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CN117486976A - 一种自组装多肽raka 16的合成方法 - Google Patents

一种自组装多肽raka 16的合成方法 Download PDF

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CN117486976A
CN117486976A CN202410004984.4A CN202410004984A CN117486976A CN 117486976 A CN117486976 A CN 117486976A CN 202410004984 A CN202410004984 A CN 202410004984A CN 117486976 A CN117486976 A CN 117486976A
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Suzhou Saipu Biotechnology Co ltd
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Suzhou Saipu Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种自组装多肽RAKA 16的固相合成方法。该方法包括：制备X1全保护片段和X2全保护片段；将X1全保护片段和X2全保护片段依次间隔连接Rink Resin上；脱保护试剂脱除Fmoc保护基，乙酸酐和吡啶混合溶液进行N端的乙酰化，经裂解，沉降得到的固体粗肽，将粗品经HPLC提纯，冻干后得精肽的冻干粉末。本发明选用片段X1和X2全保护肽合成RAKA 16，简化了操作步骤，缩短了反应周期，且可以有效控制消旋杂质和缺失杂质的产生，降低了纯化的难度，有着较好的应用前景。

Description

一种自组装多肽RAKA 16的合成方法
技术领域
本发明属于有机合成领域，尤其涉及一种自组装多肽RAKA 16的固相合成方法。
背景技术
自组装多肽可以利用氢键、疏水作用、π-π堆积作用等非共价键力自组装成形态与结构特异的组装体，且由于多肽具有良好的生物相容性和可控的降解性能，因此被广泛应用于3D打印、细胞储存，组织工程支架等研究领域。其中RAKA 16已被开发为止血剂和水凝胶敷料等医疗产品。
RAKA 16的肽序为：
Ac- Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH
自组装多肽RAKA 16的合成，一般采用逐步偶联的方式。将16位至1位的保护氨基酸通过脱保护和偶联的方式依次连接在氨基酸树脂上。由于受多肽二级结构的影响，在连接至第9位Arg和第1位Arg时，反应位点的空间位阻变大，偶联反应困难，容易产生较多的缺失杂质，影响合成收率并且提高了纯化难度。
综上，现有合成RAKA 16的方法，合成周期较长，且容易引入一些难以去除的缺失肽和消旋肽，并且影响收率。
发明内容
本发明提出一种自组装多肽RAKA 16的合成方法，其目的在于解决现有合成RAKA16的方法，合成周期长，且容易引入一些难以去除的缺失肽和消旋肽，并且影响收率的问题。
技术方案：
本发明提出一种自组装多肽RAKA 16的固相合成方法，包括以下步骤：
S1、制备X1全保护片段，X1全保护片段为Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH；
S2、制备X2全保护片段，X2全保护片段为Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-OH；
S3、先用脱保护试剂脱除Rink Resin的Fmoc保护基，再用缩合试剂将X1全保护片段和X2全保护片段依次间隔偶联在Rink Resin上，得X1-X2-X1-X2-Rink Resin，即Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -Rink Resin；
S4、X1-X2-X1-X2-Rink Resin用脱保护试剂脱除Fmoc保护基，再用乙酸酐和吡啶混合溶液进行N端的乙酰化，得到Ac- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -Rink Resin；
S5、裂解Ac- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -Rink Resin，裂解反应液经过滤，沉降得到的固体粗肽，固体粗肽通过乙醚重复洗涤离心2~5次，得到洗涤后的粗肽，将粗肽干燥至不再减重，得到Ac- Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2粗品；
S6、将粗品经HPLC提纯，冻干后得Ac- Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2精肽的冻干粉末。
进一步的，所述Rink Resin的替代度为0.2~0.8mmol/g。
进一步的，步骤S4中脱除Fmoc保护基的X1-X2-X1-X2-Rink Resin与乙酸酐和吡啶的摩尔比为1：(5~20)：(5~20)。
进一步的，步骤S5中所述粗品经HPLC提纯之前，需用N-甲基吡咯烷酮或DMF溶解粗品，至粗品的浓度为0.5 ~1mmol/L。
优选的，所述X1全保护片段的制备步骤如下：
1a、制备Fmoc- Ala-CTC Resin：向溶胀后的2-CTC Rsein中加入Fmoc-Ala-OH和有机碱，得到Fmoc-Ala- CTC Resin；
