CN109477148A - 儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的辅助判定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用以辅助儿童急性淋巴性白血病(儿童ALL)的血液学病期的判定的方法、及可用于该方法的体外诊断用医药品。本发明是一种辅助儿童ALL的血液学病期的判定的方法，其包括如下步骤：(1)获取受试者的末梢血及骨髓液的至少任一生物样品中的威尔姆氏肿瘤‑1基因(WT1)的mRNA量的步骤；(2)获取上述同一样品中的GAPDH mRNA量的步骤；及(3)基于上述(1)及(2)的步骤中分别获取的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助判定所需的指标值的步骤。

Description

儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的辅助判定方法

技术领域

本发明是关于一种用以辅助儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的判定的方法。具体而言，关于一种用于对患有或疑似患有急性淋巴性白血病的儿童受试者判别该受试者为急性淋巴性白血病的非缓解期亦或缓解期的方法。另外，本发明是关于一种体外诊断用医药品，其有效地用于实施上述急性淋巴性白血病的血液学病期的辅助判定、尤其是从非缓解期转变成缓解期的辅助判定、以及从缓解期转变成非缓解期的辅助判定，或监测急性淋巴性白血病的血液学病期。

背景技术

以人类末梢血或骨髓液作为受试标本而测量WT1 mRNA(Wilms'tumor gene 1messenger ribonucleic acid，威尔姆氏肿瘤-1基因信使核糖核酸)量的试剂盒(WT1 mRNA测量试剂盒)已被批准用作急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，以下亦称为「AML」)患者的微小残留病变(minimal residual disease，以下亦称为「MRD」)的监测标记物、或骨髓增生异常症候群(myelodysplastic syndrome，以下亦称为「MDS」)患者的诊断辅助及进展度监测标记物，其作为体外诊断用医药品而被纳入承保范围内(参照非专利文献1、专利文献1等)。

另外，报告有WT1 mRNA亦在急性淋巴性白血病(acute lymphoblastic leukemia，以下亦称为「ALL」)中表达(参照非专利文献2～8)。此处，ALL为以幼淋巴球是细胞的肿瘤性病变与骨髓浸润为特征的造血器官肿瘤。在WHO(World Health Organization，世界卫生组织)分类第4版中，重视胚细胞的起源而将血液是肿瘤大致分为骨髓是肿瘤与淋巴是肿瘤两种，淋巴是肿瘤进而分为B细胞性与T细胞性。将ALL定位为其中的未成熟的淋巴是肿瘤，如表1所示分类成3组(参照非专利文献9)。

[表1]

表1根据WHO分类第4版的ALL病型

根据非专利文献2～8的各自试验成绩，认为与AML同样地，ALL的成人患者的骨髓液或末梢血中的WT1 mRNA是对于成年ALL患者的MRD有用的监测标记物。

作为ALL患者的MRD的评价、测量法，可列举：嵌合体基因定量、使用免疫受体(Immunoglobulin/T cell receptor，Ig/TCR，免疫球蛋白/T细胞受体)基因重排的MRD解析、及借由流式细胞术(flow cytometry，以下亦称为「FCM」)的MRD解析等。然而，嵌合体基因即便在表达频度最高的次要BCR/ABL中，其表达频度亦较低，成人ALL为25％，儿童ALL为3％左右，即便与其他嵌合体基因一起，能将嵌合体基因用作MRD监测标记物的病例亦有限。另外，使用Ig/TCR基因重排的MRD解析法及借由FCM的MRD解析法是成本较高且要求专业技术与经验的测量法，因而尚停留在于一部分治疗(研究)机构实施。

另一方面，近年来，业界认识到治疗开始后的MRD量的重要性。例如根据非专利文献10，报告有WT1 mRNA在多种白血病中高度表达，在成人白血病中显示该WT1 mRNA定量对预后预测因素及MRD的监测有用。然而，关于WT1 mRNA定量对儿童白血病的预后预测因素及MRD的监测的有用性尚未得出结论。另外，根据非专利文献11，指出上述WT1 mRNA作为成年AML患者的MRD的监测标记物而言充分，但作为儿童ALL患者的MRD监测标记物而言不充分。其原因尚未明确，认为由于成年ALL患者与儿童ALL患者有使频度不同的各种基因异常、或两者的预后亦有差异等(非专利文献12～13)，故而成人的ALL与儿童的ALL为不同的疾病。另外，认为原因亦在于：对于儿童ALL患者而言，由于为了提高中性粒细胞功能而给予G-CSF(颗粒性白血球群落刺激因子，granulocyte-colony stimulation factor)或末梢血中出现幼细胞等，故而大量存在表达WT1的非肿瘤性细胞(非专利文献10)。

因此，现状为对于儿童ALL的诊断，寻求与成人ALL的诊断不同的指标和/或基准。

背景技术文献

非专利文献

[非专利文献1]威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)mRNA试剂盒「WT1 mRNA测量试剂盒II『Otsuka』」随附文件(大冢制药股份有限公司)(2015年7月修订(第3版))

[非专利文献2]Chiusa L,di Celle PF,Campisi P,Ceretto C,Marmont F,PichA.Prognostic value of quantitative analysis of WT1 gene transcripts in adultacute lymphoblastic leukemia Haematologica.「WT1基因转录物定量分析在成人急性淋巴细胞白血病血肿中的预后价值」2006；91:270-1。

[非专利文献3]Boublikova L,Kalinova M,Ryan J,Quinn F,O'Marcaigh A,Smith O等人，Wilms'tumor gene 1(WT1)expression in childhood acute lymphoblasticleukemia:a wide range of WT1 expression levels,its impact on prognosis andminimal residual disease monitoring.「威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达：WT1表达水平的广泛范围、其对预后的影响和最低残留疾病监测」Leukemia「白血病」2006；20:254-63。

[非专利文献4]Shabani M,Asgarian-Omran H,Vossough P,Vossough P,SharifianRA,Faranoush M等人，Expression profile of orphan receptor tyrosine kinase(ROR1)and Wilms'tumor gene 1(WT1)in different subsets of B-cell acutelymphoblastic leukemia.「孤儿受体酪氨酸激酶(ROR1)和威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)在B细胞急性淋巴细胞白血病不同亚群中的表达谱」Leuk Lymphoma「白血病和淋巴瘤」2008；49(7):1360-7。

[非专利文献5]Chen JS,Hsiao CC,Sheen JM,Cheng CN.Comparison of minimalresidual disease(MRD)estimated by flow cytometry and by real-timequantitative PCR of Wilms tumor gene 1(WT1)transcript expression in childrenwith acute lymphoblastic leukemia.「通过流式细胞术和通过实时定量PCR检测急性淋巴细胞白血病患儿中威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)转录表达的微小残留病变(MRD)的比较」Leukemia Research「白血病研究」2007；31:1351-7。

[非专利文献6]Busse A,Gokbuget N,Siehl JM,Hoelzer D,Schwartz S,Rietz A等人，Wilms'tumor gene 1(WT1)expression in subtypes of acute lymphoblasticleukemia(ALL)of adults and impact on clinical outcome.「威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)在成人急性淋巴细胞白血病(ALL)亚型中的表达及对临床结果的影响」Ann Hematol「血液学年鉴」2009；88:1199-205。

[非专利文献7]Hu SY,Gu WY,Chen ZX,Wang XL,Cen JN,He HL等人，Thesignificance of detecting WT1expression in childhood acute leukemias.「检测WT1在儿童急性白血病中表达的意义」Pediatric Hematology and Oncology.「儿科血液学和肿瘤学」2010；27:581-91。

[非专利文献8]Xu B,Song X,Yip NC,Xiao P,Zhang Y,Wang W等人，Simultaneousdetection of MDR1and WT1gene expression to predict the prognosis of adultacute lymphoblastic leukemia.「同时检测MDR1和WT1基因表达，预测成人急性淋巴细胞白血病的预后」Hematology.「血液学」2010；15(2):74-80。

[非专利文献9]Borowitz MJ,Chan JKC.Precusor Lymphoid Neoplasms,overview.In:Swerdlow SH,Campo E,Harris NL等人编辑，WHO Classification ofTumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.「WHO对造血和淋巴组织肿瘤的分类」第四版,里昂(Lyon),IARC Press(IARC出版社内)2008；168-78。

[非专利文献10]中尾朋平,Non-malignant elevation of Wilms Tumor gene(WT1)expression is frequently observed in the blood and bone marrow of childhoodacute leukemia in remission and in benign blood diseases.「威尔姆氏肿瘤基因(WT1)表达的非恶性升高常见于儿童急性白血病缓解期和良性血液病的血液和骨髓中」筑波大学博士(医学)学位论文(甲第5112号).2009:638-640。

[非专利文献11]R.Zhang等人，Comparison of minimal residual disease(MRD)monitoring by WT1quantification between childfood acute myeloid leukemia andacute leukemia.「儿童急性髓细胞白血病与急性白血病WT1定量监测微小残留病(MRD)的比较」Euroepean Review for Medical and Pharmacological Sciences「欧洲医学和药理学评论」2015；19:2679-2688。

[非专利文献12]Pui CH,Relling MV,James R,Downing JR.Acute LymphoblasticLeukemia.「急性淋巴细胞白血病」N Engl J Med.「新英格兰医学期刊」2004；350:1535-8.[非专利文献13]薄井纪子,临床血液.2009；50:230-43

专利文献

[专利文献1]国际公开公报WO 2014/115779 A1

发明内容

发明所欲解决的问题

本发明鉴于上述课题，以提供如下辅助方法为目的，该辅助方法是以ALL中的儿童ALL为对象，用以对该儿童ALL患者或疑似患有儿童ALL的患者使用WT1mRNA作为MRD的监测标记物来判定儿童ALL的血液学病期，尤其是判别缓解期与非缓解期。本发明的目的特别在于提供一种作为该方法的用以与先前法相比尽可能简便且容易，而且高精度地进行判断的方法。另外，本发明的目的在于提供一种用以检测ALL的血液学病期、特别是缓解期的体外诊断用医药品，其可有效地用于该方法的实施。

解决问题的技术手段

本发明者等人为了解决上述课题反复进行努力研究，结果发现：借由使用先前认为作为儿童ALL的MRD的监测标记物而言不充分的WT1 mRNA量，并使用基于其与用作修正基因的GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)而算出的指标值，意外地能够明确区分处于缓解期的儿童ALL患者与处于非缓解期的儿童ALL患者，而能够明确区分(诊断)出儿童ALL的血液学病期，尤其是区别缓解期与非缓解期。

本发明是基于该见解进一步反复研究而完成，包括下述实施方面。

(I)辅助儿童ALL的血液学病期的判定的方法

(I-1)一种辅助儿童急性淋巴性白血病(儿童ALL)的血液学病期的判定的方法，其具有下述(1)～(3)的步骤：

(1)获取受试者的生物样品中的威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)的mRNA量的步骤；

(2)获取上述该生物样品中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA量的步骤；及

(3)基于上述(1)及(2)的步骤中分别获取的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出上述辅助判定所需的指标值的步骤。

再者，儿童ALL的血液学病期大致分为非缓解期(包括未治疗期、治疗后复发期、及治疗不应期)与缓解期的两种。上述本发明在将正接受诱导缓解治疗及缓解后疗法的儿童ALL患者作为对象的情形时，可换称为「辅助对儿童ALL患者进行非缓解期与缓解期的鉴别判定的方法」。另外，在将疑似儿童ALL的患者作为对象的情形时，亦可换称为「辅助对疑似儿童ALL的患者进行有无患有儿童ALL、即为儿童ALL的未治疗期(患有)或不为儿童ALL的未治疗期(未患有)的判定的方法」。

(I-2)如(I-1)所记载的方法，其中上述(1)的步骤是使用RT-PCR(reversetranscriptase-polymerase chain reaction，逆转录酶-聚合酶链反应)法测量WT1 mRNA量、或接受使用RT-PCR法所测得的WT1 mRNA量的提供的步骤。

(I-3)如(I-1)或(I-2)所记载的方法，其中上述(2)的步骤是使用RT-PCR法测量GAPDH mRNA量、或接受使用RT-PCR法所测得的GAPDH mRNA量的提供的步骤。

(I-4)如(I-3)所记载的方法，其中上述(1)及(2)的步骤中的1步骤RT-PCR法是在受试者的生物样品中同时且在同一容器内连续进行WT1 mRNA及GAPDH mRNA的逆转录反应及延伸反应的方法。

