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TW201813640A - 含ｓｒｃ同源區２蛋白酪胺酸磷酸酶－１增效劑用於改善纖維化之用途 - Google Patents

含ｓｒｃ同源區２蛋白酪胺酸磷酸酶－１增效劑用於改善纖維化之用途 Download PDF

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TW201813640A
TW201813640A TW106132694A TW106132694A TW201813640A TW 201813640 A TW201813640 A TW 201813640A TW 106132694 A TW106132694 A TW 106132694A TW 106132694 A TW106132694 A TW 106132694A TW 201813640 A TW201813640 A TW 201813640A
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fibrosis
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蕭崇瑋
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陳昆鋒
蕭崇瑋
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Abstract

本發明提供一種含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑用於治療降低纖維化之用途，其作為抗纖維化之新治療策略。

Description

含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑用於改善纖維化之用途
本發明係關於一種具有含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)增效之用途，特別係一種具有含SRC同源區蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑用於改善纖維化之用途。
纖維化是一種病理變化，表現為纖維母細胞啟動增殖、組織器官內纖維結締組織增多，實質細胞減少，持續進展可致組織、器官結構破壞和功能喪失。重要臟器的纖維化嚴重影響患者生存品質，甚至危及生命。纖維化疾病包括累及多系統的疾病，如系統性硬化症、多灶性纖維化、硬皮病、腎源性的多系統纖維化，也包括器官組織特異性疾病，如皮膚、心、肺、肝、腎纖維化等。不同纖維化疾病的病因各不相同，例如組織器官的損傷、感染、免疫反應、慢性炎症等，但其共同的特徵是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在組織中的過度沈積和器官組織重構。
肝纖維化是指由各種致病因素所致肝內結締組織異常增生，肝內彌漫性細胞外基質過度沈澱的病理過程。多種因素均可引起肝纖維化，如病毒感染、炎症反應和酗酒等。肝纖維化的病理特點為肝門脈區和肝小葉內有大量纖維組織增生和沈積，但尚未形成小葉內間隔，肝硬化則有假小葉形成，中心靜脈區和肝門脈區出現間隔，肝的正常結構遭到破壞，肝纖維化進一步發展即為肝硬化。
肺纖維化疾病包括特發性肺纖維化、結節病、過敏性肺炎、塵肺、藥物和放射線導致的纖維化，以及與膠原血管病有關的致纖維化肺泡炎等病因各異、範圍廣泛的疾病譜。其主要病理特點包括肺組織間充質細胞增殖、細胞外基質增生沈積及肺實質的重構等。目前主要採用抗炎、抗氧化、抗纖維母細 胞增殖和膠原沈積及肺移植等措施治療肺纖維化。特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是間質性肺疾病最常見的類型，主要是發生在中年和老年成人中未知病因的致命性疾病。雖然特發性肺纖維化的臨床表現已知包含不同程度的間質性纖維化和炎症，但其他相關的診斷仍然很難治療。特發性肺纖維化的特點是呼吸功能喪失，肺結構明顯變形。特發性肺纖維化患者的組織病理學特徵稱為纖維母細胞病灶，其由活化的纖維母細胞的聚集體組成，該纖維細胞是在上皮細胞損失部位的肺泡空間內產生過量的細胞外基質。
由於肺纖維母細胞在肺纖維化中的細胞外基質沈積中起重要作用，所以肺中這些細胞的擴增群的起源是非常有意義的。對纖維母細胞/肌纖維母細胞的起源有一個典型及當代的理論。該典型的理論是組織損傷會引起纖維母細胞的活化，以增殖和表現細胞外基質的成分。該當代的理論認為，存在轉化生長因子β(transforming growth factor-beta；TGFβ)的組織損傷會誘導上皮細胞轉變為間充質的表現型，即纖維母細胞/肌纖維母細胞，後者有助於纖維增生和纖維化。因此，纖維母細胞的失活以及皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的抑制對改善肺纖維化有重要作用。
有鑑於此，本發明之一目的在於提供一種一含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)增效劑用於製備治療纖維化的藥劑之用途。
本發明之另一目的在於提供一種以下化合物用於製備治療以含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)不活化為特徵之疾病的藥物之用途
本發明之再一目的在於提供一種一含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)增效劑用於製備治療以含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)不活化為特徵之疾病的藥物之用途。
在本發明之一實施例中，該含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑係提升含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)之活性。
在本發明之一實施例中，該含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑係為以下化合物
在本發明之一實施例中，該以含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)不活化為特徵之疾病係為纖維化。
在本發明之一實施例中，該纖維化係為皮膚硬化或心臟、肺、肝、胰、或腎臟的纖維化。
本發明之實施例經由肝、肺纖維化中的SHP-1/STAT3訊息傳導路徑，評估給予細胞和動物一SHP-1磷酸酶增效劑，例如SC-43化合物，而產生的抗纖維化效力。SHP-1磷酸酶增效劑SC-43化合物經由降低SHP-1具抑制性的N-SH2區域與有催化性的蛋白酪胺酸磷酸酶區域直接相互作用，而活化SHP-1，並促進纖維母細胞凋亡而展現抗纖維化活性，表示SHP-1磷酸酶增效劑是抗纖維化藥物的潛在靶標，其可為一種發展抗纖維化藥物的新策略。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係為本發明之博來黴素(bleomycin)誘導小鼠肺纖維化之實驗性急性肺損傷模型的示意圖。
圖2係為本發明以SC-43治療以改善在博來黴素誘導小鼠肺纖維化之肺的蘇木素-伊紅(H&E)組織染色圖。CTL表示控制小鼠組；BLM表示博來黴素誘導小鼠組；BLM+SC43表示以SC-43治療博來黴素誘導小鼠組。
圖3係為本發明以SC-43治療以改善在博來黴素誘導小鼠肺纖維化之肺的梅生三色(Masson's trichrome)組織染色圖。CTL表示控制組小鼠；BLM表示博來黴素誘導小鼠；BLM+SC43表示以SC-43治療博來黴素誘導小鼠。
圖4係為本發明以SC-43治療以改善在博來黴素誘導小鼠肺纖維化之羥脯氨酸(hydroxyproline)含量的數據圖。CTL表示控制組小鼠；BLM表示博來黴素誘 導小鼠；BLM+SC43表示以SC-43治療博來黴素誘導小鼠。柱表示平均值；條帶表示標準差；**P<0.05。
圖5係為本發明以SC-43治療以改善在博來黴素誘導小鼠肺纖維化之膠原蛋白含量的數據圖。CTL表示控制組小鼠；BLM表示博來黴素誘導小鼠；BLM+SC43表示以SC-43治療博來黴素誘導小鼠。柱表示平均值；條帶表示標準差。
