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TW201730203A - 製備rada-16的方法 - Google Patents

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TW201730203A
TW201730203A TW105139804A TW105139804A TW201730203A TW 201730203 A TW201730203 A TW 201730203A TW 105139804 A TW105139804 A TW 105139804A TW 105139804 A TW105139804 A TW 105139804A TW 201730203 A TW201730203 A TW 201730203A
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obzl
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TW105139804A
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盧西亞諾 福爾尼
郭言明
彭彬
蔣爭國
亞歷山德羅 巴特
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廣州南沙龍沙有限公司
隆薩布萊納公司
隆薩有限公司
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Abstract

本發明公開一種通過液相肽合成製備RADA-16的方法，所述RADA-16為具有序列Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala)4-NH2的16肽。

Description

製備RADA-16的方法
本發明公開一種通過液相肽合成製備RADA-16的方法，所述RADA-16是具有序列Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala)4 -NH2 的16肽。
在下文中，如果沒有另外指明，使用以下縮寫和定義。
RADA-16是一種合成的兩親性肽，其被設計為根據pH以受控方式自組裝成纖維和較高有序結構，例如具有極高含水量的水凝膠。已發現這種生物相容性材料在醫療、生物技術、奈米技術和生物學中具有潛在應用。實例包括三維細胞培養、組織修復和組織工程、化妝品工業、藥物釋放和藥物遞送、生物表面工程、分離基體和膜蛋白穩定。而且，自我互補的肽代表調查一些神經變性疾病中涉及的澱粉樣纖維的體外形成的有用模型系統。
Paolo Arosio等在Biophysical Journal 2012, 102, 1617-1626中公開了基於其性能的調查。
迄今為止已知SPPS用於RADA-16。RADA-16在SPPS中顯示低的收率。Paradis-Bas, M.,等Eur. J. Org. Chem., 2013, 26, 5871-5878,公開了SPPS導致粗製產物的最終純度相當差，且形成的雜質不容易去除。SPPS具有的缺點是較大體積是成本增加的。在SPPS Fmoc化學法中Arg通常用Pbf保護。Pbf的裂解通常導致例如來源於不完全裂解和產生SO3 衍生物的競爭性反應的副產物。而且，據觀察，在SPPS中偶聯完成需要相當長的時間，為3-4小時。尤其是，在位置1處Fmoc-Arg(Pbf)的偶聯非常困難，並且花費非常長的時間。
在SPPS中使用Arg的NO2 保護原則上是可能的，但是不與在SPPS Fmoc化學法中的Asp的Bzl保護相結合，這是因為其會導致形成高水準的天冬醯亞胺（aspartimide）和相關雜質。因此與在Arg上NO2 相組合時，將使用tBu保護Asp。但是如果用NO2 保護Arg，則需要兩個脫保護步驟，催化裂解NO2 和酸性裂解tBu。
而且，在SPPS中，在四聚體例如Fmoc-RADA-OH偶聯至另一四聚體NH2 -RADA-樹脂的Arg上時，會產生相對高含量的Ala消旋化。
Paradis-Bas, M.,等Eur. J. Org. Chem., 2013, 26, 5871-5878,在方案1中公開了一種製備RADA-16的方法，其中三次將片段F1  Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-OH偶聯到結合樹脂的片段H-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-NH-Rink Chemmatrix (CM)樹脂上，該方法被稱為“固相片段縮合”。在該方法中，所述片段F1通過SPPS製備，需要3倍摩爾過量的氨基酸2至4（Asp(tBu), Ala和Arg(Pbf））。
對於肽樹脂II ([RADA]2 -CM樹脂)的製備，其是在樹脂片段偶聯上的所述三個中的第一個，需要3當量的片段F1。
對於肽樹脂III([RADA]3 -CM樹脂)的製備，其是在樹脂片段偶聯上的所述三個中的第二個，需要三次偶聯片段F1，每次1.5當量的片段F1，即總共4.5當量的片段F1，以獲得對茚三酮試驗呈陰性。
對於Ac-(RADA)4 -NH2 的製備，其是樹脂片段偶聯上的所述三個中的第三個，需要兩次偶聯片段F1，每次1.5當量的片段F1，即總共3.0當量的片段F1，以獲得對茚三酮試驗呈陰性。
在方案2中，公開了兩個八聚體片段F2和F3在溶液中的片段縮合，這些片段F2和F3通過SPPS製備。此外，使用三倍摩爾過量的每個Fmoc-氨基酸2至8，其是在所述第一個氨基酸Ala之後後續偶聯到所述不斷延長的肽鏈上。
據報導，所述片段縮合方法中在整體脫保護（global deprotection）之後粗品純度為58%。
王俊,“用於分子自組裝的短肽RADA的合成研究”，中國優秀碩士學位論文全文資料庫（工程科技Ⅰ輯），02期，2007年2月15日(15.02.2007)在摘要和文章第18頁第11行至第25頁第4行公開了四聚體Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-Obzl。由於所述C-末端Ala的COOH的Bzl保護基，該四聚體不適合作為RADA-16的構建單元。
需要一種以高產率製備RADA-16的方法，其具有較少雜質或副產物，可適於大量製備，且彼此之間相對而言不需要大大過量的底物或構建塊。
意外地發現基於純LPPS的製備方法滿足這些需求：由LPPS製備的序列RADA的四肽偶聯至序列(RADA)2的八肽，它們偶聯以提供所期望的RADA-16。相比於Paradis-Bas公開的樹脂上片段偶聯，該LPPS方法允許該片段策略產生較低消旋化水準的Ala。
同樣地，在LPPS中仍觀察到一些消旋化： 當使用Arg的保護形式Arg(NO2 )時，在兩個八肽的偶聯反應期間觀察到兩個異構體，並且在整體脫保護之後也觀察到兩個異構體。LC-MS（液相色譜-質譜聯用技術）譜顯示這兩對峰具有相似分子量。這種雜質通常表示來自消旋化的異構體。在整體脫保護之後，兩個相應的異構體仍存在於所述LC-MS譜中。即使分離是完全可能的，來源於消旋化的所述異構體也是難以分離的。
當以未保護形式替代保護的Arg(NO2 ) 形式來使用Arg時，在該方法中在最終RADA‑16中Ala的消旋化水準意外地為1%以下。
此外，本發明的 所述LPPS策略使用烯丙基用於所述主要四聚體片段的C-末端COOH殘基的保護，從而該主要四聚體片段（其被製備成具有該烯丙基保護基）可用於兩種轉化，即，用於所述C-末端COOH殘基向所述醯胺殘基的轉化，以及用於向所述未保護的C-末端COOH（其是所述片段偶聯所需）的轉化。這代表製備僅這一個主要四聚體片段有效的合理策略，該主要四聚體片段隨後可如本文所概述的用於衍生化為用於構建所述八聚體片段的四聚體片段底物。
本發明提供一種基於純LPPS的新穎製備方法。該方法是能成噸規模生產所必需的，而在已知的SPPS策略中，觀察到較低的轉化和需要較多的底物、材料和中間體。在LPPS中的所述偶聯反應中，可以使用化學計量或近化學計量含量的構建塊。
當以其保護形式Arg(NO2 )使用Arg時，獲得在整體脫保護之後的粗品純度為58%，其分別高於Paradis-Bas報導的針對所述樹脂上片段偶聯策略的純度41%和純度46%，並且類似於Paradis-Bas報導的在溶液中所述兩個八聚體片段F2和F3的片段縮合的純度。當以其未保護形式使用Arg時，甚至獲得46%的純度。
本發明的主題是一種製備所述肽(RADA)4 的方法；其中在液相中使具有序列(RADA)2 的八肽偶聯以提供所述肽(RADA)4 ；通過使具有序列RADA的四肽在液相中偶聯來製備所述八肽；在液相中製備得到具有所述序列RADA的所述四肽。
所述八肽是片段FRAG2。
FRAG2和(RADA)4 是在液相中製備，即通過LPPS製備。
具有所述序列RADA的所述四肽是片段FRAG1。
FRAG1是在液相中製備，即通過LPPS製備。
較佳地，任意偶聯是在液相中進行的，即通過LPPS進行的。這意味著在任意偶聯中不使用固相偶聯，即不使用SPPS。
較佳地，通過逐步偶聯單個氨基酸來製備FRAG1；更較佳地，所述逐步偶聯以D與所述C-末端A的偶聯來提供DA為起始，然後第二個A與所述DA偶聯以提供ADA，最後所述N-末端R與所述ADA偶聯以提供RADA。
在本發明和本說明書的定義範圍內，除非另外明確指明，否則每當在肽中的氨基酸或氨基酸殘基用其一個字母代碼表示時，則在肽中的氨基酸或氨基酸殘基的任意側鏈，氨基酸的任意α氨基殘基，氨基酸的任意COOH殘基，肽的任意N-末端NH2 殘基和肽的任意C-末端COOH殘基可以是保護的或未保護的。
在本發明和本說明書的定義範圍內，術語片段是指從(RADA)4 的碎片衍生的肽。
較佳地，任意Asp以其側鏈保護形式Asp(OBzl)被使用。
