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TW201819413A - Ｃｄ４７抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents

Ｃｄ４７抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 Download PDF

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TW201819413A
TW201819413A TW106141160A TW106141160A TW201819413A TW 201819413 A TW201819413 A TW 201819413A TW 106141160 A TW106141160 A TW 106141160A TW 106141160 A TW106141160 A TW 106141160A TW 201819413 A TW201819413 A TW 201819413A
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TW
Taiwan
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seq
antibody
variable region
antigen
sequence
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TW106141160A
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English (en)
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葉鑫
孫樂
徐韶瑜
胡齊悅
陶維康
張連山
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大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
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Abstract

本發明涉及CD47抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含所述CD47抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人CD47抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本發明涉及人源化的CD47抗體在製備用於治療CD47通路相關疾病的藥物中的用途。

Description

CD47抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
本公開涉及生物學和醫學領域；更具體而言，本公開涉及一種CD47抗體及其抗原結合片段、其嵌合抗體、人源化抗體，以及包含所述CD47抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。
隨著人類對免疫系統和腫瘤發生機制上認識的深入，腫瘤免疫療法已經日益成為人類對抗腫瘤的有力武器。
腫瘤靶向單株抗體是腫瘤免疫治療領域的重要手段之一。巨噬細胞發揮吞噬效應需要兩個信號同時起作用：一個是靶向細胞表面的“eat me”信號的啟動，另一個是同一細胞表面“don't eat me”信號的失活。任何一個信號的缺少都不足以引發吞噬效應的發生。越來越多的證據表明，CD47是一類“don't eat me”信號，它藉由與巨噬細胞表面的SIRP-α相互結合而抑制巨噬細胞的吞噬功能。
CD47是免疫球蛋白Ig超家族成員，其廣泛表達於不同組織的細胞表面，比如紅細胞、淋巴細胞、血小板、肝細胞。CD47在各種腫瘤細胞上有較高表達，有研究顯示多 種腫瘤細胞表面的CD47表達量高於正常細胞平均約3倍多。此外，癌細胞表達大量CD47的患者相比於CD47表達低水準的患者具有更短的生存期。目前研究已經發現，阻斷性抗CD47單克隆抗體在腫瘤治療方面有著非常良好的效果，但是這一過程的作用機制尚不清楚。
CD47作為癌症治療的靶點具有以下不可比擬的優勢：1. 它廣泛地表達於各類癌細胞表面，因此可以用於治療各種類型的癌症；2. 正常細胞由於缺乏“eat me”信號，因此單單阻斷CD47並不能引發巨噬細胞對正常細胞的吞噬效應。因此，CD47阻斷劑的副作用十分小。前期的很多基礎實驗資料已經支援了這一觀點。研究者藉由小鼠異體腫瘤移植模型說明了CD47阻斷的有效性與安全性。
目前已有相關的CD47專利，如WO2016065329、WO2016109415、WO2014087248和WO2014093678。有效阻斷CD47與SIRP-α之間的結合並促進體內巨噬細胞對於腫瘤細胞的吞噬，具有良好的臨床前景。
本公開的第一個方面提供一種CD47抗體或其抗原結合片段，其包含：抗體重鏈可變區的CDR區(以下稱為HCDR)和/或抗體輕鏈可變區的CDR區(以下稱為LCDR)。
在一些實施方案中，HCDR選自以下的任一個或多個CDR：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、以及 與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16具有至少85%序列同一性的CDR。
在另一些實施方案中，LCDR選自以下的任一個或多個CDR：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、以及與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19具有至少85%序列同一性的CDR。
在本公開的上下文中，表述“至少85%序列同一性”是指至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含抗體重鏈可變區；其中該抗體重鏈可變區包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少85%序列同一性的CDR。
在另一個具體的實施方案中，提供了一種CD47的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含抗體重鏈可變區；其中該抗體重鏈可變區包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具 有至少85%序列同一性的CDR。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含抗體輕鏈可變區；其中該抗體輕鏈可變區包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少85%序列同一性的CDR。