圖6係為本發明以SC-43治療以改善在博來黴素誘導小鼠肺纖維化之皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的膠體電泳圖。
圖7A係表示本發明以SC-43處理經由SHP-1/STAT3訊息傳導路徑會降低小鼠纖維母細胞(NIH3T3細胞株)存活率。
圖7B係表示本發明以SC-43處理經由SHP-1/STAT3訊息傳導路徑會降低p-STAT3的表現。
圖7C係表示本發明以SC-43處理經由SHP-1/STAT3訊息傳導路徑會誘導細胞凋亡。
圖7D係表示本發明以SC-43處理經由SHP-1/STAT3訊息傳導路徑會因SHP-1剔除而導致細胞凋亡作用抵消。
圖8A係表示本發明將人肺上皮細胞(A549細胞株)暴露於TGF-β1誘導皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的產生。E-鈣黏蛋白的表現降低；纖連蛋白和N-鈣黏蛋白的表現向上調節；暴露於TGF-β1後STAT3磷酸化也增加(左圖)；TGF-β1刺激後EMT的侵襲和遷移細胞增加(右圖)。
圖8B係表示本發明以SC-43處理在人肺上皮細胞(A549細胞株)中會抑制TGF-β1-誘導皮間質轉化的產生。E-鈣黏蛋白的表現增加；纖連蛋白和N-鈣黏蛋白的表現降低；暴露於TGF-β1後STAT3磷酸化也降低。
圖8C係表示本發明以SC-43處理在人肺上皮細胞(A549細胞株)中會抑制TGF-β1-誘導皮間質轉化的產生。以SC-43處理後TGF-β1刺激產生的EMT侵襲和遷移細胞減少。
圖8D係表示本發明以SC-43處理在人肺上皮細胞(A549細胞株)中會抑制TGF-β1-誘導皮間質轉化的侵襲和遷移細胞。
圖9A係表示本發明在A549細胞中轉染SHP-1會減少遷移及侵襲細胞的EMT標記表現。
圖9B係表示本發明在A549細胞中以siRNA剔除SHP-1的對遷移及侵襲細胞的EMT標記表現的影響。
圖9C係表示本發明在A549細胞中以siRNA剔除STAT3的表現對EMT標記、遷移及侵襲細胞的影響。
圖10A係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠模型中的纖維化區域中SHP-1磷酸酶的表現；比例尺：200μm。
圖10B係表示在慢性B型肝炎(CHB)晚期纖維化患者中SHP-1磷酸酶的表現；比例尺：200μm。
圖10C係表示SHP-1磷酸酶的表現與血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)濃度有正相關性。
圖10D係表示SHP-1磷酸酶表現於活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)。SHP-1磷酸酶與活化的肝星狀細胞標誌(marker)α-SMA同位(colocalized)，證實SHP-1磷酸酶表現於活化的肝星狀細胞。
圖11A係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠預防模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色(Picrosirius Red Stain)影像圖；每個群組n=7-9。
圖11B係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠預防模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)的數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=7-9。
圖11C係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠預防模型中SC-43治療會改善肝纖維化的Ishak纖維化評分系統分級數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=7-9。
圖11D係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠預防模型中SC-43治療會改善肝纖維化的α-SMA染色影像圖。α-SMA為活化的肝星狀細胞標誌(marker)；比例尺：200μm，每個群組n=7-9。
圖11E係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠預防模型中SC-43治療會改善肝纖維化的羥脯氨酸濃度數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=7-9。
圖12A係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠治療模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色影像圖；比例尺：200μm；每個群組n=6-8。
圖12B係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠治療模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)的數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05以及**P<0.01，每個群組n=6-8。
圖12C係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠治療模型中SC-43治療會改善肝纖維化的Ishak纖維化評分系統分級數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05，每個群組n=6-8。
圖12D表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠治療模型中SC-43治療會改善肝纖維化的羥脯氨酸濃度數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05，每個群組n=6-8。
圖12E係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠治療模型中SC-43治療會改善肝纖維化的小鼠存活率(log-rank P=0.0291)；每個群組n=6-10。
圖12F係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠復原模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色影像圖；比例尺：200μm；每個群組n=6-8。
圖12G係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠復原模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)的數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05，每個群組n=6-8。
圖12H係表示在CCl4誘導肝纖維化小鼠復原模型中SC-43治療會改善肝纖維化的Ishak纖維化評分系統分級數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05，每個群組n=6-8。
圖13A係表示在膽管結紮(bile duct ligation，BDL)小鼠預防模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色影像圖；比例尺：200μm；每個群組n=7-8。
圖13B係表示在BDL誘導膽汁淤積纖維化小鼠預防模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)的數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05，每個群組n=7-8。
圖13C係表示在BDL誘導膽汁淤積纖維化小鼠小鼠治療模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色影像圖；比例尺：200μm；每個群組n=7-8。
