TW201713689A - Ｔａｕ結合抗體 - Google Patents

Abstract

本發明係關於Tau結合抗體及其結合片段。

Description

TAU結合抗體

本發明尤其係關於治療性及診斷性Tau結合抗體及其結合片段、製備此類抗體之方法以及其用於治療及/或診斷Tau蛋白病的用途，諸如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；肌肉萎縮性側索硬化/巴金森氏症(parkinsonism)-癡呆綜合症；嗜銀顆粒疾病；慢性創傷性腦病變；皮質基底核退化症；彌漫性神經原纖維纏結伴鈣化；唐氏症候群(Down syndrome)；英國家族性癡呆症；丹麥家族性癡呆症；與MAPT突變所產生之染色體17關聯的額顳葉型癡呆症及巴金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-謝恩克爾疾病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)；瓜德羅普島巴金森氏症(Guadeloupean parkinsonism)；肌緊張性營養不良；神經退化伴腦鐵積聚；C型尼曼-匹克疾病(Niemann-Pick disease)；非關島運動神經元疾病(Non-Guamanian motor neuron disease)伴神經原纖維纏結；匹克疾病；腦炎後巴金森氏症；朊病毒蛋白質大腦澱粉樣蛋白血管病變；漸進性皮層下神經膠樣變性；進行性核上麻痺；SLC9A6相關智力遲鈍；亞急性硬化性全腦炎；唯纏結型癡呆症；出現球狀神經膠質包裹體的白質Tau蛋白病(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)。本發明亦關於治療罹患或懷疑易患上述Tau蛋白病(特定言之，諸如阿茲海默氏病及進行性核上麻痺之Tau蛋白病)之人類個體的方法。

阿茲海默氏病(AD)及漸進性核上麻痺(PSP)為醫學需要未得到高度滿足、對於社會健康系統而言成本較高且對所影響家庭之負擔較重的神經退化性疾病。AD臨床症狀包括記憶、認知、推理、判斷及情感穩定性的降低以及最終死亡。PSP包括嚴重及漸進性步態控制及平衡問題、摔倒、垂直眼球運動障礙、認知問題、抑鬱症、無表情及輕度癡呆症。後期症狀包括視力模糊、眼球運動不可控、言語不清、吞咽困難及死亡。

對於超過十年的AD疾病而言，改良規劃已經由各種機制靶向澱粉樣蛋白-β肽。相比之下，解決細胞內Tau病理學(AD之第二大標誌)的進展小得多。含有過磷酸化Tau聚集物的神經原纖維包裹體或纏結界定AD病理學特徵及其他Tau蛋白病種數，包括PSP。

在此等疾病中，症狀進展與神經內Tau聚集物含量及分佈之間存在強相關性。AD神經元Tau纏結首先出現於經內嗅皮層中，自經內嗅皮層散佈至海馬體及新皮層中。AD神經元中所觀測到的纏結係由過磷酸化的不溶性Tau聚集物組成。已提出病理性Tau物質的直接毒性作用及/或軸突傳輸損失(由於功能Tau螯合成過磷酸化之聚集形式，其不再能夠支持軸突傳輸)導致疾病。

Tau在其非病理性狀態下為高度可溶性細胞質微管結合蛋白，由於替代性拼接，因此其以長度範圍為352至441個胺基酸的6種主要同功異型物出現於人類中樞神經系統(CNS)中。此等同功異型物可具有零、一或二個N端插入序列(0N、1N、2N)，及三或四個C端「重複」序列(3R或4R)。此等30至32個胺基酸C端重複序列R1、R2、R3及R4一起構成Tau微管結合區(MTBR)。實際上，Tau的主要作用咸信為組裝及穩定化軸突微管。微管形成用於軸突傳輸之軌道及用於細胞生長之細胞骨架元件(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)。三種Tau同功異型物已證明含有三個微管結合區(MTBR)： -同功異型物4，亦稱為3R0N，NCBI參考序列NP_058525.1(352個胺基酸)，-同功異型物7，亦稱為3R1N，NCBI參考序列NP_001190180.1(381個胺基酸)-同功異型物8，亦稱為3R2N，NCBI參考序列NP_001190181.1(410個胺基酸)。

而其他三種Tau同功異型物含有四個MTBR：-同功異型物2，亦稱為4R2N，NCBI參考序列NP_005901.2(441個胺基酸)，-同功異型物3，亦稱為4R0N，NCBI參考序列NP_058518.1(383個胺基酸)，及-同功異型物5，亦稱為4R1N，NCBI參考序列NP_001116539.1(412個胺基酸)。

當前可用於此等疾病的唯一對症療法功效輕微或無功效。當前不存在可用於減緩或理想地中止疾病發展的療法。因此，此項技術中仍需要適用於治療Tau蛋白病的新穎化合物及組合物。

本發明之一目標尤其為提供用於治療或診斷Tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病(AD)或進行性核上麻痺(PSP))的藥劑。另外，本發明之一目標尤其為提供治療或診斷Tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病(AD)或進行性核上麻痺(PSP))的方法。

此等及其他目標(由隨之而來的下文描述，其將變得顯而易見)係藉由獨立請求項之標的物達到。本發明所涵蓋之一些特定態樣及其實施例形成附屬請求項之標的物。本發明所涵蓋之其他態樣及其實施例可自接下來的描述獲得。

在第一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片 段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：2或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：3或與其至少90%一致之序列的CDR3；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：5或與其至少90%一致之序列的CDR2及/或選自SEQ ID No.：6或與其至少90%一致之序列的CDR3。

在第二態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：7或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：8或與其至少80%一致之序列。

在第三態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：9或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：10或與其至少80%一致之序列。

在第四態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至至少包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246的抗原決定基。

作為第一及第四態樣之一個實施例，本發明提供的單株抗體或其結合片段可為嵌合、人類化或完全人類抗體或其結合片段。

作為第二態樣之一個實施例，本發明提供的單株抗體或其結合片段可為嵌合抗體或其結合片段。

作為第三態樣之一個實施例，本發明提供的單株抗體或其結合 片段可為人類化抗體或其結合片段。

在第五態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與第一至第四態樣及其實施例中之任一者的Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。

在第六態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與第一至第四態樣及其實施例中任一者之Tau結合抗體或其結合片段結合至大體上相同的Tau抗原決定基。

作為第五及第六態樣之一個實施例，本發明提供的單株抗體或其結合片段可為人類化抗體或其結合片段。

第一至第六態樣及其實施例的抗體及其結合片段能夠結合至人類Tau的可溶形式、人類Tau的成對螺旋狀纖絲(paired helical filaments；PHF)，或結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

在第七態樣中，本發明提供包含核酸序列(諸如編碼第一至第六態樣及其實施例之抗體及結合片段的DNA序列)的核酸分子。

在第八態樣中，本發明提供包含此等前述核酸分子的選殖或表現載體。

在第九態樣中，本發明提供包含此等前述核酸分子、選殖載體或表現載體的宿主細胞。

在第十態樣中，本發明提供製造第一至第六態樣及其實施例之抗體及其結合片段的方法。

本發明之第十一態樣係關於第一至第六態樣及其實施例之抗體及其結合片段用於治療Tau蛋白病(特定而言，諸如AD及PSP)的用途。

本發明之另一態樣係關於第一至第六態樣及其實施例之抗體及 其結合片段用於診斷Tau蛋白病(特定而言，諸如AD及PSP)的用途。

圖1：A)描繪SEQ ID No.：7之AB1之供體VL(VL_AB1)，其中CDR 1(SEQ ID No.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)及CDR 3(SEQ ID No.：3)加有下劃線。B)描繪SEQ ID No.：31之人類受體區域IGKV2-29之VL序列，其中受體CDR 1、CDR 2及CDR 3加有下劃線。C)描繪SEQ No.：9之CDR移植序列gVL3_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：1)、CDR 2(SEQ ID No.：2)及CDR 3(SEQ ID No.：3)加有下劃線。

圖2：A)描繪SEQ ID No.：8之AB1之供體VH(VH_AB1)，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：36)及CDR 3(SEQ ID No.：6)加有下劃線。B)描繪SEQ ID No.：32之人類受體區域IGHV4-59之VH序列，其中受體CDR 1、CDR 2及CDR 3加有下劃線。C)描繪SEQ ID No.：12之CDR移植序列gVH17_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：37)及CDR 3(SEQ ID No.：6)加有下劃線。供體殘基係以斜體突出顯示：M48。構架中的突變突出顯示(E1)。相較於VH_AB1，CDR2包含S61A取代。D)描繪SEQ ID No.：13之移植序列gVH18_AB1，其中CDR 1(SEQ ID No.：4)、CDR 2(SEQ ID No.：38)及CDR 3(SEQ ID No.：6)加有下劃線。供體殘基係以斜體突出顯示(M48)。構架中的突變突出顯示(E1)。相較於VH_AB1，CDR2包含S61T取代。

圖3：圖說明實驗3.1之細胞聚集分析。

圖4：在使用自人類AD患者回收之人類Tau病理性原纖維(AD-PHF8)作為晶種的細胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：18之重鏈之Tau結合抗體(A)及具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：17之重鏈之Tau結合抗體(B)或陰性對照IgG4抗體A33(C)的功效。

圖5：西方墨點，其顯示具有SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH之Tau結合抗體AB1(A)，以及具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID 17之重鏈之人類化抗體(B)、具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：18之重鏈之Tau結合抗體(C)針對自人類AD、PSP或對照患者之溶離份8樣品回收之Tau的結合特性。A33抗體用作陰性對照物。

圖6：具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID17之重鏈之Tau結合抗體、具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：18之重鏈之Tau結合抗體、具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：54之重鏈之Tau結合抗體，以及具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：55之重鏈之Tau結合抗體的熱分析圖重疊圖。

圖7：編碼人類Tau同功異型物2之DNA構築體用於大腸桿菌表現(pET 6His TEV-hTau iso 2(1-441))(BioReg ID：D0003105)(SEQ ID No.：39)。編碼胺基酸序列的BamHI/XhoI插入序列次選殖入經BamHI/XhoI切割之經修飾pET32載體中。(6His-TEV-Tau編碼序列呈粗體斜體形式)。

圖8：A)經由pET 6HisTEV-hTau iso 2(1-441)表現的胺基酸序列(SEQ ID No.：40)；B)TEV裂解之後，經由pET 6His TEV-hTau iso 2(1-441)表現的最終胺基酸序列(SEQ ID No.：41)。

圖9：編碼人類Tau同功異型物3之DNA構築體用於大腸桿菌表現(pET 6His TEV-hTau iso 3(1-383))(BioReg ID：D0003104)(SEQ ID No.：42)。編碼胺基酸序列的BamHI/XhoI插入序列次選殖入經BamHI/XhoI切割之經修飾pET32載體中。(6His-TEV-Tau編碼序列呈粗體斜體形式)。

圖10：A)經由pET 6His TEV-hTau iso 3(1-383)表現的胺基酸序列(SEQ ID No.：43)；B)TEV裂解之後，經由pET 6His TEV-hTau iso 3 (1-383)表現的最終胺基酸序列(SEQ ID No.：44)。

圖11：編碼人類Tau同功異型物4之DNA構築體用於大腸桿菌表現(pET 6His TEV-hTau iso 4(1-352))(BioReg ID：D0003093)(SEQ ID No.：45)。編碼胺基酸序列的BamHI/XhoI插入序列次選殖入經BamHI/XhoI切割之經修飾pET32載體中。(6His-TEV-Tau編碼序列呈粗體斜體形式)。

圖12：A)經由pET 6His TEV-hTau iso 4(1-352)表現的胺基酸序列(SEQ ID No.：46)；B)TEV裂解之後，經由pET 6His TEV-hTau iso 4(1-352)表現的最終胺基酸序列(SEQ ID No.：47)。

圖13：編碼人類Tau同功異型物5之DNA構築體用於大腸桿菌表現(pET 6His TEV-hTau iso 5(1-412))(BioReg ID：D0003103)(SEQ ID No.：48)。編碼胺基酸序列的BamHI/XhoI插入序列次選殖入經BamHI/XhoI切割之經修飾pET32載體中。(6His-TEV-Tau編碼序列呈粗體斜體形式)。

圖14：A)經由pET 6His TEV-hTau iso 5(1-412)表現的胺基酸序列(SEQ ID No.：49)；B)TEV裂解之後，經由pET 6His TEV-hTau iso 5(1-412)表現的最終胺基酸序列(SEQ ID No.：50)。

圖15：編碼人類Tau同功異型物2之DNA構築體用於HEK293細胞表現(pMH-10His-TEV-hTau iso2(1-441))(BioReg ID：D0003109)(SEQ ID No.：51)。編碼胺基酸序列的BamHI/XhoI插入序列次選殖入經BamHI/XhoI切割的哺乳動物表現載體pMH-10HisTEV中。(10His-TEV-Tau編碼序列呈粗體斜體形式，移除限制位點的靜默點突變A1032T加有下劃線)。

圖16：A)經由pMH-10His-TEV-hTau iso2(1-441)表現的胺基酸序列(SEQ ID No.：52)；B)TEV裂解之後，經由pET-10His-TEV-hTau iso 2(1-441)表現的最終胺基酸序列(SEQ ID No.：53)。

圖17：在使用自人類AD患者或人類PSP患者或人類FTD患者回收之人類Tau病理性原纖維作為晶種的細胞Tau聚集分析中，具有SEQ ID NO：14之輕鏈及SEQ ID NO：18之重鏈之Tau結合抗體的功效。

下文說明性描述之本發明可在本文未特定揭示之任一元件或多個元件、限制或多個限制缺乏之情況下適合地實施。

本發明將根據特定態樣及其實施例且參照某些圖式及實例來描述，但本發明不受其限制，而僅受申請專利範圍限制。

除非另外指明，否則技術術語係根據其常見含義使用。若向某些術語賦予特定含義，則下文在使用術語的上下文中提供術語定義。

若本發明說明書及申請專利範圍中使用術語「包含」，其不排除其他元件。出於本發明之目的，術語「由……組成(consisting of)」視為術語「包含(comprising of)」之較佳實施例。若下文中將群組定義為包含至少一定數目個實施例，則此亦理解為揭示較佳僅由此等實施例組成之群組。

出於本發明之目的，術語「獲得」視為術語「可獲得」之較佳實施例。若在下文中，例如抗體定義為可獲自特定來源，則此亦應理解為揭示抗體獲自此來源。

當提及單數名詞時，若使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a)」、「一(an)」或「該(the)」，則此包括複數個該名詞，除非具體陳述某物。術語「約」或「大約」表示熟習此項技術者理解仍確保相關特性之技術效果的準確度區間。該術語通常指示相對於指定數值偏離±10%，且較佳偏離±5%。