較佳地，任意Arg僅以未保護側鏈的形式被使用或者任意Arg僅以其側鏈保護形式Arg(NO2 ) 被使用；因此，更佳地，通過本發明的所述方法提供(Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala)4 ，或通過本發明所述方法提供(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)4 。
甚至更佳地，任意Arg僅以未保護側鏈的形式被使用，因此，通過本發明所述方法提供(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)4 。
較佳地，在5°C以下（較佳在3°C以下）的溫度進行所述四肽的偶聯以提供(RADA)2 。
較佳地，在Arg僅以未保護側鏈的形式被使用的情況下，則在5°C以下（較佳在3°C以下）的溫度進行所述八肽的偶聯以提供(RADA)4 。
更較佳地，在5°C以下（較佳在3°C以下）的溫度進行所述八肽的偶聯以提供(RADA)4 。
較佳地，在任何偶聯期間N-末端α氨基殘基的任意保護是通過使用Boc或Ac進行的。
較佳地，在任何偶聯期間C-末端COOH殘基的任意保護是以烯丙基酯All或以醯胺C(O)NH2 的形式進行的。
較佳地，所述肽(RADA)4 是以肽PEP-AC-NH2的形式提供的；PEP-AC-NH2是Ac-(RADA)4 -NH2 ；也就是說，其N-末端α氨基殘基經Ac保護，以及其C-末端COOH為醯胺C(O)NH2 的形式。
較佳地，所述方法包括步驟STEPB；在步驟STEPB中，通過片段FRAG2-AC-OH與片段FRAG2-H-NH2偶聯來製備所述PEP-AC-NH2；FRAG2-AC-OH是Ac-(RADA)2 -OH；FRAG2-H-NH2是H-(RADA)2 -NH2 。
FRAG2-AC-OH和FRAG2-H-NH2是FRAG2的實施方式。
較佳地，所述方法包括步驟STEPA1；在STEPA1中，製備所述FRAG2-H-NH2；STEPA1包括片段FRAGA1-Boc-OH與片段FRAGA1-H-NH2偶聯，隨後裂解N-末端Boc殘基；FRAGA1-Boc-OH是Boc-RADA-OH，FRAGA1-H-NH2是H-RADA-NH2 。
較佳地，所述方法包括步驟STEPA2；在STEPA2中，製備所述FRAG2-AC-OH；STEPA2包括片段FRAGA2-Ac-OH與片段FRAGA2-H-OAll偶聯，以及包括隨後裂解所述C-末端All殘基；FRAGA2-Ac-OH是Ac-RADA-OH；FRAGA2-H-OAll是H-RADA-OAll。
FRAGA1-Boc-OH、FRAGA1-H-NH2、FRAGA2-Ac-OH和FRAGA2-H-OAll是FRAG1的實施方式。
較佳地，對於FRAG1的製備，即對於具有序列RADA的所述四肽的製備，所述三個氨基酸R、A和D被用作為Boc-Ala-OH、Boc-Asp(OBzl)-OH和Boc-Arg(NO2 )-OH；或者被用作為Boc-Ala-OH、Boc-Asp(OBzl)-OH和Boc-Arg-OH。
較佳地，Boc-Arg-OH以Boc-Arg-OH.HCl.H2 O的形式被使用。
FRAG1用作為本發明所述方法的中間體，其另一較佳實施方式是Boc-RADA-OAll；尤其是Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的形式或Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的形式。
較佳地，在所述八肽的偶聯之後，即在STEPB之後，進行任意側鏈保護基的裂解。
較佳地，通過催化氫化裂解Arg的任意NO2 保護基和Asp的Bzl保護基。催化氫化可通過以下實現：元素氫，或合適的氫供體，例如甲酸、甲酸銨、1,3-環己二烯、1,4-環己二烯或硼烷加合物（例如硼烷叔丁胺（tert-BuNH2 .BH3 ））。合適的氫化催化劑為例如基於貴金屬的氫化催化劑，尤其是已知為鉑族金屬的金屬，即，銠、釕、鈀、鋨、銥和鉑。便利地，所述氫化催化劑是在諸如炭之類的載體之上。
尤其是，NO2 和Bzl的裂解是同時進行的。
尤其是，使用催化劑Pd/C進行NO2 和Bzl的裂解。
尤其是，在作為溶劑的TFA、甲酸或其混合物中（更特別是在TFA中）進行NO2 和Bzl的裂解。
較佳地，在大氣壓或高於大氣壓下進行NO2 和Bzl的裂解。壓力通常為1-100 巴，較佳1-70巴，更佳1-10巴。
較佳地，NO2 和Bzl的裂解的反應溫度是-20至70°C；更佳地為0 至60°C，甚至更佳地為10至40°C。
較佳地，NO2 和Bzl的裂解的反應時間是1至6小時，更佳地為1至5小時。
較佳地，All用作為需要保護其COOH殘基的任意Ala 的C-末端保護基，以及用作為任意FRAG1或FRAG2的任意C-末端Ala的C-末端保護基。
較佳地，All連接至需要保護的所述COOH殘基，所述連接是通過在該COOH殘基和烯丙基供體之間的反應REACALL得以實現的，該烯丙基供體較佳為3-溴丙烯。
較佳地，所述烯丙基供體的摩爾量是所述COOH殘基的摩爾量的1至2倍。
較佳地，在鹼的存在下，較佳在K2 CO3 的存在下，進行REACALL。
較佳地，所述鹼的摩爾量是所述COOH殘基的摩爾量的1至2倍。
較佳地，在溶劑中，較佳在DMF中，進行REACALL。
較佳地，在大氣壓下進行REACALL。
較佳地，REACALL的反應溫度是-20至70°C，更佳為-15至60°C。
較佳地，REACALL的反應時間是1至48小時。
較佳地，利用採用催化劑Pd(PPh3 )4 的反應CLEAVALL實施All的任意裂解。
較佳地，Pd(PPh3 )4 的摩爾量是所述All殘基的摩爾量的0.01至0.05倍。
可在添加劑ADDALL的存在下，進行CLEAVALL，所述ADDALL選自由以下組成的組：嗎啉、1,3-二甲基巴比妥酸、吡咯烷、三苯基膦、雙甲酮及其混合物。
較佳地，ADDALL的摩爾量是所述All殘基的摩爾量的2至7倍。
較佳地，可在可溶解所述反應物的任意惰性溶劑中進行CLEAVALL。用於CLEAVALL的較佳溶劑是二甲亞碸(DMSO)，二氧六環，四氫呋喃類（例如四氫呋喃(THF)或甲基四氫呋喃（甲基-THF）），1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N,N-二甲基甲醯胺(DMF)，N,N-二甲基乙醯胺(DMA)，二氯甲烷(DCM)，乙酸乙酯，乙腈或其任意混合物。
更佳地，在DMF、乙腈或二氧六環中進行CLEAVALL。
較佳地，在大氣壓下進行CLEAVALL。
較佳地，CLEAVALL的反應溫度為-20至70°C；更佳為-15至60°C。
較佳地，CLEAVALL的反應時間為1至48小時。
較佳地，通過HPLC監控REACALL和CLEAVALL的過程，從而確定必要的反應時間。
較佳地，Boc用作為N-末端保護基。
利用反應CLEAVBOC進行N-末端Boc殘基的任意裂解。可使用肽合成領域中已知的反應條件進行CLEAVBOC。較佳地，通過酸實現裂解，所述酸較佳為三氟乙酸或HCl，所述酸在TFA的情況下可以單獨使用，或者作為與惰性溶劑的混合物使用，或者在HCl的情況下作為氣體使用；所述惰性溶劑為例如甲苯或二氧六環或其混合物。
通常，在溶劑中進行CLEAVBOC，所述溶劑可以是不干擾所述反應物的任意溶劑，例如是氯化的烴，例如二氯甲烷或二氯乙烷；芳烴，例如甲苯；醚，例如THF或二氧六環；或其任意混合物。
較佳地，在甲苯或二氧六環中進行CLEAVBOC。
較佳地，在大氣壓下進行CLEAVBOC。
較佳地，CLEAVBOC的反應溫度是-20至70°C；更佳地是-15至60°C。
較佳地，CLEAVBOC的反應時間是0.5至12小時。
較佳地，通過HPLC監控CLEAVBOC的過程，從而確定必要的反應時間。
較佳地，可以使用肽合成領域中已知的反應條件進行任意偶聯，所述任意偶聯包括提供FRAG1的單個氨基酸的逐步偶聯，或者提供所述八肽的所述四肽的偶聯，或者所述八肽的偶聯。
較佳地，用於所述偶聯的原位偶聯試劑為例如鏻偶聯試劑或脲鎓偶聯試劑或碳化二亞胺偶聯試劑，所述鏻偶聯試劑或脲鎓偶聯試劑為例如苯並三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)，苯並三唑-1-基氧基-三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)，O-(苯並三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)，O-(6-氯苯並三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HCTU)，O-(6-氯苯並三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU)，O-(7-氮雜苯並三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)，O-(7-氮雜苯並三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TATU)，O-(苯並三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)，O-[氰基(乙氧基羰基) 亞甲基氨基]-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TOTU)和(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亞乙基氨基氧基)二甲基氨基-嗎啉-碳鎓六氟磷酸鹽 (COMU)；所述碳化二亞胺偶聯試劑為例如二異丙基碳二亞胺(DIC)，二環己基碳二亞胺(DCC)和水溶性碳化二亞胺類(WSCDI)，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，任選為例如鹽酸鹽之類的鹽的形式。