圖13D係表示在BDL誘導膽汁淤積纖維化小鼠治療模型中SC-43治療會改善肝纖維化的天狼星紅染色經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)的數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)*P<0.05，每個群組n=7-8。
圖14A係表示在時間及劑量依賴下給予SC-43的肝星狀細胞存活率的數據圖；在HSC-T6及LX2細胞中給予SC-43或索拉非尼24小時；初代小鼠HSCs細胞中分別給予SC-43 24或48小時。柱代表平均值、條帶代表標準差，每個群組n=3-4。
圖14B係表示在時間及劑量依賴下給予SC-43的肝星狀細胞凋亡的數據圖；在HSC-T6及LX2細胞中給予SC-43或索拉非尼24小時。柱代表平均值、條帶代表標準差，每個群組n=3-4。
圖14C係表示SC-43經由增加切割的poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)片段誘導肝星狀細胞凋亡的電泳圖；每個群組n=3-4。
圖14D表示在LX2細胞中SC-43會誘導轉化生長因子(TGF)-β路徑p-Smad2以及p-Smad3向下調節的電泳圖；每個群組n=3-4。
圖14E係表示在LX2以及HSC-T6細胞中SC-43會誘導血小板衍生生長因子受體(PDGFR)路徑p-PDGFR以及p-Akt向下調節的電泳圖；每個群組n=3-4。
圖15A係表示在LX2和HSC-T6細胞中SC-43治療會劑量依賴的向下調節p-STAT3和細胞週期素D1的電泳圖。
圖15B係表示SC-43會向下調節介白素(IL)-6-STAT3的電泳圖。
圖15C係表示SC-43誘導的細胞凋亡在STAT3過度表現的HSC中會被顯著消除；柱代表平均值、條帶代表標準差；相較於載體(vehicle)***P<0.001。
圖15D係表示給予特異性PDGFR抑制劑AG1295後SC-43會向下調節p-Akt和p-STAT3。
圖16A為SHP-1及其突變體dN1(包含N-SH2區域缺失)以及D61A(D61的單一突變)的示意圖。
圖16B係表示SHP-1過度表現會顯著減少LX2細胞存活率；柱代表平均值、條帶代表標準差；*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖16C係表示在LX2及HSC-T6細胞中分別給予索拉非尼(5μM)或SC-43(2.5或5μM)後會增加SHP-1活性使細胞凋亡率提升；柱代表平均值、條帶代表標準差；*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖16D係表示以非專一性磷酸酶抑制劑釩酸鹽治療會向上調節p-STAT3及減少細胞凋亡；柱代表平均值、條帶代表標準差；*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖16E係表示SHP-1的專一性抑制劑(PTP抑制劑III)會向上調節p-STAT3以及減少細胞凋亡；柱代表平均值、條帶代表標準差；*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖16F係表示利用siRNA默化SHP-1基因而逆轉SC-43對p-STAT以及細胞凋亡的效果；柱代表平均值、條帶代表標準差；*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖17A係表示SHP-1、dN1以及D61A突變體的異位表現顯著抑制細胞群落形成的數據圖；柱代表平均值、條帶代表標準差；***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖17B係表示dN1以及D61A突變體表現顯著使細胞存活率降低；柱代表平均值、條帶代表標準差；***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖17C係表示SC-43處理會顯著增加載體和野生型SHP-1的SHP-1活性但不會增加dN1和D61A突變體的SHP-1活性；柱代表平均值、條帶代表標準差；*P<0.05，每個群組n=3-5。
圖17D係表示載體對照組以及野生型SHP-1的異位表現在SC-43處理(5μM，24小時)後會顯著增加凋亡的LX2細胞並向下調節p-STAT3；柱代表平均值、條帶代表標準差，每個群組n=3-5。
圖17E係表示在過度表現野生型SHP-1的細胞中，SC-43處理會顯著增加凋亡的LX2細胞並向下調節p-STAT3，但dN1和D61A突變體對SC-43處理並不敏感；柱代表平均值、條帶代表標準差；***P<0.001，每個群組n=3-5。
圖17F係為SC-43藉由SHP-1-STAT3路徑抗纖維化機制的示意圖。
除非另有定義，本文所用之所有技術及科學術語與本發明所屬技術領域之技術人員通常理解的含義相同。本文所提及之所有出版物皆以引用方式併入本文，以揭露及描述與該被引用之出版物有關的方法及/或材料。
如本文所使用，單數形式「一」(a、an)和「該」(the)包括複數對象，除非該內文清楚地另有規定。因此，例如，參照「一樣品」包括複數個此類樣品以及本領域之技術人員已知的等同物。
本文所述之「纖維化」是肺、肝、腎、血管、腹膜、胰臟、皮膚等組織、器官受到炎症、感染、免疫反應、缺血、化學物質、輻射等各種原因導致持續損傷後，纖維母細胞啟動增殖、組織器官內纖維結締組織增多，實質細胞減少，組織、器官結構破壞和功能喪失的病變。該纖維化病變術語涵蓋各種原因導致的心臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、血管纖維化、皮膚纖維化(硬化)等組織器官纖維化病變，還包括各種疾病發生、發展過程中伴隨產生的心臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、血管纖維化、皮膚纖維化(硬化)等組織器官纖維化病變。
本文所述之「肝纖維化」是指由各種原因(例如炎症、感染(例如病毒感染)、免疫反應、缺血、化學物質、輻射、氧化應激和酗酒)導致的或伴隨的肝內結締組織異常增生，肝內彌漫性細胞外基質過度沈澱、肝的正常結構遭到破壞的病理變化(病變)。肝纖維化進一步發展即為肝硬化，也涵蓋在本發明「肝纖維化」術語的範圍內。
本文所述之「肺纖維化」是指各種原因(例如炎症、感染、免疫反應、缺血、化學物質、輻射)導致的或伴隨的肺組織間充質細胞增殖、細胞外基質增生沈積及肺實質的重構而造成的病理過程。
本文所述之「治療」包括該特定失調或病症的預防，或與一特定失調或病症有關的症狀的減輕及/或該症狀的預防或消除。
本文所述之「預防」為治療以降低或最小化尚未呈現臨床疾病狀態之患者之疾病狀態的風險，而次級預防定義為最小化或降低相同或類似臨床疾病狀態之復發或第二次發生的風險。
本文所述之「個體」係為一動物，如人類，但也可以是一寵物(例如，狗、貓及其類似物)、經濟動物(例如，牛、羊、豬、馬及其類似物)或實驗用動物(例如，大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似物)，該動物係需要如本文所述之治療。
本文所述之「有效量」係指在一個體上達到治療效果所需要的活性劑的量，不論是單獨或與一種或多種其他活性劑組合使用。根據給藥途徑、 賦形劑的使用，以及與其他活性劑共同使用等不同情況，在由本領域技術人員確認下，有效量各不相同。
適合的給藥途徑可能包括如口服、直腸給藥、黏膜給藥、或腸道給藥；非經口傳輸，包括肌內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈、腹膜、鼻內或眼內注射，並可為補充或緩釋劑型。
本發明之醫藥組合物可以本領域已知之方式製造，例如，透過習用的混合、溶解、乳化、包埋、包封、或凍乾過程製造。因此，根據本發明所提供使用之醫藥組合物係可以常規的方式配製，使用一個或多個生理上可接受的載劑，包含賦形劑及/或助劑，以助於活性化合物的加工而形成醫藥上可使用的製劑。如本文所用，「可接受」係指該載劑必須與該組合物的活性成分相容(且較佳地，能夠穩定該活性成分)，且不會對受治療的個體有害。適當的劑型係取決於所選擇的給藥途徑。