應瞭解，任何提及Tau結合抗體或其結合片段作為各種態樣之較佳實施例均涵蓋單株Tau結合抗體或其結合片段。

在各種態樣中，本發明提及包含相應輕鏈及/或重鏈區域之CDR 及可變區的抗體及其結合片段。僅包含輕鏈可變區或重鏈可變區的抗體或其結合片段可適用於例如製造方法，或適用於例如篩選可有效地與相應其他可變區締合的可變區。然而，應瞭解，每當提及包含相應輕鏈及/或重鏈區域之CDR及可變區的抗體及其結合片段時，其總是考慮為包含相應輕鏈及重鏈區域之CDR及可變區的較佳實施例抗體及其結合片段。

如本文所用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似術語係指獲得所要的藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，且/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。因此療法涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病的任何療法，且包括：(a)預防可能易患該疾病、但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制該疾病，亦即阻滯其發展；以及(c)緩解該疾病，亦即促使該疾病消退。

將Tau結合抗體或其結合片段稱為「治療活性劑」係指Tau結合抗體或其結合片段用於治療疾病的用途。

「治療有效量」係指Tau結合抗體或其結合片段的量，當投與哺乳動物或其他個體用於治療疾病時，該量足以對該疾病實施此類治療。治療有效量將視以下而變：Tau結合抗體或其結合片段、疾病及其嚴重度以及待治療個體的年齡、體重等。

將Tau結合抗體或其結合片段稱為「診斷活性劑」係指Tau結合抗體或其結合片段用於診斷疾病的用途。

「診斷有效量」係指Tau結合抗體或其結合片段的量，當用於對生物樣品進行診斷測試時，該量足以允許鑑別疾病或作為監測治療性干預之功效的手段來監測疾病組織之量。

本申請案部分地基於結合人類Tau之抗體(名稱為AB1)的鑑別。如本領域中所慣用，本文中的Tau殘基編號係指SEQ ID No.：35之Tau 同功異型物2(NCBI參考序列：NP_005901.2)。如下文中所闡述，AB1自免疫大鼠中分離且識別至少包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246的抗原決定基。此區域恰好位於存在於Tau之所有6種同功異型物中之前MTBR重複區域之前，此等同功異型物均可發現於中樞神經系統中。

實例確立，AB1能夠結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)(參見實例2.3)且AB1能夠偵測人類樣品冷凍切片中之神經元內神經原纖維纏結(NFT)、神經元外NFT、神經炎斑樣結構及神經纖維網絲(參見實例3.2)。在一些分析及模型中，經測試之AB1呈現的IC50低於先前技術抗體。假定此行為至少部分地由AB1之輕鏈可變區(VL)及重鏈可變區(VH)中之互補決定區(CDR)介導似乎為合理的。

針對此背景，本發明提供包含AB1之VL區域之CDR或特異性決定殘基(SEQ ID No.：7)及/或AB1之VH區域之CDR(SEQ ID No.：8)的Tau結合抗體或其結合片段。

抗體可變域中之殘基習知地根據Kabat等人所設計的系統編號。此系統闡述於Kabat等人，1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest，美國健康及人類服務部(US Department of Health and Human Services),NIH,USA(下文稱「Kabat等人(同上)」。本說明書中使用此編號系統，除非其中另有說明。

Kabat殘基名稱不總是直接與胺基酸殘基之線性編號對應。對應於基本可變域結構的縮短或插入結構組分、是否為構架或互補決定區(CDR)，實際線性胺基酸序列含有的胺基酸可比嚴格Kabat編號少或含有其他胺基酸。就指定抗體而言，可藉由將抗體序列中之同源殘基與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之正確Kabat編號。然而，根據Chothia(Chothia,C.及Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917 (1987))，等效於CDR-H1的環自殘基26延伸至殘基32。

因此鑑別出AB1之VL中的CDR1、CDR2及CDR3分別對應於SEQ ID NO.：1、2及3。因此鑑別出AB1之VH中的CDR1、CDR2及CDR3分別對應於SEQ ID NO.：4、36及6。通常已知可對本發明所提供的CDR產生一或多個胺基酸取代、添加及/或缺失，而不會顯著改變抗體結合至Tau的能力。熟習此項技術者可容易測試任何胺基酸取代、添加及/或缺失的影響，例如藉由使用實例中所述或由常見一般知識所知的方法來測試。在VH之最初鑑別之CDR2(CDRH2)(亦即SEQ ID No.：36)中，鑑別例如潛在的天冬醯胺去醯胺化位點且藉由丙胺酸或蘇胺酸置換鄰接絲胺酸殘基來修飾。CDRH2由此分別產生序列SEQ ID No.：37及38。為了簡潔起見，將CDRH2之三個序列(亦即SEQ ID NO.：36、37及38)組合為SEQ ID No.：5。

應瞭解，可進一步修飾CDR，諸如取代、添加及/或缺失，而不會實質性改變例如結合特性(相較於AB1)。此主要可藉由例如用相似胺基酸置換CDR中之胺基酸來達成。如本文所用，「相似性」表示在所比對序列中的任何特定位置，胺基酸殘基的類型在序列之間相似。舉例而言，可用白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。彼此間通常可取代之其他胺基酸包括(但不限於)：-苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)；-離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)；-天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽(具有酸性側鏈之胺基酸)；-天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；以及-半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。

針對此背景，本發明在一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1或與其至少90%一致之序 列的CDR1、選自SEQ ID No.：2或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：3或與其至少90%一致之序列的CDR3；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：5或與其至少90%一致之序列的CDR2及/或選自SEQ ID No.：6或與其至少90%一致之序列的CDR3。

如本文所用，「一致性」表示在所比對序列之任何特定位置，序列之間的胺基酸殘基一致。一致性程度可容易使用例如獲自NCBI的BLAST^TM軟體計算(Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W & States,D.J.1993,Nature Genet.3：266-272.Madden,T.L.等人，1996,Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.k.Madden,T.L.1997,Genome Res.7：649-656)。

CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及CDRH3分別與SEQ ID NO.：1、2、3、4、5及6的一致性可為至少90%，但亦可為較高的，諸如至少95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。

在此上下文中，本發明特定地考慮Tau結合抗體或其結合片段，其包含具有分別為SEQ ID No：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、5及6之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH。本發明亦考慮包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、36及6之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、37及6之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH；及包含以下之Tau結合抗體或其結合片段：具有分別為SEQ ID No.：1、2、3之CDRL1、CDRL2及 CDRL3的VL及具有分別為SEQ ID No：4、38及6之CDRH1、CDRH2及CDRH3的VH。

該第一態樣所涵蓋之Tau結合抗體或其結合片段可包含嵌入不同來源之構架區中的此等CDR。因此，CDR可包含於AB1之原始構架區(亦即SEQ ID No.：7之大鼠VL區域及SEQ ID No.：8之大鼠VH區域)內。然而，CDR亦可嵌入不同物種來源之構架區(諸如小鼠或人類構架區)中。視可與此類構架區組合之構架區及恆定區之來源而定，可獲得嵌合、人類化或完全人類Tau結合抗體或其結合片段。

嵌合Tau結合抗體或其結合片段將在與人類來源之恆定區組合之非人類來源之構架區內包含CDR。人類化Tau結合抗體或其結合片段將在與人類來源之恆定區組合之人類來源的構架區內包含CDR。

針對此背景，本發明在另一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：7或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：8或與其至少80%一致之序列。

VL及VH分別與SEQ ID No.：7及8的一致性可為至少80%，但亦可為較高的，諸如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更大靈活性。

在此上下文中，本發明特定地考慮包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段。

本發明尤其涵蓋人類化Tau結合抗體或其結合片段。

為此目的，可將CDR移植至人類構架區上。應瞭解，此類人類化CDR移植Tau結合抗體或其結合片段的鑑別可利用此項技術中已確立的方法達成。當移植CDR或特異性決定殘基時，可使用與CDR所來源之供體抗體類別/類型相關的任何適當受體人類可變區構架序列(參見例如Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Cabilly等人，歐洲專利第0,125,023 B1號；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Boss等人，歐洲專利第0,120,694 B1號；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，歐洲專利第0,194,276 B1號；Winter，美國專利第5,225,539號；Winter，歐洲專利第0,239,400 B1號；Padlan,E.A.等人，歐洲專利申請案第0,519,596 A1號)。

另外，在本發明之CDR移植抗體可變區中，構架區無需具有與受體抗體之序列完全相同的序列。從而可移植具有或不具有構架變化的CDR。根據供體可變區構架區與受體構架區之間的比較來引入構架變化可允許保持例如抗體親和力，否則作為人類化的結果，可能會使抗體親和力降低。舉例而言，可將異常殘基改變為受體鏈類別或類型中較頻繁存在的殘基。或者，可改變受體構架區中的所選殘基，使得其對應於供體抗體中之相同位置所發現的殘基(參見Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。此類變化應減少至為恢復供體抗體親和力所必需的最小程度。可使用Adair等人(1991)(Humanised antibodies.WO91/09967)概述之方案選擇供改變之殘基。在本發明之CDR移植抗體中，受體重鏈及輕鏈不必定來源於相同抗體且必要時可包含具有來源於不同鏈之構架區的複合鏈。

可用於本發明之人類受體構架實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM(Kabat等人，同上)。舉例而言，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈且EU、LAY及POM可用於重鏈與 輕鏈。或者，可使用人類生殖系序列；此等序列可獲得於：(http：//vbase.mrc-ce.cam.ac.uk/，或http：//www.imgt.org)。本發明特定地考慮使用人類V區IGKV2-29+JK2 J區SEQ ID No.：31(IMGT，http：//www.imgt.org/)作為輕鏈CDR的受體構架區及人類V區IGHV4-59+JH3 J區SEQ ID No.：32(IMGT，http：//www.imgt.org/)作為重鏈CDR之受體構架區。在SEQ ID No.：32中，可考慮例如位置1及48進行構架區中之殘基變化。位置1之麩醯胺酸殘基可變為麩胺酸鹽或天冬胺酸鹽。位置48中之異白胺酸殘基可變為甲硫胺酸。SEQ ID No.：32中之用於進行構架區中之殘基變化的其他位置可為位置37及/或71。舉例而言，SEQ ID NO：32之位置37的異白胺酸殘基可變為纈胺酸。位置71之蘇胺酸殘基可變為精胺酸。SEQ ID No.：31中用於進行構架區中之殘基變化的位置可為位置68。SEQ ID No.：31之位置68的絲胺酸殘基可變為異白胺酸。

針對此背景，本發明在另一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：9或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：10或與其至少80%一致之序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：9或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：11、12、13或與其至少80%一致之序列。

VL及VH分別與SEQ ID No.：9及10的一致性可為至少80%，但亦可為較高的，諸如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更大靈活性。

在此上下文中，本申請案特定地考慮包含SEQ ID No.：9之VL及SEQ ID No.：11之VH的Tau結合抗體或其結合片段；包含SEQ ID No.：9之VL及SEQ ID No.：12之VH的Tau結合抗體或其結合片段；以及包含SEQ ID No.：9之VL及SEQ ID No.：13之VH的Tau結合抗體或其結合片段。

人類化CDR移植Tau結合抗體或其結合片段可包含人類來源之恆定區。抗體或免疫球蛋白視其重鏈之恆定區胺基酸序列而定，分成以下類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步分成亞類(亞型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。特定而言，當抗體分子意欲用於治療用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區結構域，尤其IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意欲用於治療目的且不需要抗體效應功能時，可使用IgG2及IgG4同型。本發明特定地考慮IgG1及IgG4亞型之人類化抗體。

應瞭解亦可使用此等恆定區結構域之序列修飾。舉例而言，抗體恆定域中亦可進行一或多個胺基酸(諸如1或2個胺基酸)取代、添加及/或缺失，而不會顯著改變抗體結合至Tau的能力。亦可使用其中位置241之絲胺酸已變成脯胺酸的IgG4分子，如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(I),105-108中所述。

抗體效應功能包括ADCC及CDC。ADCC係指抗體依賴性細胞的細胞毒性。為了判定抗體原則上是否能夠介導ADDC，可藉由例如所謂的Cr⁵¹、Eu及S³⁵釋放分析來測量ADCC。含有所關注之抗原(亦即Tau)的靶細胞可用此等化合物標記。治療抗體結合之後，洗滌細胞且將表現Fc受體(諸如FcγRIII)的效應細胞與經抗體標記的靶細胞一起共 培育且可根據標記的釋放來監測靶細胞的溶解。另一種方法係利用所謂的aCella TOX^TM分析。CDC係指補體依賴性細胞的細胞毒性。為了判定抗體原則上是否能夠介導CDC，可如例如以下文獻中所述來活體外測量CDC：Delobel A等人，Methods Mol Biol.(2013)；988：115-43或Current Protocols in Immunology，第13章Complement(Print ISSN：1934-3671)。

針對此背景，本發明在另一個態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：14或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：15或與其至少70%一致的序列。

此類經分離之Tau結合抗體或其結合片段可包含：輕鏈，其包含SEQ ID No.：14或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：16、17、18或與其至少70%一致之序列。

輕鏈及重鏈分別與SEQ ID No.：14及15的一致性可為至少70%，但亦可為較高的，諸如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更多靈活性且恆定區可存在甚至更多的靈活性。

在此上下文中，本申請案特定地考慮包含SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：16之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段、包含SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：17之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段，以及包含SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：18之重鏈的Tau結合抗體或其結合片段

另外，本發明在另一態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含： 輕鏈，其包含SEQ ID No.：14或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：54或SEQ ID No.：55或與其至少70%一致的序列。

輕鏈及重鏈分別與SEQ ID No.：14及SEQ ID No.：54或55的一致性可為至少70%，但亦可為較高的，諸如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，視情況優選較高一致性。不同的一致性位置可根據相似性考慮因素選擇。應瞭解，就一致性而言，構架區相對於CDR可存在更多靈活性且恆定區可存在甚至更多的靈活性。

本發明亦提供人類Tau的特異性區域或抗原決定基，其被本發明所提供的抗體或其結合片段結合，特定而言，包含以下中之任一者的抗體或其結合片段：CDR-H1(SEQ ID No.：4)、CDR-H2(SEQ ID No.：5)、CDR-H3(SEQ ID No.：6)、CDR-L1(SEQ ID No.：1)、CDR-L2(SEQ ID No.：2)或CDR-L3(SEQ ID No.：3)，例如包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VL的抗體。

本發明進一步提供人類Tau之特異性區域或抗原決定基，特定言之，SEQ ID No.：35之胺基酸235-250內的抗原決定基，其被本發明中所提供的抗體或其結合片段所結合，特定言之，包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VL的抗體或其結合片段。