在另一個具體的實施方案中，提供了一種CD47的人源化抗體或其抗原結合片段，其包含抗體輕鏈可變區；其中該抗體輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少85%序列同一性的CDR。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47抗體或其抗原結合片段，其為鼠源抗體或其抗原結合片段。在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47抗體或其抗原結合片段，該抗體的輕鏈可變區包含鼠源輕鏈FR區或其突變序列；該抗體的重鏈可變區包含鼠源重鏈FR區或其突變序列。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47抗體或其抗原結合片段，該抗體包含SEQ ID NO：4所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：5所示的輕鏈可變區。在另一個實施方案中，提供了一種CD47抗體或其抗原結合片段，該CD47抗體包含SEQ ID NO：6所示的重鏈可變區和 SEQ ID NO：7所示的輕鏈可變區。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47抗體或其抗原結合片段，其為嵌合抗體或其抗原結合片段。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其重鏈可變區上重鏈FR區的序列選自人種系重鏈IGHV1-3*01和hjh6.1的組合及其突變序列，或選自人種系重鏈IGHV1-2*02和hjh6.1的組合及其突變序列。
本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其輕鏈可變區上輕鏈FR區的序列選自人種系輕鏈IGKV4-1*01和hjk2.1的組合及其突變序列，或選自人種系輕鏈IGKV1-39*01和hjk4.1的組合及其突變序列。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，該人源化抗體或其抗原結合片段的可變區上FR區包含0至10個胺基酸的回復突變，包括但不限於0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸的回復突變。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區或其突變序列和SEQ ID NO：21所示的輕鏈可變區或其突變序列。
在本公開另一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：22所 示的重鏈可變區或其突變序列和SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區或其突變序列。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區突變序列，該輕鏈可變區突變序列是在SEQ ID NO：21所示的輕鏈可變區基礎上，將第66位胺基酸殘基D替換為E(以D66E表示，以下同)。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區突變序列，該重鏈可變區突變序列是在SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區基礎上，包含選自以下的突變：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L、R38K、R67K、A97S及其組合。在一個具體的實施方案中，該重鏈可變區突變序列是在SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區基礎上包含選自以下的突變：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L及其組合。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區突變序列，該輕鏈可變區突變序列是在SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區基礎上，包含選自以下的突變：V58I、I2V、M4I、Q38E、A43T、P44H及其組合。在一個具體的實施方案中，該輕鏈可變區突變序列是在SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區基礎上，包含選自以下的突變I2V、M4I及其組合。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區突變序 列，該重鏈可變區突變序列是在SEQ ID NO：22所示的重鏈可變區基礎上，包含選自以下的突變：R72V、M48V、V68A、M70L、T74K、A40R、R38K、R67K及其組合。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47抗體或其抗原結合片段，其中：該人源化抗體可變區包含：SEQ ID NO：26所示的重鏈可變區或其突變序列，和SEQ ID NO：27所示的輕鏈可變區或其突變序列；或 該人源化抗體可變區包含：SEQ ID NO：28所示的重鏈可變區或其突變序列，和SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區或其突變序列。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47嵌合抗體或CD47人源化抗體，其重鏈包含：‧人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其突變序列；和‧人源κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其突變序列。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47嵌合抗體或CD47人源化抗體，其重鏈包含：‧人源IgG4的重鏈恆定區或其突變序列，和‧人源κ鏈的輕鏈恆定區或其突變序列。
在本公開一個具體的實施方案中，提供了一種CD47嵌合抗體或CD47人源化抗體，其重鏈包含：含有F234A和L235A突變的人源IgG4重鏈恆定區(如SEQ ID NO：30)。
本公開進一步提供一種醫藥組成物，其含有：‧治療有效量的根據本公開的CD47抗體或其抗原結 合片段，以及‧一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
根據本公開的CD47抗體或其抗原結合片段可以作為醫藥組成物中唯一的藥物活性成分而配製於組合物中，或者可以與其它活性組分組合配製在組合物中。
本文所用的“載體”包括當其以所用劑量和濃度與細胞或哺乳動物接觸時沒有毒性的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。藥學上可接受的載體通常是指緩衝水溶液。藥學上可接受的載體的例子包括但不限於緩衝液；抗氧化劑；多肽；蛋白質；親水性聚合物；胺基酸；糖；螯合劑；糖醇；離子；表面活性劑。再比如，藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑還可以是脂質體的形式，包括以癌組織為靶標的脂質體也可以用作藥物學上可接受的載體。這些都可以依據本領域技術人員已知的方法來製備。
“治療有效量”可以藉由在已知的體外和體內系統中測試本公開的CD47抗體或其抗原結合片段而確定，例如根據在動物體上所證實的有效量，然後由此推斷出用於人的量。
為了全身性的、外部的或局部的給藥，將本公開的CD47抗體或其抗原結合片段與合適的藥物載體混合，從而形成醫藥組成物。組合物中CD47抗體或其抗原結合片段的濃度取決於抗體或其抗原結合片段的吸收、失活、代謝率、給藥方案、給藥量、劑型以及本領域技術人員已知的其它因素。
