TW201819623A

TW201819623A - 用於降低膽紅素位準之組成物及方法

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Publication number: TW201819623A
Application number: TW106135489A
Authority: TW
Inventors: 俊麟王
Original assignee: 美商幹細胞生物科技股份有限公司
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2018-06-01
Also published as: WO2018075433A1

Abstract

一種降低在一個體中膽紅素位準的方法，其包含：辨識一有需要之個體；以及向該個體投予一包含有尺寸為大於2微米且小於6微米之小型細胞的組成物；其中該等小型細胞包括複數個體幹細胞，該等體幹細胞為：(i)多功能性或者全能性；以及(ii) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

Description

用於降低膽紅素位準之組成物及方法

本發明係有關於用於降低膽紅素位準之組成物及方法。

發明背景膽紅素係一種黃色色素，其通常存在於血液以及糞便中。當老化的紅血球在一正常的且健康的程序中分解時，膽紅素會在體內產生。在血液中循環之後，膽紅素會移動至肝臟。在肝臟中，膽紅素會被排入膽管並且被儲存於膽囊中。然後膽紅素會隨著膽汁被釋放至小腸以幫助消化脂肪。最後，膽紅素會與糞便一起被排出。多種狀況可導致一高膽紅素位準。

發明概要於一個態樣中，在本文中所描述的係一種降低在一個體中膽紅素位準的方法。該方法包括：辨識一有需要之個體；以及向該個體投予(例如，靜脈內)一包含有尺寸為大於2微米且小於6微米之小型細胞的組成物；其中該等小型細胞包括複數個體幹細胞，該等體幹細胞為：(i)多功能性或者全能性；以及(ii) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

於一個具體實施例中，在該方法中的該辨識步驟包括在該個體中偵測比一對照位準高的膽紅素位準。於一個具體實施例中，該經辨識之個體不具有一肝臟病況或病症。該個體可具有一膽囊病況、一胰臟病況、一病毒性感染、一自體免疫疾病、一代謝缺陷，或者溶血性貧血。

在向該個體投予之該組成物中的該等小型細胞可進一步包括血小板。例如，該等小型細胞的75%至85%可以係血小板，且該等小型細胞的20%至25%可以係該等體幹細胞。於一些具體實施例中，該組成物包含1千萬至5億個該等體幹細胞。

於一個具體實施例中，該組成物係藉由一製程所製備，其中該製程包括：提供一混合物，其含有一從該個體或一捐贈個體所獲得之血液樣品及一種二價陽離子螯合劑；將該混合物儲存在2°C與12°C之間的溫度下3至72小時，藉此使該混合物分離成一上層及一下層，其中該上層包含該等小型細胞群(population)；以及收集該上層，藉此製備該組成物。每毫米該血液樣品之1.5至2.0 mg的該二價陽離子螯合劑可以與該血液樣品混合以獲得該混合物。較佳地，該二價陽離子螯合劑係EDTA。

任擇地，在獲得該血液樣品以製備該組成物之前，對該個體或者捐贈個體進行一用於增加幹細胞數目之動作(action)。該動作可以係投予一有效量的褐藻醣膠或者一顆粒性白血球群落刺激因子。

該用於製備該組成物之製程可以進一步包括，在收集該上層之後，添加一藥學上可接受之賦形劑至該經收集的上層。另擇地，該製程可進一步包括，在收集該上層之後，離心該上層以獲得一細胞沉澱物。該沉澱物可進一步被清洗並且懸浮於一藥學上可接受之賦形劑中。該藥學上可接受之賦形劑可以係不含有二價離子。於一個具體實施例中，該藥學上可接受之賦形劑係一食鹽溶液。

於一個具體實施例中，該方法進一步包括，在該投予步驟之後，偵測在該投予步驟之後在從該個體所獲得之一生物樣品中膽紅素位準。

於另一個態樣中，在本文中所描述的係一種用於降低在一個體中膽紅素位準的組成物。該組成物包含有尺寸為大於2微米且小於6微米的小型細胞，其中該等小型細胞包括複數個體幹細胞，該等體幹細胞為：(i)多功能性或者全能性；以及(i)CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

下文說明一或多個具體實施例的細節。從該說明以及從本申請專利範圍該等具體實施例的其它特徵、目的，以及優點將會係顯而易見的。

較佳實施例之詳細說明意外地發現一包含有特定的小型體幹細胞(例如，Lgr5(+)或者CD349(+)細胞)的組成物可降低在病患中血液膽紅素位準。因此，在本文中所描述的係用於治療高膽紅素血症的方法以及組成物。體幹細胞

