RU2758160C2

RU2758160C2 - Новые антитела против фактора xi и их применения

Info

Publication number: RU2758160C2
Application number: RU2019111862A
Authority: RU
Inventors: Андреас Вильмен; Анья Бухмюллер; Эрик ТАККЕР
Original assignee: Байер Фарма Акциенгезельшафт; Аронора Инк.
Priority date: 2016-09-20
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2021-10-26
Also published as: AR109683A1; TW201825523A; MX2019003077A; CN110099927A; FI3515947T3; AU2017329645A8; EP3515947A1; WO2018054813A1; ES2984011T3; RU2019111862A; EP4413996A2; EP4413996A3; PE20191319A1; DK3515947T3; CA3037087A1; JP2019537451A; AU2017329645A1; US20190225705A1; RU2019111862A3; KR20190075920A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфически связывает человеческий Фактор XI и человеческий Фактор Xia, способу его получения, а также к содержащей указанное антитело или его фрагмент композиции и набору. Также раскрыт полинуклеотид, кодирующий указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, а также содержащий его вектор и клетка-хозяин. Изобретение эффективно для лечения или профилактики тромботических нарушений или тромботических осложнений, а также для лечения или профилактики тромбоэмболических нарушений или тромбоэмболических осложнений. 12 н. и 8 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 7 пр.

Description

Уровень техники

Тромбоэмболические нарушения, включая венозный и артериальный тромбоз, являются основной причиной заболеваний и смертности во всем мире. Они вызваны нарушением регуляции нормального свертывания крови (гемостаза), приводящим к аномальному образованию сгустков (тромбов) из фибрина, что в итоге приводит к ишемии тканей и, в некоторых случаях, эмболизации из-за вытеснения и миграции фрагментов сгустка из тромба.

В нормальных условиях гемостаз является жизненно важным механизмом, который предотвращает кровопотерю из участков сосудистого повреждения, вызывая активацию тромбоцитов и образование фибрина. На механистическом уровне гемостаз протекает в два этапа. Во время первичного гемостаза тромбоциты прилипают к месту травмы и становятся активированными и в конечном итоге агрегируют, связываясь друг с другом, образуя тромбоцитарную пробку. Формирование тромбоцитарной пробки усиливается и стабилизируется во время вторичного гемостаза - серии ферментативных реакций с участием белков коагуляции (также называемой системой свертывания крови), которые завершаются образованием протеазы тромбина, который превращает фибриноген в фибрин, образуя стабильный сгусток, который герметизирует нарушение в стенки кровеносных сосудов

С 1964 года, когда Макфарлейн (Nature. 1964 от 2 мая; 202: 498-9) ввел каскадные гипотезы для процесса свертывания крови, знания о функции свертывания крови in vivo расширились. В последние годы теория двух разных путей, так называемый внешний и внутренний путь, которые инициируют коагуляцию и сходятся на общем пути, что в конечном итоге приводит к образованию тромбина и осаждению фибрина, была пересмотрена.

В существующей в настоящее время модели инициация коагуляции происходит, когда активированный протеазой плазмы фактор VII вступает в контакт и тем самым образует комплекс с тканевым фактором (TF). Этот комплекс тканевый фактор-FVIIa превращает зимоген FX в его активную форму FXa, которая, в свою очередь, расщепляет протромбин (фактор коагуляции II) с образованием тромбина (IIa) в присутствии кофактора FVa. Тромбин, ключевой игрок в коагуляции, в свою очередь может катализировать превращение фибриногена в фибрин. Кроме того, тромбин активирует специфические рецепторы, экспрессируемые тромбоцитами, что приводит к активации последних. Активированные тромбоциты в сочетании с фибрином необходимы для образования сгустка и, следовательно, являются основными участниками нормального гемостаза. Комплекс FVIIa-TF также превращает FIX в протеазу FIXa, которая в присутствии FVIIIa активирует дополнительный FX для поддержания выработки тромбина.

Путь коагуляции включает фактор коагуляции XI (FXI). Хорошо подтверждено, что FXI, как и другие члены каскада коагуляции, представляет собой сериновую протеазу плазмы зимоген, играющий ключевую роль в соединении фазы инициации и фазы амплификации свертывания крови in vivo (Davie EW et al., Biochemistry. 1991 Oct 29;30(43):10363-70, Gailani D and Broze GJ Jr., Science. 1991 Aug 23;253(5022):909-12; Kravtsov DV et al. Blood. 2009 Jul 9;114(2):452-8.).

Интересно, что дефицит FXI обычно не приводит к спонтанному кровотечению, но связан с повышенным риском кровотечения с гемостатическими проблемами, хотя тяжесть кровотечения слабо коррелирует с уровнем FXI в плазме. Сообщалось, что серьезный дефицит FXI у людей оказывает определенные защитные эффекты от тромботических заболеваний, включая ишемический инсульт и тромбоз глубоких вен (DVT) (Salomon O et al, Thromb Haemost. 2011 Feb; 105 (2): 269-73; Salomon O et al., Blood. 2008 Apr 15; 111 (8): 4113-7). Тем не менее, высокий уровень FXI связан с тромботическими событиями и, как сообщается, придает более высокий риск DVT, инфаркта миокарда (MI) и инсульта (Meijers JC et al, N Engl J Med. 2000 Mar 9;342(10):696-701).

Взятые вместе, предыдущие исследования предполагают, что FXI играет незначительную вспомогательную роль в поддержании гемостаза, но играет решающую роль в патогенезе тромбоза, что делает FXI многообещающей мишенью для антитромботической терапии. Это так, потому что, хотя тромбоз и гемостаз не являются идентичными молекулярными процессами, они подобны достаточно, чтобы используемые в настоящее время антитромботические препараты были непреднамеренно нацелены на оба. Доступные в настоящее время антитромботические препараты либо воздействуют на строительные блоки тромбов (фибрин и тромбоциты), либо препятствуют участию молекул (факторов коагуляции) и клеток (тромбоцитов) в процессе формирования тромба. Антиагреганты, профибринолитические и антикоагулянтные агенты были основой для лечения и профилактики тромбоэмболических заболеваний на протяжении десятилетий и являются одними из наиболее часто назначаемых препаратов в клинической практике. Тем не менее, большинство из этих агентов могут полностью блокировать как тромбоз, так и гемостаз при введении в эффективных дозах.

До настоящего времени одним из немногих примеров анти-FXI антитела, проявляющего терапевтический потенциал, является мышиное антитело 1A6 (также называемое aXIMab), опубликованное Tucker et al. (Prevention of vascular graft occlusion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI. Erik I. Tucker, Ulla M. Marzec, Tara C. White, Sawan Hurst, Sandra Rugonyi, Owen J. T. McCarty, David Gailani,

Gruber, and Stephen R. Hanson. Blood. 2009 Jan 22;113(4):936-944). Антитело 1A6 также раскрыто в заявке на патент WO 2009/067660 A2, также опубликованной в качестве патента США № 9,125,895, который включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Однако, поскольку антитело 1А6 является мышиным антителом, оно не подходит для терапии человека, особенно для хронических применений, таких как антитромботическая терапия. Одним из способов превращения мышиного антитела в приемлемое терапевтическое антитело является так называемая гуманизация. Специалистам в данной области доступны стандартные методики, такие как описанные в O’Brien and Jones, Humanising Antibodies by CDR Grafting, Chapter 40; Antibody Engineering, Part of the series Springer Lab Manuals pp 567-590; R. Kontermann et al. (eds.), Antibody Engineering; Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001, и в Hwang, Almagro, Buss, Tan, and Foote (2005) Use of human germline genes in CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods, May; 36(1):35-42, и в процитированных в них документах. Для дальнейшего снижения потенциала иммуногенности, присущей гуманизированным антителам, необходима дальнейшая оптимизация последовательности и модифицирование на уровне генов зародышевой линии.

Когда заявители применяли эти стандартные методы для гуманизации и оптимизации парентерального антитела 1А6, некоторые из полученных антител проявляли связывающую активность в биохимическом анализе, сопоставимую с парентеральным 1А6, однако, показали значительную потерю активности в анализах на основе плазмы и были недостаточными в in vivo моделях коагуляции. До настоящего времени нет доступных объяснений, почему сопоставимый биохимический профиль родительского мышиного антитела 1А6 и гуманизированных вариантов не приводит к эффективной противотромбозной активности. Удивительно, что путем введения дальнейших изменений последовательности был получен гуманизированный вариант родительского мышиного антитела 1A6 (антитело TPP-3583), который проявляет как сравнимый биохимический профиль, так и противотромбозную эффективность in vivo.

С антителами согласно настоящему изобретению были получены терапевтические молекулы, которые имеют пониженный риск иммуногенности и эффективно блокируют тромбоз без ослабления гемостаза, тем самым делая антитромботическую терапию более безопасной и, таким образом, расширяя диапазон клинических показаний и сценариев, в которых может применяться антитромботическая терапия.

Сущность изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является связывающая молекула, содержащая

CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8);

CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность AASTLES (SEQ ID NO: 9);

CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10);

CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность TSGMGVG (SEQ ID NO: 11);

CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); и

CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

Связывающая молекула может содержать область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17, и/или область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18.

Указанная связывающая молекула, как исследовано, способна связывать фактор XI и/или фактор XIa, в частности фактор XI человека или нечеловеческого примата или фактор XIa человека или нечеловеческого примата.

В частности, связывающая молекула, как исследовано, связывается внутри аминокислотной последовательности, соответствующей A3 домену фактора XI, содержащему аминокислоты 200 - 283 последовательности SEQ ID NO: 7, и в частности с доменом внутри аминокислотной последовательности, соответствующей a) аминокислотам 200 - 215 последовательности SEQ ID NO: 7; b) аминокислотам 221 - 222 последовательности SEQ ID NO: 7; c) аминокислотам 252 - 254 последовательности SEQ ID NO: 7; d) аминокислотам 259 - 261 последовательности SEQ ID NO: 7; e) аминокислотам 270 - 272 последовательности SEQ ID NO: 7; и f) аминокислотам 276 - 278 последовательности SEQ ID NO: 7. Здесь нумерация аминокислот человеческого фактора XI включает сигнальную последовательность, начинающуюся с метионина в положении 1. Предполагается, что указанная связывающая молекула может быть антителом, в частности гуманизированным моноклональным антителом или антиген-связывающим фрагментом, например, являющимся антителом IgG.

Другим объектом настоящего изобретения является полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу, как определено в настоящей заявке, и вектор, в частности экспрессионный вектор, содержащий указанный полинуклеотид. Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор или полинуклеотид.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения связывающей молекулы, как определено в настоящей заявке, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, как определено в настоящей заявке, в условиях, позволяющих экспрессию указанной связывающей молекулы и необязательно извлечение полученной связывающей молекулы из культуры.

Более того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей связывающую молекулу, полинуклеотид, вектор и/или клетку-хозяин как определено в настоящей заявке,, и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент. Указанная фармацевтическая композиция может содержать дополнительные активные агенты, в частности противотромбозные и/или антикоагулянтные средства или вводиться как часть комбинаторной терапии с дополнительными активными средствами.

Согласно настоящему изобретению, связывающая молекула, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин или фармацевтическая композиция может применяться в способе ингибирования коагуляции крови, агрегации тромбоцитов и/или тромбоза у субъекта, и поэтому предусмотрены для использования для лечения и/или профилактики нарушений, в частности сердечнососудистых нарушений, тромботических или тромбоэмболических нарушений и/или тромботических или тромбоэмболических осложнений.

Кроме того, в настоящем документе предлагается использование связывающей молекулы в качестве антикоагулянта в образцах крови, консервациях крови, продуктах плазмы, биологических образцах или лекарственных добавках или в качестве покрытия на медицинских устройствах.

Более того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему связывающую молекулу, полинуклеотиду, вектору, клетке-хозяину или фармацевтической композиции, как определено в настоящей заявке.

Описание чертежей

Фиг. 1: Последовательности анти-FXI антитела TPP-3583.

Фиг. 2: Активности связывания (EC50 значение) мышиного анти-FXI антитела 1A6 с человеческим фактором коагуляции XI (FXI).

Фиг. 3: Активности связывания (EC50 значение) гуманизированного и модифицированного на уровне генов зародышевой линии анти-FXI антитела TPP-3583, содержащего SEQ ID NO: 17, для аминокислотной последовательности для домена вариабельной легкой цепи и SEQ ID NO: 18 для аминокислотной последовательности для вариабельной тяжелой цепи.

Фиг. 4: Активности связывания (EC50 значение) гуманизированного и модифицированного на уровне генов зародышевой линии анти-FXI антитела TPP-3577, содержащего SEQ ID NO: 19, для аминокислотной последовательности для домена вариабельной легкой цепи и SEQ ID NO: 20 для аминокислотной последовательности для вариабельной тяжелой цепи.

Фиг. 5: Активности связывания (EC50 значение) гуманизированного и модифицированного на уровне генов зародышевой линии анти-FXI антитела TPP-3290, содержащего SEQ ID NO: 21, для аминокислотной последовательности для домена вариабельной легкой цепи и SEQ ID NO: 22 для аминокислотной последовательности для вариабельной тяжелой цепи.

Фиг. 6: Активности связывания (EC50 значение) гуманизированного и модифицированного на уровне генов зародышевой линии анти-FXI антитела TPP-3238, содержащего SEQ ID NO: 23, для аминокислотной последовательности для домена вариабельной легкой цепи и SEQ ID NO: 24 для аминокислотной последовательности для вариабельной тяжелой цепи.

Фиг. 7: Анализ домена посредством конкурентного анализа ELISA для антитела TPP-3583.

Фиг. 8: Функциональная нейтрализация превращения FXI в его активную форму, FXIa, посредством антител согласно настоящему изобретению. Ингибирование FXIIa - индуцированного превращения FXI в его активную форму FXIa. Ингибирующая активность (IC50 значение) гуманизированного и модифицированного на уровне генов зародышевой линии анти-FXI антитела TPP-3583.

Фиг. 9: Перечень EC50 значений и aPTT значений для определенных антител.

Фиг. 10: in vivo измерение отложения тромбоцитов на покрытых коллагеном сосудистых трансплантатах после внутривенного применения TPP3583.

Фиг. 11: in vivo измерение отложения фибрина на покрытых коллагеном сосудистых трансплантатах после внутривенного применения TPP3583.

Подробное описание изобретения

Ингибирование FXI, которому приписывают критическую роль в развитии патологического образования тромба, хотя оно ограничено влияет (или не влияет) на физиологический гемостаз, является многообещающим новым подходом в разработке новых противотромбозных агентов для достижения улучшенного соотношения пользы и риска. Настоящее изобретение, в частности, обеспечивает новые связывающие молекулы, которые способны специфически связываться с FXI, тем самым ингибируя превращение FXI в его активированную форму FXIa. Кроме того, связывающие молекулы, как было показано, связываются с FXIa. Связывающие молекулы, обеспеченные в настоящей заявке, хотя блокируют активацию нижестоящих игроков, участвуют в образовании тромба и тромбозе. В частности, авторы настоящего изобретения обеспечили гуманизированные версии мышиного анти-FXI антитела 1A6, которые преимущественно связываются с FXI, а также FXIa с высокой аффинностью связывания, сравнимой с 1A6. Более того, связывающие молекулы эффективно уменьшают образование тромба, о чем свидетельствует их способность пролонгировать активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT) при низких концентрациях. Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, следовательно, являются многообещающими новыми средствами для эффективного лечения и/или профилактики тромботических или тромбоэмболических нарушений и/или тромботических или тромбоэмболических осложнений и, кроме того, считаются эффективными без серьезного нарушения гемостаза, тем самым сводя к минимуму риск кровотечения.

Связывающая молекула

Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению получают посредством гуманизации и последующей CDR оптимизации мышиного анти-FXI антитела 1A6, как раскрыто в WO 2009/067660 A2. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что связывающие молекулы, содержащие ряд аминокислотных замещений в их CDR областях, по сравнению с 1A6 CDR, проявляли преимущественные свойства. Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению способны связывать FXI с аффинностью связывания, сопоставимой с 1A6, и ингибировать его превращение в его активную форму FXIa, и эффективно снижать свертывание крови. Напротив, другие кандидатные связывающие молекулу, имеющие меньшее или большее количество аминокислотных замещений, не проявляли таких же преимущественных свойств.

Поэтому первым объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы, способные специфически связывать фактор XI, где связывающие молекулы содержат следующие определяющие комплементарность области (CDR):

a) CDR1 легкой цепи: KASQSVDYDGDSYLN (SEQ ID NO: 1),

b) CDR2 легкой цепи: AASNLES (SEQ ID NO: 2),

c) CDR3 легкой цепи: QQSNGDPWT (SEQ ID NO: 3),

d) CDR1 тяжелой цепи: TSGMGVG (SEQ ID NO: 4),

e) CDR2 тяжелой цепи: HIWWDDDKYYNPSLKS (SEQ ID NO: 5), и

f) CDR3 тяжелой цепи: KRSSVVAHYYAMD (SEQ ID NO: 6),

где указанные CDR характеризуются тем, что по меньшей мере две CDR кумулятивно содержат 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислотных замещений.

Термин «аминокислота» или «аминокислотный остаток», как правило, относится к аминокислоте, имеющей свое известное в данной области техники определение, такой как аминокислота, выбранная из группы, состоящей из: аланина (Ala или A); аргинина (Arg или R); аспарагина (Asn или N); аспарагиновой кислоты (Asp или D); цистеина (Cys или C); глютамина (GIn или Q); глутаминовой кислоты (GIu или E); глицина (Gyy или G); гистидина (His или H); изолейцина (He или I): лейцина (Leu или L); лизина (Lys или K); метионина (Met или M); фенилаланина (Phe или F); пролина (Pro или P); серина (Ser или S); треонина (Thr или T); триптофана (Trp или W); тирозина (Tyr или Y); и валина (VaI или V), хотя модифицированные, синтетические или редкие аминокислоты могут быть использованы при необходимости. В общем, аминокислоты могут быть сгруппированы как имеющие неполярную боковую цепь (например, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, VaI); отрицательно заряженную боковую цепь (например, Asp, GIu); положительно заряженную боковую цепь (например, Arg, His, Lys); или незаряженную полярную боковую цепь (например, Asn, Cys, GIn, Gyy, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp и Tyr).

Число и распределение заместителей

Аминокислотные замены в общем могут быть распределены по CDR любым образом, то есть одна CDR может, например, содержать одну замену, а вторая CDR может содержать 9, 10, 11, 12 или 13 замен. Или две CDR могут содержать 5 аминокислотных замен, или все шесть CDR могут содержать аминокислотные замены, например, две замены на CDR. В частности, в настоящем заявке рассматриваются связывающие молекулы, содержащие по меньшей мере 5 аминокислотных замен в CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи и по меньшей мере 5 аминокислотных замен в CDR1, CDR2 и/или CDR3 тяжелой цепи. Как правило, аминокислотные замены могут быть распределены практически любым образом, при условии, что число кумулятивных аминокислотных замен по сравнению с 1А6 CDR аминокислотными последовательностями составляет от 10 до 14 (то есть включает 10, 11, 12, 13 или 14) и предпочтительно не отменяет способность связывающей молекулы связывать фактор XI.

