2，由序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)組成；以及重鏈的CDR3，由序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)組成。

此外，本發明結合分子預期包含如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的一個輕鏈可變區(V_L或VL區)，其中如SEQ ID NO：17中所示的VL區較佳；及/或如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20中所示的一個重鏈可變區(V_H或VH區)，其中如SEQ ID NO：18中所示的V_H區較佳。因此，本發明的較佳結合分子包含如SEQ ID NO：17中所示的V_L區以及如SEQ ID NO：18中所示的V_H區。然而，本文所揭示之V_L區和V_H區的其他組合也是可以想像的。因此，較佳具體例是具有如圖1中所示序列的人類化單株抗體TPP-3583。

因子XI

如本文先前所列，本發明的結合分子較佳地能夠結合至因子XI。

「因子XI」在本文又意指為「凝血因子XI」、「FXI」或「fXI」，是一個具有分子量約160千道耳頓(kD)的雙鏈醣蛋白。這兩條鏈是分子量約80,000道耳頓之相同多肽，經雙硫鍵結。FXI含有4個「蘋果結構域」(自N端起A1至A4，重鏈)以及1個C端催化結構域(輕鏈)。在不希望受到特定理論囿限的情況下，認為所述4個蘋果結構域含有用於其他蛋白質的FXI結合位點，諸如用於凝血酶的A1；用於HK的A2；用於因子IX(FIX)、GPIb與肝素的A3；以及用於FXIIa的A4。FXI可透過因子XIIa(FXIIa)被轉化成其活化形式凝血因子XIa(FXIa)。絲胺酸蛋白酶FXIa將凝血因子IX轉化成IXa，其之後活化凝血因子X(Xa)。Xa接而媒介凝血因子II/凝血酶活化。

具體而言，術語「因子XI」意指人類凝血因子XI，Uniprot Acc.No.為P03951，2015年10月14日的輸入版本194(SEQ ID NO：7)。如本文他處所述，本發明結合蛋白尤其預期結合至對應於SEQ ID NO：7之胺基酸200至283的胺基酸序列內的結構域。人類FXI的胺基酸編號包括訊號序列，始於位置1的胺基酸甲硫胺酸。

根據本揭示內容中使用時，術語「位置」表示本文所示胺基酸序列中某一個胺基酸的位置或本文所示核酸序列中某一個核苷酸的位置。本文所用的術語「對應」還包括位置不僅由前述核苷酸/胺基酸的數量確定，還在序列的周圍部分的環境中進行觀察。因此，本揭示內容中的特定胺基酸或核苷酸的位置可能因為序列中其他地方的胺基酸或核苷酸缺失或添加而改變。因此，當一個位置根據本揭示內容被稱為「對應位置」，應該理解，核苷酸/胺基酸可能在指定的數值不同，但仍然可以具有相似的比鄰核苷酸/胺基酸。為了確定在一個給定序列中的某個胺基酸殘基(或核苷酸)是否對應於一個「母本」胺基酸(或聚核苷酸序列)之胺基酸序列(或聚核苷酸序列)的特定位置(例如，如SEQ ID NO：7中所示的人類FXI)，習於技藝者可以使用本技藝中熟知的裝置和方法(例如序列比對)，手動或透過使用電腦程式(如本文所例舉者)。

術語「表位」一般意指抗原上的一個位點，典型的是(多)肽，其受到一個結合結構域所辨識，並也可以意指為「抗原性結構」或「抗原決定基」。術語「結合結構域」意指「抗原結合位點」，即特徵為具有結合至一個抗原或一群抗原(例如不同物種的相同抗原)上之給定目標表位及/或與其交互作用的結合分子的結構域。目標抗原可包含單一個表位，但通常包含至少兩個表位，且可包括任何數目的表位，這取決於抗原的大小、構形和類型。此外，應該注意的是，目標抗原上的「表位」通常是一個目標(多)肽，但也可以是或包括非多肽要素，例如，表位可包括碳水化合物側鏈。一般而言，術語「表位」涵蓋線性表位和構形性表位。線性表位是包含在胺基酸一級序列中的連續表位，並且通常包括至少2個胺基酸或更多個。構形性表位由因為目標抗原(特別是目標(多)肽)折疊而相鄰接的非連續胺基酸形成。

本發明的結合分子預期會辨識因子XI重鏈上的表位，其含有因子XI(SEQ ID NO：7)的至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個連續或不連續胺基酸的序列。

尤其預期本文提供的結合分子結合至人類因子XI的A3結構域，其包含SEQ ID NO：7的胺基酸200至283。

然而，亦預期結合分子可以是能夠結合至上述指定人類FXI的變體。與FXI一起使用時，術語「變體」意指相較於「母本」FXI序列包含一或多個胺基酸序列置換，缺失及/或添加的多肽，並展現出相同的生物學功能，即可被轉化具有絲胺酸蛋白酶活性並催化因子IX活化的活化形式FXIa.，從而觸發血液凝固的內因性路徑。胺基酸置換可以是保守的，如本文定義的，或非保守的或其任何組合。FXI變體可以在羧基端或胺基端(其中胺基端可以或可以不包含前導序列)具有胺基酸殘基添加。特別是，與FXI一起使用時，術語「變體」包括已知FXI多肽的同功型、對位基因變體或剪接變體，或轉譯後修飾變體(例如糖基化變體)，例如具有如SEQ ID NO：7 中所示序列的FXI多肽。將容易理解，本發明結合分子可以具體表現出對FXI變體的結合親和力，其包含對應於SEQ ID NO：7之胺基酸200至283的胺基酸序列，或具體是對應於下列的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：7的胺基酸201至215；b)SEQ ID NO：7的胺基酸221至222；c)SEQ ID NO：7的胺基酸252至254；d)SEQ ID NO：7的胺基酸259至261；e)SEQ ID NO：7的胺基酸270至273；及/或f)SEQ ID NO：7的胺基酸276至278。依據前述內容，也預期結合分子亦能夠結合至FXIa及其變體，只要它們包含至少一個與其對應之前述胺基酸延伸段或胺基酸位置。

本發明的結合分子亦能夠結合至其他哺乳動物物種的FXI，其他哺乳動物物種較佳為非人類靈長類動物物種。這些非人類FXI多肽較佳由FXI基因或其異種同源物或同種同源物所編碼，並且表現出與人類FXI相同的生物學功能。本發明結合分子的潛在非人類靈長類動物蛋白目標包括具有下列之多肽：Uniprot Acc No.H2QQJ4(黑猩猩，2015年11月11日的輸入版本26版)、Uniprot Acc.No.H2PEX7(蘇門達臘猩猩，2015年11月11日的輸入版本27版)、Uniprot Acc.No.A0A0D9S2M6(綠猴，2015年11月11日的輸入版本6版)、UniProt Acc.No.G3R2X1(西部低地大猩猩，2015年10月14日的輸入版本27版)、Uniprot Acc.No.A0A096NC95(棕狒狒，2015年11月11日的輸入版本11版)、Uniprot Acc.No.G1RLE8(白頰長臂猿，2015年11月11日的輸入版本28版)、Uniprot Acc.No.G7PKF5(石蟹獼猴，2015年10月14日的輸入版本13版)、UniProt Acc.No.G7MSF8(恆河獼猴，2015年10月14日的輸入版本12版)。上述多肽的變體也預期是本發明結合分子辨識的目標。由本發明結合分子所辨識的預期非人類靈長類動物多肽目標尤其預期是包含對應於SEQ ID NO：7的胺基酸200至283的序列，及/或對應於下列的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：7的胺基酸201至215；b)SEQ ID NO： 7的胺基酸221至222；c)SEQ ID NO：7的胺基酸252至254；d)SEQ ID NO：7的胺基酸259至261；e)SEQ ID NO：7的胺基酸270至273；及/或f) SEQ ID NO：7的胺基酸276至278，或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。因此，本文亦提供針對FXI的跨物種特異性結合分子，特別是在非人類靈長類動物中。術語「跨物種辨識」或「物種間特異性」如本文所用表示本文所述結合分子與在人類與非人類(尤其是非人類靈長類動物)物種中的相同目標多肽結合。

如先前所列，預期本文所述結合分子也能夠結合至人類或非人類靈長類動物因子XIa。因此，如同因子XI般於結合分子的結合特性上下文中揭示者較佳同樣適用於如因子XIa的結合特性，加以必要的變更。

抗體

本發明結合分子尤其預期是一種抗體。如技藝中所熟知，抗體為免疫球蛋白分子，能夠透過位於免疫球蛋白分子之可變區中的至少一個表位辨識位點特異結合至目標表位。術語「抗體」、「抗體分子」和「免疫球蛋白」可交替使用並以其在本文中最廣泛的意義使用，且包括原生抗體、單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、(天然存在或合成)抗體衍生物、片段或變體、包含所需特異性之抗原結合片段的融合蛋白以及包含所需特異性之抗原結合位點的任何其他抗體修飾構形。根據本發明，預期抗體如本文他處所述能夠結合至FXI，且較佳如隨附實例中所示表現出抗體TTP-3583和TTP-3577的有利特徵。

原生抗體

「原生抗體」是四聚體醣蛋白。在天然存在的原生抗體中，每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條「輕」鏈(約25kDa)和一條「重」鏈(約50-70kDa)。每條鏈的胺基端部分包括一個具有約100至 110或更多個胺基酸的「(高)變」區，主要負責抗原辨識。高變區包含來自「互補決定區」或CDR或「CDR區」的胺基酸殘基。「框架」或FR殘基是高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。

輕鏈和重鏈被分成在結構上與功能上同源的數個區域，稱為「恆定區」和「可變區」。術語「恆定」和「可變」使用於功能上。在這方面，應當理解輕鏈(V_L)和重鏈(V_H)的可變區均決定抗原辨識和特異性。術語「V_L」、「V_L區」及「V_L域」可於整份說明書交替使用，以意指輕鏈的可變區。同樣地，術語「V_H」、「V_H區」及「V_H域」在本文中可交替使用，意指重鏈的可變區。

術語「C_L」、「C_L區」及「C_L域」在本文中可交替使用，意指輕鏈的恆定區。術語「C_H」、「C_H區」及「C_H域」在本文中可交替使用，以意指重鏈的恆定區，且包含「C_H1」、「C_H2」及「C_H3」區或結構域。相反地，輕鏈的恆定區(C_L)及重鏈的恆定區(C_H1、C_H2或C_H3)賦予重要的生物學特性，例如分泌、穿胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合及類似特性。按照慣例，恆定區結構域的編號隨著它們變得更為遠離抗體的抗原結合位點或胺基端而增加。N端部分是可變區，而在C端部分是恆定區；C_H3和C_L區實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基端。

如上面所指出，可變區允許抗體選擇性地辨識並特異地結合抗原上的表位。也就是說，將在抗體之這些可變域的V_L區和V_H區或互補決定區(CDR)的子集組合而形成可變區，其定義出三維抗原結合位點。這種四級抗體結構形成存在於Y的每個臂的末端處的抗原結合位點。更具體來說，抗原結合位點由每個V_H區與V_L區的三個CDR(CDR1、CDR2、CDR3，遵循Kabat編號系統來決定)所界定。輕鏈的三個CDR在本文中亦指定CDR1 LC或CDR_L1、CDR2 LC或CDR_L2和CDR3 LC或CDR_L3。重鏈的三個CDR被稱為 CDR1 HC或CDR_H1、CDR2 HC或CDR_H2和CDR3 HC或CDR_H3。在原生抗體中，存在於每個抗原結合域中的六個「互補決定區」或「CDR」或「CDR區」是典型的非連續胺基酸短序列，當抗體在水性環境中採取其三維構形時，其經特別定位以形成抗原結合域。

正如本文先前所示，本發明的結合分子，且特別是抗體預期包含輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)或KSSQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：14)或由其組成，其中SEQ ID NO：8較佳；及/或輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)或由其組成；及/或輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)或由其組成；及/或重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)或由其組成；及/或重鏈的CDR2，包含序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)或HIWWDDDKYYNPSLKS(SEQ ID NO：15)或由其組成，其中SEQ ID NO：12較佳；及/或重鏈的CDR3，包含序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)或IRSSVYAHYYGMDV(SEQ ID NO：16)或由其組成，其中SEQ ID NO：13較佳。

根據本發明，一個尤佳的結合分子可以是單株抗體或其抗原結合片段，包含下列CDR：輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)或由其組成；輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)或由其組成；輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)或由其組成；重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)或由其組成；重鏈的CDR2，包含序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)或由其組成；以及重鏈的CDR3，包含序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)或由其組成，全部示於圖1中。習於技藝者將容易理解的是，CDR分別位於輕鏈與重鏈之可變區中。本發明的一個尤佳具體例為抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈之抗原結合位點以及重鏈之抗原結合位點，該輕鏈之抗原結合位點包含輕鏈的CDR1，包含如SEQ ID NO：8中所示的序列；輕鏈的CDR2，包含如SEQ ID NO：9中所示的序列；和輕鏈的CDR3，包含如SEQ ID NO：10中所示的序列；該重鏈之抗原結合位點包含重鏈的CDR1，包含如SEQ ID NO：11中所示的序列；重鏈的CDR2，包含如SEQ ID NO：12中所示的序列；和重鏈的CDR3，包含如SEQ ID NO：13中所示的序列。本發明的另一尤佳具體例為抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈之抗原結合位點及重鏈之抗原結合位點，該輕鏈之抗原結合位點包含輕鏈的CDR1，由如SEQ ID NO：8中所示的序列組成；輕鏈的CDR2，由如SEQ ID NO：9中所示的序列組成；和輕鏈的CDR3，由如SEQ ID NO：10中所示的序列組成；該重鏈之抗原結合位點包含重鏈的CDR1，由如SEQ ID NO：11所示中的序列組成；重鏈的CDR2，由如SEQ ID NO：12中所示的序列組成；和重鏈的CDR3，由如SEQ ID NO：13中所示的序列組成。包含前述CDR的單株抗體在隨附實例中進行評估並且在本文中命名為「TTP-3583」。