(I-5)如(I-2)至(I-4)中任一项所记载的方法，其中上述RT-PCR法为2步骤RT-PCR法、或1步骤RT-PCR法。

(I-6)如(I-2)至(I-4)中任一项所记载的方法，其中上述RT-PCR法为1步骤RT-PCR法。

(I-7)如(I-1)至(I-6)中任一项所记载的方法，其中上述(3)的步骤中所获得的指标值是将(1)及(2)的步骤中分别获取的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)进行标准化而获得的值。

(I-8)如(I-7)所记载的方法，其中上述标准化是借由将WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)乘以健康成人1μg RNA中所含的GAPDH mRNA量的平均值而进行。

(I-9)如(I-8)所记载的方法，其中上述健康成人1μg RNA中所含的GAPDH mRNA量的平均值为2.7×10⁷拷贝/μg RNA。

(I-10)如(I-1)至(I-9)中任一项所记载的方法，其进而具有下述步骤：(4)将上述(3)的步骤中所获得的指标值与预先设定的临界值(参考基准值)进行对比，并基于其大小而表示受试者的血液学病期的步骤。

(I-11)如(I-10)所记载的方法，其中上述(4)的步骤是在上述(3)的步骤中所获得的指标值小于预先设定的临界值的情形时表示受试者处于缓解期、或在为上述临界值以上的情形时表示受试者处于非缓解期(未治疗期、治疗后复发期、或治疗不应期)的步骤。

(I-12)如(I-11)所记载的方法，其中上述非缓解期为未治疗期。

(I-13)如(I-10)至(I-12)中任一项所记载的方法，其中上述临界值是基于ROC曲线(Receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线)求出的值，上述ROC曲线是根据基于对儿童ALL患者或疑似儿童ALL患者的生物样品求出的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比所获得的指标值与儿童ALL的血液学病期的关系而制作。

(I-14)如(I-10)至(I-13)中任一项所记载的方法，其中儿童ALL的血液学病期的判定是判别儿童ALL的非缓解期(未治疗期、治疗后复发期、或治疗不应期)与缓解期，并且

上述临界值是分别将处于非缓解期的儿童ALL患者(非缓解期组)与处于缓解期的儿童ALL患者(缓解期组)的两组作为对象并借由统计学解析而求出的值。

(I-15)如(I-14)所记载的方法，其中上述统计学解析为ROC解析、判别分析、或单变量解析。

(I-16)如(I-1)至(I-15)中任一项所记载的方法，其中受试者的生物样品为血液(优选为末梢血)或骨髓液。

(I-17)如(I-10)至(I-16)中任一项所记载的方法，其中上述临界值高于上述指标值的检测极限的最低值(检测下限值)。

(I-18)如(I-10)至(I-17)所记载的方法，其中上述临界值为大于50拷贝/μg RNA的值。

(I-19)如(I-10)至(I-18)中任一项所记载的方法，其中关于上述临界值，生物样品中的末梢血为220拷贝/μg RNA，骨髓液为1,820拷贝/μg RNA。

(I-20)如(I-2)至(I-19)中任一项所记载的方法，其中在上述(1)的步骤的1步骤RT-PCR法中，WT1 mRNA量的测量是使用：(a)包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组，或

(b)包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

(I-21)如(I-2)至(I-19)中任一项所记载的方法，其中在上述(1)的1步骤RT-PCR法中，WT1 mRNA量的测量是使用：

(a')包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号4所示的碱基序列的探针，或

(b')包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号7所示的碱基序列的探针。

(I-22)如(I-3)至(I-21)中任一项所记载的方法，其中在上述(2)的步骤的1步骤RT-PCR法中，GAPDH mRNA量的测量是使用：

(c)包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

(I-23)如(I-3)至(I-21)中任一项所记载的方法，其中在上述(2)的步骤的1步骤RT-PCR法中，GAPDH mRNA量的测量是使用：

(c')包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号11所示的碱基序列的探针。

(I-24)如(I-3)至(I-23)中任一项所记载的方法，其中在上述(1)的步骤的1步骤RT-PCR法中，WT1 mRNA量的测量是使用：(a')包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号4所示的碱基序列的探针，或

(b')包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号7所示的碱基序列的探针；

在上述(2)的步骤的1步骤RT-PCR法中，GAPDH mRNA量的测量是使用：

(c')包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号11所示的碱基序列的探针。

(I-25)如(I-1)至(I-24)中任一项所记载的方法，其中WT1 mRNA量为从末梢血白血球或骨髓液有核细胞提取的RNA中的WT1 mRNA量。

(I-26)如(I-1)至(I-25)中任一项所记载的方法，其中生物样品中的WT1 mRNA量分别为儿童ALL中的微小残留病变的监测标记物。

(I-27)如(I-1)至(I-26)中任一项所记载的方法，其中受试者为儿童ALL患者或疑似患有儿童ALL的儿童。

(I-28)如(I-1)至(I-27)中任一项所记载的方法，其中生物样品为末梢血、优选为末梢血白血球，或骨髓液、优选为骨髓液有核细胞。

(II)用以测量急性淋巴性白血病(ALL)的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂 试剂盒(体外诊断用医药品)

(II-1)一种用以测量ALL的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其包含：

(a)包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组，或

(b)包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

(II-2)一种用以测量ALL的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其包含：(a')包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号4所示的碱基序列的探针，或

(b')包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号7所示的碱基序列的探针。

(II-3)如(II-1)或(II-2)记载的用以测量ALL的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其进而包含：

(c)包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

(II-4)如(II-1)或(II-2)记载的用以测量ALL的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其进而包含：(c')包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号11所示的碱基序列的探针。

(II-5)如(II-1)至(II-4)中任一项所记载的用以测量ALL的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其是儿童用实时PCR用试剂盒。

(II-6)一种商业套装，其包含如(II-1)至(II-5)中任一项所记载的用以测量ALL的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒及关于该试剂盒的说明书，并且该说明书和/或商业套装中记载有下述至少任一条记载或与其相关的记载：

(i)该试剂盒可用于辅助ALL的血液学病期的判定，及

(ii)用于ALL的血液学病期的辅助判定的临界值(参考基准值)。

(II-7)如(II-6)所记载的商业套装，其中上述临界值为大于50拷贝/μg RNA的值。

(II-8)如(II-6)或(II-7)所记载的商业套装，其中上述临界值是基于ROC曲线(Receiver operating characteristic curve)求出的值，上述ROC曲线是根据基于对儿童ALL患者或疑似儿童ALL患者的生物样品求出的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA的比所获得的指标值与儿童ALL的血液学病期的关系而制作。

(II-9)如(II-6)至(II-8)中任一项所记载的商业套装，其中关于儿童ALL患者的上述临界值，末梢血为220拷贝/μg RNA，骨髓液为1,820拷贝/μg RNA。

(III)急性淋巴性白血病(ALL)的血液学病期的经时监测方法(监测方法)

(III-1)一种经时监测儿童ALL的血液学病期的方法(监测方法)，其是使用如(I-1)至(I-28)中任一项所记载的辅助儿童ALL的血液学病期的判定的方法而经时监测儿童ALL的血液学病期。

(III-2)如(III-1)所记载的方法，其中上述儿童ALL的血液学病期的监测是监测从非缓解期(未治疗期、或治疗后复发期、或治疗不应期)向缓解期的转变、和/或从缓解期向非缓解期(未治疗期、治疗后复发期、或治疗不应期)的转变。

(IV)计算机程序

(IV-1)一种计算机程序，其是利用计算机执行下述(I)及(II)的步骤：

(I)接受受试者的生物样品中的WT1 mRNA量、及上述该生物样品中的GAPDH mRNA量的输入的步骤；及

(II)基于上述(I)的步骤中接受输入的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助儿童ALL的血液学病期的判定所需的指标值的步骤。

(IV-2)如(IV-1)记载的计算机程序，其进而具有利用计算机执行下述(III)的步骤的程序：

(III)基于上述(II)的步骤中所获得的指标值，对受试者决定儿童ALL的血液学病期的步骤。

(V)计算机程序系统

(V-1)一种计算机系统，其是用于儿童ALL的血液学病期的判定，并且

该计算机系统具备包含处理器及内存的计算机，

上述内存中记录有使上述计算机执行如下步骤的计算机程序：

(I)接受受试者的生物样品中的WT1 mRNA量、及上述该生物样品中的GAPDH mRNA量的输入的步骤；及

(II)基于上述(I)的步骤中接受输入的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助儿童ALL的血液学病期的判定所需的指标值的步骤。

(V-2)如(V-1)所记载的计算机系统，其中上述内存中所记录的计算机程序是使计算机进而执行下述步骤：

(III)基于上述(II)的步骤中所获得的指标值，对受试者决定儿童ALL的血液学病期的步骤。

发明效果

根据本发明的儿童ALL的血液学病期的辅助判定方法及用以测量ALL的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒(体外诊断用医药品)，能够对儿童ALL患者或疑似患有ALL的儿童患者简便地检测儿童ALL的血液学病期(判别缓解期与非缓解期[未治疗期、治疗后复发期、或治疗不应期]、特别是缓解期与未治疗期)或有无患有儿童ALL。另外，本发明的实时PCR用试剂盒亦能够对成年ALL患者同样地进行检测。另外，借由本发明的方法所获得的结果能够有效地用作基于血像、骨髓像、及染色体异常等其他关联的检查结果或临床症状等来确定判定有无患有ALL以及患有ALL的血液学病期、特别是从未治疗期向缓解期的转变方面的判断材料之一。

尤其关于ALL的确诊，先前以来必须采用使细针刺入胸骨或胯骨而抽吸骨髓液的方法进行骨髓穿刺，与此相对，使用末梢血作为受试标本的本发明的方法由于为对身体及精神施加的负担较少的低侵袭的方法，故而能够有效地用作确诊ALL前的预判方法。

另外，根据本发明的监测方法，能够对儿童ALL患者经时监测ALL的血液学病期。其结果为，能够反映至儿童ALL患者的合适的治疗，实现治疗费用的减轻、儿童ALL患者的身体负担的减轻。

附图说明

图1是表示本发明的儿童ALL的血液学病期的辅助判定方法所使用的辅助判定装置的一例的概略图。

图2是表示辅助判定装置的软件的功能构成的方块图。

图3是表示辅助判定装置的硬件的构成的方块图。

图4是表示辅助判定装置的动作的流程图的一例。

图5表示WT1 mRNA的检查流程。

图6表示48个跟踪观察病例的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量的变迁。各曲线图中，纵轴表示WT1 mRNA表达量(拷贝/μg RNA)的常用对数值，横轴表示治疗开始后的跟踪观察期间(月)(下述的图7亦相同)

图7A表示A组(7例)(表8)的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量的变迁。

图7B表示B组(14例)(表8)的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量的变迁。

图7C表示C组(13例)(表8)的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量的变迁。

图7D表示D组(11例)(表8)的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量的变迁。

图7E表示E组(3例)(表8)的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量的变迁。

图8表示血液学病期中的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量。纵轴表示WT1 mRNA表达量(拷贝/μg RNA)的常用对数值。

图9表示缓解期与未治疗期中的末梢血及骨髓液中的WT1 mRNA表达量的ROC解析结果。纵轴表示敏感度，横轴表示特异度。

具体实施方式

(I)关于儿童ALL

儿童ALL是白血球中的包含B细胞或T细胞等的淋巴球在未成熟阶段恶化，主要在骨髓中异常地增加并迅速地发展的疾病，是一般称为「血癌」的白血病的一种。儿童ALL的症状(贫血症状、倦怠感、眩晕、头晕、心悸、气喘、水肿(浮肿等)、伴有感染的发热、鼻血、牙龈出血或皮下出血、淋巴结肿大、肝脾肿大等)主要是由白血病细胞(癌细胞)在骨髓及末梢血中异常增生而使正常的血液细胞(白血球、红血球、血小板)受到压迫而减少所引起。在确认到如上所述的症状的情形时，虽然疑似患有儿童ALL，但其确诊必须进行缺骨髓穿刺，在借由利用骨髓穿刺而获得的骨髓液标本确认到酯酶染色阴性及过氧化酶染色阴性(阴性的基准是设为未达3％)的淋巴胚细胞为全部有核细胞的25％以上的情形时，判断患有儿童ALL。再者，据信儿童ALL与长期生存率未达30％～40％的成人ALL不同，大致80％以上可借由治疗而痊愈。认为其原因在于，与成人发病例相比，费城染色体的变异或T细胞性的急性淋巴性白血病的频度较少。就该意义而言，将儿童ALL定位为包括治疗方法在内不同在成人ALL的疾病。