具體而言，對於注射給藥，本發明之化合物可以被配製於例如生理上相容的緩衝液內，如漢克緩衝液、林格氏緩衝液或生理食鹽緩衝液。針對口服給藥，本發明之化合物的配製可經由將該活性化合物與本領域已知的醫藥上可接受之載劑結合，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，及/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP，polyvinylpyrrolidone)，以使本發明之化合物可以配製為片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及其類似物。對於吸入法給藥，本發明之化合物可被配製為自加壓容器或噴霧器噴出之氣霧噴霧，並搭配使用適當的推進劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。
實施例1本發明之SC-43化合物的製備方法
將4-氯-3-(三氟甲基)苯胺(0.21g，1.1mmol)和2當量的三乙胺加入50mL含有三光氣(0.30g，1.0mmol)的THF溶液中。將混合物加熱至50℃後加熱30分鐘。待溫度降至室溫後，將溶於10mL THF溶液的4-(4-胺基苯氧基)芐腈加入該混合物中，並再次加熱至50℃後加熱30分鐘。將該混合物蒸發，用水稀釋，並用乙酸乙酯(EtOAc)萃取。以食鹽水洗滌萃取液，以無水硫酸鎂乾燥，並進行減壓濃縮，得到1-(3-(4-氰基苯氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯)脲 (1-(3-(4-cyanophenoxy)phenyl)-3-(4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)urea)(0.34g，80%)，本發明命名為SC-43。
質子核磁共振(1H-NMR)光譜記錄於核磁共振光譜儀(Bruker DPX300(400MHz))。化學位移係被報告為δ值(ppm)低磁場，該低磁場來自指示用有機溶液內部的氘代氯仿。峰的多重性係表示如下：s，單峰；d，雙峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，雙重雙峰；ddd，雙重峰組成的雙重雙峰；dt，雙重三重峰；brs，寬單峰；m，多重峰。偶合常數(J值)係以赫茲(Hz，hertz)表示。反應進程係以在矽膠60 F254板(Merck)上進行薄層色層分析法(TLC，thin layer chromatography)分析而確定。色層分析的純化係於矽膠管柱60(0.063-0.200mm或0.040-0.063mm，Merck)，鹼性矽膠中進行。使用市售的試劑和溶劑而無需再純化。化學式縮寫如下所示：CDCl3，氘代氯仿；DMSO-d6，二甲亞碸-d6；EtOAc，乙酸乙酯；DMF，N,N-二甲基甲醯胺；MeOH，甲醇；THF，四氫呋喃；EtOH，乙醇；DMSO，二甲亞碸；NMP，N-甲基吡咯烷酮。高解析質譜係紀錄於FINNIGAN MAT 95S質譜儀上。
1H NMR(400MHz,DMSO)：δ 9.17(s,1H),9.03(s,1H),8.04(d,J=2.4Hz,1H),7.83(d,J=8.8Hz,2H),7.64-7.55(m,2H),7.41-7.32(m,2H),7.23(d,J=7.2Hz,1H),7.11(d,J=8.0Hz,2H),6.75(dd,J=8.0Hz,2.4Hz,1H)；C21H12N3O2F3Cl[M-H]-的計算值：430.0570。實測值：430.0576。
實施例2生物活性檢測的方法
本發明研究纖維化中的含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(Src-homology region 2 containing tyrosine phosphatase-1，SHP-1)-轉錄啟動因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)路徑，評估給予活體外(in vitro)和活體內(in vivo)SC-43(SHP-1磷酸酶增效劑)而產生的抗纖維化效力。本發明在纖維化的肺、肝中提升SHP-1活性。藉由鼻內滴注博來黴素(bleomycin) 在雄性C57BL/6J小鼠中建立實驗性肺纖維化小鼠模型；以及經由在雄性C57BL/6小鼠中注射四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)以及經由Balb/C小鼠膽管結紮(bile duct ligation，BDL)建立實驗性肝纖維化小鼠模型，並給予SC-43進行試驗。人肺上皮細胞(A549細胞株)、小鼠纖維母細胞(NIH3T3細胞株)及大鼠、人類和小鼠肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)則用於體外細胞研究，特別是著眼於SHP-1/STAT3訊息傳導路徑。
2.1材料與方法
索拉非尼(蕾莎瓦膜衣錠®)係由拜耳製藥公司(Bayer HealthCare AG)(柏林，德國)提供。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、磷酸化STAT3(Tyr705)、STAT3、細胞週期蛋白D1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、P-Smad2(Ser465/467)、P-Smad3(Ser423/425)Smad2、Smad3、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)-β，P-PDGFR-β(Tyr857)和P-Akt(Ser473)購自細胞信號轉導公司(Cell Signaling)(麻州，美國)。Akt購自聖克魯斯生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology)(加州，美國)。釩酸鈉購自昶安生物科技有限(Cayman Chemical)(密西根，美國)。PTP抑制劑III購自Calbiochem公司(加州，美國)。聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)從Sigma公司(密蘇裡州，美國)獲得。
2.2實驗方法 2.2.1動物實驗
雄性C57BL/6J(6-8週齡)係自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(臺北，台灣)而來。所有使用這些小鼠進行的實驗程式，根據由天主教耕莘醫院機構實驗室動物護理和使用委員會批准的方案進行。將動物飼養在個別通氣籠(individual ventilation cage，IVC)中，每天光照射12小時；室溫維持在22至25℃；濕度保持在60至70%；通氣率保持在16至18次/小時；食物和飲用水(Altromin 1326小鼠飼料，德國)自由給予。所有實驗程式均按照動物實驗動物法標準程式執行。動物的管理和餵養符合實際使用(NRC 1996)規則方法實施的依據
2.2.2博來黴素(bleomycin)誘導肺纖維化
在雄性C57BL/6J小鼠中，使用博來黴素硫酸鹽誘導肺纖維化(圖1)。在阿佛丁(Avertin)(240mg/Kg)麻醉下小鼠腹膜內注射(intraperitoneal injection，IP)。在第0天(n=20)，經由鼻內滴注，以3.5mg/kg接受單劑量的博來黴素(BLM)(1mg=1000IU，臨床級，Bleomycine Bellon，Sanofi-Aventis，法國)。對照組(n=10)中的小鼠只給予食鹽水。在鼻內BLM滴注後的第14天，將BLM處理的小鼠隨機分成接受載體(vehicle)或SC-43的兩組，直到實驗結束。從第14天至第28天，每天腹膜內給予SC-43 7.5mg/kg/天，施用體積為10mL/kg體重。研究時間為28天，SC-43化合物在14至28天內給藥。
2.2.3免疫組織分析
將石蠟包埋的組織陣列塊切成4μm厚的蘇木素-伊紅染色(H&E Stain)染色切片。對於每種病例，由兩名病理學家重新檢查癌症類型、細胞分化、生長模式、腫瘤細胞核形態、組織轉化、鈣化、壞死、有絲分裂數、侵襲狀態和其他特異性差異。使用Ventana BenchMark XT自動染色機(亞利桑那，美國)進行免疫組織化學(IHC)染色。簡言之，從福爾馬林固定的石蠟包埋的組織中連續切割4μm厚的切片。然後將這些切片放置在矽烷化載玻片上，並使其在37℃下乾燥過夜。脫石蠟和再水化後，將載玻片與3%過氧化氫溶液反應5分鐘。用供應的緩衝液洗滌後，用乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid)將組織切片修復40分鐘。