本發明結合分子，且特別是抗體，預期包含如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的V_L區，其中如SEQ ID NO：17中所示的V_L區較佳；及/或如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20中所示的V_H區，其中如SEQ ID NO：18中所示的V_H區較佳。因此，本發明的較佳抗體包含如SEQ ID NO：17中所示的V_L區以及如SEQ ID NO：18中所示的V_H區。但是也可想到本文揭示之V_L區以及V_H區的其他組合。

本發明結合分子，且特別是抗體，預期包含如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29中所示的輕鏈，其中如SEQ ID NO：27中所示的輕鏈較佳，及/或如SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30中所示的重鏈，其中如SEQ ID NO：28中所示的重鏈較佳。因此，本發明的較佳抗體包含如SEQID NO： 27中所示的輕鏈以及如SEQ ID NO：28中所示的重鏈。但是也可想到本文揭示之輕鏈以及重鏈的其他組合。

本發明的尤佳具體例是單株抗體或其抗原結合片段，包含如SEQ ID NO：17中所示的V_L區以及如SEQ ID NO：18中所示的V_H區。根據本發明的一個尤佳結合分子是單株抗體或其抗原結合片段，包含如SEQ ID NO：27中所示的輕鏈序列以及如SEQ ID NO：28中所示的重鏈序列。根據本發明的一個尤佳結合分子是單株抗體，由如SEQ ID NO：27中所示的輕鏈序列以及如SEQ ID NO：28中所示的重鏈序列組成。根據本發明的一個尤佳單株抗體是抗體TPP-3583。

各輕鏈與重鏈的羧基端部分定義出主要負責效應功能的恆定區。免疫球蛋白可分別依據其重鏈的恆定域的胺基酸序列分成不同類。重鏈分類為μ、△、γ、α及ε，並分別界定所述抗體同型為IgM、IgD、IgG，IgA和IgE。這些中的一些可以進一步分為亞類或同型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的同型具有不同的效應功能；例如，IgG1和IgG3同型通常具有ADCC活性。輕鏈被分類為κ或λ。每個重鏈類可與κ或λ輕鏈結合。輕鏈和重鏈大體上彼此共價鍵結，且兩個重鏈的「尾部」部分透過二硫鍵共價鍵結或非共價鍵結彼此結合。根據本發明的抗體可以是IgG抗體，特別是IgG1。

單株抗體

尤其預期本發明為單株抗體及其抗原結合片段。術語「單株抗體」如本文所用意指由基本上同質的抗體群所獲得的抗體，即構成該抗體群的個別抗體都相同，除了可能出現少數的天然突變以外。相對於典型包括針對不同表位的不同抗體之習知(多株)抗體製品，單株抗體包含基本上相似的表位結合位點和因此通常針對抗原上的相同表位。術語「單株抗體」因而包括重組、嵌合、人類化、人類，或人類工程化^TM單株抗體。

用於產生單株抗體的各種製造方法是本技藝中已知的，並且描述於，例如Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.116-227(Academic Press,1996)中。適當技術包括首先由Kohler et al.,Nature,256：495(1975)中所述的融合瘤方法，使用首先描述於McCafferty et al.,Nature,348：552-554(1990)中的重組DNA方法，其涉及分離與定序編碼單株抗體之DNA，及其後續引入並表現於適當宿主細胞中，以及由抗體噬菌體庫分離抗體。

嵌合抗體

如本文他處所示，術語「抗體」也包括嵌合抗體。短語「嵌合抗體」如本文所用意指含有典型源自不同物種的兩個不同抗體衍生之序列的抗體。具體而言，該術語意指抗體在重鏈及/或輕鏈中的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類或亞類之抗體中的對應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分與源自另一物種或屬於特定抗體類或亞類之抗體中的對應序列相同或同源。

換句話說，術語「嵌合抗體」認為是表示任何抗體，其中抗原結合位點得自於或衍生自第一物種而恆定區(其可以是完整的，部分的或根據本發明經修飾)得自於第二物種。例如，抗原結合位點可以是來自非人類來源(例如小鼠或靈長類動物)而恆定區可以是人類。

通常嵌合抗體可以例如包含人類與鼠類抗體片段，通常是人類恆定區和小鼠可變區。

人類化抗體

正如本文先前所示，本發明尤其是關於衍生自如WO 2009/067660 A2中所述之小鼠抗人類FXI 1A6的(單株)人類化抗體及其抗原結合片段。

「人類化抗體」一般被定義為是(I)源自非人類來源(例如帶有異源性免疫系統的轉殖小鼠)，該抗體是基於人類生殖系序列；或(II)CDR經移植，其中可變區的CDR區來自非人類來源，而一或多個框架區及/或可變區之一部分CDR序列具有人類來源且通常是人類來源的恆定區(如果有的話)。

術語「人類化抗體」因而包括抗體，其中可變區在人類抗體的重鏈或輕鏈或兩者中透過將具有已知特異性之非人類抗體的一或多個CDR至少部分取代，且如果必要的話透過將部分框架區取代和序列變化而改變。換句話說，一個其中一或多個「供體」CDR是來自具有已知特異性之非人類抗體(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物抗體)被移植到人類重鏈或輕鏈框架區的抗體在本文中被稱為「人類化抗體」。它不必然會將所有CDR取代成供體可變域的完整CDR以將一個可變域的抗原結合能力轉移至另一者。相反地，它可能只需要轉移那些維持目標結合位點活性所必須的殘基。

發明人透過確定1A6 CDR殘基並分別從資料庫選出與鼠類V_H及V_L序列具有最佳整體同源性的人類生殖系序列作為受體人類生殖系框架用於移植V_H及V_L CDR，如實驗1中所詳述。之後，如實例2中所述，透過將1A6中的胺基酸交換成人類生殖系序列中在序列一致性及同源性方面最相近的對應胺基酸，使所產生的人類化胺基酸進行CDR最佳化(「生殖系化」)。然後，發明人發現到，經生殖系化的人類化1A6抗體在CDR序列中包含10、11、12、13或14個胺基酸置換，特別是包含本文他處所揭示的CDR序列，其在結合特徵和生物學活性方面表現出有利性質，但具有更多個胺基酸置換(TTP-3283，TTP3290)或更少個胺基酸置換者卻沒有。

關於本發明的目的，CDR已經最佳化的人類化抗體(「生殖系化」)包含在術語「人類化」抗體內。

人類化抗體之重鏈或輕鏈或兩者之可變區中的框架區(FR)可僅只包含人類來源的殘基，其中人類化抗體的這些框架區被稱為「完全人類框架區」。包含人類與供體的混合框架殘基的人類框架區在本文被稱為「部分人類框架區」。此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中都沒有發現到的殘基。進行這些修飾以進一步提升抗體性能(例如，獲得所需親和力)。

一般而言，人類化抗體因此包含基本上所有的至少一個，並且通常是兩個可變區，其中全部或部分CDR對應於非人類免疫球蛋白的可變區，且全部或基本上全部FR是人類免疫球蛋白序列的FR。人類化抗體視情況還將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白恆定區。

人類抗體

「人類」抗體在此被定義為一個不是嵌合或「人類化」的抗體，且不是來自(全部或部分)非人類物種。人類抗體或功能性抗體片段可以衍生自人類或者可以是合成人類抗體。「合成人類抗體」在本文中定義為具有全部或部分使用電腦從基於分析已知人類抗體序列的合成序列衍生而來的序列。電腦設計人類抗體序列或其片段是可以實現的，例如，透過分析人類抗體或抗體片段序列的資料庫並利用由此獲得的數據而設計出胺基酸序列。人類抗體或功能性抗體片段的另一個實例是一個由人類來源的抗體序列庫中分離的核酸所編碼者(意即，此等庫是基於來自人類天然來源的抗體)。

片段、變體及衍生物

如本文先前所示，本發明含括全長抗體及其抗原結合片段，變體和衍生物。

片段

術語「抗體片段」意指衍生自一個「親本」抗體且保持其基本結構和功能的多肽。抗體片段因而較佳能夠結合至其特定的抗原，即FXI。此外，本發明之抗體片段包含抗體的最低結構要求，其允許抗原結合。此最低要求可以例如透過存在至少三個輕鏈CDR(即V_L區的CDR1、CDR2和CDR3，即CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3)及/或三個重鏈CDR(即V_H區的CDR1、CDR2和CDR3，即CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3)來界定。換句話說，術語「抗體片段」意指一個「功能性」或「抗原結合」多肽，其保留「親本」抗體的抗原結合位點(意即CDR和視情況(部分)FR)。本發明的抗體片段可以衍生自例如單株、重組、嵌合，人類化和人類「親本」抗體。

較佳的抗原結合抗體片段包含下列至少一個，較佳全部：輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)；輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)；輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)；重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)；重鏈的CDR2，包含序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)；以及重鏈的CDR3，包含序列鏈IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)。

根據前述，術語「抗原結合抗體片段」尤其意指全長抗體的片段，例如(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab'、F(ab')2或「r IgG」(「半抗體」)。本發明的抗體片段也可以是經修飾的抗體片段，如scFv、二scFv或雙-scFv、scFv-Fc、scFv拉鍊、scFab、Fab2、Fab3、雙抗體、單鏈雙抗體、串聯雙抗體(Tandab’s)、串聯二scFv、串聯三scFv、「微型抗體」，結構例示如下；(V_H-V_L-CH₃)₂、(scFv-CH₃)₂或(scFv-CH₃-scFv)₂、多抗體如三抗體或四抗體。此外，術語「抗體片段」的定義包括含有該片段的建構物，即單價、二價和多價(polyvalent)/多價(multivalent)建構物，因此透過獨特抗原結合位點，單特異性建構物僅特異地結合至一個目標抗原，而雙特異性和多特異性/多特異性建構物特異地結合一個以上的目標抗原，例如兩個、三個或更多個。此外，術語「抗體片段」的定義包括僅由一個多肽鏈組成的分子以及由多於一個多肽鏈組成的分子，該等鏈可以相同(同二聚體、同三聚體或同寡聚物)或不同(異二聚體，雜三聚體或雜寡聚體)。

可以透過重組DNA技術或透過完整抗體的酶促或化學切割來製造抗體片段。用於製造此等片段的方法是本技藝中所熟知的。

變體

術語「變體」意指包含一個「親本」結合分子之胺基酸序列的多肽，例如抗體或抗體片段，但是相較於「親本」胺基酸序列含有至少一個胺基酸修飾(例如，置換、缺失或插入)，先決要件是該變體仍能夠(特異地)結合至FXI，尤其是如SEQ ID NO：7中所示的人類FXI，且較佳地相較於抗體TTP-3583及/或TTP-3577表現出類似或更為增進的特徵，如隨附實例中所評估般。本發明結合分子(尤其是抗體和抗體片段)的變體通常透過將合適的核苷酸變化引入編碼抗體或抗體片段的核酸，或透過肽合成來製備。一般來說，前述胺基酸修飾可以被引入，或存在於可變區或恆定區中，前提是相較於如SEQ ID NO：1、2、3、4，5和6中所示的1A6 CDR，變體的兩個或更多個CDR累積包含10、11、12，13或14個胺基酸置換。胺基酸修飾例如可以被引入以調整抗體特性，像是會影響醫藥開發的熱力學穩定性、溶解性或黏度(「序列最佳化」)。

正如先前所示，胺基酸修飾包括，例如缺失及/或插入、及/或置換本文所述結合分子之胺基酸序列內的殘基，較佳為抗體或抗原結合抗體片段。缺失、插入和置換的任何組合可被引入「親本」胺基酸序列，以便於產生終產物，前提是它具有如本文他處所示的期望特徵。胺基酸修飾也可以改變結合分子的轉譯後加工，諸如改變糖基化位點的數目或位置。

舉例而言，在每個CDR中可以插入或刪除1、2、3、4、5或6個胺基酸(當然，取決於其長度)，且在每個FR中可以插入或刪除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，或25個胺基酸。在本文中預期胺基酸序列插入包括長度範圍為1、2、3、4、5、6、7、8，9或10個殘基以N端及/或C端融合至具有上百或更多殘基的多肽，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。本發明結合分子(特別是抗體或抗體片段)的插入變體包括具有抗體或抗體片段與酶或另一種功能性多肽(例如，其增加結合分子的血清半衰期，結合分子為例如抗體或抗體片段)的融合產物。

胺基酸置換可以被引入重鏈及/或輕鏈的CDR(特別是高變區)，或重鏈及/或輕鏈的FR區。本文特別預期保守性胺基酸置換可以基於，例如所涉及殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性，及/或兩親媒性性質相似性來進行。

較佳地，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸可在CDR中被置換-前提是該抗體變體相較於如SEQ ID NO：1-6中所示的1A6 CDR累積包含10、11、12、13或14個胺基酸置換，且在框架區(FR)中可置換1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，或25個胺基酸，這取決於CDR或FR的長度。

