相關申請案之交叉參考
本申請案主張2016年8月3日申請之名為「PLAZOMICIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE」之美國臨時專利申請案第62/370,580號之優先權，出於所有目的，其內容以全文引用的方式併入本文中。 本發明提供用於確定生物樣品中哌唑黴素含量之反應物及方法，其包括哌唑黴素特異性抗體，其使得可特定偵測哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽，且用於哌唑黴素治療期間之治療藥物監測(TDM)中。若干胺基醣苷抗生素展現高度化學相似性且針對特定胺基醣苷(諸如哌唑黴素)產生之抗體與其他胺基糖苷具有高交叉反應性(Shalev, Moran等人, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 75 (2013): 33-40)。與多種胺基糖苷交叉反應之抗體不能夠分析含有兩種或更多種結構類似之抗生素的樣品中之一種特定化合物之精確量測濃度。 本發明係關於特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的抗體及其抗原結合片段，尤其具有特定抗原決定基特異性之抗體。在特定實施例中，本文揭示之抗體及其抗原結合片段優於與其他胺基糖苷結合優先與哌唑黴素結合，以使得抗體與哌唑黴素之結合親和力係抗體與其他胺基糖苷之結合親和力的至少5倍、至少10倍、至少100倍或至少1000倍。其他胺基糖苷可包括(但不限於)阿米卡星、西索米星或慶大黴素。在其他實施例中，本文揭示之抗體及其抗原結合片段以極高親和力結合於哌唑黴素。在某些實施例中，如實例1中所述之分析(例如競爭性ELISA分析)所確定之IC50小於0.1 μg/mL。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約100 μg/mL或更小之IC50特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽(諸如約50 μg/mL或更小、約25 μg/mL或更小、約20 μg/mL或更小、約19 μg/mL或更小、約15 μg/mL或更小、約10 μg/mL或更小、約5 μg/mL或更小、約2 μg/mL或更小、約1 μg/mL或更小、約0.5 μg/mL或更小、約0.2 μg/mL或更小、約0.1 μg/mL或更小、約0.05 μg/mL或更小或約0.02 μg/mL或更小。在某些實施例中，IC50小於0.05 μg/mL。在某些實施例中，半最大抑制濃度(IC50)係約0.02 μg/mL。在某些實施例中，IC50係約0.012 μg/mL。在一些實施例中，IC50係約0.02 μg/mL或更大。 本發明之實施例亦涉及抗哌唑黴素抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於經設計用於哌唑黴素治療方案之治療藥物監測(TDM)之免疫分析中。某些實施例提供一種選擇個體以在接受投與哌唑黴素之後進行進一步治療之方法，其中在投與哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之後哌唑黴素之含量由獲自個體之生物樣品確定。某些實施例提供一種治療細菌感染之方法，其中在施以哌唑黴素治療之後，諸如在第一時間段之哌唑黴素治療之後哌唑黴素之含量由獲自個體之生物樣品確定。若哌唑黴素之確定含量低於或高於規定截止值，則其他實施例包含向個體提供額外哌唑黴素。在其他實施例中，若哌唑黴素之確定含量高於規定截止值，則不向個體提供額外哌唑黴素，或降低未來劑量之含量。在某些實施例中，細菌係革蘭氏陰性細菌。在其他實施例中，細菌係多重抗藥細菌。在其他實施例中，感染係泌尿道感染。 除非另外明確說明，否則本說明書中之各實施例在加以必要修正後應用於其他每一實施例。 本發明之細節闡述於以下隨附描述中。儘管可使用與本文中所描述類似或等效之方法及材料來實踐或測試本發明，但現描述說明性方法及材料。本發明之其他特徵、目標及優點將由說明書及申請專利範圍變得顯而易見。除非上下文另外清楚指示，否則在說明書及隨附申請專利範圍中，單數形成亦包括複數。除非另外規定，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。本說明書中引用之所有專利及公開案均以全文引用的方式併入本文中。 除非確切表明相反，否則本發明之實踐將採用此項技術之技能內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學及重組型DNA技術之習知方法，其中許多出於說明之目的而描述於下文中。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如
Current Protocols in Molecular Biology
or
Current Protocols in Immunology
, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009)；Ausubel等人,
Short Protocols in Molecular Biology
, 第3版, Wiley & Sons, 1995；Sambrook及Russell,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(第3版, 2001)；Maniatis等人,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(1982)；
DNA Cloning: A Practical Approach
, 第I及II卷 (D. Glover編)；
Oligonucleotide Synthesis
(N. Gait編, 1984)；
Nucleic Acid Hybridization
(B. Hames及S. Higgins編, 1985)；
Transcription and Translation
(B. Hames及S. Higgins編, 1984)；
Cell Culture
(R. Freshney編, 1986)；Perbal,
A Practical Guide to Molecular Cloning
(1984)及其他類似參考文獻。 對重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型可使用標準技術(例如電穿孔、脂質體轉染)。可根據製造商之說明書或如通常在此項技術中所實現或如本文所描述執行酶促反應及純化技術。此等及相關之技術及程序一般可根據此項技術中熟知之習知方法及如在本說明書通篇中所引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所描述來進行。除非提供特定界定，否則本文所述之結合分子生物學、分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學所利用之命名法及該等學科之實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等者。標準技術可用於重組技術、分子生物學、微生物學、化學合成、化學分析、醫藥之製備、調配及輸送、以及患者治療。 除非內容另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。 如在本說明書中所用，除非另外指出，否則本發明中術語「及/或」用於「及」或「或」。 如本文所用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。 在本說明書通篇中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所陳述之要素、或整數、或要素或整數之群組，但不排除任何其他要素、或整數、要素或整數之群組。
抗體及抗原結合片段
本文所述之抗體及抗原結合片段可結合小分子治療劑，亦即胺基醣苷抗細菌劑或醫藥學上可接受之胺基醣苷鹽。在某些實施例中，抗體或抗原結合劑結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。本發明包括特異性結合於哌唑黴素之抗體及其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合於醫藥學上可接受之哌唑黴素鹽。 哌唑黴素(其亦可稱為6'-(羥基乙基)-1-(HABA)-西索米星)係具有抗細菌活性之胺基醣苷化合物。哌唑黴素藉由化學改質現有胺基醣苷西索米發展而來，以克服抗生素耐受機制。此化學改質包含在位置1附加羥基-胺基丁酸(hydroxy-aminobutyric acid，HABA)取代基及在位置6'附加羥乙基取代基，產生如下所描畫之哌唑黴素之化學結構。本發明係指哌唑黴素且包括其立體異構體、醫藥學上可接受之鹽、載劑、稀釋劑或賦形劑及前藥。
6'-(羥基乙基)-1-(Haba)-西索米星 「醫藥學上可接受之鹽」包括酸與鹼加成鹽。 「醫藥學上可接受之酸加成鹽」係指保留游離鹼之生物有效性及特性，合乎生物學或其他方面需要，且由無機酸(諸如(但不限於)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物)及有機酸(諸如(但不限於)乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯胺基苯甲酸、樟腦酸、樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、檸檬酸、環己胺磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羥基乙烷磺酸、甲酸、反丁烯二酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡糖庚酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、麩胺酸、戊二酸、2-側氧基-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、馬尿酸、異丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、杏仁酸、甲烷磺酸、黏液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、菸鹼酸、油酸、乳清酸、乙二酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、丙酸、焦麩胺酸、丙酮酸、水楊酸、4-胺基水楊酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、酒石酸、硫氰酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸及其類似物)形成之鹽。 「醫藥學上可接受之鹼加成鹽」係指保留游離酸之生物有效性及特性，合乎生物學或其他方面需要之鹽。此等鹽由無機鹼或有機鹼與游離酸加成製備。衍生自無機鹼之鹽包括(但不限於)鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽及其類似鹽。較佳無機鹽係銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽。衍生自有機鹼之鹽包括(但不限於)以下鹽：一級胺、二級胺及三級胺、經取代之胺(包括天然產生之經取代之胺)、環胺及鹼性離子交換樹脂，諸如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡鹼、普魯卡因(procaine)、海卓胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、苄苯乙胺、苯乍生(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基還原葡糖胺、可可豆鹼、三乙醇胺、緩血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、
N
-乙基哌啶、多元胺樹脂及其類似物。尤其較佳之有機鹼係異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己胺、膽鹼及咖啡鹼。 本發明亦包括哌唑黴素-半抗原結合物，例如如實例1中所述之哌唑黴素-匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)。如本文所用，「半抗原」係指僅在連接至大型載劑(諸如蛋白質)時可產生免疫反應的小分子。半抗原之非限制性實例包括KLH、螢光素、二硝基苯酚、生物素、地高辛、漆酚、肼酞嗪、苯胺、鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸及對胺基苯甲酸。 如此項技術中所熟知，「抗體」係能夠經由至少一個位於分子之可變區中之抗原決定基識別位點特異性結合於諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質或多肽之標靶之免疫球蛋白(Ig)分子。如本文所用，該術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且涵蓋其片段，諸如dAb、Fab、Fab'、F(ab')
2
、Fv)、單鏈(scFv)、其合成變異體、天然產生之變異體、包含抗原結合片段具有所要特異性之抗體部分之融合蛋白、嵌合抗體、奈米抗體及免疫球蛋白分子之任何其他經修飾組態，包含具有所要特異性之抗原結合位點或片段(抗原決定基識別位點)。本文亦包括包含接合於CH3域之scFv的微型抗體(S. Hu等人, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996)。參見例如Ward, E. S.等人, Nature 341, 544-546 (1989)；Bird等人, Science, 242, 423-426, 1988；Huston等人, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P. Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993；Y. Reiter等人, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996；S. Hu等人, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996。 在某些實施例中，如本文所述之抗體及其抗原結合片段包括分別插入重鏈與輕鏈「構架區(FR)組」之間的重鏈及輕鏈「互補決定區組」或「CDR組」，其為CDR提供支撐物且界定CDR相對於彼此之空間關係。如本文所用，術語「CDR組」係指重鏈或輕鏈可變(V)區之三個CDR。自重鏈或輕鏈之N端開始，此等區分別標示為「CDR1」、「CDR2」及「CDR3」。因此，抗原結合位點可包括六個CDR，其包含來自各重鏈及輕鏈V區之CDR組。包含單一CDR (例如CDR1、CDR2或CDR3)之多肽在本文中稱為「分子識別單元」。對多種抗原抗體複合物之結晶分析已表明，CDR之胺基酸殘基與結合之抗原形成廣泛接觸，其中最廣泛抗原接觸係與重鏈CDR3。因此，分子識別單元主要導致抗原結合位點之特異性。 此項技術中已知且本文中涵蓋多種CDR描述。熟習此項技術者可容易基於重鏈或輕鏈可變區之序列確定既定描繪之CDR。「Kabat」互補決定區(Complementarity Determining Regions，CDR)係基於序列可變性且最常用(Kabat等人,
Sequences of Proteins of Immunological Interest
, 第5版, 公共衛生處(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, Md. (1991))。「Chothia」CDR係指結構環之位置(Chothia及Lesk,
Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins
, J. Mol. Biol., 第196卷, 第901-917頁 (1987))。「AbM」CDR表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折中，且由Oxford Molecular之AbM抗體模擬軟體使用。「Contact」CDR係基於可用複合晶體結構之分析。參見常見抗體編號方案，各此等CDR之殘基示於以下表1。 除非本文另外說明，否則CDR及FR之編號係指如Kabat等人, 同上中所述之Kabat編號方案，包括當參見Kabat、Chothia、AbM或Contact方案描述CDR時。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或向其中之插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域在H2之殘基52之後可包括單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)且在重鏈FR殘基82之後包括插入之殘基(例如根據Kabat之殘基82a 82b及82c等)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。
表 1 ： 根據各種方案之 CDR 描述
在一些實施例中，CDR係「延伸CDR」涵蓋根據不同方案開始或終止之區。舉例而言，延伸CDR可如下：L24—L36、L26—L34或L26—L36 (VL-CDR1)、L46—L52、L46—L56或L50—L55 (VL-CDR2)、L91—L97 (VL-CDR3)、H47—H55、H47—H65、H50—H55、H53—H58或H53—H65 (VH-CDR2)及/或H93—H102 (VH-CDR3)。 如本文所用，術語「FR組」係指四個側接胺基酸序列，其構架重鏈或輕鏈V區之CDR組之CDR 。一些FR殘基可接觸結合抗原；然而，FR主要導致V區摺疊以形成抗原結合位點，尤其直接鄰近CDR之FR殘基。亦即，可變輕鏈及可變重鏈根據式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列，其中FR根據其間並列之CDR根據如上文所述之CDR描述界定。在FR內，某些胺基殘基及某些結構特徵高度保守。就此而言，所有V區序列含有環繞90個胺基酸殘基之內部雙硫環。當V區摺疊以形成結合位點時，CDR顯示為形成抗原結合表面之突出環基元。一般認為存在FR保守結構區，其影響CDR環形成某些「典型」結構之摺疊形狀，與精確CDR胺基酸序列無關。此外，已知某些FR殘基參與非共價域間接觸，該等接觸使抗體重鏈及輕鏈之相互作用穩定。免疫球蛋白可變域之結構及位置可參考Kabat, E. A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第4版, 美國衛生與人群服務部(US Department of Health and Human Services), 1987及現可於網際網路(immuno.bme.nwu.edu)上獲得之其更新來確定。 抗體及其抗原結合片段之輕鏈與重鏈之可變區可包括來自任何物種之免疫球蛋白之構架。在一些實施例中，輕鏈之可變區及/或重鏈之可變區包含鼠類構架或源自鼠類構架之構架。在一些實施例中，輕鏈之可變區及/或重鏈之可變區包含人類構架或源自人類構架之構架。在一些實施例中，構架係或源自共同構架，例如如Kabat等人，同上中所述。共同構架係表示所選免疫球蛋白可變輕鏈或可變重鏈構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。構架可選自可變域序列之子群。輕鏈可變構架子群包括κ或λ子群，諸如κI、κII、κIII、κIV。重鏈可變構架之子群包括子群I、子群II及子群III。或者，共同構架可源自以上所使用之特定共同殘基，諸如當構架殘基藉由比對供者構架序列與各種構架序列之集合基於與供者構架之同源性進行選擇時。「源自」免疫球蛋白構架或共同構架之接受體人類構架可包含免疫球蛋白構架或共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有預先存在之胺基酸序列變化。在一些實施例中，預先存在之胺基酸變化之數目係10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少或2個或更少。 例示性抗哌唑黴素抗體之可變區胺基酸序列及CDR區示於表2中。在表2中之各胺基酸序列中，重鏈與輕鏈之CDR 1至3由加下劃線之文本指示。根據各種CDR描述之其他CDR區描述於表3、序列表及圖2A及圖2B中。
表 2 ：例示性抗哌唑黴素抗體序列
如本文所用，術語「抗原結合片段」係指含有結合於相關抗原之至少一個抗原決定基的免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈之至少一個CDR之多肽片段。就此而言，本文中所述抗體之抗原結合片段可包含來自結合本文所闡述之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的抗體之可變重鏈(variable heavy chain，VH)及可變輕鏈(variable light chain，VL)序列中之1、2、3、4、5或所有6個CDR。本文所述之哌唑黴素特異性抗體之抗原結合片段能夠結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。例示性抗原結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')
2
及Fv片段；雙功能抗體；線抗體(參見美國專利5,641,870，實例2；Zapata等人, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995])；單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜酶消化產生兩種相同抗原結合片段，稱作「Fab」片段，及殘餘「Fc」片段，反映易於結晶之能力的名稱。Fab片段由整個L鏈以及H鏈之可變區結構域(VH)及一個重鏈之第一恆定域(CH1)組成。各Fab片段就抗原結合而言係單價的，亦即其具有單一抗原結合位點。抗體之胃蛋白酶處理產生單一大F(ab')
2
片段，該片段大致對應於經二硫鍵連接的具有不同抗原結合活性的兩個Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於Fab'片段在CH1域之羧基端具有若干額外殘基，其包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH係其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'在本文中的名稱。F(ab')
2
抗體片段最初係以其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對形式產生。抗體片段之其他化學偶合亦已知。 術語「抗原」係指能夠與選擇性結合劑(諸如抗體)結合且另外能夠用於動物中以產生能夠結合於彼抗原之抗原決定基之抗體的分子或分子之一部分。抗原可具有一或多個抗原決定基。本文中之實施例涵蓋哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽，或結合於作為抗原之半抗原之哌唑黴素的用途。 術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合於免疫球蛋白或T細胞受體之任何決定子。抗原決定基為抗體所結合之抗原區域。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面群組(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。在某些實施例中，在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中，當抗體優先識別其標靶抗原時，稱該抗體特異性結合抗原。當平衡解離常數≤10
- 7
或10
- 8
M時，稱抗體特異性結合抗原。在一些實施例中，平衡解離常數可≤10
- 9
M或≤10
- 10
M。在其他實施例中，平衡解離常數可≤10
- 11
M或更小。 「特異性結合」或「優先結合」(在本文中可互換使用)於抗體或多肽之抗原決定基係在此項技術中充分理解之術語。若分子與特定細胞或物質之反應或締合比其與替代性細胞或物質之反應或締合更頻繁、更快速、持續時間更長及/或親和力更大，則稱其展現「特異性結合」或「優先結合」。若抗體與標靶結合比與其他物質結合具有更大親和力、親合力、更容易及/或具有更長持續時間，則抗體特異性結合或優先結合於標靶。舉例而言，特異性或優先結合於哌唑黴素抗原決定基之抗體係與一個哌唑黴素抗原決定基之結合比與其他哌唑黴素抗原決定基或非哌唑黴素抗原決定基之結合具有更大親和力、親合力、更容易及/或更長持續時間之抗體。藉由讀取此定義亦應理解，特異性結合或優先結合不一定需要(儘管其可包括)排他性結合。確定此類特異性或優先結合之方法在此項技術中亦熟知，例如免疫分析。在本文所述之某些實施例中，抗哌唑黴素抗體特異性或優先結合於哌唑黴素之抗原決定基，比與諸如阿米卡星、西索米星或慶大黴素之其他胺基糖苷之結合具有更大親和力、親合力、更容易及/或更長持續時間。 「免疫結合」一般係指免疫球蛋白分子與對免疫球蛋白具有特異性之抗原之間出現之類型的非共價相互作用，例如(以說明而非限制之方式)由於靜電、離子、親水性及/或疏水性吸引或斥力、空間力、氫鍵結、范德華力(van der Waals force)及其他相互作用實現。免疫結合相互作用之強度或親和力可根據相互作用之解離常數(K
d
)表示，其中較小的k
d
表示較大的親和力。所選多肽之免疫結合特性可使用此項技術中熟知之方法定量。一種此類方法需要量測抗原結合位點/抗原複合物形成及解離之速率，其中該等速率視複合搭配物之濃度、相互作用之親和力及同等影響兩個方向上速率之幾何結構參數而定。因此，「締合速率常數」(K
on
)與「解離速率常數」(K
off
)可藉由計算之濃度及實際締合及解離速率來確定(參見Nature 361:186-87 (1993))。K
off
/K
on
之比率使得能夠抵消與親和力無關之所有參數，且因此等於解離常數K
d
(一般參見Davies等人, (1990)
Annual Rev. Biochem. 59
:439-473)。 關於抗原決定基之術語「免疫活性」或「剩餘免疫活性」係指在不同條件下，例如在抗原決定基已經受還原及變性條件之後，抗體(例如抗哌唑黴素抗體)結合於抗原決定基之能力。 術語「F(ab)」係指藉由酶木瓜酶蛋白水解分裂免疫球蛋白G (IgG)分子產生之蛋白質片段中之兩者。各F(ab)包含VH鏈及VL鏈之共價雜二聚體且包括完整抗原結合位點。 術語「F(ab)
2
」係指藉由酶胃蛋白酶蛋白水解分裂產生之IgG的蛋白質片段。各F(ab')
2
片段包含兩個F(ab)片段，因此包含兩個抗原結合部位。 根據本發明之某些實施例使用之「Fv片段」可藉由優先蛋白水解分裂IgM及偶爾蛋白水解分裂IgG或IgA免疫球蛋白分子而產生。然而，Fv片段更通常使用此項技術中已知之重組技術得到。Fv片段包括非共價VH::VL雜二聚體，該雜二聚體包括抗原結合位點，其保留天然抗體分子之大多抗原識別及結合能力，但缺乏含於Fab內之CH1及CL域。Inbar等人, (1972)
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69
:2659-2662；Hochman等人, (1976)
Biochem 15
:2706-2710；及Ehrlich等人, (1980)
Biochem 19
:4091-4096。 在某些實施例中，涵蓋單鏈Fv (scFv)抗體，且可使用標準分子生物學技術遵循本申請案關於選擇具有所需特異性之抗體之教示來製備。 在其他實施例中，可製得嵌合抗體。舉例而言，嵌合抗體可包含來自不同抗體之CDR及構架區。此等抗體可經由重組分子生物學技術產生或可以物理方式結合於一起。 scFv多肽係共價連接之VH::VL雜二聚體，其自包括藉由編碼肽之連接子連接之編碼VH及VL之基因的基因融合物表現。Huston等人, (1988)
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85
(16):5879-5883。已描述多種方法來辨別化學結構以用於使來自抗體V區之天然聚集(但經化學分離)之輕多肽鏈及重多肽鏈轉化成為scFv分子，該scFv分子將摺疊以形成大體上與抗原結合位點之結構類似之三維結構。參見例如Huston等人之美國專利第5,091,513號及第5,132,405號；及Ladner等人之美國專利第4,946,778號。 在某些實施例中，可提供呈UniBody®形式之本文所述之抗體。UniBody®係移除鉸鏈區之IgG4抗體(參見GenMab Utrecht, The Netherlands；亦參見，例如US20090226421)。此抗體技術產生預期治療窗比當前之小抗體格式長之穩定的較小抗體格式。IgG4抗體視為惰性的，且因此不與免疫系統相互作用。全人類IgG4抗體可藉由消除抗體之鉸鏈區修飾，以獲得相對於相應完整IgG4具有明顯穩定性特性之半分子片段(GenMab, Utrecht)。將IgG4分子切半僅在UniBody®上留下一個可結合於同源抗原(例如疾病標靶)之區域，且因此使UniBody®單價結合於標靶細胞上之僅一個位點。對於某些癌細胞表面抗原，單價結合可能不如使用具有相同抗原特異性之二價抗體所見般刺激癌細胞生長，且因此UniBody®技術可為難以用習知抗體治療之一些類型之癌症提供治療選項。當治療一些形式之癌症時，小尺寸之UniBody®可具有巨大益處，使得分子較佳分配於較大實體腫瘤之上且可能增加功效。 在某些實施例中，本發明之抗體可呈單域抗體(sdAb，例如奈米抗體)之形式。單域抗體係包含抗體之重鏈可變域全部或一部分或輕鏈可變域全部或一部分的抗體片段。在一些實施例中，單域係含有單可變域(VHH)及兩個恆定域(CH2及CH3)之重鏈抗體(VHH)。在一些態樣中，單域抗體由單一基因編碼且在幾乎所有原核及真核宿主中高效產生，例如大腸桿菌(參見例如美國專利第6,765,087號)、黴菌(例如曲黴菌(
Aspergillus
)或木黴菌(
Trichoderma
))及酵母(例如酵母菌(
Saccharomyces
)、克魯維酵母(
Kluyvermyces
)、漢森酵母(
Hansenula
)或畢赤酵母(
Pichia
) (參見例如美國專利第6,838,254號)。生產過程可擴展且可產生數公斤量之奈米抗體。單域抗體可調配成具有長儲存壽命之備用溶液。奈米選殖方法(參見例如WO 06/079372)係基於B細胞之自動高通量選擇產生抵抗所需標靶之奈米抗體之方法。 在某些實施例中，本發明之抗體可為嵌合抗體。就此而言，嵌合抗體包含可操作地連接或以其他方式融合於不同抗體之異源Fc部分的抗哌唑黴素抗體之抗原結合片段。在某些實施例中，異源Fc域具有人類來源。在其他實施例中，異源Fc域可來自出自親本抗體之不同Ig類別，包括IgA (包括子類IgA1及IgA2)、IgD、IgE、IgG (包括子類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)及IgM。在其他實施例中，異源Fc域可包含來自不同Ig類別中之一或多者的CH2及CH3域。嵌合抗體之抗哌唑黴素抗原結合片段可包含本文所述抗體之CDR中之僅一或多者(例如本文所述抗體之1、2、3、4、5或6個CDR)，或可包含整個可變域(VL、VH或兩者)。 在某些實施例中，本發明抗體可為「非天然產生之」抗體。非天然產生之抗體可指包含一或多個胺基酸修飾之抗體，以使得所得抗體大體上非天然產生(例如自然界中不存在)。此等胺基酸修飾可包括用一天然產生之胺基酸取代另一天然產生之胺基酸的點突變。在一些實施例中，胺基酸修飾可包括用非天然產生之胺基酸取代天然產生之胺基酸的點突變。非天然產生之抗體亦可指與諸如可偵測標記之異源蛋白質或化合物結合之抗體。 「單株抗體」(monoclonal antibody，mAb)係指均質抗體群體，其中單株抗體包含涉及抗原決定基之選擇性結合的胺基酸(天然產生及非天然產生)。詳言之，在群體中之全部分子中單株抗體之CDR相同。MAb含有能夠與抗原之特定抗原決定基進行免疫反應之抗原結合位點，其特徵在於對其具有特有結合親和力。術語「單株抗體」不僅涵蓋完整單株抗體及全長單株抗體，而且涵蓋如上文所述之其片段。 在一些實施例中，抗體係鼠類抗體。在一些實施例中，本文所述之抗體或抗原結合片段係人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。嵌合抗體可包含來自不同抗體之CDR及構架區。此等抗體可經由重組分子生物學技術產生或可以物理方式結合於一起。 非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式係含有一部分源自非人類免疫球蛋白之序列及一種部分源自人類免疫球蛋白之序列的嵌合抗體。在一個實施例中，人類化抗體係人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之一或多個CDR的殘基經具有所需特異性、親和力及/或能力之來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供者抗體)之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白的構架(「FR」)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在接受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。可進行此等修飾以進一步優化抗體效能，諸如結合親和力。一般而言，人類化抗體將大體上包含至少一個且通常兩個可變域之全部，其中全部或大體上全部CDR對應於非人類免疫球蛋白序列之CDR，且全部或大體上全部FR區係人類免疫球蛋白序列之FR區，但該等FR區可包括一或多種改善抗體效能(諸如結合親和力、異構化、免疫原性等)的個別FR殘基取代。FR中此等胺基酸取代之數目通常在重鏈中不超過6，且在輕鏈中不超過3。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之至少一部分。關於其他細節，參見例如Jones等人, Nature 第321卷, 第522-525頁 (1986)；Riechmann等人, Nature 第332卷, 第323-329頁 (1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 第2卷, 第593-596頁 (1992)。亦參見例如Vaswani及Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol., 第1卷, 第105-115頁 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 第 23卷, 第1035-1038頁 (1995)；Hurle及Gross, Curr. Op. Biotech., 第5卷, 第428-433頁 (1994)；及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。 在一些態樣中，對抗體或抗體之抗原結合片段進行分離。抗體或抗原結合片段可特異性結合於小分子抗生素劑。舉例而言，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合胺基醣苷，諸如哌唑黴素、阿米卡星、西索米星或慶大黴素、或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 本發明涵蓋本文揭示之抗體之變異體。在某些實施例中，此類變異型抗體或抗原結合片段或其CDR以至少約50%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%且在某些實施例中，至少約95%結合於哌唑黴素，以及本文所特定闡述之抗體序列。在其他實施例中，此類變異型抗體或抗原結合片段或其CDR以比本文所闡述之抗體更大的親和力結合於哌唑黴素，例如其以定量方式至少約105%、106%、107%、108%、109%或110%結合，以及本文所特定闡述之抗體序列。 在特定實施例中，本發明抗體可具有：a)重鏈可變區，其具有與本文所述之抗哌唑黴素抗體之重鏈可變區至少80%一致、至少85%一致、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或99%或100%一致之胺基酸序列；及b)輕鏈可變區，其具有與本文所述之抗哌唑黴素抗體之輕鏈可變區至少80%一致、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或99%或100%一致之胺基酸序列。說明性重鏈之胺基酸序列以SEQ ID NO: 22、34、42、50、58、66、74、82、90及98所示。說明性輕鏈區之胺基酸序列以SEQ ID NO: 26、30、38、46、54、62、70、78、86、94及102所示。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 22、34、42、50、58、66、74、82、90或98中之任一者至少80%一致、至少85%一致、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列的重鏈可變區。在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 26、30、38、46、54、62、70、78、86、94或102中之任一者至少80%一致、至少85%一致、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，抗哌唑黴素可具有：a)重鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 22、34、42、50、58、66、74、82、90或98中之任一者至少80%一致、85%一致、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或99%或100%一致之胺基酸序列及b)輕鏈可變區，其具有與SEQ ID NO: 26、30、38、46、54、62、70、78、86、94或102中之任一者的輕鏈可變區至少80%一致、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：VL-CDR1、VL-CDR2及/或VL-CDR3，其包含與本文所述之VL-CDR1、VL-CDR2及/或VL-CDR3中之任一者至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(例如根據Kabat、Chothia、AbM、Contact、延伸或任何其他方案)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 舉例而言，在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 27、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、196、197、198、203、204、205、211、212、213、218、219、220、226、227、228、233、234、235、240、241、242、247、248、249、254、255、256、261、262、263、268、269或270中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 196、203、218、226或254中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段之VL-CDR1，包含根據VL-CDR1共同序列之胺基酸序列。共同序列可由共有常見結構特徵及較佳常見功能特徵(諸如特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽)之來自抗體或其抗原結合片段之複數個CDR確定。CDR共同序列可例如根據任何CDR描繪(例如Kabat、Chothia、AbM、Contact、延伸等)來確定。舉例而言，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR1包含根據KASQSVX