Tau之此特異性區域或抗原決定基的結合可藉由此項技術中已知的任何適合抗原決定基定位方法與本發明所提供之任一種抗體的組合來鑑別。此類方法之實例包括利用可特異性結合至含有由Tau結合抗體或其結合片段識別之抗原決定基之序列之抗體的最小片段篩選用於結合至本發明之Tau結合抗體或其結合片段的來源於SEQ ID No.：35之不同長度的肽。若中樞神經系統中存在不同的Tau同功異型物，則應瞭解本文詳述的方法中可使用任何此類同功異型物。在特定實例中， 可使用Tau的最長同功異型物，亦即如SEQ ID No.：35中所定義的同功異型物2。SEQ ID No.：35之Tau肽可以重組方式、合成方式或藉由蛋白分解消化Tau多肽來產生。結合抗體的肽可藉由例如西方墨點或質譜分析來鑑別。在另一實例中，NMR光譜法或X射線結晶學可用於鑑別Tau結合抗體或其結合片段所結合之抗原決定基。一旦鑑別，結合本發明之抗體的抗原決定基片段必要時可用作免疫原以獲得結合相同抗原決定基之其他抗體。另外，結合本發明之抗體的抗原決定基片段可用於獲得結合至相同抗原決定基的蛋白質，且必要時抑制Tau的至少一種生物活性，諸如包含超過10個胺基酸之蛋白質或多肽化合物，該等胺基酸係基於來源於例如以下之蛋白質骨架：脂質運載蛋白(「抗運載蛋白」)、纖維結合蛋白(「阿德奈汀(adnectins)，特林奈汀(trinectins)」、昆尼茲域、C型凝集素、轉鐵蛋白、γ-結晶體、半胱胺酸-nots、錨蛋白重複(「DARPins」)或蛋白質A(「親和抗體」)，如此項技術中所知(Tomlinson,2004；Mosavi等人，2004；Gill及Damle,2006；Nilsson及Tolmachev,2007；Binz等人，2004)。另外，結合相同抗原決定基的分子包括其他有機分子，包括包含不超過10個胺基酸的肽及環肽，以及肽模擬物。肽模擬物為基於在蛋白質-蛋白質相互作用位點所發現之胺基酸序列且在此項技術中已知的化合物(Sillerud及Larson,2005)。

針對此背景，本發明在另一態樣中提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至至少包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246的抗原決定基。整個抗原決定基似乎自SEQ ID No.：35之胺基酸232延伸至251。在一個實例中，本發明之抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含SEQ ID No.：35之胺基酸S238、A239、S241、T245、A246，及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250的殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至至少包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S235、S238、A239、K240、S241、Q244、T245及A246的抗原決定基。在一個實例中，本發明之抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含SEQ ID No.：35之胺基酸S235、S238、A239、K240、S241、Q244、T245、A246，及一或多個選自S237、R242、L243、V248及M250的殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至至少包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S235、S237、S238、A239、K240、S241、Q244、T245及A246的抗原決定基。在一個實例中，本發明之抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含SEQ ID No.：35之胺基酸S235、S237、S238、A239、K240、S241、Q244、T245、A246，及一或多個選自R242、L243、V248及M250的殘基。

在一個實例中，本發明之抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含SEQ ID No.：35的胺基酸殘基S235、S237、S238、A239、K240、S241、R242、L243、Q244、T245、A246、V248及M250。

包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段為結合至前述抗原決定基之Tau結合抗體或其結合片段的代表。

此類抗體可為嵌合、人類化或完全人類單株抗體或可用於獲得嵌合、人類化或完全人類單株抗體。

在另一態樣中，本發明提供經分離之中和Tau結合抗體或其結合片段，其中該中和Tau結合抗體或其結合片段結合包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246的Tau抗原決定基。在一個實例中，本發明之中和抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含 SEQ ID No.：35之胺基酸S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250的殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之中和Tau結合抗體或其結合片段，其中該中和Tau結合抗體或其結合片段結合至至少包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S235、S238、A239、K240、S241、Q244、T245及A246的抗原決定基。在一個實例中，本發明之中和抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含SEQ ID No.：35之胺基酸S235、S238、A239、K240、S241、Q244、T245及A246以及一或多個選自S237、R242、L243、V248及M250的殘基。

在另一態樣中，本發明提供經分離之中和Tau結合抗體或其結合片段，其中該中和Tau結合抗體或其結合片段結合至至少包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S235、S237、S238、A239、K240、S241、Q244、T245及A246的抗原決定基。在一個實例中，本發明之中和抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含SEQ ID No.：35之胺基酸S235、S237、S238、A239、K240、S241、Q244、T245、A246及一或多個選自R242、L243、V248及M250的殘基。

在一個實例中，本發明之中和抗體所結合的人類Tau抗原決定基包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S235、S237、S238、A239、K240、S241、R242、L243、Q244、T245、A246、V248及M250。

包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段為結合至前述抗原決定基之中和Tau結合抗體或其結合片段的代表。

此類中和抗體可為嵌合、人類化或完全人類單株抗體或可用於獲得嵌合、人類化或完全人類單株抗體。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片 段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與上述Tau結合抗體或其結合片段結合至大體上相同的Tau抗原決定基。對抗原決定基的結合可如針對抗原決定基定位所述，使用例如包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段作為參考物來測定。

此類抗體可為嵌合、人類化或完全人類單株抗體或可用於獲得嵌合、人類化或完全人類單株抗體。

本發明亦提供特異性結合至人類Tau之區域或抗原決定基(特定而言，SEQ ID No.：35之胺基酸235-250內的抗原決定基，如藉由雜核單量子相干性核磁共振(HSQC NMR)所測定)的Tau結合抗體或其結合片段。

此類抗體可為嵌合、人類化或完全人類單株抗體或可用於獲得嵌合、人類化或完全人類單株抗體。

在另一態樣中，本發明提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與上述Tau結合抗體競爭結合至Tau。

在此上下文中，本發明特定地涵蓋經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。

此類抗體可為嵌合、人類化或完全人類單株抗體或可用於獲得嵌合、人類化或完全人類單株抗體。

對Tau的競爭結合可根據在可包含SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的參考抗體或其結合片段存在下，抗體或其結合片段對Tau之結合減少至少約50%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%或約100%來確定。結合可使用表面電漿共振(使用BIAcore®設備)、各種螢光偵測技術(例如螢光相關光譜法、螢光交叉關聯法、螢光壽命量測等)或各種類型之放射免疫 分析或用於追蹤結合至標靶分子之抗體的其他分析來量測。

術語「Tau結合抗體或其結合片段」意謂抗體或其結合片段藉助於其可變區特異性結合至Tau，亦即結合Tau抗原的親和力大於不為Tau同源物的其他抗原。「Tau結合抗體或其結合片段」藉助於其可變區結合至Tau的親和力是不為Tau同源物之其他抗原的至少兩倍、至少五倍、至少10、20、100、10³、10⁴、10⁵或至少10⁶倍。應瞭解，Tau結合抗體及其結合片段然而亦可經由與Tau結合抗體及其結合片段之可變區外部序列的相互作用而與其他蛋白質(例如金黃色葡萄球菌蛋白質A或ELISA技術中的其他抗體)發生相互作用。術語「Tau結合抗體或其結合片段」不意欲涵蓋此類後者結合特性，此等特性係由Tau結合抗體及其結合片段之可變區外部的序列介導且特定言之，係由Tau結合抗體及其結合片段之恆定區介導。測定抗體結合特異性的篩選分析已熟知且在此項技術中常規地實施。就抗體(或其結合片段)結合至其抗原的親和力而言，Tau結合抗體或其結合片段可具有奈莫耳濃度範圍內的平衡解離常數(K_D)。因此，K_D可低於約1*10^-6，例如低於約5*10^-7，諸如約2*10^-7或低於2*10^-7，且可可使用例如表面電漿共振及BIAcore裝置量測，如實例中所述。

如上所述，本發明提供Tau結合抗體或其結合片段。全長抗體包括恆定域及可變區。恆定區在抗體之抗原結合片段中可不一定以其全長形式存在。然而應瞭解，每當本申請案考慮使用抗體介導的ADCC及/或CDC時，結合片段必須包含長度仍足以能夠介導ADCC及/或CDC的恆定區。

如上所述，本發明亦關於人類Tau結合抗體或其結合片段，其可作為人類化的替代方案產生。舉例而言，可產生在免疫接種後能夠在不產生內源鼠類抗體的情況下產生人類抗體之完整譜系的轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中之抗體重 鏈接合區(JH)基因的同型接合子缺失導致內源抗體產生被完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此類生殖系突變型小鼠中將產生特異性針對特定抗原的人類抗體(用該抗原免疫接種攜帶人類生殖系免疫球蛋白基因的轉殖基因動物後)。用於產生此類轉殖基因動物的技術及自此類轉殖基因動物中分離及產生人類抗體的技術在此項技術中已知(Lonberg,2005；Green,1999；Kellermann及Green,2002；Nicholson等人，1999)。或者，在轉殖基因動物(例如小鼠)中，唯編碼小鼠抗體之可變區的免疫球蛋白基因用相應的人類可變免疫球蛋白基因序列置換。編碼抗體恆定區的小鼠生殖系免疫球蛋白基因保持不變。以此方式，轉殖基因小鼠之免疫系統中的抗體效應功能及因此B細胞發育基本上不變，從而可在活體內抗原攻擊後使得抗體反應改良。一旦編碼所關注之特定抗體的基因已自此類轉殖基因動物中分離，則編碼恆定區的基因可用人類恆定區基因置換以便獲得完全人類抗體。用於活體外獲得人類抗體之抗體片段的其他方法係基於呈現技術，諸如噬菌體呈現或核糖體呈現技術，其中使用至少部分地以人工方式或自供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系產生的重組DNA文庫。用於產生人類抗體的噬菌體及核糖體呈現技術在此項技術中已熟知(Winter等人，1994；Hoogenboom,2002；Kretzschmar及von Ruden,2002；Groves及Osbourn,2005；Dufner等人，2006)。

人類抗體亦可自經分離之人類B細胞中產生，該等人類B細胞用所關注之抗原離體免疫且隨後融合而產生融合瘤，接著可篩選此等融合瘤以產生最佳人類抗體(Grasso等人，2004；Li等人，2006)。

如本文所用，術語「Tau結合抗體」或其結合部分係指結合至Tau且抑制Tau之至少一種生物活性的抗體或其結合片段。Tau的生物活性在此項技術中已知且包括(但不限於)Tau分子聚集，形成不同類型的聚集物，諸如上述纏結或原纖維。在一個特定實施例中，如本文所 用，「中和Tau結合抗體」或其結合片段係指活體外分析中，諸如下文實驗3.1所述的活體外分析中，結合Tau且抑制Tau聚集的抗體或其結合片段。

如本文所用，術語'抗體'大體上係指完整(完全，全長)抗體，亦即包含兩條重鏈及兩條輕鏈的元件。抗體可包含其他結合域，例如WO 2007/024715中所揭示的分子DVD-Ig，或WO2011/030107中所述的所謂(FabFv)2Fc。因此，如本文所使用之抗體包括二價、三價或四價全長抗體。

抗體結合片段包括單鏈抗體(亦即全長重鏈及輕鏈)；Fab、經修飾之Fab、Fab'、經修飾之Fab'、F(ab')₂、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-scFv、Fab-scFc、二硫鍵穩定化Fab-scFv、單域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、scFv-scFc、dsscFv、dsscFv-scFc、二價、三價或四價抗體、雙scFv、雙功能抗體、三功能抗體、三功能抗體、四功能抗體；域抗體(dAbs)，諸如sdAb；VHH及VNAR片段，及上述任一者之抗原決定基結合片段(參見例如Holliger及Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair及Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用於產生及製造此等抗體片段之方法在此項技術中已熟知(參見例如Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首次揭示於WO2009/040562中且其二硫化物穩定型Fab-dsFv首次揭示於WO2010/035012中。Fab-scFv之二硫化物穩定化形式描述於WO2013/068571中。包含scFc形式的抗體形式首次描述於WO2008/012543中。用於本發明中之其他抗體片段包括國際專利申請案WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171中所述的Fab及Fab'片段。

多價抗體可包含多特異性，例如雙特異性，或可具單特異性(參見例如WO92/22583及WO05/113605)。後者之一個此實例為如 WO92/22583中所述之Tri-Fab(或TFM)。

在一個實施例中，提供Fab片段。

在一個實施例中，提供Fab'片段。

典型Fab'分子包含重鏈及輕鏈對，其中重鏈包含可變區VH、恆定域CH1及天然或經修飾之鉸鏈區且輕鏈包含可變區VL及恆定域CL。

在一個實施例中，提供根據本發明之Fab'的二聚物以產生F(ab')2，例如可經由鉸鏈發生二聚。

在一個實施例中，抗體或其結合片段包含結合域。結合域通常將包含6個CDR，三個來自重鏈且三個來自輕鏈。在一個實施例中，CDR位於一個構架中且一起形成可變區。因此，在一個實施例中，抗體或結合片段包含特異性針對包含輕鏈可變區及重鏈可變區之抗原的結合域。

應瞭解，本發明所提供之Tau結合抗體或其結合片段的親和力可使用此項技術中已知之適合方法改變。本發明因此亦關於本發明之抗體分子的變異體，其對Tau具有改良之親和力。此類變異體可藉由多種親和力成熟方案獲得，包括使CDR發生突變(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、鏈改組(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大腸桿菌突變菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改組(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌體呈現(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)及性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)論述此等親和力成熟方法。

Tau結合抗體及其結合片段因此亦可涵蓋例如具有一或多個保守取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守取代)的前文特定提及之輕鏈或重鏈胺基酸序列中之任一者。可 確定胺基酸序列中的位置作為保守取代的候選位置，且可選擇合成及天然存在之胺基酸來實現任何特定胺基酸的保守取代。用於選擇保守取代的考慮因素包括產生任何特定胺基酸取代的背景、側鏈的疏水性或極性、側鏈的一般尺寸，及在生理學條件下具有酸性或鹼性特徵的側鏈之pK值。舉例而言，離胺酸、精胺酸及組胺酸彼此間取代通常為適合的。如此項技術中所知，此係因為全部三種胺基酸具有鹼性側鏈，然而與組胺酸(約6)相比，離胺酸及精胺酸之側鏈的pK值彼此間更接近(約10及12)。類似地，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸彼此間的取代通常為適合的，其限制條件為甘胺酸不宜頻繁地取代群組中的其他成員。彼此間宜頻繁取代之其他胺基酸群組包括(但不限於)由麩胺酸及天冬胺酸組成之群；由苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸組成之群；及由絲胺酸、蘇胺酸及視情況存在之酪胺酸組成之群。