通常，如果重鏈及/或輕鏈之CDR的一或多者或全部中的胺基酸經置換時，較佳為所得到的「變體」序列與「親本」CDR序列至少80%，又更佳至少90%且最佳至少95%、96%、97%、98%或99%一致。CDR的長度從而影響可能的胺基酸置換數目，以使變體序列仍然被本發明所涵括。例如，具有5個胺基酸的CDR與其經置換序列為80%一致，以具有至少一個胺基酸取代。因此，抗體建構物的CDR與其經置換序列可具有不等程度的一致性，例如CDR_L1可能具有80%，而CDR_L3可能具有90%。

較佳的置換(或取代)是保守性置換。然而，預期有任何置換(包括非保守性置換或例示性取代的一或多者)，只要抗體建構物保留其結合FXI的能力及/或其CDR與經置換序列具有至少80%，又更佳至少90%和最佳至少95%、96%、97%，98%或99%一致性。

如本文中所用，術語「序列一致性」表示兩個(核苷酸或胺基酸)序列在一個對準的相同位置處具有相同殘基的程度，並且通常用百分比表示。較佳地，一致性是對要比較序列的整個長度進行確認。因此，完全相同序列的兩個複本具有100%一致性，但較不那麼高度保守且具有缺失、添加或取代的序列可能具有較低程度的一致性。習於技藝者將認知到，數種演算法可用於使用標準參數來確定序列一致性，例如Blast(Altschul,et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith,et al.(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)以及ClustalW。因此，SEQ ID：8、9、10、11、12或13的胺酸序列或SEQ ID NO：31或32的核苷酸序列可作為「目標序列」或「參考序列」，而與其不同之多肽的胺基酸序列或核酸序列可以作為「查詢序列」。

術語「序列同源性」指出由一個共同祖先派生而來的兩個(核苷酸或胺基酸)序列的相似性。同源生物組分(基因、蛋白質、結構)被稱為同系物且包括異種同源物與同種同源物。

相較於包含「親本」CDR的結合分子(尤其是如SEQ ID NO：8、9、10、11、12和13)，本發明的較佳結合分子變體在CDR區中具有至少 80%，又更佳至少90%，且最佳至少95%、96%、97%、98%、99%或幾乎100%的序列一致性或同源性，且表現出對FXI有相媲美或增進的結合親和力及/或相當或增進的生物學活性。

此外，編碼個別變體CDR的核苷酸序列與本文所示核苷酸序列的核酸序列同源性或相似性為至少80%，並且更典型地較佳同源性或一致性增加至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或99%，以及幾乎100%。

除了在CDR和FR中以外，胺基酸修飾也可引入結合分子的Fc部分，結合分子較佳是單株抗體或其抗原結合片段。這樣的修飾可以用來調節抗體的功能特性，例如與補體蛋白(諸如C1q)及/或其他免疫細胞上的Fc受體交互作用，或者調節血清半衰期或抗原依賴性細胞毒性(ADCC)。因此，用於修飾效應功能的突變可以使用本技藝中已知的常規方法被引入Fc結構域。例示性修飾包括Asn297→Ala297和Asn297→Gln297，導致IgG1的糖基化，或Lys322→Ala322以及視情況Leu234→Ala234和Leu235→Ala234，已報導會降低或消除抗體衍生之細胞介導的細胞毒性(ADCC)及/或補體衍生的細胞毒性(CDC)。

衍生物

術語「結合分子」也含括衍生物。本文特別預期如本文他處所揭示之抗體或抗體片段的衍生物。術語「衍生物」通常意指已被共價修飾而引入額外功能性的結合分子。結合分子的共價修飾通常但不一定是在轉譯後進行，並且可以透過使分子的特定胺基酸殘基與能夠和N端或C端殘基之選定側鏈反應的有機衍生劑反應而引入到結合分子。結合分子衍生化可用於附接治療劑或診斷劑、標記物、延長分子之血清半衰期的基團，或插入非天然胺基酸。本發明結合分子的可能化學修飾包含醯化或乙醯化N端或醯胺化或酯化C端，或可替換地兩者均有。也預期諸如以下的化學修飾：烷基化(例如甲基化、丙基化、丁基化)、芳基化，和醚化。

延長血清半衰期

關於延長結合分子(特別是本發明抗體及其抗原結合片段)之血清半衰期的方法實例包括附接上在人類體內結合至其他蛋白質的肽或蛋白結構域(諸如血清白蛋白、免疫球蛋白Fc區或新生兒Fc受體(FcRn))。其他會延長血清半衰期的可想到修飾包含將胺基延伸具有不同長度的多肽鏈(例如，XTEN技術或PASylation®)、綴合非蛋白質聚合物，包括但不限於各種多元醇，諸如聚乙二醇(PEG化)、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物；或碳水化合物，如羥乙基澱粉(例如HESylation®)或聚唾液酸(例如PolyXen®技術)。另外，如本技藝中已知的，胺基酸置換可以在結合分子內的不同位置上進行，以便於添加該聚合物。

糖基化

結合分子(尤其是本發明抗體及其抗原結合片段)的另一類共價修飾包含改變其糖基化模式。如在本技藝中已知的，糖基化模式可取決於該分子的胺基酸序列(例如，存在或不存在特定糖基化胺基酸殘基，在下面討論)，或生產蛋白質的宿主細胞或生物。多肽的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接的意指碳水化合物部分附接至天冬醯胺酸殘基的側鏈。將N-連接的糖基化位點添加至結合分子是便利地透過改變胺基酸序列來達成，使胺基酸序列含有一或多個選自下列的三肽序列：天冬醯胺酸-X-絲胺酸和天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X是脯胺酸以外的任何胺基酸)。O-連接的糖基化位點可透過將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至起始序列或予以置換而被引入。

另一個結合分子糖基化的方法是透過使糖苷與蛋白質化學或酶促偶接。這些程序是有利的，因為它們不需要在能夠進行N-與O-連接糖基化的宿主細胞中生產蛋白質。根據所使用的偶接模式，糖可以附接至(a)精胺酸和組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基，例如半胱胺酸的游離巰基、(d)游離羥基，例如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸的游離羥基、(E)芳族殘基，諸如苯丙胺酸，酪胺酸或色胺酸的芳族殘基，或(f)麩醯胺酸的醯胺基。

同樣地，去糖基化(即，移除存在於結合分子上的碳水化合物部分)可以化學的方式(例如，透過將結合分子暴露於三氟甲磺酸)，或酶促的方式藉由採用內切和外切糖苷酶來完成。

標記

本發明結合分子的更多潛在共價修飾包含添加一或多個標記物。該標記基團可以經由具有各種長度的間隔子被偶接至結合分子，以降低潛在的空間位阻。用於標記蛋白質的各種方法在本技藝中是已知的，並且可以在實施本發明時使用。術語「標記物」或「標記基團」意指任何可檢測的標記物。一般而言，標記物有各式各樣，這取決於它們要檢測的分析-下面例示性標記物包括，但不限於：同位素標記物，其可以是放射性或重同位素，諸如放射性同位素或放射性核種(例如，3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)；磁性標記物(例如磁性粒子)；氧化還原活性部分；光學染料(包括，但不限於發色團，磷光體和螢光團)，如螢光基團(例如，FITC、羅丹明、鑭系磷光體)、化學發光基團，以及螢光團(它可以是「小分子」螢光團或蛋白質螢光團)；酶基團(例如辣根過氧化酶、β半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶；生物素化基團；被一個二級報導子所辨識的預定多肽表位位(例如，白胺酸拉鍊對序列、二級抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標籤等等)。

ADC

也預期對結合分子(尤其是抗體或其抗原結合片段)添加藥物，諸如小分子化合物。「抗體藥物綴合物」，縮寫「ADC」是連接至藥物或藥劑的抗體或其抗原結合片段。鍵聯可透過共價鍵或非共價交互作用(諸如透過靜電力)建立。在本技藝中可採用已知各種連接子以形成如技藝中已知與本文中所述的ADC。

親和力標籤

本發明結合分子(特別是抗體或其抗原結合片段)亦可包含額外結構域，該等結構域有助於純化和分離分子(親和力標籤)。此等額外結構域的非限制性實例包含已知為Myc-標籤、HAT-標籤、HA-標籤、TAP-標籤、GST-標籤、幾丁質結合結構域(CBD-標籤)、麥芽糖結合蛋白(MBP-標籤)、Flag-標籤、Strep-標籤及其變體(例如，Strep II-標籤)和His-標籤。

上述的片段、變體和衍生物可以進一步調整以提高，例如其抗原結合特性。例如，F(ab')₂或Fab可以被工程改造以將C_H1與C_L域之間發生的分子間二硫相互作用降至最低或完全消除。Fv多肽還進一步包含在V_H與V_L域之間的多肽連接子，使Fv能夠形成所需結構供抗原結合。Fab片段還含有輕鏈的恆定域及重鏈的第一恆定區(CH₁)。Fab片段與於Fab'片段不同處在於加入了幾個殘基於重鏈CH₁區的羧基端，包括來自抗體鉸鏈區的一或多個半胱胺酸。Fab'-SH在本文是關於Fab'的名稱，其中恆定區的半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基。F(ab')2抗體片段最初是如成對的Fab'片段被生產出來，在它們之間具有鉸鏈半胱胺酸殘基。

可呈「經分離的」或「基本上純的」形式提供本發明的結合分子。當用於本文時，「經分離的」或「基本上純的」表示結合分子已從其生產環境的組分被鑑定、分開及/或回收，使得「經分離的」結合分子不含或基本上不含其生產環境中的其他污染組分而可能會干擾其治療或診斷用途。污染組分可以包括酶、激素，和其他蛋白質或非蛋白質溶質。「經分離的」結合分子因而將透過至少一個移除或基本上移除這些污染組分的純化步驟來製備。經過必要的修改後，前述定義同樣適用於「經分離的」聚核苷酸。

特異性結合

本發明結合分子(特別是抗體及其抗原結合片段)有利地能夠結合至因子XI，特別是包含如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列或由其組成的人類因子XI。術語「結合至」及「辨識」在本文所有語法形式中可交替使用。較佳地，該結合分子特異地結合至因子XI。術語「特異地結合」通常表示一個結合分子(尤其是如本文所述抗體或其抗原結合片段)經由其抗原結合位點更容易地結合至其預期的目標表位，而不是一個隨機、無關的非目標表位。具體而言，術語「特異地結合」表示結合分子對其目標表位的親和力將會是其對非目標表位之親和力的至少約5倍，較佳10倍、更佳25倍，甚至更佳50倍，和最佳100倍或更多。

因此，若結合分子(特別是抗體或其抗原結合片段)對目標表位以少於對非目標表位的抗體解離常數(K_D)的K_D結合至該表位，則結合分子可被視為特異地結合至該目標表位。本發明結合分子還可以其對因子XI(尤其是人類因子XI)的結合親和力來描述。術語「親和力」或「結合親和力」意指是一個單獨表位與抗原結合結構域(且特別是結合分子的CDR)的結合強度。特定結合分子與其特異性表位的結合親和力通常是透過測量平衡締合常數(Ka)與平衡解離常數(Kd)，並計算Kd對Ka的商(K_D=kd/ka)來確定。結合親和力可使用常規技術，如透過平衡透析；透過使用BIAcore 2000儀器；透過使用經放射性標記之目標抗原的放射免疫分析；或透過習於技藝者熟知的另一種方法容易地確定。親和力數據可以被分析，例如，透過在 Kaufman RJ and Sharp PA.(1982)J Mol Biol.159：601-621中所描述的方法。本發明結合分子的較佳結合親和力包括那些具有小於以下的解離常數或K_D者；5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M、10^-8M、5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M或10^-15M。

交叉反應性

術語「特異地結合」並不排除(特異地)結合至人類因子XI的結合分子與來自不同物種的因子XI蛋白質交叉反應。因此，本發明結合分子也能夠結合至其他哺乳動物物種(較佳如本文他處列舉的非人類靈長類動物物種)的FXI。

「跨物種」結合或辨識表示本文所述結合域結合至人類和非人類物種中的相同目標抗原。因此，「跨物種特異性」應理解為對在不同物種中表現之因子XI的物種間反應性，而不是因子XI以外的抗原。例如，結合至人類因子XI(尤其是包含如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的胺基酸200至283之A3結構域)的結合結構域也結合至非人類靈長類動物因子XI，而且特別是對應於SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列的胺基酸200至283的區域。

生物學活性

本文提供的結合分子預期具有生物學活性，即結合至因子XI及/或因子XIa並阻斷其各自的生物學功能。具體而言，根據本發明的「生物學活性」結合分子阻斷因子XI轉化成其活化形式(因子XIa)及/或阻斷下游凝血因子IX結合至因子XIa，較佳完全或部分抑制XI及/或因子XIa活性。因此，生物活性結合分子與其目標因子XI及/或因子XIa的結合預期會產生抗凝血活性。換句話說，預期根據本發明的結合分子經由下列而展現其有益功能：a)結合至因子XI，從而阻斷其轉化成其活化形式因子XIa，及/或b)結合至因子XIa，從而阻斷其結合至並活化下游凝血因子IX。本發明的結合分子從而較佳地中斷凝血級聯的「FXI分支」，並因而防止血栓形成，而有利不損害正常止血。

結合分子的抗凝血活性可以在活體外如隨附實驗中所述般進行測定。簡言之，在存在有不同濃度該結合分子或對應溶劑的情況下，使用商業測試套組(Roche的PTT試劑)來測定活化部分凝血激酶時間(aPTT)。將測試化合物與血漿和PTT試劑(腦磷脂、高嶺土)一起在37℃下培育3分鐘。然後透過加入25mM氯化鈣啟始凝血，並且確定當凝血發生的時間。確定使aTPP延長1.5倍的測試物質濃度。