基于借由骨髓穿刺所获得的信息(骨髓有核细胞数及其形态、细胞的表面抗原解析(白血病细胞的种类)、染色体检查、基因解析、病理学检查)而选定预想的预后及适当的治疗方法。

儿童ALL的治疗根据病期大致分为诱导缓解疗法与缓解后疗法，缓解后疗法进而包括强化疗法及维持疗法。诱导缓解疗法通常需要1个月左右的治疗期间，若成为缓解状态，则继而移向缓解后疗法，实施进一步减少残留的白血病细胞而维持缓解并且预防复发的治疗。因此，在治疗进行方面极重要的是分辨在哪一阶段是否成为缓解状态、即病期是否转变成缓解期。

再者，儿童ALL的「缓解」的定义为满足下述条件的状态：

(1)未给予G-CSF而中性粒细胞为500/μL以上，

(2)血小板为8万/μL以上，

(3)非输血依赖性，

(4)末梢血中未确认到白血病细胞，

(5)由白血病导致的临床症状及临床表达消失，以及

(6)在骨髓血中胚细胞未达5％，未确认到明确的白血病细胞的形态的状态。

(II)儿童ALL的血液学病期的辅助判定方法

本发明是关于一种辅助儿童ALL的血液学病期的判定的方法。

此处，作为儿童ALL的血液学病期，可列举：处于尚未对儿童ALL进行诱导缓解疗法的状态的「未治疗期(初发期)」、转变成上述缓解状态的「缓解期」、及由缓解状态再次成为白血病细胞增加的状态的「治疗后复发期」、以及治疗未奏效的状态即「治疗不应期」。本发明是关于一种用以对儿童ALL鉴别上述血液学病期中的缓解期与非缓解期(包括未治疗期、治疗后复发期、及治疗不应期)的辅助方法。尤其优选为本发明关于一种对儿童ALL判定自上述血液学病期中的作为非缓解期的未治疗期(初发期)向缓解期的转变的辅助方法。即，本发明是关于一种用于以进行了诱导缓解疗法及缓解后疗法的儿童ALL患者为对象，在确诊前判断该患者是否到达缓解状态的辅助判定方法。

本发明的方法可借由至少进行下述(1)～(3)的步骤而实施。

(1)获取受试者的生物样品中的WT-1的mRNA量的步骤(WT1 mRNA量获取步骤)

(2)获取上述该生物样品中的GAPDH mRNA量的步骤(GAPDH mRNA量获取步骤)、及

(3)基于上述(1)及(2)的步骤中分别获取的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助判定所需的指标值的步骤(指标值算出步骤)。

再者，在本发明中，有时将指标值算出步骤中所获得的「指标值」称为「WT1 mRNA表达量」。

以下，对这些步骤进行描述。

(1)WT1 mRNA量获取步骤

该步骤是获取受试者的生物样品中表达的WT1 mRNA量的步骤。

该WT1 mRNA量的获取方式或获取方法在实施该步骤后，结果成为获取到WT1 mRNA量(信息)的状态即可，只要如此则无特别限制。具体而言，可借由自行将受试者的生物样品作为材料，测量WT1 mRNA量而获取，另外，亦可借由直接或间接地接受第三人所测得的WT1mRNA量的提供而获取。

设为本发明的对象的受试者为患有儿童急性淋巴性白血病(儿童ALL)的儿童ALL患者或疑似患有儿童ALL的儿童(以下，亦称为「疑似儿童ALL患者」)。优选为儿童ALL患者，进而优选为已开始进行针对儿童ALL的诱导缓解疗法的儿童ALL患者。在本发明中，儿童意指1～19岁的男女。

另外，所谓儿童ALL患者，例如是指借由物理化学表达、血液检查、及骨髓穿刺等特定检查方法而确诊患有儿童ALL的儿童患者。

另外，所谓疑似患有儿童ALL的儿童(疑似儿童ALL患者)，是指至今为止无患有儿童ALL的既往史，根据临床表达(血液常规检查、血液生化学检查等)及临床症状等而疑似ALL者。

本发明的方法中作为测量对象的生物样品可列举包含WT1 mRNA的源自儿童(儿童ALL患者、疑似儿童ALL患者)的生物样品，例如可列举：细胞、组织、血液、骨髓液、唾液、痰液、粪便、及尿。优选为血液及骨髓液。另外，作为血液，优选可列举末梢血。更优选可列举末梢血中的末梢血白血球、骨髓液中的骨髓液有核细胞。另外，作为该生物样品，亦可使用从可能含有WT1 mRNA的样品借由利用公知的方法进行处理所获得的总RNA、或者富集mRNA的RNA样品等。RNA样品可使用可商业获取的RNA提取试剂盒进行制备。优选可例示使用市售的RNA提取试剂盒从血液(优选为末梢血)中的白血球成分或骨髓液中的有核细胞所制备者。再者，RNA样品可在水溶液、或者吸附或固定在适当的固相的状态下使用。作为mRNA量，亦可以相对于反应液每100μl为0.01ng～1μg的方式制备。

设为本发明的测量对象的WT1基因是如上所述鉴定为儿童威尔姆氏肿瘤的病原基因的包含3037bp的基因，作为「Homo sapiens Wilms Tumor 1(WT1),transcript variantD,mRNA」登记在NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)中(NM_024426.4)。将其碱基序列示于序列表的序列编号1。

生物样品中的WT1 mRNA量的测量方法只要为能够测量作为WT1基因的转录物的mRNA的量的方法即可，可例示RT-PCR法(2步骤RT-PCR法、1步骤RT-PCR法)、原位RT-PCR法、下一代序列分析仪等业界广为人知的方法。优选为2步骤RT-PCR法或1步骤RT-PCR法。更优选为利用于同一容器内连续进行逆转录反应与PCR反应(延伸及扩增反应)的1步骤RT-PCR法所进行的测量方法。

作为本发明中可使用的1步骤RT-PCR法所使用的反应缓冲液，只要为适于使具有逆转录活性的酶显示活性的水溶性缓冲液即可，例如可列举pH值7～10、优选为pH值8～9的缓冲液，例如Tris(三羟甲基胺基甲烷)缓冲液。进而，该缓冲液中可包含具有逆转录活性的酶或DNA(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)聚合酶的活性所需的各种离子。其中，Na离子或K离子可以盐的形式以5～50mM的浓度添加。另外，Mg离子或Mn离子可以盐的形式以1～10mM的浓度添加。此外，亦可根据需要调配表面活性剂、牛血清白蛋白(BSA)、明胶等促进具有逆转录活性的酶或DNA聚合酶的活性或使其等稳定化的药剂。另外，为了抑制样品中的RNA及RNA竞争物的分解，亦可添加核糖核酸酶抑制剂。

作为具有逆转录活性的酶，可列举源自禽类成髓细胞瘤病毒的逆转录酶(AMV)、源自劳斯相关病毒的逆转录酶(RAV2)、源自莫罗尼鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV)、源自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的DNA聚合酶(Tth)、源自热坚芽孢杆菌(Bacilluscardotenax)的DNA聚合酶(Bca)、以及这些的衍生物，其中，Tth最适合本发明。作为Tth，具体可例示源自栖热菌种(Thermus species)Z05的耐热性酶(Thermostable enzyme)的DNA聚合酶。再者，这些酶可为自其原本的起源加以纯化而获取者、或者借由基因工程学方法生产的重组蛋白质的任一者。

对于反应液，添加cDNA(complementary deoxyribonucleic acid，互补脱氧核糖核酸)合成以及PCR中成为底物的4种脱氧核苷三磷酸(dATP(deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸)；本说明书中亦有将该4种统称为「dNTP」的记载)。另外，dNTP的全部或一部分亦可在能够使由引物合成的DNA链延伸的范围内置换为经修饰和/或标记的dNTP。

在本发明中，作为由标靶RNA合成为cDNA(逆转录反应及延伸反应)所使用的引物，必须为至少具有与标靶RNA的碱基序列互补的碱基序列，且在所采用的反应条件下与标靶RNA进行退火的寡核苷酸。作为寡核苷酸的长度，可例示6～100个核苷酸、优选为10～30个核苷酸的长度。另外，亦可使用经修饰和/或标记的引物。该引物例如可借由公知方法化学地合成。另外，PCR中使用的引物必须能够至少以源自标靶RNA的cDNA为模板进行DNA扩增。因此，必须为至少具有与模板cDNA的碱基序列互补的碱基序列，且在采用的反应条件下与该cDNA进行退火的寡核苷酸。优选为在由上述标靶RNA合成cDNA(逆转录反应及延伸反应)时作为引物而发挥功能，并且对以cDNA为模板的DNA亦作为引物而发挥功能的寡核苷酸。

关于可优选地用于将作为本发明的目标基因的人类WT1 mRNA逆转录为cDNA并加以延伸、扩增的引物组，可列举包含下述表2所记载的(A1)正向引物及(A2)反向引物的引物组A、以及包含表3所记载的(B1)正向引物及(B2)反向引物的引物组B。再者，表2及3中亦一并表示用于检测利用这些引物组进行扩增的人类WT1基因扩增物的序列特异性结合探针((A3)探针、(B3)探针)。再者，对于该探针，优选为进行标记，以使扩增物的检测变得容易。

[表2]

WT1 mRNA扩增用引物组A及探针

*：意指人类WT1基因(NM_024426.4：序列编号1)的区域。

[表3]

WT1 mRNA扩增用引物组B及探针

*：意指人类WT1基因(NM_024426.4：序列编号1)的区域。

探针的表示法有RI(radioactive isotope，放射性同位素)法与非RI法，优选为使用非RI法。非RI法可列举荧光表示法、生物素表示法、化学发光法等，优选为使用荧光表示法。作为荧光物质，只要为能够与核酸的碱基部分结合者，则无特别限定，例如可使用花青素色素(Cy DyeTM系列的Cy3或Cy5等)、玫瑰红6G试剂、FAM(6-羧基荧光素)、及HEX(6-六氯荧光素)等。另外，探针亦可经淬灭色素标记。再者，作为淬灭色素，只要为具有作为淬灭色素的功能且与上述同样地能够与核酸的碱基部分结合者，则无特别限定，例如可列举ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH公司)。

本发明中使用的RNA标准品(标靶RNA)可借由公知的方法而制作。例如可参照「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)「美国国家科学院院刊」，第87卷，第2725～2729页(1990)」、「Clinical Chemistry(Clin.Chem.)「临床化学」，第41卷，第819～825页(1995)」、「Blood「血液」，第82卷，第1929～1936页(1993)」等的记载而制作。

具体而言，如下所述。对扩增对象的双链DNA序列附加成为RNA合成酶、例如T7RNA聚合酶等的反应基点的启动子序列，制作成为RNA合成的模板的DNA序列。在反应容器内添加RNA聚合酶与包含RNA启动子序列的双链DNA、及核苷三磷酸，在37℃下反应30分钟～2小时，借此合成与RNA启动子下游的模板DNA互补的单链RNA(标靶RNA)。

作为本发明中可使用的1步骤RT-PCR法的反应操作及反应条件，并无限制，可例示下述。

在反应容器内添加例如包含cNTP、Mg盐或Mn盐等金属离子、核糖核酸酶抑制剂、具有逆转录活性的酶、及引物等的反应液，直至反应开始前预先在4℃以下保持冷却。在其中添加欲测量的能够包含人类WT1 mRNA的受试标本，在50℃～70℃、优选为在55℃～65℃下以2～30分钟、优选为2～10分钟左右反应复数次，进行cDNA合成(逆转录反应)。继而，以90℃～99℃加热10秒～2分钟左右，使RNA-cDNA复合体变性(热变性)。进而进行2～50个循环的包含90℃～99℃下的热变性、45℃～65℃的退火反应、及60℃～80℃的DNA延伸反应的温度循环反应，使源自标靶RNA的DNA片段扩增。在为了进一步提高敏感度和/或特异性而进行巢式PCR的情形时，亦可预先将第1阶段、第2阶段的PCR所使用的引物一同从一开始起便预先添加至反应容器内，连续地进行2个阶段的PCR。在该情形时，第1阶段的PCR用引物量必须少在第2阶段的PCR用引物量，优选为第2阶段的PCR用引物量的100倍以下的量。