1
NDVA (SEQ ID NO:275)之胺基酸序列，其中X
1
係S、T或R。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR1包含根據SQSVX
1
ND (SEQ ID NO: 276)之胺基酸序列，其中X
1
係S、T或R。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR1包含根據X
1
NDVAWY (SEQ ID NO: 277)之胺基酸序列，其中X
1
係S、T或R。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR1包含根據KASQSVX
1
NDVAWY (SEQ ID NO:278)之胺基酸序列，其中X
1
係S、T或R。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 28、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、199、200、206、207、214、215、221、222、229、230、236、237、243、244、250、251、257、258、264、256、271或272中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 199、206或229中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段之VL-CDR2，包含根據VL-CDR2共同序列之胺基酸序列。舉例而言，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR2包含根據YASNRYT (SEQ ID NO:279)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR2包含根據YAS (SEQ ID NO: 280)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR2包含根據LLIX
1
YASNRY (SEQ ID NO:281)之胺基酸序列，其中X
1
係Y、S或C。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR2包含根據LLIX
1
YASNRYT (SEQ ID NO:282)之胺基酸序列，其中X
1
係Y、S或C。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、201、202、208、209、210、216、217、223、224、225、231、232、238、239、245、246、252、253、259、260、266、267、273或274中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段之VL-CDR3，包含根據VL-CDR3共同序列之胺基酸序列。舉例而言，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR3包含根據QQDX
2
X
3
SPX
4
T (SEQ ID NO: 283)之胺基酸序列，其中X
2
係Y或H；X
3
係S、T或I；且X
4
係Y、F或W。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR3包含根據QQDX
2
X
3
SPX
4
(SEQ ID NO: 284)之胺基酸序列，其中X
2
係Y或H；X
3
係S、T或I；且X
4
係Y、F或W。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL-CDR3包含根據DX
2
X
3
SPX
4
(SEQ ID NO: 285)之胺基酸序列，其中X
2
係Y或H；X
3
係S、T或I；且X
4
係Y、F或W。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或抗原結合片段包括根據上述VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。舉例而言，在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之可變輕鏈：VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 27、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、196、197、198、203、204、205、211、212、213、218、219、220、226、227、228、233、234、235、240、241、242、247、248、249、254、255、256、261、262、263、268、269或270中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 28、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、199、200、206、207、214、215、221、222、229、230、236、237、243、244、250、251、257、258、264、256、271或272中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、201、202、208、209、210、216、217、223、224、225、231、232、238、239、245、246、252、253、259、260、266、267、273或274中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之可變輕鏈：VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 196、203、218、226或254中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 199、206或229中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：VL-CDR1，其包含根據KASQSVX
1
NDVA (SEQ ID NO: 275)之胺基酸序列，其中X
1
係S、T或R；VL-CDR2，其包含根據YASNRYT (SEQ ID NO: 279)之胺基酸序列；及VL-CDR3，其包含根據QQDX
2
X
3
SPX
4
T (SEQ ID NO: 283)之胺基酸序列；其中X
2
係Y或H；X
3
係S、T或I；且X
4
係Y、F或W。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：(a)包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 199之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列的VL-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 203之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 206之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VL-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 218之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列的VL-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 226之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 229之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的VL-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 240之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 243之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的VL-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 247之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 250之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列的VL-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 254之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 257之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的VL-CDR3；或(h)包含SEQ ID NO: 261之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 264之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的VL-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：(a) 包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列的VL-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的VL-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的VL-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的VL-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的VL-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的VL-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的VL-CDR3；或(h)包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列的VL-CDR3；(i)包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的VL-CDR3；(j)包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的VL-CDR3；或(k)包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列的VL-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：(a) 包含SEQ ID NO: 197之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 201之胺基酸序列的VL-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 204之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 209之胺基酸序列的VL-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 216之胺基酸序列的VL-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 219之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 224之胺基酸序列的VL-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 227之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 231之胺基酸序列的VL-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 234之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 238之胺基酸序列的VL-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 241之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 245之胺基酸序列的VL-CDR3；或(h)包含SEQ ID NO: 248之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 252之胺基酸序列的VL-CDR3；(i)包含SEQ ID NO: 255之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 259之胺基酸序列的VL-CDR3；(j)包含SEQ ID NO: 262之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 266之胺基酸序列的VL-CDR3；或(k)包含SEQ ID NO: 269之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 273之胺基酸序列的VL-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：(a) 包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 202之胺基酸序列的VL-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 207之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的VL-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 213之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 215之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 217之胺基酸序列的VL-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 220之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 222之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 225之胺基酸序列的VL-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 228之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 230之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 232之胺基酸序列的VL-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 235之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 237之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 239之胺基酸序列的VL-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 242之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 244之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 246之胺基酸序列的VL-CDR3；或(h)包含SEQ ID NO: 249之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 251之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 253之胺基酸序列的VL-CDR3；(i)包含SEQ ID NO: 256之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 258之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 260之胺基酸序列的VL-CDR3；(j)包含SEQ ID NO: 263胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 265之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 267之胺基酸序列的VL-CDR3；或(k)包含SEQ ID NO: 270之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 272之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 274之胺基酸序列的VL-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之重鏈可變區：VH-CDR1、VH-CDR2及/或VH-CDR3，其包含與本文所述之VH-CDR1、VH-CDR2及/或VH-CDR3中之任一者至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列(例如根據Kabat、Chothia、AbM、Contact、延伸或任何其他方案)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 舉例而言，在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 23、35、43、51、59、67、75、83、91、99、106、107、108、115、116、117、124、125、126、133、134、135、142、143、144、151、152、153、160、160、162、169、170、171、178、17、180、187、188或189中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 106、115、124、133、151、169、178或187中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 24、36、44、52、60、68、76、84、92、100、109、110、111、118、119、120、127、128、129、136、137、138、145、146、147、154、155、156、163、164、165、172、173、174、181、182、183、190、191或192中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 25、37、45、53、61、69、77、85、93、101、112、113、114、121、122、123、130、131、132、139、140、141、148、149、150、157、158、159、166、167、168、175、176、177、184、185、186、193、194或195中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 112、121、130、139、157、175、184或193中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含根據上文所述VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3中之任一者的VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之重鏈可變區。舉例而言，在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之重鏈可變區：VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 23、35、43、51、59、67、75、83、91、99、106、107、108、115、116、117、124、125、126、133、134、135、142、143、144、151、152、153、160、160、162、169、170、171、178、17、180、187、188或189中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 24、36、44、52、60、68、76、84、92、100、109、110、111、118、119、120、127、128、129、136、137、138、145、146、147、154、155、156、163、164、165、172、173、174、181、182、183、190、191或192中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 25、37、45、53、61、69、77、85、93、101、112、113、114、121、122、123、130、131、132、139、140、141、148、149、150、157、158、159、166、167、168、175、176、177、184、185、186、193、194或195中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之重鏈可變區：VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 106、115、124、133、151、169、178或187中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 112、121、130、139、157、175、184或193中之任一者胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之重鏈可變區：(a)包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的VH-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的VH-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的VH-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 157之胺基酸序列的VH-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 163之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 169之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列的VH-CDR3；(h)包含SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:181之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 184之胺基酸序列的VH-CDR3；或(i)包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 190之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列的VH-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之重鏈可變區：(a)包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的VH-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的VH-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的VH-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的VH-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的VH-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的VH-CDR3；(h)包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 85之胺基酸序列的VH-CDR3；(i)包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列的VH-CDR3；或(j)包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列的VH-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之重鏈可變區：(a)包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的VH-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列的VH-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列的VH-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列的VH-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 155之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 158之胺基酸序列的VH-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 161之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 167之胺基酸序列的VH-CDR3；(h)包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 173之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 176之胺基酸序列的VH-CDR3；(i)包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列的VH-CDR3；或(j)包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的VH-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之重鏈可變區：(a)包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的VH-CDR3；(b)包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 123之胺基酸序列的VH-CDR3；(c)包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列的VH-CDR3；(e)包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列的VH-CDR3；(f)包含SEQ ID NO: 153之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 159之胺基酸序列的VH-CDR3；(g)包含SEQ ID NO: 162之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 168之胺基酸序列的VH-CDR3；(h)包含SEQ ID NO: 171之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 174之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 177之胺基酸序列的VH-CDR3；(i)包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 183之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 186之胺基酸序列的VH-CDR3；或(j)包含SEQ ID NO: 189之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 192之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列的VH-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含根據上文所述VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3中任一者之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。舉例而言，在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：VL-CDR1，其包含，與選自SEQ ID NO: 27、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、196、197、198、203、204、205、211、212、213、218、219、220、226、227、228、233、234、235、240、241、242、247、248、249、254、255、256、261、262、263、268、269或270中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 28、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、199、200、206、207、214、215、221、222、229、230、236、237、243、244、250、251、257、258、264、256、271或272中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、201、202、208、209、210、216、217、223、224、225、231、232、238、239、245、246、252、253、259、260、266、267、273或274中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及包含以下之重鏈可變區：VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 23、35、43、51、59、67、75、83、91、99、106、107、108、115、116、117、124、125、126、133、134、135、142、143、144、151、152、153、160、160、162、169、170、171、178、17、180、187、188或189中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 24、36、44、52、60、68、76、84、92、100、109、110、111、118、119、120、127、128、129、136、137、138、145、146、147、154、155、156、163、164、165、172、173、174、181、182、183、190、191或192中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 25、37、45、53、61、69、77、85、93、101、112、113、114、121、122、123、130、131、132、139、140、141、148、149、150、157、158、159、166、167、168、175、176、177、184、185、186、193、194或195中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：(i) VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 106、115、124、133、151、169、178或187中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，(ii) VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，及(iii)VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 112、121、130、139、157、175、184、193中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列；及包含以下之輕鏈可變區：(i) VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 196、203、218、226或254中之任一者的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，(ii) VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 199、206或229中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，及(iii) VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在特定實施例中，抗體可包含：a)重鏈可變區，其包含：i) CDR1區，其胺基酸序列與本文所述之所選抗體之重鏈CDR1區一致；ii) CDR2區，其胺基酸序列與所選抗體之重鏈CDR2區一致；及iii) CDR3區，其胺基酸序列與所選抗體之重鏈CDR3區一致；及b)輕鏈可變域，其包含：i) CDR1區，其胺基酸序列與所選抗體之輕鏈CDR1區一致；ii) CDR2區，其胺基酸序列與所選抗體之輕鏈CDR2區一致；及iii) CDR3區，其胺基酸序列與所選抗體之輕鏈CDR3區一致；其中該抗體特異性結合所選標靶(例如哌唑黴素)。