如在本發明之上下文中提及的Tau結合抗體及其結合片段可涵蓋本文揭示之例示性抗體、片段及序列的衍生物。「衍生物」包括已經化學修飾之Tau結合抗體及其結合片段。化學修飾之實例包括共價連接一或多個聚合物，諸如水溶性聚合物、N連接或O連接型碳水化合物、糖類、磷酸鹽及/或其他此類分子，諸如可偵測標記，諸如螢光團。

必要時，用於本發明中之Tau結合抗體或其結合片段因此可與一或多個效應分子結合。應瞭解效應分子可包含單個效應分子或兩個或多於兩個如此連接以形成可連接至本發明抗體之單一部分的此類分子。在需要獲得連接至效應分子之抗體片段的情況下，此可藉由其中抗體片段直接或經由偶合劑連接至效應分子之標準化學或重組DNA程序來製備。用於此類效應分子與抗體結合之技術在此項技術中已熟知(參見Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人 編，1987，第623-53頁；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62：119-58及Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。用於結合效應分子的此等技術可包括位點特異性結合或非位點特異性或隨機結合。特定化學程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03/031581中所述之程序。或者，在效應分子為蛋白質或多肽之情況下，可使用重組DNA程序，例如如WO 86/01533及EP0392745中所述來實現鍵聯。或者，效應分子中的特定連接位點可工程改造成本發明之抗體或其抗原結合片段，例如如WO 2008/038024中所述。另外，可利用偶合劑使效應分子與本發明之抗體或其抗原結合片段連接，例如如WO 2005/113605中所述。熟習此項技術者應瞭解，上述可能性可單獨或組合使用。

如本文所用，術語效應分子包括例如藥物、毒素、生物學活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、合成或天然存在之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金屬、奈米顆粒及報導基團，諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜法偵測的化合物。如本文所用，效應分子亦包括治療劑，諸如化學治療劑、治療多肽、奈米顆粒、脂質體或治療核酸。

其他效應分子可包括螯合放射性核素，諸如¹¹¹In及⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、鉍²¹³、鐦²⁵²、銥¹⁹²及鎢¹⁸⁸/錸¹⁸⁸；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、類紫杉醇及蘇拉明(suramin)。

其他效應分子包括蛋白質、肽及酶。所關注之酶包括(但不限於)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。所關注之蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白；毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子或 組織纖維蛋白溶酶原活化因子；血栓藥劑或抗血管生成劑，例如血管生長抑素或內皮生長抑素；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素、介白素-1(IL-I)、介白素-2(IL-2)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白，或包含超過10個胺基酸的其他蛋白質或多肽化合物，該等胺基酸係基於來自例如以下的蛋白質骨架：脂質運載蛋白(「抗運載蛋白」)、纖維結合蛋白(「阿德奈汀」，特林奈汀)、昆尼茲域、C型凝集素、轉鐵蛋白、γ-結晶體、半胱胺酸-nots、錨蛋白重複(「DARPins」)、Fyn SH3域(「非諾莫(fynomers)」)或蛋白質A(「親和抗體」)，如此項技術中所知(Tomlinson,2004；Mosavi等人，2004；Gill及Damle,2006；Nilsson及Tolmachev,2007；Binz等人，2004；Silacci等人，2014)。

其他效應分子包括增強或促進血腦障壁滲透的肽及蛋白質。舉例而言，WO2010/043047、WO2010/063122、WO2010/063123或WO2011/041897描述可充當能夠傳輸治療分子跨越血腦障壁之載體的肽或多肽及使其與治療分子結合的方法。在血腦障壁滲透之情形下，所關注之肽及蛋白質包括(但不限於)結合至血腦障壁受體(諸如轉鐵蛋白受體、葡萄糖受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白8、低密度脂蛋白受體相關蛋白1及肝素結合表皮生長因子樣生長因子)的肽及蛋白質。或者，效應分子為特異性結合至上述血腦障壁受體之一的抗體片段，諸如域抗體、駱駝科抗體或鯊魚源抗體(VNAR)。

其他效應分子可包括適用於例如診斷之可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性核素、正電子發射金屬(諸如可用於正電子發射斷層攝影術或單光子發射電腦化斷層攝影術中)及非放射性順磁金屬離子。關於適 用於診斷學中之可與抗體結合的金屬離子，一般參見美國專利第4,741,900號。適合酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白及生物素；適合螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適合發光物質包括魯米諾(luminol)；適合生物發光物質包括螢光素酶、螢光素及水母素；且適合放射性核素包括¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga及¹⁸F。作為可偵測物質適用於診斷之效應分子的特定類型包括缺電子四嗪及反-環辛烯(TCO)，如Wyffels等人，2014,Nuclear Medicine and biology 41(2014)：513-523中所述，其中可投與連接至四嗪的本發明Tau結合抗體且使其達到最大吸收及自非標靶位點足夠清除，接著隨後投與經適合放射性核素標記的TCO或最佳化TCO類似物，使得TCO共價結合本發明之Tau結合抗體上的四嗪，且藉由例如正電子發射斷層攝影術或單光子發射電腦化斷層攝影術實現其偵測。

在一個實施例中，提供連接至放射性核素或連接至四嗪的Tau結合Fab、Fab'或scFv。連接至放射性核素或連接至四嗪可經由位於抗體片段中之任何可利用之胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基(例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基)、藉助於連接來達成。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至片段中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之Tau結合抗體或其結合片段為經修飾之Fab片段，其中該修飾為向其重鏈的C末端添加一或多個胺基酸以實現效應分子的連接。適合的是，其他胺基酸形成經修飾之鉸鏈區，其含有一或多個可連接至效應分子之半胱胺酸殘基。在一個實施例中，若放射性核素為金屬離子，諸如¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁶⁴Cu或⁶⁸Ga，則其可被巨環螯合劑結合，例如如Turner等人(Br. J.Cancer,1994,70：35-41；Comparative biodistribution of indium-111-labelled macrocycle chimeric B72.3 antibody conjugates in tumour-bearing mice)所述，其中後者又共價連接至抗體或抗體片段的前述胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基。在另一個實施例中，結合放射性核素的後者巨環螯合劑可為WO05/113605中所述的效應分子，該效應分子為連接兩個或超過兩個抗Tau抗體或其片段之交聯劑的一部分。

在另一實例中，效應分子可延長抗體的活體內半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增強抗體跨越上皮障壁傳送至免疫系統。適合的此類型效應分子之實例包括聚合物、白蛋白及白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如WO05/117984中所述之彼等物。

在效應分子為聚合物之情況下，其一般可為合成或天然存在之聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧伸烷基聚合物或分支鏈或非分支鏈多醣(例如均多醣或雜多醣)。

可視情況存在於上述合成聚合物上的特定取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。

合成聚合物之特定實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

天然存在之特定聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。

在一個實施例中，效應分子為白蛋白或其片段，諸如人類血清白蛋白或其片段。

聚合物尺寸可根據需要變化，但平均分子量通常在500Da至50000Da之範圍內，例如5000Da至40000Da，諸如20000Da至40000Da。聚合物尺寸尤其可基於產品之預定用途來選擇，例如局域化至某些組織(諸如腦)中或延長循環半衰期之能力(欲回顧，參見 Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，舉例而言，希望產物離開循環且滲入組織中。

適合聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在約15000Da至約40000Da範圍內。

在一個實例中，用於本發明中之抗體連接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一個特定實例中，抗體為Tau結合抗體或其結合片段且PEG分子可經由位於抗體片段中之任何可利用之胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基連接，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至片段中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之Tau結合抗體或其結合片段為經修飾之Fab片段，其中該修飾為向其重鏈的C末端添加一或多個胺基酸以實現效應分子的連接。適合的是，其他胺基酸形成經修飾之鉸鏈區，其含有一或多個可連接至效應分子之半胱胺酸殘基。可利用多個位點連接兩個或超過兩個PEG分子。

PEG分子宜經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連接。連接至經修飾之抗體片段的每個聚合物分子可共價連接至位於片段中之半胱胺酸殘基之硫原子。共價鍵一般為二硫鍵或尤其硫-碳鍵。在硫醇基用作連接點之情況下，可使用適當活化之效應分子，例如硫醇選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。活化聚合物可用作起始物質來製備如上所述之經聚合物修飾之抗體片段。活化聚合物可為含有硫醇反應基之任何聚合物，諸如α-鹵基羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺(例如順丁烯二醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物。此類起始物質可市購(例如購自Nektar，前身為Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可使用習知化學程序 由市售起始物質製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，前身為Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)及M-PEG-SPA(可獲自Nektar，前身為Shearwater)。

在另一態樣中，本發明提供包含編碼Tau結合抗體及其結合片段之核酸序列的核酸分子；包含編碼其可變輕鏈及/或重鏈之核酸序列的核酸分子；及包含編碼其可變輕鏈及/或重鏈之CDR1、CDR2及/或CDR3之核酸序列的核酸分子。

舉例而言，AB1(SEQ ID No.：7)之VL可由SEQ ID No.：19)編碼。AB1(SEQ ID No.：8)之VH可由SEQ ID No.：20)編碼。

SEQ ID No.：9之人類化VL可由SEQ ID No.：21編碼。SEQ ID No.：12之人類化VH可由SEQ ID No.：22編碼且SEQ ID No.：13之人類化VH可由SEQ ID No.：23編碼。

SEQ ID No.：14之人類化輕鏈可由SEQ ID No.：24編碼。SEQ ID No.：17之人類化重鏈可由SEQ ID No.：25編碼且SEQ ID No.：18之人類化重鏈可由SEQ ID No.：26編碼。SEQ ID No.：54之人類化重鏈可由SEQ ID No.：56編碼且SEQ ID No.：55之人類化重鏈可由SEQ ID No.：57編碼。

Tau結合抗體及其結合片段可由單一核酸(例如包含編碼抗體之輕鏈及重鏈多肽之核苷酸序列的單一核酸)編碼，或由兩個或超過兩個各別核酸編碼(各編碼抗體或抗體片段的不同部分)。就此而言，本發明提供一或多個編碼任一種前述抗體或結合片段的核酸。核酸分子可為DNA、cDNA、RNA及其類似物。

舉例而言，編碼抗體重鏈及輕鏈之一部分或全部的DNA序列可根據需要自經測定之DNA序列或基於相應胺基酸序列來合成。編碼受體構架序列之DNA可由熟習此項技術者廣泛獲得且容易基於其已知胺基酸序列合成。

可利用標準分子生物學技術製備編碼本發明之抗體分子的DNA序列。所要DNA序列可使用寡核苷酸合成技術完全或部分地合成。適當時可使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術。

較佳地，編碼核酸序列可操作地連接至表現控制序列，從而允許在原核或真核細胞中表現。該聚核苷酸之表現包含將聚核苷酸轉錄成可轉譯mRNA。確保在真核細胞(較佳為哺乳動物細胞)中達成表現的調控元件已為熟習此項技術者熟知。其通常包含確保轉錄起始的調控序列且視情況包含確保轉錄終止及轉錄物穩定化的聚A信號。其他調控元件可包括轉錄以及轉譯增強子，及/或天然相關的或異質啟動子區域。

因此，本發明在另一態樣中提供包含編碼Tau結合抗體及其結合片段之此類核酸序列的選殖或表現載體。

「載體」為能夠將核酸序列運載至適合宿主細胞(例如其中可發生所編碼多肽之合成)中的任何分子或組合物。通常且較佳地，載體為一種核酸，其已使用在此項技術中已知可併入所要核酸序列(例如本發明之核酸)的重組DNA技術經工程改造。表現載體通常含有以下組分中之一或多者(若其已不由核酸分子提供)：啟動子、一或多個增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點的完整內含子序列、分泌用的前導序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現之多肽之核酸的多酶切點接頭區域，及可選標記元件。

通常選擇在使用載體(該載體與宿主細胞機構相容，使得可發生基因擴增及/或基因表現)的宿主細胞中發揮作用的載體。

本發明因此在另一態樣中提供包含如上文所述之選殖或表現載體的宿主細胞及/或編碼如上文所述之Tau結合抗體及其結合片段的核酸序列。

宿主細胞可為能夠經核酸或載體轉型以便產生由其編碼之Tau結合抗體或其結合片段的任何細胞類型。包含核酸或載體的宿主細胞可用於產生Tau結合抗體或其結合片段，或其部分(例如由核酸或載體編碼的重鏈序列或輕鏈序列)。將核酸或載體引入細胞中之後，在適合於表現所編碼序列的條件下培養細胞。接著可自細胞中分離抗體、抗原結合片段或該抗體之一部分。

宿主細胞可為原核宿主細胞(諸如大腸桿菌)或真核宿主細胞(諸如酵母細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞)。在適當條件培養下培養時，宿主細胞表現抗體或其結合片段，隨後可自培養基收集(若宿主細胞將抗體或其結合片段分泌至培養基中)或直接自產生抗體或其結合片段的宿主細胞收集(若不分泌抗體或其結合片段)。適當宿主細胞之選擇將視多種因素而定，諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物學活性分子之容易性。宿主細胞之選擇部分地取決於抗體或其結合片段是否經轉錄後修飾(例如糖基化及/或磷酸化)。若如此，則酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞較佳。

適合哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。適用於本發明中之中國倉鼠卵巢(CHO細胞)的類型可包括CHO及CHO-K1細胞，包括dhfr-CHO，諸如可結合DHFR可選標記使用的CHO-DG44細胞及CHODXB11細胞或可結合麩醯胺酸合成酶可選標記使用之CHOKI-SV細胞。多者獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC),Manassas,Va。實例包括哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(ATCC第CCL61號)、人類胚腎(HEK)293或293T細胞(ATCC第CRL1573號)、3T3細胞(ATCC第CCL92號)或PER.C6細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包括淋巴細胞性細胞株，例如NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。

本發明之另一態樣提供一種產生Tau結合抗體或其結合片段的方法，該方法包含在適合於自例如編碼Tau結合抗體或其結合片段之DNA表現Tau結合抗體或其結合片段的條件下培養含有例如載體的宿主細胞及分離抗體分子。

Tau結合抗體或其結合片段可僅包含重鏈或輕鏈多肽，在此情況下僅需使用重鏈或輕鏈多肽編碼序列轉染宿主細胞。為產生包含重鏈與輕鏈之產物，細胞株可經兩種載體轉染，第一載體編碼輕鏈多肽且第二載體編碼重鏈多肽。或者，可使用單一載體，載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。

Tau結合抗體或其結合片段(根據本發明之抗體及片段)在宿主細胞中得到高量的表現。因此，抗體及/或片段的特性有助於商業加工。

因此，提供一種培養宿主細胞且表現Tau結合抗體或其結合片段、分離後者且視情況純化其以提供經分離之Tau結合抗體或其結合片段的方法。在一個實施例中，該方法進一步包含使效應分子與經分離之抗體或片段結合(例如與尤其如本文所述之PEG聚合物結合)的步驟。

