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TW201808997A - 新型抗hＣＴＬＡ－4抗體 - Google Patents

新型抗hＣＴＬＡ－4抗體 Download PDF

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TW201808997A
TW201808997A TW106125917A TW106125917A TW201808997A TW 201808997 A TW201808997 A TW 201808997A TW 106125917 A TW106125917 A TW 106125917A TW 106125917 A TW106125917 A TW 106125917A TW 201808997 A TW201808997 A TW 201808997A
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antigen
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antibodies
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TW106125917A
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伊寧那姆 漢斯 凡
伊爾薩斯 安卓 凡
朱思特 克萊茲
大衛 路特傑 休爾西克
保羅 維克
Original Assignee
艾杜諾生物科技控股歐洲公司
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Abstract

本發明係關於結合於與先前技術抗CTLA4抗體不同之抗原決定基的新型抗hCTLA-4抗體，產生此等抗體之方法及此等抗體之治療及診斷用途。此等抗體顯示相似的對CTLA4抗原之親和力且其亦能夠阻斷CTLA4結合於CD80及/或CD86。

Description

新型抗hCTLA-4抗體
本申請案主張2016年8月2日申請之荷蘭專利申請案第2017270號的優先權，該荷蘭專利申請案以引用之方式整體併入本文中，包括所有表格、圖式及申請專利範圍。
本發明係關於藉由刺激免疫反應、尤其藉由刺激抗原特異性T-淋巴細胞改善之病狀的治療。更特定言之，本發明係關於抗人類CTLA-4抗體，以及此等抗體用於治療諸如癌症及傳染病之疾病之用途。
先前技術之以下論述僅為了幫助讀者理解本發明而提供且並未獲得承認描述或構成本發明之先前技術。
T淋巴細胞在抗原之適應性免疫反應中起關鍵作用。原生T細胞需要針對其完全活化之兩種信號(Bretscher 1999,Proc Natl Acad Sci USA 96：185-90)。第一信號為抗原特異性的且藉由T細胞受體(TCR)與抗原呈現細胞(APC)上之MHC/肽複合物之相互作用提供。第二信號為藉由T細胞上之受體與APC上之其配位體之間的相互作用提供之共刺激信號。TCR/MHC及共刺激相互作用之接合導致經由多種細胞內路徑(包括鈣-鈣調磷酸酶及RAS促分裂原活化蛋白激酶)實現之T-細胞活化，及轉錄因子針對多種效應子化合物(包括細胞因子，諸如IL-2)的後續活化。
儘管多種正性及負性共刺激路徑牽涉於T-細胞調節中，最關鍵 在T細胞上之CD28與APC上之B7-1(CD80)及B7-2(CD86)之間。CD28促進T-細胞分化且增強B細胞之抗體產生及T細胞之活化。在諸如樹突狀細胞及B細胞之APC上表現的CD80及CD86具有重疊但不同功能。CD86組成性地表現且與TCR/MHC接合一致地在APC上快速上調。CD80表現在靜止細胞上極低，但典型地在延長之T-細胞刺激之後經誘導。此等差異表明雖然CD86可對於T-細胞活化之初始化至關重要，但CD80可在使免疫反應永久存在方面起更大作用。
在T-細胞活化之後，負性調節受體細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4或CTLA-4，亦稱為CD152)在T細胞上上調(Alegre等人,2001,Nat Rev Immunol 1：220-8)。CTLA-4在結構上與CD28同源，但更緊密地結合於CD80及CD86配位體。CTLA-4以兩種主要方式抑制免疫反應，即其與CD28競爭CD80及CD86配位體且因此阻斷共刺激，及其亦以負性方式傳送信號以抑制T細胞活化(Krummel及Allison,1995,J Exp Med 182：459-465；Walunas等人,1994,Immunity 1：405-413)。進一步已顯示CD86在免疫突觸處接合CD28超過CTLA-4，而CD80接合CTLA-4超過CD28(Collins等人,2002,Immunity 17：201-210；Jansson等人,2005,J Immunol 175：1575-1585)。
據報道，CTLA-4阻斷會增加活體外及活體內T細胞反應，加重抗腫瘤免疫性，且增強經誘導之自體免疫疾病。亦據報道，CTLA-4對T細胞免疫反應之初始特徵具有替代或額外影響。這與以下觀察結果一致，即一些自體免疫患者具有CTLA-4自體抗體。有可能CTLA-4阻斷性自體抗體在此等患者中起病原性作用。此外，針對人類CTLA-4之人類抗體已在多種疾病病狀中經描述為免疫刺激調節劑，諸如治療或預防病毒性及細菌性感染 及用於治療癌症。伊匹單抗為人類抗人類CTLA-4抗體，其阻斷CTLA-4結合於APC上表現之CD80及CD86，從而阻斷藉由此等分子之相互作用引起的免疫反應之負性下調。腫瘤消退在延長時間內進展之跡象已在接受伊匹單抗(10D1)或另一抗CTLA-4抗體替西木單抗(CP-675,206)之黑色素瘤患者中可見，且在黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌及腎細胞癌患者中已用伊匹單抗觀察到持久反應。有趣的是，抗腫瘤反應之特徵可在於短期進展、隨後延遲消退，且抗CTLA-4抗體之重要、可能獨特的臨床特徵在於臨床反應及甚至穩定疾病之持續時間通常或多或少地有所延長。具有晚期黑色素瘤之患者的臨床前及早期臨床研究顯示，伊匹單抗作為單一療法且與諸如化學療法、抗體、疫苗或細胞因子之治療組合促進抗腫瘤活性(Weber,J.,The Oncologist,12(7)：864-872,2007；Scott,A.M.等人,Nature Reviews(Cancer)12：278-287,2012；Hodi,F.S.等人,New Eng.J.Med.363(8)：711-723,2010；Schadendorf,D.等人,J.Clin.Oncol.33(17)：1889-1894,2015；Larkin,J.V.等人,New Eng.J.Med.2015；Ribas,A.等人,J.Clin.Oncol.31(5)：616-622,2013))。
第二種所提出之藉由伊匹單抗靶向CTLA-4之機制在於CTLA-4+調節T細胞(Treg)之耗盡，其已顯示為支持小鼠中CTLA-4靶向之功效的關鍵驅動因素(Peggs等人,J Exp Med,2009,DOI：10.1084/jem.20082492；Simpson等人,J Exp med,2013,DOI：10.1084/jem.20130579；Selby等人Cancer Immunol,2013 DOI：10.1158/2326-6066.CIR-13-0013)。
儘管伊匹單抗已經在市面上用於一些癌症療法且正針對其他抗癌適應症加以測試，且儘管替西木單抗亦在臨床測試階段中存在進展，仍需要替代抗CTLA-4抗體，尤其在其具有可與已知抗CTLA-4抗體之活性區分 之活性的情況下。
在第一態樣中，本發明係關於結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含以下一或多者且視情況包含以下每一者：重鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列，重鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2或與SEQ ID NO：2之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列，重鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列，輕鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4或與SEQ ID NO：4之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列，輕鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5或與SEQ ID NO：5之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列，及輕鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6或與SEQ ID NO：6之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列。
較佳地，該抗體或抗原結合片段包含以下一或多者且較佳地以下每一者：a.重鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1；b.重鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2；c.重鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3； d.輕鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；e.輕鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5；f.輕鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6
較佳地，該抗體具有根據SEQ ID NO：7之重鏈。進一步較佳地，該抗體具有根據SEQ ID NO：8之輕鏈。更佳地，該重鏈選自SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者。更佳地，該輕鏈選自SEQ ID NO：22、24、26、30中任一者。
本發明進一步係關於結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之輕鏈免疫球蛋白、重鏈免疫球蛋白或輕鏈及重鏈免疫球蛋白：a.包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：7之可變重鏈及/或包含胺基酸序列SEQ ID NO：8之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；b.包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20之可變重鏈及/或包含胺基酸序列SEQ ID NO：22、24、26或30之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；c.包含包含與SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之可變重鏈及/或包含與SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；及d.包含包含與SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之可變重鏈及/或包含與SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者至少90%、95%、95%、96%、97%、98%或99%一 致性之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段，其中任何序列變異均發生於該抗體或抗原結合片段之構架區中；e.包含相對於SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代之可變重鏈及/或相對於SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；及f.包含相對於SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代之可變重鏈及/或相對於SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段，其中任何該等取代均發生於該抗體或抗原結合片段之構架區中。
較佳地，該抗體或抗原結合片段具有以下特徵中之至少一者：a)以至少約1×10-9M之KD值結合於人類CTLA-4，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；b)以約100nM或更低之IC50阻斷hCTLA-4結合於hCD80；c)以約100nM或更低之IC50阻斷hCTLA-4結合於hCD86；d)結合於與伊匹單抗或替西木單抗不同之CTLA-4抗原決定基。
本發明進一步包含結合於人類CTLA-4之抗原決定基的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段片段不結合於小鼠-人類嵌合CTLA-4分子SEQ ID NO：44。
本發明之另一態樣為結合於與包含可變重鏈SEQ ID NO：7及可變輕鏈SEQ ID NO：8之抗體相同的人類CTLA-4之抗原決定基之抗體或其抗 原結合片段，其中該抗體或其片段不結合於小鼠-人類嵌合CTLA-4分子SEQ ID NO：44且具有以下特徵中之一者、兩者、三者或全部四者：g.以至少約1×10-9M之KD值結合於人類CTLA-4，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；h.以約100nM或更低之IC50阻斷hCTLA-4結合於hCD80；i.以約100nM或更低之IC50阻斷hCTLA-4結合於hCD86；j.結合於與伊匹單抗或替西木單抗不同之CTLA-4抗原決定基。
本發明之另一態樣為結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合於人類CTLA4中包含SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO：53)之至少8個相鄰殘基的抗原決定基。
根據技術方案34之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定基由SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO：53)組成。
一種結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其中人類CTLA-4中在序列SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO：53)內之一或多種突變防止該抗體結合於人類CTLA4。
一種與抗體hCTLA4.27A競爭結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段。
較佳地，本發明之抗體或抗原結合片段為包含兩條重鏈及兩條輕鏈之人類化抗體。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1-8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或30中任一者。
在另一態樣中，本發明係有關一種經分離核酸，其編碼：本發 明之抗體或抗原結合片段中任一者，或如上文所定義之多肽中任一者。本發明亦涵蓋包含該經分離核酸之表現載體。
本發明亦包含一種宿主細胞，其包含本發明之抗體、結合片段、多肽、聚核苷酸或表現載體。該宿主細胞較佳地為畢赤酵母細胞或中國倉鼠卵巢細胞。
在本發明之一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段與一或多種環狀二核苷酸或其他STING路徑促效劑聯合使用。干擾素基因刺激劑(STING，亦稱作TMEM173、MITA、ERIS及MPYS)為局限於ER之跨膜蛋白，其回應於環狀二核苷酸(CDN)之直接結合而經歷構形改變，導致涉及TBK1活化、IRF-3磷酸化及IFN-β及其他細胞因子產生之下游信號傳導級聯。腫瘤相關宿主抗原呈現細胞中之STING路徑牽涉於針對腫瘤源性抗原之自發CD8+ T細胞反應的誘導中。此路徑之活化及IFN-β之後續產生據報道亦有助於輻射之抗腫瘤功效。STING促效劑及其用途描述於例如US20060040887、US20080286296、US20120041057、US20140205653、WO2014179335、WO 2014179760、US20150056224、WO 2016096174、WO 2017011444、WO 2017027645及WO 2017027646中，其中該化合物呈包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物形式投與。Sting促效劑可藉由一或多種非-非經腸或非經腸途徑投與。在一些實施例中，該投與為皮下、肌肉內、皮內、黏膜、陰道、子宮頸、腫瘤周圍、腫瘤內或直接投與至腫瘤引流淋巴結中。在某些實施例中，STING促效劑及本發明之抗體或抗原結合片段呈獨立投與形式投與，例如在不同時間處及/或藉由不同投與途徑。
本發明之另一實施例藉由包含本發明之抗體或抗原結合片段及 醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或穩定劑的組合物形成。較佳地，該組合物進一步包含選自由以下組成之群之試劑： k.抗PD1抗體或其抗原結合片段； l.抗LAG3抗體或其抗原結合片段； m.抗TIGIT抗體或其抗原結合片段； n.抗VISTA抗體或其抗原結合片段； o.抗BTLA抗體或其抗原結合片段； p.抗TIM3抗體或其抗原結合片段； q.抗CD27抗體或其抗原結合片段； r.抗HVEM抗體或其抗原結合片段； s.抗CD70抗體或其抗原結合片段； t.抗CD137抗體或其抗原結合片段； u.抗OX40抗體或其抗原結合片段； v.抗CD28抗體或其抗原結合片段； w.抗PDL1抗體或其抗原結合片段； x.抗PDL2抗體或其抗原結合片段；y.抗GITR抗體或其抗原結合片段； z.抗ICOS抗體或其抗原結合片段； aa.抗SIRPα抗體或其抗原結合片段； bb.抗ILT2抗體或其抗原結合片段； cc.抗ILT3抗體或其抗原結合片段； dd.抗ILT4抗體或其抗原結合片段； ee.抗ILT5抗體或其抗原結合片段； ff.抗4-1BB抗體或其抗原結合片段； gg.抗NK2GA抗體或其抗原結合片段； hh .抗NK2GC抗體或其抗原結合片段； ii.抗NK2GE抗體或其抗原結合片段； jj.抗TSLP抗體或其抗原結合片段， kk.STING促效劑，及； ll.抗IL10抗體或其抗原結合片段。
亦較佳地，在該組合物中，抗PD1抗體或其抗原結合片段選自由以下組成之群：派姆單抗或其抗原結合片段及納武單抗或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明組合物進一步包含選自以下群之化合物：ADU-S100、美法侖、長春新鹼、氟達拉濱、苯丁酸氮芥、苯達莫司汀、依託泊苷、阿黴素、環磷醯胺、順鉑、免疫調節劑(諸如皮質類固醇，例如地塞米松或普賴蘇穠)、沙利度胺類似物(例如沙利度胺、來那度胺或泊馬度胺)、激酶抑制劑(例如依魯替尼、艾代拉里斯)、靶向CD20之抗體(例如利妥昔單抗、奧法木單抗或奧比妥珠單抗)、靶向CD52之抗體(例如阿侖珠單抗)、靶向CD38之抗體(例如達雷木單抗)、靶向IL-6或IL-6受體之抗體(例如薩利魯單抗或托珠單抗)、靶向CS-1之抗體(例如埃羅妥珠單抗)、靶向BCMA之抗體(例如GSK2857916)、靶向BAFF或BLyss之抗體(例如塔巴魯單抗)、雙膦酸鹽(例如帕米膦酸鹽或唑來膦酸)、硼替佐米或其組合。
本發明亦關於一種產生抗體或抗原結合片段之方法，其包含： mm.在有利於編碼任何本發明抗體或抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈的聚核苷酸之表現的條件下培養包含該聚核苷酸之宿主細胞；及nn.視情況，自宿主細胞及/或培養基回收該抗體或抗原結合片段。
在某些實施例中，宿主細胞包含包含該聚核苷酸之表現載體，其中該表現載體包含可操作地連接至該聚核苷酸之控制序列，該等控制序列驅動該抗體或抗原結合片段的表現。在較佳實施例中，該聚核苷酸包含分泌信號序列，該序列介導由宿主細胞分泌該抗體或抗原結合片段。
本發明之另一態樣為一種治療個體、較佳地人類個體中之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之本發明抗體或抗原結合片段，或介導該個體內該抗體或抗原結合片段之表現的表現載體，視情況連同另一治療劑或治療程序。
本發明之另一部分為一種治療人類個體中之感染或傳染病的方法，其包含向該個體投與有效量之根據本發明之抗體或抗原結合片段，視情況連同另一治療劑或治療程序。
本發明進一步包含一種疫苗，其包含根據本發明之抗體或抗原結合片段及抗原。
在另一態樣中，本發明包含一種用於偵測樣品中CTLA-4肽或其片段之存在的方法，其包含使該樣品與本發明抗體或片段接觸及偵測該抗體或片段與該肽之間複合物的存在；其中該複合物之偵測指示了該CTLA-4肽之存在。
本發明亦關於一種增加免疫細胞之活性的方法，其包含向有需要之個體投與有效量之根據本發明之抗體或抗原結合片段，或介導該個體 內該抗體或抗原結合片段之表現的表現載體。較佳地，該方法用於：oo.癌症之治療；pp.感染或傳染病之治療；或qq.用作疫苗佐劑。
在另一態樣中，本發明係有關根據本發明之抗體或抗原結合片段，或介導該個體內該抗體或抗原結合片段之表現的表現載體，其用於製備藥劑以：rr.增加免疫細胞活化；ss.治療癌症；或tt.治療感染或傳染病。
在下一態樣中，本發明包含本發明抗體或抗原結合片段用於製造用於治療癌症之藥劑的用途以供：增加免疫細胞活化；治療癌症；或治療感染或傳染病。
本發明亦包含本發明抗體或其抗原結合片段，其中該片段為Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv片段(scFV)。
在下一態樣中，本發明抗體或其抗原結合片段包含選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，較佳地IgG1或IgG4之重鏈恆定區，及選自輕鏈恆定區κ或λ之輕鏈恆定區。在其中該抗體或其抗原結合片段包含人類IgG4重鏈恆定區之實施例中，該IgG4序列較佳地在位置228處具有Ser→Pro突變，如SEQ ID NO：50中所描繪。
本發明亦有關一種刺激個體中之免疫反應的方法，其包含向有需要之個體投與有效刺激該免疫反應之量的本發明抗體或其抗原結合片 段。較佳地，在該方法中，抗體分子與一或多種共刺激分子之促效劑組合投與，例如選自由OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配位體組成之群之一或多種分子。或者，抗體分子與免疫檢查點分子之一或多種抑制劑組合投與，例如選自由PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR組成之群之一或多種抑制劑
在另一實施例中，本發明包含一種治療癌症之方法，其中該癌症選自由肺癌、黑色素瘤、腎癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、胰臟癌、甲狀腺癌、血液科癌症、淋巴瘤、骨髓瘤或白血病或癌症之轉移病變組成之群。
另外，關於治療癌症之方法，本發明亦有關如下方法，其中抗體分子與一或多種第二治療劑或程序組合投與，例如其中該第二治療劑或程序選自由化學療法、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞因子、手術程序、輻射程序、共刺激分子之活化劑、抑制分子之抑制劑、疫苗或細胞免疫療法組成之群。
圖1：基於Jurkat之報告基因分析中hCTLA4.27A抗體之功能性。
圖2：hCTLA4.27抗體之差示hCD80阻斷型態。
圖3：PBMC SEB分析中hCTLA4.27抗體對IL2產生之誘導。
圖4A：hCTLA4.27及對照抗體：ADCC分析中之效應子功能。
圖4B：hCTLA4.27及對照抗體：CDC分析中之效應子功能。
圖5：hCTLA4.27A嵌合hIgG4與人類/小鼠CTLA-4交換突變體之獨特結合型態。
圖6描繪結合於rhCTLA-4/Fc之hCTLA4.27A的抗原決定基定位結果。藉由不同蛋白水解方法偵測之交聯肽為SEQ ID NO：54-57。示出hCTLA-4殘基46-76(SEQ ID NO：58)用於參考。
在本發明之實施方式及實例中，將使用以下縮寫：
ADCC抗體依賴性細胞毒性
CDC補體依賴性細胞毒性
CDR免疫球蛋白可變區中之互補決定區，使用Kabat編號系統定義
CHO中國倉鼠卵巢
EC50導致總結合之50%的濃度
ELISA酶聯免疫吸附劑分析
FR抗體構架區：不包括CDR區之免疫球蛋白可變區。
HRP辣根過氧化酶
IFN干擾素
IC50導致50%抑制總信號之濃度
IgG免疫球蛋白G
Kabat由Elvin A.Kabat開創之免疫球蛋白比對及編號系統((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)
mAb或Mab或MAb單株抗體
SEB葡萄球菌腸毒素B
TT破傷風類毒素
V區IgG鏈中在不同抗體之間序列可變之區段。其延伸至輕鏈中之Kabat殘基109及重鏈中之Kabat殘基113。
VH免疫球蛋白重鏈可變區
VL免疫球蛋白輕鏈可變區
VK免疫球蛋白κ輕鏈可變區
以下為本說明書中提及之序列的清單(表1)：
「治療(Treat)」或「治療(treating)」意謂在內部或在外部向具有一或多種疾病症狀或疑似具有疾病之個體或患者投與治療劑，諸如含有任何本發明抗體或抗原結合片段之組合物，該劑對該一或多種疾病症狀或該疾病具有治療活性。典型地，該劑以有效減輕所治療個體或群體中之一或多種疾病症狀的量投與，誘導該(等)症狀之衰退或抑制該(等)症狀之進展達任何臨床上可量測之程度。有效減輕任何特定疾病症狀之治療劑的量可根據諸如疾病狀態、患者年齡及重量、及該藥物在個體中引起所需反應之能力之因素變化。疾病症狀是否已減輕可藉由典型地由醫師或其他熟練保健提供者使用之任何臨床量測來分析以分析彼症狀之嚴重程度或進展狀態。
本發明包括抗CTLA-4抗體及其使用方法。如本文所用，術語「抗體」係指展現所需生物活性之任何抗體形式。因此，其以最廣泛含義使用且特定地涵蓋但不限於單株抗體(包括包含兩條輕鏈及兩條重鏈之全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類化抗體、全人類抗體、嵌合抗體及駱駝化單域抗體。
本發明包括抗CTLA-4抗原結合片段及其使用方法。如本文所 用，除非另外指示，否則「抗體片段」或「抗原結合片段」係指抗體之抗原結合片段，亦即，保持特異性結合於由全長抗體結合之抗原的能力之抗體片段，例如保持一或多個CDR區之片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；奈米抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
本發明包括抗CTLA-4 Fab片段及其使用方法。「Fab片段」包含一條輕鏈，及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈無法與另一重鏈分子形成二硫鍵。「Fab片段」可為抗體之木瓜蛋白酶裂解產物。
本發明包括抗CTLA-4抗體及其包含Fc區之抗原結合片段及其使用方法。「Fc」區含有兩個重鏈片段，其包含抗體之CH2及CH3域。該兩個重鏈片段藉由兩個或兩個以上二硫鍵且藉由CH3域之疏水性相互作用保持在一起。
本發明包括抗CTLA-4 Fab’片段及其使用方法。「Fab'片段」含有一條輕鏈，及一條重鏈中含有VH域及CH1域以及在CH1與CH2域之間的區之部分或片段，以致可在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
本發明包括抗CTLA-4 F(ab’)2片段及其使用方法。「F(ab')2片段」含有兩條輕鏈及兩條含有恆定區中在CH1與CH2域之間的部分之重鏈，以致在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。F(ab')2片段因此由兩個Fab'片段構成，該等Fab'片段藉由兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起。「F(ab')2片段」可為抗體之胃蛋白酶裂解產物。
本發明包括抗CTLA-4 Fv片段及其使用方法。「Fv區」包含來 自重鏈及輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。
本發明包括抗CTLA-4 scFv片段及其使用方法。術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包含抗體之VH及VL域之抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步包含在VH與VL域之間之多肽連接子，其使得scFv能夠形成抗原結合所需之結構。關於scFv之回顧，參見Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES,第113卷,Rosenburg及Moore編Springer-Verlag,New York,第269-315頁。亦參見國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946, 778號及第5,260,203號。
本發明包括抗CTLA-4域抗體及其使用方法。「域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區用肽連接子共價接合以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本發明包括抗CTLA-4二價抗體及其使用方法。「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，該兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性的(參見下文)。
本發明包括抗CTLA-4駱駝化單域抗體及其使用方法。在某些實施例中，本文中之抗體亦包括駱駝化單域抗體。參見例如Muyldermans等人(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等人(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO 94/04678；WO 94/25591；美國專利第6,005,079號)。
在一實施例中，本發明提供單域抗體，其包含兩個具有修飾之VH域以致形成單域抗體。
本發明包括抗CTLA-4雙功能抗體及其使用方法。如本文所用，術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段在同一多肽鏈(VH-VL或VL-VH)中包含連接至輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。藉由使用過短而不允許同一鏈上的兩個域之間配對之連接子，迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中。關於經工程改造之抗體變異體的回顧，一般參見Holliger及Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。
典型地，當結合活性以莫耳表述時，以某種方式經修飾之本發明抗體或抗原結合片段保持其結合活性之至少10%(當與親本抗體相比時)。較佳地，本發明抗體或抗原結合片段保持親本抗體之至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高的CTLA-4結合親和力。其亦意謂本發明抗體或抗原結合片段可包括不會實質上改變其生物活性之保守或非保守胺基酸取代(稱作該抗體之「保守變異體」或「功能保守變異體」)。
本發明包括經分離抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段及其使用方法。「經分離」抗體或其抗原結合片段至少部分地不含來自產生該等抗體或其抗原結合片段之細胞或細胞培養物的其他生物分子。該等生物分子包括核酸、蛋白、脂質、碳水化合物，或其他材料，諸如細胞碎片及生長培養基。經分離抗體或抗原結合片段可進一步至少部分地不含表現系統組分，諸如來自宿主細胞或其生長培養基之生物分子。一般而言，術語「經分離」不意欲指完全不存在該等生物分子或不存在水、緩衝液或鹽或包括該等抗體或片段之醫藥調配物之組分。
本發明包括抗CTLA-4嵌合抗體(例如，人類恆定域/小鼠可變域)及其使用方法。如本文所用，「嵌合抗體」為具有來自第一抗體之可變域及來自第二抗體之恆定域的抗體，其中第一及第二抗體來自不同物種。(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。典型地，可變域獲自來自實驗動物之抗體(「親本抗體」)，該實驗動物諸如齧齒動物，且恆定域序列獲自人類抗體，使得所得嵌合抗體在人類個體中相比親本(例如小鼠)抗體將不太可能引起不利的免疫反應。