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3之輕鏈可變區，該VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3分別包含以SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 102所示之輕鏈可變區內所含之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3的胺基酸序列；及/或包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之重鏈可變區，該VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3分別包含以SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 82；SEQ ID NO: 90及SEQ ID NO: 98所示之重鏈可變區內所含之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，分離之抗體或其抗原結合片段包含有包含以下之輕鏈可變區：與選自SEQ ID NO: 26、30、38、46、54、62、70、78、86、94或102中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，其中該輕鏈可變區包含以SEQ ID NO: 196、203、218、226或254所示之VL-CDR1；以SEQ ID NO: 199、206或229所示之VL-CDR2；及以29、57、73、81、97、208或223所示之VL-CDR3；及/或包含以下之重鏈可變區：與選自SEQ ID NO: 22、34、42、50、58、66、74、82、90或98中之任一者的胺基酸序列至少85一致之胺基酸序列，其中該重鏈可變區包含以106、115、124、133、151、169、178或187所示之VH-CDR1；以SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190所示之VH-CDR2；及以SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223所示之VL-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含(a)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 199及SEQ ID NO: 29所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 112所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(b)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 206及SEQ ID NO: 208所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 112所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(c)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 214及SEQ ID NO: 41所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 118及SEQ ID NO: 121所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(d)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 221及SEQ ID NO: 223所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 127及SEQ ID NO: 130所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(e)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 229及SEQ ID NO: 57所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 139所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(f)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 243及SEQ ID NO: 73所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 154及SEQ ID NO: 157所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(g)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 250及SEQ ID NO: 81所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 163及SEQ ID NO: 166所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(h)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 254、SEQ ID NO: 257及SEQ ID NO: 89所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 172及SEQ ID NO: 175所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；(i)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 264及SEQ ID NO: 97所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 181及SEQ ID NO: 184所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；或(j)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 271及SEQ ID NO: 105所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 190及SEQ ID NO: 193所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含(a)與SEQ ID NO: 26至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 22至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(b)與SEQ ID NO: 30至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 22至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(c)與SEQ ID NO: 38至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 34至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(d)與SEQ ID NO: 46至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 42至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(e)與SEQ ID NO: 54至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 50至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(f)與SEQ ID NO: 62至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 58至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(g)與SEQ ID NO: 70至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 66至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(h)與SEQ ID NO: 78至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 74至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、，99%或100%一致之可變重鏈區；(i)與SEQ ID NO: 86至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 82至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；(j)與SEQ ID NO: 94至少85%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 90至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區；或(k)與SEQ ID NO: 102至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變輕鏈區，及與SEQ ID NO: 98至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之可變重鏈區。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含(a)根據SEQ ID NO: 26之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 22之可變重鏈區；(b)根據SEQ ID NO: 30之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 22之可變重鏈區；(c)根據SEQ ID NO: 38之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 34之可變重鏈區；(d)根據SEQ ID NO: 46之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 42之可變重鏈區；(e)根據SEQ ID NO: 54之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 50之可變重鏈區；(f)根據SEQ ID NO: 62之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 58之可變重鏈區；(g)根據SEQ ID NO: 70之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 66之可變重鏈區；(h)根據SEQ ID NO: 78之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 74之可變重鏈區；(i)根據SEQ ID NO: 86之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 82之可變重鏈區；(j)根據SEQ ID NO: 94之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 90之可變重鏈區；或(k)根據SEQ ID NO: 102之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 98之可變重鏈區。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 在特定實施例中，抗體可包含有包含以下中之任一者的重鏈可變區：a) SEQ ID NO: 23、24及22；b) SEQ ID NO: 35、36及37；c) SEQ ID NO: 43、44及45；d) SEQ ID NO: 51、52及53；e) SEQ ID NO: 59、60及61；f) SEQ ID NO: 67、68、69；g) SEQ ID NO: 75、76及77；h) SEQ ID NO: 83、84及85；i) SEQ ID NO: 91、92及93；j) SEQ ID NO: 99、100及101；k) SEQ ID NO: 22；l) SEQ ID NO: 34；m) SEQ ID NO: 42；n) SEQ ID NO: 50；o) SEQ ID NO: 58；p) SEQ ID NO: 66；q) SEQ ID NO: 74；r) SEQ ID NO: 82；s) SEQ ID NO: 90；或t) SEQ ID NO: 98；及包含以下中之任一者的輕鏈可變區：a) SEQ ID NO: 27、28及29；b) SEQ ID NO: 31、32及33；c) SEQ ID NO: 39、40及41；d) SEQ ID NO: 47、48及49；e) SEQ ID NO: 55、56及57；f) SEQ ID NO: 63、64及65；g) SEQ ID NO: 71、72及73；h) SEQ ID NO: 79、80及81；i) SEQ ID NO: 87、88及89；j) SEQ ID NO: 95、96及97；k) SEQ ID NO: 103、104及105；l) SEQ ID NO: 26；m) SEQ ID NO: 30；n) SEQ ID NO: 38；o) SEQ ID NO: 46；p) SEQ ID NO: 54；q) SEQ ID NO: 62；r) SEQ ID NO: 70；s) SEQ ID NO: 78；t) SEQ ID NO: 86；u) SEQ ID NO: 94；或v) SEQ ID NO:102。 在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段係變異型抗體，其中該變異體包含除VH及VL區之CDR區中之多達8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸取代以外與所選抗體一致之重鏈及輕鏈。就此而言，在所選抗體之CDR區中存在1、2、3、4、5、6、7、8個，或在某些實施例中，9、10、11、12、13、14、15個、更多個胺基酸取代。取代可位於VH及/或VL區中之CDR中。(參見例如Muller, 1998, Structure 6:1153-1167)。舉例而言，在SEQ ID NO: 23-25、27-29、31-33、35-37、39-41、43-45、47-49、51-53、55-57、59-61、63-65、67-69、71-73、75-77、79-81、83-85、87-89、91-93、95-97、99-101或103-104中之任一者的CDR區中存在1、2、3、4、5、6、7、8個，或在某些實施例中，9、10、11、12、13、14、15個、更多個胺基酸取代。 在某些實施例中，哌唑黴素結合抗體包含本文所述抗體之CDR中之一或多者。就此而言，在一些情況下已展示，在仍保留所需特異性結合之同時，可轉移僅抗體之VHCDR3(Barbas等人,
PNAS
(1995) 92: 2529-2533)。亦參見McLane等人,
PNAS
(1995) 92:5214-5218，Barbas等人,
J. Am. Chem. Soc
. (1994) 116:2161-2162。 Marks等人(
Bio/Technology
, 1992, 10:779-783)描述產生抗體可變域譜系之方法，其中指向可變域區域之5'端或鄰近可變域區域之5'端的共同引子結合人類VH基因之第三構架區之共同引子使用，得到缺乏CDR3之VH可變域譜系。Marks等人進一步描述此譜系可如何與特定抗體之CDR3組合。使用類似技術，本發明所述抗體之CDR3源性序列可用缺乏CDR3之VH或VL域譜系改組，且經改組完全VH或VL域與同源VL或VH域組合，得到結合哌唑黴素之抗體或其抗原結合片段。該譜系接著可展示於適合宿主系統中，諸如WO92/01047之噬菌體呈現系統，以使得可選擇適合抗體或其抗原結合片段。譜系可由至少約10
4
個個別成員且高若干數量級組成，例如至約10
6
至10
8
或10
10
或更多個成員。亦藉由Stemmer (Nature, 1994, 370: 389-391)揭示類似改組或組合技術，其描述與β-內醯胺酶基因相關聯之技術，但觀測該方法可用於抗體之產生。 另一替代方案係產生帶有一或多個本文所述本發明實施例之CDR源性序列的新穎VH或VL區，其使用一或多個所選VH及/或VL基因之無規突變誘發以在整個可變域內產生突變來實現。此類技術由Gram等人(1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580)描述，其使用易錯PCR。另一種可使用之方法為VH或VL基因直接突變誘發至CDR區域。此類技術藉由Barbas等人, (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813)及Schier等人(1996, J. Mol. Biol. 263:551-567)所揭示。 在某些實施例中，本文所述抗體之特異性VH及/或VL可用於篩檢互補可變域之文庫以鑑別具有所需特性，諸如對哌唑黴素之親和力增加之抗體。此類方法描述於例如Portolano等人, J. Immunol. (1993) 150:880-887；Clarkson等人, Nature (1991) 352:624-628中。 亦可使用額外方法以混合並匹配CDR，以鑑別具有所需結合活性之抗體，諸如特異性結合於哌唑黴素之抗體。舉例而言：Klimka等人,
British Journal of Cancer
(2000) 83: 252-260，描述使用小鼠VL及保留小鼠VH之CDR3及FR4之人類VH庫的篩檢方法。在獲得抗體之後，相對於人類VL庫篩檢VH，以獲得結合抗原之抗體。Beiboer等人, J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849描述使用整個小鼠重鏈及人類輕鏈庫之篩檢方法。在獲得抗體之後，使一個VL與保留小鼠之CDR3的人類VH庫組合。獲得能夠結合抗原之抗體。Rader等人, PNAS (1998) 95:8910-8915描述與Beiboer等人, 上述類似之方法。 例示性可變輕鏈及重鏈區，以及根據各種描述之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3序列及共同序列提供於以下表3及序列之清單中。
表 3 ： 例示性抗哌唑黴素抗體序列、序列及共同序列
在本文中實施例中之任一些中，抗體進一步包含重鏈恆定域及/或輕鏈恆定域。在一些實施例中，重鏈及/或輕鏈恆定域係鼠類或人類的。在一些實施例中，重鏈恆定域係IgG1、IgG2a、IgG2b或IgM。 「恆定區」或「恆定域」係含有在抗體中比可變區結構域相對更保守之胺基酸序列的抗體重鏈或輕鏈中之結構域。免疫球蛋白之恆定區展示比可變區小之序列多樣性，且負責結合多種天然蛋白質以產生重要生物化學事件。各輕鏈具有單一輕鏈恆定區(light chain constant region，CL)結構域，其係κ或λ類型中之任一者。各重鏈含有一或多個可歸屬於不同類別或同型之重鏈恆定區(heavy chain constant region，CH)結構域。存在五種類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其分別具有命名為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。全長IgA、IgD及IgG同型含有CH1、CH2、CH3及鉸鏈區，而IgE及含有CH1、CH2、CH3及CH4。基於CH序列及功能之相對較小差異，γ及α類別進一步分成子類，例如人類表現以下子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。IgG1抗體可以多個稱為異型之多晶型變異體形式存在(綜述於Jefferis及Lefranc 2009. mAbs 第1卷, 第4期 1-7中)，其中任一者均適合。在人類中，存在五種不同類別之抗體，包括IgA (其包括子類IgA1及IgA2)、IgD、IgE、IgG (其包括子類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)及IgM。此等抗體類別之間的區別特徵係其恆定Fc區，但在V區中可存在微小差異。抗體恆定區可包括Fc部分。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可有所改變，但人類IgG重鏈Fc區通常包括含有CH2及CH3域之區及鉸鏈區，諸如Cys226位，或由Pro230，至其羧基端之胺基酸殘基。 在某些實施例中，具有所需結合特異性之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。在某些實施例中，融合物具有Ig重鏈恆定域，其包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分。某些實施例具有存在於融合物中之至少一者中之含有輕鏈結合所需位點之第一重鏈恆定區(first heavy-chain constant region，CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入至各別表現載體中，且共轉染至適合宿主細胞中。在實施例中，當用於構築中之不等比率之三個多肽鏈提供最佳所需融合抗體產率時，此舉對調節三個多肽片段之相互比例提供較大可撓性。然而，當相等比率之至少兩個多肽鏈之表現產生高產率時或當該等比率對所需鏈組合之產率無明顯作用時，可將兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列插入至單一表現載體中。 本發明之抗體及其抗原結合片段及變異體亦可經修飾以包括例如用於純化或診斷性應用之可偵測標記，例如抗原決定基標籤或標記。此等標記可例如使用連接子或連接基團與抗體結合成為融合蛋白或結合物。存在許多用於製造抗體結合物之此項技術中已知之連接基團，包括例如美國專利第5,208,020號或歐洲專利0 425 235 B1，及Chari等人，Cancer Research 52: 127-131 (1992)中所揭示之該等連接基團。連接基團包括二硫鍵基、硫酯基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團，如以上所述之專利中所揭示。標籤及/或標記之實例可包括(但不限於)FLAG標籤、聚組胺酸標籤(例如6xHis)、cMyc標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶標籤、抗生素蛋白、螢光標記、聚合物粒子、金屬顆粒、半抗原、酶標記、發光標記、電化學發光標記、生物發光標記、放射性同位素或寡核苷酸。 本發明亦包括本文所述之抗體及其抗原結合片段之變異體及片段，其中變異體及片段結合於哌唑黴素。在特定實施例中，與本文所述之抗體或其抗原結合片段中之任一者相比，變異體包含一或多個胺基酸修飾，例如胺基酸取代、缺失或添加。 如本文所用，術語「胺基酸」係指天然產生與非天然產生之胺基酸以及胺基酸類似物及模擬物。天然產生之胺基酸包括蛋白質生物合成期間所用之20種(L)-胺基酸以及其他諸如4-羥基脯胺酸、羥基離胺酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、高半胱胺酸、瓜胺酸及鳥胺酸。非天然產生之胺基酸包括例如(D)-胺基酸、正白胺酸、正纈胺酸、對氟苯丙胺酸、乙硫胺酸及其類似物，其為熟習此項技術者所已知。胺基酸類似物包括天然及非天然產生之胺基酸之經修飾形式。此類修飾可包括例如胺基酸上化學基團及部分之取代或置換或藉由胺基酸衍生。胺基酸模擬物包括例如展現功能類似特性，諸如參比胺基酸之電荷及電荷間距特徵之有機結構。舉例而言，模擬精胺酸(Arg或R)之有機結構將具有位於類似分子空間中且與天然產生之Arg胺基酸之側鏈的e胺基具有相同程度之移動性之正電荷部分。模擬物亦包括受限之結構，以便維持胺基酸或胺基酸官能基之最佳間距及電荷相互作用。熟習此項技術者已知或可確定何種結構構成功能相同之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。 術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」及「糖蛋白」可互換使用且意謂不限於任何特定長度之胺基酸(天然產生、非天然產生或兩者)之聚合物。該術語不排除修飾，諸如豆蔻醯化、硫酸化、糖基化、磷酸化及信號序列之添加或缺失。術語「多肽」或「蛋白質」意謂一或多個胺基酸鏈，其中各鏈包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸，且其中該多肽或蛋白質可包含複數個藉由肽鍵非共價及/或共價連接之鏈(該等鏈具有天然蛋白質(亦即藉由天然產生之且特定言之非重組型之細胞產生的蛋白質)或經基因改造之或重組型細胞的序列)，且包含具有天然蛋白質之胺基酸序列的分子、或具有對一或多個天然序列胺基酸進行之缺失、添加及/或取代的分子。術語「多肽」及「蛋白質」具體而言是涵蓋結合於本發明哌唑黴素之抗體，或自抗哌唑黴素抗體缺失一或多個胺基酸、向抗哌唑黴素抗體中添加一或多個胺基酸及/或取代抗哌唑黴素抗體之一或多個胺基酸的序列。因此，「多肽」或「蛋白質」可包括一個(稱為「單體」)或複數個(稱為「多聚體」)胺基酸鏈。 本文所提及之術語「分離之蛋白質」意謂本發明蛋白質(1)不含至少一些通常與其在自然界中一起發現之其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同來源(例如來自相同物種)之其他蛋白質，(3)可藉由不同物種之細胞表現，(4)已與自然界中與其聯合之至少約50百分比之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分開，(5)不會(藉由共價或非共價相互作用)與在自然界中與「分離之蛋白質」聯合之蛋白質部分聯合，(6)可操作性地與在自然界中未聯合之多肽(藉由共價或非共價相互作用)聯合，或(7)未出現於自然界中。此類分離之蛋白質可由基因體DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼，可為合成來源，或其任何組合。在某些實施例中，分離之蛋白質實質上不含存在於會干擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其他)之其自然環境的蛋白質或多肽或其他污染物。 術語「多肽片段」係指一種多肽，其可為單體或多聚體，其具有天然產生之或以重組方式產生之多肽之胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失取代取代。在某些實施例中，多肽片段可包含長至少5至約500個胺基酸的胺基酸鏈。應瞭解在某些實施例中，片段長至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。尤其適用之多肽片段包括功能性結構域，包括抗體之抗原結合域或片段。在抗哌唑黴素抗體之情況下，適用片段包括(但不限於)：重鏈或輕鏈之CDR區，尤其CDR3區；重鏈或輕鏈之可變區；抗體鏈之一部分或僅其包括兩個CDR之可變區；及其類似物。 肽連接子/間隔子序列亦可用以使多個多肽組分必要時以足以確保彼等多肽摺疊成其二級及/或三級結構之間距分開。可使用在此項技術中熟知之標準技術將此類肽連接子序列併入至融合多肽中。 某些肽間隔子序列可例如基於以下進行選擇：(1)其能呈現可撓性延伸構形；(2)其不能呈現可與第一及第二多肽上之功能抗原決定基相互作用之二級結構；及/或(3)缺少可與多肽功能抗原決定基反應之疏水性或帶電殘基。 在一個說明性實施例中，肽間隔子序列含有例如Gly、Asn及Ser殘基。在間隔子序列中亦可包括諸如Thr及Ala之其他接近中性之胺基酸。 可有效用作間隔子之其他胺基酸序列包括以下中所揭示之該等胺基酸序列：Maratea等人,
Gene 40
:39 46 (1985)；Murphy等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83
:8258 8262 (1986)；美國專利第4,935,233號及美國專利第4,751,180號。 其他說明性間隔子可包括例如Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (Chaudhary等人, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070)及Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (Bird等人, 1988, Science 242:423-426)。 在一些實施例中，當第一及第二多肽具有可用以分開功能域且阻止空間干擾之非必需N端胺基酸區時，需要間隔子序列。兩個編碼序列可在無任何間隔子下或藉由使用由例如五聚體Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重複1至3次構成之可撓性多酶切點接頭直接融合。此類間隔子已藉由插入VH與VL之間用於構築單鏈抗體(scFv)中(Bird等人, 1988, Science 242:423-426；Huston等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5979-5883)。 在某些實施例中，肽間隔子經設計以實現形成單鏈抗體之可變區的兩個β片之間的恰當相互作用。 在某些實施例中，肽間隔子係在1至5個胺基酸之間、在5至10個胺基酸之間、在5至25個胺基酸之間、在5至50個胺基酸之間、在10至25個胺基酸之間、在10至50個胺基酸之間、在10至100個胺基酸之間或胺基酸之任何中間範圍。在一些實施例中，肽間隔子在長度上包含約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個胺基酸。 涵蓋本文所述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。舉例而言，抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當核苷酸變化引入至編碼抗體或其鏈鏈之聚核苷酸中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如發生於抗體之胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終抗體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵(例如結合於哌唑黴素之高親和力)。胺基酸變化可改變抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數量或位置。上文針對本發明之多肽所述之變化及修飾中之任一者可包括在本發明之抗體中。 用以描述兩個或更多個蛋白質序列(或核苷酸序列)之間的序列關係之術語包括「參考序列」、「比較窗」、「序列一致性」、「序列一致性百分比」及「大體一致」。「參考序列」之長度係至少12個，但經常15至18個，且通常至少25個單體單元，該等單體單元包括核苷酸及胺基酸殘基。因為兩個蛋白質序列可各自包含(1)兩個蛋白質之間類似的序列(亦即完全序列之僅一部分)，及(2)兩個蛋白質之間相異的序列，故兩個(或更多個)蛋白質序列之間的序列比較通常藉由比較兩個蛋白質序列在「比較窗」上之序列進行，以識別且比較序列相似之局部區域。「比較窗」係指具有至少6個連續位置之概念區段，通常約50至約100個、更通常約100至約150個，其中將序列與具有相同數目之連續位置之參考序列在兩個序列最佳對準之後相比。比較窗可包含與參考序列相比(其不包含添加或缺失)約20%或更少之添加或缺失(亦即間隙)以最佳比對兩個序列。用於比對比較窗之序列之最佳比對可藉由電腦實施演算法(Wisconsin Genetics套裝軟體版本7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由檢測及由所選各種方法中的任一者產生之最佳比對(亦即在比較窗上產生最高同源性百分比)進行。亦可參考BLAST程式族，如例如Altschul等人, 1997,
Nucl . Acids Res
.25:3389所揭示。序列分析之詳述論述可見於Ausubel等人, 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, 第15章之單元19.3中。 用於比較之多肽或聚核苷酸序列之最佳比對可使用生物資訊軟體之Lasergene套件中之Megalign程式(DNASTAR, Inc., Madison, WI)使用預設參數進行。此程序體現以下參考文獻中描述之若干比對方案：Dayhoff, M.O., (1978), A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships, Dayhoff, M.O. (編)
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:726-730(1983)。 如下進行序列之間的序列相似性或序列一致性之計算(該等術語在本文中可互換使用)。為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，出於最佳比較目的來比對序列(例如可將間隙引入第一及第二胺基酸或核酸序列中之一或兩者中用於最佳比對且為了比較目的可忽略非同源序列)。在某些實施例中，出於比較目的比對之參考序列長度係參考序列長度之至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、60%且甚至更佳至少70%、80%、90%、100%。接著比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。若第一序列中之位置與第二序列中之相應位置由相同胺基酸殘基或核苷酸佔據，則分子在該位置處一致。 兩個序列之間的一致性百分比與該等序列共有的一致位置數目有關，且考慮為了兩個序列之最佳對準而需要引入的間隙數目及各間隙長度。 可使用數學演算法達成序列比較及確定兩個序列之間的一致性百分比。在一個實施例中，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比係使用Needleman及Wunsch (1970,
J . Mol . Biol .