預期本發明結合分子在以下濃度時延長aPTT達1.5倍：0.03μM或更少，或0.015μM或更少，或0.01μM或更少。

有利地，本發明結合分子(且特別是單株抗體及其抗原結合片段)展現出上述生物學性質，並因此是有希望抑制血栓形成的新藥劑。因為結合分子特別預期會特異地結合至因子XI，預期它們不會，或不會嚴重危及到止血，從而較佳地不增加出血風險。

聚核苷酸

本發明進一步提供一種編碼本發明結合分子或V_H或V_L域的聚核苷酸/核酸分子。

術語「聚核苷酸」如本文所用包含聚核糖核苷酸和聚去氧核糖核苷酸，例如經修飾或未經修飾的RNA或DNA，各自呈單股及/或雙股形式，線性或環狀，或其混合物，包括雜交分子。聚核苷酸可包含常規磷酸二酯鍵或非常規的鍵(例如，醯胺鍵，諸如在肽核酸(PNA)中發現者)。本發明聚核苷酸還可含有一或多個經修飾鹼基，諸如例如三苯甲基化鹼基和不常見的鹼基(如肌苷)。也預期其他修飾(包括化學，酶促或代謝修飾)，只要本發明結合分子可以從聚核苷酸表現即可。聚核苷酸可以呈經分離形式如本文他處所定義來提供。聚核苷酸可以包括調節序列，諸如轉錄控制要素(包括啟動子、增強子、操縱子、抑制子，和轉錄終止訊號)、核糖體結合位點，內含子或類似物。

因此，本發明提供了一種聚核苷酸，其包含編碼免疫球蛋白重鏈區(V_H區)的核酸或由其組成，其中V_H區的CDR的至少一個CDR具有與SEQ ID NO：11、12、13、15或16中任一者至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%，或一致的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：11-13較佳。另外，本發明包括一種聚核苷酸，其包含編碼V_H區的核酸或由其組成，該核酸具有與選自由SEQ ID NO：18與20組成之群的參考V_H區胺基酸序列至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%，或100%一致的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：18較佳。包含經編碼CDR或V_H域的結合分子預期能夠結合至FXI且較佳展現出如本文他處所述的期望生物學活性。

此外，本發明提供一種聚核苷酸，其包含編碼免疫球蛋白輕鏈結構域(V_L區)的核酸或由其組成，其中V_L區的至少一個CDR具有與SEQ ID NO：8、9、10或14任一者至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%，或一致的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：8-10較佳。此外，本發明包括一種聚核苷酸，其包含編碼V_L區的核酸或由其組成，該V_L區具有與選自由SEQ ID NO：17或19組成之群的參考V_L區胺基酸序列至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%，或100%一致的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：17較佳。預期包含經編碼CDR或V_L區的結合分子能夠結合至FXI且較佳展現出如本文他處所述的期望生物學活性。

再者，本發明提供了一種經分離的聚核苷酸，其包含與選自由SEQ ID NO：31、32、33和34組成之群的參考聚核苷酸序列至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%，或100%一致的核酸或由其組成。

上文所述的聚核苷酸可以或可以不包含額外核苷酸序列，其編碼例如訊號肽以指揮經編碼多肽、如本文所述之抗體恆定區或如本文所述其他異源性多肽的分泌。因此，此等聚核苷酸可以編碼本文所述結合分子的融合多肽、片段，變體和其他衍生物。

另外，本發明包括包含一或多種上述聚核苷酸的組成物。本文還提供包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的組成物，其中該第一聚核苷酸編碼如本文所述的V_H區，而其中該第二聚核苷酸編碼如本文所述的V_L區；具體而言是包含以下或由以下組成的組成物：選自由SEQ ID NO：18和20組成之群的V_H區(其中SEQ ID NO：18較佳)，及/或選自由SEQ ID NO：17和19組成之群的V_L區(其中SEQ ID NO：17較佳)。

聚核苷酸的生產

本發明的聚核苷酸可透過技藝中習知的常規方法來生產。例如，如果結合分子的核苷酸序列是已知的，便可以由化學合成的寡核苷酸、黏合並接合彼等寡核苷酸，然後透過PCR擴增經接合的寡核苷酸來組裝編碼結合分子的聚核苷酸。透過PCR擴增使用雜交至序列3'端和5'端的合成引子，或透過使用對特定基因序列具有特異性的寡核苷酸探針來進行選殖以鑑別編碼結合分子之cDNR庫的cDNA選殖株，可以從適當來源(例如，cDNA庫，或自任何組織或諸如融合瘤細胞之表現結合分子的細胞中分離的核酸，諸如聚(A)+mRNA)獲得編碼結合分子的聚核苷酸。

在確定結合分子的核苷酸序列和對應胺基酸序列之後，可以使用技藝中熟知用於操作核苷酸序列的方法對其核苷酸序列進行修飾，用於操作核苷酸序列的方法為例如重組DNA技術、定點誘變、PCR等，從而將一或多個核苷酸置換、添加或缺失引入至聚核苷酸序列(參見，例如在J.Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(4th edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2012)中所述的技術)，以產生結合分子的非天然存在片段、變體或衍生物，特別是本文所述的單株抗FXI抗體(例如，免疫球蛋白重鏈區或輕鏈區)。

載體

本文進一步提供包含如本文所述之聚核苷酸的載體。該聚核苷酸編碼本發明的結合分子，具體而言是單株抗體或其抗原結合片段。「載體」是用做為將(外來)遺傳物質轉移至宿主細胞中的媒介，遺傳物質可以例如在其中複製及/或表現。

術語「載體」含括，但不限於質體、病毒載體(包括逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、多瘤病毒載體，以及腺病毒相關載體(AAV))、噬菌體、噬菌粒、黏粒和人工染色體(包括BAC和YAC)。載體本身通常是核苷酸序列，更常見為包含一個插入物(轉基因)以及一個作為載體「骨架」的較大序列的DNA序列。經工程改造的載體通常包含一個在宿主細胞中自主複製的源點(如果希望聚核苷酸穩定表現的話)、選擇標記，以及限制性內切酶切割位點(例如多選殖位點，MCS)。載體可以另外包含啟動子、遺傳標記、報導基因、靶向序列，及/或蛋白質純化標籤。被稱為表現載體(表現建構物)的載體是專門為在目標細胞中表現轉基因而設計，通常具有控制序列。

彼等習於技藝者熟知許多合適的載體且許多是市售的。在J. Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(4th edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2012)中提供了合適載體的實例。

靶定載體

靶定載體可以被用於將一個聚核苷酸併入至宿主細胞的染色體中(例如由described by J.Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(4th edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2012)所述)。簡言之，合適的方法包括同源重組或使用特異地靶向併入位點之序列的雜交重組酶。靶向載體通常為環狀且在用於同源重組之前予以線性化。或者，外來聚核苷酸可以是透過融合PCR連接的DNA片段或者是合成地建構的DNA片段，其接而被重組至宿主細胞中。也可以使用異源重組導致隨機或非靶向併入。

生產 表現載體

「表現載體」或「表現建構物」可用於轉錄異源性聚核苷酸序列(例如那些編碼本發明的結合分子者)並且在合適的宿主細胞中轉譯其mRNA。這個過程在本文也被稱為本發明結合分子的「表現」。除了一個複製源點、選擇標記，和限制酶切割位點以外，表現載體通常包括一或多個可操作地連接至待表現異源性聚核苷酸的調節序列。

術語「調節序列」意指一個在特定宿主生物中表現(異源性)聚核苷酸之可操作地連接編碼序列所必須的核酸序列，且因而包括轉錄和轉譯調節序列。一般來說，在原核生物中表現異源性聚核苷酸序列所需的調節序列包括啟動子、視情況操縱子序列，以及核糖體結合位點。在真核生物中，啟動子、聚腺苷酸化訊號、增強子和視情況剪接訊號通常必需的。此外，特定起始訊號及分泌訊號也可被引入至載體中以允許感興趣的多肽分泌到培養基中。

當一個核酸與另一個核酸序列以功能性關係被安置時(特別是在同一個聚核苷酸分子上)，這個核酸是「可操作地連接」。例如，一個啟動子能夠影響一個異源性基因的編碼序列表現時，啟動子與該編碼序列是可操作地連接。啟動子通常位於編碼感興趣多肽之基因的上游並且調節基因的表現。

用於哺乳動物宿主細胞表現的例示性調節序列包括病毒要素，其在哺乳動物細胞中指揮表現大量蛋白質，諸如來自巨細胞病毒(CMV)的啟動子及/或增強子(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒。關於病毒調節要素及其序列的更多說明(參見Stinski的美國5,168,062；Bell等人的US 4,510,245；Schaffner等人的美國4,968,615)。一如前述，表現載體也可以包括複製源點和選擇標記。

如前述，本發明載體可進一步包含一或多種選擇標記。與真核宿主細胞一起使用的合適選擇標記包括，但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hgprt)，和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(aprt)基因。其他基因包括dhfr(甲胺蝶呤抗性)、gpt(黴酚酸抗性)、neo(G-418抗性)和hygro(潮黴素抗性)。載體擴增可用以增加表現量。一般來說，選擇標記基因可以直接連接至要表現的聚核苷酸序列，或者透過共轉形被引入相同的宿主細胞。

考慮到上述，本發明因而進一步提供一或多種如本文所述插入至載體中的聚核苷酸序列。因此，本發明尤其提供包含編碼本發明結合分子或其重鏈或輕鏈、或重鏈或輕鏈可變域可操作地連接至啟動子之核苷酸序列的可複製載體。此等載體可包括編碼結合分子之恆定區的核苷酸序列，且結合分子的可變域可被選殖至載體中供用於表現整個重鏈或輕鏈。

宿主細胞

一般而言，多種宿主細胞可用以從表現載體表現本發明的結合分子。如本文所用，「宿主細胞」意指可以是或已是聚核苷酸或載體或編碼本發明結合分子之接受者的細胞。具體而言，宿主細胞還可以表現並視情況分泌該結合分子。在關於從宿主細胞獲得結合分子的方法說明中，除非另有明確指定，否則術語「細胞」和「細胞培養物」可交替使用，表示結合分子的來源。術語「宿主細胞」還包括「宿主細胞株」。

一般而言，該術語包括原核生物細胞或真核生物細胞，且在不受限制的情況下還包括細菌、酵母細胞、真菌細胞，植物細胞和動物細胞(諸如昆蟲細胞和哺乳動物細胞，例如鼠類、大鼠，獼猴或人類細胞)。

本發明的聚核苷酸及/或載體可使用在本技藝中熟知的常規方法(例如透過轉染、轉形，或類似方法)被引入至宿主細胞中。

「轉染」是將核酸分子或聚核苷酸(包括載體)有意地引入至目標細胞中的方法。該術語主要用於在真核生物細胞中的非病毒方法。轉導通常用於說明核酸分子或聚核苷酸的病毒媒介的轉移。動物細胞的轉染通常涉及在細胞膜中打開瞬時孔或「洞」以允許攝入物質。轉染可以使用磷酸鈣，透過電穿孔、透過細胞擠壓或透過將陽離子脂質與材料混合以產生脂質體(其與細胞膜融合並將其攜帶物貯存其內)來進行。用於轉染真核生物宿主細胞的例示性技術包括脂質囊泡媒介的攝入、熱休克媒介的攝入、磷酸鈣媒介的轉染(磷酸鈣/DNA共沉澱)，顯微注射和電穿孔。

術語「轉形」用於描述核酸分子或聚核苷酸(包括載體)以非病毒的方式轉移至細菌，還有非動物真核生物細胞(包括植物細胞)中。故轉形是因為從細菌或非動物真核生物細胞透過細胞膜從它的周圍直接攝入以及之後併入外源性遺傳物質(核酸分子)所產生的遺傳變化。轉形可以透過人工手段來實現。要發生轉形的話，細胞或細菌必須處在勝任的狀態，這可能會在對環境條件(諸如飢餓及細胞密度)發生時間限制性反應之時發生。關於原核生物轉形，技術可包括熱休克媒介的攝入、細菌原生質體與完整細胞融合、顯微注射及電穿孔。用於植物轉形的技術包括農桿菌媒介的轉移，例如透過根癌農桿菌、迅速推進鎢或金微粒、電穿孔，顯微注射和聚乙二醇媒介的攝入。

考慮到上述，本發明因此進一步提供宿主細胞，其包含至少一個如本文所述的聚核苷酸序列及/或載體。

關於表現本發明的結合分子，可選出一個依需要調控插入的聚核苷酸序列表現，及/或修飾和加工處理基因產物(即RNA及/或蛋白質)的宿主細胞。基因產物的這類修飾(例如糖基化)和加工處理(例如，切割)對於結合分子的功能來說至為重要。不同的宿主細胞就基因產物的轉譯後加工和修飾有不同特徵和特定機制。可以選擇合適的細胞株或宿主系統以確保產物的正確修飾和加工。為此，可以使用具有對基因產物之初步轉錄、糖基化與磷酸化進行適當加工的細胞機制的真核生物宿主細胞。