其它偶聯技術使用預先製備的活性酯（例如N-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)和對硝基苯酚(HONp)酯），預先製備的對稱酸酐，不對稱的酸酐（例如N-羧基酸酐(NCAs)）和醯鹵（例如醯基氟或醯氯）。
較佳的偶聯試劑是碳化二亞胺偶聯試劑和鏻偶聯試劑，最佳的偶聯試劑選自PyBOP、DCC、DIC和EDC；更佳地，偶聯試劑是PyBOP、DCC或EDC。
較佳地，EDC作為鹽被使用，更佳地，作為EDC.HCl被使用。
較佳地，偶聯試劑的摩爾量是所述底物（例如分別為待偶聯的AA或片段）的摩爾量的1至10倍，更佳為1至5倍。
可在堿的存在下進行任意偶聯，所述堿較佳為叔胺鹼，其對在所述偶聯中的所述羧酸部分的COOH殘基進行去質子化並且中和所述偶聯中的所述氨基部分的NH2 殘基的任意抗衡離子，因此促進所述偶聯反應。
合適的鹼為例如三烷基胺，例如N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)；N,N-二烷基苯胺，例如N,N-二乙基苯胺；2,4,6-三烷基吡啶，例如2,4,6-三甲基吡啶；以及N-烷基嗎啉，例如N-甲基嗎啉。
較佳地，在作為鹼的DIPEA的存在下進行偶聯。
較佳地，鹼的摩爾量是所述底物（例如分別為待偶聯的AA或片段）的摩爾量的1至3倍。
由於作為添加劑的輔助親核試劑具有抑制不期望的副反應的積極作用，因此可在作為添加劑的輔助親核試劑的存在下進行任意偶聯。可使用任意已知的輔助親核試劑。
合適的輔助親核試劑的實例是1-羥基苯並三唑(HOBt)，N-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)，N-羥基-3,4-二氫-4-氧代-1,2,3-苯並三嗪(HOOBt)和1-羥基-7-氮雜苯並三唑(HOAt)。
較佳地，HOBt或HOAt用作為輔助親核試劑。
較佳地，輔助親核試劑的摩爾量分別是待偶聯的AA或片段的摩爾量的0.5至3倍。
尤其是，使用DCC/HOBt、EDC/HOBt、PyBOP/HOBt或EDC/HOAt進行任意偶聯。
較佳地，可在能溶解所述反應物的任意惰性溶劑中進行任意偶聯。用於所述偶聯的較佳溶劑是水混溶性溶劑，和與水不混溶的溶劑以及水混溶性溶劑和與水不混溶的溶劑之間的任意合適的混合物，包括具有水的混合物，所述水混溶性溶劑為例如二甲亞碸(DMSO)，二氧六環，四氫呋喃類（例如四氫呋喃(THF)或甲基四氫呋喃（甲基-THF）），1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，N,N-二甲基甲醯胺(DMF)，N,N-二甲基乙醯胺(DMA)，或其任意混合物；所述與水不混溶的溶劑為例如二氯甲烷(DCM)，乙酸乙酯或其任意混合物。
更佳地，在選自二氯甲烷、甲基-THF、DMF、NMP和其混合物的溶劑中進行偶聯。
較佳地，在大氣壓下進行所述偶聯。
較佳地，所述偶聯的反應溫度是-20至70°C，更佳地為-15至40°C，甚至更佳地為-15至30°C。
較佳地，所述偶聯的反應時間為1至48小時。
較佳地，通過HPLC監控所述偶聯的過程，從而確定必要的反應時間。
在本發明的意義上，所述C-末端COOH殘基或氨基酸的所述COOH殘基的任意醯胺化也是偶聯，其是所述C-末端COOH殘基和銨供體之間的偶聯。因此，描述用於偶聯的所有實施方式也適用於所述醯胺化。
較佳地，所述銨供體是NH3 或其鹽，例如其鹽酸鹽、乙酸鹽或三氟乙酸鹽。
較佳地，所述銨供體是NH4 Cl或NH4 OAc。
較佳地，銨供體的摩爾量是待醯胺化的所述COOH殘基的摩爾量的3至7倍。
較佳地，採用EDC/HOBt或EDC/HOAt進行醯胺化。
較佳地，在N-末端NH2 殘基上或氨基酸的α氨基殘基上的Ac通過反應ACETYLA引入，其中所述N-末端NH2 與乙醯基供體發生反應。
所述乙醯基供體可以是乙酸酐或乙酸。
較佳地，乙醯基供體的摩爾量是待乙醯化的氨基殘基的摩爾量的1至2倍。
在本發明的意義上，在乙酸的情況下，ACETYLA實際上也是偶聯，其是N-末端NH2 殘基或氨基酸的α氨基殘基與乙酸的COOH殘基之間的偶聯。因此，描述用於偶聯的所有實施方式也適用於ACETYLA。
較佳地，使用EDC/HOBt 或EDC/HOAt，更佳使用EDC/HOBt，進行ACETYLA。
較佳地，在鹼的存在下，較佳在二異丙基乙基胺的存在下，進行ACETYLA。
較佳地，在溶劑中，較佳在DMF或CAN中，進行ACETYLA。
較佳地，在大氣壓下進行ACETYLA。
較佳地，ACETYLA的反應溫度為-20至70°C，更佳為-15至60°C，甚至更佳為-10至40°C。
較佳地，ACETYLA的反應時間為1至48小時，更佳為1至12小時。
較佳地，通過HPLC監控ACETYLA的過程，從而確定必要的反應時間。
RADA-16，當其在任意側鏈保護基團裂解之後，以粗品形式得到時，可通過本領域技術人員已知的常規方法純化，例如通過HPLC純化。
較佳地，在任意側鏈保護基團裂解之後獲得的RADA-16為TFA鹽。如果期望的是鹽酸鹽或不同的鹽，則可採用本領域技術人員已知的常規的鹽交換方法。
較佳地，採用MeOH或EtOH作為移動相之一進行任意純化或鹽交換。
在通式方案1、2、3和4中示出了以Arg的側鏈保護形式Arg(NO2 )採用Arg製備Ac-[Arg-Ala-Asp-Ala]4 -NH2 .TFA的較佳路線。
通式方案1。
通式方案2。
通式方案3。
通式方案4。
在通式方案A、B、C和D中示出了採用側鏈未保護的Arg製備Ac-[Arg-Ala-Asp-Ala]4 -NH2 .TFA的較佳路線。
通式方案A。
通式方案B。
通式方案C。
通式方案D。 實施例
材料
Boc-Ala-OH、Boc-Asp(OBzl)-OH和Boc-Arg(NO2 )-OH以及Boc-Arg-OH.HCl.H2 O購自GL Biochem。
Pd(PPh3 )4 購自Alfa Aesar。
Pd/C購自Johnson Matthey；產品型號A109047-5。
方法
通過HPLC進行純度的確定。
用於程序控制(IPC)和中間體的HPLC條件 儀器：Waters 2695或協作性 VWD HPLC 柱：Nucleosil 100-5 C18, 250mm×4.6mm,5µm 移動相： A=0.1% TFA的水溶液 B=0.1% TFA 的乙腈溶液 波長: 215nm 流速: 1.0mL/Min 溫度: 15-25°C 檢測器: Waters 2996 梯度:在20分鐘內從5%的B至85%的B，然後保持5分鐘。
用於最終粗製肽的HPLC條件 儀器：Waters 2695或協作性 VWD HPLC 柱：Nucleosil 100-5 C18, 250mm×4.6mm,5µm 移動相： A=0.1% TFA的水溶液 B=0.1% TFA的乙腈溶液 波長: 215nm 流速: 1.0mL/Min 溫度: 15-25°C 檢測器: Waters 2996 梯度:在25分鐘內從5%的B至40%的B，然後保持5分鐘。
實施例1至4顯示了採用NO2 -保護的Arg作為起始原料合成Ac-[Arg-Ala-Asp-Ala]4 -NH2 .TFA。
實施例5和6顯示了採用未保護的Arg作為起始原料合成Ac-[Arg-Ala-Asp-Ala]4 -NH2 .TFA。
實施例7顯示了純化和TFA交換為HCl。 實施例1
根據通式方案1合成片段Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll。
1(1)Boc-Ala-OAll的合成 Boc-Ala-OH+ Br-CH2 -CH=CH2 -＞ Boc-Ala-OAll
在25 °C向DMF (0.61 kg)和Boc-Ala-OH (1.0當量, 0.122 kg)的混合物添加K2 CO3 (0.134 kg,1.50 當量)。在25 °C攪拌0.5小時後，逐滴加入3-溴丙烯(0.122 kg,1.56當量)，同時溫度保持在25±5 °C。在約3小時之後，根據HPLC監控所顯示的，反應完成。然後過濾反應混合物。濕濾餅經乙酸乙酯洗滌兩次（每次0.73 kg，總共1.46 kg）。濾液和洗滌溶液合併，並與去離子水混合(1.46 kg)，所得混合物經乙酸乙酯萃取三次(每次0.61 kg，總共1.83 kg)。合併所有有機相，並用飽和鹽水洗滌兩次(每次0.14 kg，總共0.28 kg)。有機相經無水MgSO4 (0.061 kg)乾燥1小時，然後過濾經乾燥的有機相，且濕濾餅用乙酸乙酯洗滌兩次(每次0.61 kg，總共1.22 kg)。合併濾液和洗滌溶液，並在40±5 °C真空濃縮，然後與二氧六環兩次(每次0.122 kg，總共0.244 kg)真空共沸蒸餾，得到濃縮油狀的產物Boc-Ala-OAll，其用於下一步驟。HPLC純度：94.3%。
Boc-Ala-OAll是式（1）化合物。。
1(2)HCl.H-Ala-OAll的合成 Boc-Ala-OAll   +   HCl 氣體  -＞   HCl.H-Ala-OAll
包含Boc-Ala-OAll的濃縮油用二氧六環(620 ml)稀釋。向所述混合物通過鼓泡加入HCl 氣體(186 g)，同時溫度保持在20±5°C。1小時後，真空蒸發反應混合物，然後所述殘餘物通過接連與二氧六環(120 ml)和乙酸乙酯(120 ml)共沸蒸餾來乾燥。分離的HCl.H-Ala-OAll成油狀，並直接用於下一個與Boc-Asp(OBzl)-OH的偶聯步驟。
1(3)  Boc-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 Boc-Asp(OBzl)-OH  +   HCl.H-Ala-OAll   + DCC/HOBt -＞  Boc-Asp(OBzl)-Ala-Oall
