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TW201803906A - 結合物件(二) - Google Patents

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TW201803906A TW106120589A TW106120589A TW201803906A TW 201803906 A TW201803906 A TW 201803906A TW 106120589 A TW106120589 A TW 106120589A TW 106120589 A TW106120589 A TW 106120589A TW 201803906 A TW201803906 A TW 201803906A
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尼可萊 珊蒂
米賀瑞班 吐納
法蘭西斯卡 沃勒湯凡后克
凱蒂 L. 依沃特
米古爾 蓋斯帕
馬修 卡拉曼
卡塔茲納 奇米奇克
穆斯塔法 法拉迪
娜塔莉 安倫
芭芭拉 西比斯
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Ｆ星德爾塔有限公司
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Abstract

本發明係有關於結合程式性死亡配體1(PD-L1)及淋巴細胞活化基因3(LAG-3)的抗體分子。該抗體分子較佳包含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址，以及一LAG-3抗原結合位址，其可座落於該抗體分子的CH3域之二或更多結構環內。本發明之抗體分子於舉例而言，癌症療法方面獲得應用。

Description

結合物件(二)
發明領域 相關申請案 此案係有關於2016年六月20日提申之US 62/352482，其係以其等之整體內容藉此併入以作為參考資料。
發明領域 本發明係有關於結合程式性死亡配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)及淋巴細胞活化基因3(LAG-3)的抗體分子。該抗體分子較佳包含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址，以及一LAG-3抗原結合位址，其可座落於該抗體分子的CH3域之二或更多結構環內。本發明之抗體分子於舉例而言，癌症療法方面獲得應用。
發明背景 淋巴細胞活化基因-3(LAG-3；CD223)係Ig超家族之成員，且在遺傳及結構上與CD4相關(儘管只有20%的序列同一性)。像CD4一樣，LAG-3會與第II類MHC分子結合，但親和力比CD4更高(K D = 60 nM)。LAG-3表現於活化的T細胞、NK細胞、pDCs、B細胞、γδ T細胞及參與免疫抑止作用，特別是通過持續性強大表現於一定百分率的調節性T細胞(Tregs)上(Liang等人，2008)。
LAG-3基因係位於人類染色體12上，靠近CD4基因，且延伸8個外顯子。有五個任擇的轉錄本，其中兩個會產生蛋白產物：一種全長的跨膜蛋白及一種任擇剪接的可溶單體形式。全長的轉錄本編碼一種分子量為70 kDa之525個胺基酸的蛋白且具有功能活性，而可溶形式似乎不會與第II類MHC分子結合且其之功能未知。人類全長的LAG-3蛋白與食蟹獼猴(Macaca fascicularis )(食蟹獼猴(cynomolgus monkey))LAG-3有93%的序列同一性以及與家鼷鼠(Mus musculus )(家鼷鼠(house mouse))LAG-3有70%的序列同一性。
LAG-3係一種跨膜蛋白具有四個細胞外似Ig域(D1-D4)，以及一細胞質部分負責LAG-3發送訊息(signalling)。細胞質域具有與LAG-3-關聯性蛋白(LAP)締合的EP(麩胺酸/脯胺酸)部分(motif)，以及被認為是LAG-3調控T細胞功能需要的KIEELE部分。對於EP部分角色的報告暗示其可能負責運輸LAG-3至T細胞表面膜(cell surface membrane)(Bae等人，2014)，或可以直接負責調控T細胞活化期間下游的STAT5之發送訊息(Durham等人，2014)，或者可能是二者。
LAG-3對於T細胞免疫抑止的機轉被認為是由活化的T細胞上LAG-3之交聯作用所驅使，導致T細胞活化期間鈣通量及IL-2釋放減少(Huard等人，1997)。於抗原呈現細胞方面(APCs)，LAG-3陽性調節T細胞與第II類MHC分子之結合造成降低的IL-12分泌及向下調節CD86，活化的“第二信號”(Liang等人，2008)，而由不適當活化及/或APCs減少的抗原呈現導致T細胞無因變性(anergy)。LAG-3剔除(knock out)小鼠模式是能活的，且只有輕度淋巴過度增殖(Workman等人，2003)，表示LAG-3作用為適度的免疫“煞車(brake)”。
此LAG-3及第II類MHC之間的抑止交互作用亦已被提出會於Tregs及CD4陽性T細胞之間發生(Sega等人，2014)。Tregs係藉由釋放抑止性細胞介素(cytokine)(諸如IL-10及TGFβ)、操縱發炎代謝(諸如CD73分解代謝腺苷)、調節APC成熟或調節T細胞及效應子T細胞之間的直接交互作用來抑止免疫反應。有證據顯示於人類第II類MHC陽性Tregs比第II類MHC陰性Tregs抑止性更高(Baecher-Allen等人，2006)且會通過與效應子T細胞上表現的LAG-3之直接交互作用來主動抑止免疫反應。雖然LAG-3陰性Tregs能抑止傳統的T細胞增殖，但LAG-3陰性CD4及CD8 T細胞對Treg免疫抑止作用是有抵抗作用的。此過程被描述通過已知為胞啃作用(trogocytosis)的過程而於人類T細胞之間發生(Sega等人，2014)，因此Tregs不止會防止APC成熟而且會獲取第II類MHC以抑止經引發的(primed)LAG-3陽性CD4 T細胞。
LAG-3表現也是重複抗原刺激的指標。於癌症方面，T細胞通常採用“衰竭的”表現型，其涉及免疫抑止因子例如PD-1、CTLA-4、TIM-3及LAG-3之表現(Wherry等人，2011)，細胞一般無法對抗原起反應而適當地增殖及分泌趨化介素(chemokines)。抑制此等免疫抑止因子會降低免疫閾值且(再)賦予T細胞適當的抗癌反應。在臨床前模式方面，此現象已經使用對抗LAG-3、CTLA-4及PD-1的拮抗抗體來證明，其可見腫瘤負荷(tumour burden)之減少。拮抗抗體之LAG-3抑制作用被認為使腫瘤微環境內的免疫反應再活化，CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞上LAG-3的表現係與衰竭的表現型有關連，以及Tregs上LAG-3的表現與可能的免疫抑止能力有關連。阻斷LAG-3之抗體會增高T效應子細胞增殖、細胞介素生產、細胞毒性，以及減少Treg抑止因子活性而導致腫瘤生長減小。
於人類腫瘤方面，來自人類腎細胞癌及其他腫瘤，例如黑色素瘤及淋巴瘤之腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)上發現增高的LAG-3表現(Demeure等人，2001；Wolchock等人，2013)。很重要地，LAG-3亦與慢性病毒感染(Workman等人，2005)及癌症(Workman等人，2003)之病患的T細胞官能不良密切相關。LAG-3也已經辨識為許多人類癌症之腫瘤浸潤Tregs的表面標誌(Camisachi等人2010；Gandhi等人，2006)。
人類LAG-3的單株抗體正在臨床開發中以廢除免疫抑止作用且有可能增強癌症內之抗原呈現(實性(solid)及血液惡性腫瘤)。
LAG-525及IMP-701(Novartis AG)為對抗LAG-3的人類抗體且於腎臟癌(腎細胞癌)；非小細胞肺癌(NSCLC)；鼻咽癌；結腸直腸癌；黑色素瘤；胃癌及胃食道交接處腺癌方面業已分別進展至第II期及第I期臨床研究。
抗-LAG-3抗體BMS-986016(必治妥施貴寶公司)，目前在卵巢癌；NSCLC；結腸直腸癌；子宮頸癌；黑色素瘤；胃癌；膀胱癌；頭頸部癌鱗狀細胞癌；腎細胞癌的第I期臨床試驗以及在NSCLC；復發的慢性淋巴球性白血病(CLL)；不反應的慢性淋巴球性白血病(CLL)；黑色素瘤；非何杰金氏淋巴瘤；何杰金氏淋巴瘤；瀰漫型大B細胞淋巴瘤；緩慢型(Indolent)淋巴瘤；外膜細胞淋巴瘤；不反應的多發性骨髓瘤；及復發的多發性骨髓瘤的第II期臨床研究作為單方療法或作為組合療法的一部分。
另外的對抗LAG-3抗體也在臨床前發展中。
程式性細胞死亡1(PD-1)及其之配體PD-L1 (CD274，B7-H1)與PD-L2(B7-DC)遞送抑制訊息以調節T細胞活化、耐受性及免疫病理學之間的平衡。PD-L1暫時地表現於所有的免疫細胞及一些腫瘤細胞上。
PD-L1為第I型跨膜蛋白具有二個似Ig域於細胞外區域、一個跨膜域及一個短的細胞質域。細胞質域沒有已知的訊息傳遞部分，暗示關於PD-L1沒有透過配體及其受體之交互作用發送訊息。其之分子量為40 kDa(290個胺基酸)且其係分別由小鼠染色體19及人類染色體9上的CD274基因所編碼。PD-L1為B7蛋白家族之成員且與B7.1及B7.2共享大概20 %的胺基酸序列同一性。人類PD-L1分別與鼠類及食蟹獼猴(cynomolgus)之PD-L1異種同源物共享70 %及93 %的胺基酸同一性。
PD-L1係以770 nM之親和力(KD )與其之受體PD-1結合。PD-1係表現於活化的T細胞、B細胞及骨髓細胞上，以及調控細胞免疫反應的活化或抑制。PD-L1與PD-1結合以遞送抑制訊息，減少細胞介素生產及T細胞增殖。 結果，細胞之PD-L1表現能媒介胞毒型T淋巴細胞(CTL)毒殺作用且為病毒感染期間減輕慢性免疫反應的調控機轉。癌症，如同慢性及促進發炎性(pro-inflammatory)疾病，通過上調PD-L1表現而破壞此免疫保護途徑以躲避宿主的免疫反應。於主動免疫反應的情況中，IFNγ亦會上調PD-L1的表現。
PD-L1亦會通過與另一種蛋白B7.1(也稱為CD80)之交互作用來媒介免疫抑制作用，阻斷其之能力以通過CD28遞送T細胞活化的第二信號之一者。就腫瘤細胞上PD-L1的表現及其與B7.1的接合方面來說，腫瘤免疫抗性之此種特異交互作用的相關性還不清楚。
種類繁多的實性腫瘤業已顯示出PD-L1的表現。於一研究中檢查的654個樣本中，包括來自不同位址的19種腫瘤，89個(14%)為PD-L1陽性(≥5%頻率)。於頭頸部(17/54；31%)、子宮頸(10/34；29%)、不明原始來源的癌症(CUP；8/29；28%)、多形性神經膠質母細胞瘤(GBM；5/20；25%)、膀胱(8/37；21%)、食道(16/80；20%)、三重陰性(TN)乳房(6/33；18%)及肝癌(6/41；15%) (Grosso等人，2013)看到最高的PD-L1陽性頻率。PD-L1之腫瘤關聯性表現已經顯示出會賦予免疫抗性及可能保護腫瘤細胞免受T細胞媒介的細胞凋亡。
靶定PD-L1的療法已經於活體研究中顯示出傑出的結果。於黑色素瘤之B16鼠類模式中，抗-PD-L1組合以GVAX或FVAX疫苗接種策略的治療，對於研究結束後之存活(對照為30天vsPD-L1-治療為52天)及無腫瘤動物百分率(5%)二者均導致顯著效應(Curran等人，2010)。抗-PD-L1療法也已經用來研究P815鼠類乳腺瘤(mastoma)模式內免疫抑制作用的機轉。注射至小鼠內的P815細胞通常會觸發強大的免疫反應，其導致其等之排斥作用。當PD-L1表現於P815細胞上時，此等細胞逃避免疫的攻擊，此又能通過投與抗-PD-L1抗體而失效(Iwai等人，2002)。很明顯地靶定免疫性人類癌症的PD-1/PD-L1中心(Herbst等人，2014)通過刺激抗癌的免疫反應而導致存活優勢(Wolchock等人，2013；Larkin等人，2015)。
阿替珠單抗(Atezolizumab) (MPDL3280A，RG7466，TECENTRIQ)為一種結合PD-L1的人化IgG1抗體。其於臨床試驗作為單一試劑並且也與其他的治療實性癌症，包括結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌及腎細胞癌的生物及/或小分子療法組合。用阿替珠單抗之治療於NSCLC導致23%、36%黑色素瘤、33%膀胱、RCC為14%，以及頭頸部癌症為13%之客觀反應率(ORR) (Herbst等人，2014；Powles等人，2014)。
阿維魯單抗(Avelumab) (MSB0010718C) 為一種結合PD-L1之完全的人類IgG1抗體且正進行一些癌症的臨床試驗，包括膀胱癌、胃癌、頭頸部癌症、間皮瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、腎細胞癌及默克細胞癌(Merkel-cell carcinoma)。
德瓦魯單抗(Durvalumab)(MEDI4736)為一種結合PD-L1之人類IgG1抗體且於非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、膀胱癌、胰臟癌之臨床試驗中單獨測試或與摧麥拉單抗(tremelimumab)組合測試，以及於額外的實性癌症例如胃癌、黑色素瘤及不可切除的肝細胞癌之試驗中與其他的生物及小分子組合測試。
另外的抗-PD-L1抗體業已在臨床試驗中測試，包括BMS-936559以及其餘者係於臨床前試驗中。
然而，目前在臨床試驗中的抗-LAG-3療法很少且無一者被批准用於治療，所以對於發展靶定LAG-3之額外的分子仍然有需要。雖然有一些抗-PD-L1療法在發展中，但目前的數據顯示用抗-PD-L1單方療法之整體治療導致低於50%的癌症病患有反應。因而，本技藝對於能靶定LAG-3及/或PD-L1且於癌症療法方面獲得應用之額外的分子仍然有需要。
發明概要 抗-PD-1及抗-PD-L1抗體主要涉及破壞免疫耐受性及活化抗腫瘤免疫反應。LAG-3，於活化後表現於T細胞上，且持續表現於衰竭的T細胞上，進一步使此等細胞維持於抑止狀態。LAG-3之阻斷，當組合其他已建立的免疫抑止分子(即：PD-1，PD-L1)使用時，也已經於鼠類腫瘤模式中顯示出會提供協同改良的免疫反應(Woo等人，2012)。本發明人假設同時靶定此等二種途徑的療法會直接滿足促進及維持T細胞衰竭之機轉。此外，本發明人預期靶定LAG-3可通過表現LAG-3調節T細胞對APCs之作用來抑止抗原呈現，以及發表的研究證明CD86之向下調節(Grosso等人，2013)。阻斷此交互作用預期會維持抗原呈現，而阻斷PD-L1發送訊息預期會破壞耐受性，當同時抑制二種途徑時導致顯著的抗腫瘤反應。
雖然有來自臨床前同基因小鼠腫瘤及病毒負荷量模式的一些結果，但抗-LAG-3及抗-PD-L1抗體組合發表的數據是有限的。於鼠類骨髓瘤模式中，低劑量全身照射後投與抗-PD-L1及抗-LAG-3阻斷抗體之組合以及改良存活率至大於80%(Jing等人，2015)。沒有觀察到全身性或器官專一性自體免疫性的證據。LAG-3及PD-1剔除(knock-out)小鼠顯示出自多樣可移植腫瘤明顯增加的存活(survival from)及多樣可移植腫瘤的廓清作用(clearance)(Woo等人，2012)。
本發明人假設結合LAG-3及PD-L1之雙專一性抗體會賦予超越對抗此等抗原的單株抗體組合的一些優勢，包括：1. 導向療法 (Directed Therapy)
活化的T細胞於淋巴結內表現LAG-3。抗-LAG-3/PD-L1雙專一性抗體的一部分於淋巴結內靶定經引發的LAG-3陽性T細胞，其繼而運送雙專一性抗體，運輸至腫瘤位址。一旦進入腫瘤微環境內，攜帶雙專一性抗體之T細胞能立即接合且經由抗-PD-L1部分來阻斷腫瘤細胞上的PD-L1。結果，全部移動至腫瘤位址的T細胞對LAG-3及PD-L1/PD-1發送訊息二者均有抵抗作用。2. 架橋法 (Bridging)
經引發的CD8陽性T細胞於腫瘤微環境內遭遇腫瘤抗原，其等在缺乏抑止訊息之下會作出殺死腫瘤細胞的反應。透過維持或延長T細胞與腫瘤細胞之間的此種接觸，雙專一性抗體預期會比個別的單株療法之組合優秀。T細胞活化的訊息強度是必要的，其就癌症呈現抗原來說可能是關鍵(Engels等人，2013)，以及結合APC或癌症細胞上的標靶之雙專一性抗-LAG-3/PD-L1抗體的存在預期會使T細胞能成功辨識抗原且變成活化的時間增加。3. 定位 (Localisation)
於發炎區域及持續的免疫反應，PD-L1表現因為定位的IFN-γ釋放而顯著增加。此不管是在標靶癌細胞、腫瘤相關巨噬細胞(TAM)或重複刺激的T細胞族群都是事實。一種拮抗PD-L1及LAG-3之雙專一性抗體預期會定位且集中至腫瘤內最大PD-L1表現的區域，同時允許抗-LAG-3部分結合且免受LAG-3-媒介的T細胞抑止作用。
於廣泛篩選及親和力成熟程序之後，本發明人能辨識出十種專一性結合物件，其包含對LAG-3專一的一結合位址於該分子的CH3域內。此等分子顯示出對於人類及食蟹獼猴LAG-3二者具有高親和力。對於人類LAG-3之高親和力預期在譬如人類病患體內治療含表現LAG-3之腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的癌症方面會是有利的，而食蟹獼猴LAG-3之高親和力，其比得上人類LAG-3之親和力，預期可用於食蟹獼猴疾病模式內評估專一性結合物件的性質。原因是，比起一種對於人類及食蟹獼猴LAG-3之親和力有更高的變異性的分子於食蟹獼猴模式內測試時，該等獲得的結果更有可能預測專一性結合物件於人類病患的效應。
該專一性結合物件亦於T細胞活化分析中顯示為具有高活性，預期係通過提升的LAG-3抑制作用而預測人類病患體內改良的效應。
本發明人進一步組合此等專一性結合物件，其包含對LAG-3專一的一結合位址於該CH3域內加上包含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址之一抗體Fab域，以創造包含LAG-3及PD-L1二者之結合位址的雙專一性抗體分子，其預期會具有以上詳述的優點。本發明人也製備與鼠類LAG-3及鼠類PD-L1結合的此等抗體分子之代理者鼠類版本且顯示出能夠顯著抑制同基因小鼠癌症模式之腫瘤生長。特別地，當一種包含LAG-3及PD-L1之結合位址二者的抗體分子投與至小鼠模式測試的小鼠時，使用此等代理者鼠類分子展示出對於腫瘤生長的抑止作用有協同效應。基於腫瘤環境內小鼠及人類LAG-3及PD-L1相似的作用機轉，顯示出減少腫瘤負荷功效之鼠類研究預期會轉變成人類癌症病患之臨床治療益處。根據此等結果，因而預期本發明的抗體分子會於人類病患之癌症治療顯示出比，舉例而言，投與分別結合LAG-3及PD-L1之二個分開的分子更優越的效應，特別是於抑止腫瘤細胞生長方面。
因而，於第一個態樣中本發明提供一種與PD-L1及LAG-3二者結合的抗體分子。具體而言，此等抗體包含： (i)一用於PD-L1之CDR-為基的抗原結合位址；以及 (ii)一LAG-3抗原結合位址座落於，或經設計置入，該抗體分子的一CH3域之二或更多結構環內。該LAG-3結合位址較佳包含胺基酸序列WDEPWGED(序列辨識編號：1)及PYDRWVWPDE。(序列辨識編號：3)。
該抗體分子較佳包含序列辨識編號：1內列出的該胺基酸序列於AB環內，以及序列辨識編號：3內列出的該胺基酸序列於該CH3域之EF環內。
因而，於第一個態樣中本發明提供一種結合程式性死亡配體1(PD-L1)及淋巴細胞活化基因3(LAG-3)的抗體分子。該抗體分子包含(i)一用於PD-L1之CDR-為基的抗原結合位址；以及 (ii) 一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內。
該LAG-3結合位址較佳包含該胺基酸序列WDEPWGED(序列辨識編號：1)及PYDRWVWPDE(序列辨識編號：3)。該胺基酸序列WDEPWGED較佳座落於該CH3域之一第一結構環內以及該胺基酸序列PYDRWVWPDE較佳座落於該CH3域之一第二結構環內。
舉例而言，該LAG-3抗原結合位址可座落於該抗體分子的一CH3域之一結構環區域內，其中該結構環區域較佳包含二或更多結構環，以及其中該LAG-3結合位址較佳包含該胺基酸序列WDEPWGED(序列辨識編號：1)及PYDRWVWPDE(序列辨識編號：3)。
作為另一個實例，該LAG-3抗原結合位址可經設計置入該抗體分子的一CH3域之二或更多結構環內，其中該LAG-3結合位址較佳包含該胺基酸序列WDEPWGED(序列辨識編號：1)及PYDRWVWPDE(序列辨識編號：3)。
如以上所提及，該LAG-3結合位址的序列較佳座落於該抗體分子的該CH3域之二或更多結構環內。於較佳的具體例中，該LAG-3抗原結合位址包含序列辨識編號：1內列出的該胺基酸序列於AB環內，以及序列辨識編號：3內列出的該胺基酸序列於該CH3域之EF環內。
序列辨識編號：1內列出的該胺基酸序列較佳座落於該CH3域之殘基11至18；及/或序列辨識編號：3內列出的該胺基酸序列係座落於該CH3域之殘基92至101；其中該胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics IMGT)編號方式。
該抗體分子的LAG-3抗原結合位址可進一步包含下列序列中的一者，較佳於該抗體分子的該CH3域之CD環內： (i) SNGQPENNY (序列辨識編號：2、8及18)； (ii) SNGQPEDNY (序列辨識編號：13)； (iii) SNGYPEIEF (序列辨識編號：23)； (iv) SNGIPEWNY (序列辨識編號：28)； (v) SNGYAEYNY (序列辨識編號：33)； (vi) SNGYKEENY (序列辨識編號：38)； (vii) SNGVPELNV (序列辨識編號：43)；或 (viii) SNGYQEDNY (序列辨識編號：48)。
較佳地，該抗體分子的LAG-3抗原結合位址進一步包含下列序列中的一者，較佳於該抗體分子的該CH3域之CD環內：序列辨識編號：2、28或38內列出的該胺基酸序列於該CH3域之CD環內。更佳地，該抗體分子的LAG-3抗原結合位址進一步包含序列辨識編號：2內列出的該胺基酸序列於該CH3域之CD環內。
序列辨識編號：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48內列出的該胺基酸序列較佳座落於該抗體分子的該CH3域之殘基43至78，其中該殘基係根據IMGT編號方式進行編號。
該抗體分子的該CH3域之序列，該LAG-3抗原結合位址的其餘序列，不特別限制。較佳地，CH3域為一種人類免疫球蛋白G域，例如一種人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域，最佳為一種人類IgG1 CH3域。人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域的序列為本技藝已知的。
於較佳的具體例中，該抗體分子包含序列辨識編號：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50內列出的該CH3域，更佳為序列辨識編號：5、30或40內列出的該CH3域，最佳為序列辨識編號：5內列出的該CH3域。任擇地，該抗體分子可包含帶有一胺基酸序列之一CH3域，該胺基酸序列與序列辨識編號：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50，較佳為序列辨識編號：5、30或40，更佳為序列辨識編號：5，有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
該抗體分子可進一步包含一CH2域。該CH2域較佳座落於該CH3域的N端，於人類IgG分子的情況下。該抗體分子的CH2域較佳為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2域，更佳為人類IgG1的CH2域。人類IgG域的序列為本技藝已知的。於較佳的具體例中，該抗體分子包含帶有序列辨識編號：53或序列辨識編號：54內列出的序列之IgG CH2域，或帶有與序列辨識編號：53或序列辨識編號：54有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之胺基酸序列的CH2域。
於較佳的具體例中，該抗體分子包含序列辨識編號：6、7、11、12、16、17、21、22、26、27、31、32、36、37、41、42、46、47、51或52內列出的序列，或與序列辨識編號：6、7、11、12、16、17、21、22、26、27、31、32、36、37、41、42、46、47、51或52內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。更佳地，該抗體分子包含序列辨識編號：6、7、31、32、41或42內列出的序列，或與序列辨識編號：6、7、31、32、41或42內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。再更佳地，該抗體分子包含序列辨識編號：6或7內列出的序列，或與序列辨識編號：6或7內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。
於較佳的具體例中，該抗體分子為一人類免疫球蛋白G分子，例如一種人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子，更佳為一種人類IgG1分子。人類免疫球蛋白G分子的序列為本技藝已知的且導入如此所揭示的CH3域或CH3域序列至此一分子之內對熟悉此藝者不會出現任何困難。
該抗體分子較佳包含序列辨識編號：92及93內列出的VH及/或VL域之CDRs。決定一假定的VH或VL域之CDR序列的方法係本技藝者已知的且包括Kabat及IMGT編號系統。更佳地，該抗體分子較佳包含序列辨識編號：86至91內列出的一或更多、二或更多、三或更多、四或更多、五或更多或全部六個互補性決定區域。較佳地，該抗體分子分別包含序列辨識編號：92及93內列出的VH及/或VL域。
於較佳的具體例中，該抗體分子包含序列辨識編號：94至113之任一者內列出的重鏈序列，或帶有與序列辨識編號：94至113之任一者有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之胺基酸序列的重鏈，條件是該重鏈序列的VH域保持不變。更佳地，該抗體分子包含序列辨識編號：94、95、104、105、108及109之任一者內列出的重鏈序列，或帶有與序列辨識編號：94、95、104、105、108及109之任一者有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之胺基酸序列的重鏈，條件是該重鏈序列的VH域保持不變。再更佳地，該抗體分子包含序列辨識編號：94或95內列出的重鏈序列，或帶有與序列辨識編號：94或95有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之胺基酸序列的重鏈，條件是該重鏈序列的VH域保持不變。
於另外的較佳具體例中，該抗體分子可額外，或任擇地包含序列辨識編號：116內列出的輕鏈序列，或帶有與序列辨識編號：116有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之胺基酸序列的輕鏈，條件是該輕鏈序列的VL域保持不變。
該抗體分子較佳能同時結合PD-L1及LAG-3。PD-L1及LAG-3可以，舉例而言，存在於二個不同的細胞上。不希望受理論束縛，認為此會導致細胞之間的交聯作用以及PD-L1及/或LAG-3的內化使其等無法刺激。
本發明人業已證明一種如本發明之抗體分子，其包含(i)用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址；以及(ii)一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內，FS18-7-9/84G09，出人意外地會媒介表現PD-L1細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)但不會媒介表現LAG-3細胞之補體依賴性細胞毒性，即使樣本內存在表現LAG-3及PD-L1細胞之混合物時。此性質預期可用於，像FS18-7-9/84G09的情況，該抗體分子之CDR-為基的抗原結合作用靶定腫瘤細胞且座落於該抗體分子之恆定域的結合位址靶定免疫細胞，如此會保護免疫細胞免受抗體分子結合所媒介的CDC傷害，同時腫瘤細胞會經歷CDC。
因而，於另外的具體例中，本發明係有關於一種結合腫瘤抗原及一免疫細胞抗原的抗體分子，其中該抗體分子包含： (i)用於一腫瘤抗原之一CDR-為基的抗原結合位址；以及 (ii)用於一免疫細胞抗原的一抗原結合位址座落於一恆定域內， 較佳為該抗體分子的一CH3或CH2域，更佳為一CH3域， 其中當該抗體分子結合包含該免疫細胞抗原的一免疫細胞時，該抗體分子不會媒介，或不會媒介顯著的該免疫細胞之補體依賴性細胞毒性。
較佳地，當該抗體分子結合包含該腫瘤抗原的一腫瘤細胞時，該抗體分子進一步媒介該腫瘤細胞之補體依賴性細胞毒性。
用於測量一抗體分子之CDC的方法係本技藝已知的且描述於本文內。
本發明人已進一步證明一種如本發明之抗體分子，其包含(i)用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址；以及(ii)一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內，FS18-7-9/84G09，與表現PD-L1細胞之ADCC相比，出人意外地會媒介表現LAG-3細胞減弱的抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)。此性質再次預期可用於，像FS18-7-9/84G09，該抗體分子之CDR-為基的抗原結合作用靶定腫瘤細胞且座落於該抗體分子之恆定域的結合位址靶定免疫細胞的情況，如此免疫細胞會經歷比抗體結合的腫瘤細胞更弱的ADCC。