48:444-453)演算法(其已併入GCG套裝軟體(可在http://www.gcg.com獲得)中之GAP程式中)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來確定。在另一實施例中，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比係使用GCG套裝軟體(可在http://www.gcg.com獲得)中之GAP程式，其使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來確定。另一參數集(及應使用者，除非另外說明)係Blossum 62計分矩陣，其使用間隙罰分12、間隙擴展罰分4及讀框轉移間隙罰分5。 兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比可使用E. Meyers及W. Miller (1989,
Cabios
4:11-17)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權數殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4來確定。 代表性多肽之三維結構的確定(例如如本文所提供之變異型哌唑黴素特異性抗體，例如具有如本文所提供之抗原結合片段的抗體蛋白質)可經由常規方法進行，以使得實際上可使所選天然或非天然胺基酸取代、添加、缺失或插入一或多個胺基酸模型化，以達到確定如此來源之結構性變異體是否保留本發明物種之空間填充特性之目的。參見例如Donate等人, 1994
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450:259 (2007)；Raman等人, Science 327:1014-1018 (2010)。可用於此等及相關實施例，諸如用於如本文所提供之哌唑黴素特異性抗體、其抗原結合域之合理設計的電腦演算法之一些其他非限制性實例包括VMD，其係使用3-D圖形及內置指令碼展示、動畫化及分析大生物分子系統之分子觀測程式(參見Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champagne之網站，ks.uiuc.edu/Research/vmd/。許多其他電腦程式在此項技術中已知的且熟習此項技術者可獲得，且其使得可自能量最低構形之空間填充模型(范德華力半徑(van der Waals radii))確定原子尺寸；GRID，其試圖確定不同化學基團之高親和力區，由此增強結合，Monte Carlo檢索，其計算數學比對，及CHARMM (Brooks等人, (1983)
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製品、套組及裝置
在本發明之另一態樣中，提供含有適用於測樣品(諸如生物樣品)中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量或量之物質的製品或套組。在一些實施例中，製品或套組包括適用於容納包含特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的抗體或其抗體片段之組合物之容器。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。製品或套組可包括容器上之標記或藥品說明書。「藥品說明書」係指包括於市售包裝中之說明書，其含有抗體或其抗原結合片段之使用說明書。舉例而言，在一些實施例中，說明書提供執行偵測生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽及/或確定生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之量的分析之說明。在一些實施例中，製品或套組包括確定樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽量含量或量的反應物。此類反應物可包括例如二級抗體、螢光團、緩衝劑或執行諸如ELISA分析之分析的任何其他物質。在一些實施例中，製品或套組包括用於與執行或實施免疫分析有關之哌唑黴素。該等反應物可與抗體或抗原結合片段提供於相同容器中，或提供於不同容器中。 本發明亦提供一種固體支撐物，其包含連接至支撐物之本文所述之抗體或抗原結合片段。抗體或抗原結合片段可藉由任何適合之方法連接至支撐物。包含連接之抗體或抗原結合片段之支撐物可用以例如執行確定樣品(諸如生物樣品)中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的量或含量之分析。固體支撐物可為例如珠粒、管柱、陣列、分析盤、微孔(例如ELISA盤之孔)、棒狀物、過濾器或條帶。用於表面之例示性材料包括聚合物、乳膠、聚苯乙烯、PMMA或二氧化矽。本發明亦提供一種包含固體支撐物之裝置，該固體支撐物其可用於分析。 本發明亦提供一種固體支撐物，其包含結合或連接至該支撐物之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽可藉由任何適合之方法連接至支撐物。包含連接之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的支撐物可例如結合對哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽具有特異性的抗體或抗原結合片段來使用，以便執行確定樣品(諸如生物樣品)中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之量或含量的分析。固體支撐物可為例如珠粒、管柱、陣列、分析盤、微孔(例如ELISA盤之孔)、棒狀物、過濾器或條帶。用於表面之例示性材料包括聚合物、乳膠、聚苯乙烯、PMMA或二氧化矽。本發明亦提供一種包含固體支撐物之裝置，該固體支撐物其可用於分析。
核酸及聚核苷酸
在某些實施例中，本發明進一步提供一種編碼如本文所述之抗體或其抗原結合片段之分離之核酸(例如編碼CDR或VH或VL域之核酸)。在一些實施例中，核酸編碼本文所述之抗體或其抗原結合片段之可變重鏈區。在一些實施例中，核酸編碼本文所述之抗體或其抗原結合片段之可變輕鏈區。核酸包括脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)及核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)。此等及相關實施例可包括編碼結合如本文所述之哌唑黴素的抗體之聚核苷酸。如本文所用之術語「分離之聚核苷酸」係指基因組、cDNA或合成來源或其某一組合之聚核苷酸，根據其來源，該分離之聚核苷酸(1)不會與自然界中所發現分離之聚核苷酸之所有或一部分聚核苷酸聯合，(2)可連接至自然界中不會與其連接之聚核苷酸，或(3)在自然界中不會以較大序列之部分存在。 術語「可操作地連接」意謂該術語所應用之組分呈允許其在適合條件下執行其固有功能之關係。舉例而言，「可操作地連接」於蛋白質編碼序列之轉錄對照序列與蛋白質編碼序列接合以便在與控制序列之轉錄活性相容之條件下實現蛋白編碼序列之表現。 如本文所用之術語「控制序列」係指可影響所接合或可操作地連接之編碼序列的表現、加工或細胞內定位之聚核苷酸序列。此類控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之轉錄控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。在其他特定實施例中，用於真核生物之轉錄控制序列可包括包含一個或複數個轉錄因子識別部位之啟動子、轉錄強化序列、轉錄終止序列及聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，「控制序列」可包括前導序列及/或融合搭配物序列。 如本文中所提及，術語「聚核苷酸」意謂單股或雙股核酸聚合物。在某些實施例中，包含聚核苷酸之核苷酸可為RNA或DNA或任一類型核苷酸之經修飾形式，諸如經修飾信使核糖核酸。該等修飾可包括(但不限於)鹼基修飾，諸如溴尿苷；核糖修飾，諸如阿拉伯糖苷及2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸酯。術語「聚核苷酸」特定包括單股及雙股形式之DNA。 術語「天然產生之核苷酸」包括DNA (A、T、C、G)及RNA (A、U、C、G)核苷酸。術語「經修飾之核苷酸」包括具有經修飾或經取代之糖基及其類似物、鹼基修飾、核糖修飾及核苷酸間鍵聯修飾之核苷酸。熟習此項技術者將理解，經修飾之核苷酸可包含非天然產生之變化，以使得包含一或多個經修飾之核苷酸的聚核苷酸序列亦係非天然產生的。術語「寡核苷酸鍵聯」包括寡核苷酸鍵聯，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷醯胺酸酯及其類似物(參見例如LaPlanche等人, 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081；Stec等人, 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077；Stein等人, 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209；Zon等人, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539；Zon等人, 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, 第87-108頁 (F. Eckstein編), Oxford University Press, Oxford England；Stec等人, 美國專利第5,151,510號；Uhlmann及Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543，其揭示內容為任何目的以全文引用之方式併入本文中)。寡核苷酸可包括使得能夠偵測寡核苷酸或其雜交之可偵測標記。 本發明之實施例亦包括寡核苷酸，以達到偵測、擴增、反義療法或其他目的。為達到此等及相關目的，術語「寡核苷酸」或「寡」或「寡聚物」意欲涵蓋單個「寡核苷酸」以及多個「寡核苷酸」，且係指本發明擴增方法及後續偵測方法中作為反應物之兩個或多個核苷酸、核苷、核鹼基或相關化合物之任何聚合物。寡核苷酸可為DNA及/或RNA及/或其類似物。 術語寡核苷酸不必然表示反應物的任何特定功能，相反地，其一般用以涵蓋本文所述之此類全部的反應物。寡核苷酸可有各種不同功能，例如若其能夠與互補股雜交且可在核酸聚合酶存在下進一步延伸，則其可充當引子，若其含有藉由RNA聚合酶識別之序列且使得可轉錄，則其可提供啟動子，且若經適當定位及/或修飾，則其可用以阻止雜交或阻礙引子延伸。寡核苷酸亦可充當探針。例如在擴增反應中、在偵測擴增反應之擴增產物中，或在反義或RNA干擾應用中，寡核苷酸實際上可為任何長度，僅受其特定功能限制。本文所述之寡核苷酸中之任一者均可用作引子或探針。 如本文所用之術語「引子」係指在例如藉由緩衝劑及溫度界定之適合條件下，在四種不同核苷三磷酸及諸如DNA或RNA聚合酶或逆轉錄酶之用於聚合反應之藥劑存在下，能夠充當模板導引之DNA合成的起始點之單股寡核苷酸。在任何既定情況下，引子之長度視例如引子之預定用途而定，且一般在約15至30個核苷酸之範圍內，但可使用較短及較長之引子。較短引子分子一般需要較冷溫度以與模板形成足夠穩定的雜交複合物。引子無需反映模板之精確序列，但必須足夠互補以與此類模板雜交。引子位點係與引子雜交之模板區域。引子對係一組引子，包括與待擴增之序列之5'端雜交的5'上游引子，及與待擴增之序列的3'端之互補序列雜交的3'下游引子。 如本文所用之術語「探針」包括可藉由特定標靶識別之表面固定或可溶但能夠固定之分子。如本文所用之探針及引子通常包含已知序列之至少10至15個連續核苷酸。為增強特異性，亦可利用較長探針及引子，諸如包含參考序列或其互補序列(例如編碼抗哌唑黴素抗體、其抗原結合片段之核苷酸序列)之至少20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或至少150個核苷酸之探針及引子。探針及引子可顯著長於此等實例，且應理解，可使用此項技術中之知識及包括表、圖及序列表之說明書支持之任何長度。 如熟習此項技術者將理解，聚核苷酸可包括基因組序列、基因組外及編碼質體之序列及表現或可適於表現蛋白質、多肽、肽及其類似物之較小的經工程改造之基因區段。此類區段可自然地分離，或藉由熟習此項技術者以合成方式修飾。 如熟習此項技術者亦將認可，聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA (基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子可包括雜核RNA (heteronuclear RNA，hnRNA)分子，其含有內含子且與DNA分子以一對一方式對應；及信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)分子，其不含內含子。額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於根據本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但未必)連接至其他分子及/或支撐材料。聚核苷酸可包含天然序列或可包含編碼此類序列之變異體或衍生物之序列。 因此，根據此等及相關實施例，本發明亦提供編碼本文所述之抗哌唑黴素抗體之聚核苷酸。在某些實施例中，聚核苷酸之限制條件為包含編碼如本文所述之抗體之聚核苷酸序列中之一些或全部及此類聚核苷酸之互補序列。舉例而言，SEQ ID NO: 1-21包含編碼如本文所述之抗體或其抗體片段中之一些或全部聚核苷酸序列。由於基因密碼之簡併，故應瞭解多種不同聚核苷酸序列可編碼相同多肽，且本發明涵蓋編碼本文所述之多肽中之任一者的全部聚核苷酸。在某些實施例中，本文所述之聚核苷酸中之任一者可經密碼子優化例如以在重組產生期間增強表現或穩定性。 在相關實施例中，本發明亦提供「聚核苷酸變異體」，其可與編碼本文所述之抗哌唑黴素抗體之聚核苷酸序列大體一致。舉例而言，聚核苷酸變異體可為包含使用本文所述方法(例如使用標準參數之BLAST分析，如下所述)與諸如編碼本文所述之抗體之序列的參考聚核苷酸序列相比至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高序列一致性之聚核苷酸。熟習此項技術者將認識到，可適當地調節此等值以確定藉由兩個核苷酸序列編碼之蛋白質的對應一致性，其藉由考量密碼簡併、胺基酸相似性、閱讀框架定位及其類似者得到。 通常，聚核苷酸變異體將含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，以使得相對於本文所特定闡述之由聚核苷酸序列編碼之抗體，由變異型聚核苷酸編碼之抗體之結合親和力大體上不減弱。舉例而言，與諸如編碼本文所述之抗體或其抗原結合片段之序列的參考聚核苷酸序列相比，聚核苷酸變異體可包含至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個取代、添加、缺失或插入。 在一些實施例中，編碼-哌唑黴素抗體之可變輕鏈之聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO: 2、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中之任一者的核苷酸序列或前述中之任一者的互補序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼抗哌唑黴素抗體之可變重鏈的聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO: 1、4、6、8、10、12、14、16、18或20中之任一者的核苷酸序列或前述中之任一者的互補序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之核苷酸序列。 在相關實施例中，本發明提供「聚核苷酸片段」，其可包含或基本上由與編碼如本文所述抗體之序列一致或互補之各種長度之數段連續序列組成。舉例而言，聚核苷酸之限制條件為包含或基本上由編碼本文揭示之抗體或其抗原結合片段之序列之至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500或1000或更多個連續核苷酸以及其間之全部中間長度組成。不難理解，在此情形下，「中間長度」意謂給出值之間的任何長度，諸如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500；500-1,000上之全部整數，及其類似者。如本文所述之聚核苷酸序列可在一或兩個末端由並非存在於天然序列中之額外核苷酸延伸。此額外序列可在編碼本文所述抗體之聚核苷酸之任一端或在編碼本文所述抗體之聚核苷酸之兩端由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸組成。 在一些實施例中，聚核苷酸之限制條件為能夠在中等至高度嚴格之條件下與編碼本文提供之抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸序列、或其片段、或其互補序列，例如寡核苷酸、引子或探針雜交。雜交技術在分子生物學技術中已熟知。出於說明的目的，適用於測試如本文所提供之聚核苷酸與其他聚核苷酸雜交之中等嚴格條件包括用5倍SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液預洗滌；在50℃-60℃、5倍SSC下雜交隔夜；之後在65℃下各用含有0.1% SDS之2倍、0.5倍及0.2倍SSC洗滌兩次，持續20分鐘。熟習此項技術者將理解，雜交之嚴格度可容易諸如藉由改變雜交溶液之鹽含量及/或執行雜交之溫度操作。舉例而言，適合的高度嚴格雜交條件可包括上文所述的該等條件，但改為雜交溫度溫度增加，例如增加至60℃-65℃或65℃-70℃。 在某些實施例中，例如聚核苷酸變異體、片段及雜交序列之上文所描述之聚核苷酸編碼結合哌唑黴素之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，此類聚核苷酸編碼至少約50%、至少約70%，及在某些實施例中，至少約90%結合於哌唑黴素之抗體或抗原結合片段或其CDR，以及本文所特定闡述之抗體序列。在其他實施例中，此類聚核苷酸編碼抗體或抗原結合片段或其CDR，其以比本文所闡述之抗體更大的親和力結合於哌唑黴素，例如其以定量方式至少約105%、106%、107%、108%、109%或110%結合，以及本文所特定闡述之抗體序列。 如本文其他地方所描述，代表性多肽之三維結構的確定(例如如本文所提供之變異型哌唑黴素特異性抗體，例如具有如本文所提供之抗原結合片段的抗體蛋白質)可經由常規方法進行，以使得實際上可使所選天然或非天然胺基酸取代、添加、缺失或插入一或多個胺基酸模型化，以達到確定如此來源之結構性變異體是否保留本發明物種之空間填充特性之目的。熟習此項技術者已知多種電腦程式以確定抗體內之適當胺基酸取代(或編碼胺基酸序列之適當聚核苷酸)，以使得例如維持親和力或實現較佳親和力。 不管編碼序列本身之長度，本文所述之聚核苷酸或其片段可與其他DNA序列，諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、額外限制酶位點、多個選殖位點、其他編碼區段及其類似物組合，使得其總長度可顯著變化。因此預期可採用幾乎任何長度之核酸片段，其中總長度較佳受製備簡易性及預期重組DNA方案中之用途限制。舉例而言，認為總長度約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50個鹼基對長及其類似長度(包括全部中間長度)之說明性聚核苷酸區段適用。 當比較聚核苷酸序列時，若兩個序列中之核苷酸之序列在關於最大對應性進行比對(如下所述)時相同，則兩個序列稱為「一致」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗口比較序列以鑑別且比較局部區之序列相似性來進行。如本文所用之「比較窗」係指至少約20個、通常30至約75個、或40至約50個連續位置之區段，其中兩個序列經最佳比對之後，序列可與相同數目連續位置之參考序列相比較。 用於比較之最佳序列比對可使用生物資訊軟體之Lasergene套件中之Megalign程式(DNASTAR, Inc., Madison, WI)使用預設參數來進行。此程序體現以下參考文獻中描述之若干比對方案：Dayhoff, M.O., (1978), A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships。Dayhoff, M.O. 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25:3389-3402 (1977)及Altschul等人,
J . Mol . Biol .