本公開的醫藥組成物可以藉由本領域技術人員已知的任何途徑來施用，例如但不限於口服、局部給藥、腦內給藥、眼內給藥、心內給藥、鞘內給藥、靜脈內給藥、肌內給藥、腹腔內給藥、皮內給藥、氣管內給藥及其組合。
最合適的給藥途徑將依據預期用途而變化。例如，對於各種癌症的治療，例如乳腺癌、膀胱癌和腸胃癌的治療，可以採用局部給藥，包括施用至腫瘤生長的位點是較佳的，因為優點在於本公開的CD47抗體或其抗原結合片段能夠以較高的濃度被施用。
用於腸胃外、皮內、皮下的溶液或懸浮液，包括但不限於：無菌稀釋劑；抗菌劑；抗氧化劑；緩衝液；以及用於調整滲透壓的試劑。腸胃外給藥的製劑可以裝入玻璃、塑膠或其他合適材料製成的安瓿、注射器或者單劑量或多次劑量的小瓶中。
本公開進一步提供一種雙特異性抗體，其包含根據本公開的CD47抗體或其抗原結合片段。
本公開進一步提供一種分離的核酸，其編碼根據本公開的CD47抗體或其抗原結合片段。
本公開進一步提供一種表達載體，其表達根據本公開的CD47抗體或其抗原結合片段。
本公開進一步提供一種表達載體，其包含根據本公開的分離的核酸。
本公開進一步提供一種宿主細胞，其轉化有根據本公開的表達載體。
在具體的實施方案中，該宿主細胞選自原核細胞或真核細胞。在具體的實施方案中，該宿主細胞是真核細胞。在具體的實施方案中，該宿主細胞是哺乳動物細胞。
本公開進一步提供一種用於製備CD47抗體及其抗原結合片段的方法，包括：‧在適合表達本公開的CD47抗體或其抗原結合片段的條件下，培養如上所述的宿主細胞，以及‧自該宿主細胞中分離本公開的CD47抗體或其抗原結合片段。
本公開進一步提供一種用於抑制個體中的腫瘤細胞的生長的方法，包括：向該個體施用本公開的CD47抗體或其抗原結合片段、或本公開的醫藥組成物。
本公開進一步提供了本公開的CD47抗體或其抗原結合片段在製備用於治療癌症的藥物中的用途。根據另一方面，提供了本公開的醫藥組成物在製備用於治療癌症的藥物中的用途。根據又一方面，提供了本公開的雙特異性抗體在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
在一些實施方案中，本公開的CD47抗體或其抗原結合片段能夠治療癌症，該癌症包括，但不限於：卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、腦癌、睾丸癌、皮膚癌、甲狀腺癌以及血液學惡性腫瘤。在一些實施方案中，血液學惡性腫瘤選自骨髓瘤、 慢性白血病和急性白血病。
第1圖為本公開CD47抗體在體外增強CCRF-CEM細胞的抗體依賴性細胞的吞噬作用(ADCP)。表示hu055-5；表示hu167-33；表示5F9。
第2圖為本公開CD47抗體紅細胞凝集實驗。
第3圖為本公開CD47抗體紅細胞裂解實驗。
第4圖為本公開CD47抗體hu055-5大鼠體內藥物代謝動力學。
第5圖為本公開CD47抗體hu167-33大鼠體內藥物代謝動力學。
術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
CD47是一種廣泛表達的細胞膜表面的免疫球蛋白，又稱整合素相關蛋白。信號調節蛋白(singal regulatory protein，SIRP)是抑制性受體超家族的一個成員，屬於免疫球蛋白超家族，主要表達於巨噬細胞、樹突狀細胞和神經細胞表面，藉由細胞表面受配體接觸調節細胞的遷移和吞 噬活性、免疫自穩及神經元網路。CD47是人信號調節蛋白α(SIRP α)的胞外配體，藉由與巨噬細胞表面SIRP α結合傳導抑制性信號而降低吞噬活性，進而對固有免疫系統產生抑制作用，該信號被形象的描述為“don't eat me(別吃我)”信號。
本公開所述的抗體指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈、λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈、λ鏈。
在本公開中，該抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈的恆定區或其突變序列。
在本公開中，該抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1,2,3,4的恆定區或其突變序列。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和 4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
發明所述的抗體或其抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3、HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。
術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的對人CD47的單株抗體。製備時用CD47抗原注射試驗物件，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體。在本公開一個較佳的實施方案中，該鼠源CD47抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其突變序列的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達 嵌合抗體分子。在本發明較佳的實施方案中，該嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。該嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後顯著降低ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4恆定區。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架(FR)中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的對人體的免疫副反應。人種系抗體可變區框架(FR)序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區進行反向突變(回復突變)，以保持活性。
本公開中所述的“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段、F(ab’)2片段、以及與人CD47結合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位元點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條 多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(scFv)。
本公開的術語“與CD47結合”，指能與人CD47相互作用。
本公開的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本公開抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
本公開中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。