體幹細胞有許多種類，包括全能性幹細胞、多功能性幹細胞、多潛能性幹細胞，以及先驅幹細胞(亦稱為專一性幹細胞)。類卵裂球幹細胞(BLSCs)係全能性或多功能性體幹細胞。極小類胚胎幹細胞(VSELs)係多功能性體幹細胞。SB細胞係多功能性或多潛能性體幹細胞。間質幹細胞(MSCs)以及造血幹細胞(HSC)係多潛能性體幹細胞。

在本文中所使用之諸如一幹細胞之一細胞的尺寸(Z)可以係(1)在細胞生物學領域或幹細胞領域中一細胞的尺寸或代表性長度的習知定義，(2)一細胞的直徑，尤其是當該細胞實質上為球形，(3)一細胞的主軸的長度，尤其是當該細胞實質上為橢圓體，(4)一細胞的寬度，當該細胞的形狀具有一近似於一正方形的形狀，(5)一細胞的長度，當該細胞的形狀具有一近似於一長方形的形狀，或者(6)一細胞的最大截面或橫向尺寸。可以例如使用從一光學顯微鏡或從一電子顯微鏡(例如，掃描電子顯微鏡(SEM))所獲得之該細胞的影像，或者使用從一流式細胞儀所獲得之該細胞的數據(例如，二維的點、輪廓或是密度圖)測定或測量該尺寸(Z)，不論是直徑、長度、寬度，或者最大截面或橫向尺寸。從一光學顯微鏡或電子顯微鏡所獲得之一細胞的一影像可以係該細胞的一二維(2D)截面或三維(3D)結構。作為一個範例，該細胞的尺寸(Z)可藉由測量在從一光學顯微鏡或一電子顯微鏡(例如，SEM)所獲得之一2D截面影像中該細胞的最大截面或橫向尺寸而獲得。

術語“小型細胞”(例如，小型體幹細胞)指的是一具有小於6微米(例如，在2.0與6.0微米之間)之尺寸的細胞。術語“大型細胞”指的是一具有大於6微米之尺寸的細胞。

CD349(+) SB細胞係多功能性或多潛能性體幹細胞。CD349(+) SB細胞亦可以係CD9(+)、Oct4(+)，及Nanog(+)，以及CD133(−)、CD90(−)、CD34(−)，及Sox2(−)。各個 CD349(+) SB細胞具有一等於或者小於4、5或6微米的尺寸，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間，或者在1.0與4.0微米之間。較佳地，該尺寸係大於2微米且小於6微米。

Lgr5(+) SB細胞亦係多功能性或多潛能性體幹細胞。其亦可以係Oct4(+)及Nanog(+)，以及CD133(−)、CD66e(−)、CD4(−)、CD8(−)、CD9(−)、CD10(−)、CD11(−)、CD16(−)、CD17(−)、CD18(−)、CD19(−)、CD20(−)、CD21(−)、CD31(−)、CD42(−)、CD63(−)、CD34(−)、Lin(−)、CD38(−)、CD90(−)、CD45(−)、CD349(−)，及Sox2(−)。Lgr5(+) SB細胞的尺寸可以係等於或者小於4、5或6微米的尺寸，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間，或者在1.0與4.0微米之間。較佳地，一Lgr5(+) SB細胞的尺寸係大於2微米且小於6微米。

類卵裂球幹細胞(BLSCs)係CD66e(+)全能性或多功能性體幹細胞。其各個可以具有一等於或者小於4、5或6微米的尺寸，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間，或者在1.0與4.0微米之間。例如，一BLSC可以具有一大於2微米且小於6微米的尺寸。

極小類胚胎幹細胞(VSELs)係多功能性體幹細胞，其可以係CD133(+)或CD34(+)。一VSEL亦可以係CD45(−)及Lin(−)。例如，一VSEL可以係CD133(+)、CD45(−)及Lin(−)，或者CD34(+)、CD45(−)及Lin(−)。一VSEL的尺寸可以係等於或者小於4、5或6微米的尺寸，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在2.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間，或者在1.0與4.0微米之間。一VSEL的尺寸可以係大於2微米且小於6微米。

