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TW201629214A - 神經組織的製造方法 - Google Patents

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TW201629214A
TW201629214A TW104134901A TW104134901A TW201629214A TW 201629214 A TW201629214 A TW 201629214A TW 104134901 A TW104134901 A TW 104134901A TW 104134901 A TW104134901 A TW 104134901A TW 201629214 A TW201629214 A TW 201629214A
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Atsushi Kuwahara
Suguru YAMASAKI
Yasushi Hiramine
Yoshiki Sasai
Masayo Takahashi
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Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Riken
Sumitomo Chemical Co
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Abstract

本發明為提供一種含有下述步驟(1)~(3)之神經系細胞或神經組織的製造方法：(1)將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下，以含有1)TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養的第一步驟、(2)將以第一步驟所得之細胞進行浮游培養，形成細胞之凝集體的第二步驟、及(3)將以第二步驟所得之凝集體在誘導分化因子的存在下或者非存在下進行浮游培養，得到含有神經系細胞或者神經組織之凝集體的第三步驟。

Description

神經組織的製造方法
本發明係關於由多能性幹細胞製造網膜組織等神經組織之方法者。
作為由多能性幹細胞製造網膜組織等神經組織(neural tissue)之方法，將均勻多能性幹細胞之凝集體在無血清培養基中形成，將此進行浮游培養後，在誘導分化用之培養液中，在適宜誘導分化因子等存在下進行浮游培養，自多能性幹細胞誘導分化為目的之神經系細胞(neural cells)，製造出神經組織之方法已被報告(專利文獻1及非專利文獻1)。例如，由多能性幹細胞得到多層網膜組織之方法(非專利文獻2及專利文獻2)、將均勻多能性幹細胞的凝集體在含有Wnt信號傳達途徑阻礙物質之無血清培養基中使其形成，將此在基底膜標品的存在下進行浮游培養後，以血清培養基中進行浮游培養後得到多層網膜組織之方法(非專利文獻3及專利文獻3)為已知。又，自多能性幹細胞誘導分化至丘腦下部組織的方法(專利文獻4及非專利文獻4)、及自多能性幹細胞誘導分化至神經前驅 細胞之方法(非專利文獻5及6)亦有報告記載。
這些製造法之出發材料的多能性幹細胞，特別在靈長類多能性幹細胞之情況時，在飼養細胞存在下．未分化維持因子添加條件下，進行未分化維持培養。近年來，未分化維持培養之改良正進展著，將靈長類多能性幹細胞在飼養細胞非存在下(無飼養)．未分化維持因子添加條件下進行培養的方法已有報告記載(非專利文獻7、8及9)。將以該手法所無飼養培養之多能性幹細胞作為出發材料，使神經系細胞或神經組織在安定下製造的方法受到期待。
[先行技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2009/148170號
[專利文獻2]國際公開第2011/055855號
[專利文獻3]國際公開第2013/077425號
[專利文獻4]國際公開第2013/065763號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008)
[非專利文獻2]Nature, 472, 51-56 (2011)
[非專利文獻3]Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)
[非專利文獻4]Nature, 480, 57-62 (2011)
[非專利文獻5]Nature Biotechnology, 27(3), 275-80 (2009)
[非專利文獻6]Proc Natl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013)
[非專利文獻7]Nature Methods, 8, 424-429 (2011)
[非專利文獻8]Scientific Reports, 4, 3594 (2014)
[非專利文獻9]In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010)
本發明所解決的問題為提供一種自在飼養細胞非存在下所調製或未分化維持培養之多能性幹細胞，製造出網膜組織等神經組織或神經系細胞的方法。
本發明者們，對於所要解決的上述課題進行重複檢討結果，發現將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下(無飼養之條件下)，以含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質之培養基中進行培養後，可藉由浮游培養，高效率下形成圓形、表面平滑，且凝集體之內部密集，維持未分化性之細胞凝集體。且發現若使用該高品質之細胞凝集體，可將網膜組織等神經組織或神經系細胞以高效率下進行誘導，而完成本發 明。
即，本發明為有關以下者。
[1]含有下述步驟(1)~(3)之神經系細胞或神經組織的製造方法；(1)將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下，以含有1)TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基進行培養的第一步驟、(2)將以第一步驟所得之細胞進行浮游培養，形成細胞之凝集體的第二步驟、及(3)將以第二步驟所得之凝集體在誘導分化因子之存在下或者非存在下進行浮游培養，得到含有神經系細胞或者神經組織之凝集體的第三步驟。
[2]對於第二步驟，將以第一步驟所得之細胞經分散，使該分散之細胞進行浮游培養的[1]所記載的製造方法。
[3]未分化維持因子為FGF信號傳達途徑作用物質之[1]或[2]所記載的製造方法。
[4]FGF信號傳達途徑作用物質為bFGF之[3]所記載的製造方法。
[5]對於第二步驟，將細胞以含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質之無血清培養基中進行浮游培養者為特徵之[1]~[4]中任一項所記載的製造方法。
[6]對於第三步驟，將凝集體在誘導分化因子之存在下進行浮游培養者為特徵之[1]~[5]中任一項所記載的製造方法。
[7]TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質為Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質、TGFβ信號傳達途徑阻礙物質、或BMP信號傳達途徑阻礙物質之[1]~[6]中任一項所記載的製造方法。
[8]TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質為Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189之[1]~[7]中任一項所記載的製造方法。
[9]音蝟因子信號傳達途徑作用物質為Shh、SAG或嘌嗎啡胺之[1]~[8]中任一項所記載的製造方法。
[10]第三步驟中之誘導分化因子為BMP信號傳達途徑作用物質的[1]~[9]中任一項所記載的製造方法。
[11]BMP信號傳達途徑作用物質為選自由BMP2、BMP4、BMP7及GDF7所成群的1種以上蛋白質之[10]所記載的製造方法。
[12]BMP信號傳達途徑作用物質為BMP4之[10]所記載的製造方法。
[13]於第三步驟所得之凝集體為含有網膜組織之凝集體的[1]~[12]中任一項所記載的製造方法。
[14]於第三步驟所得之凝集體為含有選自由網膜前驅細胞、神經網膜前驅細胞、感光細胞前驅細胞、感光細胞、視桿細胞、錐體感光細胞、水平細胞、無長突細胞、 介在神經細胞、神經節細胞、網膜色素上皮細胞、及睫狀體周緣部細胞所成群的1種或複數種細胞之凝集體的[1]~[13]中任一項所記載的製造方法。
[15]第三步驟中之誘導分化因子為BMP信號傳達途徑作用物質，且第二步驟中之培養基為含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質之[13]或[14]所記載的製造方法。
[16]多能性幹細胞為人類多能性幹細胞，第二步驟中之培養基中的音蝟因子信號傳達途徑作用物質濃度相當於SAG10nM~700nM之音蝟因子信號傳達作用的濃度，且網膜組織為人類網膜組織之[15]所記載的製造方法。
[17]於第三步驟，第二步驟的開始後第1天至第9天之間，添加BMP信號傳達途徑作用物質於培養基之[15]或[16]所記載的製造方法。
[18]於第三步驟，以音蝟因子信號傳達途徑作用物質的濃度相當於SAG700nM的音蝟因子信號傳達作用之濃度以下的培養基進行凝集體的培養之[13]或[14]所記載的製造方法。
[19]第三步驟中之誘導分化因子為TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質之[1]~[9]中任一項所記載的製造方法。
[20]TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質為Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189之[19]所記載的製造方法。
[21]Wnt信號傳達途徑阻礙物質為IWR-1-endo之[19] 或[20]所記載的製造方法。
[22]於第三步驟所得之凝集體為含有大腦組織之凝集體的[1]~[9]或[19]~[21]中任一項所記載的製造方法。
[23]第一步驟的培養時間為0.5小時~144小時之[1]~[22]中任一項所記載的製造方法。
[24]第一步驟為在接著培養法進行之[1]~[23]中任一項所記載的製造方法。
[25]於第三步驟，於第二步驟開始後第3天至第6天之間，添加誘導分化劑於培養基之[1]~[24]中任一項所記載的製造方法。
[26]多能性幹細胞為靈長類多能性幹細胞之[1]~[15]及[17]~[25]中任一項所記載的製造方法。
[27]多能性幹細胞為人類多能性幹細胞之[1]~[26]中任一項所記載的製造方法。
[28]多能性幹細胞為人工多能性幹細胞之[1]~[27]中任一項所記載的製造方法。
[29]於第二步驟，形成均勻凝集體之[1]~[28]中任一項所記載的製造方法。
[30]浮游培養在基底膜標品非存在下進行之[1]~[29]中任一項所記載的製造方法。
[31]含有[1]~[30]中任一項所記載的方法所製造的神經系細胞或神經組織而成之被驗物質的毒性．藥效評估用試藥。
[32]含有使藉由[1]~[30]中任一項所記載的方法所製 造的神經系細胞或神經組織與被驗物質接觸後，檢定該物質造成該細胞或該組織之影響的該物質之毒性．藥效評估方法。
[33]含有藉由[1]~[30]中任一項所記載的方法所製造的神經系細胞或神經組織而成的以神經系細胞或神經組織的障礙為準的疾病之治療藥。
[34]神經系細胞或神經組織為網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、網膜組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞、或大腦組織之[33]所記載的治療藥。
[35]含有將藉由[1]~[30]中任一項所記載的方法所製造的神經系細胞或神經組織之有效量，移植至必須移植的對象者之以神經系細胞或神經組織的障礙為準的疾病之治療方法。
[36]使用於以神經系細胞或神經組織的障礙為準的疾病之治療的藉由[1]~[30]中任一項所記載的方法所製造的神經系細胞或神經組織。
[37]含有將藉由[1]~[30]中任一項所記載的方法所製造的神經系細胞或神經組織作為有效成分之醫藥組成物。
依據本發明，由在飼養細胞非存在下所培養的多能性幹細胞，可在高效率下製造出高品質的細胞凝集體、以及網膜組織等神經組織或神經系細胞。
[圖1]表示實施例1的培養條件、及培養後之人類iPS細胞的形態。
[圖2]表示實施例2的培養條件、及培養後之細胞的亮場圖像及有關Oct3/4之免疫組織染色像。
[圖3]表示凝集體的亮場圖像(A及B)、及將凝集體的形態之程度經定量化的圖表(C)。
[圖4]表示凝集體的亮場圖像。
[圖5]表示凝集體的亮場圖像(A及B)、及有關神經組織標示物(Nestin,TuJ1,PSA-NCAM)之凝集體的免疫組織染色像(C-E)。
[圖6]表示實施例7的培養條件、及有關網膜組織標示物(Chx10，Rx)之凝集體的免疫組織染色像(A-D)。
[圖7]表示實施例8的培養條件、培養後之凝集體的亮場圖像(A-H)、及將凝集體之形態的程度經定量化的圖表(I)。
[圖8]有關神經組織標示物(Nestin,TuJ1,PSA-NCAM)之凝集體的免疫組織染色像。
[圖9]表示實施例9的培養條件、及有關網膜組織標示物(Chx10,Rx)之凝集體的免疫組織染色像(A-H)。
[圖10]表示在種種條件下所形成的凝集體之亮場圖像。
[圖11]表示實施例11的培養條件、及有關神經組織 標示物(Nestin,TuJ1,PSA-NCAM)之凝集體的免疫組織染色像(A-F)。
[圖12]表示實施例12的培養條件、及有關網膜組織標示物(Chx10,Rx)之凝集體的免疫組織染色像(A-D)。
[圖13]表示實施例13的培養條件、及有關Chx10的凝集體之免疫組織染色像(A-D)。
[圖14]表示實施例14的培養條件、凝集體的亮場圖像、及有關網膜組織標示物(Chx10,Rx)之凝集體的免疫組織染色像。
[圖15]表示實施例15的培養條件、及培養後之細胞的亮場圖像(A-D)。
[圖16]表示實施例16的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A，B)、及有關Chx10的凝集體之免疫組織染色像(C)。
[圖17]表示實施例17的培養條件、及培養後的細胞之亮場圖像(A-F)。
[圖18]表示實施例18的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A-E)、及有關Chx10的凝集體之免疫組織染色像(F-I)。
[圖19]表示實施例19的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A-D)、及有關Chx10的凝集體的免疫組織染色像(E-H)。
[圖20]表示實施例20的培養條件、及培養後的細胞之亮場圖像(A-J)。
[圖21]表示實施例21的培養條件、及培養後的細胞之亮場圖像(A-L)。
[圖22]表示實施例22的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A-C)、及有關Chx10的凝集體之免疫組織染色像(D-F)。
[圖23]表示實施例23的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A，B)、及有關Chx10的凝集體之免疫組織染色像(C，D)。
[圖24]表示實施例24的培養條件、及培養後的細胞之亮場圖像(A-D)。
[圖25]表示實施例25的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A-D)。
[圖26]表示實施例26的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A-E)、及有關Chx10之凝集體的免疫組織染色像(F-I)。
[圖27]表示實施例27的培養條件、人類ES細胞的培養像(A)、培養後的細胞之亮場圖像(B-D)及、Rx：：GFP的螢光像(E，F)。
[圖28]表示網膜組織標示物(Rx、Chx10、Crx、Blimp1、Brn3b)及有關Ki67的凝集體之免疫組織染色像(A-F)。
[圖29]表示有關網膜組織標示物(Calretinin、S-opsin、Rx、Pax6、Recoverin、Rhodopsin、NRL、Calbindin)之凝集體的免疫組織染色像(A-H)。
[圖30]表示培養後的細胞之亮場圖像(A、B)、及有關網膜組織標示物(SSEA1、Mitf、Aqp1)之凝集體的免疫組織染色像(C-E)。
[圖31]表示實施例31的培養條件、及培養後的細胞之亮場圖像(A-C)。
[圖32]表示有關大腦組織標示物(Sox2、FoxG1、Pax6、Tbr1、Ctip2)之凝集體的免疫組織染色像(A-F)。
[圖33]表示在種種條件下進行培養的細胞之亮場圖像(A-J)。
[圖34]表示實施例33的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A，B)、及有關Chx10之凝集體的免疫組織染色像(C，D)。
[圖35]表示實施例34的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A-D)、及有關Chx10之凝集體的免疫組織染色像(E-H)。
[圖36]表示實施例35的培養條件、培養後的細胞之亮場圖像(A-E)、及有關Chx10之凝集體的免疫組織染色像(F-I)。
[實施發明的形態]
1.定義
對於本發明，所謂「幹細胞」表示具有維持分化能及 分化能之增殖能(特別為自身複製能)之未分化細胞。於幹細胞配合分化能力，含有多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、多能幹細胞(multipotent stem cell)、單能性幹細胞(unipotent stem cell)等亞集團。所謂多能性幹細胞為，可於活體外進行培養者，且具有分化為三胚葉(外胚葉、中胚葉、內胚葉)及/或胚體外組織所屬的所有細胞系譜之能力(分化多能性(pluripotency))的幹細胞。所謂多能幹細胞表示並非所有種類，但具有分化為複數種組織或細胞的能力之幹細胞。所謂單能性幹細胞表示具有分化為特定組織或細胞的能力之幹細胞。
多能性幹細胞可自受精卵、克隆胚、生殖幹細胞、組織內幹細胞、體細胞等所誘導。作為多能性幹細胞，可舉出胚胎幹細胞(ES細胞：Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞(iPS細胞：induced pluripotent stem cell)等。由間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell；MSC)所得之Muse細胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell)或由生殖細胞(例如精巢)所製作的GS細胞亦包含於多能性幹細胞。胚胎幹細胞係在1981年建構，於1989年後亦應用在基因敲除小鼠製作上。於1998年已建構人類胚胎幹細胞，現今亦利用於再生醫學上。ES細胞可藉由將內部細胞塊在飼養細胞上或含有LIF之培養基中進行培養而製造。ES細胞的製造方法，例如記載在WO96/22362、WO02/101057、US5，843，780、US6，200，806、US6， 280，718等。胚胎幹細胞可由所定機關獲得，又可購入市售品。例如，人類胚胎幹細胞之KhES-1、KhES-2及KhES-3可由京都大學再生醫科學研究所獲得。人類胚胎幹細胞之Rx：：GFP株(來自KhES-1)可由國立研究開發法人理化學研究所獲得。皆為老鼠胚胎幹細胞，EB5細胞可由國立研究開發法人理化學研究所獲得，D3株可由ATCC獲得。
ES細胞之一的核移植ES細胞(ntES細胞)可由去除細胞株的卵子中移植體細胞的細胞核後所做出的克隆胚所建構。
EG細胞可藉由將原始生殖細胞在含有mSCF、LIF及bFGF的培養基中進行培養而製造(Cell,70：841-847,1992)。
所謂本發明中之「人工多能性幹細胞」為，將體細胞藉由公知方法等進行初期化(reprogramming)後，誘導成多能性之細胞。具體可舉出藉由將成纖維細胞或末梢血單核球等經分化的體細胞自含有Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等之初期化基因群選出的複數基因的組合中任一表現而進行初期化後誘導為多分化能之細胞。作為較佳初期化因子之組合，可舉出(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及L-Myc(Stem Cells,2013；31：458-466)。
