TW201807197A

TW201807197A - 兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之輔助判定方法

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Publication number: TW201807197A
Application number: TW106124121A
Authority: TW
Inventors: 宮崎良秀; 梅原緣; 小坂修; 首藤公義
Original assignee: 大塚製藥股份有限公司
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2018-03-01
Also published as: JPWO2018016474A1; CN109477148A; EP3489364A4; US20190161810A1; US12060616B2; EP3489364A1; JP7002450B2; WO2018016474A1

Abstract

本發明提供一種用以輔助兒童急性淋巴性白血病(兒童ALL)之血液學病期之判定的方法、及可用於該方法之體外診斷用醫藥品。

本發明係一種輔助兒童ALL之血液學病期之判定的方法，其包括如下步驟：(1)獲取受試者之末梢血及骨髓液之至少任一生物樣本中之威爾姆氏腫瘤-1基因(WT1)之mRNA量的步驟；(2)獲取上述同一樣本中之GAPDH mRNA量之步驟；及(3)基於上述(1)及(2)之步驟中分別獲取之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助判定所需之指標值的步驟。

Description

兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之輔助判定方法

本發明係關於一種用以輔助兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之判定的方法。具體而言，關於一種用於對罹患或疑似罹患急性淋巴性白血病之兒童受試者判別該受試者為急性淋巴性白血病之非緩解期亦或緩解期的方法。另外，本發明係關於一種體外診斷用醫藥品，其有效地用於實施上述急性淋巴性白血病之血液學病期之輔助判定、尤其是從非緩解期轉變成緩解期之輔助判定、以及從緩解期轉變成非緩解期之輔助判定，或監測急性淋巴性白血病之血液學病期。

以人類末梢血或骨髓液作為受試試樣而測定WT1 mRNA(Wilms' tumor gene 1 messenger ribonucleic acid，威爾姆氏腫瘤-1基因信使核糖核酸)量之套組(WT1 mRNA測定套組)已被批准用作急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，以下亦稱為「AML」)患者之微小殘留病變(minimal residual disease，以下亦稱為「MRD」)之監測標記物、或骨髓增生異常症候群(myelodysplastic syndrome，以下亦稱為「MDS」)患者之診斷輔助及進展度監測標記物，其作為體外診斷用醫藥品而被納入承保範圍內(參照非專利文獻1、專利文獻1等)。

另外，報告有WT1 mRNA亦於急性淋巴性白血病(acute lymphoblastic leukemia，以下亦稱為「ALL」)中表現(參照非專利文獻2~8)。此處，ALL為以幼淋巴球系細胞之腫瘤性病變與骨髓浸潤為特徵之造血器官腫瘤。於WHO(World Health Organization，世界衛生組織)分類第4版中，重視胚細胞之起源而將血液系腫瘤大致分為骨髓系腫瘤與淋巴系腫瘤兩種，淋巴系腫瘤進而分為B細胞性與T細胞性。將ALL定位為其中之未成熟之淋巴系腫瘤，如表1所示分類成3組(參照非專利文獻9)。

根據非專利文獻2~8之各自試驗成績，認為與AML同樣地，ALL之成人患者之骨髓液或末梢血中之WT1 mRNA係對於成年ALL患者之MRD有用之監測標記物。

作為ALL患者之MRD之評價、測定法，可列舉：嵌合體基因定量、使用免疫受體(Immunoglobulin/T cell receptor，Ig/TCR，免疫球蛋白/T細胞受體)基因重排之MRD解析、及藉由流動式細胞測量術(flow cytometry，以下亦稱為「FCM」)之MRD解析等。然而，嵌合體基因即便於表現頻度最高之次要BCR/ABL中，其表現頻度亦較低，成人ALL為25%，兒童ALL為3%左右，即便與其他嵌合體基因一起，能將嵌合體基因用作MRD監測標記物之病例亦有限。另外，使用Ig/TCR基因重排之MRD解析法及藉由FCM之MRD解析法係成本較高且要求專業技術與經驗之測定法，因而尚停留於在一部分醫療(研究)機構實施。

另一方面，近年來，業界認識到治療開始後之MRD量之重要性。例如根據非專利文獻10，報告有WT1 mRNA於多種白血病中高度表現，於成人白血病中顯示該WT1 mRNA定量對預後預測因素及MRD之追蹤有用。然而，關於WT1 mRNA定量對兒童白血病之預後預測因素及MRD之追蹤之有用性尚未得出結論。另外，根據非專利文獻11，指出上述WT1 mRNA作為成年AML患者之MRD之監測標記物而言充分，但作為兒童ALL患者之MRD監測標記物而言不充分。其原因尚未明確，認為由於成年ALL患者與兒童ALL患者有使頻度不同之各種基因異常、或兩者之預後亦有差異等(非專利文獻12~13)，故而成人之ALL與兒童之ALL為不同之疾病。另外，認為原因亦在於：對於兒童ALL患者而言，由於為了提高嗜中性球功能而投予G-CSF(顆粒性白血球群落刺激因子，granulocyte-colony stimulation factor)或末梢血中出現幼細胞等，故而大量存在表現WT1之非腫瘤性細胞(非專利文獻10)。

因此，現狀為對於兒童ALL之診斷，尋求與成人ALL之診斷不同之指標及/或基準。

【先前技術文獻】【非專利文獻】

【非專利文獻1】威爾姆氏腫瘤-1基因(WT1)mRNA套組「WT1 mRNA測定套組II『Otsuka』」隨附文件(大塚製藥股份有限公司)(2015年7月修訂(第3版))

【非專利文獻2】Chiusa L, di Celle PF, Campisi P, Ceretto C, Marmont F, Pich A. Prognostic value of quantitative analysis of WT1 gene transcripts in adult acute lymphoblastic leukemia Haematologica. 2006; 91: 270-1.

【非專利文獻3】Boublikova L, Kalinova M, Ryan J, Quinn F, O' Marcaigh A, Smith O, et al. Wilms' tumor gene 1 (WT1) expression in childhood acute lymphoblastic leukemia: a wide range of WT1 expression levels, its impact on prognosis and minimal residual disease monitoring. Leukemia 2006; 20: 254-63.

【非專利文獻4】Shabani M, Asgarian-Omran H, Vossough P, Vossough P, Sharifian RA, Faranoush M, et al. Expression profile of orphan receptor tyrosine kinase (ROR1) and Wilms' tumor gene 1 (WT1) in different subsets of B-cell acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma 2008; 49(7): 1360-7.

【非專利文獻5】Chen JS, Hsiao CC, Sheen JM, Cheng CN. Comparison of minimal residual disease (MRD) estimated by flow cytometry and by real-time quantitative PCR of Wilms tumor gene 1 (WT1) transcript expression in children with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia Research 2007; 31: 1351-7.

【非專利文獻6】Busse A, Gokbuget N, Siehl JM, Hoelzer D, Schwartz S, Rietz A, et al. Wilms' tumor gene 1 (WT1) expression in subtypes of acute lymphoblastic leukemia (ALL) of adults and impact on clinical outcome. Ann Hematol 2009; 88: 1199-205.

【非專利文獻7】Hu SY, Gu WY, Chen ZX, Wang XL, Cen JN, He HL, et al. The significance of detecting WT1 expression in childhood acute leukemias. Pediatric Hematology and Oncology. 2010; 27: 581-91.

【非專利文獻8】Xu B, Song X, Yip NC, Xiao P, Zhang Y, Wang W, et al. Simultaneous detection of MDR1 and WT1 gene expression to predict the prognosis of adult acute lymphoblastic leukemia. Hematology.2010; 15(2): 74-80.

【非專利文獻9】Borowitz MJ, Chan JKC. Precusor Lymphoid Neoplasms, overview. In: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. eds. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Fourth Edition, Lyon, IARC Press 2008; 168-78.

【非專利文獻10】中尾朋平, Non-malignant elevation of Wilms Tumor gene (WT1) expression is frequently observed in the blood and bone marrow of childhood acute leukemia in remission and in benign blood diseases. 築波大學博士(醫學)學位論文(甲第5112號). 2009: 638-640.

【非專利文獻11】R. Zhang, et al., Comparison of minimal residual disease (MRD) monitoring by WT1 quantification between childfood acute myeloid leukemia and acute leukemia. Euroepean Review for Medical and Pharmacological Sciences 201

5; 19: 2679-2688.

【非專利文獻12】Pui CH, Relling MV, James R, Downing JR. Acute Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med. 2004; 350: 1535-8.

【非專利文獻13】薄井紀子, 臨床血液. 2009; 50: 230-43

【專利文獻】

【專利文獻1】國際公開公報WO 2014/115779 A1

本發明鑒於上述課題，以提供如下輔助方法為目的，該輔助方法係以ALL中之兒童ALL為對象，用以對該兒童ALL患者或疑似罹患兒童ALL之患者使用WT1mRNA作為MRD之監測標記物來判定兒童ALL之血液學病期，尤其是判別緩解期與非緩解期。本發明之目的特別在於提供一種作為該方法之用以與先前法相比儘可能簡便且容易，而且高精度地進行判斷之方法。另外，本發明之目的在於提供一種用以檢測ALL之血液學病期、特別是緩解期之體外診斷用醫藥品，其可有效地用於該方法之實施。

本發明者等人為了解決上述課題反覆進行努力研究，結果發現：藉由使用先前認為作為兒童ALL之MRD之監測標記物而言不充分的WT1 mRNA量，並使用基於其與用作修正基因之GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)而算出之指標值，意外地能夠明確區分處於緩解期之兒童ALL患者與處於非緩解期之兒童ALL患者，而能夠明確區分(診斷)出兒童ALL之血液學病期，尤其是區別緩解期與非緩解期。

本發明係基於該見解進一步反覆研究而完成，包括下述實施態樣。

(I)輔助兒童ALL之血液學病期之判定的方法

(I-1)一種輔助兒童急性淋巴性白血病(兒童ALL)之血液學病期之判定的方法，其具有下述(1)~(3)之步驟： (1)獲取受試者之生物樣本中之威爾姆氏腫瘤-1基因(WT1)之mRNA量的步驟；(2)獲取上述該生物樣本中之甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)之mRNA量的步驟；及(3)基於上述(1)及(2)之步驟中分別獲取之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出上述輔助判定所需之指標值的步驟。

再者，兒童ALL之血液學病期大致分為非緩解期(包括未治療期、治療後復發期、及治療不應期)與緩解期之兩種。上述本發明於將正接受誘導緩解治療及緩解後療法之兒童ALL患者作為對象之情形時，可換稱為「輔助對兒童ALL患者進行非緩解期與緩解期之鑑別判定的方法」。另外，於將疑似兒童ALL之患者作為對象之情形時，亦可換稱為「輔助對疑似兒童ALL之患者進行有無罹患兒童ALL、即為兒童ALL之未治療期(罹患)或不為兒童ALL之未治療期(未罹患)之判定的方法」。

(I-2)如(I-1)所記載之方法，其中上述(1)之步驟係使用RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，逆轉錄酶-聚合酶鏈反應)法測定WT1 mRNA量、或接受使用RT-PCR法所測得之WT1 mRNA量之提供的步驟。

(I-3)如(I-1)或(I-2)所記載之方法，其中上述(2)之步驟係使用RT-PCR法測定GAPDH mRNA量、或接受使用RT-PCR法所測得之GAPDH mRNA量之提供的步驟。