215:403-410 (1990)中。BLAST及BLAST 2.0可例如與本文所述之參數一起使用，以在兩個或更多個聚核苷酸中確定序列一致性百分比。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。在一個說明性實例中，對於核苷酸序列，可使用參數M (對於匹配殘基對係獎勵分值；始終＞0)及N (對於錯配殘基係罰分；始終＜0)計算累計分值。在以下情況時，字命中在各方向之延伸中斷：累積對準分值自其達成之最大值降低量X；累積分值因一或多種負評分殘基比對之累積而變成0或低於0；或達到任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X決定比對之靈敏度及速度。BLASTP程式(就核苷酸序列而言)使用以下預設：字長(W)係11，且期望值(E)係10，且BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,
Proc . Natl . Acad . Sci . USA
89:10915(1989))使用以下預設：比對(B)係50，期望值(E)係10，M = 5，N = -4，且係雙股之對比。 在某些實施例中，「序列一致性百分比」藉由經至少20個位置之比較窗口比較兩個最佳比對序列確定，其中比較窗口中之聚核苷酸序列部分相比於用於兩個序列之最佳比對的參考序列(其不包含添加或缺失)可包含20%或更小，通常5%至15%，或10%至12%之添加或缺失(亦即，間隙)。百分比如下來計算：確定序列中存在一致核酸鹼基之位置數以得到匹配位置數，匹配位置數除以參考序列中之總位置數(亦即視窗大小)，及結果乘以100，得到序列一致性百分比。 一般熟習此項技術者將瞭解，由於基因密碼之簡併，故存在許多編碼如本文所述之多肽之核苷酸序列。一些此等聚核苷酸與編碼結合於哌唑黴素之抗體的天然或原始聚核苷酸序列之核苷酸序列具有最小序列一致性。然而，本發明明確涵蓋因密碼子使用差異而改變之聚核苷酸。在某些實施例中，特定涵蓋已經密碼子優化以用於哺乳動物表現之序列。 因此，在本發明之另一實施例中，諸如定點突變誘發之突變誘發方法可用於製備本文所述抗體之變異體及/或衍生物。藉由此方法，可經由使編碼多肽序列之基礎聚核苷酸突變誘發，對多肽序列進行特定修飾。此等技術提供一種製備及測試序列變異體之簡單方法，例如藉由引入一或多種核苷酸序列改變至聚核苷酸中而併入以上考慮因素中之一或多者。 定點突變誘發允許經由使用編碼所需突變體之DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數目之相鄰核苷酸產生突變體，以提供具有足夠尺寸及序列複雜性之引子序列，從而在所穿過之缺失連接片段之兩側上形成穩定雙螺旋。突變可用於所選聚核苷酸序列，以改善、更改、減少、改變或者變化聚核苷酸本身之特性，及/或改變編碼多肽之特性、活性、組成、穩定性或一級序列。 在某些實施例中，本發明人涵蓋編碼本文揭示之抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸序列之突變誘發，以改變編碼多肽之一或多個特性，諸如抗體或其抗原結合片段之結合親和力。定點突變誘發之技術為此項技術中熟知，且廣泛用於產生多肽與聚核苷酸之變異體。舉例而言，定點突變誘發通常用於改變DNA分子之特定部分。在此類實施例中，採用長度通常包含約14至約25個核苷酸左右之引子，其中在序列連接片段之兩側的約5至約10個殘基發生改變。 術語「載體」用以指用以將編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子(例如核酸、質體或病毒)。術語「表現載體」係指適用於轉型宿主細胞且含有引導及/或控制插入之異源核酸序列之表現的核酸序列之載體。表現包括(但不限於)諸如轉錄、轉譯及RNA拼接(若存在內含子)之過程。 已知多種表現載體/宿主系統且可用以含有且表現聚核苷酸序列。此等表現載體/宿主系統包括(但不限於)微生物，諸如經重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型之細菌；經酵母表現載體轉型之酵母；經病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；經病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒，CaMV；菸草花葉病毒，TMV)或經細菌表現載體(例如Ti或pBR322質體)轉型之植物細胞系統；或動物細胞系統，包括哺乳動物細胞，且更特定言之人類細胞系統。 如熟習此項技術者將瞭解，定點突變誘發技術通常採用以單股於雙股形式存在之噬菌體載體。適用於定點突變誘發之典型載體包括諸如M13噬菌體之載體。此等噬菌體易商業上獲得且其用途一般為熟習此項技術者所熟知。消除了相關基因由質體轉移至噬菌體之步驟的定點突變誘發中通常亦採用雙股質體。 一般而言，根據本發明之定點突變誘發如下進行：首先獲得單股載體或將其序列內包括編碼所需肽之DNA序列的雙股載體之兩個股熔融分開。一般以合成方式製備帶有所需經突變序列之寡核苷酸引子。此引子接著黏接單股載體，且經受DNA聚合酶，諸如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段，以完成帶有突變之股的合成。因此，形成異雙螺旋，其中一個股編碼原始非突變序列且第二股帶有所需突變。此異雙螺旋載體接著用以轉型適當細胞，諸如大腸桿菌細胞，且選擇包括帶有經突變序列排列之重組載體之純系。 使用定點突變誘發製備所選編碼肽之DNA區段的序列變異體提供一種產生可能適用的物種之方法且不意欲為限制性的，因為存在可獲得肽之序列變異體及編碼其之DNA序列的其他方式。舉例而言，編碼所需肽序列之重組載體可用諸如羥胺之突變劑處理，以獲得序列變異體。關於此等方法及方案之具體細節見於Maloy等人, 1994；Segal, 1976；Prokop及Bajpai, 1991；Kuby, 1994；及Maniatis等人, 1982之教示內容中，其各為彼目的以引用的方式併入本文中。 如本文所用，術語「寡核苷酸定向突變誘發程序」係指模板依賴性過程及載體介導之傳播，其導致特定核酸分子之濃度相對於其初始濃度增加，或可偵測信號(諸如擴增)之濃度增加。如本文所用，術語「寡核苷酸定向突變誘發程序」意欲指涉及引子分子之模板依賴性擴展之方法。術語模板依賴性方法係指RNA或DNA分子之核酸合成，其中核酸之新合成股之序列藉由熟知互補鹼基配對規則定向(參見例如Watson, 1987)。通常，載體介導之方法涉及將核酸片段引入至DNA或RNA載體中、載體之純系擴增及擴增核酸片段之回收。此類方法之實例藉由美國專利第4,237,224號提供，以全文引用的方式特定併入本文中。 可採用產生多肽變異體之另一方法，如美國專利第5,837,458號中所述之循環性序列重組。在此方法中，執行重組及篩檢或選擇之迭代循環以「放出」例如結合親和力增加之個別聚核苷酸變異體。某些實施例亦提供呈質體、載體、轉錄或表現卡匣形式之構築體，其包含至少一種如本文所述之聚核苷酸。 在一些實施例中，將編碼本發明單株抗體之核酸直接引入至宿主細胞中，且在足以誘導編碼之抗體表現之條件下培育細胞。本發明抗體使用熟習此項技術者熟知之標準技術以及本文提供之多肽及核酸序列來製備。多肽序列可用於確定編碼由此所揭示之特定抗體的適當核酸序列。核酸序列可根據熟習此項技術者熟知之標準方法優化以反映用於各種表現系統之特定密碼子「偏好」。 根據某些相關實施例，提供一種重組宿主細胞，其包含一或多種如本文所述之構築體；編碼任何抗體、CDR、VH或VL域、或其抗原結合片段之核酸；及一種產生編碼之產物的方法，該方法包含自其編碼核酸表現。表現宜可藉由在適當條件下培養含有核酸之重組型宿主細胞來實現。在藉由表現產生之後，抗體或其抗原結合片段可使用任何適合之技術分離及/或純化，且接著視需要使用。 如本文所提供之抗體或其抗原結合片段、及編碼核酸分子及載體可以大體上純或均質的形式例如自其天然環境分離及/或純化，或在核酸之情況下，不含或大體上不含與編碼具有所需功能之多肽的序列不同來源之核酸或基因。核酸可包含DNA或RNA，且可整體或部分合成。除非上下文有其他需要，否則提及如本文所闡述之核苷酸序列涵蓋具有指定序列之DNA分子，且涵蓋具有其中U取代T之指定序列的RNA分子。
抗體表現及產生之方法
本發明不意欲關於抗體之來源或其操作方式(例如藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、轉殖基因動物等)加以限制。可使用所屬領域內已知之各種程序產生針對哌唑黴素之多株或單株抗體(參見例如Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E及Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，其以引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段以重組方式表現且產生。 多種不同宿主細胞中用於多肽之選殖及表現之系統為吾人所熟知。適合宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、酵母及桿狀病毒系統。此項技術中可用於表現異源多肽之哺乳動物細胞株包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑素瘤細胞及許多其他細胞。 某些實施例可採用基於大腸桿菌之表現系統(參見例如Structural Genomics Consortium等人,
Nature Methods
. 5:135-146, 2008)。此等及相關實施例可部分或全部依賴於非接合依賴型選殖(LIC)，以產生適合表現載體。在特定實施例中，蛋白質表現可由T7 RNA聚合酶(例如pET載體系列)控制。此等及相關實施例可利用表現宿主菌株BL21 (DE3)，即支持T7介導之表現且缺乏提高靶蛋白穩定性之lon及ompT蛋白酶的BL21之λDE3溶源。亦包括帶有編碼很少用於大腸桿菌之tRNA之質體的表現宿主菌株，諸如ROSETTA
™
(DE3)及Rosetta 2 (DE3)菌株。細胞溶解及樣品處理亦可使用以商標BENZONASE®核酸酶及BUGBUSTER®蛋白質萃取試劑出售之試劑改良。對於細胞培養，自誘導培養基可改良許多表現系統之效率，包括高產量表現系統。此類型培養基(例如OVERNIGHT EXPRESS™自體誘導系統)經由不添加人造誘導劑(諸如IPTG)之代謝轉移而逐漸產生蛋白質表現。特定實施例採用六組胺酸標籤(諸如以商標HIS•TAG®融合物出售之該等標籤)，之後為固定金屬親和性層析(IMAC)純化，或相關技術。然而，在某些態樣中，臨床級蛋白質可在使用或不使用親和力標籤下自大腸桿菌包涵體分離(參見例如Shimp等人,
Protein Expr Purif
. 50:58-67, 2006)。作為另一實例，某些實施例可採用冷震誘導之大腸桿菌高產率生產系統，因為低溫下蛋白質在大腸桿菌中之過度表現會改良其溶解度及穩定性(參見例如Qing等人,
Nature Biotechnology
. 22:877-882, 2004)。 在酵母釀酒酵母中，可使用含有諸如α因子、醇氧化酶及PGH之組成性或誘導性啟動子之多種載體。關於綜述，參見Ausubel等人(同上)及Grant等人,
Methods Enzymol. 153
:516-544 (1987)。亦包括畢赤潘多拉酵母(
Pichia pandoris
)表現系統(參見例如Li等人,
Nature Biotechnology.
24, 210 - 215, 2006；及Hamilton等人,
Science
, 301:1244, 2003)。某些實施例包括經工程改造以選擇性糖基化蛋白質之酵母系統，尤其包括具有人類化N-糖基化路徑酵母(參見例如Hamilton等人,
Science.
313:1441-1443, 2006；Wildt
等人 , Nature Reviews Microbiol.
3:119-28, 2005；及Gerngross等人,
Nature-Biotechnology
. 22:1409 -1414, 2004；美國專利第7,629,163號；第7,326,681號；及第7,029,872號)。僅舉例而言，重組酵母培養基尤其可生長於馮巴赫燒瓶(Fernbach Flask)或15L、50L、100L及200L醱酵器中。 在使用植物表現載體之情況下，編碼多肽之序列之表現可藉由多種啟動子中之任一者驅動。舉例而言，諸如CaMV之35S及19S啟動子之病毒性啟動子可單獨或與來自TMV之ω前導序列組合使用(Takamatsu,
EMBO J. 6
:307-311 (1987))。或者，可使用植物啟動子，諸如RUBISCO小次單元，或熱休克啟動子(Coruzzi等人,
EMBO J. 3
:1671-1680 (1984)；Broglie等人,
Science 224
:838-843 (1984)；及Winter等人,
Results Probl. Cell Differ. 17
:85-105 (1991))。可藉由直接DNA轉型或病原體介導之轉染將此等構築體引入至植物細胞中。此類技術描述於多個通常可獲得之綜述中(參見例如Hobbs, McGraw Hill,
Yearbook of Science and Technology
, 第191-196頁 (1992))。 亦可使用昆蟲系統以表現相關多肽。舉例而言，在一個此類系統中，將苜蓿銀紋夜蛾(
Autographa californica
)細胞核多角體病毒(AcNPV)用作載體以於草地黏蟲(
Spodoptera frugiperda
)細胞或粉紋夜蛾(
Trichoplusia
)幼蟲中表現外源基因。可將編碼多肽之序列選殖至病毒之非必需區，諸如多角體蛋白基因，且置於多角體蛋白啟動子之控制下。成功插入多肽編碼序列將使得多角體蛋白基因無活性且產生缺乏鞘蛋白之重組病毒。接著可將重組病毒用以感染例如可表現相關多肽之草地黏蟲細胞或粉紋夜蛾幼蟲 (Engelhard等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91
:3224-3227 (1994))。亦包括桿狀病毒表現系統，包括利用SF9、SF21及Tni細胞之該等表現系統(參見例如Murphy and Piwnica‐Worms,
Curr Protoc Protein Sci .
第5章:第5.4單元, 2001)。昆蟲系統可提供與哺乳動物系統類似之轉譯後修飾。 在哺乳動物宿主細胞中，一般可利用多種基於病毒之表現系統。舉例而言，在其中腺病毒用作表現載體之情況下，編碼相關多肽之序列可接合至由晚期啟動子及三聯前導序列組成之腺病毒轉錄/轉譯控制複合物。可使用病毒基因組之非必需E1或E3區中之插入以獲得能夠在感染之宿主細胞中表現多肽之活病毒(Logan及Shenk,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81
:3655-3659 (1984))。另外，轉錄增強子，諸如勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)增強子可用於增加哺乳動物宿主細胞中之表現。 適用哺乳動物宿主細胞株之實例包括由SV40轉型之獼猴腎CV1株系(COS-7, ATCC CRL 1651)；人胚腎株系(在懸浮培養液中生長之293或次選殖293細胞, Graham等人,
J . Gen Virol .
36:59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；小鼠睾丸支持細胞(TM4, Mather,
Biol . Reprod
. 23:243-251 (1980))；獼猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠獼猴腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562, ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather等人,
Annals N . Y . Acad . Sci .