人工多能性幹細胞係在2006年由山中們由老鼠細胞 所建構(Cell,2006,126(4),pp.663-676)。人工多能性幹細胞在2007年亦建構人類成纖維細胞，具有與胚胎幹細胞同樣之多能性與自身複製能(Cell,2007,131(5),pp.861-872；Science,2007,318(5858),pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.,2008,26(1),pp.101-106)。
作為人工多能性幹細胞，除藉由基因表現以直接初期化製造之方法以外，可藉由化合物之添加等，由體細胞誘導出人工多能性幹細胞(Science,2013,341,pp.651-654)。
又，亦可獲得經株化的人工多能性幹細胞，例如京都大學所建構的201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞或、1231A3細胞等人類人工多能性細胞株可由京都大學及iPSAcademia Japan股份有限公司獲得。作為經株化的人工多能性幹細胞，例如京都大學所建構的Ff-I01細胞及Ff-I14細胞可由京都大學獲得。
作為使用於製造人工多能性幹細胞時的體細胞，並無特別限定，可舉出來自組織的成纖維細胞、血細胞(例如末梢血單核球或T細胞)、肝細胞、胰臟細胞、腸上皮細胞、平滑肌細胞等。
製造人工多能性幹細胞時，藉由數種類基因的表現使其初期化時，使基因表現之手段並無特別限定。作為前述手段，可舉出使用病毒載體(例如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、血凝日本的病毒載體、腺病毒載體、腺 相關病毒載體)之感染法、使用質粒載體(例如質粒載體、游離載體)之基因導入法(例如磷酸鈣法、脂質體轉染法、RetroNectin法、電穿孔法法)、使用RNA載體的基因導入法(例如磷酸鈣法、脂質體轉染法、電穿孔法法)、蛋白質之直接注入法等。
製造人工多能性幹細胞時，可在飼養細胞存在下或飼養細胞非存在下(無飼養)製造。在飼養細胞存在下製造人工多能性幹細胞時，以公知方法在未分化維持因子存在下可製造人工多能性幹細胞。在飼養細胞非存在下，作為製造人工多能性幹細胞時所使用的培養基，雖無特別限定，可使用公知之胚胎幹細胞及/或人工多能性幹細胞的維持培養基或無飼養下使用於建構人工多能性幹細胞時所使用的培養基。作為在無飼養下欲建構人工多能性幹細胞的無飼養建構用培養基，例如可舉出Essential 8培養基或TeSR培養基、mTeSR培養基、mTeSR-E8培養基、StemFit培養基等無飼養培養基。製造人工多能性幹細胞時，例如在飼養細胞非存在下於體細胞，使用血凝日本的病毒載體，將Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc的4因子進行基因導入後可製造出人工多能性幹細胞。
使用於本發明的多能性幹細胞，較佳為ES細胞或人工多能性幹細胞，更佳為人工多能性幹細胞。
作為多能幹細胞，可舉出造血幹細胞、神經幹細胞、網膜幹細胞、間葉系幹細胞等組織幹細胞(亦稱為組織性幹細胞、組織專一性幹細胞或體性幹細胞)。
基因經改變的多能性幹細胞，例如可藉由使用相同重組技術而製作。作為經改變的染色體上之基因，例如可舉出細胞標示物基因、組織適合性抗原之基因、以神經系細胞之障礙為準的疾病相關基因等。染色體上之標的基因的改變可使用Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993)；生物手冊叢書8，Gene targeting，使用ES細胞的變異老鼠之製作，羊土公司(1995)等所記載的方法而進行。
具體為例如將含有經改變的標的基因(例如細胞標示物基因、組織適合性抗原之基因或疾病關連基因等)的基因組DNA經分離，使用經分離的基因組DNA，至做出欲將標的基因進行相同重組的標的載體。將所製作的標的載體導入於幹細胞中，藉由選擇在標的基因與標的載體之間引起相同重組的細胞，可製造出染色體上的基因經改變的幹細胞。
作為含有標的基因之基因組DNA的分離方法，可舉出Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997)等記載之公知方法。藉由使用基因組DNA基因庫篩選系統(Genome Systems製)或Universal GenomeWalker Kits(CLONTECH製)等，亦可分 離含有標的基因之基因組DNA。取代基因組DNA，亦可使用編碼標的蛋白質之核苷酸。該核苷酸可藉由以PCR法增加該核苷酸而取得。
使用於將標的基因進行相同重組的標的載體之製作、及相同重組體之效率性選別，可依據Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993)；生物手冊叢書8，Gene targeting，使用ES細胞的變異老鼠之製作，羊土公司(1995)等所記載的方法進行。標的載體可使用置換型或插入型中任一種。作為選別方法，可使用正選擇、啟動子選擇、負選擇、或聚A選擇等方法。
作為由選別的細胞株之中選擇目的之相同重組體的方法，可舉出對於基因組DNA之南方雜交法或PCR法等。
於本發明中之「哺乳動物」中包含囓齒類、有蹄類、貓目、靈長類等。於囓齒類中包含老鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等。於有蹄類包含豬、牛、羊、馬、綿羊等。於貓目包含狗、貓等。所謂本發明中之「靈長類」表示靈長目所屬的補乳類動物，作為靈長類，可舉出狐猴或懶猴、樹鼩等原猿亞目與猴、類人猿、人類等真猿亞目。
於本發明所使用的多能性幹細胞係為哺乳動物之多能性幹細胞，較佳為囓齒類(例如老鼠、大鼠)或靈長類(例如人類、猴)之多能性幹細胞，較佳為人類多能性幹細胞，更佳為人類人工多能性幹細胞(iPS細胞)或人類胚胎幹細胞(ES細胞)。
所謂本發明中之「浮游培養」或者「浮游培養法」表示維持細胞或細胞之凝集體於培養液中以浮游存在狀態下進行培養，及進行該培養的方法。即浮游培養在將細胞或細胞的凝集體不黏著於培養器材等條件下進行，接著於培養器材等條件下所進行的培養(接著培養、或者接著培養法)未含於浮游培養之範疇。此時，若接著細胞時，於細胞或細胞之凝集體與培養器材之間，會產生強固細胞-基質間結合(cell-substratum junction)。更詳細為，所謂浮游培養為，於細胞或細胞的凝集體與培養器材等之間未產生強固細胞-基質間結合之條件下進行培養，所謂接著培養為細胞或細胞的凝集體與培養器材等之間產生強固細胞-基質間結合之條件下的培養。
在浮游培養中的細胞之凝集體，細胞與細胞為面接著。在浮游培養中的細胞之凝集體，細胞-基質間結合在與培養器材等之間幾乎不會形成，或者即使形成該貢獻亦少。在一部份的態樣，在浮游培養中的細胞之凝集體，內在之細胞-基質間結合雖存在於凝集塊的內部，但細胞-基質間結合幾乎不形成於與培養器材等之間，或者即使形成該貢獻亦小。
若細胞與細胞為面接著(plane attachment)時，稱為細胞與細胞以面進行接著。更詳細為，若細胞與細胞為面接著時，某細胞表面積中與其他細胞表面進行接著的比例例如為1%以上，較佳為3%以上，更佳為5%以上。細胞表面可藉由染色膜的試藥(例如DiI)進行染色，或藉 由細胞接著因子(例如E-cadherin或N-cadherin)的免疫染色進行觀察。
進行浮游培養時所使用的培養器若為「可進行浮游培養」者即可，並無特別限定，若為斯業者，可適宜決定。作為如此培養器，例如可舉出燒瓶、組織培養用燒瓶、培養皿(Dish)、培養皿、組織培養用皿、多功能皿、微平板、微孔板、微孔、多片式盤、多片孔板、室載玻片、碟、試管、盤、培養包、旋轉燒瓶、三角燒瓶或旋轉瓶。這些培養器欲可進行浮游培養，以細胞非接著性者為佳。作為細胞非接著性之培養器，培養器的表面為使用以提高與細胞之接著性的目的下未經過人工處理(例如基底膜標品、層黏連蛋白、巢蛋白、膠原、明膠等細胞外基質等、或藉由聚賴胺酸、聚鳥胺酸等高分子等進行塗布處理、或正電荷處理等表面加工)者等。作為細胞非接著性之培養器，培養器的表面為使用以後低與細胞之接著性為目的下，經由人工處理(例如MPC聚合物等超親水性處理、蛋白質低吸著處理等)者等。可使用旋轉燒瓶或旋轉瓶等進行轉動培養。培養器的培養面可為平底亦可為凹凸。
進行接著培養時所使用的培養器若為可「進行接著培養」者即可並無特別限定，若為斯業者可配合適宜培養之規模、培養條件及培養期間而選擇培養器。作為如此培養器，例如可舉出燒瓶、組織培養用燒瓶、培養皿(盤子)、組織培養用盤子、多功能皿、微平板、微孔板、 多片式盤、多片孔板、室載玻片、碟、試管、盤、培養包、微小載體、珠子、堆疊板、旋轉燒瓶或旋轉瓶。這些培養器因可進行接著培養，以細胞接著性為佳。作為細胞接著性之培養器，可舉出培養器的表面以提高與細胞之接著性為目的經人工處理的培養器，具體的可舉出經表面加工的培養器、或內部經塗布劑進行包覆的培養器。作為塗布劑，例如可舉出層黏連蛋白[含有層黏連蛋白α5β1γ1(以下、層黏連蛋白511)、層黏連蛋白α1β1γ1(以下、層黏連蛋白111)等及層黏連蛋白片段(層黏連蛋白511E8等)]、巢蛋白、膠原、明膠、玻璃黏連蛋白(Vitronectin)、Synth Max(康寧公司)、基底膜等細胞外基質等、或聚賴胺酸、聚鳥胺酸等高分子等。作為經表面加工的培養器，可舉出經正電荷處理等表面加工的培養容器。
使用於本發明中之細胞的培養之培養基，可將通常使用於動物細胞培養之培養基作為基礎培養基而調製。作為基礎培養基，例如可舉出BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM(GMEM)培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基、F-12培養基、DMEM/F12培養基、IMDM/F12培養基、火腿培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基、或這些混合培養基等，可使用於動物細胞之培養的培養基。
所謂本發明中之「無血清培養基」表示未含 有無調整或未純化的血清之培養基。本發明中，即使混入來自經純化的血液之成分或來自動物組織之成分(例如增殖因子)的培養基，僅未含有無調整或未純化的血清，即包含於無血清培養基中。
無血清培養基可含有血清代替物。作為血清代替物，例如可舉出適宜地含有白蛋白、轉鐵蛋白、脂肪酸、膠原前驅體、微量元素、2-巰基乙醇或3’硫醇甘油、或者這些均等物等者。該血清代替物，例如可藉由WO98/30679所記載的方法調製。作為血清代替物可利用市售品。作為該市售的血清代替物，例如可舉出KnockoutTM Serum Replacement(Life Technologies公司製；現ThermoFisher：以下有時記載為KSR)、Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies公司製)、GlutamaxTM(Life Technologies公司製)、B27(Life Technologies公司製)、N2supplement(Life Technologies公司製)。
在浮游培養所使用的無血清培養基可適宜地含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如非必須胺基酸)、維他命、增殖因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。
欲避開調製之煩雜，作為該無血清培養基，可使用添加市售之KSR(Life Technologies公司製)適量(例如約0.5%至約30%，較佳為約1%至約20%)的無血清培養基(例如於F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液 中添加10% KSR、Chemically-defined Lipid concentrated、及450μM 1-一硫甘油之培養基)。又，作為KSR同等品可舉出特表2001-508302所揭示的培養基。
所謂本發明中之「血清培養基」表示含有無調整或未純化之血清的培養基。該培養基可含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如非必須胺基酸)、維他命、增殖因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、1-一硫甘油、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。例如使用基底膜等基底膜標品，將多能性幹細胞誘導分化網膜組織等時，可使用血清培養基(Cell Stem Cell,10(6),771-775(2012))。又，對於維持藉由本發明所製造的神經組織(例如網膜組織、大腦組織)之步驟(亦稱為成熟培養)，可使用血清培養基。
本發明中之培養較佳為在無異物條件(Xeno-free)下進行。所謂「無異物」表排除來自與培養對象的細胞生物種相異的生物種之成分的條件。
對於本發明，所謂「含有物質X之培養基」「物質X之存在下」表示添加外來性(exogenous)的物質X之培養基或含有外來性物質X之培養基、或外來性物質X之存在下。即，於該培養基中存在的細胞或組織為，將該物質X於內在性(endogenous)表現、分泌或者產生時，內在性物質X可與外來性物質X區分，未含外來性物質X之培養基即使含有內在性物質X，亦解釋為非在「含有物質X之培養基」的範疇。
例如所謂「含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙 物質的培養基」表示添加外來性TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之培養基或含有外來性TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之培養基。
對於本發明，所謂飼養細胞表示培養幹細胞時使其共存之該幹細胞以外的細胞。作為使用於多能性幹細胞的未分化維持培養之飼養細胞，例如可舉出老鼠成纖維細胞(MEF等)、人類成纖維細胞、SNL細胞等。作為飼養細胞，以經增殖抑制處理之飼養細胞為佳。作為增殖抑制處理，可舉出增殖抑制劑(例如絲裂黴素C)處理或伽馬射線照射或者UV照射等。使用於多能性幹細胞的未分化維持培養之飼養細胞為藉由液性因子(較佳為未分化維持因子)的分泌或細胞接著用足場(細胞外基質)之製作，對多能性幹細胞之未分化維持有所貢獻。
對於本發明，所謂飼養細胞非存在下(無飼養)表示在飼養細胞非存在下進行培養。所謂飼養細胞非存在下，例如可舉出未添加飼養細胞的條件、或實質上未含有飼養細胞(例如對於全細胞數的飼養細胞數比例為3%以下)之條件。
對於本發明，所謂細胞的「凝集體」(Aggregate)表示於培養基中分散的細胞經集合所形成的塊，稱為細胞彼此接著之塊。細胞塊、胚體(Embryoid body)、球體(Sphere)、橢球體(Spheroid)亦包含於細胞的凝集體。較佳為對於細胞的凝集體，細胞彼此為面接著。對於一部分的態樣，於凝集體的一部分或者全部，細胞彼 此形成細胞-細胞間結合(cell-cell junction)及/或細胞接著(cell adhesion)，例如有時形成接著結合(adherence junction)。作為本發明中之「凝集體」，具體可舉出在上述本發明[1]的第二步驟所生成之分散在浮游培養開始時的細胞所形成的凝集體，或含有在上述本發明[1]的第三步驟所生成之自多能性幹細胞所誘導分化的神經系細胞之凝集體，於「凝集體」中亦包含於上述本發明[1]的第二步驟開始時(即浮游培養開始時)已經形成的凝集體。在第二步驟所生成的細胞之凝集體包含「胚體」(Embryoid body；EB)。
對於本發明，所謂「均勻凝集體」表示於培養複數凝集體時，各凝集體的尺寸為一定者，凝集體的尺寸若以最大徑長度做評估時，所謂均勻凝集體表示最大徑長度的分散較小的意思。更具體表示凝集體的集團全體中之75%以上凝集體在該凝集塊集團中之最大徑平均值±100%，較佳為平均值±50%之範圍內，更佳為平均值±20%之範圍內。
對於本發明，所謂「形成均勻凝集體」表示集合細胞形成細胞的凝集體進行浮游培養時，因使其「迅速凝集經一定數分散之細胞」，而形成尺寸均勻之細胞的凝集體。
所謂分散表示將細胞或組織藉由酵素處理或物理處理等分散處理，分離至小細胞片(2細胞以上100細胞以下，較佳為50細胞以下)或單一細胞的意思。所謂經 一定數分散之細胞表示以一定數聚集的細胞片或單一細胞之意思。
作為分散多能性幹細胞之方法，例如可舉出機械性分散處理、細胞分散液處理、細胞保護劑添加處理。亦可組合這些處理進行。較佳為進行細胞分散液處理，其次可再進行機械性分散處理。
作為機械性分散處理之方法，可舉出移液處理或以刮刀刮取的操作。
作為使用於細胞分散液處理之細胞分散液，例如可舉出含有胰蛋白酶、膠原酶、透明質酸酶、彈性蛋白酶、鏈黴蛋白酶、DNase或木瓜蛋白酶等酵素類或乙二胺四乙酸等螯合劑中任一種之溶液。市售的細胞分散液，例如可使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)或TrypLE Express(Life Technologies公司製)。
分散多能性幹細胞時，藉由以細胞保護劑進行處理，可抑制多能性幹細胞之細胞死。作為使用於細胞保護劑處理之細胞保護劑，可舉出FGF信號傳達途徑作用物質、肝素、IGF信號傳達途徑作用物質、血清、或血清代替物。又，欲抑制藉由分散所誘導的細胞死(特別為人類多能性幹細胞之細胞死)，在分散時亦可添加Rho-associated coiled-coil激酶(ROCK)的阻礙物質或Myosin的阻礙物質。作為ROCK阻礙物質，可舉出Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等。作為Myosin的阻礙物質，有Blebbistatin可舉出。作為較佳的細胞保護劑可舉出 ROCK阻礙物質。
例如作為使多能性幹細胞分散之方法，可舉出將多能性幹細胞的群體在作為細胞保護劑的ROCK阻礙物質之存在下，以細胞分散液(TrypLE Select)處理，進一步藉由移液使其分散的方法。
對於本發明之製造方法，以迅速集合多能性幹細胞而形成多能性幹細胞的凝集體者為佳。形成如此多能性幹細胞的凝集體時，對於自所形成的凝集體所誘導分化的細胞，可使再現性良好下形成上皮樣結構。作為使凝集體形成之實驗操作，例如可舉出使用孔較小的平板(例如孔之底面積以平底換算時為0.1~2.0cm2程度之平板)或微孔等，於較小空間塞入細胞的方法、使用較小離心試管藉由短時間離心使細胞凝集的方法。作為孔較小的平板，例如可舉出24孔板(面積以平底換算為1.88cm2程度)、48孔板(面積以平底換算為1.0cm2程度)、96孔板(面積以平底換算為0.35cm2程度、內徑6~8mm程度)、384孔板。較佳可舉出96孔板。作為孔較小的平板之形狀，作為將孔由上面看時的底面形狀，可舉出多角形、長方形、楕圓、正圓，較佳為正圓。作為孔較小的平板形狀，作為將孔由橫向看時的底面形狀，可為平底結構，亦可為外周部高而內凹部低陷的結構。作為底面形狀，例如可舉出U底、V底、M底，較佳為U底或V底，更佳為V底可舉出。作為孔較小的平板，可使用細胞培養皿(例如60mm~150mm盤子、培養燒瓶)的底面為凹凸、或有窪地 者。孔較小的平板之底面為細胞非接著性之底面，較佳為使用經前述細胞非接著性塗布之底面為佳。
多能性幹細胞、或含有多能性幹細胞之細胞集團的凝集體之形成、及其均勻性可依據凝集體的尺寸及細胞數、肉眼形態、藉由組織染色解析之微觀形態及其均勻性等來判斷。又，對於凝集體在形成上皮樣結構時，及其均勻性可依據凝集體之肉眼形態、藉由組織染色解析之微觀形態及其均勻性、分化及未分化標示物之表現及其均勻性、分化標示物之表現控制及其同期性、分化效率的凝集體間之再現性等來判斷。
所謂本發明中之「組織」表示形態或性質均勻之一種類細胞、或形態或性質相異的複數種類細胞具有以一定圖型成立體配置的結構之細胞集團的結構體。
對於本發明所謂「神經組織」表示發生期或成體期的大腦、中腦、小腦、脊髓、網膜、末梢神經、前腦、後腦、端腦、間腦等藉由神經系細胞所構成的組織。神經組織可形成具有層結構之上皮結構(神經上皮)，細胞凝集體中的神經上皮可藉由使用光學顯微鏡之亮視野觀察評估存在量。
對於所謂本發明「神經系細胞(Neural cell)」表示來自外胚葉的組織中之表皮系細胞以外的細胞。即，含有神經系前驅細胞、神經元(神經細胞)、膠質、神經幹細胞、神經元前驅細胞及膠質前驅細胞等細胞。於神經系細胞中亦包含構成下述網膜組織之細胞(網膜細胞)、網膜 前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、神經網膜細胞、網膜色素上皮細胞。神經系細胞可將Nestin、TuJ1、PSA-NCAM、N-cadherin等作為標示物進行鑑定。
神經細胞(Neuron．Neuronal cell)為形成神經回路對情報傳達具有貢獻功能之細胞，可將TuJ1、Dcx、HuC/D等幼若神經細胞標示物、及/或Map2、NeuN等成熟神經細胞標示物之表現作為指標進行鑑定。
作為膠質(glia)可舉出星形膠質細胞、少突膠質細胞、穆勒膠質等。作為星形膠質細胞的標示物可舉出GFAP，作為突膠質細胞的標示物，可舉出O4，作為穆勒膠質的標示物可舉出CRALBP等。
