ES3038117T3 - Antibodies against human ctla-4 - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a nuevos anticuerpos anti-h CTLA-4 que se unen a un epítopo diferente al de los anticuerpos anti-CTLA4 de la técnica anterior, a métodos para producir estos anticuerpos y a sus usos terapéuticos y diagnósticos. Estos anticuerpos muestran una afinidad similar por el antígeno CTLA4 y también son capaces de bloquear la unión de CTLA4 a CD80 y/o CD86. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra CTLA-4 humano

Campo de la invención

La presente invención se refiere a tratamientos de afecciones mejoradas por la estimulación de una respuesta inmunitaria, en particular por la estimulación de linfocitos T específicos de antígeno. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-CTLA-4 humano, así como al uso de estos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades tales como cáncer y enfermedad infecciosa.

Antecedentes de la invención

La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona simplemente para ayudar al lector a entender la invención y no se admite que describa o constituya técnica anterior a la presente invención.

Los linfocitos T desempeñan un papel central en la respuesta inmunitaria adaptativa al antígeno. Las células T indiferenciadas requieren dos señales para su activación completa (Bretscher 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:185-90). La primera señal es específica de antígeno y se proporciona por interacción del receptor de células T (TCR) con el complejo MHC/péptido en una célula presentadora de antígeno (APC). La segunda señal es una señal coestimuladora proporcionada por las interacciones entre receptores en la célula T y sus ligandos en la APC. El acoplamiento tanto de las interacciones TCR/MHC como de las interacciones coestimuladoras conduce a la activación de células T a través de varias rutas intracelulares, incluyendo calcineurina cálcica y proteína cinasa activada por mitógenos RAS, y a la activación posterior de factores de transcripción para varios compuestos efectores, incluyendo citocinas tales como IL-2.

Aunque están implicadas múltiples rutas coestimuladoras positivas y negativas en la regulación de células T, las más críticas son entre CD28 en las células T y B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) en las APC. CD28 fomenta la diferenciación de células T y potencia la producción de anticuerpos por células B y la activación de células T. CD80 y CD86, expresados en APC tales como células dendríticas y células B, tienen funciones solapantes pero distintas. CD86 se expresa constitutivamente y se regula por incremento rápidamente en las APC de manera coincidente con el acoplamiento TCR/MHC. La expresión de CD80 es muy baja en la célula en reposo, pero normalmente se induce después de una estimulación de células T prolongada. Estas diferencias sugieren que, aunque CD86 puede ser importante en la inicialización de la activación de células T, CD80 puede desempeñar un papel mayor en la perpetuación de la respuesta inmunitaria.

Después de la activación de células T, un receptor regulador negativo, el antígeno de linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4 o CTLA-4, también denominado CD152), se regula por incremento en las células T (Alegreet al.,2001, Nat Rev Immunol 1:220-8). CTLA-4 es estructuralmente homólogo a CD28, pero se une más estrechamente tanto a ligandos de CD80 como a ligandos de CD86. CTLA-4 inhibe la respuesta inmunitaria de dos maneras principales: compite con CD28 por los ligandos de CD80 y CD86 y, por tanto, bloquea la coestimulación, y también señaliza de manera negativa para inhibir la activación de células T (Krummel y Allison, 1995, J Exp Med 182:459-465; Walunaset al.,1994, Immunity 1:405-413). Se ha demostrado además que CD86 se acopla con CD28 más que con CTLA-4 en la sinapsis inmunitaria, mientras que CD80 se liga más a CTLA-4 que a CD28 (Collinset al.,2002, Immunity 17:201-210; Janssonet al.,2005, J Immunol 175:1575-1585).

Se ha notificado que el bloqueo de CTLA-4 aumenta las respuestas de células Tin vitroein vivo,exacerba la inmunidad antitumoral, y potencia una enfermedad autoinmunitaria inducida. También se ha notificado que CTLA-4 tiene un impacto alternativo o adicional sobre el carácter inicial de la respuesta inmunitaria de células T. Esto es coherente con la observación de que algunos pacientes con enfermedades autoinmunitarias tienen autoanticuerpos contra CTLA-4. Es posible que los autoanticuerpos bloqueantes de CTLA-4 desempeñen un papel patógeno en estos pacientes. Además, se han descrito anticuerpos humanos contra CTLA-4 humano como moduladores de inmunoestimulación en varias afecciones patológicas, tal como para tratar o prevenir una infección viral y bacteriana y para tratar un cáncer. El ipilimumab es un anticuerpo humano anti-CTLA-4 humano que bloquea la unión de CTLA-4 a CD80 y CD86 expresados en las APC, bloqueando la regulación por disminución negativa de las respuestas inmunitarias provocadas por la interacción de estas moléculas. Se han observado evidencias de regresión tumoral con un tiempo prolongado hasta la progresión en pacientes con melanoma que recibieron o bien ipilimumab (10D1) o bien otro anticuerpo anti-CTLA-4, tremelimumab (CP-675,206) y se han observado respuestas duraderas con ipilimumab en pacientes con melanoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata y cáncer de células renales. Curiosamente, las respuestas antitumorales pueden caracterizarse por una progresión a corto plazo seguida de una regresión retardada, y una característica clínica importante, posiblemente distintiva, de los anticuerpos anti-CTLA-4 es que la duración de las respuestas clínicas e incluso de la enfermedad estable a menudo es bastante prolongada. Estudios preclínicos y clínicos tempranos de pacientes con melanoma avanzado muestran que el ipilimumab fomenta la actividad antitumoral como monoterapia y en combinación con tratamientos tales como quimioterapia, anticuerpos, vacunas, o citocinas (Weber, J., The Oncologist, 12(7):864-872, 2007; Scott, A.M.et al.,Nature Reviews (Cancer) 12:278-287, 2012; Hodi, F.S.et al.,New Eng. J. Med. 363(8):711-723, 2010; Schadendorf, D.etal.,J. Clin. Oncol. 33(17):1889-1894, 2015; Larkin, J.V.et al.,New Eng. J. Med. 2015; Ribas, A.et al.,J. Clin. Oncol.

31(5):616-622, 2013)).

Un segundo mecanismo propuesto para la selección de CTLA-4 como diana por ipilimumab es el agotamiento de células T reguladoras (Treg) CTLA-4+, que se ha demostrado que es un impulsor crítico detrás de la eficacia de la selección de CTLA-4 como diana en ratones (Peggset al.,J Exp Med, 2009, DOI: 10.1084/jem.20082492; Simpsonet al.,J Exp Med, 2013, DOI: 10.1084/jem.20130579; Selbyet alCancer Immunol, 2013 DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0013).

Aunque el ipilimumab ya está en el mercado para algunas terapias contra el cáncer y está sometiéndose a ensayo para otras indicaciones anticancerosas, y aunque el tremelimumab también está avanzado en la fase de ensayo clínico, todavía existe la necesidad de anticuerpos anti-CTLA-4 alternativos, especialmente cuando tienen una actividad que puede diferenciarse de las actividades de los anticuerpos anti-CTLA-4 conocidos.

El documento WO 2006/066568 A2 se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado agonista específico de CTLA-4 que no se une al bucle C”D de CTLA-4.

El documento WO 2009/100140 A1 se refiere a anticuerpos anti-CTLA-4 con bloqueo reducido de la unión de CTLA-4 a B7 ya usos de los mismos.

El documento WO 01/14424 A2 se refiere a anticuerpos contra CTLA-4 humano y a sus usos.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones.

La presente descripción se refiere a anticuerpos anti-CTLA-4 que comprenden:

a. una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; b. una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; c. una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; d. una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e. una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; f. una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Preferiblemente, dicho anticuerpo tiene una cadena pesada según SEQ ID NO: 7. Además, preferiblemente, dicho anticuerpo tiene una cadena ligera según SEQ ID NO: 8. Más preferiblemente, la cadena pesada se elige de cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20. Más preferiblemente, la cadena ligera se elige de cualquiera de SEQ ID NO: 22, 24, 26, 30.

La descripción se refiere además a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CTLA-4 humano que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera, una inmunoglobulina de cadena pesada o tanto una inmunoglobulina de cadena ligera como una inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en:

a. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y/o una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

b. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 y/o una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 24, 26 ó 30;

c. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que comprende al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 y/o una cadena ligera variable que comprende al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con una cualquiera de SEQ ID<n>O: 22, 24, 26 ó 30; y

d. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que comprende al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 y/o una cadena ligera variable que comprende al menos el 90 %, el 95 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98%o el 99%de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 22, 24, 26 ó 30, en el que se produce cualesquiera variaciones de secuencia en las regiones de entramado del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno;

e. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácido con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 y/o una cadena ligera variable que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácido con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 22, 24, 26 ó 30; y

f. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada variable que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácido con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 y/o una cadena ligera variable que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácido con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 22, 24, 26 ó 30, en el que se produce cualesquiera de dichas sustituciones en las regiones de entramado del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

Preferiblemente, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene al menos una de las siguientes características:

a) se une a CTLA-4 humano con un valor de Kd de al menos aproximadamente 1 x 10-9 M tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, BIACORE) o una técnica similar (por ejemplo, KinExa u OCTET);

b) bloquea la unión de hCTLA-4 a hCD80 con una CI<50>de aproximadamente 100 nMo inferior;

c) bloquea la unión de hCTLA-4 a hCD86 con una CI<50>de aproximadamente 100 nMo inferior;

d) se une a un epítopo de CTLA-4 diferente de ipilimumab o tremelimumab.

La descripción comprende además un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo de CTLA-4 humano, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno no se une a la molécula de CT<l>A-4 quimérica de ratón-humano de SEQ ID NO: 44.

También se divulga un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo de CTLA-4 humano que un anticuerpo que comprende la cadena pesada variable de SEQ ID NO: 7 y la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 8, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo no se une a la molécula de CTLA-4 quimérica de ratón-humano de SEQ ID NO: 44 y tiene una, dos, tres, o las cuatro de las siguientes características: g. se une a CTLA-4 humano con un valor de K<d>de al menos aproximadamente 1 x 10'9 M tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, BIACORE) o una técnica similar (por ejemplo, KinExa u OCTET);

h. bloquea la unión de hCTLA-4 a hCD80 con una CI<50>de aproximadamente 100 nMo inferior;

i. bloquea la unión de hCTLA-4 a hCD86 con una CI<50>de aproximadamente 100 nMo inferior;

j. se une a un epítopo de CTLA-4 diferente de ipilimumab o tremelimumab.

También se divulga un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CTLA-4 humano, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo de CTLA-4 humano que comprende al menos 8 residuos contiguos de SFVCEYASPGKAT (SEQ ID NO: 53).

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 34, en el que el epítopo consiste en SFVCEYASPGKAT (SEQ ID NO: 53).

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CTLA-4 humano, en el que una o más mutaciones en CTLA-4 humano dentro de la secuencia SFVCEYASPGKAT (SEQ ID NO: 53) impiden la unión del anticuerpo a CTLA-4 humano.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite con el anticuerpo hCTLA-4.27A por la unión a CTLA-4 humano.

Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción es un anticuerpo humanizado que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 30.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para: uno cualquiera de los anticuerpos de la invención. La invención también abarca un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado de este tipo.

La invención también comprende una célula huésped que comprende el anticuerpo, fragmento de unión, polipéptido, polinucleótido o vector de expresión de la invención. Dicha célula huésped es preferiblemente una célula dePichiao una célula de ovario de hámster chino.

En una realización de la invención, un anticuerpo de la invención se usa en asociación con uno o más dinucleótidos cíclicos u otros agonistas de la ruta de STING. STING (estimulador de genes de interferón, también conocido como TMEM173, MITA, ERIS, y MPYS) es una proteína transmembrana localizada en el RE que experimenta un cambio conformacional en respuesta a la unión directa de dinucleótidos cíclicos (CDN), dando como resultado una cascada de señalización aguas abajo que implica la activación de TBK1, la fosforilación de IRF-3, y la producción de IFN-p y otras citocinas. La ruta de STING en células presentadoras de antígeno huésped residentes en tumores está implicada en la inducción de una respuesta de células T CD8+ espontánea contra antígenos derivados de tumores. La activación de esta ruta y la posterior producción de IFN-p también contribuyen según se notifica al efecto antitumoral de la radiación. Se describen agonistas de STING y sus usos en, por ejemplo, los documentos US20060040887, US20080286296, US20120041057, US20140205653, WO2014179335, WO 2014179760, US20150056224, WO 2016096174, WO 2017011444, WO 2017027645, y WO 2017027646, en los que se administra el compuesto como una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Los agonistas de STING pueden administrarse mediante una o más vías no parenterales o parenterales. En algunas realizaciones, la administración es subcutánea, intramuscular, intradérmica, mucosa, vaginal, cervical, peritumoral, intratumoral, o directamente en el/los ganglio(s) linfático(s) de drenaje tumoral. En determinadas realizaciones, el agonista de STING y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se administran como administraciones independientes, por ejemplo, en momentos diferentes y/o por vías de administración diferentes.

Otra realización de la invención está formada por una composición que comprende el anticuerpo de la invención y un portador, diluyente, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, dicha composición comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste en:

k.un anticuerpo anti-PD1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

l. un anticuerpo anti-LAG3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

m.un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

n.un anticuerpo anti-VISTA o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

o.un anticuerpo anti-BTLA o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

p.un anticuerpo anti-TIM3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

q.un anticuerpo anti-CD27 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

r.un anticuerpo anti-HVEM o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

s. un anticuerpo anti-CD70 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

t.un anticuerpo anti-CD137 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

u.un anticuerpo anti-OX40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

v.un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

w.un anticuerpo anti-PDL1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

x. un anticuerpo anti-PDL2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

y.un anticuerpo anti-GITR o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

z.un anticuerpo anti-ICOS o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

aa.un anticuerpo anti-SIRPa o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

bb.un anticuerpo anti-ILT2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

cc.un anticuerpo anti-ILT3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

dd.un anticuerpo anti-ILT4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

ee.un anticuerpo anti-ILT5 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

ff.un anticuerpo anti-4-1BB o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

gg.un anticuerpo anti-NK2GA o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

hh.un anticuerpo anti-NK2GC o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

ii.un anticuerpo anti-NK2GE o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

jj.un anticuerpo anti-TSLP o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

kk.un agonista de STING; y

ll. un anticuerpo anti-IL10 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Además, preferiblemente, en dicha composición, el anticuerpo anti-PD1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en: pembrolizumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo y nivolumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otra realización, la composición de la invención comprende además un compuesto seleccionado del grupo de ADU-S100, melfalán, vincristina, fludarabina, clorambucilo, bendamustina, etopósido, doxorubicina, ciclofosfamida, cisplatino, agentes inmunomoduladores tales como corticosteroides, por ejemplo, dexametasona o prednisolona, análogos de talidomida, por ejemplo, talidomida, lenalidomida o pomalidomida, inhibidores de cinasas, por ejemplo, ibrutinib, idealisib, anticuerpo que selecciona como diana CD20, por ejemplo, rituximab, ofatumab u obinotuzumab, anticuerpo que selecciona como diana CD52, por ejemplo, alemtuzumab, anticuerpo que selecciona como diana CD38, por ejemplo, daratumumab, anticuerpo que selecciona como diana IL-6 o receptor de IL-6, por ejemplo, sarilumab o tocilizumab, anticuerpo que selecciona como diana CS-1, por ejemplo, elotuzumab, anticuerpo que selecciona como diana BCMA, por ejemplo, GSK2857916, anticuerpo que selecciona como diana BAFF o BLyss, por ejemplo, tabalumab, bisfosfonatos, por ejemplo, pamidronato o ácido zoledrónico, bortezomid, o combinaciones de los mismos.

La presente descripción también se refiere a un método de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende:

mm. cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica para la cadena pesada y/o la cadena ligera de uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la descripción en condiciones favorables para la expresión del polinucleótido; y

nn. opcionalmente, recuperar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a partir de la célula huésped y/o el medio de cultivo.

En determinadas realizaciones, la célula huésped comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido de este tipo, en la que el vector de expresión comprende secuencias de control operativamente unidas al polinucleótido que impulsan la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En realizaciones preferidas, el polinucleótido comprende una secuencia señal de secreción que media en la secreción del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno por la célula huésped. Cualquier referencia a un método de tratamiento o diagnóstico puesto en práctica en el cuerpo humano o animal debe interpretarse como sustancias y composiciones para su uso en tales métodos.

Un aspecto adicional de la presente descripción es un método de tratamiento de cáncer en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se divulga en el presente documento, o de un vector de expresión que media en la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo dentro del sujeto, opcionalmente en asociación con un agente terapéutico o procedimiento terapéutico adicional.

También forma parte de la descripción un método de tratamiento de una infección o enfermedad infecciosa en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la descripción, opcionalmente en asociación con un agente terapéutico o procedimiento terapéutico adicional.

La descripción comprende además una vacuna que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la descripción y un antígeno.

Además, la descripción comprende un método para detectar la presencia de un péptido de CTLA-4 o un fragmento del mismo en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de la descripción y detectar la presencia de un complejo entre el anticuerpo o fragmento y el péptido; en el que la detección del complejo indica la presencia del péptido de CTLA-4.

La descripción también se refiere a un método de aumento de la actividad de una célula inmunitaria, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la descripción, o de un vector de expresión que media en la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dentro del sujeto. Preferiblemente, dicho método se usa:

oo. para el tratamiento de cáncer;

pp. para el tratamiento de una infección o enfermedad infecciosa; o

qq. como adyuvante de vacuna.

En otro aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la descripción, o a un vector de expresión que media en la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dentro del sujeto para su uso en la preparación de un medicamento:

rr. para aumentar la activación de células inmunitarias;

ss. para tratar un cáncer; o

tt. para tratar una infección o enfermedad infecciosa.

La descripción comprende, en un aspecto siguiente, el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer: para aumentar la activación de células inmunitarias; para tratar un cáncer; o para tratar una infección o enfermedad infecciosa.

En un aspecto siguiente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción comprende una región constante de cadena pesada seleccionada de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, preferiblemente IgG1 o IgG4, y una región constante de cadena ligera elegida de las regiones constantes de cadena ligera kappa o lambda. Si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, dicha secuencia de IgG4 tiene preferiblemente una mutación Ser->Pro en la posición 228, tal como se representa en SEQ ID NO: 50.

La descripción también se refiere a un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción en una cantidad eficaz para estimular la respuesta inmunitaria. Preferiblemente, en un método de este tipo, la molécula de anticuerpo se administra en combinación con un agonista de una o más moléculas coestimuladoras, por ejemplo, una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en ligando de OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 o CD83. Alternativamente, la molécula de anticuerpo se administra en combinación con uno o más inhibidores de una molécula de punto de control inmunitario, por ejemplo, uno o más inhibidores seleccionados del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR.

En una realización adicional, la invención comprende un método de tratamiento de cáncer, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de pulmón, un melanoma, un cáncer renal, un cáncer de hígado, un mieloma, un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer colorrectal, un cáncer de estómago, un cáncer de páncreas, un cáncer de tiroides, un cáncer hemático, un linfoma, un mieloma, o una leucemia, o una lesión metastásica del cáncer.

Además, en relación con un método de tratamiento de cáncer, la descripción también se refiere a un método en el que la molécula de anticuerpo se administra en combinación con uno o más segundos agentes o procedimientos terapéuticos, por ejemplo, en el que el segundo agente o procedimiento terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una quimioterapia, una terapia antineoplásica dirigida, un fármaco oncolítico, un agente citotóxico, una inmunoterapia, una citocina, un procedimiento quirúrgico, una radioterapia, un activador de una molécula coestimuladora, un inhibidor de una molécula inhibidora, una vacuna, o una inmunoterapia celular.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Funcionalidad del anticuerpo hCTLA4.27A en el ensayo de indicador basado en Jurkat.

Figura 2: Perfil de bloqueo diferencial de hCD80 de los anticuerpos hCTLA4.27.

Figura 3: Inducción de la producción de IL-2 por anticuerpos hCTLA4.27 en el ensayo de SEB en PBMC.

Figura 4A: Anticuerpos hCTLA4.27 y de control: función efectora en el ensayo de ADCC.

Figura 4B: Anticuerpos hCTLA4.27 y de control: función efectora en el ensayo de CDC.

Figura 5: Perfil de unión distintivo de hIgG4 quimérico de hCTLA4.27A a mutantes de intercambio de CTLA-4 de humano/ratón.

La figura 6 representa los resultados de mapeo de epítopos de la unión de hCTLA4.27A a rhCTLA-4/Fc. Los péptidos reticulados detectados mediante diferentes enfoques de proteólisis son SEQ ID NO: 54-57. Los residuos 46-76 de hCTLA-4 (SEQ ID NO: 58) se muestran como referencia.

Descripción detallada

A lo largo de la descripción detallada y los ejemplos de la invención, se usarán las siguientes abreviaturas:

ADCC citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

CDC citotoxicidad dependiente del complemento

CDR región determinante de complementariedad en las regiones variables de inmunoglobulina, definida usando el sistema de numeración de Kabat

CHO ovario de hámster chino

CE<50>concentración que da como resultado el 50 % de unión total

ELISA ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas

FR región de entramado de anticuerpo: regiones variables de inmunoglobulina excluyendo las regiones CDR.

HRP peroxidasa de rábano picante

IFN interferón

CI<50>concentración que da como resultado el 50 % de inhibición de la señal total

IgG inmunoglobulina G

Kabat sistema de alineación y numeración de inmunoglobulina desarrollado por Elvin A. Kabat ((1991)

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md.)

AcM anticuerpo monoclonal

SEB enterotoxina B deStaphylococcus

TT toxoide tetánico

Región V segmento de cadenas de IgG que es variable en cuanto a secuencia entre anticuerpos diferentes.

Se extiende hasta el residuo l09 en la cadena ligera y hasta el residuo 113 en la cadena pesada según Kabat.

VH región variable de cadena pesada de inmunoglobulina

VL región variable de cadena ligera de inmunoglobulina

VK región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina

Lo siguiente es una lista de secuencias a las que se hace referencia en la presente memoria descriptiva (tabla 1):

“Tratar” o “que trata(n)” significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contienen cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención, de manera interna o externa a un sujeto o paciente que padece uno o más síntomas de enfermedad, o que se sospecha que padece una enfermedad, para la cual el agente tiene actividad terapéutica. Normalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntomas de enfermedad en el sujeto o la población que se trata, ya sea induciendo la regresión o inhibiendo la progresión de tal(es) síntoma(s) en cualquier grado clínicamente mediable. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad particular puede variar según factores tales como el estado patológico, la edad, y el peso del paciente, y la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el sujeto. Puede evaluarse si se ha aliviado un síntoma de enfermedad mediante cualquier medición clínica usada normalmente por los médicos u otros profesionales sanitarios expertos para evaluar el estado de progresión o gravedad de ese síntoma.

La presente descripción incluye anticuerpos anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a cualquier forma de anticuerpo que muestre la actividad biológica deseada. Por tanto, se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa que comprenden dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos de dominio único camelizados.

La presente descripción incluye fragmentos de unión a antígeno anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, “fragmento de anticuerpo” o “fragmento de unión a antígeno” se refiere a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, es decir, fragmentos de anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente al antígeno unido por el anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, fragmentos que conservan una o más regiones CDR. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, por ejemplo, scFv; nanocuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La presente descripción incluye fragmentos Fab anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Un “fragmento Fab” está compuesto por una cadena ligera y las regiones CH1 y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un “fragmento Fab” puede ser el producto de la escisión con papaína de un anticuerpo.

La presente descripción incluye anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden una región Fc y métodos de uso de los mismos. Una región “Fc” contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos mediante dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrófobas de los dominios Ch3. La presente descripción incluye fragmentos Fab’ anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Un “fragmento Fab’” contiene una cadena ligera y una porción o un fragmento de una cadena pesada que contiene el dominio Vh y el dominio C h1 y también la región entre los dominios Ch1 y Ch2, de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab’ para formar una molécula de F(ab’)<2>.

La presente descripción incluye fragmentos F(ab’)<2>anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Un “fragmento F(ab’)2” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH y CH2, de manera que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Por tanto, un fragmento F(ab’)2 está compuesto por dos fragmentos Fab’ que se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. Un “fragmento F(ab’)2” puede ser el producto de la escisión con pepsina de un anticuerpo.

La presente descripción incluye fragmentos Fv anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. La “región Fv” comprende las regiones variables tanto de las cadenas pesadas como de las cadenas ligeras, pero carece de las regiones constantes.

La presente descripción incluye fragmentos scFv anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. El término anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios Vh y V<l>de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF Mo NOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315. Véanse también la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 88/01649 y las patentes estadounidenses n.os 4.946.778 y 5.260.203.

La presente descripción incluye anticuerpos de dominio anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Un “anticuerpo de dominio” es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene sólo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VHse unen de manera covalente con un ligador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente pueden seleccionar como diana los mismos antígenos o antígenos diferentes.

La presente descripción incluye anticuerpos bivalentes anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Un “anticuerpo bivalente” comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase a continuación).

La presente descripción incluye anticuerpos de dominio único camelizados anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos en el presente documento también incluyen anticuerpos de dominio único camelizados. Véanse, por ejemplo, Muyldermanset al.(2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmannet al.(1999) J. Immunol. Methods 231:25; el documento WO 94/04678; el documento WO 94/25591; la patente estadounidense n.° 6.005.079).

En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios VHcon modificaciones de manera que se forman anticuerpos de dominio único.

La presente descripción incluye diacuerpos anti-CTLA-4 y métodos de uso de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena de polipéptido (Vh-Vl o Vl-Vh). Mediante el uso de un ligador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios de complementariedad de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161; y Holligeret al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para una revisión de las variantes de anticuerpo diseñadas por ingeniería, véase generalmente Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol.

23:1126-1136.

Normalmente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la descripción que se modifica de cierto modo conserva al menos el 10% de su actividad de unión (en comparación con el anticuerpo parental) cuando esa actividad se expresa en base molar. Preferiblemente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la descripción conserva al menos el 20 %, el 50 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % o más de la afinidad de unión a CTLA-4 en comparación con el anticuerpo parental. También se pretende que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la descripción pueda incluir sustituciones de aminoácido conservadoras o no conservadoras (denominadas “variantes conservadoras” o “variantes con función conservada” del anticuerpo) que no alteren sustancialmente su actividad biológica.