根据以上所描述的方法，可借由同一容器内的1步骤反应简便地测量人类WT1mRNA量。另外，该方法可借由使用可商业获取的实时RT-PCR用试剂盒、和/或实时PCR装置而简便地实施。

其中，该WT1 mRNA量的获取步骤并不限于该方法，如上所述，只要为可至少以信息的形式获得受试者(例如儿童ALL患者、疑似儿童ALL患者)的生物样品中的WT1 mRNA量的方法即可，如上所述，可借由自行以受试者的生物样品为材料测量WT1 mRNA量而获取，另外，亦可借由从第三人或其他人以数据(信息)的形式获取该第三人所测得的WT1 mRNA量而进行。

在本发明中，如上所述，可优选地使用2步骤RT-PCR法、或1步骤RT-PCR法。作为2步骤RT-PCR法，例如可列举WT1 mRNA测量试剂盒「Otsuka」，并且可使用该试剂盒的随附文件(2013年3月修订(第6版))所记载的方法。此处，下述实例是使用1步骤RT-PCR法，但文献(K.Kitamura等人，Clinical usefulness of WT1 mRNA expression in bone marrowdetected by a new WT1 mRNA assay kid for monitoring acute myeloid leukemia:acomparison with expression of WT1 mRNA in peripheral blood.「用新的WT1 mRNA测定试剂盒监测急性髓细胞白血病中WT1 mRNA在骨髓中的表达的临床意义：与外周血中WT1mRNA的表达比较」Int J Hematol「国际血液学杂志」(2016)103:53-62.)中显示：在使用1步骤RT-PCR法的情形与使用2步骤RT-PCR法的情形时，所获得的WT1 mRNA量(定量值)有相关关系。

(2)GAPDH mRNA量获取步骤

该步骤是以上述(1)的步骤中设为对象的受试者的生物样品为对象，获取该生物样品中所表达的GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的mRNA量的步骤。

该GAPDH mRNA的量的获取方式或获取方法在实施该步骤后，结果成为获取到GAPDH mRNA量(信息)的状态即可，只要如此，则无特别限制。具体而言，可借由自行将受试者的上述该生物样品作为材料测量GAPDH mRNA的量而获取，另外，亦可借由直接或间接地接受第三人对该生物样品测得的GAPDH mRNA的量的提供而获取。

设为对象的生物样品为与上述测量过WT1 mRNA量的源自儿童(儿童ALL患者、疑似儿童ALL患者)的生物样品相同的生物样品。因此，作为生物样品，如上所述，例如可列举：细胞、组织、血液、骨髓液、唾液、痰液、粪便、及尿。优选为血液及骨髓液。另外，作为血液，优选可列举末梢血。更优选可列举末梢血中的末梢血白血球、骨髓液中的骨髓液有核细胞。

GAPDH是作为「Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH),mRNA」而登记在NCBI的基因(NM_002046.3)。该基因是与细胞的分化无关，在任何细胞中均始终表达并存在，虽然不发挥出特殊功能但具有这些的生存所需的作用的基因。尤其是该基因与作为测量目标的人类WT1基因的碱基序列同源性较低，因此借由RT-PCR所进行的扩增不会产生竞争，故而可优选地用作管家基因。将其碱基序列示于序列表的序列编号8。

受试者的生物样品中的GAPDH mRNA量的测量方法只要为能够测量作为GAPDH基因的转录物的mRNA的量的方法即可，可使用RT-PCR法(2步骤RT-PCR法、1步骤RT-PCR法)、原位RT-PCR法、下一代序列分析仪等业界广为人知的方法进行测量。优选为2步骤RT-PCR法或1步骤RT-PCR法。更优选为利用于同一容器内连续进行逆转录反应与PCR反应(延伸及扩增反应)的1步骤RT-PCR法所进行的测量方法。作为本发明中可使用的1步骤RT-PCR法所使用的反应缓冲液、调配至该反应缓冲液的各种成分、具有逆转录活性的酶、及其他成分，同样可列举上述「(1)WT1 mRNA量获取步骤」所记载者。

作为优选地用于将GAPDH mRNA逆转录为cDNA并加以延伸、扩增的引物组，可列举包含下述表4所记载的(a1)正向引物及(a2)反向引物的引物组a、以及包含表5所记载的(b1)正向引物及(b2)反向引物的引物组b。再者，表4及5中亦一并表示用于检测利用这些引物组而进行扩增的人类GAPDH基因扩增物的序列特异性结合探针((a3)探针、(b3)探针)。再者，对于该探针，优选为进行标记，以使扩增物的检测变得容易。作为探针的表示法，同样可列举上述「(1)WT1 mRNA量获取步骤」所记载的方法。

[表4]

GAPDH mRNA扩增用引物组a及探针

**：意指人类GAPDH基因(NM_002046.3：序列编号8)的区域。

[表5]

GAPDH mRNA扩增用引物组b及探针

﹡﹡：意指人类GAPDH基因(NM_002046.3：序列编号8)的区域。

作为1步骤RT-PCR的反应操作及反应条件，并无限制，同样可列举上述「(1)WT1 mRNA量获取步骤」所记载的方法及条件。该方法可借由使用可商业获取的实时RT-PCR试剂盒和/或实时PCR装置而简便地实施。如此，可借由同一容器内的1步骤反应而简便地测量人类GAPDHmRNA量。

其中，GAPDH mRNA量的获取步骤并不限于该方法，如上所述，只要为可获得受试者(儿童ALL患者、疑似儿童ALL患者)的生物样品中的GAPDH mRNA量的方法即可，如上所述，可借由自行以受试者的生物样品为材料测量GAPDH mRNA量而获取，另外，亦可借由以数据信息的形式收集第三人所测得的GAPDH mRNA量而进行。

上述(2)GAPDH mRNA量获取步骤亦可与上述(1)WT1 mRNA量获取步骤分开进行，优选为与(1)WT1 mRNA量获取步骤同时进行。更优选为(1)WT1 mRNA量获取步骤与(2)GAPDHmRNA量获取步骤均是借由1步骤RT-PCR法测量受试者的生物样品中的mRNA量而获取其的步骤，该(1)及(2)中的1步骤RT-PCR法是同时且在同一容器内连续进行WT1 mRNA及GAPDHmRNA各者的逆转录反应及包含双链cDNA的合成的PCR反应而进行的方法(多任务/1步骤定量实时RT-PCR)。

该方法可借由于同一反应容器内添加反应液并使用上述反应操作及反应条件进行1步骤RT-PCR而实施，该反应液包含WT1基因扩增用的包含正向引物与反向引物的引物组及用以检测其扩增产物的探针、以及GAPDH基因扩增用的包含正向引物与反向引物的引物组及用以检测其扩增产物的探针，此外还包含cNTP、Mg盐或Mn盐等金属离子、核糖核酸酶抑制剂、具有逆转录活性的酶等。

可在该反应容器内产生下述两种反应，同时且实时地测量存在于受试者的生物样品中的源自WT1 mRNA的cDNA的增加、及源自GAPDH mRNA的cDNA的增加两者。

在本发明中，如上所述，可优选地使用2步骤RT-PCR法、或1步骤RT-PCR法。作为2步骤RT-PCR法，例如可列举WT1 mRNA测量试剂盒「Otsuka」，可使用该试剂盒的随附文件(2013年3月修订(第6版))所记载的方法。此处，本案的实例是使用1步骤RT-PCR法，但文献(K.Kitamura等人，Clinical usefulness of WT1 mRNA expression in bone marrowdetected by a new WT1 mRNA assay kid for monitoring acute myeloid leukemia:acomparison with expression of WT1 mRNA in peripheral blood.「用新的WT1 mRNA测定试剂盒监测急性髓细胞白血病中WT1 mRNA在骨髓中的表达的临床意义：与外周血中WT1mRNA的表达比较」Int J Hematol「国际血液学杂志」(2016)103:53-62.)中显示：在使用1步骤RT-PCR法的情形与使用2步骤RT-PCR法的情形时，所获得的WT1 mRNA量(定量值)有相关关系。

[反应容器内所产生的反应]

以下，对使用1步骤RT-PCR法的情形进行描述。

关于WT mRNA，首先使具有与测量样品所含的WT1 mRNA互补的序列的WT1反向引物结合。以该WT1反向引物为起点，利用具有逆转录活性的DNA聚合酶而合成对WT1 mRNA具有特异性的第1链cDNA。继而，以具有与第1链cDNA互补的序列的WT1正向引物为起点而合成双链cDNA。借由反复进行以所合成的双链cDNA为模板的PCR而扩增源自WT1 mRNA的cDNA。在该扩增过程中，结合在双链cDNA的一条链的WT1探针(标记WT1探针)借由DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性而分解，标记物从标记WT1探针游离而发出由该标记物产生的讯号(例如荧光讯号等)。借由于每个扩增周期测量该讯号，可实时测量源自WT1 mRNA的cDNA的增加。另外，由于关于GAPDH mRNA亦并列地同样产生连续的反应，故而借由与上述同样地在每个扩增周期测量由从标记GAPDH探针游离的标记物产生的讯号，可实时测量源自GAPDH mRNA的cDNA的增加。在该情形时，对于WT1探针及GAPDH探针，优选为分别利用不同的标记物(例如荧光物质)进行标记。

(3)指标值算出步骤

该步骤是基于上述(1)及(2)的步骤中分别获取的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，而算出辅助判定所需的指标值的步骤。

WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比可借由将上述(1)的步骤中获取的WT1 mRNA量(标记物基因的量)除以(2)的步骤中获取的GAPDH mRNA量(管家基因的量)，而以「WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量」的值的形式获得，意指相对于GAPDH mRNA每1个拷贝的WT1 mRNA的拷贝数。此处，「1个拷贝」意指1个GAPDH mRNA或WT1 mRNA、1分子的GAPDH mRNA或WT1 mRNA。具体而言，「相对于GAPDH mRNA每1个拷贝的WT1 mRNA的拷贝数」可换称为「相对于GAPDH mRNA每1个的WT1 mRNA的个数」或「相对于GAPDH mRNA每1分子的WT1 mRNA的分子数」。

本发明的辅助判定所需的指标值可借由将上述所获得的WT1 mRNA量与GAPDHmRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)进一步标准化(normalization)而算出。

此处，标准化可借由将上述所获得的「WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量」乘以健康成人的每1μg RNA的平均GAPDH mRNA测量值(GAPDH mRNA量：拷贝/μg RNA)而进行。再者，此处，健康成人意指血液常规检查及血液生化学检查、肝功能及肾功能常规检查的检查结果基于业界的技术常识而判断为正常的20岁以上的人类(不分男女)。

具体而言，作为一例，标准化可借由将上述中获得的「WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量」乘以相当于健康成人每1μg RNA的平均GAPDH mRNA测量值的「2.7×10⁷拷贝/μg RNA」而进行，可将如此而获得的值作为指标值而用于辅助判定。

在本发明中，有时将指标值算出步骤中所获得的指标值称为WT1 mRNA表达量。

(4)血液学病期的辅助判定步骤

本发明的方法可进而包括下述步骤。

(4)将上述(3)的步骤中所获得的指标值与预先设定的临界值加以对比，基于其大小而表示受试者的儿童ALL的血液学病期的步骤。

在受试者为儿童ALL患者的情形时，该步骤(4)可设为如下步骤：在上述步骤(3)中所获得的指标值小于特定的临界值的情形时，表示该受试者处于缓解期，另一方面，在上述步骤(3)中所获得的指标值为上述特定的临界值以上的情形时，表示该受试者处于非缓解期。此处，非缓解期包括未治疗期、治疗后复发期、及治疗不应期。因此，可根据缓解期与鉴别目标的非缓解期，从未治疗期、治疗后复发期、及治疗不应期中至少选择一个病期，使用与此对应的临界值。再者，在本发明中，「临界值」意指用以辅助血液学病期的判定的「参考基准值」，本说明书中所记载的「临界值」可换称为「参考基准值」。