如本文中所說明，用於減少或廢除抗體分子之ADCC活性的突變係本技藝已知的。本文所述之LALA突變係一個此種突變。意外地發現FS18-7-9/84G09對表現LAG-3細胞有低的ADCC活性。不需要完全廢除ADCC活性，此可能代表一優勢。
因而，於另外的具體例中，本發明係有關於一種結合腫瘤抗原及一免疫細胞抗原的抗體分子，其中該抗體分子包含： (i)用於一腫瘤抗原之一CDR-為基的抗原結合位址；以及 (ii)用於一免疫細胞抗原的一抗原結合位址座落於一恆定域內， 較佳為該抗體分子的一CH3或CH2域，更佳為一CH3域， 其中當該抗體分子結合包含該免疫細胞抗原的免疫細胞時，該抗體分子對於免疫細胞造成的ADCC比包含該腫瘤抗原的腫瘤細胞更小。較佳地，當該抗體分子結合包含該免疫細胞抗原的一免疫細胞時，該抗體分子不會媒介，或不會媒介顯著的免疫細胞之ADCC。當該抗體分子結合包含該免疫細胞抗原的一免疫細胞時，該抗體分子可能不會進一步媒介，或不會媒介顯著的該免疫細胞之補體依賴性細胞毒性，及/或當該抗體分子結合包含該腫瘤抗原的一腫瘤細胞時，可媒介該腫瘤細胞之補體依賴性細胞毒性。
用於測量一抗體分子之ADCC的方法係本技藝已知的且描述於本文內。
本技藝已知各種腫瘤抗原及免疫細胞抗原。腫瘤抗原及免疫細胞抗原較佳為細胞表面抗原。免疫細胞抗原較佳為出現於腫瘤浸潤淋巴細胞上的細胞表面抗原。
免疫細胞抗原之抗原結合位址較佳包含一或更多修飾於該抗體分子的恆定域之一或更多結構環內，例如恆定域之AB、CD及/或EF環。舉例而言，結合位址可以為如本文所述之LAG-3結合位址。
本發明之抗體分子可以結合至一免疫系統調控劑、胞毒型分子、放射性同位素或可偵測的標示。免疫系統調控劑可以為胞毒型分子為一細胞介素。
本發明亦提供一種編碼本發明之抗體分子的核酸，以及一種包含此一核酸之載體。
亦提供一種重組宿主細胞，其包含本發明之核酸或載體。此一重組宿主細胞可用於生產一抗體分子。因而，亦提供一種生產本發明的抗體分子之方法，該方法包含於用於生產該抗體分子的條件下培養該重組宿主細胞。該方法可進一步包含單離及/或純化該抗體分子的步驟。
本發明之抗體分子預期會於治療應用方面獲得應用，特別是人類之治療應用，例如癌症治療。因而，亦提供一種藥學組成物，其包含如本發明之抗體分子及一藥學上可接受的賦形劑。
本發明亦提供一種本發明之抗體分子，供用於治療一病患癌症的方法。亦提供一種治療一病患癌症的方法，其中該方法包含投與一治療有效量的如本發明之抗體分子至該病患。進一步提供一種如本發明之抗體分子供用於製造一藥劑之用途，該藥劑用於治療一病患的癌症。該治療可進一步包含投與一種抗腫瘤疫苗及/或化學治療藥物至該病患。
較佳實施例之詳細說明 本發明係有關於結合PD-L1及LAG-3二者的抗體分子。具體而言，本發明之抗體分子包含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址以及一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的恆定域內。術語“PD-L1”及“LAG-3”可以指人類PD-L1及人類LAG-3、鼠類PD-L1及鼠類LAG-3，及/或食蟹獼猴(cynomologus monkey)PD-L1及食蟹獼猴(cynomologus monkey)LAG-3，除非上下文另有要求。較佳地術語“PD-L1”及“LAG-3”係指人類PD-L1及人類LAG-3，除非上下文另有要求。
術語“抗體分子”描述一種不論是天然或部分或完全合成產生的免疫球蛋白。該抗體分子可以為人類或人化的。
該抗體分子較佳為單株抗體分子。抗體的實例為免疫球蛋白同型，例如免疫球蛋白G及其等之同型亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4分子，以及其片段。
當使用於本文中，術語“抗體分子”因而包括抗體片段，條件是此片段包含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址以及一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一恆定域內，例如CH1、CH2或CH3域，較佳為CH3域。除非上下文另有要求，當使用於本文中，術語“抗體分子”因而等效於“抗體分子或其片段”。
取得單株及其他抗體並使用重組DNA科技技術來生產保留原始抗體專一性的其他抗體或嵌合分子是有可能的。此等技術可涉及導入CDRs或可變異區域，及/或恆定域序列提供該LAG-3抗原結合位址，至不同的免疫球蛋白之內。導入一免疫球蛋白的CDRs至另一免疫球蛋白之內係描述於舉例而言EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400內。相似的技術可使用於相關的恆定域序列。任擇地，生產抗體分子的融合瘤或其他的細胞可經歷基因突變或其他的變化，其可能或可能不會改變所生產抗體的結合專一性。
因抗體可以以許多方式予以修飾，所以術語“抗體分子”應該解釋為涵蓋抗體片段、衍生物、功能等效物及抗體同源物，包括包含一免疫球蛋白結合域的任何多肽，不論是天然或完全或部分合成的。因而含括融合至另一多肽之包含一免疫球蛋白結合域或等效物的嵌合分子。嵌合抗體之選殖及表現係描述於EP-A- 0120694及EP-A-0125023之內。
一種包含CDR序列及CH3域二者之抗體片段之實例為一種微型抗體(minibody)，其包含連結一CH3域之scFv (Hu等人(1996), Cancer Res., 56(13):3055-61)。
本發明之抗體分子與PD-L1及LAG-3結合。於此上下文中結合可以指專一的結合。術語“專一的”可以指抗體分子不會與其專一的結合伙伴，於此為PD-L1及LAG-3，以外的分子表現出任何明顯結合的情況。術語“專一的”也可適用於抗體分子對一些抗原所攜帶的特定抗原決定位，如PD-L1及LAG-3上的抗原決定位為專一的情況中，在這種情況下抗體分子能與攜帶抗原決定位的各種抗原結合。
LAG-3與其最密切相關的蛋白，CD4共享40%的序列同一性。本發明人測試FS18-7-9 Fcab，其包含序列辨識編號：1至3內列出的胺基酸序列，用於結合CD4。FS18-7-9 Fcab顯現出不會結合CD4，證明此分子與LAG-3專一地結合。因而，於較佳的具體例中，本發明之抗體分子的LAG-3抗原結合位址與CD4不會結合，或不會顯現出任何明顯的結合。
本發明之抗體分子較佳包含一種LAG-3抗原結合位址。該LAG-3抗原結合位址係座落於該抗體分子的恆定域內，例如CH1、CH2、CH3或CH4域。較佳地，該LAG-3抗原結合位址係座落於該抗體分子的CH3域內。該LAG-3結合位址較佳包含胺基酸序列WDEPWGED(序列辨識編號：1)及PYDRWVWPDE。(序列辨識編號：3)。如實施例內所述之廣泛篩選及特徵化程序之後，本發明人辨識之所有最重要的抗-LAG-3 Fcab殖株(clone)內呈現此等序列。
序列辨識編號1及2內列出的胺基酸序列較佳座落於該抗體分子的恆定域之結構環內。將序列導入至抗體恆定域之結構環區域內以創造新的抗原結合位址，係描述於舉例而言，WO2006/072620及WO2009/132876內。
抗體恆定域之結構環包括AB、CD及EF環。於CH3域中，AB、CD及EF環係座落於CH3域的殘基11-18、43-78及92-101處，其中該胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方式。序列辨識編號：1內列出的該胺基酸序列較佳座落於該恆定域的AB環內。序列辨識編號：3內列出的該胺基酸序列較佳座落於該恆定域的該EF環內。更佳地，序列辨識編號：1內列出的該胺基酸序列係座落於該CH3域之殘基11至18；及/或序列辨識編號：3內列出的該胺基酸序列係座落於該CH3域之殘基92至101，其中該胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方式。
此外，該抗體分子較佳包含序列辨識編號：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48，更佳為序列辨識編號：2、28或38，再更佳為序列辨識編號：2，內列出的該胺基酸序列於該抗體分子的一恆定域之結構環內。該結構環較佳為CD環且該恆定域較佳為CH3域。序列辨識編號：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48內列出的該胺基酸序列較佳座落於該CH3域之殘基43至78，其中該胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方式。
本發明之抗體分子可進一步包含一麩胺酸殘基(E)於該CH3域之位置36及/或一酪胺酸殘基(Y)於該CH3域之位置85.2(如圖1A中所示)，其中該胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方式。特別地，一種包含序列辨識編號：8內列出的該CD結構環區域之抗體分子較佳進一步包含一麩胺酸殘基(E)於該CH3域之位置36。相似地，一種包含序列辨識編號：18內列出的該CD結構環區域之抗體分子較佳進一步包含一酪胺酸殘基(Y)於該CH3域之位置85.2。
於較佳的具體例中，本發明之抗體分子包含一CH3域，其包含、具有或由下列所組成：序列辨識編號：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50內列出的該序列，較佳為帶有序列辨識編號：5、30或40內列出的該序列之一CH3域，更佳為，帶有序列辨識編號：5內列出的該序列之一CH3域。
本發明之抗體分子可包含一CH3域，其包含、具有或由下列所組成：序列辨識編號：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50內列出的該序列，其中該CH3域序列進一步包含一離胺酸殘基(K)於序列辨識編號：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50內顯示的最接近序列C端處。因而，舉例而言，本發明之抗體分子可包含一CH3域，其包含、具有或由序列辨識編號：5內列出的該序列所組成，其帶有一離胺酸殘基於序列辨識編號：5內顯示的該序列C端處。此一CH3域的序列於是會如下： GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (序列辨識編號：135)
此外，本發明之抗體分子可包含一免疫球蛋白G分子之一CH2域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的CH2域。較佳本發明之抗體分子包含一IgG1分子的CH2域。該CH2域可具有序列辨識編號：53內列出的序列。
該抗體分子之CH2域可包含一突變以減少或廢除CH2域與一個或更多個FcγR受體，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII及/或補體的結合作用。人類IgG域之CH2域一般與Fcγ受體及補體結合，以及本發明人假設與Fcγ受體減少的結合作用會降低抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)以及與補體減少的結合作用會降低該抗體分子之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。用於減少或廢除CH2域與一個或更多個Fcγ受體及補體之結合作用的突變為已知的以及包括Bruhns等人(2009)及Xu等人(2000)之內描述的“LALA突變”。因而，該抗體分子可包含一CH2域，其中該CH2域包含丙胺酸殘基於CH2域之位置4及5，其中編號係根據IMGT編號方式。舉例而言，該抗體分子包含一IgG1 CH2域，其包含、具有或由序列辨識編號：54內列出的該序列所組成。
本發明之抗體分子包含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址。術語“CDR-為基的抗原結合位址”係指一種抗體分子可變異區域之抗原結合位址，該抗體分子可變異區域係由六個CDRs組成。對抗PD-L1的抗體分子之製備，及此抗體分子之CDR序列之判定，係在本技術人員的能力範圍內且許多合適的技術係本技藝已知的。
較佳地，本發明之抗體分子包含抗體84G09之HCDR3。已知HCDR3於決定抗體分子之專一性方面扮演一角色 (Segal等人，(1974), PNAS, 71:4298-4302；Amit等人，(1986), Science, 233:747-753；Chothia等人，(1987), J. Mol. Biol., 196:901-917；Chothia等人，(1989), Nature, 342:877-883；Caton等人，(1990), J. Immunol., 144:1965-1968；Sharon等人，(1990a), PNAS, 87:4814-4817；Sharon等人，(1990b), J. Immunol., 144:4863-4869；Kabat等人，(1991b), J. Immunol., 147:1709-1719)。
該抗體分子可進一步包含抗體84G09之HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2及/或LCDR3。分別顯示於序列辨識編號：92及93內之抗體84G09的VH及VL域序列的CDRs序列之判定對於熟悉此藝者沒有困難。CDR序列可以，舉例而言，根據卡貝特氏(Kabat)(Kabat, E.A.等人，(1991))或IMGT編號方式來決定。
抗體84G09之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的序列，根據IMGT編號方式，係分別列於序列辨識編號：86、87、88、89、90及91內。
抗體84G09之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的序列，根據卡貝特氏，係分別列於序列辨識編號：136、137、138、139、140及141內。
該抗體亦可包含抗體84G09之VH及/或VL域。抗體84G09之VH及VL域序列係分別顯示於序列辨識編號：92及93內。
於較佳的具體例中，本發明之抗體分子包含(i)用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址，其包含抗體84G09之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，以及(ii)一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內，其中該LAG-3結合位址包含序列辨識編號：1及3內列出的胺基酸序列，及選自於下列所構成的群組之胺基酸序列：序列辨識編號：2、8、13、18、23、28、33、38、43及48。
更佳地，本發明之抗體分子包含(i)用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址，其包含抗體84G09之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，以及(ii)一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內，其中該LAG-3結合位址包含序列辨識編號：1及3內列出的胺基酸序列，及選自於下列所構成的群組之胺基酸序列：序列辨識編號：2、28及38。
再更佳地，本發明之抗體分子包含(i)用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址，其包含抗體84G09之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，以及(ii)一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內，其中該LAG-3結合位址包含序列辨識編號：1、2及3內列出的胺基酸序列。
於較佳的具體例中，本發明之抗體分子包含一VH域及一VL域，其分別包含、具有或由序列辨識編號：92及93內列出的該序列所組成，以及一CH3域，其包含、具有或由序列辨識編號：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50內列出的該序列所組成，較佳為一CH3域，其包含、具有或由序列辨識編號：5、30或40內列出的該序列所組成，更佳為一CH3域，其包含、具有或由序列辨識編號：5內列出的該序列所組成。
於另外的較佳具體例中，該抗體分子包含一重鏈，其包含、具有或由序列辨識編號：94至113內列出序列，以及一輕鏈，其包含、具有或由序列辨識編號：116內列出的該序列所組成。更佳地，該抗體分子包含一重鏈，其包含、具有或由序列辨識編號：94、95、104、105、108及109內列出的該序列所組成，以及一輕鏈，其包含、具有或由序列辨識編號：116內列出的該序列所組成。最佳地，該抗體分子包含一重鏈，其包含、具有或由序列辨識編號：94或95內列出的該序列所組成，以及一輕鏈，其包含、具有或由序列辨識編號：116內列出的該序列所組成。
本發明之抗體分子亦可包含於此所揭示的結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、輕鏈或重鏈序列之變異體，條件是輕鏈及重鏈序列之VL及VH域分別保持不變。可藉由序列改變或突變及篩選的方法來得到合適的變異體。於較佳的具體例中，一種包含一或更多變異體序列的抗體分子保留親代抗體分子的一或更多功能特徵，例如LAG-3及PD-L1之結合專一性及/或結合親和力。舉例而言，一種包含一或更多變異體序列的抗體分子較佳以相同的親和力，或比(親代)抗體分子更高的親和力與LAG-3及/或PD-L1結合。親代抗體分子為一種抗體分子其不含已經併入變異體抗體分子內的胺基酸取代、缺失及/或插入。
舉例而言，本發明之抗體分子可包含一結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、輕鏈或重鏈序列，其與於此所揭示的結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、、輕鏈或重鏈序列，有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性，條件是該輕鏈及重鏈序列的VL及VH域，分別保持不變。
於較佳的具體例中，本發明之抗體分子包含一CH3域序列，其與序列辨識編號：4、5或135內列出的CH3域序列有至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性。
於另外的較佳具體例中，本發明之抗體分子包含一CH3及CH2域序列，其與序列辨識編號：6或7內列出的CH2及CH3域序列有至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性。
序列同一性一般係參考演算法GAP (Wisconsin GCG軟體包，Accelerys Inc, San Diego USA)來定義。GAP使用Needleman及Wunsch演算法來排列兩個完整序列其使得匹配數目最大且間隙數目最小。一般而言，使用預設參數，且空格創造罰分(gap creation penalty)=12以及空格擴展罰分=4。使用GAP可能是較佳的但是可使用其他的演算法，例如BLAST(其使用Altschul等人(1990) J. MoI. Biol. 215: 405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448的方法)，或Smith-Waterman演算法(Smith and Waterman (1981) J. MoI Biol. 147: 195-197)，或之前的Altschul等人(1990)之TBLASTN程式，一般使用預設參數。特別地，可以使用psi-Blast演算法(Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402)。
本發明之抗體分子亦可包含一結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、輕鏈或重鏈序列，其與於此所揭示的一結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、輕鏈或重鏈序列相比，具有一或更多個胺基酸序列改變(加入、缺失、取代及/或插入一胺基酸殘基)，較佳20個改變或更少、15個改變或更少、10個改變或更少、5個改變或更少、4個改變或更少、3個改變或更少、2個改變或更少或是1個改變，條件是輕鏈及重鏈序列之VL及VH域分別保持不變。特別地，可以於VH及VL域序列之外的該抗體分子之一或更多框架區域內進行改變。
於較佳的具體例中，本發明之抗體分子可包含一CH3域序列，其與序列辨識編號：4、5或135內列出的CH3域序列相比，具有一或更多個胺基酸序列改變(加入、缺失、取代及/或插入一胺基酸殘基)，較佳20個改變或更少、15個改變或更少、10個改變或更少、5個改變或更少、4個改變或更少、3個改變或更少、2個改變或更少或是1個改變。
於另外的較佳具體例中，本發明之抗體分子包含一CH3及CH2域序列，其與序列辨識編號：6或7內列出的CH2及CH3域序列相比，具有一或更多個胺基酸序列改變(加入、缺失、取代及/或插入一胺基酸殘基)，較佳20個改變或更少、15個改變或更少、10個改變或更少、5個改變或更少、4個改變或更少、3個改變或更少、2個改變或更少或是1個改變。
亦預期一種抗體分子，其與本發明之抗體分子競爭與LAG-3及/或PD-L1之結合，或其與如本發明之抗體分子之LAG-3及/或PD-L1上相同的抗原決定位結合，其中該抗體分子包含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址以及一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內二者。用於決定二種抗體競爭一抗原之方法係本技藝已知。舉例而言，二種抗體與一抗原結合之競爭能使用BIAcore來判定。用於定位一種抗體結合的抗原決定位之方法同樣為本技藝已知的。
本發明之抗體分子較佳以1 x 10-9 M的親和力(KD )或更大的親和力與LAG-3結合。舉例而言，本發明之抗體分子可以8 x 10-10 M的親和力(KD )或更大的親和力與LAG-3結合。
Fcabs具有比單株抗體更小的結合界面，因Fcabs的結合位址形成相對緊密的抗體片段帶有位處極接近的二個結合位址。相反地，典型的mAb之Fab臂係由一種撓性鉸鏈區分隔開。當與典型的mAb之該等相比之下，Fcab的二個抗原結合位址亦在空間上彼此接近。基於此更小的結合界面及二個結合位址降低的可撓性，抗-LAG-3 Fcabs能結合且以如單株抗體基準相似的親和力及效能抑制LAG-3是令人驚異的。
本發明之抗體分子較佳以1 x 10-9 M的親和力(KD )或更大的親和力與PD-L1結合。
一抗體分子與同源抗原，諸如LAG-3或PD-L1的結合親和力能由，舉例而言表面電漿子共振(SPR)來判定。一抗體分子與細胞表面上表現的同源抗原，諸如LAG-3或PD-L1的結合親和力能由流動式細胞測量術來判定。
本發明之抗體分子較佳能與細胞表面上表現的LAG-3及PD-L1結合。細胞較佳為癌細胞。
本發明之抗體分子較佳能同時結合LAG-3及PD-L1。於較佳的具體例中，本發明之抗體分子能同時結合LAG-3及PD-L1，其中LAG-3及PD-L1係表現於單一細胞表面上或二個分開的細胞表面上。
本發明之抗體分子可結合人類LAG-3、鼠類LAG-3及/或食蟹獼猴LAG-3。較佳地，本發明之抗體分子結合人類LAG-3。最佳地，本發明之抗體分子結合人類LAG-3及人類PD-L1。
本發明之抗體分子包含(i)用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址；以及(ii)一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的恆定域內。不含一種LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的恆定域，諸如CH3域內之抗體分子，因而不會形成本發明的一部分。相似地，不含用於PD-L1之一CDR-為基的抗原結合位址之分子不會形成本發明的一部分。
本發明之抗體分子可以結合至一治療劑或可偵測的標示。在這種情況下，該抗體分子可以稱為結合物(conjugate)。舉例而言，該抗體分子可以結合至一免疫系統調控劑、胞毒型分子、放射性同位素或可偵測的標示。免疫系統調控劑或胞毒型分子可以為一細胞介素。可偵測的標示可以為一放射性同位素，諸如非治療放射性同位素。
該抗體分子可以藉由胜肽鍵或鍵接子結合至治療劑或可偵測的標示，換言之於融合多肽之內，該融合多肽包含該治療劑或可偵測的標示及該抗體分子或其多肽鏈組分。其他用於結合的構件包括化學結合，尤其是使用雙功能製劑之交聯作用(諸如使用DOUBLE-REAGENTSTM Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce)。
該抗體分子及治療劑或可偵測的標示因而可以，舉例而言經由任何合適的化學鍵或經由鍵接子，例如胜肽鍵接子而直接彼此連接。
胜肽鍵接子可以為短的(2-20，較佳2-15個胺基酸殘基長(stretch))。合適的胜肽鍵接子序列之實例係本技藝已知的。可以使用一或更多不同的鍵接子。鍵接子長度可以為約5個胺基酸。
化學鍵可以為，舉例而言，共價或離子鍵。共價鍵之實例包括胜肽鍵(醯胺鍵)及雙硫鍵。舉例而言該抗體分子及治療或診斷劑可以共價鍵接。舉例而言藉由胜肽鍵(醯胺鍵)。因而，該抗體分子及治療或診斷劑可以生產(分泌)為單鏈多肽。
本發明亦提供編碼本發明之抗體分子之經單離的核酸。使用本技藝眾所周知的方法來製備此核酸對於熟悉此藝者沒有困難。一種經單離的核酸可，舉例而言藉由表現於細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞內，而用來表現本發明之抗體分子。較佳的宿主細胞為哺乳動物細胞諸如CHO、HEK或NS0細胞。核酸一般而言會以用於表現重組載體的形式來提供。
經單離的核酸可，舉例而言，包含序列辨識編號：142、4、9、14、19、24、29、34、39、44或49內列出的序列，其分別編碼FS18-7-9(CHO密碼子最佳化核苷酸序列)、FS18-7-9(HEK293表現的核苷酸序列)、FS18-7-32、FS18-7-33、FS18-7-36、FS18-7-58、FS18-7-62、FS18-7-65、FS18-7-78、FS18-7-88及FS18-7-95的CH3域。
包含此核酸及載體之活體外宿主細胞為本發明的一部分，因表現本發明的抗體分子為其等之用途，其可隨後自細胞培養物純化且選擇性地調配成一藥學組成物。本發明因而進一步提供一種生產本發明抗體分子之方法，其包含於用於生產該抗體分子的條件下培養本發明的重組宿主細胞。用於培養如上提及合適的宿主細胞之方法為本技藝眾所周知的。該方法可進一步包含單離及/或純化該抗體分子。該方法亦可包含調配該抗體分子成一藥學組成物，選擇性地加上一藥學上可接受的賦形劑或如以下所述之其他物質。
已知PD-L1表現於許多癌細胞上，而LAG-3於癌細胞上的表現更加受限。二者均表現於免疫系統細胞上。特別地，已知LAG-3表現於腫瘤環境內衰竭的T細胞上。此外，本發明人已經證明使用一種結合LAG-3及PD-L1二者的抗體分子於抑止同基因小鼠癌症模式之腫瘤生長是有效的，以及此抗體分子比分別投與結合LAG-3及PD-L1的二種結合分子是更有效的。
因而，本發明之抗體分子可用於一種治療一病患癌症的方法。病患較佳為人類病患。
要使用本發明之抗體分子治療的癌症可表現LAG-3，舉例而言於其等之細胞表面上。在一具體例中，要治療的癌症細胞可能已經判定要表現LAG-3，舉例而言於其等之細胞表面上。舉例來說，B細胞淋巴瘤已經證明表現LAG-3於其等之細胞表面上。用於判定一種抗原於細胞表面上的表現之方法為本技藝已知的且包括，舉例而言，流動式細胞測量術。
以下的實施例4證明本發明之抗體分子可用於治療小鼠體內帶有高位準表現LAG-3免疫細胞，諸如表現LAG-3 TILs。因而，額外，或任擇地，要使用本發明之抗體分子治療的癌症腫瘤可包含表現LAG-3免疫細胞。表現LAG-3免疫細胞，諸如表現LAG-3 TILs，係存在於許多癌症的腫瘤細胞之間。在一具體例中，要使用本發明之抗體分子治療的癌症腫瘤已經判定含有表現LAG-3免疫細胞。用於判定一種腫瘤或腫瘤周圍表現LAG-3免疫細胞存在的方法為本技藝已知的。
以下的實施例4亦證明本發明之抗體分子可用於治療其等之細胞表面上表現PD-L1之腫瘤。因而，額外，或任擇地，要使用本發明之抗體分子治療的癌症細胞可表現PD-L1，舉例來說於其等之細胞表面上。額外或任擇地，要治療的癌症腫瘤可包含表現PD-L1的免疫細胞，諸如TILs。要治療的癌症細胞可能已經判定表現PD-L1，舉例來說於其等之細胞表面上。額外或任擇地，要治療的癌症腫瘤可能已經判定包含表現PD-L1的免疫細胞，諸如TILs。
細胞表面表現LAG-3及PD-L1預期會允許該抗體分子與免疫細胞及/或癌細胞表面上表現的LAG-3及PD-L1。認為此狀況導致癌細胞及免疫細胞之導向療法、架橋及定位。