本發明包括抗CTLA-4人類化抗體及其抗原結合片段(例如，已人類化之大鼠或小鼠抗體)及其使用方法。本發明包括如實例中所示之hCTLA4.27A抗體的任何人類化形式。如本文所用，「27抗體」及「hCTLA4.27」可互換使用以指包含SEQ ID NO：7之VH區及SEQ ID NO：8之VL區，更佳地SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者之VH區及SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者之VL區的抗體。如本文所用，術語「人類化抗體」係指含有來自人類及非人類(例如小鼠或大鼠)抗體之序列的抗體形式。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變域中之實質上全部，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等且全部或實質上全部構架(FR)區為人類免疫球蛋白序列之彼等。人類化抗體可視情況包含人類免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分。
一般而言，基礎抗體結構單元包含四聚體。各四聚體包括兩個相同之多肽鏈對，各對具有一條「輕」(約25kDa)鏈及一條「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端部分包括約100至110個或更多個胺基酸之可變區，其主要負責抗原識別。重鏈之羧基端部分可定義主要負責效應子功能之恆定 區。典型地，人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。此外，人類重鏈典型地分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區藉由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10個或更多個胺基酸之「D」區。一般參見Fundamental Immunology第7章(Paul,W.編,第2版Raven Press,N.Y.(1989)。
各輕/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中，該兩個結合位點一般相同。
典型地，重鏈及輕鏈之可變域包含三個位於相對保守構架區(FR)內之高變區，該等高變區亦稱作互補決定區(CDR)。該等CDR通常藉由構架區對準，使得能夠結合於特異性抗原決定基。一般而言，自N端至C端，輕鏈及重鏈可變域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸指派給各域一般係根據Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公開案第91-3242號(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人,(1989)Nature 342：878-883之定義。
如本文所用，術語「高變區」係指抗體或其抗原結合片段中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(亦即，輕鏈可變域中之LCDR1、LCDR2及LCDR3及重鏈可變域中之HCDR1、HCDR2及HCDR3)。參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(藉由序列定義抗體之CDR區)；亦參見Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917(藉由結構定義抗體之CDR區)。如本文所用，術語「構架」或「FR」殘基係指除本文中定義為CDR殘基之高變區殘基外的彼等可變域殘基。
「經分離核酸分子」或「經分離聚核苷酸」意謂基因組、mRNA、cDNA或合成起源之DNA或RNA或其某一組合，其不與其中在自然界發現該經分離聚核苷酸之聚核苷酸的全部或一部分締合，或連接至在自然界未與其連接之聚核苷酸。出於本發明目的，應理解「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整染色體。「包含」規定核酸序列之經分離核酸分子除該等規定序列外亦可包括針對多達十種或甚至多達二十種或更多種其他蛋白或部分或其片段之編碼序列，或可包括可操作性連接之調節序列，該等調節序列控制所陳述核酸序列之編碼區的表現，及/或可包括載體序列。
措辭「控制序列」係指在特定宿主生物體中可操作性連接之編碼序列之表現所必需的DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱子序列、及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺苷酸化信號、及增強子。
當核酸或聚核苷酸置於與另一核酸序列之功能性關係中時，其「經可操作性連接」。例如，若用於前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽之分泌的前蛋白，則其可操作性連接至用於多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其可操作性連接至該序列；或若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯，則其可操作性連接至編碼序列。一般而言但並非始終，「可操作性連接」意謂所連接之DNA序列為鄰近的，且在 分泌前導序列之情況下為鄰近的且在閱讀框中。然而，增強子不必為鄰近的。連接藉由在便利限制位點處之接合實現。若該等位點不存在，則根據習知規範使用合成寡核苷酸接頭或連接子。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有該等名稱均包括後代。因此，措辭「轉型體」及「經轉型細胞」包括原代個體細胞及源於其之培養物，而與轉移次數無關。亦瞭解，由於有意或無意突變，並非所有後代均將具有精確一致DNA含量。包括如關於初始經轉型細胞中所篩選具有相同功能或生物活性之突變型後代。在意指不同名稱之情況下，其將自上下文清楚。
如本文所用，「生殖系序列」係指未重排免疫球蛋白DNA序列之序列。可使用任何合適來源之未重排免疫球蛋白序列。人類生殖系序列可在美國國家衛生研究院(United States National Institutes of Health)國立關節炎及肌肉骨骼及皮膚病研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)之網站上例如自JOINSOLVER生殖系資料庫獲得。小鼠生殖系序列可例如如Giudicelli等人(2005)Nucleic Acids Res.33：D256-D261中所述獲得。
本發明抗體可包含如本申請案中所定義且以SEQ ID NO：7及8提供之重鏈及輕鏈及更佳地如以SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20提供之重鏈及如以SEQ ID NO：22、24、26及30提供之輕鏈的任何組合。
此意謂可製成以下組合：具有重鏈SEQ ID NO：10及輕鏈SEQ ID NO：22之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：12及輕鏈SEQ ID NO：22之抗體； 具有重鏈SEQ ID NO：14及輕鏈SEQ ID NO：22之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：16及輕鏈SEQ ID NO：22之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：18及輕鏈SEQ ID NO：22之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：20及輕鏈SEQ ID NO：22之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：10及輕鏈SEQ ID NO：24之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：12及輕鏈SEQ ID NO：24之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：14及輕鏈SEQ ID NO：24之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：16及輕鏈SEQ ID NO：24之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：18及輕鏈SEQ ID NO：24之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：20及輕鏈SEQ ID NO：24之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：10及輕鏈SEQ ID NO：26之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：12及輕鏈SEQ ID NO：26之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：14及輕鏈SEQ ID NO：26之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：16及輕鏈SEQ ID NO：26之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：18及輕鏈SEQ ID NO：26之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：20及輕鏈SEQ ID NO：26之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：10及輕鏈SEQ ID NO：30之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：12及輕鏈SEQ ID NO：30之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：14及輕鏈SEQ ID NO：30之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：16及輕鏈SEQ ID NO：30之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：18及輕鏈SEQ ID NO：30之抗體；具有重鏈SEQ ID NO：20及輕鏈SEQ ID NO：30之抗體。
例示性抗CTLA-4抗體之物理及功能特性
本發明提供具有規定結構及功能特徵之抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段，及該等抗體或其抗原結合片段在疾病(例如癌症或傳染病)之治療或預防中的使用方法。其均源於如實例中所述已發現之小鼠抗體，該抗體具有重鏈SEQ ID NO：32及輕鏈SEQ ID NO：34(編碼此等鏈之核苷酸序列分別為SEQ ID NO：31及33)。
表徵此抗體及源於其之人類化抗體，因為其以小於20nM、較佳地小於1nM之EC50結合於人類CTLA-4(hCTLA-4)且其能夠以針對hCD80阻斷小於100nM、較佳地小於10nM且針對hCD86阻斷較佳地小於10nM、更佳地小於2.5nM之IC50阻斷hCTLA-4結合於hCD80或hCD86。應注意，本發明抗體之hCD80阻斷型態位於10D1(伊匹單抗)與CP-675,206(替西木單抗)之hCD80阻斷型態之間(參見圖2)。其不同於伊匹單抗及替西木單抗，因為其結合於CTLA-4分子上之不同抗原決定基。一種差異在於本發明抗體或抗原結合片段不結合於以SEQ ID NO：44提供序列之嵌合小鼠-人類CTLA4分子(亦參見圖5)，而10D1及CP-675,206結合
有數種方法可用於精細定位靶標抗原上之抗體抗原決定基，包括：H/D-Ex質譜分析、X射線結晶學、肽陣列及定點突變誘發。例如，氫氘交換(HDX；Hydrogen Deuterium Exchange)聯合蛋白水解及質譜分析可用於測定抗體中針對特異性抗原Y之抗原決定基。HDX-MS依賴於當以D2O單獨培育且抗原之抗體以多種時間間隔存在時抗原之氘併入程度的精確量測及比較。氘與蛋白之醯胺骨架上在暴露之區域中的氫交換，而抗原中結合於抗體之區將受到保護且在藉由蛋白水解片段之LC-MS/MS分析之後將顯示 較少或無交換。
本發明亦包含結合於人類CTLA-4之抗原決定基但不結合於小鼠-人類嵌合CTLA-4分子SEQ ID NO：44之抗CTLA-4抗體。
在其他實施例中，本發明提供結合人類CTLA-4(例如人類化抗體)且具有與胺基酸序列SEQ ID NO：7-30具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，較佳地與SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26或30具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VL域及VH域的抗體或其抗原結合片段；其中該變異體展現所需結合及特性，即結合於CTLA-4之能力及阻斷CTLA-4結合於CD80及/或CD86之能力。在其他實施例中，本發明提供結合人類CTLA-4(例如人類化抗體)且具有與胺基酸序列SEQ ID NO：7-30具有至少95%序列一致性，較佳地與SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26或30具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VL域及VH域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類CTLA-4(例如人類化抗體)且具有與胺基酸序列SEQ ID NO：7-30具有至少97%序列一致性，較佳地與SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26或30具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VL域及VH域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類CTLA-4(例如人類化抗體)且具有與胺基酸序列SEQ ID NO：7-30具有至少99%序列一致性，較佳地與SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26或30具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VL域及VH域的抗體或其抗原結合片段。
「經保守修飾之變異體」或「保守取代」係指用具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、骨架構形及剛性等)之其他胺基酸取代蛋白中之胺基酸，以致可頻繁地進行改變而不改變蛋白之生物活性。熟習此項技術者認識到一般而言，多肽之非必需區中的單一胺基酸取代不會實質上改變生物活性(參見例如Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁(第4版))。另外，結構上或功能上類似之胺基酸的取代不太可能破壞生物活性。例示性保守取代陳述於表2中。
本發明亦涵蓋本發明抗體之功能保守變異體。如本文所用，「功能保守變異體」係指其中一或多種胺基酸殘基已發生改變而未改變諸如抗體親和力及/或特異性之所需特性的抗體或片段。該等變異體包括但不限於 胺基酸用具有類似特性之胺基酸置換，諸如表2之保守胺基酸取代。亦提供包含本發明抗CTLA-4抗體之VL域的經分離多肽(例如SEQ ID NO：22、24、26、30)，及包含本發明抗CTLA-4抗體之VH域的經分離多肽(例如SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20)，該等域具有多達0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種胺基酸取代。
在另一實施例中，提供結合人類CTLA-4且具有與本文所述之VL域或VH域中一或多者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%或75%序列一致性之VL域及VH域，且展現特異性結合於CTLA-4的抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明之結合抗體或其抗原結合片段包含具有多達0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25種或更多種胺基酸取代之VL及VH域(具有及不具有信號序列)，且展現特異性結合於CTLA-4。
聚核苷酸及多肽
本發明進一步包含編碼本發明抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段之多肽或免疫球蛋白鏈中任一者之聚核苷酸。例如，本發明包括編碼SEQ ID NO：1-30中任一者所述之胺基酸的聚核苷酸。
在一實施例中，提供編碼本文所陳述之經分離抗體或抗原結合片段之多肽鏈的經分離聚核苷酸，例如DNA。在一實施例中，該經分離聚核苷酸編碼包含至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白輕鏈可變(VL)域及/或至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白重鏈可變(VH)域的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該經分離聚核苷酸編碼單一聚核苷酸分子上之輕鏈及重鏈，且在其他實施例中編碼獨立聚核苷酸分子上之輕鏈及重 鏈。在另一實施例中，該等聚核苷酸進一步編碼信號序列。
在一實施例中，本發明包含編碼包含HCDR-1(SEQ ID NO：1)、HCDR-2(SEQ ID NO：2)及HCDR-3(SEQ ID NO：3)之抗體重鏈可變(VH)域或其抗原結合片段之經分離聚核苷酸。
在一實施例中，本發明包含編碼包含LCDR-1(SEQ ID NO：4)、LCDR-2(SEQ ID NO：5)及LCDR-3(SEQ ID NO：6)之抗體輕鏈可變(VL)域或其抗原結合片段之經分離聚核苷酸。
在一實施例中，本發明包含編碼免疫球蛋白重鏈可變(VH)域SEQ ID NO：7之經分離聚核苷酸。
在一實施例中，本發明包含編碼免疫球蛋白輕鏈可變(VL)域SEQ ID NO：8之經分離聚核苷酸。
在一實施例中，本發明包含編碼人類化重鏈之根據SEQ ID NO：9、11、13、15、17或19中任一者之經分離聚核苷酸。
在一實施例中，本發明包含編碼人類化輕鏈之根據SEQ ID NO：21、23、25或29中任一者之經分離聚核苷酸。
在本發明之另一實施例中包含經分離聚核苷酸，其包含編碼人類化重鏈之根據SEQ ID NO：9、11、13、15、17或19中任一者之經分離聚核苷酸及編碼人類化輕鏈之根據SEQ ID NO：21、23、25或29中任一者之經分離聚核苷酸。包括其所有可能組合。相應地，本發明包含包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：21之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：21之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：21之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：21之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：21之聚核 苷酸、包含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：21之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：23之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：23之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：23之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：23之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：23之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：23之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：25之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：25之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：25之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：25之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：25之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：25之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：29之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：29之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：29之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：29之聚核苷酸、包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：29之聚核苷酸及/或包含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：29之聚核苷酸。
本發明亦提供包含本發明之經分離聚核苷酸之載體，例如表現載體，諸如質體，其中該聚核苷酸可操作性連接至控制序列，當宿主細胞用該載體轉染時，該宿主細胞識別控制序列。亦提供包含本發明載體之宿主細胞及用於產生本文所揭示之抗體或其抗原結合片段或多肽之方法，該等方法包含在培養基中培養具有表現載體或編碼該抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白鏈的核酸之宿主細胞，及自宿主細胞或培養基分離該抗原或其抗原結合片段。
本發明亦包括包含當藉由BLAST算法執行比較時與本文所提供之抗體的胺基酸序列至少約75%一致、約80%一致、更佳地至少約90%一致 且最佳地至少約95%一致(例如95%、96%、97%、98%、99%、100%)之胺基酸序列的多肽，例如免疫球蛋白多肽，其中該算法之參數經選擇以給出各別序列之間在各別參考序列之完整長度內之最大匹配(例如，期望閾值：10；字長：3；在查詢範圍內之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；間隙成本：存在11，延伸1；條件合成評分矩陣調節)。
序列一致性係指當兩種多肽之胺基酸經最佳比對時，該兩個序列在相等位置處相同之程度。
以下參考文獻係關於通常用於序列分析之BLAST算法：BLAST算法：Altschul等人(2005)FEBS J.272(20)：5101-5109；Altschul,S.F.等人,(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.等人,(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人,(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人,(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.等人,(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton,J.C.等人,(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；比對評分系統：Dayhoff,M.O.等人,「A model of evolutionary change in proteins.」Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷,增刊3.M.O.Dayhoff(編),第345-352頁,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人,「Matrices for detecting distant relationships.」Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷,增刊3."M.O.Dayhoff(編),第353-358頁,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States,D.J.等人,(1991)Methods3：66-70；Henikoff,S.等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；Altschul,S.F.等人,(1993)J. Mol.Evol.36：290-300；比對統計學：Karlin,S.等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin,S.等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877；Dembo,A.等人,(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；及Altschul,S.F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.」Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai編),(1997)第1-14頁,Plenum,New York。
結合親和力
舉例而言且非限制，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定至少約1×10-9M之KD值(亦即，1×10-9M或更低之KD值)結合包含以下胺基酸序列之人類CTLA-4(NCBI寄存號NM_005214.4)：(SEQ ID NO：36)：
免疫細胞活化
在一些實施例中，本發明抗體或抗原結合片段增加免疫細胞之活性。免疫細胞之活性的增加可使用此項技術中已知之任何方法偵測。在一實施例中，免疫細胞之活性的增加可藉由量測免疫細胞之增殖來偵測。例如，T細胞之活性的增加可藉由量測T細胞增殖或信號轉導事件，諸如向轉錄調節因子傳送信號之免疫受體或下游激酶的酪胺酸磷酸化來偵測。在 其他實施例中，免疫細胞之活性的增加可藉由量測對特異性靶標細胞之CTL或NK細胞細胞毒性功能或IFNγ細胞因子反應來偵測，該等反應與抗腫瘤免疫性之刺激有關。在其他實施例中，免疫細胞之活性的增加可藉由量測源於個體之樣品中的離體T細胞活化來偵測。在一實施例中，T細胞活性之增加如下測定：(i)量測葡萄球菌腸毒素B(SEB)誘導之一或多種選自由以下組成之群之促發炎細胞因子的產生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13，或來自由以下組成之群之膜活化標記物的上調：CD25及CD69，或使用藉由流式細胞術或3H-併入偵測胚細胞形成之增殖之誘導，或(ii)量測T細胞受體(TCR)信號傳導之混合淋巴細胞反應或直接抗CD3 mAb刺激，該信號傳導用以誘導選自由以下組成之群之細胞因子的產生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13，或來自由以下組成之群之膜活化標記物的上調：CD25及CD69，或使用藉由流式細胞術或3H-併入偵測胚細胞形成之增殖之誘導。在某些實施例中，當本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段經提供至表現CD80及CD86之Raji細胞時，其將刺激CD3+ T細胞，以產生選自由以下組成之群之促發炎細胞因子：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13，或來自由以下組成之群之膜活化標記物的上調：CD25及CD69，或使用藉由流式細胞術或3H-併入偵測胚細胞形成之增殖之誘導。在某些實施例中，本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段將刺激由活化之T細胞產生IL-2及/或IFNγ達至少1.5倍。如自實驗部分清楚，本發明抗體之T細胞活化特徵約等於已知之先前技術抗hCTLA4抗體伊匹單抗及替西木單抗之T細胞刺激特徵。
抗hCTLA-4抗體之效應子功能
在一些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或抗原結合片段可耗盡CTLA-4+調節T細胞。該等抗體發揮該效應子功能之能力可使用此項技術中已知之任何方法測定。在一實施例中，該等抗體誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性的能力使用作為效應子細胞之天然殺手細胞及穩定地表現人類CTLA-4之細胞株來測定。如實驗部分中所示，具有人類IgG1 Fc部分之hCTLA-4抗體能夠對CTLA-4+細胞誘導ADCC。
在另一實施例中，該等抗體誘導補體依賴性細胞毒性之能力使用人類補體及穩定地表現人類CTLA-4之細胞株來測定。如實驗部分中所示，具有人類IgG1 Fc部分之hCTLA-4抗體能夠對CTLA-4+細胞誘導CDC。
在另一實施例中，該等抗體誘導細胞介導之溶解的能力可使用非經典CD14+CD16++單核細胞來測定，該等單核細胞在諸如伊匹單抗之hIgG1 CTLA-4抗體的背景下誘導CTLA-4+ Treg之FcγRIIIA依賴性溶解(Romano等人；PNAS；2015；6140-6145；doi：10.1073/pnas.1417320112)
抗hCTLA-4抗體阻斷結合於hCD80及hCD86之能力
在一些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或抗原結合片段能夠阻斷人類CTLA-4結合於人類CD80及/或人類CD86。阻斷人類CTLA-4結合於人類CD80及/或人類CD86之能力可使用此項技術中已知之任何方法測定。在一實施例中，該等抗體阻斷人類CTLA-4結合於人類CD80及/或人類CD86之能力使用ELISA分析來測定。
如實驗部分中所示，阻斷CTLA-4結合於人類CD80及/或人類CD86之效能類似已知之抗CTLA-4抗體伊匹單抗及替西木單抗之活性。應強 調本發明之抗CTLA-4抗體關於hCD80之阻斷顯示在伊匹單抗與替西木單抗之效應之間的中間功效(參見圖2)。
製造抗體及其抗原結合片段之方法
因此，本發明包括用於製造本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段之方法，該等方法包含在有利於該抗體或片段之表現的條件下培養表現該抗體或片段之融合瘤細胞及視情況，自融合瘤及/或生長培養基(例如細胞培養基)分離該抗體或片段。
源於除大鼠及小鼠外之動物的單株抗體提供獨特優勢。多種與信號轉導及疾病有關之蛋白靶標在小鼠、大鼠與人類之間高度保守，且因此可由小鼠或大鼠宿主視為自體抗原，從而使其不太具免疫原性。當使用兔作為宿主動物時，可避免此問題。參見例如Rossi等人,Am.J.Clin.Pathol.,124,295-302,2005。
使用融合瘤技術產生及篩選特異性抗體之方法為常規的及此項技術中熟知的。在一非限制性實例中，小鼠可用所關注之抗原或表現該抗原之細胞免疫。一旦偵測到免疫反應，例如在小鼠血清中偵測到對抗原具特異性之抗體，即收集小鼠脾且分離脾細胞。培養B細胞，如由Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19：125-134所述。
來自反應性上清液之B細胞純系接著例如根據公開程序(Steenbakkers等人,1992,J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19：125-34)藉由微型電融合永生化。選擇融合瘤且藉由限制性稀釋進行選殖。
該等融合瘤純系接著藉由此項技術中已知之方法針對分泌能夠 結合抗原之抗體的細胞進行分析。一般含有高含量之抗體的腹水液可藉由用陽性融合瘤純系腹膜內接種小鼠而產生。