本公開中所述的融合蛋白是一種藉由DNA重組，將得到的兩個基因共同表現的蛋白產物。重組CD47胞外區Fc融合蛋白藉由DNA重組，把CD47胞外區和人抗體Fc片段共同表現的融合蛋白。該CD47胞外區，是指CD47蛋白表達在細胞膜以外的部分，序列見SEQID NO：1。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人CD47或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈CDR和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的技術，哺乳動物表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fe區的高度保守N端。藉由表達與人CD47特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌有抗體的培養液可以用一般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的Protein A或G Sepharose FF管柱進行過柱。洗去非特異性結合的組分。再用酸性緩衝液沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-80℃，或者凍乾。
本公開的抗體指單株抗體。本公開所述的單株抗體或mAb，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-grafting)，或其它現有技術進行重組得到。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指 例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，所述流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施、研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含CD47抗體或其抗原結合片段的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物對患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個患者的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
本公開中所述的“突變序列”中的“突變”包括但 不限於“回復突變”、“保守修飾”或“保守置換或取代”。本公開中所述的“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。
本發明所述的“突變序列”是指對本發明的核苷酸序列和胺基酸序列進行適當的替換、插入或缺失等突變修飾情況下，得到的與本發明的核苷酸序列和胺基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和胺基酸序列。本發明中所述的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，較佳至少為95%。非限制性實施例包括85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Institute網站上可得的BLASTN/BLASTP演算法的預設設置來進行。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於 特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程式或技術。一般來說，需要獲得來自目標地區域末端或之外的序列資訊，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質體序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，所述方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述CD47抗體或其抗原結合片段與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目標是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
實施例
以下結合實施例進一步描述本公開，但這些實施例並非限制本公開的範圍。本公開實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
實施例1. CD47抗原及檢測用蛋白的製備
以UniProt Leukocyte surface antigen CD47(人CD47蛋白，Uniprot號：Q08722)作為CD47的模板，設計本公開涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在CD47蛋 白基礎上融合不同的標籤如his標籤或Fc等。
1. 帶His標籤的CD47蛋白胞外域(CD47-ECD-His)： (SEQ ID NO：1)。注釋：劃線部分為6×his標籤。
2. CD47胞外域與人IgG1Fc融合蛋白(CD47-ECD-Fc)作為免疫原及檢測試劑： (SEQ ID NO：2)。注釋：劃線部分為人IgG1-Fc部分。
3. 人SIRP α與人IgG1Fc融合蛋白(SIRP α-Fc)作為結合及阻斷檢測試劑： (SEQ ID NO：3)。注釋：劃線部分為huamn-IgG1-Fc部分。
實施例2. CD47、SIRP α相關重組蛋白的純化
1. 帶His標籤的重組蛋白的純化步驟：將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將置換後的上清樣品上IMAC管柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目標蛋白，並收集沖提峰。收集的沖提液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE，28-9893-35)進一步純化，流動相為PBS。去除聚體峰，收集沖提峰。所得到的蛋白經電泳、肽圖、LC-MS鑒定為正確後，分裝備用。
得到帶His標籤的CD47-ECD-His(SEQ ID NO：1)用於本公開抗體的免疫原或檢測試劑。CD47-ECD-His也可以藉由體外化學法與KLH進行偶聯反應後作為免疫原刺激小鼠免疫。
2. CD47-ECD-Fc及SIRP α-Fc融合蛋白的純化步驟： 將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，上清進行MabSelect Sure(GE，17-5438-01)親和層析。MabSelect Sure層析管柱先用0.1M NaOH再生，利用純水沖洗後用PBS平衡管柱，將上清結合後，利用PBS進行洗滌至A280讀數降至基線。用0.1M醋酸緩衝液在pH3.5條件下沖提目標蛋白，用1MTris-HCl中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE，28-9893-35)進一步純化，合併收集目標蛋白所在接收管濃縮至適當濃度。
此方法用來純化CD47-ECD-Fc(SEQ ID NO：2)及SIRP α-Fc(SEQ ID NO：3)融合蛋白，該方法也可以用來純化本公開中涉及的人源化抗體蛋白。