(I-4)如(I-3)所記載之方法，其中上述(1)及(2)之步驟中之1步驟RT-PCR法係於受試者之生物樣本中同時且於同一容器內連續進行WT1 mRNA及GAPDH mRNA之逆轉錄反應及延伸反應之方法。

(I-5)如(I-2)至(I-4)中任一項所記載之方法，其中上述RT-PCR法為2步驟RT-PCR法、或1步驟RT-PCR法。

(I-6)如(I-2)至(I-4)中任一項所記載之方法，其中上述RT-PCR法為1步驟RT-PCR法。

(I-7)如(I-1)至(I-6)中任一項所記載之方法，其中上述(3)之步驟中所獲得之指標值係將(1)及(2)之步驟中分別獲取之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)進行標準化而獲得之值。

(I-8)如(I-7)所記載之方法，其中上述標準化係藉由將WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)乘以健康成人1μgRNA中所含之GAPDH mRNA量之平均值而進行。

(I-9)如(I-8)所記載之方法，其中上述健康成人1μgRNA中所含之GAPDH mRNA量之平均值為2.7×10⁷copies/μgRNA。

(I-10)如(I-1)至(I-9)中任一項所記載之方法，其進而具有下述步驟：(4)將上述(3)之步驟中所獲得之指標值與預先設定之臨界值(參考基準值)進行對比，並基於其大小而表示受試者之血液學病期的步驟。

(I-11)如(I-10)所記載之方法，其中上述(4)之步驟係於上述(3)之步驟中所獲得之指標值小於預先設定之臨界值之情形時表示受試者處於緩解期、或於為上述臨界值以上之情形時表示受試者處於非緩解期(未治療期、治療後復發期、或治療不應期)的步驟。

(I-12)如(I-11)所記載之方法，其中上述非緩解期為未治療期。

(I-13)如(I-10)至(I-12)中任一項所記載之方法，其中上述臨界值係基於ROC曲線(Receiver operating characteristic curve，受試者工作特徵曲線)求出之值，上述ROC曲線係根據基於對兒童ALL患者或疑似兒童ALL患者之生物樣本求出之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比所獲得之指標值與兒童ALL之血液學病期的關係而製作。

(I-14)如(I-10)至(I-13)中任一項所記載之方法，其中兒童ALL之血液學病期之判定係判別兒童ALL之非緩解期(未治療期、治療後復發期、或治療不應期)與緩解期，並且上述臨界值係分別將處於非緩解期之兒童ALL患者(非緩解期組)與處於緩解期之兒童ALL患者(緩解期組)之兩組作為對象並藉由統計學解析而求出之值。

(I-15)如(I-14)所記載之方法，其中上述統計學解析為ROC解析、判別分析、或單變量解析。

(I-16)如(I-1)至(I-15)中任一項所記載之方法，其中受試者之生物樣本為血液(較佳為末梢血)或骨髓液。

(I-17)如(I-10)至(I-16)中任一項所記載之方法，其中上述臨界值高於上述指標值之檢測極限之最低值(檢測下限值)。

(I-18)如(I-10)至(I-17)所記載之方法，其中上述臨界值為大於50copies/μgRNA之值。

(I-19)如(I-10)至(I-18)中任一項所記載之方法，其中關於上述臨界值，生物樣本中之末梢血為220copies/μgRNA，骨髓液為1,820copies/μgRNA。

(I-20)如(I-2)至(I-19)中任一項所記載之方法，其中於上述(1)之步驟之1步驟RT-PCR法中，WT1 mRNA量之測定係使用：(a)包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組，或(b)包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。

(I-21)如(I-2)至(I-19)中任一項所記載之方法，其中於上述(1)之1步驟RT-PCR法中，WT1 mRNA量之測定係使用：(a')包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號4所示之鹼基序列之探針，或(b')包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號7所示之鹼基序列之探針。

(I-22)如(I-3)至(I-21)中任一項所記載之方法，其中於上述(2)之步驟之1步驟RT-PCR法中，GAPDH mRNA量之測定係使用：(c)包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。

(I-23)如(I-3)至(I-21)中任一項所記載之方法，其中於上述(2)之步驟之1步驟RT-PCR法中，GAPDH mRNA量之測定係使用： (c')包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號11所示之鹼基序列之探針。

(I-24)如(I-3)至(I-23)中任一項所記載之方法，其中於上述(1)之步驟之1步驟RT-PCR法中，WT1 mRNA量之測定係使用：(a')包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號4所示之鹼基序列之探針，或(b')包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號7所示之鹼基序列之探針；於上述(2)之步驟之1步驟RT-PCR法中，GAPDH mRNA量之測定係使用：(c')包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號11所示之鹼基序列之探針。

(I-25)如(I-1)至(I-24)中任一項所記載之方法，其中WT1 mRNA量為從末梢血白血球或骨髓液有核細胞提取之RNA中之WT1 mRNA量。

(I-26)如(I-1)至(I-25)中任一項所記載之方法，其中生物樣本中之WT1 mRNA量分別為兒童ALL中之微小殘留病變之監測標記物。

(I-27)如(I-1)至(I-26)中任一項所記載之方法，其中受試者為兒童ALL患者或疑似罹患兒童ALL之兒童。

(I-28)如(I-1)至(I-27)中任一項所記載之方法，其中生物樣本為末梢血、較佳為末梢血白血球，或骨髓液、較佳為骨髓液有核細胞。

(II)用以測定急性淋巴性白血病(ALL)之受試者之WT1mRNA量的即時PCR用試劑套組(體外診斷用醫藥品)

(II-1)一種用以測定ALL之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其包含：(a)包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組，或(b)包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。

(II-2)一種用以測定ALL之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其包含：(a')包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號4所示之鹼基序列之探針，或(b')包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號7所示之鹼基序列之探針。

(II-3)如(II-1)或(II-2)記載之用以測定ALL之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其進而包含： (c)包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。

(II-4)如(II-1)或(II-2)記載之用以測定ALL之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其進而包含：(c')包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號11所示之鹼基序列之探針。

(II-5)如(II-1)至(II-4)中任一項所記載之用以測定ALL之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其係兒童用即時PCR用套組。

(II-6)一種商業套裝，其包含如(II-1)至(II-5)中任一項所記載之用以測定ALL之受試者之WT1 mRNA量之即時PCR用套組及關於該套組之說明書，並且該說明書及/或商業套裝中記載有下述至少任一條記載或與其相關之記載：(i)該套組可用於輔助ALL之血液學病期之判定，及(ii)用於ALL之血液學病期之輔助判定之臨界值(參考基準值)。

(II-7)如(II-6)所記載之商業套裝，其中上述臨界值為大於50copies/μgRNA之值。

(II-8)如(II-6)或(II-7)所記載之商業套裝，其中上述臨界值係基於ROC曲線(Receiver operating characteristic curve)求出之值，上述ROC曲線係根據基於對兒童ALL患者或疑似兒童ALL患者之生物樣本求出之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA之比所獲得之指標值與兒童ALL之血液學病期的關係而製作。

(II-9)如(II-6)至(II-8)中任一項所記載之商業套裝，其中關於兒童ALL患者之上述臨界值，末梢血為220copies/μgRNA，骨髓液為1,820copies/μgRNA。

(III)急性淋巴性白血病(ALL)之血液學病期之經時追蹤方法(監測方法)

(III-1)一種經時追蹤兒童ALL之血液學病期之方法(監測方法)，其係使用如(I-1)至(I-28)中任一項所記載之輔助兒童ALL之血液學病期之判定之方法而經時追蹤兒童ALL之血液學病期。

(III-2)如(III-1)所記載之方法，其中上述兒童ALL之血液學病期之追蹤係追蹤從非緩解期(未治療期、或治療後復發期、或治療不應期)向緩解期之轉變、及/或從緩解期向非緩解期(未治療期、治療後復發期、或治療不應期)之轉變。

(IV)電腦程式

(IV-1)一種電腦程式，其係利用電腦執行下述(I)及(II)之步驟：(I)接受受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量、及上述該生物樣本中之GAPDH mRNA量之輸入的步驟；及(II)基於上述(I)之步驟中接受輸入之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助兒童ALL之血液學病期之判定所需之指標值的步驟。

(IV-2)如(IV-1)記載之電腦程式，其進而具有利用電腦執行下述(III)之步驟之程式：(III)基於上述(II)之步驟中所獲得之指標值，對受試者決定兒童 ALL之血液學病期的步驟。

(V)電腦程式系統

(V-1)一種電腦系統，其係用於兒童ALL之血液學病期之判定，並且該電腦系統具備包含處理器及記憶體之電腦，上述記憶體中記錄有使上述電腦執行如下步驟之電腦程式：(I)接受受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量、及上述該生物樣本中之GAPDH mRNA量之輸入的步驟；及(II)基於上述(I)之步驟中接受輸入之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助兒童ALL之血液學病期之判定所需之指標值的步驟。

(V-2)如(V-1)所記載之電腦系統，其中上述記憶體中所記錄之電腦程式係使電腦進而執行下述步驟：(III)基於上述(II)之步驟中所獲得之指標值，對受試者決定兒童ALL之血液學病期的步驟。

根據本發明之兒童ALL之血液學病期之輔助判定方法及用以測定ALL之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組(體外診斷用醫藥品)，能夠對兒童ALL患者或疑似罹患ALL之兒童患者簡便地檢測兒童ALL之血液學病期(判別緩解期與非緩解期【未治療期、治療後復發期、或治療不應期】、特別是緩解期與未治療期)或有無罹患兒童ALL。另外，本發明之即時PCR用套組亦能夠對成年ALL患者同樣地進行檢測。另外，藉由本發明之方法所獲得之結果能夠有效地用作基於血像、骨髓像、及染色體異常等其他關聯之檢查結果或臨床症狀等來確定判定有無罹患ALL以及罹患ALL之血液學病期、特別是從未治療期向緩解期之轉變方面的判斷材料之一。

尤其關於ALL之確診，先前以來必須採用使細針刺入胸骨或胯骨而抽吸骨髓液之方法進行骨髓穿刺，與此相對，使用末梢血作為受試試樣之本發明之方法由於為對身體及精神施加之負擔較少之低侵襲之方法，故而能夠有效地用作確診ALL前之預判方法。

另外，根據本發明之監測方法，能夠對兒童ALL患者經時追蹤ALL之血液學病期。其結果為，能夠反映至兒童ALL患者之合適之治療，實現醫療費用之減輕、兒童ALL患者之身體負擔之減輕。

1‧‧‧輔助判定裝置

2‧‧‧測定裝置

3‧‧‧電腦系統

3a‧‧‧電腦本體

3b‧‧‧輸入部

3c‧‧‧顯示部

30‧‧‧CPU

31‧‧‧ROM

32‧‧‧RAM

33‧‧‧輔助記憶部

34‧‧‧輸入輸出介面

35‧‧‧媒體介面

36‧‧‧通訊介面

37‧‧‧圖像輸出介面

38‧‧‧匯流排

40‧‧‧記錄媒體

301‧‧‧接收部

302‧‧‧記憶部

303‧‧‧算出部

304‧‧‧判定部

305‧‧‧輸出部

圖1係表示本發明之兒童ALL之血液學病期之輔助判定方法所使用之輔助判定裝置之一例的概略圖。

圖2係表示輔助判定裝置之軟體之功能構成的方塊圖。

圖3係表示輔助判定裝置之硬體之構成的方塊圖。

圖4係表示輔助判定裝置之動作之流程圖之一例。

圖5表示WT1 mRNA之檢查流程。

圖6表示48個跟蹤觀察病例之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量之變遷。各曲線圖中，縱軸表示WT1 mRNA表現量(copy/μg RNA)之常用對數值，橫軸表示治療開始後之跟蹤觀察期間(月)(下述之圖7亦相同)