在0 °C，包含HCl.H-Ala-OAll(200 g, 1.00當量)的油狀物用在二氯甲烷(1000 ml)中的二異丙基乙基胺(91.7 g，相比於Boc-Ala-OH，為1.10當量)混合物和13wt%的鹽水(600 ml)中和。有機相經無水MgSO4 (100 g)乾燥。1小時後，過濾混合物，且濕濾餅用二氯甲烷洗滌兩次(每次70 ml ，總共140 ml)。合併濾液和洗滌溶液。連續加入Boc-Asp(OBzl)-OH (175 g, 0.84當量)和 HOBt.H2 O (83 g, 1.00當量)。然後加入在二氯甲烷(400 ml)中的DCC(111 g, 1.00當量)的溶液，同時溫度保持在–6°C±5°C。在–6°C±5°C攪拌混合物1小時，然後溫熱至20°C。在20 °C攪拌大約1小時後，根據HPLC監控顯示的，反應完成。然後過濾反應混合物。然後濾液接連用5wt% NaHCO3 水溶液洗滌兩次(每次600 ml，總共1200 ml)，用10wt% KHSO4 水溶液洗滌兩次(每次600 ml，總共1200 ml)，用20wt%鹽水洗滌兩次(每次600 ml，總共1200 ml)。然後在夾套溫度40°C± 5°C真空濃縮所述有機相，並與二氧六環兩次(每次400 ml，總共800 ml)共沸蒸餾進行乾燥，得到油狀物，其用於下一步驟。
HPLC純度：92.28%。
1(4)  HCl.H-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 Boc-Asp(OBzl)-Ala-OAll   +  HCl氣體 -＞   HCl.H-Asp(OBzl)-Ala-OAll
包含Boc-Asp(OBzl)-Ala-OAll的油用二氧六環(500 ml)稀釋。向所述混合物通過鼓泡加入HCl 氣體(225 g)，同時溫度保持在20±5°C。1小時後，真空蒸發反應混合物，然後所述殘餘物通過與二氧六環兩次(每次150 ml，總共300 ml)共沸蒸餾進行乾燥。油狀殘餘物直接用於下一個偶聯步驟。
1(5)  Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 DCC/HOBt Boc-Ala   +   HCl.H-Asp(OBzl)-Ala-OAll   -＞   Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
在0 °C，包含HCl.H-Asp(OBzl)-Ala-OAll(148 g, 1.0當量)的油狀殘餘物用在二氯甲烷(750 ml)中的二異丙基乙基胺(59 g，1.10當量)和13wt%的鹽水(450 ml)中和。有機相經無水MgSO4 (75 g)乾燥。1小時後，過濾除去固體，且濕濾餅用二氯甲烷洗滌兩次(每次55 ml ，總共110 ml)。合併濾液和洗滌溶液。向H-Asp(OBzl)-Ala-OAll二氯甲烷溶液連續加入Boc-Ala-OH (78 g, 1當量)和 HOBt.H2 O (63 g, 1.00當量)。然後緩慢加入在二氯甲烷(320 ml)中的DCC(102 g, 1.20當量)的溶液，同時溫度保持在–6°C±5°C。在–6°C±5°C攪拌混合物1小時，然後溫熱至20°C。在約8小時後，根據HPLC監控顯示的，偶聯完成。然後過濾除去鹽和產生的DCU。濾液接連用5wt% NaHCO3 洗滌兩次(每次450 ml，總共900 ml)，用10wt% KHSO4 洗滌兩次(每次450 ml，總共900 ml)，用20wt%鹽水洗滌兩次(每次450 ml，總共900 ml)。然後所述有機相在夾套溫度40°C± 5°C真空濃縮，並與二氧六環兩次(每次300 ml，總共600 ml)共沸蒸餾進行乾燥，得到油狀物，其直接用於下一個脫保護步驟。
HPLC純度：93.3%。
1(6)  HCl.H-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 HCl氣體 Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll   -＞   HCl.H-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
包含Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll(14 g, 1.00當量)的油用二氧六環(100 ml)溶解。向所述混合物通過鼓泡加入HCl 氣體(21.0 g)，同時溫度保持在20±5°C。1小時後，真空蒸發反應混合物，然後所述殘餘物通過與二氧六環兩次(每次14 ml，總共28 ml)共沸蒸餾進行乾燥。油狀產物直接用於下一個與Boc-Arg(NO2 )-OH的偶聯反應。
1(7)  Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 Boc-Arg(NO2 )-OH + HCl.H-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll   DCC / HOBt -＞Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
在0 °C，包含HCl.H-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll(116g, 1.00當量)的油狀產物用在甲基-THF (1080 ml)中的二異丙基乙基胺(39.7 ml，1.10當量)和13wt%的鹽水(300 ml)中和。有機相經無水MgSO4 (58 g)乾燥。1小時後，過濾除去固體，且濕濾餅用甲基-THF洗滌兩次(每次70 ml ，總共140 ml)。合併濾液和洗滌溶液。向在甲基-THF溶液中的H-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll連續加入Boc-Arg(NO2 )-OH (86 g, 1 當量)和HOBt.H2 O (41.4 g, 1.00 當量)。然後緩慢加入在DMF (120 ml)和甲基-THF(270 ml)中的DCC(61 g, 1.10 當量)溶液，同時溫度保持在–6°C±5°C。在–6°C±5°C攪拌混合物1小時，然後溫熱至20°C。在20 °C約2小時後，根據HPLC監控顯示的，偶聯完成。過濾除去鹽和產生的DCU。濾液接連用5wt% NaHCO3 洗滌兩次(每次220 ml，總共440 ml)，用10wt% KHSO4 水溶液洗滌兩次(每次220 ml，總共440 ml)，用20wt%鹽水洗滌兩次(每次220 ml，總共440 ml)。然後在夾套溫度40°C± 5°C真空濃縮所述有機相，直至獲得油狀殘餘物。然後加熱所述油狀殘餘物至50±5°C，在1小時內逐滴加入二異丙基醚(200 ml)，接著在1小時內添加二異丙基醚(200 ml)和甲基-THF(330 ml)的混合物。在添加混合溶劑之後，在1小時內將懸浮液冷卻至35±5°C。然後攪拌所述懸浮液1小時並過濾。用二異丙基醚洗滌濕濾餅三次(每次480 ml，總共1440 ml)。在35 ±5 °C真空乾燥濕濾餅。
純度：92.2% 。
整體收率（Global yield）：28%。 實施例2
根據通式方案2，使用片段Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll來合成TFA.H-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 ，其是所述目標產物的保護的C-末端二聚體。
2(1)  Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH的合成 Pd(PPh3 )4 Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
在20±5°C，將根據實施例1(7)製備的Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (40 g, 1.00當量)溶於DMF (160 ml)和乙腈 (100 ml)中。然後一次性全部加入嗎啉(24.7 g, 5.00當量)。向所述混合物通過鼓泡加入N2 以驅除所述混合物中的殘餘氧氣。0.5小時後，加入Pd(PPh3 )4 (1.3, 0.02當量)。在N2 氣氛下攪拌所述混合物。大約1小時後，根據HPLC監控顯示的，反應完成。有機混合物接連用10% KHSO4 水溶液洗滌三次(每次80 ml，總共240 ml)，用20%鹽水洗滌兩次(每次80 ml，總共160 ml)。然後所述有機相在夾套溫度40±5°C真空濃縮，並通過與乙腈(100 ml)共沸蒸餾進行乾燥，得到油狀物。
所述油狀物分別用於步驟(2)和步驟(2a)。
2(2)  Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 的合成 Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH  -＞ Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2
在20±5°C，將根據實施例2(1)製備的包含Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH(21.5 g, 1.00當量)的油狀物溶於DMF (80 ml)和乙腈 (50 ml)中。連續加入乙酸銨(12.4 g, 5.00當量)、HOBt.H2 O (4.9 g, 1.00當量)和EDC.HCl (8 g, 1.3當量)。在20 °C攪拌約24小時後，根據HPLC監控顯示的，醯胺化反應完成。在55 ±5°C真空濃縮反應混合物，得到油狀殘餘物，其溶於甲基-THF (250 ml)。該溶液接連用5% NaHCO3 洗滌兩次(每次45 ml ，總共90 ml)，用10% KHSO4 水溶液洗滌兩次(每次45 ml ，總共90 ml)，用20%鹽水洗滌兩次(每次45 ml ，總共90 ml)。然後在夾套溫度40°C± 5°C真空濃縮有機相，得到油狀殘餘物。加入DMF (45 ml)溶解所述殘餘物，並將混合物加熱至50±5°C。加入二異丙基醚(120 ml)和乙酸乙酯(270 ml)的混合物，同時溫度保持在50±5°C。得到的懸浮液在2小時內被冷卻至10±5°C，並攪拌1小時，過濾。濕濾餅用二異丙基醚洗滌三次(一次使用60 ml, 兩次使用180 ml)。在35±5°C真空乾燥濕濾餅。