2.2.4細胞培養
小鼠纖維母細胞(NIH3T3細胞株)和人肺上皮細胞(A549細胞株)購自生物資源保存及研究中心(新竹，台灣)。使用添加10%胎牛血清(FBS)、100μg/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素的杜氏改良Eagle培養基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)於37℃含有5%二氧化碳的加濕培養箱中培養，每4至5天以1：4比例繼代培養。
大鼠永生肝星狀細胞株HSC-T6以及LX2人類肝星狀細胞株由紐約西奈山醫院的Scott Friedman教授親自提供，初代小鼠HSCs細胞由小鼠肝門靜脈插管後，利用Leffert’s及乙二醇雙氨乙基醚四乙酸(EGTA)緩衝液原位循環灌流，再灌入膠原酶(collagenase)將肝組織進行消化，取得細胞後利用Histodenz梯度分離的方式獲得。HSC-T6細胞培養在Waymouth培養基；LX2 細胞及初代小鼠HSCs細胞使用添加10%胎牛血清(FBS)、100μg/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素以及2mM L-穀氨醯胺(L-glutamine)的杜氏改良Eagle培養基(DMEM)於37℃含有5%二氧化碳的加濕培養箱中培養。在添加FBS後，休眠的HSC被啟動。對於活體外研究中，將各種濃度的SC-43和索拉非尼溶解在二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide)中，隨後加入至在5%FBS中的細胞中處理一預定時間。
2.2.5羥脯氨酸(hydroxyproline)測定
依據製造商的操作手冊進行(Cell BioLabs,Inc公司，美國)使用羥脯氨酸檢測套組進行羥脯氨酸分析。將肺組織在120℃的12N HCl中水解3小時，然後洗滌並在懸浮於H2O中。然後將組織懸浮液與氯胺-T(chloramines-T)混合，並在室溫下反應30分鐘。然後加入Ehrlich’s試劑並在60℃下反應90分鐘。之後，測量540nm下的吸光值。
2.2.6膠原蛋白含量
依據製造商的操作手冊進行，使用Sircol測定(Biocolor公司，英國)在肺均質物(homogenate)中測量小鼠肺膠原蛋白。簡言之，將肺組織均質物與Sircol染料混合並離心。將沈澱物重新懸浮在NaOH中，並測量550nm下的吸光值。獲得的吸光值與最近合成的膠原蛋白的濃度成正比。
2.2.7西方點墨法
經由RIPA緩衝液(Millipore公司，美國)獲得全細胞萃取物，且經由BCA蛋白質分析套組(Thermo Fisher scientific公司，美國)定量蛋白質濃度。將20或25μg的蛋白質加入至各種百分比SDS-丙烯醯胺(sodium dodecyl sulfate-acrylamide)凝膠上，並印跡至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。然後，將膜與第一抗體進行反應；大量清洗後，將膜與含有結合第二抗體的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)阻攔緩衝液反應。蛋白質由以Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物(Millipore公司，美國)或ECL檢測系統(UVP公司，美國)檢測。
2.2.8抗體
用於免疫印跡技術的抗體如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、纖維連接 蛋白(Fibronectin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)(Abcam公司，英國)。購自細胞信號轉導公司(麻州，美國)的其它抗體如抗SHP-1、磷酸化STAT3(Tyr705)、STAT3α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和半胱天冬酶-9(Caspase-9)。
2.2.9細胞存活率分析
將小鼠NIH3T3纖維母細胞接種至96-孔盤中(1×103細胞數/孔洞)中。為測量細胞存活率及增殖，加入10%WST-1(細胞增殖試劑WST-1，羅氏)至每個孔洞並培養3小時。該反應在活性細胞中以線粒體還原酶(mitochondrial reductase)進行催化，並經由Bio-Rad ELISA分析儀測量450nm下的吸光值計算光密度(OD)。
將HSC-T6、LX2或初代小鼠HSCs細胞接種至96-孔平底盤中(5,000個細胞數/孔洞)中培養24小時，將該細胞分別以各種濃度的SC-43或索拉非尼處理24及48小時。使用含有3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑內鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，an inner，MTS)的CellTiter 96 AQueous one溶液細胞增殖分析(Promega公司，美國)評估各試劑對細胞存活率的影響，依據製造商的操作手冊進行，進行三重覆。在SC-43或索拉非尼治療24小時後，以BD FACS Verse流式細胞儀(BD公司，美國)利用膜聯蛋白(Annexin)V和碘化丙錠(propidium iodide)雙重染色檢測，在早期(Annexin V+/PI-)和晚期(Annexin V+/PI+)凋亡細胞混合後檢測凋亡細胞的比例。
2.2.10細胞凋亡分析
使用流式細胞儀(sub-G1)對凋亡的細胞進行計量，且以細胞質組蛋白相關的DNA片段化的酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)檢測細胞死亡。經由使用ELISA分析儀以測量570nm下formazan染劑量的吸光值計算光密度(OD)。
2.2.11 STAT3的異位表現(ectopic expression)
由Addgene質體工廠公司購買STAT3 cDNA(KIAA1524)。小鼠纖維母細胞(NIH3T3細胞株)和人肺上皮細胞(A549細胞株)與STAT3、SHP-1、SHP-1(dN1)突變體以及SHP-1(61A)突變體過渡性轉染(Transient transfection)， 然後分別與SC-43化合物一起反應，並進行西方點墨法。轉染是使用X-tremeGENE HP轉染試劑(羅氏公司，德國)，依據製造商的操作手冊進行。
2.2.12 SHP-1磷酸酶活性
藥物治療後，將小鼠纖維母細胞(NIH3T3細胞株)、人肺上皮細胞(A549細胞株)或LX2細胞蛋白質萃取物在免疫沈澱緩衝液中與抗-SHP-1抗體一起反應過夜。蛋白質A/G瓊脂糖快速流珠(GE)加入每個樣本中，隨後在4℃下旋轉反應3小時。將96EnzChek®酪氨酸磷酸酶分析套組(R-22067)用於SHP-1活性檢測(Invitrogen公司，美國)。
2.2.13使用siRNA進行基因剔除
Smart-pool siRNA，包括對照組(sc-37007)siRNA、siRNA抗SHP-1以及STAT3均購自聖克魯斯生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology)(加州，美國)。
2.2.14在肝纖維化患者中SHP-1的表現
本發明收集25個具有不同程度肝纖維化的慢性B型肝炎患者(n=5，分別為F0、F1、F2、F3和F4)。他們的活組織檢查肝組織進行SHP-1或α-SMA染色。該研究符合1975年「赫爾辛基宣言」的道德準則，並獲得臺灣大學附設醫院倫理委員會的批准。所有患者在入院時獲得書面知情同意書。
2.2.15肝纖維化小鼠模型
在雄性C57BL/6J小鼠中，使用四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導肝纖維化。每兩週腹膜注射給予小鼠四氯化碳持續4或8週，在指定期間內，經由灌食給予聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)載體、SC-43(分別為5、10、或20mg/kg)或索拉非尼(sorafenib)每週五天至犧牲；索拉非尼因已證實具有抗纖維化活性，故作為陽性對照組。