圖7A表示A組(7例)(表8)之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量之變遷。

圖7B表示B組(14例)(表8)之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量之變遷。

圖7C表示C組(13例)(表8)之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量之變遷。

圖7D表示D組(11例)(表8)之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量之變遷。

圖7E表示E組(3例)(表8)之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量之變遷。

圖8表示血液學病期中之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量。縱軸表示WT1 mRNA表現量(copy/μg RNA)之常用對數值。

圖9表示緩解期與未治療期中之末梢血及骨髓液中之WT1 mRNA表現量之ROC解析結果。縱軸表示敏感度，橫軸表示特異度。

(I)關於兒童ALL

兒童ALL係白血球中之包含B細胞或T細胞等之淋巴球在未成熟階段惡化，主要於骨髓中異常地增加並迅速地發展之疾病，係一般稱為「血癌」之白血病之一種。兒童ALL之症狀(貧血症狀、倦怠感、眩暈、頭暈、心悸、氣喘、水腫(浮腫等)、伴有感染之發熱、鼻血、牙齦出血或皮下出血、淋巴結腫大、肝脾腫大等)主要係由白血病細胞(癌細胞)於骨髓及末梢血中異常增生而使正常之血液細胞(白血球、紅血球、血小板)受到壓迫而減少所引起。於確認到如上所述之症狀之情形時，雖然疑似罹患兒童ALL，但其確診必須進行缺骨髓穿刺，於藉由利用骨髓穿刺而獲得之骨髓液標本確認到酯酶染色陰性及過氧化酶染色陰性(陰性之基準係設為未達3%)之淋巴胚細胞為全部有核細胞之25%以上之情形時，判斷罹患兒童ALL。再者，據信兒童ALL與長期生存率未達30~40%之成人ALL不同，大致80%以上可藉由治療而痊癒。認為其原因在於，與成人發病例相比，費城染色體之變異或T細胞性之急性淋巴性白血病之頻度較少。就該意義而言，將兒童ALL定位為包括治療方法在內不同於成人ALL之疾病。

基於藉由骨髓穿刺所獲得之資訊(骨髓有核細胞數及其形態、細胞之表面抗原解析(白血病細胞之種類)、染色體檢查、基因解析、病理學檢查)而選定預想之預後及適當之治療方法。

兒童ALL之治療根據病期大致分為誘導緩解療法與緩解後療法，緩解後療法進而包括強化療法及維持療法。誘導緩解療法通常需要1個月左右之治療期間，若成為緩解狀態，則繼而移向緩解後療法，實施進一步減少殘留之白血病細胞而維持緩解並且預防復發之治療。因此，在治療進行方面極重要的是分辨於哪一階段是否成為緩解狀態、即病期是否轉變成緩解期。

再者，兒童ALL之「緩解」之定義為滿足下述條件之狀態：(1)未投予G-CSF而嗜中性球為500/μL以上， (2)血小板為8萬/μL以上，(3)非輸血依賴性，(4)末梢血中未確認到白血病細胞，(5)由白血病導致之臨床症狀及臨床表現消失，以及(6)於骨髓血中胚細胞未達5%，未確認到明確之白血病細胞之形態的狀態。

(II)兒童ALL之血液學病期之輔助判定方法

本發明係關於一種輔助兒童ALL之血液學病期之判定的方法。

此處，作為兒童ALL之血液學病期，可列舉：處於尚未對兒童ALL進行誘導緩解療法之狀態之「未治療期(初發期)」、轉變成上述緩解狀態之「緩解期」、及由緩解狀態再次成為白血病細胞增加之狀態之「治療後復發期」、以及治療未奏效之狀態即「治療不應期」。本發明係關於一種用以對兒童ALL鑑別上述血液學病期中之緩解期與非緩解期(包括未治療期、治療後復發期、及治療不應期)之輔助方法。尤佳為本發明關於一種對兒童ALL判定自上述血液學病期中之作為非緩解期之未治療期(初發期)向緩解期之轉變的輔助方法。即，本發明係關於一種用於以進行了誘導緩解療法及緩解後療法之兒童ALL患者為對象，於確診前判斷該患者是否到達緩解狀態的輔助判定方法。

本發明之方法可藉由至少進行下述(1)~(3)之步驟而實施。

(1)獲取受試者之生物樣本中之WT-1之mRNA量的步驟(WT1 mRNA 量獲取步驟)

(2)獲取上述該生物樣本中之GAPDH mRNA量的步驟(GAPDH mRNA量獲取步驟)、及

(3)基於上述(1)及(2)之步驟中分別獲取之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助判定所需之指標值的步驟(指標值算出步驟)。

再者，於本發明中，有時將指標值算出步驟中所獲得之「指標值」稱為「WT1mRNA表現量」。

以下，對該等步驟進行說明。

(1)WT1 mRNA量獲取步驟

該步驟係獲取受試者之生物樣本中表現之WT1 mRNA量之步驟。

該WT1 mRNA量之獲取方式或獲取方法於實施該步驟後，結果成為獲取到WT1 mRNA量(資訊)之狀態即可，只要如此則無特別限制。具體而言，可藉由自行將受試者之生物樣本作為材料，測定WT1 mRNA量而獲取，另外，亦可藉由直接或間接地接受第三人所測得之WT1 mRNA量之提供而獲取。

設為本發明之對象之受試者為罹患兒童急性淋巴性白血病(兒童ALL)之兒童ALL患者或疑似罹患兒童ALL之兒童(以下，亦稱為「疑似兒童ALL患者」)。較佳為兒童ALL患者，進而較佳為已開始進行針對兒童ALL之誘導緩解療法之兒童ALL患者。於本發明中，兒童意指1~19歲之男女。

另外，所謂兒童ALL患者，例如係指藉由理化學表現、血液檢查、及骨髓穿刺等特定檢查方法而確診罹患兒童ALL之兒童患者。

另外，所謂疑似罹患兒童ALL之兒童(疑似兒童ALL患者)，係指至今為止無罹患兒童ALL之既往史，根據臨床表現(血液常規檢查、血液生化學檢查等)及臨床症狀等而疑似ALL者。

本發明之方法中作為測定對象之生物樣本可列舉包含WT1 mRNA之源自兒童(兒童ALL患者、疑似兒童ALL患者)之生物樣本，例如可列舉：細胞、組織、血液、骨髓液、唾液、痰液、糞便、及尿。較佳為血液及骨髓液。另外，作為血液，較佳可列舉末梢血。更佳可列舉末梢血中之末梢血白血球、骨髓液中之骨髓液有核細胞。另外，作為該生物樣本，亦可使用從可能含有WT1 mRNA之樣本藉由利用公知之方法進行處理所獲得之總RNA、或者富集mRNA之RNA樣本等。RNA樣本可使用可商業獲取之RNA提取套組進行製備。較佳可例示使用市售之RNA提取套組從血液(較佳為末梢血)中之白血球成分或骨髓液中之有核細胞所製備者。再者，RNA樣本可於水溶液、或者吸附或固定於適當之固相之狀態下使用。作為mRNA量，亦可以相對於反應液每100μl為0.01ng~1μg之方式製備。

設為本發明之測定對象之WT1基因係如上所述鑑定為兒童威爾姆氏腫瘤之病原基因的包含3037bp之基因，作為「Homo sapiens Wilms Tumor 1(WT1),transcript variant D,mRNA」登記於NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)中(NM_024426.4)。將其鹼基序列示於序列表之序列編號1。

生物樣本中之WT1 mRNA量之測定方法只要為能夠測定作為WT1基因之轉錄物的mRNA之量之方法即可，可例示RT-PCR法(2步驟RT-PCR法、1步驟RT-PCR法)、原位RT-PCR法、下一代序列分析儀等業界廣為人知之方法。較佳為2步驟RT-PCR法或1步驟RT-PCR法。更佳為利用於同一容器內連續進行逆轉錄反應與PCR反應(延伸及擴增反應)之1步驟RT-PCR法所進行之測定方法。

作為本發明中可使用之1步驟RT-PCR法所使用之反應緩衝液，只要為適於使具有逆轉錄活性之酶顯示活性之水溶性緩衝液即可，例如可列舉pH值7~10、較佳為pH值8~9之緩衝液，例如Tris(三羥甲基胺基甲烷)緩衝液。進而，該緩衝液中可包含具有逆轉錄活性之酶或DNA(deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸)聚合酶之活性所需之各種離子。其中，Na離子或K離子可以鹽之形式以5~50mM之濃度添加。另外，Mg離子或Mn離子可以鹽之形式以1~10mM之濃度添加。此外，亦可根據需要調配界面活性劑、牛血清白蛋白(BSA)、明膠等促進具有逆轉錄活性之酶或DNA聚合酶之活性或使其等穩定化之藥劑。另外，為了抑制樣本中之RNA及RNA競爭物之分解，亦可添加核糖核酸酶抑制劑。

作為具有逆轉錄活性之酶，可列舉源自禽類成髓細胞瘤病毒之逆轉錄酶(AMV)、源自勞斯相關病毒之逆轉錄酶(RAV2)、源自莫洛尼鼠白血病病毒之逆轉錄酶(MMLV)、源自嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)之DNA聚合酶(Tth)、源自熱堅芽孢桿菌(Bacillus cardotenax)之DNA聚合酶(Bca)、以及該等之衍生物，其中，Tth最適合本發明。作為Tth，具體可例示源自棲熱菌種(Thermus species)Z05之耐熱性酶(Thermostable enzyme)之DNA聚合酶。再者，該等酶可為自其原本之起源加以純化而獲取者、或者藉由基因工程學方法生產之重組蛋白質之任一者。

對於反應液，添加cDNA(complementary deoxyribonucleic acid，互補脫氧核糖核酸)合成以及PCR中成為受質之4種脫氧核苷三磷酸 (dATP(deoxyadenosine triphosphate，脫氧腺苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidine triphosphate，脫氧胞苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosine triphosphate，脫氧鳥苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidine triphosphate，脫氧胸苷三磷酸)；本說明書中亦有將該4種統稱為「dNTP」之記載)。另外，dNTP之全部或一部分亦可於能夠使由引子合成之DNA鏈延伸之範圍內置換為經修飾及/或標記之dNTP。

於本發明中，作為由標靶RNA合成為cDNA(逆轉錄反應及延伸反應)所使用之引子，必須為至少具有與標靶RNA之鹼基序列互補之鹼基序列，且於所採用之反應條件下與標靶RNA進行退火之寡核苷酸。作為寡核苷酸之長度，可例示6~100個核苷酸、較佳為10~30個核苷酸之長度。另外，亦可使用經修飾及/或標記之引子。該引子例如可藉由公知方法化學地合成。另外，PCR中使用之引子必須能夠至少以源自標靶RNA之cDNA為模板進行DNA擴增。因此，必須為至少具有與模板cDNA之鹼基序列互補之鹼基序列，且於採用之反應條件下與該cDNA進行退火之寡核苷酸。較佳為於由上述標靶RNA合成cDNA(逆轉錄反應及延伸反應)時作為引子而發揮功能，並且對以cDNA為模板之DNA亦作為引子而發揮功能的寡核苷酸。