Тип замещений

В общем, любая комбинация аминокислотных замен в CDR по сравнению с 1A6 возможна, до тех пор пока она не отменяет преимущественных свойств связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Аминокислотные замены может быть консервативными (т.е. замена аминокислоты одного класса или группы на другую аминокислоту из того же класса или группы, как указано выше) или неконсервативным (т.е. замена аминокислоты из одного класса/группы на другую аминокислоту из другого класса/группы)

Конкретные аминокислотные замены, которые предусмотрены в соответствии с настоящим изобретением, включают следующие:

(a) D₉®L₉, D₁₁®S₁₁ и/или S₁₄®N₁₄ в отношении SEQ ID NO: 1;

(b) N₆®T₆ в отношении SEQ ID NO: 2;

(c) S₅®Y₅ в отношении SEQ ID NO: 3;

(d) G₁₂®C₁₂ в отношении SEQ ID NO: 4;

(e) W₅®D₅ , N₁₃®S₁₃ в отношении SEQ ID NO: 5;

(f) K₃®I₃, V₈®Y₈, A₁₃®G₁₃ и/или Y₁₆®V₁₆ в отношении SEQ ID NO: 6

Предпочтительные замены дают связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, которые приводят к 1.5 -кратному пролонгированию aPTT (как описано в настоящей заявке) при концентрации 0.03 мкМ или менее, или 0.015 мкМ или менее, или 0.01 мкМ или менее.

В частности, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать следующие CDR:

(a) CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8) или KSSQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 14), причем SEQ ID NO: 8 является предпочтительной; и/или

(b) CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность AASTLES (SEQ ID NO: 9); и/или

(c) CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); и/или

(d) CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); и/или

(e) CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12) или HIDWDDDKYYSTSLKS (SEQ ID NO: 15), причем SEQ ID NO: 12 является предпочтительной; и/или

(f) CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13) или IRSSVYAH YYGMDV (SEQ ID NO: 16), причем SEQ ID NO: 13 является предпочтительной.

Как очевидно из указанного выше, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать одну или более из указанных CDR, необязательно в комбинации.

Особенно предпочтительная связывающая молекула согласно настоящему изобретению, которая может представлять собой моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержит следующие CDR: CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность AASTLES (SEQ ID NO: 9); CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); и CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13). Другие особенно предпочтительные связывающая молекула согласно настоящему изобретению, которые могут представлять собой моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержат следующие CDR: CDR1 легкой цепи, состоящую из последовательности KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); CDR2 легкой цепи, состоящую из последовательности AASTLES (SEQ ID NO: 9); CDR3 легкой цепи, состоящую из последовательности QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); CDR1 тяжелой цепи, состоящую из последовательности TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); CDR2 тяжелой цепи, состоящую из последовательности HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); и CDR3 тяжелой цепи, состоящую из последовательности IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

Более того, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, как исследовано, содержат вариабельную область легкой цепи (V_L или VL), как показано в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, причем область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17, является предпочтительной, и/или вариабельную область тяжелой цепи (область V_H или VH), как показано в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, причем область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18, является предпочтительной. Соответственно, предпочтительные связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17, и область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18. Однако другие комбинации V_L и V_H областей, раскрытых в настоящей заявке, также возможны. Соответственно предпочтительным вариантом выполнения настоящего изобретения является гуманизированное моноклональное антитело TPP-3583 с последовательностями, как показано на Фиг. 1.

Фактор XI

Как изложено ранее в настоящей заявке, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению предпочтительно способны связывать фактор XI.

«Фактор XI», также называемый в настоящем документе «коагуляционный фактор XI», «FXI» или «fXI», представляет собой двухцепочечный гликопротеин с молекулярной массой около 160 килоДальтон (кДа). Две цепи представляют собой идентичные полипептиды с дисульфидной связью с молекулярной массой около 80000 дальтон. FXI содержит 4 «яблочных домена» (от А1 до А4 от N-конца, тяжелая цепь) и С-концевой каталитический домен (легкая цепь). Не желая ограничиваться конкретной теорией, полагают, что 4 яблочных домена содержат сайты связывания FXI для других белков, как например А1 для тромбина; A2 для HK, A3 для фактора IX (FIX), GPIb и гепарина, и A4 для FXIIa. FXI может быть преобразован в свою активную форму, фактор коагуляции XIa (FXIa), фактором XIIa (FXIIa). Сериновая протеаза FXIa превращает Фактор коагуляции IX в IXa, который впоследствии активирует коагуляцию Фактор X (Xa). Ха тогда может опосредовать Фактор коагуляции II/активацию тромбина.

В частности, термин “Фактор XI” относится к человеческому фактору коагуляции XI с номером доступа Uniprot P03951, входная версия 194 от 14 октября 2015 (SEQ ID NO: 7). Как изложено в настоящей заявке, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, как в частности исследовано, связывают домен внутри аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 200 - 283 последовательности SEQ ID NO: 7. Нумерация аминокислот человеческого FXI включает сигнальную последовательность, начинающуюся с аминокислоты метионина в положении 1.

Термин «положение», когда он используется в соответствии с настоящим изобретением, означает положение либо аминокислоты в аминокислотной последовательности, указанной в настоящей заявке, либо положение нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в настоящей заявке. Термин «соответствующий», как применяется в настоящей заявке, также включает то, что положение определяется не только числом предшествующих нуклеотидов/аминокислот, но также должно рассматриваться в контексте прилегающей части последовательности. Соответственно, положение данной аминокислоты или нуклеотида в соответствии с настоящим изобретением может варьироваться вследствие удаления или добавления аминокислот или нуклеотидов в других местах последовательности. Таким образом, когда положение упоминается как «соответствующее положение» в соответствии с настоящим изобретением, подразумевается, что нуклеотиды/аминокислоты могут различаться в терминах указанного множества, но все же могут иметь подобные соседние нуклеотиды/аминокислоты. Чтобы определить, соответствует ли аминокислотный остаток (или нуклеотид) в данной последовательности определенному положению в аминокислотной последовательности (или полинуклеотидной последовательности) «родительской» аминокислоты (или полинуклеотидной последовательности) (например, последовательности человеческого FXI, Как показано в SEQ ID NO: 7), специалист в данной области техники может использовать средства и способы, хорошо известные в данной области техники, например выравнивание последовательностей, либо вручную, либо с использованием компьютерных программ, приведенных в качестве примера в настоящей заявке.

Термин «эпитоп» в общем относится к сайту на антигене, как правило, к (поли)пептиду, который распознает домен связывания, и также может упоминаться как «антигенная структура» или «антигенная детерминанта». Термин «домен связывания» относится к «сайту связывания антигена», то есть характеризует домен связывающей молекулы, который связывается/взаимодействует с данным целевым эпитопом на антигене или группе антигенов, например идентичном антигене у разных видов. целевой антиген может содержать один эпитоп, но обычно содержит по меньшей мере два эпитопа и может включать любое количество эпитопов, в зависимости от размера, конформации и типа антигена. Кроме того, следует отметить, что «эпитоп» на целевом антигене, как правило, является целевым (поли)пептидом, но может также представлять собой или включать неполипептидные элементы, например, эпитоп может включать углеводную боковую цепь. Термин «эпитоп» в общем охватывает линейные эпитопы и конформационные эпитопы. Линейные эпитопы являются смежными эпитопами, содержащимися в первичной аминокислотной последовательности, и обычно, как правило, включают по меньшей мере 2 аминокислоты или более. Конформационные эпитопы образуются несмежными аминокислотами, расположенными рядом сворачиванием целевого антигена, и, в частности, целевого (поли-)пептида.

Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, как исследовано, распознают эпитопы, локализованные на тяжелой цепи фактора XI, которая содержит последовательность по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 смежных или несмежных аминокислот фактора XI (SEQ ID NO: 7).

В частности исследовано, что связывающие молекулы, обеспеченные в настоящей заявке, связывают A3 домен человеческого фактора XI, который содержит аминокислоты 200 - 283 последовательности SEQ ID NO: 7.

Однако также исследовано, что связывающие молекулы могут быть способны связываться с вариантами человеческого FXI, как указано выше. Термин «вариант», когда он используется в отношении FXI, относится к полипептиду, содержащему одну или более замен, делеций и/или добавлений аминокислотной последовательности по сравнению с «родительской» последовательностью FXI, и проявляет ту же биологическую функцию, т.е. может быть преобразован в его активную форму FXIa, которая имеет активность сериновой протеазы и катализирует активацию фактора IX, таким образом, запуская естественный путь свертывания крови. Аминокислотные замены могут быть консервативными, как определено в настоящей заявке, неконсервативными или любой их комбинацией. Варианты FXI могут иметь добавления аминокислотных остатков либо на карбокси-конце, либо на аминоконце (где аминоконец может содержать или не содержать лидерную последовательность). В частности, термин «вариант» при использовании в отношении FXI включает изоформы, аллельные или сплайс-варианты или посттрансляционно модифицированные варианты (например, варианты гликозилирования) известных полипептидов FXI, например полипептид FXI, имеющий последовательность, как показано в SEQ ID NO: 7. Понятно, что связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут в частности проявлять аффиность связывания в отношении FXI вариантов, содержащих аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам 200 - 283 последовательности SEQ ID NO: 7, или в частности аминокислотную последовательность, соответствующую a) аминокислоты 201 - 215 последовательности SEQ ID NO: 7; b) аминокислоты 221 - 222 последовательности SEQ ID NO: 7; c) аминокислоты 252 - 254 последовательности SEQ ID NO: 7; d) аминокислоты 259 - 261 последовательности SEQ ID NO: 7; e) аминокислоты 270 - 273 последовательности SEQ ID NO: 7; и/или f) аминокислоты 276 - 278 последовательности SEQ ID NO: 7. В соответствии с вышеуказанным, также предусматривается, что связывающие молекулы также способны связываться с FXIa и его вариантами при условии, что они содержат по меньшей мере один из вышеупомянутых аминокислотных участков или соответствующих им положений аминокислот.

Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению также могут быть способны связываться с FXI из других видов млекопитающих, предпочтительно видов нечеловеческих приматов. Эти нечеловеческие полипептиды FXI предпочтительно кодированы геном FXI или его ортологом или паралогом и проявляют ту же биологическую функцию, что и человеческий FXI. Потенциальные белки-мишени нечеловеческих приматов для связывающих молекул согласно настоящему изобретению включают полипептиды с номером доступа Uniprot H2QQJ4 (Pan troglodytes, входная версия 26 от 11 ноября 2015), Номером доступа Uniprot H2PEX7 (Pongo abelii, входная версия 27 от 11 ноября 2015), Номером доступа Uniprot A0A0D9S2M6 (Chlorocebus sabaeus, входная версия 6 от 11 ноября 2015), Номером доступа Uniprot G3R2X1 (Gorilla gorilla gorilla, входная версия 27 от 14 октября 2015), Номером доступа Uniprot A0A096NC95 (Papio anubis, входная версия 11 от 11 ноября 2015), Номером доступа Uniprot G1RLE8 (Nomascus leucogenys, входная версия 28 от 11 ноября 2015), Номером доступа Uniprot G7PKF5 (Macaca fascicularis, входная версия 13 от 14 октября 2015), Номером доступа Uniprot G7MSF8 (Macaca mulatta, входная версия 12 от 14 октября 2015). Варианты вышеупомянутых полипептидов также предусматриваются в качестве мишеней для связывающих молекул согласно реальному изобретению. Исследованные полипептидные мишени нечеловеческих приматов, распознаваемые связывающими молекулами согласно настоящему изобретению, как в частности исследовано, содержат последовательность, соответствующую аминокислотам 200 - 283 последовательности SEQ ID NO: 7, и/или аминокислотную последовательность, соответствующую a) аминокислотам 201 - 215 последовательности SEQ ID NO: 7; b) аминокислотам 221 - 222 последовательности SEQ ID NO: 7; c) аминокислотам 252 - 254 последовательности SEQ ID NO: 7; d) аминокислотам 259 - 261 последовательности SEQ ID NO: 7; e) аминокислотам 270 - 273 последовательности SEQ ID NO: 7; и/или f) аминокислотам 276 - 278 последовательности SEQ ID NO: 7, или последовательность на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичную им. Таким образом, в настоящей заявке также обеспечены межвидовые специфические связывающие молекулы, направленные против FXI, особенно у нечеловеческих приматов. Термин «межвидовое распознавание» или «межвидовая специфичность», как применяется в настоящей заявке, таким образом, означает, связывание связывающей молекулы, описанной в настоящей заявке, с одним и тем же полипептидом-мишенью у людей и нечеловеческих видов, в частности нечеловеческих приматов.

Как изложено ранее, предусматривается, что связывающие молекулы, описанные в настоящей заявке, также способны связываться с человеческим фактором XIa или фактором XIa нечеловеческого примата. Таким образом, то, что раскрывается в контексте характеристики связывания связывающей молекулы в отношении фактора XI, в равной степени применимо к его характеристикам связывания в отношении Фактора XIa, с соответствующими поправками.

Антитело

Как в частности исследовано, связывающая молекула согласно настоящему изобретению является антителом. Как хорошо известно в данной области, антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с эпитопом-мишенью через по меньшей мере один сайт распознавания эпитопа, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Термины «антитело», «молекула антитела» и «иммуноглобулин» используются здесь взаимозаменяемо и в их самом широком смысле и включают нативные антитела, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), (встречающиеся в природе или синтетические) производные, фрагменты или варианты антитела, слитые белки, содержащие антиген-связывающий фрагмент требуемой специфичности, и любую другую модифицированную конфигурацию антитела, которая содержит антигенсвязывающий сайт требуемой специфичности. Как исследовано, антитела в соответствии с настоящим изобретением способны связываться с FXI, как описано в другом месте в настоящем документе, и демонстрируют предпочтительные характеристики антител TTP-3583 и TTP-3577, как изложено в прилагаемых примерах.

Нативное антитело

«Нативное антитело» представляет собой тетрамерный гликопротеин. В нативном антителе природного происхождения каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая из которых имеет одну «легкую» цепь (около 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (около 50-70 кДа). Аминотерминальная часть каждой цепи включает в себя «(гипер)вариабельную» область примерно от 100 до 110 или более аминокислот, которые в первую очередь ответственны за распознавание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или CDR или «CDR областей». «Каркас» или остатки FR представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области.

Как легкие, так и тяжелые цепи разделены на области структурной и функциональной гомологии, называемые «константной областью» и «вариабельной областью». Термины «константная» и «переменная» используются функционально. В связи с этим следует понимать, что вариабельные области как легкой (V_L), так и тяжелой (V_H) цепей определяют распознавание и специфичность антигена. Термины “V_L”, “ область V_L”, и “V_L домен” применяются взаимозаменяемо в описании настоящего изобретения в отношении вариабельной области легкой цепи. Подобным образом, термины “V_H”, “область V_H” и “V_H домен” применяются взаимозаменяемо в описании настоящего изобретения в отношении вариабельной области тяжелой цепи.

Термины “C_L”, C_L область” и “C_L домен” применяются взаимозаменяемо в описании настоящего изобретения в отношении константной области легкой цепи. Термины “C_H”, C_H область” и “C_H домен” применяются взаимозаменяемо в описании настоящего изобретения в отношении константной области тяжелой цепи и содержат “C_H1”, C_H2”, и “C_H3” области или домены. И наоборот, константные домены легкой цепи (C_L) и тяжелой цепи (C_H1, C_H2, или C_H3) придают важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание с Fc-рецептором, связывание с комплементом и тому подобное. По соглашению, нумерация доменов константных областей увеличивается по мере того, как они становятся более удаленными от антигенсвязывающего сайта или аминоконца антитела. N-концевая часть является вариабельной областью, а С-концевая часть является константной областью; области C_H3 и C_L фактически содержат карбокси-конец тяжелой и легкой цепей, соответственно.

Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать и специфически связывать эпитопы на антигенах. Таким образом, область V_L и V_H или подмножество определяющих комплементарность областей (CDR) внутри этих вариабельных доменов, антитела объединяются, образуя вариабельную область, которая определяет трехмерный сайт связывания антигена. Эта четвертичная структура антитела образует антигенсвязывающий сайт, присутствующий в конце каждого плеча Y. Более конкретно, антигенсвязывающий сайт определяется тремя CDR (CDR1, CDR2, CDR3, определенными по системе нумерации Kabat) на каждой из V_H и V_L областей. Три CDR легкой цепи также обозначены здесь CDR1 LC или CDR_L1, CDR2 LC или CDR_L2 и CDR3 LC или CDR_L3. Три CDR тяжелой цепи называются CDR1 HC или CDR_H1, CDR2 HC или CDR_H2 и CDR3 HC или CDR_H3. В нативных антителах шесть «определяющих комплементарность области», или «CDR», или «области CDR», присутствующие в каждом антигенсвязывающем домене, как правило, представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, которые специально расположены для формирования антигенсвязывающего домена, как предполагает трехмерная конфигурация антитела в водной среде.

Как изложено ранее в настоящей заявке, связывающие молекулы и, в частности, антитела согласно настоящему изобретению, как исследовано, содержат CDR1 легкой цепи, содержащей или состоящей из последовательности KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8) или KSSQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 14), причем SEQ ID NO: 8 является предпочтительной; и/или CDR2 легкой цепи, содержащей или состоящей из последовательности AASTLES (SEQ ID NO: 9); и/или CDR3 легкой цепи, содержащей или состоящей из последовательности QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); и/или CDR1 тяжелой цепи, содержащей или состоящей из последовательности TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащей или состоящей из последовательности HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12) или HIWWDDDKYYNPSLKS (SEQ ID NO: 15), причем SEQ ID NO: 12 является предпочтительной; и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащей или состоящей из последовательности IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13) или IRSSVYAHYYGMDV (SEQ ID NO: 16), причем SEQ ID NO:13 является предпочтительной.

Особенно предпочтительная связывающая молекула согласно настоящему изобретению, которая может представлять собой моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержит следующие CDR: CDR1 легкой цепи, содержащей или состоящей из последовательности KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); CDR2 легкой цепи, содержащей или состоящей из последовательности AASTLES (SEQ ID NO: 9); CDR3 легкой цепи, содержащей или состоящей из последовательности QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); CDR1 тяжелой цепи, содержащей или состоящей из последовательности TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); CDR2 тяжелой цепи, содержащей или состоящей из последовательности HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); и CDR3 тяжелой цепи, содержащей или состоящей из последовательности IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13), все из которых изображены на Фиг. 1. Специалисту в данной области техники очевидно, что CDR расположены в вариабельной области легкой и тяжелой цепи, соответственно. Особенно предпочтительный вариант выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению представляет собой антитело его антиген-связывающий фрагмент, содержащий сайт связывания антигена легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 8; CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 9; и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 10; и сайт связывания антигена тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 11; CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 12; и CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 13. Другой особенно предпочтительный вариант выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащий сайт связывания антигена легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящую из последовательности, как показано в SEQ ID NO: 8; CDR2 легкой цепи, состоящую из последовательности, как показано в SEQ ID NO: 9; и CDR3 легкой цепи, состоящую из последовательности, как показано в SEQ ID NO: 10; и сайт связывания антигена тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящую из последовательности, как показано в SEQ ID NO: 11; CDR2 тяжелой цепи, состоящую из последовательности, как показано в SEQ ID NO: 12; и CDR3 тяжелой цепи, состоящую из последовательности, как показано в SEQ ID NO: 13. Моноклональное антитело, содержащее вышеуказанные CDR, исследовано в приложенных примерах и обозначено в настоящей заявке “TTP-3583”.