La presente descripción incluye anticuerpos anti-CTLA-4 aislados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos y métodos de uso de los mismos. Los anticuerpos “aislados” o fragmentos de unión a antígeno de los mismos están al menos parcialmente libres de otras moléculas biológicas procedentes de las células o los cultivos celulares en los que se producen. Tales moléculas biológicas incluyen ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, hidratos de carbono, u otro material tal como residuo celular y medio de crecimiento. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno aislado puede estar además al menos parcialmente libre de componentes del sistema de expresión tales como moléculas biológicas procedentes de una célula huésped o del medio de crecimiento de la misma. Generalmente, no se pretende que el término “aislado” se refiera a la ausencia completa de tales moléculas biológicas ni a la ausencia de agua, tampones o sales, o a componentes de una formulación farmacéutica que incluye los anticuerpos o fragmentos.

La presente descripción incluye anticuerpos quiméricos anti-CTLA-4 (por ejemplo, dominio constante humano/dominio variable de ratón) y métodos de uso de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo quimérico” es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, donde los anticuerpos primero y segundo son de especies diferentes (patente estadounidense n.° 4.816.567; y Morrisonet al.,(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855). Normalmente, los dominios variables se obtienen a partir de un anticuerpo de un animal experimental (el “anticuerpo parental”), tal como un roedor, y las secuencias de dominio constante se obtienen a partir de anticuerpos humanos, de modo que será menos probable que el anticuerpo quimérico resultante provoque una respuesta inmunitaria adversa en un sujeto humano en comparación con el anticuerpo parental (por ejemplo, de ratón).

La presente descripción incluye anticuerpos humanizados anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, anticuerpos de rata o ratón que se han humanizado) y métodos de uso de los mismos. La descripción incluye cualquier versión humanizada del anticuerpo hCTLA4.27A tal como se muestra en los ejemplos. Tal como se usa en el presente documento “anticuerpo 27” y “hCTLA4.27” se usan de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que comprende la región VH de SEQ ID NO: 7 y la región VL de SEQ ID NO: 8, más preferiblemente la región VH de cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 y la región VL de cualquiera de SEQ ID NO: 22, 24, 26 ó 30. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias procedentes tanto de anticuerpos humanos como de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de ratón o rata). En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones de entramado (FR) son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana (Fc).

En general, la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena “ligera” (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que es responsable principalmente del reconocimiento de antígeno. La porción carboxilo-terminal de la cadena pesada puede definir una región constante que es responsable principalmente de la función efectora. Normalmente, las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Además, las cadenas pesadas humanas se clasifican normalmente como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase generalmente Fundamental Immunology, cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989).

Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por tanto, en general, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. A excepción de los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son, en general, los mismos.

Normalmente, los dominios variables tanto de las cadenas pesadas como de las cadenas ligeras comprenden tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), ubicadas dentro de regiones de entramado (FR) relativamente conservadas. Las CDR se alinean habitualmente por las regiones de entramado, lo que permite la unión a un epítopo específico. En general, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, los dominios variables tanto de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas comprenden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es, generalmente, según las definiciones de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat,et al.;Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md.; 5a ed.; publ. del NIH n.° 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat,et al.,(1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia,et al.,(1987) J Mol. Biol. 196:901-917 o Chothia,et al.,(1989) Nature 342:878-883.

Tal como se usa en el presente documento, el término “región hipervariable” se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácido de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (es decir, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en el dominio variable de cadena ligera y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en el dominio variable de cadena pesada). Véase Kabatet al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,<5>a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (que define las regiones CDR de un anticuerpo por secuencia); véase también Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (que define las regiones CDR de un anticuerpo por estructura). Tal como se usa en el presente documento, el término residuos de “entramado” o “FR” se refiere a aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable definidos en el presente documento como residuos de CDR.

“Molécula de ácido nucleico aislada” o “polinucleótido aislado” significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético, o alguna combinación de los mismos, que no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unido a un polinucleótido al que no se une en la naturaleza. Con los propósitos de esta divulgación, debe entenderse que “una molécula de ácido nucleico que comprende” una secuencia de nucleótidos particular no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas “que comprenden” secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte o más de otras proteínas o porciones o fragmentos de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras operativamente unidas que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácido nucleico enumeradas, y/o pueden incluir secuencias de vectores.

La expresión “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

Un ácido nucleico o polinucleótido está “operativamente unido” cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretor está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si se posiciona para facilitar la traducción. Generalmente, pero no siempre, “operativamente unido” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se usan ligadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se usan de manera intercambiable y la totalidad de tales designaciones incluyen la progenie. Por tanto, los términos “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados a partir de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que no toda la progenie tendrá un contenido de ADN precisamente idéntico, debido a mutaciones voluntarias o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la detectada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenden designaciones distintas, resultará evidente a partir del contexto.

Tal como se usa en el presente documento, “secuencia de línea germinal” se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas. Puede usarse cualquier fuente adecuada de secuencias de inmunoglobulina no reordenadas. Las secuencias de línea germinal humanas pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de las bases de datos de línea germinal JOINSOLVER en el sitio web del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y Cutáneas de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos. Las secuencias de línea germinal de ratón pueden obtenerse, por ejemplo, tal como se describe en Giudicelliet al.(2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

Los anticuerpos de la presente descripción pueden comprender cualquier combinación de las cadenas pesadas y ligeras tal como se definen en la presente solicitud y que se presentan en SEQ ID NO: 7 y 8, y más preferiblemente las cadenas pesadas tal como se presentan en SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 y la cadena ligera tal como se presenta en SeQ ID NO: 22, 24, 26 y 30.

Esto significa que pueden realizarse las siguientes combinaciones:

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 22

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 22

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 22

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 22

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 22

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 22

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 24

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 24

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 24

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 24

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 24

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 24

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 26

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 26

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 26

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 26

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 26

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 26

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 30

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 30

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 30

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 30

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 30

un anticuerpo con una cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 30

Propiedades físicas y funcionales de los anticuerpos anti-CTLA-4 a modo de ejemplo

La presente descripción proporciona anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen características estructurales y funcionales especificadas, y métodos de uso de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en el tratamiento o la prevención de una enfermedad (por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa). Todos estos se originan a partir del anticuerpo de ratón que se ha hallado tal como se describe en los ejemplos, anticuerpo que tiene la cadena pesada de SEQ ID NO: 32 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 34 (las secuencias de nucleótidos que codifican para éstas son SEQ ID NO: 31 y 33, respectivamente).

Este anticuerpo y los anticuerpos humanizados derivados a partir del mismo se caracterizan porque se unen a CTLA-4 humano (hCTLA-4) con una CE<50>menor de 20 nM, preferiblemente menor de 1 nM, y son capaces de bloquear la unión de hCTLA-4 a hCD80 o hCD86 con una CI<50>menor de 100 nM, preferiblemente menor de 10 nM, para el bloqueo de hCD80 y preferiblemente menor de 10 nM, más preferiblemente menor de 2,5 nM, para el bloqueo de hCD86. Debe observarse que el perfil de bloqueo de hCD80 de los anticuerpos de la presente invención se encuentra entre los perfiles de bloqueo de hCD80 de 10D1 (ipilimumab) y CP-675,206 (tremelimumab) (véase la figura 2). Difiere de ipilimumab y tremelimumab porque se une a un epítopo diferente en la molécula de CTLA-4. Una de las diferencias es que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención no se une a la molécula de CTLA-4 quimérica de ratón-humano cuya secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 44 (véase también la figura 5), mientras que 10D1 y CP-675,206 sí se unen.

Hay disponibles varios métodos para el mapeo fino de epítopos de anticuerpo en antígenos diana, incluyendo: espectrometría de masas de intercambio de H/D, cristalografía de rayos X, matriz de péptidos, y mutagénesis dirigida al sitio. Por ejemplo, puede usarse HDX (intercambio de hidrógeno-deuterio) acoplado con proteólisis y espectrometría de masas para determinar el epítopo de un anticuerpo en un antígeno específico Y. HDX-MS se basa en la medición y la comparación precisas del grado de incorporación de deuterio por un antígeno cuando se incuba en D<2>O por sí mismo y en presencia de su anticuerpo en diversos intervalos de tiempo. El deuterio se intercambia por hidrógeno en la estructura principal de amida de las proteínas en áreas expuestas, mientras que las regiones del antígeno unidas al anticuerpo se protegerán y mostrarán un intercambio menor o nulo después del análisis por CL-EM/EM de los fragmentos proteolíticos.

La descripción también comprende anticuerpos anti-CTLA-4 que se unen a un epítopo de CTLA-4 humano, pero que no se unen a la molécula de CTLA-4 quimérica de ratón-humano de SEQ ID NO: 44.

Además, la descripción proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CTLA-4 humano (por ejemplo, anticuerpos humanizados) y tienen dominios V<l>y dominios VHcon al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-30, preferiblemente con al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 30; en los que la variante muestra la unión y las propiedades deseadas, que es la capacidad para unirse a CTLA-4 y bloquear de ese modo la unión de CTLA-4 a Cd80 y/o CD86. También se divulgan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CTLA-4 humano (por ejemplo, anticuerpos humanizados) y tienen dominios Vl y dominios Vh con al menos el 95%de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-30, preferiblemente con al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 30. En otras realizaciones, la descripción proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CTLA-4 humano (por ejemplo, anticuerpos humanizados) y tienen dominios V<l>y dominios VHcon al menos el 97 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-30, preferiblemente con al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 30. La descripción proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CTLA-4 humano (por ejemplo, anticuerpos humanizados) y tienen dominios V<l>y dominios VHcon al menos el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-30, preferiblemente con al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó 30.

“Variantes modificadas de manera conservadora” o “sustitución conservadora” se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína por otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de cadena lateral, hidrofobia/hidrofilia, conformación y rigidez de estructura principal, etc.), de manera que los cambios pueden realizarse con frecuencia sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watsonet al.(1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4a ed.)). Además, es menos probable que las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares alteren la actividad biológica. En la tabla 2 se exponen sustituciones conservadoras a modo de ejemplo.

Tabla 2. Sustituciones de aminoácidos conservadoras a modo de ejemplo.

“Variantes conservadoras de función”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos o fragmentos en los que se han cambiado uno o más residuos de aminoácido sin alterar una propiedad deseada, tal como la afinidad y/o especificidad de antígeno. Tales variantes incluyen, pero no se limitan a, el reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares, tal como las sustituciones de aminoácidos conservadoras de la tabla 2. También se proporcionan polipéptidos aislados que comprenden los dominios VL de los anticuerpos anti-CTLA-4 de la descripción (por ejemplo, las SEQ ID NO: 22, 24, 26, 30), y polipéptidos aislados que comprenden los dominios VHde los anticuerpos anti-CTLA-4 de la descripción (por ejemplo, las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20) que tienen hasta 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos.

También se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CTLA-4 humano y tiene dominios Vl y dominios Vh con al menos el 99 % el 98 %, el 97 %, el 96 %, el 95 %, el 90 %, el 85 %, el 80 % o el 75 % de identidad de secuencia con uno o más de los dominios Vl o dominios Vh descritos en el presente documento, y muestra una unión específica a CTLA-4. En otra realización, el anticuerpo de unión o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente descripción comprende dominios V<l>y VH(con y sin secuencia señal) que tienen hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más sustituciones de aminoácidos, y muestra una unión específica a CTLA-4.

Polinucleótidos y polipéptidos

La presente descripción comprende además los polinucleótidos que codifican para cualquiera de los polipéptidos o las cadenas de inmunoglobulina de los anticuerpos anti-CTLA-4 de la invención. La presente descripción incluye los polinucleótidos que codifican para los aminoácidos descritos en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-30.

Se proporciona un polinucleótido aislado, por ejemplo, ADN, que codifica para las cadenas de polipéptido de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno aislados expuestos en el presente documento. El polinucleótido aislado codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende al menos un dominio variable de cadena ligera (Vl) de inmunoglobulina maduro según la invención y/o al menos un dominio variable de cadena pesada (Vh) de inmunoglobulina maduro según la invención. En algunos casos, el polinucleótido aislado codifica tanto para una cadena ligera como para una cadena pesada en una única molécula de polinucleótido, y en otras realizaciones, las cadenas ligeras y pesadas se codifican en moléculas de polinucleótido independientes. En otro caso, el polinucleótido codifica además para una secuencia señal.

En un caso, la descripción comprende un polinucleótido aislado que codifica para un dominio variable de cadena pesada (Vh) de anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende HCDR-1 (SEQ ID NO: 1), HCDR-2 (SEQ ID NO: 2) y HCDR-3 (SEQ ID NO: 3).

En un caso, la descripción comprende un polinucleótido aislado que codifica para un dominio variable de cadena ligera (V<l>) de anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende LCDR-1 (SEQ ID NO: 4), LCDR-2 (SEQ ID NO: 5) y LCDR-3 (SEQ ID NO: 6).

En un caso, la descripción comprende un polinucleótido aislado que codifica para el dominio variable de cadena pesada (Vh) de inmunoglobulina de SEQ ID NO: 7.

En un caso, la descripción comprende un polinucleótido aislado que codifica para el dominio variable de cadena ligera (Vl) de inmunoglobulina de SEQ ID NO: 8.

En un caso, la descripción comprende un polinucleótido aislado según cualquiera de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 ó 19 que codifica para una cadena pesada humanizada.

En un caso, la descripción comprende un polinucleótido aislado según cualquiera de SEQ ID NO: 21, 23, 25 ó 29 que codifica para una cadena ligera humanizada.

En un caso adicional de la descripción, está comprendido un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido aislado según cualquiera de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 ó 19 que codifica para una cadena pesada humanizada y un polinucleótido aislado según cualquiera de SEQ ID NO: 21, 23, 25 ó 29 que codifica para una cadena ligera humanizada. Se incluyen todas las combinaciones posibles de éstas. Por consiguiente, la descripción comprende un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 21, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 21, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 21, un polinucleótido que comprende SEQ ID<n>O: 15 y SEQ ID NO: 21, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 21, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 23, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 23, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 13 y SEQ ID N<o>: 23, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 23, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 23, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 25, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 25, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 25, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 25, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 25, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 19 y SEQ ID nO: 25, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 29, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 29, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 29, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 29, un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 17 y SEQ ID<n>O: 29, y/o un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 29.

Esta presente invención también proporciona vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como plásmidos, que comprenden los polinucleótidos aislados de la invención, en los que el polinucleótido está operativamente unido a secuencias de control que son reconocidas por una célula huésped cuando la célula huésped se transfecta con el vector. También se proporcionan células huésped que comprenden un vector de la presente descripción y métodos para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido divulgado en el presente documento que comprenden cultivar una célula huésped que alberga un vector de expresión o un ácido nucleico que codifica para las cadenas de inmunoglobulina del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en un medio de cultivo, y aislar el antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo a partir de la célula huésped o el medio de cultivo.

En la presente descripción también se incluyen polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos de inmunoglobulina, que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente el 75 % idénticas, el 80 % idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90 % idénticas y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% idénticas (por ejemplo, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, el 100%) a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento cuando se realiza la comparación mediante un algoritmo BLAST en el que los parámetros del algoritmo se seleccionan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias respectivas a lo largo de toda la longitud de las secuencias de referencia respectivas (por ejemplo, umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 3; coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; matriz<b>L<o>SUM 62; costes por hueco: existencia 11, extensión 1; ajuste de matriz de puntuación composicional condicional).

La identidad de secuencia se refiere al grado en que los aminoácidos de dos polipéptidos son los mismos en posiciones equivalentes cuando se alinean de manera óptima las dos secuencias.

Las siguientes referencias se refieren a algoritmos de BLAST usados a menudo para el análisis de secuencias: ALGORITMOS DE BLAST: Altschulet al.(2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F.,et al,(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W.,et al.,(1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L.,et al.,(1996) Met. Enzymol.

266:131-141; Altschul, S.F.,et al.,(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J.,et al.,(1997) Genome Res.

7:649-656; Wootton, J.C.,et al.,(1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M.et al.,(1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; SISTEMAS DE PUNTUACIÓN DE ALINEACIONES: Dayhoff, M.O.,et al.,“A model of evolutionary change in proteins” en Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), págs. 345 352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M.,et al.,“Matrices for detecting distant relationships” en Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), págs. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J.,et al.,(1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S.,et al.,(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F.,et al.,(1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ESTADÍSTICA DE ALINEACIÓN: Karlin, S.,et al.,(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S.,et al.,(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A.,et al.,(1994) Ann. Prob.

22:2022-2039; y Altschul, S.F. “Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments” en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) págs. 1-14, Plenum, Nueva York.

Afinidad de unión

A modo de ejemplo, y no de limitación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados en el presente documento pueden unirse a CTLA-4 humano (registro del NCBI n.° NM_005214.4) que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: (SEQ ID NO: 36):

M AC L GF QR H K A Q L N L AT R T WP C T L L F F LL F I P V F C K A M H V A Q P A V V L A S S R G I A S F VC E Y A S P G K A T E V R V T V L R Q A D S Q V T E V C A A TY M MG N E L T F L D D S I C T G T S S G N Q V N L T I QG L R A M D T G L Y I C K V E L MY P P P Y Y L G I GN G T Q I Y V I D P E P C P D S D F L L W I L A A V S S G L F F Y S F L L T A V S L S K M L K K R S P L T T G V Y V K M P P T E P E C E K Q F Q P Y F I P I N

con un valor de KD de al menos aproximadamente 1 x 10-9 M (es decir, un valor de KD de 1 x 10-9 M o inferior) tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, BIACORE) o una técnica similar (por ejemplo, KinExa u OCTET).

Activación de células inmunitarias

En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la descripción aumentan la actividad de una célula inmunitaria. El aumento de la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse usando cualquier método conocido en la técnica. En una realización, el aumento en la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse midiendo la proliferación de la célula inmunitaria. Por ejemplo, un aumento en la actividad de una célula T puede detectarse midiendo la proliferación de la célula T o eventos de transducción de señales tales como fosforilación de tirosina de inmunorreceptores o cinasas aguas abajo que transmiten señales a reguladores transcripcionales. En otras realizaciones, el aumento en la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse midiendo la función citotóxica de células NK o CTL en células diana específicas o respuestas de citocinas IFNy, que están asociadas con la estimulación de la inmunidad antitumoral. En aún otras realizaciones, el aumento en la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse midiendo la activación de células Tex vivoen una muestra derivada del sujeto. En una realización, el aumento en la actividad de células T se determina: (i) midiendo la producción inducida por SEB (enterotoxina B deStaphylococcus)de una o más citocinas proinflamatorias seleccionadas del grupo que consiste en: IL-2, TNFa, IL-17, IFNy, IL-1p, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 e IL-13 o la regulación por incremento de marcadores de activación de membrana de un grupo que consiste en: CD25 y CD69 o la inducción de proliferación usando la detección de formación de blastocitos mediante citometría de flujo o incorporación de 3H o (ii) midiendo reacciones linfocitarias mixtas o la estimulación directa con AcM anti-CD3 de la señalización del receptor de células T (TCR) para inducir la producción de una citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-2, TNFa, IL-17, IFNy, IL-1p, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 e IL-13 o la regulación por incremento de marcadores de activación de membrana de un grupo que consiste en: CD25 y CD69 o la inducción de proliferación usando la detección de formación de blastocitos mediante citometría de flujo o incorporación de 3H. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención estimulará las células T CD3+, cuando éstas se presentan a células Raji que expresan CD80 y CD86, para producir citocinas proinflamatorias seleccionadas del grupo que consiste en: iL-2, TNFa, IL-17, IFNy, IL-ip, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 e IL-13 o la regulación por incremento de marcadores de activación de membrana de un grupo que consiste en: CD25 y CD69 o la inducción de proliferación usando la detección de formación de blastocitos mediante citometría de flujo o incorporación de 3H. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención estimulará la producción de IL-2 y/o IFNy por células T activadas en al menos 1,5 veces. Tal como resulta evidente a partir de la parte experimental, las características de activación de células T de los anticuerpos de la presente invención es aproximadamente igual a las características de estimulación de células T de los conocidos anticuerpos anti-hCTLA4 ipilimumab y tremelimumab de la técnica anterior.

Función efectora de los anticuerpos anti-hCTLA-4

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CTLA-4 o fragmentos de unión a antígeno de la invención pueden agotar las células T reguladoras CTLA-4+. La capacidad de los anticuerpos para ejercer una función efectora de este tipo puede determinarse usando cualquier método conocido en la técnica. En una realización, la capacidad de los anticuerpos para inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos se determina usando células citolíticas naturales como células efectoras y una línea celular que expresa de manera estable CTLA-4 humano. Tal como se muestra en la sección experimental, los anticuerpos contra hCTLA-4 con una porción Fc de IgG1 humana son capaces de inducir ADCC en células CTLA-4+.

En otra realización, la capacidad de los anticuerpos para inducir citotoxicidad dependiente del complemento se determina usando complemento humano y una línea celular que expresa de manera estable CTLA-4 humano. Tal como se muestra en la sección experimental, los anticuerpos contra hCTLA-4 con una porción Fc de IgG1 humana son capaces de inducir CDC en células CTLA-4+.

En otra realización, la capacidad de los anticuerpos para inducir lisis mediada por células puede determinarse usando monocitos CD14+CD16++ no clásicos que inducen lisis dependiente de FcyRIIIA de Treg CTLA-4+ en el contexto de un anticuerpo contra CTLA-4 de hIgG1 tal como ipilimumab (Romanoet al.,PNAS, 2015, 6140-6145, doi: 10.1073/pnas.1417320112).

Capacidad de los anticuerpos anti-hCTLA-4 para bloquear la unión a hCD80 y hCD86

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CTLA-4 o fragmentos de unión a antígeno de la invención son capaces de bloquear la unión de CTLA-4 humano a CD80 humano y/o CD86 humano. La capacidad para bloquear la unión de CTLA-4 humano a CD80 humano y/o CD86 humano puede determinarse usando cualquier método conocido en la técnica. En una realización, la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de CTLA-4 humano a CD80 humano y/o CD86 humano se determina usando un ensayo ELISA.

Tal como se muestra en la sección experimental, la potencia de bloqueo de la unión de CTLA-4 a CD80 humano y/o CD86 humano se asemeja a las actividades de los conocidos anticuerpos anti-CTLA-4 ipilimumab y tremelimumab. Debe destacarse que los anticuerpos anti-CTLA-4 de la invención mostraron una eficacia intermedia entre los efectos de ipilimumab y tremelimumab con respecto al bloqueo de hCD80 (véase la figura 2).

Métodos de preparación de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos

Por tanto, la presente descripción incluye métodos para preparar un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente descripción que comprenden cultivar una célula de hibridoma que expresa el anticuerpo o fragmento en condiciones favorables para tal expresión y, opcionalmente, aislar el anticuerpo o fragmento a partir del hibridoma y/o el medio de crecimiento (por ejemplo, medio de cultivo celular).

Los anticuerpos monoclonales derivados de animales distintos de ratas y ratones ofrecen ventajas distintivas. Muchas dianas proteicas relevantes para la transducción de señales y la enfermedad están altamente conservadas entre ratones, ratas y humanos y, por tanto, pueden reconocerse como autoantígenos por un huésped ratón o rata, lo que las hace menos inmunogénicas. Este problema puede evitarse cuando se usa un conejo como animal huésped. Véase, por ejemplo, Rossiet al.,Am. J. Clin. Pathol., 124, 295-302, 2005.

Los métodos para producir y cribar anticuerpos específicos usando la tecnología de hibridoma son rutinarios y se conocen bien en la técnica. En un ejemplo no limitativo, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés o una célula que expresa un antígeno de este tipo. Una vez detectada una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero de ratón, se recoge el bazo de ratón y se aíslan los esplenocitos. Las células B se cultivaron tal como describen Steenbakkerset al.,1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134.

Luego se inmortalizan clones de células B de los sobrenadantes reactivos, por ejemplo, mediante minielectrofusión siguiendo procedimientos publicados (Steenbakkerset al.,1992, J. Immunol. Met. 152: 69-77; Steenbakkerset al.,1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-34). Se seleccionan y clonan los hibridomas mediante dilución limitante.

Luego se someten a ensayo los clones de hibridoma mediante métodos conocidos en la técnica en busca de células que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno. Puede generarse líquido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, mediante la inoculación intraperitoneal de clones de hibridoma positivos a los ratones.

Los adyuvantes que pueden usarse en los métodos de generación de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes proteicos; adyuvantes bacterianos, por ejemplo, bacterias completas (BCG,Corynebacterium parvum, Salmonella minnesota)y componentes bacterianos incluyendo el esqueleto de la pared celular, dimicolato de trehalosa, monofosforil-lípido A, residuo que puede extraerse con metanol (MER) del bacilo tuberculoso, adyuvante completo o incompleto de Freund; adyuvantes virales; adyuvantes químicos, por ejemplo, hidróxido de aluminio, yodoacetato, y hemisuccinato de colesterilo; o adyuvantes de ADN desnudo. Otros adyuvantes que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen toxina colérica, proteínas deParapox,MF-59 (Chiron Corporation; véase también Bieget al.(1999) “GAD65 And Insulin B Chain Peptide (9-23) Are Not Primary Autoantigens In The Type 1 Diabetes Syndrome Of The BB Rat”, Autoimmunity, 31(1):15-24), MPL® (Corixa Corporation; véanse también Lodmellet al.(2000) “DNA Vaccination Of Mice Against Rabies Virus: Effects Of The Route Of Vaccination And The Adjuvant Monophosphoryl Lipid A (MPL)”, Vaccine, 18: 1059-1066; Johnsonet al.(1999) “3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid A Derivatives: Synthesis And Immunostimulant Activities”, Journal of Medicinal Chemistry, 42: 4640-4649; Baldridgeet al.(1999) “Monophosphoryl Lipid A (MPL) Formulations For The Next Generation Of Vaccines”, Methods, 19: 103-107), adyuvante rC-529 (Corixa Corporation; el compuesto de partida de la biblioteca química de aminoalquil-glucosaminida-4-fosfato (AGP) de Corixa, véase también www.corixa.com), y adyuvante DETOX™ (Corixa Corporation; el adyuvante DETOX™ incluye el adyuvante MPL® (monofosforil-lípido A) y esqueleto de la pared celular micobacteriana; véanse también Etonet al.(1998) “Active Immunotherapy With Ultraviolet B-Irradiated Autologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX In Patients With Metastatic Melanoma”, Clin. Cancer Res.

4(3):619-627; y Guptaet al.(1995) “Adjuvants For Human Vaccines-Current Status, Problems And Future Prospects”, Vaccine, 13(14): 1263-127).