間質幹細胞(MSCs)係多潛能性體幹細胞。一MSC可表現一或多個細胞表面標誌CD13、CD29、CD44、CD73、CD90以及CD105。MSCs組成一非常不均一的族群。有些種類的MSCs的尺寸可以係等於或者小於4、5或6微米，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間，或者在1.0與4.0微米之間。其它種類的MSCs的尺寸可以係大於6、7或10微米。

造血幹細胞(HSCs)係多潛能性體幹細胞。其可以係CD34(+)、cKit(−)、CD38(−)、Lin(−)細胞或者CD150(+)、CD244(−)，及CD48(−)細胞。HSCs的尺寸可以係等於或者小於4、5或6微米，諸如在0.1與6.0微米之間、在0.5與6.0微米之間、在1.0與6.0微米之間、在0.1與5.0微米之間、在0.5與5.0微米之間、在1.0與5.0微米之間、在0.1與4.0微米之間、在0.5與4.0微米之間，或者在1.0與4.0微米之間。增加幹細胞之動作

在本文中所使用之一動作(X)係一可在活體內，例如，在一人類個體或非人類個體中有效增加一或多種幹細胞之數目的動作。動作(X)可包括： 1. 服用藥物，諸如合成藥物或者天然化合物； 2. 服用藥草或者中草藥，諸如冬蟲夏草、人參、枸杞、靈芝(靈芝)、牛樟芝，及/或巴西蘑菇； 3. 服用營養品或者膳食補充品，諸如營養丸或營養粉，其包括下列物質或元素：維生素(維生素A、B、B群、B₁₂ 、D、D₃ 、E等等)、巨量及/或微量礦物質(例如，鈣、鈉、鉀、氟、溴、鉻、碘、矽、硒、鈹、鋰、鈷、釩及/或鎳)、多醣類、高分子量含海藻糖之醣蛋白、海藻(包括綠藻、藍綠藻、褐藻等等)、海藻糖、褐藻醣膠(褐藻的一主要成分)、寡褐藻醣膠、藻類、含褐藻醣膠之褐藻(例如，在日本沖繩生長及生產的褐藻)、日本水雲、綠藻、藍綠藻(或者藍藻)、褐藻(包括水雲、昆布、裙帶菜屬、羊棲菜、裙帶菜等等)、植物性化合物(例如，異黃酮或者植物雌激素)、茄紅素、表沒食子兒茶素沒食子酸脂(EGCG)、綠茶素、醣質營養素(例如，木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺，或者N-乙醯神經胺酸)、魚油、香椿(toona sinensis)，及/或從植物、葉子、果實、蔬菜、魚、海藻，或藻類萃取出的營養素； 4. 勵行素食飲食； 5. 服用或食用健康食品或者有機食品； 6. 採用替代(非傳統)醫學； 7. 接受一替代療法或治療，諸如葛森療法(Gerson therapy)或者布魯士癌症療法(Breuss cancer cure)； 8. 接受針灸； 9. 接受按摩，諸如足部按摩； 10. 運動，諸如走路、慢跑、跳舞、體操、瑜珈、有氧運動，及/或太極拳(中式影子訓練)； 11. 睡覺(目的為測量睡眠品質)； 12. 冥想； 13. 實行由一個人、一醫療專業人員，或者一醫學醫生所設計之一健康改善計畫或者一疾病治療計畫； 14. 服用一用於改善體內一特定器官之健康的特定營養品，例如，服用改善前列腺之健康的茄紅素； 15. 參與一復健計畫，以治癒受傷處，或者治癒由手術所造成的傷口，或者治療一疾病； 16. 服用一藥酒(medicinal liquor) (或者稱為藥酒(medicinal wine)、藥酒(medicated liquor)或藥酒(medicated wine)，其係例如將一種中藥或多種中藥浸泡在酒(liquor)或酒(wine)中歷時一段時間而製成，諸如將人參浸泡在高酒精濃度的米酒中歷時一個月而製成的人參酒； 17. 服用經諸如美國食品藥物管理局(U.S. FDA)之一政府部門或機構所核准之用於治療一特定疾病(例如，一種癌症、皮膚疾病、腎臟疾病及/或等等)的一或多種藥物； 18. 採用或接受經一政府部門所核准之用於治療一特定疾病(例如，一種癌症、皮膚疾病，或者腎臟疾病)的一治療或療法； 19. 參與一宗教活動，諸如祈求平靜或者崇拜上帝； 20. 直接地或間接地曝露於日照或日光(在早上，例如在日出前10分鐘與日出後50分鐘之間(包含大量的紅外(IR)光)；或者在接近中午，例如在上午11點30分與下午12點30分之間(包含大量的紫外(UV)光)；或者在下午，例如在日落前50分鐘與日落後10分鐘之間(包含大量的紅外(IR)光))； 21. 曝露於燈光或者發光二極體(LED)光，其可包括可見光的全光譜、IR光、紅光、綠光、藍光或UV光，或者上述一種以上光線的一組合； 22. 實行或接受用於改善身體自癒力之計畫、療法、方法、儀器及/或系統，例如，在受傷或手術之後所進行之用於改善自癒力的一方法或療法(例如，高壓氧療法)； 23. 飲用咖啡，諸如黑咖啡； 24. 飲用茶，諸如綠茶、紅茶，或者茉莉花茶； 25. 飲用紅酒； 26. 服用褪黑激素； 27. 聽音樂，諸如莫札特或貝多芬的交響曲； 28. 注射一包含褐藻醣膠或寡褐藻醣膠的物質(例如，一營養品或補充品)； 29. 服用荷爾蒙補充品或者接受荷爾蒙注射； 30. 注射一顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF或GCSF)，其係一醣蛋白； 31. 接受一個GCSF注射療程；以及 32. 服用一營養品、一營養產品、一營養流體、一營養飲料、一營養液體，或者一營養食品，其包含(1)多種胺基酸(諸如精胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甘胺酸、硒半胱胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸，或者色胺酸)，(2)均衡胺基酸，或者(3) 9種人體必需胺基酸 (亦即，組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸以及纈胺酸)。例如：(a)由紅豆、綠豆、黑豆之發酵所產生或萃取的產品；(b)由一種水果或數種水果之組合，諸如甜菜、蘋果、番石榴、奇異果、葡萄、鳳梨、紅龍果(火龍果)、青木瓜、番茄，及/或酪梨等等之發酵所產生的液體、流體，或者飲料；(c)例如將一種中藥或多種中藥浸泡在酒(liquor)或酒(wine)中歷時一段時間而製成的一藥酒(medicinal liquor)(或者稱為藥酒(medicinal wine)、藥酒(medicated liquor)或藥酒(medicated wine)，諸如將人參浸泡在高酒精濃度的米酒中歷時一個月而製成的人參酒；含有幹細胞之組成物