1b、Fmoc-Ala- CTC Resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除Fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Arg(Pbf)-OH，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin；
1c、采用全保护裂解的方式裂解Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin，得到X1全保护片段，即Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH；
所述X2全保护片段的制备步骤如下：
2a、向溶胀后的2-CTC Rsein中加入Fmoc-Ala-OH和有机碱，得到Fmoc-Ala- CTCResin；
2b、Fmoc-Ala- CTC Resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除Fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -CTC Resin；
2c、采用全保护裂解的方式裂解Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin，得X2全保护片段，即Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-OH。
优选的，步骤1a和2a中所述的有机碱为DIPEA，且有机碱与2-CTC Rsein、Fmoc-Ala-OH的摩尔比为（2~10）：1：（1~5）。
优选的，所述全保护裂解试剂为TFE的二氯甲烷溶液，TFE与二氯甲烷体积比为（10~25）：（75~90）；全保护裂解试剂用量为1g肽树脂/10ml全保护裂解试剂。
优选的，所述缩合试剂为等摩尔比的DIC和HOBt的混合液，或者等摩尔比的PyBOP和DIEA和HOBt的混合液；或者等摩尔比的HBTU和DIEA和HOBt的混合液；
在步骤S3中缩合试剂、Rink Resin、X1全保护片段或者X2全保护片段的摩尔比为（4.8~12）：1：（2~5）；
在步骤1b和2b中缩合试剂、Fmoc-Ala- CTC Resin、氨基酸原料的摩尔比为（4.8~12）：1：（2~5）。
优选的，所述脱保护试剂为哌啶和DMF的混合溶液，二者体积比为哌啶：DMF=1：4；脱保护试剂的用量为1g肽树脂/（10-20）ml脱保护试剂。
优选的，所述裂解的裂解液为三氟乙酸溶液，其中三氟乙酸的体积占比为85%~95%；裂解时间为2~4h，裂解温度为25~45℃；裂解液用量为1g肽树脂/10ml裂解液。
本发明具有以下优点：
本发明通过合成全保护片段Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH和Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-OH，再通过逐步偶联的方式，用缩合试剂将片段依次偶联在Rink Resin（树脂）上，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Rink Resin。经过Fmoc基团脱除，乙酰化反应，肽树脂收缩，肽树脂裂解，粗肽纯化，得到RAKA 16精肽。常规逐步偶联的合成周期为14天，总收率约为10%，本发明缩短了合成周期，约为8天，提高了收率，总收率在20%以上。
本发明用片段法合成RAKA 16，这种方式规避了中长肽因二级结构影响导致的偶联困难的情形，缩短了合成的周期，简化了合成的操作，提高了合成效率。同时有效地减少了缺失肽和消旋肽的产生，从而降低了纯化的难度，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为粗肽的HPLC图谱；
图2为精肽的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案进一步的说明。在本实施例中，英文缩写对应的中文含义见下表1。
表1 所用试剂及仪器
本发明提出一种自组装多肽RAKA 16的固相合成方法，本发明首先制备X1和X2全保护片段，用固相多肽合成法制备RAKA 16肽树脂，使用的溶剂为DMF，DCM，DMSO中的一种或者组合使用。RAKA 16的肽树脂经过裂解得到RAKA 16粗品，最后经过纯化和冻干得到RAKA16精肽Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala- Glu-Ala-Lys-Ala-NH2。
实施例1
1、制备Fmoc-Ala-CTC Resin；
称取0.032mol 2-CTC Resin，用DCM溶胀30min，DCM的体积需满足1g树脂对应10~20mlDCM。有机碱与2-CTC Rsein、Fmoc-Ala-OH的摩尔比为（2~10）：1：（1~5），本实施例中加入0.032mol Fmoc-Ala-OH，0.064mol DIPEA和500mlDMF。DMF溶解和洗脱的用量为1g树脂对应10-30ml。在30℃条件下，反应3h。抽滤洗涤得到Fmoc-Ala-CTC Resin。
2、制备Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin；
2.1制备Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin；