Numerosas publicaciones comentan el uso de la tecnología de presentación en fago para producir y cribar bibliotecas de polipéptidos para la unión a un analito seleccionado. Véanse, por ejemplo, Cwirlaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlinet al.,Science 249, 404-6, 1990, Scott y Smith, Science 249, 386-88, 1990; y Ladneret al.,patente estadounidense n.° 5.571.698. Un concepto básico de los métodos de presentación en fago es el establecimiento de una asociación física entre el ADN que codifica para un polipéptido que va a cribarse y el polipéptido. Esta asociación física se proporciona por la partícula de fago, que presenta un polipéptido como parte de una cápside que encierra el genoma del fago que codifica para el polipéptido. El establecimiento de una asociación física entre polipéptidos y su material genético permite el cribado masivo simultáneo de números muy grandes de fagos que portan polipéptidos diferentes. Los fagos que presentan un polipéptido con afinidad por una diana se unen a la diana y estos fagos se enriquecen mediante cribado por afinidad con respecto a la diana. La identidad de los polipéptidos presentados a partir de estos fagos puede determinarse a partir de sus genomas respectivos. Usando este método, luego puede sintetizarse en masa un polipéptido que se ha identificado que tiene afinidad de unión por una diana deseada mediante medios convencionales. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.057.098, incluyendo la totalidad de tablas, figuras, y reivindicaciones.

Luego pueden seleccionarse los anticuerpos que se generan mediante estos métodos cribando en primer lugar la afinidad y la especificidad con el polipéptido purificado de interés y, si se requiere, comparando los resultados con la afinidad y la especificidad de los anticuerpos con polipéptidos que se desea excluir de la unión. El procedimiento de cribado puede implicar la inmovilización de los polipéptidos purificados en pocillos independientes de placas de microtitulación. Luego se coloca la disolución que contiene un posible anticuerpo o posibles grupos de anticuerpos en los pocillos de microtitulación respectivos y se incuba durante de aproximadamente 30 min a 2 h. Luego se lavan los pocillos de microtitulación y se añade un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina si los anticuerpos producidos son anticuerpos de ratón) a los pocillos y se incuba durante aproximadamente 30 min y luego se lava. Se añade sustrato a los pocillos y aparecerá una reacción de coloración cuando esté presente el anticuerpo contra el/los polipéptido(s) inmovilizado(s).

Luego pueden analizarse adicionalmente la afinidad y la especificidad de los anticuerpos así identificados en el diseño de ensayo seleccionado. En el desarrollo de inmunoensayos para una proteína diana, la proteína diana purificada actúa como patrón con el que evaluar la sensibilidad y la especificidad del inmunoensayo usando los anticuerpos que se han seleccionado. Debido a que la afinidad de unión de diversos anticuerpos puede diferir, determinados pares de anticuerpos (por ejemplo, en ensayos en sándwich) pueden interferir unos con otros de manera estérica, etc., el rendimiento del ensayo de un anticuerpo puede ser una medida más importante que la afinidad y la especificidad absolutas de un anticuerpo.

Los anticuerpos también pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, pueden introducirse complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humanos al azar o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, pueden introducirse la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas en células madre embrionarias de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden hacerse no funcionales de manera independiente o simultánea con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región JH impide la producción de anticuerpos endógenos. Se expanden las células madre embrionarias modificadas y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Luego se crían los ratones quiméricos para producir camadas homocigóticas que expresen anticuerpos humanos. Se inmunizan los ratones transgénicos usando metodologías convencionales con un antígeno seleccionado, por ejemplo, la totalidad o una porción de un polipéptido de la invención. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno a partir de los ratones transgénicos inmunizados usando la tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de células B, y posteriormente experimentan cambio de clase y mutación somática. Por tanto, usando una técnica de este tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberget al.(1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice”, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.osWO 98/24893, WO 96/34096, y WO 96/33735; y las patentes estadounidenses n.os 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318, y 5.939.598. Además, pueden contratarse empresas tales como Abgenix/Amgen (Freemont, Calif.) y Medarex/BMS (Princeton, N.J.), Kymab (Cambridge, Reino Unido) y Merus (Utrecht, Países Bajos) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.

Los anticuerpos anti-CTLA-4 divulgados en el presente documento también pueden producirse de manera recombinante (por ejemplo, en un sistema de expresión enE. col¡/T7,un sistema de expresión en células de mamífero o un sistema de expresión en eucariotas inferiores). En esta realización, los ácidos nucleicos que codifican para las moléculas de inmunoglobulina de anticuerpo de la invención (por ejemplo, VHo V<l>) pueden insertarse en un plásmido basado en pET y expresarse en el sistemaE. col¡/T7.Por ejemplo, la presente invención incluye métodos para expresar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o una cadena de inmunoglobulina del mismo en una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped bacteriana tal comoE. col¡tal como BL21 o BL21DE3) que comprenden expresar ARN polimerasa T7 en la célula que también incluye un polinucleótido que codifica para una cadena de inmunoglobulina que está operativamente unida a un promotor T7. Por ejemplo, en una realización de la invención, una célula huésped bacteriana, tal como unaE. col¡,incluye un polinucleótido que codifica para el gen de ARN polimerasa T7 operativamente unido a un promotorlacy se induce la expresión de la polimerasa y la cadena mediante la incubación de la célula huésped con IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido).

Las preparaciones de anticuerpos monoclonales pueden producirse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes, y de presentación en fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlowet al.,ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling,et al.,en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS, págs. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). El término “anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en el presente documento, no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota, o de fago, y no del método mediante el cual se produce. Se divulga un ejemplo de un método para la producción recombinante de anticuerpos en la patente estadounidense n.° 4.816.567.

Por tanto, la presente invención incluye métodos recombinantes para preparar un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención, o una cadena de inmunoglobulina del mismo, que comprenden introducir un polinucleótido que codifica para una o más cadenas de inmunoglobulina del anticuerpo o fragmento (por ejemplo, cadena de inmunoglobulina pesada y/o ligera); cultivar la célula huésped (por ejemplo, CHO oP¡ch¡aoP¡ch¡a pastons)en condiciones favorables para tal expresión y, opcionalmente, aislar el anticuerpo o fragmento o la cadena a partir de la célula huésped y/o el medio en el que se cultiva la célula huésped.

Los anticuerpos anti-CTLA-4 también pueden sintetizarse mediante cualquiera de los métodos expuestos en la patente estadounidense n.° 6.331.415.

Las células huésped eucariotas y procariotas, incluyendo células de mamífero, como huéspedes para la expresión de los anticuerpos o fragmentos o las cadenas de inmunoglobulina divulgados en el presente documento se conocen bien en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Éstas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, HepG2), células A549, células 3T3, células HEK-293 y otras varias líneas celulares. Las células huésped de mamífero incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, bovinas, de caballo y de hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibio, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Las células fúngicas incluyen células de levaduras y hongos filamentosos incluyendo, por ejemplo,Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijper, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichiasp.,Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycessp.,Hansenula polymorpha, Kluyveromycessp.,Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusariumsp.,Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patensyNeurospora crassa. Pichiasp., cualquierSaccharomycessp.,Hansenula polymorpha,cualquierKluyveromycessp.,Candida albicans,cualquierAspergillussp.,Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense,cualquierFusariumsp.,Yarrowia lipolytica,yNeurospora crassa.Cuando se introducen en células huésped de mamífero los vectores de expresión recombinantes que codifican para la cadena pesada o una porción de unión a antígeno o un fragmento de la misma, la cadena ligera y/o el fragmento de unión a antígeno de la misma, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo o fragmento o la cadena en la células huésped o la secreción al medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped.

Pueden utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión en huésped para expresar los anticuerpos de la invención. Tales sistemas de expresión en huésped representan vehículos mediante los cuales pueden producirse y posteriormente purificarse las secuencias codificantes de los anticuerpos, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, pueden expresar los anticuerpos de la invenciónin situ.Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo,E. coliyB. subtilis)transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de inmunoglobulina; levaduras (por ejemplo,Saccharomyces, Pichia)transformadas con vectores recombinantes de expresión de levaduras que contienen secuencias codificantes de inmunoglobulina; sistemas de células de insecto infectados con vectores recombinantes de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificantes de inmunoglobulina; sistemas de células vegetales infectados con vectores recombinantes de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV)) o transformados con vectores recombinantes de expresión de plásmidos (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de inmunoglobulinas; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo,<c>O<s>, CHO, BHK, 293, 293T, células 3T3, células linfáticas (véase la patente estadounidense n.° 5.807.715), células Per C.6 (células retinianas de rata desarrolladas por Crucell) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la variolovacuna).

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el anticuerpo que esté expresándose. Por ejemplo, cuando debe producirse una gran cantidad de una proteína de este tipo, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vector de expresión deE. colipUR278 (Rutheret al.(1983) “Easy Identification Of<c>DN<a>Clones”, EMBO J. 2:1791-1794), en el que la secuencia codificante de anticuerpo puede ligarse individualmente al vector en marco con la región codificantelacZde modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouyeet al.(1985) “Up-Promotor Mutations In The Lpp Gene OfEscherichia coli’,Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heekeet al.(1989) “Expression Of Human Asparagine Synthetase InEscherichia coli’,J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células sometidas a lisis mediante adsorción y unión a perlas de glutatión-agarosa de matriz seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión con proteasa de factor Xa o trombina de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse a partir del resto de GST.

En un sistema de insecto, como vector se usa virus de la poliedrosis nuclear deAutographa californica(AcNPV) para expresar genes extraños. El virus crece en células deSpodoptera frugiperda.La secuencia codificante de anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de poliedrina) del virus y situarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).

En células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se una un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma de adenovirus mediante recombinaciónin vitrooin vivo.La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en huéspedes infectados (véase, por ejemplo, Loganet al.(1984) “Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659). También pueden requerirse señales de iniciación específicas para una traducción eficiente de las secuencias codificantes de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas codones de iniciación y señales de control de traducción exógenos pueden proceder de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de transcripción, terminadores de transcripción, etc., apropiados (véase Bitteret al.(1987) “Expression And Secretion Vectors For Yeast”, Methods in Enzymol. 153:516-544).

Además, puede elegirse una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Células huésped diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para la modificación y el procesamiento posterior a la traducción de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que presentan la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación, y la fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VE<r>Y, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.

Para la producción de alto rendimiento y a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse por ingeniería líneas celulares que expresen de manera estable un anticuerpo de la invención. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, pueden transformarse las células huésped con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, puede permitirse el crecimiento de las células diseñadas por ingeniería durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para diseñar por ingeniería líneas celulares que expresen los anticuerpos de la invención. Tales líneas celulares diseñadas por ingeniería pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de compuestos que interaccionen de manera directa o indirecta con los anticuerpos de la invención.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitarse a, los genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigleret al.(1977) “Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells”, Cell 11:223-232), hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa (Szybalskaet al.(1962) “Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), y adenina-fosforribosiltransferasa (Lowyet al.(1980) “Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene”, Cell 22:817-823), que pueden emplearse en células tk', hgprt-, o aprt, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigleret al.(1980) “Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hareet al.(1981) “Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulliganet al.(1981) “Selection For Animal Cells That Express TheEscherichia coliGene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Tachibanaet al.(1991) “Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene”, Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) “Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions”, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.

32:573-596; Mulligan (1993) “The Basic Science Of Gene Therapy”, Science 260:926-932; y Morganet al.(1993) “Human gene therapy”, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217). Los métodos habitualmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubelet al.(eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; y en los capítulos 12 y 13, Dracopoliet al.(eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY; Colbere-Garapinet al.(1981) “A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells”, J. Mol. Biol. 150:1-14; e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerreet al.(1984) “Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells”, Gene 30:147-156).

Los niveles de expresión de un anticuerpo de la invención pueden aumentarse mediante amplificación vectorial (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, “The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammalian Cells”, en DNA CLONING, vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando puede amplificarse un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de células huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouseet al.(1983) “Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes”, Mol. Cell. Biol. 3:257-266).

La célula huésped puede transfectarse conjuntamente con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector para un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector para un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una misma expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un único vector que codifica para polipéptidos tanto de cadena pesada como de cadena ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe situarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot (1986) “Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes”, Nature 322:562-565; Kohler (1980) “Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos y las cadenas de inmunoglobulina pueden recuperarse a partir del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Además, la expresión de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos y cadenas de inmunoglobulina de la invención (u otros restos de los mismos) a partir de líneas celulares de producción puede potenciarse usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de genes de glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque habitual para potenciar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se comenta en su totalidad o en parte junto con las patentes europeas n.os 0216846, 0256055, y 0323997 y la solicitud de patente europea n.° 89303964.4. Por tanto, en una realización de la invención, las células huésped de mamífero (por ejemplo, CHO) carecen de un gen de glutamina sintetasa y se cultivan en ausencia de glutamina en el medio en el que, sin embargo, el polinucleótido que codifica para la cadena de inmunoglobulina comprende un gen de glutamina sintetasa que complementa la carencia del gen en la célula huésped.

La presente invención incluye métodos para purificar un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención que comprenden introducir una muestra que comprende el anticuerpo o fragmento en un medio de purificación (por ejemplo, medio de intercambio catiónico, medio de intercambio aniónico, medio de intercambio hidrófobo, medio de purificación por afinidad (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteína A/G, proteína L)) y o bien recoger el anticuerpo o fragmento purificado a partir de la fracción de flujo continuo de dicha muestra que no se une al medio; o bien descartar la fracción de flujo continuo y eluir el anticuerpo o fragmento unido a partir del medio y recoger el eluido. En una realización de la invención, el medio está en una columna a la que se aplica la muestra. En una realización de la invención, el método de purificación se realiza tras la expresión recombinante del anticuerpo o fragmento en una célula huésped, por ejemplo, en el que en primer lugar se somete a lisis la célula huésped y, opcionalmente, se purifica el lisado para eliminar materiales insolubles antes de la purificación en un medio.

En general, las glicoproteínas producidas en una línea celular o un animal transgénico particular tendrán un patrón de glicosilación que es característico para las glicoproteínas producidas en la línea celular o el animal transgénico. Por tanto, el patrón de glicosilación particular de un anticuerpo dependerá de la línea celular o el animal transgénico particular usado para producir el anticuerpo. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento, comprenden la presente invención, independientemente del patrón de glicosilación que puedan tener los anticuerpos. De manera similar, en realizaciones particulares, pueden ser ventajosos los anticuerpos con un patrón de glicosilación que comprende sólo W-glicanos no fucosilados, porque se ha demostrado que estos anticuerpos normalmente muestran una eficacia más potente que sus homólogos fucosilados tantoin vitrocomoin vivo(véanse por ejemplo, Shinkawaet al.,J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); las patentes estadounidenses n.os 6.946.292 y 7.214.775). Es poco probable que estos anticuerpos con W-glicanos no fucosilados sean inmunogénicos porque sus estructuras de hidrato de carbono son un componente normal de la población que existe en la IgG sérica humana.

La presente descripción incluye anticuerpos biespecíficos y bifuncionales y fragmentos de unión a antígeno que tienen una especificidad de unión por CTLA-4 y otro antígeno tal como, por ejemplo, un antígeno que desempeña un papel en la inmunoestimulación, tal como PD-1, PD-L1, TSLP, IL-10, 4-IBB, SIRP-alfa, ICOS, n Kg2C, NkG2A, los antígenos KR2DL y KIR3DL, OX40, CD40, ITL-1 a ITL-8, GITR, CD137, CS1, CD27, APRIL, o LAG-3, o antígenos que desempeñan un papel en el direccionamiento a y el reconocimiento de células cancerosas, tales como EGFR (ERBB1), HER2 (ERBB2), ERBB3, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, CEA, alfa-fetoproteína, CC49, VEGF, VEGFR, HGFR (MET), CA-125, tenascina, integrina, FAB, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, o RANKL, y métodos de uso de los mismos. En un caso, las cadenas anti-CTLA-4 comprenden una cualquiera de las secuencias de VH/VL proporcionadas en las SEQ ID NO: 7-30 (o un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de dichas secuencias, tal como se proporciona en las SEQ ID NO: 1-6). Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véanse, por ejemplo, Songsivilai,et al.,(1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, Kostelny,et al.,(1992) J Immunol. 148:1547-1553. Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formarse como “diacuerpos” (Holliger,et al.,(1993) PNAS USA 90:6444-6448) o como “janusinas” (Traunecker,et al.,(1991) EMBO J. 10:3655-3659 y Traunecker,et al.,(1992) Int. J. Cancer, supl. 7:51-52). Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formarse como “duocuerpos” (Labrijnet al.,PNAS 2013;110(13):5145-5150).

La presente descripción incluye además fragmentos de unión a antígeno anti-CTLA-4 de los anticuerpos anti-CTLA-4 divulgados en el presente documento. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab)<2>, que pueden producirse mediante escisión enzimática de una IgG, por ejemplo, con pepsina. Los fragmentos Fab pueden producirse, por ejemplo, mediante la reducción de F(ab)<2>con ditiotreitol o mercaptoetilamina.

Las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases dependiendo de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. En algunas realizaciones, pueden unirse diferentes dominios constantes a las regiones Vl y Vh humanizadas derivadas de las CDR proporcionadas en el presente documento. Hay al menos cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. La descripción comprende anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de estas clases o subclases de anticuerpos.

El anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante humana, tal como la región constante de cadena pesada humana y1, y2, y3 o y4, o una variante de las mismas. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena ligera, por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana, tal como la región constante de cadena ligera humana lambda o kappa, o una variante de las mismas. A modo de ejemplo, y no de limitación, la región constante de cadena pesada humana puede ser y4 y la región constante de cadena ligera humana puede ser kappa. En una realización alternativa, la región Fc del anticuerpo es<y>4 con una mutación Ser228Pro (Angal S.et al.,1993, Mol Immunol. 30: 105-108; la posición 241 se basa en el sistema de numeración de Kabat).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena pesada del subtipo IgG1.

Modificación por ingeniería de anticuerpos

Además, se incluyen realizaciones en las que los anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos modificados por ingeniería para incluir modificaciones en los residuos de entramado dentro de los dominios variables del anticuerpo monoclonal hCTLA4.27A parental, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo o fragmento. Normalmente, tales modificaciones de entramado se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo o fragmento. Esto se logra habitualmente reemplazando residuos que no son de CDR en los dominios variables (es decir, residuos de entramado) en un anticuerpo o fragmento parental (por ejemplo, de roedor) por residuos análogos del repertorio inmunitario de las especies en las que debe usarse el anticuerpo, por ejemplo, residuos humanos en el caso de productos terapéuticos para humanos. Un anticuerpo o fragmento de este tipo se denomina anticuerpo o fragmento “humanizado”. En algunos casos, es deseable aumentar la afinidad, o alterar la especificidad de un anticuerpo modificado por ingeniería (por ejemplo, humanizado). Un enfoque es “retromutar” uno o más residuos de entramado en la secuencia de línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo o fragmento que ha experimentado mutación somática puede contener residuos de entramado que difieren de la secuencia de línea germinal a partir de la cual deriva el anticuerpo. Tales residuos pueden identificarse comparando las secuencias de entramado de anticuerpo o fragmento con las secuencias de línea germinal a partir de las cuales deriva el anticuerpo o fragmento. Otro enfoque es revertir al residuo parental original (por ejemplo, de roedor) en una o más posiciones del anticuerpo modificado por ingeniería (por ejemplo, humanizado), por ejemplo, para restablecer la afinidad de unión que puede haberse perdido en el procedimiento de reemplazo de los residuos de entramado (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.693.762, la patente estadounidense n.° 5.585.089 y la patente estadounidense n.° 5.530.101).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se modifican por ingeniería (por ejemplo, se humanizan) para incluir modificaciones en el entramado y/o las CDR para mejorar sus propiedades. Tales cambios modificados por ingeniería pueden estar basados en el modelado molecular. Puede construirse un modelo molecular para la región variable para la secuencia de anticuerpo parental (no humana) para entender las características estructurales del anticuerpo y usarse para identificar potenciales regiones en el anticuerpo que pueden interaccionar con el antígeno. Las CDR convencionales se basan en la alineación de secuencias de inmunoglobulina y la identificación de regiones variables. Kabatet al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat,et al.;Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md.; 5a ed.; publ. del NIH n.° 91-3242; Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat,et al.,(1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616. Chothiaet al. examinaron cuidadosamente las conformaciones de los bucles en las estructuras cristalinas de anticuerpos y propusieron bucles hipervariables. Chothia,et al.,(1987) J Mol. Biol. 196:901-917 o Chothia,et al.,(1989) Nature 342:878-883. Hay variaciones entre las regiones clasificadas como “CDR” y “bucles hipervariables”. Estudios posteriores (Raghunathanet al.,(2012) J. Mol Recog. 25, 3, 103-113) analizaron varios complejos cristalinos de anticuerpo-antígeno y observaron que las regiones de unión a antígeno en los anticuerpos no conforman necesariamente de manera estricta a los residuos de “CDR” o bucles “hipervariables”. El modelo molecular para la región variable del anticuerpo no humano puede usarse para guiar la selección de regiones que potencialmente pueden unirse al antígeno. En la práctica, las potenciales regiones de unión a antígeno basadas en el modelo difieren de las “CDR” o los bucles “hipervariables” convencionales. Puede usarse software científico comercial tal como Discovery Studio (BIOVIA, Dassault Systemes) para el modelado molecular. Pueden seleccionarse entramados humanos basándose en las mejores coincidencias con la secuencia no humana tanto en los entramados como en las CDR. Para FR4 (entramado 4) en VH, las regiones VJ para las líneas germinales humanas se comparan con la región no humana correspondiente. En el caso de FR4 (entramado 4) en VL, las regiones J-kappa y J-lambda de las secuencias de línea germinal humanas se comparan con la región no humana correspondiente. Una vez identificados los entramados humanos adecuados, se injertan las CDR en los entramados humanos seleccionados. En algunos casos, pueden conservarse determinados residuos en la superficie de contacto VL-VH como en la secuencia no humana (parental). Los modelos moleculares también pueden usarse para identificar residuos que potencialmente pueden alterar las conformaciones de CDR y, por tanto, unirse al antígeno. En algunos casos, estos residuos se conservan como en la secuencia no humana (parental). Los modelos moleculares también pueden usarse para identificar aminoácidos expuestos a disolvente que pueden dar como resultado efectos indeseados tales como glicosilación, desamidación y oxidación. Pueden introducirse filtros de desarrollabilidad de manera temprana en la fase de diseño para eliminar/minimizar estos potenciales problemas.

Otro tipo de modificación de entramado implica mutar uno o más residuos dentro de la región de entramado, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de células T para reducir de ese modo la potencial inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque también se denomina “desinmunización” y se describe con mayor detalle en la patente estadounidense n.° 7.125.689.

En realizaciones particulares, será deseable cambiar determinados aminoácidos que contienen cadenas laterales expuestas por otro residuo de aminoácido con el fin de proporcionar una mayor estabilidad química del anticuerpo final, para evitar la desamidación o isomerización. La desamidación de asparagina puede producirse en las secuencias NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG o QS y dar como resultado la creación de un residuo de ácido isoaspártico que introduce un acodamiento en la cadena de polipéptido y disminuye su estabilidad (efecto de ácido isoaspártico). La isomerización puede producirse en las secuencias DG, dS, DA o DT. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación no contienen sitios de isomería de asparagina o desamidación.

Por ejemplo, un residuo de asparagina (Asn) puede cambiarse por Gln o Ala para reducir el potencial para la formación de isoaspartato en cualquier secuencia Asn-Gly, particularmente dentro de una CDR. Puede producirse un problema similar en una secuencia Asp-Gly. Reissner y Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. La formación de isoaspartato puede debilitar o suprimir completamente la unión de un anticuerpo a su antígeno diana. Véase Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 a 734. En una realización, la asparagina se cambia por glutamina (Gln). También puede ser deseable alterar un aminoácido adyacente a un residuo de asparagina (Asn) o glutamina (Gln) para reducir la probabilidad de desamidación, que se produce a mayores tasas cuando hay aminoácidos pequeños adyacentes a asparagina o glutamina. Véase Bischoff y Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. Además, cualquier residuo de metionina (normalmente Met expuesta a disolvente) en las CDR puede cambiarse por Lys, Leu, Ala o Phe, u otros aminoácidos, con el fin de reducir la posibilidad de que se oxide el azufre de la metionina, lo que puede reducir la afinidad de unión a antígeno y también contribuir a la heterogeneidad molecular en la preparación de anticuerpo final. Adicionalmente, con el fin de impedir o minimizar los potenciales enlaces peptídicos Asn-Pro escindibles, puede ser deseable alterar cualquier combinación Asn-Pro hallada en una CDR a Gln-Pro, Ala-Pro, o Asn-Ala. Posteriormente se criban los anticuerpos con tales sustituciones para garantizar que las sustituciones no disminuyen la afinidad o especificidad del anticuerpo por CTLA-4, u otra actividad biológica deseada, hasta niveles inaceptables.

Tabla 3. Variantes de CDR estabilizantes a modo de ejemplo.

Modificación por ingeniería de anticuerpos de la región Fc

Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) también pueden modificarse por ingeniería para incluir modificaciones dentro de la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades del anticuerpo, tales como semivida sérica, fijación del complemento, unión al receptor de Fc, y/o función efectora (por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de antígenos). Además, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) pueden modificarse químicamente (por ejemplo, uno o más restos químicos pueden unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades del anticuerpo o fragmento. Cada una de estas realizaciones se describe con mayor detalle a continuación. La numeración de residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) también incluyen anticuerpos y fragmentos con regiones Fc modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.624.821; el documento WO2003/086310; el documento WO2005/120571; el documento WO2006/0057702. Tales modificaciones pueden usarse para potenciar o suprimir diversas reacciones del sistema inmunitario, con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región Fc incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, deleciones e inserciones), glicosilación o desglicosilación, y adición de múltiples regiones Fc. Los cambios en la Fc también pueden alterar la semivida de los anticuerpos en anticuerpos terapéuticos, lo que permite una dosificación menos frecuente y, por tanto, una mayor comodidad y un menor uso del material. Véase Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 a 734-35.

En un caso, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la descripción (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) es un anticuerpo o fragmento de isotipo IgG4 que comprende una mutación de serina a prolina en una posición correspondiente a la posición 228 (S228P; índice EU) en la región bisagra de la región constante de cadena pesada. Se ha notificado que esta mutación suprime la heterogeneidad de los puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la región bisagra (Angal S.et al.,1993, Mol Immunol. 30: 105-108; la posición 241 se basa en el sistema de numeración de Kabat).