所謂神經幹細胞為具有對神經細胞及神經膠質細胞之分化能(多分化能)與維持多分化能之增殖能(亦稱為自身複製能)的細胞。作為神經幹細胞的標示物，可舉出Nestin、Sox2、Musashi、Hes家族、CD133等，但這些標示物為前驅細胞全般的標示物，無法考慮為神經幹細胞專一性標示物。神經幹細胞的數可藉由神經球體分析或克隆性分析等進行評估。
所謂神經元前驅細胞為，具有增殖能，產生神經細胞，不產生神經膠質細胞的細胞。作為神經元前驅細胞的標示物，可舉出Tbr2、Tα1等。或者可將幼若神經細胞標示物(TuJ1、Dcx、HuC/D)陽性且增殖標示物(Ki67,pH3,MCM)陽性之細胞作為神經元前驅細胞進行鑑定。
所謂膠質前驅細胞為具有增殖能，產生神經 膠質細胞，不產生神經細胞之細胞。
神經系前驅細胞(Neural Precursor cell)為含有神經幹細胞、神經元前驅細胞及膠質前驅細胞之前驅細胞的集合體，具有增殖能與神經元及膠質產生能。神經系前驅細胞可將Nestin,GLAST,Sox2,Sox1,Musashi,Pax6等作為標示物進行鑑定。或者將神經系細胞之標示物陽性且增殖標示物(Ki67,pH3,MCM)陽性的細胞作為神經系前驅細胞進行鑑定。
本發明中所謂的「網膜組織」表示對於活體網膜，夠各網膜層之感光細胞、感光細胞前驅細胞、視桿細胞、錐體感光細胞、介在神經細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、網膜神經節細胞(神經節細胞)、網膜色素上皮細胞(RPE)、睫狀體周緣部細胞、這些前驅細胞、或網膜前驅細胞等細胞一種類或至少複數種類，以層狀以立體性排列的組織。各細胞是否為構成任一網膜層的細胞，可藉由公知方法，例如藉由細胞標示物之表現有無或者該程度等而做確認。
本發明中所謂「網膜層」表示構成網膜之各層，具體有網膜色素上皮層、感光細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網狀層、內顆粒層、內網狀層、神經節細胞層、神經線維層及內境界膜可舉出。
本發明中所謂「網膜前驅細胞」表示，可經分化為感光細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、網膜神經節細胞、網膜色素上皮細胞等任一成熟網膜細胞的 前驅細胞。
本發明中所謂「神經網膜前驅細胞」表示，可經分化為感光細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、網膜神經節細胞等中任一或者複數成熟網膜細胞的前驅細胞。一般而言神經網膜前驅細胞並未能分化為網膜色素上皮細胞。
所謂感光細胞前驅細胞、水平細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞、無長突細胞前驅細胞、網膜神經節細胞前驅細胞、網膜色素上皮前驅細胞為，決定分化為各感光細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、網膜神經節細胞、網膜色素上皮細胞之前驅細胞。
本發明中所謂「網膜層專一性神經細胞」表示構成網膜層之細胞，對於網膜層具有專一性之神經細胞。作為網膜層專一性神經細胞，有雙極細胞、網膜神經節細胞、無長突細胞、水平細胞、感光細胞、網膜色素上皮細胞、桿體細胞及錐體細胞可舉出。
作為網膜細胞標示物，可舉出在網膜前驅細胞表現之Rx(亦稱為Rax)、在PAX6及Chx10、丘腦下部神經元的前驅細胞表現，但在網膜前驅細胞則無表現的Nkx2.1、在丘腦下部神經上皮表現但在網膜無表現的Sox1、在感光細胞之前驅細胞表現的Crx、Blimp1等。作為網膜層專一性神經細胞之標示物，可舉出在雙極細胞表現的Chx10、PKCα及L7、在網膜神經節細胞表現之TuJ1及Brn3、在無長突細胞表現之Calretinin、在水平細胞表 現之Calbindin、在成熟感光細胞表現之Rhodopsin及Recoverin、在桿體細胞表現之Nrl及Rhodopsin、在錐體細胞表現之Rxr-gamma及S-Opsin、在網膜色素上皮細胞表現之RPE65及Mitf、在睫狀體周緣部表現之Rdh10及SSEA1等。
本發明中所謂「大腦組織」表示構成胚胎期或成體之大腦的細胞(例如大腦神經系前驅細胞(cortical neural precursor cell)、背側大腦神經系前驅細胞、腹側大腦神經系前驅細胞、大腦層結構專一性神經細胞(神經元)、第一層神經元、第二層神經元、第三層神經元、第四層神經元、第五層神經元、第六層神經元、神經膠質細胞(星形膠質細胞及少突膠質細胞)、這些前驅細胞等)為一種類或至少複數種類，以層狀成立體排列的組織。胚胎期的大腦亦稱為前腦或端腦。各細胞之存在可藉由公知方法，例如藉由細胞標示物之表現有無或者其程度等進行確認。
本發明中所謂「大腦層」表示構成成體大腦或胚胎期大腦之各層，具體可舉出分子層、外顆粒層、外錐體細胞層、內顆粒層、神經細胞層(內錐體細胞層)、多型細胞層、第一層、第二層、第三層、第四層、第五層、第六層、皮質帶、中間帶、腦室下帶、及腦室帶(ventricular zone)。
作為本發明中之「大腦神經系前驅細胞」有神經元前驅細胞、第一層神經元前驅細胞、第二層神經元 前驅細胞、第三層神經元前驅細胞、第四層神經元前驅細胞、第五層神經元前驅細胞、第六層神經元前驅細胞、星形膠質細胞前驅細胞、少突膠質細胞前驅細胞等可舉出。各細胞為決定分化為第一層神經元、第二層神經元、第三層神經元、第四層神經元、第五層神經元、第六層神經元、星形膠質細胞、及少突膠質細胞之前驅細胞。
本發明中之「大腦神經系前驅細胞」為包含具有對第一層神經元、第二層神經元、第三層神經元、第四層神經元、第五層神經元、第六層神經元、星形膠質細胞、及少突膠質細胞中至少複數分化系譜之分化能(多分化能)的多能幹細胞(複能性神經幹細胞、multi-potent neural stem cell)。
所謂本發明中之「大腦層專一性神經細胞」表示構成大腦層之細胞，對於大腦層具有專一性之神經細胞。作為大腦層專一性神經細胞，有第一層神經元、第二層神經元、第三層神經元、第四層神經元、第五層神經元、第六層神經元、大腦興奮性神經元、大腦抑制性神經元等可舉出。
作為大腦細胞標示物，可舉出在大腦細胞表現之FoxG1(別名Bf1)、在大腦神經系前驅細胞表現之Sox2及Nestin、在背側大腦神經系前驅細胞表現之Pax6及Emx2、在腹側大腦神經系前驅細胞表現之Dlx1、Dlx2及Nkx2.1、在神經元前驅細胞表現之Tbr2、Nex、Svet1、在第六層神經元表現之Tbr1、在第五層神經元表 現之Ctip2、在第四層神經元表現之RORβ、在第三層神經元或第二層神經元表現之Cux1或Brn2、在第一層神經元表現之Reelen等。
2.神經系細胞或神經組織的製造方法
本發明之製造方法1為含有下述步驟(1)~(3)之神經系細胞或神經組織的製造方法：(1)在含有將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下，1)TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基進行培養的第一步驟、(2)將以第一步驟所得之細胞進行浮游培養，使其形成細胞的凝集體之第二步驟、及(3)將以第二步驟所得之凝集體在誘導分化因子之存在下或者非存在下進行浮游培養，得到含有神經系細胞或者神經組織之凝集體的第三步驟。
對於步驟(1)，在將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下，以含有1)TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基進行培養。
作為步驟(1)中較佳多能性幹細胞，可舉出人工多能性幹細胞或胚胎幹細胞(ES細胞)，較佳為人類人工多能性幹細胞或人類胚胎幹細胞(ES細胞)。
其中，人工多能性幹細胞的製造方法雖無特 別限定，如上述可以斯業者所熟知的方法製造，但人工多能性幹細胞的製作步驟(即將體細胞經初期化建構多能性幹細胞之步驟)亦在無飼養下進行為佳。
其中，胚胎幹細胞(ES細胞)的製造方法並無特別限定，如上述可依據斯業者熟知的方法製造，但胚胎幹細胞(ES細胞)的製作步驟亦在無飼養下進行為佳。
在步驟(1)所使用的多能性幹細胞之維持培養．擴大培養可藉由如上述斯業者所熟知的方法實施。多能性幹細胞的維持培養．擴大培養即使在接著培養或在浮游培養亦可實施，但較佳為在接著培養實施。多能性幹細胞的維持培養．擴大培養可在送料機存在下實施，亦可在無飼養實施，較佳為在無飼養下實施。所謂多能性幹細胞的維持培養及擴大培養中之飼養細胞非存在下(無飼養)表示實質上未含有飼養細胞(例如對於全細胞數之飼養細胞數的比例為3%以下)條件。較佳為對於未含有飼養細胞，實施多能性幹細胞之維持培養及擴大培養。
所謂步驟(1)中之飼養細胞非存在下(無飼養)，表示時值上未含有飼養細胞(例如對於全細胞數之飼養細胞數的比例為3%以下)之條件。較佳為對於未含有飼養細胞之條件，實施步驟(1)。對於步驟(1)所使用的培養基在無飼養條件下，僅為可進行多能性幹細胞之未分化維持培養的培養基(無飼養培養基)即可，並無特別限定，較佳為欲可未分化維持培養，含有未分化維持因子。
未分化維持因子若為具有抑制多能性幹細胞 的分化之作用的物質即可，並無特別限定。作為斯業者所汎用的未分化維持因子，在引發性多能性幹細胞(Primed pluripotent stem cells)(例如人類ES細胞或人類iPS細胞)時，有FGF信號傳達途徑作用物質、TGFβ家族信號傳達途徑作用物質、insulin等可舉出。作為FGF信號傳達途徑作用物質的具體例子，可舉出成纖維細胞增殖因子(例如bFGF、FGF4或FGF8)。又，作為TGFβ家族信號傳達途徑作用物質，可舉出TGFβ信號傳達途徑作用物質、Nodal/Activin信號傳達途徑作用物質。作為TGFβ信號傳達途徑作用物質，例如可舉出TGFβ1、TGFβ2。作為Nodal/Activin信號傳達途徑作用物質，例如可舉出Nodal、ActivinA、ActivinB。培養人類多能性幹細胞(人類ES細胞、人類iPS細胞)時，步驟(1)中之培養基較佳為含有作為未分化維持因子之bFGF。
使用於本發明的未分化維持因子通常為哺乳動物的未分化維持因子。作為哺乳動物，有上述者可舉出。未分化維持因子因為在哺乳動物的種間具有交差反應性，故僅可維持培養對象的多能性幹細胞之未分化狀態，可使用任一種哺乳動物的未分化維持因子，較佳為與培養細胞為相同種的哺乳動物之未分化維持因子。例如在人類多能性幹細胞的培養中，使用人類未分化維持因子(例如bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等)。其中，所謂「人類蛋白質X」表示蛋白質X在人類活體內具有天然表現之蛋白質X 的胺基酸序列。
使用於本發明的未分化維持因子較佳為經分離者。所謂「分離」表示進行除去作為目的之成分或細胞以外的因子之操作，離開天然存在之狀態。因此，於「經分離的蛋白質X」中未包含自培養對象的細胞或組織所產生的細胞或組織及培養基中所含的內在性蛋白質X。「將分離的蛋白質X」之純度(於總蛋白質重量所佔蛋白質X的重量百分率)通常為70%以上，以80%以上為佳，較佳為90%以上，更佳為99%以上，最佳為100%。因此，對於一態樣，本發明含有提供經分離的未分化維持因子之步驟。又，對於一態樣，對於使用於步驟(1)的培養基中，含有將經分離的未分化維持因子添加於外來性(或外因性)的步驟。或者可於使用於步驟(1)的培養基中預先添加未分化維持因子。
於步驟(1)所使用的培養基中之未分化維持因子濃度為可維持進行培養的多能性幹細胞之未分化狀態的濃度，僅為斯業者即可適宜地設定。例如具體為作為未分化維持因子，在飼養細胞非存在下使用bFGF時，該濃度通常為4ng~500ng/mL程度，較佳為10ng~200ng/mL程度，更佳為30ng~150ng/mL程度。
作為無飼養培養基為多數的合成培養基已被開發．市售，例如可舉出Essential 8培養基。Essential 8培養基為於DMEM/F12培養基中，作為添加劑含有L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium(64mg/l),sodium selenium(14μg/l),insulin(19.4mg/l),NaHCO3(543mg/l),transferrin(10.7mg/l),bFGF(100ng/mL)、及TGFβ家族信號傳達途徑作用物質(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))的(Nature Methods,8,424-429(2011))。作為市售的無飼養培養基，例如可舉出Essential 8(Life Technologies公司製)、S-medium(DSPharma Biomedical公司製)、StemPro(Life Technologies公司製)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008 Sep 9；105(36)：13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司製)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司製。又其他作為無飼養培養基可舉出StemFit(味之素公司製)。在上述步驟(1)藉由使用這些可簡便地實施本發明。
步驟(1)中之多能性幹細胞的培養可在浮游培養及接著培養之任一條件下進行，較佳可藉由接著培養進行。
使用於進行接著培養時的培養器若為「可接著培養」者即可，並無特別限定，以細胞接著性培養器為佳。作為細胞接著性的培養器為培養器表面以提供與細胞之接著性為目的而經人工處理的培養器，具體為前述內部以塗布劑進行包覆的培養器。作為塗布劑，例如可舉出層黏連蛋白[含有層黏連蛋白α5β1γ1(以下層黏連蛋白511)、層黏連蛋白α1β1γ1(以下層黏連蛋白111)等及層黏連蛋白片段(層黏連蛋白511E8等)]、巢蛋白、膠原、明膠、玻璃 黏連蛋白(Vitronectin)、Synth Max(康寧公司)、基底膜等細胞外基質等、或聚賴胺酸、聚鳥胺酸等高分子等。又，可使用經正電荷處理等表面加工的培養容器。較佳可舉出層黏連蛋白，較佳為可舉出層黏連蛋白511E-8。層黏連蛋白511E-8可由市售品購入(例：iMatrix-511、Nippi)。
步驟(1)中所使用的培養基為含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質。對於第一步驟，將多能性幹細胞以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質進行處理後，藉由於第二步驟賦予浮游培養，高效率製造出變化為多能性幹細胞之狀態，提高凝集體之品質，維持表面平滑且凝集體內部緊密的未分化性的細胞凝集體。
所謂TGFβ家族信號傳達途徑(即TGFβ超家族信號傳達途徑)為將TGFβ、Nodal/Activin、或BMP作為配位體，在細胞內藉由Smad家族進行傳達的信號傳達途徑。
所謂TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質表示TGFβ家族信號傳達途徑，即表示阻斷藉由Smad家族所傳達的信號傳達途徑之物質，具體有TGFβ信號傳達途徑阻礙物質、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質及BMP信號傳達途徑阻礙物質可舉出。
作為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質，若為阻礙因TGFβ所造成的信號傳達途徑的物質即可，並無特別限定，可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物中任一種。作 為該物質，例如於TGFβ直接作用之物質(例如蛋白質、抗體、適配體等)、抑制編碼TGFβ的基因之表現的物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、阻礙TGFβ受體與TGFβ之結合的物質、阻礙藉由TGFβ受體的信號傳達所引起的生理活性之物質(例如TGFβ受體之阻礙劑、Smad之阻礙劑等)可舉出。作為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質已知的蛋白質，可舉出Lefty等。作為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質，可使用斯業者熟知的化合物，具體可舉出SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等。其中，SB431542(4-(5-苯甲醯基[1，3]二氧雜環戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲醯胺)及A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代羧醯胺)為作為TGFβ受體(ALK5)及Activin受體(ALK4/7)的阻礙劑(即TGFβR阻礙劑)為公知化合物。TGFβ信號傳達途徑阻礙物質較佳為SB431542或A-83-01。
作為Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質，僅為阻礙Nodal或Activin引起的信號傳達途徑之物質即可，並無特別限定，可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物中任一種。作為該物質例如對Nodal或者Activin起直接作用的物質(例如抗體、適配體等)、抑制編碼Nodal或者Activin之基因的表現的物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、阻礙Nodal/Activin受體與Nodal/Activin的結合之物質、阻礙藉由Nodal/Activin受體之信號傳達所引起的生理活性之物質可舉出。作為Nodal/Activin信號傳 達途徑阻礙物質，可使用斯業者所周知之化合物，具體可舉出SB431542、A-83-01等。又可使用作為Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質已知的蛋白質(Lefty、Cerberus等)。Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質較佳為SB431542、A-83-01或Lefty。
作為BMP信號傳達途徑阻礙物質，若為阻礙BMP所引起的信號傳達途徑之物質即可，並無特別限定，可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物中任一種。其中作為BMP，可舉出BMP2、BMP4、BMP7及GDF7。作為該物質例如有對BMP直接作用之物質(例如抗體、適配體等)、抑制編碼BMP之基因的表現之物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、阻礙BMP受體(BMPR)與BMP的結合之物質、阻礙藉由BMP受體之信號傳達所引起的生理活性的物質可舉出。作為BMPR，有ALK2或ALK3可舉出。作為BMP信號傳達途徑阻礙物質，可使用斯業者所熟知的化合物，具體可舉出LDN193189、Dorsomorphin等。其中LDN193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑並[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)為公知之BMPR(ALK2/3)阻礙劑(以下BMPR阻礙劑)，通常以鹽酸鹽之形態被市售。又，可使用作為BMP信號傳達途徑阻礙物質已知蛋白質(Chordin、Noggin等)。BMP信號傳達途徑阻礙物質較佳為LDN193189。
TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質較佳為Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。
可使用組合作用點相異的複數種類之TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質亦佳。藉由組合，期待提高凝集體的品質的效果會被增強。例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質與BMP信號傳達途徑阻礙物質之組合，TGFβ信號傳達途徑阻礙物質與Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質之組合、BMP信號傳達途徑阻礙物質與Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質之組合可舉出，但較佳為使用TGFβ信號傳達途徑阻礙物質為與BMP信號傳達途徑阻礙物質之組合。作為具體較佳組合，可舉出SB431542與LDN193189之組合。