可用於表現本文所提供之結合分子的例示性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括DHFR^- CHO細胞，諸如DG44和DUXBI 1和如在US 4,634,665中描述者(例如與DHFR可選擇標記物一起使用者，例如，如US 5,179,017中所述)、NSO、COS(具有SV40 T抗原的CVI衍生物)、HEK293(人類腎臟)，和SP2(小鼠骨髓瘤)細胞。其他例示性宿主細胞株包括，但不限於HELA(人類子宮頸癌)、CVI(猴腎臟細胞系)、VERY、BHK(幼倉鼠腎臟)、MDCK、293、WI38、R1610(中國倉鼠纖維母細胞)BALBC/3T3(小鼠纖維母細胞)、HAK(倉鼠腎臟細胞株)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-IcIBPT(牛內皮細胞)，和RAJI(人類淋巴細胞)。宿主細胞株通常可從商業服務、美國組織培養物保存中心或公開發表的文獻取得。

諸如細菌、酵母，昆蟲或植物細胞的非哺乳動物細胞也容易獲得並且原則上可以用於表現本發明的結合分子。例示性細菌宿主細胞包括腸內桿菌科(諸如大腸桿菌)、沙門氏菌屬；芽孢桿菌科，諸如枯草芽孢桿菌；肺炎球菌屬；鏈球菌屬和流感嗜血桿菌。

其他宿主細胞包括酵母細胞(諸如釀酒酵母與畢赤酵母)。昆蟲細胞包括，但不限於草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。

根據上文，預期的表現系統(意即包含如上文所述表現載體的宿主細胞)包括微生物，諸如經重組噬菌體DNA、質體DNA或黏粒DNA表現載體轉形的細菌(例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；經重組酵母表現載體轉形的酵母(例如，酵母屬，畢赤酵母)；經重組病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經重組病毒表現載體(例如，花椰菜鑲嵌病毒，CaMV；煙草鑲嵌病毒，TMV)感染或經重組質體表現載體(例如，Ti質體)轉形的植物細胞系統；或哺乳動物細胞系統(例如，COS、CHO、BLK、293、3T3細胞)，其攜帶含有衍生自哺乳動物細胞之啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或衍生自哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)之啟動子的重組表現建構物)。

關於表現本發明的結合分子，特別預期為真核生物細胞。因此，CHO細胞是可用於生產本發明結合分子的表現系統，該CHO細胞包含具有一個編碼本發明結合分子的聚核苷酸序列(其可操作地連接至人類巨細胞病毒(CMV)之主要立即早期啟動子(MIEP))的真核載體。

培育

在適於生產本文所述結合分子(特別是如本文他處所述的輕鏈和重鏈)的條件下生長攜帶有表現載體的宿主細胞，並分析重鏈及/或輕鏈蛋白質合成。因此，本發明包括含有編碼本發明的結合分子，或其重鏈或輕鏈(可操作地連接至啟動子)之聚核苷酸的宿主細胞。關於表現雙鏈抗體，可將編碼重鏈和輕鏈二者的載體於宿主細胞中共同表現以表現整個分子。

純化

在本發明結合分子已被重組表現之後，它可透過技藝中熟知的任何純化方法加以純化，例如透過層析(例如，離子交換層析(例如羥基磷灰石層析)、親和力層析(特別是蛋白質A、蛋白質G或凝集素親和力層析、尺寸排阻層析)、離心、差異溶解度、疏水交互作用層析，或透過用於蛋白質純化的任何其他標準技術。習於技藝者將能夠容易地基於待回收結合分子的個別特性選擇合適的純化方法。

考慮到上述，本發明因而亦提供一種用於生產本發明結合分子的方法，包含在允許結合分子表現的條件下培養如本文界定的宿主細胞，以及視情況自培養物回收所生產的結合分子。

醫藥組成物

本發明進一步提供一種醫藥組成物，其包含本發明的結合分子、核酸、載體及/或宿主細胞，以及視情況一或多種醫藥上可接受的賦形劑。較佳的醫藥組成物包含本發明的抗體和任選一或多種醫藥上可接受的賦形劑。

在一個態樣中，本發明因而是有關於一種醫藥組成物，其包含作為活性劑之如本文所述的結合分子，特別是抗FXI抗體或其抗原結合片段。因此，在本文中也預期該結合分子用於製造醫藥組成物的用途。術語「醫藥組成物」特別是意指一適合投與給人類的組成物。但是，該術語也含括投與給非人類動物的組成物。

醫藥組成物及其組分(即活性劑和視情況賦形劑)較佳是醫藥上可接受的，亦即能夠引發所需治療效應但不會在接受者體內引起任何不希望的局部或全身性效應。本發明的醫藥上可接受組成物特別是無菌及/或醫藥上惰性的。具體來說，術語「醫藥上可接受的」可表示經主管機關或其他經認可藥典核准用於動物，更特別是在人類體內。

本文所述的結合分子較佳以治療有效量存在於醫藥組成物中。「治療有效量」表示結合分子引起所期望的治療效應之量。治療效力和毒性可在細胞培養物或實驗動物中透過標準醫藥學方法來確定例如ED₅₀(在50%群體中治療有效的劑量)和LD₅₀(對群體的50%致死的劑量)。治療和毒性效應之間的劑量比為治療指數，且它可以表示為比率，ED₅₀/LD₅₀。呈現高治療指數的醫藥組成物較佳。

如先前所示，醫藥組成物可視情況包含一或多種賦形劑及/或額外活性劑。

抗體及其片段通常非經腸投與，且特別是靜脈內(注射或輸注)或皮下投與。用於非經腸投藥的組成物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑包括，但不限於丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)，以及諸如油酸乙酯的可注射有機酯。水性溶劑可以選自由以下組成之群：水、醇/水溶液、乳液或懸浮液(包括鹽水和緩衝介質，諸如但不限於磷酸鹽緩衝鹽水溶液)。非經腸媒劑進一步包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。其他適合的醫藥載體、稀釋劑及/或賦形劑為技藝中熟知的。根據本發明的結合分子(諸如抗體或其抗體片段)可以與醫藥上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑(諸如以上討論的那些)組合以形成醫藥組成物。醫藥組成物可包含在包含選自由組胺酸緩衝劑、乙酸緩衝劑、檸檬酸緩衝劑和組胺酸/HCl緩衝劑組成之群的緩衝劑之水性載體中的本發明結合分子。其他緩衝劑和調配資訊為習於技藝者可取得的，例如在Wang W et al.,J.Pharmaceutical Sci.2007 Jan(1)：1-26中。防腐劑也可以存在，諸如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。

醫藥組成物可進一步包含蛋白質載劑，諸如例如血清白蛋白或免疫球蛋白，特別是人類來源。在一個具體例中，醫藥組成物包含呈凍乾形式的結合分子且較佳於投藥前在溶液或懸浮液中還原。在另一個具體例中，醫藥組成物包含結合分子且呈液體形式。

在本發明醫藥組成物及任選地合適的賦形劑已經製備好後，它們可以被放置在適當容器中，並標記用於治療指明病狀。這樣的標記將例如包括投藥之數量，頻率和方法。

額外活性劑

本發明進一步提供了包含本發明化合物和一種或多種其它活性成分的藥物或藥物組成物，特別適用於本文中提及的疾病的治療及/或預防。適合於組合的活性成分的優選實例包括：●降血脂物質，尤其是HMG-CoA(3-羥基-3-甲基戊二醯基-輔酶A)還原酶抑制劑，包括但不限於洛伐他汀(lovastatin)(Mevacor)、辛伐他汀(simvastatin)(Zocor)、普伐他汀(pravastatin)(Pravachol))、氟伐他汀(fluvastatin)(Lescol)和阿托伐他汀(atorvastatin)(Lipitor)；●冠狀動脈治療劑/血管舒張劑，特別是ACE(血管張力素轉換酶)抑制劑，包括但不限於卡托普利(captopril)、賴諾普利(lisinopril)、依那普利(enalapril)、雷米普利(ramipril)、西拉普利(cilazapril)、貝那普利(benazepril)、福辛普利(fosinopril)、喹那普利(quinapril)和培哚普利 (perindopril)，或AII(血管張力素II)受體拮抗劑，包括但不限於恩布沙坦(embusartan)、氯沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、坎地沙坦(candesartan)、依普羅沙坦(eprosartan)和替米沙坦(temisartan)，或腎上腺素受體拮抗劑，包括但不限於卡維地洛(carvedilol)、阿普洛爾(alprenolol)、比索洛爾(bisoprolol)、醋丁洛爾(acebutolol)、阿替洛爾(atenolol)、倍他洛爾(betaxolol)、卡替洛爾(carteolol)、美托洛爾(metoprolol)、納多洛爾(nadolol)、噴布洛爾(penbutolol)、吲哚洛爾(pindolol)、普萘洛爾(propanolol)和噻嗎洛爾(timolol)，或α-1-腎上腺素受體拮抗劑，包括但不限於哌唑嗪(prazosine)、布那唑嗪(bunazosine)、多沙唑嗪(doxazosine)和特若辛(terazosine)，或利尿劑，包括但不限於氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、呋塞米(furosemide)、布美他尼(bumetanide)、吡咯他尼(piretanide)、托拉塞米(torasemide)、阿米洛利(amiloride)和雙肼苯噠嗪(dihydralazine)，或鈣通道阻斷劑，包括但不限於維拉帕米(verapamil)和地爾硫卓(diltiazem)，或二氫吡啶衍生物，包括但不限於硝苯地平(nifedipin)(Adalat)和尼群地平(nitrendipine)(Bayotensin)，或硝基製劑，包括但不限於異山梨醇-5-單硝酸酯、異山梨醇二硝酸鹽和甘油硝酸酯，或引起環單磷酸鳥苷酸(cGMP)增加的物質，包括但不限於可溶性鳥苷酸環化酶的刺激劑，包括但不限於利奥西呱(riociguat)；●纖維蛋白溶酶原活化劑(血栓溶解劑/纖維蛋白溶解劑)，以及促進血栓溶解/纖維蛋白溶解的化合物，包括但不限於纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑的抑制劑(PAI抑制劑)或凝血酶活化纖維蛋白溶解抑制劑的抑制劑(TAFI抑制劑)，包括但不限於組織纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)、鏈激酶，瑞替普酶和尿激酶； ●抗凝血物質(抗凝血劑)，包括但不限於肝素(UFH)、低分子量肝素(LMW)，包括但不限於亭扎肝素(tinzaparin)、舍托肝素(certoparin)、帕肝素(parnaparin)、那屈肝素(nadroparin)、阿地肝素(ardeparin)、依諾肝素(enoxaparin)、瑞肝素(reviparin)、達肝素(dalteparin)、達那肝素(danaparoid)、瑟莫羅培林(semuloparin)(AVE 5026)、阿都米肝素(adomiparin)(M118)和EP-42675/ORG42675；●直接凝血酶抑制劑(DTI)，包括但不限於帕拉達沙(Pradaxa)(達比加群(dabigatran))、阿特加群(atecegatran)(AZD-0837)、DP-4088、SSR-182289A、阿加曲班(argatroban)、比伐盧定(bivalirudin)和他諾群(tanogitran)(BIBT-986和前藥BIBT-1011)、水蛭素；●直接因子Xa抑制劑，包括但不限於利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)、依度沙班(edoxaban)(DU-176b)、貝曲西班(betrixaban)(PRT-54021)、R-1663、達瑞沙班(darexaban)(YM-150)、奧米沙班(otamixaban)(FXV-673/RPR-130673)、雷扎沙班(letaxaban)(TAK-442)、瑞扎沙班(razaxaban)(DPC-906)、DX-9065a、LY-517717、他諾西群(tanogitran)(BIBT-986，前藥：BIBT-1011)，依達肝素(idraparinux)和磺達肝素(fondaparinux)，●血小板聚集抑制物質(血小板聚集抑制劑、血小板(thrombocyte)聚集抑制劑)，包括但不限於乙醯水楊酸(例如阿司匹林)、噻氯匹定(ticlopidine)(Ticlid)、氯吡格雷(clopidogrel)(Plavix)、普拉格雷(prasugrel)、替卡格雷(ticagrelor)、坎格雷洛(cangrelor)、依諾格雷(elinogrel)、沃拉帕夏(vorapaxar)；●纖維蛋白原受體拮抗劑(糖蛋白-IIb/IIIa受體拮抗劑)，包括但不限於阿昔單抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)、替羅非班(tirofiban)、拉米非班 (lamifiban)，來達非班(lefradafiban)和夫雷非班(fradafiban)；●抗心律不整劑(antiarrhythmics)；●各種抗生素或抗真菌藥劑，無論是作為預測療法(在診斷微生物存在之前)或者作為具體療法；●血管加壓劑，包括但不限於去甲腎上腺素，多巴胺和血管加壓素；●肌肉收縮療法，包括但不限於多巴酚丁胺(dobutamine)；●重組人類活化蛋白C，例如Xigris；●血液製品，包括但不限於紅血球濃縮物、血小板濃縮物、紅血球生成素及新鮮冰凍血漿；●血小板附著抑制劑，像是GPVI及/或GPIb拮抗劑，包括但不限於瑞窩特(Revacept)或卡普藍珠單抗(Caplacizumab)；●VEGF及/或PDGF依賴性信號轉導路徑的抑制劑，包括但不限於阿柏西普(Aflibercept)、雷尼單抗(Ranibizumab)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)、KH-902、哌加他尼(Pegaptanib)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、角鯊胺(Squalamin)或奧德貝伐西尼(Bevasiranib)、阿帕替尼(Apatinib)、阿西替尼(Axitinib)、布立尼布(Brivanib)、西地尼布(Cediranib)、多韋替尼(Dovitinib)、瑞瓦替尼(Lenvatinib)、利尼凡尼(Linifanib)、莫替沙尼(Motesanib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、替沃扎尼(Tivozanib)、凡德他尼(Vandetanib)、瓦他拉尼(Vatalanib)，瓦加特浮(Vargatef)或E-10030；●血管生成素-Tie信號轉導路徑的抑制劑，包括但不限於AMG386；●Tie2受體酪胺酸激酶活性的抑制劑；●整合素依賴性信號轉導路徑的抑制劑，包括但不限於伏洛昔單抗(Volociximab)、西侖吉肽(Cilengitid)或ALG1001； ●PI3激酶-AKT-mTor依賴性信號轉導的抑制劑，包括但不限於XL-147、哌立福新(Perifosin)、MK2206、西羅莫司(Sirolimus)、坦羅莫司(Temsirolimus)或依維莫司(Everolimus)；●皮質類固醇，包括但不限於氫化可體松(hydrocortisone)、氟氫可體松(fludrocortisone)、阿奈可他(Anecortave)、倍他米松(Betamethason)、地塞米松(Dexamethason)、曲安西龍(Triamcinolon)、氟新諾龍(Fluocinolon)或氟新諾龍丙酮氟(Fluocinolonacetonid)；●ALK1-Smad1/5依賴性信號轉導路徑的抑制劑，包括但不限於ACE041；●環加氧酶的抑制劑，包括但不限於溴芬酸(Bromfenac)或奈帕芬胺(Nepafenac)；●激肽釋放素-激肽系統的抑制劑，包括但不限於沙替帕特(Safotibant)或艾卡拉肤(Ecallantid)；●神經鞘胺醇-1-磷酸依賴性信號轉導路徑的抑制劑，包括但不限於松普希珠單抗(Sonepcizumab)；●補體C5a受體的抑制劑，包括但不限於依庫珠單抗(Eculizumab)；●5HT1a受體的抑制劑，包括但不限於坦度螺酮(Tandospiron)；●Raf-Mek-Erk依賴性信號轉導路徑的抑制劑、MAPK信號轉導路徑的抑制劑；FGF信號轉導路徑的抑制劑、內皮細胞增生的抑制劑；以及能夠誘導細胞凋亡的化合物；或●光動力療法，由活性物質組成並暴露於光線，而活性物質是例如維替泊芬(Verteporfin)。「組合」就本發明目的來說不僅表示含有所有這些組分(所謂固定組合)的劑型及含有彼此分開之組分的組合包，還含有同時或依序投與的組分，前提是它們用於預防及/或治療同一疾病。同樣可以將兩個或更多個活性成分彼此組合，這意味著它們各自是呈雙組分或多組分組合。