En una realización de la invención, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que se aumenta o disminuye el número de residuos de cisteína en la región bisagra. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente estadounidense n.° 5.677.425. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo o fragmento. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz de dominios CH2-CH3 del fragmento bisagra Fc de manera que el anticuerpo o fragmento tiene una unión a proteína estafilocócica A (SpA) alterada con respecto a la unión a SpA de dominio bisagra de Fc nativa. Este enfoque se describe con mayor detalle en la patente estadounidense n.° 6.165.745.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.277.375. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión a receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 5.869.046 y 6.121.022.

En aún otras realizaciones, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente para alterar la(s) función/funciones efectora(s) del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse por un residuo de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector y conserve la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector cuya afinidad se altera puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con mayor detalle en las patentes estadounidenses n.os 5.624.821 y 5.648.260.

En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 329, 331 y 322 pueden reemplazarse por un residuo de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una unión a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o suprimida. Este enfoque se describe con mayor detalle en la patente estadounidense n.° 6.194.551.

En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácido 231 y 239 se alteran para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 94/29351.

En aún otro ejemplo, se modifica la región Fc para disminuir la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para disminuir la afinidad del anticuerpo o fragmento por un receptor de Fcy mediante la modificación de uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 00/42072. Además, se han mapeado los sitios de unión en IgG1 humana para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shieldset al.(2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604).

En una realización de la invención, se modifica la región Fc para disminuir la capacidad del anticuerpo de la invención (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) para mediar en la función efectora y/o para aumentar las propiedades antiinflamatorias mediante la modificación de los residuos 243 y 264. En una realización, se modifica la región Fc del anticuerpo o fragmento cambiando los residuos en las posiciones 243 y 264 por alanina. En una realización, se modifica la región Fc para disminuir la capacidad del anticuerpo o fragmento para mediar en la función efectora y/o para aumentar las propiedades antiinflamatorias mediante la modificación de los residuos 243, 264, 267 y 328.

Potenciación de la función efectora

En algunas realizaciones, se modifica la región Fc de un anticuerpo anti-CTLA-4 para aumentar la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para mediar en la función efectora y/o para aumentar su unión a los receptores de Fcgamma (FcyR).

Se pretende que el término “función efectora”, tal como se usa en el presente documento, se refiera a uno o más de actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), respuestas mediadas por actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC), fagocitosis mediada por Fc o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y reciclaje de anticuerpos a través del receptor FcRn.

Se cree que la interacción entre la región constante de una proteína de unión a antígeno y diversos receptores de Fc (FcR) incluyendo FcgammaRI (CD64), FcgammaRII (CD32) y FcgammaRIII (CD16) media en las funciones efectoras, tales como ADCC y CDC, de la proteína de unión a antígeno. El receptor de Fc también es importante para la reticulación de anticuerpos, que puede ser importante para la inmunidad antitumoral.

La función efectora puede medirse de varias maneras incluyendo, por ejemplo, a través de la unión de FcgammaRIII a células citolíticas naturales o a través de la unión de FcgammaRI a monocitos/macrófagos para medir la función efectora de ADCC. Por ejemplo, puede evaluarse la función efectora de ADCC de una proteína de unión a antígeno de la presente invención en un ensayo de células citolíticas naturales. Pueden encontrarse ejemplos de tales ensayos en Shieldset al.,2001 J. Biol. Chem., vol. 276, págs. 6591-6604; Chappelet al.,1993 J. Biol. Chem., vol 268, págs. 25124-25131; Lazaret al.,2006 PNAS, 103; 4005-4010.

Las propiedades ADCC o CDC de los anticuerpos de la presente descripción, o sus propiedades de reticulación, pueden potenciarse de varias maneras.

Se ha demostrado que las regiones constantes de IgG1 humana que contienen mutaciones específicas o una glicosilación alterada en el residuo Asn297 potencian la unión a receptores de Fc. En algunos casos, también se ha demostrado que estas mutaciones potenciar la ADCC y la CDC (Lazaret al.PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shieldset al.J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechanskyet al.Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).

En una realización de la presente invención, tales mutaciones son en una o más de las posiciones seleccionadas de 239, 332 y 330 (IgG1). Ejemplos de mutaciones adecuadas son S239D y I332E y a 330L. En una realización, la proteína de unión a antígeno de la invención descrita en el presente documento se muta en las posiciones 239 y 332, por ejemplo, S239D y I332E, o en una realización adicional, se muta en tres o más posiciones seleccionadas de 239 y 332 y 330, por ejemplo, S239D y I332E y A330L (numeración según el índice EU).

En una realización alternativa de la presente invención, se proporciona un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada con un perfil de glicosilación alterado de manera que la proteína de unión a antígeno tiene una función efectora potenciada. Por ejemplo, en la que el anticuerpo tiene una ADCC potenciada o una CDC potenciada o en la que tiene una función efectora tanto de ADCC como de CDC potenciada. Se describen ejemplos de metodologías adecuadas para producir proteínas de unión a antígeno con un perfil de glicosilación alterado en los documentos WO2003011878, WO2006014679 y EP1229125.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona anticuerpos “no fucosilados” o “afucosilados”. Los anticuerpos no fucosilados albergan una estructura de núcleo de trimanosilo de W-glicanos de tipo complejo de Fc sin residuo de fucosa. Estos anticuerpos glicomodificados por ingeniería que carecen de residuo de fucosa de núcleo de los W-glicanos de Fc pueden mostrar una ADCC mayor que los equivalentes fucosilados debido a la potenciación de la capacidad de unión a FcgammaRIIIa.

La presente descripción también proporciona un método para la producción de un anticuerpo según la descripción que comprende las etapas de: a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado tal como se describe en el presente documento, en el que la célula huésped recombinante no comprende ninguna alfa-1,6-fucosiltransferasa; y b) recuperar la proteína de unión a antígeno. La célula huésped recombinante puede no contener normalmente un gen que codifica para una alfa-1,6-fucosiltransferasa (por ejemplo, células huésped de levaduras tales comoPichiasp.) o puede haberse modificado genéticamente para inactivar una alfa-1,6-fucosiltransferasa. Hay disponibles células huésped recombinantes que se han modificado genéticamente para inactivar el gen FUT8 que codifica para una alfa-1,6-fucosiltransferasa. Véase, por ejemplo, el sistema tecnológico POTELLIGENT™ disponible de BioWa, Inc. (Princeton, N.J.) en el que células CHOK1SV que carecen de una copia funcional del gen FUT8 producen anticuerpos monoclonales que tienen una actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) potenciada que se aumenta con respecto a un anticuerpo monoclonal idéntico producido en un célula con un gen FUT8 funcional. Se describen aspectos del sistema tecnológico POTELLIGENT™ en los documentos US7214775, US6946292, WO0061739 y WO0231240. Los expertos habituales en la técnica también reconocerán otros sistemas apropiados.

Resultará evidente para los expertos en la técnica que tales modificaciones no sólo pueden usarse solas, sino que también pueden usarse en combinación entre sí con el fin de potenciar adicionalmente la función efectora.

Producción de anticuerpos con glicosilación modificada

En todavía otra realización, los anticuerpos de la invención comprenden un patrón de glicosilación particular. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo o fragmento afucosilado o aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de fucosa o glicosilación, respectivamente). Puede alterarse el patrón de glicosilación de un anticuerpo o fragmento, por ejemplo, para aumentar la afinidad o avidez del anticuerpo o fragmento por un antígeno CTLA-4. Tales modificaciones pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más de los sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de una o más de los sitios de glicosilación de entramado de región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad o avidez del anticuerpo o fragmento por el antígeno. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.714.350 y 6.350.861.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) pueden incluir además aquellos producidos en células huésped de eucariotas inferiores, en particular células huésped fúngicas tales como levaduras y hongos filamentosos que se han modificado por ingeniería genética para producir glicoproteínas que tienen patrones de glicosilación de tipo mamífero o humano (véanse, por ejemplo, Choiet al.,(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5022-5027; Hamiltonet al.,(2003) Science 301: 1244-1246; Hamiltonet al.,(2006) Science 313: 1441-1443; Nettet al.,Yeast 28(3):237-52 (2011); Hamiltonet al.,Curr Opin Biotechnol. Octubre;18(5):387-92 (2007)). Una ventaja particular de estas células huésped modificadas genéticamente con respecto a las líneas celulares de mamífero usadas actualmente es la capacidad para controlar el perfil de glicosilación de las glicoproteínas que se producen en las células de manera que pueden producirse composiciones de glicoproteínas en las que predomina una estructura de W-glicano particular (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.029.872 y la patente estadounidense n.° 7.449.308). Estas células huésped modificadas genéticamente se han usado para producir anticuerpos que tienen predominantemente estructuras de W-glicano particulares (véase, por ejemplo, Liet al.,(2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215).

En casos particulares, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) incluyen además aquellos producidos en células huésped de eucariotas inferiores y que comprenden W-glicanos híbridos y complejos fucosilados y no fucosilados, incluyendo especies bisecadas y multiantenarias, incluyendo, pero sin limitarse a, W-glicanos tales como GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2; Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2.

En casos particulares, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) pueden comprender anticuerpos o fragmentos que tienen al menos un N-glicano híbrido seleccionado del grupo que consiste en GlcNAcMan<5>GlcNAc<2>; GalGlcNAcMansGlcNAc<2>; y NANAGalGlcNAcMansGlcNAc<2>. En aspectos particulares, el N-glicano híbrido es la especie de N-glicano predominante en la composición.

En casos particulares, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) comprenden anticuerpos y fragmentos que tienen al menos un N-glicano complejo seleccionado del grupo que consiste en GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; GahGlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGahGlcNAc2Man3GlcNAc2; y NANA<2>GahGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>. En aspectos particulares, el N-glicano complejo es la especie de N-glicano predominante en la composición. En aspectos adicionales, el N-glicano complejo es una especie de N-glicano particular que comprende aproximadamente el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 97%, el 98%, el 99%, o el 100% de los N-glicanos complejos en la composición. En una realización, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento comprenden N-glicanos complejos, en los que al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99%, o el 100% de los N-glicanos complejos comprenden la estructura NANA<2>GahGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>, en los que tal estructura está afucosilada. Tales estructuras pueden producirse, por ejemplo, en células huésped dePichia pastorismodificadas por ingeniería.

En realizaciones particulares, el N-glicano está fucosilado. En general, la fucosa se encuentra en un enlace a1,3 con GlcNAc en el extremo reductor del N-glicano, un enlace a1,6 con GlcNAc en el extremo reductor del N-glicano, un enlace a1,2 con Gal en el extremo no reductor del N-glicano, un enlace a1,3 con GlcNac en el extremo no reductor del N-glicano, o un enlace a1,4 con GlcNAc en el extremo no reductor del N-glicano.

Por tanto, en aspectos particulares de las composiciones de glicoproteínas anteriores, la glicoforma se encuentra en una fucosa de enlace a1,3 o enlace a1,6 para producir una glicoforma seleccionada del grupo que consiste en Man<5>GlcNAc<2>(Fuc), GlcNAcMan<5>GlcNAc<2>(Fuc), Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), GlcNAcMan<3>GlcNAc<2>(Fuc), GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), GalGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), Gal<2>GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), NANAGahGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc), y NANA<2>GahGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>(Fuc); en una fucosa de enlace a1,3 o enlace a1,4 para producir una glicoforma seleccionada del grupo que consiste en GlcNAc(Fuc)Man<5>GlcNAc<2>, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc-|.2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuci-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuci-2)Man3GlcNAc2, NANAGal<2>GlcNAc<2>(Fuci<-2>)Man<3>GlcNAc<2>, y NANA<2>Gal<2>GlcNAc<2>(Fuci<-2>)Man<3>GlcNAc<2>; o en una fucosa de enlace a1,2 para producir una glicoforma seleccionada del grupo que consiste en Gal(Fuc)GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>, Gal<2>(Fuci<-2>)GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>, NANAGal2(Fuci-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, y NANA2Gal2(Fuci-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2.

En aspectos adicionales, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden N-glicanos con alto contenido de manosa, incluyendo, pero sin limitarse a, MansGlcNAc<2>, ManzGlcNAc<2>, Man<6>GlcNAc<2>, Man<5>GlcNAc<2>, Man<4>GlcNAc<2>, o N-glicanos que consisten en la estructura de N-glicano Man<3>GlcNAc<2>.

En aspectos adicionales de los anteriores, los N-glicanos complejos incluyen además especies bisecadas y multiantenarias fucosiladas y no fucosiladas.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “N-glicano” y “glicoforma” se usan de manera intercambiable y se refieren a un oligosacárido unido aN, por ejemplo, uno que se une mediante un enlace asparagina-N-acetilglucosamina a un residuo de asparagina de un polipéptido. Las glicoproteínas unidas aNcontienen un residuo de N-acetilglucosamina unido al nitrógeno de la amida de un residuo de asparagina en la proteína. Los azúcares predominantes hallados en las glicoproteínas son glucosa, galactosa, manosa, fucosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc),N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico (por ejemplo, ácidoN-acetil-neuramínico (NANA)). El procesamiento de los grupos azúcar se produce conjuntamente con la traducción en la luz del RE y continúa después de la traducción en el aparato de Golgi para las glicoproteínas unidas aN.

Los N-glicanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man<3>GlcNAc<2>(“Man” se refiere a manosa; “Glc” se refiere a glucosa; y “NAc” se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). Habitualmente, las estructuras de N-glicano se presentan con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha. El extremo reductor del N-glicano es el extremo que se une al residuo de Asn que comprende el sitio de glicosilación en la proteína. Los N-glicanos difieren con respecto al número de ramificaciones (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, GlcNAc, galactosa, fucosa y ácido siálico) que se añaden a la estructura de núcleo de Man<3>GlcNAc<2>(“Man3”) que también se denomina “núcleo de trimanosa”, “núcleo de pentasacárido” o “núcleo de paucimanosa”. Los N-glicanos se clasifican según sus constituyentes ramificados (por ejemplo, alto contenido de manosa, complejo o híbrido). Un N-glicano de tipo “alto contenido de manosa” tiene cinco o más residuos de manosa. Un N-glicano de tipo “complejo” tiene normalmente al menos un GlcNAc unido al brazo de manosa i,3 y al menos un GlcNAc unido al brazo de manosa i,6 de un núcleo de “trimanosa”. Los N-glicanos complejos también pueden tener residuos de galactosa (“Gal”) o W-acetilgalactosamina (“GalNAc”) que se modifican opcionalmente con ácido siálico o derivados (por ejemplo, “NANA” o “NeuAc”, donde “Neu” se refiere a ácido neuramínico y “Ac” se refiere a acetilo). Los W-glicanos complejos también pueden tener sustituciones intracatenarias que comprenden GlcNAc “bisecante” y fucosa (“Fuc”) de núcleo. Los W-glicanos complejos también

pueden tener múltiples antenas en el “núcleo de trimanosa”, a menudo denominados “glicanos de múltiples antenas”. Un W-glicano “híbrido” tiene al menos un GlcNAc en el terminal del brazo de manosa 1,3 del núcleo de trimanosa y cero o más manosas en el brazo de manosa 1,6 del núcleo de trimanosa. Los diversos W-glicanos también se denominan “glicoformas”.

Con respecto a los W-glicanos complejos, los términos “G-2”, “G-1”, “G0”, “G1”, “G2”, “A1”, y “A2” significan lo siguiente. “G-2” se refiere a una estructura de W-glicano que puede caracterizarse como ManaGlcNAc<2>; el término

“G-1” se refiere a una estructura de W-glicano que puede caracterizarse como GlcNAcMan<3>GlcNAc<2>; el término “G0” se refiere a una estructura de W-glicano que puede caracterizarse como GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; el término “G1” se

refiere a una estructura de W-glicano que puede caracterizarse como GalGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; el término “G2” s refiere a una estructura de W-glicano que puede caracterizarse como GahGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; el término “A1” refiere a una estructura de W-glicano que puede caracterizarse como NANAGahGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>; y el térmi “A2” se refiere a una estructura de W-glicano que puede caracterizarse como NANA<2>GahGlcNAc<2>Man<3>GlcNAc<2>. A

menos que se indique lo contrario, los términos G-2”, “G-1”, “G0”, “G1”, “G2”, “A1”, y “A2” se refieren a especies de

W-glicano que carecen de fucosa unida al residuo de GlcNAc en el extremo reductor del W-glicano. Cuando el término incluye una “F”, la “F” indica que la especie de W-glicano contiene un residuo de fucosa en el residuo de GlcNAc en el extremo reductor del W-glicano. Por ejemplo, G0F, G1F, G2F, A1F, y A2F indican, todos ellos, que el

W-glicano incluye además un residuo de fucosa unido al residuo de GlcNAc en el extremo reductor del W-glicano.

Los eucariotas inferiores tales como levaduras y hongos filamentosos normalmente no producen W-glicanos que producen fucosa.

Con respecto a los W-glicanos multiantenarios, el término “W-glicano multiantenario” se refiere a W-glicanos que comprenden además un residuo de GlcNAc en el residuo de manosa que comprende el extremo no reductor del brazo 1,6 o del brazo 1,3 del W-glicano o un residuo de GlcNAc en cada uno de los residuos de manosa que comprende el extremo no reductor del brazo 1,6 y el brazo 1,3 del W-glicano. Por tanto, los W-glicanos multiantenarios pueden caracterizar por las fórmulas GlcNAc(<2>-<4>)Man<3>GlcNAc<2>, Gal(<1>-<4>)GlcNAc(<2>-<4>)Man<3>GlcNAc<2>, o NANA(<1>-<4>)Gal(<1>-<4>)GlcNAc(<2>-<4>)Man<3>GlcNAc<2>. El término “1-4” se refiere a 1, 2, 3 ó 4 residuos.

Con respecto a los W-glicanos bisecados, el término “W-glicano bisecado” se refiere a W-glicanos en los que un

residuo de GlcNAc se une al residuo de manosa en el extremo reductor del W-glicano. Un W-glicano bisecado puede caracterizarse por la fórmula GlcNAc<3>Man<3>GlcNAc<2>en la que cada residuo de manosa se une en su extremo no reductor a un residuo de GlcNAc. En cambio, cuando un W-glicano multiantenario se caracteriza como GlcNAc<3>Man<3>GlcNAc<2>, la fórmula indica que dos residuos de GlcNAc se unen al residuo de manosa en el extremo

no reductor de uno de los dos brazos de los W-glicanos y un residuo de GlcNAc se une al residuo de manosa en el extremo no reductor del otro brazo del W-glicano.

Propiedades físicas de los anticuerpos

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) pueden contener además uno o más sitios de glicosilación en cualquiera de la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada. Tales sitios de glicosilación pueden

dar como resultado una inmunogenicidad aumentada del anticuerpo o fragmento o una alteración del pK del anticuerpo debido a una unión al antígeno alterada (Marshallet al.(1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala y Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallicket al(1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology

12:43R-56<r>; Parekhet al(1985) Nature 316:452-7; Mimuraet al.(2000) Mol Immunol 37:697-706). Se sabe que la glicosilación se produce en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T.

Cada anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, 27A o versiones humanizadas del mismo) tendrá un

punto isoeléctrico (pI) distintivo, que generalmente se encuentra en el intervalo de pH de entre 6 y 9,5. El pI para un anticuerpo IgG1 se encuentra normalmente dentro del intervalo de pH de 7-9,5 y el pI para un anticuerpo IgG4 se encuentra normalmente dentro del intervalo de pH de 6-8.

Cada anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, 27A o versiones humanizadas del mismo) tendrá

una temperatura de fusión característica, indicando una mayor temperatura de fusión una mayor estabilidad globalin

vivo(Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). En general, la T<m1>(la temperatura de despliegue inicial) puede ser mayor de 60 °C, mayor de 65 °C, o mayor de 70 °C. El punto de fusión de un anticuerpo

o fragmento puede medirse usando calorimetría diferencial de barrido (Chenet al(2003) Pharm Res 20:1952-60;

Ghirlandoet al(1999) Immunol Lett 68:47-52) o dicroísmo circular (Murrayet al.(2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

En un ejemplo adicional, se seleccionan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) que no se degraden rápidamente. La degradación de un anticuerpo o fragmento puede medirse usando electroforesis capilar (EC) y MALDI-ES (Alexander AJ y Hughes DE

(1995) Anal Chem 67:3626-32).

En un ejemplo adicional, se seleccionan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tengan mínimos efectos de agregación, que pueden conducir a la activación de una respuesta inmunitaria indeseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables. Generalmente, los anticuerpos y fragmentos son aceptables con una agregación del 25 % o menos, del 20% o menos, del 15% o menos, del 10% o menos, o del 5% o menos. La agregación puede medirse mediante varias técnicas, incluyendo columna de exclusión molecular (SEC), cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), y dispersión de luz.

Conjugados de anticuerpos

Los anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento

(por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) también pueden conjugarse con un resto químico. El resto químico puede ser, entre otros, un polímero, un radionúclido o un factor citotóxico. En realizaciones particulares, el resto químico es un polímero que aumenta la semivida del anticuerpo o fragmento en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrófilos que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa), dextrano y monometoxipolietilenglicol (mPEG). Lee,et al.,(1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981) divulgan anticuerpos de cadena sencilla conjugados con PEG. Wen,et al.,(2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) divulgan la conjugación de anticuerpos con PEG que está unido a un quelante radiometálico (ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA)).

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) también pueden conjugarse con marcadores tales como 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 13F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, y 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, y 56Fe.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo

27A y versiones humanizadas del mismo) también pueden pegilarse, por ejemplo, para aumentar su semivida biológica (por ejemplo, sérica). Para pegilar un anticuerpo o fragmento, el anticuerpo o fragmento normalmente se hace reaccionar con una forma reactiva de polietilenglicol (PEG), tal como un derivado de éster o aldehído reactivo de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En realizaciones particulares, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término “polietilenglicol” abarque cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como monoalcoxi (C1-C10)- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento que va a pegilarse es un anticuerpo o fragmento aglicosilado. Los métodos para la pegilación de proteínas se conocen en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0154316 y EP 0401 384.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo

27A y versiones humanizadas del mismo) también pueden conjugarse con marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes, incluyendo fluoróforos tales como quelatos de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaladehído, fluorescamina, 152Eu, dansilo, umbeliferona, luciferina, marcador luminal, marcador isoluminal, un marcador de éster de acridinio aromático, un marcador de imidazol, un marcador de sal de acridinio, un marcador de éster oxalato, un marcador de aecuorina, 2,3-dihidroftalazindionas, biotina/avidina, marcadores de espín y radicales libres estables.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la descripción (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) también pueden conjugarse con un factor citotóxico tal como toxina diftérica, cadena de exotoxina A dePseudomonas aeruginosa,cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina

A, alfa-sarcina, proteínas y compuestos (por ejemplo, ácidos grasos) deAleurites fordii,proteínas diantina, proteínas PAPI, PAPII y PAP-S dePhytoiacca americana,inhibidorde Momordica charantia,curcina, crotina, inhibidor deSaponaria officinalis,mitogelina, restrictocina, fenomicina, y enomicina.

Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la descripción (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) con los diversos restos, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter,et al.,(1962) Nature 144:945; David,et al.,(1974) Biochemistry 13:1014; Pain,et al.,(1981) J. Immunol. Met. 40:219; y Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Los métodos para conjugar anticuerpos y fragmentos son convencionales y se conocen muy bien en la técnica.

Los anticuerpos u otros polipéptidos pueden inmovilizarse sobre una variedad de soportes sólidos para su uso en ensayos. Las fases sólidas que pueden usarse para inmovilizar elementos de unión específicos incluyen aquellas desarrolladas y/o usadas como fases sólidas en ensayos de unión en fase sólida. Los ejemplos de fases sólidas adecuadas incluyen filtros de membrana, papeles a base de celulosa, perlas (incluyendo partículas poliméricas, de látex y paramagnéticas), vidrio, obleas de silicio, micropartículas, nanopartículas, TentaGel, AgroGel, geles PEGA, geles SPOCC, y placas de múltiples pocillos. Puede prepararse una tira de ensayo recubriendo el anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos en una matriz sobre un soporte sólido. Luego puede sumergirse esta tira en la muestra de prueba y luego procesarse rápidamente a través de lavados y etapas de detección para generar una señal medible, tal como una mancha coloreada. Los anticuerpos u otros polipéptidos pueden unirse a zonas específicas de dispositivos de ensayo o bien mediante la conjugación directa con una superficie del dispositivo de ensayo, o bien mediante unión indirecta. En un ejemplo de este último caso, los anticuerpos u otros polipéptidos pueden inmovilizarse sobre partículas u otros soportes sólidos, y ese soporte sólido inmovilizarse sobre la superficie del dispositivo.

Los ensayos biológicos requieren métodos para la detección, y uno de los métodos más comunes para la cuantificación de resultados es conjugar un marcador detectable con una proteína o un ácido nucleico que tenga afinidad por uno de los componentes en el sistema biológico que esté estudiándose. Los marcadores detectables pueden incluir moléculas que son detectables por sí mismas (por ejemplo, restos fluorescentes, marcadores electroquímicos, marcadores metálicos, etc.), así como moléculas que pueden detectarse indirectamente mediante la producción de un producto de reacción detectable (por ejemplo, enzimas tales como peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.) o mediante una molécula de unión específica que puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, biotina, digoxigenina, maltosa, oligohistidina, 2,4-dinitrobenceno, fenilarseniato, ADNmc, ADNbc, etc.).

La preparación de fases sólidas y conjugados de marcadores detectables a menudo comprende el uso de agentes de reticulación químicos. Los reactivos de reticulación contienen al menos dos grupos reactivos, y se dividen generalmente en agentes de reticulación homofuncionales (que contienen grupos reactivos idénticos) y agentes de reticulación heterofuncionales (que contienen grupos reactivos no idénticos). Los agentes de reticulación homobifuncionales que se acoplan a través de aminas, sulfhidrilos o reaccionan de manera inespecífica están disponibles de muchas fuentes comerciales. Las maleimidas, los haluros de alquilo y arilo, los alfa-haloacilos y los piridil-disulfuros son grupos reactivos de tiol. Las maleimidas, los haluros de alquilo y arilo, y alfa-haloacilos reaccionan con los sulfhidrilos para formar enlaces tioéter, mientras que los piridil-disulfuros reaccionan con los sulfhidrilos para producir disulfuros mixtos. El producto de piridil-disulfuro es escindible. Los imidoésteres también son muy útiles para las reticulaciones proteína-proteína. Hay disponibles comercialmente una variedad de agentes de reticulación heterobifuncionales, combinando cada uno diferentes atributos para lograr una conjugación exitosa.