另外，在受试者为疑似儿童ALL患者的情形时，该步骤(4)可设为如下步骤：在上述步骤(3)中所获得的指标值小于特定的临界值的情形时，表示该受试者未患有，另一方面，在上述步骤(3)中所获得的指标值为上述特定的临界值以上的情形时，表示该受试者患有(在儿童ALL的血液学病期的分类中为「非缓解期」)。

该步骤中使用的临界值(儿童ALL血液学病期辅助判定用临界值)在受试者为儿童ALL患者的情形时(优选为正接受诱导缓解疗法的儿童ALL患者)，为针对用于辅助判定该受试者是否处于儿童ALL的缓解期的指标值的参考基准值。换言的，该临界值是针对用于辅助判别受试者处于缓解期亦或处于非缓解期(未治疗期、治疗后复发期、或治疗不应期)的指标值的参考基准值。

另外，该步骤中使用的临界值在受试者为疑似儿童ALL患者的情形时，为针对用于辅助判定该受试者是否患有儿童ALL的指标值的参考基准值。该患有状态为相当于儿童ALL患者的未治疗期的状态，未患有状态为相当于儿童ALL患者的缓解期的状态。

临界值是根据作为对象的受试者的生物样品的种类、鉴别对象病期及判定目标等而个别地设定，根据这些而存在复数个值。具体而言，例如可列举：在受试者为正接受诱导缓解疗法的儿童ALL患者的情形时，为用以辅助判别该受试者处于非缓解期或已到达缓解期的临界值；在受试者为正接受缓解后疗法的儿童ALL患者的情形时，为用以辅助判别该受试者处于缓解期或处于治疗后复发期的临界值；在受试者为正接受诱导缓解疗法或缓解后疗法的儿童ALL患者的情形时，为用以辅助判别该受试者处于治疗不应期或处于缓解期的临界值；在受试者为疑似儿童ALL患者的情形时，为用以辅助判别该受试者是否为未治疗期、即否患有儿童ALL的临界值等。再者，在「是否患有儿童ALL」为「否」的情形时，包括虽然未患有儿童ALL但患有儿童ALL以外的血液病的情况、及不仅患有儿童ALL而且亦患有儿童ALL以外的血液病的情况。

另外，这些临界值亦根据设为对象的受试者的生物样品而异，具体而言例如可根据末梢血与骨髓液等生物样品的种类而设定各自的临界值。

例如，在受试者为儿童ALL患者的情形时，该临界值可根据基于儿童ALL患者的生物样品中的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)而获得的指标值与儿童ALL患者的儿童ALL的血液学病期的关系而求出。此处，指标值可借由上述「(3)指标值算出步骤」中所描述的方法而求出。

具体而言，首先以借由惯用的诊断方法确诊儿童ALL的血液学病期(未治疗期、治疗后复发期、治疗不应期、及缓解期)的复数个儿童ALL患者为对象，对每1个血液学病期求出基于生物样品(例如末梢血、骨髓液)中的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)的指标值的分布或平均值。继而，可基于所获得的每1个病期的指标值的分布或平均值(平均指标值)，任意地设定能够识别(分离)属于缓解期的组(缓解期组)与属于各非缓解期的组(非缓解期组)的值，并将其设为临界值。上述非缓解期组中包括未治疗期组、治疗后复发期组、及治疗不应期组。即，若设定能够分离未治疗期组与缓解期组的值，则其成为用以鉴别未治疗期组与缓解期组的临界值，以下同样地借由设定能够分离缓解期组与治疗后复发期组的值、以及能够分离缓解期组与治疗不应期组的值，该设定值成为各自的临界值。

另外，在将疑似儿童ALL患者作为对象的情形时，首先，以借由惯用的诊断方法确诊为患有儿童ALL(未治疗期)的复数个儿童ALL患者与复数个未患有ALL的儿童为对象，按照有无患有儿童ALL，求出基于生物样品(例如末梢血、骨髓液)中的WT1 mRNA量与GAPDHmRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)的指标值的分布或平均值。继而，基于所获得的按照有无患有的指标值的分布或其平均值(平均指标值)，任意地设定能够识别(分离)儿童ALL患有者组与未患有ALL的儿童组的值，借此可将其设为用以辅助判定有无患有儿童ALL的临界值。再者，作为未患有ALL的儿童，可列举虽然未患有ALL但患有ALL以外的血液病的儿童、及不仅患有ALL而且亦患有ALL以外的血液病的儿童。尤其是患有呈现与ALL类似的症状的ALL以外的血液病的儿童。

在本发明中，能够识别(分离)这些两组的临界值可借由统计学解析而求出。作为统计学解析，可使用各种解析方法。例如，具体而言可列举ROC解析、判别分析、及单变量解析等。

判别分析例如是用于从某资料识别2组的方法，是根据为某值以上与未达该值而进行分组的分析。

单变量解析例如是如下解析：在反应变量(相当于Y＝a+bX的Y者)为连续资料的情形时，若考虑使高血压患者的血压下降10时某药剂的用量，则以何种基准决定该10。

在本发明中，优选为使用ROC解析。对使用ROC(Receiver operation character)解析求出临界值的方法进行记载。关于能够识别(分离)非缓解期与缓解期的两组的临界值，作为一例，可借由将由两组所求出的指标值(将WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比标准化所得的值)制成由敏感度(sensitivity)与特异度(100％-specificity)的2轴表示的ROC曲线(Receiver operating characteristic curve)而求出。基于ROC曲线的临界值的求出方法例如可根据「生物样品分析」2005年、第28卷、第133-139页及Perkins NJ,Am JEpidemiol.「美国流行病学杂志」2006；163:670-675.所记载的方法而设定。

作为利用ROC曲线求出临界值的方法，可列举如下两方法：(1)在记载有ROC曲线的曲线图中，利用距左上角的距离的方法；及(2)使用约登指数(Youden index)的方法。(1)的方法是如下方法：根据敏感度与特异度优异的独立变量的ROC曲线会逐渐靠近左上角这一事实，而将距该左上角的距离最小的点设为临界值。另一方面，(2)的方法是如下方法：将距预测能力及诊断能力较低的独立变量的ROC曲线、即AUC＝0.500的线最远的点设为临界值。具体而言为计算「敏感度+特异度-1」，将其成为最大值的点(约登指数)设为临界值的方法。

如此，可设定用以辅助判定各组(缓解期组与未治疗期组、缓解期组与治疗后复发期组、缓解期组与治疗不应期组、患有组与未患有组)的鉴别的临界值。

在本发明中，临界值高于上述指标值的检测下限值。

「指标值的检测下限值」意指指标值能够检测到的最小量(值)。具体而言，意指使用RT-PCR法进行测量的情形时的检测最小量。更优选为使用本发明的实时PCR用试剂盒进行测量的情形时试剂盒的性能上所能够测量到的检测下限的值。

在下述本实例中，作为一例，借由ROC曲线(约登指数法)而设定这些临界值中的用以辅助判别未治疗期与缓解期的临界值(约登指数)。具体而言，在使用骨髓液作为生物样品的情形时，优选的临界值为1,820拷贝/μg RNA(敏感度58.1％、特异度98.0％、AUC0.794)，在使用末梢血作为生物样品的情形时，优选的临界值为220拷贝/μg RNA(敏感度68.8％、特异度98.0％、AUC 0.894)。

因此，能够对未治疗的儿童ALL患者及正实施诱导缓解疗法的儿童ALL患者，基于该临界值而辅助判别未治疗期与缓解期。具体而言，关于儿童ALL患者，若以末梢血和/或骨髓液作为受试标本而算出的指标值分别未达220拷贝/μg RNA和/或未达1,820拷贝/μgRNA，则能够判断(预判)该儿童ALL患者到达缓解期，相反若为220拷贝/μg RNA以上和/或1,820拷贝/μg RNA以上，则能够判断(预判)该儿童ALL患者尚处于未治疗期。

借由使用以上所描述的辅助急性淋巴性白血病的血液学疾病的判定的方法，能够对儿童ALL患者经时监测其血液学病期。因此，本发明亦是关于一种借由实施上述方法的儿童ALL的血液学病期的经时监测方法。再者，上述儿童ALL的血液学病期的监测包括监测从非缓解期向缓解期的转变、及监测从缓解期向非缓解期的转变。

(III)用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒(体 外诊断用医药品)

本发明的用以测量ALL受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒的特征在于包含用以将人类WT1 mRNA供于RT-PCR法的引物组、及用以将作为管家基因的GAPDH mRNA供于RT-PCR法的引物组两者。另外，该试剂盒中可包含用于检测借由RT-PCR法而进行扩增的人类WT1mRNA的扩增产物、及管家基因(GAPDH mRNA)的扩增产物的探针。

作为试剂盒的一例，可列举如下者，其包含：作为用以将人类WT1 mRNA供于RT-PCR法的引物组的包含表2所示的「(A1)正向引物(序列编号2)」及「(A2)反向引物(序列编号3)」的引物组A、以及作为用于检测利用这些引物组进行扩增的人类WT1基因扩增物的序列特异性结合探针的表2所示的「(A3)探针(序列编号4)」，且包含：作为用以将用作管家基因的人类GAPDH mRNA供于RT-PCR法的引物组的包含表4所示的「(a1)正向引物(序列编号9)」及「(a2)反向引物(序列编号10)」的引物组a、以及作为用于检测利用这些引物组进行扩增的人类GAPDH基因扩增产物的序列特异性结合探针的表4所示的「(a3)探针(序列编号11)」。

再者，对于探针，优选为进行标记，以使扩增物的检测变得容易。

探针的表示法有RI法与非RI法，优选为使用非RI法。非RI法可列举荧光表示法、酶、生物素表示法、发色团、化学发光表示法等，可优选地使用荧光表示法。作为荧光物质，只要为能够与核酸的碱基部分结合者，则无特别限定，可使用花青素色素(Cy DyeTM系列的Cy3或Cy5等)、玫瑰红6G试剂、FAM(6-羧基荧光素)、及HEX(6-六氯荧光素)等。另外，探针亦可经淬灭色素标记。再者，作为淬灭色素，只要为具有作为淬灭色素的功能且与上述同样地能够与核酸的碱基部分结合者，则无特别限定，例如可列举ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH公司)。

作为试剂盒的另一例，可列举如下者，其包含：作为用以将人类WT1 mRNA供于RT-PCR法的引物组的包含表3所示的「(B1)正向引物(序列编号5)」及「(B2)反向引物(序列编号6)」的引物组B、以及作为用于检测利用这些引物组进行扩增的人类WT1基因扩增物的序列特异性结合探针的表3所示的「(B3)探针(序列编号7)」，且包含：用以将用作管家基因的人类GAPDH mRNA供于RT-PCR法的引物组的包含表5所示的「(b1)正向引物(序列编号9)」及「(b2)反向引物(序列编号12)」的引物组b、以及用于检测利用这些引物组进行扩增的人类GAPDH基因扩增产物的序列特异性结合探针的表5所示的「(b3)探针(序列编号11)」。

本发明的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒除上述成分以外，亦可包含逆转录反应与PCR的两个反应所需的各种成分(dNTP、金属离子、用以调整pH值的缓冲成分等)、具有逆转录活性等的酶或酶辅助因子等。再者，作为金属离子，并无限制，可例示乙酸锰或镁盐等能够产生二价金属离子的盐。另外，该试剂盒的各种成分可进而添加使酶稳定化的成分或核糖核酸酶抑制剂等。另外，该试剂盒中可包含以特定浓度含有WT1RNA和/或GAPDH RNA的标准液、以及视需要的用以稀释该标准液的缓冲液。

本发明的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒可进而包含用以装入反应液的容器(反应容器)或用以维持或保存受试标本的容器(例如用以采集并保存末梢血或骨髓液的容器)。若预先准备分注有反应液的1次所需量的反应容器，则能够仅添加欲测量的受试标本而开始反应，故而能够简便地进行人类WT1 mRNA量的定量。尤其在对大量受试标本定量人类WT1 mRNA量的情形时有用。另外，试剂盒可任意地包含用以使受试标本的制备变得容易的其他成分。另外，亦可包含移液管、注射器、及镊子等、以及其他用以辅助采集受试标本的一种以上的器具。