純度：94.7%。
收率：38%。
2(3)  HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 的合成 Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 -＞  HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2
將根據實施例2(2)製備的Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 (14.3 g, 1當量)與二氧六環(150 ml)混合。向所述混合物通過鼓泡加入HCl 氣體(21.5 g)，同時溫度保持在20±5°C。1小時後，丟棄上清液，且剩餘的油狀殘餘物被蒸發，以及經過與二氧六環兩次(每次15 ml，總共30 ml)共沸蒸餾進行乾燥。
2(4)   Boc-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 的合成 Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH + HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 EDC/HOBt           -＞Boc-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2
在20±5°C，將根據實施例2(3)製備的HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 (2.3 g, 1.00 當量)溶於DMF (15 ml)中。連續加入二異丙基乙基胺(0.9 ml, 1.4當量)、HOBt.H2 O (0.9 g, 0.9 當量)和根據實施例1(1a)製備的Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (2.3 g, 0.9 當量)。然後將混合物冷卻至0°C，加入EDC.HCl (1.1 g, 1.5當量)。使反應混合物達到室溫(20 °C)，並攪拌約20小時以達到完全偶聯。在55 ±5°C真空濃縮反應混合物，直到收集7 ml的蒸餾液。然後在20±5°C將殘餘物傾倒入2wt%NaHCO3 水溶液 (35 ml)。然後將形成的懸浮液過濾，用去離子水洗滌濕濾餅三次(每次5 ml，總共 15 ml)。在35 ±5°C真空乾燥濕濾餅。
純度：83%。
收率：71%。
2(5)  TFA.H-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 的合成 TFA/甲苯 Boc-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 -＞TFA.H-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2
在20± 5°C，將根據實施例2(4)製備的Boc-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 (2 g, 1.00當量)與甲苯(12 ml)混合。向所述混合物逐滴加入TFA (8 ml)，同時溫度保持在20±5°C。1小時後，在1小時內加入二異丙基醚(40 ml)，然後將產生的懸浮液過濾，濕濾餅用二異丙基醚洗滌三次(每次5 ml，總共15 ml)。在35±5 °C真空乾燥濕濾餅。
純度：85.7% 。
收率：100 % 。 實施例3
根據通式方案3，使用片段Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll合成Ac-(RADA)2 -OH，其是所述目標產物的保護的N-末端二聚體。
3(1)  HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞ HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
將根據實施例1(7)製備的Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (10 g, 1當量)與二氧六環(100 ml)混合。向所述混合物通過鼓泡加入HCl 氣體(15 g)，同時溫度保持在20±5°C。1小時後，反應完成。丟棄上清液，且剩餘的油狀殘餘物被蒸發，以及經過與二氧六環真空下兩次(每次10 ml，總共20 ml)共沸蒸餾進行乾燥。直接使用所述油狀殘餘物。
3(2)  Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 Ac2 O HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞ Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
在20±5°C，將包含HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的油狀殘餘物 (11 g, 1.00 當量)溶於DMF (55 ml)中，並冷卻溶液至0±5°C。連續加入二異丙基乙基胺(3.2 g, 1.40 當量)和乙酸酐(4.1 g, 1.40 當量)，同時溫度保持在0±5°C。添加乙酸酐之後，溫熱反應混合物至20±5°C。根據HPLC監控顯示的，通常該反應在20 °C在3小時內完成。反應混合物直接用於下一步驟。
3(3)   Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH的合成 Pd(PPh3 )4 Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞   Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
在20±5°C，向包含Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (10 g, 1 當量)的反應混合物加入嗎啉(6.7 g, 5.00當量)。在0.5小時期間，使N2 鼓泡通過所述溶液，以除去痕量的氧氣。加入Pd(PPh3 )4 (0.35 g g, 0.02當量)。在N2 氣氛下攪拌反應混合物約2小時。在55±5 °C真空濃縮反應混合物，直至保持約25 ml的殘餘物。在20±5°C加入甲基-THF(120 ml)以溶解所述殘餘物，然後溶液用10wt% KHSO4 水溶液 (30 ml)洗滌。水相用甲基-THF萃取兩次(每次25 ml，總共50 ml)。合併所有有機相，並在40±5 °C真空濃縮，直至獲得約80 ml的殘餘物。加入乙酸乙酯(60 ml)，並將懸浮液在1小時內冷卻至10±5°C。過濾所述懸浮液。濾餅接連用乙酸乙酯洗滌兩次(每次40 ml ，總共80 ml)，和用二異丙基醚(40 ml)洗滌。在35±5 °C真空乾燥濕濾餅。
純度：96.1% 。
所述3個步驟3(1)、3(2) 和3(3)的整體收率：71%。
3(4)  Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OAll的合成 Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH + HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll   EDC/HOBt -＞Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OAll
在20±5°C，將根據實施例3(1)製備的包含HCl.H-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (6.3 g, 1.00 當量)的油狀殘餘物溶於0.4 M LiCl在DMF (42 ml)中的混合物中。連續加入二異丙基乙基胺(1.5 g, 1.20當量)、HOBt.H2 O (1.6 g, 1.00 當量)和根據實施例3(3)製備的Ac-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (6 g, 1.00 當量)。然後將混合物冷卻至0°C，並加入EDC.HCl (2.3 g, 1.2當量)。溫熱反應混合物至20 °C，並攪拌約4小時，直至根據HPLC監控顯示的反應完成。反應混合物在55±5 °C真空濃縮，直至收集18 ml的蒸餾液。然後在20±5°C將殘餘物傾倒入2% NaHCO3水溶液(90 ml)。然後將形成的懸浮液過濾。濾餅接連用水洗滌兩次(每次12 ml ，總共24 ml)，用乙酸乙酯洗滌兩次(每次15 ml ，總共 30 ml)。在35±5 °C真空乾燥濕濾餅。
純度：82.1% 。
收率：83% 。
3(5)  Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OH的合成 Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OAll -＞ Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OH
在20±5°C，將根據實施例3(4)製備的Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OAll (6.3 g, 1.00當量)溶於DMF (80 ml)中，然後添加1,3-二甲基巴比妥酸(2.5 g, 3.00當量)。在0.5小時期間將N2 鼓泡通過所述溶液，以除去氧氣。加入Pd(PPh3 )4 (0.1 g, 0.02當量)。在約2小時期間在N2 氣氛下攪拌反應混合物，直至如HPLC監控顯示的反應完成。在55±5°C真空濃縮反應混合物，直至殘餘體積為約25 ml。加入去離子水(100 ml)，以促使沉澱。將產生的懸浮液過濾。濕濾餅接連用去離子水洗滌兩次(每次20 ml ，總共40 ml)，以及用乙酸乙酯洗滌三次(每次25 ml，總共75 ml)。在35±5 °C真空乾燥濕濾餅。