關於可較佳地用於將作為本發明之目標基因的人類WT1 mRNA逆轉錄為cDNA並加以延伸、擴增之引子組，可列舉包含下述表2所記載之(A1)前置引子及(A2)反置引子之引子組A、以及包含表3所記載之(B1)前置引子及(B2)反置引子之引子組B。再者，表2及3中亦一併表示用於檢測利用該等引子組進行擴增之人類WT1基因擴增物之序列特異性結合探針((A3)探針、(B3)探針)。再者，對於該探針，較佳為進行標記，以使擴增物之檢測變得容易。

探針之標記法有RI(radioactive isotope，放射性同位素)法與非RI法，較佳為使用非RI法。非RI法可列舉螢光標記法、生物素標記法、化學發光法等，較佳為使用螢光標記法。作為螢光物質，只要為能夠與核酸之鹼基部分結合者，則無特別限定，例如可使用花青素色素(Cy DyeTM系列之Cy3或Cy5等)、玫瑰紅6G試劑、FAM(6-羧基螢光素)、及HEX(6-六氯螢光素)等。另外，探針亦可經淬滅色素標記。再者，作為淬滅色素，只要為具有作為淬滅色素之功能且與上述同樣地能夠與核酸之鹼基部分結合者，則無特別限定，例如可列舉ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH公司)。

本發明中使用之RNA標準品(標靶RNA)可藉由公知之方法而製作。例如可參照「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第87卷，第2725 ~2729頁(1990)」、「Clinical Chemistry(Clin.Chem.)，第41卷，第819~825頁(1995)」、「Blood，第82卷，第1929~1936頁(1993)」等之記載而製作。

具體而言，如下所述。對擴增對象之雙鏈DNA序列附加成為RNA合成酶、例如T7 RNA聚合酶等之反應基點之啟動子序列，製作成為RNA合成之模板之DNA序列。於反應容器內添加RNA聚合酶與包含RNA啟動子序列之雙鏈DNA、及核苷三磷酸，於37℃下反應30分鐘~2小時，藉此合成與RNA啟動子下游之模板DNA互補之單鏈RNA(標靶RNA)。

作為本發明中可使用之1步驟RT-PCR法之反應操作及反應條件，並無限制，可例示下述。

於反應容器內添加例如包含cNTP、Mg鹽或Mn鹽等金屬離子、核糖核酸酶抑制劑、具有逆轉錄活性之酶、及引子等之反應液，直至反應開始前預先在4℃以下保冷。於其中添加欲測定之能夠包含人類WT1 mRNA之受試試樣，於50~70℃、較佳為於55~65℃下以2~30分鐘、較佳為2~10分鐘左右反應複數次，進行cDNA合成(逆轉錄反應)。繼而，以90~99℃加熱10秒~2分鐘左右，使RNA-cDNA複合體變性(熱變性)。進而進行2~50個循環之包含90~99℃下之熱變性、45~65℃之退火反應、及60~80℃之DNA延伸反應的溫度循環反應，使源自標靶RNA之DNA片段擴增。於為了進一步提高敏感度及/或特異性而進行巢式PCR之情形時，亦可預先將第1階段、第2階段之PCR所使用之引子一同從一開始起便預先添加至反應容器內，連續地進行2個階段之PCR。於該情形時，第1階段之PCR用引子量必須少於第2階段之PCR用引子量，較佳為第2階段之PCR用引子量之100倍以下之量。

根據以上所說明之方法，可藉由同一容器內之1步驟反應簡便地測定人類WT1 mRNA量。另外，該方法可藉由使用可商業獲取之即時RT-PCR用套組、及/或即時PCR裝置而簡便地實施。

其中，該WT1 mRNA量之獲取步驟並不限於該方法，如上所述，只要為可至少以資訊之形式獲得受試者(例如兒童ALL患者、疑似兒童ALL患者)之生物樣本中之WT1 mRNA量之方法即可，如上所述，可藉由自行以受試者之生物樣本為材料測定WT1 mRNA量而獲取，另外，亦可藉由從第三人或其他人以資料(資訊)之形式獲取該第三人所測得之WT1 mRNA量而進行。

於本發明中，如上所述，可較佳地使用2步驟RT-PCR法、或1步驟RT-PCR法。作為2步驟RT-PCR法，例如可列舉WT1 mRNA測定套組「Otsuka」，並且可使用該套組之隨附文件(2013年3月修訂(第6版))所記載之方法。此處，下述實施例係使用1步驟RT-PCR法，但文獻(K.Kitamura,et al.Clinical usefulness of WT1 mRNA expression in bone marrow detected by a new WT1mRNA assay kid for monitoring acute myeloid leukemia：a comparison with expression of WT1 mRNA in peripheral blood.Int J Hematol(2016)103：53-62.)中顯示：於使用1步驟RT-PCR法之情形與使用2步驟RT-PCR法之情形時，所獲得之WT1 mRNA量(定量值)有相關關係。

(2)GAPDH mRNA量獲取步驟

該步驟係以上述(1)之步驟中設為對象之受試者之生物樣本為對象，獲取該生物樣本中所表現之GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)之mRNA量的步驟。

該GAPDH mRNA之量之獲取方式或獲取方法於實施該步驟後，結果成為獲取到GAPDH mRNA量(資訊)之狀態即可，只要如此，則無特別限制。具體而言，可藉由自行將受試者之上述該生物樣本作為材料測定GAPDH mRNA之量而獲取，另外，亦可藉由直接或間接地接受第三人對該生物樣本測得之GAPDH mRNA之量之提供而獲取。

設為對象之生物樣本為與上述測定過WT1 mRNA量之源自兒童(兒童ALL患者、疑似兒童ALL患者)之生物樣本相同之生物樣本。因此，作為生物樣本，如上所述，例如可列舉：細胞、組織、血液、骨髓液、唾液、痰液、糞便、及尿。較佳為血液及骨髓液。另外，作為血液，較佳可列舉末梢血。更佳可列舉末梢血中之末梢血白血球、骨髓液中之骨髓液有核細胞。

GAPDH係作為「Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH),mRNA」而登記於NCBI之基因(NM_002046.3)。該基因係與細胞之分化無關，於任何細胞中均始終表現並存在，雖然不發揮出特殊功能但具有該等之生存所需之作用的基因。尤其是該基因與作為測定目標之人類WT1基因之鹼基序列同源性較低，因此藉由RT-PCR所進行之擴增不會產生競爭，故而可較佳地用作管家基因。將其鹼基序列示於序列表之序列編號8。

受試者之生物樣本中之GAPDH mRNA量之測定方法只要為能夠測定作為GAPDH基因之轉錄物的mRNA之量之方法即可，可使用RT-PCR法(2步驟RT-PCR法、1步驟RT-PCR法)、原位RT-PCR法、下一代序列分析儀等業界廣為人知之方法進行測定。較佳為2步驟RT-PCR法或1步驟RT-PCR法。更佳為利用於同一容器內連續進行逆轉錄反應與PCR反應(延伸及擴增反應)之1步驟RT-PCR法所進行之測定方法。作為本發明中可使用之1步驟RT-PCR法所使用之反應緩衝液、調配至該反應緩衝液之各種成分、具有逆轉錄活性之酶、及其他成分，同樣可列舉上述「(1)WT1 mRNA量獲取步驟」所記載者。

作為較佳地用於將GAPDH mRNA逆轉錄為cDNA並加以延伸、擴增之引子組，可列舉包含下述表4所記載之(a1)前置引子及(a2)反置引子之引子組a、以及包含表5所記載之(b1)前置引子及(b2)反置引子之引子組b。再者，表4及5中亦一併表示用於檢測利用該等引子組而進行擴增之人類GAPDH基因擴增物之序列特異性結合探針((a3)探針、(b3)探針)。再者，對於該探針，較佳為進行標記，以使擴增物之檢測變得容易。作為探針之標記法，同樣可列舉上述「(1)WT1 mRNA量獲取步驟」所記載之方法。

作為1步驟RT-PCR之反應操作及反應條件，並無限制，同樣可列舉上述「(1)WT1 mRNA量獲取步驟」所記載之方法及條件。該方法可藉由使用可商業獲取之即時RT-PCR套組及/或即時PCR裝置而簡便地實施。如此，可藉由同一容器內之1步驟反應而簡便地測定人類GAPDH mRNA量。

其中，GAPDH mRNA量之獲取步驟並不限於該方法，如上所述，只要為可獲得受試者(兒童ALL患者、疑似兒童ALL患者)之生物樣本中之GAPDH mRNA量之方法即可，如上所述，可藉由自行以受試者之生物樣本為材料測定GAPDH mRNA量而獲取，另外，亦可藉由以資料資訊之形式收集第三人所測得之GAPDH mRNA量而進行。

上述(2)GAPDH mRNA量獲取步驟亦可與上述(1)WT1 mRNA量獲取步驟分開進行，較佳為與(1)WT1 mRNA量獲取步驟同時進行。更佳為(1)WT1 mRNA量獲取步驟與(2)GAPDH mRNA量獲取步驟均係藉由1步驟RT-PCR法測定受試者之生物樣本中之mRNA量而獲取其之步驟，該(1)及(2)中之1步驟RT-PCR法係同時且於同一容器內連續進行WT1 mRNA及GAPDH mRNA各者之逆轉錄反應及包含雙鏈cDNA之合成之PCR反應而進行的方法(多工/1步驟定量即時RT-PCR)。

該方法可藉由在同一反應容器內添加反應液並使用上述反應操作及反應條件進行1步驟RT-PCR而實施，該反應液包含WT1基因擴增用之包含前置引子與反置引子之引子組及用以檢測其擴增產物之探針、以及GAPDH基因擴增用之包含前置引子與反置引子之引子組及用以檢測其擴增產物之探針，此外亦包含cNTP、Mg鹽或Mn鹽等金屬離子、核糖核酸酶抑制劑、具有逆轉錄活性之酶等。

可於該反應容器內產生下述兩種反應，同時且即時地測定存在於受試者之生物樣本中之源自WT1 mRNA之cDNA之增加、及源自GAPDH mRNA之cDNA之增加兩者。

於本發明中，如上所述，可較佳地使用2步驟RT-PCR法、或1步驟RT-PCR法。作為2步驟RT-PCR法，例如可列舉WT1 mRNA測定套組「Otsuka」，可使用該套組之隨附文件(2013年3月修訂(第6版))所記載之方法。此處，本案之實施例係使用1步驟RT-PCR法，但文獻(K.Kitamura,et al.Clinical usefulness of WT1 mRNA expression in bone marrow detected by a new WT1 mRNA assay kid for monitoring acute myeloid leukemia：a comparison with expression of WT1 mRNA in peripheral blood.Int J Hematol(2016)103：53-62.)中顯示：於使用1步驟RT-PCR法之情形與使用2步驟RT-PCR法之情形時，所獲得之WT1 mRNA量(定量值)有相關關係。