向Fmoc-Ala-CTC Resin中加入500ml 20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Ala-CTC Resin。
本实施例中脱保护试剂用量大约是1g树脂对应10-20ml脱保护试剂。
本实施例中茚三酮检测为：取少量树脂依次加入试剂a、5%茚三酮的无水乙醇溶液（w/v），b、苯酚的无水乙醇溶液（w/v），c、吡啶各1~2滴，摇匀，在105℃条件下加热5min。若溶液和树脂显蓝色或者深蓝色，即检测为阳性；若溶液和树脂为微蓝或者无颜色变化，则检测为阴性。
本发明根据RAKA 16肽序的特点，以缩短偶联次数以及规避Arg的偶联为目的，巧妙的设计出X1全保护片段和X2全保护片段。称取氨基酸原料和缩合试剂进行偶联，其中氨基酸原料包括Fmoc- Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc- Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，缩合试剂包括DIC和HOBt，NH2-Ala-CTC Resin、氨基酸原料、DIC、HOBt的摩尔比为1：（2~5）：（2.4~6）：（2.4~6）。所述偶联的温度为20~40℃。优选为30℃左右。
具体偶联的步骤为：
称取0.064mol Fmoc- Asp(OtBu)-OH，0.096molHOBt投入NH2-Ala-CTC Resin中，加入500ml DMF搅拌均匀，再加入0.096mmol DIC。在30℃条件下反应2h，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阴性，抽干反应液。洗涤抽滤得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin。
采用上述同样的方法，依次连接Fmoc-Ala-OH，Fmoc- Arg(Pbf)-OH。
具体的，向Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin中加入500ml 20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin。
称取0.048molFmoc-Ala-OH，0.096molHOBt投入NH2-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin中，加入500ml DMF搅拌均匀，再加入0.096mmol DIC。在30℃条件下反应2h，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阴性，抽干反应液。洗涤抽滤得Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin。
向NH2-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin中加入500ml 20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin。
再称取0.048molFmoc-Arg(Pbf)-OH，0.096molHOBt投入Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin中，加入500ml DMF搅拌均匀，再加入0.096mmol DIC。在30℃条件下反应2h，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阴性，抽干反应液。洗涤抽滤得Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin。
2.2制备Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin；
向Fmoc-Ala-CTC Resin中加入500ml20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Ala-CTC Resin。
称取0.048molFmoc-Lys（Boc）-OH，0.096molHOBt投入NH2-Ala-CTC Resin中，加入500mlDMF搅拌均匀，再加入0.096mmol DIC。在30℃条件下反应2h，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阴性，抽干反应液。洗涤抽滤得Fmoc-Lys（Boc）-Ala-CTC Resin。
采用上述同样的方法，依次连接Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu（OtBu）-OH。
具体的，向Fmoc-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin中加入500ml 20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin。
称取0.048molFmoc-Ala-OH，0.096molHOBt投入NH2-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin中，加入500mlDMF搅拌均匀，再加入0.096mmol DIC。在30℃条件下反应2h，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阴性，抽干反应液。洗涤抽滤得Fmoc-Ala-Lys（Boc）-Ala-CTC Resin。
向Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin中加入500ml 20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin。
再称取0.048mol Fmoc-Glu（OtBu）-OH，0.096molHOBt投入NH2-Ala-Lys（Boc）-Ala-CTC Resin中，加入500mlDMF搅拌均匀，再加入0.096mmol DIC。在30℃条件下反应2h，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阴性，抽干反应液。洗涤抽滤得Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin。
3、制备全保护片段
以1g/10ml的裂解比例裂解Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-CTC Resin，所述全保护裂解试剂为TFE的二氯甲烷溶液，TFE与二氯甲烷体积比为10~25：75~90，优选为全保护裂解液的体积比为TFE：DCM=1：9。裂解3h，裂解温度约30℃。裂解反应液经砂芯漏斗过滤，保留滤液。将滤液用旋转蒸发仪旋蒸，得到白色或类白色固体。再将旋蒸所得的固体放入真空干燥箱中减压干燥，干燥至不再减重为止，最终得全保护片段：X1全保护片段Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH和X2全保护片段Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-OH。
4、制备RAKA 16肽树脂
称取0.001mol Rink Resin，用40mlDCM溶胀30min，DCM添加的比例需满足1g树脂对应10~20mlDCM。所述Rink Resin的替代度为0.2~0.8mmol/g。所述Rink Resin的替代度优选为0.3~0.6mmol/g。
向0.001molRink Resin中加入40ml 20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Rink Resin。
NH2-Rink Resin、X1全保护片段或者X2全保护片段、DIC和HOBt的摩尔比为1：（2~5）：（2.4~6）：（2.4~6）。
本实施例中称取0.004molX2全保护片段Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-OH，0.0048molHOBt投入Rink Resin中，加入40ml DMF搅拌均匀，再加入0.0048mol DIC。反应4h，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阴性，抽干反应液。洗涤抽滤得Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。
采用上述同样的方法，依次连接X1全保护片段Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH、X2全保护片段Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp（OtBu)-Ala-OH、X1全保护片段Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-OH，经过洗涤干燥得到Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。
向上述反应柱中加入适量的20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应20min，取少量树脂用茚三酮检测，检测显阳性，洗涤抽滤得NH2-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。
向上述反应柱中加入0.02mol乙酸酐，0.02mol吡啶和40mlDMF的混合液。反应60min。用DMF洗涤肽树脂6次，抽掉洗涤废液，再加入40ml无水甲醇进行肽树脂的收缩，收缩3次，抽掉收缩废液。将肽树脂转移至真空干燥箱中进行减压干燥，干燥至不再减重为止，得RAKA 16肽树脂：Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。
5、制备RAKA 16精肽
取RAKA 16肽树脂，投入裂解液中，进行裂解反应。裂解液用量为1g肽树脂/10ml裂解液。裂解液为浓度为85%~95%的高浓度三氟乙酸溶，裂解液其它成分为相应的侧链保护基捕获试剂。具体的三氟乙酸溶液为三氟乙酸，苯甲硫醚，EDT，水的混合溶液，其中三氟乙酸的体积占比为85%~95%，其余三种试剂占比相同，四种试剂体积比之和为100%；本实施例中优选裂解液配比为TFA：苯甲硫醚：EDT：水=91：3：3：3（v/v），30℃裂解3h。经甲基叔丁基醚沉降，洗涤离心得RAKA 16粗肽。粗肽纯度为68.597% 。
取上述的RAKA 16粗肽，将粗肽用N-甲基吡咯烷酮或DMF溶解到0.5mmol/L至1mmol/L，进一步经HPLC制备提纯，HPLC的条件为，A相为0.1%三氟乙酸的纯化水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱40min，收集纯度90%以上的样品溶液，进行冻干。冻干前，先将样品溶液预冻，再在冻干机中冷冻干燥48h以上，冻干得RAKA 16精肽：Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2。