可用於抗體產生方法之佐劑包括但不限於蛋白佐劑；細菌佐劑，例如全細菌(BCG、短小棒狀桿菌、明尼蘇達沙門氏菌)及細菌組分，包括細胞壁骨架、海藻糖二黴菌酸酯、單磷醯脂質A、結核桿菌之甲醇可萃取殘餘物(MER)、完全或不完全弗氏佐劑；病毒佐劑；化學佐劑，例如氫氧化鋁、碘乙酸鹽及膽固醇半琥珀酸酯；裸DNA佐劑。可用於本發明方法之其他佐劑包括霍亂毒素、副痘蛋白、MF-59(Chiron Corporation；亦參見Bieg等人(1999)「GAD65 And Insulin B Chain Peptide(9-23)Are Not Primary Autoantigens In The Type 1 Diabetes Syndrome Of The BB Rat,」Autoimmunity,31(1)：15-24，其以引用之方式併入本文中)、MPL®(Corixa Corporation；亦參見Lodmell等人(2000)「DNA Vaccination Of Mice Against Rabies Virus：Effects Of The Route Of Vaccination And The Adjuvant Monophosphoryl Lipid A(MPL),」Vaccine,18：1059-1066；Johnson等人(1999)「3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid A Derivatives：Synthesis And Immunostimulant Activities,」Journal of Medicinal Chemistry,42：4640-4649；Baldridge等人(1999)「Monophosphoryl Lipid A(MPL)Formulations For The Next Generation Of Vaccines,」Methods,19：103-107，其均以引用之方式併入本文中)、RC-529佐劑(Corixa Corporation；來自Corixa之胺基烷基葡萄胺糖苷4-磷酸(AGP)化學文庫的主要化合物，亦參見www.corixa.com)及DETOXTM佐劑(Corixa Corporation；DETOXTM佐劑包括MPL®佐劑(單磷醯脂質A)及分枝桿菌細胞壁骨架；亦參見Eton等人(1998)「Active Immunotherapy With Ultraviolet B-Irradiated Autologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX In Patients With Metastatic Melanoma,」Clin.Cancer Res.4(3)：619-627；及Gupta等人(1995)「Adjuvants For Human Vaccines-Current Status,Problems And Future Prospects,」Vaccine,13(14)：1263-1276，其均以引用之方式併入本文中)。
多個公開案論述了噬菌體呈現技術用於產生及篩選用於結合於所選分析物之多肽的文庫之用途。參見例如Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等人,Science 249,404-6,1990,Scott及Smith,Science 249,386-88,1990；及Ladner等人,美國專利第5,571,698號。噬菌體呈現方法之基礎概念為在編碼欲篩選之多肽的DNA與該多肽之間建立物理聯繫。此物理聯繫由噬菌體粒子提供，該粒子將多肽呈現為密封編碼該多肽之噬菌體基因組之衣殼的一部分。在多肽與其遺傳材料之間建立物理聯繫允許同時對極大數目之具有不同多肽的噬菌體進行質量篩選。呈現對靶標具有親和力之多肽的噬菌體結合於該靶標且此等噬菌體藉由親和力篩選富集至該靶標。自此等噬菌體呈現之多肽的身份可由其各別基因組確定。使用此方法，經鑒別為對所需靶標具有結合親和力之多肽可接著藉由習知方式大量合成。參見例如美國專利第6,057,098號，其整體併入本文中，包括所有表格、圖式及申請專利範圍。
藉由此等方法產生之抗體可接著藉由首先用經純化之所關注多肽針對親和力及特異性進行篩選且需要時用需要自結合排除之多肽比較該等抗體之親和力及特異性的結果來進行選擇。篩選程序可涉及將該等經純化多肽固定於微量滴定板之獨立壁中。含有潛在抗體或抗體組之溶液接著置於各別微量滴定孔中且培育約30min至2h。接著洗滌該等微量滴定孔且 將經標記二次抗體(例如，若培育之抗體為小鼠抗體，則為結合至鹼性磷酸酯酶之抗小鼠抗體)添加至該等孔中且培育約30min且接著洗滌。受質添加至該等孔中且將出現顯色反應，其中存在經固定多肽之抗體。
如此鑒別之抗體可接著進一步針對親和力及特異性在所選分析設計中進行分析。在用於靶標蛋白之免疫分析的開發中，經純化靶標蛋白充當標準物，使用已選擇之抗體用該標準物判斷該免疫分析之靈敏性及特異性。因為多種抗體之結合親和力可不同；某些抗體對(例如在夾心分析中)可在空間中彼此干擾等，抗體之分析效能可為比抗體之絕對親和力及特異性更重要的量度。
抗體亦可使用不能表現功能性內源免疫球蛋白、但可表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠來產生。例如，人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物可隨機地或藉由同源重組引入至小鼠胚胎幹細胞中。或者，除人類重鏈及輕鏈基因外，人類可變區、恆定區及多樣性區亦可引入至小鼠胚胎幹細胞中。小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因可獨立地或與人類免疫球蛋白基因座之引入同時地藉由同源重組變得非功能性。詳言之，JH區之純合性缺失會防止內源抗體產生。經修飾胚胎幹細胞經擴增且微量注射至胚胞中以產生嵌合小鼠。該等嵌合小鼠接著經繁殖以產生表現人類抗體之純合後代。該等轉殖基因小鼠使用習知方法用所選抗原，例如本發明多肽之全部或一部分免疫。針對該抗原之單株抗體可使用習知融合瘤技術自經免疫、轉殖基因小鼠獲得。該等轉殖基因小鼠具有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期間重排，且隨後經歷類別轉換及體細胞突變。因此，使用該技術，有可能產生治療上適用之IgG、IgA、IgM及IgE抗體。關於用於 產生人類抗體之此技術的概述，參見Lonberg等人(1995)「Human Antibodies From Transgenic Mice,」Int.Rev.Immunol.13：65-93，其以引用之方式整體併入本文中)。關於用於產生人類抗體及人類單株抗體之此技術及用於產生該等抗體之方案的詳細論述，參見例如國際公開案第WO 98/24893號、第WO 96/34096號及第WO 96/33735號；及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號及第5,939,598號，其以引用之方式整體併入本文中。另外，諸如Abgenix/Amgen(Freemont,Calif.)及Medarex/BMS(Princeton,N.J.)、Kymab(Cambridge,UK)及Merus(Utrecht,Netherlands)之公司可著手使用類似於上述技術之技術提供針對所選抗原之人類抗體。
本文所揭示之抗CTLA-4抗體亦可重組產生(例如，在大腸桿菌/T7表現系統、哺乳動物細胞表現系統或低等真核生物表現系統中)。在此實施例中，編碼本發明之抗體免疫球蛋白分子(例如VH或VL)之核酸可插入至基於pET之質體中且在大腸桿菌/T7系統中表現。例如，本發明包括用於在宿主細胞(例如細菌宿主細胞，諸如大腸桿菌，諸如BL21或BL21DE3)中表現抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈之方法，該等方法包含在細胞中表現T7 RNA聚合酶，該細胞亦包括編碼可操作性連接至T7啟動子之免疫球蛋白鏈之聚核苷酸。例如，在本發明之一實施例中，諸如大腸桿菌之細菌宿主細胞包括編碼可操作性連接至lac啟動子之T7 RNA聚合酶基因之聚核苷酸且該聚合酶及該鏈的表現藉由用異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)培育宿主細胞來誘導。
單株抗體製劑可使用此項技術中已知之多種技術產生，包括使 用融合瘤、重組、及噬菌體呈現技術、或其組合。例如，單株抗體可使用融合瘤技術產生，包括此項技術中已知且教示於例如Harlow等人,ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等人,MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS,第563-681頁(Elsevier,N.Y.,1981)(其均以引用之方式整體併入本文中)中之彼等。如本文所用，術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指源於單一純系(包括任何真核、原核或噬菌體純系)之抗體，且並非其產生方法。用於抗體之重組產生之方法的一實例揭示於美國專利第4,816,567號中。
因此，本發明包括用於製備本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈之重組方法，該等方法包含引入編碼該抗體或片段之一或多個免疫球蛋白鏈(例如重及/或輕免疫球蛋白鏈)的聚核苷酸；在有利於該表現之條件下培養宿主細胞(例如CHO或畢赤酵母或巴斯德畢赤酵母)及視情況，自宿主細胞及/或其中宿主細胞生長之培養基分離該抗體或片段或鏈。
抗CTLA-4抗體亦可藉由美國專利第6,331,415號中所陳述之任何方法合成。
作為用於表現本文所揭示之抗體或片段或免疫球蛋白鏈的宿主之真核及原核宿主細胞(包括哺乳動物細胞)為此項技術中熟知的且包括可獲自American Type Culture Collection(ATCC)之多種永生化細胞株。其尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、海拉細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3 細胞、HEK-293細胞及多種其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。經由確定何種細胞株具有高表現水準來選擇具有特定偏好之細胞株。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9細胞、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。真菌細胞包括酵母及絲狀真菌細胞，包括例如巴斯德畢赤酵母、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母、考克拉畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭畢赤氏酵母、微小畢赤酵母(Pichia minuta/Ogataea minuta/Pichia lindneri)、仙人掌畢赤酵母、耐熱畢赤酵母、柳畢赤酵母、松櫟畢赤酵母、皮傑普畢赤酵母、樹幹畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、畢赤酵母屬、釀酒酵母、酵母菌屬、多形漢森酵母、克魯維酵母屬、乳酸克魯維酵母、白色念珠菌、小巢狀麴菌、黑麴菌、米麴菌、里氏木黴、拉克瑙金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮孢菌屬、禾谷鐮孢菌、金黃色鐮孢菌、小立碗蘚及粗糙脈胞菌、畢赤酵母屬、任何酵母菌屬、多形漢森酵母、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌、任何麴菌屬、里氏木黴、拉克瑙金孢子菌、任何鐮孢菌屬、解脂耶氏酵母及粗糙脈胞菌。當編碼重鏈或其抗原結合部分或片段、輕鏈及/或其抗原結合片段之重組表現載體經引入至哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養該等宿主細胞持續足以允許該抗體或片段或鏈在宿主細胞中表現或分泌至其中宿主細胞生長之培養基中的一段時間而產生抗體。
多種宿主-表現載體系統可用於表現本發明抗體。該等宿主-表現系統表示可用於產生該等抗體之編碼序列且隨後進行純化之媒劑，而且表示當用適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時可原位表現本發明抗體之細胞。 其包括但不限於微生物，諸如經含有免疫球蛋白編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體轉型的細菌(例如大腸桿菌及枯草芽孢桿菌)；經含有免疫球蛋白編碼序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如酵母菌、畢赤酵母)；經含有免疫球蛋白編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)及煙草嵌紋病毒(TMV))感染或經含有免疫球蛋白編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統；或具有重組表現構築體之哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、淋巴細胞(參見美國專利第5,807,715號)、Per C.6細胞(由Crucell開發之大鼠視網膜細胞)，該等構築體含有源於哺乳動物細胞的基因組之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)。
在細菌系統中，多種表現載體可有利地視意欲用於正在表現之抗體的用途而經選擇。例如，當欲產生大量該蛋白時，關於抗體之醫藥組合物的產生，可需要指導高水準的容易經純化之融合蛋白產物之表現的載體。該等載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278(Ruther等人(1983)「Easy Identification Of cDNA Clones,」EMBO J.2：1791-1794)，其中抗體編碼序列可與lac Z編碼區同框個別地接合至該載體中，使得產生融合蛋白；pIN載體(Inouye等人(1985)「Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli,」Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等人(1989)「Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli,」J.Biol.Chem.24：5503-5509)；及其類似物。pGEX載體亦可用於將外來多肽表現為 具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白。一般而言，該等融合蛋白為可溶的且可容易地藉由吸附及結合至基質麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒、隨後在游離麩胱甘肽存在下溶離而自溶解之細胞純化。該等pGEX載體經設計以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，使得經選殖之靶標基因產物可自GST部分釋放。
在昆蟲系統中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)用作載體以表現外來基因。該病毒在草地貪夜蛾細胞中生長。抗體編碼序列可個別地經選殖至該病毒之非必需區(例如多角體蛋白基因)中且置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)之控制下。
在哺乳動物宿主細胞中，可使用多種基於病毒之表現系統。若腺病毒用作表現載體，則所關注之抗體編碼序列可接合至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三聯前導序列。此嵌合基因可接著藉由活體外或活體內重組插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組之非必需區(例如區E1或E3)中將導致有活力且能夠在經感染宿主中表現免疫球蛋白分子之重組病毒。(參見例如參見Logan等人(1984)「Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.s.A.)81：3655-3659)。經插入之抗體編碼序列的有效轉譯亦可需要特定起始信號。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，該起始密碼子必須與所需編碼序列之閱讀框同相以確保完整插入物之轉譯。此等外源轉譯控制信號及起始密碼子可具有多種起源(天然及合成)。表現之效率可藉由包括適當轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強(參見Bitter等人(1987)「Expression And Secretion Vectors For Yeast,」Methods in Enzymol. 153：516-544)。
此外，可選擇宿主細胞株，其調節經插入序列之表現或以所需之特定方式修飾及加工基因產物。蛋白產物之該等修飾(例如糖基化)及加工(例如裂解)對於蛋白之功能可至關重要。不同宿主細胞具有關於蛋白及基因產物之轉譯後加工及修飾之特有且特定機制。可選擇適當細胞株或宿主系統以確保所表現之外來蛋白的正確修飾及加工。為此，可使用具有用於原始轉錄物之適當加工、基因產物之糖基化及磷酸化之細胞機構的真核宿主細胞。該等哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERY、BHK、海拉、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20及T47D、CRL7030及Hs578Bst。
關於重組蛋白之長期、高產率產生，穩定表現為較佳的。例如，穩定地表現本發明抗體之細胞株可經工程改造。與其使用含有病毒複製起點之表現載體，宿主細胞可經藉由適當表現控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選擇標記物轉型。在引入外來DNA之後，可使經工程改造之細胞在富集培養基中生長持續1-2天，且接著轉換至選擇培養基。重組質體中之可選擇標記物賦予選擇抗性且允許細胞將該質體穩定地整合至其染色體中且生長以形成焦點，該等焦點又可經選殖且擴增至細胞株中。此方法可有利地用於工程改造表現本發明抗體之細胞株。該等經工程改造之細胞株可尤其適用於篩選及評估直接地或間接地與本發明抗體相互作用之化合物。
可使用多種選擇系統，包括但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人(1977)「Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells,」Cell 11：223-232)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska等人(1962)「Genetics Of Human Cess Line.IV.DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48：2026-2034)及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人(1980)「Isolation Of Transforming DNA：Cloning The Hamster Aprt Gene,」Cell 22：817-823)基因，其分別可用於tk-、hgprt-或aprt-細胞中。又，抗代謝物抗性可用作以下基因之選擇基礎：dhfr，其賦予對胺甲喋呤之抗性(Wigler等人(1980)「Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77：3567-3570；O'Hare等人(1981)「Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78：1527-1531)；gpt，其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan等人(1981)「Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78：2072-2076)；neo，其賦予對胺基糖苷G-418之抗性(Tachibana等人(1991)「Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene,」Cytotechnology 6(3)：219-226；Tolstoshev(1993)「Gene Therapy,Concepts,Current Trials And Future Directions,」Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)「The Basic Science Of Gene Therapy,」Science 260：926-932；及Morgan等人(1993)「Human gene therapy,」Ann.Rev.Biochem.62：191-217)。可使用之重組DNA技術的此項技術中通常已知之方 法描述於Ausubel等人(編),1993,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,NY；Kriegler,1990,GENE TRANSFER AND EXPRESSION,A LABORATORY MANUAL,Stockton Press,NY；及第12及13章,Dracopoli等人(編),1994,CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS,John Wiley & Sons,NY.；Colbere-Garapin等人(1981)「A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells,」J.Mol.Biol.150：1-14中；及hygro，其賦予對潮黴素之抗性(Santerre等人(1984)「Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells,」Gene 30：147-156)。
本發明抗體之表現水準可藉由載體擴增來增加(關於回顧，參見Bebbington及Hentschel,「The Use Of Vectors Based On GeneAmplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells,」DNA CLONING,第3卷(Academic Press,New York,1987))。當表現抗體之載體系統中的標記物可擴增時，存在於宿主細胞之培養物中的抑制劑之含量之增加將增加標記物基因的複本數。由於經擴增之區與抗體之核苷酸序列有關，抗體之產生亦將增加(Crouse等人(1983)「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,」Mol.Cell.Biol.3：257-266)。
宿主細胞可用兩種本發明之表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。該兩種載體可含有相同的可選擇標記物，該等標記物使得能夠相等表現重鏈及輕鏈多肽。或者，可使用編碼重鏈及輕鏈多肽之單一載體。在該等情況下，輕鏈應置於重鏈之前以 避免過量毒性游離重鏈(Proudfoot(1986)「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,」Nature 322：562-565；Kohler(1980)「Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.s.A.)77：2197-2199)。用於該等重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈可使用標準蛋白純化方法自培養基回收。此外，來自生產細胞株之本發明抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈(或其他部分)的表現可使用多種已知技術增強。例如，麩醯胺合成酶基因表現系統(GS系統)為用於在某些條件下增強表現之常見方法。該GS系統完全地或部分地與歐洲專利第0 216 846號、第0 256 055號及第0 323 997號及歐洲專利申請案第89303964.4號聯合論述。因此，在本發明之一實施例中，哺乳動物宿主細胞(例如CHO)缺乏麩醯胺合成酶基因且在培養基中在麩醯胺不存在下生長，然而，其中編碼免疫球蛋白鏈之聚核苷酸包含補充宿主細胞中該基因之缺乏的麩醯胺合成酶基因。
本發明包括用於純化本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段的方法，該等方法包含將包含該抗體或片段之樣品引入純化培養基(例如陽離子交換培養基、陰離子交換培養基、疏水性交換培養基、親和力純化培養基(例如蛋白-A、蛋白-G、蛋白-A/G、蛋白-L))中，及自該樣品中未結合於培養基之流通部分收集經純化抗體或片段；或，棄去該流通部分且自培養基溶離結合抗體或片段及收集溶離液。在本發明之一實施例中，培養基在其中施加該樣品之管柱中。在本發明之一實施例中，該純化方法在該抗體或片段在宿主細胞中之重組表現之後進行，例如其中該宿主細胞首先 溶解且視情況，溶解產物在培養基上純化之前清除不溶性材料。
一般而言，在特定細胞株或轉殖基因動物中產生之醣蛋白將具有在該細胞株或轉殖基因動物中產生之醣蛋白所特有的糖基化模式。因此，抗體之特定糖基化模式將取決於用於產生該抗體之特定細胞株或轉殖基因動物。然而，由本文所提供之核酸分子編碼或包含本文所提供之胺基酸序列的所有抗體構成本發明，與該等抗體可具有之糖基化模式無關。同樣，在特定實施例中，具有僅包含非岩藻糖基化N-聚醣之糖基化模式的抗體可為有利的，因為此等抗體已顯示典型地展現比其岩藻糖基化配對物更有效之活體外及活體內功效(參見例如Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美國專利第6,946,292號及第7,214,775號)。此等具有非岩藻糖基化N-聚醣之抗體不可能具免疫原性，因為其碳水化合物結構為存在於人類血清IgG中之群體的正常組分。
本發明包括對CTLA-4及另一抗原具有結合特異性之雙特異性及雙功能性抗體及抗原結合片段及其使用方法，該另一抗原諸如在免疫刺激中起作用之抗原，諸如PD-1、PD-L1、TSLP、IL-10、4-IBB、SIRP-α、ICOS、NKG2C、NKG2A、KR2DL及KIR3DL抗原、OX40、CD40、ITL-1至ITL-8、GITR、CD137、CS1、CD27、APRIL或LAG-3，或在癌細胞的靶向及識別中起作用之抗原，諸如EGFR(ERBB1)、HER2(ERBB2)、ERBB3、CD19、CD20、CD30、CD33、CD52、CEA、α-胎蛋白、CC49、VEGF.VEGFR、HGFR(MET)、CA-125、生腱蛋白、整合素、FAB、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2或RANKL。在本發明之一實施例中，抗CTLA-4鏈包含以SEQ ID NO：7-30提供之VH/VL序列中任一者(或該等序列中任一者之抗原結合片 段，諸如以SEQ ID NO：1-6提供)。雙特異性或雙功能性抗體為具有兩個不同的重鏈/輕鏈對及兩個不同的結合位點之人工雜合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法產生，包括融合瘤之融合或Fab'片段之連接。參見例如Songsivilai等人,(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人,(1992)J Immunol.148：1547-1553。另外，雙特異性抗體可形成為「雙功能抗體」(Holliger等人,(1993)PNAS USA 90：6444-6448)或「Janusin」(Traunecker等人,(1991)EMBO J.10：3655-3659及Traunecker等人,(1992)Int.J.Cancer Suppl.7：51-52)。另外，雙特異性抗體可形成為「雙體」(Labrijn等人,PNAS 2013；110(13)：5145-5150)。
本發明進一步包括本文所揭示之抗CTLA-4抗體之抗CTLA-4抗原結合片段。該等抗體片段包括F(ab)2片段，其可藉由例如由胃蛋白酶酶促裂解IgG而產生。Fab片段可藉由例如用二硫蘇糖醇或巰基乙胺還原F(ab)2而產生。
免疫球蛋白可經指派為不同類別，視其重鏈之恆定域的胺基酸序列而定。在一些實施例中，不同恆定域可附接至源於本文所提供之CDR的人類化VL及VH區。存在至少五個主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之一些可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4；IgA1及IgA2。本發明包含此等類別或亞類之抗體中任一者之抗體及抗原結合片段。
在一實施例中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區，例如人類恆定區，諸如γ1、γ2、γ3或γ4人類重鏈恆定區或其變異體。在另一實施例中，該抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區，例如人類輕鏈恆定區，諸 如λ或κ人類輕鏈區或其變異體。舉例而言且非限制，該人類重鏈恆定區可為γ4且該人類輕鏈恆定區可為κ。在一替代實施例中，該抗體之Fc區為具有Ser228Pro突變之γ4(Angal S.等人,1993,Mol Immunol.30：105-108，位置241係基於Kabat編號系統)。
在一實施例中，該抗體或抗原結合片段包含IgG1亞型之重鏈恆定區。在一實施例中，該抗體或抗原結合片段包含IgG2亞型之重鏈恆定區。在一實施例中，該抗體或抗原結合片段包含IgG4亞型之重鏈恆定區。
抗體工程改造
進一步包括以下實施例，其中該等抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段為經工程改造之抗體以包括在親本hCTLA4.27A單株抗體之可變域內的構架殘基之修飾，例如以改良該抗體或片段之特性。典型地，進行該等構架修飾以降低該抗體或片段之免疫原性。此舉通常藉由用來自其中欲使用該抗體之物種之免疫譜系的類似殘基(例如在人類治療劑之情況下，人類殘基)置換親本(例如齧齒動物)抗體或片段中的可變域中之非CDR殘基(亦即，構架殘基)來實現。該抗體或片段稱作「人類化」抗體或片段。在一些情況下，可需要增加經工程改造(例如人類化)抗體之親和力，或改變其特異性。一種方法在於將一或多種構架殘基「回復突變」為相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體或片段可含有不同於產生該抗體之生殖系序列的構架殘基。該等殘基可藉由比較該抗體或片段構架序列與產生該抗體或片段之生殖系序列而經鑒別。另一方法在於恢復經工程改造(例如人類化)抗體之一或多個位置處的初始親本(例如齧齒動物)殘基，例如以恢復在置換構架殘基之過程中可能已喪失之結合親和力。(參見例如美國專 利第5,693,762號、美國專利第5,585,089號及美國專利第5,530,101號。)
在某些實施例中，該等抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段經工程改造(例如人類化)以包括構架及/或CDR中之修飾，從而改良其特性。該等經工程改造之改變可基於分子模型化。用於親本(非人類)抗體序列之可變區的分子模型可經構建以理解該抗體之結構特徵且用於鑒別該抗體上可與抗原相互作用之潛在區。習知CDR基於免疫球蛋白序列之比對及鑒別可變區。Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公開案第91-3242號；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616。Chothia及同事細心地檢查了抗體之晶體結構中的環及所提出之高變環之構形。Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人,(1989)Nature 342：878-883。在經分類為「CDR」及「高變環」之區之間存在變異。後來的研究(Raghunathan等人,(2012)J.Mol Recog.25,3,103-113)分析了數種抗體-抗原晶體複合物且觀察到抗體中之抗原結合區不必要嚴格地符合「CDR」殘基或「高變」環。用於非人類抗體之可變區的分子模型可用於指導可潛在地結合於抗原之區的選擇。實際上，基於模型之潛在抗原結合區不同於習知「CDR」或「高變」環。諸如Discovery Studio(BIOVIA,Dassault Systemes)之商業科學軟體可用於分子模型化。人類構架可基於與構架中及CDR中之非人類序列的最佳匹配來選擇。關於VH中之FR4(構架4)，用於人類生殖系之VJ區與相應非人類區進行比較。在VL中之FR4(構架4)的情況下，人類生殖系序列之J-κ及J-λ區與相應非人類區進行比較。一旦合適人類構架經鑒別，將CDR移植至所選人類構架中。在一些情 況下，VL-VH界面中之某些殘基可如非人類(親本)序列中經保持。分子模型亦可用於鑒別可潛在地改變CDR構形之殘基且因此結合於抗原。在一些情況下，此等殘基如非人類(親本)序列中經保持。分子模型亦可用於鑒別溶劑暴露胺基酸，該等胺基酸可導致不想要之效應，諸如糖基化、去醯胺化及氧化。可展性過濾器可在設計階段之早期引入以消除/最少化此等潛在問題。
另一類型之構架修飾涉及使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多種殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，由此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱作「去免疫化」且更詳細描述於美國專利第7,125,689號中。