【反應容器內所產生之反應】

以下，對使用1步驟RT-PCR法之情形進行說明。

關於WT mRNA，首先使具有與測定樣本所含之WT1 mRNA互補之序列之WT1反置引子結合。以該WT1反置引子為起點，利用具有逆轉錄活性之DNA聚合酶而合成對WT1 mRNA具有特異性之第1鏈cDNA。繼而，以具有與第1鏈cDNA互補之序列的WT1前置引子為起點而合成雙鏈cDNA。藉由反覆進行以所合成之雙鏈cDNA為模板之PCR而擴增源自WT1mRNA之cDNA。於該擴增過程中，結合於雙鏈cDNA之一條鏈之WT1探針(標記WT1探針)藉由DNA聚合酶之5'-3'核酸外切酶活性而分解，標記物從標記WT1探針游離而發出由該標記物產生之訊號(例如螢光訊號等)。藉由在每個擴增週期測定該訊號，可即時測定源自WT1 mRNA之cDNA之增加。另外，由於關於GAPDH mRNA亦並列地同樣產生連續之反應，故而藉由與上述同樣地於每個擴增週期測定由從標記GAPDH探針游離之標記物產生之訊號，可即時測定源自GAPDH mRNA之cDNA之增加。於該情形時，對於WT1探針及GAPDH探針，較佳為分別利用不同之標記物(例如螢光物質)進行標記。

(3)指標值算出步驟

該步驟係基於上述(1)及(2)之步驟中分別獲取之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，而算出輔助判定所需之指標值的步驟。

WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比可藉由將上述(1)之步驟中獲取之WT1 mRNA量(標記物基因之量)除以(2)之步驟中獲取之GAPDH mRNA量(管家基因之量)，而以「WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量」之值之形式獲得，意指相對於GAPDH mRNA每1個拷貝之WT1 mRNA之拷貝數。此處，「1個拷貝」意指1個GAPDH mRNA或WT1 mRNA、1分子之GAPDH mRNA或WT1 mRNA。具體而言，「相對於GAPDH mRNA每1個拷貝之WT1 mRNA之拷貝數」可換稱為「相對於GAPDH mRNA每1個之WT1 mRNA之個數」或「相對於GAPDH mRNA每1分子之WT1 mRNA之分子數」。

本發明之輔助判定所需之指標值可藉由將上述所獲得之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)進一步標準化(normalization)而算出。

此處，標準化可藉由將上述所獲得之「WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量」乘以健康成人之每1μg RNA之平均GAPDH mRNA測定值(GAPDH mRNA量：copies/μg RNA)而進行。再者，此處，健康成人意指血液常規檢查及血液生化學檢查、肝功能及腎功能常規檢查之檢查結果基於業界之技術常識而判斷為正常之20歲以上之人類(不分男女)。

具體而言，作為一例，標準化可藉由將上述中獲得之「WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量」乘以相當於健康成人每1μg RNA之平均GAPDH mRNA測定值之「2.7×10⁷copies/μgRNA」而進行，可將如此而獲得之值作為指標值而用於輔助判定。

於本發明中，有時將指標值算出步驟中所獲得之指標值稱為WT1 mRNA表現量。

(4)血液學病期之輔助判定步驟

本發明之方法可進而包括下述步驟。

(4)將上述(3)之步驟中所獲得之指標值與預先設定之臨界值加以對比，基於其大小而表示受試者之兒童ALL之血液學病期的步驟。

於受試者為兒童ALL患者之情形時，該步驟(4)可設為如下步驟：在上述步驟(3)中所獲得之指標值小於特定之臨界值之情形時，表示該受試者處於緩解期，另一方面，在上述步驟(3)中所獲得之指標值為上述特定之臨界值以上之情形時，表示該受試者處於非緩解期。此處，非緩解期包括未治療期、治療後復發期、及治療不應期。因此，可根據緩解期與鑑別目標之非緩解期，從未治療期、治療後復發期、及治療不應期中至少選擇一個病期，使用與此對應之臨界值。再者，於本發明中，「臨界值」意指用以輔助血液學病期之判定之「參考基準值」，本說明書中所記載之「臨界值」可換稱為「參考基準值」。

另外，於受試者為疑似兒童ALL患者之情形時，該步驟(4)可設為如下步驟：在上述步驟(3)中所獲得之指標值小於特定之臨界值之情形時，表示該受試者未罹患，另一方面，在上述步驟(3)中所獲得之指標值為上述特定之臨界值以上之情形時，表示該受試者罹患(於兒童ALL之血液學病期之分類中為「非緩解期」)。

該步驟中使用之臨界值(兒童ALL血液學病期輔助判定用臨界值)於受試者為兒童ALL患者之情形時(較佳為正接受誘導緩解療法之兒童ALL患者)，為針對用於輔助判定該受試者是否處於兒童ALL之緩解期之指標值的參考基準值。換言之，該臨界值係針對用於輔助判別受試者處於緩解期亦或處於非緩解期(未治療期、治療後復發期、或治療不應期)之指標值的參考基準值。

另外，該步驟中使用之臨界值於受試者為疑似兒童ALL患者之情形時，為針對用於輔助判定該受試者是否罹患兒童ALL之指標值的參考基準值。該罹患狀態為相當於兒童ALL患者之未治療期之狀態，未罹患狀態為相當於兒童ALL患者之緩解期之狀態。

臨界值係根據作為對象之受試者之生物樣本之種類、鑑別對象病期及判定目標等而個別地設定，根據該等而存在複數個值。具體而言，例如可列舉：於受試者為正接受誘導緩解療法之兒童ALL患者之情形時，為用以輔助判別該受試者處於非緩解期或已到達緩解期的臨界值；於受試者為正接受緩解後療法之兒童ALL患者之情形時，為用以輔助判別該受試者處於緩解期或處於治療後復發期的臨界值；於受試者為正接受誘導緩解療法或緩解後療法之兒童ALL患者之情形時，為用以輔助判別該受試者處於治療不應期或處於緩解期的臨界值；於受試者為疑似兒童ALL患者之情形時，為用以輔助判別該受試者是否為未治療期、即否罹患兒童ALL的臨界值等。再者，於「是否罹患兒童ALL」為「否」之情形時，包括雖然未罹患兒童ALL但罹患兒童ALL以外之血液病之情況、及不僅罹患兒童ALL而且亦罹患兒童ALL以外之血液病之情況。

另外，該等臨界值亦根據設為對象之受試者之生物樣本而異，具體而言例如可根據末梢血與骨髓液等生物樣本之種類而設定各自之臨界值。

例如，於受試者為兒童ALL患者之情形時，該臨界值可根據基於兒童ALL患者之生物樣本中之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)而獲得之指標值與兒童ALL患者之兒童ALL之血液學病期的關係而求出。此處，指標值可藉由上述「(3)指標值算出步驟」中所說明之方法而求出。

具體而言，首先以藉由慣用之診斷方法確診兒童ALL之血液學病期(未治療期、治療後復發期、治療不應期、及緩解期)的複數個兒童ALL患者為對象，對每1個血液學病期求出基於生物樣本(例如末梢血、骨髓液)中之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)的指標值之分佈或平均值。繼而，可基於所獲得之每1個病期之指標值之分佈或平均值(平均指標值)，任意地設定能夠識別(分離)屬於緩解期之組(緩解期組)與屬於各非緩解期之組(非緩解期組)之值，並將其設為臨界值。上述非緩解期組中包括未治療期組、治療後復發期組、及治療不應期組。即，若設定能夠分離未治療期組與緩解期組之值，則其成為用以鑑別未治療期組與緩解期組之臨界值，以下同樣地藉由設定能夠分離緩解期組與治療後復發期組之值、以及能夠分離緩解期組與治療不應期組之值，該設定值成為各自之臨界值。

另外，於將疑似兒童ALL患者作為對象之情形時，首先，以藉由慣用之診斷方法確診為罹患兒童ALL(未治療期)之複數個兒童ALL患者與複數個未罹患ALL之兒童為對象，按照有無罹患兒童ALL，求出基於生物樣本(例如末梢血、骨髓液)中之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)的指標值之分佈或平均值。繼而，基於所獲得之按照有無罹患之指標值之分佈或其平均值(平均指標值)，任意地設定能夠識別(分離)兒童ALL罹患者組與未罹患ALL之兒童組之值，藉此可將其設為用以輔助判定有無罹患兒童ALL之臨界值。再者，作為未罹患ALL之兒童，可列舉雖然未罹患ALL但罹患ALL以外之血液病之兒童、及不僅罹患ALL而且亦罹患ALL以外之血液病之兒童。尤其是罹患呈現與ALL類似之症狀的ALL以外之血液病之兒童。

於本發明中，能夠識別(分離)該等兩組之臨界值可藉由統計學解析而求出。作為統計學解析，可使用各種解析方法。例如，具體而言可列舉ROC解析、判別分析、及單變量解析等。

判別分析例如係用於從某資料識別2組之方法，係根據為某值以上與未達該值而進行分組之分析。

單變量解析例如係如下解析：於反應變數(相當於Y=a+bX之Y者)為連續資料之情形時，若考慮使高血壓患者之血壓下降10時某藥劑之用量，則以何種基準決定該10。

於本發明中，較佳為使用ROC解析。對使用ROC(Receiver operation character)解析求出臨界值之方法進行記載。關於能夠識別(分離)非緩解期與緩解期之兩組之臨界值，作為一例，可藉由將由兩組所求出之指標值(將WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比標準化所得之值)製成由敏感度(sensitivity)與特異度(100%-specificity)之2軸表示之ROC曲線 (Receiver operating characteristic curve)而求出。基於ROC曲線之臨界值之求出方法例如可根據「生物樣本分析」2005年、第28卷、pp.133-139及Perkins NJ,Am J Epidemiol.2006；163：670-675.所記載之方法而設定。

作為利用ROC曲線求出臨界值之方法，可列舉如下兩方法：(1)於記載有ROC曲線之曲線圖中，利用距左上角之距離之方法；及(2)使用約登指數(Youden index)之方法。(1)之方法係如下方法：根據敏感度與特異度優異之獨立變數之ROC曲線會逐漸靠近左上角這一事實，而將距該左上角之距離最小之點設為臨界值。另一方面，(2)之方法係如下方法：將距預測能力及診斷能力較低之獨立變數之ROC曲線、即AUC=0.500之線最遠之點設為臨界值。具體而言為計算「敏感度+特異度-1」，將其成為最大值之點(約登指數)設為臨界值之方法。

如此，可設定用以輔助判定各組(緩解期組與未治療期組、緩解期組與治療後復發期組、緩解期組與治療不應期組、罹患組與未罹患組)之鑑別的臨界值。

於本發明中，臨界值高於上述指標值之檢測下限值。

「指標值之檢測下限值」意指指標值能夠檢測到之最小量(值)。具體而言，意指使用RT-PCR法進行測定之情形時之檢測最小量。更佳為使用本發明之即時PCR用套組進行測定之情形時套組之性能上所能夠測定到之檢測下限之值。