取实施例1中粗肽小样进行HPLC分析，得图1，粗肽纯度为68.597%，此纯度较优。取精肽样品进行HPLC分析，得图2，样品纯度为95.480%，此纯度较优，且几乎没有依附主峰的杂质，纯度还有进一步提升的空间。
实施例2
1、制备Fmoc-Ala-CTC Resin；
称取0.032mol 2-CTC Resin，用DCM溶胀30min。有机碱与2-CTC Rsein、Fmoc-Ala-OH的摩尔比为（2~10）：1：（1~5），本实施例中加入0.16mol Fmoc-Ala-OH，0.32mol DIPEA和500mlDMF。在30℃条件下，反应3h。抽滤洗涤得到Fmoc-Ala-CTC Resin。
2、制备Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin；
与实施例1的不同在于，缩合试剂包括DIC和HOBt，NH2-Ala-CTC Resin、氨基酸原料、DIC、HOBt的摩尔比为1：5：6：6。所述偶联的温度为38℃。
得Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin。
3、制备全保护片段
以1g/10ml的裂解比例裂解Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-CTC Resin，裂解采用全保护裂解试剂，全保护裂解试剂为TFE的二氯甲烷溶液，TFE与二氯甲烷体积比为25：75，裂解3h，裂解温度约30℃。最终得全保护片段：X1全保护片段Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH和X2全保护片段Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-OH。
4、制备RAKA 16肽树脂
与实施例1的不同在于，所述Rink Resin的替代度优选为0.5mmol/g。NH2-RinkResin、X1全保护片段或者X2全保护片段、DIC和HOBt的摩尔比为1：5：6：6。
得RAKA 16肽树脂：Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。
5、制备RAKA 16精肽
与实施例1的不同在于，裂解液为浓度为95%的高浓度三氟乙酸溶，裂解时间为2h，裂解温度为25℃。经甲基叔丁基醚沉降，洗涤离心得RAKA 16粗肽。粗肽纯度为69.125%。
取上述的RAKA 16粗肽，将粗肽用N-甲基吡咯烷酮或DMF溶解到1mmol/L，进一步经HPLC制备提纯，HPLC的条件为，A相为0.1%三氟乙酸的纯化水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱40min，收集纯度90%以上的样品溶液，进行冻干。冻干前，先将样品溶液预冻，再在冻干机中冷冻干燥48h以上，冻干得RAKA 16精肽：Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2。
实施例3
1、制备Fmoc-Ala-CTC Resin；
称取0.032mol 2-CTC Resin，用DCM溶胀30min。有机碱与2-CTC Rsein、Fmoc-Ala-OH的摩尔比为（2~10）：1：（1~5），本实施例中加入0.096mol Fmoc-Ala-OH，0.16mol DIPEA和500mlDMF。在30℃条件下，反应3h。抽滤洗涤得到Fmoc-Ala-CTC Resin。
2、制备Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin；
与实施例1的不同在于，缩合试剂包括PyBOP和DIEA和HOBt，NH2-Ala-CTC Resin、氨基酸原料、PyBOP、DIC、HOBt的摩尔比为1：2：2.4：2.4：2.4。所述偶联的温度为25℃。
得Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin。
3、制备全保护片段
以1g/10ml的裂解比例裂解Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin和Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-CTC Resin，裂解采用全保护裂解试剂，全保护裂解试剂为TFE的二氯甲烷溶液，TFE与二氯甲烷体积比为20：80，裂解3h，裂解温度约30℃。最终得全保护片段：X1全保护片段Fmoc- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH和X2全保护片段Fmoc- Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-OH。
4、制备RAKA 16肽树脂
与实施例1的不同在于，所述Rink Resin的替代度优选为0.6mmol/g。NH2-RinkResin、X1全保护片段或者X2全保护片段、DIC和HOBt的摩尔比为1：3：4：4。
得RAKA 16肽树脂：Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。
5、制备RAKA 16精肽
与实施例1的不同在于，裂解液为浓度为85%的高浓度三氟乙酸溶，裂解时间为4h，裂解温度为45℃。经甲基叔丁基醚沉降，洗涤离心得RAKA 16粗肽。粗肽纯度为58.667% 。