一含有幹細胞之組成物(例如，一含有幹細胞之溶液)可以係使用下述一例示性方法所製備。

對一個體進行一動作(X)，其可以係上述動作(X)之一者。該個體，例如，係一人類(例如，小孩、青少年、成人，或老人)或者一非人類之動物。一非人類之動物的範例包括一靈長類動物(例如，猴子或大猩猩)、狗、齧齒動物(例如，老鼠或天竺鼠)、貓、馬、乳牛、牛、綿羊、豬、雞、鴨、鵝、鳥，以及大象。

例如，該個體可攝取一幹細胞動員劑(stem cell-mobilization agent)，諸如一含有褐藻醣膠之化合物。該含有褐藻醣膠之化合物可以係一褐藻補充品。一褐藻補充丸包含80%的水雲粉、15%的結晶纖維素、3%的蔗糖脂肪酸酯，以及2%的微或細矽粉(含有二氧化矽)。從生長在日本沖繩附近海域中的水雲褐藻(一種海藻)可以萃取出該水雲粉。然後將該水雲粉與結晶纖維素、蔗糖脂肪酸酯，以及微或細矽粉(含有二氧化矽)混合以形成該褐藻補充丸，其包含0.1公克的褐藻醣膠。該個體可攝取20粒或更多(例如，至少30粒)的褐藻補充丸或者2公克或更多(諸如至少3公克)的褐藻醣膠。於另一個範例中，該個體可攝取一顆粒性白血球群落刺激因子(GCSF)，亦即，一動員劑，或者可接受一個GCSF注射療程。