本发明的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒可单独进行包装，或者任选地与关于该试剂盒的说明书一同包装而商业流通。该说明书可为纸质、或可被计算机读取的媒体(磁盘、CD、DVD等)。作为该说明书的记载，并无限制，可列举选自由本发明的实时PCR用试剂盒的试剂盒构成、使用目的、测量原理、操作方法(用法、用量)、测量结果的判定方法、及临床意义所组成的群的至少一个事项。

本发明的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒包含能够借由定量实时RT-PCR而测量从末梢血(白血球)或骨髓液(有核细胞)所提取的RNA中的WT1 mRNA的试剂盒，作为该试剂盒的使用目的或临床意义，可列举能够用于以ALL患者或疑似患有ALL的患者为对象进行ALL的血液学病期(缓解期、非缓解期[未治疗期、缓解后复发期、治疗不应期])的辅助判定(ALL患者的诊断辅助)。另外，该实时PCR用试剂盒能够用于对ALL患者进行ALL发展或复发的监测、或者对正接受治疗的ALL患者进行治疗效果的监测。另外，该ALL诊断用试剂盒能够用于对疑似儿童ALL患者进有无患有儿童ALL的辅助判定(儿童ALL的患有诊断的辅助)。

本发明的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒并不特别限定使用年龄，可用于大人亦可用于儿童。

(IV)计算机程序制品

本发明亦包括用以使计算机实施儿童ALL的血液学病期的判定的计算机程序制品。计算机程序制品可例示能够经由因特网等而下载的计算机程序、或记录有该程序的媒体(磁盘、CD、DVD等)。

例如可例示用以使计算机执行以下步骤的计算机程序。

(I)接受受试者的生物样品中的WT1 mRNA量、及上述该生物样品中的GAPDH mRNA量的输入的步骤；及

(II)基于上述(I)的步骤中接受输入的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助儿童ALL的血液学病期的判定所需的指标值的步骤。再者，上述(I)的步骤可为同时接受WT1mRNA量与GAPDH mRNA量的输入者，亦可为分别接受输入者。

另外，上述程序亦可为用以使计算机除上述(I)及(II)以外进而执行下述(III)的步骤的程序：

(III)基于上述(II)的步骤中所获得的指标值，对受试者决定儿童ALL的血液学病期的步骤。

[儿童ALL的血液学病期的辅助判定装置]

以下，参照图式对优选地用于执行该计算机程序的装置(计算机装置)的一形态进行描述。但本发明并不限定于该实施形态。图1是表示用于受试者的血液学病期的辅助判定的装置(以下，亦简称为「辅助判定装置」)的一例的概略图。图1所示的辅助判定装置1包括测量装置2、及与该测量装置2连接的计算机系统3。在该实施形态中，测量装置2是测量受试者的生物样品中的WT1 mRNA量和/或GAPDH mRNA量的装置。该测量装置2获取受试者的生物样品中的WT1 mRNA量和/或GAPDH mRNA量本身、或者由借由RT-PCR法等进行扩增的各基因扩增物产生的荧光或发光强度等与WT1 mRNA量和/或GAPDH RNA量有关的信息。具体而言，若将从受试者采集的生物样品放置在测量装置2，则测量装置2获取与该生物样品中的WT1 mRNA量和/或GAPDH RNA量相关的信息，并将所获得的信息发送至计算机系统3。但在本发明的辅助判定装置中，上述测量装置2为任意，本发明的辅助判定装置亦可为由计算机系统3构成者。

计算机系统3包括计算机本体3a、包含键盘或鼠标的输入部3b、及显示受试者或受试标本等信息或判定结果等的显示部3c。计算机系统3接受与受试标本中的WT1 mRNA量和/或GAPDH mRNA量相关的信息的输入。然后，计算机系统3执行基于这些信息而判定受试者的儿童ALL的血液学病期的程序。

图2是以功能方块表示辅助判定装置1的计算机本体3a的软件的方块图。如图2所示，计算机本体3a具备接收部301、记忆部302、算出部303、判定部304、及输出部305。

接收部301可经由输入部3b而接收实施儿童ALL的血液学病期判定所需的信息、具体而言受试者或受试标本等信息、或与受试者的生物样品中的WT1 mRNA量和/或GAPDHmRNA量等有关的信息。另外，接收部301可经由网络而以能够进行通讯的方式与作为任意装置的上述测量装置2连接，可接收从测量装置2发送的信息(例如受试者或受试标本等信息、或与受试者的生物样品中的WT1 mRNA量和/或GAPDH mRNA量等有关的信息等)。

记忆部302是记忆判定所需的基准值(标准化所需的信息[例如健康成人的每1μgRNA的平均GAPDH mRNA测量值]或临界值等)及用以算出WT1基因的表达量的式或处理程序等用以使计算机系统执行本发明的计算机程序。算出部303是使用接收部301中取得的信息，根据所记忆的式而算出WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)或指标值(WT1 mRNA表达量)等。判定部304是判定利用接收部301取得或利用算出部303算出的指标值(WT1 mRNA表达量)为记忆在记忆部302的基准值(临界值)以上或未达。输出部305将由判定部304得出的判定结果输出至显示部3c作为受试者的儿童ALL的血液学病期的判定结果。再者，显示部3c并无限制，可为包含布朗管(CRT)、液晶显示器(LCD)、电浆显示器(PDP)、有机EL显示器(OLED)者。

图3是表示图2所示的计算机本体3a的硬件构成的方块图。如图3所示，计算机本体3a具备：CPU(Central Processing Unit，中央处理单元)30、ROM(Read Only Memory，只读存储器)31、RAM32、辅助记忆部33、输入输出接口34、媒体接口35、通讯接口36、及图像输出接口37。CPU30、ROM31、RAM(Random Access Memory，随机存储内存)32、辅助记忆部33、输入输出接口34、媒体接口35、通讯接口36及图像输出接口37是以能够进行数据通讯的方式被总线38所连接。

CPU30能够执行记忆在ROM31中的计算机程序及加载在RAM32中的计算机程序。借由使CPU30执行计算机程序，对所取得的资料进行处理，而执行图2所示的各功能。借此，计算机系统3作为用以对受试者判定儿童ALL的血液学病期的装置而发挥功能。

ROM31是由光罩式ROM、PROM(Programmable Read Only Memory，可程序化只读存储器)、EPROM(Erasable Programmable Read Only Memory，可抹除可程序化只读存储器)、EEPROM(Electrically Erasable Programmable Read Only Memory，电子可抹除可程序化只读存储器)等所构成。ROM31中记录有如上所述利用CPU30所执行的计算机程序及用于其的数据。

RAM32是由SRAM(Static Random Access Memory，静态随机存取内存)或DRAM(Dynamic Random Access Memory，动态随机存取内存)等所构成。RAM32是用于读取记录在ROM31及辅助记忆部33的计算机程序。另外，RAM32在执行这些计算机程序时，用作CPU30的作业区域。

辅助记忆部33是由硬盘、闪存等半导体内存组件、光盘等所构成。辅助记忆部33记忆有用以使CPU30执行的操作系统或应用程序等计算机程序、及用于该计算机程序的执行的各种设定数据。

媒体接口35能够读取记录在记录媒体40的计算机程序、数据、应用程序。所读取的应用程序等是记忆在RAM32或辅助记忆部33。另外，媒体接口35将CPU30所生成的信息写入至记录媒体40。媒体接口35将CPU30所生成并记忆在辅助记忆部33的信息写入至记录媒体40。

记录媒体40由软盘、CD-ROM、或DVD-ROM等可携型记录媒体所构成。记录媒体40是利用软盘驱动器、CD-ROM驱动器、或DVD-ROM驱动器等读取装置而与上述媒体接口35连接。记录媒体40中亦可储存有用以使计算机执行操作的应用程序等。

输入输出接口34例如由USB(universal serial bus，通用串行总线)、IEEE1394、RS-232C等串行界面、SCSI(Small Computer System Interface，小型计算机系统界面)、IDE(Integrated Development Environment，整合发展环境)、IEEE1284等并行界面、及包含D/A(digital/analog，数字/模拟)转换器、A/D转换器等的模拟界面所构成。在输入输出接口34连接有触控面板、手写板、键盘、鼠标、麦克风等输入部3b。操作者能够借由该输入部3b向计算机本体3a输入各种指令。另外，输入输出接口34连接在显示器或打印机等输出部305，将CPU30所生成的信息、或CPU30所生成且记忆在辅助记忆部33的信息输出至输出部305。

通讯接口36例如由USB、IEEE1394、RS-232C等串行界面、SCSI、IDE、IEEE1284等并行界面、包含D/A转换器、A/D转换器等的模拟界面、网络界面控制器等所构成。通讯接口36在CPU30的控制下接收来自测量装置2或其他外部机器的数据，视需要将数据处理部所保存或生成的信息发送至或显示于测量装置2或外部。通讯接口36亦可经由网络而与测量装置2或其他外部机器进行通讯。计算机本体3a亦可借由通讯接口36而向打印机等发送印刷数据。

图像输出接口37连接在上述显示部3c。借此，显示部3c能够输出与由CPU30提供的图像数据对应的影像讯号。显示部3c根据所输入的影像讯号而显示图像(画面)。

[用以判定儿童ALL的血液学病期的辅助判定装置的动作]

使用图4所记载的流程图，对利用辅助判定装置1所进行的受试者的儿童ALL的血液学病期判定的顺序加以描述。此处，根据使用源自受试者的生物样品所获得的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量，算出指标值(WT1 mRNA表达量)，进行所获得的指标值是否为基准值(临界值)以上的判断，列举此情形为例进行描述。但是，本发明并不仅限定于该实施形态。

在步骤S1-1中，辅助判定装置1的接收部301由测量装置2取得受试者的生物样品中的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量。另外，该步骤S1-1亦可借由从辅助判定装置1的输入部3b接受受试者的生物样品中的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的输入，而取得WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量。再者，可同时接受WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量向接收部301的输入，另外，亦可分别接受。

其次，在步骤S1-2中，算出部303根据上述步骤1-1中所取得的信息(WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量)而算出WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)，并视需要发送至记忆部302。然后，在步骤S1-3中，算出部303基于上述步骤S1-2中所算出的WT1mRNA量/GAPDH mRNA量、以及记忆在记忆部302中的健康成人的每1μg RNA的平均GAPDHmRNA测量值，算出辅助判定所需的指标值。

其后，在步骤S1-4中，判定部304从记忆在记忆部302中的各种临界值(用以判别缓解期与未治疗期的临界值、用以判别缓解期与治疗后复发期的临界值、用以判别缓解期与治疗不应期的临界值)中，根据目的而读取所需的(设为对象的)临界值，将这些与步骤S1-3中所取得的生物样品的指标值进行对比，算出该指标值为上述临界值以上亦或未达上述临界值。

在步骤S1-5～S1-6中，基于上述步骤S1-4中的算出结果，针对受试者血液学病期判别缓解期(未患有)与非缓解期(未治疗期、治疗后复发期、治疗不应期、患有)。具体而言，在受试者为儿童ALL患者的情形时，将该患者的生物样品的指标值与用以判别缓解期与未治疗期的临界值进行对比，在该指标值为上述临界值以上的情形时，判定为未治疗期，在未达临界值的情形时，判定为缓解期。另外，在受试者为儿童ALL患者的情形时，将该患者的生物样品的指标值与用以判别缓解期与治疗后复发期的临界值进行对比，在该指标值为上述临界值以上的情形时，判定为治疗后复发期，在未达临界值的情形时，判定为缓解期。进而，在受试者为儿童ALL患者的情形时，将该患者的生物样品的指标值与用以判别缓解期与治疗不应期的临界值进行对比，在该指标值为上述临界值以上的情形时，判定为治疗不应期，在未达临界值的情形时，判定为缓解期。另外，在受试者为疑似儿童ALL患者的情形时，将该患者的生物样品的指标值与用以判别缓解期与未治疗期的临界值进行对比，在该指标值为上述临界值以上的情形时，判定该疑似儿童ALL患者患有儿童ALL，在未达临界值的情形时，判定未患有儿童ALL。

在步骤S1-7中，输出部305将受试者的儿童ALL的血液学病期的判定结果输出并显示于显示部3c。借此，辅助判定装置1在受试者为儿童ALL患者的情形时，能够判别该儿童ALL的血液学病期为缓解期或为非缓解期(未治疗期、治疗后复发期、治疗不应期)，另外，在受试者为疑似儿童ALL患者的情形时，能够判别是否患有该儿童ALL(患有或未患有)，并可将其结果作为儿童ALL的血液学病期的辅助判定信息提供给医师等。