取上述的RAKA 16粗肽，将粗肽用N-甲基吡咯烷酮或DMF溶解到0.5mmol/L，进一步经HPLC制备提纯，HPLC的条件为，A相为0.1%三氟乙酸的纯化水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱40min，收集纯度90%以上的样品溶液，进行冻干。冻干前，先将样品溶液预冻，再在冻干机中冷冻干燥48h以上，冻干得RAKA 16精肽：Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2。
对比例1
本对比例与实施例1的区别为：实施例1为逐步偶联和片段法相结合的方式合成RAKA肽树脂。本对比例全程采用逐步偶联的方式合成RAKA肽树脂。
1、制备RAKA 16肽树脂
称取0.001mol Rink Resin，用40mlDCM溶胀30min，DCM添加的比例需满足1g树脂对应10~20mlDCM。所述Rink Resin的替代度优选为0.3~0.6mmol/g。
向0.001molRink Resin中加入40ml 20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应结束，洗涤抽滤得NH2-Rink Resin。
NH2-Rink Resin、氨基酸原料、DIC和HOBt的摩尔比为1：（2~5）：（2.4~6）：（2.4~6）。氨基酸原料包括Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
本对比例中称取0.004molFmoc-Ala-OH，0.005molHOBt投入NH2-Rink Resin中，加入40ml DMF搅拌均匀，再加入0.005mol DIC。反应4h。洗涤抽滤得Fmoc-Ala-Rink Resin。
采用上述同样的方法，再依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。其中两个位点的Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联反应都很困难，均进行了重复投料，延长反应时间的操作。且偶联结束时茚三酮检测仍为阳性，但是相较上一位点脱保护的茚三酮检测有明显变化，判断大部分位点已经完成偶联反应，所以继续进行了下一步的反应。
向上述反应柱中加入适量的20%哌啶/DMF（v/v）溶液进行脱保护。反应结束，洗涤抽滤得NH2-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu（OtBu）-Ala-Lys（Boc)-Ala-Rink Resin。
向上述反应柱中加入0.02mol乙酸酐，0.02mol吡啶和40mlDMF的混合液。反应60min。用DMF洗涤肽树脂6次，抽掉洗涤废液，再加入40ml无水甲醇进行肽树脂的收缩，收缩3次，抽掉收缩废液。将肽树脂转移至真空干燥箱中进行减压干燥，干燥至不再减重为止，得RAKA 16肽树脂：Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Rink Resin。
2、制备RAKA 16粗肽
取1中得到的RAKA 16肽树脂，投入裂解液中，进行裂解反应。裂解液用量为1g肽树脂/10ml裂解液。裂解液为浓度为85%~95%的高浓度三氟乙酸溶，三氟乙酸溶液为三氟乙酸，苯甲硫醚，EDT，水的混合溶液，本对比例中优选裂解液配比为TFA：苯甲硫醚：EDT：水=91：3：3：3（v/v）。30℃裂解3h。经甲基叔丁基醚沉降，洗涤离心得RAKA 16粗肽。粗肽纯度为45.083 。
3、制备RAKA精肽
取上述的RAKA 16粗肽，将粗肽用N-甲基吡咯烷酮或DMF溶解到0.5mmol/L至1mmol/L，进一步经HPLC制备提纯，HPLC的条件为，A相为0.1%三氟乙酸的纯化水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱40min，收集纯度90%以上的样品溶液，进行冻干。冻干前，先将样品溶液预冻，再在冻干机中冷冻干燥48h以上，冻干得RAKA 16精肽：Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2。
取实施例1-3以及对比例1中的RAKA 16精肽进行比对，所得数据见表2所示。
表2为比对数据
从表2中的数据可知，常规逐步偶联（对比例1）的合成周期为14天，总收率约为10%，本发明缩短了合成周期，约为8天，提高粗肽和精肽的纯度，提高了总收率，总收率约为20%。
综上，本发明用片段法合成RAKA 16，这种方式规避了中长肽因二级结构影响导致的偶联困难的情形，缩短了合成的周期，简化了合成的操作，提高了合成效率。同时巧妙的规避了连接第9位Arg和第1位Arg时，容易产生较多的缺失杂质的问题，有效地减少了缺失肽和消旋肽的产生，从而降低了纯化的难度，具有广泛的应用前景。

Claims (10)

1.一种自组装多肽RAKA 16的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备X1全保护片段，X1全保护片段为Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH；
S2、制备X2全保护片段，X2全保护片段为Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-OH；
S3、先用脱保护试剂脱除Rink Resin的Fmoc保护基，再用缩合试剂将X1全保护片段和X2全保护片段依次间隔偶联在Rink Resin上，得X1-X2-X1-X2-Rink Resin，即Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -Rink Resin；