要使用本發明之抗體分子治療的癌症可以選自於下列所構成的群組：何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(譬如瀰漫型大B細胞淋巴瘤、緩慢型(indolent)非何杰金氏淋巴瘤、外膜細胞淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌(colorectal cancer)、纖維肉瘤、腎細胞癌、黑色素瘤、胰臟癌、乳癌、多形性神經膠質母細胞瘤、肺癌(譬如非小細胞肺癌)、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、胃癌(stomach cancer) (胃癌(gastric cancer))、膀胱癌、子宮頸癌、子宮癌、陰門癌、睪丸癌、陰莖癌、白血病(譬如慢性淋巴球性白血病、骨髓性白血病、急性類淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastoid leukaemia)或慢性類淋巴母細胞白血病)、多發性骨髓瘤、鱗狀細胞癌、睪丸癌、食道癌(譬如胃食道交接處腺癌)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)及中樞神經系統(CNS)淋巴瘤、肝細胞癌、鼻咽癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)及間皮瘤。此等癌症腫瘤已知，或預期會表現PD-L1於其等之細胞表面上及/或含有表現PD-L1及/或LAG-3的免疫細胞，例如TILs。
使用抗-LAG-3抗體進行的腎細胞癌、肺癌(譬如非小細胞肺癌)、鼻咽癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、胃癌(stomach cancer) (胃癌(gastric cancer))、食道癌(譬如胃食道交接處腺癌)、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、白血病(譬如慢性淋巴球性白血病、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(譬如瀰漫型大B細胞淋巴瘤、緩慢型(indolent)非何杰金氏淋巴瘤、外膜細胞淋巴瘤)及多發性骨髓瘤之治療，業已在臨床試驗中研究且顯現出大有可為的結果。因而，要使用本發明之抗體分子治療的癌症可以為腎細胞癌、肺癌(譬如非小細胞肺癌)、鼻咽癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、胃癌(stomach cancer) (胃癌(gastric cancer))、食道癌(譬如胃食道交接處腺癌)、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、白血病(譬如慢性淋巴球性白血病、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(譬如瀰漫型大B細胞淋巴瘤、緩慢型(indolent)非何杰金氏淋巴瘤、外膜細胞淋巴瘤)或多發性骨髓瘤。
使用抗-PD-L1抗體進行的黑色素瘤、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、間皮瘤、肺癌(譬如非小細胞肺癌)、卵巢癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、胰臟癌、黑色素瘤及肝細胞癌之治療，業已在臨床試驗中研究且顯現出大有可為的結果。因而，要使用本發明之抗體分子治療的癌症可以為黑色素瘤、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、間皮瘤、肺癌(譬如非小細胞肺癌)、卵巢癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、胰臟癌、黑色素瘤或肝細胞癌。
使用本發明之抗體分子進行治療的較佳癌症為肺癌(譬如非小細胞肺癌)、膀胱癌、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、瀰漫型大B細胞淋巴瘤、胃癌、膀胱癌及肝細胞癌。此等癌症腫瘤已知會包含表現LAG-3免疫細胞以及會表現PD-L1於其等之細胞表面上或會包含表現PD-L1的免疫細胞。
本申請案提及一特定種類的癌症的情況中，諸如乳癌，此係指相關組織，在這種情況下為乳房組織的惡性轉化。一種源自於不同組織，諸如卵巢組織惡性轉化的癌症，可能於身體的另一位置，諸如乳房導致轉移性病灶，但是本文不會由此稱為乳癌而是稱為卵巢癌。
癌症可為原發性或繼發性癌症。因而，本發明之抗體分子可用於一種治療一病患癌症的方法，其中該癌症為原發性腫瘤及/或腫瘤轉移。
本發明之抗體分子係設計用於治療病患，較佳為人類病患之方法中。抗體分子通常會以一藥學組成物之形式投與，該藥學組成物可包含該抗體分子以外之至少一組分，例如一種藥學上可接受的賦形劑。舉例而言，本發明之藥學組成物，除了活性成分之外，可包含一藥學上可接受的賦形劑、載劑、緩衝液、安定劑或本技藝熟悉此藝者眾所周知的其他物質。此等物質不應具有毒性並且不應干擾活性成分之功效。載體或其他物質的確切性質將依投與途徑而定，投與途徑可為經由注射，如靜脈或皮下注射。該抗體分子可靜脈內或皮下投與。
液態藥學組成物一般包含一液態載劑，諸如水、石油、動物或植物油、礦油或合成油。可包括生理食鹽水溶液、右旋糖或其他醣溶液或二醇類諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
就靜脈注射或病痛部位的注射而言，該抗體分子或包含該抗體分子的藥學組成物較佳係呈一種非經腸可接受的水溶液形式，其係無熱原及具有適宜的pH值、等滲透壓性及安定性。本技藝相關技藝者足能使用，舉例而言，等滲透壓性載劑諸如氯化鈉注射液、林格氏(Ringer)注射液、乳酸林格氏注射液來製備適宜的溶液。可視需要使用防腐劑、安定劑、緩衝液、抗氧化劑及/或其他添加劑。許多用於製備藥學調配物的方法係本技藝熟悉此藝者已知的。參見例如，Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
一種包含如本發明之抗體分子的組成物可以單獨投與或是組合以其他的治療同時或相繼投與，或與另一種治療劑(agent)或治療劑(agents)作為一種組合製備物，取決於待治療的病況。舉例而言，本發明之抗體分子可以組合以用於待治療的疾病，例如以上提及的癌症現存的治療劑。舉例而言，本發明之抗體分子可以組合以第二種抗癌療法，例如化學療法、抗腫瘤疫苗接種(亦稱為癌症疫苗接種)、放射療法、免疫療法、溶瘤病毒、嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法或激素療法投與至病患。
本發明之抗體分子預期可作用為抗癌療法，例如化學療法、抗腫瘤疫苗接種或放射療法的佐劑。不希望受理論束縛，認為投與該抗體分子至病患作為化學療法、抗腫瘤疫苗接種或放射療法的一部分會觸發對抗癌症關聯性抗原LAG-3及PD-L1，比化學療法、抗腫瘤疫苗接種或放射療法單獨達成的免疫反應更大的免疫反應。舉例而言，抗-LAG-3療法已經於治療小鼠病毒為基的病狀顯示出良好的功效(Blackburn SD等人，2009)。
一種治療一病患癌症的方法因而可包含投與一治療有效量的如本發明之抗體分子組合以一化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑至該病患。該化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑較佳為用於所談論的癌症之化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑，亦即已經證實對治療所談論的癌症有效的化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑。已經證實對治療所談論的癌症有效之合適的化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑的選擇係在本技術人員的能力範圍內。
舉例而言，於該方法包含投與一治療有效量的如本發明之抗體分子組合以一種化學治療劑的情況中，該化學治療劑係來自下列所組成的群組：紫杉烷(taxanes)、胞毒型抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、PARP抑制劑、B_RAF酵素抑制劑、烷化劑、鉑類似物、核苷類似物、沙利竇邁(thalidomide)衍生物、抗惡性腫瘤化學治療劑及其他。紫杉烷包括多烯紫杉醇(Docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)及nab-紫杉醇；胞毒型抗生素包括放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、蒽環(anthracyclines)、多柔比星(doxorubicin)及戊柔比星(valrubicin)；酪胺酸激酶抑制劑包括厄洛替尼(erlotinib)、吉菲替尼(gefitinib)、阿西替尼(axitinib)、PLX3397、伊馬替尼(imatinib)、考比替尼(cobemitinib)及曲美替尼(trametinib)；PARP抑制劑包括尼拉帕尼(piraparib)；B-Raf酵素抑制劑包括維羅非尼(vemurafenib)及達拉菲尼(dabrafenib)；烷化劑包括達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)；鉑類似物包括卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)及奥沙利鉑(oxaliplatin)；核苷類似物包括吉西他汀(gemcitabine)及阿扎胞苷(azacitidine)；抗惡性腫瘤劑包括氟達拉濱(fludarabine)。合適用於本發明之其他的化學治療劑包括胺甲喋呤(methotrexate)、地法替尼(defactinib)、恩替諾特(entinostat)、培美曲塞(pemetrexed)、卡培他濱(capecitabine)、艾日布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)、氟尿嘧啶(fluorouracil)及長春鹼(vinblastine)。
癌症治療之疫苗接種策略已於臨床中執行且於科學文獻中詳盡地討論(諸如Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccines)。此主要涉及激起免疫系統以對自體或同種異體癌症細胞表現的各種細胞標記起反應，自體或同種異體癌症細胞係藉由使用該等細胞作為疫苗接種方法，自體或同種異體癌症細胞二者帶有或不帶有顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。GM-CSF於抗原呈現激起強大的反應且當與該策略一起使用時運作得特別好。
可按足以顯示對於一病患之益處之一“治療有效量”予以投與。該益處至少可改善至少一症狀。因而“治療”一指定疾病係指改善至少一症狀。所投與的實際量及投與速率與時程，將依所治療病況的性質與嚴重性、所治療的特定病患、個別病患的臨床狀況、該障礙的肇因、組成物的遞輸部位、抗體分子的類型、投與方法、投與日程安排及執業醫師所知的其他因素而定。開立治療處方，例如決定劑量等等，係屬於普通科醫師及其他醫師的責任範圍內，及可能依所治療疾病的症狀嚴重性及/或惡化程度而定。適當的抗體分子劑量係本技藝眾所周知的(Ledermann等人(1991) Int. J. Cancer 47: 659-664；及Bagshawe等人(1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922)。可使用本文所示的特定劑量或Physician's Desk Reference (2003)中所指出之適合所投與抗體分子的特定劑量。可藉由比較其活體外活性與在一動物模式中之活體內活性而判定一抗體分子的一治療有效量或適宜劑量。用於外推小鼠及其他測試動物之有效劑量至人類的方法係已知的。確切劑量將依數項因子而定，包括待治療區域的大小與位置以及該抗體分子的確切性質。治療可以以每天、每星期二次、每星期或每個月的間隔予以重複，由醫師自行決定。治療可在手術之前及/或之後投予，並且可投與或直接施用在外科手術治療的解剖部位上。
鑑於包括下列實驗例證在內之本揭露內容，本發明的其他態樣與具體例將為本技藝熟悉此藝者所顯而易見者。
本說明書所提及之所有文件係以其等之整體藉此併入以作為參考資料。
本文所用之“及/或”應視為兩種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示內容。舉例而言，“A及/或B”應視為(i)A、(ii)B以及(iii)A及B之每一者的特定揭示內容，如同各者係在本文中個別陳述一樣。
除非上下文另有規定，以上所列特性之說明與定義並非受限於本發明的任一特定態樣或具體例且同樣適用於所述的所有態樣與具體例。
現在將藉由實施例及參考以上所述之圖式來說明本發明的特定態樣與具體例。實施例 實施例1–Fcab分子之選擇及特徵化1.1 抗 人類LAG-3 Fcabs 之初始的選擇(Naïve selection) 及親和力成熟 1.1.1 初始的選擇
使用具有AB(殘基14-18)及EF(殘基92-101)環內隨機化、展示人類IgG1(IMGT編號1.4-130)的CH3域之初始的噬菌體庫來選擇重組Fc-標誌的人類LAG-3(LAG-3 Fc)抗原(R&D systems, 2319-L3-050)。使用蛋白A(Life Technologies, 10002D)或蛋白G(Life Technologies, 10004D)小珠上捕獲的抗原來進行庫之三輪選擇。用ELISA來篩選產品以及亞選殖(sub-cloned)陽性結合者且使用EasySelectPichia 表現套組(Life Technologies, K1740-01)予以表現為可溶性Fcabs(含截斷的鉸鏈)於巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )內。繼而以Biacore 3000(GE Healthcare)來篩選Fcabs對重組人類LAG-3 Fc之結合作用。簡言之，LAG-3 Fc(R&D systems, 2319-L3-050)係使用胺偶合作用(GE Healthcare, BR-1000-50)、以7200 RU的密度予以偶合至CM5晶片(GE Healthcare, BR-100012)。Fcabs係以HBS-P(GE Healthcare, BR100368)緩衝液予以稀釋且以250 nM、500 nM及1000 nM注射3 min然後允許在緩衝液中解離5 min。減去參考的數據(LAG-3 Fc流動室(flow cell)2–空白流動室)係使用BIAevaluation 3.2軟體來分析以辨識結合作用。繼而測試Fcabs與HEK細胞-表現的人類LAG-3(LAG-3選殖至pcDNA5FRT載體之內[Life Technologies, V6010-20] [關於方法論見第1.4.5節])之結合作用。簡言之，生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B (Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)及1 µg/ml多西環素(Doxycyclin) (Sigma, D9891)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內、過度表現人類LAG-3的HEK 293細胞係使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離以及以2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤內。Fcabs係以5 µM配於100 µl體積與細胞於4 ℃下培育1 h。清洗平盤二級抗體(抗人類Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)係以PBS稀釋1:1000及添加100 µl至細胞且於4 ℃下培育30 min。清洗平盤以及使細胞再懸浮於含1 µg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。以BD FACSCanto II細胞計數器(BD Biosciences)來讀取平盤以及使用FlowJoX來分析數據。Fcabs繼而藉由使用脂質體(lipofectamine) (Life Technologies, 11668-019)轉形至Flp-In T-Rex 293細胞(Life Technologies, R780-07)內而表現於哺乳動物細胞內。測試結合LAG-3 Fcabs對於A375細胞(ATCC, CRL-1619)上的人類第II類MHC與重組LAG-3 Fc之結合的抑制(使用實施例1.6內的方法論)。從三輪噬菌體選擇辨識出54個獨特的Fcab序列，以及此等Fcabs中的12者係藉由BIAcore分析來判定會結合LAG-3 Fc及/或結合表現LAG-3 HEK細胞。三個選擇的Fcabs也能抑制LAG-3與第II類MHC之交互作用以及選擇用於親和力成熟。三種Fcabs稱為FS18-3、FS18-7及FS18-21。 1.1.2 親和力成熟 第一次親和力成熟
使用以上所述之初始選擇方法所辨識的三種Fcabs之各者，AB環內的五個殘基(殘基14-18)以及EF環內的五個(殘基92-94及97-98)或八個(殘基92-94及97-101)殘基進行隨機化，來建構六個噬菌體展示親和力成熟庫。
親和力成熟庫係使用重組人類LAG-3 Fc (R&D systems, 2319-L3-050)及表現人類LAG-3的HEK細胞(如以上所述)來選擇。用噬菌體ELISA來篩選產品，亞選殖(sub-cloned)陽性結合者且表現為可溶性Fcabs(含截斷的鉸鏈)於HEK Expi293細胞之內(Fcabs選殖至pTT5載體[National Research Council of Canada]之內、使用ExpiFectamine 293轉染套組[Life Technologies, A14524]轉染至Expi293F細胞[Life technologies, A14527]內)。繼而篩選HEK表現的可溶性Fcabs與細胞表現的人類LAG-3之結合、與細胞表現的食蟹獼猴LAG-3之結合作用(方法如實施例1.4.3)，以及阻斷第II類MHC與重組LAG-3 Fc結合的能力(方法如實施例1.6)。進一步測試阻斷性Fcabs以決定其等是否能於T細胞活化分析內逆轉LAG-3誘發的IL-2分泌抑制作用(方法如實施例2.1)。使用此等方法自六個親和力成熟庫辨識出61個獨特的抗-LAG-3 Fcab。來自FS18-7譜系之親和力成熟的Fcabs顯示出與食蟹獼猴LAG-3最高位準的交叉反應性。選擇來自此譜系、與食蟹獼猴LAG-3 Fc有最強之結合作用及於T細胞活化分析內有最高活性的三種Fcabs(稱為FS18-7-7、FS18-7-9與FS18-7-11)進行進一步親和力成熟。此等三種Fcabs亦證實會阻斷LAG-3 Fc與表現第II類MHC細胞之交互作用。 第二次親和力成熟
使用來自第一次親和力成熟之三種Fcabs (FS18-7-7、FS18-7-9與FS18-7-11)匯集來創造進一步親和力成熟庫。CD環很難使用ELLA Biotech的隨機化引子進行隨機化。CD環內一部分的胺基酸位置(殘基45.1-78)係使用等莫耳分布的胺基酸予以隨機化，除了半胱胺酸之外。也於整個CH3域序列各處進行易出錯PCR以導入可提升結合作用的額外突變。
親和力成熟庫係以噬菌體來生產且對生物素化重組LAG-3 avi-Fc(BPS Bioscience, 71147)及HEK hLAG-3細胞執行選擇以及藉由噬菌體ELISA來篩選重組LAG-3 Fc(R&D systems, 2319-L3-050)之結合作用。HEK293F細胞內表現86個獨特的Fcabs(含截斷的鉸鏈)。選擇的Fcabs也於如以上所述之T細胞活化分析來篩選活性。於第二次親和力成熟期間辨識出九個Fcab且於T細胞活化分析有最高的活性(FS18-7-32；FS18-7-33；FS18-7-36；FS18-7-58；FS18-7-62；FS18-7-65；FS18-7-78；FS18-7-88；及FS18-7-95)，以及親代Fcab殖株，FS18-7-9，接而如以下所述予以進一步特徵化。此等九個Fcabs對親代Fcab殖株，FS18-7-9，之序列排列比對係顯示於圖 1A 內。圖1B 詳述九個Fcab殖株各者與親代Fcab殖株，FS18-7-9之序列同一性百分率。源自於二個其他的親代Fcab殖株，FS18-7-7及FS18-7-11，之親和力成熟的Fcabs，不像源自於FS18-7-9之親和力成熟的該等為有前途的候選者以及因而不進一步進行。1.2 對 小鼠LAG-3 專一的 代理者Fcab 之選擇
使用以上所述之初始選擇程序所選擇的Fcab FS18-7，係用來生產噬菌體庫以選擇抗小鼠LAG-3。執行二輪親和力成熟，以及於親和力成熟後選出Fcab殖株FS18-7-108-29及FS18-7-108-35，其等顯示出與小鼠LAG-3之高親和力、專一性結合。FS18-7-108-29及FS18-7-108-35於T細胞活化分析內抑制小鼠LAG-3的能力被確認。使用Octet(Forteo Bio)進行的抗原決定位定位顯示抗小鼠LAG-3 Fcabs與抗人類LAG-3 Fcabs(如以上所述於第二次親和力成熟後選出的)競爭與人類LAG-3的結合。於抗人類LAG-3及抗小鼠LAG-3 Fcabs之間有4及8個殘基之間的差異。因而預期抗小鼠LAG-3 Fcabs代表為抗人類LAG-3 Fcabs於小鼠體內之結合作用及功能合適的代理者。1.3 假mAb2 之建構及表現
製備包含以上的1.1及1.2辨識出的最重要的抗人類LAG-3及抗小鼠LAG-3 Fcabs之“假”mAb2 俾以允許此等呈mAb2 形式的Fcabs之特徵化。此等假mAb2 係製備自抗LAG-3 Fcabs及抗-FITC抗體4420之可變異區域(關於詳情見序列辨識編號：83、序列辨識編號：84及序列辨識編號：85) (Bedzyk, W. D.等人，1989及Bedzyk, W. D.等人，1989)。於重鏈的CH2域帶有(序列辨識編號：63、65、67、69、71、73、75、77、79及81)或不帶有(序列辨識編號：64、66、68、70、72、74、76、78、80及82)LALA突變(關於詳情見以下的第1.5節)以及進一步包含抗-FITC mAb 4420的輕鏈(序列辨識編號：85)之假mAb2 二者係予以製備。藉由暫時表現於HEK293-6E細胞及使用mAb Select SuRe蛋白A管柱予以純化來生產假mAb2 。1.4 Fcabs 與LAG-3 的 結合 親和力 1.4.1 以表面電漿子共振(SPR) 來測定Fcabs 與 人類LAG-3 的 結合 親和力
使用BIAcore T200(GE Healthcare)來測定呈假mAb2 形式的抗人類LAG-3 Fcabs對於人類LAG-3之親和力。CM5感測器晶片(GE Healthcare，BR1005-30)之流動室4係以人類LAG-3-Fc(R&D Systems, 2319-L3-050)予以固定，以及流動室3係使用胺偶合套組(GE Healthcare, BR-1000-50)以緩衝劑予以固定作為參考。LAG-3-Fc係以醋酸鈉pH5(ForteoBio, 18-1069)稀釋至5µg/ml且以10µl/min的流速注射歷時12秒接著藉由注射乙醇胺420 sec以使表面去活化。固定位準為158 RU。假mAb2 (或對照抗人類LAG-3 mAb，25F7)係自4 µg/ml、用HBS-P緩衝液(GE Healthcare, BR-1003-68)以2倍稀釋系列予以稀釋。對照mAb/假mAb2 係以30µl/min、240秒締合時間，及30µl/min、300秒解離時間來進行注射。使用25mM NaOH、以100 µl/min、歷時30秒以使表面再生。數據減去雙重參考且使用BIAevaluation 3.2軟體來計算動力學常數予以分析。呈假mAb2 形式的Fcabs對人類LAG-3具有0.8 – 1.1 nM(表1 )範圍內的親和力，其與基準抗-人類LAG-3 mAb 25F7的親和力相似。這是令人驚訝的因為Fcabs具有比單株抗體更小的結合界面，因Fcabs的結合位址形成相對緊密的抗體片段帶有位處極接近的二個結合位址。相反地，典型的mAb 之Fab臂係由一種撓性鉸鏈區分隔開。基於此更小的結合界面及Fc區內二個結合位址之相關降低的可撓性，抗-LAG-3 Fcabs能結合且以如基準抗體25F7相似的親和力及效能來抑制LAG-3是意想不到的。表1 ：呈假mAb2 形式之LAG-3專一的Fcabs對人類LAG-3之結合親和力 1.4.2以SPR 來測定對 小鼠LAG-3 專一的 代理者Fcab 對 小鼠LAG-3 之 結合 親和力
使用BIAcore 3000(GE Healthcare)來測定對小鼠LAG-3專一的代理者Fcabs與小鼠LAG-3之親和力。使用胺偶合作用(胺偶合套組，GE Healthcare, BR-1000-50)將10 mM醋酸鈉pH5.0 (ForteBio, 18-1069)稀釋的mLAG-3 Fc(R&D Systems, 3328-L3-050)直接塗覆至CM5晶片(GE Healthcare, BR-1000-12)。流動室1係以小鼠Fc(SinoBiological, 51094-MNAH)予以塗覆，以及流動室2係以950 RU之mLAG-3 Fc予以塗覆。以HBS-P緩衝劑(GE Healthcare, BR-1003-68)來稀釋Fcabs且以20 µl/min、各種濃度(自100 nM予以四倍稀釋)注射3 min然後在緩衝液中解離12 min。以30 µl/min來注射pH 2.5的10 mM甘胺酸歷時30 s以再生晶片。數據減去雙重參考(Data was double reference subtracted)且使用BIAevaluation 3.2軟體來計算動力學常數予以分析。測試的代理者Fcabs係以如表 2 內列出的一位數奈莫耳(nanomolar)親和力與小鼠LAG-3結合。表2 ：代理者LAG-3專一的Fcab對小鼠LAG-3之結合親和力(KD )1.4.3 以流動式細胞測量術來判定Fcabs 對 細胞上 表現的 人類LAG-3 之 結合親和力 生產過度表現LAG-3的細胞株
使用慢病毒(lentiviral)轉導方法論來產生過度表現人類、食蟹獼猴或小鼠LAG-3的DO11.10細胞(National Jewish Health)，其係利用Lenti-X HTX包裝系統(Clontech, Cat. No 631249)來進行。含小鼠LAG-3 cDNA(序列辨識編號：96)、人類LAG-3 cDNA(序列辨識編號：95)或食蟹獼猴LAG-3 cDNA(序列辨識編號：97)的Lenti-X表現載體(pLVX) (Clontech, Cat. No 631253)，係與Lenti-X HTX包裝混合物共轉染至Lenti-X 293T細胞株(Clontech, Cat. No 632180)之內以產生病毒。DO11.10細胞株係使用Lenti-X HTX包裝系統生產的慢病毒載體予以轉導。
呈假mAb2 形式之抗人類LAG-3 Fcab對表現人類LAG-3的細胞(轉染人類LAG-3的DO11.10細胞株)之親和力係使用流動式細胞測量術來判定。mAb2 及對照mAb稀釋(2 x終濃度)係一式三份製備於1 x DPBS (Gibco, 14190-094)內。DO11.10:LAG-3細胞懸浮液係製備於PBS+2%BSA(Sigma, A7906)內以及以4x10-6 個細胞/ml且50 µl/孔播種於V-底96-孔平盤內(Costar, 3897)。添加50µl的mAb2 或對照mAb(抗人類LAG-3 mAb，25F7)稀釋至含有細胞的孔(終體積100 µl)且於4 ℃下培育1小時。清洗平盤以及接著添加以PBS+2% BSA稀釋1:1000之二級抗體(抗人類Fc-488抗體，Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)100µl/孔並且在黑暗中於4 ℃下培育30 mins。清洗平盤以及再懸浮於含1 mg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤。排除死細胞且測量FITC道的螢光(488nm/530/30)。以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑) vs反應來擬合數據。所有呈假mAb2 形式之測試的Fcabs及基準抗人類LAG-3 mAb，25F7，係以落在如表 3 所述之1.2–2.1 nM範圍內相似的親和力(EC50 )與人類LAG-3結合。表3 ： 以流動式細胞測量術來判定呈假mAb2 形式之抗人類LAG-3 Fcab對表現人類LAG-3的DO11.10細胞之結合親和力1.4.4 以流動式細胞測量術來判定Fcabs 對 細胞上 表現的 食 蟹獼猴LAG-3 之 結合親和力