Связывающие молекулы и, в частности, антитела согласно настоящему изобретению, как исследовано, содержат область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, причем область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17 является предпочтительной, и/или область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, причем область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18, является предпочтительной. Соответственно, предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению содержат область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17, и область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18. Однако другие комбинации V_L и V_H областей, раскрытых в настоящей заявке, также возможны.

Связывающие молекулы и, в частности, антитела согласно настоящему изобретению, как исследовано, содержат легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 29, причем легкая цепь, как показано в SEQ ID NO: 27 является предпочтительной, и/или тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 30, причем тяжелая цепь, как показано в SEQ ID NO: 28, является предпочтительной. Соответственно, предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению содержат легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 28. Однако другие комбинации легкой и тяжелой цепе, раскрытых в настоящей заявке, также возможны.

Особенно предпочтительный вариант выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17, и область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18. Особенно предпочтительная связывающая молекула согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 27, и последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 28. Особенно предпочтительная связывающая молекула согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, состоящее из последовательности легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 27, и последовательности тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 28. Особенно предпочтительное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело TPP-3583.

Карбоксиконцевая часть каждой легкой и тяжелой цепи определяет константную область, в первую очередь ответственную за эффекторную функцию. Иммуноглобулины можно отнести к разным классам в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей. Тяжелые цепи классифицируются как mu (μ), дельта (Δ), гамма (γ), альфа (α) и эпсилон (ε) и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. Некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы или изотипы, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Разные изотипы имеют разные эффекторные функции; например, изотипы IgG1 и IgG3 часто обладают активностью ADCC. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда (κ, λ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан с легкой цепью каппа или лямбда. В общем, легкая и тяжелая цепи ковалентно связаны друг с другом, а «хвостовые» части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть антителами IgG, в частности, IgG1.

Моноклональные антитела

В частности, в соответствии с настоящим изобретением предусматриваются моноклональные антитела и их антиген-связывающие фрагменты. Термин «моноклональное антитело», как применяется в настоящей заявке, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. В отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые, как правило, включают разные антитела, направленные против разных эпитопов, моноклональные антитела содержат по существу сходные сайты связывания эпитопов и, следовательно, обычно направлены против одного и того же эпитопа на антигене. Таким образом, термин «моноклональное антитело» включает рекомбинантные, химерные, гуманизированные, человеческие или Human Engineered™ моноклональные антитела.

Различные способы получения монолональных антител известны и описаны, например, в Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 116-227 (Academic Press, 1996). Подходящие методики включают метод гибридомы, впервые описанный Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), методы рекомбинантной ДНК, которые включают выделение и секвенирование ДНК, кодирующей моноклональные антитела, и ее последующее введение и экспрессию в подходящие клетки-хозяева, а также выделение антител из фаговых библиотек антител, полученных с использованием методики, впервые описанной в McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990).

Химерное антитело

Как указано в настоящей заявке, термин «антитело» также включает химерные антитела. Используемая в настоящей заявке фраза «химерное антитело» относится к антителу, содержащему последовательность, полученную из двух разных антител, которые, как правило, происходят из разных видов. В частности, термин относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител.

Другими словами, термин «химерное антитело» будет означать любое антитело, в котором антиген-связывающий сайт получен или происходит из первого вида, и константную область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с настоящим изобретением) получают из второго вида. Например, антиген-связывающий сайт может быть из нечеловеческого источника (например, мыши или примата), а константная область может быть человеческой.

Как правило, химерные антитела могут, например, содержать человеческие и мышиные фрагменты антител, обычно человеческие константные и мышиные вариабельные области.

Гуманизированное антитело

Как изложено ранее в настоящей заявке, настоящее изобретение в частности относится к (моноклональным) гуманизированным антителам и их антиген-связывающим фрагментам, полученным из мышиного античеловеческого FXI 1A6, как описано в WO 2009/067660 A2.

«Гуманизированное антитело» обычно определяется как антитело, которое (I) получено из нечеловеческого источника (например, трансгенной мыши с гетерологичной иммунной системой), причем это антитело основано на последовательности зародышевой линии человека; или (II) является CDR-привитым, где CDR вариабельной области происходят из нечеловеческого происхождения, тогда как одна или более каркасных областей и/или часть последовательности CDR вариабельной области имеют человеческое происхождение, и, как правило, константная область (если есть) имеет человеческое происхождение.

Термин «гуманизированное антитело», таким образом, включает антитела, в которых вариабельная область тяжелой или легкой цепи или обоих антитела человека изменяется путем по меньшей мере частичного замещения одной или более CDR из нечеловеческого антитела известной специфичности и при необходимости путем частичного замещения каркасной области и изменения последовательности. Другими словами, антитело, в котором одна или более «донорских» CDR из нечеловеческого антитела (такого как антитело мыши, крысы, кролика или нечеловеческого примата) известной специфичности трансплантируется в каркасную область тяжелой или легкой цепи человека, упоминается в настоящей заявке как «гуманизированное антитело». Может быть необязательно заменять все CDR полными CDR донорного вариабельного домена для переноса антиген-связывающей способности одного вариабельного домена в другой. Может быть необходимо перенести только те остатки, которые необходимы для поддержания активности целевого сайта связывания.

Авторы настоящего изобретения гуманизировали мышиное антитело 1А6 путем определения остатков CDR 1А6 и выбора из базы данных последовательности человеческой зародышевой линии с наилучшей общей гомологией с мышиными V_H и V_L последовательностями в качестве акцепторного каркаса человеческой зародышевой линии для трансплантации CDR V_H и V_L, соответственно, как подробно описано в эксперименте 1. Впоследствии сгенерированные гуманизированные антитела были подвергнуты оптимизации CDR, как описано в эксперименте 2, путем замены аминокислот в 1A6 на соответствующие аминокислоты в последовательности зародышевой линии человека, наиболее близкой по идентичности и гомологии последовательности («модифицирование на уровне генов зародышевой линии»). Затем авторы настоящего изобретения обнаружили, что гуманизированные антитела, подвергавшиеся модификации на уровне генов зародышевой линии, 1A6, содержащие 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислотных замен в последовательностях CDR и, в частности, содержащие последовательности CDR, раскрытые в других местах в настоящей заявке, проявляют предпочтительные свойства с точки зрения характеристик связывания и биологической активности. тогда как антитела с большими (TTP-3283, TTP3290) или меньшими аминокислотными заменами не проявляли.

Для целей настоящего изобретения гуманизированные антитела, которые были CDR оптимизированы («модифицированный на уровне генов зародышевой линии»), включены в термин «гуманизированные» антитела.

Каркасные области (FR) в пределах вариабельной области в тяжелой или легкой цепи или обеих гуманизированного антитела могут содержать только остатки человеческого происхождения, и в этом случае эти каркасные области гуманизированного антитела называют «полностью человеческими каркасными областями». Человеческая каркасная область, которая содержит смесь человеческих и донорских каркасных остатков и упоминается в настоящей заявке как «частично человеческая каркасная область». Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентом антителе, ни в донорском антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител (например, для получения желаемой аффинности).

В общем, гуманизированное антитело, таким образом, будет включать, по существу, все из по меньшей мере одной и, как правило, двух вариабельных областей, в которых все или часть CDR соответствуют таковым для нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все FR представляют собой FR из последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека.

Человеческое антитело

«Человеческое» антитело определяется в настоящей заявке как антитело, которое не является химерным или «гуманизированным» и не происходит (полностью или частично) из нечеловеческого вида. Человеческое антитело или функциональный фрагмент антитела могут происходить из человека или могут быть синтетическим человеческим антителом. «Синтетическое человеческое антитело» определяется в настоящей заявке как антитело, имеющее последовательность, полученную полностью или частично in silico из синтетических последовательностей, которые основаны на анализе известных последовательностей человеческого антитела. In silico конструирование последовательности человеческого антитела или ее фрагмента может быть достигнуто, например, путем анализа базы данных последовательностей человеческого антитела или фрагментов антител и конструирования аминокислотной последовательности с использованием полученных данных. Другим примером человеческого антитела или функционального фрагмента антитела является тот, который кодируется нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения (то есть такая библиотека основана на антителах, взятых из природного человеческого источника).

Фрагменты, варианты и производные

Как изложено ранее в настоящей заявке, настоящее изобретение охватывает антитела полной длины, а также и их антиген-связывающие фрагменты, варианты и производные.

Фрагменты

Термин «фрагмент антитела» относится к полипептиду, полученному из «родительского» антитела и сохраняющему его основную структуру и функцию. Следовательно, фрагмент антитела предпочтительно обладает способностью связываться со своим специфическим антигеном, т.е. FXI. Кроме того, фрагмент антитела согласно настоящему изобретению содержит минимальные структурные требования антитела, которые допускают связывание антигена. Это минимальное требование может, например, быть определенным наличием по меньшей мере трех CDR легкой цепи (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3 области V_L, т.е. CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3) и/или трех CDR тяжелой цепи (то есть CDR1, CDR2 и CDR3 области V_H, т.е. CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3). Иными словами, термин «фрагмент антитела» относится к «функциональному» или «антигенсвязывающему» полипептиду, который сохраняет антиген-связывающий сайт (то есть CDR и необязательно (часть) FR) «родительского» антитела. Фрагменты антитела согласно настоящему изобретению могут происходить, например, из моноклональных, рекомбинантных, химерных, гуманизированных и человеческих «родительских» антител.

Предпочтительные антиген-связывающие фрагменты антител содержат по меньшей мере одно из, предпочтительно все из, CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8); CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность AASTLES (SEQ ID NO: 9); CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10); CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность TSGMGVG (SEQ ID NO: 11); CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); и CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

В соответствии с вышеизложенным термин «антиген-связывающие фрагменты антител», в частности, относится к фрагментам антител полной длины, таким как (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 или «rIgG» («полуантител»). Фрагменты антител в соответствии с настоящим изобретением также может быть модифицированными фрагментами антител, такими как scFv, di-scFv или bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zipper, scFab, Fab2, Fab3, диатела, одноцепочечные диатела, тандемные диатела (Tandab's), тандемные di-scFv, тандемные tri-scFv, «мини-тела», примером которых является структура, которая является следующей: (V_H-V_L-CH₃)₂, (scFv-CH₃)₂ или (scFv-CH₃-scFv)₂, мультитела, такие как тритела или тетратела. Кроме того, определение термина «фрагменты антител» включает конструкции, содержащие указанные фрагменты, то есть моновалентные, двухвалентные и поливалентные/поливалентные конструкции и, таким образом, моноспецифические конструкции, специфически связывающиеся только с одним антигеном-мишенью, а также биспецифичные и полиспецифичные/мультиспецифичные конструкции, которые специфически связывают более один антиген-мишень, например два, три или более, через различные сайты связывания антигена. Кроме того, определение термина «фрагменты антител» включает молекулы, состоящие только из одной полипептидной цепи, а также молекулы, состоящие из более чем одной полипептидной цепи, причем эти цепи могут быть либо одинаковыми (гомодимеры, гомотримеры или гомоолигомеры), либо разными (гетеродимер, гетеротример или гетероолигомер).

Фрагменты антител могут быть получены методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. Способы получения таких фрагментов хорошо известны в данной области техники.

Варианты

Термин «вариант» относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность «родительской» связывающей молекулы, такой как антитело или фрагмент антитела, но содержащим по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, замену, делецию или вставку) по сравнению с ««родительской» аминокислотной последовательностью, при условии, что вариант все еще способен (специфически) связываться с FXI, в частности с человеческим FXI, как показано в SEQ ID NO: 7, и предпочтительно проявляет аналогичные или даже улучшенные характеристики по сравнению с антителами TTP-3583 и/или TTP-3577 согласно оценке в прилагаемых примерах. Варианты связывающих молекул согласно настоящему изобретению, в частности антител и фрагментов антител, как правило, получают путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело или фрагмент антитела, или путем пептидного синтеза. Как правило, вышеупомянутые модификации аминокислот могут быть введены или присутствовать в вариабельной области или константной области при условии, что две или более CDR вариантов кумулятивно содержат 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислотных замен по сравнению с CDR 1A6, как показано в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Аминокислотные модификации, например, могут быть введены для того, чтобы модулировать свойства антител, такие как термодинамическая стабильность, растворимость или вязкость, которые влияют на разработку фармацевтических препаратов («оптимизация последовательности»).

Как изложено ранее, аминокислотные модификации включают, например, делеции из и/или вставки в и/или замены остатков в описанных в настоящей заявке аминокислотных последовательностях связывающих молекул, предпочтительно антител или антигенсвязывающих фрагментов антител. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть введена в «родительскую» аминокислотную последовательность, чтобы получить конечный продукт, при условии, что он обладает желаемыми характеристиками, как изложено в настоящей заявке. Модификации аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы связывающих молекул, как например изменение количества или положения сайтов гликозилирования.

Например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот могут быть вставлены или удалены в каждой из CDR (конечно, в зависимости от ее длины), в то время как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 25 аминокислот могут быть вставлены или удалены в каждой из FR. Вставки аминокислотной последовательности, предусматриваемая в настоящей заявке, включает амино- и/или карбоксильные концевые слияния в диапазоне длины от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также в виде внутрипоследовательных вставок из одного или более аминокислотных остатков. Инсерционный вариант связывающей молекулы, в частности антитела или фрагмента антитела, согласно настоящему изобретению, включает продукт слияния антитела или фрагмента антитела и фермента или другого функционального полипептида (например, который увеличивает период полураспада в сыворотке связывающей молекулы, например, антитела или фрагмента антитела).

Аминокислотные замены могут быть введены в CDR тяжелой и/или легкой цепи, в частности гипервариабельные области, или FR-области в тяжелой и/или легкой цепи. В частности, здесь предусмотрены консервативные аминокислотные замены, которые могут быть сделаны, например, на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природе участвующих остатков.

Предпочтительно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот могут быть замещены в CDR, при условии, что вариант антитела кумулятивно содержит 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислотных замен по сравнению с CDR 1A6, как показано в SEQ ID NO: 1-6-, в то время как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19, 20 или 25 аминокислот могут быть заменены в каркасных областях (FR), в зависимости от длины CDR или FR.

В общем, если аминокислоты замещены в одной или нескольких или во всех CDR тяжелой и/или легкой цепи, предпочтительно, чтобы полученная затем «вариантная» последовательность была на по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% % и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична «родительской» последовательности CDR. Длина CDR, таким образом, влияет на число возможных аминокислотных замен, так что вариантная последовательность все еще включена в настоящее изобретение. Например, CDR, имеющая 5 аминокислот, предпочтительно на 80% идентична ее замещенной последовательности, чтобы иметь по меньшей мере одну замещенную аминокислоту. Соответственно, CDR конструкции антитела могут иметь разные степени идентичности с их замещенными последовательностями, например, CDR_L1 может иметь 80%, тогда как CDR_L3 может иметь 90%.

Предпочтительными заменами (или замещениями) являются консервативные замены. Однако предусматривается любая замена (включая неконсервативную замену или одну или более из примерных замен), до тех пор пока конструкция антитела сохраняет свою способность связывать FXI, и/или ее CDR имеют идентичность с замещенной последовательностью по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Как применяется в настоящей заявке, термин «идентичность последовательности» указывает степень, в которой две (нуклеотидные или аминокислотные) последовательности имеют идентичные остатки в одних и тех же положениях при выравнивании, и часто выражается в процентах. Предпочтительно, идентичность определяется по всей длине сравниваемых последовательностей. Таким образом, две копии одной и той же последовательности имеют 100%-ную идентичность, но последовательности, которые менее консервативны и имеют делеции, добавления или замены, могут иметь более низкую степень идентичности. Специалистам в данной области техники понятно, что доступно несколько алгоритмов для определения идентичности последовательности с использованием стандартных параметров, например, Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197) и ClustalW. Соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID No: 8, 9, 10, 11, 12 или 13 или нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 31 или 32 могут служить в качестве “предметной последовательности” или “ссылочной последовательности”, тогда как аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты полипептида, отличная от нее, может служить в качестве “запрашиваемой последовательности”.

Термин «гомология последовательности» указывает на сходство двух (нуклеотидных или аминокислотных) последовательностей, приписываемых происхождению от общего предка. Гомологичные биологические компоненты (гены, белки, структуры) называются гомологами и включают ортологи и паралоги.

Предпочтительные варианты связывающей молекулы согласно настоящему изобретению имеют идентичность последовательности или гомологию в областях CDR по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или почти 100% и демонстрирует сравнимую или улучшенную аффинность связывания с FXI и/или сопоставимую или улучшенную биологическую активность по сравнению со связывающими молекулами, содержащими «родительские» CDR, в частности SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 12 и 13.

Более того, гомология или сходство последовательности нуклеиновой кислоты между нуклеотидными последовательностями, кодирующими отдельные вариантные CDR, и нуклеотидными последовательностями, изображенными в настоящем документе, составляют, по меньшей мере, 80%, и, более типично, предпочтительно с увеличением гомологий или идентичностей до по меньшей мере 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и почти 100%.

Помимо CDR и FR, аминокислотные модификации также могут быть введены в Fc-часть связывающей молекулы, которая представляет собой предпочтительно моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент. Такие модификации могут быть использованы для модуляции функциональных свойств антитела, например, взаимодействий с белками комплемента, такими как рецепторы C1q и/или Fc, на других иммунных клетках или для модуляции периода полураспада в сыворотке или антиген-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Таким образом, мутации для модификации эффекторных функций могут быть введены в Fc-домены с использованием рутинных методов, известных в данной области. Примеры модификаций включают Asn297 → Ala297 и Asn297 → Gln297, приводящие к агликозилированию IgG1 или Lys322 → Ala322 и необязательно Leu234 → Ala234 и Leu235 → Ala234, которые, как сообщалось, снижают или отменяют клеточно-опосредованную цитотоксичность, вызванную антителами (ADCC) или цитотоксичность, обусловленную комплементом (CDC).

Производные

Термин «связывающая молекула» также охватывает производные. В частности, в настоящем документе предусматриваются производные антител или фрагментов антител, как описано в другом месте в настоящем документе. Термин «производное» обычно относится к связывающей молекуле, которая была ковалентно модифицирована для введения дополнительной функциональности. Ковалентные модификации связывающих молекул обычно, но не всегда, осуществляются посттрансляционно и могут быть введены в связывающую молекулу путем взаимодействия определенных аминокислотных остатков молекулы с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N - или С-концевыми остатками. Дериватизацию связывающих молекул можно использовать для присоединения терапевтических или диагностических агентов, меток, групп, продлевающих период полураспада в сыворотке молекулы, или для вставки неприродных аминокислот. Возможные химические модификации связывающей молекулы согласно настоящему изобретению включают ацилирование или ацетилирование N-концевого конца или амидирование или эстерификацию C-концевого конца или, альтернативно, обоих. Химические модификации, такие как алкилирование (например, метилирование, пропилирование, бутилирование), арилирование и этерификация, также предусмотрены.