Tau結合抗體或其結合片段可調配成組合物，尤其醫藥或診斷組合物。醫藥組合物包含治療或預防有效量之Tau結合抗體或其結合片段與適合載劑(例如醫藥學上可接受之藥劑)的混合物。診斷組合物包含診斷有效量的Tau結合抗體或其結合片段與適合載劑(例如診斷學上可接受之藥劑)的混合物。

本發明醫藥組合物中使用之醫藥學上可接受之藥劑包括載劑、賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調味及稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、增積劑、緩衝液、傳送媒劑、張力劑、共溶劑、濕潤劑、錯合劑、緩衝劑、抗微生物劑及界面活性劑。

組合物可呈液體形式或呈凍乾或冷凍乾燥形式且可包括一或多種凍乾保護劑、賦形劑、界面活性劑、高分子量結構添加劑及/或增積劑(參見例如美國專利6,685,940、6,566,329及6,372,716)。

組合物可適於非經腸投與。例示性組合物適合於藉由可供熟習此項技術者使用的任何路徑注射或輸注至動物中，諸如關節內、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、腦內(腦實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內或病灶內途徑。非經腸調配物通常為無菌、無熱原質的等張水溶液，其視情況含有醫藥學上可接受之防腐劑。

非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇溶液/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖的彼等物)，及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物。一般參見Remington's Pharmaceutical Science，第16版，Mack編，1980，該文獻以引用的方式併入本文中。

本文所述之醫藥組合物可以在特定局部環境中提供產物(例如藥團、儲集式作用)的局域濃度及/或增加穩定性或半衰期的方式調配成供控制或維持傳送。組合物可包括本發明之抗體、結合片段、核酸或載體與以下之調配物：聚合物化合物(諸如聚乳酸、聚乙醇酸等)之微粒製劑，以及諸如以下之藥劑：生物可降解基質、可注射微球體、微膠囊顆粒、微膠囊、生物溶蝕性顆粒珠粒、脂質體，及提供活性劑之控制或持續釋放、接著可以儲槽式注射遞送的可植入傳送裝置。

或者或另外，組合物可藉助於植入已吸收或囊封有本發明之抗體、結合片段、核酸或載體的膜、海綿或其他適當材料之所影響區域 中來局部投與。在使用植入裝置的情況下，可將裝置植入任何適合組織或器官中，且本發明之抗體、結合片段、核酸或載體可直接經由該裝置、藉助於藥團傳送，或藉助於連續投與或藉助於使用連續輸注的導管傳送。

包含Tau結合抗體或其結合片段的醫藥組合物可調配成用於吸入，諸如乾粉形式。吸入溶液亦可調配於液化推進劑中用於氣溶膠傳送。在又另一個調配物中，溶液可霧化。

本發明之一個態樣係關於Tau結合抗體及其結合片段作為治療活性劑治療疾病的用途。

本發明之另一態樣係關於Tau結合抗體及其結合片段用於治療Tau蛋白病的用途。已描述含有Tau包裹體(Clavaguera等人，Brain Pathology 23(2013)342-349)的Tau蛋白病包括阿茲海默氏病(AD)；肌肉萎縮性側索硬化/巴金森氏症-癡呆綜合症；嗜銀顆粒疾病；慢性創傷性腦病變；皮質基底核退化症；彌漫性神經原纖維纏結伴鈣化；唐氏症候群；英國家族性癡呆症；丹麥家族性癡呆症；與MAPT突變所引起之染色體17關聯的額顳葉型癡呆症及巴金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-謝恩克爾疾病；瓜德羅普島巴金森氏症；肌緊張性營養不良；出現腦鐵積聚的神經退化；C型尼曼-匹克疾病；非關島運動神經元疾病伴神經原纖維纏結；匹克疾病；腦炎後巴金森氏症；朊病毒蛋白大腦澱粉樣蛋白血管病變；漸進性皮層下神經膠樣變性；進行性核上麻痺(PSP)；SLC9A6相關智力遲鈍；亞急性硬化性全腦炎；僅纏結癡呆症；及出現球狀神經膠質包裹體的白質tau蛋白病。

本發明之另一態樣因此係關於Tau結合抗體及其結合片段用於治療阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺的用途。

相應地，本發明亦關於藉由向有需要的個體投與治療活性量之Tau結合抗體或其結合片段來治療Tau蛋白病(特定而言，阿茲海默氏 病及/或進行性核上麻痺)的方法。

本發明亦關於Tau結合抗體或其結合片段用於製造供治療Tau蛋白病(特定言之，阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)之藥劑的用途。

在本發明之另一態樣中，Tau結合抗體或其結合片段可單獨或與其他藥劑組合用於治療。舉例而言，Tau結合抗體或其結合片段可與至少一種其他治療劑共投與。在某些態樣中，其他治療劑為當正使用Tau結合抗體或其結合片段治療時有效治療相同或不同病症的治療劑。例示性其他治療劑包括(但不限於)：膽鹼酯酶抑制劑(諸如多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rovastigmine)及他可林(tacrine))、NMDA受體拮抗劑(諸如美金剛(memantine))、澱粉樣蛋白β肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARy促效劑、HMS-CoA還原酶抑制劑(抑制素)、安目帕克(ampakines)、鈣離子通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝糖合成酶激酶抑制劑、靜脈內免疫球蛋白、蕈毒鹼受體促效劑、菸鹼受體調節劑、主動或被動澱粉樣蛋白β肽免疫接種、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗澱粉樣蛋白β肽抗體或其他抗Tau抗體。其他例示性神經學藥物可選自生長激素或神經營養因子；實例包括(但不限於)腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、神經營養素-4/5、纖維母細胞生長因子(FGF)-2及其他FGF、神經營養素(NT)-3、紅血球生成素(EPO)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉型生長因子(TGF)-α、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGF)、介白素-1受體拮抗劑(IL-lra)、睫毛神經營養因子(CNTF)、神經膠質源神經營養因子(GDNF)、神經秩蛋白(neurturin)、血小板源生長因子(PDGF)、海瑞古林(heregulin)、神經調節蛋白、青蒿琥酯(artemin)、珀瑟芬(persephin)、介白素、神經膠質細胞株源神經營養因子(GFR)、顆粒球群落刺激因子(CSF)、顆粒球-巨噬細胞- CSF、軸突導向因子(netrins)、心營養素-1、刺蝟蛋白(hedgehogs)、白血病抑制因子(LIF)、中期因子(midkine)、多效生長因子(pleiotrophin)、骨形態發生蛋白(BMP)、軸突導向因子、皂角素(saposins)、信號素(semaphorins)及幹細胞因子(SCF)。在某些實施例中，選擇能夠緩解神經學藥物之一或多種副作用的至少一種其他治療劑。上文提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或超過兩種治療劑包括於相同或各別調配物中)及各別投與，在此情況下，Tau結合抗體或其結合片段之投與可在其他治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。Tau結合抗體或其結合片段亦可與其他干預療法組合使用，諸如(但不限於)輻射療法、行為療法，或此項技術中已知且適於治療或預防神經病症的其他療法。

本發明之另一態樣係關於Tau結合抗體及其結合片段用作診斷活性劑的用途。

本發明之一個態樣亦關於Tau結合抗體及其結合片段用於診斷Tau蛋白病(特定而言，阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)的用途。

此類診斷測試較佳可針對生物樣品進行。「生物樣品」涵蓋獲自個體之多種樣品類型且可用於診斷或監測分析。定義涵蓋腦脊髓液、血液及生物學來源之其他液體樣品、實體組織樣品(諸如活檢試樣)或組織培養基或來源於其的細胞及其子代。定義亦包括在獲取之後已以任何方式操控的樣品，諸如藉由試劑處理、增溶，或富集某些組分，諸如聚核苷酸。術語「生物樣品」涵蓋臨床樣品且亦包括培養中之細胞、細胞上清液、細胞溶胞物、血清、血漿、生物體液及組織樣品。術語「生物樣品」包括尿液、唾液、腦脊髓液、血液部分(諸如血漿及血清)，及其類似物。

診斷測試較佳可針對不與人類或動物身體接觸的生物樣品進行。此類診斷測試亦稱為活體外測試。

活體外診斷測試可依賴於活體外偵測已獲自個體之生物樣品中之Tau的方法，該方法包含以下步驟：i)使生物樣品與如本文所述的Tau結合抗體或其結合片段接觸；及ii)偵測如本文所述之Tau結合抗體或其結合片段對Tau的結合。藉由比較所偵測之Tau含量與適合對照，接著可診斷tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)之存在或存在可能性。因此可使用此類偵測方法判定個體是否患有tau蛋白病(包括確定tau蛋白病之階段(嚴重度))或處於出現tau蛋白病的風險中。

本發明因此提供活體外診斷個體中之tau蛋白病(諸如阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺)的方法，該方法包含以下步驟：i)藉由使用如本文所述的Tau結合抗體或其結合片段評估自個體獲得之生物樣品中的Tau含量或狀態；及ii)將Tau含量或狀態與指示正常對照個體中之Tau含量或狀態的參考值、標準值或或正常對照值進行比較。生物樣品中之Tau多肽含量及/或狀態與正常對照值之間的顯著差異表示個體患有tau蛋白病，諸如阿茲海默氏病及/或進行性核上麻痺。

根據本文已描述之此等各種態樣及實施例，本發明尤其涵蓋：

1.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：2或與其至少90%一致之序列的CDR2及選自SEQ ID No.：3或與其至少90%一致之序列的CDR3；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4或與其至少90%一致之序列的CDR1、選自SEQ ID No.：5或與其至少90%一致之序列的CDR2及/或選自SEQ ID No.：6或與其至少90%一致之序列的CDR3。

2.如實施例1之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含 輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1之CDR1、選自SEQ ID No.：2之CDR2及選自SEQ ID No.：3之CDR3；及重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4之CDR1、選自SEQ ID No.：5之CDR2及/或選自SEQ ID No.：6之CDR3。

3.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：5中之X₁為A。

4.如實施例1或2之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：5中之X1為T。

5.如實施例1、2、3或4中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

6.如實施例5之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合、人類化或完全人類抗體。

7.如實施例6之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為IgG1或IgG4亞型之人類化抗體。

8.如實施例1、2、3、4、5、6或7中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基A246、A239、S241、T245、S238的抗原決定基。

9.如實施例1、2、3、4、5、6、7或8中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250之殘基的抗原決定基。

10.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau。

11.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一例之Tau結合抗 體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

12.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

13.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：7或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：8或與其至少80%一致之序列。

14.如實施例13之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：8之重鏈可變區。

15.如實施例13或14之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：8中之X₁為A。

16.如實施例13或14之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：8中之X₁為T。

17.如實施例13、14、15或16中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

18.如實施例17之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合抗體。

19.如實施例13、14、15、16、17或18中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基A246、A239、S241、T245、S238的抗原決定基。

20.如實施例13、14、15、16、17、18或19中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250之殘基的抗原決定基。

21.如實施例13、14、15、16、17、18、19或20中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau。

22.如實施例13、14、15、16、17、18、19或20中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

23.如實施例13、14、15、16、17、18、19或20中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

24.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID No.：9或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID No.：10或與其至少80%一致之序列。

25.如實施例24之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：10之重鏈可變區。

26.如實施例24或25之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：10中之X₃為A。

27.如實施例24或25之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：10中之X₃為T。

28.如實施例24之Tau結合抗體或其結合片段，其中重鏈可變區包含SEQ ID No.：11或12。

29.如實施例24、25、26、27或28中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

30.如實施例29之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為人類化抗體。

31.如實施例30之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段具有IgG1或IgG4亞型。

32.如實施例24、25、26、27、28、29、30或31中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基A246、A239、S241、T245、S238的抗原決定基。

33.如實施例24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250之殘基的抗原決定基。

34.如實施例24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau。

35.如實施例24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

36.如實施例24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一例之 Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

37.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈，其包含SEQ ID No.：14或與其至少70%一致的序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：15或與其至少70%一致的序列。

38.如實施例37之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID No.：14的輕鏈，及包含SEQ ID No.：15的重鏈。

39.如實施例37或38之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：15中之X₃為A。

40.如實施例37或38之Tau結合抗體或其結合片段，其中SEQ ID No.：15中之X₃為T。

41.如實施例37之Tau結合抗體或其結合片段，其中重鏈可變區包含SEQ ID No.：17或18。

42.如實施例37、38、39、40或41中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株人類化抗體。

43.如實施例42之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段具有IgG1或IgG4亞型。

44.如實施例37、38、39、40、41、42或43中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基A246、A239、S241、T245、S238的抗原決定基。

45.如實施例37、38、39、40、41、42、43或44中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包 含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250之殘基的抗原決定基。

46.如實施例37、38、39、40、41、42、43、44或45中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶tau。

47.如實施例37、38、39、40、41、42、43、44或45中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

48.如實施例37、38、39、40、41、42、43、44或45中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

49.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基A246、A239、S241、T245、S238的抗原決定基。

50.如實施例49之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250之殘基的抗原決定基。

51.如實施例50之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

52.如實施例50或51之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合、人類化或完全人類抗體。

53.如實施例52之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為IgG1或IgG4亞型的單株人類化抗體或其結合片段。

54.如實施例50、51、52或53中任一例之Tau結合抗體或其結合 片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau。

55.如實施例50、51、52或53中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

56.如實施例50、51、52或53中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

57.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56中任一例之Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。

58.如實施例57之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與包含以下之Tau結合抗體或結合片段競爭結合至Tau：包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：12或13之重鏈可變區。

59.一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56中任一例之Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至大體上相同的Tau抗原決定基。

60.如實施例59之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗 體或其結合片段與包含以下之Tau結合抗體或結合片段結合至大體上相同的Tau抗原決定基：包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：12或13之重鏈可變區。

61.如實施例57、58、59或60中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株抗體。

62.如實施例61之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為嵌合、人類化或完全人類抗體。

63.如實施例62之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為IgG1或IgG4亞型之人類化抗體。

64.如實施例57、58、59、60、61、62或63中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基A246、A239、S241、T245、S238的抗原決定基。

65.如實施例57、58、59、60、61、62、63或64中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250之殘基的抗原決定基。

66.如實施例57、58、59、60、61、62、63、64或65中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau。

67.如實施例57、58、59、60、61、62、63、64或65中任一例之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

68.如實施例57、58、59、60、61、62、63、64或65中任一例之 Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或結合片段結合至人類可溶Tau與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。

69.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd及Fv、scFv、Fab-Fv、Fab-scFv、Fab-dsFv、Fab-scFc、scFv-scFc、dsscFv、dsscFv-scFc、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、線抗體或含VHH抗體。