呈假mAb2 形式之抗人類LAG-3 Fcabs對表現食蟹獼猴LAG-3的細胞(轉染食蟹獼猴LAG-3的DO11.10細胞株)之親和力係使用流動式細胞測量術來判定。mAb2 及對照mAb稀釋(2 x終濃度)係一式三份製備於1 x DPBS(Gibco, 14190-094)內。DO11.10:LAG-3細胞懸浮液係製備於PBS+2%BSA(Sigma, A7906)內以及以4x10-6 個細胞/ml且50 µl/孔播種於V-底96-孔平盤內(Costar, 3897)。添加50µl 的mAb2 或對照mAb(抗人類LAG-3 mAb，25F7)稀釋至含有細胞的孔(終體積100 µl)且於4 ℃下培育1小時。清洗平盤以及接著添加以PBS+2% BSA稀釋1:1000之二級抗體(抗人類Fc-488抗體，Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)100µl/孔並且在黑暗中於4 ℃下培育30 mins。清洗平盤以及再懸浮於含1 mg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤。排除死細胞且測量FITC道的螢光(488nm/530/30)。以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑) vs反應來擬合數據。呈假mAb2 形式之測試的Fcabs係以0.5-0.6 nM親和力與食蟹獼猴LAG-3結合，表示食蟹獼猴的毒性研究預期可預測人類可見的效應(見表 4 )。基準抗人類LAG-3 mAb，25F7，係以更差15倍的親和力(EC50 )與食蟹獼猴LAG-3結合(表4 )。表4 ： 以流動式細胞測量術進行之抗LAG-3 Fcabs對表現食蟹獼猴LAG-3的DO11.10細胞之結合親和力 1.4.5以流動式細胞測量術來判定 代理者 抗 小鼠LAG-3 Fcabs 及 抗人類LAG-3 Fcab 對 細胞上 表現的 小鼠LAG-3 之 結合親和力 生產過度表現mLAG-3的HEK細胞
小鼠LAG-3序列(序列辨識編號：96)係使用KpnI(NEB, R0142)及NotI(NEB, R0146)限制性消化予以亞選殖至pcDNA5FRT載體(Life Technologies, V6010-20)內。載體繼而使用脂質體2000(Life Technologies, 11668-019)轉形至Flp-In T-REx 293 HEK細胞株(Life Technologies, R780-07)之內。轉形的Flp-In T-REx 293細胞係生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內3-4週直到出現穩定轉形的細胞群落。此等群落係於1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)存在下擴大以及使用PE結合的抗小鼠LAG-3(殖株C9B7W, BD Biosciences, 552380)來測試小鼠LAG-3表現。
代理者抗小鼠LAG-3 Fcabs(含截斷的鉸鏈；序列辨識編號：58)對細胞表現的小鼠LAG-3之親和力係使用流動式細胞測量術來判定。生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)及1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內、表現mLAG-3的HEK細胞係使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離以及以2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤(Costar, 3897)內。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3 min以使細胞成丸粒。Fcabs(或對照mAb)之稀釋系列係與配於100 µl體積的細胞於4 ℃下培育1 h。清洗平盤以及二級抗體(關於Fcabs為抗人類Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098，或關於C9B7W為抗-大鼠IgG(H+L), Alexa Fluor 488結合物，ThermoFisher, A-11006)係以1:1000稀釋於PBS內以及於4 ℃下添加100 µl至細胞歷時30 min(平盤保持於黑暗中)。繼而清洗平盤以及細胞再懸浮於含1 mg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤。排除死細胞且測量FITC道的螢光(488nm/530/30)。以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑) vs反應來擬合數據。測試的Fcabs係以相似的親和力與小鼠LAG-3結合(見表 5 )。基準LAG-3 mAb，C9B7W(2B Scientific, BE0174-50MG)，係以比Fcabs更差17倍的親和力(EC50 )與小鼠LAG-3結合(表5 )。表5 ： 以流動式細胞測量術來進行代理者抗小鼠LAG-3 Fcabs對表現小鼠LAG-3之HEK細胞的結合親和力
呈假mAb2 形式之抗人類LAG-3 Fcab FS18-7-9對細胞表現的小鼠LAG-3之親和力係使用流動式細胞測量術來判定。生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)及1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內、表現mLAG-3的HEK細胞係使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離。藉由於4 ℃下以1500 rpm離心3 min來收集細胞以使細胞成丸粒然後再懸浮於1 x DPBS內接著以配於30 µl內1.2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤(Costar, 3897)。添加1:1體積稀釋系列的mAb2 (或對照mAb)以及與細胞一起於4 ℃下培育1 h。清洗平盤以及二級抗體(抗人類Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)係以1:1000稀釋於PBS內且於4 ℃下添加60 µl至細胞歷時30 min(平盤保持於黑暗中)。繼而清洗平盤以及細胞再懸浮於含1 µg/ml DAPI(Biotium, 40043)的60 µl PBS內。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤。排除死細胞且測量FITC道的螢光(488nm/530/30)。以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑) vs反應來擬合數據。與代理者抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-9-108之2.6 nM的EC50 相比，呈假mAb2 形式之抗人類LAG-3 Fcab FS18-7-9係以19 nM的EC50 與小鼠LAG-3結合(表6 )。人類mAb，25F7與小鼠LAG-3沒有顯示任何可檢測的結合，表示人類LAG-3 Fcab，FS18-7-9，具有與25F7的結合抗原決定位不同的結合抗原決定位於LAG-3上。表6 ： 以流動式細胞測量術來進行人類抗LAG-3 Fcab FS18-7-9對表現小鼠LAG-3之HEK細胞的結合親和力1.5 Fcabs 與Fc 受體的 結合親和力
已知於人類IgG1的CH2域內導入LALA突變會降低Fcγ受體的結合(Bruhns, P.等人(2009)；及Xu, D.等人(2000))。使用BIAcore來確認LALA突變業已降低Fcabs(呈假mAb2 形式)對Fcγ受體的結合親和力。人類FcγR結合分析係使用呈假mAb2 形式之Fcabs、以一種Biacore T200儀器(GE Healthcare)來執行。人類FcγRs (R&D Systems, 1257-FC, 1330-CD, 1875-CD, 4325-FC)係使用胺偶合(胺偶合套組，GE Healthcare, BR-1000-50)固定於一種S系列CM5晶片(GE Healthcare, BR-1005-30)上，FcγRI達370 RU、FcγRIII達264 RU(高親和力人類FcγRs)以及FcγRIIa與FcγRIIb達500 RU(低親和力人類FcγRs)之表面密度。關於每個固定晶片留下一空白流動室用於背景扣除。使用配於醋酸鈉pH5、5 µg/ml濃度的FcγR(ForteBio, 18-1069)予以固定且以15秒循環、10µl/min的流速來注射直到達到所需的固定位準。
關於高親和力FcγRI及FcγRIII，200 µg/ml的mAbs或假mAb2 係以30 µl/min的流速流過晶片歷時3 min以及接著進行解離歷時5 min。運行緩衝液為HBS-P(0.01 M HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，0.005% v/v界面活性劑P20，GE Healthcare，BR-1003-68)。關於低親和力FcγRIIa及FcγRIIb，假mAb2 的濃度增加至500 µg/ml。
陽性對照為野生型IgG1同型mAb，其與對照LALA IgG1 mAb及不相關的標靶之單株IgG2及IgG4同型mAbs作比較。藉由以100 µl/min的流速注射10 mM氫氧化鈉(VWR，28244.262)歷時30秒以使流動室再生。用BIAevaluation軟體3.2 RC1版來執行數據分析，其係藉由雙重參考對照空白流動室(沒有固定的FcγR)並且自測試mAb2 減去緩衝液循環。結果顯示於表 7 內。表7 ： 以SPR來進行呈假mAb2 形式之抗人類LAG-3 Fcabs(包含如以上詳述的LALA突變)與人類Fcγ受體的結合反應
與沒有LALA突變的對照抗體(假mAb IgG1)相比之下，所有測試的假mAb2 (全體包含如以上所述的LALA突變)顯示出與測試的Fcγ受體顯著降低的結合，表示LALA突變已經使此等假mAb2 與Fcγ受體的結合降低且因而預期會降低mAb2 之ADCC活性。1.6 第 II 類 MHC 與LAG-3 結合之 阻斷
Fcabs(含截斷的鉸鏈；序列辨識編號：58)阻斷重組人類或小鼠LAG-3 Fc和人類第II類MHC之間的交互作用的能力係藉由測量LAG-3 Fc與一種表現人類第II類MHC的黑色素瘤細胞株，A375細胞之結合作用來研究。生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-106)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內的A375(ATCC, CRL-1619)細胞係使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離以及以2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤(Costar, 3897)內。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3 min以使細胞成丸粒。恰當濃度的Fcab或對照mAb係以配於含10% FBS之100 µl DMEM之1 µg/ml LAG-3 Fc(人類LAG-3-Fc R&D Systems，2319-L3-050或小鼠LAG-3 Fc R&D Systems，3328-L3-050)於4 ℃下培育1 h。添加LAG-3/Fcab混合物至A375細胞且於4 ℃下培育1 h。清洗細胞。二級抗體(Alexa Fluor 488結合山羊抗人類Fc F(ab’)2 ，Jackson Immunoresearch，109-546-098或山羊抗小鼠IgG(H+L)488結合物，Life Technologies，A-1101)係以1:1000稀釋於PBS內以及於4 ℃下添加100 µl至細胞歷時30 min(平盤保持於黑暗中)。以PBS清洗細胞一次以及再懸浮於100 µl PBS + 1 µg/ml DAPI(Biotium, 40043)內。以BD FACSCanto II細胞計數器(BD Biosciences)來讀取平盤以及使用FlowJo軟體來分析數據。
二種抗小鼠LAG-3 Fcabs均能抑制人類第II類MHC與小鼠LAG-3的交互作用，而對照抗小鼠LAG-3 mAb(C9B7W, 2B Scientific, BE0174-50MG)則不能(見表 8 )。表8 ： 代理者抗小鼠LAG-3 Fcabs抑制小鼠LAG-3與第II類MHC的結合
測試的抗人類LAG-3 Fcabs亦能以如同對照抗人類LAG-3 mAb(25F7)相似的效能來抑制人類第II類MHC與人類LAG-3的交互作用。表9 ： 抗人類LAG-3 Fcabs抑制人類LAG-3與第II類MHC的結合 實施例2：mAb及mAb2 分子之製備及特徵化2.1 mAb 84G09 之製備 2.1.1 DNA 建構物生產
編碼84G09之可變異重及輕鏈區域的DNA插入子(inserts)係予以密碼子最佳化用於哺乳動物表現且藉由DNA2.0(Menlo Park, CA, USA)來合成。pJ-Amp-high宿主載體所供應的插入子係經由EcoRI 及NheI 限制性消化予以亞選殖至表現載體pFS-hHC2.1-G1m17(z) LALA(包含LALA突變的IgG重鏈)或pFS-hHC2.1-G1m17(z)(沒有LALA突變的IgG重鏈)及pFShK1.0(IgG κ輕鏈)。
選殖的保真度係藉由群落PCR及第三方(GATC Biotech)之後續核苷酸定序分析來驗證。2.1.2 細胞維持
HEK293-6E細胞(NRCC)於補充4mM的GlutaMAX-1(Invitrogen, 35050-038)、0.1%的普朗尼克(Pluronic) F-68(Invitrogen A13835-01)及25 μg/ml的建那黴素(geneticin) (Invitrogen, 10131-027)之預溫熱的F17培養基(Invitrogen, A13835-01)內繼代培養。細胞係於5% CO2 、140 rpm、37 ℃下予以培育以及以0.3x106 個細胞/ml於三天四天的方式(a three then four day regime)繼代培養。2.1.3 暫時轉染
HEK293-6E細胞係以1 mg/ml的PEIpro(Polyplus, PPLU115)予以暫時轉染。轉染24小時前細胞係以0.8x106 個細胞/孔ml播種於培養基內。關於各200 ml的細胞培養物，DNA混合物係藉由混合10 ml溫熱的Opti-MEMI(Invitrogen, 11058-021)、100 µg編碼重鏈之無內毒素的DNA及100 µg編碼輕鏈之無內毒素的DNA予以製備。PEI混合物係藉由混合10 ml溫熱的Opti-MEMI及200 µl的PEIpro以及渦流來製備。DNA混合物迅速地添加至經渦流的PEI混合物、藉由渦流脈衝1 s 3次來混合、於室溫下培育3 min以及一滴一滴地添加至細胞。轉染後48小時將20 ml的F17加上補充0.5%胰蛋白腖(Tryptone) N1(TekniScience Inc., 19553)添加至各燒瓶。
轉染後6天藉由以4500 rpm離心40 min來收穫細胞。繼而上清液係以0.22 µm聚醚碸過濾器單元(Millipore, SCGPU01RE, SCGPU02RE, SCGPU05RE, SCGPU11RE)予以過濾且儲存於+4 ℃直到純化。2.1.4 蛋白A 層析法
澄清的上清液係使用預裝填的5ml HiTrap MabSelect SuRe管柱(GE Healthcare, 11-0034-95)於ÄKTAexplorer或ÄKTAxpress上純化。簡言之，管柱係用50mM Tris-HCl、250mM NaCl於pH 7.0予以平衡，未結合的物質用同樣的緩衝液以5 ml/min予以清洗。用10mM甲酸鈉pH 3.0、以5 ml/min來沖提產物。沖提的樣本係根據製造商的建議用PBS pH 7.4預平衡的PD-10管柱(GE Healthcare, 17-0851-01)立即進行緩衝液交換為PBS pH 7.4。2.1.5 以光譜術進行產物濃度測量
各純化產物之280 nm吸光度係使用LabChip DS(PerkinElmer, 133089)及DropPlate 96 D+ (PerkinElmer, CLS135136)來測量。產物濃度係使用消光係數(A280 of 1mg/ml之)來計算，其係使用VectorNTI Advance v11.5.4 軟體(Thermofisher Scientific, A13784)作計算。2.1.6 產物濃度
當需要時，純化的餾份係使用Amicon Ultra-4離心過濾器單元30K(Millipore, UFC803024)予以濃縮。藉由以3000 rpm離心10 min、用PBS pH 7.4使Ultracel再生的纖維素膜平衡之後，樣本裝載至4 ml單元且再次以3000 rpm予以離心直到達到所欲的蛋白濃度。2.1.6 過濾滅菌
終樣本係使用預潤濕Millex-GV PVDF針筒過濾器(Millipore, SLGV013SL)予以過濾。2.2 人類LAG-3/PD-L1 mAb2 之製備
mAb2 分子FS18-7-9/84G09(序列辨識編號：94及95)、FS18-7-32/84G09(序列辨識編號：96及97)、FS18-7-33/84G09(序列辨識編號：98及99)、FS18-7-36/84G09(序列辨識編號：100及101)、FS18-7-58/84G09(序列辨識編號：102及103)、FS18-7-62/84G09(序列辨識編號：104及105)、FS18-7-65/84G09(序列辨識編號：106及107)、FS18-7-78/84G09(序列辨識編號：108及109)、FS18-7-88/84G09(序列辨識編號：110及111)以及FS18-7-95/84G09(序列辨識編號：112及113)之重鏈係藉由用存在於未經修飾的人類IgG1之CH3域序列內、於XhoI 及BamHI 位址之內的人類LAG-3專一性Fcabs FS18-7-9、FS18-7-32、FS18-7-33、FS18-7-36、FS18-7-58、FS18-7-62、FS18-7-65、FS18-7-78、FS18-7-88及FS18-7-95的CH3域，代替單株抗體84G09的CH3域(有或沒有LALA突變)來製備。mAb2 的重鏈係如以上第2.1節關於mAb 84G09所述以84G09的輕鏈(序列辨識編號：116)予以共轉染。mAb2 繼而以如以上第2.1節關於mAb 84G09所述之方式予以表現及純化。2.3 人類LAG-3/ 假mAb2 之製備
抗-FITC mAb(有或沒有LALA突變)係如以上第2.1節關於mAb 84G09所述、使用mAb 4420之重鏈(序列辨識編號：83及84；有或沒有LALA突變)及輕鏈(序列辨識編號：85)來製備。
mAb2 分子FS18-7-9/4420(序列辨識編號：63及64)、FS18-7-32/4420(序列辨識編號：65及66)、FS18-7-33/4420(序列辨識編號：67及68、FS18-7-36/4420(序列辨識編號：69及70)、FS18-7-58/4420(序列辨識編號：71及72)、FS18-7-62/4420(序列辨識編號：73及74)、FS18-7-65/4420(序列辨識編號：75及76)、FS18-7-78/4420(序列辨識編號：77及78)、FS18-7-88/4420(序列辨識編號：79及80)以及FS18-7-95/4420(序列辨識編號：81及82)之重鏈係藉由用存在於未經修飾的人類IgG1之CH3域序列內、於XhoI 及BamHI 位址之內的人類LAG-3專一性Fcabs FS18-7-9、FS18-7-32、FS18-7-33、FS18-7-36、FS18-7-58、FS18-7-62、FS18-7-65、FS18-7-78、FS18-7-88及FS18-7-95的CH3域，代替單株抗體4420的CH3域(有或沒有LALA突變)來製備。mAb2 的重鏈係如以上第2.1節關於mAb 84G09所述以mAb 4420的輕鏈予以共轉染。蛋白質繼而以如以上第2.1節關於mAb 84G09所述之方式予以表現及純化。2.4 小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 之製備
小鼠抗PD-L1 mAb(有或沒有LALA突變)係如以上第2.1節關於mAb 84G09所述、使用mAb S1之重鏈(序列辨識編號：122及123)及輕鏈(序列辨識編號：119)予以製備。
mAb2 分子FS18-7-108-29/S1(序列辨識編號：117及118)及FS18-7-108-35/S1(序列辨識編號：120及121)的重鏈係藉由用存在於未經修飾的人類IgG1之CH3域序列內、於XhoI 及BamHI 位址之內的小鼠LAG-3專一性Fcabs FS18-7-108-29及FS18-7-108-35的CH3域，代替單株抗體S1的CH3域(有或沒有LALA突變)來製備。mAb2 的重鏈係如以上第2.1節關於mAb 84G09所述以S1的輕鏈予以共轉染。蛋白質繼而以如以上第2.1節關於mAb 84G09所述之方式予以表現及純化。2.5 mAb2 對人類LAG-3 及人類PD-L1 的 結合親和力 及動力學
蛋白L(Thermo, 21189)係依照BIAcore T200儀器製造商的指示、藉由胺偶合(GE Healthcare, BR-1000-50)予以固定於一種S系列CM5晶片(GE Healthcare, BR-1005-30)的流動室1及2上達2000 RU之表面密度。關於LAG-3結合，mAb2 樣本(全體均含有LALA突變)只於流動室2上被捕捉且以0.5 nM開始2倍稀釋系列的4個濃度之人類LAG-3Fc(R&D Systems, 2319-L3)係以30 µl/min的流速流過流動室1及2二者。締合時間為3 min以及解離時間為6 min。運行緩衝液為HBS-P(GE Healthcare, BR-1003-68)。流動室二者均藉由以100 µl/min的流速來注射10 mM氫氧化鈉(NaOH)歷時20秒予以再生。數據係藉由雙重參考對照空白流動室來分析。
關於PD-L1結合，以40 nM開始的2倍稀釋系列之4個濃度的PD-L1 Fc(R&D Systems, 156-B7)係流過相同的蛋白L晶片上捕捉的mAb2 。所有其他的條件與LAG-3結合(參見以上)相同。
用1:1朗繆(Langmuir)模型來擬合結合動力學以產生結合締合(ka )及解離(kd )率。平衡結合常數(KD )係藉由各樣本之解離率除以締合率來計算。用BiaEvaluation軟體3.2版來執行數據分析。結果顯示於表 10 及11 內。表10 ： 以SPR來判定mAb2 對人類LAG-3的結合親和力及動力學表11 ： 以SPR來判定mAb2 對人類PD-L1的結合親和力及動力學
所有測試的mAb2 之人類PD-L1及人類LAG-3的結合親和力是可比較的。人類PD-L1之mAb2 的結合親和力比得上84G09，表示導入LAG-3的結合位址至CH3域之內不影響PD-L1的結合。2.6 mAb2 與 人類LAG-3 及 人類PD-L1 之同時結合
mAb2 (FS18-7-09/84G09、FS18-7-32/ 84G09、FS18-7-33/84G09、FS18-7-36/84G09、FS18-7-62/84G09、FS18-7-65/84G09及FS18-7-78/84G09全體帶有LALA突變)與LAG-3及PD-L1同時結合之能力係由SPR來測試。人類PD-L1Fc(R&D Systems, 156-B7)係遵循製造商的指示固定於一種S系列CM5晶片的流動室2(GE Healthcare, BR-1005-30)上達150 RU之表面密度。使流動室1活化以及在沒有固定任何蛋白的情況下去活化用於背景扣除。關於每個樣本，10 µg/ml的mAb2 係以10 µl/min的流速流過流動室1及2歷時3 min。隨後，40 nM的LAG-3Fc(R&D Systems, 2319-L3)係以10 µl/min的流速流過流動室1及2二者歷時3 min。關於每個結合步驟，接著進行解離歷時3 min。於每個循環後用25mM NaOH、以100 µl/min的流速注射15 s以使感測器晶片再生。
所有測試的mAb2 都能同時結合LAG-3及PD-L1。親代抗PD-L1 mAb，84G09，只結合 PD-L1。2.7. 代理者mAb2 與鼠類LAG-3 及 鼠類PD-L1 之同時結合
二種代理者小鼠mAb2 (FS18-7-108-29/S1及FS18-7-108-35/S1，二者均含有LALA突變)同時結合鼠類LAG-3及鼠類PD-L1之能力係由SPR於BIAcore 3000(GE Healthcare)上進行測試。鼠類PD-L1Fc(R&D Systems, 1019-B7-100)係依照製造商的指示固定於一種CM5晶片的流動室4上達830 RU之表面密度。流動室3係用820 RU的人類-Fc(R&D system, 110-HG)予以固定用於背景扣除。關於每個樣本，50 nM的mAb2 係以20 µl/min的流速流過流動室1及2歷時150 sec。隨後，50 nM的鼠類LAG-3Fc(R&D Systems, 3328-L3-050)係以20 µl/min的流速流過流動室3及4二者歷時150 sec。關於每個結合步驟接著進行解離步驟歷時3 min。於每個循環之後用2 x 10 µl 之50 mM NaOH使感測器晶片再生。測試的mAb2 二者均能同時結合鼠類LAG-3及鼠類PD-L1且因而為人類LAG-3/PD-L1 mAb2 合適的代理者。2.8 含有LALA 突變之mAb2 與 人類Fcγ 受體之結合
人類Fcγ受體係依照BIAcore3000儀器製造商的指示固定於一種CM5晶片上，Fcγ RI(R&D Systems, 1257-FC)及Fcγ RIIIa(R&D Systems, 4325-FC)達大概200 RU以及Fcγ RIIa(R&D Systems, 1330-CD)及Fcγ RIIb/c(R&D Systems, 1875-CD)達大概500 RU之表面密度。關於Fcγ RI及Fcγ RIIIa，100µg/ml的mAbs或mAb2 係以10 µl/min的流速流過晶片歷時3 min以及接著解離歷時5 min。運行緩衝液為PBS(Lonza, BE17-516F) + 0.05% (v/v)P20界面活性劑(GE Healthcare, BR-1000-54)。陽性對照為野生型IgG1 4420-mAb。含括不相關的標靶(20H4及MOR7490)之單株IgG2及IgG4 mAbs及小鼠IgG1(Sigma, P5305)作為參考點。因為結合複合物快速的解離率所以不需要再生。於Fcγ RIIa及Fcγ RIIb/c測試方面mAb2 的濃度增高到500 µg/ml以補償此等二受體較弱的結合。結果顯示於表 12 內。表12 ： 以SPR來判定抗LAG-3/PD-L1 mAb2 與人類Fcγ受體的結合反應
如預期，導入mAb或mAb2 內的LALA變異體降低此等分子結合人類Fcγ受體的能力。2.9 mAb2 與表現人類及 食 蟹獼猴LAG-3 的細胞之 結合
人類LAG-3序列(序列辨識編號：126)或食蟹獼猴LAG-3序列(序列辨識編號：128)係使用KpnI(NEB, R0142)及NotI(NEB, R0146)限制性消化予以亞選殖至pcDNA5FRT載體(Life Technologies, V6010-20)內。載體繼而使用脂質體2000(Life Technologies, 11668-019)轉形至Flp-In T-REx 293 HEK細胞株(Life Technologies, R780-07)之內。轉形的Flp-In T-REx 293細胞係生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內3-4週直到出現穩定轉形的細胞群落。此等群落係於1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)存在下擴大以及測試LAG-3表現藉由流動式細胞測量術來確認。
mAb2 (全體含有LALA突變)對細胞表現的人類或食蟹獼猴LAG-3之親和力係使用流動式細胞測量術來判定。生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)及1 µg/ml多西環素(Doxycyclin) (Sigma, D9891)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內、表現人類或食蟹獼猴LAG-3的HEK細胞係使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離以及以2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤(Costar, 3897)內。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3 min以使細胞成丸粒。mAb2 (或對照mAb)之稀釋系列係與配於100 µl體積的細胞於4 ℃下培育1 h。清洗平盤以及二級抗體(抗人類Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)係以1:1000稀釋於PBS內以及於4 ℃下添加100 µl至細胞歷時30 min(平盤保持於黑暗中)。清洗平盤然後使細胞再懸浮於含1 µg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤。排除死細胞且測量FITC道的螢光(488nm/530/30)。以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑)vs反應來擬合數據。以BD FACSCanto II細胞計數器(BD Biosciences)來讀取平盤以及使用FlowJo來分析數據。結果顯示於表 13 內。表13 ： 以流動式細胞測量術來判定抗LAG-3/PD-L1 mAb2 對表現人類或食蟹獼猴LAG-3的HEK細胞之結合親和力