所謂音蝟因子信號(以下記載為Shh)傳達途徑作用物質為增強藉由Shh經媒介的信號傳達而得之物質。作為Shh信號傳達途徑作用物質，例如可舉出屬於Hedgehog家族之蛋白質(例如Shh或Ihh)、Shh受體、Shh受體激動劑、PMA(嘌嗎啡胺；9-環己基-N-[4-(4-嗎啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)、或SAG(Smoothened Agonist；N-甲基-N'-(3-吡啶基苯甲基)-N'-(3-氯苯並[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二胺基環己烷)等。Shh信號傳達途徑作用物質較佳為Shh蛋白質(Genbank登錄號碼：NM_000193、NP_000184)、SAG或PMA。
可組合TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質與Shh信號傳達途徑作用物質後使用。藉由組合，可期待增強提高凝集體的品質的效果。作為具體之組合，例如可舉出選自由Lefty、SB431542、A-83-01及LDN193189所成 群的任一TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質與選自由Shh蛋白質、SAG及PMA所成群的任一Shh信號傳達途徑作用物質之組合。使用組合TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質與Shh信號傳達途徑作用物質時，可以含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質與Shh信號傳達途徑作用物質雙方的培養基中培養細胞，或以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質中任一方進行細胞處理後，亦可藉由任一方或雙方繼續對細胞進行處理。
TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及音蝟因子信號傳達途徑作用物質的濃度可適宜地設定在可達成上述效果的範圍。例如，SB431542通常為0.1~200μM，較佳為2~50μM之濃度下使用。A-83-01通常為0.05~50μM，較佳為0.5~5μM之濃度下使用。LDN193189通常為1~2000nM，較佳為10~300nM的濃度下使用。Lefty通常為5~200ng/ml，較佳為10~50ng/ml的濃度下使用。Shh蛋白質通常為20~1000ng/ml，較佳為50~300ng/ml的濃度下使用。SAG通常為1~2000nM，較佳為10~700nM，較佳為30~600nM的濃度下使用。PMA通常為0.002~20μM，較佳為0.02~2μM的濃度下使用。對於一態樣，TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質為可以具有與前述濃度SB43154同等之TGFβ家族信號傳達途徑阻礙活性的量下適宜地使用。又，對一態樣，音蝟因子信號傳達途徑作用物質可以具有與前述濃度SAG同等之Shh信號傳達促進活性的量下適宜地使用。
且，SB431542或LDN193189等TGFβ家族信號傳達途徑阻礙活性可由斯業者所熟知的方法，例如將Smad的磷酸化以免疫印跡法進行檢測而決定(Mol Cancer Ther.(2004)3,737-45.)。SAG等音蝟因子信號傳達促進活性可藉由斯業者所熟知的方法，例如可藉由Gli1基因之表現顯著的報告基因分析而決定(Oncogene(2007)26,5163-5168)。
對於步驟(1)所使用的培養基為血清培養基，亦可為無血清培養基，但由迴避混入化學性未決定成分的觀點來看，較佳為無血清培養基。
步驟(1)中所使用的培養基由迴避混入化學性未決定成分的觀點來看，含有成分可為由化學性設定的培養基。
步驟(1)中之多能性幹細胞的培養可在浮游培養及接著培養中任一條件下進行，較佳為藉由接著培養進行。
對於步驟(1)中之無飼養條件下的多能性幹細胞之培養，作為培養基可使用前述無飼養培養基。作為無飼養培養基，可舉出Essential 8、S-medium、StemPro、hESF9、mTeSR1、mTeSR2、TeSR-E8、或StemFit等，較佳為可使用Essential8或StemFit。
對於在步驟(1)中之無飼養條件的多能性幹細胞之培養，欲將取代為飼養細胞之足場提供於多能性幹細胞，可將適切基質作為足場使用。藉由足場之基質，在塗 布表面之細胞容器中，將多能性幹細胞進行接著培養。
作為可作為足場使用的基質，可舉出層黏連蛋白(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))、層黏連蛋白片段(Nat Commun 3,1236(2012))、基底膜標品(Nat Biotechnol 19,971-974(2001))、明膠、膠原、肝素硫酸蛋白多醣、巢蛋白、玻璃黏連蛋白(Vitronectin)等。
所謂「層黏連蛋白」為，由α、β、γ鏈所成的異三聚體分子，子單元鏈的組成為相異異構體存在的細胞外基質蛋白。具體而言，層黏連蛋白唯有5種α鏈、4種β鏈及3種γ鏈之異三聚體的組合約15種類之異構體。組合α鏈(α1~α5)、β鏈(β1~β4)及γ鏈(γ1~γ3)的各數字，定義層黏連蛋白之名稱。例如將藉由α5鏈、β1鏈、γ1鏈之組合的層黏連蛋白稱為層黏連蛋白511。對於本發明，較佳為使用層黏連蛋白511(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))。
在本發明所使用的層黏連蛋白通常為哺乳動物之層黏連蛋白。作為哺乳動物，有上述者可舉出。由達成無異物條件(Xeno-free)之觀點來看，較佳為使用與培養細胞為同一種的哺乳動物之層黏連蛋白。例如於人類多能性幹細胞之培養中使用人類層黏連蛋白(較佳為人類層黏連蛋白511)。
在本發明所使用的層黏連蛋白片段具有對多能性幹細胞之接著性，若為可在無飼養條件之能性幹細胞的維持培養者即可，並無特別限定，較佳為E8片段。層 黏連蛋白E8片段為在將層黏連蛋白511以彈性蛋白酶進行消化所得之片段中，鑑定為具有強細胞接著活性之片段者(EMBO J.,3：1463-1468,1984、J.Cell Biol.,105：589-598,1987)。對於本發明，較佳為使用層黏連蛋白511的E8片段(Nat Commun 3,1236(2012)、Scientific Reports 4,3549(2014))。使用於本發明的層黏連蛋白E8片段並非必須為層黏連蛋白的彈性蛋白酶消化產物，亦可為重組體。由迴避混入未鑑定成分之觀點來看，對於本發明，較佳為使用重組體的層黏連蛋白片段。層黏連蛋白511的E8片段已被市售，例如可由Nippi股份有限公司等購入。
本發明中所使用的層黏連蛋白或層黏連蛋白片段較佳為經分離者。
所謂本發明中之「基底膜標品」表示在於該上播種具有基底膜形成能之所望細胞並培養時，含有具有控制上皮細胞樣的細胞形態、分化、增殖、運動、功能表現等功能之基底膜構成成分。例如分散由本發明所製造的神經系細胞．神經組織，進一步進行接著培養時，可在基底膜標品存在下進行培養。其中，所謂「基底膜構成成分」為，對於動物之組織，作為於上皮細胞層與間質細胞層等之間所存在的薄膜狀之細胞外基質分子。基底膜標品，例如可介在基底膜於支持體上接著的具有基底膜形成能之細胞，可使用具有該細胞之脂質溶解能的溶液或鹼溶液等自支持體除去而製作。作為基底膜標品，可舉出含有作為基底膜調製物之市售的商品(例如MatrigelTM(康寧公 司製：以下亦稱為基底膜))或GeltrexTM(Life Technologies公司製)、作為基底膜成分之公知細胞外基質分子(例如層黏連蛋白、IV型膠原、肝素硫酸蛋白多醣、巢蛋白等)者。
MatrigelTM為自Engelbreth Holm Swarn(EHS)老鼠肉瘤所萃取的基底膜調製物。MatrigelTM的主成分為IV型膠原、層黏連蛋白、肝素硫酸蛋白多醣及巢蛋白，除這些以外，含有TGFβ、FGF、組織纖溶酶原活性化因子及EHS腫瘤為天然產生的增殖因子。MatrigelTM的「growth factor reduced製品」通常比MatrigelTM之增殖因子濃度更低，該標準濃度中，EGF為<0.5ng/ml，NGF為<0.2ng/ml，PDGF為<5pg/ml，IGF1為5ng/ml，TGFβ為1.7ng/ml。
由迴避混入未鑑定成分的觀點來看，對於本發明，較佳為使用經分離的層黏連蛋白或層黏連蛋白片段。
較佳為，對於在步驟(1)中之無飼養條件的多能性幹細胞之培養，藉由經分離的層黏連蛋白511或層黏連蛋白511之E8片段(更佳為層黏連蛋白511的E8片段)，在塗布表面之細胞容器中，將多能性幹細胞進行接著培養。
步驟(1)中之多能性幹細胞的培養時間若為對於步驟(2)，提高所形成的凝集體之品質的效果可達成之範圍即可，並無特別限定，通常為0.5~144小時。步驟(1) 中之多能性幹細胞的培養時間，較佳為1小時以上、2小時以上、6小時以上、12小時以上、18小時以上、或24小時以上。步驟(1)中之多能性幹細胞的培養時間較佳為96小時以內、或72小時以內。對於一態樣，步驟(1)中之多能性幹細胞的培養時間之範圍，較佳為2~96小時，較佳為6~48小時，更佳為12~48小時，特佳為18~28小時(例如24小時)。即，於步驟(2)開始之0.5~144小時(較佳為18~28小時)前開始第一步驟，結束步驟(1)後繼續進行步驟(2)。對於進一步態樣，步驟(1)中之多能性幹細胞的培養時間之範圍，較佳為18~144小時、24~144小時、24~96小時、或24~72小時。以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質中任一方對細胞進行處理後，以另一方繼續進行細胞處理時，各處理時間可在上述培養時間之範圍內。
步驟(1)中之培養溫度、CO2濃度等的培養條件可適宜地設定。培養溫度例如約30℃至約40℃，較佳為約37℃。又，CO2濃度，例如約1%至約10%，較佳為約5%。
對於較佳一態樣，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有bFGF的無血清培養基中進行接著培養。該接著培養，較佳為將層黏連蛋白511、層黏連蛋白511之E8片段或玻璃黏連蛋白塗布表面的細胞容器中實施。該接著培養，較佳為作為無飼養培養基，使用Essential 8、TeSR培養基、mTeSR培養 基、mTeSR-E8培養基、或StemFit培養基，更佳為使用Essential 8或StemFit培養基而實施。
對於較佳一態樣，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有bFGF之無血清培養基中進行浮游培養。在該浮游培養，人類多能性幹細胞可形成人類多能性幹細胞之凝集體。
對於較佳態樣，由步驟(1)所得之細胞為維持多能性樣性質(pluripotent-like state)之細胞，經過步驟(1)維持多能性樣性質。所謂多能性樣性質為，含有多能性且維持於多能性幹細胞共通的多能性幹細胞所具有的特有形質之至少一部份之狀態。多能性樣性質並未要求其嚴密多能性。具體為表現成為多能性性質(pluripotent state)之指標的標示物之全部或一部分的狀態含於「多能性樣性質」。作為多能性樣性質之標示物，可舉出Oct3/4陽性、鹼性磷酸酶陽性等。對於一態樣，維持多能性樣性質之細胞為Oct3/4陽性。Nanog的表現量與ES細胞或者iPS細胞相比為較低時，亦相當於「顯示多能性樣性質之細胞」。
對於一態樣，由步驟(1)所得之細胞為，具有至少分化為神經系細胞或神經組織(較佳為網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞)的能力之幹細胞。對於一態樣，由步驟(1)所得之細胞具有至少分化神經系細胞或神經組織(較佳為網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞)的能力之 Oct3/4陽性的幹細胞。
對於較佳態樣，將人類多能性幹細胞(例如iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及bFGF之無血清培養基中進行接著培養。
上述該接著培養，較佳為在以層黏連蛋白511或層黏連蛋白511之E8片段塗布表面之細胞容器中實施。TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，較佳為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01、Lefty)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01)、BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189、Chordin、Noggin)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)。TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，更佳為Lefty、SB431542、A-83-01、或LDN193189、或該組合(例如SB431542及LDN193189)。音蝟因子信號傳達途徑作用物質，較佳為Shh蛋白質、SAG或嘌嗎啡胺(PMA)，較佳為SAG。亦可使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)與音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)之組合。培養時間為0.5~144小時(較佳為18~144小時、24~144小時、24~96小時、或24~72小時(例如18~28小時))。
步驟(1)為例如將多能性幹細胞在飼養細胞不存在下，在含有未分化維持因子之培養基中進行維持培 養，對該培養中添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質，繼續培養而實施。
例如將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞不存在下，在含有bFGF的無血清培養基中進行維持培養。該維持培養，較佳為藉由接著培養進行。該接著培養，較佳為以玻璃黏連蛋白、層黏連蛋白511或層黏連蛋白511的E8片段塗布表面之細胞容器中實施。而對該培養中添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質，繼續培養。TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，較佳為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01、Lefty)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01、Lefty)、BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)。TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，更佳為Lefty、SB431542、A-83-01、或LDN193189、或該組合(例如SB431542及LDN193189)。音蝟因子信號傳達途徑作用物質，較佳為Shh蛋白質、SAG或PMA。可組合TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)與音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)後使用。添加後繼續0.5~144小時(較佳為18~144小時、24~144小時、24~96小時、或24~72小時(例如18~28小時))培養。
對於將以步驟(1)所得之細胞在培養基中進行 浮游培養後形成細胞之凝集體的步驟(2)做說明。
步驟(2)中所使用的培養基僅為上述定義項所記載者即可並無特別限定。對於步驟(2)所使用的培養基為含有血清之培養基或無血清培養基。由迴避混入化學性未決定成分的觀點來看，對於本發明，可適用無血清培養基。例如可使用未添加BMP信號傳達途徑作用物質及Wnt信號傳達途徑阻礙物質中任一種的無血清培養基。欲迴避調製之繁雜性，例如使用適量添加市售KSR等血清代替物的無血清培養基(例如IMDM與F-12之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate的培養基、或於GMEM添加5%~20%KSR、NEAA、丙酮酸、2-巰基乙醇之培養基)為佳。作為對於無血清培養基之KSR的添加量，例如以人類多能性幹細胞時，通常為約1%至約30%，較佳為約2%至約20%。
於形成凝集體時，首先藉由以步驟(1)所得之細胞的分散操作，調製出經分散的細胞。所謂藉由分散操作所得之「經分散的細胞」表示，例如7成以上為單一細胞，2~50細胞的塊為3成以下之存在狀態。作為經分散的細胞，較佳為8成以上為單一細胞，2~50細胞的塊為2成以下之存在狀態。所謂經分散的細胞可舉出細胞彼此幾乎成無接著(例如面接著)之狀態。對於一部分態樣，所謂經分散的細胞，可舉出細胞-細胞間結合(例如接著結合)幾乎消失之狀態
在步驟(1)所得之細胞的分散操作如前述，可含有機械性分散處理、細胞分散液處理、細胞保護劑處理。亦可組合這些處理實施。較佳為與細胞保護劑處理同時進行細胞分散液處理，再進行機械性分散處理。
作為使用於細胞保護劑處理的細胞保護劑，有FGF信號傳達途徑作用物質、肝素、IGF信號傳達途徑作用物質、血清、或血清代替物可舉出。又，作為使用於抑制經分散所誘導的多能性幹細胞(特別為人類多能性幹細胞)之細胞死的細胞保護劑，可添加Rho-associated coiled-coil激酶(ROCK)的阻礙劑或Myosin的阻礙劑。使用於抑制藉由分散所誘導的多能性幹細胞(特別為人類多能性幹細胞)之細胞死，並保護細胞時，可將Rho-associated coiled-coil激酶(ROCK)的阻礙劑或Myosin的阻礙劑自第二步驟培養開始時添加。作為ROCK阻礙劑，有Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等可舉出。作為Myosin的阻礙劑有Blebbistatin可舉出。
作為使用於細胞分散液處理的細胞分散液，有含有胰蛋白酶、膠原酶、透明質酸酶、彈性蛋白酶、鏈黴蛋白酶、DNase或木瓜蛋白酶等酵素類、或乙二胺四乙酸等螯合劑中任一者之溶液可舉出。市售的細胞分散液，例如可使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)或TrypLE Express(Life Technologies公司製)。
作為機械性分散處理之方法，可舉出以移液處理或刮刀進行刮取的操作。
經分散的細胞為懸浮於上述培養基中。
而將經分散的細胞之懸浮液播種在上述培養器中，將經分散的細胞對於培養器，在非接著性的條件下進行培養，集合複數細胞形成凝集體。
此時，將經分散的細胞藉由播種於如10cm盤子之比較大的培養器中，於1個培養器中可同時形成複數細胞凝集塊，但若如此會產生各凝集塊的尺寸偏差。因此例如於96穴微平板的多片孔板(U底、V底)之各孔放入一定數經分散的幹細胞，將此進行靜置培養時，藉由細胞迅速凝集，於各孔形成1個凝集體。藉由將該凝集體自複數孔回收，可得到均勻凝集體之集團。
步驟(2)中之細胞的濃度可適宜地設定在可將細胞凝集體更均勻且有效率地形成。例如使用96穴微孔板，使人類細胞(例如對於步驟(1)，自人類iPS細胞得到細胞)浮游培養時，將如每1孔約1 x 103至約1 x 105細胞，較佳為約3 x 103至約5 x 104細胞，較佳為約4 x 103至約2 x 104細胞，更佳為、約4 x 103至約1.6 x 104細胞，特佳為約8 x 103至約1.2 x 104細胞而調製的液添加於孔中，靜置平板後形成凝集體。
步驟(2)中之培養溫度、CO2濃度等的培養條件可適宜地設定。培養溫度例如約30℃至約40℃，較佳為約37℃。CO2濃度例如約1%至約10%，較佳為約5%。
對於步驟(2)，進行培養基交換操作時，例如為捨去原來培養基，但加入新培養基的操作(培養基添加 操作)、將原來培養基捨去半量程度(原來培養基的體積量之30~90%程度，例如40~60%程度)，加入新培養基半量程度(原來培養基的體積量之30~90%、例如40~60%程度)之操作(半量培養基交換操作)、將原來培養基捨去全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)後加入新培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)之操作(全量培養基交換操作)可舉出。
有時添加特定的成分(例如誘導分化因子)時，例如計算最終濃度時，將原來培養基捨去半量程度，使特定成分比最終濃度高，具體為最終濃度的1.5~3倍，例如可進行含有最終濃度的約2倍之濃度的新培養基以半量程加入的操作(半量培養基交換操作、半量培養基交換)。
有時維持含於原來培養基的特定的成分之濃度時，例如可進行捨去原來培養基半量程度，將含有與原來培養基所含濃度相同濃度的特定成分之新培養基以半量程度加入的操作。