純度：85.2% 。
收率：72% 。 實施例4
根據通式方案4將所述保護的N-末端和C-末端二聚體連接並通過催化氫化脫保護，以製備Ac-[Arg-Ala-Asp-Ala]4 -NH2 .TFA。
4(1)  Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]4 -NH2 的合成 Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OH +  TFA.H-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 -＞Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]4 -NH2
在20±5°C，將根據實施例2(5)製備的TFA.H-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 (0.2 g, 1.00 當量)溶於NMP (3 ml)中。連續加入二異丙基乙基胺(0.065 ml, 2.30 當量)、HOBt.H2 O (0.026 g, 1.00 當量)、根據實施例3(5)製備的 Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -OH (0.188 g, 1.00 當量)以及PyBOP (0.128 g, 1.50當量)。在20 °C攪拌約40小時後，根據HPLC監控顯示的，反應完成。在55±5 °C真空濃縮反應混合物，直至收集0.6 ml蒸餾液。然後在20±5°C將殘餘物傾倒入2wt% NaHCO3 水溶液 (3 ml)。將產生的懸浮液過濾，且濾餅接連用去離子水洗滌兩次(每次0.4 ml ，總共0.8 ml)，以及用乙酸乙酯洗滌兩次(每次0.4 ml ，總共0.8 ml)。在35±5 °C真空乾燥濕濾餅。
純度：68% 。
收率：78% 。
4(2)  Ac-[Arg-Ala-Asp-Ala]4 -NH2 作為粗製TFA鹽的合成 Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]4 -NH2 -＞   Ac-[Arg-Ala-Asp-Ala]4 -NH2 .TFA
在20±5°C，在燒瓶中將根據實施例4(2)製備的Ac-[Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala]4 -NH2 (0.5 g, 1.00當量)溶於TFA (5 ml)中，然後添加Pd/C (負載量: 5wt%, 含水量: 53wt%) (0.71 g)。在20±5°C，所述燒瓶被排空並用H2 再次填充三次，然後用1.1 個大氣壓的H2 加壓。在攪拌約2小時之後，根據HPLC監控顯示的，反應完成。然後通過矽藻土過濾反應混合物，以除去Pd/C顆粒。加入TFA (3 ml)以洗滌所述濕的矽藻土濾餅。合併TFA濾液，並在45±5 °C真空濃縮，直至殘留體積為約2ml。在20±5°C將殘餘物傾倒入二異丙基醚(7 ml)。將產生的懸浮液過濾。濾餅用二異丙基醚洗滌三次(每次1.5 ml，總共4.5 ml)，並在35±5 °C真空乾燥。
純度：58% 。
收率：62% 。 實施例5
根據通式方案A通過逐步組裝合成片段Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (1)。
5(1)  Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 EDC / HOBt Boc-ArgOH   +   HCl.Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞   Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
將根據實施例1(6)製備的包含HCl.H-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (79.5 g, 1.0 當量)的殘餘物溶於DCM (400 ml)中。所述溶液用5wt% NaHCO3 水溶液洗滌。將水相的pH調節至7.5-7.8。然後分離有機相，並在35°C真空濃縮。加入DMF (290 ml)。將得到的溶液冷卻至0°C。然後連續加入HOBt.H2 O (19.9 g, 1.0 當量) 和 Boc-Arg-OH.HCl.H2 O (50.9 g, 1.1當量)。緩慢加入EDC.HCl(49.5 g, 1.3當量)，同時將內部溫度保持在3°C以下。然後在3°C攪拌所述反應混合物2小時。然後在1小時內溫熱所述反應混合物至20°C。在20 °C攪拌約2小時之後，根據HPLC監控所確認的，反應完成。然後在45±5°C在真空下將所述混合物濃縮至油狀殘餘物。加入DCM (360 ml)以稀釋所述油狀殘餘物。所述溶液用20wt% 鹽水洗滌三次 (每次870 ml，總共2610 ml)。在35°C真空濃縮有機相。然後加入DIPE (1850 ml)。在至少2小時期間在室溫攪拌所述混合物，直至所述混合物變成均勻懸浮液。過濾所述混合物。用DIPE (220 ml)洗滌濾餅。在40 °C乾燥濾餅過夜。
粗品收率：92.8% 。
純度：97.7% 。 實施例6：Ac-(RADA)4 -NH2 的合成
根據通式方案B製備片段Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OH。
根據通式方案C製備片段TFA.H-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -NH2 。
根據通式方案D製備片段Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala)4 -NH2 .TFA。
6(1)  TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞   TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
將TFA (150 ml)冷卻至10°C。然後緩慢加入根據實施例5(1)製備的Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (25 g)，同時將溫度保持在20°C以下。然後在20±5°C攪拌所述得到的混合物1小時。然後加入DCM (50 ml)以淬滅該反應。然後在30±5°C真空濃縮所述混合物。使所述殘餘物與ACN (380 ml)共沸蒸餾兩次，以除去大部分的殘餘TFA。將DIPE (240 ml)加入所述殘餘物。在室溫攪拌所述混合物30分鐘。然後倒出上層液相。將DIPE (340 ml)加入殘餘物。在室溫在至少2小時期間攪拌所述混合物，直至所述混合物變成均勻懸浮液。然後過濾所述混合物。用DIPE (68 ml)洗滌濾餅。在40 °C乾燥濾餅過夜。
粗品收率：98.5% 。
純度：96.5% 。
6(2)  Ac-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll的合成 TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll   -＞   Ac-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll
將根據實施例6(1)製備的TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (23.3 g, 1.0 當量)溶於ACN (280 ml)中。將所述溶液冷卻至0°C。然後加入DIPEA (7.4 ml, 1.2 當量)，同時將溫度保持在10°C以下。加入乙酸(2.53 g, 1.2 當量)，然後加入HOBt.H2 O (4.7 g, 1.0 當量)。然後加入EDC.HCl (7.9 g, 1.3 當量)，同時將溫度保持在3°C以下。然後在3°C攪拌所述反應混合物2小時。然後在1小時內溫熱反應混合物至20 °C。在約1小時攪拌之後，根據HPLC監控顯示的，所述反應完成。然後在35±5°C在真空下將所述混合物濃縮成油液。將DCM (230 ml) 和DIPE (230 ml)加入至所述殘餘物。在室溫攪拌所述得到的混合物30分鐘。倒出上層液相。加入DCM (230 ml)以稀釋殘餘物。在室溫在約2小時期間攪拌所述混合物，直至所述混合物變成均勻懸浮液。過濾所述混合物。用DCM (35 ml)洗滌濾餅。在40 °C乾燥濾餅過夜。
粗品收率：109.7% 。
純度：98.24% 。
6(3)  Ac-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH的合成 Ac-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞   Ac-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
將根據實施例6(2)製備的Ac-Arg-Asp(OBzl)-Ala-OAll (25 g, 1.0 當量)溶於DMF (260 ml)中。加入1,3-二甲基-巴比妥酸(19.5 g, 3.0 當量)，然後加入Pd(PPh3 )4 (1.4 g, 0.04 當量)。將得到的混合物脫氣並回填充以氮氣氣氛三次。在20 °C攪拌約3小時之後，根據HPLC監控顯示的，反應完成。然後在45±5°C在真空下將所述混合物濃縮成油液。向所述殘餘物加入DCM (250 ml) 和DIPE (250 ml)。得到的混合物在室溫攪拌30分鐘。倒出上層液相。加入DCM (150 ml)。混合物在室溫攪拌至少2小時，直至混合物變成均勻的懸浮液。過濾溶液。用DCM (40 ml)洗滌濾餅。在40°C乾燥濾餅過夜。