S4、X1-X2-X1-X2-Rink Resin用脱保护试剂脱除Fmoc保护基，再用乙酸酐和吡啶混合溶液进行N端的乙酰化，得到Ac- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -Rink Resin；
S5、裂解Ac- Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -Rink Resin，裂解反应液经过滤，沉降得到的固体粗肽，固体粗肽通过乙醚重复洗涤离心2~5次，得到洗涤后的粗肽，将粗肽干燥至不再减重，得到Ac- Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2粗品；
S6、将粗品经HPLC提纯，冻干后得Ac- Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-NH2精肽的冻干粉末。
2.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述Rink Resin的替代度为0.2~0.8mmol/g。
3.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：步骤S4中脱除Fmoc保护基的X1-X2-X1-X2-Rink Resin与乙酸酐和吡啶的摩尔比为1：(5~20)：(5~20)。
4.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：步骤S5中所述粗品经HPLC提纯之前，需用N-甲基吡咯烷酮或DMF溶解粗品，至粗品的浓度为0.5 ~1mmol/L。
5.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：
所述X1全保护片段的制备步骤如下：
1a、制备Fmoc- Ala-CTC Resin：向溶胀后的2-CTC Rsein中加入Fmoc-Ala-OH和有机碱，得到Fmoc-Ala- CTC Resin；
1b、Fmoc-Ala- CTC Resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除Fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Arg(Pbf)-OH，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin；
1c、采用全保护裂解的方式裂解Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC Resin，得到X1全保护片段，即Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH；
所述X2全保护片段的制备步骤如下：
2a、向溶胀后的2-CTC Rsein中加入Fmoc-Ala-OH和有机碱，得到Fmoc-Ala- CTCResin；
2b、Fmoc-Ala- CTC Resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除Fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala -CTC Resin；
2c、采用全保护裂解的方式裂解Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin，得X2全保护片段，即Fmoc- Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-OH。
6.根据权利要求5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：步骤1a和2a中所述的有机碱为DIPEA，且有机碱与2-CTC Rsein、Fmoc-Ala-OH的摩尔比为（2~10）：1：（1~5）。
7.根据权利要求5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述全保护裂解试剂为TFE的二氯甲烷溶液，TFE与二氯甲烷体积比为（10~25）：（75~90）；全保护裂解试剂用量为1g肽树脂/10ml全保护裂解试剂。
8.根据权利要求1或5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述缩合试剂为等摩尔比的DIC和HOBt的混合液，或者等摩尔比的PyBOP和DIEA和HOBt的混合液；或者等摩尔比的HBTU和DIEA和HOBt的混合液；
在步骤S3中缩合试剂、Rink Resin、X1全保护片段或者X2全保护片段的摩尔比为（4.8~12）：1：（2~5）；
在步骤1b和2b中缩合试剂、Fmoc-Ala- CTC Resin、氨基酸原料的摩尔比为（4.8~12）：1：（2~5）。
9.根据权利要求1或5所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述脱保护试剂为哌啶和DMF的混合溶液，二者体积比为哌啶：DMF=1：4；脱保护试剂的用量为1g肽树脂/（10-20）ml脱保护试剂。
10.根据权利要求1所述的RAKA 16的固相合成方法，其特征在于：所述裂解的裂解液为三氟乙酸溶液，其中三氟乙酸的体积占比为85%~95%；裂解时间为2~4h，裂解温度为25~45℃；裂解液用量为1g肽树脂/10ml裂解液。
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