結果確認了mAb2 結合至HEK細胞上表現的人類及食蟹獼猴(cynomologus)LAG-3。關於計算的EC50 值，當與對照抗LAG-3抗體25F7相比，測試的mAb2 顯示出與人類LAG-3較佳或相等的結合作用以及與食蟹獼猴(cynomologus)LAG-3為至少二倍更佳的結合作用。與HEK細胞株表面上表現的其他蛋白沒有觀察到交叉反應性。2.10 mAb2 與表現人類及 食 蟹獼猴PD-L1 的細胞之 結合
人類PD-L1序列(序列辨識編號：129)或食蟹獼猴PD-L1序列(序列辨識編號：131)係使用KpnI(NEB, R0142)及NotI(NEB, R0146)限制性消化予以亞選殖至pcDNA5FRT載體(Life Technologies, V6010-20)內。載體繼而使用脂質體2000(Life Technologies, 11668-019)轉形至Flp-In T-REx 293 HEK細胞株(Life Technologies, R780-07)之內。轉形的Flp-In T-REx 293細胞係生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內3-4週直到出現穩定轉形的細胞群落。此等群落係於1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)存在下擴大以及藉由流動式細胞測量術來確認LAG-3表現。
mAb2 (全體含有LALA突變)與細胞表現的人類或食蟹獼猴PD-L1或對親代(未轉形的細胞)之結合的親和力係使用流動式細胞測量術來判定。生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)及1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內、表現人類或食蟹獼猴PD-L1的HEK細胞係使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離以及以2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤(Costar, 3897)內。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3 min以使細胞成丸粒。mAb2 (或對照mAb)之稀釋系列係與配於100 µl體積的細胞於4 ℃下培育1 h。清洗平盤以及二級抗體(抗人類Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)係以1:1000稀釋於PBS內以及於4 ℃下添加100 µl至細胞歷時30 min(平盤保持於黑暗中)。清洗平盤繼而使細胞再懸浮於含1 µg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤。排除死細胞且測量FITC道的螢光(488nm/530/30)。以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑)vs反應來擬合數據。以BD FACSCanto II細胞計數器(BD Biosciences)來讀取平盤以及使用FlowJo來分析數據。結果顯示於表 14 內。表14 ： 以流動式細胞測量術來測量抗LAG-3/PD-L1 mAb2 對表現人類或食蟹獼猴PD-L1的HEK細胞之結合親和力
所有測試的LAG-3/PD-L1 mAb2 係以和84G09 mAb之EC50 接近的EC50 來與人類PD-L1及cyno PD-L1結合，展示出導入LAG-3結合位址至mAb2 的CH3域之內不影響PD-L1的結合PD-L1之結合親和力。2.11 代理者 小鼠mAb2 與表現 小鼠LAG-3 或 小鼠PD-L1 的細胞之 結合
鼠類LAG-3序列(序列辨識編號：127)或鼠類PD-L1序列(序列辨識編號：130)係使用KpnI(NEB, R0142)及NotI(NEB, R0146)限制性消化予以亞選殖至pcDNA5FRT載體(Life Technologies, V6010-20)內。載體繼而使用脂質體2000(Life Technologies, 11668-019)轉形至Flp-In T-REx 293 HEK細胞株(Life Technologies, R780-07)之內。轉形的Flp-In T-REx 293細胞係生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內3-4週直到出現穩定轉形的細胞群落。此等群落係於1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)存在下擴大以及藉由流動式細胞測量術來確認LAG-3或PD-L1表現。
mAb2 (全體含有LALA突變)與細胞表現的鼠類LAG-3或鼠類PD-L1之結合的親和力係使用流動式細胞測量術來判定。生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)及1 µg/ml多西環素(Sigma, D9891)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內、表現鼠類LAG-3或鼠類PD-L1的HEK細胞係使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離以及以2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤(Costar, 3897)內。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3 min以使細胞成丸粒。mAb2 (或對照mAb)之稀釋系列係與配於60 µl體積的細胞於4 ℃下培育1 h。清洗平盤以及二級抗體(mAb2 為抗人類Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098或關於抗LAG-3對照，C9B7W為抗-大鼠IgG(H+L), Alexa Fluor 488，ThermoFisher, A-11006)係以1:1000稀釋於PBS內以及於4 ℃下添加50 µl至細胞歷時30 min(平盤保持於黑暗中)。清洗平盤繼而使細胞再懸浮於50 µl FACS Cell Fix(BD Bioscience, 340181)歷時15分鐘，接著清洗且再懸浮於含1 µg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤。排除死細胞且測量FITC道的螢光(488nm/530/30)。以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑)vs反應來擬合數據。以BD FACSCanto II細胞計數器(BD Biosciences)來讀取平盤以及使用FlowJo來分析數據。結果顯示於表 15 內。表15 ： 以流動式細胞測量術來進行代理者抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 對表現鼠類LAG-3或鼠類PD-L1之HEK細胞的結合親和力
代理者mAb2 能與細胞表現的鼠類LAG-3及細胞表現的鼠類PD-L1結合。代理者mAb2 對細胞表現的鼠類LAG-3之結合親和力與抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 與人類LAG-3之親和力大概相同(2.3-3.8 nM與2.5-4.2 nM相比)，以及代理者mAb2 與細胞表現的鼠類PD-L1之結合親和力係在抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 與人類PD-L1之親和力3倍之內(11.9-12.3 nM與3.1-4.0 nM相比)，展示出此等mAb2 為抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 合適的代理者供用於小鼠之活體內研究。 實施例3：mAb2 分子於T細胞活化分析及SEB分析之活性3.1 T 細胞 活化分析
一種DO11.10 OVA T淋巴細胞及LK35.2 B淋巴細胞融合瘤細胞株為基的IL-2釋放分析係用於mAb2 之功能篩選。IL-2釋放是T細胞活化的指標。表現內生的鼠類PD-1之T細胞，係用空載體(pLVX)或人類LAG-3建構物予以轉染。B細胞係用空載體(pLVX)或人類PD-L1建構物予以轉染。
此等四種細胞株之三種組合一起使用於測試mAb2 之T細胞活化： •DO11.10 pLVX + LK35.2 hPD-L1用於抗PD-L1活性； •DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 pLVX用於抗LAG-3活性； •DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 hPD-L1用於同時抗LAG-3/抗PD-L1活性。
全部的mAb2 (全部都含LALA突變)於此T細胞活化分析內測試二次。與食蟹獼猴LAG-3及PD-L1之交叉反應性係於一種功能T細胞活化分析內、使用過度表現食蟹獼猴標靶(cPD-L1及cLAG-3)的細胞予以測試。生產過度表現LAG-3 的T 細胞 株
使用慢病毒轉導方法論來產生過度表現人類、食蟹獼猴或小鼠LAG-3的DO11.10細胞(National Jewish Health)，其係利用Lenti-X HTX包裝系統(Cat. No 631249)來進行。含小鼠LAG-3 cDNA(序列辨識編號：127)、人類LAG-3 cDNA(序列辨識編號：126)或食蟹獼猴LAG-3 cDNA(序列辨識編號：128)的Lenti-X表現載體(pLVX) (Cat. No 631253)，係與Lenti-X HTX包裝混合物共轉染至Lenti-X 293T細胞株(Cat. No 632180)之內以產生病毒。DO11.10細胞株係使用Lenti-X HTX包裝系統生產的慢病毒載體予以轉導。生產過度表現PD-L1 的 抗原呈現細胞
使用慢病毒轉導方法論來產生過度表現人類、食蟹獼猴或小鼠PD-L1的LK35.2 B細胞淋巴瘤(ATCC, HB-98)，其係利用Lenti-X HTX包裝系統(Cat. No 631249)來進行。含小鼠PD-L1 cDNA(序列辨識編號：130)、人類PD-L1 cDNA(序列辨識編號：129或食蟹獼猴PD-L1 cDNA(序列辨識編號：131)的Lenti-X表現載體(pLVX) (Cat. No 631253)，係與Lenti-X HTX包裝混合物共轉染至Lenti-X 293T細胞株(Cat. No 632180)之內以產生病毒。LK35.2細胞株係使用Lenti-X HTX包裝系統生產的慢病毒載體予以轉導。培養基及胜肽 細胞培養基：DMEM(Gibco, 61965-026) 10% FBS (Gibco, 10270-106)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco, 11360-070)、1 µg/ml嘌呤黴素(puromycin) (Gibco, A11138-03)
實驗培養基：沒有嘌呤黴素之完全DO11.10培養基。 OVA胜肽(MW=1773.9 Da)：H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(肽掃描(Pepscan))
細胞： •DO11.10 hLAG-3：以慢病毒載體轉導以過度表現人類LAG-3的DO11.10 T細胞融合瘤； •DO11.10 pLVX：以空的慢病毒載體轉導的DO11.10 T細胞融合瘤； •DO11.10 cLAG-3：以慢病毒載體轉導以過度表現食蟹獼猴LAG-3的DO11.10 T細胞融合瘤。 •LK 35.2 hPD-L1：以含hPD-L1的慢病毒載體轉導以過度表現人類PD-L1的B細胞融合瘤； •LK 35.2 PLVX：以空的慢病毒(pLVX)載體轉導的B細胞融合瘤； •LK 35.2 cPD-L1：以慢病毒載體轉導以過度表現食蟹獼猴PD-L1的B細胞融合瘤。
0.3 x 106 個細胞/ml之DO11.10細胞(DO11.10 pLVX細胞或DO11.10 hLAG-3細胞)係以1:1比率與3 x終濃度的抗體混合。抗體及DO11.10細胞係於5%CO2 、37℃下培育歷時1小時。LK 35.2細胞(pLVX及PD-L1-pLVX二者)係以3x105 個細胞/ml實驗培養基與1.5 µM的OVA胜肽一起培育30 min.。LK 35.2細胞+OVA係以下列組合、以1:2比率添加至DO11.10細胞/治療混合內： 人類功能篩選 DO11.10 pLVX + LK35.2 hPD-L1， DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 pLVX， DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 hPD-L1； 食蟹獼猴交叉反應性篩選 DO11.10 pLVX + LK35.2 cPD-L1， DO11.10 cLAG-3 + LK35.2 pLVX， DO11.10 cLAG-3 + LK35.2 cPD-L1；
細胞係於5%CO2 、37℃下培育歷時24小時。收集上清液且用小鼠IL-2 ELISA套組(eBioscience, 88-7024-88或R&D systems, SM2000)遵循製造商的指示予以分析。使用平盤讀數器及Gen5軟體，BioTek於450 nm下讀取平盤。450 nm的吸光度值減去570 nm的吸光度值(校正)。計算細胞介素濃度的標準曲線係根據四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。繪製mIL-2濃度vs Fcab或mAb的log濃度的圖以及產生的曲線係以GraphPad Prism、使用log(促效劑)vs反應方程式來擬合。表 16 顯示mAb2 及對照mAbs之EC50 值及最大IL-2釋放，計算為對照(84G09 + 25F7)之百分率。圖 2A-F 顯示用FS18-7-9/84G09、FS18-7-62/84G09或FS18-7-78/84G09以及對照治療的細胞株小組內IL-2釋放之代表圖。於二者標靶均存在(DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 hPD-L1)的T細胞活化分析中，IL-2釋放僅於LAG-3及PD-L1二者均抑制時受誘發，舉例而言，當使用mAb2 或LAG-3及PD-L1抗體的組合時。因而mAb2 已經受益於獨立單一製劑。於只有LAG-3(DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 pvlx)或PD-L1(DO11.10 pvlx + LK35.2 PD-L1)的分析中，mAb2 顯示出於抑制此等標靶如單一製劑相似的活性，展示出在LAG-3、PD-L1或LAG-3+PD-L1存在下能導致T細胞活化唯一的單一分子為mAb2 。表 16 ： 九種mAb2 之EC50 值及最大IL-2釋放(計算為與對照–84G09+25F7相比之下的IL2釋放百分率)
mAb2 中之一者(包含LALA突變的FS18-7-9/84G09)係於DO11.1-/LK35.2 T細胞活化分析中測試食蟹獼猴功能交叉反應性。圖 3A-C 顯示三種細胞為基的分析小組的結果。FS18-7-9/84G09於存在cLAG-3 + cPD-L1二者以及cLAG-3或cPD-L1單獨的情況下能誘發T細胞活化，表示mAb2 為功能食蟹獼猴交叉反應性的且因而合適用於靈長類動物為基的安全性研究中。3.2 葡萄球菌腸毒素B 分析
三種mAb2 (全部都含LALA突變)係於人類PBMC為基的葡萄球菌腸毒素B分析(SEB分析)中予以測試。葡萄球菌腸毒素B為一種超抗原，以及與抗原呈現細胞(APCs)上之第II類MHC分子及T細胞受體(TCR)之vβ鏈結合，造成非專一性T細胞活化及細胞介素釋放。要看見T細胞活化不需要抗原呈現。SEB分析使用經刺激的人類細胞(PBMCs)及生理水平的檢查點抑制劑，以及能用來確認mAb2 提升人類系統內的T細胞活化。SEB系統測試三種mAb2 加上來自4個不同供體的細胞。產生擴增的T 細胞
藉由Ficoll梯度分離而自白血球椎(cones)單離PBMC。CD4+ T細胞係使用人類CD4+ T細胞單離套組(Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-533)、依照製造商的指示予以單離。藉由渦流使人類T-活化劑CD3/CD28標記磁珠(Dynabeads) (Life technologies, 11131D)再懸浮。小珠移至無菌15ml管以及添加10ml RPMI(Life Technologies, 61870044)加上10% FBS(Life Technologies, 10270106)及1x青黴素鏈黴素(Life Technologies, 15140122)來清洗標記磁珠。丟棄上清液。配於RPMI加上10% FBS及1x青黴素鏈黴素溶液及50 IU/ml重組人類IL2(Peprotech, 200-02-50ug )之所需量的CD4+ T細胞係以1.0 x106 個細胞/ml、以小珠對細胞比3:1移至T75燒瓶(Greiner Bio-one, 690195)以及於37℃ + 5% CO2 下培育。3天之後溫和地再懸浮細胞且計數。視需要藉由添加新鮮的培養基(RPMI-10% FBS+青黴素鏈黴素溶液1X + 50IU/ml rhuIL2)以使細胞密度維持在0.8-1 x 106 個細胞/ml之間。於第7或8天，移去CD3/28小珠以及CD4+ T細胞係以1 x 106 個細胞/ml新鮮的培養基RPMI-10% FBS+青黴素鏈黴素溶液1X加上減少的10IU/ml rhuIL2休息過夜。細胞冷凍儲存至需要。產生MoiDCs
未觸動的單核球係使用人類泛單核球(Pan Monocyte)單離套組，(Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-537)而自人類PBMCs單離。單核球係使用人類Mo-DC分化培養基(Miltenyi Biotec Ltd, 130-094-812)遵循製造商的指示而分化成iDCs。SEB 分析
擴增的T細胞於實驗前一天解凍，用AIM培養基(Gibco, 12055-091)來清洗以及以1x106 個細胞/ml於AIM培養基內、在5%CO2 、37℃下培育過夜。於DPBS(Gibco, 14190-169)內製備2 µM濃度的各抗體/混合物以及以培養基1:10稀釋(30 µl+270 µl)以獲得200 nM。於96孔平盤內，以1:10進行連續稀釋(30 µl+270 µl實驗培養基；2x終濃度)。解凍MoiDCs，用AIM培養基來清洗以及以1:10比率與來自相同供體的T細胞混合(5 ml、2x105 個細胞/ml的iDCs組合以5ml、2x106 個細胞/ml的T細胞)。將0.1 µg/ml、20 µl的SEB(Sigma, S4881)添加至10 ml的細胞。於圓底96孔平盤內，添加100 µl的細胞/SEB混合物至100 µl的抗體稀釋，提供每孔配於200 µl AIM培養基之104 iDC細胞對105 T細胞比率及0.1 ng/ml SEB及及100、10、1、0.1、0.01、0.001 nM的終抗體濃度。細胞係於5%CO2 、37℃下培育歷時3天。收集上清液且立即用人類IFNᵧ ELISA套組(R&D Systems, PDIF50)予以分析或於-20℃下冷凍供進一步分析。分析係使用以PBA(DPBS, 2% BSA(Sigma, A7906-100G))1:30稀釋的上清液、根據套組製造商的指示來執行。繪製人類IFNᵧ濃度vs mAb2 或mAb的log濃度的圖以及以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑)vs反應方程式來擬合產生的曲線。表 17 顯示來自4個不同的細胞供體(供體A至D)的細胞於SEB分析中之EC50 值及IFNγ釋放的跨度(span of the IFNγ release)。圖 4 顯示單一供體之SEB分析的代表圖。於六個分析中LAG-3/PD-L1 mAb2 及LAG-3/FITC mAb2 + 84G09LALA之組合顯示比84G09LALA mAb單獨更大的活化作用，而當分析LAG-3/FITC mAb2 或4420 mAb時其等未顯示出顯著的活化作用。SEB分析的結果因而於更多的生理系統確認DO11.10/LK35.2分析的結果。
表 17 . 以4個不同的細胞供體來進行、以六個SEB分析為基礎之六個mAb2 計算出的EC50 值. 實施例4：mAb2 分子於鼠類腫瘤模式內的活體內活性 4.1 mAb2 分子於MC38 未 建立的腫瘤模式內的活性
此實驗使用MC38同基因腫瘤模式，因已知MC38腫瘤會表現PD-L1於其等之細胞表面上且為高度免疫性導致腫瘤或腫瘤周圍之免疫細胞上的LAG-3表現增高。
稱為FS18-29/S1之含LALA突變的代理者小鼠mAb2 FS18-7-108-29/S1(序列辨識編號：117及119)係使用MC38同基因小鼠腫瘤生長模式來測試活體內活性。mAb2 抑制腫瘤生長的能力係與LAG-3/假mAb2 ，稱為FS18-29/4420之含LALA突變的FS18-7-108-29/4420(序列辨識編號：132及85)、基準抗-LAG-3 mAb C9B7W(2B scientific；目錄號BE0174-50MG)、含LALA突變的基準抗-PD-L1 mAb S1(序列辨識編號：122及119)以及mAbs C9B7W及S1之組合抑制腫瘤生長的能力進行比較。
年齡8-10週大且各自稱重為20-25 g之C57BL/6雌性小鼠(Charles River)於研究開始前休息一週。所有的動物都被切出微缺口(micro-chipped)且給予獨一無二的識別器。每群有10隻小鼠。MC38結腸癌細胞株(S. Rosenberg, NIH)初步被擴增、儲存，然後由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I程序來預篩選病原體並且顯示為無病原體。自-150 ℃儲存解凍MC38細胞且添加至含10% FCS(Gibco, 10270-106)之20 ml DMEM(Gibco, 61965-026)的T175組織培養燒瓶內。使用異氟醚(isoflurane) (Abbott Laboratories)麻醉小鼠且各動物於左側接受皮下注射2x106 個細胞。腫瘤細胞接種7-8天後，從研究中去除在此刻沒有腫瘤的小鼠。
全部的mAb2 分子及對照抗體都於注射前24小時之內以SEC-HPLC剖析(profiling)予以分析且檢查雜質。製備配於PBS之10 mg/kg終濃度的抗體且於組合研究中組合以第二抗體。於腫瘤接種後第8、11及14天藉由腹膜內(IP)注射來投與mAb2 分子及對照抗體至小鼠。進行準確的腫瘤測量，於討論的合適日子執行任何藥物給藥，以及小鼠於剩餘的試驗期間接受密切觀察。用測徑器進行腫瘤體積測量以判定腫瘤的最長軸及最短軸。使用下式來計算腫瘤體積： L x (S2 ) / 2 其中L=最長軸；S=最短軸
於第20天認為腫瘤負荷接近限制時停止試驗。人道犧牲全部的小鼠以及切除且秤重腫瘤。
結果顯示於圖 5 及6 內。LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1)治療的小鼠具有比用基準mAbs，C9B7W及S1之組合治療的該等，顯著更小重量之最終的腫瘤。具體而言，最終的腫瘤重量之統計分析係使用GraphPad Prism軟體包之內的雙尾司徒頓t檢定(Student’s t-test)來執行，其展示出投與FS18-29/S1以及投與基準抗體C9B7W及S1之組合之間有統計上顯著之差異(p = 0.0125)，表示與分開的分子所提供的LAG-3及PD-L1抑制作用相比，由相同的分子提供的LAG-3及PD-L1抑制作用對於最終的腫瘤重量導致了協同效應。
代理者mAb2 FS18-29/S1亦對於腫瘤生長有顯著的效應，防止8個生長MC38腫瘤中6者的建立，以及減緩剩餘2者的生長。投與組合的基準抗-LAG-3及PD-L1抗體減緩7隻動物之腫瘤生長且沒有動物是無腫瘤的。
FS18-29/4420單獨對於腫瘤生長沒有顯著的效應，表示為了最大的功效，mAb2 需要抗-PD-L1 Fab。基準抗小鼠LAG-3抗體單獨對於產生的腫瘤生長有非常少或沒有效應，而基準抗小鼠PD-L1防止此群7個腫瘤中1者的建立，以及有一些整體減緩腫瘤生長的效應。
同基因小鼠模式被接受為合適用於測試抑制治療標靶之抗腫瘤效應的鼠類系統，以及已經廣泛地用於證實人類療法的發展。 4.2mAb2 分子於MC38 建立的腫瘤模式內的活性
稱為FS18-29/S1、含LALA突變的代理者小鼠mAb2 FS18-7-108-29/S1(序列辨識編號：117及119)係以MC38同基因小鼠腫瘤生長模式來測試活體內活性。mAb2 抑制腫瘤生長的能力係與LAG-3/假mAb2 ，稱為FS18-29/4420、含LALA突變的FS18-7-108-29/4420(序列辨識編號：132及85)、基準LAG-3 mAb C9B7W、含LALA突變的基準PD-L1 mAb S1(序列辨識編號：122及119)以及C9B7W及S1之組合抑制腫瘤生長的能力進行比較。
年齡8-10週大且各自稱重為20-25 g之C57BL/6雌性小鼠(Charles River)於研究開始前休息一週。所有的動物都被切出微缺口且給予獨一無二的識別器。每群有10隻小鼠。MC38結腸癌細胞株(S. Rosenberg, NIH)初步被擴增、儲存，然後由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I程序來預篩選病原體並且顯示為無病原體。自-150 ℃儲存解凍MC38細胞(大概3-5x106 )且添加至含10% FCS(Gibco, 10270-106)之20 ml DMEM(Gibco, 61965-026)的T175組織培養燒瓶內。使用異氟醚(Abbott Laboratories)麻醉小鼠且將配於100 µl之2x106 個細胞予以皮下注射至各小鼠的左側內。腫瘤細胞接種7-8天後，例行監測小鼠的健康狀況及合適開始研究的腫瘤生長狀況。當多數小鼠顯現出直徑5-10 mm的腫瘤時，挑選出其等且隨機回到研究群。從研究中去除在此刻沒有合適大小腫瘤的任何小鼠。
全部的mAb2 分子及對照抗體都於注射前24小時之內以SEC-HPLC剖析予以分析且檢查雜質。製備配於PBS之10 mg/kg終濃度的抗體且於組合研究中組合以第二抗體。於腫瘤接種後第15、18及21天藉由IP注射來投與mAb2 分子及對照抗體至小鼠。以盲目的方式(blinded fashion)一週麻醉動物三次進行健康篩選，在那段時間進行準確的腫瘤測量。用測徑器進行腫瘤體積測量以判定腫瘤的最長軸及最短軸。使用來計算腫瘤體積之公式係如以上第4.1節所述。
於第24天認為腫瘤負荷接近限制時停止試驗。人道犧牲全部的小鼠以及切除且秤重腫瘤。結果顯示於圖 7 及8 內。
於小鼠同基因腫瘤模式內有效控制或抑止腫瘤生長最佳是在早期時間點經由治療性介入來達成(小於40mm3 的開始腫瘤體積)。介入投與得越晚，就越難觀察到關於腫瘤生長的正向效應，雖然也許此與人類臨床背景的情況是更相近的。
FS18-29/S1在早期時間點給予C57BL/6小鼠時，於免疫機能健全的小鼠內抑止腫瘤生長及預防MC38結腸癌之建立二者上均有正向效應。當在較晚的時間點投與時(50-125mm3 的開始腫瘤體積)，FS18-29/S1於抑止腫瘤生長方面只是像基準抗體組合一樣有效。FS18-29/4420單獨對於腫瘤生長沒有明顯影響以及S1及C9B7W二者對於產生的腫瘤生長有溫和的功效。4.3 mAb2 分子於CT26 未 建立的腫瘤模式內的活性
此實驗使用CT26同基因腫瘤模式，因已知CT26腫瘤會表現PD-L1於其等之細胞表面上且為高度免疫性導致腫瘤及周圍之免疫細胞上的LAG-3表現增高。
稱為FS18-29/S1、含LALA突變的代理者小鼠mAb2 FS18-7-108-29/S1(序列辨識編號：117及119)，以及稱為FS18-35/S1、含LALA突變的FS18-7-108-35/S1(序列辨識編號：120及119)，係以CT26同基因小鼠腫瘤生長模式來測試活體內活性。mAb2 抑制腫瘤生長的能力係與LAG-3/假mAb2 ，稱為FS18-29/4420之含LALA突變的FS18-7-108-29/4420(序列辨識編號：132及85)、及稱為FS18-35/4420之含LALA突變的FS18-7-108-35/4420(序列辨識編號：133及85)、基準LAG-3 mAb C9B7W、含LALA突變的基準PD-L1 mAb S1(序列辨識編號：122及119)以及C9B7W及S1之組合抑制腫瘤生長的能力進行比較。