在進行一動作(X)之後，該個體等候一段時間(例如，一段預定的時間)，諸如在15分鐘與60分鐘之間、在20分鐘與100分鐘之間、在30分鐘與4小時之間、在60分鐘與90分鐘之間、在0.5小時與3小時之間、在1小時與6小時之間、在1小時與12小時之間、在12小時與36小時之間，或者在36小時與50小時之間。進行動作(X)並且等候一段時間允許一或多種特定類型的體幹細胞，諸如SB細胞(亦即，CD349(+)及Lgr5(+) SB細胞)，從例如該個體的骨髓移動至該個體的周邊血液。該個體的周邊血液因此成為富含一或多種特定類型的體幹細胞。該一或多種特定類型的體幹細胞，例如，可以係或者可以包括一或多種上述體幹細胞。例如，該一或多種特定類型的體幹細胞可以係或者可以包括尺寸為小於6微米的體幹細胞，且更佳地，尺寸為大於2微米的體幹細胞，諸如CD349(+)體幹細胞及/或Lgr5(+)體幹細胞。

進行動作(X)並且等候一段時間係選擇性步驟。換句話說，當製備一含有幹細胞的組成物時，可以從一個體獲得一血液樣品而不需先對該個體進行任何動作(X)。

緊接著上述等候步驟之後(若是有進行動作(X)以及該等候步驟)，一血液樣品係從該個體的該周邊血液所獲得並且係放置在一或多個包含一二價陽離子螯合劑的容器中(例如，一袋子、一或多個注射器，或者一或多個試管)。將該血液樣品與在該容器中的該二價陽離子螯合劑混合以形成一混合物。該二價陽離子螯合劑，例如一抗凝血劑，可以係乙二胺四乙酸(EDTA)，諸如K2 EDTA 抗凝血劑或者K3 EDTA 抗凝血劑，其具有一重量，例如，大於70 mg，諸如在90與900 mg之間、在120與450 mg之間，或者在150與400 mg之間。另擇地，該二價陽離子螯合劑可以係檸檬酸鹽，其具有一重量，例如，大於70 mg，諸如在90與900 mg之間、在120與450 mg之間，或者在150與400 mg之間。該血液樣品包含多種細胞，包括尺寸為小於6微米的小型細胞以及尺寸為大於6微米的大型細胞。該等小型細胞，例如，包含血小板以及尺寸為小於6微米的小型體幹細胞。例如，該等小型體幹細胞包含該一或多種特定類型的體幹細胞(亦即，SB細胞，例如)、BLSCs(亦即，CD66e(+)體幹細胞)，以及VSELs(例如，CD133(+)體幹細胞以及CD34(+)體幹細胞)。該等大型細胞，例如，包含尺寸為大於6微米的大型體幹細胞以及諸如紅血球與白血球之譜系細胞。該血液樣品可具有大於或等於45毫升的體積，諸如在60與500毫升之間、在80與250毫升之間，或者在100與200毫升之間。在一範例中，該血液樣品可以與每毫升血液樣品之1.5 mg或更多，諸如在1.6與2.0 mg之間，的該二價陽離子螯合劑(諸如K2 EDTA、K3 EDTA，或者檸檬酸鹽)混合以在該容器中形成該混合物。

接著，處理該混合物以形成一含有幹細胞之溶液。該製程可包括幹細胞活化以及純化/分離的步驟。在本文中所使用之術語“純化”或“分離”意指小型細胞(例如，尺寸為大於2微米且小於6微米的細胞)與大型細胞(例如，尺寸為大於6微米的細胞)的實質分離。

該混合物可以被儲存在攝氏2度(°C)與12°C之間的溫度，更佳地係在2°C與7°C之間或者在4°C，在一合適的設施中(例如，冰箱或者其它用於保持東西冷卻的裝置)歷時一段預定的時間。該段時間可以係在3小時與72小時之間，且更佳地係在3小時與6小時之間、在6小時與72小時之間、在6小時與48小時之間、在16小時與72小時之間、在16小時與48小時之間、在36小時與60小時之間、在48小時與72小時之間，或者約48小時。在該混合物已被儲存一段預定的時間之後，在該混合物中的該一或多種特定類型的體幹細胞(例如，SB細胞)可以藉由該二價陽離子螯合劑(諸如K2 EDTA、K3 EDTA，或者檸檬酸鹽)被活化，亦即，該一或多種特定類型的體幹細胞的細胞週期從G0進入G1而被活化。該活化係與該二價陽離子螯合劑抑制p53之功能的能力(假設藉由螯合Zn²⁺ )有關，從而允許該一或多種特定類型的體幹細胞(例如，SB細胞)從該細胞週期的G0靜止期離開並進入G1期。因為該p53蛋白質需要Zn²⁺ 才可適當地折疊並且形成一功能性蛋白質，所以藉由該二價陽離子螯合劑螯合Zn²⁺ 可能係活化該一或多種特定類型的體幹細胞(例如，SB細胞)的一關鍵步驟。該二價陽離子螯合劑也有可能螯合其它二價離子(例如，Ca²⁺ )，從而活化該一或多種特定類型的體幹細胞並且促使其增生及擴大。