383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤株系(Hep G2)。適用哺乳動物宿主細胞株亦包括中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人, PNAS USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如NSO及Sp2/0。關於適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如Yazaki及Wu,
Methods in Molecular Biology
, 第248卷 (B. K.C Lo編, Humana Press, Totowa, N.J., 2003), 第255-268頁。某些哺乳動物細胞表現系統包括基於CHO及HEK293細胞之表現系統。在此項技術中之已知者中，哺乳動物表現系統尤其可利用例如T燒瓶、輥瓶或細胞廠中之附著細胞株；或例如1L及5L旋轉器，5L、14L、40L、100L及200L攪拌槽生物反應器或20/50L及100/200L WAVE生物反應器中之懸浮培養物。 亦包括蛋白質之無細胞表現。此等及相關實施例通常係利用純化RNA聚合酶、核糖體、tRNA及核糖核苷酸；此等反應物係從細胞或從基於細胞之表現系統藉由提取作用而產生。 可選擇或構築含有適當調節序列(包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、強化子序列、標記基因及視需要選用之其他序列)之適當載體。載體可視需要為質體、病毒(例如噬菌體)或噬菌粒。其他細節參見例如Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第2版, Sambrook等人, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。舉例而言，核酸構築體製備、突變誘發、定序、DNA引入細胞中及基因表現以及蛋白質分析中之許多核酸操縱之已知技術及方案詳細地描述於Current Protocols in Molecular Biology, 第二版, Ausubel等人編, John Wiley & Sons, 1992或其後續更新中。 術語「宿主細胞」用以指已引入或能夠引入編碼本文所述抗體中之一或多者的核酸序列，且進一步表現或能夠表現所選相關基因，諸如編碼本文所述抗體之基因的細胞。該術語包括母細胞之子代，而不管子代在形態或遺傳構成方面是否與原始母細胞一致，只要存在所選基因即可。核酸序列之引入可採用任何可獲得之技術。對於真核細胞，適合技術可包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質體介導之轉染及使用反轉錄病毒或例如牛痘之其他病毒進行之轉導，或對於昆蟲細胞，使用桿狀病毒。對於細菌細胞，適合技術可包括氯化鈣轉型、電致孔及使用噬菌體進行之轉染。引入之後可接著引起或實現自核酸之表現，例如藉由在用於基因表現之條件下培養宿主細胞。在一個實施例中，將核酸整合至宿主細胞之基因組(例如染色體)中。整合可根據標準技術藉由包含促進與基因組重組之序列來促進。 術語「轉導」用以指基因通常藉由噬菌體自一個細菌轉移至另一個細菌。「轉導」亦指藉由反轉錄病毒獲取及轉移真核細胞序列。術語「轉染」用以指細胞攝取外來或外源DNA，且當外源DNA已引入細胞膜內時，細胞經「轉染」。許多轉染技術已在此項技術中熟知且揭示於本文中。參見例如Graham等人, 1973, Virology 52:456；Sambrook等人, 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories；Davis等人, 1986, BASIC METHODS 1N MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier；及Chu等人, 1981, Gene 13:197。該等技術可用於將一或多個外源性DNA部分引入至適合宿主細胞中。 如本文所用之術語「轉型」係指細胞遺傳特徵之變化，且當細胞經修飾以含有新穎DNA時，細胞經轉型。舉例而言，在細胞自其天然狀態發生遺傳修飾之情況下，細胞經轉型。在轉染或轉導之後，轉型DNA可藉由物理整合至細胞之染色體中而與細胞之DNA重組，或可以游離型元件形式短暫維持而不複製，或可以質體形式獨立複製。當DNA由細胞分裂而複製時，細胞視為已穩定轉型。術語「天然產生」或「天然」在與諸如核酸分子、多肽、宿主細胞及其類似物之生物學物質結合使用時，係指物質存在於自然界中且不經人為操作。類似地，如本文中所用之「非天然產生」或「非天然」係指該物質不存在於自然界中或已經過人為結構修飾或合成。 在本發明之另一實施例中，抗哌唑黴素抗體源自兔單株抗體，且詳言之使用RabMAb®技術產生。此等抗體因其需要最小序列修飾而為有利的，由此有助於在使用突變譜系引導(mutational lineage guided，MLG)之人類化技術人類化之後保持功能特性(參見例如美國專利第7,462,697號)。因此，製造本發明之抗哌唑黴素抗體之說明性方法包括例如美國專利第5,675,063號及第7,429,487號中所述之RabMab®兔單株抗體技術。就此而言，在某些實施例中，本發明之抗哌唑黴素抗體在兔中產生。在特定實施例中，使用能夠與兔脾細胞融合之來源於兔之永生B淋巴細胞產生產生抗體之雜交細胞。永生B淋巴細胞不以可偵測方式表現內源性免疫球蛋白重鏈，且在某些實施例中，可含有改變之免疫球蛋白重鏈編碼基因。 在一些實施例中，抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段使用融合瘤方法產生，諸如由Kohler及Milstein, Nature, 256:495 (1975)描述之該等融合瘤方法。在融合瘤方法中，小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物用免疫劑免疫以產生淋巴細胞，其產生或能夠產生將特異性結合於免疫劑之抗體。或者，淋巴細胞可在活體外免疫。 免疫劑通常將包括抗原、其片段或其融合構築體。通常對於試管內免疫接種而言，若需要人類來源之細胞，則使用末梢血液淋巴球，或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。淋巴球接著使用適合融合劑(諸如聚乙二醇)與永生化細胞株融合以形成融合瘤細胞(Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice
, Academic Press, (1986) 第59-103頁)。永生化細胞株通常係經轉型哺乳動物細胞，尤其嚙齒動物、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。融合瘤細胞可在含有一或多種抑制未融合、永生化細胞之生長或存活之物質的適合培養基中培養。舉例而言，若親本細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(「HAT培養基」)，該等物質會阻止缺乏HGPRT之細胞生長。 在一些實施例中，所用永生化細胞株高效融合，支撐藉由所選產抗體細胞穩定且高表現量表現抗體，且對諸如HAT培養基之培養基敏感。永生化細胞株之實例係鼠類骨髓瘤細胞株，其可例如獲自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California及美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株。(參見Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) 第51-63頁))。 接著可針對單株抗體之存在來分析其中培養融合瘤細胞之培養基，該等單株抗體係針對抗原。由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性可藉由免疫沈澱或藉由試管內結合分析來確定，諸如酶聯免疫吸附分析(enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA)。該等技術及分析在此項技術中已知。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson及Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)之Scatchard分析確定。在某些實施例中，鑑別之抗體對標靶抗原，尤其對哌唑黴素具有高度特異性及高結合親和力。 在鑑別所需融合瘤細胞之後，純系可藉由限制稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長。(參見Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice
, Academic Press, (1986) 第59-103頁)。適用於此目的之培養基包括例如杜爾貝科氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)及RPMI-1640培養基。或者，融合瘤細胞可以腹水形式活體內生長於哺乳動物中。 此等剛剛描述之技術本身在此項技術中公知。然而，熟習此項技術者將能夠使用此類技術使用此項技術中之常規方法以獲得根據本文所述之本發明之若干實施例之抗體或其抗原結合片段。
使用方法
本發明提供與使用本文所述之抗體及其抗原結合片段有關之方法，其係用於免疫分析中以偵測生物樣品中之哌唑黴素。某些實施例包括治療細菌感染，包括感染革蘭氏陰性細菌、多重抗藥細菌及泌尿道感染之方法。 本文揭示之方法之實施例係針對確定生物樣品中哌唑黴素之含量，其包含：(i)使樣品與本文所述之分離之抗體或其抗原結合片段中之任一者接觸，及(ii)藉由免疫分析偵測結合於哌唑黴素之抗體存在或不存在或量，由此確定樣品中哌唑黴素之存在或不存在或量。樣品與分離之抗體或其抗原結合片段接觸可發生於活體外。 如本文所用，「生物樣品」係指獲自個體，例如哺乳動物，諸如人類之樣品。此等樣品可包括(但不限於)細胞、組織樣品及體液(包括(但不限於)黏液、血液、血漿、血清、尿液、唾液、痰液及精液)。在某些實施例中，樣品係液體基質樣品，包括(但不限於)血液、血漿、血清、尿液或痰液。樣品可藉由治療或測試下之個體提供。或者，樣品可藉由醫師根據此項技術中之常規實踐獲得。在某些實施例中，樣品係獲自已投與哌唑黴素之個體。 如本文所用，「免疫分析」係指經由使用抗體或其抗原結合片段，例如本文所述之哌唑黴素特異性抗體量測溶液中分析物，例如待偵測化合物之存在或濃度之生物化學測試。在一些實施例中，分析物係抗原。在其他實施例中，分析物係哌唑黴素。某些免疫分析採用使用抗原特異性抗體，例如用可偵測標記進行標記之抗哌唑黴素抗體，或「初級抗體」來直接偵測分析物或抗原之存在或濃度。某些免疫分析利用未標記之抗原特異性抗體，且需要應用一或多種額外抗體或「二級抗體」來偵測初級抗體之存在，且因此間接偵測分析物或抗原之存在或濃度。當執行免疫分析時，對照通常包括單獨含有抗體或其抗原結合片段(亦即在不存在抗原下)之反應孔/管，其中在不存在抗原下藉由抗體或其抗原結合片段得到之活性量(例如與孔非特異性結合)視為本底。由此使得可精確評估抗原特異性結合。免疫分析之非限制性實例包括直接酶聯免疫吸附分析(ELISA)、競爭性ELISA、選殖酶供體免疫分析(CEIDA)、即時免疫定量聚合酶鏈式反應(immunoquantitative polymerase chain reaction，iqPCR)、側向流測試、磁性免疫分析、放射免疫分析、圍繞光纖免疫分析(surround optical fiber immunoassay，SOFIA)及酶倍增免疫分析技術(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT)及濁度分析。 如本文所用之「可偵測標記」係指可產生指示樣品中標記之存在及/或濃度之可偵測(目測、以電子方式或以其他方式)信號之分子或物質。在一些實施例中，抗原特異性抗體或其抗原結合片段與可偵測標記有關。可偵測標記之非限制性實例包括螢光標記、聚合物粒子、金屬顆粒、半抗原、酶標記、發光標記、電化學發光標記、生物發光標記、放射性同位素、寡核苷酸及奈米粒子。 螢光標記之實例包括5-(及6)-羧基螢光素、5-或6-羧基螢光素、6-(螢光素)-5-(及6)-甲醯胺基己酸、異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明及染料(諸如Cy2、Cy3及Cy5)、視情況經取代之香豆素(包括AMCA)、PerCP、藻膽蛋白(包括R-藻紅素(R-phycoerythrin，RPE)及別藻紅素(allophycoerythrin，APC))、德克薩斯紅(Texas Red)、普林斯頓紅(Princeton Red)、綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其類似物、及R-藻紅素或別藻紅素之結合物、無機螢光標記，諸如基於半導體材料之粒子，如經塗佈CdSe奈米晶。 聚合粒子標記之實例包括可嵌入有螢光染料之聚苯乙烯、PMMA或二氧化矽之微型粒子或乳膠粒子，或含有染料、酶或受質之聚合物微胞或膠囊。 金屬粒子標記之實例包括金粒子及經塗佈之金粒子，其可藉由銀染色劑轉化。半抗原之實例包括二硝基苯基(dinitrophenyl，DNP)、異硫氰酸螢光素(FITC)、生物素及地高辛(digoxigenin)。酶促標記之實例包括辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP或AP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，GAL)、葡萄糖-6-磷酸鹽去氫酶、β-N-乙醯基葡糖醯胺酶(β-N-acetylglucosamimidase)、β-葡糖苷酸酶、轉化酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲螢光素酶及葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GO)。常用於辣根過氧化酶之受質的實例包括3,3'-二胺基聯苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB)、鎳增強二胺基聯苯胺、3-胺基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)、二氫氯化聯苯胺(Benzidine dihydrochloride，BDHC)、漢克耶茨試劑(Hanker-Yates reagent，HYR)、靛烷藍(Indophane blue，IB)、四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)、4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphtol，CN)、α-萘酚派洛寧(.alpha.-naphtol pyronin，α-NP)、鄰二甲氧苯胺(o-dianisidine，OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate，BCIP)、氮藍四唑(Nitro blue tetrazolium，NBT)、氯化2-(對碘苯基)-3-對硝基苯基-5-苯基四唑鎓(2-(p-iodophenyl)-3-p-nitropheny- l-5-phenyl tetrazolium chloride，INT)、四硝基藍四唑鎓(tetranitro blue tetrazolium，TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-半乳糖苷/鐵氰化鐵(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactoside/ferro-ferricyanide，BCIG/FF)。 常用於鹼性磷酸酶之受質的實例包括萘酚-AS-B1-磷酸鹽/堅牢紅TR (Naphthol-AS-B 1-phosphate/fast red，NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/堅牢紅TR (Naphthol-AS-MX-phosphate/fast red TR，NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸鹽/堅牢紅TR (Naphthol-AS-B1-phosphate/- fast red TR，NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/堅牢紅TR (Naphthol-AS-MX-phosphate/fast red TR，NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸鹽/新穎品紅(Naphthol-AS-B1-phosphate/new fuschin，NABP/NF)、溴氯吲哚基 磷酸鹽/硝基藍四唑鎓(bromochloroindolyl phosphate/nitroblue tetrazolium，BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-哌喃半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-d-galactopyranoside，BCIG)。 發光標記之實例包括魯米諾(luminol)、異魯米諾、吖錠酯、1,2-二氧雜環丁烷及吡啶并噠嗪。電化學發光標記之實例包括釕衍生物。放射性標記之實例包括碘、鈷、硒、氚、碳、硫及磷之放射性同位素。 奈米粒子之尺寸在1-1000 nm之範圍內且包括不同化學結構，諸如金及銀粒子及量子點。當用成角度之入射白光照射時，40-120 nm範圍內之銀或金奈米粒子將散射高強度之單色光。散射光之波長取決於粒子尺寸。四至五個不同粒子緊密鄰近將各自散射單色光，當重疊時其將得到特定特有顏色。粒子藉由諸如Genicon Sciences (Carlsbad, CA)之公司製造。衍生之銀或金粒子可連接至廣泛的分子，包括蛋白質、抗體小分子、受體配位體及核酸。 奈米粒子之其他實例包括量子點。量子點係直徑1-5 nm之螢光晶體，其可藉由大波長範圍上之光激發。在藉由具有適當波長之光激發時，此等晶體發射光，諸如單色光，該光之波長取決於晶體之化學組成及尺寸。諸如CdSe、ZnSe、InP或InAs之量子點具有特有光學特性；此等及類似量子點係獲自多種市售來源(例如NN-Labs, Fayetteville, AR；Ocean Nanotech, Fayetteville, AR；Nanoco Technologies, Manchester, UK；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。 粒子之幾十個類別可根據量子點晶體之尺寸類別數產生。晶體之尺寸類別如下產生：1)藉由嚴格控制晶體形成參數以產生各所需尺寸類別之粒子，或2)藉由在不嚴格控制之晶體形成參數下產生各批晶體，之後根據所需尺寸及/或發射波長分選。量子點嵌入半導體發光/偵測裝置之固有矽磊晶層內之參考文獻之兩個實例係Chapple Sokol等人之美國專利第5,293,050號及第5,354,707號。 可偵測標記可與本文所述之抗體或特異性結合於相關生物標記(例如抗體、核酸探針或聚合物)之任何其他分子連接。此外，一般熟習此項技術者將瞭解，可偵測標記亦可與第二、及/或第三、及/或第四、及/或第五結合劑或抗體等結合。此外，熟習此項技術者將瞭解，用以表徵相關生物標記之各額外結合劑或抗體可充當信號放大步驟。在某些實施例中，生物標記可使用例如光顯微術、螢光顯微術、電子顯微術目測偵測，其中可偵測物質係例如染料、膠態金粒子、發光試劑。結合於生物標記之可目測偵測之物質亦可使用分光光度計偵測。在可偵測物質係放射性同位素之情況下，偵測可藉由自動放射照像術目測實現，或使用閃爍計數器以非目測方式實現。參見例如 Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.)；Methods in Molecular Biology, 第80 卷1998, John D. Pound (編.) (Humana Press, Totowa, N.J.)。在某些實施例中，抗哌唑黴素抗體或其抗原結合片段結合於可偵測標記，該可偵測標記在結合於例如哌唑黴素之分析物時，發射經改變或不同的信號(例如增加或降低)。 在一些實施例中，免疫分析包括結合於例如ELISA盤之固體支撐物之哌唑黴素。在此類實施例中，本文所述之抗哌唑黴素抗體中之任一者可在溶液中與包含哌唑黴素之樣品接觸。在此實例中，在與包含哌唑黴素之樣品接觸之後保持未結合之抗哌唑黴素抗體之量與樣品中哌唑黴素之濃度成反比。當將此樣品/抗哌唑黴素抗體溶液應用於結合哌唑黴素之固體支撐物時，未結合抗哌唑黴素抗體自由結合於貼附支撐物之哌唑黴素。在其他實施例中，抗哌唑黴素抗體用本文所述之可偵測標記來標記。可偵測標記之量測告知結合於貼附於固體支撐物之哌唑黴素的抗哌唑黴素抗體之量。在上述「競爭性」免疫分析中，偵測之抗哌唑黴素之含量與樣品中存在之哌唑黴素之量間接相關。在額外實施例中，抗哌唑黴素抗體不用可偵測標記來標記。在此類實施例中，用可偵測標記來標記之二級抗體可以用以量測結合於固體支撐物之抗哌唑黴素抗體之量。 在額外實施例中，抗哌唑黴素抗體中之任一者結合於固體支撐物，ELISA盤。將包含哌唑黴素之樣品應用於固體支撐物使得哌唑黴素結合於貼附抗體。結合於抗-哌唑黴素抗體之哌唑黴素之量接著藉由應用本文所述之抗哌唑黴素抗體來量測。額外抗哌唑黴素抗體可用本文所述之可偵測標記來標記。可偵測標記之量測告知結合於抗哌唑黴素抗體之哌唑黴素之量。在上述「直接」免疫分析中，量測之可偵測標記之含量與結合於額外抗哌唑黴素抗體之哌唑黴素之量正相關。在額外實施例中，抗哌唑黴素抗體不用可偵測標記來標記。在此類實施例中，用可偵測標記來標記之二級抗體可以用以量測結合於固體支撐物之抗哌唑黴素抗體之量。 某些實施例包含確定樣品中哌唑黴素之含量，其中該樣品係獲自投與哌唑黴素之個體。如本文所用，「個體」包括可獲取樣品之任何哺乳動物個體。在某些實施例中，哺乳動物係人類。本發明之方法亦可用於治療非人類靈長類動物(例如猴、狒狒及黑猩猩)、小鼠、大鼠、牛、馬、貓、狗、豬、兔、山羊、鹿、綿羊、雪貂、沙鼠、天竺鼠、倉鼠、鳥類(例如雞、火雞及鴨)、魚及爬行動物。 在一些實施例中，確定樣品(諸如生物樣品)中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之含量或量的方法包含(i)使樣品與特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的分離之抗體或抗原結合片段接觸，及(ii)偵測結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的抗體存在或不存在或量，由此確定樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量。該方法可包含例如免疫分析，諸如ELISA、競爭性ELISA、濁度分析或選殖酶供體免疫分析(CEDIA)。生物樣品可為液體樣品，諸如血清、血漿、血液、尿液、唾液或痰液。在一些實施例中，生物樣品係獲自已投與哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的個體(例如人類患者)。樣品可獲自已投與哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之後一段時間後之個體。 獲自已投與哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的個體之生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的確定含量可以用以判定是否應向個體投與後續劑量，或應投與多大之後續劑量。舉例而言，在一些實施例中，選擇投與後續劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的個體，其中，若生物樣品中之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽低於或等於預定截止值，則選擇該個體來接受後續劑量；或若生物樣品中之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽高於預定截止值，則選擇該個體不接受後續劑量。在一些實施例中，該方法包含選擇後續劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽投與個體，其中若生物樣品中之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽低於或等於預定截止值，則選擇該個體來接受等於或大於先前劑量之後續劑量；或若生物樣品中之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽高於預定截止值，則選擇該個體來接受小於先前劑量之後續劑量。截止值可為個體血清中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之生理含量或可與其相關。預期患者血清中哌唑黴素濃度之臨床範圍在0.5 μg/mL與40 μg/ml之間。因此，在一些實施例中，截止值係約40 μg/mL或更小(諸如約35 μg/mL或更小、約30 μg/mL或更小、約25 μg/mL或更小、約20 μg/mL或更小、約15 μg/mL或更小、約10 μg/mL或更小、約5 μg/mL或更小、約1 μg/mL或更小或約0.5 μg/mL或更小。在一些實施例中，該方法包含向個體投與後續劑量。 在一些實施例中，哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的初始或後續劑量係約1 mg/kg或更大(諸如約2 mg/kg或更大、約4 mg/kg或更大、約6 mg/kg或更大、約8 mg/kg或更大、約10 mg/kg或更大、約12 mg/kg或更大、約15 mg/kg或更大、約20 mg/kg或更大或約25 mg/kg或更大)。在一些實施例中，哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的初始或後續劑量係約50 mg/kg或更小(諸如約25 mg/kg或更小、約20 mg/kg或更小、約15 mg/kg或更小、約12 mg/kg或更小、約10 mg/kg或更小、約8 mg/kg或更小、約6 mg/kg或更小、約4 mg/kg或更小或約2 mg/kg或更小)。在一些實施例中，後續劑量係初始劑量之約1.25倍或更大(諸如約1.5倍或更大、約1.75倍或更大、約2倍或更大、約2.5倍或更大、約3倍或更大、約3.5倍或更大、約4倍或更大、約4.5倍或更大或約5倍或更大)。在一些實施例中，後續劑量係初始劑量之約1倍至約5倍之間(諸如約1倍至約4.5倍之間、約1倍至約4倍之間、約1倍至約3.5倍之間、約1倍至約3倍之間、約1倍至約2.5倍之間、約1倍至約2倍之間、約1倍至約1.75倍之間、約1倍至約1.5倍之間或約1倍至約1.25倍之間)。在一些實施例中，後續劑量小於初始劑量之1倍(諸如初始劑量之約90%或更小、約80%或更小、約70%或更小、約60%或更小、約50%或更小、約40%或更小、約30%或更小、約20%或更小、或約10%或更小倍)。 一些實施例係針對治療有需要個體之細菌感染之方法，其包含(i)向個體提供有效量之哌唑黴素，(ii)等待第一時間段，及(iii)經由使用免疫分析確定自個體收集之生物樣品中哌唑黴素之含量。其他實施例包含(iv)若哌唑黴素之含量低於規定截止值，則向個體提供額外哌唑黴素，或若哌唑黴素之含量高於規定截止值，則不向個體提供額外哌唑黴素，或提供降低量之哌唑黴素。該方法例如在個體用哌唑黴素治療之過程中可重複一次或更多次。本發明之方法可用於監測個體用哌唑黴素治療之過程中之哌唑黴素含量，從而調節提供至個體之哌唑黴素之量以維持個體中哌唑黴素之所需含量。預期患者血清中哌唑黴素濃度之臨床範圍在0.5 μg/mL與40 μg/ml之間。 在一些實施例中，治療個體之細菌感染之方法包含(i)向個體投與一定劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽；及(ii)確定獲自個體之生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之含量，例如如上文所論述。在一些實施例中，在投與該劑量之後確定哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量。在一些實施例中，在投與該劑量之前確定哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之含量。舉例而言，哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量可包括(i)使樣品與特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的分離之抗體或抗原結合片段接觸；及(ii)偵測結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的抗體存在或不存在或量，由此確定樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量。該方法可包含例如免疫分析，諸如ELISA、競爭性ELISA、濁度分析或選殖酶供體免疫分析(CEDIA)。生物樣品可為液體樣品，諸如血清、血漿、血液、尿液、唾液或痰液。在一些實施例中，該方法包括在投與該劑量與確定獲自個體之生物樣品中之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽含量之間等待一段時間。 若哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的確定含量低於或等於預定截止值，則治療個體之方法可視情況包括向個體投與後續劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，該方法包括向個體投與後續劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽，其中後續劑量係(a)若獲自個體之生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的確定含量低於或等於預定截止值，則大於先前劑量；或(b)若生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的確定含量高於預定截止值，則小於先前劑量。在一些實施例中，哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的初始或後續劑量係約1 mg/kg或更大(諸如約2 mg/kg或更大、約4 mg/kg或更大、約6 mg/kg或更大、約8 mg/kg或更大、約10 mg/kg或更大、約12 mg/kg或更大、約15 mg/kg或更大、約20 mg/kg或更大或約25 mg/kg或更大)。在一些實施例中，哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的初始或後續劑量係約50 mg/kg或更小(諸如約25 mg/kg或更小、約20 mg/kg或更小、約15 mg/kg或更小、約12 mg/kg或更小、約10 mg/kg或更小、約8 mg/kg或更小、約6 mg/kg或更小、約4 mg/kg或更小或約2 mg/kg或更小)。在一些實施例中，後續劑量係初始劑量之約1.25倍或更大(諸如約1.5倍或更大、約1.75倍或更大、約2倍或更大、約2.5倍或更大、約3倍或更大、約3.5倍或更大、約4倍或更大、約4.5倍或更大或約5倍或更大)。在一些實施例中，後續劑量係初始劑量之約1倍至約5倍之間(諸如約1倍至約4.5倍之間、約1倍至約4倍之間、約1倍至約3.5倍之間、約1倍至約3倍之間、約1倍至約2.5倍之間、約1倍至約2倍之間、約1倍至約1.75倍之間、約1倍至約1.5倍之間或約1倍至約1.25倍之間)。在一些實施例中，後續劑量小於初始劑量之1倍(諸如初始劑量之約90%或更小、約80%或更小、約70%或更小、約60%或更小、約50%或更小、約40%或更小、約30%或更小、約20%或更小、或約10%或更小倍)。 如本文所用，「有效量」係指獲得特定生物學結果所需之哌唑黴素之量。此類結果可包括(但不限於)細菌負載量降低。細菌負載量可藉由此項技術中已知之技術(例如每單元樣品之菌落形成單位(colony forming unit，CFU))來量測。細菌負載量降低可界定為在哌唑黴素治療之後細菌負載量比治療起始之前所存在之細菌負載量降低至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。有效量將根據化合物(例如哌唑黴素)之代謝穩定性及作用時長及個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食以及感染之嚴重程度及性質有所改變。 「時段」係指在用哌唑黴素進行初始或先前治療之後經過之時間的量(例如第一時間段)。第一時間段可為至少24小時、至少48小時、至少72小時、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少14天或至少21天。 「提供額外哌唑黴素」可包含提供等於哌唑黴素之初始劑量的額外哌唑黴素。如本文所用，「劑量」係指所投與之藥物的量，例如所投與之哌唑黴素的量。在其他實施例中，在初始哌唑黴素投與之後投與額外劑量等於哌唑黴素之初始劑量的哌唑黴素至少一次。在其他實施例中，在初始哌唑黴素投與之後投與額外劑量等於哌唑黴素之初始劑量的哌唑黴素至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15次或更多次。在一些實施例中，「提供額外哌唑黴素」可包含提供額外劑量大於哌唑黴素之初始劑量的哌唑黴素。在其他實施例中，在初始哌唑黴素投與之後投與額外劑量大於哌唑黴素之初始劑量的哌唑黴素至少一次。在其他實施例中，在初始哌唑黴素投與之後投與額外劑量大於哌唑黴素之初始劑量的哌唑黴素至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15次或更多次。在上述實施例中之任一者中，可在各自、一些或全部投與額外哌唑黴素之前或之後偵測哌唑黴素之存在或不存在或量。 如本文所用，「不提供額外哌唑黴素」可包含停止哌唑黴素投與。在一些實施例中，「提供額外哌唑黴素」可包含提供小於哌唑黴素之初始或先前劑量的劑量之哌唑黴素。在其他實施例中，投與劑量小於哌唑黴素之初始劑量的哌唑黴素至少一次。在其他實施例中，在初始哌唑黴素投與之後投與劑量小於哌唑黴素之初始劑量的哌唑黴素至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15次或更多次。在上述實施例中之任一者中，可在各自、一些或全部投與哌唑黴素之前或之後偵測哌唑黴素之存在或不存在或量。 如本文所用，「截止值」係指用以確定提供額外哌唑黴素或不提供額外哌唑黴素之值。截止值在性質上可為二進制的，例如「一」及「零」，其中「一」指示生物樣品存在哌唑黴素，且其中「零」指示生物樣品不存在(或量低於偵測限)哌唑黴素。截止值可為濃度，例如μg/L。在其他實施例中，若哌唑黴素之確定含量低於或等於截止值，則向個體投與額外哌唑黴素，持續第二時間段。在一些實施例中，若哌唑黴素之確定含量高於截止值，則不向個體投與額外哌唑黴素，持續第二時間段。人類血漿中使用於哌唑黴素濃度之範圍係0.5-40 μg/ml。舉例而言，在一些實施例中，在人類血漿中截止值係0.5 μg/mL之哌唑黴素，低於其，投與額外哌唑黴素。在一些實施例中，在人類血漿中截止值係40 μg/mL之哌唑黴素，高於其，不投與額外哌唑黴素。人類血漿中適用於哌唑黴素濃度之範圍可根據包括個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食以及感染之嚴重程度及性質之因子而變窄。 本文所述之某些方法係針對抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段，其係用於治療細菌感染。在特定實施例中，細菌係革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陰性細菌在此項技術中已知，且係指不保留用於細菌分化之革蘭氏染色方法中之結晶紫染色的細菌。革蘭氏陰性細菌之特徵進一步在於含有脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)之外部膜。革蘭氏陰性細菌之非限制性實例包括綠膿桿菌(