Usos terapéuticos de los anticuerpos anti-CTLA-4

Además, se proporcionan métodos para tratar a sujetos, incluyendo sujetos humanos, que necesitan tratamiento con los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo). En una realización de la invención, tal sujeto padece una infección o una enfermedad infecciosa. En otra realización de la invención, tal sujeto padece cáncer. En una realización, el cáncer es, por ejemplo, osteosarcoma, rabdomiosarcoma, neuroblastoma, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de células transicionales renales, cáncer de vejiga, tumor de Wilms, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hueso, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, sarcoma sinovial, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas, mieloma múltiple, cáncer de células renales, retinoblastoma, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, melanoma, tumor rabdoide renal, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, cáncer de cerebro, glioblastoma, meningioma, adenoma hipofisario, schwannoma vestibular, un tumor neuroectodérmico primitivo, meduloblastoma, astrocitoma, astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma, ependimoma, papiloma del plexo coroideo, policitemia vera, trombocitemia, mielofibrosis idiopática, sarcoma de partes blandas, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, tumor carcinoide o cáncer de hígado, cáncer de mama o cáncer de estómago. En una realización de la invención, el cáncer es un cáncer metastásico, por ejemplo, de las variedades descritas anteriormente.

En una realización, la invención proporciona métodos para tratar a sujetos usando un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención, en los que el sujeto padece una infección viral. En una realización, la infección viral es una infección por un virus seleccionado del grupo que consiste en virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis (A, B, o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, VSH-I, VAH-6, VSH-II, y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus de Coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de la parotiditis, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus de la variolovacuna, virus VLTH, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, virus de la poliomielitis, virus de la rabia, virus de JC o virus de la encefalitis arboviral.

En una realización, la invención proporciona métodos para tratar a sujetos usando un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención, en los que el sujeto padece una infección bacteriana. En una realización, la infección bacteriana es una infección por una bacteria seleccionada del grupo que consiste enChlamydia trachomatis,bacteriasRickettsiatales comoEhrlichia, OrientiayRicekettsia,micobacterias tales comoMycobacterium lepraeoMycobacterium lepromatosis,estafilococos tales comoStaphylococcus aureus,estreptococos, neumococos, meningococos y gonococos,Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Corynebacterium diphtheriae, Salmonella,bacilos,Vibrio cholerae, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Haemophilus influenza, Actinomyces, Leptospira, Treponema, Shigella, Chlamydophila psittaciyBorrelia.

En una realización, la invención proporciona métodos para tratar a sujetos usando un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención, en los que el sujeto padece una infección fúngica. En una realización, la infección fúngica es una infección por un hongo seleccionado del grupo que consiste enCandida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis,etc.),Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.),géneroMucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitiseHistoplasma capsulatum.

En una realización, la invención proporciona métodos para tratar a sujetos usando un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención, en los que el sujeto padece una infección parasitaria. En una realización, la infección parasitaria es una infección por un parásito seleccionado del grupo que consiste enEntamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba, Giardia lambia, Cryptosporidium, Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondiiyNippostrongylus brasiliensis.Un “sujeto” puede ser un mamífero tal como un humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un ratón, una rata, un mono(Macaca fascicularis(macaco cangrejero)) o un conejo. En realizaciones preferidas de la invención, el sujeto es un sujeto humano.

En determinados casos, los métodos y las composiciones descritos en el presente documento se administran en combinación con uno o más de otras moléculas de anticuerpo, agonistas de STING, quimioterapia, otra terapia contra el cáncer (por ejemplo, terapias contra el cáncer dirigidas, terapia génica, terapia viral, terapia con ARN, trasplante de médula ósea, nanoterapia, o fármacos oncolíticos), agentes citotóxicos, inmunoterapias (por ejemplo, citocinas o inmunoterapias basadas en células), procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, tumorectomía mamaria o mastectomía) o radioterapias, o una combinación de cualesquiera de los anteriores. La terapia adicional puede estar en forma de terapia adyuvante o neoadyuvante. En algunas realizaciones, la terapia adicional es un inhibidor enzimático (por ejemplo, un inhibidor enzimático de molécula pequeña) o un inhibidor metastásico. Los agentes citotóxicos a modo de ejemplo que pueden administrarse en combinación incluyen agentes antimicrotúbulos, inhibidores de topoisomerasas, antimetabolitos, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antraciclinas, alcaloides de la vinca, agentes intercalantes, agentes capaces de interferir con una ruta de transducción de señales, agentes que fomentan la apoptosis, inhibidores de proteasomas, y radiación (por ejemplo, irradiación local o de cuerpo entero (por ejemplo, irradiación gamma). En otras realizaciones, la terapia adicional es cirugía o radiación, o una combinación de las mismas. En otras realizaciones, la terapia adicional es una terapia que selecciona como diana uno o más de la ruta de PI3K/AKT/mTOR, un inhibidor de HSP90, o un inhibidor de tubulina. Alternativamente, o en combinación con las combinaciones mencionadas anteriormente, los métodos y las composiciones descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más de: un inmunomodulador (por ejemplo, un activador de una molécula coestimuladora o un inhibidor de una molécula inhibidora, por ejemplo, una molécula de punto de control inmunitario); una vacuna, por ejemplo, una vacuna terapéutica contra el cáncer; u otras formas de inmunoterapia celular.

En casos particulares, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A o versiones humanizadas del mismo) pueden usarse solos, o en asociación con otros agentes terapéuticos y/o procedimientos terapéuticos adicionales, para tratar o prevenir cualquier enfermedad tal como cáncer, por ejemplo, tal como se comenta en el presente documento, en un sujeto que necesita tal tratamiento o prevención. Las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable, que comprenden tales anticuerpos y fragmentos en asociación con agentes terapéuticos adicionales también forman parte de la presente invención.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento pueden usarse solos, o en asociación con vacunas contra tumores.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento pueden usarse solos, o en asociación con agentes quimioterápicos.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento pueden usarse solos, o en asociación con radioterapia.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento pueden usarse solos, o en asociación con terapias dirigidas. Los ejemplos de terapias dirigidas incluyen: terapias hormonales, inhibidores de la transducción de señales (por ejemplo, inhibidores de EGFR, tales como cetuximab (Erbitux) y erlotinib (Tarceva)); inhibidores de HER2 (por ejemplo, trastuzumab (Herceptin) y pertuzumab (Perjeta)); inhibidores de BCR-ABL (tales como imatinib (Gleevec) y dasatinib (Sprycel)); inhibidores de ALK (tales como crizotinib (Xalkori) y ceritinib (Zykadia)); inhibidores de BRAF (tales como vemurafenib (Zelboraf) y dabrafenib (Tafinlar)), moduladores de la expresión génica, inductores de la apoptosis (por ejemplo, bortezomib (Velcade) y carfilzomib (Kyprolis)), inhibidores de la angiogénesis (por ejemplo, bevacizumab (Avastin) y ramucirumab (Cyramza), anticuerpos monoclonales unidos a toxinas (por ejemplo, brentuximab vedotina (Adcetris) y adotrastuzumab emtansina (Kadcyla)).

En realizaciones particulares, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la invención pueden usarse en combinación con un agente terapéutico antineoplásico o fármaco inmunomodulador tal como un inhibidor de receptor inmunomodulador, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al receptor. Por tanto, la presente invención incluye composiciones que comprenden un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención en asociación con uno o más de anticuerpos bloqueantes de PD-1/PD-L1: pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, REGN2810, MEDI-0680, PDR-001, SHR-1210, BGB-A317, PF-06801591, TSR-042, atezoluzimab, durvalumab, BMS-936559; así como métodos para tratar o prevenir un cáncer en un sujeto que comprenden administrar una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CTLA-4 y uno o más de pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, REGN2810 al sujeto. Opcionalmente, al sujeto también se le administra un agente terapéutico adicional.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención está en asociación con un anticuerpo aislado que codifica para la cadena pesada y ligera de pembrolizumab.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención está en asociación con un anticuerpo aislado que codifica para la cadena pesada y ligera de nivolumab.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con uno o más de: anticuerpo anti-PD1 (por ejemplo, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab (CT-011)), anticuerpo anti-PDL1, anticuerpo anti-TIGIT, anticuerpo anti-CD27, anticuerpo anti-CS1 (por ejemplo, elotuzumab), anticuerpo anti-KIR2DL1/2/3 (por ejemplo, lirilumab), anticuerpo anti-CD137 (por ejemplo, urelumab), anticuerpo anti-GITR (por ejemplo, TRX518), anticuerpo anti-PD-L1 (por ejemplo, BMS-936559, MSB0010718C o MPDL3280A), anticuerpo anti-PD-L2, anticuerpo anti-ILT1, anticuerpo anti-ILT2, anticuerpo anti-ILT3, anticuerpo anti-ILT4, anticuerpo anti-ILT5, anticuerpo anti-ILT6, anticuerpo anti-ILT7, anticuerpo anti-ILT8, anticuerpo anti-CD40, anticuerpo anti-OX40, anticuerpo anti-ICOS, anticuerpo anti-SIRPa, anticuerpo anti-KIR2DL1, anticuerpo anti-KIR2DL2/3, anticuerpo anti-KIR2DL4, anticuerpo anti-KIR2DL5A, anticuerpo anti-KlR2DL5B, anticuerpo anti-KIR3DL1, anticuerpo anti-KIR3DL2, anticuerpo anti-KIR3DL3, anticuerpo anti-NKG2A, anticuerpo anti-NKG2C, anticuerpo anti-NKG2E, anticuerpo anti-4-1BB (por ejemplo, PF-05082566), anticuerpo anti-TSLP, anticuerpo anti-IL-10, anticuerpo anti-APRIL (por ejemplo, BION1301), anticuerpo anti-CD38 (daratumumab), anticuerpo anti-IL-10 o IL-10 pegilada, o cualquier inhibidor de molécula orgánica pequeña de tales dianas.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-PD1.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-PDL1 (por ejemplo, BMS-936559, MSB0010718C o MPDL3280A).

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-CD27.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-CS1.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR2DL1/2/3.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-CD137 (por ejemplo, urelumab).

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-GITR (por ejemplo, TRX518).

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-PD-L2.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL1.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL2.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL3.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL4.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL5.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL6.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL7.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ITL8.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-CD40.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-OX40.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR2DL1.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR2DL2/3.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR2DL4.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR2DL5A.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anti-KIR2DL5B.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR3DL1.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR3DL2.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-KIR3DL3.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-NKG2A.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-NKG2C.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-ICOS.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-SIRPa.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-4-1BB.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención (por ejemplo, anticuerpo 27A o una versión humanizada del mismo) está en asociación con un anticuerpo anti-IL-10.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un anticuerpo anti-TSLP.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con IL-10 o IL-10 pegilada.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un antagonista de la ruta de Tim-3, preferiblemente como parte de una composición farmacéutica.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un antagonista de la ruta de Vista, preferiblemente como parte de una composición farmacéutica.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un antagonista de la ruta de BTLA, preferiblemente como parte de una composición farmacéutica.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un antagonista de la ruta de LAG-3, preferiblemente como parte de una composición farmacéutica.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un antagonista de la ruta de TIGIT, preferiblemente como parte de una composición farmacéutica.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un agonista de STING, preferiblemente como parte de una composición farmacéutica. Los dinucleótidos cíclicos (CDN) di-AMP cíclico (producido porListeria monocytogenesy otras bacterias) y sus análogos di-GMP cíclico y GMP-AMP cíclico son reconocidos por la célula huésped como patrón molecular asociado a patógenos (PAMP), que se unen al receptor de reconocimiento de patógenos (PRR) conocido como estimulador de genes de interferón (STING). STING es una proteína adaptadora en el citoplasma de células huésped de mamífero que activa la cinasa de unión a TANK (TBK1)-IRF3 y el eje de señalización de NF-kappaB, dando como resultado la inducción de IFN-p y otros productos génicos que activan fuertemente la inmunidad innata. Ahora se reconoce que STING es un componente de la ruta de vigilancia citosólica del huésped (Vanceet al.,2009), que detecta una infección por patógenos intracelulares y, en respuesta, induce la producción de IFN-p, lo que conduce al desarrollo de una respuesta inmunitaria específica de patógenos protectora adaptiva que consiste tanto en células T CD4+ como en células T CD8+ específicas de antígeno, así como anticuerpos específicos de patógenos. Los ejemplos de dinucleótidos de purina cíclicos se describen con cierto detalle en, por ejemplo: las patentes estadounidenses n.os 7.709.458 y 7.592.326; las solicitudes de patente WO2007/054279, WO2014/093936 y WO2014/189805; y Yanet al.,Bioorg. Med. Chem Lett. 18: 5631 (2008).

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención aumentan la actividad de una célula inmunitaria. El aumento de la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse usando cualquier método conocido en la técnica. En una realización, el aumento en la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse midiendo la proliferación de la célula inmunitaria. Por ejemplo, un aumento en la actividad de una célula T puede detectarse midiendo la proliferación de la célula T o eventos de transducción de señales tales como fosforilación de tirosina de inmunorreceptores o cinasas aguas abajo que transmiten señales a reguladores transcripcionales. En otras realizaciones, el aumento en la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse midiendo la función citotóxica de células NK o CTL en células diana específicas o respuestas de citocinas IFNy, que están asociadas con la estimulación de la inmunidad antitumoral. En aún otras realizaciones, el aumento en la actividad de una célula inmunitaria puede detectarse midiendo la activación de células Tex vivoen una muestra derivada del sujeto. En una realización, el aumento en la actividad de células T se determina: (i) midiendo la producción inducida por SEB (enterotoxina B deStaphylococcus)de una o más citocinas proinflamatorias seleccionadas del grupo que consiste en: IL-2, TNFa, IL-17, IFN<y>, IL-ip, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 e IL-13; o (ii) midiendo reacciones linfocitarias mixtas o la estimulación directa con AcM anti-CD3 de la señalización del receptor de células T (TCR) para inducir la producción de una citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-2, TNFa, IL-17, IFNy, IL-ip, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 e IL-13. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención estimulará la producción de células T específicas de antígeno de IL-2 y/o IFNy y/o la regulación por incremento de CD25 y/o CD69 en al menos 1,5 veces. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención estimulará las células T CD3+, cuando éstas se presentan a células Raji que expresan CD80 y CD86, para producir citocinas proinflamatorias seleccionadas del grupo que consiste en: IL-2, TNFa, IL-17, IFNy, IL-1P, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 e IL-13.

Pueden usarse agentes adicionales que son beneficiosos para producir una respuesta de células T citotóxicos en combinación con el anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención. Éstos incluyen, sin limitación, molécula coestimuladora B7, interleucina-2, interferón-y,<g>M-CSF, antagonistas de PD-1, OX-40/ligando de OX-40, CD40/ligando de CD40, sargramostim, levamisol, virus de la variolovacuna, bacilo de Calmette-Guérin (BCG), liposomas, alumbre, adyuvante completo o incompleto de Freund, endotoxinas detoxificadas, aceites minerales, tensioactivos tales como lipolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, y emulsiones de aceites o hidrocarburos.

Se prefieren las composiciones para inducir una respuesta inmunitaria de células T que estimulan preferentemente una respuesta de células T citolíticas frente a una respuesta de anticuerpos, aunque también pueden usarse aquellas que estimulan ambos tipos de respuesta. En casos en los que el agente es un polipéptido, puede administrarse el propio polipéptido o un polinucleótido que codifica para el polipéptido. El portador puede ser una célula, tal como una célula presentadora de antígeno (APC) o una célula dendrítica. Las células presentadoras de antígeno incluyen tipos de células tales como macrófagos, células dendríticas y células B. Otras células presentadoras de antígeno profesionales incluyen monocitos, células de Kupffer de la zona marginal, microglía, células de Langerhans, células dendríticas interdigitantes, células dendríticas foliculares, y células T. También pueden usarse células presentadoras de antígeno facultativas. Los ejemplos de células presentadoras de antígeno facultativas incluyen astrocitos, células foliculares, endotelio y fibroblastos.

La composición puede comprender una célula bacteriana que se transforma para expresar el polipéptido o para administrar un polinucleótido que posteriormente se expresa en las células del individuo vacunado. Pueden añadirse adyuvantes, tales como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, para aumentar la capacidad de la vacuna para activar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria.

La composición puede comprender una célula bacteriana que se transforma para expresar el polipéptido o para administrar un polinucleótido que posteriormente se expresa en las células del individuo vacunado. Se han desarrollado varias especies bacterianas para su uso como vacunas y pueden usarse como plataforma de vacuna en la presente descripción, incluyendo, pero sin limitarse a,Shigella flexneri, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi,o especies deMycobacterium.No se pretende que esta lista sea limitativa. La presente descripción contempla el uso de cepas bacterianas atenuadas, comensales y/o inactivadas, pero metabólicamente activas, como plataformas de vacuna. En realizaciones preferidas, la bacteria esListeria monocytogenes.

En un caso de la descripción, un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción con una vacuna de células tumorales inactivadas. Por “vacuna de células tumorales inactivadas” se entiende una célula tumoral (o bien “autóloga” o bien “alogénica” con respecto al paciente) que se ha tratado para impedir la división de las células. Con los propósitos de la presente descripción, tales células conservan su inmunogenicidad y su actividad metabólica. Tales células tumorales se modifican genéticamente para expresar un transgén que se expresa dentro de un paciente como parte de una terapia contra el cáncer. Por tanto, una composición o vacuna de la descripción comprende células neoplásicas (por ejemplo, tumorales) que son autólogas o alogénicas con respecto al paciente que se somete a tratamiento y, lo más preferiblemente, es del mismo tipo general de célula tumoral que está afectando al paciente. Por ejemplo, a un paciente que padece melanoma normalmente se le administrará una célula modificada genéticamente derivada de un melanoma. Los métodos para inactivar células tumorales para su uso en la presente descripción, tal como el uso de irradiación, se conocen bien en la técnica.

En algunos casos, las células tumorales inactivadas de la presente descripción se modifican para expresar y secretar una o más proteínas de choque térmico. Por ejemplo, pueden expresarse y secretarse proteínas de fusión gp96-Ig para estimular una respuesta inmunitaria (Yamazakiet al.,The Journal of Immunology, 1999, 163:5178-5182; Strboet al.,Immunol Res. Diciembre de 2013;57(1-3):311-25). En algunas realizaciones, las células tumorales inactivadas se modifican para expresar y secretar una proteína de fusión gp96-Ig.

Las células tumorales inactivadas de la presente descripción se administran al paciente junto con una o más moléculas o agentes coestimuladores. Un agente coestimulador preferido comprende una o más citocinas que estimulan la inducción, el reclutamiento, y/o la maduración de células dendríticas. En la bibliografía se conocen bien métodos para evaluar tales agentes coestimuladores. La inducción y maduración de DC se evalúa normalmente mediante la expresión aumentada de determinadas moléculas de membrana tales como CD80 y CD86, y/o la secreción de citocinas proinflamatorias tales como IL-12 e interferones de tipo I tras la estimulación.

En casos preferidos, las propias células tumorales inactivadas se modifican para expresar y secretar una o más citocinas que estimulan la inducción, el reclutamiento, y/o la maduración de células dendríticas. La presente descripción se describe en términos a modo de ejemplo con respecto al uso de GM-CSF. Por tanto, a modo de ejemplo, la célula tumoral puede expresar un transgén que codifica para GM-CSF tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 5.637.483, 5.904.920, 6.277.368 y 6.350.445, así como en la publicación de patente estadounidense n.° 20100150946. Se describe una forma de células cancerosas modificadas genéticamente que expresan GM-CSF o una “vacuna de células que expresan citocinas” para el tratamiento de cáncer de páncreas en las patentes estadounidenses n.os 6.033.674 y 5.985.290.

Otras citocinas adecuadas que pueden expresarse por tales células tumorales inactivadas y/o células espectadoras en lugar de, o junto con, GM-CSf incluyen, pero no se limitan a, uno o más de ligando de CD40, ligando de FLT-3, IL-12, CCL3, CCL20, y CCL21. No se pretende que esta lista sea limitativa.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención se administra junto con una o más vacunas destinadas a estimular una respuesta inmunitaria a uno o más antígenos predeterminados. El/los antígeno(s) puede(n) administrarse directamente al individuo, o puede(n) expresarse dentro del individuo a partir de, por ejemplo, una vacuna de células tumorales (por ejemplo, GVAX) que pueden ser autólogas o alogénicas, una vacuna de células dendríticas, una vacuna de ADN, una vacuna de ARN, una vacuna viral, una vacuna de bacteriana o de levaduras (por ejemplo,Listeria monocytogenesoSaccharomyces cerevisiae),etc. Véanse, por ejemplo, Guoet al.,Adv. Cancer Res. 2013; 119: 421-475; Obeidet al.,Semin Oncol. Agosto de 2015; 42(4): 549 561. En la siguiente tabla se enumeran ejemplos de antígenos diana que pueden encontrar uso en la descripción. El antígeno diana también puede ser un fragmento o polipéptido de fusión que comprende una porción inmunológicamente activa de los antígenos enumerados en la tabla. No se pretende que esta lista sea limitativa.

Tabla 4. Lista de antígenos para su uso en combinación con el anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención tal como se describe en el presente documento.

Otros organismos para los cuales se conocen en la técnica antígenos adecuados incluyen, pero no se limitan a,Chlamydia trachomatis, Streptococcus pyogenes (Strep.del grupo A),Streptococcus agalactia (Strep.del grupo B),Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheae, Vibrio cholerae,especies deSalmonella(incluyendotyphi, typhimurium),enterica (incluyendoHelicobactor pylori, Shigella flexneriy otras especies deShigelladel grupo D),Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Klebsiella pneumonia,especies deClostridium(incluyendoC. difficile), Vibrio parahaemolyticusyV. vulnificus.No se pretende que esta lista sea limitativa.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con uno o más de un inhibidor (por ejemplo, una molécula orgánica pequeña o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) tal como: un inhibidor de MTOR (diana de mamífero de la rapamicina), un agente citotóxico, un agente de platino, un inhibidor de EGFR, un inhibidor de VEGF, un estabilizador de microtúbulos, un taxano, un inhibidor de CD20, un inhibidor de CD52, un inhibidor de CD30, un inhibidor de RANK (receptor activador del factor nuclear kappa-B), un inhibidor de RANKL (receptor activador del ligando de factor nuclear kappa-B), un inhibidor de ERK, un inhibidor de MAP cinasa, un inhibidor de AKT, un inhibidor de MEK, un inhibidor de PI3K, un inhibidor de HERI, un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de Bcl2, un inhibidor de CD22, un inhibidor de CD79b, un inhibidor de ErbB2, o un inhibidor de farnesil-proteína transferasa.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con uno cualquiera o más de: ácido 13-cis-retinoico, 3-[5-(metilsulfonilpiperadinmetil)-indolil]-quinolona, 4-hidroxitamoxifeno, 5-desoxiuridina, 5'-desoxi-5-fluorouridina, 5-fluorouracilo, 6-mecaptopurina, 7-hidroxistaurosporina, A-443654, acetato de abiraterona, abraxano, ABT-578, acolbifeno, ADS-100380, ALT-110, altretamina, amifostina, aminoglutetimida, amrubicina, amsacrina, anagrelida, anastrozol, angiostatina, AP-23573, ARQ-197, arzoxifeno, AS-252424, AS-605240, asparaginasa, AT-9263, atrasentán, axitinib, AZD1152, vacuna de bacilo de Calmette-Guérin (BCG), batabulina, BC-210, besodutox, bevacizumab, bicalutamida, Bio111, BIO140, bleomicina, BMS-214662, BMS-247550, BMS-275291, BMS-310705, bortezimib, buserelina, busulfán, calcitriol, camptotecina, canertinib, capecitabina, carboplatino, carmustina, CC8490, Cediranib, CG-1521, CG-781, clamidocina, clorambucilo, clorotoxina, cilengitida, cimitidina, cisplatino, cladribina, clodronato, COL-3, CP-724714, ciclofosfamida, ciproterona, acetato de ciproterona, citarabina, arabinósido de citosina, dacarbazina, dacinostat, dactinomicina, dalotuzumab, danusertib, dasatanib, daunorubicina, decatanib, deguelina, denileucina, desoxicoformicina, depsipéptido, diarilpropionitrilo, dietilestilbestrol, diftitox, docetaxel, dovitinib, doxorubicina, droloxifeno, edotecarina, edotreotida marcada con itrio-90, edotreotida, EKB-569, EMD121974, endostatina, enzalutamida, enzastaurina, epirubicina, epitilona B, ERA-923, Erbitux, erlotinib, estradiol, estramustina, etopósido, everólimus, exemestano, ficlatuzumab, finasterida, flavopiridol, floxuridina, fludarabina, fludrocortisona, fluoximesterona, flutamida, régimen FOLFOX, fulvestrant, galeterona, gefitinib, gemcitabina, gimatecán, goserelina, acetato de goserelina, gossypol, GSK461364, GSK690693, HMR-3339, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, IC87114, idarubicina, idoxifeno, ifosfamida, IM862, imatinib, IMC-1C11, INCB24360, INO1001, interferón, interleucina-12, ipilimumab, irinotecán, JNJ-16241199, ketoconazol, KRX-0402, lapatinib, lasofoxifeno, letrozol, leucovorina, leuprolida, acetato de leuprolida, levamisol, paclitaxel atrapado en liposomas, lomustina, lonafarnib, lucantona, LY292223, LY292696, LY293646, LY293684, LY294002, LY317615, marimastat, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, tozasertib, MLN8054, neovastat, neratinib, neuradiab, nilotinib, nilutimida, nolatrexed, NVP-BEZ235, oblimersén, octreotida, ofatumumab, oregovomab, orteronel, oxaliplatino, paclitaxel, palbociclib, pamidronato, panitumumab, pazopanib, PD0325901, PD184352, interferón pegilado, pemetrexed, pentostatina, perifosina, mostaza de fenilalanina, PI-103, pictilisib, PIK-75, pipendoxifeno, PKI-166, plicamicina, porfímero, prednisona, procarbazina, progestinas, PX-866, R-763, raloxifeno, raltitrexed, razoxina, ridaforólimus, rituximab, romidepsina, RTA744, rubitecán, scriptaid, Sdx102, seliciclib, selumetinib, semaxanib, SF1126, sirólimus, SN36093, sorafenib, espironolactona, escualamina, SR13668, estreptozocina, SU6668, ácido suberoilanilida-hidroxámico, sunitinib, estrógeno sintético, talampanel, talimogén laherparepvec, tamoxifeno, temozolomida, temsirólimus, tenipósido, tesmilifeno, testosterona, tetrandrina, TGX-221, talidomida, tioguanina, tiotepa, ticilimumab, tipifarnib, tivozanib, TKI-258, TLK286, topotecán, citrato de toremifeno, trabectedina, trastuzumab, tretinoína, tricostatina A, fosfato de triciribina monohidratado, pamoato de triptorelina, TSE-424, mostaza de uracilo, ácido valproico, valrubicina, vandetanib, vatalanib, trampa de VEGF, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, vitaxina, vitespan, vorinostat, VX-745, wortmanina, Xr311, zanolimumab, ZK186619, ZK-304709, ZM336372, ZSTK474.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con uno o más antieméticos incluyendo, pero sin limitarse a: casopitant (GlaxoSmithKline), Netupitant (MGI-Helsinn) y otros antagonistas del receptor de NK-1, palonosetrón (vendido como Aloxi por MGI Pharma), aprepitant (vendido como Emend por Merck & Co.; Rahway, NJ), difenhidramina (vendida como Benadryl® por Pfizer; Nueva York, NY), hidroxizina (vendida como Atarax® por Pfizer; Nueva York, NY), metoclopramida (vendida como Reglan® por AH Robins Co.; Richmond, VA), lorazepam (vendido como Ativan® por Wyet; Madison, NJ), alprazolam (vendido como Xanax® por Pfizer; Nueva York, NY), haloperidol (vendido como Haldol® por Ortho-McNeil; Raritan, NJ), droperidol (Inapsine®), dronabinol (vendido como Marinol® por Solvay Pharmaceuticals, Inc.; Marietta, GA), dexametasona (vendida como Decadron® por Merck & Co.; Rahway, NJ), metilprednisolona (vendida como Medrol® por Pfizer; Nueva York, NY), proclorperazina (vendida como Compazine® por GlaxoSmithKline; Research Triangle Park, NC), granisetrón (vendido como Kytril® por Hoffmann-La Roche Inc.; Nutley, NJ), ondansetrón (vendido como Zofran® por GlaxoSmithKline; Research Triangle Park, NC), dolasetrón (vendido como Anzemet® por Sanofi-Aventis; Nueva York, NY), tropisetrón (vendido como Navoban® por Novartis; East Hanover, NJ).