在特定實施例中，將需要將含有暴露之側鏈的某些胺基酸改變為另一胺基酸殘基以便提供最終抗體之更大化學穩定性，以避免去醯胺化或異構化。天冬醯胺之去醯胺化可發生於NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上且導致產生異天冬胺酸殘基，該殘基將扭結引入至多肽鏈中且降低其穩定性(異天冬胺酸效應)。異構化可發生於DG、DS、DA或DT序列處。在某些實施例中，本發明抗體不含去醯胺化或天冬醯胺異構位點。
例如，天冬醯胺(Asn)殘基可改變為Gln或Ala以降低在任何Asn-Gly序列處、尤其在CDR內形成異天冬胺酸之潛能。類似問題可出現於Asp-Gly序列處。Reissner及Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60：1281。異天冬胺酸形成可減弱或完全地消除抗體與其靶標抗原之結合。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731,734。在一實施例中，天冬醯胺改變為麩醯胺(Gln)。亦可需要改變與天冬醯胺(Asn)或麩醯胺(Gln)相鄰之胺基酸以降低去醯胺化之可能性，當與天冬醯胺或麩醯胺相鄰出現小胺基酸時， 去醯胺化以較大速率發生。參見Bischoff及Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。另外，CDR中之任何甲硫胺酸殘基(典型地為溶劑暴露Met)可改變為Lys、Leu、Ala或Phe或其他胺基酸以便降低甲硫胺酸硫將氧化之可能性，該氧化可能降低抗原結合親和力且亦促進最終抗體製劑中之分子異質性。同上。另外，為了防止或最少化潛在易裂開Asn-Pro肽鍵，可需要將CDR中發現之任何Asn-Pro組合改變為Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。具有該等取代之抗體隨後經篩選以確保該等取代不會降低該抗體對CTLA-4之親和力或特異性或其他所需生物活性至不可接受之水準。
Fc區之抗體工程改造
本文所揭示之抗體(例如人類化抗體)及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可經工程改造以在Fc區內包括修飾，典型地以改變該抗體之一或多種特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或效應子功能(例如抗原依賴性細胞毒性)。此外，本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可經化學修飾(例如一或多種化學部分可連接至該抗體)或經修飾以改變其糖基化，此外改變該抗體或片段之 一或多種特性。此等實施例中之每一者更詳細描述於下文。Fc區中殘基之編號為Kabat之EU指數的彼編號。
本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦包括具有經修飾(或經阻斷)Fc區之抗體及片段以提供改變之效應子功能。參見例如美國專利第5,624,821號；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。該等修飾可用於增強或抑制免疫系統之多種反應，在診斷及療法方面具有可能有益效應。Fc區之改變包括胺基酸改變(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化、及添加多個Fc區。Fc之改變亦可改變治療性抗體中抗體之半衰期，使得能夠不太頻繁給藥及因此增加材料之便利性且減少材料之使用。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731,734-35。
在一實施例中，本發明抗體或抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)為在對應於重鏈恆定區之鉸鏈區中的位置228(S228P；EU指數)之位置處包含絲胺酸至脯胺酸突變之IgG4同型抗體或片段。據報道此突變消除鉸鏈區中之重鏈內二硫橋的異質性(Angal S.等人,1993,Mol Immunol.30：105-108；位置241基於Kabat編號系統)。
在本發明之一實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾，以致鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目增加或降低。此方法進一步描述於美國專利第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目改變，例如以促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低抗體之穩定性。
在另一實施例中，本發明抗體或抗原結合片段之Fc鉸鏈區(例如抗體27A及其人類化形式)突變以降低該抗體或片段之生物半衰期。更特定言之，一或多種胺基酸突變經引入至Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中， 以致該抗體或片段相對於原生Fc-鉸鏈域葡萄球菌蛋白A(SpA)結合具有削弱之SpA結合。此方法更詳細描述於美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，本發明抗體或抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)經修飾以增加其生物半衰期。多種方法為可能的。例如，一或多種以下突變可經引入：T252L、T254S、T256F，如美國專利第6,277,375號中所述。或者，為了增加生物半衰期，該抗體可在CH1或CL區內改變以含有取自IgG Fc區之CH2域的兩個環之挽救受體結合抗原決定基，如美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。
在其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一種胺基酸殘基來改變以改變該抗體或抗原結合片段之效應子功能。例如，選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多種胺基酸可用不同胺基酸殘基置換，以致該抗體具有改變的對效應子配位體之親和力且保持親本抗體之抗原結合能力。親和力發生改變之效應子配位體可為例如Fc受體、或補體之C1組分。此方法更詳細描述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實例中，選自胺基酸殘基329、331及322之一或多種胺基酸可用不同胺基酸殘基置換，以致該抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法更詳細描述於美國專利第6,194,551號中。
在另一實例中，在胺基酸位置231及239內之一或多種胺基酸殘基發生改變以由此改變該抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於PCT公開案WO 94/29351中。
在另一實例中，Fc區藉由修飾以下位置處之一或多種胺基酸而經修飾以降低本發明抗體或抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或降低該抗體或片段對Fcγ受體之親和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法進一步描述於PCT公開案WO 00/42072中。此外，人類IgG1上用於FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點已經定位且已描述具有改良結合之變異體(參見Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。
在本發明之一實施例中，Fc區藉由修飾殘基243及264而經修飾以降低本發明抗體(例如抗體27A及其人類化形式)介導效應子功能之能力及/或增加消炎特性。在一實施例中，該抗體或片段之Fc區藉由將位置243及264處之殘基改變為丙胺酸而經修飾。在一實施例中，Fc區藉由修飾殘基243、264、267及328而經修飾以降低該抗體或片段介導效應子功能之能力及/或增加消炎特性。
效應子功能增強
在一些實施例中，抗CTLA-4抗體之Fc區經修飾以增加該抗體或抗原結合片段介導效應子功能之能力及/或增加其與Fcγ受體(FcγR)之結合。
如本文所用，術語「效應子功能」意欲指抗體依賴性細胞介導 之細胞毒性活性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性活性(CDC)介導之反應、Fc介導之噬菌作用或抗體依賴性細胞噬菌作用(ADCP)及抗體經由FcRn受體再循環。
咸信在抗原結合蛋白之恆定區與包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之多種Fc受體(FcR)之間的相互作用介導抗原結合蛋白之效應子功能，諸如ADCC及CDC。Fc受體對於抗體交聯亦至關重要，該抗體交聯可對於抗腫瘤免疫性至關重要。
效應子功能可以多種方式進行量測，包括例如經由FcγRIII與天然殺手細胞之結合或經由FcγRI與單核細胞/巨噬細胞之結合以量測ADCC效應子功能。例如，本發明之抗原結合蛋白可在天然殺手細胞分析中針對ADCC效應子功能加以分析。該等分析之實例可發現於Shields等人,2001 J.Biol.Chem.,第276卷,第6591-6604頁；Chappel等人,1993 J.Biol.Chem.,第268卷,第25124-25131頁；Lazar等人,2006 PNAS,103；4005-4010中。
本發明抗體之ADCC或CDC特性或其交聯特性可以多種方式增強。
在殘基Asn297上含有特定突變或改變之糖基化的人類IgG1恆定區已顯示增強與Fc受體之結合。在一些情況下，此等突變亦已顯示增強ADCC及CDC(Lazar等人PNAS 2006,103；4005-4010；Shields等人J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等人Mol Immunol,2007,44；1815-1817)。
在本發明之一實施例中，該等突變在選自239、332及330(IgG1)之一或多個位置、或其他IgG同型中之相等位置處。合適突變之實例為S239D 及I332E及A330L。在一實施例中，本文所述之本發明抗原結合蛋白在位置239及332處突變，例如S239D及I332E或在另一實施例中，其在選自239及332及330之三個或三個以上位置處突變，例如S239D及I332E及A330L(EU指數編號)。
在本發明之一替代實施例中，提供包含具有改變之糖基化型態的重鏈恆定區之抗體，以致該抗原結合蛋白具有增強之效應子功能。例如，其中該抗體具有增強之ADCC或增強之CDC或其中其具有增強之ADCC及CDC效應子功能。產生具有改變之糖基化型態的抗原結合蛋白之合適方法之實例描述於WO2003011878、WO2006014679及EP1229125中。
在另一態樣中，本發明提供「非岩藻糖基化」或「無岩藻糖基化」抗體。非岩藻糖基化抗體具有Fc之複合型N-聚醣之三-甘露糖基核心結構而無岩藻糖殘基。此等缺乏Fc N-聚醣之核心岩藻糖殘基的糖基工程改造之抗體可歸因於FcγRIIIa結合能力之增強展現強於岩藻糖基化相等物的ADCC。
本發明亦提供一種用於產生根據本發明之抗體之方法，其包含以下步驟：a)培養包含表現載體之重組宿主細胞，該表現載體包含如本文所述之經分離核酸，其中該重組宿主細胞不包含α-1,6-岩藻糖基轉移酶；及b)回收該抗原結合蛋白。該重組宿主細胞可通常不含編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶之基因(例如酵母宿主細胞，諸如畢赤酵母屬)或可已經遺傳修飾以不活化α-1,6-岩藻糖基轉移酶。可獲得已經遺傳修飾以不活化編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶之FUT8基因的重組宿主細胞。參見例如可獲自BioWa,Inc.(Princeton,N.J.)之POTELLIGENTTM技術系統，其中缺乏該FUT8基因之功能複本的 CHOK1SV細胞產生具有增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性的單株抗體，該活性相對於在具有功能性FUT8基因之細胞中產生的相同單株抗體有所增加。該POTELLIGENTTM技術系統之態樣描述於US7214775、US6946292、WO0061739及WO0231240中。一般技術者亦將認識其他適當系統。
熟習此項技術者應顯而易知，該等修飾不僅可單獨使用，而且可彼此組合使用以便進一步增強效應子功能。
具有經修飾糖基化之抗體之產生
在另一實施例中，本發明抗體或抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)包含特定糖基化模式。例如，可製得無岩藻糖基化或無糖基化抗體或片段(亦即，該抗體分別缺乏岩藻糖或糖基化)。抗體或片段之糖基化模式可發生改變以例如增加該抗體或片段對CTLA-4抗原之親和力或親合力。該等修飾可藉由例如改變該抗體或片段序列內之一或多個糖基化位點來實現。例如，可進行一或多種胺基酸取代，其導致移除一或多個可變區構架糖基化位點以由此消除在彼位點處之糖基化。該無糖基化可增加該抗體或片段對抗原之親和力或親合力。參見例如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。
本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可進一步包括在低等真核宿主細胞中產生之彼等，詳言之諸如酵母及絲狀真菌之真菌宿主細胞已經遺傳工程改造以產生具有哺乳動物或人類樣糖基化模式之醣蛋白(參見例如Choi等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100：5022-5027；Hamilton等人,(2003)Science 301：1244-1246；Hamilton等人, (2006)Science 313：1441-1443；Nett等人,Yeast 28(3)：237-52(2011)；Hamilton等人,Curr Opin Biotechnol.十月；18(5)：387-92(2007))。在目前使用之哺乳動物細胞株中此等經遺傳修飾之宿主細胞的特定優勢在於控制在該等細胞中產生之醣蛋白的糖基化模式以致可產生其中特定N-聚醣結構佔優勢之醣蛋白組合物的能力(參見例如美國專利第7,029,872號及美國專利第7,449,308號)。此等經遺傳修飾之宿主細胞已用於產生主要具有特定N-聚醣結構之抗體(參見例如Li等人,(2006)Nat.Biotechnol.24：210-215)。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)進一步包括在低等真核宿主細胞中產生且包含岩藻糖基化及非岩藻糖基化雜合及複合N-聚醣(包括經平分及多觸角物質，包括但不限於諸如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2之N-聚醣)之彼等。
在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可包含具有至少一種選自由GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2組成之群之雜合N-聚醣的抗體或片段。在特定態樣中，該雜合N-聚醣為組合物中之主要N-聚醣物質。
在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)包含具有至少一種選自由GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2組成之群之複 合N-聚醣的抗體及片段。在特定態樣中，該複合N-聚醣為組合物中之主要N-聚醣物質。在其他態樣中，該複合N-聚醣為特定N-聚醣物質，其構成組合物中約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之複合N-聚醣。在一實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段包含複合N-聚醣，其中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之複合N-聚醣包含結構NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其中該結構為無岩藻糖基化的。該等結構可例如在經工程改造之巴斯德畢赤酵母宿主細胞中產生。
在特定實施例中，N-聚醣經岩藻糖基化。一般而言，岩藻糖與N-聚醣之還原末端處的GlcNAc呈α1,3-連接，與N-聚醣之還原末端處的GlcNAc呈α1,6-連接，與N-聚醣之非還原末端處的Gal呈α1,2-連接，與N-聚醣之非還原末端處的GlcNac呈α1,3-連接，或與N-聚醣之非還原末端處的GlcNac呈α1,4-連接。
因此，在以上醣蛋白組合物之特定態樣中，糖型呈α1,3-連接或α1,6-連接岩藻糖以產生選自由Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)組成之群之糖型；呈α1,3-連接或α1,4-連接岩藻糖以產生選自由GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2及NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3 GlcNAc2組成之群之糖型；或呈α1,2-連接岩藻糖以產生選自由Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2及NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2組成之群之糖型。
在特定態樣中，該等抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段包含高甘露糖N-聚醣，包括但不限於Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2、或由Man3GlcNAc2 N-聚醣結構組成之N-聚醣。
在以上內容之特定態樣中，複合N-聚醣進一步包括岩藻糖基化及非岩藻糖基化經平分及多觸角物質。
如本文所用，術語「N-聚醣」及「糖型」可互換使用且係指N-連接寡糖，例如藉由天冬醯胺-N-乙醯基葡糖胺連接而連接至多肽之天冬醯胺殘基者。N-連接醣蛋白含有連接至該蛋白中之天冬醯胺殘基的醯胺氮之N-乙醯基葡糖胺殘基。在醣蛋白上發現之主要糖為葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)及唾液酸(例如N-乙醯基-神經胺糖酸(NANA))。糖基之加工在ER之內腔中共轉譯地發生且在用於N-連接醣蛋白之高基氏體中轉譯後繼續。
N-聚醣具有常見五糖核心Man3GlcNAc2(「Man」係指甘露糖；「Glc」係指葡萄糖；及「NAc」係指N-乙醯基；GlcNAc係指N-乙醯基葡糖胺)。通常，N-聚醣結構用非還原末端提供至左側且用還原末端提供至右側。N-聚醣之還原末端為連接至蛋白上包含糖基化位點之Asn殘基的末端。N-聚醣關於包含添加至Man3GlcNAc2(「Man3」)核心結構中之外周糖(例如 GlcNAc、半乳糖、岩藻糖及唾液酸)的分支鏈(觸角)之數目不同，該核心結構亦稱作「三甘露糖核心」、「五糖核心」或「少甘露糖核心」。N-聚醣根據其分支鏈成分分類(例如高甘露糖、複合或雜合)。「高甘露糖」類型N-聚醣具有五個或五個以上甘露糖殘基。「複合」類型N-聚醣典型地具有至少一個連接至「三甘露糖」核心之1,3甘露糖臂之GlcNAc及至少一個連接至1,6甘露糖臂的GlcNAc。複合N-聚醣亦可具有半乳糖(「Gal」)或N-乙醯基半乳糖胺(「GalNAc」)殘基，該等殘基視情況用唾液酸或衍生物(例如「NANA」或「NeuAc」，其中「Neu」係指神經胺糖酸且「Ac」係指乙醯基)修飾。複合N-聚醣亦可具有包含「平分」GlcNAc及核心岩藻糖(「Fuc」)之鏈內取代。複合N-聚醣亦可具有在「三甘露糖核心」上之多個觸角，通常稱作「多觸角聚醣」。「雜合」N-聚醣具有至少一個在三甘露糖核心之1,3甘露糖臂的末端上之GlcNAc及零個或零個以上在三甘露糖核心之1,6甘露糖臂上的甘露糖。多種N-聚醣亦稱作「糖型」。
關於複合N-聚醣，術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」意謂以下。「G-2」係指可表徵為Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G-1」係指可表徵為GlcNAcMan3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G0」係指可表徵為GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G1」係指可表徵為GalGlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G2」係指可表徵為Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「A1」係指可表徵為NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；且術語「A2」係指可表徵為NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構。除非另外指示，否則術語G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及 「A2」係指缺乏連接至N-聚醣之還原末端處的GlcNAc殘基之岩藻糖的N-聚醣物質。當該術語包括「F」時，「F」指示N-聚醣物質含有在N-聚醣之還原末端處的GlcNAc殘基上之岩藻糖殘基。例如，G0F、G1F、G2F、A1F及A2F均指示N-聚醣進一步包括連接至N-聚醣之還原末端處的GlcNAc殘基之岩藻糖殘基。諸如酵母及絲狀真菌之低等真核生物通常不產生會產生岩藻糖之N-聚醣。
關於多觸角N-聚醣，術語「多觸角N-聚醣」係指進一步包含在包含N-聚醣之1,6臂或1,3臂的非還原末端之甘露糖殘基上的GlcNAc殘基或在包含N-聚醣之1,6臂及1,3臂的非還原末端之甘露糖殘基中每一者上的GlcNAc殘基之N-聚醣。因此，多觸角N-聚醣可由式GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2表徵。術語「1-4」係指1、2、3或4個殘基。
關於經平分N-聚醣，術語「經平分N-聚醣」係指其中GlcNAc殘基連接至N-聚醣之還原末端處的甘露糖殘基之N-聚醣。經平分N-聚醣可由式GlcNAc3Man3GlcNAc2表徵，其中各甘露糖殘基在其非還原末端處連接至GlcNAc殘基。相反，當多觸角N-聚醣經表徵為GlcNAc3Man3GlcNAc2時，該式指示兩個GlcNAc殘基連接至N-聚醣之兩個臂之一的非還原末端處之甘露糖殘基且一個GlcNAc殘基連接至N-聚醣之另一臂的非還原末端處之甘露糖殘基。
抗體物理特性
本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化 形式)可進一步含有一或多個在輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變域中之糖基化位點。該等糖基化位點可導致該抗體或片段之增加的免疫原性或歸因於改變之抗原結合的抗體之pK改變(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala及Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已顯示在含有N-X-S/T序列之基序處發生。
各抗體或抗原結合片段(例如27A或其人類化形式)將具有獨特等電點(pI)，其一般屬6與9.5之間之pH範圍。針對IgG1抗體之pI典型地屬7-9.5之pH範圍內且針對IgG4抗體之pI典型地屬6-8之pH範圍內。
各抗體或抗原結合片段(例如27A或其人類化形式)將具有特有熔融溫度，其中較高熔融溫度指示較大的活體內總體穩定性(Krishnamurthy R及Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。一般而言，TM1(初始未折疊之溫度)可大於60℃、大於65℃或大於70℃。抗體或片段之熔點可使用差示掃描熱量測定(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圓形二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)量測。
在另一實施例中，選擇不會快速地降解之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)。抗體或片段之降解可使用毛細管電泳(CE)及MALDI-MS(Alexander AJ及Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)量測。
在另一實施例中，選擇具有最小聚集效應之抗體(例如抗體27A 及其人類化形式)及其抗原結合片段，該等聚集效應可導致不良免疫反應及/或改變或不利的藥物動力學特性之觸發。一般而言，具有25%或更少、20%或更少、15%或更少、10%或更少、或5%或更少之聚集的抗體及片段為可接受的。聚集可藉由數種技術量測，包括尺寸排阻管柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)及光散射。
抗體結合物
本文所揭示之抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可結合至化學部分。該化學部分尤其可為聚合物、放射性核素或細胞毒性引子。在特定實施例中，該化學部分為增加該抗體或片段在個體之身體中的半衰期之聚合物。合適聚合物包括但不限於親水性聚合物，其包括但不限於聚乙二醇(PEG)(例如具有2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa之分子量的PEG)、葡聚糖及單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人,(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)揭示了PEG結合之單鏈抗體。Wen等人,(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)揭示了具有PEG之結合抗體，該PEG連接至放射性金屬螯合劑(二伸乙基三胺五乙酸(DTPA))。
本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可與諸如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57T0、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th及40K、157Gd、55Mn、52Tr及56Fe之標記結合。
本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可經PEG化，例如以增加其生物(例如血清)半衰期。為了PEG化抗體或片段，該抗體或片段典型地與聚乙二醇(PEG)之反應性形式，諸如PEG之反 應性酯或醛衍生物在其中一或多個PEG基團變得連接至該抗體或抗體片段之條件下反應。在特定實施例中，PEG化經由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生化其他蛋白之任何PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，欲PEG化之抗體或片段為無糖基化抗體或片段。用於PEG化蛋白之方法為此項技術中已知的且可應用於本發明抗體。參見例如EP 0 154 316及EP 0 401 384。
本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可與螢光或化學發光標記結合，包括螢光團(諸如稀土螯合物、螢光素及其衍生物)、若丹明及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅素、藻藍素、異藻藍素、鄰苯二醛、螢光胺、152Eu、丹磺醯基、傘形酮、螢光素、魯米諾標記、異魯米諾標記、芳族吖啶酯標記、咪唑標記、吖啶鹽標記、草酸酯標記、水母素標記、2,3-二氫酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記及穩定自由基。
本發明抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可結合於細胞毒性因子，諸如白喉毒素、綠膿桿菌外毒素A鏈、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白及化合物(例如脂肪酸)、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII及PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、邁托毒素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)及伊諾黴素(enomycin)。
可使用此項技術中已知用於使本發明抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)結合於多種部分之任何方法，包括由Hunter等人,(1962)Nature 144：945；David等人,(1974)Biochemistry 13：1014；Pain等人,(1981)J.Immunol.Meth.40：219；及Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30：407所述之彼等方法。用於結合抗體及片段之方法為此項技術中習知且極其熟知的。
抗體或其他多肽可固定至多種用於分析中之固體支撐物上。可用於固定特定結合成員之固相包括在固相結合分析中作為固相開發及/或使用之彼等。合適固相之實例包括膜濾器、基於纖維素之紙、珠粒(包括聚合物、乳膠及順磁粒子)、玻璃、矽晶圓、微粒、奈米粒子、TentaGel、AgroGel、PEGA凝膠、SPOCC凝膠及多孔板。分析條可能藉由將該抗體或呈陣列形式之複數種抗體塗佈於固體支撐物上來製備。此條可能接著浸漬於測試樣品中且接著快速地經由洗滌及偵測步驟加工以產生可量測信號，諸如色斑。抗體或其他多肽可藉由直接地結合於分析器件表面或藉由間接結合而結合於分析器件之特定區域。在後一種情形之一實例中，抗體或其他多肽可固定於粒子或其他固體支撐物上，且彼固體支撐物固定於器件表面。
生物分析需要用於偵測之方法，且用於結果定量的最常見方法之一在於使可偵測標記結合於對所研究之生物系統中的組分之一具有親和力之蛋白或核酸。可偵測標記可包括自身可偵測之分子(例如螢光部分、電化學標記、金屬螯合物等)，以及可藉由產生可偵測反應產物(例如酶，諸如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酯酶等)或藉由自身可偵測之特定結合分子(例如生物素、長葉毛地黃配質、麥芽糖、寡組胺酸、2,4-二硝基苯、苯砷酸鹽、 ssDNA、dsDNA等)間接地偵測之分子。
固相及可偵測標記結合物之製備通常包含使用化學交聯劑。交聯試劑含有至少兩種反應性基團，且一般分為同官能交聯劑(含有相同反應性基團)及異官能交聯劑(含有不同反應性基團)。經由胺、巰基偶合或非特異性反應之同雙官能交聯劑可獲自多種商業來源。順丁烯二醯亞胺、烷基及芳基鹵化物、α-鹵醯基及吡啶基二硫化物為硫醇反應性基團。順丁烯二醯亞胺、烷基及芳基鹵化物、及α-鹵醯基與巰基反應以形成硫醇醚鍵，而吡啶基二硫化物與巰基反應以產生混合二硫化物。吡啶基二硫化物產物為可裂解的。亞胺酸酯亦極其適用於蛋白-蛋白交聯。多種異雙官能交聯劑均可購得，其各自組合針對成功結合之不同屬性。
抗CTLA-4抗體之治療用途
進一步提供用於治療需要用本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)治療之個體(包括人類個體)的方法。在本發明之一實施例中，該個體經歷感染或傳染病。在本發明之另一實施例中，該個體經歷癌症。在一實施例中，該癌症為例如骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經胚細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸部癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜胚細胞瘤、肝胚細胞瘤、肝細胞癌、黑色素瘤、腎臟橫紋肌樣腫瘤、尤文氏肉瘤、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層腫瘤、神經管胚細胞瘤、星細胞瘤、未分化星細胞瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、室鼓膜瘤、脈絡 叢乳頭狀瘤、真性紅細胞增多症、血小板過多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌或肝癌、乳癌或胃癌。在本發明之一實施例中，該癌症為轉移癌，例如具有上文所述之變化性。