在膽管結紮(bile duct ligation，BDL)小鼠模型中，在Balb/C小鼠中將膽總管雙重結紮然後切除。第1天或第8天每天經由灌食給予載體或SC-43，直到在第14天犧牲。
2.2.16肝纖維的組織分析
將小鼠肝臟樣本保存在10%甲醛中，以梯度酒精脫水，包埋至石蠟塊中，切片至3μm厚度，放置在載玻片上，並使用天狼星紅染色(Picrosirius Red Stain)套組(ScyTek公司，美國)，依據製造商操作手冊進行。肝纖維化嚴重程度根據Ishak纖維化評分系統分級。經由使用ImageJ軟體，經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)。使用羥脯氨酸(hydroxyproline)套組測定(Biovision公司，USA美國)測量肝羥脯氨酸濃度，依據製造商操作手冊進行。使用Leica BOND-MAX自動色譜儀(Leica Biosystems公司，德國)進行免疫組織化學染色，依據製造商操作手冊進行。
2.2.17轉化生長因子-β誘導
關於轉化生長因子(TGF)-β誘導，將HSC血清處裡4小時，隨後用10μM SC-43處理4小時，再用10ng/mL重組人類TGF-β1(R&D Systems 公司，美國)處理20分鐘。
2.2.18血小板衍生生長因子-BB誘導
關於血小板衍生生長因子(PDGF)-BB誘導，將LX2或HSC-T6細胞血清處裡4小時，隨後用10μM SC-43處理4小時，再用100ng/mL重組人類或大鼠PDGF-BB(R&D Systems公司，美國)處理10分鐘。
2.2.19介白素-6刺激
關於介白素(IL)-6刺激，將HSC血清處裡4小時，隨後用10μM SC-43處理4小時，再用100ng/mL IL-6(R&D Systems公司，美國)處理30分鐘。
2.2.20質體、siRNA以及轉染
大鼠STAT3(Open Biiosystem，美國)建構在pLVX-AcGFP-N1表在載體(Clontech公司，美國)上，其後除了慢病毒(lentiviral)包裹以及表現載體(P8.91以及VSV-G)外，經由使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen公司，美國)共轉染至293FT細胞。轉染48小時後取慢病毒上清液，用於感染5×105個HSC-T6細胞，將其接種在6-cm培養皿上；獲得大鼠STAT3穩定的表現的細胞。
含有人類野生型SHP-1以及SHP-1突變體的質體，含SHP-1突變體的質體是將N-SH2區域截斷(dN1)或位點61處的一個天冬氨酸改變為丙氨酸殘基(D61A)的質體被選殖至具有myc標籤的pCMV6-entry載體。經由DNA定序確認該些突變體的序列。Smart-pool siRNA，包括對照組(D-001810-10)以及SHP-1(PTPN6，L-009778-00-0005)均購自Dharmacon公司(芝加哥，美國)。關於過渡性(Transient)基因表現，依據製造商的操作手冊進行，以Lipofectamine 2000轉染試劑將的SHP-1質體或siRNA(最終濃度為100nM)轉染至LX2細胞24小時。
2.2.21細胞群落形成分析
將LX2細胞置於10-公分的培養皿上(每個培養皿1500至5000個細胞)以DMEM培養基培養2週。該細胞之後以4%甲醛固定並以0.1%結晶紫染色。
2.2.22統計分析
連續變量以平均值(標準誤差)表示，分類數據以適當的數量(百分比)表示。使用Student's t檢驗確定亞群組(subgroup)之間的差異。使用斯皮爾曼相關性(Spearman's coefficient)用於確認SHP-1和血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)之間的關聯性。使用Kaplan-Meier法評估小鼠存活率。Log-rank檢驗用於確定不同實驗組的存活率的統計學差異。使用STATA(第13版，Stata Corp公司，美國)進行統計學分析。所有檢驗均為雙側，P<0.05認為顯著差異有統計學意義。
實施例3 SC-43用於治療減少小鼠肺纖維化
含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(Src-homology region 2 containing tyrosine phosphatase-1，SHP-1)，是一種對不同的細胞內信號分子的調節劑，例如信號轉導因子和轉錄啟動因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、KIT、CD22、CD5、CD72、SHPS-1、TIMP(金屬蛋白酶)、CDK2、p27、SRC、ZAP70、介白素10(IL-10)、NF-κB、Lck、3BP2、Lyn，以及細胞週期素D1。STAT3是一種藉由調製目標基因的表現來調節細胞生長和存活的轉錄因子。SHP-1是STAT3活性的一個關鍵調節因子。
本發明證明SC-43的抗肺纖維化活性，顯示SC-43化合物啟動SHP-1活性，向下調節STAT3，然後降低上皮細胞的纖維母細胞存活率和皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)。本發明於活體內實驗數據也證實SC-43改善博來黴素誘導小鼠的肺纖維化，這表示SHP-1增效劑有可用於治療特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)和其他纖維化疾病。
3.1 SC-43會改善在博來黴素誘導小鼠肺纖維化之肺纖維化
本發明建立博來黴素(bleomycin)誘導肺纖維化的實驗性急性肺損傷模型(如圖1所示)。使用這種動物模型，利用7.5mg/kg劑量的SC-43經由日常管飼法用進行治療有良好耐受性，因為沒有觀察到藥物相關的不良事件。根據肺切片的蘇木素-伊紅染色(H&E Stain)檢測，BLM鼻內注射導致正常肺結構的破壞、纖維母細胞的顯著增殖、發炎細胞的浸潤和纖維膠原的大量沈積)(圖2中間)。更重要的事是，給予SC-43後這些病理變化會顯著改善(圖2右圖)；同樣，在給予SC-43後纖維膠原沈積會大幅降低，如梅生三色(Masson's trichrome)染色陽性區域所示(圖3)。
接著，由於肺羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)是膠原蛋白的主要成分，本發明檢測每組小鼠的肺羥脯氨酸(Hyp)含量，以定量肺纖維化的程度。如圖4所示，與BLM組相比，SC-43治療後Hyp含量降低約22%，表示SC-43在對細胞外基質(extracellular matrix，ECM)積累中具有保護作用。本發明檢測小鼠的膠原蛋白含量(圖5)，發現SC-43會改善肺纖維化模型中膠原蛋白的積累。本發明進一步檢測SC-43是否減少皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，這是纖維發生的關鍵步驟；如圖6所示，與對照組(膠行1和2)相比，博來黴素誘導小鼠肺纖維化樣本(膠行3和4)中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(上皮表型蛋白)減少。但是，博來黴素誘導小鼠肺纖維化樣本經過SC-43處理後(膠行5和6博來黴素誘導小鼠肺纖維化樣本後，E-鈣黏蛋白的表現量增加。纖維連接蛋白(Fibronectin)是間質表現型標記物，在博來黴素誘導小鼠肺纖維化樣本的表現量會增加(膠行3和4)，但在SC-43處理後(膠行5和6)減少。博來黴素誘導的肺纖維化中P-STAT3增加，但在SC-43治療後也會降低。
3.2在小鼠肺纖維化中SC-43經由SHP-1誘導STAT3抑制進而抑制細胞增生以及誘導細胞凋亡
上述實驗結果促使本發明進一步研究SC-43抗纖維化活性的機制。使用SC-43治療會以劑量依賴方式降低小鼠纖維母細胞(NIH3T3細胞株)存活率(圖7A)；且SC-43的治療亦會降低p-STAT3的表現(圖7B)；STAT3的過度表現會因SC-43誘導細胞凋亡而拯救NIH3T3(圖7C)；除此之外，SC-43的凋亡作用會因SHP-1剔除而抵消(圖7D)。這些結果表示SC-43的治療會下調節p-STAT3並誘導纖維化凋亡，而SHP-1的抑制會抵消SC-43的影響。
3.3在人肺上皮細胞(A549細胞株)中SC-43會抑制TGF-β1-誘導皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的產生