70.一種經分離之核酸分子，其編碼如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69中任一例之Tau結合抗體或其結合片段的輕鏈及/或重鏈。

71.一種選殖或表現載體，其包含一或多種如實施例70之核酸序列。

72.一種宿主細胞，其包含一或多種如實施例70之核酸序列或一或多種如實施例71之選殖或表現載體。

73.如實施例72之宿主細胞，其不為人類胚胎幹細胞。

74.一種製造如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69中任一例之Tau結合抗體或其結合片段的方法，該方法至少包含以下步驟：a)培養如實施例72或73之宿主細胞，及b)分離該Tau結合抗體或其結合片段。

75.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其適用作治療活性劑。

76.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其用於治療tau蛋白病。

77.如實施例76使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病。

78.如實施例76使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為進行性核上麻痺。

79.一種治療tau蛋白病的方法，該方法包含向有需要的個體投與如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一例之Tau結合抗體或其 結合片段的步驟。

80.如實施例79之方法，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病。

81.如實施例79之方法，其中該tau蛋白病為進行性核上麻痺。

82.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其適用作診斷劑。

83.如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一例之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其用於診斷tau蛋白病。

84.如實施例83使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病。

85.如實施例83使用之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為進行性核上麻痺。

本發明現根據一些實例加以描述，然而，該等實例不應理解為具限制性。

實驗 實驗1-產生Tau結合抗體 1.1 重組Tau表現

人類Tau蛋白表現於兩種宿主系統中：大腸桿菌BL21(DE3)及HEK293細胞(人類胚腎細胞株)。在大腸桿菌中產生Tau的四種不同同 功異型物：同功異型物2、3、4及5，且在HEK293細胞中產生Tau的一種同功異型物：同功異型物2。所產生之所有表現載體及蛋白質的完整序列包括於圖5至14中。

大腸桿菌中之Tau產生

以合成方式產生編碼不同Tau同功異型物的基因且將密碼子最佳化以便在大腸桿菌中表現。使用標準分子生物學技術次選殖入經修飾之pET32載體中，該載體經工程改造以產生具有N端6His-TEV標記的Tau。

大腸桿菌BL 21(DE3)細胞經上述載體轉型，且使用標準技術表現蛋白質。

接著藉由離心回收大腸桿菌細胞，溶解且藉由使用NiNTA(Qiagen)的親和層析自可溶溶離份中捕捉Tau蛋白。使用TEV蛋白酶移除6His標記，隨後進行第二NiNTA層析步驟。經純化之Tau於適合緩衝液中進行緩衝交換，此視應用而定。為了免疫而產生的樣品已使用Proteus NoEndo^TM管柱(Vivaproducts)移除內毒素。

產生同位素標記之Tau用於核磁共振(NMR)研究：如上文所述進行蛋白質表現，但其中使用最少培養基將¹⁵N、¹³C及²H併入蛋白質中。溶解大腸桿菌細胞集結粒且使用NiNTA(Qiagen)親和層析步驟純化Tau蛋白，利用TEV蛋白酶移除6His標記且接著藉由凝膠過濾、使用Superdex 200單元(GE-Healthcare)純化Tau蛋白。

HEK293中之Tau產生

使用野生型DNA序列，以合成方式產生編碼Tau同功異型物2的基因。使用標準分子生物學技術將其次選殖入表現載體pMV-10HisTEV(含有CMV啟動子)中，該表現載體經工程改造可產生具有N端10His-TEV標記(SEQ ID NO：51)的Tau。

所得載體係使用Expi293^TM表現系統(Invitrogen)、依據製造商方 案轉染。此系統係使用來源於HEK293細胞株的Expi293F人類細胞。

Tau蛋白聚積於培養基中，使用固著金屬離子親和層析Ni Sepharose Excel(GE Healthcare)自其中回收。接著使用TEV蛋白酶移除10His標記，隨後再施加至Ni Sepharose管柱上且收集流過的裂解Tau。經純化之Tau於適合緩衝液中進行緩衝交換，此視應用而定。

原纖維形成

無菌過濾450μM之Tau蛋白且在1.5ml艾本德管(Eppendorf tube)中使用熱混合器(Eppendorf)、在750rpm、37℃下振盪310小時。使用硫代黃素-T(Thioflavin-T)染料監測原纖維形成且在Fluostar Omega分光光度計(BMG Labtech)上讀取吸光度。藉由陰性染料電子顯微法確認成對螺旋狀纖絲(PHF)形成。

1.2免疫接種

10隻雌性史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rats)(260-280g)用50μg重組Tau蛋白皮下免疫，在等體積的完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant；CFA)中藉由注射器劇烈混合來乳化。以14天時間間隔，使用不完全弗氏佐劑(IFA)給予大鼠3次加打注射，其中亦自尾部放血。使用在胎牛血清(FCS)中、在10%二甲亞碸(DMSO)中所製備且在-80℃冷凍之脾臟及骨髓單一細胞懸浮液最後加打之後的第14天終止。重組人類Tau蛋白表現於大腸桿菌中，純化且活體外聚集，隨後進行免疫接種。使用含有可溶Tau與不溶性原纖維Tau混合物之之Tau之四種同功異型物(2、3、4及5)之等莫耳濃度混合物的最終樣品進行免疫接種。

1.3 B細胞培養

使用類似於Zubler等人(1985)所述的方法製備B細胞培養物。簡言之，來自免疫大鼠的PBMC源B細胞以每孔約3000個細胞的密度在條形碼編碼之96孔組織培養盤中、在37℃、在5% CO₂氛圍中培養七 天，該等組織培養盤具有每孔200μl RPMI 1640培養基(Gibco BRL)，該培養基補充有10% FCS(PAA laboratories 1td)、2% HEPES(Sigma Aldrich)、1% L-麩醯胺酸(Gibco BRL)、1%青黴素/鏈黴素溶液(Gibco BRL)、0.1% β-巰基乙醇(Gibco BRL)、3%活化脾細胞培養物上清液及γ照射突變型EL4鼠類胸腺瘤細胞(5x10⁴/孔)。總共獲取約1.2×10⁸個B細胞樣品。

1.4初始篩選

使用經如章節1.1中所述獲得之可溶或不溶性生物素化Tau塗佈之Superavidin^TM珠粒(Bangs Laboratories)，使用基於螢光之均質結合分析來測定B細胞培養物上清液中之Tau結合抗體的存在。所產生的Tau具有可溶與不溶性部分。使用台上型Eppendorf mini-spin plus離心機，在14,500RPM下，藉助於離心10分鐘自混合物中移除不溶性Tau。各部分分別使用EZ-link sulfo-NHS-LC生物素化套組，根據製造商說明書發生生物素化。使用Zeba離心脫鹽管柱，根據製造商說明書自游離生物素中移除可溶生物素化部分。藉由將混合物在Eppendorf mini-spin plus離心機中、在14,500RPM下離心10分鐘來移除不溶性部分，回收含有Tau的離心塊且將其再懸浮於1.5ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且將此過程重複5次。分析可篩選出顯示結合至可溶或不溶性Tau形式的上清液。使用Matrix Platemate液體處置器，自條形碼編碼的96孔組織培養盤轉移10ul上清液置於條形碼編碼的384孔黑壁分析盤中，該384孔分析盤含有固著於珠粒上的可溶或不溶性Tau(10μl/孔)。結合經由山羊抗大鼠IgG Fcγ特異性Cy-5結合物(Jackson)展現。在Applied Biosystems 8200細胞偵測系統上讀盤。

1.5二次篩選

初始篩選之後，使用Aviso Onyx揀選機器人將陽性上清液合併於條形碼編碼之96孔母液盤上且將細胞培養盤中的B細胞在-80℃冷凍。 接著在ELISA分析中，針對可溶Tau溶離份篩選母液盤。此舉為了在更嚴格的篩選中測定抗體在初始篩選中結合Tau及檢查其不結合珠粒的能力。ELISA分析包括以3μg/ml將可溶Tau於碳酸鹽塗佈緩衝液(dH₂O+0.16%Na₂CO₃+0.3% NaHCO₃)中塗佈於384孔Maxisorp盤(ThermoScientific/Nunc)上。用含有1% w/v酪蛋白+1% w/v BSA的PBS阻斷盤且接著與10μl/孔之B細胞培養物上清液一起培育。向盤中添加二次HRP結合山羊抗大鼠IgG Fc抗體(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)，隨後利用TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，得自EMD Millipore；10μl/孔)目測結合。使用BioTek Synergy 2微定量盤式讀取器，在630nM量測光密度。選擇對Tau展現特異性的B細胞上清液用於可變區回收。

1.6可變區回收

為了允許經由選擇所關注之孔回收抗體可變區基因，必須進行解褶積步驟以能夠在含有異質B細胞群的指定孔中鑑別出抗原特異性B細胞。此係使用螢光焦點方法(Clargo等人，2014)達成。簡言之，將得自陽性孔之分泌免疫球蛋白之B細胞與塗有生物素化可溶Tau之抗生蛋白鏈菌素珠粒(New England Biolabs)及1：1200最後稀釋之山羊抗大鼠Fcγ片段特異性FITC結合物(Jackson)混合。在37℃靜態培育1小時之後，由於在該B細胞周圍存在螢光光環而可鑑別出抗原特異性B細胞。使用Olympus顯微鏡鑑別的此等個別B細胞接著用Eppendorf微操作器挑選且沈積至PCR管中。

使用重鏈及輕鏈可變區特異性引子，藉由逆轉錄(RT)-PCR自單細胞中回收抗體可變區基因。在Aviso Onyx液體處置機器人上進行兩輪PCR，其中第2個巢式PCR合併限制位點位於3'端及5'端，從而將可變區選殖入小鼠γ1 IgG(VH)或小鼠κ(VL)哺乳動物表現載體中。使用Fectin 293(Invitrogen)將重鏈及輕鏈構築體共轉染至HEK-293細胞中 且在125ml錐形瓶(Erlenmeyer flask)中以30ml體積表現重組抗體。培養5-7天之後，收集上清液且使用親和層析純化抗體。

實驗2-進一步篩選所鑑別的抗體 2.1 PHF製備

根據Ksiezak-Reding及Wall公開的方案(Neurobiology of Aging 15,11-19,1994)，自得自患有阿茲海默氏病或進行性核上麻痺或額顳葉型癡呆症之供者的腦樣品中純化成對螺旋狀纖絲(PHF)-Tau蛋白。回收先前已描述之PHF-Tau增濃之溶離份8(等效於此參考文獻中之蔗糖梯度離心之前的粗PHF-Tau)及溶離份11(等效於溶離份A2，如此參考文獻中所述的SDS可溶PHF)且用於實驗3之BIAcore分析及細胞分析。

2.2 ELISA篩選

ELISA分析包括以3μg/ml將可溶Tau於碳酸鹽塗佈緩衝液(dH₂O+0.16% Na₂CO₃+0.3% NaHCO₃)中捕捉於384孔Maxisorp盤(ThermoScientific/Nunc)上。用含有1% w/v酪蛋白+1% w/v BSA的PBS阻斷盤且接著與10μl/孔之純化抗體一起培育。向盤中添加二次HRP結合山羊抗小鼠IgG Fc抗體(Stratech Scientific Ltd/Jackson ImmunoResearch)，隨後利用HRP受質TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，得自EMD Millipore；10μl/孔)目測結合。使用BioTek Synergy 2微定量盤式讀取器，在630nM量測光密度。

2.3 BIAcore篩選

根據製造商方案，使用Pierce Ficin裂解套組(目錄號44980，Thermo Scientific)，由嵌合mIgG1抗體製備所選單株Fab片段(mFab)。

在BiAcore分析中使用280nm吸光度測定Fab儲備溶液之濃度。將得自阿茲海默氏病患者的不溶性Tau蛋白製劑(AD-PHF，溶離份11)、HEK源Tau同功異型物-2單體(胺基酸1-441)及大腸桿菌中所表現的同功異型物-2單體用胺固著至CM5晶片上，且使用Biacore T200儀器量 測抗Tau mFab之結合。使用得自GE Healthcare的緩衝液HBS-EP進行固著，但其中AD-PHF使用10mM乙酸(pH 3.0)。HBS-EP+緩衝液補充有300mM NaCl及1.25% CM-Dextran(Sigma)且用作分析緩衝液。雖然使用流動池(Fc)1作為參考物，但針對Fc2-4獲得以下RU值：5μg/ml大腸桿菌Tau為44RU，5μg/ml HEK Tau為56RU，且AD-PHF物質之1：20稀釋溶液為500RU。使用兩個60秒10mM甘胺酸(pH1.7)循環進行再生。使用10μl/min流速進行固著及再生，而使用30μl/min流速進行分析物結合。對於AD-PHF而言，應用多次人工注射以達到500RU，包括EDC/NHS及EtoA封端。使用90μl分析物注射180秒或300秒用於解離，每個mFab樣品或緩衝液對照物應用五個啟動循環及12個循環。各mFab使用600nM溶液之11個1：3稀釋液與緩衝液。使用BIAcore測試來分析AB 1。

結果描繪於表1中，其顯示具有SEQ ID No.：7之大鼠VL及SEQ ID No.：8之大鼠VH之mFab AB1對大腸桿菌中所表現之單體Tau同功異型物-2、來源於哺乳動物HEK293細胞之單體Tau同功異型物-2及自阿茲海默氏病患者分離之Tau PHF原纖維(Tau聚集物)的結合。AB1及上文提及之先前技術抗體的結合概況顯示於表3中。

實驗3-所鑑別之抗體的進一步表徵 3.1細胞分析 利用Tau轉殖基因小鼠製備粗可溶性及不溶性溶離份以誘導Tau聚集

在此等實驗中，使用表現人類Tau P301S(Allen等人，2002 J.Neurosci.22(21)：9340-51)及表現人類Tau P301L(Lewis等人，2000 Nat Genet.(4)：402-5.；Götz J等人，2001 J Biol Chem.276(1)：529-34)的轉殖基因小鼠。

粗可溶性及不溶性溶離份係由P301S及P301L Tau轉殖基因小鼠之腦藉由差速離心來製備。簡言之，使用手持式均質器Pellet Pestle Motor(Kontes)，在1.5ml微量離心管中，在冰上，將得自P301S(脊髓及腦幹)及P301L(中腦及腦幹)Tau轉殖基因小鼠的腦組織在冰冷TBS(Fisher Scientific)中均質化。接著，使勻漿(H)在4℃下以4,000g離心10分鐘以移除組織殘渣。所得上清液(S0)在4℃下以20,000g離心20分鐘，以提供對應於粗可溶性溶離份(S1)的上清液。將剩餘集結粒(P1)再懸浮於1ml於TBS中製備的1%十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)溶液中，在室溫下培育1小時，且接著在4℃下以100,000g離心1小時。捨棄上清液(S2)。集結粒(P2)用5ml冰冷TBS洗滌，且接著再懸浮於TBS中以提供粗不溶性溶離份(P2')。