在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)來治療個體之方法，其中該個體經歷病毒性感染。在一實施例中，該病毒性感染用選自由人類免疫缺乏病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、皰疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II及CMV、埃巴病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或蟲媒病毒性腦炎病毒組成之群之病毒感染。
在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段來治療個體之方法，其中該個體經歷細菌性感染。在一實施例中，該細菌性感染用選自由沙眼披衣菌、立克次體細菌(諸如艾利希體屬、東方體屬及立克次體)、分枝桿菌(諸如麻瘋分枝桿菌或彌漫型麻瘋分枝桿菌)、葡萄球菌(諸如金黃色葡萄球菌)、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎球菌及淋病雙球菌、克萊桿菌屬、盲螈屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌、退伍軍人桿菌、白喉棒狀桿菌、沙門氏菌屬、桿菌、霍亂弧菌、破傷風梭菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、耶氏桿菌、嗜血桿菌流感、放線菌、螺旋體、密螺旋體、志賀桿菌屬、鸚鵡熱嗜衣原體及疏螺旋體組成之群之細菌感染。
在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CTLA-4抗體或其抗 原結合片段來治療個體之方法，其中該個體經歷真菌性感染。在一實施例中，該真菌性感染用選自由念珠菌屬(白色念珠菌、克魯斯念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌、麴菌(薰煙色麴菌、黑麴菌等)、毛黴目屬(毛黴屬、犁頭黴屬、根黴屬)、申克氏孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌及莢膜組織漿菌組成之群之真菌感染。
在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段來治療個體之方法，其中該個體經歷寄生蟲感染。在一實施例中，該寄生蟲感染用選自由溶組織阿米巴、大腸纖毛蟲、變形纖毛蟲、棘狀變形蟲、藍氏賈第鞭毛蟲、隱胞子蟲、肺胞囊蟲、間日瘧原蟲、小鼠焦蟲、布氏錐蟲、克魯氏錐蟲、黑熱病原蟲、弓蟲及巴西鼠鉤蟲組成之群之寄生蟲感染。
「個體」可為哺乳動物，諸如人類、犬、貓、馬、牛、小鼠、大鼠、猴(長尾獼猴(食蟹獼猴))或兔。在本發明之較佳實施例中，該個體為人類個體。
在某些實施例中，本文所述之方法及組合物與其他抗體分子、STING促效劑、化學療法、其他抗癌療法(例如靶向抗癌療法、基因療法、病毒療法、RNA療法骨髓移植、奈米療法或溶瘤藥物)、細胞毒性劑、基於免疫之療法(例如細胞因子或基於細胞之免疫療法)、手術程序(例如乳房腫瘤切除術或乳房切除術)或輻射程序中之一或多者、或前述任一者之組合組合投與。該額外療法可呈輔助或新輔助療法之形式。在一些實施例中，該額外療法為酶抑制劑(例如小分子酶抑制劑)或轉移抑制劑。可組合投與之例示性細胞毒性包括抗微管劑、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物、有絲分裂抑 制劑、烷基化劑、蒽環、長春花屬生物鹼、嵌入劑、能夠干擾信號轉導路徑之試劑、促進細胞凋亡之試劑、蛋白體抑制劑及輻射(例如局部或全身照射(例如γ照射)。在其他實施例中，該額外療法為手術或輻射、或其組合。在其他實施例中，該額外療法為靶向PI3K/AKT/mTOR路徑中之一或多者之療法、HSP90抑制劑、或微管蛋白抑制劑。或者，或與前述組合組合，本文所述之方法及組合物可與以下一或多者組合投與：免疫調節劑(例如共刺激分子之活化劑或抑制分子之抑制劑，例如免疫檢查點分子)；疫苗，例如治療性癌症疫苗；或細胞免疫療法之其他形式。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)可單獨使用，或聯合其他、進一步治療劑及/或治療程序使用，用於治療或預防需要該治療或預防之個體中的任何疾病，諸如癌症，例如如本文所論述。包含該等抗體及片段聯合進一步治療劑之組合物(例如包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物)亦為本發明之一部分。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可單獨使用，或聯合腫瘤疫苗使用。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可單獨使用，或聯合化學治療劑使用。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可單獨使用，或聯合輻射療法使用。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可單獨使用，或聯合靶向療法使用。靶向療法之實例包括：激素療法、信號轉導抑制劑(例如EGFR抑制劑，諸如西妥苷單抗 (Erbitux)及厄洛替尼(Tarceva))；HER2抑制劑(例如曲妥珠單抗(Herceptin)及帕妥珠單抗(Perjeta))；BCR-ABL抑制劑(諸如伊馬替尼(Gleevec)及達沙替尼(Sprycel))；ALK抑制劑(諸如克唑替尼(Xalkori)及色瑞替尼(Zykadia))；BRAF抑制劑(諸如威羅菲尼(Zelboraf)及達拉非尼(Tafinlar))、基因表現調節劑、細胞凋亡誘導劑(例如硼替佐米(Velcade)及卡非佐米(Kyprolis))、血管生成抑制劑(例如貝伐珠單抗(Avastin)及雷莫蘆單抗(Cyramza)、連接至毒素之單株抗體(例如本妥昔單抗(Adcetris)及ado-曲妥珠單抗emtansine(Kadcyla))。
在特定實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可與抗癌治療劑或免疫調節藥物組合使用，諸如免疫調節受體抑制劑，例如特異性結合於該受體之抗體或其抗原結合片段。
因此，本發明包括包含本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)聯合一或多種PD-1/PD-L1阻斷抗體之組合物：派姆單抗、納武單抗、皮地利珠單抗、REGN2810、MEDI-0680、PDR-001、SHR-1210、BGB-A317、PF-06801591、TSR-042、阿特珠單抗、杜瓦姆單抗(durvalumab)、BMS-936559；以及用於治療或預防個體中之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之該抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段及派姆單抗、納武單抗、皮地利珠單抗、REGN2810中之一或多者。視情況，該個體亦投與另一治療劑。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)與編碼派姆單抗之重鏈及輕鏈的經分離抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體)或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)與編碼納武單抗之重鏈及輕鏈的經分離抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)與以下一或多者聯合：抗PD1抗體(例如派姆單抗、納武單抗、皮地利珠單抗(CT-011))、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗CD27抗體、抗CS1抗體(例如埃羅妥珠單抗)、抗KIR2DL1/2/3抗體(例如利麗單抗)、抗CD137抗體(例如烏瑞魯單抗)、抗GITR抗體(例如TRX518)、抗PD-L1抗體(例如BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗PD-L2抗體、抗ILT1抗體、抗ILT2抗體、抗ILT3抗體、抗ILT4抗體、抗ILT5抗體、抗ILT6抗體、抗ILT7抗體、抗ILT8抗體、抗CD40抗體、抗OX40抗體、抗ICOS、抗SIRPα、抗KIR2DL1抗體、抗KIR2DL2/3抗體、抗KIR2DL4抗體、抗KIR2DL5A抗體、抗KIR2DL5B抗體、抗KIR3DL1抗體、抗KIR3DL2抗體、抗KIR3DL3抗體、抗NKG2A抗體、抗NKG2C抗體、抗NKG2E抗體、抗4-1BB抗體(例如PF-05082566)、抗TSLP抗體、抗IL-10抗體、抗APRIL(例如BION1301)、抗CD38(達雷木單抗)、抗IL-10或PEG化IL-10、或該等靶標之任何小有機分子抑制劑。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗PD1抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗PDL1抗體(例如BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗CD27抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗CS1抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR2DL1/2/3抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗CD137(例如烏瑞魯單抗)抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗GITR(例如TRX518)抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗PD-L2抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL1抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL2抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL3抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL4抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合 片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL5抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL6抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL7抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ITL8抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗CD40抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗OX40抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR2DL1抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR2DL2/3抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR2DL4抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR2DL5A抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR2DL5B抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合 片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR3DL1抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR3DL2抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗KIR3DL3抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗NKG2A抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗NKG2C抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗ICOS抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗SIRPα抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗4-1BB抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗IL-10抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗TSLP抗體聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與IL-10或PEG化IL-10聯合。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合 片段與Tim-3路徑拮抗劑聯合，較佳地作為醫藥組合物之一部分。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段與Vista路徑拮抗劑聯合，較佳地作為醫藥組合物之一部分。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段與BTLA路徑拮抗劑聯合，較佳地作為醫藥組合物之一部分。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段與LAG-3路徑拮抗劑聯合，較佳地作為醫藥組合物之一部分。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段與TIGIT路徑拮抗劑聯合，較佳地作為醫藥組合物之一部分。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段與STING促效劑聯合，較佳地作為醫藥組合物之一部分。環-二-核苷酸(CDN)環-二-AMP(由單核球增多性李氏菌及其他細菌產生)及其類似物環-二-GMP及環-GMP-AMP由宿主細胞識別為病原體相關分子模式(PAMP)，其結合於病原體識別受體(PRR)，該受體稱作干擾素基因刺激劑(STING)。STING為宿主哺乳動物細胞之細胞質中的接頭蛋白，其活化TANK結合激酶(TBK1)-IRF3及NF-κB信號傳導軸，導致誘導IFN-β及強烈地活化先天免疫性之其他基因產物。現在認識到STING為宿主細胞溶質監視路徑之組分(Vance等人,2009)，其感測細胞內病原體之感染且作出回應而誘導產生IFN-β，導致開發適應性保護性病原體特異性免疫反應，該反應由抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞以及病原體特異性抗體組成。環狀嘌呤二核苷酸之實例更詳細描述於例如：美國專利7,709458及7,592,326；專利申請案WO2007/054279、WO2014/093936及WO2014/189805；及Yan等人,Bioorg. Med.Chem Lett.18：5631(2008)中。
在一些實施例中，本發明抗體或抗原結合片段增加免疫細胞之活性。免疫細胞之活性的增加可使用此項技術中已知之任何方法偵測。在一實施例中，免疫細胞之活性的增加可藉由量測免疫細胞之增殖來偵測。例如，T細胞之活性的增加可藉由量測T細胞增殖或信號轉導事件，諸如向轉錄調節因子傳送信號之免疫受體或下游激酶的酪胺酸磷酸化來偵測。在其他實施例中，免疫細胞之活性的增加可藉由量測對特異性靶標細胞之CTL或NK細胞細胞毒性功能或IFNγ細胞因子反應來偵測，該等反應與抗腫瘤免疫性之刺激有關。在其他實施例中，免疫細胞之活性的增加可藉由量測源於個體之樣品中的離體T細胞活化來偵測。在其他實施例中，T細胞活性之增加如下測定：(i)量測葡萄球菌腸毒素B(SEB)誘導之一或多種選自由以下組成之群之促發炎細胞因子的產生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13；或(ii)量測T細胞受體(TCR)信號傳導之混合淋巴細胞反應或直接抗CD3 mAb刺激，該信號傳導用以誘導選自由以下組成之群之細胞因子的產生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13。在某些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段將刺激IL-2及/或IFNγ之抗原特異性T細胞產生及/或CD25及/或CD69之上調達至少1.5倍。在某些實施例中，當本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段經提供至表現CD80及CD86之Raji細胞時，其將刺激CD3+ T細胞，以產生選自由以下組成之群之促發炎細胞因子：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13。
有益於引起溶細胞T細胞反應之額外試劑可與本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段組合使用。此等試劑包括而不限於B7共刺激分子、介白素-2、干擾素-γ、GM-CSF、PD-1拮抗劑、OX-40/OX-40配位體、CD40/CD40配位體、沙格司亭、左旋咪唑、牛痘病毒、卡介苗(BCG)、脂質體、明礬、弗氏完全或不完全佐劑、解毒內毒素、礦物油、表面活性物質(諸如脂肪卵磷脂)、複合多元醇、聚陰離子、肽、及油或烴乳液。
與抗體反應相對優先刺激溶細胞T細胞反應之用於誘導T細胞免疫反應之組合物為較佳的，不過亦可使用刺激兩種類型之反應的彼等。若該試劑為多肽，則可投與該多肽自身或編碼該多肽之聚核苷酸。載劑可為細胞，諸如抗原呈現細胞(APC)或樹突狀細胞。抗原呈現細胞包括諸如巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞之細胞類型。其他專業抗原呈現細胞包括單核細胞、邊緣區庫弗細胞、小神經膠質細胞、蘭格漢氏細胞、交錯性網織樹突狀細胞、濾泡性樹突狀細胞及T細胞。亦可使用特許抗原呈現細胞。特許抗原呈現細胞之實例包括星形細胞、濾泡細胞、內皮及纖維母細胞。
該組合物可包含經轉型以表現多肽或遞送隨後在接種疫苗之個體的細胞中表現之聚核苷酸的細菌細胞。可添加諸如氫氧化鋁或磷酸鋁之佐劑以增加疫苗觸發、增強或延長免疫反應之能力。
該組合物可包含經轉型以表現多肽或遞送隨後在接種疫苗之個體的細胞中表現之聚核苷酸的細菌細胞。已開發多種細菌物質用作疫苗且其可用作本發明中之疫苗平台，包括但不限於副痢疾桿菌、大腸桿菌、單核球增多性李氏菌、小腸大腸炎耶氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌或分枝桿菌屬。此清單不意謂限制性的。本發明涵蓋經減弱、共生性及/ 或經殺滅但具代謝活性細菌株用作疫苗平台之用途。在較佳實施例中，細菌為單核球增多性李氏菌。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段用於不活化腫瘤細胞疫苗。「不活化腫瘤細胞疫苗」意謂已經處理以防止細胞分裂之腫瘤細胞(對於患者為「自體同源的」或「同種異體的」)。出於本發明之目的，該等細胞保持其免疫原性及其代謝活性。該等腫瘤細胞經遺傳修飾以表現轉殖基因，該轉殖基因作為癌症療法之一部分在患者內表現。因此，本發明組合物或疫苗包含腫瘤性(例如腫瘤)細胞，其對於經歷治療之患者為自體同源的或同種異體的且最佳地為與困擾患者之腫瘤細胞相同通用類型之腫瘤細胞。例如，罹患黑色素瘤之患者將典型地投與源於黑色素瘤之經遺傳修飾細胞。用於不活化用於本發明之腫瘤細胞之方法為此項技術中熟知的，諸如使用照射。
在一些實施例中，本發明之不活化腫瘤細胞經修飾以表現及分泌一或多種熱休克蛋白。例如，gp96-Ig融合蛋白可經表現及分泌以刺激免疫反應(Yamazaki等人,The Journal of Immunology,1999,163：5178-5182；Strbo等人,Immunol Res.2013年12月；57(1-3)：311-25)。在一些實施例中，該等不活化腫瘤細胞經修飾以表現及分泌gp96-Ig融合蛋白。
本發明之不活化腫瘤細胞與一或多種共刺激分子或試劑一起投與至患者。較佳共刺激試劑包含一或多種刺激樹突狀細胞誘導、募集及/或成熟之細胞因子。用於分析該等共刺激試劑之方法為文獻中熟知的。DC之誘導及成熟典型地藉由在刺激之後諸如CD80及CD86之某些膜分子的增加之表現，及/或諸如IL-12及I型干擾素之促發炎細胞因子的分泌來分析。
在較佳實施例中，該等不活化腫瘤細胞自身經修飾以表現及分泌一或多種刺激樹突狀細胞誘導、募集及/或成熟之細胞因子。本發明以關於GM-CSF之使用的例示性術語描述。因此，舉例而言，腫瘤細胞可表現編碼GM-CSF之轉殖基因，如美國專利第5,637,483號、第5,904,920號、第6,277,368號及第6,350,445號以及美國專利公開案第20100150946號中所述。用於治療胰臟癌之表現GM-CSF之經遺傳修飾癌細胞或「表現細胞因子之細胞疫苗」之形式描述於美國專利第6,033,674號及第5,985,290號中。
可藉由該等不活化腫瘤細胞及/或除GM-CSF外或與GM-CSF一起由旁觀者細胞表現之其他合適細胞因子包括但不限於CD40配位體、FLT-3配位體、IL-12、CCL3、CCL20及CCL21中之一或多者。此清單不意謂限制性的。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段與意欲刺激對一或多種預定抗原之免疫反應的疫苗一起投與。該(等)抗原可直接地投與至個體，或可由例如可自體同源或同種異體之腫瘤細胞疫苗(例如GVAX)、樹突狀細胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、基於病毒之疫苗、細菌或酵母疫苗(例如單核球增多性李氏菌或釀酒酵母)等在個體內表現。參見例如Guo等人,Adv.Cancer Res.2013；119：421-475；Obeid等人,Semin Oncol.2015年8月；42(4)：549-561。可用於本發明之靶標抗原的實例在下表中列出。該靶標抗原亦可為包含該表中列出之抗原的免疫活性部分之片段或融合多肽。此清單不意謂限制性的。
表4.與如本文所述之本發明抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段組合使用之抗原的清單
此項技術中已知適用抗原之其他生物體包括但不限於沙眼披衣菌、釀膿鏈球菌(A組鏈球菌)、無乳鏈球菌(B組鏈球菌)、肺炎鏈球菌、金黃 色葡萄球菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍亂弧菌、沙門氏菌屬(包括傷寒、鼠傷寒)、腸道(包括幽門螺桿菌、福氏志賀桿菌及其他D組志賀桿菌屬)、鼻疽伯克氏菌、類鼻疽伯克氏菌、克雷白氏肺炎、梭菌屬(包括艱難梭菌)、腸炎弧菌及創傷弧菌。此清單不意謂限制性的。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)聯合一或多種抑制劑(例如小有機分子或抗體或其抗原結合片段)，諸如：雷帕黴素之哺乳動物靶標(MTOR)抑制劑、細胞毒性劑、鉑試劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、微管穩定劑、紫杉烷、CD20抑制劑、CD52抑制劑、CD30抑制劑、核因子κ-B之受體活化劑(RANK)抑制劑、核因子κ-B配位體之受體活化劑(RANKL)抑制劑、ERK抑制劑、MAP激酶抑制劑、AKT抑制劑、MEK抑制劑、PI3K抑制劑、HER1抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、Bcl2抑制劑、CD22抑制劑、CD79b抑制劑、ErbB2抑制劑或法呢基蛋白轉移酶抑制劑。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)聯合以下任何一或多者：13-順-視網酸、3-[5-(甲基磺醯基哌啶甲基)-吲哚基]-喹啉酮、4-羥基他莫昔芬、5-去氧尿苷、5'-去氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、7-羥基星形孢菌素、A-443654、乙酸阿比特龍、白蛋白結合型紫杉醇、ABT-578、阿考比芬、ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺、阿米斯丁、胺基格魯米特、胺柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、血管生長抑素、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬、AS-252424、AS-605240、天冬醯胺酶、AT-9263、阿曲生坦、阿西 替尼、AZD1152、卡介苗(BCG)、巴他布林、BC-210、白索多托(besodutox)、貝伐單抗、比卡魯胺、Bio111、BIO140、博來黴素、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米、布舍瑞林、白消安、骨化三醇、喜樹鹼、卡奈替尼、截瘤達錠、卡鉑、卡莫司汀、CC8490、西地尼布、CG-1521、CG-781、氯林可黴素、苯丁酸氮芥、氯毒素、西侖吉肽、甲腈咪胍、順鉑、克拉曲濱、氯膦酸鹽、COL-3、CP-724714、環磷醯胺、環丙孕酮、乙酸環丙孕酮、阿糖胞苷(cytarabine/cytosinearabinoside)、達卡巴嗪、達諾司他、放線菌素、達妥珠單抗、達努塞替、達沙替尼、道諾黴素、迪卡他尼、魚藤素、地尼介白素、去氧柯福黴素、酯肽、二芳基丙腈、己烯雌酚、狄提拓(diftitox)、多西他賽、多韋替尼、阿黴素、屈洛昔芬、埃朵特克啉、釔-90標記之依多曲肽、依多曲肽、EKB-569、EMD121974、內皮抑素、恩雜魯胺、恩紮妥林、表阿黴素、埃博黴素B、ERA-923、Erbitux、厄洛替尼、雌二醇、雌莫司汀、依託泊苷、依維莫司、依西美坦、非妥珠單抗、非那雄胺、夫拉平度、氟尿苷、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睾酮、氟他胺、FOLFOX方案、氟維司瓊、咖樂特彤(galeterone)、吉非替尼、吉西他濱、吉馬替康、戈舍瑞林、乙酸戈舍瑞林、棉酚、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羥孕酮、羥基脲、IC87114、艾達黴素、艾多昔芬、異環磷醯胺、IM862、伊馬替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干擾素、介白素-12、伊匹單抗、伊立替康、JNJ-16241199、酮康唑、KRX-0402、拉帕替尼、拉索昔芬、來曲唑、甲醯四氫葉酸、亮丙瑞林、乙酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂質體包裹太平洋紫杉醇、洛莫司汀、洛那法尼、硫蒽酮、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、 馬立馬司他、二氯甲基二乙胺、乙酸甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司鈉、胺甲喋呤、光神黴素、絲裂黴素、米托坦、米托蒽醌、陶紮色替、MLN8054、諾司達、諾拉替尼、紐迪(neuradiab)、尼洛替尼、尼魯提米、諾拉曲塞、NVP-BEZ235、奧利默森、奧曲肽、奧法木單抗、奧戈伏單抗、奧特羅那、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕博西尼、帕米膦酸鹽、帕尼單抗、帕唑帕尼、PD0325901、PD184352、PEG-干擾素、培美曲塞、噴司他丁、哌立福辛、苯丙胺酸氮芥、PI-103、皮提里斯(pictilisib)、PIK-75、哌噴昔芬、PKI-166、普卡黴素、卜吩姆、潑尼松、甲基苄肼、黃體素、PX-866、R-763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷佐生、地磷莫司、利妥昔單抗、羅米地辛、RTA744、魯比替康、斯瑞泰德、Sdx102、塞利西利、司美替尼、司馬尼布、SF1 126、西羅莫司、SN36093、索拉非尼、螺內酯、角鯊胺、SR13668、鏈脲黴素、SU6668、N-辛二醯基苯胺異羥肟酸、舒尼替尼、合成雌激素、他侖帕奈、拉他莫金(talimogene laherparepvec)、他莫昔芬、替莫唑胺、坦西莫司、替尼泊苷、替米利芬、睪酮、粉防己鹼、TGX-221、沙利度胺、硫鳥嘌呤、噻替哌、替西木單抗、替吡法尼、替沃紮尼、TKI-258、TLK286、拓撲替康、檸檬酸托瑞米芬、曲貝替定、曲妥珠單抗、維甲酸、曲古抑菌素A、磷酸曲西立濱單水合物、羥萘酸曲普瑞林、TSE-424、尿嘧啶氮芥、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、瓦他拉尼、VEGF trap、長春花鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱、維他辛、維特斯朋、伏立諾他、VX-745、渥曼青黴素、Xr311、紮木單抗、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)聯合一或多種止嘔劑，包括但不限於： 卡索匹坦(GlaxoSmithKline)、奈妥匹(MGI-Helsinn)及其他NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊(由MGI Pharma作為Aloxi售出)、阿瑞匹坦(由Merck and Co.；Rahway,NJ作為Emend售出)、苯海拉明(由Pfizer；New York,NY作為Benadryl®售出)、羥嗪(由Pfizer；New York,NY作為Atarax®售出)、甲氧氯普胺(由AH Robins Co,；Richmond,VA作為Reglan®售出)、勞拉西泮(由Wyeth；Madison,NJ作為Ativan®售出)、阿普唑侖(由Pfizer；New York,NY作為Xanax®售出)、氟哌啶醇(由Ortho-McNeil；Raritan,NJ作為Haldol®售出)、氟哌利多(Inapsine®)、屈大麻酚(由Solvay Pharmaceuticals,Inc.；Marietta,GA作為Marinol®售出)、地塞米松(由Merck and Co.；Rahway,NJ作為Decadron®售出)、甲潑尼龍(由Pfizer；New York,NY作為Medrol®售出)、丙氯拉嗪(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC作為Compazine®售出)、格拉司瓊(由Hoffmann-La Roche Inc.；Nutley,NJ作為Kytril®售出)、昂丹司瓊(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC作為Zofran®售出)、多拉司瓊(由Sanofi-Aventis；New York,NY作為Anzemet®售出)、托烷司瓊(由Novartis；East Hanover,NJ作為Navoban®售出)。
癌症治療之其他副作用包括紅血球及白血球缺乏。因此，在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)聯合治療或預防該缺乏之試劑，諸如非格司亭、PEG-非格司亭、促紅細胞生成素、阿法依伯汀或阿法依泊汀。
在本發明之一實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)與抗癌輻射療法聯合投與。例如，在本發明之一實施例中，該輻射療法為外部光束療法(EBT)：一種用於將高能X 射線之光束遞送至腫瘤位置之方法。該光束在患者外部產生(例如，藉由線性加速器)且靶向腫瘤位點。此等X射線可破壞癌細胞且謹慎治療計劃允許不傷害周圍正常組織。並無放射性來源置於患者之身體內部。在本發明之一實施例中，該輻射療法為質子束療法：一種類型之用質子替代X射線來轟擊患病組織之適形療法。在本發明之一實施例中，該輻射療法為適形外部光束輻射療法：一種使用先進技術使輻射療法適應個體之身體結構的程序。在本發明之一實施例中，該輻射療法為近程療法：放射性材料短暫置於身體內，通常用於向區域中給出額外輻射劑量或增強。
在本發明之一實施例中，可聯合本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)應用之手術程序為手術腫瘤切除術。
術語「聯合」指示在本發明方法中投與之組分(例如本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)連同派姆單抗)可經調配成用於同時遞送之單一組合物或獨立地調配成兩種或兩種以上組合物(例如套組)。各組分可在不同於投與另一組分之時間投與至個體；例如，各投與可在一段既定時期內非同時地(例如獨立地或依序地)以數種時間間隔給予。此外，該等獨立組分可藉由相同或藉由不同途徑投與至個體。