在肺纖維化的疾病發生過程，負責過量的皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)產生的主要效應細胞為活化的纖維母細胞，其是由肺泡上皮細胞(alveolar epithelium cells)的肺泡細胞外基質以及駐留的纖維母細胞的增殖所引起。本發明利用A549細胞評估SC-43在EMT的效應，A549細胞是一種已被廣泛應用於研究EMT的理想體外模型的肺泡II型上皮細胞株。將A549細胞暴露於TGF-β1 8小時誘導EMT。黏著連接(adherens junction)蛋白E-鈣黏蛋白的表現降低，中間絲蛋白(intermediate filament)纖連蛋白和N-鈣黏蛋白的表現向上調節；此外，暴露於TGF-β1後STAT3磷酸化也增加(圖8A，左圖)。還觀察到TGF-β1刺激後EMT的侵襲和遷移細胞增加(圖8A，右圖)。另一方面，使用SC-43處理A549細胞以劑量依賴性方式會逆轉TGF-β1誘導的EMT現象，如EMT標記的表現圖譜(圖8B)所示，遷移和侵襲細胞會減少(圖8C和圖8D)。
3.4 SC-43經由SHP-1/STAT3訊息傳導路徑抑制皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)
為確認經由SHP-1/STAT3訊息傳導路徑SC-43的影響，本發明在A549細胞中轉染SHP-1，SHP-1過量表現會減少EMT標記、遷移及侵襲細胞(圖9A)。本發明接著以siRNA剔除SHP-1的表現，而抵消SC-43的作用，包含p-STAT3的表現、EMT標記表現、遷移及侵襲細胞(圖9B)。該些結果顯示SC-43會經由SHP-1的活性抑制EMT，向下調節p-STAT3的表現，進而減少在上皮細胞中的皮間質轉化。最後，本發明剔除STAT3的表現，其係為在SHP-1/STAT3訊息傳導路徑中的下游分子，確認剔除STAT3會抵消SC-43的作用，包含EMT標記表現(圖9C，左圖)、遷移及侵襲細胞(圖9C，右圖)。
因此，本發明證實在博來黴素誘導小鼠肺纖維化模型中，SC-43治療能有效地改善肺纖維化。同時；在活體外研究顯示，SC-43能抑制上皮細胞的皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，並減少纖維母細胞中的增殖和膠原蛋白的合成，促進纖維母細胞凋亡。SC-43會增加SHP-1活性並抑制STAT3磷酸化。增強的SHP-1活性顯著抑制上皮細胞的EMT和促進纖維母細胞凋亡，而SHP-1表現的抑制會抵銷SC-43治療導致的上皮細胞的EMT抑制和纖維母細胞凋亡。本發明另發現SC-43與SHP-1的N-SH2區域會相互作用而增強SHP-1的活性並抑制STAT3訊息傳遞，其為SC-43抗纖維化的作用機制。
實施例4 SC-43用於治療減少小鼠肝纖維化
SHP-1在人和小鼠肝臟的纖維化區域中過度表現，在注射四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)以及膽管結紮(bile duct ligation，BDL)小鼠模型中，以SC-43治療能有效預防和減少肝纖維化，進而改善小鼠的存活率。體外研究顯示SC-43促進肝星狀細胞(HSC)凋亡；SC-43增加SHP-1活性，並且抑制STAT3磷酸化，其與血小板衍生生長因子受體途徑無關。增強的SHP-1活性顯著抑制HSC增殖，而SHP-1抑制會抵消SC-43誘導的HSC凋亡。此外，SC-43與SHP-1的N-SH2區域會相互作用而提高SHP-1的抗纖維化作用。
4.1 SHP-1磷酸酶與肝纖維化之關係
因此，本發明在纖維化的肝臟中研究P-STAT3抑制劑的SHP-1的表現。在CCl4誘導肝纖維化4週的小鼠模型中，SHP-1在具有顯著纖維化區域中會過度表現(圖10A)。本發明進一步研究具有不同程度纖維化的慢性B型肝炎(CHB)患者的SHP-1表現，晚期纖維化患者的SHP-1表現會顯著增加(圖10B)。SHP-1表現與血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)濃度正相關(圖10C)。SHP-1與活化的HSC標誌α-SMA同位(colocalized)表現(圖10D)。這些數據顯示SHP-1可能參與肝纖維化的發生。
4.2 SC-43可改善CCl 4 誘導肝纖維化小鼠模型中的纖維化
本發明已證實SC-43可提升SHP-1活性之表現優於已知抗肝纖維化藥物索拉非尼(sorafenib)(圖2A)。因此。本發明假設SC-43比索拉非尼更具有抗纖維化之能力，在纖維化預防小鼠模型中，同時給予SC-43或索拉非尼與CCl4誘導肝纖維化的小鼠模型後。接著給予SC-43或索拉非尼治療，明顯觀察 到在肝組織中纖維化的減少，使用天狼星紅染色(Picrosirius Red Stain)(圖11A)，經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)(圖11B)，依據Ishak纖維化評分系統分級(圖11C)，檢測α-SMA的表現(圖11D)以及羥脯氨酸濃度(圖11E)。
在肝纖維化治療小鼠模型中，在小鼠CCl4誘導肝纖維化2週後為輕度肝纖維化(Ishak分級，2-3)。在接下來的6週內，同時給予SC-43(5、10或20mg/kg)或索拉非尼(10mg/kg)與CCl4誘導肝纖維化的小鼠模型，如經由天狼星紅染色觀察到的，SC-43以及索拉非尼的治療能顯著改善肝纖維化(圖12A)，經由光密度測定qCPA(圖12B)、依據Ishak纖維化評分系統分級(圖12C)以及羥脯氨酸濃度(圖12D)觀察到SC-43的抗纖維化活性增加。此外，與對照組相比，SC-43(10mg/kg)治療後顯著提高存活率(log-rank P=0.0291)，並且具有比索拉非尼治療更高的存活率(log rank P=0.0671；圖12E)。
在纖維化復原小鼠模型中，在小鼠CCl4誘導肝纖維化8週後為晚期纖維化和肝硬化(Ishak分級，4-6)。接下的四週在沒有CCl4誘導的情況下，給予SC-43(10mg/kg)或索拉非尼(10mg/kg)。在小鼠犧牲時，觀察到肝臟纖維化甚至在對照組(圖12F，與圖12A相比)顯示停止CCl4誘導8週後自發性纖維化減少。然而，觀察到SC-43治療組的qCPA和Ishak纖維化評分顯著降低(圖12G和圖12H)。
4.3 SC-43可改善膽汁淤積性纖維化小鼠模型中的纖維化
本發明進一步檢測SC-43在膽管結紮(bile duct ligation，BDL)小鼠模型中的抗纖維化效果。在纖維化預防小鼠模型中，第一天直到第十四天後小鼠犧牲，給予BDL小鼠模型載體或SC-43(10mg/kg)。使用天狼星紅染色，經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)，顯示SC-43可顯著減少定量的膠原-陽性面積(qCPA)(圖13A及圖13B)。
在膽汁淤積性纖維化治療小鼠模型中，BDL之後第八天直到第十四天小鼠犧牲，給予BDL小鼠模型載體或SC-43(10mg/kg)。使用天狼星紅染色，經由光密度測定以定量的膠原-陽性面積(qCPA)，顯示SC-43可顯著減少定量的膠原-陽性面積(qCPA)(圖13C及D)。該些數據表示在預防、治療及復原小鼠模型中，SC-43具有抗纖維化活性。
4.4 SC-43經由血小板衍生生長因子受體(PDGFR)依賴性訊號傳導及轉錄啟動因子3的抑制誘導肝星狀細胞凋亡
本發明在活體外(in vitro)確認SC-43的抗纖維化機制。SC-43的劑量依賴治療具有減少HSC-T6及LX2細胞存活率的效果，且比索拉非尼的效果更顯著；在時間及劑量依賴下SC-43亦有具有減少初代小鼠HSCs細胞存活率的效果(圖14A)。此外，相較於索拉非尼，在劑量依賴下SC-43顯著增加HSC細胞凋亡(圖14B)，西方點墨法顯示SC-43劑量依賴的增加poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)片段的切割(圖14C)。
轉化生長因子(TGF)-β和PDGFR是參與纖維化發生以及HSC活化與增殖的主要路徑，本發明研究SC-43對TGF-β以及PDGFR路徑的影響。SC-43會向下調節LX2細胞中TGF-β路徑的p-Smad2以及p-Smad3(圖14D)；亦會向下調節HSC-T6和LX2細胞中PDGFR路徑中的p-PDGFR以及p-Akt(圖14E)。