有時稀釋原來培養基所含的成分，使濃度降低時，例如將培養基交換操作於1天進行複數次，較佳為可在1小時以內進行複數次(例如2~3次)。又，有時稀釋原來培養基所含的成分而降低濃度時，將細胞或凝集體移至其他培養容器。
使用於培養基交換操作的道具並無特別限定，例如可舉出移液器、微管、多通道微管、連續分注器等。例如作為培養容器，使用96孔板時，亦可使用多通 道微管。
欲形成細胞凝集體時所必要的浮游培養時間，欲使細胞均勻地凝集，藉由所使用的細胞可適宜地決定，但欲形成均勻細胞凝集體盡可能短時間為佳。經分散的細胞至形成細胞凝集體為止步驟可分為集合細胞之步驟、及集合之細胞形成細胞凝集體之步驟。播種經分散的細胞的時間點(即浮游培養開始時)至細胞集合為止，例如在人類細胞(例如於步驟(1)中由人類iPS細胞得到幹細胞)時，較佳為約24小時以內，較佳為約12小時以內形成經集合之細胞。播種經分散的細胞之時間點(即浮游培養開始時)至形成細胞凝集體為止的時間，例如在人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)時，較佳為約72小時以內，較佳為約48小時以內。形成該凝集體之時間可藉由凝集細胞所使用的工具或調整離心分離條件等做適宜調節。
形成細胞的凝集體及其均勻性可依據凝集體的尺寸及藉由細胞數、肉眼形態、組織染色解析之微觀形態及其均勻性、分化及未分化標示物之表現及其均勻性、分化標示物之表現控制及其同期性、分化效率之凝集體間的再現性等做判斷。
形成凝集體後，可可直接繼續凝集體的培養。步驟(2)中之浮游培養的時間通常為12小時~6天，較佳為12小時~48小時程度。
對於一態樣，於步驟(2)所使用的培養基含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質。對於步驟(1)，將多能 性幹細胞以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質進行處理，對於第二步驟，將以第一步驟所得之細胞，藉由在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質之培養基(較佳為無血清培養基)中進行浮游培養後使形成凝集體，可高效率地形成凝集體的品質可更提高，圓形、表面光滑且形狀不會崩壞，凝集體的內部為緊密之維持未分化性的細胞凝集體。
作為音蝟因子信號傳達途徑作用物質，可使用上述者。較佳為音蝟因子信號傳達途徑作用物質為SAG、嘌嗎啡胺(PMA)或Shh蛋白質。培養基中的音蝟因子信號傳達途徑作用物質之濃度可適宜地設定在可達成上述效果之範圍。SAG通常為1~2000nM，較佳為10nM~1000nM，較佳為10nM~700nM，更佳為50nM~700nM，更佳為100nM~600nM，更佳為100nM~500nM的濃度下使用。PMA通常為0.002~20μM，較佳為0.02~2μM的濃度下使用。Shh蛋白質通常為20~1000ng/ml，較佳為50~300ng/ml的濃度下使用。使用SAG、PMA、Shh蛋白質以外的音蝟因子信號傳達途徑作用物質時，以顯示與上述SAG之濃度同等之音蝟因子信號傳達促進活性的濃度下使用為佳。
添加音蝟因子信號傳達途徑作用物質於培養基的時間點可達成上述效果之範圍下即可並無特別限定，但越快效果越高。音蝟因子信號傳達途徑作用物質自步驟(2)開始，通常6天以內，較佳為3天以內，較佳為1天 以內，更佳為步驟(2)開始時添加於培養基。
對於較佳態樣，對於步驟(2)，將在步驟(1)所得之人類細胞(例如藉由步驟(1)由人類iPS細胞所得之細胞)在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)之無血清培養基中進行浮游培養形成凝集體。音蝟因子信號傳達途徑作用物質，較佳為自浮游培養開始時即含於培養基中。於培養基亦可添加ROCK阻礙劑(例如Y-27632)。培養時間為12小時~6天，較佳為12小時~48小時。所形成的凝集體較佳為均勻凝集體。
例如回收在步驟(1)所得之人類細胞(例如藉由步驟(1)由人類iPS細胞所得之細胞)，於含有因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)的無血清培養基中進行分散、進行浮游培養至單一細胞、或接近此狀態。該無血清培養基亦可含有ROCK阻礙物質(例如Y-27632)。將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)的懸浮液播種在上述培養器中，將經分散的多能性幹細胞對於培養器，在非接著性之條件下進行培養後，形成集合複數多能性幹細胞的凝集體。培養時間為12小時~6天，較佳為12小時~48小時。所形成的凝集體較佳為均勻凝集體。
對於較佳一態樣，對於步驟(1)，將多能性幹細胞以TGFβ信號傳達途徑阻礙物質處理，且對於步驟(2)，在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)的培養基中實施由步驟(1)所得之細胞的浮游培養。於此作為較佳TGFβ信號傳達途徑阻礙物 質，可使用SB431542或A-83-01。
又，對於較佳一態樣，對於步驟(1)，將多能性幹細胞以BMP信號傳達途徑阻礙物質處理，且對於步驟(2)，在未含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)之培養基實施由步驟(1)所得之細胞的浮游培養。於此作為較佳BMP信號傳達途徑阻礙物質，可使用LDN193189。
對於較佳一態樣，對於步驟(1)，將多能性幹細胞(例如人類多能性幹細胞)以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01)、BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)等)；音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)；或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)與音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)的組合進行處理，且對於步驟(2)，在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)的培養基實施由步驟(1)所得之細胞的浮游培養。
對於其他態樣，對於步驟(1)，將多能性幹細胞(例如人類多能性幹細胞)以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物 質(例如Lefty、SB431542、A-83-01)、BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)等)；音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)；或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)與音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)之組合進行處理，且對於步驟(2)，以未含音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)的培養基實施由步驟(1)所得之細胞的浮游培養。
對於任何態樣，步驟(2)之培養基，較佳為含有ROCK阻礙物質(例如Y-27632)。
如此，藉由實施步驟(2)，形成由步驟(1)所得之細胞、或來自此的細胞的凝集體。本發明亦提供如此凝集體的製造方法。在步驟(2)所得之凝集體對於步驟(1)，比未以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質進行處理之情況，具有高品質。具體為可得到圓形、表面為光滑且凝集體的內部為緊密、形狀沒有崩壞的凝集體的比例為高之凝集體的集團。對於一態樣，自第二步驟開始第6天以無作為方式選出凝集體(例如100個以上)時，未崩壞的凝集體之比例及/或未嚢胞化的凝集體之比例和例如70%以上，較佳為80%以上。
由步驟(2)所得之凝集體具有分化為種種分化細胞或對分化組織之能力。對於一態樣，由步驟(2)所得之凝集體具有分化為神經系細胞或神經組織(較佳為網膜 組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞)之能力。
對於一態樣，藉由將在步驟(1)所得之具有分化為至少神經系細胞或神經組織(較佳為網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞)的能力之幹細胞(較佳為具有分化為至少神經系細胞或神經組織(較佳為網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞)的能力之Oct3/4陽性幹細胞)使用於步驟(2)，可得到含有具有分化至少神經系細胞或神經組織(較佳為網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞)的能力之幹細胞(較佳為Oct3/4陽性幹細胞)的凝集體。在步驟(2)所得之凝集體為藉由將該凝集體在適切分化條件下進行培養時，可高效率下誘導出種種分化細胞或分化組織。
對於一態樣，於在步驟(2)所得之凝集體中含有，在步驟(1)終了時所得之保持多能性樣性質的細胞(具體為表現Oct3/4)、與相當於神經系細胞或神經組織之間的中間段階細胞之細胞。該細胞為表示多能性性質標示物Oct3/4、外胚葉標示物(Sox1、Sox2、N-cadherin、TP63)、神經外胚葉標示物(Sox1、Sox2、Nestin、N-cadherin、Otx2)、前述神經系細胞標示物中任一種。即，對於一態樣，在步驟(2)所得之凝集體中，含有表示多能性性質標示物Oct3/4、外胚葉標示物(Sox1、Sox2、N-cadherin、TP63)、神經外胚葉標示物(Sox1、Sox2、 Nestin、N-cadherin、Otx2)、前述神經系細胞標示物中任一的細胞混合物。即，在步驟(2)所得之凝集體含有具有分化至少神經系細胞或神經組織的能力之幹細胞、及/或神經系細胞或神經組織的前驅細胞。該前驅細胞在公知適切培養條件下進行培養，即具有可表現前述神經系細胞標示物之能力(competence)為特徵。因此，對於一態樣，在步驟(2)所得之凝集體中，含有Oct3/4陽性的具有分化至少神經系細胞或神經組織的能力之幹細胞、及/或神經系細胞或神經組織的前驅細胞。於在步驟(2)所得之凝集體中所含的細胞一部份亦可表現上述神經組織標示物。對於一態樣，在步驟(2)所得之凝集體中，全細胞中的Oct3/4陽性之比例為50%以上，例如可含有70%以上。
對於步驟(2)，進行培養基交換操作時，例如不捨去原來培養基而添加新培養基之操作(培養基添加操作)、捨去原來培養基半量程度(原來培養基的體積量之30~90%程度、例如40~60%程度)添加新培養基半量程度(原來培養基的體積量之30~90%程度、例如40~60%程度)之操作(半量培養基交換操作)、捨去原來培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)添加新培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)之操作(全量培養基交換操作)可舉出。
在某時點添加特定成分(例如誘導分化因子)時，例如可進行將最終濃度在計算上，捨去原來培養基半量程度，加入含有比最終濃度高的濃度(具體為最終濃度 的1.5倍~3.0倍，例如最終濃度的約2倍之濃度)的特定成分之新培養基半量程度之操作(半量培養基交換操作、半量培養基交換)。
有時維持含於原來培養基之特定成分濃度時，例如亦可進行捨去原來培養基半量程度，加入含有與原來培養基所含的濃度相同濃度之特定的成分的新培養基半量程度的操作。
有時稀釋含於原來培養基的成分而使濃度降低時，例如可將培養基交換操作在1天進行複數次，較佳為1小時以內進行複數次(例如2~3次)。又，有時原來培養基所含的成分經稀釋使濃度降低時，可將細胞或凝集體移至其他培養容器。
使用於培養基交換操作的道具並無特別限定，例如可舉出移液器、微管、多通道微管、連續分注器等。例如作為培養容器，使用96孔板時可使用多通道微管。
對於自在步驟(2)所得之凝集體誘導出含有神經系細胞或者神經組織之凝集體的步驟(3)進行說明。
作為藉由將多能性幹細胞的凝集體進行浮游培養，誘導為神經系細胞或神經組織之方法，已有多數方法被報告。例如已知有WO 2005/123902、WO2009/148170、WO2008/035110、WO2011/055855、Cell Stem Cell,3,519-32(2008)、Nature,472,51-56(2011)、Cell Stem Cell,10(6),771-775(2012)、Nature Biotechnology,27(3),275-80(2009)、Proc Natl Acad Sci USA,110(50),20284-9(2013)等記載的方法，但並未限定於此等。將如此種種神經系細胞或神經組織之誘導方法適用於在步驟(2)所得之凝集體，將在步驟(2)所得之凝集體在適切神經誘導分化條件下進行培養後，可製造含有神經系細胞或者神經組織之凝集體。
例如將在步驟(2)所得之凝集體於誘導分化因子的存在下或者非存在下(較佳為存在下)進行浮游培養，得到含有神經系細胞或者神經組織的凝集體。
所謂誘導分化因子為具有誘導細胞或者組織之分化的活性之因子，例如具有將幹細胞或前驅細胞往特定分化系譜進行分化(或者運命決定)的活性之因子。作為誘導分化因子，例如可舉出增殖因子等活體內基因產物、控制活體內基因產物作用的低分子化合物、荷爾蒙類、維他命等生理活性物質類等，並無特別限定。作為斯業者所汎用的誘導分化因子，例如可舉出BMP信號傳達作用物質、BMP信號傳達途徑阻礙物質、Shh信號傳達途徑作用物質、Shh信號傳達途徑阻礙物質、FGF信號傳達途徑作用物質、FGF信號傳達途徑阻礙物質、Wnt信號傳達途徑作用物質、及Wnt信號傳達途徑阻礙物質。藉由細胞的種類或分化狀態(分化能力、potential)，對誘導分化因子之應答相異，對於誘導分化過程，藉由誘導分化因子之濃度或添加時期亦使誘導分化因子的效果相異。又，已知藉由動物種產生同樣效果之誘導分化因子的至適濃度相異，例 如一般已知老鼠細胞與人類細胞中，人類細胞的至適濃度為高(特別為外胚葉、內胚葉)。自多能性幹細胞往特定細胞或者組織之誘導分化方法已有多數報告，可選擇適合目的之細胞或組織的誘導分化因子或誘導分化方法。
本發明所使用的誘導分化因子通常為哺乳動物之誘導分化因子。作為哺乳動物，可舉出上述者。誘導分化因子因在哺乳動物之種間具有交差反應性，故盡可能培養對象的多能性幹細胞之誘導分化使用任一哺乳動物的未分化維持因子為佳，較佳為使用與培養之細胞為同一種哺乳動物之誘導分化因子。
使用於本發明之誘導分化因子，較佳為經分離者。因此，對於一態樣，本發明含有提供經分離的誘導分化因子之步驟。又，對於一態樣，含有對於步驟(3)所使用的培養基中，將經分離的誘導分化因子經外因性添加之步驟。
對於一態樣，對於本發明之方法，作為誘導分化因子，使用神經誘導分化因子時，可製造含有神經系細胞或者神經組織的凝集體。
對於一態樣，於步驟(3)中所使用的培養基，例如有添加誘導分化因子的無血清培養基或血清培養基(較佳為無血清培養基)。於該培養基中，可添加或不用添加基底膜標品。作為基底膜標品，可使用上述者。添加基底膜標品時的濃度，例如使用Matrigel時，以體積濃度為0.1~10%，較佳為0.5%至2%。由迴避混入化學性未鑑定 物質的觀點來看，不添加基底膜標品。
使用於該培養基的無血清培養基或血清培養基僅為上述者即可無特別限定。欲迴避調製之煩雜，例如使用適量添加的市售KSR等血清代替物的無血清培養基(例如IMDM與F-12之1：1的混合液中添加10%KSR、450μM 1-一硫甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate的培養基、或於GMEM添加5%~20%KSR、NEAA、丙酮酸、2-巰基乙醇之培養基)為佳。作為對無血清培養基之KSR的添加量，例如人類ES細胞時通常為約1%至約20%，較佳為約2%至約20%。
在步驟(3)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)可直接使用在步驟(2)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)，亦可取代為新培養基(較佳為無血清培養基)。在步驟(2)所使用的未含有誘導分化因子的無血清培養基直接使用於步驟(3)時，僅將誘導分化因子添加於培養基中即可。
對於步驟(3)，進行培養基交換操作時，例如有未捨去原來培養基而加入新培養基的操作(培養基添加操作)、捨去原來培養基半量程度(原來培養基的體積量之40~80%程度)而加入新培養基半量程度(原來培養基的體積量之40~80%)的操作(半量培養基交換操作)、捨去原來培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)而加入新培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)之操作(全量培養基交換操作)可舉出。
在某時間點，添加特定的成分(例如誘導分化因子)時，例如將最終濃度在計算上，捨去原來培養基半量程度，加入含有特定的成分濃度為比最終濃度高之濃度(具體之最終濃度的1.5倍~3.0倍，例如最終濃度的約2倍之濃度)之新培養基半量程度的操作(半量培養基交換操作、半量培養基交換)。
有時維持含於原來培養基之特定成分的濃度時，例如可進行捨去原來培養基半量程度，加入含有與原來培養基所含濃度相同的濃度之特定成分的新培養基半量程度之操作。
有時稀釋含於原來培養基的成分而使濃度降低時，例如將培養基交換操作在1天進行複數次，較佳為1小時以內進行複數次(例如2~3次)。又，有時稀釋含於原來培養基之成分而使濃度降低時，可將細胞或凝集體移至其他培養容器。
使用於培養基交換操作的道具並無特別限定，例如可舉出移液器、微管、多通道微管、連續分注器等。例如作為培養容器使用96孔板時，亦可使用多通道微管。
誘導分化因子可在步驟(2)之浮游培養開始至約24小時後添加，浮游培養開始後數天以內(例如15天以內或18天以內)添加於培養基亦可。較佳為誘導分化因子的添加在浮游培養開始後第1天至第18天之間或第1天至第15天之間，較佳為第1天至第9天之間，更佳為 第3天至第8天之間或第2天至第9天之間，特佳為第3天至第6天之間添加培養基。
對於另一態樣，將誘導分化因子(例如Wnt信號傳達途徑阻礙物質或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質等)在與步驟(2)之浮游培養開始同時或約24小時以內添加。
誘導分化因子添加於培養基，往凝集體的神經系細胞的誘導分化開始後，無須將誘導分化因子添加於培養基，使用未含有誘導分化因子之無血清培養基或血清培養基進行培養基交換。對於一態樣，往凝集體的神經系細胞之誘導分化開始後，藉由未含有誘導分化因子之無血清培養基或血清培養基進培養基交換，將培養基中的誘導分化因子濃度為2~4天，40~60%減的比例下徐徐或段階式降低。
作為具體態樣，於浮游培養開始後(即前述步驟(2)的開始後)、0~第18天，較佳為於第1~9天，更佳為第2~8天，特佳為第3天或者第4天，將培養基的一部分或全部與含有誘導分化因子之培養基交換，在誘導分化因子存在下可進行1~100天程度培養。對此，必須使誘導分化因子之濃度維持在同一濃度，可將培養基的一部分或全部取代為含有誘導分化因子之培養基。或如前述，亦可將誘導分化因子之濃度以段階式減少。
往神經系細胞的誘導分化已開始的細胞例如可藉由檢測該細胞中之神經系標示物基因的表現而確認。 作為步驟(3)的實施態樣之一，將在步驟(2)所形成的凝集體至表現神經系標示物基因之細胞開始出現之間，在含有對神經誘導分化為必要的濃度之誘導分化因子的無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有神經系細胞之凝集體的步驟可舉出。
對於一態樣，作為誘導分化因子，使用BMP信號傳達途徑作用物質。即，將在第二步驟所得之凝集體在BMP信號傳達途徑作用物質之存在下進行浮游培養，得到含有神經系細胞或者神經組織的凝集體。
所謂BMP信號傳達途徑作用物質為可增強藉由BMP媒介的信號傳達途徑之物質。作為BMP信號傳達途徑作用物質，例如可舉出BMP2、BMP4或者BMP7等BMP蛋白、GDF7等GDF蛋白、抗BMP受體抗體、或BMP部分肽等。BMP2蛋白、BMP4蛋白及BMP7蛋白例如可由R&D Systems獲得，GDF7蛋白例如可由和光純藥獲得。
BMP信號傳達途徑作用物質之濃度僅為可誘導往多能性幹細胞、或來自此的幹細胞的凝集體之神經系細胞分化之濃度即可。例如人類BMP4之情況時，約0.01nM至約1μM，較佳為約0.1nM至約100nM，更佳為約1nM至約10nM，特佳為約1.5nM(55ng/mL)之濃度下添加於培養基。