實驗及診斷用途
本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)可用作親和力純化試劑。在此過程中，該等抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段使用此項技術中熟知之方法固定於諸如Sephadex、玻璃或瓊脂糖樹脂或濾紙之固相上。經固定抗體或片段與含有欲純化之CTLA-4蛋白(或其片段)之 樣品接觸，且其後支撐物用合適溶劑洗滌，該溶劑將移除樣品中除CTLA-4蛋白以外之實質上所有材料，該CTLA-4蛋白結合於經固定抗體或片段。最後，支撐物用溶離該結合之CTLA-4(例如蛋白A)的溶劑洗滌。該等經固定抗體及片段形成本發明之一部分。進一步提供用於產生二次抗體之抗原，該等二次抗體例如適用於執行免疫印跡及本文所論述之其他免疫分析。
抗CTLA-4抗體(例如人類化抗體)及其抗原結合片段亦可適用於針對CTLA-4蛋白之診斷分析，例如偵測其在特定細胞、組織或血清中之表現，例如腫瘤細胞，諸如黑色素瘤細胞。該等診斷方法可適用於多種疾病診斷。
本發明包括ELISA分析(酶聯免疫吸附劑分析)，其併入本文所揭示之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)之使用。
例如，該方法包含以下步驟：(a)用抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段塗佈基板(例如，微量滴定板孔之表面，例如塑膠板)；(b)將欲測試CTLA-4存在之樣品應用於該基板；(c)洗滌該板，使得樣品中之未結合材料經移除；(d)應用亦對CTLA-4抗原具特異性之可偵測標記抗體(例如酶聯抗體)；(e)洗滌該基板，使得未結合、經標記抗體經移除；(f)若該等經標記抗體進行酶聯，則應用由該酶轉化為螢光信號之化學品；及 (g)偵測經標記抗體之存在。與基板締合之標記的偵測指示了CTLA-4蛋白之存在。
在另一實施例中，該經標記抗體或其抗原結合片段用過氧化酶標記，該過氧化酶與ABTS(例如2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺反應以產生可偵測之色變。或者，該經標記抗體或片段用可偵測放射性同位素(例如3H)標記，該可偵測放射性同位素可在閃爍體存在下藉由閃爍計數器偵測。
本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)可用於免疫印跡或免疫-蛋白印跡程序。該程序形成本發明之一部分且包括例如：
(1)視情況使用此項技術中已知之方法(例如半乾印跡或槽印跡)將來自欲測試CTLA-4存在之樣品的蛋白(例如來自樣品中該等蛋白之PAGE或SDS-PAGE電泳分離)轉移至膜或其他固體基板上；使欲測試結合之CTLA-4或其片段之存在的膜或其他固體基板與本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段接觸。該膜可採用硝基纖維素或基於乙烯基(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))之膜的形式，欲在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)凝膠或十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中測試CTLA-4存在之蛋白已轉移至該膜上(例如，在凝膠中之電泳分離之後)。在使該膜與該抗CTLA-4抗體或片段接觸之前，該膜視情況例如用脫脂乳粉或其類似物阻斷以便結合該膜上之非特異性蛋白結合位點。
(2)洗滌該膜一或多次以移除未結合抗CTLA-4抗體或片段及其他未結合物 質；及
(3)偵測結合之抗CTLA-4抗體或片段。經結合抗體或片段之偵測指示了該CTLA-4蛋白存在於該膜或基板上及樣品中。經結合抗體或片段之偵測可藉由使該抗體或片段與二次抗體(抗免疫球蛋白抗體)結合及接著偵測該二次抗體之存在，該二次抗體可經可偵測標記。
本文所揭示之抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可用於免疫組織化學。該方法形成本發明之一部分且包含例如(1)使欲測試CTLA-4蛋白之存在的細胞(例如腫瘤細胞，諸如黑色素瘤細胞)與本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段接觸；及(2)偵測細胞上或細胞中之該抗體或片段。
若該抗體或片段自身可經可偵測標記，則其可直接地加以偵測。或者，該抗體或片段可藉由經偵測之經可偵測標記二次抗體結合。
本文所揭示之某些抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)亦可用於活體內腫瘤成像。該方法可包括將經放射性標記抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段注射至欲測試與CTLA-4表現有關之腫瘤的存在之患者的身體中(例如，其表現例如腫瘤浸潤性淋巴細胞上之CTLA-4)，隨後使患者的身體核成像以偵測例如在結合於腫瘤之包含高濃度的該抗體或片段之基因座處該經標記抗體或片段之存在。該基因座之偵測指示了腫瘤中CTLA-4+細胞之存在。
成像技術包括SPECT成像(單一光子發射電腦斷層掃描)或PET 成像(正電子發射斷層掃描)。標記包括例如碘-123(123I)及鍀-99m(99mTc)，例如與SPECT成像一起，或11C、13N、15O或18F，例如與PET成像一起，或銦-111(參見例如Gordon等人,(2005)International Rev.Neurobiol.67：385-440)。
醫藥組合物及投與
為了製備本發明之抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)的醫藥或無菌組合物，該抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences及U.S.Pharmacopeia：National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。
治療劑及診斷劑之調配物可藉由與可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合呈例如凍乾粉末、漿液、水溶液或懸浮液之形式而製備(參見例如Hardman等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms： Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
單獨或與另一治療劑組合投與之本發明抗體的毒性及治療功效 可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如用於測定LD50(該群體之50%致死的劑量)及ED50(在治療上在該群體之50%中有效的劑量)。毒性與治療效應之間的劑量比率為治療指數(LD50/ED50)。自此等細胞培養物分析及動物研究獲得之資料可用於闡明用於人類之劑量範圍。該等化合物之劑量較佳地位於循環濃度之範圍內，該等循環濃度包括ED50而幾乎無毒性。該劑量可在此範圍內變化，視所用劑型及投與途徑而定。
在另一實施例中，另一治療劑根據Physicians' Desk Reference 2003(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))聯合本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)投與至個體。
投與模式可變化。投與途徑包括經口、直腸、經黏膜、腸、非經腸；肌肉內、皮下、皮內、髓內、鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、眼內、吸入、吹入、表面、皮膚、經皮或動脈內。
在特定實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可藉由侵入途徑，諸如藉由注射投與。在本發明之其他實施例中，抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物經靜脈內、皮下、肌肉內、動脈內、腫瘤內或藉由吸入、氣霧劑遞送投與。藉由非侵入途徑(例如經口；例如在丸劑、膠囊或錠劑中)投與亦在本發明之範圍內。
本發明提供包含本發明抗體或抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)或其醫藥組合物中任一者之容器(例如塑膠或玻璃小瓶，例如具有帽，或層析管柱、空心針或注射器圓筒)。本發明亦提供包含本發明抗體或抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)或其醫藥組合物中任一者之 注射器件。注射器件為經由非經腸途徑，例如肌肉內、皮下或靜脈內將物質引入至患者身體中之器件。例如，注射器件可為注射器(例如預填充有醫藥組合物，諸如自動注射器)，其例如包括用於容納欲注射之流體(例如抗體或片段或其醫藥組合物)的圓筒或桶、用於刺穿皮膚及/或血管以注射該流體之針；及用於自該圓筒中推出該流體且通過針孔之插塞。在本發明之一實施例中，包含本發明抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物之注射器件為靜脈內(IV)注射器件。該器件包括在可連接至管之套管或套管針/針中之抗體或片段或其醫藥組合物，該管可連接至用於容納流體(例如生理食鹽水；或包含NaCl、乳酸鈉、KCl、CaCl2且視情況包括葡萄糖之乳酸林格溶液)之袋或儲器，該流體經由該套管或套管針/針引入至患者身體中。在本發明之一實施例中，一旦該套管針及套管插入至個體之靜脈中且該套管針自經插入之套管移出，該抗體或片段或其醫藥組合物可經引入至該器件中。該IV器件可例如插入至外周靜脈(例如在手或臂中)；上腔靜脈或下腔靜脈中，或心臟之右心房(例如中樞IV)內；或鎖骨下靜脈、頸內靜脈或股靜脈中且例如朝向心臟推進直至其到達上腔靜脈或右心房(例如中樞靜脈管道)。在本發明之一實施例中，注射器件為自動注射器；射流泵或外部輸注泵。射流泵使用高壓狹窄液體射流，其穿透表皮以將該抗體或片段或其醫藥組合物引入至患者之身體。外部輸注泵為將控制量之該抗體或片段或其醫藥組合物遞送至患者之身體中的醫學器件。外部輸注泵可以電學方式或以機械方式驅動。不同泵以不同方式操作，例如注射泵將流體容納於注射器之儲器中，且可移動活塞控制流體遞送，彈性泵將流體容納於可延伸氣球儲器中，且來自該氣球之彈性壁的壓力驅動流體遞送。在蠕動泵中，輥筒之集合在可 撓性管之長度上向下夾持，從而推動流體向前。在多通道泵中，流體可以多種速率自多個儲器遞送。
本文所揭示之醫藥組合物亦可用無針皮下注射器件投與；諸如美國專利第6,620,135號；第6,096,002號；第5,399,163號；第5,383,851號；第5,312,335號；第5,064,413號；第4,941,880號；第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之器件。該等包含該醫藥組合物之無針器件亦為本發明之一部分。本文所揭示之醫藥組合物亦可藉由輸注投與。用於投與該等醫藥組合物之熟知植入物及模塊之實例包括以下所揭示之彼等：美國專利第4,487,603號，其揭示用於以控制速率分配藥物之可植入微量輸注泵；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示用於持續藥物遞送之可變流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多腔室隔室之滲透藥物遞送系統。多種其他該等植入物、遞送系統及模塊為熟習此項技術者熟知的且包含本發明之醫藥組合物的彼等在本發明之範圍內。
或者，吾人可以局部而非全身性方式投與本發明之抗CTLA-4抗體或抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)，例如經由將該抗體或片段直接注射至腫瘤中。此外，吾人可在靶向例如腫瘤(例如，由免疫病理學表徵)之靶向藥物遞送系統中，例如在塗佈有組織特異性抗體之脂質體中投與該抗體或片段。該等脂質體將靶向患病組織且由患病組織選擇性地吸收。該等方法及脂質體為本發明之一部分。
投與方案取決於數種因素，包括治療抗體或抗原結合片段之血清或組織週轉率、症狀之水準、治療抗體之免疫原性及生物基質中靶標細 胞的可及性。較佳地，投與方案遞送充足治療抗體或片段以實現靶標疾病狀態之改良，同時使不良副作用降至最低。因此，所遞送之生物製劑的量部分地取決於特定治療抗體及所治療之病狀的嚴重程度。可獲得關於選擇治療抗體或片段之適當劑量的指導(參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(編)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
適當劑量之確定由臨床醫師，例如使用此項技術中已知或懷疑實現治療之參數或因素來作出。一般而言，該劑量以略微低於最佳劑量之量開始且其隨後以小增量增加直至相對於任何不良副作用實現所需或最佳效應。重要診斷量度包括例如發炎之症狀的彼等或所產生之發炎細胞因子之水準。一般而言，可需要將使用之生物製劑源於與治療所靶向之動物相同的物種，由此使對該試劑之任何免疫反應降至最低。在人類個體之情況下，例如，可需要人類化及全人類抗體。
本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)可藉由持續輸注，或藉由例如每日、每週1-7次、每週、每兩週、每月、 每兩個月、每季、每半年、每年等投與之劑量提供。劑量可例如靜脈內、皮下、經表面、經口、經鼻、經直腸、肌肉內、腦內、脊椎內或藉由吸入提供。總每週劑量一般為至少0.05μg/kg體重，更一般為至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更高(參見例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：151-144)。亦可提供劑量以在個體之血清內實現抗CTLA-4抗體之預定靶標濃度，諸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更高。在其他實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體例如皮下或靜脈內，每週、每兩週、「每4週」、每月、每兩個月或每季以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/個體投與。
如本文所用，術語「有效量」係指當單獨或與額外治療劑組合投與至細胞、組織或個體時有效引起疾病(例如癌症或癌症之進展)之一或多種症狀的可量測改良之本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A及其人類化形式)的量。有效劑量進一步係指該抗體或片段足以導致症狀之至少部分改善(例如腫瘤收縮或消除、腫瘤生長之缺乏、增加之存活時間)的彼量。當向個體應用單獨投與之活性成分時，有效劑量係指單獨彼成分。當應用組合時，有效劑量係指引起治療效應之活性成分的組合量，無論組合、依序或同時投與。有效量之治療劑將引起診斷量度或參數之改良達至少10%；通常至少20%；較佳地至少約30%；更佳地至少40%，且最佳地至少50%。有效量亦可在主觀量度用於分析疾病嚴重程度之情況下引起 主觀量度之改良。
套組
進一步提供包含一或多種組分之套組，該一或多種組分包括但不限於如本文所論述之抗CTLA-4抗體或抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)聯合一或多種額外組分，包括但不限於如本文所論述之醫藥學上可接受之載劑及/或治療劑。該抗體或片段及/或該治療劑可經調配為純組合物或與醫藥學上可接受之載劑組合調配於醫藥組合物中。
在一實施例中，該套組包括在一容器中(例如，在無菌玻璃或塑膠小瓶中)的本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)及在另一容器中(例如，在無菌玻璃或塑膠小瓶中)的其醫藥組合物及/或治療劑。在另一實施例中，該套組包含在單一、常見容器中之本發明組合，包括本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如人類化27A)連同醫藥學上可接受之載劑，視情況與一或多種治療劑組合一起經調配，視情況調配於醫藥組合物中。
若該套組包括用於非經腸投與至個體之醫藥組合物，則該套組可包括用於執行該投與之器件。例如，該套組可包括一或多個皮下注射針或如上文所論述之其他注射器件。
該套組可包括包裝插頁，其包括關於該套組中之醫藥組合物及劑型的資訊。一般而言，該資訊幫助患者及醫師有效地且安全地使用經密封之醫藥組合物及劑型。例如，關於本發明組合之以下資訊可在插頁中提供：藥物動力學、藥效學、臨床研究、功效參數、適應症及用法、禁忌症、 警告、防範、有害反應、藥劑過量、適當劑量及投與、如何提供、適當儲存條件、參考、製造商/經銷商資訊及患者資訊。
偵測套組及治療套組
為方便起見，本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段(例如抗體27A或其人類化形式)可以套組提供，亦即預定量之試劑與用於執行該診斷或偵測分析之說明書的經包裝組合。在該抗體或片段經酶標記之情況下，該套組將包括由該酶所需之受質及輔因子(例如提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體)。另外，可包括其它添加劑，諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或溶解緩衝液)及其類似物。多種試劑之相對量可廣泛地變化以提供實質上最佳化該分析之靈敏度的試劑在溶液中之濃度。特定言之，該等試劑可以乾粉形式提供，通常經凍乾，包括在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液的賦形劑。
亦提供診斷或偵測試劑及用於多種偵測分析之包含一或多種該等試劑的套組，該等分析包括例如免疫分析，諸如ELISA(夾心型或競爭形式)。當使用該套組時，該套組之組分可預連接至固體支撐物，或可應用於固體支撐物之表面。在本發明之一些實施例中，信號產生構件可與本發明抗體或片段預締合或可需要在使用之前與一或多種組分組合，例如緩衝液、抗體-酶結合物、酶受質或其類似物。套組亦可包括額外試劑，例如用於減少與固相表面之非特異性結合的阻斷試劑、洗滌試劑、酶受質及其類似物。該固相表面可呈管、珠粒、微量滴定板、微球或適用於固定蛋白、肽或多肽之其他材料的形式。在特定態樣中，催化化學發光或發色產物之形成或化學發光或發色受質之還原的酶為信號產生構件之組分。該等酶為 此項技術中熟知的。套組可包含任何本文所述之捕捉試劑及偵測試劑。視情況，該套組亦可包含用於進行本發明方法之說明書。
亦提供一種套組，其包含在諸如小瓶或瓶之容器中包裝的抗CTLA-4抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段，且進一步包含連接至該容器或與該容器一起包裝的標籤，該標籤描述該容器之內含物且提供關於該容器之內含物用於治療如本文所述之一或多種疾病狀態的用途之適應症及/或說明書。
在一態樣中，該套組用於治療癌症且包含抗CTLA-4抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段及另一治療劑或疫苗。該套組可視情況進一步包括用於非經腸(例如靜脈內)投與之注射器。在另一態樣中，該套組包含抗CTLA-4抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段及連接至該容器或與該容器一起包裝的標籤，該標籤描述該抗體或片段與該疫苗或另一治療劑一起之用途。在另一態樣中，該套組包含該疫苗或另一治療劑及連接至該容器或與該容器一起包裝的標籤，該標籤描述該疫苗或另一治療劑與抗CTLA-4抗體或片段一起之用途。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體及疫苗或另一治療劑在獨立小瓶中或一起組合於同一醫藥組合物中。
如上文在組合療法部分中所論述，兩種治療劑之並行投與不需要該等試劑同時或藉由相同途徑投與，只要其中該等試劑發揮其治療效應之時期存在重疊即可。預期同時或依序投與，亦預期在不同天或週投與。
亦可製備本文所揭示之治療及偵測套組，其包含本文所揭示之抗體、肽、抗原結合片段或聚核苷酸中至少一者及關於使用該組合物作為偵測試劑或治療劑之說明書。用於該等套組之容器可典型地包含至少一個 小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他合適容器，一或多種偵測及/或治療組合物可置於其中，且較佳地合適地經等分。在亦提供第二治療劑之情況下，該套組亦可含有第二不同容器，此第二偵測及/或治療組合物可置於其中。或者，複數種化合物可製備於單一醫藥組合物中，且可包裝於單一容器構件中，諸如小瓶、燒瓶、注射器、瓶或其他合適單一容器。本文所揭示之套組亦將典型地包括用於依用於商業規模之嚴格限制容納該(等)小瓶之構件，諸如注射或吹塑模製塑膠容器，該(等)所需小瓶保持於其中。在該套組內包括放射性標記、發色、螢光生成或其他類型之可偵測標記或偵測構件的情況下，該標記試劑可作為偵測或治療組合物自身提供於同一容器中，或可替代地置於第二不同容器構件中，此第二組合物可置於其中且合適地經等分。或者，該偵測試劑及該標記可製備於單一容器構件中，且在大多數情況下，該套組亦將典型地包括用於依用於商業規模之嚴格限制容納該(等)小瓶及/或便利包裝及遞送之構件。
亦提供用於進行本文所述之偵測或監測方法之器件或裝置。該裝置可包括其中可輸入樣品之腔室或管，視情況包括閥或泵以引導樣品流動通過該器件之流體處置系統，視情況選用之過濾器以分離血漿或血清與血液，用於添加捕捉試劑或偵測試劑之混合腔室，及視情況選用之用於偵測結合於捕捉試劑免疫複合物的可偵測標記之量之偵測器件。樣品之流動可為被動的(例如藉由毛細管、流體靜力、或一旦應用樣品即無需進一步操縱該器件之其他力)或主動的(例如藉由應用經由機械泵、電滲透泵、離心力或增加之空氣壓力產生的力)，或藉由主動及被動力之組合。
在其他實施例中，亦提供處理器、電腦可讀記憶體、及儲存於 該電腦可讀記憶體上且經調試以在該處理器上執行以執行任何本文所述之方法的程序。合適計算系統、環境及/或組態之實例包括個人電腦、伺服器電腦、手持式或膝上型器件、多處理器系統、基於微處理器之系統、機上盒、可程式化消費電子器件、網路PC、小型電腦、大型電腦、包括任何上述系統或器件之分散式計算環境、或此項技術中已知之任何其他系統。
一般方法
分子生物學中之標準方法描述於Sambrook、Fritsch及Maniatis(1982及1989年第2版、2001年第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press,San Diego,CA)中。標準方法亦出現於Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述細菌細胞之選殖及DNA突變誘發(第1卷)、哺乳動物細胞及酵母之選殖(第2卷)、糖結合物及蛋白表現(第3卷)及生物資訊學(第4卷)。
用於蛋白純化之方法，包括免疫沉澱、層析、電泳、離心及結晶有所描述(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York)。化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白產生、蛋白糖基化有所描述(參見例如Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY，第16.0.5-16.22.17頁；Sigma-Aldrich,Co.(2001) Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.，第384-391頁)。多株及單株抗體之產生、純化及片段化有所描述(Coligan等人(2001)Current Protcols in Immunology，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow及Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow及Lane，同上)。可獲得用於表徵配位體/受體相互作用之標準技術(參見例如Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,New York)。
可製備單株、多株及人類化抗體(參見例如Sheperd及Dean(編)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann及Dubel(編)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow及Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，第139-243頁；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165：6205；He等人(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342：877-883；Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；美國專利第6,329,511號)。
人類化之替代方法在於在轉殖基因小鼠中使用在噬菌體或人類抗體文庫上呈現之人類抗體文庫(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1：837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15：146-156；Hoogenboom及Chames(2000)Immunol.Today 21：371-377；Barbas等人(2001)Phage Display：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17：397-399)。
單鏈抗體及雙功能抗體有所描述(參見例如Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：213-218；Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276：26285-26290；Hudson及Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231：177-189；及美國專利第4,946,778號)。雙功能抗體有所提供(參見例如Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15；Volkel等人(2001)Protein Engineering 14：815-823；Segal等人(2001)J.Immunol.Methods 248：1-6；Brennan等人(1985)Science 229：81-83；Raso等人(1997)J.Biol.Chem.272：27623；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Traunecker等人(1991)EMBO J.10：3655-3659；及美國專利第5,932,448號、第5,532,210號及第6,129,914號)。
雙特異性抗體亦有所提供(參見例如Azzoni等人(1998)J.Immunol.161：3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162：6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74：9115；Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275：38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276：12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165：2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17：875)。
抗原之純化並非抗體產生所必需。動物可用具有所關注抗原之細胞免疫。脾細胞可接著自經免疫動物分離，且該等脾細胞與骨髓瘤細胞株融合以產生融合瘤(參見例如Meyaard等人(1997)Immunity 7：283-290； Wright等人(2000)Immunity 13：233-242；Preston等人，同上；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。
抗體可結合至例如小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)。抗體適用於治療、針對、套組或其他目的，且包括偶合至例如染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠態金)之抗體(參見例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing及Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168：883-889)。
可獲得用於流式細胞術之方法，包括螢光活化細胞分選(FACS)(參見例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。可獲得適用於修飾核酸(包括核酸引子及探針、多肽及抗體)之螢光試劑，其用作例如診斷試劑(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
免疫系統之組織學的標準方法有所描述(參見例如Muller-Harmelink(編)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology：Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
可獲得用於確定例如抗原片段、前導序列、蛋白折疊、功能域、 糖基化位點及序列比對之套裝軟體及資料庫(參見例如GenBank,Vector NTI® Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；DeCypher®(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Apoplications Note 16：741-742；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。
實例
以下實例用於說明本發明。此等實例決不意欲限制本發明之範圍。
實例1：抗hCTLA-4抗體之免疫化及選擇
為了分離針對人類CTLA-4蛋白之抗體，小鼠用編碼hCTLA-4之表現構築體免疫。為了產生此構築體，編碼hCTLA-4之全長開放閱讀框之cDNA(NCBI參考序列：NM_005214.4，SEQ ID NO：35)次選殖至pCI-neo載體(Promega,Madison,WI)中。小鼠藉由基因槍免疫使用Helios基因槍(BioRad,Hercules,CA)及DNA塗佈之金子彈(BioRad)根據製造商之說明書免疫。簡言之，1μm金粒子經呈2：1：1比率之pCI-neo-CTLA-4 cDNA及用於小鼠Flt3L及小鼠GM-CSF之商業表現載體(均來自Aldevron,Fargo,ND)塗佈。總計1μg質體DNA用於塗佈500μg金粒子。特定言之，7-8週齡磁性BALB/C小鼠用基因槍在耳朵中免疫，兩隻耳朵均接收4個投與週期。近似地，在三次DNA免疫化之後在小鼠血清中藉由流式細胞術偵測1：125-625抗hCTLA-4效價。關於此篩選，使用CHO-K1細胞，其使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)經pCI-neo-CTLA-4構築體短暫轉染。經轉染細胞培養隔夜且使用細胞解離溶液(Sigma)獲得後續單一細胞懸浮液。7,5×105個細胞在4℃下用經稀釋小鼠血清之各樣品培育30分鐘。接著，細胞用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)/2%胎牛血清(FBS)洗滌且在4℃下用FITC標記之山羊抗小鼠IgG(BD Pharmingen)染色持續30分鐘。細胞再次用PBS/2% FBS洗滌，隨後懸浮於PBS/2% FBS中且抗體結合細胞基於其FITC標記進行偵測，藉由流式細胞術(FACS Canto II；BD Biosciences)進行分析。證實針對hCTLA-4之反應性之小鼠最終、第四次經免疫且四天後處死。如先前所述(Steenbakkers等人，1992,J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-134)製備紅血球缺乏之脾及淋巴結細胞群體且在-140℃下冷凍。
出於B細胞選擇及CELISA目的，藉由用編碼突變型hCTLA-4 cDNA(Y166G及Y183G，SEQ ID NO：37)之pCI-neo載體轉染CHO-K1細胞(American Type Culture Collection)來產生CHO-K1.hCTLA-4穩定細胞株。藉由限制稀釋獲得穩定純系。