當該混合物被儲存，其因為重力而分離成不同的層，包括一上層以及一下層。該上層，或者該上清液，可具有一在20與250毫升之間、在40與125毫升之間，或者在50與100毫升之間的體積。該上層包含血小板、血清，以及一或多種特定類型的小型體幹細胞(亦即，SB細胞，例如)、BLSCs(亦即，CD66e(+)體幹細胞)，以及VSELs(例如，CD133(+)體幹細胞以及CD34(+)體幹細胞)。該血液樣品之大部分包含譜系細胞的該等大型細胞以及該等大型體幹細胞，諸如該血液樣品之大於95%、98%或99%的該等大型細胞，係在下層中。該上清液之體積與該血液樣品之體積的比率可以係在，例如，三分之一至二分之一的範圍。

接著，實質上所有的該上層可以被收集或者被轉移至一液體容器中，諸如一袋子、一注射器，或者一玻璃瓶，以產生一含有幹細胞之溶液或者幹細胞混合物。該上層，例如，一含有幹細胞之溶液，包含小型細胞，其包括血小板以及小型體幹細胞。在該含有幹細胞之溶液中小型體幹細胞的數目可以係大於或者等於1千萬(例如，大於或者等於3千萬、大於或者等於5千萬、在1千萬與5億之間、在2千5百萬與3億之間，或者在3千萬與5億之間)。該含有幹細胞之溶液亦可包含該二價陽離子螯合劑(例如，EDTA)及/或生長因子。

此外，該含有幹細胞之溶液幾乎不包括或者實質上排除大型細胞(例如，大型體幹細胞以及譜系細胞)。例如，在該含有幹細胞之溶液中大型細胞可組成小於5%(例如，小於1%、0.5%，或者0.01%)的細胞總數目。例如，在該含有幹細胞之溶液中(例如，該經收集之上層)每毫升紅血球的數目可以係小於10⁵ 或10⁴ 個。較佳地，每毫升該含有幹細胞之溶液紅血球的數目係小於10³ 個。每毫升該含有幹細胞之溶液白血球的數目可以係小於10⁴ 個(例如，小於10³ 個)。較佳地，每毫升該含有幹細胞之溶液白血球的數目係小於10² 個。

在該含有幹細胞之溶液中大於95%(例如，99%或者99.99%)的所有該等細胞可以係小型細胞。該等小型細胞可包括血小板、Lgr5(+)細胞、CD349(+)細胞、CD133(+)細胞、CD34(+)，以及CD66e(+)細胞。在該含有幹細胞之溶液中血小板可組成75%至85%的該等小型細胞。大於4%(例如，大於5%或者在4.5%與10%之間)的所有該等小型細胞可以係Lgr5+體幹細胞。在該含有幹細胞之溶液中CD349(+)體幹細胞可組成大於4%(例如，大於5%或者在4.5%與10%之間)的所有該等小型細胞。小於2%(例如，小於1%或者0.5%)的該等小型細胞可以係CD133(+)細胞以及CD34(+)細胞之組合。小於6%(例如，小於5%或者4.5%)的該等小型細胞可以係CD66e(+)細胞。

使用流式細胞儀或者其它習知技術(例如，以抗體為基礎之技術，諸如抗體-共軛珠)亦可以進一步從該經收集之上層分離出或者用盡任何特定的小型細胞。

該經收集之上層可以被使用作為一含有幹細胞之溶液(例如，被投予至一個體或被儲存)或者進一步被處理。例如，其可以進一步被純化(例如，被過濾)或者與一或多個額外的成分混合。一不含有Ca²⁺ 之合適的細胞培養基或溶液具有一體積，例如，大於400毫升，諸如在500與900毫升之間，其可以被添加至該經收集的上層以製造一含有幹細胞之溶液。該不含有Ca²⁺ 之合適的培養基或溶液，諸如一含有NaCl之溶液，可以係進一步不含有任何二價離子，包括Mg²⁺ 。該含有NaCl之溶液，例如，可以係生理食鹽水(例如，一0.90% w/v之NaCl的溶液，約300 mOsm/L或者每公升9.0公克)。