本發明進一步研究SC-43對STAT3路徑的影響，其是纖維發生的關鍵調節因素。在LX2和HSC-T6細胞中SC-43治療顯示比索拉非尼對p-STAT3和細胞週期素D1的有更顯著的劑量依賴下向下調節的效果(圖15A)。SC-43也抑制IL-6誘導p-STAT3向上調節(圖15B)。此外，SC-43誘導的細胞凋亡在STAT3過度表現的HSC中被顯著消除(圖15C)。這些結果顯示，SC-43經由抑制STAT3路徑能比索拉非尼更顯著地誘導HSC凋亡。
另外，在給予特異性PDGFR抑制劑AG1295後，本發明觀察到SC-43仍然會向下調節p-Akt和p-STAT3，與PDGFR訊號無關(圖15D)。該結果顯示SC-43與PDGFR各自獨立下會向下調節p-Akt以及p-STAT3訊號傳導，兩者均與細胞增殖和存活有關。
4.5 SHP-1在SC-43誘導STAT3抑制中扮演重要的角色
SHP-1包含N-端兩個SH2區域(N-SH2以及C-SH2)，接著其後是催化蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)結構區域和C末端。在非活性形式下，N-SH2結構區域的D61位點與PTPase結構區域上的WPD位點相互作用，並阻礙PTPase的活性。dN1和D61A突變體中SHP-1活性增加(圖16A)。
為研究SHP-1在HSC凋亡中的作用，本發明觀察到SHP-1過度表現自轉染第2天起顯著降低細胞存活率(圖16B)。相較於索拉非尼，在LX2以及HSC-T6細胞中，SC-43在低濃度下治療能顯著提高SHP-1活性(圖16C)。此外，經由非特異性磷酸酶抑制劑釩酸鹽(vanadate)對SHP-1的抑制，由向上調節p-STAT3抵銷SC-43誘導的LX2細胞凋亡(圖16D)。同樣地，SHP-1特異性抑制劑PTP抑制劑III亦會向上調節p-STAT3並抵銷SC-43誘導的LX2細胞凋亡(圖16E)。經由使用siRNA(圖16F)，SHP-1基因剔除顯著抵抗SC-43的抗增殖活性，顯示SC-43主要標靶於SHP-1，且HSC增殖受SHP-1表現和活性顯著影響。
該些結果顯示SHP-1活性啟動會降低HSC增殖，以SC-43處理會增加SHP-1活性，向下調節p-STAT3以促進HSC凋亡，而SHP-1抑制則抵消SC-43的作用。
4.6 SHP-1突變體的表現及HSCs的增殖
本發明使用細胞群落形成分析進一步檢測野生型(wild-type)SHP-1、dN1以及D61A突變體的異位表現(ectopic expression)與HSC增殖的相關性。如圖17A所示，與載體對照組比較，SHP-1、dN1以及D61A突變體的異位表現顯著抑制細胞群落形成。此外，使用MTS的溶液細胞增殖分析，dN1以及D61A突變體表現顯著使細胞存活率降低(圖17B)。這些結果顯示，增加的SHP-1活性與降低的HSC增殖有相關性。
4.7 SC-43經由與SHP-1具抑制性的N-SH 2 區域交互作用而活化SHP-1
接著，本發明經由不同的SHP-1突變體的異位表現檢測SC-43誘導SHP-1活性的影響。SC-43處理會顯著增加載體和野生型SHP-1的SHP-1活性，但不會增加dN1和D61A突變體的SHP-1活性(圖17C)。因為SC-43處理會增加SHP-1活性，本發明進一步研究SC-43處理後SHP-1突變體異位表現的表現型變化(細胞凋亡)和p-STAT3表現。由載體對照組以及野生型SHP-1的異位表現，SC-43處理會顯著增加凋亡的LX2細胞並向下調節p-STAT3(圖17D及圖17E)。然而，經由dN1和D61A突變體的細胞凋亡以及向下調節p-STAT3的結果，dN1和D61A突變體對SC-43處理並不敏感(圖17E)，顯示SC-43因不能與dN1和D61A突變體相互作用而不能達到啟動SHP-1活性的效果。
上述結果顯示出SHP-1和dN1和D61A突變體的異位表現能顯著抑制細胞增殖。SHP-1具抑制性的N-SH2區域的D61位點對SC-43誘導SHP-1向上調節極具有關鍵性。dN1和D61A突變體的過度表現會抵消SC-43誘導的SHP-1活性提升、細胞凋亡以及向下調節p-STAT3。圖17F中總結SHP-1/STAT3訊息傳導路徑中SC-43的抗纖維化機制。
因此，人類和小鼠肝臟的纖維化區域中表現出SHP-1過度表現。SC-43在肝毒性以及膽汁淤積性纖維化小鼠模型中均表現出抗纖維化活性。本發明進一步說明SC-43經由關鍵性的抗纖維化機制誘導HSC凋亡。SHP-1/STAT3訊息傳導路徑證明在纖維發生中極為關重要，並參與HSC的存活。經由與SHP-1之具抑制性的N-SH2區域交互作用，SC-43增加SHP-1活性並向下條調p-STAT3，與PDGFR信號無關。這些結果顯示SHP-1磷酸酶增效劑是抗纖維化治療藥物的潛在靶標。
本發明經由在不同動物模型中證實SC-43的抗纖維化活性。此外，與對照組比較，SC-43治療改善纖維化小鼠的存活率。更重要的是，本發明在停止致病因子CCl4後觀察到小鼠的肝硬化的恢復，顯示纖維化在撤回致病因子毒性劑後可逆轉，並且類似於最近的臨床發現，抗病毒治療持續的病毒抑制可逆轉慢性B型肝炎患者的肝硬化。即使在纖維化恢復的過程中，給予SC-43治療顯著降低纖維化，表示HSC凋亡在纖維化緩解是極為關鍵的。
綜上所述，本發明證實SHP-1/STAT3訊息傳導路徑與纖維發生中的相關性，SC-43經由與SHP-1之具抑制性的N-SH2區域的直接相互作用而啟動SHP-1活性，並經由促進纖維母細胞凋亡而抗纖維化。此外，SC-43在肝毒性以及膽管結紮造成的膽汁淤積性纖維化小鼠模型中顯示出抗纖維化活性，表示SHP-1磷酸酶增效劑是抗纖維化藥物的潛在靶標。SHP-1/STAT3訊息傳導路徑是纖維發生中的關鍵信號通路。SC-43促進SHP-1活性上調並抑制STAT3磷酸化而顯著改善纖維化。SHP-1靶向抗纖維化治療可能是一種發展抗纖維化藥物的策略。

Claims (11)

  1. 一種含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)增效劑用於製備治療纖維化的藥劑之用途。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑係提升含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)之活性。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑係為以下化合物
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該纖維化係為皮膚硬化或心臟、肺、肝、胰、或腎臟的纖維化。
  5. 一種以下化合物用於製備治療以含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)不活化為特徵之疾病的藥物之用途
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該以含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)不活化為特徵之疾病係為纖維化。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該纖維化係為皮膚硬化或心臟、肺、肝、胰、或腎臟的纖維化。
  8. 一種以一含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)增效劑用於製備治療以含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)不活化為特徵之疾病的藥物之用途。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑係為以下化合物
  10. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該以含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)不活化為特徵之疾病係為纖維化。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該纖維化係為皮膚硬化或心臟、肺、肝、胰、或腎臟的纖維化。
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