投藥

多種途徑適用於投與本發明的醫藥組成物。投藥典型是透過非經腸來實現。非經腸遞送方法包括局部、動脈內、肌肉內、皮下、髓內、鞘內、心室內、靜脈內、腹膜內、子宮內、陰道內，舌下或鼻內投與。

用於非經腸投與的醫藥調配物包括活性化合物的水溶液。就注射來說，本發明的醫藥組成物可以在水溶液中條配，較佳在生理相容的緩衝液，如漢克氏溶液、林格氏溶液，或生理緩衝鹽水。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇，或葡聚糖。另外，活性化合物的懸浮液可以作為適當的油性注射懸浮液來製備。例示性親脂性溶液或媒劑包括脂肪油(諸如芝麻油)，或合成脂肪酸酯(諸如油酸乙酯或甘油三酯)，或脂質體。或者，懸浮液還可以含有合適的穩定劑或增加化合物溶解度以允許製備高度濃縮溶液的試劑。關於局部或經鼻投與，適於待滲透特定屏障的滲透劑用於調配物中。此等滲透劑在本技藝中通常是熟知的。關於調配物和投藥技術的更多細節可以在Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.,2012)第22版中找到。

治療

術語「治療」在其所有語法形式來說包括治療性或預防性治療本文所述疾病。「治療性或預防性治療」包含旨在完全預防臨床及/或病理學徵象的預防性治療，或旨在改善或緩解臨床及/或病理學徵象的治療性治療。術語「治療」因此也包括改善或預防所述疾病。

術語「個體(subject或individual)」或「動物」或「患者」在本文中可交替使用以意指任何個體，特別是哺乳動物個體，對他們來說，治療是需要的。哺乳動物個體包括人類、非人類靈長類動物、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、乳牛及類似者。

劑量

結合分子、聚核苷酸，載體或宿主細胞的精確劑量將是由習於技藝者使用已知技術來確定。合適的劑量提供足量的結合分子且較佳是治療有效的，即引起期望的治療效應。

如在技藝中所熟知，基於治療目的所做的調整(例如維持緩解相對於疾病的急性發作)、投藥路徑、時間和頻率、投藥調配物的時間和頻率、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、疾病狀態的嚴重程度、藥物組合(一或多個)、反應敏感性，以及對療法的耐受性/反應可能是必要的。合適的劑量範圍可以使用從細胞培養物分析以及動物研究獲得的數據來確定且較佳包括ED₅₀。通常，劑量可以根據投藥路徑在0.1至100000微克變化，最高到約2g的總劑量。結合分子的例示性劑量是在約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.1mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg、從約1mg/kg至約5mg/kg、約0.01mg/kg至約1mg/kg或約0.1mg/kg至約1mg/kg體重的範圍內。文獻中提供指引特定劑量和遞送方法。應當認知到，治療可能需要單次投與治療有效劑量或多次投與治療有效劑量的本發明結合分子、聚核苷酸、載體或宿主細胞。例如，一些醫藥組成物可以每3至4天、每週、或每兩週投藥一次，或一個月內投藥一次，這取決於調配物、特定調配物的半衰期與清除率。

套組

本發明進一步有關於醫藥包及套組，其包含一或多個填充有一或多種前述本發明醫藥組成物之活性成分的容器或小瓶。因此，本文還提供一種包含如本文所述結合分子、聚核苷酸、載體，宿主細胞及/或醫藥組成物的套組。本文所述的前述套組可用於治療本文他處所示疾病或用於其他目的。

與前述容器繫在一起的可以是經規範製造，使用或銷售醫藥產品或生物產品之政府機關規定之形式的注意事項，反映機關核可製造、使用或銷售用於人類投藥的產品。

套組可包含一或多種活性劑(視情況與一或多種賦形劑調配成醫藥組成物)。合適的活性劑在先前已列在醫藥組成物的上下文中，並且預期也可以作為本發明套組的組成部分。可以同時或依序相對於結合分子、核酸序列、載體，宿主細胞及/或醫藥組成物向患者投與其他活性劑。本發明還含括經由不同路徑(例如經口與靜脈內)投與活性劑。

本文進一步預期包含編碼本發明結合分子之聚核苷序列的套組。該聚核苷酸通常是提供於一個適於轉染至宿主細胞並由宿主細胞表現的載體(例如質體)內。此等載體和宿主細胞在本文他處描述。

治療用途

本發明進一步提供本發明的結合分子，較佳為抗體及其抗原結合片段，其用作藥物供治療及/或預防人類及/或動物的疾病。

本發明進一步提供本發明的結合分子，較佳為抗體及其抗原結合片段，其用於治療及/或預防病症，特別是心血管疾病，較佳為血栓形成性或血栓栓塞性病症及/或血栓形成性或血栓栓塞性併發症。

因子XIa(FXIa)在凝血過程中是一個重要的酶，它可以被凝血酶和因子XIIa(FXIIa)這兩者所活化，並因此參與凝血的兩個主要過程：它是凝血開始過渡到擴大和傳播的一個關鍵組成部分：在正向回饋迴路中，凝血酶除了活化因子V與因子VIII以外，還將因子VI活化成因子XIa，由此因子IX轉化成因子IXa，且經由以這個方式所產生的因子IXa/因子VIIIa 複合體，因子X被活化，因此凝血酶形成反過來被高度刺激，導致強而有力的血栓生成並穩定血栓。

此外，因子XIa是內因性啟動凝血的一個重要組成部分：除了經由組織因子(TF)刺激之外，凝血系統也可被活化，特別是在帶負電荷的表面上，其不僅包括外來細胞(例如細菌)的表面結構，還包括人工表面(諸如血管人工替代物、支架和體外循環)。在表面上，最初因子XII(FXII)被活化成因子XIIa(FXIIa)，其隨後將FXI(附著於細胞表面)活化成FXIa。這導致如上文所述進一步活化凝血級聯。

相反，凝血酶生成在起始階段仍維持著不受TF/因子VIIa和因子X活化所影響且最後凝血酶形成，其為對血管損傷的生理學反應。這可以解釋為什麼在投與FXIa抑制劑的情況下，於FXIa剔除小鼠體內沒有發現到出血時間延長，就像在兔與其他物種中一樣。這種因為物質而導致的低出血傾向在使用於人類時具有很大的優勢，尤其是在出血風險增加的患者中。

因此，本發明的結合分子，較佳為抗體及其抗原結合片段，用於治療及/或預防因為血塊形成所產生的病症或併發症。

為了本發明之目的，「血栓形成性或血栓栓塞性病症」包括動脈和靜脈脈管系統兩者中發生的病症，且其可利用本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)治療，尤其是在心臟冠狀動脈中的病症，諸如急性冠狀動脈症候群(ACS)、帶有ST段升高的心肌梗塞(STEMI)和沒有ST段升高的心肌梗塞(非STEMI)、穩定型心絞痛、不穩定型心絞痛、冠狀動脈干預(諸如血管成形術、支架植入或主動脈冠狀動脈繞道)後的再梗塞和再狹窄，還有在其他血管中的血栓形成性或血栓栓塞性病症，導致周邊動脈閉塞性病症、肺栓塞、靜脈血栓栓塞、靜脈血栓形成(特別是在腿部深靜脈和腎靜脈)、暫時性腦缺血發作以及血栓形成性中風和血栓栓塞性中風。

可能因為各種原因或相關疾病刺激凝血系統。尤其在外科手術干預時，不動、限制在床、感染，發炎或癌症或癌症療法的情況下，凝血系統可被高度活化，並且可能有血栓形成性併發症，特別是靜脈血栓形成。因此，本發明的結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)於外科手術干預的情況下，是用於在例如罹患癌症的患者中或接受整形外科手術(像是髖關節或膝關節置換)的患者中預防血栓形成。本發明的結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)因而亦可用於在凝血系統活化(例如所述刺激情況下)的患者中預防血栓形成。

本發明的結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)因而亦用於在帶有急性，間歇性或持續性心律不整(如心房震顫)的患者中，以及正經歷心搏復原的患者中，還有在患有心臟瓣膜疾病或具有人工心臟瓣膜的患者中治療及/或預防心源性血栓栓塞，例如腦局部缺血，中風和全身性血栓栓塞和局部缺血。

此外，本發明的結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)用於治療及/或預防尤其與敗血症一起發生，還有因為外科手術干預、腫瘤性病症、燒傷或其他損傷所致，並且可能透過微血栓導致嚴重器官損傷的瀰漫性血管內凝血(DIC)。

血栓栓塞性併發症還發生在微血管病性溶血性貧血時，以及因為血液在體外循環(諸如例如，血液透析、ECMO(「體外膜氧合器」)、LVAD(「左心室輔助裝置」)和類似的方法)時與外來表面、AV瘻管，血管和心臟瓣膜人工替代物接觸。

此外，本發明的結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)是用於治療及/或預防涉及在腦血管中微血塊形成或纖維蛋白沉積的病症，在腦血管中微血塊形成或纖維蛋白沉積可能導致癡呆症(諸如血管性癡呆或阿茲海默症)。在此，血塊可透過閉塞還有透過結合更多疾病相關因子而促成該病症

此外，本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)可用於預防及/或治療血栓形成性及/或血栓栓塞性併發症，諸如，例如癌症患者中的靜脈血栓栓塞，尤其是經歷重大外科手術干預或化學療法或放射線療法的癌症患者。

在本發明的上下文中，術語「肺高血壓」包括肺動脈高血壓、與左心臟之病症相關的肺高血壓，與肺病及/或缺氧有關的肺高血壓，以及由於慢性血栓栓塞所致的肺高血壓(CTEPH)。

另外，本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)也用於在感染性疾病及/或全身性發炎症候群(SIRS)、敗血性器官功能障礙、敗血性器官衰竭與多重器官衰竭、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、敗血性休克及/或敗血性器官衰竭中治療及/或預防瀰漫性血管內凝血。在感染過程中，可能有凝血系統的泛發性活化(瀰漫性血管內凝血或消耗性凝血病，下文中稱為「DIC」)，在各種器官中有微血栓形成和繼發性出血性併發症。此外，可能有內皮損傷，血管通透性增加且液體和蛋白質擴散進入管外空間。隨著感染的進展，可能存在器官衰竭(例如腎臟衰竭、肝臟衰竭、呼吸衰竭、中樞神經障礙和心血管衰竭)或多重器官衰竭。在DIC的情況下，於受損的內皮細胞表面、異物或交聯的血管外組織的表面有凝血系統大規模活化。因此，各種缺氧器官的小血管中有凝血且接著器官功能障礙。繼發性效應為消耗凝血因子(例如因子X，凝血酶原和纖維蛋白原)與血小板，從而降低血液的凝固力，並且可能導致大量出血。

本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)也用於在其基因突變而導致酶活性提高，或酶原含量增加且經由酶活性或酶原濃度的相關測試/測量已確立的患者中，初步預防血栓形成性或血栓栓塞性病症及/或與血管通透性增加有關的發炎性病症及/或病症。