Продление периода полураспада в сыворотке

Примеры способов продления периода полураспада в сыворотке связывающих молекул и, в частности, антител и их антиген-связывающих фрагментов согласно настоящему изобретение включают прикрепление пептидов или белковых доменов, связывающихся с другими белками в организме человека (такими как сывороточный альбумин, Fc область иммуноглобулина или неонатальный Fc-рецептор (FcRn). Другие возможные модификации для увеличения периода полураспада в сыворотке включают удлинение аминогруппы полипептидными цепями различной длины (например, технология XTEN или PASylation®), конъюгацию небелковых полимеров, включая, но не ограничиваясь этим, различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, или углеводы, как например гидроксиэтилкрахмал (например, HESylation®) или полисиаловая кислота (например, технология PolyXen®). Кроме того, как известно в данной области техники, аминокислотные замены могут быть сделаны в различных положениях внутри связывающей молекулы, чтобы облегчить добавление указанных полимеров.

Гликозилирование

Другой тип ковалентной модификации связывающих молекул и, в частности, антител и их антиген-связывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением включает изменение модели гликозилирования. Как известно в данной области техники, модели гликозилирования могут зависеть как от аминокислотной последовательности указанной молекулы (например, от наличия или отсутствия конкретных аминокислотных остатков гликозилирования, обсуждаемых ниже), так и от клетки-хозяина или организма, в котором продуцируется белок. Гликозилирование полипептидов обычно является либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводной составляющей к боковой цепи остатка аспарагина. Добавление N-связанных сайтов гликозилирования к связывающей молекуле удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности, так чтобы она содержала одну или более трипептидных последовательностей, выбранных из аспарагина-Х-серина и аспарагина-Х-треонина (где Х - любая аминокислота, кроме пролина). Сайты О-связанного гликозилирования могут быть введены путем добавления или замены одним или более сериновыми или треониновыми остатками к исходной последовательности.

Другим средством гликозилирования связывающей молекулы является химическое или ферментативное связывание гликозидов с белком. Эти процедуры предпочтительны тем, что они не требуют продуцирования белка в клетке-хозяине, которая обладает способностями к гликозилированию для N- и O-связанного гликозилирования. В зависимости от используемого способа связывания сахар(сахара) может быть присоединен к (а) аргинину и гистидину, (b) свободным карбоксильным группам, (c) свободным сульфгидрильным группам, таким как цистеин, (d) свободным гидроксильным группам, таким как остатки серина, треонина или гидроксипролина, (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глютамина

Подобным образом, дегликозилирование (то есть удаление углеводных фрагментов, присутствующих на связывающей молекуле) может быть осуществлено химически, например, воздействием на связывающую молекулу трифторметансульфоновой кислотой или ферментативно путем применения эндо- и экзогликозидаз.

Введение метки

Дополнительные потенциальные ковалентные модификации связывающей молекулы согласно настоящему изобретению включают добавление одной или более меток. Вносящая метку группа может быть соединена со связывающей молекулой через спейсеры различной длины, чтобы уменьшить потенциальные стерические помехи. Различные способы введения меток в белки известны в данной области техники и могут быть использованы при выполнении настоящего изобретения. Термин «метка» или «вносящая метку группа» относится к любой обнаруживаемой метке. Как правило, метки подразделяются на различные классы, в зависимости от анализа, в котором они должны быть обнаружены - следующие примерные метки включают, но не ограничиваются ими: изотопные метки, которые могут быть радиоактивными или тяжелыми изотопами, такими как радиоизотопы или радионуклиды (например, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I); магнитные метки (например, магнитные частицы); окислительно-восстановительные активные фрагменты; оптические красители (включая, но не ограничиваясь ими, хромофоры, люминофоры и флуорофоры), такие как флуоресцентные группы (например, FITC, родамин, лантаноидные люминофоры), хемилюминесцентные группы и флуорофоры, которые могут представлять собой либо флуоресцентные "низкомолекулярные" флуорофоры, либо белковые флуорофоры; ферментативные группы (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза; биотинилированные группы или предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пар лейциновой молнии, сайты связывания для вторичных антител, домены, связывающие металлы, метки эпитопов и т.д.)

ADC

Также возможно добавлять лекарственное средство, такое как соединение малой молекулы, к связывающим молекулам и, в частности, к антителам или их антиген-связывающим фрагментам. «Конъюгаты антител с лекарственными средствами», сокращенно «ADC», представляют собой антитела или их антиген-связывающие фрагменты, связанные с лекарственным средством или агентом. Связь может быть установлена посредством ковалентных связей или нековалентных взаимодействий, таких как электростатические силы. Различные линкеры, известные в данной области, могут быть использованы для образования ADC, как известно в данной области и описано в настоящей заявке.

Аффинные метки

Связывающая молекула и, в частности, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, согласно настоящему изобретению, могут также содержать дополнительные домены, которые помогают при очистке и выделении молекулы (аффинные метки). Неограничивающие примеры таких дополнительных доменов включают пептидные мотивы, известные как Myc-метка, HAT-метка, HA-метка, TAP-метка, GST-метка, хитин-связывающий домен (CBD-метка), мальтоза-связывающий белок (MBP-метка), Flag-метка, Strep-метка и их варианты (например, Strep II-метка) и His-метка.

Вышеупомянутые фрагменты, варианты и производные могут быть дополнительно адаптированы для улучшения, например, их антигенсвязывающих свойств. Например, F(ab')2 или Fab могут быть сконструированы так, чтобы минимизировать или полностью удалить межмолекулярные дисульфидные взаимодействия, которые происходят между доменами C_H1 и C_L. Полипептиды Fv могут дополнительно содержать полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет Fv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первую константную область (CH₁) тяжелой цепи. Fab-фрагменты отличаются от Fab'-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси конце CH₁ области тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляет собой обозначение в настоящей заявке для Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константной области несут свободную тиольную группу. Изначально F(ab’)2 фрагменты антител были получены в виде пар фрагментов Fab', которые имеют шарнирные цистеиновые остатки между ними.

Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут быть обеспечены в «выделенной» или «по существу чистой» форме. «Выделенный» или «по существу чистый» при использовании в настоящем документе означает, что связывающая молекула была идентифицирована, отделена и/или извлечена из компонента среды ее получения, так что «выделенная» связывающая молекула свободна или по существу свободна от других загрязняющих компонентов из среды ее получения, которая может помешать ее терапевтическому или диагностическому использованию. Загрязняющие компоненты могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. «Выделенная» связывающая фраза, таким образом, будет получена посредством по меньшей мере одной стадии очистки, удаляющей или по существу удаляющей эти загрязняющие компоненты. Вышеупомянутое определение в равной степени применимо к «выделенным» полинуклеотидам, с небольшими поправками.

Специфическое связывание

Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, в частности антитела и их антиген-связывающие фрагменты предпочтительно способны связываться с фактором XI, в частности человеческим фактором XI, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 7. Термины «связывание» и «распознавание» во всех грамматических формах используются здесь взаимозаменяемо. Предпочтительно, указанные связывающие молекулы специально связываются с фактором XI. Термин «специфически связывается», как правило, указывает на то, что связывающая молекула, в частности антитело или его антиген-связывающий фрагмент, как определенно в настоящей заявке, связывается с помощью ее сайта связывания антигена с большей вероятностью с целевым эпитопом-мишенью, чем со случайным, неродственным нецелевым эпитоп. В частности, термин «специфически связывается» указывает на то, что сродство связывающей молекулы будет по меньшей мере примерно в 5 раз, в 10 раз, более предпочтительно в 25 раз, еще более предпочтительно в 50 раз и наиболее предпочтительно в 100 раз или более, больше для ее целевого эпитопа, чем ее сродство к нецелевому эпитопу.

Таким образом, связывающая молекула, и в частности антитело или его антиген-связывающий фрагмент, как можно считать, специфически связывается с целевым эпитопом, если она связывает указанный эпитоп с константой диссоциации (K_D), которая меньше, чем K_D антитела для нецелевого эпитопа. Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению также могут быть описаны с точки зрения их сродства к фактору XI, в частности к человеческому фактору XI. Термин «аффинность» или «аффинность связывания» относится к силе связывания отдельного эпитопа с антигенсвязывающим доменом (и, в частности, с CDR связывающей молекулы). Сродство связывания данной связывающей молекулы с ее конкретным эпитопом часто определяют путем измерения равновесной константы ассоциации (ka) и равновесной константы диссоциации (kd) и вычисления отношения kd к ka (K_D = kd/ka). Аффинность связывания может быть легко определена с использованием обычных методов, таких как равновесный диализ; с помощью инструмента BIAcore 2000; радиоиммунологического анализа с использованием меченного радиоактивным изотопом антигена-мишени; или другим способом, известным специалисту в данной области. Данные аффинности могут быть проанализированы, например, методом, описанным в Kaufman RJ and Sharp PA. (1982) J Mol Biol.159:601-621. Предпочтительные аффинности связывания связывающих молекул согласно настоящему изобретению включают аффинности связывания с константой диссоциации или K_D менее 5 x 10^-6 M, 10^-6 M, 5 x 10^-7 M, 10^-7 M, 5 x 10^-8 M, 10^-8 M, 5 x 10^-9 M, 10^-9 M, 5 x 10^-10 M, 10^-10 M, 5 x 10^-11 M, 10^-11 M, 5 x 10^-12 M, 10^-12 M, 5 x 10^-13 M, 10^-13 M, 5 x 10^-14 M, 10^-14 M, 5 x 10^-15 M, или 10^-15 M.

Перекрестная реакционная способность

Термин «специфически связывается», однако, не исключает того, что связывающие молекулы (специфически), связывающиеся с человеческим фактором XI, перекрестно реагируют с белком фактора XI из другого вида. Соответственно, связывающая молекула согласно настоящему изобретению также может быть способной связываться с FXI из других видов млекопитающих, предпочтительно видов нечеловеческих приматов, как проиллюстрировано в другом месте в настоящей заявке.

«Межвидовое» связывание или распознавание означает связывание описанного в настоящей заявке связывающего домена с одним и тем же антигеном-мишенью у людей и нечеловеческих видов. Таким образом, «межвидовую специфичность» следует понимать как межвидовую реактивность в отношении Фактора XI, экспресcируемого у различных видов, но не в отношении антигена, отличного от Фактора XI. Например, связывающий домен, который связывается с человеческим фактором XI, в частности с доменом A3, содержащим аминокислоты 200-283 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, также может связываться с Фактором XI нечеловеческого примата и, в частности, с областью, соответствующей аминокислотам 200 - 283 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7.

Биологическая активность

Связывающие молекулы, обеспеченные в настоящей заявке, как исследовано, являются биологически активными, т.e. чтобы связываться с Фактором XI и/или Фактором XIa и блокировать его соответствующие биологические функции. В частности, “биологически активные” связывающие молекулы согласно настоящему изобретению блокируют превращение Фактора XI в его активную форму (Фактор XIa) и/или блокируют связывание последующего фактора коагуляции IX с Фактором XIa, предпочтительно приводя к полному или частичному ингибированию активности Фактора XI и/или Фактора XIa. Таким образом, как исследовано, связывание биологически активных связывающих молекул с их целевым Фактором XI и/или Фактором XIa приводит к антикоагуляционной активности. Иными словами, исследовано, что связывающие молекулы согласно настоящему изобретению выполняют свою полезную функцию через а) связывание с Фактором XI, блокируя тем самым его преобразование в его активную форму Фактор XIa, и/или b) связывание с Фактором XIa, тем самым блокируя его связывание и активацию последующего Фактора коагуляции IX. Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, таким образом, прерывают «ветвь FXI» каскада коагуляции и тем самым предотвращают тромбоз, преимущественно без нарушения нормального гемостаза.

Антикоагулянтную активность связывающей молекулы можно определить in vitro, как описано в прилагаемых экспериментах. Вкратце, активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT) определяется в присутствии различных концентраций указанной связывающей молекулы или соответствующего растворителя с использованием коммерческого тест-набора (реагент PTT от Roche). Испытуемые соединения инкубируют с плазмой и реагентом РТТ (цефалин, каолин) при 37°С в течение 3 минут. Затем коагуляцию начинают добавлением 25 мМ хлорида кальция, и определяют время, когда происходит коагуляция. Определяют концентрацию испытуемого вещества, которая влияет на увеличение aPTT в 1,5 раза.

Исследовано, что концентрации связывающих молекул согласно настоящему изобретению приводят к 1.5-кратному пролонгированию aPTT при концентрации 0.03 мкМ или менее, или 0.015 мкМ или менее, или 0.01 мкМ или менее.

Предпочтительно, связывающие молекулы и в частности моноклональные антитела и их антиген-связывающие фрагменты согласно настоящему изобретению проявляют вышеуказанные биологические свойства и поэтому являются перспективными новыми агентами для ингибирования тромбоза. Поскольку связывающие молекулы в частности предназначены для специфического связывания с Фактором XI, предполагается, что они не нарушают или не оказывают серьезного влияния на гемостаз и, таким образом, предпочтительно не увеличивают риск кровотечения.

Полинуклеотид

Настоящее изобретение также обеспечивает молекулу полинуклеотида/нуклеиновой кислоты, кодирующую связывающую молекулу или V_H или V_L домен согласно настоящему изобретению.

Термин "полинуклеотид", как он использован здесь, включает полирибонуклеотиды и полидезоксирибонуклеотиды, например, модифицированные или немодифицированные РНК или ДНК, каждая в одноцепочечной и/или двухцепочечной форме, линейной или кольцевой, или их смеси, включая гибридные молекулы. Полинуклеотид может содержать обычную сложнофосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, такую как найденная в пептидных нуклеиновых кислотах (PNA)). Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут также содержать одно или более модифицированных оснований, таких как, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Также возможны другие модификации, в том числе химические, ферментативные или метаболические модификации, при условии, что связывающая молекула согласно настоящему изобретению может быть экспрессирована из полинуклеотида. Полинуклеотид может быть обеспечен в изолированной форме, как определено в другом месте здесь. Полинуклеотид может включать регуляторные последовательности, такие как элементы контроля транскрипции (включая промоторы, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции), сайт связывания рибосомы, интроны или тому подобное.

Соответственно настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей область тяжелой цепи иммуноглобулина (область V_H), где по меньшей мере одна из CDR области V_H имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, около 85%, около 90%, около 95% , около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, идентична или идентична любой одной последовательности SEQ ID NO: 11, 12, 13, 15 или 16, причем SEQ ID NO: 11-13 является предпочтительной. Кроме того, настоящее изобретение включает полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей область V_H, которая имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или 100% идентична эталонной области V_H аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 и 20, причем SEQ ID NO: 18 является предпочтительной. Как исследовано, связывающая молекула, содержащая кодированные CDR или V_H-домены, способна связываться с FXI и проявлять желаемые биологические активности, как описано здесь в другом месте.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей домен легкой цепи иммуноглобулина (область V_L), где по меньшей мере одна из CDR области V_L имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, около 85%, около 90%, около 95% , около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, идентична или идентична любой последовательности SEQ ID NOS: 8, 9, 10 или 14, причем SEQ ID No. 8-10 являются предпочтительными. Более того, настоящее изобретение включает полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей область V_L, которая имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или 100% идентична ссылочной аминокислотной последовательности области V_L, выбранной из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO:17 или 19, причем SEQ ID NO: 17 является предпочтительной. Связывающая молекула, содержащая кодированные CDR или области V_L, как исследовано, способна связывать FXI и предпочтительно проявляет желаемые биологические активности, как описано в настоящей заявке.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеиновой кислоты, которая на по меньшей мере около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или 100% идентична ссылочной полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 31, 32, 33 и 34.

Полинуклеотиды, описанные выше, могут содержать или не содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, кодирующие, например, сигнальный пептид, для прямой секреции кодируемого полипептида, константные области антител, как определено в настоящей заявке, или другие гетерологичные полипептиды, как определено в настоящей заявке. Таким образом, такие полинуклеотиды могут кодировать слитые полипептиды, фрагменты, варианты и другие производные связывающих молекул, описанных в настоящей заявке.

Также настоящее изобретение включает композиции, содержащие один или более полинуклеотидов, описанных выше. В настоящей заявке также обеспечиваются композиции, содержащие первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, где указанный первый полинуклеотид кодирует область V_H, как определенно в настоящей заявке, и где указанный второй полинуклеотид кодирует область V_L, как определенно в настоящей заявке, в частности композицию, которая содержит или состоит из области V_H, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 и 20 (причем SEQ ID NO: 18 является предпочтительной), и/или области V_L, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17 и 19 ( причем SEQ ID NO: 17 является предпочтительным).

Продукция полинуклеотиды

Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть получены рутинными способами, известными в данной области техники. Например, если нуклеотидная последовательность связывающей молекулы известна, полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу, может быть получен из химически синтезированных олигонуклеотидов, путем отжига и лигирования этих олигонуклеотидов, а затем амплификации лигированных олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу, может быть получен из подходящего источника (например, библиотеки CDNA или нуклеиновой кислоты, такой как поли(A) + мРНК, выделенной из любой ткани или клеток, экспрессирующих связывающую молекулу, таких как клетки гибридомы), с помощью ПЦР-амплификации, используя синтетические праймеры, гибридизующиеся с 3' и 5' концами последовательности или путем клонирования с использованием олигонуклеотидного зонда, специфичного для конкретной последовательности гена, для идентификации, например, клона CDNA из библиотеки CDNA, который кодирует связывающую молекулу.

Как только нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность связывающей молекулы определены, ее нуклеотидная последовательность может быть модифицирована с использованием методов, хорошо известных в данной области техники для манипулирования нуклеотидными последовательностями, например, методов рекомбинантной ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.д., таким образом, вводя одну или более нуклеотидных замен, добавлений или делеций в полинуклеотидную последовательность (смотрите, например, методы, описанные в J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)) для генерации не встречающихся в природе фрагментов, вариантов или производных связывающей молекулы и, в частности, анти-FXI моноклонального антитела, описанного в настоящей заявке (например, области тяжелой цепи или области легкой цепи иммуноглобулина).

Векторы

В настоящей заявке также обеспечивается вектор, содержащий полинуклеотид, как определено в настоящей заявке. Указанный полинуклеотид кодирует связывающую молекулу согласно настоящему изобретению, в частности моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент. “Вектор” представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, используемую в качестве средства переноса (чужеродного) генетического материала в клетку-хозяин, где она может, например, реплицироваться и/или экспрессироваться.