Otros efectos secundarios del tratamiento contra el cáncer incluyen deficiencia de glóbulos rojos y glóbulos blancos. Por consiguiente, en una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención está en asociación con un agente que trata o previene una deficiencia de este tipo, tal como, por ejemplo, filgrastim, filgrastim pegilado, eritropoyetina, epoetina alfa o darbepoetina alfa.

En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención se administra en asociación con una radioterapia contra el cáncer. Por ejemplo, en una realización de la invención, la radioterapia es terapia de haces externos (EBT): un método para administrar un haz de rayos X de alta energía a la ubicación del tumor. El haz se genera fuera del paciente (por ejemplo, mediante un acelerador lineal) y se dirige al sitio tumoral. Estos rayos X pueden destruir las células cancerosas, y una cuidadosa planificación del tratamiento permite evitar los tejidos normales circundantes. No se colocan fuentes radiactivas en el interior del cuerpo del paciente. En una realización de la invención, la radioterapia es terapia de haces de protones: un tipo de terapia conformada que bombardea el tejido enfermo con protones en lugar de rayos X. En una realización de la invención, la radioterapia es radioterapia de haces externos conformada: un procedimiento que usa una tecnología avanzada para adaptar la radioterapia a las estructuras corporales de un individuo. En una realización de la invención, la radioterapia es braquiterapia: la colocación temporal de materiales radiactivos dentro del cuerpo, empleada habitualmente para proporcionar una dosis adicional o un refuerzo de radiación a una zona.

Un procedimiento quirúrgico que puede aplicarse en asociación con un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción (por ejemplo, anticuerpo 27A o una versión humanizada del mismo) es la tumorectomía quirúrgica.

El término “en asociación con” indica que los componentes administrados en un método de la presente invención (junto con pembrolizumab) pueden formularse en una única composición para la administración simultánea o formularse por separado en dos o más composiciones (por ejemplo, un kit). Cada componente puede administrarse a un sujeto en un momento diferente con respecto al que se administra el otro componente; por ejemplo, cada administración puede proporcionarse de manera no simultánea (por ejemplo, por separado o secuencialmente) en varios intervalos a lo largo de un periodo de tiempo dado. Además, los componentes independientes pueden administrarse a un sujeto por la misma vía o por una vía diferente.

Usos experimentales y de diagnóstico

El anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención puede usarse como agente de purificación por afinidad. En este procedimiento, los anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se inmovilizan sobre una fase sólida tal como Sephadex, vidrio o resina de agarosa o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo o fragmento inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína CTLA-4 (o un fragmento de la misma) que va a purificarse y, después de eso, se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína CTLA-4, que está unida al anticuerpo o fragmento inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con un disolvente que eluye la proteína CTLA-4 unida (por ejemplo, proteína A). Tales anticuerpos y fragmentos inmovilizados forman parte de la presente invención.

Además, se proporcionan antígenos para generar anticuerpos secundarios que son útiles, por ejemplo, para realizar inmunotransferencias de tipo Western y otros inmunoensayos comentados en el presente documento.

Los anticuerpos anti-CTLA-4 (por ejemplo, anticuerpos humanizados) y fragmentos de unión a antígeno de los mismos también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína CTLA-4, por ejemplo, detectar su expresión en células específicas, tejidos, o suero, por ejemplo, células tumorales tales como células de melanoma. Tales métodos de diagnóstico pueden ser útiles en diversos diagnósticos de enfermedades.

La presente invención incluye ensayos ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas) que incorporan el uso de un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo divulgado en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A o una versión humanizada del mismo).

Por ejemplo, un método de este tipo comprende las siguientes etapas:

(a) recubrir un sustrato (por ejemplo, la superficie de un pocillo de placa de microtitulación, por ejemplo, una placa de plástico) con un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo;

(b) aplicar al sustrato una muestra que va a someterse a prueba para determinar la presencia de CTLA-4;

(c) lavar la placa, de modo que se elimina el material no unido en la muestra;

(d) aplicar anticuerpos marcados de manera detectable (por ejemplo, anticuerpos unidos a enzimas) que también son específicos para el antígeno CTLA-4;

(e) lavar el sustrato, de modo que se eliminan los anticuerpos marcados no unidos;

(f) si los anticuerpos marcados están unidos a enzimas, aplicar una sustancia química que se convierte por la enzima en una señal fluorescente; y

(g) detectar la presencia del anticuerpo marcado.

La detección del marcador asociado con el sustrato indica la presencia de la proteína CTLA-4.

En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo marcado se marca con peroxidasa que reacciona con ABTS (por ejemplo, ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)) o 3,3',5,5'tetrametilbencidina para producir un cambio de color que es detectable. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento marcado se marca con un radioisótopo detectable (por ejemplo, 3H) que puede detectarse mediante un contador de centelleo en presencia de un agente de centelleo.

Un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención puede usarse en un procedimiento de inmunotransferencia de tipo Western o transferencia de inmunoproteínas. Un procedimiento de este tipo forma parte de la presente invención e incluye, por ejemplo:

(1) opcionalmente transferir proteínas procedentes de una muestra que va a someterse a prueba para determinar la presencia de CTLA-4 (por ejemplo, procedentes de una separación electroforética con<p>A<g>E o SDS-PAGE de las proteínas en la muestra) sobre una membrana u otro sustrato sólido usando un método conocido en la técnica (por ejemplo, transferencia semiseca o transferencia en tanque); poner en contacto la membrana u otro sustrato sólido que va a someterse a prueba para determinar la presencia de CTLA-4 o un fragmento del mismo unido con un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención. Una membrana de este tipo puede adoptar la forma de una membrana de nitrocelulosa o a base de vinilo (por ejemplo, poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF)) a la que se han transferido las proteínas que van a someterse a prueba para determinar la presencia de CTLA-4 en un gel de PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) o gel de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) en condiciones desnaturalizantes (por ejemplo, tras la separación electroforética en el gel). Antes de poner en contacto la membrana con el anticuerpo o fragmento anti-CTLA-4, opcionalmente se bloquea la membrana, por ejemplo, con leche desnatada en polvo o similar para unir sitios de unión a proteína inespecíficos en la membrana;

(2) lavar la membrana una o más veces para eliminar el anticuerpo o fragmento anti-CTLA-4 no unido y otras sustancia no unidas; y

(3) detectar el anticuerpo o fragmento anti-CTLA-4 unido.

La detección del anticuerpo o fragmento unido indica que la proteína CTLA-4 está presente en la membrana o el sustrato y en la muestra. La detección del anticuerpo o fragmento unido puede ser mediante la unión del anticuerpo o fragmento con un anticuerpo secundario (un anticuerpo anti-inmunoglobulina) que está marcado de manera detectable, y la posterior detección de la presencia del anticuerpo secundario.

Los anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento también pueden usarse para inmunohistoquímica. Un método de este tipo forma parte de la presente descripción y comprende, por ejemplo,

(1) poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula tumoral tal como una célula de melanoma) que va a someterse a prueba para determinar la presencia de proteína CTLA-4 con un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción; y

(2) detectar el anticuerpo o fragmento sobre o en la célula.

Si el propio anticuerpo o fragmento está marcado de manera detectable, puede detectarse directamente. Alternativamente, puede unirse al anticuerpo o fragmento un anticuerpo secundario marcado de manera detectable que se detecta.

Determinados anticuerpos anti-CTLA-4 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) también pueden usarse para obtención de imágenes de tumoresin vivo.Un método de este tipo puede incluir la inyección de un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo radiomarcado en el cuerpo de un paciente que va a someterse a prueba para determinar la presencia de un tumor asociado con la expresión de CTLA-4 (por ejemplo, que expresa CTLA-4, por ejemplo, en linfocitos infiltrantes tumorales), seguido de obtención de imágenes nuclear del cuerpo del paciente para detectar la presencia del anticuerpo o fragmento marcado, por ejemplo, en loci que comprenden una alta concentración del anticuerpo o fragmento que están unidos al tumor. La detección de los loci indica la presencia de las células CTLA-4+ en el tumor.

Las técnicas de obtención de imágenes incluyen obtención de imágenes por SPECT (tomografía computarizada por emisión de un único fotón) u obtención de imágenes por PET (tomografía por emisión de positrones). Los marcadores incluyen, por ejemplo, yodo-123 (123I) y tecnecio-99m (99mTc), por ejemplo, junto con obtención de imágenes por SPECT, o 11C, 13N, 15O o 18F, por ejemplo, junto con obtención de imágenes por PET o indio-111 (Véase, por ejemplo, Gordonet al.,(2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440).

Composiciones farmacéuticas y administración

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles de los anticuerpos anti-CTLA-4 de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se mezcla con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y Farmacopea de Estados Unidos: Formulario Nacional, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse mediante mezclado con portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, suspensiones espesas, disoluciones o suspensiones acuosas (véanse, por ejemplo, Hardman,et al.(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, Nueva York, NY; Avis,et al.(eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman,et al.(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman,et al.(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY).

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención, administrados solos o en combinación con otro agente terapéutico, pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL<50>(la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE<50>(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (DL<50>/DE<50>). Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE<50>con poca toxicidad o sin toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración.

En una realización adicional, un agente terapéutico adicional que se administra a un sujeto en asociación con un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención según Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57a edición (1 de noviembre de 2002)).

El modo de administración puede variar. Las vías de administración incluyen oral, rectal, transmucosa, intestinal, parenteral, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópica, cutánea, transdérmica, o intraarterial.

En realizaciones particulares, los anticuerpos anti-CTLA-4 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden administrarse mediante una vía invasiva tal como mediante inyección. En realizaciones adicionales de la invención, un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica del mismo, se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intratumoral, o mediante inhalación, administración en aerosol. La administración por vías no invasivas (por ejemplo, por vía oral; por ejemplo, en una pastilla, una cápsula o un comprimido) también se encuentra dentro del alcance de la presente descripción.

La presente descripción proporciona un recipiente (por ejemplo, un vial de plástico o vidrio, por ejemplo, con una tapa o una columna de cromatografía, una aguja hueca o un cilindro de jeringa) que comprende cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la descripción (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) o una composición farmacéutica de los mismos. La presente descripción también proporciona un dispositivo de inyección que comprende cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la descripción (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) o una composición farmacéutica de los mismos. Un dispositivo de inyección es un dispositivo que introduce una sustancia en el cuerpo de un paciente a través de una vía parenteral, por ejemplo, intramuscular, subcutánea o intravenosa. Por ejemplo, un dispositivo de inyección puede ser una jeringa (por ejemplo, precargada con la composición farmacéutica, tal como un autoinyector) que, por ejemplo, incluye un cilindro o cuerpo para contener un fluido que va a inyectarse (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo), una aguja para perforar la piel y/o los vasos sanguíneos para la inyección del fluido; y un émbolo para empujar el fluido fuera del cilindro y a través de la aguja hueca. En un caso de la descripción, un dispositivo de inyección que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente descripción o una composición farmacéutica del mismo es un dispositivo de inyección intravenoso (IV). Un dispositivo de este tipo incluye el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en una cánula o un trócar/aguja que puede unirse a un tubo que puede unirse a una bolsa o un depósito para contener un fluido (por ejemplo, solución salina; o solución de lactato de Ringer que comprende NaCl, lactato de sodio, KCl, CaCh y que opcionalmente incluye glucosa) introducido en el cuerpo del paciente a través de la cánula o el trócar/aguja. En un caso de la descripción, el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo puede introducirse en el dispositivo una vez que el trócar y la cánula se insertan en la vena de un sujeto y el trócar se retira de la cánula insertada. El dispositivo IV puede insertarse, por ejemplo, en una vena periférica (por ejemplo, en la mano o el brazo); la vena cava superior o la vena cava inferior, o dentro de la aurícula derecha del corazón (por ejemplo, una línea IV central); o en la vena subclavia, yugular interna, o femoral y, por ejemplo, hacerse avanzar hacia el corazón hasta que alcance la vena cava superior o la aurícula derecha (por ejemplo, una línea venosa central). En un caso de la descripción, un dispositivo de inyección es un autoinyector; un inyector de chorro o una bomba de infusión externa. Un inyector de chorro usa un chorro estrecho a alta presión de líquido que penetra en la epidermis para introducir el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de un paciente. Las bombas de infusión externas son dispositivos médicos que administran el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de un paciente en cantidades controladas. Las bombas de infusión externas pueden accionarse de manera eléctrica o mecánica. Bombas diferentes funcionan de manera diferente, por ejemplo, una bomba de jeringa contiene el fluido en el depósito de una jeringa, y un pistón móvil controla la administración de fluido, una bomba elastomérica contiene el fluido en un depósito de globo estirable, y la presión procedente de las paredes elásticas del globo impulsa la administración de fluido. En una bomba peristáltica, un conjunto de rodillos aprieta hacia abajo sobre un tramo de tubo flexible, empujando el fluido hacia delante. En una bomba multicanal, los fluidos pueden administrarse a partir de múltiples depósitos a múltiples velocidades.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también pueden administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos divulgados en las patentes estadounidenses n.os 6.620.135; 6.096.002; 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824, ó 4.596.556. Tales dispositivos sin aguja que comprenden la composición farmacéutica también forman parte de la presente descripción. Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también pueden administrarse mediante infusión. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos para administrar las composiciones farmacéuticas incluyen aquellos divulgados en: la patente estadounidense n.° 4.487.603, que divulga una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicamento a una velocidad controlada; la patente estadounidense n.° 4.447.233, que divulga una bomba de infusión de medicamente para administrar medicamento a una velocidad de infusión precisa; la patente estadounidense n.° 4.447.224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; la patente estadounidense n.° 4.439.196, que divulga un sistema osmótico de administración de fármacos que tiene compartimentos con múltiples cámaras. Los expertos en la técnica conocen bien muchos otros de tales implantes, sistemas de administración y módulos, y aquellos que comprenden las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se encuentran dentro del alcance de la presente descripción.

Alternativamente, puede administrarse el anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno de la invención de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del anticuerpo o fragmento directamente en un tumor. Además, puede administrarse el anticuerpo o fragmento en un sistema dirigido de administración de fármacos, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido que se dirige, por ejemplo, a un tumor, por ejemplo, caracterizado por inmunopatología. Los liposomas se dirigirán a y se absorberán selectivamente por el tejido afectado. Tales métodos y liposomas forman parte de la presente descripción.

El régimen de administración depende de varios factores, incluyendo la tasa de recambio sérica o tisular del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno terapéutico, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico, y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferiblemente, el régimen de administración administra suficiente anticuerpo o fragmento terapéutico para efectuar una mejora en el estado patológico diana, mientras que minimiza simultáneamente los efectos secundarios indeseados. Por consiguiente, la cantidad de producto biológico administrado depende, en parte, del anticuerpo terapéutico particular y la gravedad de la afección que está tratándose. Hay disponible una guía para seleccionar dosis apropiadas de anticuerpos o fragmentos terapéuticos (véanse, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Baert,et al.(2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgromet al.(1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamonet al.(2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitzet al.(2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghoshet al.(2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipskyet al.(2000) New Engl. J. Med.

343:1594-1602).

La determinación de la dosis apropiada la realiza el médico, por ejemplo, usando parámetros o factores que se conoce o sospecha en la técnica que afectan al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y después de eso se aumenta en pequeños incrementos hasta lograr el efecto deseado u óptimo con respecto a cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas. En general, es deseable que un producto biológico que va a usarse derive de la misma especie que el animal diana para el tratamiento, minimizando de ese modo cualquier respuesta inmunitaria al reactivo. En el caso de sujetos humanos, por ejemplo, pueden ser deseables anticuerpos humanizados y completamente humanos.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A y versiones humanizadas del mismo) pueden proporcionarse mediante infusión continua, o mediante dosis administradas, por ejemplo, cada día, 1-7 veces a la semana, cada semana, cada dos semanas, cada mes, cada dos meses, cada tres meses, cada seis meses, cada doce meses, etc. Las dosis pueden proporcionarse, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral, intraespinal, o mediante inhalación. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 μg/kg de peso corporal, más generalmente de al menos 0,2 μg/kg, 0,5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg o más (véanse, por ejemplo, Yang,et al.(2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold,et al.(2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu,et al.(1999) J. Neurol. Neurosurg.

Psych. 67:451-456; Portielji,et al.(2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:151-144). Las dosis también pueden proporcionarse para lograr una concentración diana predeterminada de anticuerpo anti-CTLA-4 en el suero del sujeto, tal como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 |jg/ml o más. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención se administra, por ejemplo, por vía subcutánea o intravenosa, cada semana, cada dos semanas, “cada 4 semanas”, cada mes, cada dos meses o cada tres meses, a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 ó 2500 mg/sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, un tejido, o un sujeto, es eficaz para provocar una mejora medible en uno o más síntomas de enfermedad, por ejemplo, cáncer o progresión del cáncer. Una dosis eficaz se refiere además a aquella cantidad del anticuerpo o fragmento suficiente para dar como resultado al menos una mejora parcial de los síntomas, por ejemplo, contracción o eliminación de tumor, ausencia de crecimiento tumoral, tiempo de supervivencia mejorado. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, una dosis eficaz se refiere a ese principio solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis eficaz se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea administrado en combinación, en serie, o simultáneamente. Una cantidad eficaz de un producto terapéutico dará como resultado una mejora de una medida o un parámetro de diagnóstico en al menos un 10%; habitualmente en al menos un 20 %; preferiblemente en al menos aproximadamente un 30 %; más preferiblemente en al menos un 40 %, y lo más preferiblemente en al menos un 50 %. Una cantidad eficaz también puede dar como resultado una mejora en una medida subjetiva en casos en los que se usen medidas subjetivas para evaluar la gravedad de la enfermedad. Kits

Además, se proporcionan kits que comprenden uno o más componentes que incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno tal como se comenta en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo 27A o una versión humanizada del mismo) en asociación con uno o más componentes adicional incluyendo, pero sin limitarse a, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un agente terapéutico, tal como se comenta en el presente documento. El anticuerpo o fragmento y/o el agente terapéutico pueden formularse como composición pura o en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, en una composición farmacéutica.

En un caso, el kit incluye un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción (por ejemplo, anticuerpo 27A o una versión humanizada del mismo) o una composición farmacéutica del mismo en un recipiente (por ejemplo, en un vial de plástico o vidrio estéril) y una composición farmacéutica del mismo y/o un agente terapéutico en otro recipiente (por ejemplo, en un vial de plástico o vidrio estéril).

En otro caso, el kit comprende una combinación de la descripción, incluyendo un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción (por ejemplo, 27A humanizado) junto con un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en combinación con uno o más agentes terapéuticos formulados juntos, opcionalmente en una composición farmacéutica, en un único recipiente común.

Si el kit incluye una composición farmacéutica para administración parenteral a un sujeto, el kit puede incluir un dispositivo para realizar tal administración. Por ejemplo, el kit puede incluir una o más agujas hipodérmicas u otros dispositivos de inyección tal como se comentó anteriormente.

El kit puede incluir un prospecto que incluye información sobre las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación en el kit. Generalmente, tal información ayuda a los pacientes y médicos a la hora de usar las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluidas de manera eficaz y segura. Por ejemplo, puede proporcionarse la siguiente información sobre una combinación de la descripción de la invención en el prospecto: farmacocinética, farmacodinamia, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosificación, dosificación y administración apropiadas, la manera de administración, condiciones de almacenamiento apropiadas, referencias, información de fabricante/distribuidor, e información de patente.

Kits de detección y kits terapéuticos

Por conveniencia, un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención puede proporcionarse en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico o detección. Cuando el anticuerpo o fragmento está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis), y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, tras su disolución, proporcionarán una disolución de reactivos que tiene la concentración apropiada.

Además, se proporcionan reactivos y kits de diagnóstico o detección que comprenden uno o más de tales reactivos para su uso en una variedad de ensayos de detección, incluyendo, por ejemplo, inmunoensayos tales como ELISA (formato competitivo o de tipo sándwich). Los componentes del kit pueden estar previamente unidos a un soporte sólido, o pueden aplicarse a la superficie de un soporte sólido cuando se usa el kit. En algunos casos de la descripción, el medio generador de señal puede asociarse previamente con un anticuerpo o fragmento de la descripción o puede requerir su combinación con uno o más componentes, por ejemplo, tampones, conjugados anticuerpo-enzima, sustratos enzimáticos, o similares, antes de su uso. Los kits también pueden incluir reactivos adicionales, por ejemplo, reactivos bloqueantes para reducir la unión inespecífica a la superficie de la fase sólida, reactivos de lavado, sustratos enzimáticos, y similares. La superficie de la fase sólida puede estar en forma de un tubo, una perla, una placa de microtitulación, una microesfera, u otros materiales adecuados para inmovilizar proteínas, péptidos, o polipéptidos. En aspectos particulares, una enzima que cataliza la formación de un producto quimioluminiscente o cromógeno o la reducción de un sustrato quimioluminiscente o cromógeno es un componente del medio generador de señal. Tales enzimas se conocen bien en la técnica. Los kits pueden comprender cualquiera de los agentes de captura y reactivos de detección descritos en el presente documento. Opcionalmente, el kit también puede comprender instrucciones para llevar a cabo los métodos de la descripción.

Además, se proporciona un kit que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo envasado en un recipiente, tal como un vial o frasco, y que comprende además una etiqueta adherida a o envasada con el recipiente, describiendo la etiqueta el contenido del recipiente y proporcionando indicaciones y/o instrucciones sobre el uso del contenido del recipiente para tratar uno o más estados patológicos tal como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el kit es para tratar un cáncer y comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo y un agente terapéutico adicional o una vacuna. El kit puede incluir además opcionalmente una jeringa para administración parenteral, por ejemplo, intravenosa. En otro aspecto, el kit comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo y una etiqueta adherida a o envasada con el recipiente que describe el uso del anticuerpo o fragmento con la vacuna o el agente terapéutico adicional. En aún otro aspecto, el kit comprende la vacuna o el agente terapéutico adicional y una etiqueta adherida a o envasada con el recipiente que describe el uso de la vacuna o el agente terapéutico adicional con el anticuerpo o fragmento anti-CTLA-4. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CTLA-4 y la vacuna o el agente terapéutico adicional están en viales independientes o se combinan juntos en la misma composición farmacéutica.

Tal como se comentó anteriormente en la sección de terapia de combinación, la administración concurrente de dos agentes terapéuticos no requiere que los agentes se administren al mismo tiempo o por la misma vía, siempre que haya un solapamiento en el periodo de tiempo durante el cual los agentes estén ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial, al igual que la administración en días o semanas diferentes.

Los kits terapéuticos y de detección divulgados en el presente documento también pueden prepararse para comprender al menos uno del anticuerpo, péptido, fragmento de unión a antígeno, o polinucleótido divulgados en el presente documento e instrucciones para usar la composición como reactivo de detección o agente terapéutico. Los recipientes para su uso en tales kits pueden comprender normalmente al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringa, u otro recipiente adecuado, en los que puede(n) colocarse una o más de la(s) composición/composiciones de detección y/o terapéutica(s), y preferiblemente divididas en alícuotas de manera adecuada. Cuando también se proporciona un segundo agente terapéutico, el kit también puede contener un segundo recipiente distinto en el que puede colocarse esta segunda composición de detección y/o terapéutica. Alternativamente, pueden prepararse una pluralidad de compuestos en una única composición farmacéutica, y pueden envasarse en un único medio de recipiente, tal como un vial, un matraz, una jeringa, un frasco, u otro recipiente único adecuado. Los kits divulgados en el presente documento también incluirán normalmente un medio para contener el/los vial(es) en confinamiento cerrado para la venta comercial, tal como, por ejemplo, recipientes de plástico moldeados por soplado o inyección en los que se conserva(n) el/los vial(es) deseado(s). Cuando se incluye un radiomarcador, marcador cromógeno, marcador fluorógeno, u otro tipo de marcador detectable o un medio de detección dentro del kit, el agente de marcaje puede proporcionarse o bien en el mismo recipiente que la propia composición de detección o terapéutica, o bien puede colocarse alternativamente en un segundo medio de recipiente distinto en el que puede colocarse y dividirse en alícuotas de manera adecuada esta segunda composición. Alternativamente, el reactivo de detección y el marcador pueden prepararse en un único medio de recipiente, y en la mayoría de los casos, el kit también incluirá normalmente un medio para contener el/los vial(es) en confinamiento cerrado para la venta comercial y/o el envasado y la administración convenientes.