粗品收率：86.1% 。
純度：96.77% 。
6(4)  Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OAll的合成 Ac-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH +   TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞   Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OAll
將根據實施例6(1)製備的TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll (25 g, 1.0 當量)溶於DMF(100 ml)中。將所述溶液冷卻至0°C。然後加入DIPEA (8.1 ml)，同時將溫度保持在10°C以下。加入根據實施例6(3)製備的Ac-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (23 g, 1.0 當量)在DMF(120 ml)中的溶液。然後加入HOBt.H2 O (4.6 g, 1.0 當量)，接著加入EDC.HCl (8.3 g, 2當量)，同時將溫度保持在3°C以下。在0°C攪拌所述混合物2小時。然後在1小時內溫熱混合物至20 °C。在20 °C再攪拌2小時之後，根據HPLC監控顯示的，所述反應完成。然後在45±5°C在真空下濃縮所述混合物。將DCM (240 ml) 和DIPE (270 ml)加入至所述殘餘物。在室溫攪拌所述混合物30分鐘。然後倒出上層澄清液相。再加入DCM (360 ml)至所述殘餘物。在室溫攪拌所述混合物約2小時，直至所述混合物變成均勻懸浮液。過濾所述懸浮液。用DCM (30 ml)洗滌濾餅，並在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：77.0% 。
純度：90.03% 。
6(5)  Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OH的合成 Pd(PPh3 )4 Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OAll -＞ Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OH
將根據實施例6(4)製備的Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OAll (28 g, 1當量)溶於DMF(750 ml)中。連續加入1,3-二甲基-巴比妥酸(11.8 g, 3當量) 和Pd(PPh3 )4 (0.9 g, 0.03當量)。使氮氣鼓泡通過所述溶液，以除去痕量的氧氣。然後在室溫攪拌所述反應混合物3小時，並通過HPLC確認反應的完成。在40±5 °C真空濃縮所述混合物。將DIPE (500 ml)加入至所述殘餘物。在室溫攪拌所述混合物30分鐘。過濾所述混合物。濾餅用DIPE (80 ml)洗滌，並懸浮於DCM (400 ml)中，在室溫攪拌30分鐘。然後過濾所述混合物。濾餅用DCM (40 ml)洗滌，並懸浮於ACN (360 ml)中，在室溫攪拌30分鐘。然後過濾所述混合物。濾餅用ACN (50 ml)洗滌，過濾，並在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：84.4% 。
純度：91.91% 。
6(6)  Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH的合成 Pd(PPh3 )4 Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll -＞   Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH
向根據實施例5(1)製備的Boc-Arg-Asp(OBzl)-Ala-OAll (50 g, 1.0 當量)在二氧六環(780 ml)和DMF(210 ml)中的溶液添加1,3-二甲基-巴比妥酸 (35.5 g, 3.0 當量)。然後加入Pd(PPh3 )4 (3.5 g, 0.04 當量)。將得到的混合物脫氣並回填充以氮氣氣氛三次。然後在室溫攪拌所述混合物3小時，並通過HPLC確認反應的完成。然後在45±5°C在真空下將所述混合物濃縮成油液。向所述殘餘物加入DCM (500 ml) 和DIPE (500 ml)。得到的混合物在室溫攪拌30分鐘。倒出上層液相。加入ACN (500 ml)。混合物在室溫攪拌30分鐘。倒出液相。然後加入ACN (250 ml)。在室溫攪拌所述混合物30分鐘。倒出液相。加入MeOH (650 ml)。攪拌混合物至溶解。過濾溶液。收集濾液，並在35±5°C在真空下濃縮。收集固體，並在40°C乾燥過夜。
粗品收率：86.1% 。
純度：97.4% 。
6(7)  Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 的合成 Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH -＞   Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2
將根據實施例6(6)製備的Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (20 g, 1當量)溶於二氧六環(250 ml) 和乙腈(100 ml)的混合物中。然後加入NH4 Cl (8.6 g, 5 當量)在水(30 ml)中的溶液。將得到的混合物冷卻至5°C。加入HOAt (4.4 g, 1當量)，隨後加入EDC.HCl (37 g, 5當量)。加入期間，溫度保持在10°C以下。然後在5°C攪拌所述混合物2小時。然後在1小時內溫熱所述混合物至20°C。在20°C再攪拌1小時後，HPLC監控顯示反應完成。然後過濾所述混合物。用MeOH (150 ml)洗滌濾餅。收集濾液，並在35±5°C在真空下濃縮。然後將20 wt% 鹽水 (240 ml)加入至所述殘餘物。所述混合物用10wt% MeOH在DCM中的溶液萃取三次(每次980 ml，總共2940 ml)。有機相經MgSO4 (120 g)乾燥3小時。然後過濾所述混合物。收集濾液，並在35±5°C在真空下濃縮。得到的固體在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：121.6% 。
純度：90.18% 。
6(8)  TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 合成 Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 -＞  TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2
在冰浴中冷卻TFA (240 ml)至10°C。然後加入根據實施例6(7)製備的Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 (31.5 g)，同時將溫度保持在20°C以下。然後在20±5°C攪拌所述得到的混合物1小時。然後加入DCM (60 ml)。然後在35±5°C在真空下濃縮所述混合物。將殘餘物溶於乙腈(450 ml)中，並蒸發至乾，以除去大部分殘餘TFA。該殘餘TFA的去除操作再實施一次。將DIPE (300 ml)加入到殘餘物中。在室溫攪拌所述混合物30分鐘。然後倒出上層液相。將DCM (225 ml)加入至殘餘物。在室溫攪拌混合物，直至混合物是均勻懸浮液。然後過濾混合物。濾餅用DCM (45 ml)洗滌，並在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：85.5% 。
純度：89.15% 。
6(9)  Boc-[Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 的合成 Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH + TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 EDC/HOBt -＞            Boc-[Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2
將根據實施例6(8)製備的TFA.H-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-NH2 (17.9 g, 1.0 當量)溶於DMF(160 ml)中，並冷卻至0°C。然後加入DIPEA (6.2 g, 1.5 當量)，同時將溫度保持在10°C以下。加入根據實施例6(6)製備的Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (20.4 g, 1.0 當量)在DMF(160 ml)中的溶液。然後加入HOBt.H2 O(4.3 g, 1.0 當量)，隨後加入EDC.HCl (12.3 g, 2當量)，同時將溫度保持在3°C以下。然後在0°C攪拌所述混合物2小時。然後在1小時內溫熱所述混合物至20°C。在20°C攪拌約1小時後，HPLC監控顯示反應完成。然後在45±5°C在真空下濃縮所述混合物。將DCM(170 ml)和DIPE (190 ml)加入至所述殘餘物。在室溫攪拌混合物30分鐘。然後倒出上層液相。將DCM (250 ml)加入至所述固體。在室溫攪拌混合物30分鐘。然後將所述固體懸浮於ACN (170 ml)中，並在室溫攪拌，直至所述混合物變成均勻懸浮液。過濾所述混合物。濾餅用ACN (40 ml)洗滌，過濾並在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：71.84% 。