Термин «вектор» включает, без ограничения, плазмиды, вирусные векторы (включая ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы вируса коровьей оспы, векторы вируса полиомы и векторы, ассоциированные с аденовирусом (AAV)), фаги, фагмиды, космиды и искусственные хромосомы (включая BAC и YAC). Сам вектор в общем представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно последовательность ДНК, которая содержит вставку (трансген) и большую последовательность, которая служит «основой» вектора. Сконструированные векторы, в общем, содержат источник для автономной репликации в клетке-хозяине (если требуется стабильная экспрессия полинуклеотида), маркеры отбора и сайты расщепления ферментов рестрикции (например, сайт множественного клонирования, MCS). Вектор может дополнительно содержать промоторы, генетические маркеры, репортерные гены, нацеливающие последовательности и/или метки очистки белка. Векторы, называемые экспрессионными векторами (экспрессионные конструкции), в частности предназначены для экспрессии трансгена в клетке-мишени и обычно имеют контрольные последовательности.

Специалистам в данной области известно большое количество подходящих векторов, и многие из них коммерчески доступны. Примеры подходящих векторов приводятся в J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012).

Нацеливающие векторы

Нацеливающие векторы могут применяться, чтобы интегрировать полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина (как например описано J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)). Вкратце, подходящие способы включают гомологичную рекомбинацию или использование гибридной рекомбиназы, которая специфически нацеливает последовательности при сайтах интеграции. Нацеливающие векторы, как правило, являются циркулярными и линеаризованными перед использованием для гомологичной рекомбинации. В качестве альтернативы, чужеродные полинуклеотиды могут представлять собой фрагменты ДНК, соединенные с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами, или синтетически сконструированные фрагменты ДНК, которые затем рекомбинируют в клетку-хозяин. Также возможно использовать гетерологичную рекомбинацию, которая приводит к случайной или нецелевой интеграции.

Продукция

Экспрессионные вектора

“Экспрессионные вектора” или “экспрессионные конструкции” могут быть использованы для транскрипции гетерологичных полинуклеотидных последовательностей, например, тех, которые кодируют связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, и трансляции их мРНК в подходящую клетку-хозяин. Этот процесс также упоминается в настоящей заявке как «экспрессия» связывающей молекулы согласно настоящему изобретения. Помимо точки начала репликации, маркеров отбора и сайтов расщепления ферментов рестрикции, экспрессионные вектора, как правило, включает одну или более регуляторных последовательностей, функционально связанных с экспрессируемым гетерологичным полинуклеотидом.

Термин «регуляторная последовательность» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, необходимой для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности (гетерологичного) полинуклеотида в конкретном организме-хозяине и, таким образом, включает транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности. Как правило, регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии гетерологичных полинуклеотидных последовательностей в прокариотах, включают промотор(ы), необязательно операторную последовательность(и) и сайт(ы) связывания рибосом. У эукариот обычно требуются промоторы, сигналы полиаденилирования, энхансеры и необязательно сигналы сплайсинга. Кроме того, специфическая инициация и секреторные сигналы также могут быть введены в вектор для обеспечения секреции интересующего полипептида в культуральную среду.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», когда она находится в функциональном взаимоотношении с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, в частности, на той же молекуле полинуклеотида. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности. Промотор обычно располагается перед геном, кодирующим интересующий полипептид, и регулирует экспрессию гена.

Примерные регуляторные последовательности для экспрессии клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни протеиновой экспрессии в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансер, производный от цитомегаловируса (CMV) (такой как CMV промотор/энхансер), вирус обезьяны 40 (SV40) (такой как SV40 промотор/энхансер), аденовирус, (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиома. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей (смотри U.S. 5,168,062 Stinski, U.S. 4,510,245 Bell et al. и U.S. 4,968,615 Schaffner et al.). Как изложено ранее, экспрессионные векторы, кроме того, могут включать точку начала репликации и маркеры отбора.

Как упоминалось ранее, векторы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или более маркеров выбора. Подходящие маркеры отбора для использования с эукариотическими клетками-хозяевами включают, без ограничения, гены тимидин киназы вируса простого герпеса (tk), гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (hgprt) и аденинфосфорибозилтрансферазы (aprt). Другие гены включают dhfr (устойчивость к метотрексату), gpt (устойчивость к микофенольной кислоте), neo (устойчивость к G-418) и hygro (устойчивость к гигромицину). Вектор амплификации может быть использован для повышения уровня экспрессии. Как правило, ген маркера отбора может быть либо напрямую связан с полинуклеотидными последовательностями, которые должны быть экспрессированы, либо введен в ту же клетку-хозяин путем котрансформации.

Принимая во внимание вышеизложенное, настоящее изобретение, таким образом, дополнительно обеспечивает одну или более полинуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей заявке, вставленных в вектор. Таким образом, изобретение, в частности, обеспечивает реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую связывающую молекулу согласно настоящему изобретению, или ее тяжелую или легкую цепь, или вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, функционально связанный с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область связывающей молекулы, и вариабельный домен связывающей молекулы может быть клонирован в такой вектор для экспрессии всей тяжелой или легкой цепи.

Клетка-хозяин

В общем, для экспрессии связывающей молекулы согласно настоящему изобретению из экспрессионного вектора может использоваться множество клеток-хозяев. Как применяется в настоящей заявке, термин «клетка-хозяин» относится к клетке, которая может быть или есть/была реципиентом полинуклеотидов или векторов, или кодирующей связывающую молекулу согласно настоящему изобретению. В частности, клетка-хозяин может, кроме того, быть способной экспрессировать и необязательно секретировать указанную связывающую молекулу. В описаниях процессов получения связывающих молекул из клеток-хозяев термины «клетка» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо для обозначения источника связывающей молекулы, если ясно не указано иное. Термин «клетка-хозяин» также включает «линии клеток-хозяев».

В общем, термин включает прокариотические или эукариотические клетки, а также включает, без ограничения к этому, бактерии, дрожжевые клетки, клетки грибов, клетки растений и клетки животных, такие как клетки насекомых и клетки млекопитающих, например клетки мыши, крысы, макаки или человека.

Полинуклеотиды и/или вектора согласно настоящему изобретению могут быть введены в клетки-хозяева, применяя рутинные методы, известные в данной области техники, например, путем трансфекции, трансформации или тому подобного.

«Трансфекция» представляет собой процесс направленного введения молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (включая векторы) в клетки-мишени. Термин в основном используется для невирусных методов в эукариотических клетках. Трансдукция часто используется для описания вирус-опосредованного переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов. Трансфекция животных клеток обычно включает открытие переходных пор или «отверстий» в клеточной мембране, чтобы позволить поглощение материала. Трансфекция может быть осуществлена с использованием фосфата кальция, электропорацией, выдавливанием клеток или смешиванием катионного липида с материалом для получения липосом, которые сливаются с клеточной мембраной и откладывают свой депозит внутри. Примерные методики трансфекции эукариотических клеток-хозяев включают опосредованное липидной везикулой поглощение, опосредованное тепловым шоком поглощение, трансфекцию, опосредованную фосфатом кальция (совместное осаждение фосфата кальция/ДНК), микроинъекцию и электропорацию.

Термин «трансформация» используется для описания невирусного переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (включая векторы) в бактерии, а также в эукариотические клетки, не являющиеся животными, включая растительные клетки. Следовательно, трансформация - это генетическое изменение бактериальной или неживотной эукариотической клетки в результате прямого поглощения через клеточную мембрану (мембраны) из окружающей среды и последующего включения экзогенного генетического материала (молекул нуклеиновой кислоты). Трансформация может быть осуществлена искусственным путем. Чтобы трансформация произошла, клетки или бактерии должны быть в состоянии компетенции, что может происходить как ограниченный во времени ответ на условия окружающей среды, такие как голодание и плотность клеток. Для прокариотической трансформации методы могут включать поглощение, опосредованное тепловым шоком, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками, микроинъекцию и электропорацию. Методы трансформации растений включают перенос, опосредованный Agrobacterium, например, A. tumefaciens, быстродвижущиеся микрочастицы вольфрама или золота, электропорацию, микроинъекцию и поглощение, опосредованное полиэтиленгликолем.

В виду вышеуказанного, настоящее изобретение, таким образом, далее обеспечивает клетки-хозяева, содержащие по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность и/или вектор, как определено в настоящей заявке.

Для экспрессии связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, можно выбрать клетку-хозяин, которая модулирует экспрессию вставленных полинуклеотидных последовательностей, и/или модифицирует и процессирует генный продукт (т.e. РНК и/или белок), как желательно. Данные модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) генных продуктов могут быть важными для функции связывающей молекулы. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы пост-трансляционного процессинга и модификации белков и продуктов гена. Можно выбрать подходящие клеточные линии или системы хозяев, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг продукта. В этом плане можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмом надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта.

Примерные клетки-хозяева млекопитающих, которые могут применяться для экспрессии связывающих молекул, обеспеченных в настоящей заявке, включают клетки яичников китайского хомячка (CHO клетки), включая CHO клетки DHFR минус, такие как DG44 и DUXBl 1, и как описано в патенте США 4,634,665 (например, применяемые с DHFR селектируемым маркером, например, как описано в патенте США 5,179,017), NSO, COS (производная CVI с SV40 T антигеном), HEK293 (почки человека), и SP2 (мышиная меланома) клетки. Другие примерные линии клеток-хозяев включают, но без ограничения к этому, HELA (человеческая карцинома шейки матки), CVI (линия почки обезьяны), VERY, BHK (почка хомячка), MDCK, 293, WI38, R1610 (фибробласт китайского хомячка) BALBC/3T3 (мышиный фибробласт), НАК (линия почки хомячка), P3x63-Ag3.653 (мышиная миелома), BFA-1c1BPT (коровьи эндотелиальные клетки), и RAJI (человеческий лимфоцит). Линии клеток-хозяев, как правило, доступны из коммерческих источников, Американской коллекции типовых культур или из опубликованной литературы.

Клетки немлекопитающих, такие как клетки бактерий, дрожжей, насекомых или растений, также легко доступны и на самом деле могут использоваться для экспрессии связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Примерные бактериальные клетки-хозяева включают энтеробактерии, такие как Escherichia coli, Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, и Haemophilus influenza.

Другие клетки-хозяева включают дрожжевые клетки, такие как Saccharomyces cerevisiae, и Pichia pastoris. Клетки насекомых включают, без ограничения к этому, Spodoptera frugiperda клетки.

В соответствии с вышеуказанным, возможные экспрессионные системы (т.e. клетки-хозяева, содержащие экспрессионный вектор, как описано выше) включают, но без ограничения перечисленным, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli, В. subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, экспрессирующей векторы, содержащие последовательности, кодирующие антитело; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусными), содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусов табачной мозаики, TMV) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Т1-плазмидой), содержащими последовательности, кодирующие антитело, или системы клеток млекопитающих (например, клеток COS, СНО, BLK, 293, ЗТЗ), несущие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, выделенные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих (например, аденовирусный поздний промотор, промотор на основе вируса осповакцины 7.5К).

Для экспрессии связывающих молекул согласно настоящему изобретению особенно предусмотрены эукариотические клетки. Соответственно, клетки СНО, содержащие эукариотический вектор с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей связывающую молекулу согласно настоящему изобретению (которая, например, может быть функционально связана с основным немедленным ранним промотором (MIEP) цитомегаловируса человека (ЦМВ)), являются полезными системами экспрессии для получения связывающих молекул согласно настоящему изобретению.

Культивация

Клетки-хозяева, несущие экспрессионный вектор, выращивают в условиях, подходящих для продукции связывающих молекул, описанных в настоящей заявке, в частности легких цепей и тяжелых цепей, как описано в другом месте данного документа, и анализируют на синтез белка тяжелой и/или легкой цепи. Таким образом, изобретение включает в себя клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу согласно настоящему изобретению, или ее тяжелую или легкую цепь, функционально связанную с промотором. Для экспрессии антител с двойной цепью векторы, кодирующие как тяжелые, так и легкие цепи, могут совместно экспрессироваться в клетке-хозяине для экспрессии всей молекулы.

Очистка

Как только связывающая молекула согласно настоящему изобретению была экспрессирована рекомбинантно, она может быть очищена любым способом очистки, известным в данной области техники, например, хроматографией (например, ионообменной хроматографией (например, хроматография с гидроксиапатитом), аффинной хроматографией, в частности, аффинная хроматографией на основе белка А, белка G или лектина, калибровочной колоночной хроматографией), центрифугированием, дифференциальной растворимостью, хроматографией гидрофобного взаимодействия или любым другим стандартным метод очистки белков. Специалист легко сможет выбрать подходящий способ очистки на основе индивидуальных характеристик связывающей молекулы, подлежащей извлечению.

Принимая во внимание вышеизложенное, настоящее изобретение, таким образом, также обеспечивает способ получения связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, как определенно в настоящей заявке, в условиях, позволяющих экспрессию связывающей молекулы и необязательно извлечение полученной связывающей молекулы из культуры.

Фармацевтическая композиция

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую связывающую молекулу, нуклеиновую кислоту, вектор и/или клетку-хозяин согласно настоящему изобретению, и необязательно один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Предпочтительная фармацевтическая композиция содержит антитело согласно настоящему изобретению и необязательно один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного агента связывающую молекул, , как определено в настоящей заявке, в частности антитело против FXI или его антиген-связывающий фрагмент. Соответственно, применение указанных связывающих молекул для получения фармацевтической композиции также предусмотрено в настоящей заявке. Термин «фармацевтическая композиция», в частности, относится к композиции, подходящей для введения человеку. Однако композиции, подходящие для введения животным, не являющимся человеком, также охватываются этим термином.

Фармацевтическая композиция и ее компоненты (т.e. активные агенты и необязательно эксципиенты) предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми, т.e. способны вызывать желаемый терапевтический эффект, не вызывая каких-либо нежелательных локальных или системных эффектов у реципиента. Фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению могут быть, в частности, стерильными и/или фармацевтически инертными. В частности, термин «фармацевтически приемлемый» может означать одобрение регулирующего органа или другой общепризнанной фармакопеи для применения на животных и, более конкретно, на людях.

Связывающая молекула, описанная в настоящей заявке, предпочтительно присутствует в фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве. Под «терапевтически эффективным количеством" подразумевается количество связывающей молекулы, которое вызывает желаемый терапевтический эффект. Терапевтическая эффективность и токсичность могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, ED₅₀ (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции) и LD₅₀ (доза, летальная для 50% популяции). Соотношение доз между терапевтическим и токсическим эффектами является терапевтическим показателем, и оно может быть выражено как соотношение ED₅₀/LD₅₀. Фармацевтические композиции, которые проявляют большие терапевтические показатели, являются предпочтительными.

Как изложено ранее, фармацевтическая композиция может необязательно содержать один или более эксципиентов и/или дополнительных активных агентов.

Антитела и их фрагменты обычно вводят парентерально и особенно внутривенно (инъекция или инфузия) или подкожно. Композиции для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Неводные растворители включают, без ограничения к этому, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные растворители могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, спиртовых/водных растворов, эмульсий или суспензий, включая физиологический раствор и буферизованные среды, такие как, без ограничения к этому, зфосфат-буферизованный физиологический раствор. Кроме того, парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или жирные масла. Другие подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или эксципиенты хорошо известны в данной области техники. Связывающая молекула, такая как антитела или ее фрагмент антитела, согласно настоящему изобретению может быть объединена с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентом, такими как обсуждаемые выше, с образованием фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции могут содержать связывающую молекулу согласно настоящему изобретению в водном носителе, который содержит буферный агент, выбранный из группы, состоящей из гистидинового буфера, буфера на основе уксусной кислоты, буфера на основе лимонной кислоты и буфера на основе гистидина/HCl. Дополнительные буферы и информация о препарате доступны специалисту в данной области, например, в Wang W et al., J. Pharmaceutical Sci. 2007 Jan(1):1-26. Могут также присутствовать консерванты, такие как, например, противомикробные препараты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты, инертные газы и т.д.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать белковоподобные носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, особенно человеческого происхождения. В одном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит связывающую молекулу в лиофилизированной форме и предпочтительно восстанавливается в растворе или суспензии перед введением. В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит связывающую молекулу и находится в жидкой форме.

После того как фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению и необязательно приемлемый эксципиент были получены, они могут быть помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения указанного состояния. Такая маркировка будет, например, включать количество, частоту и способ введения.

Дополнительные активные агенты

Другим объектом настоящего изобретения являются лекарственные средства или фармацевтические композиции, содержащие соединение согласно изобретению и один или более других активных ингредиентов, особенно для лечения и/или профилактики ранее названных заболеваний. Предпочтительные примеры активных ингредиентов, подходящих для комбинаций, включают:

• гиполипидемические препараты, в особенности НМО-СоА-(3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А)-редуктаза-ингибиторы, как, например, ловастатин (мевакор), симвастатин (Зокор), правастатин (правахол), флювастатин (лескол) и атровастатин (липитор);

• коронарное лечение/вазодилататоры, в особенности АСЕ-(ангиотензин-конвертинг-энзимы)-ингибиторы, как, например, каптоприл, лизиноприл, эналаприл, рамиприл, килазаприл, беназеприл, фозиноприл, квинаприл и периндоприл, или AII-(ангиотензин II)-рецептор-антагонисты, как, например, эмбузартан, лозартан, валзартан, ирбезартан, кандезартан, эпрозартан и темизартан, или р-адреноцептор-антагонисты, как, например, карведилол, алпенолол, бизопролол, ацебутолол, атенолол, бетаксолол, картеолол, метопролол, надолол, пенбутолол, пиндолол, пропанолол и тимолол, или альфа-1-адренорецептор-антагонисты, как, например, працозин, бунацозин, доксацозин и терацозин, или диуретики, как, например, гидрохлоротиазид, фуросемид, буметанид, пиретанид, торасемид, амилорид и дигидралацин, или блокатор кальциевого канала, как, например, верапамил и дилтиазем, или производные дигидропиридина, как, например, нифедипин (адалат) и нитрендипин (байотензин), или нитропрепараты, как, например, изосорбид-5-мононитрат, изосорбид-динитрат и глицеролтринитрат, или вещества, которые воздействуют на повышение циклического гуанозинмонофосфата (cGMP), как, например, стимуляторы растворимой гуанилатциклазы, как, например, риоцигуат;

• плазминогенные активаторы (тромболитики/фибринолитики) и соединения, повышающие тромболиз/фибринолиз, включая, но без ограничения к этому, ингибиторы плазминогенных активаторов (PAI-ингибиторы) или ингибиторы тромбин-активирующих фибринолиз-ингибиторов (TAFI-ингибиторы), включая, но без ограничения к этому, тканевый плазминоген-активатор (t-PA), стрептокиназа, ретеплаза и урокиназа;

• антикоагуляционно действующие вещества (антикоагулянты), включая, но без ограничения к этому, гепарин (UFH), низкомолекулярный гепарин (NMH), включая, но без ограничения к этому, тинцапарин, цертопарин, парнапарин, надропарин, ардепарин, эноксапарин, ревипарин, далтепарин, данапароид, семулопарин (AVE 5026), адомипарин (M118) и EP-42675/ORG42675;

• прямые тромбин-ингибиторы (DTI), включая, но без ограничения к этому, прадакса (дабигатран), атецегатран (AZD-0837), DP-4088, SSR-182289A, аргатробан, бивалирудин и таногитран (BIBT-986 и пролекарство BIBT-1011), гирудин;