製備表現具有P301S突變之人類Tau的HEK-293-F細胞

使用293fectin(Life Technologies)，根據製造商說明書，用表現具有P301S突變之人類Tau同功異型物2的pcDNA3.1(+)載體轉染HEK-293-F細胞(Life Technologies)。經轉染之細胞的等分試樣於液氮中儲存。

誘導Tau聚集

圖3說明用於表徵Tau治療抗體之活性之細胞聚集分析的不同步驟。第1天，使表現具有P301S突變之人類Tau同功異型物2(P301S- tau)的HEK-293-F細胞在37℃解凍且在含有10%胎牛血清及1%青黴素-鏈黴素(FFBS)的293表現培養基(Life Technologies)中稀釋。使用自動細胞計數器(Vi-CELL XR,Beckman Coulter)對細胞計數，且接著以每孔25,000個活細胞的密度塗鋪於聚-D-離胺酸預塗之96孔盤(Greiner Bio-One)中。使細胞在37℃、5% CO₂中維持。同日，在4℃下，在溫和攪拌下，將得自患有阿茲海默氏病(AD-PHF，溶離份8)或進行性核上麻痺(PSP-PHF，溶離份8)或額顳葉型癡呆症(FTD-PHF，溶離份8)之患者之經音波處理的人類不溶性Tau或得自P301S或P301L轉殖基因小鼠大腦的腦溶離份(作為晶種用於誘導Tau聚集)與抗Tau抗體一起或不與抗Tau抗體一起在FFBS培養基中培育隔夜。對於AD及PSP樣品而言，AD-PHF(溶離份8)分別在80ng/μl及60ng/μl使用；得自轉殖基因小鼠P301S及P301L的可溶性腦溶離份分別在0.1μg/μl及1.2μg/μl使用。第2天，將晶種或晶種/抗體混合物施加至細胞中維持24小時。第3天，培養基用含有抗體的新鮮FFBS培養基置換，且使細胞在培養物中再維持24小時。第4天，使用Tau聚集分析套組(Cisbio)，基於均質時差式螢光能量轉移(HTRF)，根據製造商說明書量測Tau聚集。利用SpectraMax Paradigm(Molecular Devices)量測螢光。聚集係作為相對於對照(-)的聚集百分比來報導，對照對應於缺乏抗體的情況下，外源性原纖維或溶離份所誘導的最大聚集反應。

測試AB1及先前技術之其他Tau結合抗體對所誘導之Tau聚集的影響。先前技術抗體為WO2014/028777A2之IPN002、WO2013/096380A2之PT3、WO2010/142423A2之mAb2.10.3及WO 2014/008404之HJ8.5。

此分析之結果概述於表2及圖4中。

表2概述具有SEQ ID NO：7之大鼠VL及SEQ ID No.：8之大鼠VH之AB1、具有SEQ ID No.：14之輕鏈該SEQ ID No.：17之重鏈之Tau結合抗體(L14H17)、具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：18之重鏈 之Tau結合抗體(L14H18)及針對一系列得自各種腦萃取物之Tau晶種之競爭抗體的效力(IC₅₀)及最大功效(300nM下之I_max)。而圖4顯示具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：17之重鏈之Tau結合抗體(L14H17)及具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：18之重鏈之Tau結合抗體(L14H18)的功效(在使用得自人類AD患者之人類Tau病理性原纖維的細胞聚集分析中)。

3.2組織學分析

分析具有SEQ ID NO：7之大鼠VL及SEQ ID No.：8之大鼠VH的AB1以及先前技術抗體IPN002、PT3及Mab2.10.3且使用患有阿茲海默氏病之人類供者海馬體的冷凍切片測定最佳濃度，該等冷凍切片先前已使用AT8免疫染色而顯示含有病理性Tau結構(諸如Braak及Braak,1995,Neurobiol Aging；16(3)：271-8中所述)。除101.4(陰性對照抗體)之外，AB1及所有先前技術抗體展現特異性及濃度依賴性免疫反應性。根據此等資料，選擇單一、最佳濃度的抗體且用於篩選一組六個人類腦樣品。三個樣品來源於患有阿茲海默氏病的供者或來源於展現高程度Tau病理學(使用AT8免疫染色所偵測的陽性Tau病理學)的年邁供者，且三個樣品來源於無Tau病理學(使用AT8免疫染色偵測到陰性Tau病理學)之供者。

AB1及IPN002顯示神經原纖維纏結(神經元內NFT)之特異性免疫染色、神經原纖維纏結之細胞質染色(神經元外NFT)、神經炎斑樣結構及Tau陽性病理學樣品內之神經纖維網絲。其亦顯示根據Tau陰性病理學分類之樣品中的免疫染色。

實驗2及實驗3之結果概述於下文表2及表3中：

¹表示偵測到Tau病理學確認之樣品中之存在Tau。

²表示偵測到Tau陰性病理學樣品中存在Tau。

³表示大腸桿菌中所表現之單體Tau同功異型物-2及來源於哺乳動物HEK293細胞之單體Tau同功異型物-2的單體Tau形式。

⁴表示自阿茲海默氏病患者分離之Tau PHF原纖維的Tau聚集形式ND：未測定。

(*)100nM下之最大功效

3.3西方墨點

使用化學發光讀出進行西方墨點法：將由AD、PSP或人類對照物製備的勻漿負載至10%聚丙烯醯胺凝膠上(每個泳道20μg蛋白質)。藉由SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)分離蛋白質且 電轉移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。膜於含有4% BSA(牛血清白蛋白)的TBST(50mM Tris、150mM NaCl、0.05% Tween 20，pH經HCl調節至pH 7.6)中阻斷。膜在4℃與一級抗體或非免疫IgG對照抗體一起培育隔夜，用TBST沖洗，與二級抗體(小鼠抗生物素)一起培育1小時，用TBST沖洗，與三級抗體(抗小鼠IgG過氧化酶)一起培育1小時，用TBST沖洗，且使用ECL(增強式化學發光)膜暴露顯色2至5分鐘。

或者，使用螢光讀出執行西方墨點法：將勻漿(H)、得自tau轉殖基因小鼠的可溶(S1)及不溶性(P2')溶離份或AD-PHF溶離份8負載於NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris凝膠(Life Technologies)中，且接著藉由SDS-PAGE分離。使用Trans-Blot® Turbo^TM轉移系統(Bio-Rad)將所分離的蛋白質電轉移至聚偏二氟乙烯膜上。膜用Odyssey®阻斷緩衝液(LI-COR)阻斷且在4℃下與在含有0.1% Tween-20之相同緩衝液中稀釋之不同一級抗體一起培育隔夜。IRDye二次抗體在含有0.1% Tween-20及0.01% SDS的Odyssey®阻斷緩衝液中稀釋(1：5,000；LI-COR)且在室溫下培育1小時，且使用Odyssey CLx成像系統(LI-COR)執行目測。VR4295(UCB Biopharma S.P.R.L)、IPN002、PTR3及Mab2.10.3抗體係以0.1-1μg/ml使用。抗Tau pS202/T205(AT8；Thermo Scientific)、抗Tau pThr231(AT180；Thermo Scientific)及抗總Tau(HT7；Thermo Scientific)係以1：200稀釋度使用。為了控制負載量，分析β-肌動蛋白(1：2,000；Sigma)的墨點。使用Image Studio 3.1(Li-COR)定量信號強度。

具有SEQ ID No：7之大鼠VL及SEQ ID No.：8之大鼠VH的AB1以及具有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：17之重鏈或SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：18之重鏈的人類化形式結合至得自P301S及P301L轉殖基因小鼠以及人類AD、PSP及對照患者樣品的病理性 Tau。所有三種抗體的結合均呈現相似的西方墨點圖案且在AD及PSP中，展現50kDa與75kDa之間的典型色帶圖案，其對應於得自AD及PSP的病理性Tau(參見圖5)。IPN002顯示相似行為，而PTR3及Mab2.10.3抗體結合至得自P301S及P301L轉殖基因小鼠之病理性Tau且弱結合人類AD，但展現不同的西方墨點圖案。陰性對照101.4及A33抗體不展現任何顯著信號。肌動蛋白用作負載對照物。

3.4 定義AB1之抗原決定基

使用雜核單量子相干性核磁共振(HSQC NMR)，使用抗體Fab片段，測定具有SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的抗體AB1之抗原決定基結合。

Tau同功異型物4之主鏈分配

NMR樣品的體積通常為350μl，其中存在於5mm Shigemi管中的經²H/¹³C/¹⁵N標記之人類Tau同功異型物4的蛋白質濃度為270μM。緩衝條件為100mM NaCl、25mM磷酸鈉pH 6.4、10μM AEBSF、0.02% NaN₃。所有實驗均在20℃、在裝配有低溫冷卻探針的600MHz Bruker DRX或800MHz Bruker Avance光譜儀上記錄。蛋白質中殘基之主鏈NMR信號之間的順序關係H_N(i)-N(i)-N(i±1)係使用3D(H)N(CA)NNH實驗(Weisemann等人，1993 3D Triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N-and 13C-labelled proteins.J.Biomol.NMR 3.doi：10.1007/BF00242479)產生，該實驗係在¹⁵N、¹⁵N及¹H維度中分別利用1640Hz、1640Hz及7000Hz之譜寬120(F1)、120(F2)及150(F3)ms之擷取時間記錄，每個增量8次掃描及1.5秒弛豫延遲。非均一取樣係在13%(40000個超複合物點中的5200個)的取樣密度下使用，得到3.5天之擷取時間。確認順序關係且使用HNCA(Grzesiek及Bax,1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31kDa protein.J.Magn.Reson.96,432- 440.doi：10.1016/0022-2364(92)90099-S)及HNCACB(Wittekind及Mueller,1993 HNCACB,a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha-and Beta-Carbon Resonances in Proteins.J.Magn.Reson.Ser.B 101,201-205.doi：10.1006/jmrb.1993.1033)實驗鑑別殘基類型。HNCA實驗係在¹⁵N、¹³C及¹H維度中分別利用1640Hz、4830Hz及6600Hz之譜寬及24(F1)、6.6(F2)及80(F3)ms之擷取時間記錄(每個增量8次掃描，1.5秒弛豫延遲，19小時總擷取時間)，而HNCACB係在¹³C、¹⁵N及¹H維度中分別利用9800Hz、1640Hz及6600Hz之譜寬及6(F1)、24(F2)及80(F3)ms之擷取時間記錄(每個增量8次掃描，1.5秒弛豫延遲，1.5天總擷取時間)。使用NMRPipe(Delaglio等人，1995 NMRPipe：a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes.J.Biomol.NMR 6,277-93)處理NMR譜，其中使用Harvard迭代軟式定限方法(Hyberts等人，2012)執行NUS資料的重建。使用Sparky(Goddard及Kneller,D.G.SPARKY 3.In.,University of California,San Francisco)進行資料分析，從而得到304個殘基(對應於96%殘基(不包括脯胺酸殘基及N端甘胺酸)之醯胺質子及氮共振的賦值。

AB1之結合位點的定位：

使用濃度在80μM至150μM範圍內且含有10%莫耳濃度過量之相應AB1 Fab之經²H/¹³C/¹⁵N標記之人類Tau同功異型物4之樣品，對AB1的結合位點進行定位。在相同緩衝液中製備樣品，如上文針對Tau之主鏈分配所述。根據針對Tau/Fab複合物樣品以及游離Tau樣品所記錄之HNCO(Grzesiek及Bax,1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31kDa protein.J.Magn.Reson.96,432-440.doi：10.1016/0022-2364(92)90099-S)來測定¹H、¹⁵N及¹³C化學位移變化(如上文所述)。HNCO實驗係在¹⁵N、¹³C及¹H維度中分別利用2190 Hz、2210Hz及8800Hz之譜寬及25(F1)、29(F2)及80(F3)ms之擷取時間來記錄(每個增量8次掃描，1.8秒弛豫延遲)，其中NUS使用25-35%之取樣密度，總擷取時間自60小時減少至15-21小時。使用最小位移方法(Williamson等人，1997 Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by NMR chemical shift perturbation.Biochemistry 36,13882-9.doi：10.1021/bi9712091)，基本上如先前所述(Veverka等人，2008 Structural characterization of the interaction of mTOR with phosphatidic acid and a novel class of inhibitor：compelling evidence for a central role of the FRB domain in small molecule-mediated regulation of mTOR.Oncogene 27,585-95.doi：10.1038/sj.onc.1210693)來分析化學位移變化，但其中對方程式使用修改以計算包括羰基化學位移的組合化學位移變化(△δ)，從而產生以下方程式：

其中△δ_HN、△δ_N及△δ_C分別為¹H、¹⁵N及¹³C化學位移的差異。αN及αC分別對應於比例因數0.2及0.35，其用於考慮醯胺質子、氮及羰基化學位移在化學位移範圍內的差異。

為了鑑別Tau上的Fab結合位點(抗原決定基)，利用組合最小位移相對於蛋白質序列的直方圖展現含有顯著擾動信號之Tau區域。若個別胺基酸之組合化學位移變化大小超過所有胺基酸之組合化學位移變化平均值之臨限值加一個相對於該平均值之標準差，則選擇此等殘基作為Fab結合位點中的可能接觸殘基以便進一步評價。

顯著擾動殘基鑑別為最小位移至少大於所計算所有位移之平均值加一個標準差的殘基。應用四種不同臨限值鑑別Fab所結合的殘基。涉及結合位點的殘基依據遞增的嚴格度如下評分：最小位移超過 所計算所有位移之平均值加一個標準差的殘基(>0.009817)；最小位移超過所計算所有位移之平均值加兩個標準差的殘基(>0.016913)；最小位移超過所計算所有位移之平均值加三個標準差的殘基(>0.024009)；最小位移超過所計算所有位移之平均值加四個標準差的殘基(>0.031105)。在此分析中，脯胺酸殘基由於其不含醯胺質子而未能鑑別。

AB1 Fab之抗原決定基因此在嚴格度遞增的情況下根據所計算所有位移之平均值加一個標準差來定義：A246、A239、S241、T245、S238、S235、K240、Q244、S237、V248、L243、M250、R242；所計算所有位移之平均值加兩個標準差：A246、A239、S241、T245、S238、S235、K240、Q244、S237；所計算所有位移之平均值加三個標準差：A246、A239、S241、T245、S238、S235、K240、Q244；所計算所有位移之平均值加四個標準差：A246、A239、S241、T245、S238。