實施例3. 抗人CD47融合瘤單株抗體的獲得和製備
1. 免疫
抗人CD47單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。
飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按不同方案免疫，每組6-10隻。
免疫抗原可以是CD47-ECD-Fc、CD47-ECD-His6、CD47-ECD-His6-KLH等，可以單獨一種試劑配合不同的免疫佐劑或者不同類型免疫原交叉免疫。免疫部位可以是腹腔或者背部皮下，或者兩種位置交替免疫。示例性免疫方法如用弗氏佐劑(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免 用弗氏完全佐劑(CFA)，其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑(IFA)。抗原與佐劑比例為1：1，100μg/隻(首免)，50μg/隻(加強免疫)。第0天腹膜內(IP)注射100μg/隻的乳化後抗原，首免後每兩週一次，共6-8周。或用Titermax(sigma Lot Num：T2684)與Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原與佐劑(titermax)比例為1：1，抗原與佐劑(Alum)比例為3：1，10-20μg/隻(首免)，5μg/隻(加強免疫)。第0天腹膜內注射20/10μg/只的乳化後抗原，首免後每週一次，Titermax和Alum交替使用，共6至11周。免疫四週後，根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。
2. 細胞融合
選擇血清中抗體滴度高(見後面的測試例1，結合CD47的ELISA方法)並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合，融合前72小時利用CD47-ECD-Fc腹腔注射衝刺免疫所選小鼠。採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞用HAT完全培養基(含20% FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培養基)重新懸浮，分裝於96孔細胞培養板中(1×105/150μl/孔)，37℃，5% CO2孵育。融合後的第5天加入HAT完全培養基，50μl/孔，37℃，5% CO2孵育。融合後第7天至8天，根據細胞生長密度，全換液，培養基為HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，200μl/孔，37℃，5 % CO2孵育。
3. 融合瘤細胞篩選
融合後第7-9天，根據細胞生長密度，進行結合CD47的ELISA方法檢測(見測試例1)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行CD47/SIRP α結合的阻斷ELISA檢測(見測試例2)，陽性孔換液，並根據細胞密度及時擴大至24孔板中。移入24孔板的細胞株經過複測後進行保種和第一次次選殖。第一次次選殖篩選(見測試例1)為陽性的進行保種，並進行第二次或第三次次選殖，直至獲得單細胞純株。多次融合獲得有阻斷CD47和SIRP α結合效果(見測試例2)的融合瘤細胞。
藉由阻斷實驗和結合實驗篩選得到融合瘤純株055和167，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。
測得融合瘤純株055的鼠抗可變區序列如下：純株055的鼠源重鏈可變區序列： (SEQ ID NO：4)。
純株055的鼠源輕鏈可變區序列： (SEQ ID NO：5)。注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，底線為CDR序列。
融合瘤克隆167的鼠抗可變區序列如下：純株167的鼠源重鏈可變區序列： (SEQ ID NO：6)。
純株167的鼠源輕鏈可變區序列： (SEQ ID NO：7)。注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，底線為CDR序列。
實施例4. 抗人CD47融合瘤單株抗體的人源化
藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫和MOE軟體，分別挑選與055和167同源性高的重輕鏈可變區種系基因作為模板，將這兩個鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。
1. 融合瘤純株055人源化
1.1 融合瘤純株055人源化構架選擇
鼠源抗體055的人源化輕鏈模板為IGKV4-1*01和hjk2.1，人源化重鏈模板為IGHV1-3*01和hjh6.1，人源化 可變區序列如下：hu055VH-CDR嫁接： (SEQ ID NO：20)。
hu055VL CDR嫁接： (SEQ ID NO：21)。注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，底線為CDR序列。
1.2 融合瘤純株055的人源化模板選擇和回復突變設計。
1.3 融合瘤純株055的人源化
融合瘤純株055的人源化模板進行回復突變設計，不同的回復突變組合成不同的人源化抗體，具體見表3。
2. 融合瘤純株167人源化
2.1 鼠源抗體167的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV1-2*02和hjh6.1，人源化可變區序列如下：Hu167VH-CDR嫁接
(SEQ ID NO：22)。
Hu167VL-CDR嫁接
(SEQ ID NO：23)。
2.2 融合瘤純株167的人源化模板選擇和回復突變設 計，見下表4：
2.3 融合瘤純株167的人源化
融合瘤純株167的人源化模板進行回復突變設計，不同的回復突變組合成不同的人源化抗體，具體見表5。
3. 人源化抗體篩選
進行結合CD47的ELISA方法檢測(見測試例1)，並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行CD47/SIRP α結合的阻斷ELISA檢測(見測試例2，結果見表6)，根據測試結果較佳最大程度保留抗體結合能力及阻斷能力的回復突變組合。
055人源化抗體的不同組合基本都保持了良好的體外阻斷活性，藉由Biacore進行不同人源化抗體的親和力比較，部分資料如表8所示，結果顯示人源化抗體組合均保持了對於CD47良好的結合能力，尤其是hu055-3、hu055-4、hu055-5、hu055-6、hu055-7親和力和嵌合抗體ch-055相比基本接近。
同樣對於167人源化抗體的不同組合進行結合CD47的ELISA方法檢測(見測試例1)，並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行CD47/SIRP α結合的阻斷ELISA檢測(見測 試例2)，根據測試結果較佳最大程度保留抗體結合能力及阻斷能力的回復突變組合。體外阻斷實驗結果顯示大部分抗體均保持了良好的阻斷能力，相互之間無明顯差異，從中選擇了部分進行Biacore親合力比較，結果如表9所示，大部分都保持了很好的對於CD47的結合能力，尤其是hu167-4、hu167-6、hu-167-9、hu167-14。