• прямые ингибиторы фактора Ха, как, например, ривароксабан, апиксабан, эдоксабан (DU-176b), бетриксабан (PRT-54021), R-1663, дарексабан (YM-150), отамиксабан (FXV-673/RPR-130673), летаксабан (ТАК-442), разаксабан (DPC-906), DX-9065a, LY-517717, таногитран (BIBT-986, пролекарство: BIBT-1011), идрапаринукс и фондапаринукс;

• вещества, подавляющие агрегацию тромбоцитов (ингибиторы агрегации тромбоцитов, ингибиторы тромбоцитной агрегации), включая, но без ограничения к этому, ацетилсалициловую кислоту (например, аспирин), тиклопидин (тиклид), клопидогрел (плавикс), празугрел, тикагрелор, кангрелор, элиногрел, ворапаксар;

• антагонисты фирбиногенновых рецепторов (гликопротеин-IIb/IIIa-антагонисты), включая, но без ограничения к этому, абциксимаб, эптифибатид, тирофибан, ламифибан, лефрадафибан и фрадафибан;

• антиаритмические препараты;

• различные антибиотики или противогрибковые препараты, либо в качестве расчетной терапии (до наличия микробного диагноза), либо в качестве специфической терапии;

• факторы, повышающие кровяное давление, включая, без ограничения к этому норадреналин, дофамин и вазопрессин;

• инотропную терапию, включая, без ограничения к этому добутамин;

• рекомбинантный человеческий активированный белок С, например Xigris;

• продукты крови, включая, без ограничения к этому концентраты эритроцитов, концентраты тромбоцитов, эритропетин и свежезамороженная плазма;

• вещества, подавляющие адгезию тромбоцитов, как GPVI- и/или GPIb-антагонисты, включая, без ограничения к этому ревацепт или каплацизумаб;

• ингибиторы VEGF и/или PDGF-зависимых путей сигнальной трансдукции, включая, без ограничения к этому афиберцепт, ранибизумаб, бевацизумаб, КН-902, пегаптаниб, рамуцирумаб, скваламин или бевасираниб, апатиниб, акситиниб, брива-ниб, цедираниб, довитиниб, ленватиниб, линифаниб, мотесаниб, пазораниб, регорафениб, сорафениб, сунтиниб, тивозаниб, вандетаниб, ваталаниб, варгатеф и Е-10030;

• ингибиторы ангиопоэтин-Tie путей сигнальной трансдукции, включая, без ограничения к этому AMG386;

• ингибиторы активности Tie2 тирозинкиназного рецептора;

• ингибиторы интегринзависимых путей сигнальной трансдукции, включая, без ограничения к этому, волоциксимаб, циленгитид или ALG1001;

• ингибиторы PI3K-Akt-mTor-зависимых путей сигнальной трансдукции, включая, без ограничения к этому, XL-147, перифозин, МК2206, сиролимус, темсиролимус и эверолимус;

• Кортикостероиды, включая, без ограничения к этому гидрокортизон, флудрокортизон, Анекортав, бетаметазон, дексаметазон, триамцинолон, флуоцинолон или флуоцинолонацетонид;

• ингибиторы ALK1-Smad1/5-зависимого пути сигнальной трансдукции, включая, без ограничения к этому ACE041;

• ингибиторы циклооксигеназы, включая, без ограничения к этому бромфенак и непафенак;

• ингибиторы системы каликреин-кинин, включая, без ограничения к этому сафотибант и экаллантид;

• ингибиторы сфингозин-1-фосфат-зависимых путей сигнальной трансдукции, включая, без ограничения к этому Сонепцизумаб;

• ингибиторы комплемента рецептора C5a, включая, без ограничения к этому Экулизумаб;

• ингибиторы 5HT1a рецептора, включая, без ограничения к этому Тандоспирон;

• ингибиторы Ras-Raf-Mek-Erk зависимых путей сигнальной трансдукции, ингибиторы МАРК путей сигнальной трансдукции; ингибиторы FGF путей сигнальной трансдукции; вещества, подавляющие пролиферацию эндотелиальных клеток; и соединения, которые способны индуцировать апоптоз; или

фотодинамическую терапию, состоящую из воздействия вещества и света, причем веществом является, например вертепорфин.

“Комбинации” в целях настоящего изобретения означают не только лекарственные формы, которые содержат все компоненты (так называемые фиксированные комбинации), и комбинированные упаковки, которые содержат компоненты, отделенные друг от друга, но также компоненты, которые вводят одновременно или последовательно, при условии, что они используются для профилактики и/или лечения одного и того же заболевания. Также возможно комбинировать два или более активных ингредиента друг с другом, что означает, что они, таким образом, находятся в двухкомпонентных или многокомпонентных комбинациях.

Введение

Разнообразные пути применимы для введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Как правило, введение будет осуществляться парентерально. Методы парентеральной доставки включают местное, внутриартериальное, внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутриматочное, интравагинальное, подъязычное или интраназальное введение.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений. Для инъекций фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут быть рецептированы в водных растворах, в предпочтительном варианте - в физиологически совместимых буферах, таких, как раствор Хенка, раствор Рингера или физиологически буферизированный солевой раствор. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть приготовлены как приемлемые масляные суспензии для инъекций. К приемлемым липофильным растворителям или основам относятся жирные масла, такие, как кунжутное масло, или синтетические эстеры жирных масел, такие, как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Необязательно суспензия также может содержать приемлемые стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость соединений, что позволяет получать композицию из высококонцентрированных растворов. Для местного или назального введения в композиции применяют пенетранты, приемлемые для преодоления конкретного барьера. Такие пенетранты, как правило, являются общеизвестными в данной области. Дополнительные детали относительно способов рецептирования и введения содержатся в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

Лечение

Термин «лечение» во всех его грамматических формах включает терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, описанных в настоящей заявке. «Терапевтическое или профилактическое лечение» включает профилактическое лечение, направленное на полное предотвращение клинических и/или патологических проявлений, или терапевтическое лечение, направленное на улучшение или ремиссию клинических и/или патологических проявлений. Термин «лечение», таким образом, также включает улучшение или профилактику описанных заболеваний.

Термины «субъект» или «индивидуум», «животное» или «пациент» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения любого субъекта, в частности субъекта-млекопитающего, для которого требуется терапия. Субъекты млекопитающих включают людей, приматов, не являющихся людьми, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, крупного рогатого скота, коров и т.п.

Дозировка

Точная доза связывающей молекулы, полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина будет установлена специалистом в данной области техники с использованием известных методик. Подходящие дозировки обеспечивают достаточные количества связывающей молекулы и являются предпочтительно терапевтически эффективными, то есть вызывают желаемый терапевтический эффект.

Как известно в данной области, корректировки в зависимости от цели лечения (например, поддержание ремиссии в сравнении с острой вспышкой заболевания), пути, времени и частоты введения, времени и частоты введения препарата, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, тяжесть болезненного состояния, комбинации(й) лекарственных средств, реакции чувствительности и толерантность/реакция на терапию могут быть необходимы. Подходящие диапазоны доз могут быть определены с использованием данных, полученных из анализов клеточных культур и исследований на животных, и предпочтительно включают ED₅₀. Как правило, количества дозы могут варьироваться от 0,1 до 100000 мкг, вплоть до общей дозы около 2 г, в зависимости от пути введения. Примерные дозировки связывающей молекулы находятся в диапазоне от около 0,01 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около от 1 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 1 мг/кг или от около 0,1 мг/кг до около 1 мг/кг. Руководство относительно конкретных дозировок и способов доставки приведено в литературе. Общепризнанно, что для лечения может потребоваться однократное введение терапевтически эффективной дозы или многократное введение терапевтически эффективной дозы связывающей молекулы, полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина согласно настоящему результату. Например, некоторые фармацевтические композиции можно вводить каждые 3-4 дня, каждую неделю или один раз каждые две недели или один раз в течение месяца в зависимости от состава, скорости полувыведения и выведения конкретного препарата.

Набор

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим упаковкам и наборам, содержащим один или более контейнеров или сосудов, заполненных одним или более активными средствами вышеупомянутых фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает набор, содержащий связывающую молекулу, полинуклеотид, вектор, клетку-хозяин и/или фармацевтическую композицию, как определено в настоящей заявке. Вышеупомянутые наборы, описанные в настоящей заявке, могут использоваться для лечения заболеваний, описанных в другом месте здесь, или для других целей.

С вышеупомянутым контейнером (контейнерами) может быть связано уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, отражающее одобрение агентством производства, использования или продажи продукта для введения человеку.

Набор может содержать один или более активных агентов (необязательно составленных в виде фармацевтических композиций с одним или более наполнителями). Подходящие активные агенты ранее были перечислены в контексте фармацевтической композиции, и их также можно рассматривать как части набора согласно настоящему изобретению. Дополнительный активный агент может вводиться пациенту одновременно или последовательно в отношении связывающей молекулы, последовательности нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции. Настоящее изобретение дополнительно охватывает введение активных агентов различными путями, например, перорально и внутривенно.

Кроме того, в настоящей заявке рассматриваются наборы, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие связывающие молекулы согласно настоящему изобретению. Указанные полинуклеотиды обычно содержатся в векторе, таком как плазмида, подходящая для трансфекции в и экспрессии клеткой-хозяином. Такие векторы и клетки-хозяева описаны в другом месте в настоящей заявке.

Терапевтическое применение

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, для применения в качестве лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний у людей и/или животных.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, для применения для лечения и/или профилактики нарушений, в частности сердечнососудистых нарушений, предпочтительно тромботическх или тромбоэмболических нарушений и/или тромботических или тромбоэмболических осложнений.

Фактор XIa (FXIa) является важным ферментом в контексте коагуляции, который может активироваться как тромбином, так и фактором XIIa (FXIIa), и поэтому участвует в двух важных процессах коагуляции: он является центральным компонентом перехода от инициации к амплификации и распространению коагуляции: в циклах позитивной обратной связи тромбин активирует, помимо фактора V и фактора VIII, также фактор XI в фактор XIa, в результате чего фактор IX превращается в фактор IXa и через комплекс фактор IXa/фактор VIIIa, образуемый таким образом, фактор X активируется, и образование тромбина, в свою очередь, поэтому сильно стимулируется, что приводит к сильному росту тромба и стабилизации тромба.

Более того, фактор XIa является важным компонентом для внутренней инициации коагуляции: в дополнение к стимуляции тканевым фактором (TF), система коагуляции также может быть активирована, в частности, на отрицательно заряженных поверхностях, которые включают не только поверхностные структуры чужеродных клеток (например, бактерии), но также искусственные поверхности, такие как сосудистые протезы, стенты и экстракорпоральное кровообращение. На поверхности изначально фактор XII (FXII) активируется в фактор XIIa (FXIIA), который впоследствии активирует FXI, прикрепленный к поверхностям клеток, в FXIa. Это приводит к дальнейшей активации каскада коагуляции, как описано выше.

Напротив, на образование тромбина в фазе инициации не влияет ни TF / фактор VIIa, ни активация фактора X и, наконец, образование тромбина, физиологическая реакция на повреждения сосудов. Это может объяснить, почему у мышей с нокаутом FXIa не было обнаружено увеличения времени кровотечения, как у кроликов и других видов, при введении ингибитора FXIa. Эта низкая склонность к кровотечению, вызванная этим веществом, имеет большое преимущество для применения у людей, особенно у пациентов с повышенным риском кровотечения.

Соответственно, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, предназначены для использования при лечении и/или профилактике нарушений или осложнений, которые могут возникнуть в результате образования сгустка.

В целях настоящего изобретения «тромботические или тромбоэмболические нарушения» включают нарушения, которые возникают как в артериальной, так и в венозной сосудистой системе и которые можно лечить с помощью связывающих молекул согласно настоящему изобретению, предпочтительно антител и их антиген-связывающих фрагментов, в частности нарушения в коронарных артериях сердца, такие как острый коронарный синдром (ACS), инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST (STEMI) и без подъема сегмента ST (не STEMI), стабильная стенокардия, нестабильная стенокардия, реокклюзия и рестеноз после коронарные вмешательства, такого как ангиопластика, имплантация стента или аортокоронарное шунтирование, а также тромботические или тромбоэмболические нарушения в других сосудах, приводящие к окклюзионным нарушениям периферических артерий, тромбоэмболии легочной артерии, тромбоэмболии вен, тромбозу вен, особенно в глубоких венах ног и почках, временные ишемические приступы, а также тромботический инсульт и тромбоэмболический инсульт.

Стимуляция системы свертывания может происходить по разным причинам или связанным нарушениям. В контексте хирургических вмешательств, неподвижности, прикованности к постели, инфекций, воспаления или рака или терапии рака, среди прочего, система коагуляции может быть высоко активирована, и могут быть тромботические осложнения, в частности венозные тромбозы. Поэтому Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела или их антиген-связывающие фрагменты предназначены для использования в профилактике тромбозов в контексте хирургических вмешательств, например, у пациентов, страдающих раком, или пациентов, подлежащих ортопедическим операциям, таким как замена тазобедренного или коленного сустава. Поэтому связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты также используются для профилактики тромбозов у пациентов, имеющих активированную систему свертывания, например, в описанных ситуациях стимуляции.

Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, следовательно, также используются для лечения и/или профилактики кардиогенных тромбоэмболий, например ишемии головного мозга, инсульта и системных тромбоэмболий и ишемий, у пациентов с острыми, прерывистыми или постоянными нарушениями сердечного ритма, например, мерцательной аритмии, и у пациентов, перенесших кардиостимуляцию электрошоком, а также у пациентов с нарушениями клапанов сердца или с искусственными клапанами сердца.

Кроме того, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, предназначены для использования в лечении и/или профилактике генерализованного тромбогеморрагического синдрома (DIC), который может возникнуть, в частности, в связи с сепсисом, а также вследствие хирургических вмешательств, опухолевых расстройств, ожогов или других травм и может привести к серьезным повреждениям органов вследствие микротромбозов.

Кроме того, тромбоэмболические осложнения возникают при микроангиопатических гемолитических анемиях и при контакте крови с инородными поверхностями в контексте экстракорпорального кровообращения, такого как, например, гемодиализ, ECMO («экстракорпоральная мембранная оксигенация»), LVAD («вспомогательное устройство левого желудочка») и аналогичные методы, AV фистулами, протезами сосудов и клапанов сердца.

Более того, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, предназначены для использования в лечении и/или профилактике нарушений, включающих образование микросгустка или отложение фибрина в кровеносных сосудах головного мозга, которые могут привести к расстройствам деменции, таким как сосудистая деменция или болезнь Альцгеймера. Здесь сгусток может способствовать расстройству как через окклюзию, так и путем связывания других факторов, связанных с заболеванием.

Более того, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, могут быть использованы для профилактики и/или лечения тромботических и/или тромбоэмболических осложнений, таких как, например, венозные тромбоэмболии у онкологических больных, в частности тех, которые подвергаются серьезным хирургическим вмешательствам или химио- или лучевой терапии.

В контексте согласно настоящему изобретению термин «легочная гипертензия» включает легочную артериальную гипертензию, легочную гипертензию, связанную с расстройствами левого отдела сердца, легочную гипертензию, связанную с легочными нарушениями и/или гипоксией, и легочную гипертензию, вызванную хроническими тромбоэмболиями (CTEPH).

Кроме того, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, также предназначены для применения для лечения и/или профилактики диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови в контексте инфекционного заболевания и/или системного воспалительного синдрома (SIRS), септической дисфункции органа, недостаточность септического органной недостаточности и полиорганной недостаточности, синдрома острой дыхательной недостаточности (ARDS), острого повреждения легких (ALI), септического шока и/или септической органной недостаточности. В ходе инфекции может происходить общая активация системы коагуляции (диссеминированное внутрисосудистое DIC крови или коагулопатия потребления, в дальнейшем называемая «ДВС») с микротромбозом в различных органах и вторичными геморрагическими осложнениями. Кроме того, может иметь место повреждение эндотелия с повышенной проницаемостью сосудов и диффузией жидкости и белков в экстравазальное пространство. По мере развития инфекции может иметь место нарушение работы органа (например, почечная недостаточность, печеночная недостаточность, дыхательная недостаточность, дефицит центральной нервной системы и сердечно-сосудистая недостаточность) или полиорганная недостаточность. В случае DIC происходит массивная активация системы коагуляции на поверхности поврежденных эндотелиальных клеток, на поверхностях инородных тел или сшитых внесосудистых тканей. Как следствие происходит коагуляция в мелких сосудах различных органов с гипоксией и последующей дисфункцией органов. Вторичным эффектом является расход факторов свертывания (например, фактор X, протромбин и фибриноген) и тромбоцитов, что снижает свертываемость крови и может привести к сильному кровотечению.

Связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, также предназначены для первичной профилактики тромботических или тромбоэмболических нарушений и/или воспалительных нарушений и/или нарушений с повышенной проницаемостью сосудов у пациентов, у которых генные мутации приводят к повышенной активности ферментов или повышенным уровням зимогенов, и они установлены соответствующими тестами/измерениями активности фермента или концентраций зимогена.

Кроме того, связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, также могут применяться для предотвращения коагуляции ex vivo, например, для защиты органов, подлежащих трансплантации, от повреждения органов, вызванного образованием сгустков, и для защиты органа-реципиента от тромбоэмболии из трансплантированного органа, для сохранения продуктов крови и плазмы, для очистки/предварительной обработки катетеров и других медицинских вспомогательных средств и инструментов, для покрытия синтетических поверхностей медицинских вспомогательных средств и инструментов, используемых in vivo или ex vivo, или для биологических образцов, которые могут содержать фактор XIa.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает применение связывающих молекул согласно настоящему изобретению, предпочтительно антител и их антиген-связывающих фрагментов, для лечения и/или профилактики нарушений, особенно упомянутых выше нарушений.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает применение связывающих молекул согласно настоящему изобретению, предпочтительно антител и их антиген-связывающих фрагментов, для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики нарушений, особенно упомянутых выше нарушений, предпочтительно для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики тромботических или тромбоэмболических нарушений.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способ лечения и/или профилактики нарушений, особенно нарушений, упомянутых выше, в котором используется терапевтически эффективное количество связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и его антиген-связывающего фрагмента.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и их антиген-связывающие фрагменты, для применения в способе лечения и/или профилактики нарушений, особенно нарушений, упомянутых выше, в котором используется терапевтически эффективное количество связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и его антиген-связывающего фрагмента.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способы лечения тромботических или тромбоэмболических нарушений у человека и/или животных посредством введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и его антиген-связывающего фрагмента или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также обеспечивает способ ингибирования свертывания крови, агрегации тромбоцитов и/или тромбоза у субъекта путем введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, предпочтительно антитела и его антиген-связывающего фрагмента или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Генная терапия

Кроме того, в настоящем изобретении обеспечивается трансфекционный вектор для использования в генной терапии млекопитающих, которая содержит полинуклеотид, как описано в настоящей заявке, и способы лечения или профилактики заболевания, включающие включение экзогенной нуклеиновой кислоты, как определено в настоящей заявке, в клетку нуждающегося в этом пациента млекопитающего, так что экзогенная нуклеиновая кислота экспрессируется, и заболевание предотвращается или лечится.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие как тяжелую цепь, так и легкую цепь, вводят пациенту. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты вводят так, чтобы они стабильно интегрировались в хромосомы В-клеток, поскольку эти клетки специализируются на продукции антител. В одном варианте выполнения настоящего изобретения клетки-предшественники В клеток трансфицируются или инфицируются ex vivo и повторно трансплантируются пациенту, нуждающемуся в этом. В другом варианте выполнения настоящего изобретения клетки-предшественники B клеток или другие клетки инфицируют in vivo с использованием рекомбинантного вируса, о котором известно, что он заражает интересующий тип клетки.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, способ генной терапии включает введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антиген-связывающую часть анти-FXI антитела, как описано в настоящей заявке, и экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения способ генной терапии включает введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антиген-связывающую часть анти-FXI антитела, как описано в настоящей заявке, и экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты. В другом варианте выполнения настоящего изобретения способ генной терапии включает введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антиген-связывающую часть, и выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антиген-связывающую часть анти-FXI антитела, как описано в настоящей заявке, и экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты.