於下述本實施例中，作為一例，藉由ROC曲線(約登指數法)而設定該等臨界值中之用以輔助判別未治療期與緩解期的臨界值(約登指數)。具體而言，於使用骨髓液作為生物樣本之情形時，較佳之臨界值為1,820copies/μg RNA(敏感度58.1%、特異度98.0%、AUC 0.794)，於使用末梢血作為生物樣本之情形時，較佳之臨界值為220copies/μg RNA(敏感度68.8%、特異度98.0%、AUC 0.894)。

因此，能夠對未治療之兒童ALL患者及正實施誘導緩解療法之兒童ALL患者，基於該臨界值而輔助判別未治療期與緩解期。具體而言，關於兒童ALL患者，若以末梢血及/或骨髓液作為受試試樣而算出之指標值分別未達220copies/μg RNA及/或未達1,820copies/μg RNA，則能夠判斷(預判)該兒童ALL患者到達緩解期，相反若為220copies/μg RNA以上及/或1,820copies/μg RNA以上，則能夠判斷(預判)該兒童ALL患者尚處於未治療期。

藉由使用以上所說明之輔助急性淋巴性白血病之血液學疾病之判定的方法，能夠對兒童ALL患者經時追蹤其血液學病期。因此，本發明亦係關於一種藉由實施上述方法之兒童ALL之血液學病期之經時追蹤方法。再者，上述兒童ALL之血液學病期之追蹤包括追蹤從非緩解期向緩解期之轉變、及追蹤從緩解期向非緩解期之轉變。

(III)用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組(體外診斷用醫藥品)

本發明之用以測定ALL受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組之特徵在於包含用以將人類WT1 mRNA供於RT-PCR法之引子組、及用以將作為管家基因之GAPDH mRNA供於RT-PCR法之引子組兩者。另外，該套組中可包含用於檢測藉由RT-PCR法而進行擴增之人類WT1 mRNA之擴增產物、及管家基因(GAPDH mRNA)之擴增產物的探針。

作為套組之一例，可列舉如下者，其包含：作為用以將人類WT1 mRNA供於RT-PCR法之引子組的包含表2所示之「(A1)前置引子(序列編號2)」及「(A2)反置引子(序列編號3)」之引子組A、以及作為用於檢測利用該等引子組進行擴增之人類WT1基因擴增物之序列特異性結合探針的表2所示之「(A3)探針(序列編號4)」，且包含：作為用以將用作管家基因之人類GAPDH mRNA供於RT-PCR法之引子組的包含表4所示之「(a1)前置引子(序列編號9)」及「(a2)反置引子(序列編號10)」之引子組a、以及作為用於檢測利用該等引子組進行擴增之人類GAPDH基因擴增產物之序列特異性結合探針的表4所示之「(a3)探針(序列編號11)」。

再者，對於探針，較佳為進行標記，以使擴增物之檢測變得容易。

探針之標記法有RI法與非RI法，較佳為使用非RI法。非RI法可列舉螢光標記法、酶、生物素標記法、發色團、化學發光標記法等，可較佳地使用螢光標記法。作為螢光物質，只要為能夠與核酸之鹼基部分結合者，則無特別限定，可使用花青素色素(Cy DyeTM系列之Cy3或Cy5等)、玫瑰紅6G試劑、FAM(6-羧基螢光素)、及HEX(6-六氯螢光素)等。另外，探針亦可經淬滅色素標記。再者，作為淬滅色素，只要為具有作為淬滅色素之功能且與上述同樣地能夠與核酸之鹼基部分結合者，則無特別限定，例如可列舉ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH公司)。

作為套組之另一例，可列舉如下者，其包含：作為用以將人類WT1 mRNA供於RT-PCR法之引子組的包含表3所示之「(B1)前置引子(序列編號5)」及「(B2)反置引子(序列編號6)」之引子組B、以及作為用於檢測利用該等引子組進行擴增之人類WT1基因擴增物之序列特異性結合探針的表3所示之「(B3)探針(序列編號7)」，且包含：用以將用作管家基因之人類GAPDH mRNA供於RT-PCR法之引子組的包含表5所示之「(b1)前置引子(序列編號9)」及「(b2)反置引子(序列編號12)」之引子組b、以及用於檢測利用該等引子組進行擴增之人類GAPDH基因擴增產物之序列特異性結合探針的表5所示之「(b3)探針(序列編號11)」。

本發明之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組除上述成分以外，亦可包含逆轉錄反應與PCR之兩個反應所需之各種成分(dNTP、金屬離子、用以調整pH值之緩衝成分等)、具有逆轉錄活性等之酶或酶輔助因子等。再者，作為金屬離子，並無限制，可例示乙酸錳或鎂鹽等能夠產生二價金屬離子之鹽。另外，該套組之各種成分可進而添加使酶穩定化之成分或核糖核酸酶抑制劑等。另外，該套組中可包含以特定濃度含有WT1 RNA及/或GAPDH RNA之標準液、以及視需要之用以稀釋該標準液之緩衝液。

本發明之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組可進而包含用以裝入反應液之容器(反應容器)或用以維持或保存受試試樣之容器(例如用以採集並保存末梢血或骨髓液之容器)。若預先準備分注有反應液之1次所需量之反應容器，則能夠僅添加欲測定之受試試樣而開始反應，故而能夠簡便地進行人類WT1 mRNA量之定量。尤其於對大量受試試樣定量人類WT1 mRNA量之情形時有用。另外，套組可任意地包含用以使受試試樣之製備變得容易之其他成分。另外，亦可包含移液管、注射器、及鑷子等、以及其他用以輔助採集受試試樣之一種以上之器具。

本發明之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組可單獨進行包裝，或者可視需要與關於該套組之說明書一同包裝而商業流通。該說明書可為紙質、或可被電腦讀取之媒體(磁碟、CD、DVD等)。作為該說明書之記載，並無限制，可列舉選自由本發明之即時PCR用套組之套組構成、使用目的、測定原理、操作方法(用法、用量)、測定結果之判定方法、及臨床意義所組成之群之至少一個事項。

本發明之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組包含能夠藉由定量即時RT-PCR而測定從末梢血(白血球)或骨髓液(有核細胞)所提取之RNA中之WT1 mRNA的套組，作為該套組之使用目的或臨床意義，可列舉能夠用於以ALL患者或疑似罹患ALL之患者為對象進行ALL之血液學病期(緩解期、非緩解期【未治療期、緩解後復發期、治療不應期】)之輔助判定(ALL患者之診斷輔助)。另外，該即時PCR用套組能夠用於對ALL患者進行ALL發展或復發之監測、或者對正接受治療之ALL患者進行治療效果之監測。另外，該ALL診斷用套組能夠用於對疑似兒童ALL患者進有無罹患兒童ALL之輔助判定(兒童ALL之罹患診斷之輔助)。

本發明之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組並不特別限定使用年齡，可用於大人亦可用於兒童。

(IV)電腦程式製品

本發明亦包括用以使電腦實施兒童ALL之血液學病期之判定的電腦程式製品。電腦程式製品可例示能夠經由網際網路等而下載之電腦程式、或記錄有該程式之媒體(磁碟、CD、DVD等)。

例如可例示用以使電腦執行以下步驟之電腦程式。

(I)接受受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量、及上述該生物樣本中之GAPDH mRNA量之輸入的步驟；及(II)基於上述(I)之步驟中接受輸入之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助兒童ALL之血液學病期之判定所需之指標值的步驟。再者，上述(I)之步驟可為同時接受WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之輸入者，亦可為分別接受輸入者。

另外，上述程式亦可為用以使電腦除上述(I)及(II)以外進而執行下述(III)之步驟的程式：(III)基於上述(II)之步驟中所獲得之指標值，對受試者決定兒童ALL之血液學病期的步驟。

【兒童ALL之血液學病期之輔助判定裝置】

以下，參照圖式對較佳地用於執行該電腦程式之裝置(電腦裝置)之一形態進行說明。但本發明並不限定於該實施形態。圖1係表示用於受試者之血液學病期之輔助判定之裝置(以下，亦簡稱為「輔助判定裝置」)之一例的概略圖。圖1所示之輔助判定裝置1包括測定裝置2、及與該測定裝置2連接之電腦系統3。於該實施形態中，測定裝置2係測定受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量及/或GAPDH mRNA量之裝置。該測定裝置2獲取受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量及/或GAPDH mRNA量本身、或者由藉由RT-PCR法等進行擴增之各基因擴增物產生之螢光或發光強度等與WT1 mRNA量及/或GAPDH RNA量有關之資訊。具體而言，若將從受試者採集之生物樣本放置於測定裝置2，則測定裝置2獲取與該生物樣本中之WT1 mRNA量及/或GAPDH RNA量相關之資訊，並將所獲得之資訊發送至電腦系統3。但於本發明之輔助判定裝置中，上述測定裝置2為任意，本發明之輔助判定裝置亦可為由電腦系統3構成者。

電腦系統3包括電腦本體3a、包含鍵盤或滑鼠之輸入部3b、及顯示受試者或受試試樣等資訊或判定結果等之顯示部3c。電腦系統3接受與受試試樣中之WT1 mRNA量及/或GAPDH mRNA量相關之資訊之輸入。然後，電腦系統3執行基於該等資訊而判定受試者之兒童ALL之血液學病期之程式。

圖2係以功能方塊表示輔助判定裝置1之電腦本體3a之軟體的方塊圖。如圖2所示，電腦本體3a具備接收部301、記憶部302、算出部303、判定部304、及輸出部305。

接收部301可經由輸入部3b而接收實施兒童ALL之血液學病期判定所需之資訊、具體而言受試者或受試試樣等資訊、或與受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量及/或GAPDH mRNA量等有關之資訊。另外，接收部301可經由網路而以能夠進行通訊之方式與作為任意裝置之上述測定裝置2連接，可接收從測定裝置2發送之資訊(例如受試者或受試試樣等資訊、或與受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量及/或GAPDH mRNA量等有關之資訊等)。

記憶部302係記憶判定所需之基準值(標準化所需之資訊【例如健康成人之每1μgRNA之平均GAPDH mRNA測定值】或臨界值等)及用以算出WT1基因之表現量之式或處理程式等用以使電腦系統執行本發明之電腦程式。算出部303係使用接收部301中取得之資訊，根據所記憶之式而算出WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA 量)或指標值(WT1 mRNA表現量)等。判定部304係判定利用接收部301取得或利用算出部303算出之指標值(WT1 mRNA表現量)為記憶於記憶部302之基準值(臨界值)以上或未達。輸出部305將由判定部304得出之判定結果輸出至顯示部3c作為受試者之兒童ALL之血液學病期之判定結果。再者，顯示部3c並無限制，可為包含布朗管(CRT)、液晶顯示器(LCD)、電漿顯示器(PDP)、有機EL顯示器(OLED)者。

圖3係表示圖2所示之電腦本體3a之硬體構成的方塊圖。如圖3所示，電腦本體3a具備：CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)30、ROM(Read Only Memory，唯讀記憶體)31、RAM32、輔助記憶部33、輸入輸出介面34、媒體介面35、通訊介面36、及圖像輸出介面37。CPU30、ROM31、RAM(Random Access Memory，隨機存儲記憶體)32、輔助記憶部33、輸入輸出介面34、媒體介面35、通訊介面36及圖像輸出介面37係以能夠進行資料通訊之方式被匯流排38所連接。