根據親和力及阻斷活性比較不同人源化組合形式，發現回復突變中的V58I對於親和力的維持影響很小，因此在原設計基礎上增加三條輕鏈(分別為：hu167_VL.1E(I2V)、hu167_VL.1F(M4I)、hu167_VL.1G(I2V，M4I))和hu167_VH.1組合產生的hu167-31、hu167-32、hu167-33，體外Biacore檢測及阻斷活性顯示三者均保持了相當的CD47結合能力及阻斷活性。藉由Biacore檢測比較hu167-31、hu167-32、hu167-33及hu167-4的親和力(KD)，結果顯示相比hu167-4的KD比值分別為1.3、1.2、0.98，提示hu167-31、hu167-32、hu167-33很好的保持了抗體的結合能力。
實施例5. 構建和表達CD47人源化抗體的IgG4-S228P及IgG4-AA形式
設計引子PCR搭建各人源化抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。IgG4-AA抗體形式可以藉由IgG4抗體形式簡單點突變獲得，IgG4-AA代表F234A和L235A突變，結果顯示其進一步降低IgG4-Fc與FcyR的結合能力，進一步降 低ADCC/CDC。IgG4-S228P代表野生型IgG4鉸鏈區第228位的胺基酸S突變成P，該位點突變能夠避免天然IgG4抗體在體內發生Fab-交換(exchange)導致的錯配。
IgG4-S228P的重鏈恆定區序列如下： (SEQ ID NO：24)。
IgG4-AA代表上述序列底線部分發生F234A和L235A突變所得的重鏈恆定區序列，具體本公開中IgG4-AA(包含S228P)的重鏈恆定區序列如下： (SEQ ID NO：30)
抗體的輕鏈(Kappa鏈)恆定區序列如下： (SEQ ID NO：25)。
構建後的抗體序列列舉如下：hu167-33：抗體形式IgG4AA
hu167-33重鏈序列： (SEQ ID NO：26)。
hu167-33輕鏈序列： (SEQ ID NO：27)。
hu055-5：抗體形式IgG4AA
hu055-5重鏈序列： (SEQ ID NO：28)。
hu055-5輕鏈序列： (SEQ ID NO：29)。
測試例
測試例1. CD47抗體結合CD47蛋白的ELISA實驗
抗CD47抗體的結合力藉由抗體與固定在ELISA板上CD47的結合的量來檢測。用PBS稀釋CD47-ECD-His(SEQ ID NO：1)至1μg/ml包被在96孔ELISA板(Costar，CAT#3590)上，洗板封閉後，加入不同濃度稀釋的抗CD47抗體樣品，再洗板後加入辣根過氧化物酶-羊抗人(H+L)抗體(Jackson，CAT#109-035-088)，再洗板加入四甲基聯苯胺溶液顯色，最後加入終止液，在酶標儀上測量OD450並計算其EC50值。
測試例2. CD47抗體對SIRP α/CD47結合的阻斷
抗CD47抗體對SIRP α和CD47結合的阻斷能力，藉由檢測在抗體存在的條件下CD47與SIRP α結合的量來確定。用磷酸緩衝液稀釋CD47-ECD-Fc(SEQ ID NO.2)至1μg/ml包被在96孔ELISA板(Costar，CAT#3590)上，洗板封閉後，加入生物素標記的SIRP α-Fc(SEQ ID NO：3)(用磷酸緩衝液稀釋至終濃度0.5μg/ml)和抗體樣品(用磷酸緩衝液稀釋)的混合液100μl/孔，洗板後加入辣根過氧化物酶-鏈黴親和素(sigma，CAT#S2438)，再洗板加入四甲基聯苯胺溶液顯色，最後加入終止液，在酶標儀上測量OD450並計算其IC50值，結果見表6。
測試例3. CD47抗體結合CCRF-CEM細胞的實驗
CCRF-CEM細胞(ATCC，CAT#CRM-CCL-119)培養在RPMI培養基中(Hyclone，CAT#SH30809.01B)(含10%胎牛血清)，1×106細胞/ml CCRF-CEM細胞用5%BSA封閉後，加入CD47抗體樣品至1μg/ml，洗兩次後，再加入Alexa Fluor 488-羊抗人(H+L)抗體(Invitrogen，CAT#A11013)，洗兩次後，流式細胞儀讀取螢光信號值。
FACS檢測結果顯示，本公開涉及的人源化抗體對細胞表面的天然CD47具有很強的結合能力，明顯優於對照抗體B6H12(US9017675B)的結合能力，結果見表7。
測試例4. CD47抗體增強CCRF-CEM細胞體外抗體依賴的細胞介導的細胞吞噬作用(ADCP)的實驗
單核細胞分離於人外周血單核細胞，培養在RPMI培養基中(Hyclone，CAT#SH30809.01B)(含10%胎牛血清)的六孔板中7天。1×106細胞/ml CCRF-CEM細胞加入CFSE(abcam，ab113853)至終濃度0.02μM，37℃孵育5-10分鐘，洗兩次後，加入含分化後單核細胞的六孔板，加入不同濃度稀釋的抗CD47抗體樣品，37℃孵育4小時，洗兩次後，刮下分化後單核細胞，加入APC-抗人CD14抗體(BioLegend，CAT#325608)，4℃孵育0.5小時，洗兩次後，流式細胞儀讀取螢光信號值。
測試結果見第1圖，顯示加入本公開的人源化抗體可以有效促進ADCP，且有一定的劑量效應。
測試例5. CD47抗體紅細胞凝集實驗
新鮮人血用磷酸緩衝液稀釋1倍加入96孔板，加入不 同濃度稀釋的抗CD47抗體樣品，震盪後37℃孵育4小時。吸去上清，觀察96孔板上不同孔中的細胞沉澱情況，記錄各孔中各抗體不同濃度引起紅細胞(RBC)凝集的情況，以第2圖中所示的方式進行標記，並統計結果進行比較。
抗體引起紅細胞發生凝集是CD47領域內抗體較為普遍的現象，比如專利抗體5F9(US9017675B，見專利中vh2，SEQ ID NO 37和v12，SEQ ID NO 42)經檢測能夠在很大濃度範圍內引起體外紅細胞發生凝集現象，而同樣條件下本公開的hu167-33在測試的不同濃度下均不會引起紅細胞凝集，另外一個抗體分子hu055-5能夠引起紅細胞凝集，但其引起紅細胞凝集的濃度範圍明顯小於5F9。結果見第2圖。提示本公開的抗體在安全性方面的潛在優勢。
測試例6. CD47抗體紅細胞裂解實驗
新鮮人血用磷酸緩衝液稀釋1倍加入96孔板，加入0.2mg/ml的抗CD47抗體樣品或不同濃度稀釋的Triton X-100，震盪後37℃孵育4小時，離心後吸取上清至另一塊96孔板，在酶標儀上測量OD540。結果見第3圖，顯示體外加入本公開所示的抗CD47抗體不會引起紅細胞的裂解。
測試例7. BIAcore檢測CD47抗體親和力實驗
用Biacore儀器測試本公開嵌合抗體及相應的人源化抗體對人CD47-his抗原的親和力。
按照人Fab捕獲試劑盒(Cat.# 28-9583-25，GE)說明書中所述的方法，將人Fab捕獲分子共價偶聯於CM5生物傳 感晶片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體。然後於晶片表面流經人CD47-his(義翹神州，CAT#12283-HCCH-50)抗原，利用Biacore儀器即時檢測反應信號，從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值，見下表8、表9。在實驗中每個循環解離完成後，用人Fab捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物晶片洗淨再生。
本公開抗體相應的人源化抗體經Biacore檢測，發現其與抗原有較高的親和力，並進一步篩選到具有高親和力且回復突變少的優化人源化抗體。
測試例8. CD47抗體的體內藥物代謝動力學實驗