Конкретные условия поглощения экзогенной нуклеиновой кислоты хорошо известны в данной области техники. Они включают, но не ограничиваются ими, ретровирусную инфекцию, аденовирусную инфекцию, трансформацию плазмидами, трансформацию липосомами, содержащими экзогенную нуклеиновую кислоту, доставку биолистической нуклеиновой кислоты (т.е. загрузку нуклеиновой кислоты на частицы золота или других металлов и запуск или инъекцию в клетки), адено-ассоциированную вирусную инфекцию и вирусную инфекцию Эпштейна-Барр. Все они могут рассматриваться как «экспрессионные векторы» для целей согласно настоящему изобретению.

Экспрессионные векторы могут быть либо внехромосомными векторами, либо векторами, которые интегрируются в геном хозяина. Как правило, эти экспрессионные векторы включают транскрипционную и трансляционную регуляторную нуклеиновую кислоту, функционально связанную с экзогенной нуклеиновой кислотой. В общем, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности могут включать, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности старта и остановки транскрипции, последовательности старта и остановки трансляции и последовательности энхансера или активатора. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения регуляторные последовательности включают промотор и последовательности старта и остановки транскрипции. Кроме того, экспрессионный вектор может содержать дополнительные элементы. Например, для интеграции экспрессионных векторов экспрессионный вектор содержит по меньшей мере одну последовательность, гомологичную геному клетки-хозяина, и две гомологичные последовательности, которые фланкируют конструкцию экспрессии. Интегрирующий вектор может быть направлен на определенный локус в клетке-хозяине путем выбора подходящей гомологичной последовательности для включения в вектор. Конструкции для интеграции векторов хорошо известны в данной области техники.

Эксперименты

Исходя из мышиного 1A6 анти-FXI антитела были получены новые гуманизированные антитела (смотрите эксперимент 1). Чтобы еще больше снизить потенциал собственной иммуногенности, эти антитела подвергали оптимизации последовательности в областях CDR, как описано ниже (эксперимент 2). Кандидатные антитела тестировали на их активность связывания FXI, определенную с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), и на их способность ингибировать превращение FXI в его активную форму, FXIa (эксперименты 4 и 5). Для двух примерных антител, а именно TPP-3290 и TPP-3238, значения EC50 для ELISA и анализов конверсии показаны на Фиг. 9. Очевидно, что значения ЕС50 сопоставимы с 1А6, поэтому эти два антитела, по-видимому, являются ценными кандидатами для дальнейшего изучения. Поэтому, чтобы подтвердить сопоставимость с 1А6, антитела TPP-3290 и TPP-3238 были протестированы на модели тромбоза бабуина in vivo, описанной в эксперименте 7. Удивительно, что при использовании разумных фармакологических режимов дозирования эти два антитела не проявляли какой-либо противотромбозной активности. Для обеих молекул не было обнаружено никакого снижения образования тромба, вызванного коллагеном. В продолжение этого эксперимента in vivo эти антитела анализировали в тест-системе на основе активированного частичного тромбопластинового времени (АПТВ) в плазме. Этот тип анализа подтверждает данные in vivo таким образом, что для обоих антител наблюдается только очень низкий или даже не наблюдается блокирующий эффект (эксперимент 6 и Фиг. 8). Таким образом, несмотря на то, что антитела TPP-3290 и TPP-3238 имеют почти идентичные значения EC50 в анализе ELISA и анализе конверсии по сравнению с антителом 1A6 (смотрите Фиг. 9), они не проявляют противотромбозный эффект in vivo. Нет доступного объяснения, почему сопоставимые значения для 1A6 в ELISA и анализе конверсии не переходят в противотромбозную активность in vivo или пролонгацию aPTT.

Однако дальнейшие изменения последовательности приводят к антителам TTP-3583 и TTP-3577. Эти два антитела проявляли отличные аффинности связывания с целевым FXI (эксперимент 3, фиг. 3 и 4, фиг. 9). Кроме того, антитела TTP-3583 и TTP-3577 эффективно блокируют превращение FXI в его активную форму FXIa (эксперимент 5 и фиг. 7 и 8). Удивительно, что антитела TTP-3583 и TTP-3577 пролонгируют активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT) при концентрациях, сравнимых с 1A6, или, в случае TPP-3583, при еще более низких концентрациях (эксперимент 6 и фиг. 9). Таким образом, были получены два антитела, которые в биохимических анализах в отношении их связывающей активности сопоставимы с исходным мышиным вариантом 1А6. TPP-3583 продемонстрировал даже немного более высокую активность в анализе на основе aPTT в плазме.

Это также было подтверждено антитромботической активностью TPP-3583 на модели in vivo (смотрите эксперимент 7). Таким образом, с предоставлением антител TPP-3583 и TPP-3577 настоящее изобретение обеспечивает гуманизированные антитела и антитела, подвергавшиеся модификации на уровне генов зародышевой линии, которые оба являются эффективными и, как ожидается, будут безопасными для лечения, как с точки зрения сниженной иммуногенности, так и минимизации риска кровотечения. Таким образом, антитела, оцениваемые в настоящей заявке, являются перспективными новыми средствами для эффективного лечения и/или профилактики тромботических или тромбоэмболических нарушений и/или тромботических или тромбоэмболических осложнений.

Эксперимент 1: Гуманизация мышиных антител

Гуманизацию мышиного антитела 1А6 проводили с использованием стандартных методик.

Подробно, для отбора подмножеств семейства акцепторных зародышевых линий были определены и аннотированы остатки CDR мышиного антитела в соответствии с системой нумерации Kabat (подробности смотрите http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum). Канонические структуры CDR тяжелой и легкой цепи были определены на основании следующих публикаций:

O’Brien and Jones, Humanising Antibodies by CDR Grafting, Chapter 40; Antibody Engineering, Part of the series Springer Lab Manuals pp 567-590; R. Kontermann et al. (eds.), Antibody Engineering; Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001.

Hwang, Almagro, Buss, Tan, and Foote (2005) Use of human germline genes in CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods, May; 36(1):35-42.

На основании этих публикаций были выбраны каркасные акцепторы зародышевой линии человека с одинаковыми каноническими структурами.

На следующей стадии были идентифицированы остатки, поддерживающие петлевые структуры и VH, а также VL интерфейсы на основе системы нумерации Kabat (подробности смотрите http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum). Когда это необходимо, аминокислоты, которые важны для конформации петли и для V_H и V_Lинтерфейсов, подвергались обратной мутации.

Идентичность и сходство с каждой отдельной каркасной последовательностью зародышевой линии человека в одних и тех же канонических подмножествах были проанализированы, и последовательность зародышевой линии с наилучшей общей гомологией с мышиными последовательностями V_H и V_L была идентифицирована с использованием программы Align X набора Vector NTI. Эти последовательности были выбраны в качестве акцепторного каркаса зародышевой линии человека для трансплантации CDR V_H и V_L, соответственно.

Область присоединения тяжелой цепи человека (область J_H), а также область V_L человека была выбрана на основе наилучшей гомологии последовательности.

Чтобы проанализировать эти разработанные гуманизированные варианты in silico для активности связывания FXI, соответствующие кДНК были синтезированы и использованы для экспрессии гуманизированных антител. Для этого клетки HEK293 трансфицировали кДНК, и через 5 дней культивирования антитела очищали от супернатанта этих клеток. Каждое очищенное гуманизированное антитело характеризовали по активности связывания с использованием стандартного протокола ELISA и по физико-химическим свойствам путем анализа молекул с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру.

Эксперимент 2: Модифицирование на уровне генов зародышевой линии и оптимизация последовательностей CDR

Для дальнейшего снижения риска внутренней иммуногенности на следующей стадии проводили модифицирование на уровне генов зародышевой линии и оптимизацию последовательности CDR гуманизированного антитела.

Поэтому, аминокислоты, которые отличаются от ближайшей последовательности зародышевой линии, были заменены, соответствующие кДНК были синтезированы, клетки HEK293 временно трансфицированы, экспрессированные антитела согласно настоящему изобретению были количественно определены и протестированы на их способность связывать человеческий FXI (Haematologic Technologies Inc.; human FXI; Cat. No. HCXI-0150).

Эксперимент 3: Экспрессия и количественная оценка вариантов антител.

Вышеупомянутые IgG были транзиентно экспрессированы в клетках млекопитающих, как описано в Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems edited by Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007. Кратко, экспрессионная плазмида на основе CMV-промотора была трансфицирована в клетки HEK293-6E и инкубирована в Fernbach-Flaks или Wave-Bags. Трансфицированные клетки культивировали при 37°С в течение 5-6 дней в среде F17 (Invitrogen). Через 24 часа после трансфекции добавляли 1% ультранизкого IgG FCS (Invitrogen) и 0,5 мМ вальпроевой кислоты (Sigma). Антитела очищали с помощью хроматографии на белке А и дополнительно характеризовали по их аффинности связывания с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Смотрите таблицы 1 и 2 ниже для последовательностей антител согласно настоящему изобретению. В таблице 3 ниже перечислены последовательности других антител.

Эксперимент 4: твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA):

ELISA

Стандартный формат ELISA использовали для анализа аффинности связывания антител данного изобретения с FXI. Человеческий FXI был получен от Haematologic Technologies Inc. (человеческий FXI; Cat. № HCXI-0150), FXI бабуина был получен, как описано ниже. Эти антигены наносили на черные 384-луночные планшеты для микротитрования Maxisorp (Nunc; Кат. №: 460518), разбавляли до концентрации 1 мкг/мл в 1X покрывающем буфере (Candor Bioscience; Кат. № 121125). Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубации в течение ночи планшеты промывали 2 раза с 50 мкл/лунку, используя буферизованный фосфатом физиологический раствор (PBS, SigmaAldrich, номер по каталогу D8662) + 0,05% Tween 20 (SigmaAldrich, номер по каталогу P9416). После этого добавляли 50 мкл/лунка блокирующего буфера (Smart Block; Candor Bioscience; Кат. № 113500) и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого планшеты промывали 3 раз, используя 50 мкл/лунка буфера PBS + 0.05% Tween 20. Антитела согласно настоящему изобретению добавляли при различных концентрациях в конечном объеме 30 мкл/лунка. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этой стадии инкубации планшеты промывали 3 раза, используя 50 мкл/лунка буфера PBS + 0,05% Tween 20. Для обнаружения связанных кандидантных антител анти-h-Fc-POD антитело (Sigma; кат. № A0170) разводили при 1: 10000 в 10% блокирующем буфере. 30 мкл/лунка этого разбавленного детектирующего антитела добавляли, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этой стадии инкубации планшеты промывали 3 раза, используя 50 мкл/лунка буфера PBS + 0,05% Tween 20. В качестве субстрата добавили смесь 30 мкл/лунка разбавленного при 1: 1000 Amplex red (Invitrogen; номер по каталогу 12222; сток-раствор 10 мМ в ДМСО) и 1: 10000 перекиси водорода (Merck; номер по каталогу 107209; 30% сток-раствор), и планшеты инкубировали в течение 20 минут в темноте.

Для измерения применяли ридер Infinite f500 (Tecan).

Способ измерения:

• флуоресценция

• Top reading

• Ex 535 нм

• Em 590 нм

Данные проанализировали с использованием программного обеспечения GraphPadPrism, активность связывания согласно настоящему изобретению вычисляли как значения EC50. Все эксперименты были выполнены в четырех экземплярах, данные приведены как среднее ± SEM. Данные ELISA для FXI человека для антител 1A6, TPP-3583, TPP-3577, TPP-3290 и TPP-3238 показаны на Фиг. 2-6, а числовые данные на Фиг. 9. Форма кривых, а также значения EC50 сопоставимы с 1A6 и поэтому классифицированы для дальнейшего анализа.

Анализ домена связывания посредством конкурентного анализа ELISA

Чтобы показать, что гуманизированные и оптимизированные варианты все еще связывают тот же домен, что и исходный вариант 1A6, использовали конкурентный анализ ELISA. Для этого 1А6 биотинилировали с использованием набора для биотинилирования EZ-Link™ NHS-PEG4 (ThermoFischer Scientific, номер по каталогу 21455) в соответствии с инструкциями производителя. Как описано выше, FXI наносили в виде покрытия и добавляли фиксированную концентрацию биотиинлированного 1A6 в смеси с различными концентрациями антител согласно настоящему изобретению. Связывание биотинилированного 1А6 определяли с использованием HRP-конъюгированного стрептавидина (SigmaAldrich, Cat.No. S5512). В качестве субстрата добавляли смесь 30 мкл/лунка разбавленного 1: 1000 Amplex red (Invitrogen; номер по каталогу 12222; сток-раствор 10 мМ в ДМСО) и 1: 10000 перекиси водорода (Meck; номер по каталогу 107209; 30% сток-раствора), и планшеты инкубировали в течение 20 минут в темноте. Связывание антител согласно настоящему изобретению с тем же доменом, что и 1А6, приводит к замещению последнего за счет увеличения концентрации гуманизированных и оптимизированных вариантов. Этот эффект был показан для всех антител, описанных в настоящем изобретении. Например, данные конкурентного анализа связывания TPP-3583 и 1A6 показаны на Фиг. 7, показывая, что эти два антитела связываются с одним и тем же доменом в молекуле FXI.

Образование FXI бабуина

кДНК для Papio anubis FXI (Номер доступа Uniprot A0A096NC95) была синтезирована и клонирована в экспрессионный вектор млекопитающих pcDNA3.1 (+) (ThermoFisher Scientific, Cat.No. V790-20). Для экспрессии и очистки клетки HEK293 транзиентно трансфицировали с использованием реагента Lipofectamine LTX с реагентом PLUS (Invitrogen, CatNo. A12621) в соответствии с инструкциями изготовителя. Рекомбинантную экспрессию FXI бабуина анализировали с помощью SDS-PAGE. Активности связывания антител, описанных в настоящем изобретении, в отношении связывания FXI бабуина показаны на Фиг. 9.

Эксперимент 5: Функциональная нейтрализация превращения FXI в его активную форму, FXIa, антителами согласно настоящему изобретению.

Для тестирования ингибирования превращения FXI (Haematologic Technologies, Inc., номер по каталогу HCXIA-0150) в его активную форму FXIa с помощью FXIIa, 10 нМ человеческого FXI инкубировали в 50 мМ Трис/HCl, 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2 и 0,1 % БСА с различными концентрациями антител в течение 1 часа при 37°С. На следующей стадии добавляли человеческий FXIIa (Enzyme Research, каталожный номер HFXIIa 1212a) при конечной концентрации 1 единица/мг и инкубировали в течение 24 часов при 37°C. Затем добавляли кукурузный ингибитор трипсина (Enzyme Research, CTI) при конечной концентрации 200 нМ и меченный флуорогеном субстрат (I-1575, Bachem, конечная концентрация 25 мкМ). Флуоресценцию непрерывно контролировали при 360/465 нм с использованием SpectraFluorplus Reader (Tecan). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPadPrism. Данные приведены как среднее ± SEM, n = 4 (смотрите график для TPP-3583 на Фиг. 8, числовые значения для других антител приведены на Фиг. 9).

Эксперимент 6: активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT):

Аликвоты человеческой плазмы инкубировали с увеличивающимися концентрациями антител согласно настоящему изобретению в течение 3 мин при 37°С. Чтобы инициировать собственный путь коагуляции, 0,05 мл плазмы инкубировали с 0,05 мл реагента aPTT (Diagnostica Stago, K.C Perst 5) ровно в течение 3 минут. Коагуляцию начинали повторным кальцинированием образцов 0,05 мл 0,025 М предварительно нагретого раствора хлорида кальция. Автоматический коагулометр (AMAX 200, Trinity Biotech, Lemgo, Германия) смешивал плазму при 37°C и механически регистрировал время до свертывания. Концентрация тестируемого лекарственного средства, продлевающая aPTT в 1,5 раза, была рассчитана и представлена (Фиг. 9).

Эксперимент 7: In vivo модель тромбоза бабуина.

На модели AV-шунта бабуина образование тромба было инициировано временным применением тромбогенного устройства в гипотромбогенном хроническом AV-шунте. Тромбогенное устройство, которое использовалось для оценки влияния антител на инициацию и распространение тромба, состояло из трансплантата из ePTFE с внутренним диаметром 4 мм (id), покрытого коллагеном, длиной 20 мм, за которым следовала расширительная камера силиконового каучуку с внутренним диаметром 9 мм и длиной 20 мм. Скорость сдвига в трансплантате должна была имитировать свертывание крови артериального типа, а скорость сдвига в расширительной камере должна была имитировать свертывание крови венозного типа. Образование тромба оценивали в реальном времени во время экспериментов с помощью количественной гамма-визуализации накопления радиоактивно меченного тромбоцита в сегменте трансплантата и определения конечной точки радиоактивно меченного отложения фибриногена/фибрина (более подробно смотрите в Tucker et al. Blood. 2009 Jan 22;113(4):936-944, page 937, left column, chapter headed by “Thrombosis model”). Как показано на Фиг. 10, внутривенное введение 1 мг/кг физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) TPP-3583 привело к снижению отложения тромбоцитов на около 80%. Эти данные сопоставимы с противотромбозной активностью мышиного антитела 1А6, опубликованной Tucker et al. (Blood. 2009 Jan 22;113(4):936-944).

Помимо ингибирования отложения тромбоцитов введение TPP-3583 также приводило к значительному снижению накопления фибрина в трансплантате, покрытом коллагеном, на около 80% (Фиг. 11).