對於一態樣，上述在未含有誘導分化因子之無血清培養基或血清培養基(較佳為無血清培養基)或上述 未含有未分化維持因子之無血清培養基或血清培養基(較佳為無血清培養基)中，即使藉由進行步驟(3)，亦可誘導往神經系細胞或神經組織之分化(自發分化)。例如在實質上未含(即，完全未含或即使含有但該濃度為生理活性表現濃度以下)BMP信號傳達途徑作用物質(例如BMP4)及音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA)之無血清培養基或血清培養基(較佳為無血清培養基)中，即使藉由將在步驟(2)所得之凝集體進行浮游培養，亦可得到含有神經系細胞或神經組織之凝集體。
該培養基僅為如上述者即可並無特別限定。欲迴避調製之煩雜，例如使用適量添加市售KSR等血清代替物的無血清培養基(例如於IMDM與F-12之1：1的混合液中添加10%KSR、450μM 1-一硫甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate之培養基)為佳。作為對無血清培養基之KSR的添加量，例如在人類ES細胞之情況為，通常為約1%至約20%，較佳為約2%至約20%。
在步驟(3)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)可直接使用步驟(2)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)，亦可取代為新培養基(較佳為無血清培養基)者。
步驟(3)中之培養溫度、CO2濃度等的培養條件可適宜地設定。培養溫度例如約30℃至約40℃，較佳為約37℃。又，CO2濃度例如約1%至約10%，較佳為約5%。
得到含有神經系細胞之凝集體，例如可藉由檢測表現神經系細胞之標示物的細胞是否含於凝集體中而確認。作為神經系細胞的標示物，雖有Nestin,TuJ1、PSA-NCAM等可舉出，但並未限定於此等。對於一態樣，含於凝集體之細胞的20%以上(較佳為30%以上、40%以上、50%以上、60%以上)表示選自由Nestin、TuJ1及PSA-NCAM所成群的任一神經系細胞標示物的狀態為止實施步驟(3)的培養。
所得之含有神經系細胞之凝集體，可直接作為毒性．藥效評估用試藥使用。將含有神經系細胞之凝集體經分散處理(例如胰蛋白酶/EDTA處理或木瓜蛋白酶處理)，將所得之細胞使用FACS或MACS進行選別後，可得到高純度神經系細胞。
對於一態樣，對於步驟(3)所得之含有神經系細胞之凝集體中，含有神經上皮結構，於該上皮結構中含有神經組織及/或神經系細胞。神經上皮結構以覆蓋凝集體的表面之方式存在，亦形成於一部份凝集體的內部。藉由使用由步驟(2)所得之凝集體，可高效率下誘導含有神經上皮結構之凝集體。神經上皮結構可作為神經系標示物基因(例如Nestin,TuJ1、PSA-NCAM)陽性的上皮結構而被特定。而可將該神經上皮結構作為神經組織獲得。對於一態樣，於凝集體中形成神經上皮結構為止，實施步驟(3)之培養。作為步驟(3)的實施態樣之一，將在步驟(2)所形成的凝集體，至開始出現神經上皮結構之間，在神經誘 導分化條件下(例如含有對於神經誘導分化為必要濃度的誘導分化因子之無血清培養基或血清培養基中)進行浮游培養，可得到含有神經上皮結構之凝集體的步驟可舉出。
對於一態樣，將在步驟(2)或者步驟(3)所得之凝集體經分散播種於細胞培養皿中，進行接著培養，亦可製造出神經系細胞或神經組織。或對於一態樣，可將在步驟(2)或者步驟(3)所得之凝集體經分散後將所得之經分散的細胞播種於細胞培養皿中進行接著培養，製造出神經系細胞或神經組織。又，作為培養基，可使用上述培養基，於培養基中可添加誘導分化因子。作為細胞培養皿，可使用上述接著培養用之盤子。細胞培養皿可藉由細胞接著因子等進行塗布(例如層黏連蛋白塗布)。製造神經系細胞或神經組織時，對於神經系細胞或神經組織標示物可藉由免疫染色來確認。
作為一態樣，將未含在步驟(2)或者步驟(3)之浮游培養的途中所得之神經系細胞的凝集體，播種於接著培養用盤子，一直到分化為神經系細胞為止可進行接著培養。使用於接著培養之培養基並無特別限定，可使用在上述步驟(3)所使用的培養基。
作為一態樣，將未含有在步驟(2)或者步驟(3)之接著培養的途中所得之神經系細胞的細胞，由接著培養用盤子剝落，播種於浮游培養用盤子，直到分化為神經系細胞為止可進行浮游培養。使用於浮游培養之培養基並無特別限定可使用在步驟(3)所使用的培養基。
存在於凝集體的表面之神經上皮結構，在顯微鏡下使用鑷子等，可自凝集體以物理方式切出。
藉由本發明之製造方法，自多能性幹細胞可高效率地得到神經上皮結構等神經組織。藉由本發明之製造方法所得之神經上皮結構中，因含有種種神經系細胞，故使用對各種神經系細胞之標示物的抗體，藉由FACS等，可分離各種神經細胞或其前驅細胞。
含有所得之神經上皮結構等神經組織的凝集體，可直接作為毒性．藥效評估用試藥使用。將含有神經上皮結構等神經組織的凝集體進行分散處理(例如胰蛋白酶/EDTA處理或木瓜蛋白酶處理)，將所得之細胞使用FACS或MACS進行選別後可得到高純度神經系細胞。
3.網膜組織的製造方法
本發明之製造方法2為含有下述步驟(1)~(3)之網膜組織的製造方法：(1)將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下，在含有1)TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基進行培養之第一步驟、(2)將以第一步驟所得之細胞進行浮游培養，形成細胞的凝集體之第二步驟、及(3)將在第二步驟所得之凝集體在BMP信號傳達途徑作用物質之存在下，進行浮游培養得到含有網膜組織之凝 集體的第三步驟。
本發明之製造方法2的步驟(1)可以與本發明之製造方法1之步驟(1)的同樣方式實施。
較佳為由步驟(1)所得之細胞為，含有具有分化至少網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞的能力之幹細胞。對於一態樣，藉由步驟(1)所得之細胞為，含有具有分化至少網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞的能力之Oct3/4陽性幹細胞。作為一態樣，藉由步驟(1)所得之細胞為含有Oct3/4陽性幹細胞60%以上，例如90%以上。
本發明之製造方法2的步驟(2)亦可以與本發明之製造方法1的步驟(2)之同樣方式實施。
製造方法2於步驟(2)所使用的培養基，較佳為含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質。對於步驟(1)，將多能性幹細胞以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質進行處理，對於步驟(2)，將在步驟(1)所得之細胞在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質之培養基(較佳為無血清培養基)中進行浮游培養使其形成凝集體後，凝集體的品質可進一步提高，提高分化為網膜組織之能力。藉由使用該品質高凝集體，可高效率地誘導含有網膜組織之凝集體。
作為音蝟因子信號傳達途徑作用物質，可使用上述者。較佳音蝟因子信號傳達途徑作用物質為Shh蛋白質、SAG或PMA。培養基中之音蝟因子信號傳達途徑 作用物質之濃度可在可達成上述效果之範圍內做適宜設定。SAG通常為1~2000nM，較佳為10nM~700nM，更佳為30~600nM的濃度下使用。PMA通常為0.002~20μM，較佳為0.02~2μM的濃度下使用。Shh蛋白質通常為20~1000ng/ml，較佳為50~300ng/ml的濃度下使用。使用Shh蛋白質、SAG、PMA以外的音蝟因子信號傳達途徑作用物質之情況時，使用與上述SAG之濃度為顯示同等音蝟因子信號傳達促進活性的濃度者為佳。
培養基中之音蝟因子信號傳達途徑作用物質之濃度可使步驟(2)之期間中變動。例如對於步驟(2)的開始時，將音蝟因子信號傳達途徑作用物質設定為上述範圍，以2~4天，在40~60%減少的比例下，徐徐或段階式地降低該濃度。
將音蝟因子信號傳達途徑作用物質添加於培養基之時間點，僅在可達成上述效果的範圍即可並無特別限定，越快效果越高。音蝟因子信號傳達途徑作用物質自步驟(2)開始，通常6天以內，較佳為3天以內，較佳為1天以內，更佳為步驟(2)開始時添加於培養基。
對於較佳態樣，將在步驟(1)所得之人類細胞(例如對於步驟(1)，自人類iPS細胞所得之細胞)，在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)的無血清培養基中進行浮游培養，形成凝集體。音蝟因子信號傳達途徑作用物質，較佳為自浮游培養開始時含於培養基中。於培養基可添加ROCK阻礙物質(例如 Y-27632)。培養時間為12小時~6天，較佳為12小時~48小時。所形成的凝集體，較佳為均勻凝集體。
例如回收在步驟(1)所得之人類細胞(例如對於步驟(1)由人類iPS細胞所得之細胞)，將此分散成單一細胞、或接近此狀態，在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA)的無血清培養基中進行浮游培養。該無血清培養基可含有ROCK阻礙劑(例如Y-27632)。將人類幹細胞(例如來自人類iPS細胞的幹細胞)之懸浮液播散於上述培養器中，將經分散的細胞對於培養器以非接著性條件下進行培養後，可形成集合複數細胞的凝集體。培養時間為12小時~6天(較佳為12小時~48小時)。所形成的凝集體，較佳為均勻凝集體。
如此，藉由實施步驟(2)，形成在步驟(1)所得之細胞、或來自此的細胞的凝集體。本發明亦提供如此凝集體的製造方法。在步驟(2)所得之凝集體，對於步驟(1)，比未經以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質進行處理之情況相比，具有更高品質。具體為可得到圓形、表面為光滑且凝集體的內部為緊密、形狀會崩壞的凝集體的比例高之凝集體的集團。對於一態樣，自第二步驟開始至第6天，以無作為方式選出凝集體(例如100個以上)時，未經嚢胞化的凝集體之比例例如為70%以上，較佳為80%以上。
在步驟(2)所得之凝集體具有分化為網膜組織之能力。在步驟(2)所得之凝集體為，將該凝集體在以下 步驟(3)之條件下進行培養時，可高效率下製造出含有網膜組織之凝集體。
對於一態樣，將在步驟(1)所得之具有分化為至少網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞的能力之幹細胞(較佳為具有分化為至少網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞的能力之Oct3/4陽性幹細胞)使用於步驟(2)時，可得到含有具有分化為至少網膜組織、網膜細胞、網膜前驅細胞、或網膜層專一性神經細胞的能力之幹細胞(例如Oct3/4陽性幹細胞)的凝集體。
對於將在步驟(2)所形成的凝集體在BMP信號傳達途徑作用物質之存在下進行浮游培養，得到含有網膜組織之凝集體的步驟(3)做說明。
於步驟(3)中所使用的培養基，例如為添加BMP信號傳達途徑作用物質的無血清培養基或血清培養基(較佳為無血清培養基)。
使用於該培養基的無血清培養基或血清培養基，僅為如上述者即可，並無特別限定。欲迴避調製之煩雜，例如可使用適量添加市售KSR等血清代替物的無血清培養基(例如IMDM與F-12的1：1之混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate之培養基)者為佳。作為對於無血清培養基之KSR的添加量，例如人類多能性幹細胞(例如iPS細胞)之情況為通常約1%至約20%，較佳為約2%至約 20%。
在步驟(3)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)可直接使用在步驟(2)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)，或可取代為新培養基(較佳為無血清培養基)。在步驟(2)所使用的未含有BMP信號傳達途徑物質的培養基可直接使用於步驟(3)時，僅將BMP信號傳達途徑作用物質添加於培養基中。
作為於步驟(3)所使用的BMP信號傳達途徑作用物質，例如可舉出BMP2、BMP4或者BMP7等BMP蛋白、GDF7等GDF蛋白、抗BMP受體抗體、或BMP部分肽等。BMP2蛋白、BMP4蛋白及BMP7蛋白，例如可由R&D Systems獲得，GDF7蛋白例如可由和光純藥獲得。作為BMP信號傳達途徑作用物質，較佳可舉出BMP4。
BMP信號傳達途徑作用物質之濃度，僅為可誘導往形成多能性幹細胞的凝集體之細胞的網膜細胞之分化的濃度即可。例如人類BMP4之情況時，添加於培養基中至約0.01nM至約1μM，較佳為約0.1nM至約100nM，更佳為約1nM至約10nM，特佳為約1.5nM(55ng/mL)之濃度。使用BMP4以外的BMP信號傳達途徑作用物質時，使用與上述BMP4之濃度同等之表現BMP信號傳達促進活性的濃度為佳。
培養基中的BMP信號傳達途徑作用物質之濃度可在步驟(3)之期間中使其變動。例如對於步驟(3)之開始時，將BMP信號傳達途徑作用物質設定在上述範圍， 在2~4天，以40~60%減少比例下，徐徐或段階式降低該濃度。
BMP信號傳達途徑作用物質可在步驟(2)之浮游培養開始至約24小時後添加，或於浮游培養開始後數天以內(例如15天以內)添加於培養基。較佳為BMP信號傳達途徑作用物質添加於培養基的時間為，浮游培養開始後第1天至第15天之間，較佳為第1天至第9天之間，更佳為第3天至第8天之間或第2天至第9天之間，特佳為第3天至第6天之間。
作為具體態樣，浮游培養開始後(即前述步驟(2)開始後)第1天~第9天，較佳為第2天~第8天，更佳為第3天或者第4天時，將培養基的一部分或全部由含有BMP4之培養基交換，調製出BMP4之最終濃度為約1~10nM，在BMP4之存在下，例如進行1~12天，較佳為2~9天，更佳為2~5天之培養。對於此，必須將BMP4之濃度維持在同一濃度，進行1次或者2次程度之培養基的一部分或全部由含有BMP4之培養基交換。或如前述，可將BMP4之濃度以段階式減少。
BMP信號傳達途徑作用物質添加於培養基中，開始往形成凝集體之細胞的網膜細胞之誘導分化後，無須將BMP信號傳達途徑作用物質添加於培養基，可使用未含有BMP信號傳達途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基進行培養基交換。對於一態樣，開始往網膜細胞的誘導分化後，藉由未含BMP信號傳達途徑作用物質 之無血清培養基或血清培養基的培養基交換，將培養基中之BMP信號傳達途徑作用物質濃度在2~4天，以40~60%減少比例下，徐徐或段階式降低。對網膜細胞的誘導分化開始的細胞為，例如可藉由檢測該細胞中之網膜前驅細胞標示物基因(例如Rx基因(別名Rax)、Pax6基因、Chx10基因)的表現而確認。將使用GFP等螢光報導基因基因對Rx基因座敲入的多能性幹細胞，藉由步驟(2)所形成的凝集體，在對網膜細胞的誘導分化為必要的濃度之BMP信號傳達途徑作用物質的存在下進行浮游培養，藉由檢測自所表現的螢光報導基因所發出螢光，可確認對網膜細胞之誘導分化之開始時期。作為步驟(3)的實施態樣之一，將在步驟(2)所形成的凝集體，至表現網膜前驅細胞標示物基因(例如Rx基因、Pax6基因、Chx10基因)的細胞開始出現之間，在含有對網膜細胞之誘導分化為必要的濃度之BMP信號傳達途徑作用物質的無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有網膜前驅細胞之凝集體的步驟可舉出。
對於步驟(3)，進行培養基交換操作時，例如可舉出未捨去原來培養基而加入新培養基的操作(培養基添加操作)、捨去原來培養基半量程度(原來培養基的體積量之40~80%程度)加入新培養基半量程度(原來培養基的體積量之40~80%)之操作(半量培養基交換操作)、捨去原來培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)加入新培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)之操 作(全量培養基交換操作)。
在某時點添加特定成分(例如BMP4)時，例如計算最終濃度下，進行捨去原來培養基半量程度，加入含有比最終濃度高的濃度之特定成分(具體為最終濃度的1.5~3.0倍，例如最終濃度的約2倍之濃度)的新培養基半量程度之操作(半量培養基交換操作、半量培養基交換)。
有時維持含於原來培養基的特定成分之濃度時，例如可進行捨去原來培養基半量程度，加入含有與原來培養基所含濃度相同的濃度之特定成分的新培養基半量程度之操作。
有時稀釋含於原來培養基的成分而使濃度降低時，例如將培養基交換操作在1天進行複數次，較佳為1小時以內進行複數次(例如2~3次)。又，有時稀釋含於原來培養基的成分之濃度時，可將細胞或凝集體移至其他培養容器。
使用於培養基交換操作的道具並無特別限定，例如可舉出移液器、微管、多通道微管、連續分注器等。例如作為培養容器使用96孔板時，亦可使用多通道微管。
對於一態樣，在步驟(2)於培養基中所添加的Shh信號傳達途徑作用物質之濃度為比較低濃度(例如對於SAG為700nM以下，對於其他Shh信號傳達途徑作用物質為，顯示與前述濃度的SAG之同等以下的Shh信號傳達促進活性之濃度)時，無須進行培養基交換，於在步驟 (2)所使用的培養基中僅添加誘導分化因子(例如BMP4)即可。另一方面，Shh信號傳達途徑作用物質之濃度為比較高之濃度(例如對於SAG為超過700nM，或1000nM以上，對於其他Shh信號傳達途徑作用物質為，顯示與前述濃度的SAG之同等Shh信號傳達促進活性的濃度)時，欲抑制於誘導分化因子添加時所殘存的Shh信號傳達途徑作用物質之影響，可交換為含有誘導分化因子(例如BMP4)之新鮮培養基為佳。
對於較佳態樣，在步驟(3)所使用的培養基中之Shh信號傳達途徑作用物質之濃度，以SAG的Shh信號傳達促進活性換算時為700nM以下，較佳為300nM以下，更佳為10nM以下，特佳為0.1nM以下，最佳為未含有Shh信號傳達途徑作用物質。「未含Shh信號傳達途徑作用物質」之培養基中，實質上為未含Shh信號傳達途徑作用物質的培養基，例如亦含有未含有對網膜前驅細胞及網膜組織的選擇性分化會有不利影響程度之濃度的Shh信號傳達途徑作用物質之培養基。「未添加Shh信號傳達途徑作用物質」之培養基中，實質上為未添加Shh信號傳達途徑作用物質的培養基，例如亦含有未添加對網膜前驅細胞及網膜組織的選擇性分化有著不利影響程度之濃度的Shh信號傳達途徑作用物質之培養基。
步驟(3)中之培養溫度、CO2濃度等的培養條件可適宜地設定。培養溫度例如約30℃至約40℃，較佳為約37℃。又，CO2濃度例如約1%至約10%，較佳為約 5%。
藉由該培養，可自形成在步驟(2)所得之凝集體之細胞往網膜前驅細胞之分化被誘導，得到含有網膜前驅細胞之凝集體。本發明亦提供含有如此網膜前驅細胞的凝集體之製造方法。欲得到含有網膜前驅細胞之凝集體，例如網膜前驅細胞之標示物的表示Rx、PAX6或Chx10的細胞是否含於凝集體可藉由檢測來確認。作為步驟(3)之實施態樣之一，將在步驟(2)所形成的凝集體，至表現Rx基因的細胞開始出現之間，在含有對網膜細胞之誘導分化為必要的濃度之BMP信號傳達途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有網膜前驅細胞之凝集體的步驟可舉出。對於一態樣，含於凝集體之細胞的20%以上(較佳為30%以上、40%以上、50%以上、60%以上)可至成為表現Rx之狀態為止實施步驟(3)之培養。
在製造網膜細胞及/或網膜組織上的較佳態樣，於步驟(1)，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01)以及bFGF之無血清培養基中進行接著培養，在步驟(2)中，將細胞在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)之無血清培養基中進行浮游培養，在步驟(3)，將凝集體在含有BMP信號傳達途徑作用物質(例如BMP4)的無血清培養基中進行浮游培養。
又在製造網膜細胞及/或網膜組織上之較佳態樣，於步驟(1)，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)及bFGF之無血清培養基中，進行接著培養，於步驟(2)，將細胞在含有或未含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA)之無血清培養基中進行浮游培養，於步驟(3)，將凝集體在含有BMP信號傳達途徑作用物質(例如BMP4)的無血清培養基中進行浮游培養。
在製造網膜細胞及/或網膜組織上之較佳態樣，於步驟(1)，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA)以及bFGF之無血清培養基中，較佳為1天以上6天以下，更佳為2天~4天進行接著培養，於步驟(2)，將細胞在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA)的無血清培養基進行浮游培養，於步驟(3)，將凝集體在含有BMP信號傳達途徑作用物質(例如BMP4)的無血清培養基中進行浮游培養。