Pseudomonas aeruginosa
)、寡養單胞菌(
Stenotrophomonas maltophila
)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(
Burkholderia cepacia
)、木糖氧化產鹼桿菌(
Alcaligenes xylosoxidans
)、嗜血桿菌(
Haemophilus
)、弗朗西斯菌(
Franciscellaceae
)(例如土拉熱弗朗西斯菌(
Franciscella tularensis
))、奈瑟氏菌屬(
Neisseria species
)、腸內菌(
Enterobacteriaceae
)，諸如沙雷菌(
Serratia
)、變形桿菌(
Proteus
)、克雷伯氏菌(
Klebsiella
)、腸桿菌(
Enterobacter
)、檸檬酸桿菌(
Citrobacter
)、沙門氏菌(
Salmonella
)、普羅威登斯菌(
Providencia
)、耶爾森菌(
Yersinia
)(例如鼠疫耶爾森菌(
Yersinia pestis
))、摩根氏菌(
Morganella
)、西地西菌(
Cedecea
)、愛德華氏菌屬(
Edwardsiella species
)及大腸桿菌(
Escherichia coli
，
E . coli
)。其他實施例係針對抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段，其係用於治療「多重抗藥」或「MDR」細菌，尤其革蘭氏陰性MDR細菌。MDR細菌係指已獲取對三個或更多個抗微生物類別中之至少一種藥劑(例如抗生素)之抗性的細菌。多重抗藥出如下現於細菌中：使基因積聚於抗性質體或轉座子上，其中各基因編碼對特定藥劑之抗性，及/或使用多藥流出泵，各泵可泵出多於一種藥物類型。臨床相關之革蘭氏陰性MDR細菌之非限制性實例包括抗碳青黴烯類腸內菌(carbapenem-resistant
Enterobacteriaceae
，CRE)、產生碳青黴烯酶之肺炎克雷伯氏桿菌(
Klebsiella pneumoniae
)、MDR大腸桿菌、綠膿桿菌、不動桿菌屬(
Acinetobacter
species)(包括鮑氏不動桿菌(
Acinetobacter baumannii
)、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西斯菌及綠膿桿菌。 其他實施例意欲針對抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段之用途，其係用於治療「極端耐藥性」或「XDR」細菌，尤其革蘭氏陰性XDR細菌。XDR細菌係指已獲取對除一或兩個抗微生物類別外之全部中之至少一種藥劑之抗性的細菌(XDR細菌分離物保持對僅一或兩個類別之抗細菌劑敏感)。其他預期實施例係針對抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段，其係用於治療「廣泛耐藥性」或「PDR」細菌，尤其革蘭氏陰性PDR細菌。PDR細菌係指已獲取對全部抗微生物類別中之全部藥劑之抗性的細菌。 一些實施例係針對抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段之用途，其係用於治療泌尿道感染(urinary tract infection，UTI)。在一些實施例中，該UTI係下泌尿道感染(例如膀胱感染或膀胱炎)。在一些實施例中，該UTI係上泌尿道感染(例如腎臟感染或腎盂腎炎)。在某些實施例中，該UTI係感染革蘭氏陰性細菌。在某些實施例中，該UTI係感染MDR革蘭氏陰性細菌。一些實施例係針對抗哌唑黴素抗體及其抗原結合片段之用途，其係用於治療細菌性敗血症、嚴重呼吸道、骨骼、關節、皮膚、軟組織及中樞神經系統(例如腦膜炎)感染、腹內感染(腹膜炎)、燒傷部位周圍或其上產生之感染、手術後感染(包括血管手術後)。
例示性實施例
在本文所提供之實施例當中為： 實施例1. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例2. 如實施例1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合哌唑黴素。 實施例3. 如實施例1或2之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含： 輕鏈可變區，其包含與以SEQ ID NO: 26、30、38、46、54、62、70、78、86、94或102中之任一者所示之胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列；及/或 重鏈可變區，其包含與以SEQ ID NO: 22、34、42、50、58、66、74、82、90或98中之任一者所示之胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列。 實施例4. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含： 輕鏈可變區，其包含與選自SEQ ID NO: 26、30、38、46、54、62、70、78、86、94或102中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列；及/或 重鏈可變區，其包含與選自SEQ ID NO: 22、34、42、50、58、66、74、82、90或98中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列。 實施例5. 如實施例1至4中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以下之輕鏈可變區： VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列；或 VL-CDR3，其包含根據QQDX
2
X
3
SPX
4
T (SEQ ID NO: 283)之序列；其中X
2
係Y或H；X
3
係S、T或I；且X
4
係Y、F或W 實施例6. 如實施例1至5中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以下之輕鏈可變區： VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 196、203、218、226或254中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列；或 VL-CDR1，其包含根據KASQSVX
1
NDVA (SEQ ID NO:275)之序列；其中X
1
係S、T或R。 實施例7. 如實施例1至6中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以下之輕鏈可變區：VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 199、206或229中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列。 實施例8. 如實施例1至7中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以下之輕鏈可變區： VL-CDR1，其包含根據KASQSVX
1
NDVA (SEQ ID NO:275)之序列；其中X
1
係S、T或R； VL-CDR2，其包含根據YASNRYT(SEQ ID NO: 279)之序列；及 VL-CDR3，其包含根據QQDX
2
X
3
SPX
4
T (SEQ ID NO: 283)之序列；其中X
2
係Y或H；X
3
係S、T或I；且X
4
係Y、F或W。 實施例9. 如實施例1至8中任一項之分離之抗體或抗原結合片段，其包含有包含以下之輕鏈可變區：VL-CDR3，其包含根據SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 81；SEQ ID NO: 97或SEQ ID NO: 223之序列。 實施例10. 如實施例1至9中任一項之分離之抗體或抗原結合片段，其包含有包含以下之重鏈可變區：(i) VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 106、115、124、133、151、169、178或187中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，(ii) VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，及/或(iii) VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 112、121、130、139、157、175、184、193中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列。 實施例11. 如實施例1至10中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： 重鏈可變區，其包含(i) VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 106、115、124、133、151、169、178或187中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，(ii) VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，及(iii) VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 112、121、130、139、157、175、184、193中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列；及/或 輕鏈可變區，其包含(i) VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 196、203、218、226或254中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，(ii) VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 199、206或229中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，及(iii) VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列。 實施例12. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： 該重鏈可變區包含(i) VH-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 106、115、124、133、151、169、178或187中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，(ii) VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，及(iii) VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 112、121、130、139、157、175、184、193中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列；及/或 該輕鏈可變區包含(i) VL-CDR1，其包含與選自SEQ ID NO: 196、203、218、226或254中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，(ii) VL-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 199、206或229中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列，及(iii) VL-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223中之任一者的胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列。 實施例13. 如實施例1至12中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： 重鏈可變區，其包含：(i) VH-CDR1，其包含選自SEQ ID NO: 106、115、124、133、151、169、178或187之胺基酸序列；(ii) VH-CDR2，其包含與選自SEQ ID NO: 109、118、127、136、154、163、172、181或190之胺基酸序列；及(iii) VH-CDR3，其包含與選自SEQ ID NO: 112、121、130、139、157、175、184、193之胺基酸序列；及/或 輕鏈可變區，其包含：(i) VL-CDR1，其包含選自SEQ ID NO: 196、203、218、226或254之胺基酸序列；(ii) VL-CDR2，其包含選自SEQ ID NO: 199、206或229之胺基酸序列；及(iii) VL-CDR3，其包含選自SEQ ID NO: 29、57、73、81、97、208或223之胺基酸序列。 實施例14. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： 包含VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3之輕鏈可變區，該VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3分別包含以SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 102所示之輕鏈可變區內所含之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3的胺基酸序列；及/或 包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之重鏈可變區，該VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3分別包含以SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 82；SEQ ID NO: 90及SEQ ID NO: 98所示之重鏈可變區內所含之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之胺基酸序列。 實施例15. 如實施例1至10中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以下之輕鏈可變區： (a)包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 199之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列的VL-CDR3； (b)包含SEQ ID NO: 203之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 206之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 208之胺基酸序列的VL-CDR3； (c)包含SEQ ID NO: 218之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列的VL-CDR3； (d)包含SEQ ID NO: 226之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 229之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的VL-CDR3； (e)包含SEQ ID NO: 240之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 243之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的VL-CDR3； (f)包含SEQ ID NO: 247之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 250之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列的VL-CDR3； (g)包含SEQ ID NO: 254之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 257之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列的VL-CDR3；或 (h)包含SEQ ID NO: 261之胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO: 264之胺基酸序列的VL-CDR2；及包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列的VL-CDR3。 實施例16. 如實施例1至15中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含鼠類構架之輕鏈可變區。 實施例17. 如實施例1至16中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 102所示之序列的輕鏈可變區。 實施例18. 如實施例1至17中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以下之重鏈可變區： (a)包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的VH-CDR3； (b)包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的VH-CDR3； (c)包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列的VH-CDR3； (d)包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列的VH-CDR3； (e)包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 157之胺基酸序列的VH-CDR3； (f)包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 163之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的VH-CDR3； (g)包含SEQ ID NO: 169之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 172之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列的VH-CDR3； (h)包含SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 184之胺基酸序列的VH-CDR3；或 (i) 包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO: 190之胺基酸序列的VH-CDR2；及包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列的VH-CDR3。 實施例19. 如實施例1至18中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含鼠類構架之重鏈可變區。 實施例20. 如實施例1至19中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含有包含以SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 74：SEQ ID NO: 82；SEQ ID NO: 90或或SEQ ID NO: 98所示序列之重鏈可變區。 實施例21. 如實施例1至20中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 199及SEQ ID NO: 29所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 112所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (b)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 206及SEQ ID NO: 208所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 112所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (c)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 214及SEQ ID NO: 41所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 118及SEQ ID NO: 121所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (d)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 221及SEQ ID NO: 223所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 127及SEQ ID NO: 130所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (e)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 229及SEQ ID NO: 57所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 136及SEQ ID NO: 139所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (f)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 243及SEQ ID NO: 73所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 154及SEQ ID NO: 157所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (g)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 250及SEQ ID NO: 81所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 163及SEQ ID NO: 166所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (h)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 254、SEQ ID NO: 257及SEQ ID NO: 89所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 172及SEQ ID NO: 175所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3； (i)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 264及SEQ ID NO: 97所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 181及SEQ ID NO: 184所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3；或 (j)輕鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 271及SEQ ID NO: 105所示之VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3；及重鏈可變區，其包含分別以SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 190及SEQ ID NO: 193所示之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3。 實施例22. 如實施例1至21中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)與SEQ ID NO: 26至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 22至少85%一致之可變重鏈區； (b)與SEQ ID NO: 30至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 22至少85%一致之可變重鏈區； (c)與SEQ ID NO: 38至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 34至少85%一致之可變重鏈區； (d)與SEQ ID NO: 46至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 42至少85%一致之可變重鏈區； (e)與SEQ ID NO: 54至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 50至少85%一致之可變重鏈區； (f)與SEQ ID NO: 62至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 58至少85%一致之可變重鏈區； (g)與SEQ ID NO: 70至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 66至少85%一致之可變重鏈區； (h)與SEQ ID NO: 78至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 74至少85%一致之可變重鏈區； (i)與SEQ ID NO: 86至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 82至少85%一致之可變重鏈區； (j)與SEQ ID NO: 94至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 90至少85%一致之可變重鏈區；或 (k)與SEQ ID NO: 102至少85%一致之可變輕鏈區及與SEQ ID NO: 98至少85%一致之可變重鏈區。 實施例23. 如實施例1至22中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)根據SEQ ID NO: 26之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 22之可變重鏈區； (b)根據SEQ ID NO: 30之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 22之可變重鏈區； (c)根據SEQ ID NO: 38之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 34之可變重鏈區； (d)根據SEQ ID NO: 46之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 42之可變重鏈區； (e)根據SEQ ID NO: 54之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 50之可變重鏈區； (f)根據SEQ ID NO: 62之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 58之可變重鏈區； (g)根據SEQ ID NO: 70之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 66之可變重鏈區； (h)根據SEQ ID NO: 78之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 74之可變重鏈區； (i)根據SEQ ID NO: 86之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 82之可變重鏈區； (j)根據SEQ ID NO: 94之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 90之可變重鏈區；或 (k)根據SEQ ID NO: 102之可變輕鏈區及根據SEQ ID NO: 98之可變重鏈區。 實施例24. 如實施例1至23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係全抗體。 實施例25. 如實施例1至24中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其係選自由以下組成之群的抗原結合片段：單域抗體、單鏈抗體、單抗體、單鏈可變片段(scFv)、Fab片段及F(ab')
2
片段。 實施例26. 如實施例4至25中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例27. 如實施例4至26中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合哌唑黴素。 實施例28. 如實施例1至27中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約100 μg/mL或更小之IC50特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例29. 如實施例1至28中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約19 μg/mL或更小之IC50特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例30. 如實施例28或29之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約0.02 μg/mL或更大之IC50特異性結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例31. 如實施例28至30中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該IC50藉由競爭性ELISA分析確定。 實施例32. 如實施例1至31中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以大於抗體或其抗原結合片段與非哌唑黴素胺基醣苷之結合親和力的結合親和力結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例33. 如實施例32之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該非哌唑黴素胺基醣苷係阿米卡星、西索米星或慶大黴素。 實施例34. 如實施例1至33中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以10
- 7