Таблица 1: полипептидные последовательности антител TPP-3583 и TPP-3577

антитело	SEQ ID NO:
	CDRL1	CDRL2	CDRL3	CDRH1	CDRH2	CDRH3	VL	VH	Лег-кая цепь	Тяже-лая цепь
TPP-3583	8	9	10	11	12	13	17	18	27	28
TPP-3577	14	9	10	11	15	16	19	20	29	30

Таблица 2: полинуклеотидные последовательности антител TPP-3583 и TPP-3577

антител	SEQ ID NO:
	CDRL1	CDRL2	CDRL3	CDRH1	CDRH2	CDRH3	VL	VH	Лег-кая цепь	Тяже-лая цепь
TPP-3583	-	-	-	-	-	-	31	32	-	-
TPP-3577	-	-	-	-	-	-	33	34	-	-

Таблица 3: полипептидные последовательности других антител

антитело	SEQ ID NO:
	CDRL1	CDRL2	CDRL3	CDRH1	CDRH2	CDRH3	VL	VH	Лег-кая цепь	Тяже-лая цепь
1A6	1	2	3	4	5	6	25	26	-	-
TPP-3290	-	-	-	-	-	-	21	22	35	36
TPP-3238	-	-	-	-	-	-	23	24	37	38

Другими предпочтительными вариантами выполнения настоящего изобретения являются

1. Связывающая молекула, содержащая

CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13)

Предпочтительно, связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащий

сайт связывания антигена легкой цепи, который содержит

(a) CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 8;

(b) CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 9; и

(c) CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 10;

и сайт связывания антигена тяжелой цепи, который содержит

(a) CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 11;

(b) CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 12; и

(c) CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, как показано в SEQ ID NO: 13.

2. Связывающая молекула согласно варианту выполнения настоящего изобретения 1, которая способна связывать Фактор XI и/или Фактор XIa. Предпочтительно, связывающая молекула согласно варианту выполнения настоящего изобретения 1 специфически связывается с Фактором XI и/или Фактором XIa.

3. Связывающая молекула согласно варианту выполнения настоящего изобретения 1 или 2, где указанный Фактор XI или Фактор XIa представляет собой Фактор XI примата или Фактор XIa примата.

4. Связывающая молекула согласно варианту выполнения настоящего изобретения 3, где указанным приматом является человек или нечеловеческий примат.

5. Связывающая молекула согласно варианту выполнения настоящего изобретения 4, где указанным нечеловеческим приматом является бабуин, шимпанзе, горилла, орангутанг, макака циномолгус или макака-резус.

6. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, где указанная связывающая молекула связывается внутри аминокислотной последовательности, соответствующей A3 домену Фактора XI, содержащему аминокислоты 200 - 283 последовательности SEQ ID NO: 7.

7. Связывающая молекула по любому из предшествующих пунктов, где указанная связывающая молекула связывается с эпитопом внутри аминокислотной последовательности, соответствующим a) аминокислотам 201 - 215 последовательности SEQ ID NO:7; b) аминокислотам 221 - 222 последовательности SEQ ID NO:7; c) аминокислотам 252 - 254 последовательности SEQ ID NO:7; d) аминокислотам 259 - 261 последовательности SEQ ID NO:7; e) аминокислотам 270 - 272 последовательности SEQ ID NO:7; и/или f) аминокислотам 276 - 278 последовательности SEQ ID NO:7.

8. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, содержащая область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17.

9. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, где связывающая молекула содержит область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18.

10. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, содержащая область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17, и V_H область, как показано в SEQ ID NO: 18.

11. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, где связывающая молекула содержит легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 27.

12. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, где указанная связывающая молекула содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 28.

13. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, где связывающая молекула содержит легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO:28.

14. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, где указанная связывающая молекула представляет собой.

15. Связывающая молекула согласно любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент.

16. Связывающая молекула согласно варианту выполнения настоящего изобретения 15, где указанное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или химерное моноклональное антитело. Предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело представляет собой антитело с каркасными областями всего вариабельного домена и всего констнатного домена человеческого происхождения.

17. Связывающая молекула согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 14 - 16, где указанное антитело представляет собой IgG, предпочтительно IgG1 или IgG4.

18. Полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу, как определено в любом из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17.

19. Вектор, который содержит полинуклеотид, как определено в варианте выполнения настоящего изобретения 18.

20. Вектор согласно варианту выполнения настоящего изобретения 19, где указанный вектор дополнительно содержит по меньшей мере одну регуляторную последовательность, которая функционально связана с указанным полинуклеотидом, как определено в варианте выполнения настоящего изобретения 18.

21. Вектор согласно варианту выполнения настоящего изобретения 19 или 20, где указанный вектор представляет собой экспрессионный вектор.

22. Клетка-хозяин, содержащая вектор согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 19 - 21 и/или нуклеиновую кислоту согласно варианту выполнения настоящего изобретения 18.

23. Способ получения связывающей молекулы согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, определенной в варианте выполнения настоящего изобретения 22, в условиях, позволяющих экспрессию связывающей молекулы, как определено в любом из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17, и необязательно извлечение полученной связывающей молекулы из культуры.

24. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17 или полученную способом согласно варианту выполнения настоящего изобретения 23, полинуклеотид по п. 18, вектор согласно варианту выполнения настоящего изобретения 19 - 21, и/или клетку-хозяин согласно варианту выполнения настоящего изобретения 22, и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент.

25. Фармацевтическая композиция согласно варианту выполнения настоящего изобретения 24, дополнительно содержащая один или более дополнительных активных агентов.

26. Фармацевтическая композиция согласно варианту выполнения настоящего изобретения 25, где другой дополнительный активный агент выбран из активаторов плазминогена (тромболитики/фибринолитики); ингибиторы активаторов плазминогена; ингибиторы активированных тромбином ингибиторов фибринолиза (TAFI), включая тканевый активатор плазминогена (t-PA), стрептокиназу, ретеплазу и урокиназу; нефракционированные гепарины; низкомолекулярные гепарины; гепариноид; гирудин; Бивалирудин и/или Аргатробан.

27. Связывающая молекула согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17 или полученная способом согласно варианту выполнения настоящего изобретения 23, полинуклеотид согласно варианту выполнения настоящего изобретения 18, вектор согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 19 - 21, клетка-хозяин согласно варианту выполнения настоящего изобретения 22 или фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 24 - 26 для применения в качестве лекарственного средства.

28. Связывающая молекула согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17 или полученная способом согласно варианту выполнения настоящего изобретения 23, полинуклеотид согласно варианту выполнения настоящего изобретения 18, вектор согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 19 - 21, клетка-хозяин согласно варианту выполнения настоящего изобретения 22 или фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 24 - 26 для применения для лечения и/или профилактики тромботических или тромбоэмболических нарушений и/или тромботических или тромбоэмболических осложнений.

29. Связывающая молекула согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17 или полученная способом согласно варианту выполнения настоящего изобретения 23, полинуклеотид согласно варианту выполнения настоящего изобретения 18, вектор согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 19 - 21, клетка-хозяин согласно варианту выполнения настоящего изобретения 22 или фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 24 - 26 для применения в способе ингибирования коагуляции крови, агрегации тромбоцитов и/или тромбоза у субъекта.

30. Применение связывающей молекулы согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17 или полученной согласно варианту выполнения настоящего изобретения 23 в качестве антикоагулянта в образцах крови, консервациях крови, продуктах плазмы, биологических образцах или лекарственных добавках или устройствах.

31. Набор, содержащий связывающую молекулу согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 1 - 17, или полученный способом согласно варианту выполнения настоящего изобретения 23, полинуклеотид согласно варианту выполнения настоящего изобретения 18, вектор согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 19 - 21, клетку-хозяин согласно варианту выполнения настоящего изобретения 22 или фармацевтическую композицию согласно любому из вариантов выполнения настоящего изобретения 24 - 26.

--->

Перечень последовательностей

<110> Bayer Pharma AG

<120> НОВЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ФАКТОРА XI И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> BHC14 1 061

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> мышь

<400> 1

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> мышь

<400> 2

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> мышь

<400> 3

Gln Gln Ser Asn Gly Asp Pro

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> мышь

<400> 4

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> мышь

<400> 5

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> мышь

<400> 6

Lys Arg Ser Ser Val Val Ala His Tyr Tyr Ala Met Asp

1 5 10

<210> 7

<211> 625

<212> PRT

<213> человек

<400> 7

Met Ile Phe Leu Tyr Gln Val Val His Phe Ile Leu Phe Thr Ser Val

1 5 10 15

Ser Gly Glu Cys Val Thr Gln Leu Leu Lys Asp Thr Cys Phe Glu Gly

20 25 30

Gly Asp Ile Thr Thr Val Phe Thr Pro Ser Ala Lys Tyr Cys Gln Val

35 40 45

Val Cys Thr Tyr His Pro Arg Cys Leu Leu Phe Thr Phe Thr Ala Glu

50 55 60

Ser Pro Ser Glu Asp Pro Thr Arg Trp Phe Thr Cys Val Leu Lys Asp

65 70 75 80

Ser Val Thr Glu Thr Leu Pro Arg Val Asn Arg Thr Ala Ala Ile Ser

85 90 95

Gly Tyr Ser Phe Lys Gln Cys Ser His Gln Ile Ser Ala Cys Asn Lys

100 105 110

Asp Ile Tyr Val Asp Leu Asp Met Lys Gly Ile Asn Tyr Asn Ser Ser

115 120 125

Val Ala Lys Ser Ala Gln Glu Cys Gln Glu Arg Cys Thr Asp Asp Val

130 135 140

His Cys His Phe Phe Thr Tyr Ala Thr Arg Gln Phe Pro Ser Leu Glu

145 150 155 160

His Arg Asn Ile Cys Leu Leu Lys His Thr Gln Thr Gly Thr Pro Thr

165 170 175

Arg Ile Thr Lys Leu Asp Lys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Lys Ser

180 185 190

Cys Ala Leu Ser Asn Leu Ala Cys Ile Arg Asp Ile Phe Pro Asn Thr

195 200 205

Val Phe Ala Asp Ser Asn Ile Asp Ser Val Met Ala Pro Asp Ala Phe

210 215 220

Val Cys Gly Arg Ile Cys Thr His His Pro Gly Cys Leu Phe Phe Thr

225 230 235 240

Phe Phe Ser Gln Glu Trp Pro Lys Glu Ser Gln Arg Asn Leu Cys Leu

245 250 255

Leu Lys Thr Ser Glu Ser Gly Leu Pro Ser Thr Arg Ile Lys Lys Ser

260 265 270

Lys Ala Leu Ser Gly Phe Ser Leu Gln Ser Cys Arg His Ser Ile Pro

275 280 285

Val Phe Cys His Ser Ser Phe Tyr His Asp Thr Asp Phe Leu Gly Glu

290 295 300

Glu Leu Asp Ile Val Ala Ala Lys Ser His Glu Ala Cys Gln Lys Leu

305 310 315 320

Cys Thr Asn Ala Val Arg Cys Gln Phe Phe Thr Tyr Thr Pro Ala Gln

325 330 335

Ala Ser Cys Asn Glu Gly Lys Gly Lys Cys Tyr Leu Lys Leu Ser Ser

340 345 350

Asn Gly Ser Pro Thr Lys Ile Leu His Gly Arg Gly Gly Ile Ser Gly

355 360 365

Tyr Thr Leu Arg Leu Cys Lys Met Asp Asn Glu Cys Thr Thr Lys Ile

370 375 380

Lys Pro Arg Ile Val Gly Gly Thr Ala Ser Val Arg Gly Glu Trp Pro

385 390 395 400

Trp Gln Val Thr Leu His Thr Thr Ser Pro Thr Gln Arg His Leu Cys

405 410 415

Gly Gly Ser Ile Ile Gly Asn Gln Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys

420 425 430

Phe Tyr Gly Val Glu Ser Pro Lys Ile Leu Arg Val Tyr Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Asn Gln Ser Glu Ile Lys Glu Asp Thr Ser Phe Phe Gly Val Gln

450 455 460

Glu Ile Ile Ile His Asp Gln Tyr Lys Met Ala Glu Ser Gly Tyr Asp

465 470 475 480

Ile Ala Leu Leu Lys Leu Glu Thr Thr Val Asn Tyr Thr Asp Ser Gln

485 490 495

Arg Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Gly Asp Arg Asn Val Ile Tyr Thr

500 505 510

Asp Cys Trp Val Thr Gly Trp Gly Tyr Arg Lys Leu Arg Asp Lys Ile

515 520 525

Gln Asn Thr Leu Gln Lys Ala Lys Ile Pro Leu Val Thr Asn Glu Glu

530 535 540

Cys Gln Lys Arg Tyr Arg Gly His Lys Ile Thr His Lys Met Ile Cys

545 550 555 560

Ala Gly Tyr Arg Glu Gly Gly Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly

565 570 575

Gly Pro Leu Ser Cys Lys His Asn Glu Val Trp His Leu Val Gly Ile

580 585 590

Thr Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Arg Glu Arg Pro Gly Val Tyr

595 600 605

Thr Asn Val Val Glu Tyr Val Asp Trp Ile Leu Glu Lys Thr Gln Ala

610 615 620

Val

625

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 8

Lys Ala Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 9

Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 10

Gln Gln Tyr Asn Gly Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 11

Thr Ser Gly Met Gly Val Gly

1 5

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 12

His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 13

Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 14

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 15

His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 16

Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 17

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

85 90 95

Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 124

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 18

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 111

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

85 90 95

Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 124

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 20

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Cys Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 111

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

85 90 95

Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 124

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 22

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 111

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

85 90 95

Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 24

<211> 124

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 24

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> мышь

<400> 25

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 26

<211> 124

<212> PRT

<213> мышь

<400> 26

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Lys Arg Ser Ser Val Val Ala His Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 218

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 27

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

85 90 95

Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 28

<211> 453

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 28

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 29

<211> 218

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

85 90 95

Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 30

<211> 453

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 30

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Cys Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 31

<211> 333

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 31

gatattgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgcgcgacc 60

attagctgca aagcgagcca gagcgtgctg tatagcggcg ataactatct gaactggtat 120

cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg cggcgagcac cctggaaagc 180

ggcattccgg atcgctttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaccattagc 240

agcctgcagg cggaagatgt ggcggtgtat tattgccagc agtataacgg cgatccgtgg 300

acctttggcg gcggcaccaa agtggaaatt aaa 333

<210> 32

<211> 372

Страница 17

Перечень последовательностей

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 32

gaagtgaccc tgcgcgaaag cggcccggcg ctggtgaaac cgacccagac cctgaccctg 60

acctgcacct ttagcggctt tagcctgagc accagcggca tgggcgtggg ctggattcgc 120

cagccgccgg gcaaagcgct ggaatggctg gcgcatattg attgggatga tgataaatat 180

tatagcccga gcctgaaaag ccgcctgacc attagcaaag ataccagcaa aaaccaggtg 240

gtgctgacca tgaccaacat ggatccggtg gataccgcga cctattattg cgcgcgcatt 300

cgcagcagcg tgtatgcgca ttattatggc atggattatt ggggccaggg caccaccgtg 360

accgtgagca gc 372

<210> 33

<211> 333

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 33

gatattgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgcgcgacc 60

attagctgca aaagcagcca gagcgtgctg tatagcggcg ataactatct gaactggtat 120

cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg cggcgagcac cctggaaagc 180

ggcattccgg atcgctttag cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaccattagc 240

agcctgcagg cggaagatgt ggcggtgtat tattgccagc agtataacgg cgatccgtgg 300

acctttggcg gcggcaccaa agtggaaatt aaa 333

<210> 34

<211> 372

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 34

gaagtgaccc tgcgcgaaag cggcccggcg ctggtgaaac cgacccagac cctgaccctg 60

acctgcacct ttagcggctt tagcctgagc accagcggca tgtgcgtggg ctggattcgc 120

cagccgccgg gcaaagcgct ggaatggctg gcgcatattg attgggatga tgataaatat 180

tatagcacca gcctgaaaag ccgcctgacc attagcaaag ataccagcaa aaaccaggtg 240

gtgctgacca tgaccaacat ggatccggtg gataccgcga cctattattg cgcgcgcatt 300

cgcagcagcg tgtatgcgca ttattatggc atggatgtgt ggggccaggg caccaccgtg 360

accgtgagca gc 372

<210> 35

<211> 218

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 35

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

85 90 95

Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 36

<211> 453

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 36

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 37

<211> 218

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 37

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

85 90 95

Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 38

<211> 453

<212> PRT

<213> искусственная

<220>

<223> гуманизированная

<400> 38

Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Arg Ser Ser Val Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly

450

<---

Claims

1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает человеческий Фактор XI и человеческий Фактор XIa, содержащее

(a) CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVLYSGDNYLN (SEQ ID NO: 8);

(b) CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность AASTLES (SEQ ID NO: 9); и

(c) CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYNGDPWT (SEQ ID NO: 10);

(d) CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность TSGMGVG (SEQ ID NO: 11);

(e) CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность HIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 12); и

(f) CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность IRSSVYAHYYGMDY (SEQ ID NO: 13).

2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащее область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17.

3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где моноклональное антитело содержит область V_H, как показано в SEQ ID NO: 18.

4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где моноклональное антитело содержит область V_L, как показано в SEQ ID NO: 17, и область VH, как показано в SEQ ID NO: 18.

5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где моноклональное антитело содержит легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 27.

6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 28.

7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где моноклональное антитело содержит легкую цепь, как показано в SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, как показано в SEQ ID NO: 28.

8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или химерное моноклональное антитело.

9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, где моноклональное антитело представляет собой IgG, предпочтительно IgG1 или IgG4.

10. Полинуклеотид, кодирующий моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено в любом из пп. 1-9.

11. Экспрессионный вектор, который содержит полинуклеотид, как определено в п. 10.

12. Клетка-хозяин для экспрессии моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как определено в любом из пп. 1-9, содержащая экспрессионный вектор по п. 11 и/или полинуклеотид по п. 10.

13. Способ получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, как определено в п. 12, в условиях, позволяющих экспрессию моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как определено в любом из пп. 1-9, и необязательно извлечение полученного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

14. Фармацевтическая композиция, обладающая антитромботической активностью, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, полинуклеотид по п. 10, экспрессионный вектор по п. 11, и/или клетку-хозяин по п. 12 в эффективном количестве, и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент.

15. Фармацевтическая композиция, обладающая антитромботической активностью, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9 в эффективном количестве и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент.

16. Антитромботический агент, представляющий собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, полинуклеотид по п. 10, экспрессионный вектор по п. 11, клетка-хозяин по п. 12 или фармацевтическую композицию по любому из пп. 14, 15.

17. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, полинуклеотида по п. 10, экспрессионного вектора по п. 11, клетки-хозяина по п. 12 или фармацевтической композиции по любому из пп. 14, 15 для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики тромботических нарушений или тромботических осложнений.

18. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, полинуклеотида по п. 10, экспрессионного вектора по п. 11, клетки-хозяина по п. 12 или фармацевтической композиции по любому из пп. 14, 15 для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики тромбоэмболических нарушений или тромбоэмболических осложнений.

19. Набор для лечения или профилактики тромботических нарушений или тромботических осложнений, содержащий по меньшей мере один контейнер или сосуд, заполненный моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-9, полинуклеотидом по п. 10, экспрессионным вектором по п. 11, клеткой-хозяином по п. 12 или фармацевтической композицией по любому из пп. 14, 15.

20. Набор для лечения или профилактики тромбоэмболических нарушений или тромбоэмболических осложнений, содержащий по меньшей мере один контейнер или сосуд, заполненный моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-9, полинуклеотидом по п. 10, экспрессионным вектором по п. 11, клеткой-хозяином по п. 12 или фармацевтической композицией по любому из пп. 14, 15.