También se proporciona un dispositivo o aparato para llevar a cabo los métodos de detección o monitorización descritos en el presente documento. Un aparato de este tipo puede incluir una cámara o un tubo en el que puede introducirse una muestra, un sistema de manipulación de fluido que incluye opcionalmente válvulas o bombas para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo, opcionalmente filtros para separar el plasma o el suero a partir de la sangre, cámaras de mezclado para la adición de agentes de captura o reactivos de detección, y opcionalmente un dispositivo de detección para detectar la cantidad de marcador detectable unido al inmunocomplejo de agente de captura. El flujo de la muestra puede ser pasivo (por ejemplo, mediante fuerzas capilares, fuerzas hidrostáticas, u otras fuerzas que no requieren una manipulación adicional del dispositivo una vez aplicada la muestra) o activo (por ejemplo, mediante la aplicación de una fuerza generada mediante bombas mecánicas, bombas electroosmóticas, fuerza centrífuga, o presión de aire aumentada), o mediante una combinación de fuerzas activas y pasivas.

Además, se proporcionan un procesador, una memoria legible por ordenador, y una rutina almacenada en una memoria legible por ordenador y adaptada para ejecutarse en el procesador para realizar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos de sistemas informáticos, entornos, y/o configuraciones adecuados incluyen ordenadores personales, ordenadores servidores, dispositivos de mano o portátiles, sistemas multiprocesadores, sistemas basados en microprocesadores, decodificadores, productos electrónicos de consumo programables, ordenadores de red, miniordenadores, ordenadores centrales, entornos informáticos distribuidos que incluyen cualquiera de los sistemas o dispositivos anteriores, o cualesquiera otros sistemas conocidos en la técnica. Métodos generales

Se describen métodos convencionales en biología molecular en Sambrook, Fritsch y Maniatis (2a edición de 1982 y 1989, 3a edición de 2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning,<3>a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). También aparecen métodos convencionales en Ausbel,et al.(2001) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describen la clonación en células bacterianas y la mutagénesis de ADN (vol. 1), la clonación en células de mamífero y levaduras (vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteínas (vol. 3), y bioinformática (vol. 4).

Se describen métodos para la purificación de proteínas incluyendo inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación, y cristalización (Coligan,et al.(2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Se describen el análisis químico, la modificación química, la modificación postraduccional, la producción de proteínas de fusión, y la glicosilación de proteínas (véanse, por ejemplo, Coligan,et al.(2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel,et al.(2001) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, págs. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; págs. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., págs. 384-391). Se describen la producción, purificación, y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan,et al.(2001) Current Protocols in Immunology, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, citado anteriormente). Hay disponibles técnicas convencionales para caracterizar las interacciones ligando/receptor (véase, por ejemplo, Coligan,et al.(2001) Current Protocols in Immunology, vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, policlonales, y humanizados (véanse, por ejemplo, Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nueva York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Nueva York; Harlow y Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 139-243; Carpenter,et al.(2000) J. Immunol.

165:6205; He,et al.(1998) J. Immunol. 160:1029; Tanget al.(1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Bacaet al.(1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothiaet al.(1989) Nature 342:877-883; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; la patente estadounidense n.° 6.329.511).

Una alternativa a la humanización es usar bibliotecas de anticuerpos humanos presentadas en fago o bibliotecas de anticuerpos humanos en ratones transgénicos (Vaughanet al.(1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Méndezet al.(1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbaset al.(2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Kayet al.(1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruinet al.(1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

Se describen diacuerpos y anticuerpos de cadena sencilla (véanse, por ejemplo, Maleckiet al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrathet al.(2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyteret al.(2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson y Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189; y la patente estadounidense n.° 4.946.778). Se proporcionan anticuerpos bifuncionales (véanse, por ejemplo, Mack,et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel,et al.(2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal,et al.(2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan,et al.(1985) Science 229:81-83; Raso,et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker,et al.(1991) EMBO J.

10:3655-3659; y las patentes estadounidenses n.os 5.932.448, 5.532.210, y 6.129.914).

También se proporcionan anticuerpos biespecíficos (véanse, por ejemplo, Azzoniet al.(1998) J. Immunol. 161:3493; Kitaet al.(1999) J. Immunol. 162:6901; Merchantet al.(2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandeyet al.(2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zhenget al.(2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propstet al.(2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).

La purificación del antígeno no es necesaria para la generación de anticuerpos. Los animales pueden inmunizarse con células que albergan el antígeno de interés. Luego pueden aislarse los esplenocitos a partir de los animales inmunizados, y pueden fusionarse los esplenocitos con una línea celular de mieloma para producir un hibridoma (véanse, por ejemplo, Meyaardet al.(1997) Immunity 7:283-290; Wrightet al.(2000) Immunity 13:233-242; Prestonet al.,citado anteriormente; Kaithamanaet al.(1999) J. Immunol. 163:5157-5164).

Los anticuerpos pueden conjugarse con, por ejemplo, moléculas de fármaco pequeñas, enzimas, liposomas, polietilenglicol (PEG). Los anticuerpos son útiles con propósitos terapéuticos, propósitos de diagnóstico, propósitos de kit, u otros propósitos, e incluyen anticuerpos acoplados a, por ejemplo, colorantes, radioisótopos, enzimas, o metales, por ejemplo, oro coloidal (véanse, por ejemplo, Le Doussalet al.(1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibelliniet al.(1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Evertset al.(2002) J. Immunol. 168:883-889).

Hay disponibles métodos de citometría de flujo, incluyendo clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (véanse, por ejemplo, Owens,et al.(1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Hay disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluyendo cebadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos, y anticuerpos, para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

Se describen métodos convencionales de histología del sistema inmunitario (véanse, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York,<n>Y; Hiatt,et al.(2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Filadelfia, PA; Louis,et al.(2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY).

Hay disponibles paquetes de software y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias líder, el plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glicosilación, y alineaciones de secuencias (véanse, por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc., Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne,et al.(2000) Bioinformatics<1 6>: 741-742; Menne,et al.(2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren,et al.(2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención. No se pretende que estos ejemplos limiten el alcance de la invención en modo alguno.

Ejemplo 1: Inmunización y selección de anticuerpos anti-hCTLA-4

Para aislar anticuerpos contra la proteína CTLA-4 humana, se inmunizaron los ratones con un constructo de expresión que codifica para hCTLA-4. Para generar este constructo, se subclonó ADNc que codifica para el marco de lectura abierto de longitud completa de hCTLA-4 (secuencia de referencia del NCBI: NM_005214.4, SEQ ID NO: 35) en el vector pCI-neo (Promega, Madison, WI). Se inmunizaron los ratones mediante inmunización por pistola de genes usando una pistola de genes Helios (BioRad, Hercules, CA) y balas de oro recubiertas de ADN (BioRad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recubrieron partículas de oro de 1 pm con PCI-neo-ADNc de CTLA-4 y vectores de expresión comerciales para Flt3L de ratón y GM-CSF de ratón en una razón 2:1:1 (ambos de Aldevron, Fargo, ND). Se usó un total de 1 μg de ADN plasmídico para recubrir 500 μg de partículas de oro. Específicamente, se inmunizaron ratones BALB/C hembra de 7-8 semanas de edad en las orejas con una pistola de genes, recibiendo 4 ciclos de administración en ambas orejas. Aproximadamente, se detectó un título de anticuerpo anti-hCTLA-4 de 1:125-625 mediante citometría de flujo en suero de ratón después de tres inmunizaciones con ADN. Para este cribado se usaron células CHO-K1, que se transfectaron de manera transitoria con el constructo pCI-neo-CTLA-4, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se cultivaron las células transfectadas durante la noche y posteriormente se obtuvo una suspensión de célula individual usando disolución de disociación de células (Sigma). Se incubaron 7,5*10<5>células con cada muestra de los sueros de ratón diluidos durante 30 minutos a 4 °C. Luego, se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS)/suero bovino fetal (FBS) al 2 % y se tiñeron con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC (BD Pharmingen) durante 30 minutos a 4 °C. De nuevo, se lavaron las células con PBS/FBS al 2 % seguido de resuspensión en PBS/FBS al 2 % y se detectaron las células unidas a anticuerpo basándose en su marcaje con FITC, evaluado mediante citometría de flujo (FACS Canto II; BD Biosciences). Los ratones que demostraron reactividad contra hCTLA-4 se inmunizaron la cuarta y última vez y se sacrificaron cuatro días después. Se prepararon poblaciones celulares de ganglio linfático y bazo agotadas en eritrocitos tal como se describió previamente (Steenbakkerset al.,1992, J. Immunol. Met. 152: 69-77; Steenbakkerset al.,1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134) y se congelaron a -140 °C.

Para la selección de células B y con propósitos de CELISA, se generaron líneas celulares estables CHO-K1.hCTLA-4 transfectando células CHO-K1 (Colección Americana de Cultivos Tipo) con vector pCI-neo que codifica para un ADNc de hCTLA-4 mutante (Y166g e Y183G, SEQ ID NO: 37). Se obtuvieron clones estables mediante dilución limitante.

Para seleccionar células B productoras de anticuerpo anti-hCTLA-4, se diseñó y desarrolló una estrategia de selección que unía preferentemente células B que expresan anticuerpos que se unen a hCTLA-4. Se recogieron esplenocitos y ganglios linfáticos de los ratones inmunizados con hCTLA-4 y se incubaron las células aisladas con células CHO-K1.hCTLA-4 que se irradiaron a 3.000 RAD. Después de 1 hora, se eliminaron las células no unidas con múltiples etapas de lavado usando medio de cultivo. Posteriormente, se recogieron las células CHO-K1.hCTLA-4 con linfocitos unidos con tampón de disociación. Se cultivaron las células B unidas, tal como describieron Steenbakkerset al.,1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134. Brevemente, se mezclaron las células B seleccionadas con sobrenadante de células T al 7,5 % (v/v) y 50.000 células alimentadoras EL-4 B5 irradiadas (2.500 RAD) en un volumen final de 200 μl de medio en una placa de histocultivo de fondo plano de 96 pocillos. El día ocho, se cribaron los sobrenadantes para determinar la reactividad con respecto a hCTLA-4 mediante CELISA tal como se describe a continuación.

Se sembraron células CHO-K1.hCTLA-4 en medio de cultivo (DMEM-F12 (Gibco) con suero bovino fetal al 10% (Hyclone) y Pen/Strep (Gibco)) en placas de histocultivo y se cultivaron a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % hasta que fueron confluentes. Posteriormente, se eliminó el medio de cultivo y se incubaron las células durante 1 hora a 37 °C, con el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % con sobrenadantes de los cultivos de células B. A continuación, se lavaron las células con PBS/Tween al 0,05 % (PBST) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con HRP (Southern Biotechnology). Posteriormente, se lavaron las células 3 veces con PBST y se visualizó la inmunorreactividad antihCTLA-4 con cromógeno estabilizado TMB (Invitrogen). Se detuvieron las reacciones con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron las absorbancias a 450 y 610 nm.

Además, se evaluaron los sobrenadantes para determinar el bloqueo de interacción hCTLA-4/hCD80 usando un formato de ensayo de fluorescencia resuelta en el tiempo homogénea (HTRF). Se incubaron conjuntamente los sobrenadantes con hCD80 recombinante biotinilado en tampón HTRF (PBS/fluoruro de potasio 0,53 M/BSA al 0,1 %). Se añadió Fc/CTLA-4 humano recombinante en combinación con los reactivos de detección estreptavidina K (donante) y anticuerpo anti-Fc humano-D2 (aceptor).Se incubaron las mezclas completas a temperatura ambiente (TA) durante 3 horas y posteriormente se midió la fluorescencia a una longitud de onda de 615 y 665 nM usando un lector Victor2 (Perkin Elmer). La unión de hCTLA-4 a hCD80 da como resultado una señal fluorescente en esta configuración que se estableció al 100%. Los sobrenadantes que contenían anticuerpos bloqueantes redujeron la fluorescencia.

Se inmortalizaron los clones de células B de los sobrenadantes reactivos de hCTLA-4, que se demostró que bloqueaban la interacción hCTLA-4/hCD80, mediante minielectrofusion siguiendo procedimientos publicados (Steenbakkerset al.,1992, J. Immunol. Met. 152: 69-77; Steenbakkerset al.,1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-34). Brevemente, se mezclaron células B con 106 células de mieloma Sp2/0-Ag14 en tampón isomolar de electrofusión (Eppendorf). Se realizaron electrofusiones en una cámara de fusión de 50 μl mediante un campo eléctrico alterno de 30 s, 1 MHz, 15 Vrms seguido de un pulso cuadrado de alto campo de 10 ps, 3 kV/cm y de nuevo mediante un campo eléctrico alterno de 30 s, 1 MHz, 15 Vrms. Se transfirió el contenido de la cámara a medio selectivo de hibridoma y se sembró en una placa de 96 pocillos en condiciones de dilución limitante. El día 12 tras la electrofusión, se cribaron los sobrenadantes de hibridoma para determinar la actividad de unión a hCTLA-4, tal como se describió anteriormente. Se subclonaron los hibridomas que secretaban anticuerpos en el sobrenadante que se unían a hCTLA-4 mediante dilución limitante para salvaguardar su integridad y estabilidad. Se cultivaron hibridomas estables en medio libre de suero durante 7-10 días; se recogieron los sobrenadantes y se purificaron los anticuerpos usando resina de proteína A MabSelect Sure según las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Se cuantificaron las concentraciones de anticuerpo usando espectrofotometría. Se usaron los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma para someter a isotipado los hibridomas. Brevemente, se realizó el isotipado usando un kit de isotipado de anticuerpo monoclonal de ratón (Biorad) basándose en una tira reactiva con bandas de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón inmovilizado para cada uno de los isotipos y las cadenas ligeras de ratón comunes. Se identificaron todos los anticuerpos recuperados como IgG1 de ratón. Se dilucidaron las secuencias de anticuerpo mediante secuenciación de las regiones variables del material de hibridoma de IgG1 de ratón, usando el siguiente método: se extrajo el ARN total de las células de hibridoma, lo que permitió la síntesis de ADNc. Se realizó amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) que permitió la clonación de fragmentos positivos en un vector TOPO (ThermoFisher). Se secuenciaron los clones TOPO y se anotaron las secuencias usando VBASE2 (http://www.vbase2.org).

En los experimentos, se compararon la unión y el bloqueo con 10D1 (documento US20020086014) o CP-675,206 (documento WO2007113648), que se expresaban como IgG1 kappa e IgG2 kappa humanas, respectivamente. Se expresaron de manera transitoria plásmidos que codificaban para constructos de VH y VL mediante transfección en células de riñón embrionario humano FreeStyle 293-F (HEK293T/17, ATCC-CRL-11268), usando reactivo de transfección 293fectin (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recogieron los sobrenadantes (30 ml) después de 7 días y se purificaron los anticuerpos usando resina de proteína A MabSelect Sure según las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Se intercambió el tampón por tampón histidina 10 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5 usando columnas de desalación Zeba (Thermo Scientific). Se determinó la concentración de los anticuerpos purificados basándose en la DO280 (Nanodrop ND-1000). Se determinó el nivel de endotoxina mediante el ensayo de LAL según las instrucciones del fabricante (Lonza).

Se caracterizaron los anticuerpos contra hCTLA-4 para determinar la unión a hCTLA-4, CTLA-4 deMacaca fascicularis(macaco cangrejero), y el bloqueo de la unión del ligando (hCD80/hCD86). A continuación, se determinó la funcionalidadin vitrousando un ensayo de indicador basado en Jurkat (Promega), siguiendo los procedimientos del fabricante. Brevemente, se incubaron conjuntamente células Raji que expresan hCD80/hCD86 con células T Jurkat que expresan de manera estable CTLA-4 de membrana y un indicador de IL-2-RE-luciferasa. A esta mezcla se le añadieron un anticuerpo de ratón anti-CD3 humano (BD Pharmingen) y un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (Thermo Fisher) seguido de un intervalo de dilución de anticuerpos de ratón contra hCTLA-4 (comenzando a 200 |jg/ml y sus diluciones). Después de seis horas de incubación a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %, se detectó la actividad del promotor de IL-2 mediante la adición de sustrato Bio-Glo™ (Promega) y usando un lector Envision (Perkin Elmer). Tal como se muestra en la figura 1, hCTLA4.27A potencia de manera más potente el promotor de IL-2 en comparación con 10D1.

Ejemplo 2: Diseño de anticuerpos humanizados e injerto de CDR

Se humanizó el anticuerpo de ratón hCTLA4.27A mediante tecnología de injerto de CDR (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.225.539 y Williams, D.G.et al.,2010, Antibody Engineering, volumen 1, capítulo 2l). En primer lugar, se identificaron las secuencias de línea germinal humanas usando IgBLAST (Ye J.et al.,2013, Nucleic Acids Res. 41:W34-40). Para la secuencia de línea germinal humana de VH de hCTLA4.27A se identificó el gen V IGHV1-46*01 (62,2 % de identidad) y para la secuencia de línea germinal humana de VL se identificó IGKV1-NL1*01 (68,4 % de identidad). Se usaron estas dos secuencias de línea germinal para injertar directamente las CDR de ratón, dando como resultados los dos constructos de ADNc siguientes: SEQ ID NO: 15 (VH, que codifica para SEQ ID NO: 16) y SEQ ID NO: 27 (V<l>, que codifica para SEQ ID NO: 28). A continuación, se construyó una base de datos que contenía todas las secuencias humanas disponibles en la base de datos de IMGT (Lefranc, M.-P.et al.,1999, Nucleic Acids Res. 27:209-212) que identificó 82.958 secuencias individuales. Se consultaron estas secuencias usando TBLASTN (2,2.30+) para identificar secuencias de molde que demostraran la mayor identidad con el entramado de las secuencias de VHy V<l>de hCTLA4.27A. Se identificaron tres secuencias de VHy tres secuencias de Vl que demostraron una puntuación de similitud del 70 % o superior y que presentaban longitudes de CDR similares, preferiblemente idénticas a las de CDR1, CDR2 y CDR3 de Vh y c Dr 1, CDR2 y CDR3 de Vl de hCTLA4.27A, respectivamente.

Para la cadena pesada, se seleccionaron como moldes los entramados codificados por los registros de GenBank n.os L39130, DI109259, y DD431634 (Benson, D.A.et al.,2013, Nucleic Acids Res. 41(D1):D36-42) para el injerto directo de las CDR de VHde hCTLA4.27A, dando como resultados los constructos de ADNc siguientes: SEQ ID NO: 9, 11 y 13. respectivamente. Para la cadena ligera, se seleccionaron como moldes los entramados codificados por los registros de GenBank n.os AB063955, DI112350, y AB363305 para el injerto directo de las CDR de Vl de hCTLA4.27A, dando como resultados los constructos de ADNc siguientes: SEQ ID NO: 21, 23 y 25. Las definiciones de entramado y CDR fueron las descritas por Kabatet al.

Para estudiar el efecto de los residuos de entramado humanizado sobre la estructura del Fv, se realizó un modelo de homología del Fv de hCTLA4.27A de ratón usando la “cascada de modelado de anticuerpos” (parámetros por defecto) dentro de Discovery Studio 4.5. Se construyó el modelo de homología basándose en PDB ID 3V7A.

Se injertaron las CDRin silicopara estudiar los residuos que están cerca de cualquiera de las CDR y que podrían afectar a la conformación de bucle, denominados residuos de Vernier. Se identificaron los residuos que podrían afectar a la conformación de bucle, y que están dentro de < 5Á con respecto a la superficie de CDR, y se sustituyeron por el aminoácido de ratón en esta posición. Se comprobaron los moldes resultantes para determinar la presencia de motivos de modificación postraduccional (PTM) usando Discovery Studio 4.5 y, cuando fuera posible (es decir, residuos distintos de CDR, distintos de Vernier), se cambiaron para impedir una PTM. Para la cadena pesada, la eliminación de los motivos de PTM de secuencia predicha y las consideraciones estructurales (es decir, rigidez de la estructura principal) en Vh de hCTLA4.27A dio como resultado el diseño de dos constructos adicionales: SEQ ID NO: 17 y 19. Para la cadena ligera, la eliminación de PTM dio como resultado el constructo siguiente: SEQ ID NO: 29.

Se injertaron las CDR en cada uno de los moldes identificados, se expresaron como IgG4 humana (SEQ ID NO: 50), se clonó el anticuerpo kappa (SEQ ID NO: 52) en el vector pcDNA3.1(+) y se transfectó de manera transitoria en células HEK293 FreeStyle. Se produjo una versión de IgG4 de anticuerpos humanizados, con la mutación Adair estabilizante (Angal S.et al.,1993, Mol Immunol. 30: 105-108), donde la serina 228 se convierte en prolina.

También se expresó hCTLA4.27IgG1 como IgG1 humana (SEQ ID NO: 48), se clonó el anticuerpo kappa (SEQ ID NO: 52) en el vector pcDNA3.1(+) y se transfectó de manera transitoria en células HEK293 FreeStyle. Se mezclaron los plásmidos que codificaban para constructos de cadena pesada y cadena ligera de IgG1 humana en una razón 1:1 (1280 |jg en total) y se expresaron de manera transitoria mediante transfección en células de riñón embrionario humano FreeStyle 293-F (HEK293T/17, ATCC-CRL-11268), usando reactivo de transfección 293fectin (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recogieron los sobrenadantes (1250 ml) después de 7 días y se purificó hCTLA4.27IgG1 usando resina de proteína A MabSelect Sure según las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Se intercambió el tampón por tampón histidina 10 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5 usando columnas de desalación Zeba (Thermo Scientific). Se determinó la concentración de hCTLA4.27IgG1 purificado basándose en la DO280 (Nanodrop ND-1000).

Además, se expresaron Vh y Vl de hCTLA4.27A de ratón (SEQ ID NO: 32 y 34) como IgG1 (hCTLA4.27A.C1) e IgG4 (hCTLA4.27A.C4) humanas quiméricas, se clonó el anticuerpo kappa en el vector pcDNA3.1(+) y se transfectó de manera transitoria en células HEK293 FreeStyle.

Ejemplo 3: Síntesis, expresión y purificación de constructos humanizados

Se mezclaron los plásmidos que codificaban para los constructos de cadena pesada y cadena ligera en una razón 1:1 (30 jg en total) y se expresaron de manera transitoria mediante transfección en células de riñón embrionario humano FreeStyle 293-F (HEK293T/17, ATCC-CRL-11268), usando reactivo de transfección 293fectin (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recogieron los sobrenadantes (30 ml) después de 7 días y se purificaron los anticuerpos usando resina de proteína A MabSelect Sure según las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Se intercambió el tampón por tampón histidina 10 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5 usando columnas de desalación Zeba (Thermo Scientific). Se determinó la concentración de los anticuerpos purificados basándose en la DO280 (Nanodrop ND-1000). Se determinó el nivel de endotoxina mediante el ensayo de LAL según las instrucciones del fabricante (Lonza).

Ejemplo 4: Unión de anticuerpos contra CTLA-4 humanizados

Se estudió la unión de los anticuerpos humanizados a hCTLA-4 en formato CELISA. Se sembraron células CHO-K1.hCTLA-4 en medio de cultivo (DMEM-F12 (Gibco) con suero bovino fetal al 10 % (Hyclone) y Pen/Strep (Gibco)) en placas de histocultivo y se cultivaron a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % hasta que fueron confluentes. Posteriormente, se eliminó el medio de cultivo y se incubaron las células durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95% con anticuerpos contra hCTLA-4 purificados (10 jg/ml y sus diluciones). A continuación, se lavaron las células con PBS/Tween al 0,05 % (PBST) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % con anticuerpo de cabra anti-IgG humana-HRP (Southern Biotechnology) o anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP (Southern Biotechnology). Posteriormente, se lavaron las células 3 veces con PBST y se visualizó la inmunorreactividad anti-hCTLA-4 con cromógeno estabilizado TMB (Invitrogen). Se detuvieron las reacciones con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron las absorbancias a 450 y 610 nm. Se calcularon los valores de CE<50>, la concentración a la que se observa el 50 % de la señal de unión total, usando Graphpad Prism 6. En la tabla 5 se representan los valores de CE<50>de los anticuerpos hCTLA4.27 humanizados.

Tabla 5: Unión de anticuerpos hCTLA4.27 humanizados, anticuerpos parentales y quiméricos contra CTLA-4 humano expresados en células CHO-K1.hCTLA-4. Los valores de CE<50>representan la concentración a la que se observa el 50 % de la señal de unión total (se calcularon el promedio y la DE a partir de los valores de dos experimentos independientes).

Se confirmó la unión de los anticuerpos contra hCTLA-4 a CTLA-4 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 40) usando células CHO-K1 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA) que se había transfectado de manera transitoria con ADNc que codifica para el marco de lectura abierto de longitud completa de CTLA-4 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 39), subclonado en el vector pCI-neo (Promega). Se sembraron células CHO-K1.cynoCTLA-4 en placas de histocultivo y se incubaron a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % hasta que las capas de célula fueron confluentes. Posteriormente, se eliminó el medio de cultivo y se incubaron las células durante 1 hora con anticuerpos contra hCTLA-4 purificados (10 μg/ml y sus diluciones) a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %. A continuación, se lavaron las células con PBST y se incubaron durante<1>hora a 37 °C con anticuerpo de cabra anti-IgG humana-HRP (Jackson ImmunoResearch). Posteriormente, se lavaron las células 3 veces con PBST y se visualizó la inmunorreactividad anti-CTLA-4 con cromógeno estabilizado TMB (Invitrogen). Se detuvieron las reacciones con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron las absorbancias a 450 y 610 nm.