CPU30能夠執行記憶於ROM31中之電腦程式及加載於RAM32中之電腦程式。藉由使CPU30執行電腦程式，對所取得之資料進行處理，而執行圖2所示之各功能。藉此，電腦系統3作為用以對受試者判定兒童ALL之血液學病期之裝置而發揮功能。

ROM31係由光罩式ROM、PROM(Programmable Read Only Memory，可程式化唯讀記憶體)、EPROM(Erasable Programmable Read Only Memory，可抹除可程式化唯讀記憶體)、EEPROM(Electrically Erasable Programmable Read Only Memory，電子可抹除可程式化唯讀記憶體)等所構成。ROM31中記錄有如上所述利用CPU30所執行之電腦程式及用於其之資料。

RAM32係由SRAM(Static Random Access Memory，靜態隨機存取記憶體)或DRAM(Dynamic Random Access Memory，動態隨機存取記憶體)等所構成。RAM32係用於讀取記錄於ROM31及輔助記憶部33之電腦程式。另外，RAM32於執行該等電腦程式時，用作CPU30之作業區域。

輔助記憶部33係由硬碟、快閃記憶體等半導體記憶體元件、光碟等所構成。輔助記憶部33記憶有用以使CPU30執行之操作系統或應用程式等電腦程式、及用於該電腦程式之執行之各種設定資料。

媒體介面35能夠讀取記錄於記錄媒體40之電腦程式、資料、應用程式。所讀取之應用程式等係記憶於RAM32或輔助記憶部33。另外，媒體介面35將CPU30所生成之資訊寫入至記錄媒體40。媒體介面35將CPU30所生成並記憶於輔助記憶部33之資訊寫入至記錄媒體40。

記錄媒體40由軟碟、CD-ROM、或DVD-ROM等可攜型記錄媒體所構成。記錄媒體40係利用軟碟驅動器、CD-ROM驅動器、或DVD-ROM驅動器等讀取裝置而與上述媒體介面35連接。記錄媒體40中亦可儲存有用以使電腦執行操作之應用程式等。

輸入輸出介面34例如由USB(universal serial bus，通用串列匯流排)、IEEE1394、RS-232C等串列界面、SCSI(Small Computer System Interface，小型電腦系統界面)、IDE(Integrated Development Environment，整合發展環境)、IEEE1284等並行界面、及包含D/A(digital/analog，數位/類比)轉換器、A/D轉換器等之類比界面所構成。於輸入輸出介面34連接有觸控面板、手寫板、鍵盤、滑鼠、麥克風等輸入部3b。操作者能夠藉由該輸入部3b向電腦本體3a輸入各種指令。另外，輸入輸出介面34連接於顯示器或印表機等輸出部305，將CPU30所生成之資訊、或CPU30所生成且記憶於輔助記憶部33之資訊輸出至輸出部305。

通訊介面36例如由USB、IEEE1394、RS-232C等串列界面、SCSI、IDE、IEEE1284等並行界面、包含D/A轉換器、A/D轉換器等之類比界面、網路界面控制器等所構成。通訊介面36於CPU30之控制下接收來自測定裝置2或其他外部機器之資料，視需要將資料處理部所保存或生成之資訊發送至或顯示於測定裝置2或外部。通訊介面36亦可經由網路而與測定裝置2或其他外部機器進行通訊。電腦本體3a亦可藉由通訊介面36而向印表機等發送印刷資料。

圖像輸出介面37連接於上述顯示部3c。藉此，顯示部3c能夠輸出與由CPU30提供之圖像資料對應之影像訊號。顯示部3c根據所輸入之影像訊號而顯示圖像(畫面)。

【用以判定兒童ALL之血液學病期的輔助判定裝置之動作】

使用圖4所記載之流程圖，對利用輔助判定裝置1所進行之受試者之兒童ALL之血液學病期判定之順序加以說明。此處，根據使用源自受試者之生物樣本所獲得之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量，算出指標值(WT1 mRNA表現量)，進行所獲得之指標值是否為基準值(臨界值)以上之判斷，列舉此情形為例進行說明。但是，本發明並不僅限定於該實施形態。

於步驟S1-1中，輔助判定裝置1之接收部301由測定裝置2取得受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量。另外，該步驟S1-1亦可藉由從輔助判定裝置1之輸入部3b接受受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之輸入，而取得WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量。再者，可同時接受WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量向接收部301 之輸入，另外，亦可分別接受。

其次，於步驟S1-2中，算出部303根據上述步驟1-1中所取得之資訊(WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量)而算出WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)，並視需要發送至記憶部302。然後，於步驟S1-3中，算出部303基於上述步驟S1-2中所算出之WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量、以及記憶於記憶部302中之健康成人之每1μg RNA之平均GAPDH mRNA測定值，算出輔助判定所需之指標值。

其後，於步驟S1-4中，判定部304從記憶於記憶部302中之各種臨界值(用以判別緩解期與未治療期的臨界值、用以判別緩解期與治療後復發期的臨界值、用以判別緩解期與治療不應期的臨界值)中，根據目的而讀取所需之(設為對象之)臨界值，將該等與步驟S1-3中所取得之生物樣本之指標值進行對比，算出該指標值為上述臨界值以上亦或未達上述臨界值。

於步驟S1-5~S1-6中，基於上述步驟S1-4中之算出結果，針對受試者血液學病期判別緩解期(未罹患)與非緩解期(未治療期、治療後復發期、治療不應期、罹患)。具體而言，於受試者為兒童ALL患者之情形時，將該患者之生物樣本之指標值與用以判別緩解期與未治療期之臨界值進行對比，於該指標值為上述臨界值以上之情形時，判定為未治療期，於未達臨界值之情形時，判定為緩解期。另外，於受試者為兒童ALL患者之情形時，將該患者之生物樣本之指標值與用以判別緩解期與治療後復發期之臨界值進行對比，於該指標值為上述臨界值以上之情形時，判定為治療後復發期，於未達臨界值之情形時，判定為緩解期。進而，於受試者為兒童ALL患者之情形時，將該患者之生物樣本之指標值與用以判別緩解期與治療不應期之臨界值進行對比，於該指標值為上述臨界值以上之情形時，判定為治療不應期，於未達臨界值之情形時，判定為緩解期。另外，於受試者為疑似兒童ALL患者之情形時，將該患者之生物樣本之指標值與用以判別緩解期與未治療期之臨界值進行對比，於該指標值為上述臨界值以上之情形時，判定該疑似兒童ALL患者罹患兒童ALL，於未達臨界值之情形時，判定未罹患兒童ALL。

於步驟S1-7中，輸出部305將受試者之兒童ALL之血液學病期之判定結果輸出並顯示於顯示部3c。藉此，輔助判定裝置1於受試者為兒童ALL患者之情形時，能夠判別該兒童ALL之血液學病期為緩解期或為非緩解期(未治療期、治療後復發期、治療不應期)，另外，於受試者為疑似兒童ALL患者之情形時，能夠判別是否罹患該兒童ALL(罹患或未罹患)，並可將其結果作為兒童ALL之血液學病期之輔助判定資訊提供給醫師等。

(IV)電腦系統

於本發明中亦包括適於實施受試者之兒童ALL之血液學病期判定之電腦系統。該系統具備包含處理器與記憶體(記憶部302)之電腦，於上述記憶體中記錄有用以使電腦系統執行以下步驟之電腦程式。

(I)接受受試者之生物樣本中之WT1 mRNA量、及上述該生物樣本中之GAPDH mRNA量之輸入的步驟；及(II)基於上述(I)之步驟中接受輸入之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助兒童ALL之血液學病期之判定所需之指標值的步驟。再者，上述(I)之步驟可同時接受WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之輸入，亦可分別接受。

另外，上述電腦程式中亦可進而記錄有用以執行下述(III)之步驟之程式：(III)基於上述(II)之步驟中所獲得之指標值，對受試者決定兒童ALL之血液學病期的步驟。

根據本實施形態，能夠基於上述(II)或(III)之步驟中所獲得之結果，對受試者判定兒童ALL之血液學病期。例如，於提供生物樣本之受試者為兒童ALL患者之情形時，能夠提供該受試者之兒童ALL之血液學病期為緩解期或未治療期之鑑別、為緩解期或治療後復發期之鑑別、為緩解期或治療不應期之鑑別之判定結果。另外，於提供生物樣本之受試者為疑似兒童ALL患者之情形時，能夠提供該受試者罹患或未罹患兒童ALL之判定結果。藉由將該等判定結果提供給醫師等，能夠輔助醫師等對兒童ALL之血液學病期之診斷。

【實施例】

以下，列舉實施例更詳細地說明本發明。但本發明並不特別限定於該實施例。

實施例1

使用作為威爾姆氏腫瘤-1基因(WT1)mRNA套組之「WT1 mRNA測定套組II『Otsuka』」(大塚製藥股份有限公司製造)，以兒童ALL患者及懷疑罹患ALL之兒童為對象，測定從末梢白血球及骨髓液有核細胞提取之RNA中之WT1 mRNA量。該套組係由RT-PCR用混合液、金屬離子溶液(乙酸錳等)、WT1及GAPDH混合溶液RNA標準液(WT1 RNA、GAPDH RNA等)、及標準液稀釋液(緩衝劑等)等所構成。另外，RT-PCR用混合液中包含表5所示之WT1前置引子、WT1反置引子、WT1探針、GAPDH前置引子、GAPDH反置引子、及GAPDH探針。WT1探針之5'末端經HEX(6-六氯螢光素)標記，GAPDH探針之5'末端經FAM(6-羧基螢光素)標記。另外，各探針之3'末端經作為淬滅色素之ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH公司)標記。

再者，RNA之提取方法、所提取之RNA中之WT1 mRNA之量之測定及其算出方法係根據「WT1 mRNA測定套組II『Otsuka』」(大塚製藥股份有限公司製造)之說明書(隨附文件)之記載而進行。

(1)試驗對象者

以2014年12月至2015年12月末在全國14個醫療機構實施初發未治療兒童ALL患者及疑似兒童ALL之兒童患者中取得了對本試驗之同意之合計49例為對象。其中，對象病例中之1例於誘導緩解療法結束前轉院至他院，因而未能採集誘導緩解療法結束後及早期強化療法結束後之2個時點之檢體。再者，疑似ALL之患者(疑似ALL患者)於日後被認定為係ALL以外之疾病時，於治療開始前之1個時點結束試驗。

(2)試驗方法(跟蹤試驗：6個月)

以治療開始後4~6個月作為觀察期間，於下述時點採集骨髓液1mL及末梢血7mL，測定該等受試試樣中之WT1 mRNA(參照圖5)

(a)治療開始前(TP 0)

(b)誘導緩解療法結束後(TP 1)

(c)早期強化療法結束後(TP 2)

(d)早期強化療法結束以後之骨髓檢查時(僅限基於診療目的而進行骨髓檢查之情形)

將解析對象病例49例中之作為解析對象之檢體之詳細內容示於下述表7。

(3)試驗結果

(3-1)跟蹤觀察時之WT1 mRNA表現量(指標值)之變遷

對作為對象之49例中之除試驗中途轉院之1例以外之48例，於治療開始後4~6個月內每1個月進行跟蹤觀察。其結果為，於所有48例之病例中，在治療開始前(TP0)以外之跟蹤觀察時點，血液學病期均為緩解期。