在製造網膜細胞及/或網膜組織上之較佳態樣，於步驟(1)，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01)、BMP信號傳達途徑 阻礙物質(例如LDN193189)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)等)；音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)；或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)與音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)之組合；以及含有bFGF之無血清培養基進行接著培養，於步驟(2)，將在步驟(1)所得之細胞在含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如SAG、PMA、Shh蛋白質)的無血清培養基中進行浮游培養，形成細胞凝集體，於步驟(3)，將凝集體在含有BMP信號傳達途徑作用物質(例如BMP4)的無血清培養基中進行浮游培養，得到含有網膜前驅細胞、網膜細胞或網膜組織之凝集體。
步驟(2)之培養基，較佳為含有ROCK阻礙物質(例如Y-27632)。
含有所得之網膜前驅細胞的凝集體可直接作為毒性．藥效評估用試藥使用。將含有網膜前驅細胞之凝集體進行分散處理(例如胰蛋白酶/EDTA處理或木瓜蛋白酶處理)，藉由將所得之細胞使用FACS或MACS進行選別後，可得到高純度網膜前驅細胞。
進一步將含有網膜前驅細胞之凝集體在無血清培養基或血清培養基繼續培養後，將網膜前驅細胞進一步分化，可製造出神經上皮結構樣的網膜組織。
使用於該培養基的無血清培養基或血清培養基，僅為如上述者即可並無特別限定。例如於DMEM-F12培養基添加10%牛胚胎血清、N2supplement、100μM牛磺酸、及500nM視黃酸的血清培養基、或適量添加市售KSR等血清代替物的無血清培養基(例如IMDM與F-12之1：1的混合液中添加10%KSR、450μM 1-一硫甘油及1 x Chemically Defined Lipid Concentrate的培養基)等可舉出。
自網膜前驅細胞誘導網膜組織時的培養時間雖依目的之網膜層專一性神經細胞相異而不同，但例如約7天至約200天。
網膜組織為如覆蓋凝集體表面之方式存在。浮游培養終了後，將凝集體使用對甲醛溶液等固定液進行固定，製造出冷凍切片後，是否形成具有層結構之網膜組織係由免疫染色法等做確認即可。網膜組織因構成各層的網膜前驅細胞(感光細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、網膜神經節細胞)各相異，故使用對於表現於這些細胞之上述標示物的抗體，藉由免疫染色法，可確認形成層結構。對於一態樣，網膜組織為Rx或Chx10陽性之神經上皮結構。
將存在凝集體的表面之網膜組織，使用鑷子等，可自凝集體以物理方式切出。此時，於各凝集體的表面，因有時形成網膜組織以外的神經組織，故切出字凝集體所切出的神經組織之一部分，使用此藉由後述免疫染色 法等進行確認後，可確認該組織為網膜組織。
對於一態樣，在步驟(3)所得之凝集體實質上未含含有網膜組織之頭部非神經外胚葉。在實質上未含有含網膜組織之頭部非神經外胚葉的凝集體中，例如對於上述凝集體冷凍切片之免疫染色像，觀察到Rx陽性組織，於該外側未觀察到Rx陰性組織。
作為步驟(3)的實施態樣之一，將在步驟(2)所形成的凝集體，至開始表現Rx基因及/或Chx10基因之細胞出現之間，在含有對網膜細胞之誘導分化為必要濃度的BMP信號傳達途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有網膜前驅細胞之凝集體，至將含有網膜前驅細胞之凝集體形成網膜組織為止，繼續在無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有網膜組織之凝集體的步驟可舉出。至將含有網膜前驅細胞之凝集體形成網膜組織為止，繼續在無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養時，藉由以未含有BMP信號傳達途徑作用物質的無血清培養基或血清培養基進行培養基交換，欲誘導網膜前驅細胞而於培養基中所含的BMP信號傳達途徑作用物質濃度，可在2~4天，以40~60%減少比例下，徐徐或段階式地降低。對於一態樣，含於凝集體的細胞之20%以上(較佳為30%以上、40%以上、50%以上、60%以上)至成為表現Chx10的狀態為止，實施含有網膜前驅細胞之凝集體的浮游培養。
又，作為步驟(3)的實施態樣之一，可將在步 驟(2)所得之凝集體、或在步驟(2)所得之凝集體、藉由上述方法經浮游培養的凝集體進行接著培養，行成接著凝集體。將該接著凝集體至開始表現Rx基因及/或Chx10基因的細胞為止之間，在含有對網膜細胞之誘導分化為必要濃度之BMP信號傳達途徑作用物質的無血清培養基或血清培養基中進行接著培養，得到含有網膜前驅細胞之凝集體。至將該含有網膜前驅細胞之凝集體形成網膜組織為止，繼續在無血清培養基或血清培養基中進行接著培養，得到含有網膜組織之凝集體。對於一態樣，將細胞的10%以上(較佳為20%以上、30%以上、40%以上、50%以上)至成為表現Chx10之狀態為止，實施含有網膜前驅細胞之凝集體的接著培養。
藉由本發明之製造方法2，可自多能性幹細胞以高效率下得到網膜組織。於藉由本發明之製造方法2所得的網膜組織中，因各網膜層中含有專一性神經元(神經細胞)故可獲得感光細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、網膜神經節細胞或這些前驅細胞等構成網膜組織之細胞。由所得之網膜組織獲得之細胞是否為任一細胞，可藉由自體公知方法，例如細胞標示物之表現做確認。
含有所得之網膜組織的凝集體可直接作為毒性．藥效評估用試藥使用。將含有網膜組織之凝集體進行分散處理(例如胰蛋白酶/EDTA處理)，藉由將所得之細胞使用FACS或MACS進行選別後，可得到高純度網膜組織構成細胞，例如可得到高純度感光細胞。
由含有在本發明之製造方法2等所得之網膜組織的細胞凝集體，藉由下述步驟(A)及步驟(B)，可製造睫狀體周緣部樣結構體。
所謂本發明中之睫狀體周緣部樣結構體表示與睫狀體周緣部類似的結構體。作為「睫狀體周緣部(ciliary marginal zone；CMZ)」，例如有對於活體網膜存在於網膜組織(具體為神經網膜)與網膜色素上皮之境界區域的組織，且含有網膜之組織幹細胞(網膜幹細胞)的區域可舉出。睫狀體周緣部亦稱為睫狀體緣(ciliary margin)或網膜緣(retinal margin)，睫狀體周緣部、睫狀體緣及網膜緣為同等組織。已知睫狀體周緣部扮演著在對網膜組織之網膜前驅細胞或分化細胞的供給或網膜組織結構之維持等之重要角色。作為睫狀體周緣部之標示物基因，例如有Rdh10基因(陽性)及Otx1基因(陽性)及Zic1(陽性)可舉出。
首先，作為步驟(A)，含有在本發明之製造方法2所得的網膜組織之細胞凝集體，將在前述網膜組織之Chx10陽性細胞的存在比例為20%以上100%以下的細胞凝集體，於含有Wnt信號傳達途徑作用物質及/或FGF信號傳達途徑阻礙物質之無血清培養基或血清培養基中，僅至表現RPE65基因之細胞出現為止的期間中進行培養。
其中，作為步驟(A)的較佳培養有浮游培養可舉出。
作為在步驟(A)所使用的無血清培養基，可舉 出於基礎培養基添加N2或KSR的無血清培養基，更具體為於DMEM/F12培養基添加N2 supplement(Life Technologies公司)的無血清培養基可舉出。作為血清培養基，有於基礎培養基添加牛胚胎血清的血清培養基可舉出。
步驟(A)的培養溫度、CO2濃度等培養條件僅可適宜地設定即可。作為培養溫度，例如約30℃至約40℃之範圍可舉出。較佳為例如約37℃前後可舉出。又，作為CO2濃度，例如有約1%至約10%的範圍可舉出。較佳為例如約5%前後可舉出。
於步驟(A)，將上述「含有網膜組織之細胞凝集體」在無血清培養基或血清培養基中進行培養時，作為含於該培養基的Wnt信號傳達途徑作用物質，僅為可得到增強藉由Wnt經媒介的信號傳達者即可，並無特別限定。作為具體的Wnt信號傳達途徑作用物質，例如有屬於Wnt家族之蛋白質(例如Wnt1、Wnt3a、Wnt7a)、Wnt受體、Wnt受體激動劑、GSK3β阻礙劑(例如6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO)、CHIR99021、Kenpaullone)等可舉出。
作為含於步驟(A)的無血清培養基或血清培養基之Wnt信號傳達途徑作用物質的濃度，在CHIR99021等通常Wnt信號傳達途徑作用物質之情況，例如有約0.1μM至約100μM的範圍可舉出。較佳為例如有約1μM至約30μM的範圍可舉出。更佳為例如有3μM前後之濃度可舉出。
將步驟(A)之上述「含有網膜組織的細胞凝集體」在無血清培養基或血清培養基中進行培養時，作為含於該培養基之FGF信號傳達途徑阻礙物質，僅為可阻礙藉由FGF經媒介的信號傳達者即可並無特別限定。作為FGF信號傳達途徑阻礙物質，例如有FGF受體、FGF受體阻礙劑(例如SU-5402、AZD4547、BGJ398)、MAP激酶級聯阻礙物質(例如MEK阻礙劑、MAPK阻礙劑、ERK阻礙劑)、PI3激酶阻礙劑、Akt阻礙劑等可舉出。
含於步驟(A)之無血清培養基或血清培養基的FGF信號傳達途徑阻礙物質之濃度僅為可誘導對凝集體的睫狀體周緣部樣結構之分化的濃度即可。例如在SU-5402時，約0.1μM至約100μM，較佳為約1μM至約30μM，等佳為約5μM之濃度下添加。
所謂步驟(A)中之「僅至表現RPE65基因之細胞出現為止的期間中進行培養」為，僅在至表現RPE65基因的細胞出現為止的期間之全部或其一部分進行培養的意思。換言之，於培養系內存在之前述「含有網膜組織之細胞凝集體」為僅在由實質上不表現RPE65基因之細胞所構成的期間之全部或其一部分(任意期間)進行培養即可，藉由採用此培養，可得到不出現表現RPE65基因之細胞的細胞凝集體。
欲設定如此特定期間時，將前述「含有網膜組織之細胞凝集體」作為試料，將含於該試料中之RPE65基因的表現有無或其程度，使用通常基因工學手法或生化 學手法進行測定即可。具體為例如將前述「含有網膜組織的細胞凝集體」之冷凍切片可藉由使用對RPE65蛋白質之抗體進行免疫染色的方法，調查RPE65基因之表現有無或其程度。
作為步驟(A)的「至表現RPE65基因之細胞出現為止的期間」，例如為前述網膜組織中之Chx10陽性細胞的存在比例，比在含有Wnt信號傳達途徑作用物質及/或FGF信號傳達途徑阻礙物質之無血清培養基或血清培養基中之前述細胞凝集體的培養開始時更減少，到達30%至0%的範圍內為止的期間可舉出。作為「不出現表現RPE65基因之細胞的細胞凝集體」，有前述網膜組織中之Chx10陽性細胞的存在比例為30%至0%的範圍內的細胞凝集體可舉出。
步驟(A)之「至表現RPE65基因之細胞出現為止的期間」的日數雖會依Wnt信號傳達途徑作用物質及/或FGF信號傳達途徑阻礙物質之種類、無血清培養基或血清培養基之種類、其他培養條件等而變化，例如有14天以內可舉出。更具體為，使用無血清培養基(例如於基礎培養基添加N2的無血清培養基)時，作為前述期間，較佳為例如可舉出10天以內，更佳例如為3天至6天可舉出。使用血清培養基(例如於基礎培養基添加牛胚胎血清之血清培養基)時，作為前述期間，較佳例如為12天以內可舉出，更佳例如有6天至9天可舉出。
其次，作為步驟(B)，將如上述進行培養所得 之「不出現表現RPE65基因的細胞之細胞凝集體」在未含有Wnt信號傳達途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中進行培養。
作為在步驟(B)之較佳培養，例如有浮游培養可舉出。
步驟(B)無血清培養基較佳為未含有FGF信號傳達途徑阻礙物質。
作為步驟(B)的無血清培養基，有於基礎培養基添加N2或KSR的培養基可舉出。作為血清培養基，可舉出於基礎培養基添加牛胚胎血清的培養基，更具體有於DMEM/F12培養基添加牛胚胎血清之血清培養基可舉出。
於步驟(B)之前述無血清培養基或血清培養基中，可添加已知的增殖因子、促進增殖之添加劑或化學物質等。作為已知的增殖因子，有EGF、FGF、IGF、insulin等可舉出。作為促進增殖的添加劑，有N2 supplement(Life Technologies公司製)、B27 supplement(Life Technologies公司製)、KSR(Life Technologies公司製)等可舉出。作為促進增殖的化學物質，有類視黃酸類(例如視黃酸)、牛磺酸可舉出。
作為步驟(B)的較佳培養時間，例如有於前述網膜組織中之Chx10陽性細胞的存在比例，比未含有Wnt信號傳達途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中的前述細胞凝集體的培養開始時更增加，於到達30%以上為止所進行的培養時間可舉出。
步驟(B)的培養溫度、CO2濃度等培養條件進適宜地設定即可。作為培養溫度，例如有約30℃至約40℃的範圍可舉出。較佳為例如約37℃前後可舉出。又，作為CO2濃度，例如可舉出約1%至約10%的範圍，較佳例如有約5%前後可舉出。
到得到步驟(B)之「含有睫狀體周緣部樣結構體之細胞凝集體」為止的上述培養日數為依據無血清培養基或血清培養基之種類、其他培養條件等而起變化，但例如有100天以內可舉出。作為前述培養日數，較佳例如可舉出20天至70天，更佳例如可舉出30天至60天。
藉由上述步驟(A)、(B)所調製的「含有睫狀體周緣部樣結構體之細胞凝集體」中，於睫狀體周緣部樣結構體各鄰接，網膜色素上皮與網膜組織(具體為神經網膜)在同一細胞凝集體內存在。對於該結構，可藉由顯微鏡觀察等確認。具體為例如藉由顯微鏡觀察，由透明度高的網膜組織，於與見到色素沈澱的網膜色素上皮之間所形成的作為網膜側較後且網膜色素上皮側較薄的上皮結構，可確認睫狀體周緣部樣結構體的存在。又，藉由凝集體的冷凍切片之免疫染色，作為Rdh10陽性、Otx1陽性、或Zic1陽性，可確認睫狀體周緣部樣結構體之存在。
對於進一步態樣，藉由上述步驟(A)、(B)，進行含於凝集體的網膜組織(神經上皮)之分化，可製造含有選自由感光細胞前驅細胞、感光細胞、錐體感光細胞、視桿細胞、水平細胞、介在神經細胞(無長突細胞、神經節 細胞等)所成群的至少1種，較佳為複數，更佳為所有細胞之成熟網膜組織、及前述細胞。
由含有本發明之製造方法2等所得的網膜組織之細胞凝集體，可製造出藉由下述步驟(C)之網膜色素上皮細胞。由下述步驟(C)所得之網膜色素上皮細胞藉由下述步驟(D)可製造視網膜色素上皮細胞片。
所謂本發明中之「網膜色素上皮細胞」表示對於活體網膜存在於神經網膜組織之外側的上皮細胞。是否為網膜色素上皮細胞，僅為斯業者，例如可藉由細胞標示物(RPE65(成熟網膜色素上皮細胞)、Mitf(年輕或成熟網膜色素上皮細胞)等)之表現或黑色素顆粒之存在、多角形之特徵性細胞形態等而確認。
首先，作為步驟(C)，將含有在本發明之製造方法2所得之網膜組織的細胞凝集體，在含有未含BMP信號傳達途徑作用物質的Wnt信號傳達途徑作用物質之無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有網膜色素上皮細胞之凝集體。
作為在步驟(C)所使用的無血清培養基，可舉出於基礎培養基添加N2或KSR的無血清培養基，更具體有於DMEM/F12培養基添加N2 supplement(Life Technologies公司)的無血清培養基可舉出。作為血清培養基，有於基礎培養基添加牛胚胎血清的血清培養基可舉出。
於在步驟(C)所使用的無血清培養基中加入前 述Wnt信號傳達途徑作用物質，可含有前述Nodal/Activin信號傳達途徑作用物質及/或前述FGF信號傳達途徑阻礙物質。
其中，作為步驟(C)之較佳培養，有浮游培養可舉出。
其次，將在本發明步驟(C)所得之凝集體進行分散，對於將所得之細胞進行接著培養的步驟(D)做說明。
步驟(D)為，於步驟(C)的實施開始至60天以內，較佳為30天以內，較佳為3天後實施。
作為使用於步驟(D)中之接著培養的無血清培養基或血清培養基，可舉出如上述之培養基。欲迴避調製之煩雜性，使用適量添加市售KSR等血清代替物的無血清培養基(例如於DMEM/F-12與Neurobasal的1：1混合液中添加1/2 x N2supplement、1/2 x B27supplement及100μM 2-巰基乙醇的培養基)為佳。作為對無血清培養基的KSR之添加量，例如在人類iPS細胞由來細胞的場合通常約1%至約20%，較佳約2%至約20%。
對於步驟(D)中之在前述含有ROCK阻礙物質的無血清培養基或血清培養基中進行細胞的培養者為佳。
對於步驟(D)，再進一步含有選自由Wnt信號傳達途徑作用物質、FGF信號傳達途徑阻礙物質、Activin信號傳達途徑作用物質及BMP信號傳達途徑作用物質所成群的1種以上物質之無血清培養基或血清培養基中進行 細胞培養為更佳。
所謂Activin信號傳達途徑作用物質為，增強藉由Activin經媒介的信號而得之物質。作為Activin信號傳達途徑作用物質，例如可舉出屬於Activin家族的蛋白(例如Activin A，Activin B，Activin C，Activin AB等)、Activin受體、Activin受體激動劑。
在步驟(D)所使用的Activin信號傳達途徑作用物質之濃度僅可有效率地形成網膜色素上皮細胞之均勻薄片的濃度即可。例如在Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A(R&D systems公司#338-AC)之情況時，添加至約1ng/ml至約10μg/ml，較佳為約10ng/ml至約1μg/ml，更佳為約100ng/ml之濃度。
Activin信號傳達途徑作用物質為在自步驟(D)開始至例如18天以內，較佳為第6天添加。
對於步驟(D)，在以培養基質進行表面處理的培養器材上進行接著培養者為佳。作為在步驟(D)中之培養器材的處理所使用的培養基質，可舉出使凝集體由來細胞的接著培養與視網膜色素上皮細胞片之形成成為可能之細胞培養基質。
4.大腦組織的製造方法
本發明之製造方法3為含有下述步驟(1)~(3)之大腦組織的製造方法：(1)將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下，在含有 1)TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及2)未分化維持因子的培養基進行培養之第一步驟、(2)將以第一步驟所得之細胞進行浮游培養，形成細胞的凝集體之第二步驟、及(3)將在第二步驟所得之凝集體在TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質的存在下進行浮游培養，得到含有大腦組織之凝集體的第三步驟。
本發明之製造方法3的步驟(1)可與本發明之製造方法1的步驟(1)同樣地實施。
本發明之製造方法3的步驟(2)亦可與本發明之製造方法1的步驟(2)同樣地實施。
於製造方法3的步驟(2)所使用之培養基，可含有或未含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質。
於步驟(2)所使用的培養基可含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質。對於步驟(2)，可將TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質或Wnt信號傳達途徑阻礙物質單獨地添加於培養基中，但組合兩者為較佳。
對於步驟(3)，作為誘導分化劑，可將TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質或Wnt信號傳達途徑阻礙物質單獨添加於培養基，但組合兩者為較佳。
對於步驟(3)所使用的培養基，例如為添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑 阻礙物質的無血清培養基或血清培養基(較佳為無血清培養基)。
使用於該培養基的無血清培養基或血清培養基，僅為上述者即可並無特別限定。欲迴避調製之煩雜，例如使用於適量添加市售KSR等血清代替物的無血清培養基(例如於GMEM培養基添加20% KSR、0.1mM 2-巰基乙醇、非必須胺基酸、1mM丙酮酸)為佳。對於無血清培養基之KSR的添加量，例如在人類多能性幹細胞(例如iPS細胞)之情況，通常約1%至約30%，較佳約2%至約20%。
在步驟(3)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)可直接使用在步驟(2)所使用的培養基(較佳為無血清培養基)，亦可為取代為新培養基(較佳為無血清培養基)者。將在步驟(2)所使用的未含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質的培養基，直接使用於步驟(3)時，僅將TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質添加於培養基中即可。在步驟(2)所使用的含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質的培養基可直接使用於步驟(3)時，以相同培養基進行半量培養基交換即可。