Se confirmó la unión de los anticuerpos hCTLA4.27 humanizados a CTLA-4 expresado en células T CD3+ humanas mediante citometría de flujo. Se aislaron células T CD3+ humanas a partir de capa leucoplaquetaria humana de la siguiente manera. En primer lugar, se diluyó la capa leucoplaquetaria hasta un volumen total de 180 ml con PBS a temperatura ambiente. Después de mezclar la suspensión de células, se cargaron alícuotas en un gradiente de Ficoll-Paque Plus en tubos Sepmate (Stemcell Technologies) y se centrifugaron a 1200 g durante 10 min, a 20 °C sin freno. A continuación, se eliminó el plasma mediante aspiración y se recuperaron las PBMC a partir de la superficie de contacto plasma/Ficoll. Se lavaron las PBMC tres veces en PBS. Posteriormente, se realizó el aislamiento de células T CD3+ con perlas magnéticas (cóctel de Ac-biotina de células T CD3+; Miltenyi Biotec). A continuación, se estimularon las células T con perlas recubiertas con aCD3/aCD28 (Thermo Fisher Scientific) durante 48 horas. En primer lugar, se confirmó la estimulación de células T mediante la detección de la formación de blastocitos usando citometría de flujo. Se evaluó la unión de anticuerpos hCTLA4.27 humanizados después de la fijación y la permeabilización de células T con Cytofix/Cytoperm (BD). Se lavaron las células dos veces en tampón de permeación/lavado (BD), se incubaron con los anticuerpos hCTLA4.27 humanizados, se lavaron tres veces, y finalmente se incubaron con un anticuerpo de detección de cabra anti-hIgG humana marcado con FITC (Southern Biotech). Después de este procedimiento de marcaje, se lavaron las células dos veces, se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron mediante citometría de flujo en el dispositivo FACS Canto II (BD). Se procesaron y analizaron los datos con el Software FlowJo.

Se confirmó la unión de los anticuerpos hCTLA4.27 humanizados a CTLA-4 expresado en PBMC deMacaca fascicularis(macaco cangrejero) mediante citometría de flujo. Para este fin, se diluyó 1:1 sangre de macaco cangrejero con PBS y se añadió a tubos de 50 ml que contenían 13 ml de Lymphoprep al 95 %/PBS al 5%. Se centrifugaron las células durante 30 minutos a 450 g y 20 °C sin freno. A continuación, se eliminó el plasma mediante aspiración y se recuperaron las PBMC a partir de la superficie de contacto plasma/Ficoll. Se lavaron las PBMC dos veces en PBS. Se congelaron las células en nitrógeno líquido y se recuperaron de la nevera el día del experimento. Dado que la expresión endógena de CTLA-4 en células inmunitarias en reposo es baja, se estimularon las PBMC descongeladas con perlas recubiertas con aCD3/aCD28/aCD2 (Milteny Biotec) durante 48 horas. Posteriormente, se confirmó la estimulación de las PBMC mediante la detección de la formación de blastocitos usando citometría de flujo. A continuación, se analizaron las células mediante citometría de flujo para determinar la unión intracelular de anticuerpos hCTLA4.27.

Ejemplo 5: Bloqueo de la unión de hCD80 a hCTLA-4 por anticuerpos hCTLA4.27 humanizados

Se evaluó el bloqueo de hCD80 en formato CELISA para el panel completo de anticuerpos hCTLA4.27 humanizados. Se sembraron células CHO-K1.hCTLA-4 en placas de histocultivo y se incubaron a 37 °C, el 5% de CO<2>y una humedad del 95 % en medio de cultivo. Una vez que las células fueron confluentes, se eliminó el medio de cultivo y se incubaron las células durante 1 hora con las variantes de anticuerpo hCTLA4.27 humanizado (10 |jg/ml y sus diluciones) a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %. A continuación, se lavaron las células con PBS/Tween-20 al 0,05 % (PBST) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % con proteína Fc/hCD80 recombinante biotinilada. Luego se lavaron las células con PBST seguido de la adición de conjugado estreptavidina-HRP a las células, que se incubaron durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %. Posteriormente, se lavaron las células tres veces con PBST y se visualizó la unión de la proteína Fc/hCD80 con cromógeno estabilizado TMB (Invitrogen). Se detuvieron las reacciones con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron las absorbancias a 450 y 610 nm. Se calcularon los valores de CI<50>para el bloqueo de hCD80 a partir de estos datos y se representan en la tabla 6. Los valores de CI<50>representan la concentración a la que se observa la mitad de la inhibición.

Tabla 6: Bloqueo de la unión de hCD80 por anticuerpos hCTLA4.27 humanizados, anticuerpos parentales y quiméricos. Los valores de CI<50>representan la concentración a la que se observa la mitad de la inhibición (se calcularon el promedio y la DE a partir de los valores de dos experimentos independientes).

Ejemplo 6: Afinidad por hCTLA4.27, unión a hCTLA-4 y sus capacidades de bloqueo de la interacción hCD80/hCD86 en comparación con 10D1 (ipilimumab) y CP-675,206 (tremelimumab)

Se obtuvieron perfiles de las constantes de unión en equilibrio y la cinética de unión de hCTLA4.27 usando interferometría de bioluz en el dispositivo Octet RED96 y se compararon con varios anticuerpos conocidos en la técnica. En primer lugar, se acoplaron AcM anti-hCTLA-4 a biosensores de segunda generación reactivos a amina (Fortebio) usando química de amina convencional. Luego se observe la unión de hCTLA-4 a y la disociación a partir de los biosensores a diversas concentraciones de hCTLA-4. Se humedecieron previamente los biosensores reactivos a amina sumergiéndolos en pocillos que contenían MES 0,1 M pH=5,5 durante 10 minutos. Luego se activaron los biosensores usando una mezcla de NHS 0,1 M/EDC 0,4 M durante 5 minutos. Se acoplaron los anticuerpos sumergiendo los biosensores en una disolución de anticuerpo 2,5 ó 12 ug/ml en MES 0,1 M durante 7,5 minutos. Se inactivó la superficie del biosensor usando una disolución de etanolamina 1 M durante 5 minutos. Se equilibraron los biosensores en tampón de cinética Octet (ForteBio) durante 5 minutos. Se observó la asociación de rhCTLA-4/Fc (R&D Systems) colocando los biosensores en pocillos que contenían diversas concentraciones de rhCTLA-4/Fc (2,5-40 nM) y monitorizando la interferometría durante 15 minutos. Se midió la disociación después de la transferencia de los biosensores al tampón de cinética y la monitorización de la señal de interferometría durante 45 minutos. Se ejecutó el ensayo con una temperatura de placa de 30 °C. Se ajustaron las velocidades de asociación y disociación observadas (kon y koff) usando un modelo de ajuste global de unión 1:1 que comprendía todas las concentraciones sometidas a prueba, y se calculó la constante de unión en equilibrio Kd. Tal como se muestra en la tabla 7, hCTLA4.27 tiene una afinidad de unión similar a los anticuerpos de control.

Tabla 7: Afinidades de hCTLA4.27 en formato de IgG1 humana e IgG4 humana en relación con los anticuerpos de control 10D1 y CP-675,206.

A continuación, se compararon la unión de los anticuerpos hCTLA4.27 a hCTLA-4 y sus capacidades de bloqueo de la interacción hCD80/hCD86 con 10D1 y CP-675,206 en formato CELISA. Brevemente, se realizó CELISA para la unión a hCTLA-4 en células CHO-K1.hCTLA-4. Se realizó la detección de anticuerpo unido con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP (Southern Biotech) para hCTLA4.27A de ratón y con anticuerpo de cabra anti-IgG humana-HRP (Southern Biotech) para hIgG1 y hIgG4 quiméricos de hCTLA4.27A y anticuerpos de control, respectivamente. Para la evaluación del bloqueo de hCD80 y hCD86, se sembraron células CHO-K1.hCTLA-4 en placas de histocultivo y se incubaron a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % en medio de cultivo. Una vez que las células fueron confluentes, se eliminó el medio de cultivo y se incubaron las células durante 1 hora con los anticuerpos hCTLA4.27 y los anticuerpos de control (10 μg/ml y sus diluciones) a 37 °C, el 5% de CO<2>y una humedad del 95 %. A continuación, se lavaron las células con PBS/Tween al 0,05 %-20 (PBST) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % con proteína Fc/hCD80 o proteína Fc/hCD86 recombinante biotinilada. Luego se lavaron las células con PBST seguido de la adición de conjugado estreptavidina-HRP a las células, que se incubaron durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %. Posteriormente, se lavaron las células tres veces con PBST y se visualizó la unión de proteína Fc/hCD80 o proteína Fc/hCD86 con cromógeno estabilizado TMB (Invitrogen). Se detuvieron las reacciones con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron las absorbancias a 450 y 610 nm. Los valores de CI<50>representan la concentración a la que se observa la mitad de la inhibición.

Tal como se representa en la figura 2, el perfil de bloqueo de hCD80 de los anticuerpos hCTLA4.27IgG1 y hCTLA4.27IgG4 se encuentra entre los perfiles de hCD80 de ipilimumab y tremelimumab. Por tanto, aunque los valores de CI<50>son comparables, difiere la meseta de eficacia.

Tabla 8: Unión de anticuerpos hCTLA4.27A, anticuerpos hIgG1 y hIgG4 quiméricos de hCTLA4.27A y anticuerpos de control a hCTLA-4 y sus capacidades de bloqueo de la interacción hCD80/hCD86. Los valores de CE<50>representan la concentración a la que se observa el 50%de la señal de unión total. Los valores de CI<50>representan la concentración a la que se observa la mitad de la inhibición (se calcularon los promedios y las DE a partir de los valores de dos experimentos independientes).

Ejemplo 7: Funcionalidad de los anticuerpos hCTLA4.27 humanizados en el ensayo de SEB en PBMC humanas

Para confirmar la funcionalidad de hCTLA4.27 humanizado en células inmunitarias primarias, se aislaron PBMC a partir de las capas leucoplaquetarias de sangre de donante humano. En primer lugar, se diluyó la capa leucoplaquetaria y se mezcló hasta un volumen total de 180 ml con PBS a temperatura ambiente. Se cargaron alícuotas en un gradiente de Ficoll-Paque Plus en tubos Sepmate (Stemcell Technologies) y se centrifugaron a 1200 g durante 10 min, a 20 °C sin freno. A continuación, se eliminó el plasma mediante aspiración y se recuperaron las PBMC a partir de la superficie de contacto plasma/Ficoll. Se lavaron las PBMC tres veces en PBS antes de su uso en el ensayo. Se sembraron las PBMC a 2* 10<5>células por pocillo. Posteriormente, se diluyeron anticuerpos hCTLA4.27 humanizados y de control en medio RPMI 1640 (Gibco) complementado con suero de ternero fetal al<1 0>% y se añadieron en un intervalo de concentración comenzando a 100 μg/ml con etapas de dilución de raíz cuadrada de 10. Se añadió enterotoxina B deStaphylococcus(Sigma) diluida en medio RPMl 1640 complementado con suero de ternero fetal al 10 % a una concentración de 10 μg/ml. Se incubaron las placas durante setenta y dos horas a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %, seguido del aislamiento de los sobrenadantes.

Se detectó la secreción de IL-2 en el sobrenadante como una medida de inmunoactivación. Se aclararon los sobrenadantes de cualquier material celular mediante centrifugación y se añadieron a placas Nunc MaxiSorp para ELISA que se habían recubierto con anticuerpo anti-hIL-2 (BD Pharmingen) en PBS mediante incubación a 4 °C durante un periodo mínimo de 16 horas. Antes de la adición del sobrenadante, se vaciaron los pocillos y se bloquearon con PBS/BSA al 1 % durante una hora a temperatura ambiente (TA). Se incubaron los sobrenadantes en las placas recubiertas con anticuerpo anti-hIL-2 durante una hora a TA, tras lo cual se lavaron las placas tres veces con PBST (PBS con Tween-20 al 0,05%). Posteriormente, se añadió anticuerpo anti-hIL2-biotina 0,5 μg/ml (BD Pharmingen) en PBST/BSA al 0,5 % y se incubó durante una hora a TA. Después de tres lavados con PBST, se añadió estreptavidina-HRP diluido 1:5000 (BD Pharmingen) en PBST/BSA al 0,5%. Después de seis lavados con PBST, se detectó IL-2 mediante la adición de cromógeno estabilizado TMB (Invitrogen). Se detuvieron las reacciones con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron las absorbancias a 450 y 610 nm. En este ensayo, se usó IL-2 humana recombinante (Sigma) como referencia para cuantificar los niveles de proteína IL-2 en los sobrenadantes. La figura 3 muestra que los anticuerpos hCTLA4.27 potencian la inmunoactivación.

Ejemplo 8 : hCTLA4.27 en ensayos de función efectora

Se estudió la capacidad de los anticuerpos hCTLA4.27A quiméricos hCTLA4.27A.C1 y hCTLA4.27A.C4 para inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Para el ensayo de ADCC, se usaron células NK humanas como células efectoras. Se aislaron las células NK a partir de sangre humana. Se enriquecieron las capas leucoplaquetarias con respecto a células NK con el cóctel de enriquecimiento de NK Rosette SEP (Stemcell Technologies). Posteriormente, se mezcló 1:1 la capa leucoplaquetaria con PBS/FBS al 2 % y se dispuso en capas sobre Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Después de la centrifugación, se recogió la interfase y se lavaron las células con PBS/FBS al 2 %. La caracterización de las células NK aisladas mediante citometría de flujo confirmó la expresión de CD16 y CD56.

Se usaron células CHO-K1.hCTLA-4 como células diana y se sembraron en una placa de cultivo celular de fondo plano junto con células NK en una razón efectoras:diana de 10:1. Se añadieron anticuerpos hCTLA4.27 o anticuerpos de control (10D1 o anticuerpos de control de isotipo coincidente (hIgG1, hIgG4)) (100 μg/ml y sus diluciones). Se incubaron las placas durante la noche a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %. Después de la incubación durante la noche, se lavaron las células con PBST (PBS y Tween-20 al 0,01 %) y se incubaron en medio RPMI (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Hyclone) y Pen/Strep al 1 % (Gibco) a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió disolución CellTiter 96 AQueous One (Promega) seguido de 3 horas incubación a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %. Se evaluó la viabilidad celular analizando la DO492-690 usando un lector iEMS (Labsystems). Tal como se muestra en la figura 4A, hCTLA4.27A.C1 indujo lisis celular mediada por NK en dos donantes diferentes, mientras que en formato de hIgG4 no pudo inducir citotoxicidad.

Para evaluar la citotoxicidad dependiente del complemento, se añadió un intervalo de concentración de anticuerpos hCTLA4.27 a monocapas confluentes de células CHO-K1.hCTLA-4 diana. Después de un periodo de incubación de 15 minutos, se añadió suero humano del complemento al 50% (Sigma) a las células. Después de 3,5 horas de incubación, se lavaron las células con PBSt (PBS y 0,01 % Tween-20), se incubaron con medio RPMI complementado (Gibco) y se incubaron a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió disolución CellTiter 96 AQueous One (Promega) seguido de 3 horas de incubación a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 %. Se evaluó la viabilidad celular analizando la DO492-690 usando un lector iEMS (Labsystems). Tal como se muestra en la figura 4B, hCTLA4.27A.C1 induce lisis celular mediada por el complemento en el ensayo de CDC, mientras que en formato de hIgG4 no induce citotoxicidad celular mediada por el complemento.

Ejemplo 9: Competencia cruzada de anticuerpos hCTLA4.27 y de control

Para caracterizar la diferencia en el sitio de unión de hCTLA4.27 en comparación con 10D1 (ipilimumab) y CP-675,206 (tremelimumab), se obtuvieron perfiles de la competencia entre los anticuerpos usando interferometría de bioluz tal como se describió previamente. Se humedecieron previamente los biosensores reactivos a amina sumergiéndolos en pocillos que contenían MES 0,1 M pH=5,5 durante 10 minutos. Luego se activaron los biosensores usando una mezcla de NHS 0,1 M/EDC 0,4 M durante 5 minutos. Se acopló hCTLA4.27 en formato de IgG1 humana o IgG4 humana sumergiendo los biosensores en una disolución de AcM 12 μg/ml en MES 0,1 M durante 7,5 minutos. Se inactivó la superficie del biosensor usando una disolución de etanolamina 1 M durante 5 minutos. Se equilibraron los biosensores en tampón de cinética Octet (ForteBio) durante 5 minutos. Se observó la asociación de rhCTLA-4/Fc colocando los biosensores en pocillos que contenían una concentración fija de rhCTLA-4/Fc (12 μg/ml) y monitorizando la interferometría durante 15 minutos. A continuación, durante 2 minutos adicionales, se permitió la unión del mismo AcM anti-hCTLA-4 que se acopló al biosensor, para garantizar la unión de todos los sitios de unión de rhCTLA-4/Fc disponibles. Se determinó la competencia o no competencia colocando los biosensores durante 5 minutos en pocillos que contenían una concentración fija (6 μg/ml) de otro o el mismo AcM anti-hCTLA-4 o un pocillo de referencia que contenía tampón de cinética únicamente. En este ensayo de competencia directa, la unión de hCTLA4.27 a rhCTLA-4 no bloquea la unión de los anticuerpos de control a rhCTLA-4/Fc tal como se muestra en la tabla 9.

Tabla 9: Competencia cruzada de anticuerpos hCTLA4.27 y de control. La unión del segundo anticuerpo en nm de desplazamiento, un valor nulo o negativo significa que no se observa unión.

Ejemplo 10: Unión a mutantes de intercambio de CTLA-4 de humano/ratón

Se confirmó la diferencia en las regiones de unión entre hCTLA4.27 en comparación con 10D1 y CP-675,206 usando dos mutantes de hCTLA-4. Se diseñaron mutantes de hCTLA-4 que eran mitad de humano y mitad de ratón. Basándose en el pliegue de CTLA-4, un dominio de tipo V similar a Ig (similar a inmunoglobulina), la proteína puede dividirse en dos subdominios: uno que contiene la hebra beta 1, 2, 5, y 6, incluyendo los bucles de conexión, y uno que contiene la hebra beta 3, 4, 7, y 8, incluyendo los bucles de conexión. La variante de humano-ratón (s Eq ID NO: 42, Hum-Mou-CTLA-4) contiene residuos de humano en las hebras 1, 2, 5, y 6 y residuos de ratón (SEQ ID NO: 46) en las hebras 3, 4, 7, y 8. La variante de ratón-humano (SEQ ID NO: 44, Mou-Hum-CTLA-4) contiene residuos de ratón en las hebras 1, 2, 5, y 6 y residuos de humano en las hebras 3, 4, 7, y 8.

Se sintetizaron los ADNc que codificaban para estos constructos (SEQ ID NO: 41 y 43, respectivamente) y se subclonaron en el vector pCI-neo (GeneArt). Se sometió a prueba la unión de hIgG4 quimérico de hCTLA4.27A (hCTLA4.27A.C4), 10D1 y CP-675,206 a las mutantes de intercambio usando CELISA. Para este fin, se transfectaron de manera transitoria células CHO-K1, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), con los vectores pCI-neo que expresan CTLA-4 humano (hCTLA-4), CTLA-4 de ratón (mCTLA-4) (SEQ ID NO: 45), Hum-Mou-CTLA-4, y Mou-Hum-CTLA-4, respectivamente. Se cultivaron las células transfectadas a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % en medio (DMEM-F12 (Gibco) con suero de cría de ternero al 5 % (Biowest) y Pen/Strep (Gibco)) hasta que fueron confluentes. Posteriormente, se sometieron las células a tripsinización y se sembraron en placas de histocultivo y se cultivaron a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % en medio de cultivo hasta que fueron confluentes. Luego, se eliminó el medio de cultivo y se incubaron las células durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % con anticuerpos contra hCTLA-4. A continuación, se lavaron las células con PBS/Tween al 0,05 % (PBST) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, el 5 % de CO<2>y una humedad del 95 % con anticuerpo de cabra anti-IgG humana-HRP 1:2.000 (Jackson ImmunoResearch). Después de eso, se lavaron las células 3 veces con PBST y se visualizó la inmunorreactividad anti-CTLA-4 con cromógeno estabilizado TMB (Invitrogen). Se detuvieron las reacciones con H<2>SO<4>0,5 M y se leyeron las absorbancias a 450 y 610 nm. hCTLA4.27A.C4 mostró unión a la mutante de intercambio de humano-ratón, mientras que 10D1 y CP-675,206 pudieron unirse a la mutante de intercambio de ratón-humano (figura 5).

Ejemplo 11: Mapeo de la superficie de contacto de interacción entre hCTLA-4 y hCTLA4.27A

Se dilucidó el epítopo de unión de hCTLA4.27A a hCTLA-4 mediante un procedimiento que implica reticulación química deuterada seguido de digestión enzimática y detección usando espectrometría de masas. En primer lugar, se incubaron el anticuerpo hCTLA4.27A y el antígeno rhCTLA-4/Fc/6His (R&D Systems; SEQ ID NO: 59) para fomentar la unión y se verificaron la integridad y el nivel de agregación mediante un espectrómetro de masas con MALDI-ToF Ultraflex III (Bruker) equipado con un módulo de interacción HM4 (CovalX). Para estos experimentos de control, se preparó una serie de diluciones de muestras de 10 μl de anticuerpo o antígeno (dilución de 1 a 128 veces, comenzando en 1 mg/ml). De cada muestra, se sometieron 9 μl a reticulación usando el kit de análisis por MALDI-EM K200, según las instrucciones del fabricante (CovalX) y se incubaron durante 180 minutos, mientras que se usó directamente 1 μl para el análisis por espectrometría de masas (MALDI de alta masa). El análisis por espectrometría de masas mostró que el anticuerpo y el antígeno tenían el peso molecular esperado, 152,25 kDa (160,94 kDa con agente de reticulación) y 88,25 kDa (95,19 kDa con agente de reticulación), respectivamente. Para la caracterización del complejo antígeno-anticuerpo, se preparó una mezcla con un exceso de<2>veces de antígeno (razón antígeno:anticuerpo de 4 pM:2 pM). Se sometió una muestra de 9 pl de la mezcla antígeno-anticuerpo a reticulación usando el kit de análisis por MALDI-EM K200, según las instrucciones del fabricante, mientras que se usó directamente 1 μl para el análisis por espectrometría de masas. Las masas detectadas del anticuerpo (149,916 kDa) y del antígeno (88,211) corresponden a los pesos moleculares que se detectaron previamente. Se detectaron los complejos antígeno-anticuerpo, después de la reticulación, como dos complejos no covalentes con una estequiometría 1:1 (239,113 kDa) y 1:2 (326,415 kDa) (hCTLA4.27A:rhCTLA-4/Fc). No se detectaron anticuerpo ni antígeno unidos de manera no covalente, agregados no covalente, ni multímeros inespecíficos.

A continuación, se realizó la determinación de la huella peptídica masiva de rhCTLA-4/Fc. Se sometieron las muestras a proteólisis con ASP-N, tripsina, quimotripsina, elastasa y termolisina (Roche Diagnostics), siguiendo las instrucciones del fabricante, seguido de análisis por EM/EM nLC-LTQ Orbitrap usando un sistema Ultimate 3000 (Dionex) en línea con un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). El resultado de esta matriz de proteólisis demostró que los péptidos identificados abarcaron el 92,52 % de la secuencia.

Para determinar el epítopo del anticuerpo hCTLA4.27A en el antígeno rhCTLA-4/Fc con alta resolución, se incubó el complejo anticuerpo/antígeno (razón antígeno:anticuerpo de 4 pM:2 pM) con agentes de reticulación deuterados d0/d12 (kit de MALDI K200) durante 180 minutos y se sometió a escisión con múltiples enzimas con las enzimas ASP-N, tripsina, quimotripsina, elastasa y termolisina. Después del enriquecimiento de los péptidos reticulados, se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas de alta resolución (EM nLC-Orbitrap) y se analizaron los datos generados usando XQuest [Y.J. Lee, Mol. BioSyst., 2008, 4, 816-823] y Stavrox [Gotze Met al.J Am Soc Mass Spectrom. enero de 2012; 23(1):76-87]. En la figura<6>se muestran péptidos reticulados resultantes de estos diferentes enfoques de proteólisis. El epítopo de unión de hCTLA4.27A se identificó como SFVCEYASPGKAT (SEQ ID NO: 53), y es claramente diferente de los epítopos de los anticuerpos anti-CTLA-410D1 (Ramagopalet al.PNAS 2017; 114(21): E4223-E4232) y CP-675,206 (Leeet al.Nat Commun. 2016; 7: 13354).

Un experto en la técnica aprecia fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y conseguir los fines y las ventajas mencionados, así como aquellos inherentes en la misma. Los ejemplos proporcionados en el presente documento son representativos de realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo, y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invención.

Debe entenderse que la invención no se limita en cuanto a su aplicación a los detalles de construcción ni a las disposiciones de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención puede incluir realizaciones además de las descritas y ponerse en práctica y llevarse a cabo de diversas maneras. Además, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleadas en el presente documento, así como en el resumen, tienen el propósito de descripción y no deben considerarse como limitativas.

Como tal, los expertos en la técnica apreciarán que la concepción en la que se basa esta divulgación puede utilizarse fácilmente como base para el diseño de otras estructuras, métodos y sistemas para llevar a cabo los varios propósitos de la presente invención.

Los ejemplos proporcionados en el presente documento son representativos de realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo, y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invención. A los expertos en la técnica se les ocurrirán modificaciones de los mismos y otros usos.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los expertos habituales en la técnica a la que pertenece la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo que se une a CTLA-4 humano, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 34, en el que dicho anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada del subtipo IgG1.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera elegida de las regiones constantes de cadena ligera kappa o lambda.

3. Ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

4. Vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

5. Célula huésped que expresa un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2.

6. Composición que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2 y un portador, diluyente, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable.

7. Método de producción de un anticuerpo que comprende:

cultivarin vitrouna célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica para la cadena pesada y la cadena ligera de dicho anticuerpo según la reivindicación 1 en condiciones favorables para la expresión del polinucleótido; y

opcionalmente, recuperar el anticuerpo a partir de la célula huésped y/o el medio de cultivo.

8. Anticuerpo según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2 para su uso en un método de tratamiento de cáncer en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, en el que el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicho anticuerpo.

9. Vector de expresión según la reivindicación 4 para su uso en un método de tratamiento de cáncer en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, en el que el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicho vector de expresión, opcionalmente en el que el tratamiento está en asociación con un agente terapéutico o procedimiento terapéutico adicional.

10. Anticuerpo según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, en el que el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicho anticuerpo.

11. Vector de expresión según la reivindicación 4 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, opcionalmente en el que el tratamiento está en asociación con un agente terapéutico o procedimiento terapéutico adicional.