(IV)计算机系统

在本发明中亦包括适于实施受试者的儿童ALL的血液学病期判定的计算机系统。该系统具备包含处理器与内存(记忆部302)的计算机，在上述内存中记录有用以使计算机系统执行以下步骤的计算机程序。

(I)接受受试者的生物样品中的WT1 mRNA量、及上述该生物样品中的GAPDH mRNA量的输入的步骤；及

(II)基于上述(I)的步骤中接受输入的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助儿童ALL的血液学病期的判定所需的指标值的步骤。再者，上述(I)的步骤可同时接受WT1mRNA量与GAPDH mRNA量的输入，亦可分别接受。

另外，上述计算机程序中亦可进而记录有用以执行下述(III)的步骤的程序：

(III)基于上述(II)的步骤中所获得的指标值，对受试者决定儿童ALL的血液学病期的步骤。

根据本实施形态，能够基于上述(II)或(III)的步骤中所获得的结果，对受试者判定儿童ALL的血液学病期。例如，在提供生物样品的受试者为儿童ALL患者的情形时，能够提供该受试者的儿童ALL的血液学病期为缓解期或未治疗期的鉴别、为缓解期或治疗后复发期的鉴别、为缓解期或治疗不应期的鉴别的判定结果。另外，在提供生物样品的受试者为疑似儿童ALL患者的情形时，能够提供该受试者患有或未患有儿童ALL的判定结果。借由将这些判定结果提供给医师等，能够辅助医师等对儿童ALL的血液学病期的诊断。

实例

以下，列举实例更详细地描述本发明。但本发明并不特别限定于该实例。

实例1

使用作为威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)mRNA试剂盒的「WT1 mRNA测量试剂盒II『Otsuka』」(大冢制药股份有限公司制造)，以儿童ALL患者及怀疑患有ALL的儿童为对象，测量从末梢白血球及骨髓液有核细胞提取的RNA中的WT1 mRNA量。该试剂盒是由RT-PCR用混合液、金属离子溶液(乙酸锰等)、WT1及GAPDH混合溶液RNA标准液(WT1RNA、GAPDH RNA等)、及标准液稀释液(缓冲剂等)等所构成。另外，RT-PCR用混合液中包含表5所示的WT1正向引物、WT1反向引物、WT1探针、GAPDH正向引物、GAPDH反向引物、及GAPDH探针。WT1探针的5'末端经HEX(6-六氯荧光素)标记，GAPDH探针的5'末端经FAM(6-羧基荧光素)标记。另外，各探针的3'末端经作为淬灭色素的ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH公司)标记。

[表6]

RT-PCR用混合液所含的引物组

*：意指人类WT2基因(NM_024426.4：序列编号1)的区域。

**：意指人类GAPDH基因(NM_002046.3：序列编号8)的区域。

再者，RNA的提取方法、所提取的RNA中的WT1 mRNA的量的测量及其算出方法是根据「WT1 mRNA测量试剂盒II『Otsuka』」(大冢制药股份有限公司制造)的说明书(随附文件)的记载而进行。

(1)试验对象者

以2014年12月至2015年12月末在全国14个治疗机构实施初发未治疗儿童ALL患者及疑似儿童ALL的儿童患者中取得了对本试验的同意的合计49例为对象。其中，对象病例中的1例在诱导缓解疗法结束前转院至他院，因而未能采集诱导缓解疗法结束后及早期强化疗法结束后的2个时点的样品。再者，疑似ALL的患者(疑似ALL患者)在日后被认定为是ALL以外的疾病时，在治疗开始前的1个时点结束试验。

(2)试验方法(跟踪试验：6个月)

以治疗开始后4～6个月作为观察期间，在下述时点采集骨髓液1mL及末梢血7mL，测量这些受试标本中的WT1 mRNA(参照图5)

(a)治疗开始前(TP 0)

(b)诱导缓解疗法结束后(TP 1)

(c)早期强化疗法结束后(TP 2)

(d)早期强化疗法结束以后的骨髓检查时(仅限基于诊疗目的而进行骨髓检查的情形)

将解析对象病例49例中的作为解析对象的样品的详细内容示于下述表7。

[表7]

解析对象样品的详细内容

样品采集时点	末梢血	骨髓液	合计
				TP0(治疗开始前)	48	43	91
TP1(诱导缓解疗法结束后)	48	47	95
				TP2(早期强化疗法结束后)	48	47	95
TP2～试验结束日	5	5	10
				合计	149	142	291

(3)试验结果

(3-1)跟踪观察时的WT1 mRNA表达量(指标值)的变迁对作为对象的49例中的除试验中途转院的1例以外的48例，在治疗开始后4～6个月内每1个月进行跟踪观察。其结果为，在所有48例的病例中，在治疗开始前(TP0)以外的跟踪观察时点，血液学病期均为缓解期。

将所有48个病例的跟踪观察期间中的末梢血及骨髓液的WT1 mRNA表达量的变迁示于图6。

再者，末梢血及骨髓液的WT1 mRNA表达量是如下式所示算出：将WT1 mRNA测量值(WT1 mRNA量)除以GAPDH mRNA测量值(GAPDHmRNA量)，将所得的值(相对于GAPDH mRNA每1个拷贝的WT1 mRNA拷贝数)乘以健康成人的每1μg RNA的平均GAPDH mRNA拷贝数(GAPDHmRNA量＝GAPDH mRNA测量值)。再者，WT1 mRNA的测量是委托BML股份有限公司进行。

[数1]

WT1 mRNA表达量＝(WT1 mRNA测定值/GAPDH mRNA测定值)×2.7x10⁷(拷贝/μg RNA)

2.7x10⁷拷贝/μg RNA：健康成人的每1μgRNA的平均GAPDHmRNA测定值

根据至此为止所实施的成人ALL临床性能试验，缓解时的WT1 mRNA表达量在末梢血及骨髓液中均未达50拷贝/μg RNA(临界值：50拷贝/μg RNA)，在儿童ALL患者的情形时，如图2所示，尽管为缓解期，但WT1 mRNA表达量亦多数情况下在末梢血及骨髓液中均不会未达50拷贝/μg RNA(特别是骨髓液的WT1 mRNA表达量)，可知必须设定与成年ALL患者的临界值不同的至少大于50拷贝/μg RNA的值的新临界值。

其次，基于末梢血WT1 mRNA表达量的变动模式，将48个病例如表8所示分类为A、B、C、D及E的5组。

[表8]

跟踪观察时的WT1 mRNA表达量的按变动模式分类的病例数

另外，将上述A、B、C、D及E的5组的末梢血WT1 mRNA表达量及骨髓液WT1 mRNA表达量的变迁示于图7的A、B、C、D及E。

在5组中的A、B及C的3组中，治疗开始前为50拷贝/μg RNA以上的末梢血WT1 mRNA表达量在跟踪观察的某一时点降低至未达50拷贝/μg RNA。由于该3组的合计病例数为34例，因此表示总体的70.9％(34/48)的病例中，伴有缓解，在治疗开始前为50拷贝/μg RNA以上的末梢血WT1 mRNA表达量降低至未达50拷贝/μg RNA。

(3-2)血液学病期(未治疗期及缓解期)中的WT1 mRNA表达量

将儿童ALL患者49例的作为解析对象样品的末梢血样品149个样品及骨髓液样品142个样品分别分为未治疗期及缓解期的2组，将WT1 mRNA表达量加以比较。将结果示于图8及表9。

[表9]

血液学病期中的末梢血及骨髓液WT1 mRNA表达量

如图8及表9所示，在儿童ALL患者中，末梢血及骨髓液的WT1 mRNA表达量均在缓解期显示与未治疗期相比有意义的低值(学生t检验(Student's t-test)，p<0.01)。然而，由于两组的WT1 mRNA表达量的分布有重叠，故而借由以两组为对象的ROC(Receiver operationgcharacter)解析对成为判定缓解的标准的WT1 mRNA表达量的临界值进行研究。

ROC曲线的制作是依据惯例进行，将特异度、敏感度均最良好的值设为临界值。将ROC解析的结果示于图9。如图9所示，关于ROC解析的结果，对于末梢血，求出缓解判定的临界值为220拷贝/μg RNA的值，对于骨髓液，求出缓解判定的临界值为1,820拷贝/μg RNA的值。关于末梢血，将WT1 mRNA表达量220拷贝/μg RNA设为临界值时，敏感度为68.8％(33/48)，特异度为98.0％(99/101)。即，表示缓解期的末梢血样品中的98.0％的样品未达220拷贝/μg RNA。同样地，关于骨髓液，在将WT1 mRNA表达量1,820拷贝/μg RNA设为临界值时，敏感度为58.1％(25/43)，特异度为98.0％(97/99)。即，表示缓解期的骨髓液样品中的98.0％的样品未达1,820拷贝/μg RNA。

至此为止实施的成人ALL临床性能试验试验中，成人在缓解时的WT1mRNA表达量未达50拷贝/μg RNA，但根据上述实验结果，在儿童的情形时，即便未至未达50拷贝/μg RNA的程度，亦能够判定为缓解。

根据以上，关于对儿童ALL患者可判定为缓解的WT1 mRNA表达量，末梢血为未达220拷贝/μg RNA，骨髓液为未达1,820拷贝/μg RNA，在满足至少任一者的情形时，可判断进入缓解期。

符号描述

1：辅助判定装置

2：测量装置

3：计算机系统

3a：计算机本体

3b：输入部

3c：显示部

30：CPU

31：ROM

32：RAM

33：辅助记忆部

34：输入输出接口

35：媒体接口

36：通讯接口

37：图像输出接口

38：总线

40：记录媒体

301：接收部

302：记忆部

303：算出部

304：判定部

305：输出部

序列表

<110> 大塚制药株式会社

<120> 儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的辅助判定方法

<130> P17-071WO

<150> JP 2016-141793

<151> 2016-07-19

<160> 12

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 3037

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agctggggta aggagttcaa ggcagcgccc acacccgggg gctctccgca acccgaccgc 60