此外，本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)亦可用於防止離體凝血，例如用於保護待移植器官免於因為血塊形成所致的器官損傷以及用於保護器官接受者免於移植器官的血栓栓塞、用於保存血液和血漿製品、用於清潔/預處理導管和其他醫療輔助器材和儀器、用於塗覆在體內或離體使用之醫療輔助器材和儀器的合成表面，或用於可包含因子XIa的生物樣品。

本發明進一步提供本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)用於治療及/或預防病症(特別是上述病症)的用途。

本發明進一步提供本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)用於生產用以治療及/或預防病症(尤其是上文提到的病症)之藥物的用途，較佳是用於生產用以治療及/或預防血栓形成性或血栓栓塞性病症。

本發明進一步提供一種用於治療及/或預防病症(尤其是上文提到的病症)的方法，該方法使用治療有效量的本發明結合分子，較佳為抗體及其抗原結合片段。

本發明進一步提供本發明的結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)，其用於使用治療有效量之本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)治療及/或預防疾病(尤其是上述病症)的方法。

本發明進一步提供透過投與治療有效量之至少一種本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)或本發明醫藥組成物在人類及/或動物中治療血栓形成性或血栓栓塞性病症的方法。本發明進一步提供一種透過投與治療有效量之至少一種本發明結合分子(較佳為抗體及其抗原結合片段)或本發明醫藥組成物在個體體內抑制血液凝固、血小板聚集及/或血栓形成的方法。

基因療法

本文進一步提供一種在哺乳動物基因療法中使用的轉移載體，其包含如本文所揭示的聚核苷酸；以及一種治療或預防疾病的方法，其包含將外源性核酸如本文所述併入有需要之哺乳動物患者的細胞中，使得外源性核酸得以表現，並預防或治療疾病。

在一個具體例中，編碼重鏈與輕鏈的核酸分子被投與給患者。在一個較佳具體例中，投與核酸分子，使得它們被穩定地併入B細胞的染色體中，因為B細胞是專門用於生產抗體。在一個具體例中，前體B細胞經轉染或經離體感染並且重新移植至有需要的患者體內。在另一個具體例中，使用已知會感染感興趣細胞類型之重組病毒在活體內感染前體B細胞或其它細胞。

在一個較佳具體例中，基因療法包含投與編碼如本文揭示之抗FXI抗體的重鏈或其抗原結合部分的經分離核酸分子並且表現該核酸分子。在另一個較佳具體例中，基因療法包含投與編碼如本文所揭示之抗FXI抗體的輕鏈或其抗原結合部分的經分離核酸分子並表現該核酸分子。在另一個具體例中，基因療法包含投與編碼如本文揭示之抗FXI抗體的重鏈或其抗原結合部分的經分離核酸分子以及編碼抗FXI抗體的輕鏈或其抗原結合部分的經分離核酸分子並表現該核酸分子。

關於攝入外源性核酸的具體條件在本技藝中為眾所周知。它們包括，但不限於逆轉錄病毒感染、腺病毒感染、用含有外源性核酸的脂質體轉形、生物射彈核酸遞送(即，將核酸裝載到金或其他金屬粒子上且發射或注射到細胞中)、腺相關病毒感染和EB病毒感染。就本發明之目的來說，這些都可以被視為「表現載體」。

表現載體可以是染色體外載體或併入至宿主基因組中的載體。大體上，這些表現載體包括可操作地連接至外源性核酸的轉錄和轉譯調節核酸。一般而言，轉錄和轉譯調節序列可包括，但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、轉譯起始和終止序列，以及增強子或活化子序列。在一個較佳具體例中，調節序列包括啟動子與轉錄起始和終止序列。

此外，表現載體可包含額外要素。例如，就併入表現載體來說，表現載體含有至少一個與宿主細胞基因組同源的序列，且在表現建構物的兩側較佳有兩個同源性序列。併入載體可以透過選擇用於納入載體的合適同源性序列而被定向至宿主細胞中的特定基因座。用於併入載體的建構物在本技藝中是熟知的。

實驗

從鼠類1A6抗FXI抗體開始，生成新穎的人類化抗體(參見實驗1)。為了進一步降低固有的免疫原性可能性，如下文所述(實驗2)將這些抗體的CDR區進行序列最佳化。透過酶聯免疫吸附分析(ELISA)確定候選抗體的FXI結合活性，並依據候選抗體抑制FXI轉化成其活化形式FXIa的能力來測試候選抗體(實驗4和5)。關於兩個例示性抗體，即TPP-3290和TPP-3238，ELISA和轉化分析的EC50值顯示於圖9中。很明顯，EC50值可媲美1A6，因此這兩個抗體似乎是可供進一步探究的有價值候選物。因而，為了確認與1A6的可比較性，在如實驗10中所述的活體內狒狒血栓形成模型中測試抗體TPP-3290和TPP-3238。出乎意料地，使用合理的藥理學給藥方案，這兩個抗體沒有表現出任何抗血栓形成活性。針對這兩個分子，在膠原誘導的血栓形成中偵測到一點都沒有降低。於這個活體內實驗的後續追蹤中，在基於血漿的活化部分凝血酶時間(aPTT)測試系統中分析這些抗體。這類型的分析以這種方式再次確認活體內數據，也就是觀察到這兩個抗體僅有很低或甚至沒有阻斷效應(實驗6和圖8)。因此，儘管抗體TPP-3290和TPP-3238相較於抗體1A6在ELISA和轉化分析中具有幾乎相同的EC50值(參見圖9)，但它們在活體內未顯示抗血栓形成效應。無法簡單解釋為什麼與1A6相媲美的ELISA和轉化分析值沒辦法轉變為活體內抗血栓形成活性或aPTT延長。

但是，進一步序列改變產生了抗體TTP-3583和TTP-3577。這兩個抗體對目標FXI表現出優異的結合親和力(實驗3，圖3和圖4，圖9)。另外，抗體TTP-3583和TTP-3577有效地阻斷FXI轉化成其活化形式FXIa(實驗5和圖7與8)。出乎意料，抗體TTP-3583和TTP-3577在與1A6相當的濃度下會延長活化部分凝血酶時間(aPTT)，或者在TPP-3583的情況下，在甚至更低的濃度下會延長aPTT(實驗6和圖9)。因此，已經產生兩種抗體，其在生物化學分析中就它們的結合活性來說與鼠類起始變體1A6相當。TPP-3583在基於血漿的aPTT分析中甚至表現出略高的活性。

這也透過在活體內模型中的TPP-3583抗血栓形成活性獲得證實(見實驗9)。因此，透過抗體TPP-3583和TPP-3577，本發明提供了經人類化且經生殖系化抗體，兩者均有效且預期可安全用於治療，在免疫原性低和出血風險降至最低的方面均是。因此在本文中所評估的抗體是有希望的新穎藥劑，用於有效治療及/或血栓形成性或血栓栓塞性病症及/或血栓形成性或血栓栓塞併發症。

實驗1：鼠類抗體的人類化

透過使用標準技術進行鼠類抗體1A6的人類化。

詳言之，就選擇生殖系受體家族子集來說，確定鼠類抗體的 CDR殘基並且遵循Kabat編號系統下註解(詳情見http：//www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)。重鏈和輕鏈CDR的標準結構是基於以下的出版物確定：- O’Brien and Jones,Humanising Antibodies by CDR Grafting,Chapter 40；Antibody Engineering,Part of the series Springer Lab Manuals pp 567-590；R.Kontermann et al.(eds.),Antibody Engineering；Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001。

- Hwang,Almagro,Buss,Tan,and Foote(2005)Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization.Methods,May；36(1)：35-42。

基於這些出版物，選出具有相同標準結構的人類生殖系框架受體。

在下一個步驟中，基於Kabat編號系統鑑定出支持環結構和VH以及VL界面的殘基(詳情見http：//www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)。必要時，對於環構形以及V_H和V_L界面來說重要的胺基酸被回復突變。

分析在相同標準子集內個別人類生殖系框架序列的同一性和相似性，並透過使用Vector NTI suite的Align X程式鑑定出與鼠類V_H以及V_L序列具有最佳整體同源性的生殖系序列。這些序列分別被選作為用於移植V_H和V_L CDR的受體人類生殖系框架。

人類重鏈接合區(J_H區)以及人類V_L區是基於最佳序列同源性來選定。

為了分析這些針對FXI結合活性利用電腦所設計的人類化變體，合成對應的cDNA，並用於表現人類化抗體。為此，將HEK293細胞轉染cDNA，並且在培育5天之後，從這些細胞的上清液純化抗體。各個經純化的人類化抗體透過使用標準ELISA方案鑑定結合活性並依據尺寸排阻層析透過分析分子來鑑定物理化學性質。

實驗2：CDR的生殖系化以及序列最佳化

為了進一步降低內生性免疫原性風險，在下一步驟中進行人類化抗體之CDR的生殖系化和序列最佳化。

因此，將與最相近生殖系序列不同的胺基酸進行交換，合成對應的cDNA、瞬時轉染HEK293細胞、定量本發明的經表現抗體，並測試其對人類FXI的結合能力(Haematologic Technologies Inc.；人類FXI；Cat.No.HCXI-0150)。

實驗3：表現並定量抗體變體

在如Tom等人，Methods Express：Expression Systems，由Micheal R.Dyson與Yves Durocher編輯，Scion Publishing Ltd,2007第12章中所述，在哺乳動物細胞中瞬時表現上述IgG。簡言之，將基於CMV-啟動子的表現質體轉染至HEK293-6E細胞中，並且在Fernbach燒瓶或Wave袋中培養。在F17培養基(Invitrogen)中於37℃下培養經轉染細胞5~6天。在轉染後24小時補充1%超低IgG FCS(Invitrogen)和0.5mM丙戊酸(Sigma)。抗體是透過蛋白質A層析純化，並進一步使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)依據其結合親合力進行鑑定。見下表1和2有關於本發明抗體的序列。下表3列出了更多抗體的序列。

實驗4：酶聯免疫吸附分析(ELISA)： ELISA

使用標準ELISA模式來分析本發明抗體對FXI的結合親和力。人類FXI得自Haematologic Technologies Inc.(人類FXI；Cat.No.HCXI-0150)，狒狒FXI如下文所述生成。這些抗原被塗覆到黑色384孔Maxisorp微量滴定盤(Nunc； Cat.No.460518)、在1X塗覆緩衝液(Candor Bioscience；Cat.No.121125)中稀釋至1μg/ml的濃度。在4℃下培育盤過夜。培育過夜後，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，SigmaAldrich，Cat.No.D8662)+0.05% Tween 20(SigmaAldrich，Cat.No.P9416)以50μL/孔洗滌盤2次。之後，添加50μl/孔阻斷緩衝液(Smart Block；Candor Bioscience；Cat.No.113500)並在室溫下培育盤1小時。然後，以50μL/孔的PBS+0.05% Tween 20緩衝液洗滌盤3次。以30μL/孔的最終體積添加不同濃度的本發明抗體。在室溫下培育盤1小時。在這個培育步驟之後，用50μL/孔的PBS+0.05% Tween 20緩衝液洗滌盤3次。為了檢測結合的候選抗體，以1：10000的係數將抗h-Fc-POD抗體(Sigma；Cat.No.A0170)稀釋於10%阻斷緩衝液中。添加30μL/孔的這個經稀釋檢測抗體並在室溫下培育盤1小時。在這個培育步驟之後，用50μL/孔的PBS+0.05% Tween 20緩衝液洗滌盤3次。作為受質，添加1：1000經稀釋Amplex紅(Invitrogen；Cat.No.12222；原液10mM於DMSO中)和1：10000過氧化氫(Merck；Cat.No.107209；30%原液)的30μl/孔混合物並在黑暗中培育盤20分鐘。

關於測量，使用Infinite f500讀取儀(Tecan)。

測量模式：

●螢光

●重要讀值

●Ex 535nm

●Em 590nrm

使用GraphPadPrism軟體分析數據，將本發明的結合活性計算為EC50值。所有實驗均進行四次，數據是平均值±SEM。抗體1A6、TPP-3583、TPP-3577、TPP-3290，和TPP-3238的人類FXI ELISA數據顯示於圖2-6中而數值數據顯示於圖9中。曲線的形狀以及EC50值與1A6相當，並且因此予以分類用於進一步分析。

經由競爭性ELISA的結合結構域分析

為了顯示經人類化和最佳化的變體仍然結合至與起始變體1A6相同的結構域，使用競爭性ELISA。為此，透過使用EZ-Link^TM NHS-PEG4生物素化套組(ThermoFischer Scientific，Cat.No.21455)，依據製造商建議將1A6予以生物素化。如上所述，塗覆FXI並將固定濃度的經生物素化1A6與不同濃度的本發明抗體混合添加。透過使用HRP綴合的鏈親和素(SigmaAldrich，Cat.No.S5512)偵測經生物素化1A6的結合。作為受質，添加1：1000經稀釋Amplex紅(Invitrogen；Cat.No.12222；原液10mM於DMSO中)和1：10000過氧化氫(Merck；Cat.No.107209；30%原液)的30μl/孔混合物並在黑暗中培育盤20分鐘。本發明抗體結合至與1A6相同的結構域會透過增加人類化與最佳化變體的濃度來取代1A6。這個效應已被證明適用於本發明中所描述的全部抗體。作為實例，TPP-3583和1A6的競爭性結合分析數據顯示於圖7中，指明這兩個抗體結合至FXI分子中的相同結構域。