純度：90% 。
6(10)  TFA.H-[Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala]2 -NH2 的合成 TFA Boc-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -NH2 -＞   TFA.H-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -NH2
冷卻TFA (100 ml)至10°C。加入根據實施例6(9)製備的Boc-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -NH2 (26 g)，同時將溫度保持在20°C以下。將得到的混合物在20±5°C攪拌1小時。然後加入DCM (45 ml)。然後在3±5°C在真空下濃縮所述混合物。將殘餘物溶於ACN (350 ml)中，並蒸發至乾，以除去殘餘TFA。該殘餘TFA的去除操作再實施一次。將ACN (270 ml)加入到殘餘物中，並在室溫攪拌所述混合物，直至獲得均勻懸浮液。過濾後，濾餅懸浮於ACN (60 ml)中，過濾並在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：100% 。
純度：90.17% 。
6(11)  Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)4 -NH2 的合成 Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OH  +   TFA.H-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -NH2 -＞Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)4 -NH2
將根據實施例6(5)製備的Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2 -OH (20.5 g, 1當量)溶於DMF(1700 ml)中。將根據實施例6(10)製備的TFA.H-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)2-NH2 (24.1 g, 1當量) 溶於DMA (500 ml)中。合併所述兩種溶液，並冷卻至0°C。然後加入DIPEA (2.7 g, 1.05 當量)和HOAt (2.2 g, 1當量)。然後加入EDC.HCl (6.1 g, 2當量)，同時將溫度保持在3°C以下。然後在0°C攪拌所述混合物2小時。然後在1小時內溫熱所述混合物至20°C。在20°C攪拌約40小時後，HPLC監控顯示反應完成。然後在55±5°C在真空下濃縮所述混合物。將ACN (480 ml)和DIPE (530 ml)加入至所述殘餘物。在室溫攪拌所述混合物30分鐘。然後倒出上層液相。將ACN (500 ml)加入至所述殘餘物。在室溫攪拌所述混合物，直至所述混合物變成均勻懸浮液。然後過濾所述混合物，並用ACN (50 ml)洗滌濾餅。濾餅在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：103.8% 。
純度：81.35% 。
6(12)  Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala)4 -NH2 .TFA的合成 Ac-(Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala)4 -NH2 -＞ Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala)4 -NH2 .TFA
在20±5°C，將根據實施例6(11)製備的Ac-[Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala]4 -NH2 (33.7 g, 1.00 當量)溶於TFA (900 ml)中，隨後加入Pd/C (2.5 g, 負載量: 5% Pd,含水量53%)。將得到的混合物脫氣並回填充以氫氣氣氛三次。然後反應混合物在1.1個大氣壓的H2 下在20±5°C攪拌4小時。然後通過矽藻土過濾所述混合物，以除去Pd/C顆粒。用TFA (20 ml)洗滌矽藻土濾餅。合併TFA濾液，並在35±5°C真空濃縮，以提供油狀物。通過與DCM (280 ml)共沸蒸餾除去殘餘TFA，並再次進行該操作。然後將DIPE (300 ml)加入至所述殘餘物。在室溫攪拌所述混合物30分鐘。倒出液相。將DCM (480 ml)加入至所述固體。在室溫攪拌所述混合物，直至所述混合物是均勻懸浮液。然後過濾所述混合物。濾餅用DCM (50 ml)洗滌，過濾並在40 °C乾燥過夜。
粗品收率：104.3% 。
純度：46.52% 。 實施例7
7(1) 初步純化 對根據實施例4(2)和根據實施例6(12)製備的各Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala)4 -NH2 .TFA進行純化。
7(2) 鹽交換 在以下條件下通過色譜法實施從TFA鹽到HCl鹽的鹽交換：
Amberchrom® HP10柱或諸如C8 至 C18柱之類的任何常規疏水性固定相柱也均可作為固定相應用於所述純化或鹽交換中。
無
無

Claims (19)

  1. 一種製備肽(RADA)4 的方法，其中在液相中使具有序列 (RADA)2 的八肽偶聯以提供所述肽(RADA)4 ； 所述八肽是通過在液相中使具有序列RADA的四肽偶聯製備得到的； 所述具有序列RADA的四肽是在液相中製備得到的。
  2. 根據請求項1所述的方法，其中所述具有序列RADA的四肽是通過單個氨基酸的逐步偶聯製備得到的。
  3. 根據請求項1或2所述的方法，其中Asp以其側鏈保護形式Asp(OBzl)被使用。
  4. 根據請求項1至3中一或多項所述的方法，其中Arg僅以未保護側鏈的形式被使用或者Arg僅以其側鏈保護形式Arg(NO2 ) 被使用。
  5. 根據請求項4所述的方法，其中Arg僅以未保護側鏈的形式被使用。
  6. 根據請求項1至5中一或多項所述的方法，其中所述四肽的偶聯是在5°C以下的溫度進行的。
  7. 根據請求項1至6中一或多項所述的方法，其中所述八肽的偶聯是在5°C以下的溫度進行的。
  8. 根據請求項1至7中一或多項所述的方法，其中在任何偶聯期間N-末端α氨基殘基的任意保護是通過使用Boc或Ac進行的。
  9. 根據請求項1至8中一或多項所述的方法，其中在任何偶聯期間C-末端COOH殘基的任意保護是通過使用All或以醯胺C(O)NH2 的形式進行的。
  10. 根據請求項9所述的方法，其中All的任意裂解是通過使用催化劑Pd(PPh3 )4 的反應CLEAVALL進行的。
  11. 根據請求項10所述的方法，其中CLEAVALL是在添加劑ADDALL的存在下進行的，ADDALL選自由以下組成的組：嗎啉、1,3-二甲基巴比妥酸及其混合物。
  12. 根據請求項1至11中一或多項所述的方法，其中所述肽(RADA)4 以肽PEP-AC-NH2的形式被提供；PEP-AC-NH2是Ac-(RADA)4 -NH2 。
  13. 根據請求項12所述的方法，其中所述方法包括步驟STEPB； 在STEPB中，通過使片段FRAG2-AC-OH與片段FRAG2-H-NH2偶聯，製備所述PEP-AC-NH2； FRAG2-AC-OH是Ac-(RADA)2 -OH； FRAG2-H-NH2是H-(RADA)2 -NH2 。
  14. 根據請求項13所述的方法，其中所述方法包括步驟STEPA1； 在STEPA1中製備所述FRAG2-H-NH2； STEPA1包括使片段FRAGA1-Boc-OH與片段FRAGA1-H-NH2偶聯，以及隨後裂解N-末端Boc殘基； FRAGA1-Boc-OH是Boc-RADA-OH； FRAGA1-H-NH2是H-RADA-NH2 。
  15. 根據請求項13或14所述的方法，其中所述方法包括步驟STEPA2； 在STEPA2中製備FRAG2-AC-OH； STEPA2包括使片段FRAGA2-Ac-OH與片段FRAGA2-H-OAll偶聯，以及包括隨後裂解C-末端All殘基； FRAGA2-Ac-OH是Ac-RADA-OH； FRAGA2-H-OAll是H-RADA-OAll。
  16. 根據請求項1至15中一或多項所述的方法，其中對於所述具有序列RADA的四肽的製備，所述三個氨基酸R、A和D作為Boc-Ala-OH、Boc-Asp(OBzl)-OH和Boc-Arg(NO2 )-OH被使用；或作為Boc-Ala-OH、Boc-Asp(OBzl)-OH和Boc-Arg-OH被使用。
  17. 根據請求項3至16中一或多項所述的方法，其中任意側鏈保護基團的裂解是在所述八肽偶聯之後進行的。
  18. 根據請求項4至17中一或多項所述的方法，其中通過催化氫化裂解Arg的NO2 保護基和Asp的Bzl保護基。
  19. 根據請求項1至18中一或多項所述的方法，其中Boc-Arg(NO2 )-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll 或Boc-Arg-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OAll用作為中間體。
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