動物在給藥不同濃度抗CD47抗體樣品後於不同時間點採取血清，根據測試例1抗CD47抗體結合CD47蛋白的ELISA實驗中的方法作不同樣品的標準曲線，血清樣品1：1000代替抗CD47抗體加入反應體系後根據OD450換算不同時間點抗CD47抗體於血清中的濃度，所得資料由Phoenix WinNonlin軟體分析計算藥代動力學相關參數。
在大鼠中測定了hu055-5在3mpk劑量下的藥物代謝參數，結果顯示hu055-5具有良好的大鼠體內藥物代謝表現， 平均藥物半衰期t1/2約285小時，見第4圖，提示該抗體在大鼠體內穩定性良好。在小鼠體內對本公開抗體hu167-33，進行了藥物代謝檢測，在10mpk劑量下發現其藥物半衰期t1/2約192小時，見第5圖，顯示該抗體在小鼠體內穩定性良好。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 帶His標籤的CD47蛋白胞外域
<400> 1
<210> 2
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD47胞外域與人IgG1Fc融合蛋白：CD47-ECD-Fc
<400> 2
<210> 3
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人SIRP α與人IgG1Fc融合蛋白：SIRP α-Fc
<400> 3
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株055的鼠源重鏈可變區序列
<400> 4
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株055的鼠源輕鏈可變區序列
<400> 5
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株167的鼠源重鏈可變區序列
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<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株167的鼠源輕鏈可變區序列
<400> 7
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株055的HCDR1
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株055的HCDR2
<400> 9
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株055的LCDR2
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 純株055的LCDR3
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<223> 純株167的HCDR2
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<221> DOMAIN
<223> 純株167的LCDR3
<400> 19
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗體055的人源化重鏈可變區
<400> 20
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗體055的人源化輕鏈可變區
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<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗體167的人源化重鏈可變區
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗體167的人源化輕鏈可變區
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<210> 24
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> IgG4-S228P的重鏈恆定區序列
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<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 抗體的輕鏈(Kappa鏈)恆定區序列
<400> 25
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu167-33重鏈序列
<400> 26
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu167-33輕鏈序列
<400> 27
<210> 28
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu055-5重鏈序列
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<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu055-5輕鏈序列
<400> 29
<210> 30
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> IgG4-AA(包含S228P)的重鏈恆定區序列
<400> 30

Claims (26)

  1. 一種CD47抗體或其抗原結合片段，其包含選自以下的任意一個或多個CDR區：抗體重鏈可變區的HCDR區：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、以及與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16具有至少85%序列同一性的CDR；和抗體輕鏈可變區的LCDR區：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、以及與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19具有至少85%序列同一性的CDR。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中：該抗體重鏈可變區包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10具有至少85%序列同一性的CDR；和/或該抗體輕鏈可變區包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13具有至少85%序列同一性的CDR。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中：該抗體重鏈可變區包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16具有至少85%序列同一性的CDR；和/或該抗體輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19具有至少85%序列同一性的CDR。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選自鼠源抗體或其抗原結合片段，嵌合抗體或其片段，和/或人源化抗體或其片段。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該鼠源抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含鼠源的輕鏈FR區或其突變序列；該鼠源抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含鼠源的重鏈FR區或其突變序列。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該CD47抗體包含SEQ ID NO：4所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：5所示的輕鏈可變區，或該CD47抗體包含SEQ ID NO：6所示的重鏈可變 區和SEQ ID NO：7所示的輕鏈可變區。