M或更小之平衡解離常數結合於哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例35. 如實施例1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。 實施例36. 如實施例1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係鼠類抗體。 實施例37. 如實施例1至36中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段進一步包含可偵測標記。 實施例38. 一種核酸，其編碼如實施例1至37中任一項之抗體或抗原結合片段。 實施例39. 一種核酸，其編碼包含如實施例1至37中任一項之抗體或其抗原結合片段之可變重鏈區的重鏈。 實施例40. 一種核酸，其編碼包含如實施例1至37中任一項之抗體或其抗原結合片段之可變輕鏈區的輕鏈。 實施例41. 如實施例38至40中任一項之核酸，其中該核酸包含cDNA。 實施例42. 如實施例38至41中任一項之核酸，其中該核酸經密碼子優化以表現於細胞中。 實施例43. 一種載體，其包含如實施例38至42中任一項之核酸。 實施例44. 如實施例43之載體，其係表現載體。 實施例45. 一種宿主細胞，其包含如實施例38至42中任一項之核酸或如實施例43或實施例44之載體。 實施例46. 一種產生抗體之方法，其包含在產生該抗體之條件下培養如實施例45之宿主細胞。 實施例47. 如實施例46之方法，其進一步包含回收藉由該宿主細胞產生之該抗體。 實施例48. 一種抗體或其抗原結合片段，其係藉由如實施例46或實施例47之方法產生。 實施例49. 一種組合物，其包含如實施例1至37中任一項之抗體或抗原結合片段。 實施例50. 如實施例49之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。 實施例51. 一種固體支撐物，其包含固定於其中之如實施例1至37中任一項之抗體或抗原結合片段。 實施例52. 如實施例51之固體支撐物，其中該固體支撐物係珠粒、管柱、陣列、分析盤、微孔、棒狀物、過濾器或條帶。 實施例53. 一種裝置，其包含實施例51或實施例52之固體支撐物。 實施例54. 一種套組，其包含如實施例1至37中任一項之抗體或其抗原結合片段、如實施例49或50之組合物、如實施例51或52之固體支撐物或如實施例53之裝置及使用說明書。 實施例55. 如實施例54之套組，其中該說明書提供執行偵測生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽及/或確定生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的量的分析之說明。 實施例56. 一種確定生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量之方法，其包含： (i)使該樣品與如實施例1至37中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段接觸；及 (ii)偵測結合於該哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的抗體存在或不存在或量，由此確定該生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量。 實施例57. 如實施例56之方法，其中該生物樣品係液體。 實施例58. 如實施例56或57之方法，其中該生物樣品係血清、血漿、血液、尿液、唾液或痰液。 實施例59. 如實施例56至58中任一項之方法，其中該偵測使用免疫分析執行。 實施例60. 如實施例59之方法，其中該免疫分析係選自由以下組成之群：選殖酶供體免疫分析(CEDIA)、濁度分析及競爭性ELISA。 實施例61. 如實施例56至60中任一項之方法，其中該生物樣品獲自個體，向該個體投與哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽。 實施例62. 如實施例61之方法，其中該生物樣品在投與該哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之後一段時間後獲得。 實施例63. 如實施例56至62中任一項之方法，其進一步包含選擇個體以投與後續劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 若該生物樣品中之該哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽低於或等於預定截止值，則選擇該個體來接受該後續劑量；或 若該生物樣品中之該哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽高於該預定截止值，則選擇該個體不接受該後續劑量。 實施例64. 如實施例56至62中任一項之方法，其進一步包含選擇個體以投與後續劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 若該生物樣品中之該哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽低於或等於預定截止值，則選擇該個體來接受等於或大於先前劑量之後續劑量；或 若該生物樣品中之該哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽高於該預定截止值，則選擇該個體來接受小於先前劑量之後續劑量。 實施例65. 如實施例63或64之方法，其進一步包含向該個體投與該後續劑量。 實施例66. 一種治療個體之細菌感染之方法，其包含： (i)向該個體投與一定劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽；及 (ii)根據如實施例56至65中任一項之方法確定獲自該個體之生物樣品中之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量。 實施例67. 如實施例66之方法，其包含在投與該劑量與確定獲自該個體之該生物樣品中之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽含量之間等待一段時間。 實施例68. 如實施例66或實施例67之方法，若哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的該確定含量低於或等於預定含量，則該方法進一步包含向該個體投與後續劑量之哌唑黴素。 實施例69. 如實施例66或實施例67之方法，其進一步包含向該個體投與後續劑量之哌唑黴素，其中該後續劑量： (a)若獲自該個體之生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的確定含量低於或等於預定截止值，則大於該先前劑量；或 (b)若該生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的該確定含量高於該預定截止值，則小於該先前劑量。 實施例70. 如實施例66至69中任一項之方法，其進一步包含接受確定該生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的含量之分析的結果。 實施例71. 一種治療個體之細菌感染之方法，其包含向該個體投與後續劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽，其中該個體先前已接受先前劑量之哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽，且其中該後續劑量： (a)若獲自該個體之生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的確定含量低於或等於預定截止值，則大於該先前劑量；或 (b)若該生物樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽的該確定含量高於該預定截止值，則小於該先前劑量； 其中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之該含量根據如實施例56至60中任一項之方法來確定。 實施例72. 如實施例66至71中任一項之方法，其中該細菌感染由革蘭氏陰性細菌引起。 實施例73. 如實施例66至72中任一項之方法，其中該細菌感染由多重抗藥(MDR)細菌引起。 實施例74. 如實施例66至73中任一項之方法，其中該細菌感染係泌尿道感染。 實施例75. 一種如實施例1至37中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於偵測樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽量存在、含量或量。 實施例76. 一種如實施例1至37中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備用以偵測樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之存在、含量或量之組合物。 實施例77. 一種組合物，其包含如實施例1至37中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係用於偵測樣品中哌唑黴素或其醫藥學上可接受之鹽之存在、含量或量。 實施例78. 如實施例75至77中任一項之用途或組合物，其中該樣品係生物樣品。 實施例79. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於哌唑黴素，該分離之抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： (a)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 23之可變重鏈互補決定區1 (VHCDR1)、包含SEQ ID NO: 24之可變重鏈互補決定區2 (VHCDR2)及包含SEQ ID NO: 25之可變重鏈互補決定區3 (VHCDR3)；及/或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 27之可變輕鏈互補決定區1 (VLCDR1)、包含SEQ ID NO: 28之可變輕鏈互補決定區2 (VLCDR2)及包含SEQ ID NO: 29之可變輕鏈互補決定區3 (VLCDR3)； (b)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 23之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 24之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 25之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 31之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 32之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 33之VLCDR3區； (c)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 35之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 36之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 37之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 39之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 40之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 41之VLCDR3區； (d)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 43之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 44之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 45之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 47之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 48之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 49之VLCDR3區； (e)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 51之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 52之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 53之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 55之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 56之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 57之VLCDR3區； (f)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 59之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 60之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 61之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 63之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 64之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 65之VLCDR3區； (g)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 67之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 68之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 69之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 71之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 72之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 73之VLCDR3區； (h)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 75之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 76之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 77之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 79之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 80之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 81之VLCDR3區； (i)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 83之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 84之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 85之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 87之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 88之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 89之VLCDR3區； (j)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 91之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 92之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 93之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 95之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 96之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 97之VLCDR3區；或 (k)該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 99之VHCDR1區、包含SEQ ID NO: 100之VHCDR2區及包含SEQ ID NO: 101之VHCDR3區；或該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 103之VLCDR1區、包含SEQ ID NO: 104之VLCDR2區及包含SEQ ID NO: 105之VLCDR3區。 實施例80. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 23之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 24之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 25之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 27之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 28之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 29之VLCDR3區。 實施例81. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 23之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 24之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 25之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 31之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 32之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 33之VLCDR3區。 實施例82. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 35之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 36之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 37之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 39之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 40之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 41之VLCDR3區。 實施例83. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 43之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 44之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 45之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 47之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 48之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 49之VLCDR3區。 實施例84. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 51之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 52之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 53之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 55之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 56之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 57之VLCDR3區。 實施例85. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 59之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 60之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 61之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 63之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 64之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 65之VLCDR3區。 實施例86. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 67之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 68之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 69之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 71之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 72之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 73之VLCDR3區。 實施例87. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 75之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 76之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 77之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 79之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 80之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 81之VLCDR3區。 實施例88. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 83之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 84之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 85之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 87之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 88之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 89之VLCDR3區。 實施例89. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 91之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 92之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 93之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 95之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 96之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 97之VLCDR3區。 實施例90. 如實施例79之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 99之VHCDR1區、該包含SEQ ID NO: 100之VHCDR2區及該包含SEQ ID NO: 101之VHCDR3區；且該輕鏈可變區包含有該包含SEQ ID NO: 103之VLCDR1區、該包含SEQ ID NO: 104之VLCDR2區及該包含SEQ ID NO: 105之VLCDR3區。 實施例91. 如實施例79或實施例80之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 26。 實施例92. 如實施例79或實施例81之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 30。 實施例93. 如實施例79或實施例83之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包SEQ ID NO: 34或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 38。 實施例94. 如實施例79或實施例84之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 42或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 46。 實施例95. 如實施例79或實施例85之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 50或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 54。 實施例96. 如實施例79或實施例86之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 58或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 62。 實施例97. 如實施例79或實施例87之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 66或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 70。 實施例99. 如實施例79或實施例88之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 74或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 78。 實施例100. 如實施例79或實施例89之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 82或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 86。 實施例101. 如實施例79或實施例90之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 90或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 94。 實施例102. 如實施例79或實施例91之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 98或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 102。 實施例103. 如實施例79或實施例80之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 26。 實施例104. 如實施例79或實施例81之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 30。 實施例105. 如實施例79或實施例82之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包SEQ ID NO: 34且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 38。 實施例106. 如實施例79或實施例83之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 42且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 46。 實施例107. 如實施例79或實施例84之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 50且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 54。 實施例108. 如實施例79或實施例85之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 58且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 62。 實施例109. 如實施例79或實施例86之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 66且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 70。 實施例110. 如實施例79或實施例87之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 74且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 78。 實施例111. 如實施例79或實施例88之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 82且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 86。 實施例112. 如實施例79或實施例89之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 90且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 94。 實施例113. 如實施例79或實施例90之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 98且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 102。 實施例114. 如實施例79至113中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自包含單鏈可變片段(scFv)或缺乏鉸鏈區之單價抗體之群。 實施例115. 如實施例79至113中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係Fab或Fab'片段。 實施例116. 如實施例79至113中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係F(ab')2片段。 實施例117. 如實施例79至113中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係全抗體。 實施例118. 如實施例79至117中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其進一步包含可偵測標記。 實施例119. 如實施例79至118中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以重組方式產生。 實施例120. 一種確定生物樣品中哌唑黴素含量之方法，其包含： (i)使該樣品與如實施例1至40中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段接觸；及 (ii)偵測結合於該哌唑黴素之抗體存在或不存在或量，且由此確定該生物樣品中哌唑黴素之含量。 實施例121. 如實施例120之方法，其中該生物樣品係視情況選自由以下組成之群的液體基質：血清、血漿、血液、尿液或痰液。 實施例122. 如實施例120或實施例121之方法，其中該生物樣品係獲自已投與哌唑黴素之個體。 實施例123. 如實施例120之方法，其中該偵測使用視情況選自由以下組成之群的免疫分析執行：選殖酶供體免疫分析(CEDIA)、濁度分析及競爭性ELISA。 實施例124. 一種治療有需要個體之細菌感染的方法，其包含： (i)向該個體提供有效量之哌唑黴素； (ii)等待第一時間段；及 (iii)根據如實施例41至44中任一項之方法確定獲自該個體之生物樣品中哌唑黴素之含量。 實施例125. 實施例124之方法，其進一步包含： (iv)若哌唑黴素之該確定含量低於或等於截止值，則在步驟(iii)之後向該個體提供額外哌唑黴素或量大於步驟(i)之該有效量的哌唑黴素；或 (v)若哌唑黴素之該確定含量高於截止值，則在步驟(iii)之後不向該個體提供額外哌唑黴素或提供量小於步驟(i)之該有效量的哌唑黴素。 實施例126. 如實施例124或實施例125之方法，其中該細菌係革蘭氏陰性細菌。 實施例127. 如實施例126之方法，其中該細菌係多重抗藥(MDR)細菌。 實施例128. 如實施例125至127中任一項之方法，其中該感染係泌尿道感染。 實施例129. 一種分離之聚核苷酸，其編碼如實施例79至117中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段。 實施例130. 如實施例129之分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含cDNA及/或至少一種經修飾核酸。 實施例131. 如實施例129之分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸經密碼子優化以表現於宿主細胞中。 實施例132. 一種表現載體，其包含如實施例129至131中任一項之經分離之聚核苷酸序列。 實施例133. 一種宿主細胞，其包含如實施例132之表現載體。
實例
包括以下實例僅為達成說明之目的，且不意欲限制本發明之範疇。
實例 1 產生哌唑黴素特異性抗體
野生型Balb/c小鼠經由齒爪途徑經10 μg/小鼠之於PBS中之哌唑黴素結合半抗原匙孔螺血氰蛋白(KLH，哌唑黴素-KLH)免疫接種。在第0天初始免疫接種之後，在第14、21及28天對小鼠加打三次。在第32天，將小鼠處死且收集膕、腋及腹股溝淋巴結。
抗體產生
在收集之後，使淋巴結細胞與SP2/O-Ag14融合瘤細胞株(購自ATCC)融合。將融合瘤選於次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT)培養基中培養10天。在10天之後，收集融合瘤上清液且藉由ELISA測試與BSA-哌唑黴素結合之抗體。接著陽性融合瘤培養基進行次選殖且使用G-瓊脂糖自含有融合瘤之上清液純化抗體。 確定獲自融合瘤之抗體可變區(輕鏈及重鏈)之序列，如表4中所示。
表 4 ：融合瘤抗體可變區之序列 融合瘤之功能篩檢
接著藉由ELISA (抗體之測試濃度在0.0001 nM至100 nM之範圍內)(圖1A)及競爭性ELISA (圖1B)在經BSA-溴-哌唑黴素塗佈之ELISA盤上分析純化抗體與BSA-哌唑黴素之結合。對於競爭性ELISA，將以下濃度之游離胺基糖苷(哌唑黴素、慶大黴素、阿米卡星及西索米星)；270 μg/ml、90 μg/ml、30 μg/ml、10 μg/ml、3.3 μg/ml、1.1 μg/ml、0.4 μg/ml、0.12 μg/ml、0.04 μg/ml及0.013 μg/ml，與10種源自上文所述細胞培養之純化單株抗體中之一者一起培育；0.05 nM濃度之MC329、MC330、MC331、MC332、MC334、MC335、MC335、MC337、MC339、MC340(圖1B)。接著將抗體/胺基醣苷溶液添加至經BSA-溴-哌唑黴素塗佈之ELISA盤中。洗滌盤以移除未結合抗體，且確定各胺基醣苷之IC50值(μg/mL)，且示於以下表5中。
表 5 ：胺基糖苷之抗生素 IC50 值
nc = 不計算 本發明不意欲限制在具體揭示之實施例的範疇中，提供該等實施例用於例如說明本發明之各種態樣。對所述組合物及方法之各種修改將由本文中之描述及教示而變得顯而易見。此類變化形式可在不背離本發明之真正範疇及精神的情況下加以實踐且意欲屬於本發明之範疇內。