為了選擇產生抗hCTLA-4抗體之B細胞，設計且開發選擇策略，其優先結合表現結合於hCTLA-4之抗體之B細胞。自hCTLA-4免疫小鼠收集脾細胞及淋巴結且經分離細胞與在3,000 RAD下照射之CHO-K1.hCTLA-4細胞一起培育。1小時之後，使用培養基用多個洗滌步驟移除未結合細胞。隨後，用解離緩衝液收集具有結合之淋巴細胞之CHO-K1.hCTLA-4細胞。培養結合之B細胞，如由Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-134所述。簡言之，所選擇之B細胞與7.5%(v/v)T細胞上清液及50,000個經照射(2,500 RAD)之EL-4 B5飼養細胞在96孔平底組織培養板中以200μl培養基之 最終體積混合。在第八天，藉由如下文所述之CELISA針對hCTLA-4反應性篩選上清液。
CHO-K1.hCTLA-4細胞接種於組織培養板中之培養基(具有10%胎牛血清(Hyclone)及Pen/Strep(Gibco)之DMEM-F12(Gibco))中且在37℃、5% CO2及95%濕度下培養直至其匯合。隨後，移除培養基且細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下用來自B細胞培養物之上清液培育1小時。接著，細胞用PBS/0.05% Tween(PBST)洗滌且在37℃、5% CO2及95%濕度下用山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology)培育1小時。隨後，細胞用PBST洗滌3次且用TMB穩定之發色體(Invitrogen)目視檢查抗hCTLA-4免疫反應性。反應用0.5M H2SO4停止且在450及610nm下讀取吸光度。
另外，使用均相時間解析螢光(HTRF)分析形式評估上清液之hCTLA-4/hCD80相互作用阻斷。上清液與HTRF緩衝液(PBS/0.53M氟化鉀/0.1% BSA)中之生物素標記重組hCD80共培育。重組人類CTLA-4/Fc與偵測試劑抗生蛋白鏈菌素K(供體)及抗人類Fc D2(受體)組合添加。完全混合物在室溫(RT)下培育3小時且隨後在615及665nM之波長下使用Victor2讀取器(Perkin Elmer)量測螢光。hCTLA-4結合於hCD80在經設定為100%之此裝置中引起螢光信號。含有阻斷抗體之上清液降低螢光。
來自hCTLA-4反應性上清液之顯示阻斷hCTLA-4/hCD80相互作用之B細胞純系根據公開程序(Steenbakkers等人，1992,J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-34)藉由微型電融合永生化。簡言之，B細胞與電融合等滲緩衝液(Eppendorf)中之106個Sp2/0-Ag14骨髓瘤細胞混合。電融合在50μL融合腔室中藉由30s、1MHz、 15Vrms之交替電場，隨後10μs、3kV/cm之正方形、高場脈衝且再次藉由30s、1MHz、15Vrms之交替電場執行。該腔室之內含物轉移至融合瘤選擇培養基且在限制稀釋條件下接種於96孔板中。在第12天，在電融合之後，如上文所述針對hCTLA-4結合活性篩選融合瘤上清液。上清液中分泌結合hCTLA-4之抗體的融合瘤藉由限制稀釋經次選殖以保護其完整性及穩定性。穩定融合瘤在無血清培養基中培育7-10天；收集上清液且使用MabSelect Sure蛋白A樹脂根據製造商之說明書(GE Healthcare)純化抗體。使用分光光度法定量抗體濃度。融合瘤培養物之上清液用於使該等融合瘤同型。簡言之，使用小鼠單株抗體同型化套組(Biorad)基於具有固定於常見小鼠同型及輕鏈中每一者之山羊抗小鼠抗體色帶之量桿進行同型化。所回收之抗體均經鑒別為小鼠IgG1。抗體序列藉由使用以下方法對小鼠IgG1融合瘤材料之可變區測序來闡明：萃取融合瘤細胞之總RNA，其允許cDNA合成。執行cDNA末端之快速擴增(RACE)，其允許TOPO(ThermoFisher)載體中陽性片段之選殖。對TOPO純系測序且使用VBASE2(http：//www.vbase2.org)注釋序列。
在實驗中，結合及阻斷與10D1(US20020086014)或CP-675,206(WO2007113648)進行比較，其分別表現為人類IgG1 κ及IgG2 κ。編碼VH及VL構築體之質體藉由使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)根據製造商之說明書轉染至FreeStyle 293-F人類胚胎腎細胞(HEK293T/17,ATCC-CRL-11268)中而經短暫表現。7天後收集上清液(30ml)且使用MabSelect Sure蛋白A樹脂根據製造商之說明書(GE Healthcare)純化抗體。緩衝液使用Zeba去鹽管柱(Thermo Scientific)交換為10mM組胺酸、100mM NaCl pH 5.5緩衝液。基於 OD280(Nanodrop ND-1000)測定經純化抗體之濃度。藉由LAL-測試根據製造商之說明書(Lonza)測定內毒素水準。
hCTLA-4抗體針對結合於hCTLA-4、長尾獼猴(食蟹獼猴)CTLA-4及配位體結合(hCD80/hCD86)之阻斷加以表徵。接著，使用基於Jurkat之報告基因分析(Promega)，根據製造商之程序測定活體外功能性。簡言之，表現hCD80/hCD86之Raji細胞與穩定地表現膜CTLA-4及IL2-RE-螢光素酶報告基因之Jurkat T細胞共培育。向此混合物中添加小鼠抗人類CD3抗體(BD Pharmingen)及山羊抗小鼠IgG抗體(Thermo Fisher)，隨後為hCTLA-4小鼠抗體之稀釋範圍(在200μg/ml下開始及其稀釋)。在37℃、5% CO2及95%濕度下培育六小時之後，藉由添加Bio-GloTM受質(Promega)且使用Envision讀取器(Perkin Elmer)來偵測IL-2啟動子活性。如圖1所示，如與10D1相比，hCTLA4.27A更有效地增強IL-2啟動子。
實例2：人類化抗體設計及CDR移植
小鼠hCTLA4.27A抗體藉由CDR移植技術人類化(參見例如美國專利第5,225,539號及Williams,D.G.等人，2010,Antibody Engineering，第1卷，第21章)。
首先，使用IgBLAST(Ye J.等人，2013,Nucleic Acids Res.41：W34-40)鑒別人類生殖系序列。關於hCTLA4.27A VH人類生殖系序列，V-基因IGHV1-46*01經鑒別(62.2%一致性)且關於VL人類生殖系序列，IGKV1-NL1*01經鑒別(68.4%一致性)。此兩種生殖系序列用於直接地移植小鼠CDR，導致以下兩種cDNA構築體：SEQ ID NO：15(VH，編碼SEQ ID NO：16)及SEQ ID NO：27(VL，編碼SEQ ID NO：28)。接著，構建含有IMGT資料 庫(Lefranc,M.-P.等人，1999,Nucleic Acid Res.27：209-212)中可獲得之所有人類序列的資料庫，該IMGT資料庫鑒別82,958種個別序列。此等序列使用TBLASTN(2.2.30+)來查詢以鑒別模板序列，該等模板序列證明了與hCTLA4.27A VH及VL序列之構架的最高一致性。鑒別三種VH及三種VL序列，該等序列證明了70%或更高之相似性評分且呈現相似CDR長度，較佳地分別與hCTLA4.27A VH CDR1、CDR2、CDR3及VL CDR1、CDR2及CDR3中之彼等一致。
關於重鏈，選擇藉由GenBank(Benson,D.A.等人，2013,Nucleic Acids Res.41(D1)：D36-42)寄存# L39130、DI109259及DD431634編碼之構架作為用於hCTLA4.27A VH CDR的直接移植之模板，分別導致以下cDNA構築體：SEQ ID NO：9、11及13。關於輕鏈，選擇藉由GenBank寄存# AB063955、DI112350及AB363305編碼之構架作為用於hCTLA4.27A VL CDR的直接移植之模板，導致以下cDNA構築體：SEQ ID NO：21、23及25。構架及CDR定義為如由Kabat等人所述之彼等。為了研究人類化構架殘基對Fv之結構的影響，在Discovery Studio 4.5內使用『抗體模型化級聯』(預設參數)製得小鼠hCTLA4.27A Fv之同源性模型。該同源性模型基於PDB ID 3V7A建立。
該等CDR經電腦模擬移植以研究接近該等CDR中任一者且可能影響環構形之殘基(稱作標殘基)。可能影響環構形且在CDR表面之<5Å內之殘基經鑒別且在此位置處用小鼠胺基酸取代。使用Discovery Studio 4.5檢查所得模板中轉譯後修飾(PTM)基序之存在且在可能的情況下(亦即非CDR、非標殘基)發生改變以防止PTM。關於重鏈，hCTLA4.27A VH中預測序列 PTM基序及結構考慮(亦即，骨架之剛性)之移除導致兩種額外構築體的設計：SEQ ID NO：17及19。關於輕鏈，PTM移除導致以下構築體：SEQ ID NO：29。
CDR經移植於經鑒別模板中之每一者上，表現為pcDNA3.1(+)載體中選殖之人類IgG4(SEQ ID NO：50)、κ(SEQ ID NO：52)抗體且短暫轉染於HEK293自由式細胞中。產生人類化抗體之IgG4形式，具有穩定化Adair突變(Angal S.等人，1993,Mol Immunol.30：105-108)，其中絲胺酸228轉化為脯胺酸。
hCTLA4.27IgG1亦表現為pcDNA3.1(+)載體中選殖之人類IgG1(SEQ ID NO：48)、κ抗體(SEQ ID NO：52)且短暫轉染於HEK293自由式細胞中。編碼人類IgG1重鏈及輕鏈構築體之質體以1：1比率混合(總計1280μg)且藉由使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)根據製造商之說明書轉染於自由式293-F人類胚胎腎細胞(HEK293T/17，ATCC-CRL-11268)中而經短暫表現。7天後收集上清液(1250ml)且使用MabSelect Sure蛋白A樹脂根據製造商之說明書(GE Healthcare)純化hCTLA4.27IgG1。緩衝液使用Zeba去鹽管柱(Thermo Scientific)交換為10mM組胺酸、100mM NaCl pH 5.5緩衝液。基於OD280(Nanodrop ND-1000)測定經純化hCTLA4.27IgG1之濃度。
另外，小鼠hCTLA4.27A VH及VL(SEQ ID NO：32及34)表現為pcDNA3.1(+)載體中選殖之嵌合人類IgG1(hCTLA4.27A.C1)及IgG4(hCTLA4.27A.C4)、κ抗體且短暫轉染於HEK293自由式細胞中。
實例3：人類化構築體之合成、表現及純化
編碼重鏈及輕鏈構築體之質體以1：1比率混合(總計30μg)且藉由 使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)根據製造商之說明書轉染於自由式293-F人類胚胎腎細胞(HEK293T/17，ATCC-CRL-11268)中而經短暫表現。7天後收集上清液(30ml)且使用MabSelect Sure蛋白A樹脂根據製造商之說明書(GE Healthcare)純化抗體。緩衝液使用Zeba去鹽管柱(Thermo Scientific)交換為10mM組胺酸、100mM NaCl pH 5.5緩衝液。基於OD280(Nanodrop ND-1000)測定經純化抗體之濃度。藉由LAL-測試根據製造商之說明書(Lonza)測定內毒素水準。
實例4：人類化CTLA-4抗體之結合
人類化抗體與hCTLA-4之結合在CELISA形式中加以研究。CHO-K1.hCTLA-4細胞接種於組織培養板中之培養基(具有10%胎牛血清(Hyclone)及Pen/Strep(Gibco)之DMEM-F12(Gibco))中且在37℃、5% CO2及95%濕度下培養直至其匯合。隨後，移除培養基且細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下用經純化hCTLA-4抗體(10μg/ml及其稀釋)培育1小時。接著，細胞用PBS/0.05% Tween(PBST)洗滌且在37℃、5% CO2及95%濕度下用山羊抗人類IgG-HRP(Southern Biotechnology)或山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology)培育1小時。隨後，細胞用PBST洗滌3次且用TMB穩定之發色體(Invitrogen)目視檢查抗hCTLA-4免疫反應性。反應用0.5M H2SO4停止且在450及610nm下讀取吸光度。使用Graphpad Prism 6計算EC50值，即觀察到總結合信號之50%時所處之濃度。在表5中，描繪人類化hCTLA4.27抗體之EC50值。
表5：人類化hCTLA4.27抗體(親本及嵌合抗體)與CHO-K1.hCTLA-4細胞上表現之人類CTLA-4的結合。EC50值表示觀察到總 結合信號之50%時所處之濃度(自兩個獨立實驗之值計算平均值及SD)。
使用CHO-K1細胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA)確認hCTLA-4抗體結合於食蟹獼猴CTLA-4(SEQ ID NO：40)，該等細胞已經編碼食蟹獼猴CTLA-4之全長開放閱讀框的cDNA(SEQ ID NO：39)短暫轉染，該cDNA經次選殖至pCI-neo載體(Promega)中。CHO-K1.食蟹獼猴CTLA-4細胞接種於組織培養板中且在37℃、5% CO2及95%濕度下培育直至細胞層匯合。隨後，移除培養基且細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下用經純化hCTLA-4抗體(10μg/ml及其稀釋)培育1小時。接著，細胞用PBST洗滌 且在37℃下用山羊抗人類IgG-HRP(Jackson Immuno Research)培育1小時。隨後，細胞用PBST洗滌3次且用TMB穩定之發色體(Invitrogen)目視檢查抗CTLA-4免疫反應性。反應用0.5M H2SO4停止且在450及610nm下讀取吸光度。
藉由流式細胞術確認hCTLA4.27人類化抗體結合於人類CD3+ T細胞上表現之CTLA-4。人類CD3+ T細胞如下自人類膚色血球層分離。首先，該膚色血球層在室溫下用PBS稀釋至180ml之總體積。在混合細胞懸浮液之後，等分試樣裝載於Sepmate管(Stemcell Technologies)中之Ficoll-Paque Plus梯度上且在1200g下離心持續10min，在20℃下無中斷。接著，藉由抽吸移出血漿且自血漿/Ficoll界面回收PBMC。PBMC在PBS中洗滌三次。隨後，用磁性珠粒(CD3+ T細胞生物素-Ab混合液；Miltenyi Biotec)進行CD3+ T細胞分離。接著，T細胞用αCD3/αCD28塗佈之珠粒(Thermo Fisher Scientific)刺激48小時。首先，藉由使用流式細胞術偵測胚細胞形成來確認T細胞刺激。在用Cytofix/Cytoperm(BD)固定及滲透T細胞之後分析hCTLA4.27人類化抗體之結合。細胞在滲透/洗滌緩衝液(BD)中洗滌兩次，用hCTLA4.27人類化抗體培育，洗滌三次，且最終用FITC標記之山羊抗人類-hIgG偵測抗體(Southern Biotech)培育。在此標記程序之後，細胞洗滌兩次，再懸浮於FACS緩衝液中且藉由流式細胞術在FACS Canto II(BD)上進行分析。資料用Flowjo軟體處理及分析。
藉由流式細胞術確認hCTLA4.27人類化抗體結合於長尾獼猴(食蟹獼猴)PBMC上表現之CTLA-4。為此，食蟹獼猴血液用PBS 1：1稀釋且添加至含有13ml Lymphoprep 95%/PBS 5%之50ml管中。細胞在450g及20℃ 下離心持續30分鐘而無中斷。接著，藉由抽吸移出血漿且自血漿/Ficoll界面回收PBMC。PBMC在PBS中洗滌兩次。細胞在液氮中冷凍且在實驗當天自冷凍器取回。由於CTLA-4在靜止免疫細胞上之內源表現低，經解凍PBMC用αCD3/αCD28/αCD2塗佈之珠粒(Milteny Biotec)刺激48小時。隨後，藉由使用流式細胞術偵測胚細胞形成來確認PBMC之刺激。接著，藉由流式細胞術針對hCTLA4.27抗體之細胞內結合分析細胞。
實例5：藉由人類化hCTLA4.27抗體阻斷hCD80結合於hCTLA-4
在CELISA形式中針對全組人類化hCTLA4.27抗體分析hCD80阻斷。CHO-K1.hCTLA-4細胞接種於組織培養板中且在37℃、5% CO2及95%濕度下在培養基中培育。一旦該等細胞匯合，移除培養基且細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下用人類化hCTL4.27抗體變異體(10μg/ml及其稀釋)培育1小時。接著，細胞用PBS/0.05% Tween-20(PBST)洗滌且在37℃、5% CO2及95%濕度下用生物素標記之重組hCD80/Fc-蛋白培育1小時。細胞接著用PBST洗滌，隨後在細胞上添加抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物，其在37℃、5% CO2及95%濕度下培育1小時。隨後，細胞用PBST洗滌三次且用TMB穩定之發色體(Invitrogen)目視檢查hCD80/Fc-蛋白之結合。反應用0.5M H2SO4停止且在450及610nm下讀取吸光度。自此資料計算針對hCD80阻斷之IC50值且在表6中闡明。IC50值表示觀察到一半抑制時所處之濃度。
表6：藉由人類化hCTLA4.27抗體(親本及嵌合抗體)阻斷hCD80結合。IC50值表示觀察到一半抑制時所處之濃度(自兩個獨立實驗之值計算平均值及SD)。
實例6：與10D1(伊匹單抗)及CP-675,206(替西木單抗)相比hCTLA4.27親和力、結合於hCTLA-4及其阻斷hCD80/hCD86相互作用之能力
使用生物光干涉術在Octet RED96上剖繪hCTLA4.27結合動力學及平衡結合常數且與此項技術中已知之數種抗體進行比較。首先，使用標準胺化學使抗hCTLA-4 mAb偶合於胺反應性二代生物感測器(Fortebio)。接著在多種hCTLA-4濃度下觀察該等生物感測器之hCTLA-4結合及解離。胺反應性生物感測器藉由將其浸入含有0.1M MES pH=5.5之孔中持續10分鐘預 潤濕。該等生物感測器接著使用0.1M NHS/0.4M EDC混合物活化持續5分鐘。抗體藉由將該等生物感測器浸入2.5或12ug/mL抗體於0.1M MES中之溶液中持續7.5分鐘而經偶合。生物感測器表面使用1M乙醇胺之溶液淬滅持續5分鐘。生物感測器在Octet動力學緩衝液(ForteBio)中平衡持續5分鐘。藉由將該等生物感測器置於含有多種rhCTLA-4/Fc濃度(2.5-40nM)之孔中且監測干涉術持續15分鐘而觀察到rhCTLA-4/Fc(R&D Systems)之締合。在將該等生物感測器轉移至動力學緩衝液中且監測干涉術信號持續45分鐘之後量測解離。該分析用30℃之板溫度運行。所觀察到之締合及解離速率(kon及kdis)使用包含所測試之所有濃度的1：1結合全擬合模型進行擬合，且計算平衡結合常數KD。如表7所示：hCTLA4.27具有與對照抗體相似之結合親和力。
接著，hCTLA4.27抗體與hCTLA-4之結合及其阻斷hCD80/hCD86相互作用之能力在CELISA形式中與10D1及CP-675,206進行比較。簡言之，對CHO-K1.hCTLA-4細胞執行針對hCTLA-4結合之CELISA。結合抗體之偵測分別關於小鼠hCTLA4.27A用山羊抗小鼠IgG HRP(Southern Biotech)且關於hCTLA4.27A嵌合hIgG1及hIgG4及對照抗體用山羊抗人類IgG-HRP(Southern Biotech)進行。關於hCD80及hCD86阻斷之分析， CHO-K1.hCTLA-4細胞接種於組織培養板中且在37℃、5% CO2及95%濕度下在培養基中培育。一旦該等細胞匯合，移除培養基且細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下用hCTL4.27抗體及對照抗體(10μg/ml及其稀釋)培育1小時。接著，細胞用PBS/0.05% Tween-20(PBST)洗滌且在37℃、5% CO2及95%濕度下用生物素標記之重組hCD80/Fc-蛋白或hCD86/Fc蛋白培育1小時。細胞接著用PBST洗滌，隨後在細胞上添加抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物，其在37℃、5% CO2及95%濕度下培育1小時。隨後，細胞用PBST洗滌三次且用TMB穩定之發色體(Invitrogen)目視檢查hCD80/Fc-蛋白或hCD86/Fc-蛋白之結合。反應用0.5M H2SO4停止且在450及610nm下讀取吸光度。IC50值表示觀察到一半抑制時所處之濃度。
如圖2中所描繪，hCTLA4.27IgG1及hCTLA4.27IgG4抗體之hCD80阻斷型態位於伊匹單抗與替西木單抗之hCD80型態之間。因此，儘管IC50值可相當，功效平台區不同。
實例7：人類PBMC SEB分析中人類化hCTLA4.27抗體之 功能性
為了確認原代免疫細胞中人類化hCTLA4.27之功能性，自人類供體血液之膚色血球層分離PBMC。首先，該膚色血球層在室溫下用PBS稀釋且混合至180ml之總體積。等分試樣裝載於Sepmate管(Stemcell Technologies)中之Ficoll-Paque Plus梯度上且在1200g下離心持續10min，在20℃下無中斷。接著，藉由抽吸移出血漿且自血漿/Ficoll界面回收PBMC。PBMC在PBS中洗滌三次，接著用於該分析。PBMC以每孔2×105個細胞接種。隨後，人類化hCTLA4.27及對照抗體稀釋於補充有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基(Gibco)中且以平方根10個稀釋步驟以在100ug/ml下開始之濃度範圍添加。以10μg/m1之濃度添加稀釋於補充有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中的葡萄球菌腸毒素B(Sigma)。板在37℃、5% CO2及95%濕度下培育七十二小時，隨後分離上清液。
在上清液中偵測作為免疫活化之量度的IL-2分泌。藉由離心自任何細胞材料清除上清液且添加至Nunc maxisorp ELISA板中，該等板已藉由在4℃下培育16小時之最短時期經PBS中之抗hIL-2抗體(BD Pharmingen)塗佈。在添加上清液之前，孔排空且在室溫(RT)下用PBS/1%BSA阻斷持續一小時。上清液在RT下在抗hIL-2塗佈之板中培育一小時，之後板用PBST(PBS，具有0.05% Tween 20)洗滌三次。隨後，在PBST/0.5%BSA中添加0.5μg/ml抗hIL2-生物素(BD Pharmingen)且在RT下培育一小時。在用PBST洗滌三次之後，在PBST/0.5% BSA中添加1：5000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP(BD Pharmingen)。在用PBST洗滌六次之後，藉由添加TMB穩定之發色體(Invitrogen)偵測IL-2。反應用0.5M H2SO4停止且在450及610nm下讀取吸光 度。在此分析中，重組人類IL-2(Sigma)用作參考物以定量上清液中之IL-2蛋白水準。圖3示出hCTLA4.27抗體增強免疫活化。
實例8：效應子功能分析中之hCTLA4.27
研究嵌合hCTLA4.27A抗體：hCTLA4.27A.C1及hCTLA4.27A.C4誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)之能力。關於ADCC分析，人類NK細胞用作效應子細胞。NK細胞自人類血液分離。用Rosette SEP NK富集混合液(Stemcell Technologies)針對NK細胞富集膚色血球層。隨後，膚色血球層與PBS/2% FBS 1：1混合且在Ficol Paque plus(GE Healthcare)上分層。在離心之後，收集中間相且用PBS/2% FBS洗滌細胞。藉由流式細胞術表徵經分離NK細胞確認了CD16及CD56表現。
CHO-K1.hCTLA-4用作靶標細胞且與NK細胞一起以10：1之效應子：靶標比率接種於平底細胞培養板中。添加hCTLA4.27抗體或對照抗體(10D1或同型匹配對照抗體(hIgG1、hIgG4))(100μg/ml及其稀釋)。板在37℃、5% CO2及95%濕度下培育隔夜。在隔夜培育之後，細胞用PBST(PBS及0.01% Tween-20)洗滌且在補充有10%胎牛血清(Hyclone)及1% Pen/Strep(Gibco)之RPMI(Gibco)中培育，在37℃、5% CO2及95%濕度下培育30分鐘。隨後，添加Celltiter 96 Aqueous One溶液(Promega)，接著在37℃、5% CO2及95%濕度下培育3小時。藉由使用iEMS讀取器(Labsystems)分析OD492-690來分析細胞活力。如圖4A所示，hCTLA4.27A.C1在兩種不同供體中誘導NK介導之細胞溶解，而經格式化為hIgG4時，其不能誘導細胞毒性。
為了分析補體依賴性細胞毒性，hCTLA4.27抗體之濃度範圍添加至CHO-K1.hCTLA-4靶標細胞之匯合單層中。在15分鐘培育時期之後， 50%人類補體血清(Sigma)添加至該等細胞中。在3,5小時培育之後，細胞用PBST(PBS及0.01% Tween-20)洗滌，用經補充RPMI(Gibco)培育且在37℃、5% CO2及95%濕度下培育30分鐘。隨後，添加Celltiter 96 Aqueous One溶液(Promega)，接著在37℃、5% CO2及95%濕度下培育3小時。藉由在iEMS讀取器(Labsystems)中分析OD492-690來分析細胞活力。如圖4B所示，hCTLA4.27A.C1在CDC分析中誘導補體介導之細胞溶解，而經格式化為hIgG4時，其不誘導補體介導之細胞毒性。
實例9：hCTLA4.27及對照抗體之交叉競爭
為了表徵與10D1(伊匹單抗)及CP-675,206(替西木單抗)相比hCTLA4.27之結合位點的差異，使用如先前所述之生物光干涉術剖繪該等抗體之間的競爭。胺反應性生物感測器藉由將其浸入含有0.1M MES pH=5.5之孔中持續10分鐘預潤濕。該等生物感測器接著使用0.1M NHS/0.4M EDC混合物活化持續5分鐘。經格式化為人類IgG1或人類IgG4之hCTLA4.27藉由將該等生物感測器浸入12μg/ml mAb於0.1M MES中之溶液中持續7.5分鐘而經偶合。生物感測器表面使用1M乙醇胺之溶液淬滅持續5分鐘。生物感測器在Octet動力學緩衝液(ForteBio)中平衡持續5分鐘。藉由將該等生物感測器置於含有固定濃度之rhCTLA-4/Fc(12μg/ml)之孔中且監測干涉術持續15分鐘而觀察到rhCTLA-4/Fc之締合。接著，再持續2分鐘，使與偶合於該生物感測器相同之抗hCTLA-4 mAb結合，以確保所有可獲得之rhCTLA-4/Fc結合位點的結合。藉由將該等生物感測器置於含有固定濃度(6μg/ml)之另一或相同抗hCTLA-4 mAb之孔或僅含有動力學緩衝液之參考孔中持續5分鐘來確定競爭或非競爭。在此直接競爭分析中，hCTLA4.27與rhCTLA-4之結合不 阻斷對照抗體與rhCTLA-4/Fc之結合，如表9所示。
實例10：結合於人類/小鼠CTLA-4交換突變體
使用兩種hCTLA-4突變體確認與10D1及CP-675,206相比在hCTLA4.27之間的結合區差異。設計一半人類及一半小鼠之hCTLA-4突變體。基於CTLA-4(Ig樣V型(免疫球蛋白樣)域)之折疊，該蛋白可分成兩個子域：一個含有β-鏈1、2、5及6(包括連接環)且一個含有β-鏈3、4、7及8(包括連接環)。人類-小鼠變異體(SEQ ID NO：42，Hum-Mou-CTLA-4)含有在鏈1、2、5及6上之人類殘基及在鏈3、4、7及8上之小鼠殘基(SEQ ID NO：46)。小鼠-人類變異體(SEQ ID NO：44，Mou-Hum-CTLA-4)含有在鏈1、2、5及6上之小鼠殘基及在鏈3、4、7及8上之人類殘基。
合成編碼此等構築體之cDNA(分別為SEQ ID NO：41及43)且次選殖至pCI-Neo載體(GeneArt)中。使用CELISA測試hCTLA4.27A嵌合hIgG4(hCTLA4.27A.C4)、10D1及CP-675,206與交換突變體之結合。為此，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用分別表現人類CTLA-4(hCTLA-4)、小鼠CTLA-4(mCTLA-4)(SEQ ID NO：45)、Hum-Mou-CTLA-4及Mou-Hum-CTLA-4之pCI-Neo載體短暫轉染CHO-K1細胞。該等經轉染細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下在培養基(DMEM-F12(Gibco)，具有5%新生牛血清(Biowest)及Pen/Strep(Gibco))中培養直至匯合。隨後，細胞經胰蛋白 酶化且接種於組織培養板中且在37℃、5% CO2及95%濕度下在培養基中培養直至匯合。接著，移除培養基且細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下用hCTLA-4抗體培育1小時。接著，細胞用PBS/0.05% Tween(PBST)洗滌且在37℃、5% CO2及95%濕度下用1：2,000山羊抗人類IgG-HRP(Jackson Immunoresearch)培育1小時。隨後，細胞用PBST洗滌3次且用TMB穩定之發色體(Invitrogen)目視檢查抗CTLA-4免疫反應性。反應用0.5M H2SO4停止且在450及610nm下讀取吸光度。hCTLA4.27A.C4顯示結合於人類-小鼠交換突變體，而10D1及CP-675,206可能結合於小鼠-人類交換突變體(圖5)。
實例11：定位hCTLA-4與hCTLA4.27A之間之相互作用界面
藉由如下程序闡明hCTLA4.27A與hCTLA-4之結合抗原決定基，該程序涉及氘化化學交聯，隨後酶消化及使用質譜分析偵測。首先，培育抗體hCTLA4.27A及抗原rhCTLA-4/Fc/6His(R&D systems；SEQ ID NO：59)以促進結合且藉由配備有HM4相互作用模塊(CovalX)之Ultraflex III MALDI ToF質譜儀(Bruker)驗證完整性及聚集水準。關於此等對照實驗，製備抗體或抗原之10μL樣品的稀釋系列(1至128倍稀釋，在1mg/mL下開始)。在各樣品中，使用K200 MALDI MS分析套組，根據製造商之說明書(CovalX)提交9μL至交聯且培育180分鐘，而1μL直接用於質譜分析(High-Mass MALDI)。該質譜分析顯示該抗體及抗原分別具有預期分子量152.25kDa(160.94kDa，具有交聯劑)及88.25kDa(95.19kDa，具有交聯劑)。關於抗原-抗體複合物之表徵，用2倍過量之抗原製得混合物(抗原：抗體比率4μM：2μM)。使用K200 MALDI MS分析套組，根據製造商之說明書將該抗原-抗體混合物之9μL樣品提交至交聯，而1μL直接用於質譜分析。該抗體(149.916 kDa)及抗原(88.211)之所偵測質量對應於如先前所偵測之分子量。該等抗原-抗體複合物在交聯之後經偵測為具有1：1(239.113kDa)及1：2(326.415kDa)化學計量(hCTLA4.27A：rhCTLA-4/Fc)之兩種非共價複合物。未偵測到非共價結合之抗體及抗原、非共價聚集體或非特異性多聚體。
接著，執行rhCTLA-4/Fc之肽質量指紋分析。根據製造商之說明書，將樣品提交至ASP-N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶及嗜熱菌蛋白酶(Roche Diagnostic)蛋白水解，隨後使用與LTQ Orbitrap XL質譜儀(Thermo Scientific)並行之Ultimate 3000(Dionex)系統藉由nLC-LTQ Orbitrap MS/MS進行分析。此蛋白水解陣列之結果導致該序列之92.52%由經鑒別之肽覆蓋。
為了以高解析度確定rhCTLA-4/Fc抗原上抗體hCTLA4.27A之抗原決定基，該抗體/抗原複合物(抗原：抗體比率4μM：2μM)用氘化交聯劑d0/d12(K200 MALDI套組)培育180分鐘且經受使用酶ASP-N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶及嗜熱菌蛋白酶之多酶裂解。在交聯肽之富集之後，該等樣品藉由高解析度質譜分析(nLC-Orbitrap MS)進行分析且使用XQuest[Y.J.Lee,Mol.BioSyst.,2008,4,816-823]及Stavrox[Götze M等人J Am Soc Mass Spectrom.2012年1月；23(1)：76-87]分析所產生之資料。由此等不同蛋白水解方法產生之交聯肽在圖6中示出。hCTLA4.27A之結合抗原決定基經鑒別為SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO：53)，且明顯不同於抗CTLA-4抗體10D1(Ramagopal等人PNAS 2017；114(21)：E4223-E4232)及CP-675,206(Lee等人Nat Commun.2016；7：13354)之抗原決定基。
熟習此項技術者容易理解，本發明充分適於進行該等目標且獲 得所提及之目的及優勢，以及其中固有之彼等。本文所提供之實例代表較佳實施例，為例示性的，且不意欲作為對本發明之範圍的限制。
應理解本發明在其應用方面不限於以上描述中所陳述或圖式中所說明之組分的構建詳情及配置。本發明能夠執行除所述之彼等以外的實施例且能夠以多種方式實踐及進行。又，應理解本文所用之措辭及術語以及摘要係出於描述之目的且不應被視為限制性的。
同樣地，熟習此項技術者應理解作為本發明之基礎的概念可容易地用作設計用於進行本發明之數種目的之其他結構、方法及系統的基礎。因此，重要的是該等申請專利範圍被視為包括該等相等構建，只要其不偏離本發明之精神及範圍即可。