發現使用NCBI參考序列NP_005901.2(SEQ ID No.：35)AB1中所用之胺基酸編號可至少結合以下殘基(平均值+3 SD)A246、A239、S241、T245、S238、S235、K240、Q244。抗體通常可結合所有以下殘基(平均值+1 SD)A246、A239、S241、T245、S238、S235、K240、Q244、S237、V248、L243、M250、R242。

實驗4-所鑑別抗體之人類化

具有SEQ ID No.：7之VL及SEQ ID No.：8之VH的抗體AB1係藉由將來自大鼠抗體V區域的CDR移植至人類生殖系抗體V區構架上來發生人類化。

為了恢復抗體活性，來自大鼠或兔V區域之許多構架殘基亦保留於人類化序列中。可使用Adair等人(1991)(Humanised antibodies.WO91/09967)概述之方案選擇此等殘基。大鼠抗體(供體)V區序列與 人類生殖系(受體)V區序列的比對以及所設計的人類化序列顯示於圖1及圖2中。自供體移植至受體序列之CDR如Kabat(Kabat等人，1987)所定義，但其中使用組合之Chothia/Kabat定義之CDR-H1除外(參見Adair等人，1991 Humanised antibodies.WO91/09967)。

選擇人類V區IGKV2-29加JK2 J區(IMGT，http：//www.imgt.org/)(SEQ ID No.：31)作為抗體AB1輕鏈CDR的受體。移植物gVL3_AB1(SEQ ID No.：14)中的輕鏈構架殘基皆來自人類生殖系基因。

選擇人類V區IGHV4-59加JH3 J區(IMGT，http：//www.imgt.org/)(SEQ ID No.：32)作為抗體AB1重鏈CDR的受體。除殘基48(Kabat編號)(其中供體殘基甲硫胺酸(M48)得以保留)之外，移植物gVH17_AB1(SEQ ID No.：17)及gVH18_AB1(SEQ ID No.：18)中之重鏈構架殘基皆來自人類生殖系基因。殘基M48之保留允許人類化抗體發揮完全效力。人類構架位置1之麩醯胺酸殘基經麩胺酸(E1)置換，以提供均質產物之表現及純化：將抗體及抗體片段之N端的麩醯胺酸轉化成焦麩胺酸鹽已被廣泛報導。SEQ ID No.：37及38之CDRH2分別在移植物gVH17_AB1及gVH18_AB1中發生突變以修飾潛在去醯胺化位點。

設計編碼抗體之許多變異體重鏈及輕鏈V區序列的基因且藉由DNA2.0 Inc的自動化合成方法構築。重鏈及輕鏈V區之其他變異體係藉由針對寡核苷酸之突變誘發(在一些情況下，包括CDR內之突變以修飾潛在去醯胺化位點)修飾VH及VK基因來產生。為了短暫表現於哺乳動物細胞中，將人類化輕鏈V區基因選殖入UCB人類輕鏈表現載體pMhCK中，該表現載體含有編碼人類κ鏈恆定區的DNA(Km3異型)。將人類化重鏈V區基因選殖入UCB人類γ-4重鏈表現載體pMhγ4P FL中，該表現載體含有編碼具有鉸鏈穩定化突變S241P之人類γ-4重鏈恆定區的DNA(Angal等人，Mol Immunol.1993,30(1)：105-8)。或者，將人類化VH基因選殖入UCB人類γ-1重鏈表現載體pMhγ1FL中，該表 現載體含有編碼人類γ-1重鏈恆定區的DNA(G1m17，1個異型)。為了評估人類化抗體的單價結合動力學，亦將人類化VH基因選殖入UCB人類Fab-HIS表現載體pMhFab10HIS中，該表現載體含有編碼人類γ-1 CH1-鉸鏈域的DNA，該域具有十個組胺酸殘基的C端標記：該組胺酸標記有助於親和層析純化所表現之Fabs。將所得重鏈及輕鏈載體共轉染至HEK293懸浮細胞中係使用293 Fectin(12347-019 Invitrogen)達成，且促使人類化重組抗體以人類IgG4P、IgG1或Fab-HIS形式表現。

使變異體人類化抗體鏈及其組合表現且評估其效力(相對於親本抗體)、其生物物理學特性及用於下游處理的適合性。

為了使哺乳動物細胞穩定表現人類化重組抗體，使人類化輕鏈V區基因與編碼人類C-κ恆定區的DNA序列(Km3異型)連接，以產生鄰接輕鏈基因。使人類化重鏈基因與編碼人類γ-4P重鏈恆定區或人類γ-1重鏈恆定區(G1m17，1個異型)的DNA連接，以產生鄰接重鏈基因。將重鏈及輕鏈基因選殖入哺乳動物表現載體中。

實驗5-熱穩定性量測

使用Thermofluor分析來測定解鏈溫度(Tm)或去摺疊中點時的溫度。在此方法中，使用螢光染料SYPRO橙，根據對隨著溫度升高而暴露之疏水區域的結合來監測蛋白質去摺疊過程。

反應混合物含有5μl 30x SYPRO®橙色染料(Invitrogen)，用PBS自5000X儲備溶液及45μl 0.12mg/ml樣品(於PBS中，pH 7.4)稀釋。將10μl混合物一式四份分配於384 PCR光學孔盤中且在7900HT快速即時PCR系統(Applied Biosystems)上運作。PCR系統加熱裝置設定於20℃至99℃，升高速率為1.1℃/min。電荷耦合裝置監測孔中的螢光變化。對強度增加作圖，且利用斜率拐點計算Tm，如下文所述。

對於同型IgG1(SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：54之重鏈(L14/H54)，或SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：55之重鏈 (L14/H55))及IgG4(SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：17之重鏈(L14/H17)，或SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.18之重鏈(L14/H18))而言，含有SEQ ID No.：14之輕鏈及SEQ ID No.：12或SEQ ID No.：13之可變重鏈之抗體的分析顯示於下文圖6及表3中。兩種同型均觀測到兩個去摺疊域。前者可歸因於CH2域之Tm；根據文獻(Garber E,Demarest SJ.Biochem Biophys Res Commun.2007年4月13日；355(3)：751-7)，對於IgG1同型而言，發現其比IgG4形式高(更穩定)。第二去摺疊域可歸因於Fab去摺疊域與CH3域之Tm平均值。

實驗6-X射線結晶學

藉由x射線結晶學研究具有SEQ ID NO：14之輕鏈與SEQ ID NO：18之重鏈之Tau結合抗體(L14H18)與由如SEQ ID NO：35所定義之Tau之殘基234至250組成之肽(肽，SEQ ID NO：中所定義的N-乙醯基-KSPSSAKSRLQTAPVPM-醯胺)之間的相互作用。

對與L14H18 Fab複合之Tau之晶體結構的結晶學研究、結構測定及改進。

結晶學研究

L14H18 Fab/tau肽234-250複合物在MRC盤中、利用氣相沉滴、相對於含有30% w/v聚乙二醇4000、0.1M HEPES pH 7.5、0.2M氯化鈣脫水物的儲集層結晶1-2週。

液滴含有400nl之11 mg/ml L14H18 Fab蛋白質及2莫耳濃度過量之Tau肽234-250及400nl儲集層溶液。

晶體屬於空間群P 31 2 1，不對稱單元中具有L14H18 Fab/tau肽234-250的兩個複本。

X射線繞射收集

吾等收集單一L14H18 Fab/tau肽234-250晶體的x射線繞射資料。將晶體懸浮於石環管中，且短暫通過含有30%聚乙二醇4000、0.2M氯化鈣、0.1M HEPES緩衝液pH 7.5及10%乙二醇之低溫保護劑溶液之後，在液氮下急驟冷凍。在鑽石同步加速器(Diamond synchrotron,Didcot,Oxfordshire,UK)，在I04-1射束線站，在Pilatis 6M上收集繞射資料。單色x射線束波長為0.92819。圍繞φ角度穩定器軸，以0.2°振盪步階對倒晶格空間取樣。同步加速器機構所提供的經處理之資料XIA檔案用於結構測定。

結構測定

使用具有PDB代碼4HIX的Fab，藉由分子置換程式Phaser(Read,RJ,Acta Cryst.D57,1373-1382(2001))對Fab位置定位。Matthews係數表示單位晶胞中100kDa之可能分子量，該方案在不對稱單元中發現2個Fab複本。

模型構築及改進

使用2Fo-Fc及Fo-Fc電子密度圖，根據L14H18 Fab序列，用根據電子密度圖所導引的位置置換Fab分子中的殘基。

Fab之第二複本的Fab鏈C及D具有比第一複本(鏈H及L)更清晰的密度。

Fab之一個複本(鏈C及D)之CDR鄰近的外電子密度為可見的。此展現具有螺旋狀結構的肽鏈，其中可構築肽234-250序列之一部分。使用精胺酸及離胺酸殘基之清晰密度比對肽，接著根據已知序列構築。更多輪模型構築及改進使得肽區域的密度改良且顯示結合至Fab之其他複本(鏈H及L)之肽的一些密度。

就模型構築而言，使用電腦程式Coot(Emsley P.,Lohkamp B.,Scott W.G.,Cowton K.Acta Crystallography D Biol Crystallography, 2010年4月；66(Pt 4)：486-501)。使用程式REFMAC(Murshudov G.N.,Skubak P.,Lebedev A.A.,Pannu N.S.,Steiner R.A.,Nicholls R.A.,Winn M.D.,Long F.,Vagin A.A.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2011年4月；67(Pt 4)：355-67)進行改進。

L14H18 Fab/tau肽234-250複合物的模型係由如SEQ ID NO：35中所定義之Tau肽(重鏈之殘基2-219及輕鏈之殘基1-219)的殘基234-244組成。

模型之R係數為0.234且36483個反射之R-自由為0.291。偏離標準幾何形狀的rms就鍵長度而言為0.0145且就鍵角而言為1.93°。

抗原決定基

使用由與肽一起培育之L14H18 Fab片段製備之共複合物，藉由x射線結晶學研究抗體L14H18與tau肽N-乙醯基-KSPSSAKSRLQTAPVPM-醯胺(基於人類tau同功異型物2序列234至250)之間的相互作用。所得結構展現L14H18 Fab與tau肽之間的主要接觸位點，且鑑別為主要在抗體之CDR環聚類及對應於Tau蛋白之殘基235-244的肽殘基SPSSAKSRLQ。根據編號序列，如SEQ ID NO.35所示，5.0 A內之與L14H18 Fab之CDR區域相互作用最緊密的殘基為S235、P236、S237、S238、A239、K240、R242、L243、Q244及T245。

<110> 比利時商UCB生物製藥公司

<120> Tau結合抗體

<130> PF0032-WO

<160> 57

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa可為Ser、Ala、Thr

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 7

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 9

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48)..(48)

<223> Xaa可為Ile及Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (61)..(61)

<223> Xaa可為Ser、Ala、Thr

<400> 10

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 11

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 12

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 13

<210> 14

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 14

<210> 15

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> Xaa可為Ile或Met

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> Xaa可為Ser Ala或Thr

<400> 15

<210> 16

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 16

<210> 17

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 17

<210> 18

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 18

<210> 19

<211> 336

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 19

<210> 20

<211> 354

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 20

<210> 21

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 21

<210> 22

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 22

<210> 23

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 23

<210> 24

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 24

<210> 25

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 25

<210> 26

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 26

<210> 27

<211> 134

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(22)

<223> 前導序列

<400> 27

<210> 28

<211> 136

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 28

<210> 29

<211> 402

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(66)

<223> 前導序列

<400> 29

<210> 30

<211> 411

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(57)

<223> 前導序列

<400> 30

<210> 31

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

<210> 33

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人

<400> 33

<210> 34

<211> 339

<212> DNA

<213> 智人

<400> 34

<210> 35

<211> 441

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 36

<210> 37

<211> 16

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 37

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 38

<210> 39

<211> 6757

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

<210> 40

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

<210> 41

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

<210> 42

<211> 6583

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

<210> 43

<211> 403

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

<210> 44

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

<210> 45

<211> 6490

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

<210> 46

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

<210> 47

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

<210> 48

<211> 6670

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

<210> 49

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

<210> 50

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

<210> 51

<211> 6016

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

<210> 52

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

<210> 53

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

<210> 54

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 54

<210> 55

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 55

<210> 56

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 56

<210> 57

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 57

Claims (20)

1. 一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：1之CDR1、選自SEQ ID No.：2之CDR2及選自SEQ ID No.：3之CDR3；及重鏈可變區，其包含選自SEQ ID No.：4之CDR1、選自SEQ ID No.：5之CDR2及/或選自SEQ ID No.：6之CDR3。
2. 一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含包含SEQ ID No.：9之輕鏈可變區，及包含SEQ ID No.：10之重鏈可變區。
3. 如請求項2之Tau結合抗體或其結合片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID No.：11或12。
4. 如請求項2或3之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段包含輕鏈，其包含SEQ ID No.：14或與其至少80%一致之序列，及/或重鏈，其包含SEQ ID No.：17或18。
5. 一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如請求項1、2、3或4中任一項之Tau結合抗體或其結合片段競爭結合至Tau。
6. 一種經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段與如請求項1、2、3或4中任一項之Tau結合抗體或其結合片段結合至大體上相同的Tau抗原決定基。
7. 如請求項1、2、3、4、5或6中任一項之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段為單株人類化抗體。
8. 如請求項1、2、3、4、5、6或7中任一項之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246的抗原決定基。
9. 如請求項1、2、3、4、5、6、7或8中任一項之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至包含SEQ ID No.：35之胺基酸殘基S238、A239、S241、T245、A246及一或多個選自S235、S237、K240、R242、L243、Q244、V248及M250之殘基的抗原決定基。
10. 如請求項1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一項之Tau結合抗體或其結合片段，其中該Tau結合抗體或其結合片段結合至人類Tau之可溶形式與人類Tau之成對螺旋狀纖絲(PHF)。
11. 一種經分離之核酸分子，其編碼如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之Tau結合抗體或其結合片段的輕鏈及/或重鏈。
12. 一種選殖或表現載體，其包含一或多種如請求項11之核酸分子。
13. 一種宿主細胞，其包含一或多種如請求項11之核酸分子或一或多種如請求項12之選殖或表現載體。
14. 一種製造如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之Tau結合抗體或其結合片段的方法，該方法至少包含以下步驟：c)培養如請求項13之宿主細胞，及d)分離該Tau結合抗體或其結合片段。
15. 如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其適用作治療活性劑。
16. 如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其用於治療tau蛋白病。
17. 如請求項16之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病或進行性核上麻痺。
18. 如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其適用作診斷劑。
19. 如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其用於診斷tau蛋白病。
20. 如請求項19之經分離之Tau結合抗體或其結合片段，其中該tau蛋白病為阿茲海默氏病或進行性核上麻痺。