該含有幹細胞之溶液可以被儲存在一冷凍儲存溫度下，例如，等於或小於-70°C或-80°C (例如，在-75°C與-85°C之間)，歷時一段長的時間 (例如，大於一星期、一個月，或者一年)。當準備使用時，該被冷凍之含有幹細胞的溶液可以被快速地解凍並且，任擇地，與上述不含有Ca²⁺ 之合適的培養基或溶液(例如，0.9% NaCl)混合。治療方法

由上述方法所產生之該含有幹細胞的溶液或組成物可以被用於治療高膽紅素血症或者降低在一個體中膽紅素的位準。

附著至糖的膽紅素為直接型或結合型膽紅素。間接型或未結合型膽紅素係未經附著之膽紅素。在體內所有形式的膽紅素統稱為總膽紅素。在本文中所使用之術語“膽紅素位準”可意指間接型膽紅素位準、直接型膽紅素位準，或者總膽紅素位準。一高膽紅素位準係高於在健康的個體中或者在不具有一與高膽紅素位準相關之病症的個體中所發現之位準或者位準範圍。例如，成人的正常總膽紅素位準可以係低於每分升1.3毫克(mg/dL)。直接型膽紅素的正常位準通常係在0.1與0.4 mg/dL之間。根據本發明所屬技術領域所接受之規範，一熟習此技藝者可以測定一個體是否具有一高的膽紅素位準。

在該含有幹細胞之組成物被投予至一個體之前，可以測定該個體是否具有一高膽紅素位準。在該組成物被投予之後，亦可以測定在該個體中的膽紅素位準以監控治療效能並且做出治療決定。另擇地或者額外地，在該投予之前及/或之後可以評估在該個體中的其它疾病參數或者症狀。

膽紅素位準會因為數種原因而增加。例如，當多於正常的紅血球分解時會發生，例如，當一個體具有胎兒紅血球母細胞增多症或者溶血性貧血。肝臟問題亦可導致高膽紅素血症。例如，肝炎、吉伯特氏症(Gilbert disease)、硬化，以及非酒精性脂肪肝疾病會增加膽紅素位準。膽紅素位準會受到膽囊或膽管問題的影響。例如，膽石、膽囊發炎、膽囊癌、手術切除膽囊、總膽管之縮小，或者胰臟炎會導致高膽紅素血症。特定的病毒性感染(例如，艾司坦氏-巴爾氏病毒感染(Epstein-Barr virus infection))、自體免疫疾病、代謝缺陷、酒精，以及藥物(例如，乙醯胺酚、氯丙嗪、盤尼西林、雌激素類固醇及同化類固醇)亦可造成高膽紅素血症。在本文中所描述之方法可被用於降低在一個體中的高膽紅素位準，其中該個體的潛在病況或病症尚未被診斷出。

在本文中所描述之該含有幹細胞之組成物可以係經由任何的投予路徑，例如，靜脈內、關節內、結膜的、顱內、腹膜內、胸膜內、肌內、鞘內，或者皮下投予路徑，被投予至一需要之個體。該組成物可包含有在1千萬個與5億個之間的小型體幹細胞。可以使用自體的或同種異體的體幹細胞。該組成物可以係，例如，每1-14天、每2-4星期、每1-6個月，或者每2-12個月被投予至一個體歷時一段治療時間(例如，1-36個月或者2-10年)，或者當需要時。

一“個體”指的是一人類或者一非人類之動物。“治療(treating)”或者“治療(treatment)”指的是向一具有一病症之個體投予一化合物或組成物以達到以下目的：治癒、減輕、緩解、治療、延遲發作，或者改善該病症、該病症的症狀、該病症繼發的疾病狀態，或者罹患該病症之傾向。一“有效量”指的是該化合物或者組成物能夠在一經治療的個體中產生一醫學上所欲之結果的量。該治療方法可以單獨進行或者結合其它藥物或療法一起進行。

以下具體的實施例僅用於說明，而非以任何方式限制本揭示內容。無需進一步闡述，相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於本文之內容可將本發明利用至其最充分的程度。實施例

100至150 ml的周邊血液樣品係從罹患高膽紅素血症超過數個月的病患A以及病患B所獲得。該等樣品係放置於經EDTA塗覆的試管中並且在4°C下培養6至48小時直到該血液分離成2個不同的層。該上層包含有SB細胞。從該病患自己的樣品收集該上層，並且經由靜脈注射遞送回該病患中。在治療之後發現每個病患中的血漿膽紅素位準顯著地降低。