將所有48個病例之跟蹤觀察期間中之末梢血及骨髓液之WT1 mRNA表現量之變遷示於圖6。

再者，末梢血及骨髓液之WT1 mRNA表現量係如下式所示算出：將WT1 mRNA測定值(WT1 mRNA量)除以GAPDH mRNA測定值(GAPDHmRNA量)，將所得之值(相對於GAPDH mRNA每1個拷貝之WT1 mRNA拷貝數)乘以健康成人之每1μgRNA之平均GAPDH mRNA拷貝數(GAPDH mRNA量=GAPDH mRNA測定值)。再者，WT1 mRNA之測定係委託BML股份有限公司進行。

【數1】WT1 mRNA表現量=(WT1 mRNA測定值/GAPDH mRNA測定值)×2.7x10⁷(copies/μg RNA)2.7x10⁷copies/μg RNA：健康成人之每1μgRNA之平均GAPDH mRNA測定值

根據至此為止所實施之成人ALL臨床性能試驗，緩解時之WT1 mRNA表現量於末梢血及骨髓液中均未達50copies/μgRNA(臨界值：50copies/μgRNA)，於兒童ALL患者之情形時，如圖2所示，儘管為緩解期，但WT1 mRNA表現量亦多數情況下於末梢血及骨髓液中均不會未達50copies/μgRNA(特別是骨髓液之WT1 mRNA表現量)，可知必須設定與成年ALL患者之臨界值不同之至少大於50copies/μgRNA之值之新臨界值。

其次，基於末梢血WT1 mRNA表現量之變動模式，將48個病例如表8所示分類為A、B、C、D及E之5組。

另外，將上述A、B、C、D及E之5組之末梢血WT1 mRNA表現量及骨髓液WT1 mRNA表現量之變遷示於圖7之A、B、C、D及E。

於5組中之A、B及C之3組中，治療開始前為50copies/μgRNA以上之末梢血WT1 mRNA表現量於跟蹤觀察之某一時點降低至未達50copies/μgRNA。由於該3組之合計病例數為34例，因此表示總體之70.9%(34/48)之病例中，伴有緩解，於治療開始前為50copies/μgRNA以上之末梢血WT1 mRNA表現量降低至未達50copies/μgRNA。

(3-2)血液學病期(未治療期及緩解期)中之WT1 mRNA表現量

將兒童ALL患者49例之作為解析對象檢體之末梢血檢體149個檢體及骨髓液檢體142個檢體分別分為未治療期及緩解期之2組，將WT1 mRNA表現量加以比較。將結果示於圖8及表9。

如圖8及表9所示，於兒童ALL患者中，末梢血及骨髓液之WT1 mRNA表現量均於緩解期顯示與未治療期相比有意義之低值(學生t檢定(Student's t-test)，p<0.01)。然而，由於兩組之WT1 mRNA表現量之分佈有重疊，故而藉由以兩組為對象之ROC(Receiver operationg character)解析對成為判定緩解之標準的WT1 mRNA表現量之臨界值進行研究。

ROC曲線之製作係依據慣例進行，將特異度、敏感度均最良好之值設為臨界值。將ROC解析之結果示於圖9。如圖9所示，關於ROC解析之結果，對於末梢血，求出緩解判定之臨界值為220copies/μgRNA之值，對於骨髓液，求出緩解判定之臨界值為1,820copies/μgRNA之值。關於末梢血，將WT1 mRNA表現量220copies/μgRNA設為臨界值時，敏感度為68.8%(33/48)，特異度為98.0%(99/101)。即，表示緩解期之末梢血檢體中之98.0%之檢體未達220copies/μgRNA。同樣地，關於骨髓液，於將WT1 mRNA表現量1,820copies/μgRNA設為臨界值時，敏感度為58.1%(25/43)，特異度為98.0%(97/99)。即，表示緩解期之骨髓液檢體中之98.0%之檢體未達1,820copies/μgRNA。

至此為止實施之成人ALL臨床性能試驗試驗中，成人於緩解時之WT1 mRNA表現量未達50copies/μgRNA，但根據上述實驗結果，於兒童之情形時，即便未至未達50copies/μgRNA之程度，亦能夠判定為緩解。

根據以上，關於對兒童ALL患者可判定為緩解之WT1 mRNA表現量，末梢血為未達220copies/μgRNA，骨髓液為未達1,820copies/μgRNA，於滿足至少任一者之情形時，可判斷進入緩解期。

<110> 大塚製藥股份有限公司

<120> 兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之輔助判定方法

<130> P17-071TW

<150> JP 2016-141793

<151> 2016-07-19

<160> 12

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 3037

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (A1)前置引子

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (A2)反置引子

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (A3)探針

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (B1)前置引子

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (B2)反置引子

<400> 6

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (B3)探針

<400> 7

<210> 8

<211> 1310

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (a1)前置引子

<400> 9

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (a2)反置引子

<400> 10

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (a3)探針

<400> 11

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (b2)反置引子

<400> 12

Claims

一種輔助兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之判定的方法，其包括(1)~(3)之步驟：(1)獲取受試者之生物樣本中之威爾姆氏腫瘤-1基因(WT1)之mRNA量的步驟；(2)獲取上述該生物樣本中之甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)之mRNA量的步驟；及(3)基於上述(1)及(2)之步驟中分別獲取之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出上述輔助判定所需之指標值的步驟。
如申請專利範圍第1項之方法，其中上述(1)之步驟係使用RT-PCR法測定WT1 mRNA量、或接受使用RT-PCR法所測得之WT1 mRNA量之提供的步驟。
如申請專利範圍第1或2項之方法，其中上述(2)之步驟係使用RT-PCR法測定GAPDH mRNA量、或接受使用RT-PCR法所測得之GAPDH mRNA量之提供的步驟。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中上述(3)之步驟中所獲得之指標值係將(1)及(2)之步驟中分別獲取之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)進行標準化而獲得之值。
如申請專利範圍第4項之方法，其中上述標準化係藉由將WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)乘以健康成人1μgRNA中所含之GAPDH mRNA量之平均值2.7×10⁷copies/μgRNA而進行。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其進而具有下述步驟： (4)將上述(3)之步驟中所獲得之指標值與預先設定之臨界值進行對比，並基於其大小而表示受試者之血液學病期的步驟。
如申請專利範圍第6項之方法，其中上述臨界值高於上述指標值之檢測下限值。
如申請專利範圍第6或7項之方法，其中兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之判定係判別非緩解期與緩解期，並且上述臨界值係分別將處於非緩解期之兒童ALL患者(非緩解期組)與處於緩解期之兒童ALL患者(緩解期組)之兩組作為對象並藉由統計學解析而求出之值。
如申請專利範圍第8項之方法，其中關於上述臨界值，生物樣本中之末梢血為220copies/μgRNA，骨髓液為1,820copies/μgRNA。
如申請專利範圍第2至9項中任一項之方法，其中上述RT-PCR法為2步驟RT-PCR法、或1步驟RT-PCR法。
如申請專利範圍第2至9項中任一項之方法，其中上述RT-PCR法為1步驟RT-PCR法。
如申請專利範圍第11項之方法，其中上述(1)及(2)之步驟中之1步驟RT-PCR法係於受試者之生物樣本中同時且於同一容器內連續進行WT1 mRNA及GAPDH mRNA之逆轉錄反應及延伸反應的方法。
如申請專利範圍第11或12項之方法，其中於上述(1)之步驟之1步驟RT-PCR法中，WT1 mRNA量之測定係使用：(a)包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組，或 (b)包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。
如申請專利範圍第11或12項之方法，其中於上述(1)之步驟之1步驟RT-PCR法中，WT1 mRNA量之測定係使用：(a')包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號4所示之鹼基序列之探針，或(b')包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號7所示之鹼基序列之探針。
如申請專利範圍第11至14項中任一項之方法，其中於上述(2)之步驟之1步驟RT-PCR法中，GAPDH mRNA量之測定係使用：(c)包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。
如申請專利範圍第11至14項中任一項之方法，其中於上述(2)之步驟之1步驟RT-PCR法中，GAPDH mRNA量之測定係使用：(c')包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號11所示之鹼基序列之探針。
一種用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其包含：(a)包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組，或(b)包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。
一種用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其包含：(a')包括包含序列編號2所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號3所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號4所示之鹼基序列之探針，或(b')包括包含序列編號5所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號6所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號7所示之鹼基序列之探針。
如申請專利範圍第17或18項之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其進而包含：(c)包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組。
如申請專利範圍第17或18項之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其進而包含：(c')包括包含序列編號9所示之鹼基序列之前置PCR引子與包含序列編號10或12所示之鹼基序列之反置PCR引子的引子組、及經標記之包含序列編號11所示之鹼基序列之探針。
如申請專利範圍第17至20項中任一項之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1 mRNA量的即時PCR用套組，其中上述即時PCR用套組為兒童用。
一種商業套裝，其包含如申請專利範圍第17至21項中任一項之用以測定急性淋巴性白血病之受試者之WT1mRNA量的即時PCR用套組及關於該套組之說明書，並且該說明書及/或商業套裝上記載有下述至少任一條記載或其內容：(i)該套組可用於輔助急性淋巴性白血病之血液學病期之判定，及(ii)用於急性淋巴性白血病之血液學病期之輔助判定的臨界值。
如申請專利範圍第22項之商業套裝，其中上述急性淋巴性白血病為兒童急性淋巴性白血病，並且關於(ii)用於急性淋巴性白血病之血液學病期之輔助判定的臨界值，生物樣本中之末梢血為220copies/μgRNA，骨髓液為1,820copies/μgRNA。
一種經時追蹤兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之方法，其係使用如申請專利範圍第1至14中任一項之輔助急性淋巴性白血病之血液學病期之判定的方法經時追蹤兒童急性淋巴性白血病之血液學病期。
如申請專利範圍第24項之方法，其中上述兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之追蹤係追蹤從非緩解期向緩解期之轉變、及/或從緩解期向非緩解期之轉變。
一種電腦程式，其係利用電腦執行下述(I)及(II)之步驟：(I)接受受試者之生物樣本中之威爾姆氏腫瘤-1基因(WT1)之mRNA量、及上述該生物樣本中之甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)之mRNA量之輸入的步驟；及(II)基於上述(I)之步驟中接受輸入之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之判定所需之指標值的步驟。
如申請專利範圍第26項之電腦程式，其進而具有利用電腦執行下述(III)之步驟之程式：(III)基於上述(II)之步驟中所獲得之指標值，對受試者決定兒童急性淋巴性白血病之血液學病期的步驟。
一種電腦系統，其係用於兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之判定，並且具備包含處理器與記憶體之電腦，上述記憶體中記錄有使上述電腦執行如下步驟之電腦程式：(I)接受受試者之生物樣本中之威爾姆氏腫瘤-1基因(WT1)之mRNA量、及上述該生物樣本中之甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)之mRNA量之輸入的步驟；及(II)基於上述(I)之步驟中接受輸入之WT1 mRNA量與GAPDH mRNA量之比，算出輔助兒童急性淋巴性白血病之血液學病期之判定所需之指標值的步驟。
如申請專利範圍第28項之電腦系統，其中上述記憶體中所記錄之電腦程式係使電腦進而執行如下步驟：(III)基於上述(II)之步驟中所獲得之指標值，對受試者決定兒童急性淋巴性白血病之血液學病期的步驟。