年齡8-10週大且各自稱重為20-25 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)於研究開始前休息一週。所有的動物都被切出微缺口且給予獨一無二的識別器。每群有10隻小鼠。CT26結腸癌細胞株(ATCC, CRL-2638)初步被擴增、儲存，然後由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I程序來預篩選病原體並且顯示為無病原體。自-150 ℃儲存解凍CT26細胞(大概3-5x106 )且添加至含10% FCS(Gibco, 10270-106)之20 ml DMEM(Gibco, 61965-026)的T175組織培養燒瓶內。腫瘤細胞接種7-8天後，例行監測小鼠的健康狀況及合適開始研究的腫瘤生長狀況。當多數小鼠顯現出直徑3-5 mm3 的腫瘤時，挑選出其等且隨機回到研究群。從研究中去除在此刻沒有腫瘤的小鼠。
全部的mAb2 分子及對照抗體都於注射前24小時之內以SEC-HPLC剖析予以分析且檢查雜質。製備配於PBS之10 mg/kg終濃度的抗體且於組合研究中組合以第二抗體。於腫瘤接種後第8、11及14天投與mAb2 分子及對照抗體至小鼠。動物予以健康篩選，在那段時間進行準確的腫瘤測量。用測徑器進行腫瘤體積測量以判定腫瘤的最長軸及最短軸。使用來計算腫瘤體積之公式係如以上第4.1節所述：
於第20天認為腫瘤負荷接近限制時停止試驗。人道犧牲全部的小鼠以及切除且秤重腫瘤。結果顯示於圖 9 及10 內。
最終的腫瘤重量之統計分析係使用GraphPad Prism軟體包內的雙尾司徒頓t檢定來執行。腫瘤生長曲線之統計分析係使用可得自於R Project for Statistical Computing.之統計模型包，隨機模擬 (statmod) 之比較長曲線功能(Elso等人，2004及Baldwin等人，2007)來判定。
於抑止腫瘤生長方面在FS18-35/S1 mAb2 及IgG對照(正常生長)之間有展示出統計顯著之差異。於基準抗體之組合，或FS18-29/S1 mAb2 相對IgG對照組，或相對此試驗之任何其他群沒有觀察到此一統計顯著之差異。
CT26腫瘤模式為一種侵襲性、快速生長的腫瘤模式，小鼠先天傾向發展出腸轉移之一者，以及因此有非常受限的治療區間(therapeutic window)。
令人驚訝地基準LAG-3及PD-L1抗體之組合與IgG對照群相比，沒有顯著抑止腫瘤生長。然而，FS18-35/S1治療群與IgG對照相比確實顯露出顯著的生長抑止。FS18-29/S1，雖然與IgG對照相比其確實也抑止腫瘤生長，但非統計顯著的。此試驗顯示出第二種腫瘤模式，其中小鼠反應性的LAG-3/PD-L1 mAb2 業已於減緩腫瘤生長上展示出與投與基準單株抗體組合至少相同程度的正向效應。4.4 LALA 突變於MC38 未 建立的腫瘤模式內對於腫瘤 生長 抑制的效應
測試二種mAb2 (FS18-7-108-29/S1 LALA及FS18-7-108-29/S1)以檢查此等於Fc區域帶有及不帶有LALA突變之mAb2 的抗腫瘤活性可能的差異。稱為FS18-29/S1、帶有(序列辨識編號：117及119)及不帶有LALA突變(序列辨識編號：118及119)之代理者小鼠mAb2 FS18-7-108-29/S1，係使用MC38同基因小鼠腫瘤生長模式來測試活體內活性。mAb2 抑制腫瘤生長的能力係與LAG-3/假mAb2 ，帶有(序列辨識編號：132及85)及不帶有LALA突變(序列辨識編號：134及85)之FS18-7-108-29/4420，稱為FS18-29/4420LALA及FS18-29/4420，以及帶有及不帶有LALA突變之LAG-3/假mAb2 ，加上帶有(序列辨識編號：122及119)及不帶有LALA突變(序列辨識編號：123及119)之基準PD-L1 mAb S1之組合抑制腫瘤生長的能力進行比較。
年齡8-10週大且各自稱重為20-25 g之C57BL/6雌性小鼠(Charles River)於研究開始前休息一週。所有的動物都被切出微缺口且給予獨一無二的識別器。每群有10隻小鼠。MC38結腸癌細胞株(S. Rosenberg, NIH)初步被擴增、儲存，然後由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I程序來預篩選病原體並且顯示為無病原體。自-150 ℃儲存解凍MC38細胞(大概3-5x106 )且添加至含10% FCS(Gibco, 10270-106)之20 ml DMEM(Gibco, 61965-026)的T175組織培養燒瓶內。使用異氟醚(Abbott Laboratories)麻醉小鼠且將配於100 µl之2x106 個細胞予以皮下注射至各小鼠的左側內。於觀察下讓小鼠復原且接種日期記為第0天。腫瘤細胞接種7-8天後，例行監測小鼠的健康狀況及合適開始研究的腫瘤生長狀況。從研究中去除在此刻沒有腫瘤的小鼠。
全部的mAb2 分子及對照抗體都於注射前24小時之內以SEC-HPLC剖析予以分析且檢查雜質。製備配於PBS之10 mg/kg終濃度的抗體且於組合研究中組合以第二抗體。於腫瘤接種後第8、11及14天藉由IP注射來投與mAb2 分子及對照抗體至小鼠。以盲目的方式一週麻醉動物三次進行健康篩選，在那段時間進行準確的腫瘤測量。用測徑器進行腫瘤體積測量以判定腫瘤的最長軸及最短軸。使用來計算腫瘤體積之公式係如以上第4.1節所述。
人道犧牲全部的小鼠以及切除且秤重腫瘤。結果顯示於圖 11 及12 內。
此試驗確認了廢除ADCC活性之LALA突變的存在或缺乏，對於MC38結腸癌模式之腫瘤生長沒有統計上顯著的功效，然而包括LALA突變之該等mAb2 往往導致增強的腫瘤生長抑止作用。不過，包括該突變以有力地抑制ADCC活性對抗表現LAG-3或PD-L1的T細胞的基本理由是合理的，因LALA突變對於LAG-3/PD-L1 mAb2 的抗腫瘤活性沒有不利影響。有一些證據暗示包括LALA突變只對PD-L1抗體是關鍵的。
此試驗亦檢查是否LAG-3/PD-L1 mAb2 可具有超過投與個別抗體(LAG-3 LALA + PD-L1 LALA)增高的功效。在這種情況下，此等二群之間沒有顯著差異。二組均於MC38結腸癌模式中抑止生長。4.5 結論
總體來看，從以上的結果很清楚當一種包含LAG-3及PD-L1二者的結合位址之mAb2 分子投與至小鼠模式測試的小鼠時，對於腫瘤生長抑止有協同效應。根據此等結果，預期本發明的抗體分子比起分別投與結合LAG-3及PD-L1之二個分開的分子，於人類病患癌症之治療方面會顯示優越的效應，特別是抑止腫瘤生長。 實施例5：mAb2治療對於T細胞LAG-3表現的效應
稱為FS18-29/S1、含LALA突變的代理者小鼠mAb2 FS18-7-108-29/S1，(序列辨識編號：117及119)，導致下降的腫瘤負荷之機轉係於表現卵白蛋白(MC38.OVA)之MC38同基因小鼠腫瘤生長模式內予以測試。FS18-29/S1的效應係與稱為FS18-29/4420、含LALA突變的LAG-3/假mAb2 ，FS18-7-108-29/4420(序列辨識編號：132及85)、含LALA突變的基準PD-L1 mAb S1(序列辨識編號：122及119)以及FS18-29/4420及S1之組合的效應比較。
植入當天，收穫在對數期生長(匯集(Confluency) ~75%)之培養的MC38.OVA細胞且以1 x 107 個細胞/mL的濃度再懸浮於PBS內。腫瘤開始首先使用異氟醚麻醉各動物，繼而將1x106 個MC38.OVA細胞(0.1 mL懸浮液)予以皮下植入至各測試動物的左側內。腫瘤細胞植入11天之後使用決定性的隨機選擇方法，隨機選擇動物至具有32至62.5 mm3 的個別腫瘤體積之五組之內。動物係於腫瘤接種後第12、14及16天以10 mg/kg抗體或mAb2 給藥，以及於腫瘤接種後第19及23天從三隻動物/組採集腫瘤。使用GentleMACSTM 解離器來分離腫瘤與細胞隨後通過70 μm細胞過濾器予以篩分以獲得單一細胞懸浮液。於96孔平盤上1x106 個細胞/孔予以再懸浮於FACS緩衝液加上1:3000成活力染色劑及Fc阻斷物(block) (抗-CD16/32抗體)。FACS分析的細胞係使用包括對抗CD43、CD8a、CD4、FoxP3及LAG-3的標示抗體之Master Mix予以染色。關於FoxP3細胞內染色，使細胞固定及滲透化(permeabilized)然後用FoxP3抗體染色。樣本係以Canto II流式細胞儀及補償基質(compensation matrix)來進行以及計數最少500,000個事件。
在這實驗中，在已經投與第三劑量的抗體/mAb2 後，於對照及mAb2 治療之間看見腫瘤生長的區分但是於腫瘤尺寸之間有很大的差距可能扭曲結果之前的時候，檢查TILs之LAG-3表現。在這個時間點，用mAb2 FS18-29/S1或用FS18-29/4420及S1之組合治療的動物，發現TILs上之LAG-3表現顯著減少。具體而言，如圖 13 中所示，於腫瘤接種後第19及23天，分別對應於最後抗體/mAb2 給藥後3及7天，在FS18-29/S1治療之後CD8、CD4及FoxP3腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)上之LAG-3表現減少。LAG-3表現的減少於第23天更顯著但是於第19天還是很明顯。給予FS18-29/4420及S1之組合的動物於TILs之LAG-3表現亦顯示出減少但功效延遲直至第23天，而FS18-29/4420或S1個別投與對於TILs上之LAG-3表現的效應非常少或沒有效應。
此等結果顯示出LAG-3及PD-L1之雙重抑制對於減少TILs的LAG-3表現是必需的，因在用對抗LAG-3或PD-L1之單一製劑治療的動物沒有看見此現象。不希望受理論束縛，認為雙重抗-LAG-3及抗-PD-L1治療導致TILS上LAG-3的表現減少，藉此降低LAG-3之抑制效應且允許TILs克服衰竭。一旦TILs變成活化的，其等能辨識腫瘤表現的新抗原且發動反應對抗它。此因而被認為是以抗-LAG3/PD-L1 mAb2 進行治療的機轉導致腫瘤負荷減少。 實施例6：mAb2 之抗體依賴性細胞的細胞毒性及 補體 依賴性細胞毒性活性
IgG1抗體通常經由分子的恆定區域內保守的交互作用位址來展現效應子功能。此等包括抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)，其係由單核球/巨噬細胞、樹突細胞、NK細胞、嗜中性球及其他顆粒球上表現的FcγR之結合作用所媒介，以及補體依賴性細胞毒性(CDC)，其係由C1q補體組分之結合作用所起始之補體級聯(cascade)誘發的作用所媒介。既然LAG-3主要表現於活化的T細胞上以及PD-L1係表現於此等還有以高位準表現於腫瘤細胞上，所以探討mAb2 FS18-7-9/84G09(序列辨識編號：94及116)誘發ADCC及CDC的能力。
具體而言，測試LAG-3或PD-L1表現細胞之FS18-7-9/84G09治療，接著用NK細胞或補體來培育是否誘發各自標靶細胞的溶解。此外，既然FS18-7-9/84G09是雙專一性抗體，亦測試標靶接合於專一性之一者是否會影響對表現另一專一性的標靶的細胞之效應子功能。
瞭解mAb2 FS18-7-9/84G09之效應子功能為了由於一些原因是有用的，包括判定分子內是否應該包括一種會降低效應子功能的突變，例如LALA突變，以防止參與殺死腫瘤之表現LAG-3效應子T細胞免受FS18-7-9/84G09-媒介的ADCC及/或CDC的傷害。6.1 研究設計
全部的分析都使用重組表現LAG-3或PD-L1的Raji氏細胞，使用其等之內生表現的CD20作為對照供通用版本的利妥昔單抗靶定以展示添加的補體及NK細胞製備物之功能活性與重組表現標靶蛋白無關。此等實驗前確認標靶的表現。
為了判定對LAG-3或PD-L1表現細胞的基礎CDC活性，此活性使用LDH釋放來測量，其係測量一基質轉化成螢光染料(Promega之CytoTox-ONE™)。為了測量包含表現LAG-3細胞及表現PD-L1細胞二者的細胞混合物哪種標靶細胞被溶解，於用mAb2 /抗體培育之後藉由差別螢光標示的標靶細胞之流動式細胞測量術來測量差別CDC，使用排除活細胞的螢光染料來偵測死細胞。
為了判定對LAG-3或PD-L1表現細胞的ADCC活性，此活性係使用單離自冷凍PBMC的NK細胞來測量以及以比色來測量LDH釋放(Promega之CytoTox 96)。關於全部的此等研究，使用各種的同型及Fc構形之利妥昔單抗作為對照。沒有已知的可靠方法用於有差別地測量ADCC，所以不測量差別ADCC活性。
於全部的實驗中，使用PD-L1專一性mAb(84G09)及LAG-3專一性mAb(25F7)作為對照。亦使用一種IgG同型對照(4420)，其使用作為陰性對照或用來產生CDC背景活性。各自的抗體及mAb2 (除25F7之外)之LALA版本於CDC及ADCC分析中也與IgG1野生型版本作比較以判定此突變對於此等效應子功能的效應。6.2 材料及方法 6.2.1 CDC 分析
全部的抗體/mAb2 ，包括利妥昔單抗，係以1配於2之10點連續稀釋予以稀釋。含所使用最高濃度的IgG(4420LALA)之對照孔亦予以製備。各自重組表現LAG-3或PD-L1的Raji氏細胞之細胞懸浮液係以無血清培養基來製備用於LDH釋放分析且添加至等體積的製備抗體/mAb2 。
關於流動式細胞測量術為基的CDC分析， 製備5 x 107 個細胞之細胞懸浮液以及再懸浮於配於無血清培養基之0.5 μM CellTracker深紅(deep red) (CellTracker™ Deep Red, Thermo Fisher, #C34565)或5 μM CellTracker Green (CellTracker™ Green CMFDA (5-氯甲基螢光素二乙酸酯，Thermo Fisher, # C7025)。於37℃下培育30 min之後，以無血清培養基來清洗細胞且直接添加至含製備的抗體/mAb2 的孔，或組合等體積的其他差別染色的細胞株然後添加至如以上所述之含抗體/mAb2 的孔。在二者分析方面，於細胞培養條件下培育30 min之後，以等體積的兔寶寶補體，10%配於無血清培養基內(兔寶寶補體，TEBU-bio， #CL3441)予以補充加注孔。於細胞培養條件下培育平盤4 hrs。在LDH釋放CDC分析方面，藉由添加曲拉通(Triton) X 100至半數4420 LALA治療的孔來產生100%溶解對照以及Cytotox分析係依照製造商的指示(CytotoxOne,Promega, G7891)來執行。獲得讀數之後，來自100%溶解對照的訊號設定為100%以及來自樣本孔的訊號計算為該位準的百分率。
關於流動式細胞測量術為基的CDC分析，培育時期結束時，死細胞染料(SYTOX® Blue Dead Cell Stain, Thermo Fisher, #S34857)係以1配於500PBS予以稀釋以及以等體積予以補充加注。流動式細胞測量術係以Cytoflex流式細胞儀來執行，其係根據FSC及SSC來框選完整的細胞族群以及偵測CellTracker™ Deep Red陽性及CellTracker™ Green CMFDA陽性細胞族群二者之Sytox陽性細胞(PB450道) 百分率。6.3.2 ADCC 分析
如先前所述來測量ADCC(Broussas, Matthieu；Broyer, Lucile；以及Goetsch, Liliane. (2013) Evaluation of Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity Using Lactate Dehydrogenase (LDH) Measurement inGlycosylation Engineering of Biopharmaceuticals: Methods and Protocols , Methods in Molecular Biology. New York: Springer Science + Business Media. Volume 988, pp 305-317)。簡言之，標靶細胞係與一起抗體預培育然後添加20比1的比率之自人類PBMCs單離的初生NK細胞(NK細胞單離套組，Miltenyi Biotec，130-092-657)歷時4 hrs。細胞毒性分析係遵循製造商的指示(CytoTox 96非放射性細胞毒性分析，Promega，G1780)予以執行。溶解%係把效應子及標靶細胞自發性的溶解考慮在內，根據100%標靶細胞溶解來計算。 6.3結果 及結論 6.3.1 CDC 分析
抗-CD20抗體利妥昔單抗靶定表現PD-L1 Raji氏細胞，當用一般(generic)LDH釋放測量CDC時，其導致＜60%的最大溶解。抗-PD-L1抗體84G09(其包含mAb2 FS18-7-9/84G09的F(ab)2 部分)，及呈IgG1形式之FS18-7-9/84G09，以IgG1形式利妥昔單抗所需之估計半最大劑量大約一半的估計半最大劑量，顯現出更高的最大溶解還有更高的溶解效能。此顯示導入LAG-3結合位址至84G09抗體內不會改變其關於效能或最大反應之PD-L1靶定活性，因為當比較84G09及FS18-7-9/84G09時，二者均非常相似。導入LALA突變導致利妥昔單抗、84G09及FS18-7-9/84G09之最大反應降低，然而，只有84G09及FS18-7-9/84G09的效能降低。如預期，抗-LAG-3抗體25F7對於表現PD-L1 Raji氏細胞之細胞成活力沒有效應，因此等細胞沒有表現人類LAG-3。此等結果顯示於圖 14A 內。
抗-CD20抗體利妥昔單抗靶定表現LAG-3 Raji氏細胞用於CDC，然而，以利妥昔單抗所需之估計半最大劑量大約一半的估計半最大劑量，LAG-3抗體25F7顯示出更好的效能。其他的抗體無一者顯示出對抗表現LAG-3 Raji氏細胞之任何CDC活性，包括FS18-7-9/84G09。導入LALA突變對於利妥昔單抗之CDC活性的效應非常有限(圖14B )。6.3.2 差別CDC 分析
本發明人發展出一種使用流動式細胞測量術之差別CDC分析，來區分用FS18-7-9/84G09或對照抗體治療時是溶解那種表現標靶的細胞。此分析係用來確認來自以上所述基礎LDH釋放CDC分析的結果。與對於活細胞的百分率沒有效應之IgG同型對照抗體(4420)比較之下，利妥昔單抗媒介活細胞的減少及死細胞的增加，表現PD-L1及LAG-3細胞二者均是。然而，FS18-7-9/84G09對於表現LAG-3細胞沒有效應，但非常有效率地溶解表現PD-L1細胞。相似地，LAG-3專一性抗體25F7及PD-L1抗體84G09的混合物亦顯示出劑量依賴性活細胞減少以及死細胞的互反(reciprocal)增加，然而，表現LAG-3細胞之最大溶解只有超過50%細胞，但是在全部測試的抗體之最大溶解之最低劑量，大約1 nM的濃度就已經達到。此確認了先前的發現就是FS18-7-9/84G09的CH3域內之LAG-3結合位址不會誘發表現LAG-3標靶細胞之CDC媒介的溶解。此外，此實驗顯示出表現LAG-3細胞的存在對於FS18-7-9/84G09對表現PD-L1細胞之CDC活性沒有效應。結果顯示於圖 15 內。6.3.3 ADCC 分析
抗-CD20抗體利妥昔單抗、FS18-7-9/84G09及84G09以非常相似的功效及效能靶定表現PD-L1 Raji氏細胞用於ADCC，導致約40%的細胞之最大溶解。利妥昔單抗及含LALA突變的84G09顯示沒有ADCC-媒介的溶解，以及含LALA突變的FS18-7-9/84G09顯示沒有或非常低的ADCC-媒介的表現PD-L1標靶細胞之溶解。帶有及不帶有LALA突變之LAG-3專一性抗體25F7及同型對照4420於此分析內顯示沒有活性。
此等結果顯示導入LAG-3結合位址至抗體84G09內不會改變其關於效能或最大反應之PD-L1靶定ADCC活性，因為二者均與PD-L1專一性抗體84G09非常相似。導入LALA突變的導致ADCC活性之廢除(圖16A )。
利妥昔單抗及25F7靶定表現LAG-3 Raji氏細胞用於ADCC-媒介的溶解，導致大約40%的最大溶解。, FS18-7-9/84G09亦媒介表現LAG-3細胞經由ADCC之溶解，雖然效能及功效低得多，於2.5 nM濃度下只達到20%以下的溶解。導入LALA突變廢除了利妥昔單抗及FS18-7-9/84G09所有的ADCC活性。帶有及不帶有LALA突變之84G09及同型對照4420如預期地於此分析內顯示為，因此等抗體不結合LAG-3(圖 16B)。序列表 Fcab FS18-7-9環區域的胺基酸序列 FS18-7-9 AB環– WDEPWGED (序列辨識編號：1) FS18-7-9 CD環– SNGQPENNY (序列辨識編號：2) FS18-7-9 EF環– PYDRWVWPDE (序列辨識編號：3) Fcab FS18-7-9 CH3域的核苷酸序列 (序列辨識編號：4) GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Fcab FS18-7-9 CH3域之CHO密碼子最佳化的核苷酸序列 (序列辨識編號：142) GGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCTGGGATGAGCCCTGGGGCGAGGATGTGTCTCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGCCCTACGACAGATGGGTGTGGCCCGACGAGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC Fcab FS18-7-9 CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：5) GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含C端離胺酸的Fcab FS18-7-9 CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：135) GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 包含LALA突變(劃底線)的Fcab FS18-7-9 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：6) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的Fcab FS18-7-9 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：7) 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CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：15) GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變(劃底線)的Fcab FS18-7-33 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：16) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的Fcab FS18-7-33 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：17) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fcab FS18-7-36環區域的胺基酸序列 FS18-7-36 AB環– WDEPWGED (序列辨識編號：1) FS18-7-36 CD環– SNGQPENNY (序列辨識編號：18) FS18-7-36 EF環– PYDRWVWPDE (序列辨識編號：3) Fcab FS18-7-36 CH3域之核苷酸序列(序列辨識編號：19) 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CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：30) GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變(劃底線)的Fcab FS18-7-62 CH2及CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：31) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的Fcab FS18-7-62 CH2及CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：32) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fcab FS18-7-65環區域的胺基酸序列 FS18-7-65 AB環– WDEPWGED (序列辨識編號：1) FS18-7-65 CD環– SNGYAEYNY (序列辨識編號：33) FS18-7-65 EF環– PYDRWVWPDE (序列辨識編號：3) Fcab FS18-7-65 CH3域之核苷酸序列(序列辨識編號：34) 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APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fcab FS18-7-78環區域的胺基酸序列 FS18-7-78 AB環– WDEPWGED (序列辨識編號：1) FS18-7-78 CD環– SNGYKEENY (序列辨識編號：38) FS18-7-78 EF環– PYDRWVWPDE (序列辨識編號：3) Fcab FS18-7-78 CH3域之核苷酸序列(序列辨識編號：39) GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATAAAGAAGAAAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Fcab FS18-7-78 CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：40) GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變(劃底線)的Fcab FS18-7-78 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：41) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的Fcab FS18-7-78 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：42) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fcab FS18-7-88環區域的胺基酸序列 FS18-7-88 AB環– WDEPWGED (序列辨識編號：1) FS18-7-88 CD環 – SNGVPELNV (序列辨識編號：43) FS18-7-88 EF環– PYDRWVWPDE (序列辨識編號：3) Fcab FS18-7-88 CH3域之核苷酸序列(序列辨識編號：44) GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGTTCCAGAACTGAACGTTAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Fcab FS18-7-88 CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：45) GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變(劃底線)的Fcab FS18-7-88 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：46) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的Fcab FS18-7-88 CH2及CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：47) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fcab FS18-7-95環區域的胺基酸序列 FS18-7-95 AB環– WDEPWGED (序列辨識編號：1) FS18-7-95 CD環– SNGYQEDNY (序列辨識編號：48) FS18-7-95 EF環– PYDRWVWPDE (序列辨識編號：3) Fcab FS18-7-95 CH3域之核苷酸序列(序列辨識編號：49) GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATCAGGAAGATAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Fcab FS18-7-95 CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：50) GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變(劃底線)的Fcab FS18-7-95 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：51) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的Fcab FS18-7-95 CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：52) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 野生型人類IgG1 CH2域的胺基酸序列(序列辨識編號：53) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 包含“LALA突變”(劃底線)的人類IgG1 CH2域的胺基酸序列 (序列辨識編號：54) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 沒有LALA突變的“野生型”Fcab CH2及CH3域的胺基酸序列(序列辨識編號：55)。 