  7. 如申請專利範圍第4項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈可變區上的重鏈FR區序列選自人種系重鏈IGHV1-3*01和hjh6.1的組合及其突變序列，或選自人種系重鏈IGHV1-2*02和hjh6.1的組合序列及其突變序列；該人源化抗體的輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列選自人種系輕鏈IGKV4-1*01和hjk2.1的組合及其突變序列，或選自人種系輕鏈IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列及其突變序列。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的可變區上的FR區包含0至10個胺基酸的回復突變。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體可變區包含：SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區或其突變序列，和SEQ ID NO：21所示的輕鏈可變區或其突變序列；或該人源化抗體可變區包含：SEQ ID NO：22所示的重鏈可變區或其突變序列，和SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區或其突變序列。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中： SEQ ID NO：21所示的輕鏈可變區的突變序列包含突變D66E；SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區的突變序列包含選自以下的突變：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L、R38K、R67K、A97S及其組合；SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區的突變序列包含選自以下的突變：V58I、I2V、M4I、Q38E、A43T、P44H及其組合；SEQ ID NO：22所示的重鏈可變區的突變序列包含選自以下的突變：R72V、M48V、V68A、M70L、T74K、A40R、R38K、R67K及其組合。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中：SEQ ID NO：20所示的重鏈可變區的突變序列包含選自以下的突變：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L及其組合。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中：SEQ ID NO：23所示的輕鏈可變區的突變序列包含選自以下的突變：I2V、M4I及其組合。
  13. 如申請專利範圍第7至9項中任一所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中：該人源化抗體可變區包含：SEQ ID NO：26所示的重鏈可變區或其突變序列，和SEQ ID NO：27所示的輕鏈可變區或其突變序列；或該人源化抗體可變區包含：SEQ ID NO：28所示的 重鏈可變區或其突變序列，和SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區或其突變序列。
  14. 如申請專利範圍第4，7至12項中任一項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗體或人源化抗體的重鏈包含：人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其突變序列，和人源κ、λ鏈的輕鏈恆定區或其突變序列。恆
  15. 申請專利範圍第14項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗體或人源化抗體的重鏈包含：人源IgG4的重鏈 恆定區或其突變序列，和人源κ鏈輕鏈恆定區或其突變序列。
  16. 申請專利範圍第14項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，其中該嵌合抗體或人源化抗體的重鏈包含：含有F234A突變和L235A突變的人源IgG4重鏈恆定區SEQ ID NO：30。
  17. 一種醫藥組成物，其含有：治療有效量的申請專利範圍第1至16項中任一項所述的CD47抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  18. 一種雙特異性抗體，其包含：申請專利範圍第1至16項中任一項所述的CD47抗體或其抗原結合片段。
  19. 一種分離的核酸，其編碼申請專利範圍第1至16項中任一項所述的CD47抗體或其抗原結合片段。
  20. 一種表達載體，其含有申請專利範圍第19項所述的分離的核酸。
  21. 一種宿主細胞，其轉化有申請專利範圍第20項所述的表達載體，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的宿主細胞，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
  23. 一種用於製備申請專利範圍第1至16項中任一項所述CD47抗體或其抗原結合片段的方法，包括步驟：在申請專利範圍第21項所述的宿主細胞中表達抗體，以及從宿主細胞中分離所述抗體。
  24. 一種用於抑制個體中的腫瘤細胞生長的方法，包括步驟：向個體施用申請專利範圍第1至16項中任一項所述的CD47抗體或其抗原結合片段、或申請專利範圍第17項所述的醫藥組成物。
  25. 一種申請專利範圍第1至16項中任一項所述的CD47抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第17項所述的醫藥組成物以及申請專利範圍第18項所述的雙特異性抗體的用途，其用在製備用於治療癌症的藥物該癌症選自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、腦癌、 睾丸癌、皮膚癌、甲狀腺癌以及血液學惡性腫瘤。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中該血液學惡性腫瘤選自骨髓瘤、慢性白血病和急性白血病。
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