ctgtccgctc ccccacttcc cgccctccct cccacctact cattcaccca cccacccacc 120

cagagccggg acggcagccc aggcgcccgg gccccgccgt ctcctcgccg cgatcctgga 180

cttcctcttg ctgcaggacc cggcttccac gtgtgtcccg gagccggcgt ctcagcacac 240

gctccgctcc gggcctgggt gcctacagca gccagagcag cagggagtcc gggacccggg 300

cggcatctgg gccaagttag gcgccgccga ggccagcgct gaacgtctcc agggccggag 360

gagccgcggg gcgtccgggt ctgagccgca gcaaatgggc tccgacgtgc gggacctgaa 420

cgcgctgctg cccgccgtcc cctccctggg tggcggcggc ggctgtgccc tgcctgtgag 480

cggcgcggcg cagtgggcgc cggtgctgga ctttgcgccc ccgggcgctt cggcttacgg 540

gtcgttgggc ggccccgcgc cgccaccggc tccgccgcca cccccgccgc cgccgcctca 600

ctccttcatc aaacaggagc cgagctgggg cggcgcggag ccgcacgagg agcagtgcct 660

gagcgccttc actgtccact tttccggcca gttcactggc acagccggag cctgtcgcta 720

cgggcccttc ggtcctcctc cgcccagcca ggcgtcatcc ggccaggcca ggatgtttcc 780

taacgcgccc tacctgccca gctgcctcga gagccagccc gctattcgca atcagggtta 840

cagcacggtc accttcgacg ggacgcccag ctacggtcac acgccctcgc accatgcggc 900

gcagttcccc aaccactcat tcaagcatga ggatcccatg ggccagcagg gctcgctggg 960

tgagcagcag tactcggtgc cgcccccggt ctatggctgc cacaccccca ccgacagctg 1020

caccggcagc caggctttgc tgctgaggac gccctacagc agtgacaatt tataccaaat 1080

gacatcccag cttgaatgca tgacctggaa tcagatgaac ttaggagcca ccttaaaggg 1140

agttgctgct gggagctcca gctcagtgaa atggacagaa gggcagagca accacagcac 1200

agggtacgag agcgataacc acacaacgcc catcctctgc ggagcccaat acagaataca 1260

cacgcacggt gtcttcagag gcattcagga tgtgcgacgt gtgcctggag tagccccgac 1320

tcttgtacgg tcggcatctg agaccagtga gaaacgcccc ttcatgtgtg cttacccagg 1380

ctgcaataag agatatttta agctgtccca cttacagatg cacagcagga agcacactgg 1440

tgagaaacca taccagtgtg acttcaagga ctgtgaacga aggttttctc gttcagacca 1500

gctcaaaaga caccaaagga gacatacagg tgtgaaacca ttccagtgta aaacttgtca 1560

gcgaaagttc tcccggtccg accacctgaa gacccacacc aggactcata caggtaaaac 1620

aagtgaaaag cccttcagct gtcggtggcc aagttgtcag aaaaagtttg cccggtcaga 1680

tgaattagtc cgccatcaca acatgcatca gagaaacatg accaaactcc agctggcgct 1740

ttgaggggtc tccctcgggg accgttcagt gtcccaggca gcacagtgtg tgaactgctt 1800

tcaagtctga ctctccactc ctcctcacta aaaaggaaac ttcagttgat cttcttcatc 1860

caacttccaa gacaagatac cggtgcttct ggaaactacc aggtgtgcct ggaagagttg 1920

gtctctgccc tgcctacttt tagttgactc acaggccctg gagaagcagc taacaatgtc 1980

tggttagtta aaagcccatt gccatttggt gtggattttc tactgtaaga agagccatag 2040

ctgatcatgt ccccctgacc cttcccttct ttttttatgc tcgttttcgc tggggatgga 2100

attattgtac cattttctat catggaatat ttataggcca gggcatgtgt atgtgtctgc 2160

taatgtaaac tttgtcatgg tttccattta ctaacagcaa cagcaagaaa taaatcagag 2220

agcaaggcat cgggggtgaa tcttgtctaa cattcccgag gtcagccagg ctgctaacct 2280

ggaaagcagg atgtagttct gccaggcaac ttttaaagct catgcatttc aagcagctga 2340

agaaaaaatc agaactaacc agtacctctg tatagaaatc taaaagaatt ttaccattca 2400

gttaattcaa tgtgaacact ggcacactgc tcttaagaaa ctatgaagat ctgagatttt 2460

tttgtgtatg tttttgactc ttttgagtgg taatcatatg tgtctttata gatgtacata 2520

cctccttgca caaatggagg ggaattcatt ttcatcactg ggagtgtcct tagtgtataa 2580

aaaccatgct ggtatatggc ttcaagttgt aaaaatgaaa gtgactttaa aagaaaatag 2640

gggatggtcc aggatctcca ctgataagac tgtttttaag taacttaagg acctttgggt 2700

ctacaagtat atgtgaaaaa aatgagactt actgggtgag gaaatccatt gtttaaagat 2760

ggtcgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg tgttgtgttt tgttttttaa 2820

gggagggaat ttattattta ccgttgcttg aaattactgt gtaaatatat gtctgataat 2880

gatttgctct ttgacaacta aaattaggac tgtataagta ctagatgcat cactgggtgt 2940

tgatcttaca agatattgat gataacactt aaaattgtaa cctgcatttt tcactttgct 3000

ctcaattaaa gtctattcaa aaggaaaaaa aaaaaaa 3037

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (A1) 正向引物

<400> 2

cgctattcgc aatcagggtt ac 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (A2) 反向引物

<400> 3

ggatcctcat gcttgaatga gt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (A3) 探针

<400> 4

agcacggtca ccttcgacgg ga 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (B1) 正向引物

<400> 5

gataaccaca caacgcccat c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (B2) 反向引物

<400> 6

cacacgtcgc acatcctgaa t 21

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (B3) 探针

<400> 7

aatacacacg cacggtgtct tcagag 26

<210> 8

<211> 1310

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

aaattgagcc cgcagcctcc cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca 60

tcttcttttg cgtcgccagc cgagccacat cgctcagaca ccatggggaa ggtgaaggtc 120

ggagtcaacg gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt 180

aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg 240

ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag 300

cttgtcatca atggaaatcc catcaccatc ttccaggagc gagatccctc caaaatcaag 360

tggggcgatg ctggcgctga gtacgtcgtg gagtccactg gcgtcttcac caccatggag 420

aaggctgggg ctcatttgca ggggggagcc aaaagggtca tcatctctgc cccctctgct 480

gatgccccca tgttcgtcat gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc 540

atcagcaatg cctcctgcac caccaactgc ttagcacccc tggccaaggt catccatgac 600

aactttggta tcgtggaagg actcatgacc acagtccatg ccatcactgc cacccagaag 660

actgtggatg gcccctccgg gaaactgtgg cgtgatggcc gcggggctct ccagaacatc 720

atccctgcct ctactggcgc tgccaaggct gtgggcaagg tcatccctga gctgaacggg 780

aagctcactg gcatggcctt ccgtgtcccc actgccaacg tgtcagtggt ggacctgacc 840

tgccgtctag aaaaacctgc caaatatgat gacatcaaga aggtggtgaa gcaggcgtcg 900

gagggccccc tcaagggcat cctgggctac actgagcacc aggtggtctc ctctgacttc 960

aacagcgaca cccactcctc cacctttgac gctggggctg gcattgccct caacgaccac 1020

tttgtcaagc tcatttcctg gtatgacaac gaatttggct acagcaacag ggtggtggac 1080

ctcatggccc acatggcctc caaggagtaa gacccctgga ccaccagccc cagcaagagc 1140

acaagaggaa gagagagacc ctcactgctg gggagtccct gccacactca gtcccccacc 1200

acactgaatc tcccctcctc acagttgcca tgtagacccc ttgaagaggg gaggggccta 1260

gggagccgca ccttgtcatg taccatcaat aaagtaccct gtgctcaacc 1310

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (a1) 正向引物

<400> 9

cagccgagcc acatcg 16

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (a2) 反向引物

<400> 10

gtcaatgaag gggtcattga tg 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (a3) 探针

<400> 11

ttggtcgtat tgggcgcctg g 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (b2) 反向引物

<400> 12

tgatggcaac aatatccact ttacc 25

Claims (29)

1.一种辅助儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的判定的方法，其包括(1)～(3)的步骤：

(1)获取受试者的生物样品中的威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)的mRNA量的步骤；

(2)获取上述该生物样品中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA量的步骤；及

(3)基于上述(1)及(2)的步骤中分别获取的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出上述辅助判定所需的指标值的步骤。

2.如权利要求1的方法，其中上述(1)的步骤是使用RT-PCR法测量WT1 mRNA量、或接受使用RT-PCR法所测得的WT1 mRNA量的提供的步骤。

3.如权利要求1或2的方法，其中上述(2)的步骤是使用RT-PCR法测量GAPDH mRNA量、或接受使用RT-PCR法所测得的GAPDH mRNA量的提供的步骤。

4.如权利要求1至3中任一项的方法，其中上述(3)的步骤中所获得的指标值是将(1)及(2)的步骤中分别获取的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)进行标准化而获得的值。

5.如权利要求第4的方法，其中上述标准化是借由将WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比(WT1 mRNA量/GAPDH mRNA量)乘以健康成人1μg RNA中所含的GAPDH mRNA量的平均值2.7×10⁷拷贝/μg RNA而进行。

6.如权利要求1至5中任一项的方法，其进而具有下述步骤：

(4)将上述(3)的步骤中所获得的指标值与预先设定的临界值进行对比，并基于其大小而表示受试者的血液学病期的步骤。

7.如权利要求6的方法，其中上述临界值高于上述指标值的检测下限值。

8.如权利要求6或7的方法，其中儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的判定是判别非缓解期与缓解期，并且

上述临界值是分别将处于非缓解期的儿童ALL患者(非缓解期组)与处于缓解期的儿童ALL患者(缓解期组)的两组作为对象并借由统计学解析而求出的值。

9.如权利要求8的方法，其中关于上述临界值，生物样品中的末梢血为220拷贝/μgRNA，骨髓液为1,820拷贝/μg RNA。

10.如权利要求2至9中任一项的方法，其中上述RT-PCR法为2步骤RT-PCR法、或1步骤RT-PCR法。

11.如权利要求2至9中任一项的方法，其中上述RT-PCR法为1步骤RT-PCR法。

12.如权利要求11的方法，其中上述(1)及(2)的步骤中的1步骤RT-PCR法是在受试者的生物样品中同时且在同一容器内连续进行WT1 mRNA及GAPDH mRNA的逆转录反应及延伸反应的方法。

13.如权利要求11或12的方法，其中在上述(1)的步骤的1步骤RT-PCR法中，WT1 mRNA量的测量是使用：

(a)包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组，或

(b)包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

14.如权利要求11或12的方法，其中在上述(1)的步骤的1步骤RT-PCR法中，WT1 mRNA量的测量是使用：

(a')包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号4所示的碱基序列的探针，或

(b')包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号7所示的碱基序列的探针。

15.如权利要求11至14中任一项的方法，其中在上述(2)的步骤的1步骤RT-PCR法中，GAPDH mRNA量的测量是使用：

(c)包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

16.如权利要求11至14中任一项的方法，其中在上述(2)的步骤的1步骤RT-PCR法中，GAPDH mRNA量的测量是使用：

(c')包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号11所示的碱基序列的探针。

17.一种用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其包含：

(a)包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组，或

(b)包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

18.一种用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其包含：

(a')包括包含序列编号2所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号3所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号4所示的碱基序列的探针，或

(b')包括包含序列编号5所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号6所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号7所示的碱基序列的探针。

19.如权利要求17或18的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其进而包含：

(c)包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组。

20.如权利要求17或18的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其进而包含：

(c')包括包含序列编号9所示的碱基序列的正向PCR引物与包含序列编号10或12所示的碱基序列的反向PCR引物的引物组、及经标记的包含序列编号11所示的碱基序列的探针。

21.如权利要求17至20中任一项的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒，其中上述实时PCR用试剂盒为儿童用。

22.一种商业套装，其包含如权利要求17至21中任一项的用以测量急性淋巴性白血病的受试者的WT1 mRNA量的实时PCR用试剂盒及关于该试剂盒的说明书，并且该说明书和/或商业套装上记载有下述至少任一条记载或其内容：

(i)该试剂盒可用于辅助急性淋巴性白血病的血液学病期的判定，及

(ii)用于急性淋巴性白血病的血液学病期的辅助判定的临界值。

23.如权利要求22的商业套装，其中上述急性淋巴性白血病为儿童急性淋巴性白血病，并且关于(ii)用于急性淋巴性白血病的血液学病期的辅助判定的临界值，生物样品中的末梢血为220拷贝/μg RNA，骨髓液为1,820拷贝/μg RNA。

24.一种经时监测儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的方法，其是使用如权利要求1至14中任一项的辅助急性淋巴性白血病的血液学病期的判定的方法经时监测儿童急性淋巴性白血病的血液学病期。

25.如权利要求24的方法，其中上述儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的监测是监测从非缓解期向缓解期的转变、和/或从缓解期向非缓解期的转变。

26.一种计算机程序，其是利用计算机执行下述(I)及(II)的步骤：

(I)接受受试者的生物样品中的威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)的mRNA量、及上述该生物样品中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA量的输入的步骤；及

(II)基于上述(I)的步骤中接受输入的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的判定所需的指标值的步骤。

27.如权利要求26的计算机程序，其进而具有利用计算机执行下述(III)的步骤的程序：

(III)基于上述(II)的步骤中所获得的指标值，对受试者决定儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的步骤。

28.一种计算机系统，其是用于儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的判定，并且具备包含处理器与内存的计算机，

上述内存中记录有使上述计算机执行如下步骤的计算机程序：

(I)接受受试者的生物样品中的威尔姆氏肿瘤-1基因(WT1)的mRNA量、及上述该生物样品中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA量的输入的步骤；及

(II)基于上述(I)的步骤中接受输入的WT1 mRNA量与GAPDH mRNA量的比，算出辅助儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的判定所需的指标值的步骤。

29.如权利要求28的计算机系统，其中上述内存中所记录的计算机程序是使计算机进而执行如下步骤：

(III)基于上述(II)的步骤中所获得的指标值，对受试者决定儿童急性淋巴性白血病的血液学病期的步骤。