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變(劃底線)的“野生型”Fcab CH2及CH3域的胺基酸序列 (序列辨識編號：56) APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 人類IgG1鉸鏈區域的胺基酸序列 (序列辨識編號：57) EPKSCDKTHTCPPCP 人類IgG1截斷的鉸鏈區域的胺基酸序列(序列辨識編號：58) TCPPCP 包含LALA突變(劃底線)的抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-108-29的胺基酸序列 (序列辨識編號：59)CH3 域係以斜體顯示。CH3 域的AB 、CD 及EF 環以粗體顯示並劃底線。 TCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-108-29的胺基酸序列(序列辨識編號：60)CH3 域係以斜體顯示。CH3 域的AB 、CD 及EF 環以粗體顯示並劃底線。 TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變(劃底線)的抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-108-35的胺基酸序列 (序列辨識編號：61)CH3 域係以斜體顯示。AB 、CD 及EF 環區域以粗體顯示並劃底線。 TCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-108-35的胺基酸序列(序列辨識編號：62)CH3 域係以斜體顯示。AB 、CD 及EF 環區域以粗體顯示並劃底線。 TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-9/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：63)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-9/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：64)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-32/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：65)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-32的重鏈之胺基酸序列/沒有LALA突變(序列辨識編號：66)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-33/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：67)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-33/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：68)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-36/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：69)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-36/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：70)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-58/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：71)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-58/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：72)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-62/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：73)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-62/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：74)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-65/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：75)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPD E FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-65/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：76)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPD E FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-78/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：77)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-78/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：78)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-88/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：79)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-88/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：80)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-95/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：81)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗人類LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-95/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：82)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗FITC mAb 4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：83)CDRs 的位置劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 沒有LALA突變的抗FITC mAb 4420的重鏈之胺基酸序列 (序列辨識編號：84)CDRs 的位置劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗FITC mAb 4420的輕鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：85)CDRs 的位置劃底線。 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTY LRWYLQKPGQSPKVLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據IMGT) HCDR1 GFTFDDYA (序列辨識編號：86) HCDR2 ISWKSNII (序列辨識編號：87) HCDR3 ARDITGSGSYGWFDP (序列辨識編號：88) LCDR1 QSISSY (序列辨識編號：89) LCDR2 VAS (序列辨識編號：90) LCDR3 QQSYSNPIT (序列辨識編號：91) 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據卡貝特氏) HCDR1 DYAMH (序列辨識編號：136) HCDR2 GISWKSNIIGYADSVKG (序列辨識編號：137) HCDR3 DITGSGSYGWFDP (序列辨識編號：138) LCDR1 RASQSISSYLN (序列辨識編號：139) LCDR2 VASSLQS (序列辨識編號：140) LCDR3 QQSYSNPIT (序列辨識編號：141) 抗-PD-L1抗體84G09 VH域的胺基酸序列(序列辨識編號：92) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSS 抗-PD-L1抗體84G09 VL域的胺基酸序列(序列辨識編號：93) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKPLIYVASSLQSGVPSSFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPITFGQGTRLEIK 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-9/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：94)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-9/84G09重鏈之胺基酸序列 (序列辨識編號：95)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-32/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：96)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-32/84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：97)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSEIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-33/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：98)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-33/84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：99)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-36/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：100)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-36/84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：101)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSYFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-58/84G09的胺基酸序列 (序列辨識編號：102)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-58/84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：103)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYPEIEF KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-62/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：104)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-62/84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：105)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGIPEWNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-65/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：106)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-65/84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：107)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYAEYNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-78/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：108)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-78/84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：109)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYKEENY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-88/84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：110)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-88/84G09重鏈之胺基酸序列 (序列辨識編號：111)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGVPELNV KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-95/84G09的胺基酸序列 (序列辨識編號：112)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-95/84G09重鏈之胺基酸序列 (序列辨識編號：113)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGYQEDNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PYDRWVWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA重鏈之抗人類PD-L1 mAb 84G09的胺基酸序列(序列辨識編號：114)CDRs 的位置劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類PD-L1 mAb 84G09重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：115)CDRs 的位置劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNII GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDP WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗人類PD-L1 mAb 84G09輕鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：116)CDRs 的位置劃底線。 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSY LNWYQQKPGKAPKPLIYVAS SLQSGVPSSFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPIT FGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 有LALA突變重鏈之抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-29/S1的胺基酸序列(序列辨識編號：117)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW IHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGST YYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-29/S1重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：118)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW IHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGST YYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗小鼠PD-L1 mAb S1輕鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：119)CDRs 的位置劃底線。 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTA VAWYQQKPGKAPKLLIYSAS FLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 有LALA突變重鏈之抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-35/S1的胺基酸序列(序列辨識編號：120)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW IHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGST YYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗小鼠LAG-3/PD-L1 mAb2 FS18-7-108-35/S1重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：121)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW IHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGST YYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 有LALA突變重鏈之對照PD-L1 mAb S1的胺基酸序列 (序列辨識編號：122)CDRs 的位置劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW IHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGST YYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 對照PD-L1 mAb S1重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：123)CDRs 的位置劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW IHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGST YYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 對照抗人類LAG-3 mAb 25F7重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：124)CDRs 的位置劃底線。 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYY WNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGST NSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYN WFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 對照抗人類LAG-3 mAb 25F7輕鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：125)CDRs 的位置劃底線。 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSY LAWYQQKPGQAPRLLIYDAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLT FGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 人類LAG-3之胺基酸序列(序列辨識編號：126) MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL 小鼠LAG-3之胺基酸序列 (序列辨識編號：127) MREDLLLGFLLLGLLWEAPVVSSGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPGVGTPSLLIAKWTPPGGGPELPVAGKSGNFTLHLEAVGLAQAGTYTCSIHLQGQQLNATVTLAVITVTPKSFGLPGSRGKLLCEVTPASGKERFVWRPLNNLSRSCPGPVLEIQEARLLAERWQCQLYEGQRLLGATVYAAESSSGAHSARRISGDLKGGHLVLVLILGALSLFLLVAGAFGFHWWRKQLLLRRFSALEHGIQPFPAQRKIEELERELETEMGQEPEPEPEPQLEPEPRQL 食蟹獼猴LAG-3之胺基酸序列 (序列辨識編號：128) MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPPQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPPVPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALRAGHLPLFLILGVLFLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPELEPEPELERELGPEPEPGPEPEPEQL 人類PD-L1之胺基酸序列 (序列辨識編號：129) MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET 鼠類PD-L1之胺基酸序列 (序列辨識編號：130) MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET 食蟹獼猴PD-L1之胺基酸序列 (序列辨識編號：131) MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKCGIRVTNSKKQRDTQLEET 包含LALA突變的抗小鼠LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-108-29/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：132)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 包含LALA突變的抗小鼠LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-108-35/4420的重鏈之胺基酸序列(序列辨識編號：133)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。LALA 突變的位置為粗體。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDISVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗小鼠LAG-3/FITC mAb2 FS18-7-108-29/4420的重鏈之胺基酸序列 (序列辨識編號：134)CDRs 的位置劃底線，以及AB 、CD 及EF 環序列為粗體並劃底線。 EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYW MNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYET YYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS WDEPWGED VSLTCLVKGFYPSDIVVEWE SNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV PFERWMWPDE FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG參考資料 本說明書所提及之所有文件係以其等之整體藉此併入以作為參考資料。 Bae J, Lee SJ, Park CG, Lee YS, Chun T. 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圖 1 ： A 顯示於第二次親和力成熟後對照親代Fcab，FS18-7-9，鑑定出的九種Fcabs之序列排列比對，FS18-7-32；FS18-7-33；FS18-7-36；FS18-7-58；FS18-7-62；FS18-7-65；FS18-7-78；FS18-7-88；及FS18-7-95。B 顯示此等Fcabs各者與親代Fcab，FS18-7-9的序列之序列同一性百分率。