在開始化學治療之前病患A的血漿膽紅素位準係1 mg/dL。在開始化學治療之後約3個月，該病患的膽紅素位準達到2.7 mg/dL。然後中止化學治療約1個月直到膽紅素位準下降至1.8 mg/dL。然後該病患完成8回的化學治療。在完成化學治療之後約5個月，該病患的膽紅素位準係1.6 mg/dL。製備一SB細胞組成物並且投予至上述病患。該病患相隔約2個月接受2次治療。在第二個治療之後約3個星期，該病患的膽紅素位準降低至1.2 mg/dL。

在病患B的膽囊被手術切除之前，該病患具有低於1 mg/dL(例如，0.5至0.7 mg/dL)之膽紅素位準的病史。在該手術之後約1年，測量到該病患的膽紅素位準為1.5 mg/dL。1個月之後，使用上述SB細胞組成物治療該病患。在該治療之後的2個星期該病患的膽紅素位準降低至1.2 mg/dL。其它具體實施例

在本說明書中所揭露之所有特徵可以係以任何組合被結合。在本說明書中所揭露之每個特徵可以被一相同的、等同的，或者相似目的之替代特徵所取代。因此，除非另有明確地表示，所揭露的每個特徵僅是一系列等同的或者相似的特徵的一範例。

從以上的說明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以輕易地確定所述具體實施例的主要特徵，並且在不脫離其精神及範圍的情況下，可以對該等具體實施例進行各種變化和修改，以使其適用於各種用途和條件。因此，其它具體實施例亦係在本申請專利範圍內。

Claims

一種降低在一個體中一膽紅素位準的方法，其包含：辨識一有需要之個體；以及向該個體投予一包括尺寸為大於2微米且小於6微米之複數個小型細胞的組成物；其中該等小型細胞包括複數個體幹細胞，該等體幹細胞為：(i)多功能性或者全能性；以及(ii) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。
如請求項1之方法，其中該辨識步驟包括在該個體中偵測比一對照位準高的膽紅素位準。
如請求項2之方法，其中該個體不具有一肝臟病況。
如請求項3之方法，其中該個體具有一膽囊病況、一胰臟病況、一病毒性感染、一自體免疫疾病、一代謝缺陷或溶血性貧血。
如請求項2之方法，其進一步包含：在該投予步驟之後，偵測在該個體中一膽紅素位準。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該等小型細胞進一步包括血小板。
如請求項6之方法，其中該等小型細胞的75%至85%係血小板，且該等小型細胞的20%至25%係該等體幹細胞。
如請求項7之方法，其中該組成物包含1千萬個至5億個該等體幹細胞。
如請求項8之方法，其中該組成物係藉由包括下列的製程所製備：提供一混合物，其含有一從該個體或一捐贈個體所獲得之血液樣品及一種二價陽離子螯合劑；將該混合物儲存在2°C與12°C之間的溫度下3至72小時，藉此使該混合物分離成一上層及一下層，其中該上層包含該等小型細胞群(population)；以及收集該上層，藉此製備該組成物。
如請求項9之方法，其中該二價陽離子螯合劑係EDTA。
如請求項10之方法，其中每毫米血液樣品1.5至2.0 mg的二價陽離子螯合劑係與該血液樣品混合以獲得該混合物。
如請求項10之方法，其中在獲得該血液樣品之前，對該個體或者捐贈個體進行一用於增加幹細胞數目之動作。
如請求項12之方法，其中該動作係投予一有效量的褐藻醣膠或者一顆粒性白血球群落刺激因子。
如請求項10之方法，其中該用於製備該組成物的製程進一步包括，在收集該上層之後，添加一藥學上可接受之賦形劑至該經收集的上層。
如請求項10之方法，其中該用於製備該組成物之製程進一步包括，在收集該上層之後，離心該上層以獲得一細胞沉澱物。
如請求項15之方法，其中該用於製備該組成物之製程進一步包括清洗該沉澱物並使該沉澱物懸浮於一藥學上可接受之賦形劑中。
如請求項15或16之方法，其中該藥學上可接受之賦形劑不含二價離子。
如請求項17之方法，其中該藥學上可接受之賦形劑係一食鹽溶液。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該組成物係經靜脈投予。