生成狒狒FXI

合成棕狒狒的cDNA(Uniprot Acc.No.A0A096NC95)並選殖至哺乳動物表現載體pcDNA3.1(+)(ThermoFisher Scientific，Cat.No.V790-20)中。關於表現和純化，透過使用Lipofectamine LTX與PLUS試劑(Invitrogen，CatNo.A12621)，按照製造商說明書將HEK293細胞瞬時轉染。透過SDS-PAGE分析狒狒FXI的重組表現。在本發明中所述抗體對狒狒FXI結合的結合活性顯示於圖9中。

實驗5：藉由本發明抗體，FXI轉化成其活化形式FXIa的功能性中和作用

為了測試FXI(Haematologic Technologies,Inc.，目錄號HCXIA-0150)透過FXIIa轉化成其活化形式FXIa的抑制，於不同濃度抗體、 37℃下將10nM人類FXI培育於50mM Tris/HCl、100mM NaCl、5mM CaCl2和0.1% BSA中1小時。在下一個步驟中，以1單位/mg的最終濃度添加人類FXIIa(Enzyme Research，目錄號HFXIIa 1212a)，並在37℃下培育24小時。接著，添加最終濃度為200nM的玉米胰蛋白酶抑制劑(Enzyme Research,CTI)和經螢光標記的受質(I-1575，Bachem，最終濃度25μM)。使用SpectraFluorplus讀取儀(Tecan)在360/465nm下連續監測螢光。使用GraphPadPrism軟體分析數據。數據是平均值±SEM，n=4(關於TPP-3583的圖參見圖8，其他抗體的數值列於圖9中)。

實驗6：活化部分凝血酶時間(aPTT)

等分試樣的人類血漿與濃度遞增的本發明抗體在37℃下培育3分鐘。為了啟動內生性凝血路徑，將0.05ml血漿與0.05ml的aPTT試劑(Diagnostica Stago，K.C Prest 5)一起培育恰好3分鐘。透過用0.05ml的0.025M預溫熱氯化鈣溶液來再鈣化樣品以啟動凝血。自動凝血計(AMAX 200，Trinity Biotech，Lemgo,Germany)在37℃下混合血漿，並機械地記錄相對於凝血的時間。計算出測試藥物濃度延長aPTT達1.5倍並報告。(圖9)。

實驗9：活體內狒狒血栓形成模型

在狒狒AV分流模型中，透過將血栓形成裝置暫時安放於低血栓形成長期AV分流而引起血栓形成。用於評估抗體對血栓生成和擴展效應的血栓形成裝置包括一個4mm內徑(i.d.)、20mm長的經膠原蛋白塗覆ePTFE移植物，接著是9mm i.d.、20mm長的矽膠橡膠膨脹室。在移植物中的剪切速率是為了模仿動脈型血液凝固，而在膨脹室中的剪切速率是為了模仿靜脈型血液凝固。在實驗期間透過移植物區段內的放射性標記血小板累積之量化γ相機成像，還有放射線標記纖維蛋白原/纖維蛋白沉積終點測定來即時評估血栓形成(更多詳情參見Tucker et al.Blood.2009 Jan 22；113(4)：936-944，第937頁，左欄，章節標題為「Thrombosis model」)。如圖10中所示，靜脈內施用1mg/kg於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的TPP-3583會致使血小板沉積降低約80%。這些數據與如Tucker等人(Blood.2009 Jan 22；113(4)：936-944)所公開的鼠類1A6抗體的抗血栓形成活性相當。

在抑制血小板沉積的影響下，投與TPP-3583也造成在經膠原蛋白塗覆之移植物中纖維蛋白累積明顯降低約80%(圖11)。

更多較佳具體例為：

1.一種結合分子，包含 (a)輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)；(b)輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)；(c)輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)；(d)重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)；(e)重鏈的CDR2，包含序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)；以及(f)重鏈的CDR3，包含序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)。較佳地，結合分子為單株抗體或其抗原結合片段，包含：包含下列之輕鏈的抗原結合位點(a)輕鏈的CDR1，包含SEQ ID NO：8中所示序列；(b)輕鏈的CDR2，包含SEQ ID NO：9中所示序列；與(c)輕鏈的CDR3，包含SEQ ID NO：10中所示序列；以及包含下列之重鏈的抗原結合位點(a)重鏈的CDR1，包含SEQ ID NO：11中所示序列；(b)重鏈的CDR2，包含SEQ ID NO：12中所示序列；與(c)重鏈的CDR3，包含SEQ ID NO：13中所示序列。

2.如具體例1之結合分子，其能夠結合至因子XI及/或因子XIa。較佳地，具體例1之結合分子特異地結合至因子XI及/或因子XIa。

3.如具體例1或2之結合分子，其中該因子XI或因子XIa為靈長類動物因子XI或靈長類動物因子XIa。

4.如具體例3之結合分子，其中該靈長類動物為人類或非人類靈長類動物。

5.如具體例4之結合分子，其中該非人類靈長類動物為狒狒、黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩、石蟹獼猴或恆河獼猴。

6.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該結合分子結合至對應於因子 XI之A3結構域的胺基酸序列內，該胺基酸序列包含SEQ ID NO：7的胺基酸200至283。

7.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該結合分子結合至對應以下之胺基酸內的表位：a)SEQ ID NO：7的胺基酸201至215；b)SEQ ID NO：7的胺基酸221至222；c)SEQ ID NO：7的胺基酸252至254；d)SEQ ID NO：7的胺基酸259至261；e)SEQ ID NO：7的胺基酸270至272；及/或f) SEQ ID NO：7的胺基酸276至278。

8.如前述具體例中任一項之結合分子，其包含如SEQ ID NO：17中所示的V_L區。

9.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該結合分子包含如SEQ ID NO：18中所示的V_H區。

10.如前述具體例中任一項之結合分子，其包含如17中所示的V_L區以及如SEQ ID NO：18中所示的V_H區。

11.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該結合分子包含如SEQ ID NO：27中所示的輕鏈。

12.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該結合分子包含如SEQ ID NO：28中所示的重鏈。

13.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該結合分子包含如SEQ ID NO：27中所示的輕鏈以及如SEQ ID NO：28中所示的重鏈。

14.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該結合分子為抗體。

15.如前述具體例中任一項之結合分子，其中該抗體為單株抗體或其抗原結合片段。

16.如具體例15中任一項之結合分子，其中該單株抗體為人類化單株抗體或嵌合單株抗體。較佳地，人類化單株抗體為具有人類來源之全部可變域以及全部恆定域框架區的抗體。

17.如具體例14至16中任一項之結合分子，其中該抗體為IgG，較佳為IgG1或IgG4。

18.一種編碼如具體例1至17中任一項之結合分子的聚核苷酸。

19.一種載體，其包含如具體例18之聚核苷酸。

20.如具體例19之載體，其中該載體進一步包含至少一個調節序列，其可操作地連接至具體例18之該聚核苷酸。

21.如具體例19或20之載體，其中該載體為表現載體。

22.一種包含如具體例19至21中任一項之載體及/或如具體例18之核酸的宿主細胞。

23.一種用於製造如具體例1至17中任一項之結合分子的方法，該方法包含在允許如具體例1至17中任一項之結合分子表現的條件下培養如具體例22之宿主細胞，以及視情況自培養物回收所生產的結合分子。

24.一種醫藥組成物，包含如具體例1至17中任一項，或如具體例23之方法、具體例19至21之載體，及/或具體例22之宿主細胞所製造的結合分子，以及視情況醫藥上可接受的賦形劑。

25.如具體例24之醫藥組成物，進一步包含一或多種額外活性劑。

26.如具體例25之醫藥組成物，其中其他額外活性劑是選自纖維蛋白溶酶原活化劑(溶血栓劑/纖維蛋白溶解劑)；纖維蛋白溶酶原活化劑的抑制劑；凝血酶活化的纖維蛋白溶解抑制劑(TAFI)的抑制劑，包括組織纖維蛋白溶酶原活化物(t-PA)、鏈激酶、瑞替普酶(reteplase)，與尿激酶；普通肝素(non-fractionated heparins)；低分子量肝素；類肝素；水蛭素；比伐盧定(Bivalirudin)及/或阿加曲班(Argatroban)。

27.如具體例1至17中任一項，或如具體例23之方法、具體例18之聚核苷酸、具體例19至21中任一項之載體、具體例22之宿主細胞所製造的結合分子，或如具體例24至26中任一項之醫藥組成物，其用作為藥劑。

28.如具體例1至17中任一項，或如具體例23之方法、具體例18之聚核苷酸、具體例19至21中任一項之載體、具體例22之宿主細胞所製造的結合分子，或如具體例24至26中任一項之醫藥組成物，其用於治療及/或預防血栓形成性或血栓栓塞性病症及/或血栓形成性或血栓栓塞性併發症。

29.如具體例1至17中任一項，或如具體例23之方法、具體例18之聚核苷酸、具體例19至21中任一項之載體、具體例22之宿主細胞所製造的結合分子，或如具體例24至26中任一項之醫藥組成物，其用於在個體中抑制血液凝固、血小板聚集及/或血栓形成的方法中。

30.一種如具體例1至17中任一項或如具體例23所製造的結合分子，在血液樣品、血液保存品、血漿製品、生物樣品或醫藥添加物或裝置中作為抗凝血劑的用途。

31.一種套組，包含如具體例1至17中任一項，或如具體例23之方法、具體例18之聚核苷酸、具體例19至21中任一項之載體、具體例22之宿主細胞所製造的結合分子，或如具體例24至26中任一項之醫藥組成物。

<110> Bayer Pharma AG

<120> 抗因子XI之新穎抗體及其用途

<130> BHC14 1 061

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 7

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<213> 小鼠

<400> 3

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 625

<212> PRT

<213> 人類

<400> 7

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 11

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 12

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 13

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 14

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 15

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 16

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 17

<210> 18

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 18

<210> 19

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 19

<210> 20

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 20

<210> 21

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 21

<210> 22

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 22

<210> 23

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 23

<210> 24

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 24

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 25

<210> 26

<211> 124

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 26

<210> 27

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 27

<210> 28

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 28

<210> 29

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 29

<210> 30

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 30

<210> 31

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 31

<210> 32

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 32

<210> 33

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 33

<210> 34

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 34

<210> 35

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 35

<210> 36

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 36

<210> 37

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 37

<210> 38

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化

<400> 38

Claims

一種單株抗體或其抗原結合片段，其特異地結合人類因子XI及/或人類因子XIa，包含(a)輕鏈的CDR1，包含序列KASQSVLYSGDNYLN(SEQ ID NO：8)；(b)輕鏈的CDR2，包含序列AASTLES(SEQ ID NO：9)；(c)輕鏈的CDR3，包含序列QQYNGDPWT(SEQ ID NO：10)；(d)重鏈的CDR1，包含序列TSGMGVG(SEQ ID NO：11)；(e)重鏈的CDR2，包含序列HIDWDDDKYYSPSLKS(SEQ ID NO：12)；以及(f)重鏈的CDR3，包含序列IRSSVYAHYYGMDY(SEQ ID NO：13)。
如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段，包含如SEQ ID NO：17中所示的V _L區。
如前述請前求項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體包含如SEQ ID NO：18所示的V _H區。
如前述請求項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體包含如SEQ ID NO：17中所示的V _L區以及如SEQ ID NO：18中所示的V _H區。
如前述請求項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體包含如SEQ ID NO：27中所示的輕鏈。
如前述請求項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體包含如SEQ ID NO：28中所示的重鏈。
如前述請求項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體包含如SEQ ID NO：27中所示的輕鏈以及如SEQ ID NO：28中所示的重鏈。
如前述請求項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體為人類化單株抗體或嵌合單株抗體。
如前述請求項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體為IgG，較佳為IgG1或IgG4。
一種編碼如請求項1至9中任一項之單株抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸。
一種載體，其包含如請求項10的聚核苷酸。
一種宿主細胞，包含如請求項11之載體及/或如請求項10之核酸。
一種用於生產如請求項1至9中任一項之單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含在允許如請求項1至9中任一項之單株抗體或其抗原結合片段表現的條件下培養如請求項12之宿主細胞，以及視情況從培養物回收所生產的抗體或其抗原結合片段。
一種醫藥組成物，包含如請求項1至9中任一項，或如請求項13之方法、如請求項10之聚核苷酸、如請求項11之載體及/或如請求項12之宿主細胞所生產的單株抗體或其抗原結合片段，以及視情況醫藥上可接受的賦形劑。
一種醫藥組成物，包含如請求項1至9中任一項之單株抗體或其抗原結合片段以及視情況醫藥上可接受的賦形劑。
如請求項14或15之醫藥組成物，進一步包含一或多種額外活性劑。
如請求項1至9中任一項，或如請求項13之方法、如請求項10之聚核苷酸、如請求項11之載體、如請求項12之宿主細胞所生產之單株抗體或其抗原結合片段，或如請求項14至16中任一項之醫藥組成物，其用作為藥劑。
如請求項1至9中任一項，或如請求項13之方法、如請求項10之聚核苷酸、如請求項11之載體、如請求項12之宿主細胞所生產之單株抗體或其抗原結合片段，或如請求項14至16中任一項之醫藥組成物，其用於治療及/或預防血栓形成性或血栓栓塞性病症及/或血栓形成性或血栓栓塞性併發症。
一種套組，包含如請求項1至9中任一項、或如請求項13之方法、如請求項10之聚核苷酸、如請求項11之載體、如請求項12之宿主細胞所生產之單株抗體或其抗原結合片段，或如請求項14至16中任一項之醫藥組成物。