雖然本發明已充分詳細地加以描述及例示以使熟習此項技術者製造及使用本發明，但多種替代、修改及改良應為顯而易知的，而不偏離本發明之精神及範圍。本文所提供之實例代表較佳實施例，為例示性的，且不意欲作為對本發明之範圍的限制。熟習此項技術者將想到其中修改及其他用途。此等修改涵蓋於本發明之精神內且由申請專利範圍之範圍界定。
熟習此項技術者應顯而易知，可對本文所揭示之發明進行不同取代及修改而不偏離本發明之範圍及精神。
本說明書中所提及之所有專利及公開案均指示與本發明相關之一般技術者的水準。
本文中說明性描述之發明合適地可在本文中未特定揭示之任何一或多種要素、一或多種限制不存在下實踐。因此，應理解儘管本發明已藉由較佳實施例及視情況選用之特徵特定地加以揭示，熟習此項技術者可 採取本文所揭示之概念的修改及變化，且該等修改及變化被視為在如由隨附申請專利範圍界定之本發明範圍內。
其他實施例陳述於以下申請專利範圍內。
<110> 荷蘭商艾杜諾生物科技控股歐洲公司
<120> 新型抗hCTLA-4抗體
<130> P112407PC00
<150> NL 2017270
<151> 2016-08-02
<160> 59
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1重鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2重鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3重鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1輕鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2輕鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3輕鏈
<400> 6
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致重鏈
<220>
<221> 變異體
<222> (5)..(5)
<223> 可為Val或Leu
<220>
<221> 變異體
<222> (6)..(6)
<223> 可為Gln或Glu
<220>
<221> 變異體
<222> (7)..(7)
<223> 可為Ser或Ala
<220>
<221> 變異體
<222> (9)..(9)
<223> 可為Phe或Ala
<220>
<221> 變異體
<222> (10)..(10)
<223> 可為Val或Glu
<220>
<221> 變異體
<222> (11)..(11)
<223> 可為Val或Leu
<220>
<221> 變異體
<222> (12)..(12)
<223> 可為Val、Ala或Lys
<220>
<221> 變異體
<222> (13)..(13)
<223> 可為Arg或Lys
<220>
<221> 變異體
<222> (16)..(16)
<223> 可為Ala、Thr或Ser
<220>
<221> 變異體
<222> (20)..(20)
<223> 可為Ile或Val
<220>
<221> 變異體
<222> (38)..(38)
<223> 可為Lys或Arg
<220>
<221> 變異體
<222> (40)..(40)
<223> 可為Ala或Arg
<220>
<221> 變異體
<222> (43)..(43)
<223> 可為Lys或Gln
<220>
<221> 變異體
<222> (48)..(48)
<223> 可為Ile或Met
<220>
<221> 變異體
<222> (67)..(67)
<223> 可為Lys或Arg
<220>
<221> 變異體
<222> (68)..(68)
<223> 可為Val或Ala
<220>
<221> 變異體
<222> (69)..(69)
<223> 可為Lys或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (70)..(70)
<223> 可為Leu、Ile或Met
<220>
<221> 變異體
<222> (72)..(72)
<223> 可為Ala或Arg
<220>
<221> 變異體
<222> (73)..(73)
<223> 可為Ala或Asp
<220>
<221> 變異體
<222> (74)..(74)
<223> 可為Thr、Glu或Lys
<220>
<221> 變異體
<222> (76)..(76)
<223> 可為Thr或Ala
<220>
<221> 變異體
<222> (78)..(78)
<223> 可為Thr或Ile
<220>
<221> 變異體
<222> (79)..(79)
<223> 可為Ala或Val
<220>
<221> 變異體
<222> (81)..(81)
<223> 可為Leu或Met
<220>
<221> 變異體
<222> (82)..(82)
<223> 可為Glu或Gln
<220>
<221> 變異體
<222> (83)..(83)
<223> 可為Phe或Leu
<220>
<221> 變異體
<222> (87)..(87)
<223> 可為Arg或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (88)..(88)
<223> 可為Ser或Asn
<220>
<221> 變異體
<222> (91)..(91)
<223> 可為Ser或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (99)..(99)
<223> 可為Met或Ile
<220>
<221> 變異體
<222> (115)..(115)
<223> 可為Leu或Thr
<400> 7
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致輕鏈
<220>
<221> 變異體
<222> (7)..(7)
<223> 可為Ser或Ala
<220>
<221> 變異體
<222> (18)..(18)
<223> 可為Arg或Thr
<220>
<221> 變異體
<222> (48)..(48)
<223> 可為Leu或Ile
<220>
<221> 變異體
<222> (70)..(70)
<223> 可為Asp或Glu
<220>
<221> 變異體
<222> (71)..(71)
<223> 可為Tyr或Phe
<220>
<221> 變異體
<222> (72)..(72)
<223> 可為Thr或Ser
<220>
<221> 變異體
<222> (74)..(74)
<223> 可為Thr或Ser
<220>
<221> 變異體
<222> (80)..(80)
<223> 可為Pro、Ala或Ser
<220>
<221> 變異體
<222> (100)..(100)
<223> 可為Gly或Gln
<220>
<221> 變異體
<222> (104)..(104)
<223> 可為Leu或Val
<400> 8
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VH1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 9
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 10
<210> 11
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VH2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 11
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
<210> 13
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VH3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 13
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 14
<210> 15
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VH4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 15
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 16
<210> 17
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VH5
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 17
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 18
<210> 19
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VH6
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 19
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 20
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VL1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 21
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 22
<210> 23
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VL2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 23
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 24
<210> 25
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VL3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 25
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 26
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VL4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 27
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 28
<210> 29
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA4.27VL5
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 29
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 30
<210> 31
<211> 360
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 31
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
<210> 33
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 33
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 34
<210> 35
<211> 669
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(669)
<400> 35
<210> 36
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
<210> 37
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變型CTLA4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(669)
<400> 37
<210> 38
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 38
<210> 39
<211> 669
<212> DNA
<213> 長尾獼猴
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(669)
<400> 39
<210> 40
<211> 223
<212> PRT
<213> 長尾獼猴
<400> 40
<210> 41
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類-小鼠CTLA4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(669)
<400> 41
<210> 42
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 42
<210> 43
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠-人類CTLA4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(669)
<400> 43
<210> 44
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 44
<210> 45
<211> 669
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(669)
<400> 45
<210> 46
<211> 223
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 46
<210> 47
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1恆定域
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(990)
<400> 47
<210> 48
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
<210> 49
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG4恆定域(包括S228P)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(981)
<400> 49
<210> 50
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 50
<210> 51
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類κ恆定域
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 52
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
<210> 54
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
<210> 58
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
<210> 59
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhCTLA-4/Fc/6His
<400> 59

Claims (37)

  1. 一種結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含在a-f中定義之多肽序列中的一或多者，且視情況包含在a-c中定義之多肽序列中每一者及/或在d-f中定義之多肽序列中每一者：a.重鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，或與SEQ ID NO：1之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列；b.重鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2，或與SEQ ID NO：2之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列；c.重鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3，或與SEQ ID NO：3之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列；d.輕鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4，或與SEQ ID NO：4之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列；e.輕鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5，或與SEQ ID NO：5之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列，及f.輕鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6，或與SEQ ID NO：6之不同之處在於1、2、3種或更多種保守取代之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含在a-f中定義之多肽序列，且視情況包含在a-c中定義之多肽序列中每一者及/或在d-f中定義之多肽序列中每一者：a.重鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1；b.重鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2； c.重鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3；d.輕鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；e.輕鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5；f.輕鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。
  3. 一種結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之輕鏈免疫球蛋白、重鏈免疫球蛋白或輕鏈及重鏈免疫球蛋白：a.包含可變重鏈及/或可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；該可變重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：7；該可變輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：8；b.包含可變重鏈及/或可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；該可變重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20；該可變輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：22、24、26或30；c.包含可變重鏈及/或可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；該可變重鏈包含與SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者至少90%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性；該可變輕鏈包含與SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者至少90%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性；及d.包含可變重鏈及/或可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；該可變重鏈包含與SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者至少90%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性；該可變輕鏈包含與SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者至少90%、95%、95%、96%、97%、98%或 99%之一致性，其中任何序列變異均發生於該抗體或抗原結合片段之構架區中；e.包含可變重鏈及/或可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；該可變重鏈相對於SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代；該可變輕鏈相對於SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代；及f.包含可變重鏈及/或可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；該可變重鏈相對於SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代；該可變輕鏈相對於SEQ ID NO：22、24、26或30中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種胺基酸取代，其中任何該等取代均發生於該抗體或抗原結合片段之構架區中。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其片段具有以下特徵中之一者、兩者、三者或全部四者：i.以至少約1×10 -9M之KD值結合於人類CTLA-4，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；ii.以約100nM或更低之IC 50阻斷hCTLA-4結合於hCD80；iii.以約100nM或更低之IC 50阻斷hCTLA-4結合於hCD86；iv.結合於與伊匹單抗或替西木單抗不同之CTLA-4抗原決定基。
  5. 一種結合於人類CTLA-4之抗原決定基的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段片段不結合於SEQ ID NO：44之小鼠- 人類嵌合CTLA-4分子。
  6. 一種抗體或其抗原結合片段，其結合於與包含可變重鏈SEQ ID NO：7及可變輕鏈SEQ ID NO：8之抗體相同的人類CTLA-4之抗原決定基，其中該抗體或其片段不結合於SEQ ID NO：44之小鼠-人類嵌合CTLA-4分子且具有以下特徵中之至少一者：a.以至少約1×10 -9M之KD值結合於人類CTLA-4，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；b.以約100nM或更低之IC 50阻斷hCTLA-4結合於hCD80；c.以約100nM或更低之IC 50阻斷hCTLA-4結合於hCD86；d.結合於與伊匹單抗或替西木單抗不同之CTLA-4抗原決定基。
  7. 一種結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合於人類CTLA4之抗原決定基；其包含SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO：53)之至少8個相鄰殘基。
  8. 如申請專利範圍第7項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定基由SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO：53)組成。
  9. 一種結合於人類CTLA-4之抗體或其抗原結合片段，其中人類CTLA-4中在序列SFVCEYASPGKAT(SEQ ID NO：53)內之一或多種突變防止該抗體結合於人類CTLA4。
  10. 一種抗體或其抗原結合片段，其與抗體hCTLA4.27A競爭結合於人類CTLA-4。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段，其為包含兩條重鏈及兩條輕鏈之人類化抗體。
  12. 一種經分離多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1-8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或30中任一者。
  13. 一種經分離核酸，其編碼：如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段，或如申請專利範圍第12項之多肽中之任一者。
  14. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第13項之經分離核酸。
  15. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或其結合片段、申請專利範圍第12項之多肽、申請專利範圍第13項之聚核苷酸或申請專利範圍第14項之表現載體。
  16. 如申請專利範圍第15項之宿主細胞，其為畢赤酵母細胞或中國倉鼠卵巢細胞。
  17. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或穩定劑。
  18. 如申請專利範圍第17項之組合物，其進一步包含選自由以下組成之群之試劑：抗PD1抗體或其抗原結合片段；抗LAG3抗體或其抗原結合片段；抗TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗VISTA抗體或其抗原結合片段；抗BTLA抗體或其抗原結合片段；抗TIM3抗體或其抗原結合片段； 抗CD27抗體或其抗原結合片段；抗HVEM抗體或其抗原結合片段；抗CD70抗體或其抗原結合片段；抗CD137抗體或其抗原結合片段；抗OX40抗體或其抗原結合片段；抗CD28抗體或其抗原結合片段；抗PDL1抗體或其抗原結合片段；抗PDL2抗體或其抗原結合片段；抗GITR抗體或其抗原結合片段；抗ICOS抗體或其抗原結合片段；抗SIRPα抗體或其抗原結合片段；抗ILT2抗體或其抗原結合片段；抗ILT3抗體或其抗原結合片段；抗ILT4抗體或其抗原結合片段；抗ILT5抗體或其抗原結合片段；抗4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗NK2GA抗體或其抗原結合片段；抗NK2GC抗體或其抗原結合片段；抗NK2GE抗體或其抗原結合片段；抗TSLP抗體或其抗原結合片段，STING促效劑；及抗IL10抗體或其抗原結合片段。
  19. 如申請專利範圍第18項之組合物，其中該抗PD1抗體或其抗原結合片段選自由以下組成之群：派姆單抗或其抗原結合片段及納武單抗或其抗原結合片段。
  20. 如申請專利範圍第17項之組合物，其進一步包含選自以下群之化合物：ADU-S100、美法侖、長春新鹼、氟達拉濱、苯丁酸氮芥、苯達莫司汀、依託泊苷、阿黴素、環磷醯胺、順鉑、免疫調節劑(諸如皮質類固醇，例如地塞米松或普賴蘇穠)、沙利度胺類似物(例如沙利度胺、來那度胺或泊馬度胺)、激酶抑制劑(例如依魯替尼、艾代拉里斯)、靶向CD20之抗體(例如利妥昔單抗、奧法木單抗或奧比妥珠單抗)、靶向CD52之抗體(例如阿侖珠單抗)、靶向CD38之抗體(例如達雷木單抗)、靶向IL-6或IL-6受體之抗體(例如薩利魯單抗或托珠單抗)、靶向CS-1之抗體(例如埃羅妥珠單抗)、靶向BCMA之抗體(例如GSK2857916)、靶向BAFF或BLyss之抗體(例如塔巴魯單抗)、雙膦酸鹽(例如帕米膦酸鹽或唑來膦酸)、硼替佐米或其組合。
  21. 一種產生抗體或抗原結合片段之方法，其包含：在有利於表現聚核苷酸之條件下培養包含該聚核苷酸之宿主細胞，該宿主細胞包含編碼如申請專利範圍第1項至第11項之抗體或抗原結合片段中任一者之重鏈及/或輕鏈的聚核苷酸；及視情況，自該宿主細胞及/或培養基回收該抗體或抗原結合片段。
  22. 一種如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段或介導該個體內該抗體或抗原結合片段之表現的表現載體之用途，其用於製備治療個體、較佳地人類個體中之癌症的藥劑，該藥劑 視情況與另一治療劑或治療程序併用。
  23. 一種如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段或介導該個體內該抗體或抗原結合片段之表現的表現載體之用途，其用於製備治療個體、較佳地人類個體中之感染或傳染病的藥劑，該藥劑視情況與另一治療劑或治療程序併用。
  24. 一種疫苗，其包含如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段及抗原。
  25. 一種用於偵測樣品中CTLA-4肽或其片段之存在的方法，其包含使該樣品與如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或片段接觸及偵測該抗體或片段與該肽之間複合物的存在；其中該複合物之偵測指示了該CTLA-4肽之存在。
  26. 一種如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段或介導該個體內該抗體或抗原結合片段之表現的表現載體之用途，其用於製備增加免疫細胞之活性的藥劑。
  27. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該藥劑用於：癌症之治療；感染或傳染病之治療；或用作疫苗佐劑。
  28. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段，或介導該個體內該抗體或抗原結合片段之表現的表現載體，其用於製備藥劑以：增加免疫細胞活化； 治療癌症；或治療感染或傳染病。
  29. 一種如申請專利範圍第1項至第11項之抗體或抗原結合片段用於製造用於治療癌症之藥劑的用途，以供：增加免疫細胞活化；治療癌症；或治療感染或傳染病。
  30. 如申請專利範圍第1項至第10項之抗體或其抗原結合片段，其中該片段為Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv片段(scFV)。
  31. 如申請專利範圍第1項至第10項之抗體或其抗原結合片段，其包含選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，較佳地IgG1或IgG4之重鏈恆定區，及選自輕鏈恆定區κ或λ之輕鏈恆定區。
  32. 如申請專利範圍第31項之抗體或其抗原結合片段，其包含在SEQ ID NO：50之位置228處具有Ser→Pro突變之人類IgG4重鏈恆定區。
  33. 一種如申請專利範圍第1項至第11項之抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製備刺激個體中之免疫反應的藥劑。
  34. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該癌症選自由肺癌、黑色素瘤、腎癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、胰臟癌、甲狀腺癌、血液科癌症、淋巴瘤或白血病或癌症之轉移病變組成之群。
  35. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該抗體分子係用於與一或多種治療劑或程序組合投與，其中該第二治療劑或程序選自由STING促效劑、化學療法、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫 之療法、細胞因子、手術程序、輻射程序、共刺激分子之活化劑、抑制分子之抑制劑、疫苗或細胞免疫療法組成之群。
  36. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該抗體分子係用於與選自由OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配位體組成之群的一或多種共刺激分子之促效劑組合投與。
  37. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該抗體分子係用於與選自由PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR組成之群的免疫檢查點分子之一或多種抑制劑組合投與。
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