圖 2 顯示T細胞活化分析的結果。具體而言，圖2顯示用mAb2 FS18-7-9/84G09(圖 2A-C )或FS18-7-62/84G09或FS18-7-78/84G09(圖 2D-F )，及對照抗體治療的細胞株小組內IL-2釋放之代表圖，IL-2釋放為T細胞活化的指示。圖2A ： 有LAG-3及PD-L1的分析需要抑制二種標靶(FS18-7-9/84G09LALA、FS18-7-9/ 4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA或25F7+S1LALA)以使得活化。圖2B ：有LAG-3的分析只需要抑制LAG-3來活化(FS18-7-9/84G09LALA、FS18-7-9/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA、25F7+S1LALA、25F7、FS18-7-9/4420 LALA)。圖2C ： 有PD-L1的分析只需要抑制PD-L1來活化(FS18-7-9/84G09LALA、FS18-7-9/4420LALA+ 84G09、25F7+84G09LALA、25F7+S1LALA、84G09LALA)。圖 2D ： 有LAG-3及PD-L1的分析需要抑制二種標靶(FS18-7-62/84G09LALA、FS18-7-78/ 84G09LALA、FS18-7-62/4420LALA+ 84G09、FS18-7-78/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA或25F7+S1LALA)以使得活化。圖 E ： 只有LAG-3的分析需要抑制LAG-3來活化(FS18-7-62/84G09LALA、FS18-7-62/4420LALA、FS18-7-78/84G09LALA、FS18-7-78/4420LALA、FS18-7-62/4420LALA+ 84G09、FS18-7-78/4420LALA+ 84G09、25F7+ 84G09LALA或25F7+S1LALA)。圖 2F ： 只有PD-L1的分析需要抑制PD-L1來活化(FS18-7-62/84G09LALA、FS18-7-78/84G09LALA、FS18-7-62/4420LALA+ 84G09、FS18-7-78/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA或25F7+S1LALA)。
圖 3 顯示於cLAG-3 + cPD-L1二者以及cLAG-3或cPD-L1單獨存在下，FS18-7-9/84G09能誘發T細胞活化，如IL-2釋放所指示，顯示功能上食蟹獼猴交叉反應性。
圖 4 顯示SEB分析的代表圖。LAG-3/PD-L1 mAb2 及LAG-3/4420 mAb2 + 84G09LALA之組合顯示比84G09LALA mAb單獨更大的活化作用，而LAG-3/4420 mAb2 或4420 mAb未顯示顯著的活化作用。
圖 5 顯示未建立的MC38同基因腫瘤模式第20天之最終的腫瘤重量。LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1)治療的小鼠具有比用基準mAbs，C9B7W及S1之組合治療的該等顯著更輕的重量。
圖 6 顯示未建立的MC38同基因腫瘤模式之生長曲線。LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1)治療的小鼠具有比用基準mAbs，C9B7W及S1之組合治療的該等，或S1單獨治療的該等更小的腫瘤。LAG-3/4420 mAb2及基準抗-LAG-3 mAb對於腫瘤生長影響不大。
圖 7 顯示建立的MC38同基因腫瘤模式第24天之最終的腫瘤重量。LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1)如同基準抗體，C9B7W及S1之組合於抑止腫瘤生長方面同樣有效。FS18-29/4420單獨對於腫瘤生長沒有明顯影響以及S1及C9B7W二者對於產生的腫瘤生長有溫和的功效。
圖 8 顯示建立的MC38同基因腫瘤模式之腫瘤生長曲線。LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1)治療的小鼠與用基準mAbs，C9B7W及S1之組合治療的該等，有相似的腫瘤體積。用S1或C9B7W單獨治療的小鼠顯示中等程度的腫瘤體積，而LAG-3/4420 mAb2 治療對於腫瘤生長沒有影響。
圖 9 顯示未建立的CT26同基因腫瘤模式第20天之最終的腫瘤重量。LAG-3/PD-L1 mAb2 (FS18-29/S1及FS18-35/S1)抑制腫瘤生長達到比基準抗體，C9B7W及S1之組合，更大的程度。
圖 10 顯示未建立的CT26同基因腫瘤模式之腫瘤生長曲線。於FS18-35/S1相對IgG對照於抑止腫瘤生長方面展示出統計顯著之差異。於基準抗體之組合，相對IgG對照組沒有觀察到此一統計顯著之差異。
圖 11 顯示未建立的MC38同基因腫瘤模式第22天之最終的腫瘤重量，用來比較mAb2 內之LALA突變對於腫瘤生長抑制的功效。用帶有及不帶有LALA突變之mAb2 治療的小鼠之間最終的腫瘤重量沒有統計顯著之差異。
圖 12 顯示未建立的MC38同基因腫瘤模式之腫瘤生長曲線用來比較帶有及不帶有LALA突變之mAb2 對於腫瘤生長抑制的功效。用帶有及不帶有LALA突變之mAb2 治療的小鼠之間的腫瘤生長曲線沒有統計顯著之差異，然而含LALA突變之分子有增高的腫瘤生長抑制的趨勢。
圖 13 顯示mAb2 治療對於T細胞LAG-3表現的功效。顯示出於腫瘤接種後第19及23天，分別對應於最後mAb2 /抗體給藥後第3及7天，用mAb2 FS18-29/S1、FS18-29/4420、S1、FS18-29/4420及S1，或是對照抗體4420治療的CD8(A )、CD4(B )及FoxP3(C )腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)上的LAG-3表現。第19及23天於mAb2 FS18-29/S1治療後LAG-3的表現減少。提供FS18-29/4420及S1之組合的動物亦顯示出LAG-3表現的減少但功效延遲直至第23天，而FS18-29/4420或S1個別投與導致LAG-3表現的減少非常少或沒有減少。
圖 14 顯示各種的抗體/mAb2 治療後使用乳酸去氫酶(LDH)釋放CDC分析之表現PD-L1及LAG-3 Raji氏細胞之溶解百分率。A 及B 分別顯示表現PD-L1及LAG-3 Raji氏細胞之CDC-媒介的溶解。用抗-LAG-3抗體25F7、抗-PD-L1抗體84G09、包含LALA突變的抗-PD-L1抗體84G09、抗-CD20抗體利妥昔單抗(Rituximab)、mAb2 FS18-7-9/84G09、包含LALA突變的mAb2 FS18-7-9/ 84G09或包含LALA突變的利妥昔單抗來培育(incubate)細胞。治療後4 hrs用兔寶寶補體(baby rabbit complement)來測量LDH釋放以及表達為與總溶解相比之百分率。抗體/mAb2 治療的濃度表示在X軸上。所有的曲線斜率設定一共同值(shared value)俾以能對曲線作比較。
圖 15 顯示各種治療後使用流動式細胞測量術為基的CDC分析之死亡的表現PD-L1及LAG-3 Raji氏細胞之百分率。差別螢光標示的表現PD-L1及LAG-3細胞的混合物係用對照抗體4420、抗-CD20抗體利妥昔單抗(RIT)、抗-LAG-3抗體25F7及抗-PD-L1抗體84G09之組合或mAb2 FS18-7-9/84G09來培育。繼而用兔寶寶補體(baby rabbit complement)來治療細胞以及使用只染死細胞的染料來染色。二細胞族群中死細胞百分率係評定為總細胞百分率。每次治療後評估的細胞類型(表現PD-L1或表現LAG-3，由差別螢光標示予以辨認)係根據相關治療命名表示於圖 15 內，參見例如4420 PDL1，其係指表現PD-L1 Raji氏細胞於對照抗體4420治療後之成活力評估。抗體/mAb2 治療的濃度表示在X軸上。
圖 16 顯示各種的治療後使用乳酸去氫酶(LDH)釋放ADCC分析之表現PD-L1及LAG-3 Raji氏細胞之溶解(細胞毒性)百分率。用抗-CD20抗體利妥昔單抗、抗-PD-L1抗體84G09、mAb2 FS18-7-9/84G09、包含LALA突變的利妥昔單抗、包含LALA突變的mAb2 FS18-7-9/84G09、抗-LAG-3抗體25F7、包含LALA突變的抗-PD-L1抗體84G09、對照抗體4420或包含LALA突變的對照抗體4420來治療細胞。治療的細胞繼而用初生NK細胞來共培育以及特異性LDH釋放係測量為與標靶細胞總溶解相比之百分率。抗體/mAb2 治療的濃度表示在X軸上。
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 6<211> 216<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 包含LALA突變的Fcab FS18-7-9 CH2及CH3域的胺基酸序列<400> 6Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro 115 120 125 Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 8<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220><223> FS18-7-32 CD環<400> 8Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 1 5 <210> 9<211> 318<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fcab FS18-7-32 CH3域之核苷酸序列<400> 9ggccagcctc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cctgggatga gccgtggggt 60gaagacgtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgaaat 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318<210> 35<211> 106<212> PRT<213> 人工序列<220><223> Fcab FS18-7-65 CH3域的胺基酸序列<400> 35Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Tyr Ala Glu 35 40 45 Tyr Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 36<211> 216<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 包含LALA突變的Fcab FS18-7-65 CH2及CH3域的胺基酸序列<400> 36Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Val Pro Glu Leu Asn 145 150 155 160 Val Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro Asp Glu 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 47<211> 216<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 沒有LALA突變的Fcab FS18-7-88 CH2及CH3域的胺基酸序列<400> 47Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 57<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人類IgG1鉸鏈區域的胺基酸序列<400> 57Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 58<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人類IgG1截斷的鉸鏈區域的胺基酸序列<400> 58Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 59<211> 222<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 包含LALA突變的抗小鼠LAG-3 Fcab FS18-7-108-29的胺基酸序列<400> 59Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 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Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys 165 170 175 Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg 180 185 190 Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr 195 200 205 Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln 210 215 220 Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg 225 230 235 240 Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu 245 250 255 Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val 260 265 270 Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu 275 280 285 Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala 290 295 300 Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala 305 310 315 320 Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu 325 330 335 Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe 340 345 350 Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala 355 360 365 Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro 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Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270 Gly Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val 275 280 285 Gly Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320 Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg 325 330 335 Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro 370 375 380 Leu Asn Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly 435 440 445 His Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gly Ala Phe Gly 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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Trp Asp Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Phe Glu 405 410 415 Arg Trp Met Trp Pro Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 135<211> 107<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 包含C端離胺酸的Fcab FS18-7-9 CH3域的胺基酸序列<400> 135Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Trp Gly Glu Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Tyr Asp Arg Trp Val Trp Pro 65 70 75 80 Asp Glu Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 136<211> 5<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據卡貝特氏) HCDR1<400> 136Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 137<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據卡貝特氏) HCDR2<400> 137Gly Ile Ser Trp Lys Ser Asn Ile Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 138<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據卡貝特氏) HCDR3<400> 138Asp Ile Thr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 139<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據卡貝特氏) LCDR1<400> 139Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 140<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據卡貝特氏) LCDR2<400> 140Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 141<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 抗-PD-L1抗體84G09的CDRs之胺基酸序列(根據卡貝特氏) LCDR3<400> 141Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Ile Thr 1 5 <210> 142<211> 318<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fcab FS18-7-9 CH3域之CHO密碼子最佳化的核苷酸序列<400> 142ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcctccat cctgggatga gccctggggc 60gaggatgtgt ctctgacctg tctcgtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 120tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 180gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg acagtgccct acgacagatg ggtgtggccc 240gacgagttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 300ctgtccctga gccccggc 318
(無)

Claims (39)

  1. 一種結合程式性死亡配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)及淋巴細胞活化基因3(LAG-3)的抗體分子，其中該抗體分子包含： (i)一用於PD-L1之CDR-為基的抗原結合位址；以及 (ii)一LAG-3抗原結合位址座落於該抗體分子的一CH3域內，其中該LAG-3結合位址包含胺基酸序列WDEPWGED(序列辨識編號：1)及PYDRWVWPDE(序列辨識編號：3)，且其中該胺基酸序列WDEPWGED座落於該CH3域之一第一結構環內及該胺基酸序列PYDRWVWPDE座落於該CH3域之一第二結構環內。
  2. 如請求項1之抗體分子，其中該LAG-3抗原結合位址包含序列辨識編號：1內列出的該胺基酸序列於AB環內，以及序列辨識編號：3內列出的該胺基酸序列於該CH3域之EF環內。
  3. 如請求項1或2之抗體分子，其中： (i)序列辨識編號：1內列出的該胺基酸序列係座落於該CH3域之殘基11至18；及/或 (ii)序列辨識編號：3內列出的該胺基酸序列係座落於該CH3域之殘基92至101； 其中該胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics IMGT)編號方式。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體分子，其中該LAG-3抗原結合位址進一步包含下列序列中的一者： (i) SNGQPENNY (序列辨識編號2、8及18)； (ii) SNGQPEDNY (序列辨識編號：13)； (iii) SNGYPEIEF (序列辨識編號：23)； (iv) SNGIPEWNY (序列辨識編號：28)； (v) SNGYAEYNY (序列辨識編號：33)； (vi) SNGYKEENY (序列辨識編號：38)； (vii) SNGVPELNV (序列辨識編號：43)；或 (viii) SNGYQEDNY (序列辨識編號：48)。
  5. 如請求項4之抗體分子，其中該LAG-3抗原結合位址包含序列辨識編號：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48內列出的該胺基酸序列於該CH3域之CD環內。
  6. 如請求項4之抗體分子，其中該LAG-3抗原結合位址包含序列辨識編號：2、28或38內列出的該胺基酸序列於該CH3域之CD環內。
  7. 如請求項4之抗體分子，其中該LAG-3抗原結合位址包含序列辨識編號：2內列出的該胺基酸序列於該CH3域之CD環內。
  8. 如請求項4至7中任一項之抗體分子，其中序列辨識編號：2、8、13、18、23、28、33、38、43或48內列出的該胺基酸序列係座落於該抗體分子的該CH3域之殘基43至78，其中該等殘基係根據該IMGT編號方式進行編號。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體分子，其中該抗體分子為一免疫球蛋白G分子。
  10. 如請求項9之抗體分子，其中該抗體分子為一IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子。
  11. 如請求項10之抗體分子，其中該抗體分子為一IgG1分子。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：5、10、15、20、25、30、35、40、45或50內列出的該CH3域。
  13. 如請求項12之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：5、30或40內列出的該CH3域。
  14. 如請求項13之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：5內列出的該CH3域。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含一CH2域以及該CH2域具有序列辨識編號：53或序列辨識編號：54內列出的序列。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：6、7、11、12、16、17、21、22、26、27、31、32、36、37、41、42、46、47、51或52內列出的序列。
  17. 如請求項16之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：6、7、31、32、41或42內列出的該序列。
  18. 如請求項17之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：6或7內列出的該序列。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗體分子，其包含序列辨識編號86至91內列出的互補性決定區域(CDRs)。
  20. 如請求項19之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號92及93內列出的VH及/或VL域。
  21. 如請求項19或20之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：94至113之任一者內列出的重鏈序列。
  22. 如請求項21之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：94、95、104、105、108或109內列出的該重鏈序列。
  23. 如請求項22之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：94或95內列出的該重鏈序列。
  24. 如請求項19至23中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含序列辨識編號：116內列出的輕鏈序列。
  25. 如請求項1至24中任一項之抗體分子，其中該抗體能同時結合PD-L1及LAG-3。
  26. 如請求項25之抗體分子，其中該PD-L1及LAG-3係存在於二個不同的細胞上。
  27. 如請求項1至26中任一項之抗體分子，其中該抗體分子係結合至一免疫系統調控劑、胞毒型分子、放射性同位素或可偵測的標示。
  28. 如請求項27之抗體分子，其中該免疫系統調控劑或胞毒型分子是一細胞介素(cytokine)。
  29. 一種核酸，其編碼如請求項1至28中任一項之抗體分子。
  30. 一種載體，其包含如請求項29之核酸。
  31. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項29之核酸，或如請求項30之載體。
  32. 一種生產如請求項1至28中任一項之抗體分子的方法，其包含於用於生產該抗體分子的條件下培養如請求項31之重組宿主細胞。
  33. 如請求項32之方法，其進一步包含單離及/或純化該抗體分子。
  34. 一種藥學組成物，其包含如請求項1至28中任一項之抗體分子及一藥學上可接受的賦形劑。
  35. 如請求項1至28中任一項之抗體分子，供用於一治療一病患癌症的方法。
  36. 一種治療一病患癌症的方法，其中該方法包含投與一治療有效量的如請求項1至28中任一項之抗體分子至該病患。
  37. 如請求項35之供用的抗體分子或如請求項36之方法，其中該癌症係選自於下列所構成的群組：何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌(colorectal cancer)、纖維肉瘤、腎細胞癌、黑色素瘤、胰臟癌、乳癌、多形性神經膠質母細胞瘤、肺癌、頭頸部癌症、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮癌、陰門癌、睪丸癌、陰莖癌、白血病、多發性骨髓瘤、鱗狀細胞癌、睪丸癌、食道癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)及中樞神經系統(CNS)淋巴瘤、肝細胞癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、鼻咽癌以及間皮瘤。
  38. 如請求項35至37中任一項之供用的抗體分子或方法，其中該方法進一步包含投與一抗腫瘤疫苗至該病患。
  39. 如請求項35至37中任一項之供用的抗體分子或方法，其中該方法進一步包含投與一化學治療藥物至該病患。
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