作為使用於步驟(2)及(3)的TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，有TGFβ信號傳達途徑阻礙物質、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質及BMP信號傳達途徑阻礙物質可舉出。
作為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質，僅為可阻礙TGFβ所引起的信號傳達途徑的物質即可，並無特別限定，可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物中任一。作為該物質，例如有對TGFβ直接作用之物質(例如蛋白質、抗體、適配體等)、抑制編碼TGFβ的基因之表現的物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、阻礙TGFβ受體與TGFβ之結合的物質、藉由TGFβ受體阻礙信號傳達所引起的生理活性的物質(例如TGFβ受體之阻礙劑、Smad之阻礙劑等)可舉出。作為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質為已知的蛋白質，可舉出Lefty等。作為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質，可使用斯業者所熟知的化合物，具體可舉出SB431542、LY-364947、SB-505、A-83-01等。其中，SB431542(4-(5-苯甲醯基[1,3]二氧雜環戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲醯胺)及A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代羧醯胺)]為作為TGFβ受體(ALK5)及Activin受體(ALK4/7)的阻礙劑(即TGFβR阻礙劑)的公知化合物，其為TGFβ信號傳達途徑阻礙物質，較佳為SB431542或A-83-01。
作為Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質，僅為阻礙因Nodal或Activin所引起的信號傳達途徑的物質即可，並無特別限定，可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物中任一種。作為該物質，例如有對Nodal或者Activin直接作用之物質(例如抗體、適配體等)、抑制編碼Nodal或者Activin的基因之表現的物質(例如反義寡核苷 酸、siRNA等)、阻礙Nodal/Activin受體與Nodal/Activin之結合的物質、阻礙藉由Nodal/Activin受體的信號傳達所引起的生理活性的物質可舉出。作為Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質，可使用斯業者熟知的化合物，具體可舉出SB431542、A-83-01等。又，亦可使用作為Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質為已知的蛋白質(Lefty、Cerberus等)。
作為BMP信號傳達途徑阻礙物質，僅為阻礙因BMP所引起的信號傳達途徑的物質即可，並無特別限定，可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物中任一種。其中作為BMP，可舉出BMP2、BMP4、BMP7及GDF7。作為該物質，例如有對BMP直接作用之物質(例如抗體、適配體等)、抑制編碼BMP的基因之表現的物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、阻礙BMP受體(BMPR)與BMP的結合之物質、阻礙藉由BMP受體之信號傳達所引起的生理活性之物質可舉出。作為BMPR，有ALK2或ALK3可舉出。作為BMP信號傳達途徑阻礙物質，可使用斯業者所熟知的化合物，具體可舉出LDN193189、Dorsomorphin等。其中，LDN193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑並[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)為公知之BMPR(ALK2/3)阻礙劑，通常以鹽酸鹽的形態市售。又，亦可使用作為BMP信號傳達途徑阻礙物質為已知的蛋白質(Chordin、Noggin等)。BMP信號傳達途徑阻礙物質，較佳為LDN193189。
TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，較佳為 SB431542、A-83-01或LDN193189。
作為使用於步驟(2)及(3)的Wnt信號傳達途徑阻礙物質，僅為可抑制藉由Wnt經媒介的信號傳達者即可並無特別限定，可為蛋白質、核酸、低分子化合物等中任一種皆可。藉由Wn經媒介的信號為，藉由作為Frizzled(Fz)及LRP5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)的異二聚體而存在的Wnt受體進行傳達。作為Wnt信號傳達途徑阻礙物質，例如為對Wnt或Wnt受體直接作用之物質(抗Wnt抗體、抗Wnt受體抗體等)、抑制編碼Wnt或Wnt受體的基因之表現的物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、阻礙Wnt受體與Wnt之結合的物質(可溶型Wnt受體、顯性負Wnt受體等、Wnt拮抗物、Dkk1、Cerberus蛋白等)、阻礙藉由Wnt受體之信號傳達所引起的生理活性之物質[CKI-7(N-(2-胺基乙基)-5-氯異喹啉-8-磺醯胺)、D4476(4-[4-(2,3-二氫-1,4-苯並二惡烷-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲醯胺)、IWR-1-endo(IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氫-1,3-二氧代-4,7-甲醇-2H-異吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲醯胺)、以及IWP-2(N-(6-甲基-2-苯並噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氫-4-氧代-3-苯基噻吩並[3,2-d]嘧啶-2-基)硫]乙醯胺)等低分子化合物等]等可舉出，但未限定於此等。CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2等為公知Wnt信號傳達途徑阻礙物質，可由市售品等適宜獲得。作為Wnt信號傳達途徑阻礙物質，較佳為可舉出IWR1e。
Wnt信號傳達途徑阻礙物質之濃度僅為可誘導對形成多能性幹細胞的凝集體之細胞的大腦細胞之分化的濃度即可。例如在IWR-1-endo之情況時，以約0.1μM至約100μM，較佳為約0.3μM至約30μM，更佳為約1μM至約10μM，特佳為約3μM之濃度下添加於培養基。使用IWR-1-endo以外的Wnt信號傳達途徑阻礙物質時，以顯示與上述IWR1e之濃度同等Wnt信號傳達途徑阻礙活性的濃度為佳。
TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質可於與步驟(2)之浮游培養開始的同時添加於培養基，亦可自步驟(2)的浮游培養開始後經過一定時間後(例如約24小時後)添加於培養基。
對於步驟(3)，進行培養基交換操作時，例如未捨去原來培養基而加入新培養基的操作(培養基添加操作)、捨去原來培養基半量程度(原來培養基的體積量之40~80%程度)加入新培養基半量程度(原來培養基的體積量之40~80%)之操作(半量培養基交換操作)、捨去原來培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)加入新培養基全量程度(原來培養基的體積量之90%以上)之操作(全量培養基交換操作)等而可實施培養基交換。
在某時間點，添加特定的成分(例如IWR-1-endo)時，例如計算最終濃度時，可進行捨去原來培養基半量程度，加入含有比最終濃度高的濃度(具體為最終濃度的1.5~3.0倍、例如最終濃度的約2倍之濃度)之特定成 分的新培養基半量程度之操作(半量培養基交換操作、半量培養基交換)。
有時維持含於原來培養基的特定成分之濃度時，例如可進行捨去原來培養基半量程度，加入含有與含於原來培養基的濃度之相同濃度的特定成分之新培養基半量程度的操作。
有時稀釋含於原來培養基的成分而使濃度下降時，例如將培養基交換操作再1天進行複數次，較佳為1小時內進行複數次(例如2~3次)。又，有時稀釋含於原來培養基的成分而使濃度下降時，可將細胞或凝集體移至其他培養容器。
使用於培養基交換操作的道具並無特別限定，例如可舉出移液器、微管、多通道微管、連續分注器等。例如作為培養容器使用96孔板時，亦可使用多通道微管。
步驟(3)中之培養溫度、CO2濃度等的培養條件可適宜地設定。培養溫度例如約30℃至約40℃，較佳為約37℃。又，CO2濃度例如約1%至約10%，較佳為約5%。
藉由該培養，可由形成在步驟(2)所得之凝集體的細胞誘導對大腦神經系前驅細胞之分化，得到含有大腦神經系前驅細胞之凝集體。本發明為亦提供含有如此大腦神經系前驅細胞的凝集體之製造方法。所謂得到含有大腦神經系前驅細胞的凝集體，例如可藉由檢測表現大腦神 經系前驅細胞的標示物之FoxG1、Lhx2、PAX6、Emx2等的細胞是否含於凝集體而確認。作為步驟(3)的實施態樣之一，有將在步驟(2)所形成的凝集體，在表現FoxG1基因之細胞開始出現為止之間，在無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養步驟可舉出。對於一態樣，含於凝集體之細胞的20%以上(較佳為30%以上、40%以上、50%以上、60%以上)成為表現FoxG1之狀態為止，實施步驟(3)的培養。
對於製造大腦細胞及/或大腦組織上之較佳態樣，於步驟(1)，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542)及bFGF的無血清培養基中，進行接著培養，於步驟(2)，將在步驟(1)所得之細胞在無血清培養基中進行浮游培養，於步驟(3)，將在步驟(2)所得之凝集體在含有Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1-endo)及TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542)的無血清培養基進行浮游培養。
又，對於在製造大腦細胞及/或大腦組織上之較佳態樣，於步驟(1)，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)及bFGF的無血清培養基中進行接著培養，於步驟(2)，將在步驟(1)所得之細胞在無血清培養基中進行浮游培養，於步驟(3)，將在步驟(2)所得之凝集體在含有Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1- endo)及TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542)之無血清培養基進行浮游培養。
對於在製造大腦細胞及/或大腦組織上之較佳態樣，於步驟(1)，將人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)在飼養細胞非存在下，在含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty)、BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)等)；音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)；或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189)與音蝟因子信號傳達途徑作用物質(例如Shh蛋白質、SAG、PMA)之組合；以及含有bFGF、的無血清培養基中進行接著培養，於步驟(2)，將在步驟(1)所得之細胞在含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty)、BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)等)；及Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1-endo)之無血清培養基中進行浮游培養，形成細胞的凝集體，於步驟(3)，將在步驟(2)所得之凝集體在含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物 質(例如Lefty)、BMP信號傳達途徑阻礙物質(例如LDN193189)、或該組合(例如SB431542及LDN193189)等)；及Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1-endo)的無血清培養基中進行浮游培養，得到含有大腦神經系前驅細胞、大腦細胞或大腦組織之凝集體。
步驟(2)之培養基，較佳為含有ROCK阻礙物質(例如Y-27632)。
更佳為將在步驟(2)，在步驟(1)所得之細胞於含有TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(例如TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01)、Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty)；Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1-endo)；及ROCK阻礙物質(例如Y-27632)的無血清培養基中進行浮游培養，形成細胞的凝集體，於步驟(3)，將在步驟(2)所得之凝集體在含有TGFβ信號傳達途徑阻礙物質(例如SB431542、A-83-01)或Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質(例如Lefty)；及Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1-endo)、的無血清培養基中進行浮游培養，得到含有大腦神經系前驅細胞、大腦細胞或大腦組織之凝集體。
所得之含有大腦神經系前驅細胞的凝集體可直接作為毒．藥效評估用試藥使用。將含有大腦神經系前驅細胞的凝集體經分散處理(例如胰蛋白酶/EDTA處理或木瓜蛋白酶處理)，藉由將所得之細胞使用FACS或MACS進行選別後，可得到高純度大腦神經系前驅細胞。
且，將含有大腦神經系前驅細胞的凝集體在無血清培養基或血清培養基中繼續培養後，進一步分化大腦神經系前驅細胞或大腦細胞，可製造出具有層結構之大腦組織。
使用於該培養基的無血清培養基或血清培養基僅為如上述者即可，並無特別限定。例如有於DMEM-F12培養基添加10%牛胚胎血清、N2supplement、及視黃酸之血清培養基、或適量添加市售N2supplement等血清代替物的無血清培養基(例如於DMEM-F12培養基添加N2supplement之培養基)等可舉出。
由大腦神經系前驅細胞誘導大腦組織時的培養時間，依據目的的大腦層專一性神經細胞而相異，但例如約7天至約200天。
大腦組織於凝集體中形成神經上皮結構而存在。浮游培養終了後，將凝集體使用對甲醛溶液等固定液進行固定，製作出冷凍切片後，形成具有層結構之大腦組織的結果可藉由免疫染色法等進行確認即可。大腦組織為構成各層之大腦神經系前驅細胞、腦室體前驅細胞、大腦層結構專一性神經細胞為各相異，故使用對於這些細胞所表現的上述標示物的抗體，藉由免疫染色法，可確認是否形成層結構。對於一態樣，大腦組織為FoxG1陽性之神經上皮結構。
將存在於凝集體的表面之大腦組織，可使用鑷子等，自凝集體以物理方式切出。此時，於各凝集體的 表面，因有時有形成大腦組織以外之神經組織之情況，故自凝集體切出神經組織的一部分，使用此藉由後述免疫染色法等進行確認後，可確認該組織為大腦組織。
作為步驟(3)的實施態樣之一，將在步驟(2)所形成之凝集體在表現FoxG1基因之細胞開始出現為止之間，於含有對大腦細胞之誘導分化為必要濃度的TGFβ信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質之無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有大腦神經系前驅細胞之凝集體，將含有該大腦神經系前驅細胞之凝集體形成至大腦組織為止，繼續在無血清培養基或血清培養基中進行浮游培養，得到含有大腦組織之凝集體的步驟可舉出。對於一態樣，於凝集體所含的細胞之20%以上(較佳為30%以上、40%以上、50%以上、60%以上)至成為表現FoxG1之狀態為止，實施含有大腦神經系前驅細胞之凝集體的浮游培養。
又，作為步驟(3)的實施態樣之一，將將在步驟(2)所得之凝集體、或在步驟(2)所得之凝集體藉由上述方法進行浮游培養的凝集體進行接著培養，可形成接著凝集體。將該接著凝集體在表現FoxG1基因之細胞開始出現為止之間，以含有對大腦細胞之誘導分化為必要之濃度的TGFβ信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質之無血清培養基或血清培養基中進行接著培養，得到含有大腦神經系前驅細胞之凝集體。將含有該大腦神經系前驅細胞之凝集體至形成大腦組織為止，繼續在無血 清培養基或血清培養基中進行接著培養，得到含有大腦組織之凝集體。對於一態樣，細胞的10%以上(較佳為20%以上、30%以上、40%以上、50%以上)至成為表現FoxG1之狀態為止，實施含有大腦神經系前驅細胞之凝集體的接著培養。
藉由本發明之製造方法3，可由多能性幹細胞以高效率下得到大腦組織。藉由本發明之製造方法3所得之大腦組織中，因各大腦層含有專一性神經元(神經細胞)，故可獲得層結構專一性神經細胞或構成這些前驅細胞等大腦組織之細胞。由所得之大腦組織所獲得之細胞是否為任一細胞，可藉由自體公知方法，例如藉由細胞標示物之表現而確認。
含有所得之大腦組織的凝集體可直接作為毒性．藥效評估用試藥使用。將含有大腦組織之凝集體經分散處理(例如胰蛋白酶/EDTA處理)，藉由將所得之細胞使用FACS或MACS進行選別後，可得到高純度大腦組織構成細胞，例如高純度大腦層結構專一性神經細胞。
4.毒性．藥效評估方法
藉由本發明之製造方法1、2或3所製造之神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)為依據神經組織或神經系細胞的障礙的疾病之治療藥的篩選或毒性評估中，作為疾病研究材料、 創藥材料為有用者，故可作為被驗物質之毒性．藥效評估用試藥。例如神經組織(例如網膜組織、大腦組織)之障礙為準的疾病，特別為由遺傳性障礙為準的疾病之人類患者製造出iPS細胞，使用該iPS細胞藉由本發明之方法，可製造出神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)。神經組織或神經系細胞為，成為該患者所患的疾病之原因的神經組織之障礙在活體外可再現。於此，本發明為提供，含有使於本發明之製造方法1、2或3所製造之神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)與被驗物質接觸，檢測該物質對該細胞或該組織之影響的該物質之毒性．藥效評估方法。
例如將藉由本發明之製造方法1、2或3所製造之具有特定障礙(例如遺傳性障礙)之神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)，在被檢物質之存在下或非存在下(陰性對照)進行培養。而將以被檢物質進行處理之神經組織或神經系細胞中之障礙程度與陰性對照做比較。其結果，得知減輕該障礙程度之被檢物質作為以該障礙為準的疾病之治療藥的候補物質而可選擇。例如將可進一步提高本發明之製造方法所製造之神經系細胞的生理活性(例如生存促進或成熟化) 之被驗物質，可作為醫藥品之候補質而做探索。或者自具有呈現神經疾病等特定障礙之基因變異的體細胞調製出人工多能性幹細胞，於該細胞以本發明之製造方法經誘導分化而製造之神經系細胞添加被驗物質，將是否呈現前述障礙作為指標，可探索作為該障礙之治療藥．預防藥的有效被驗物質之候補。
對於毒性評估，將藉由本發明之製造方法1、2或3所製造之神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)在被檢物質之存在下或非存在下(陰性對照)進行培養。而以被檢物質進行處理之神經組織或神經系細胞中之毒性程度與陰性對照做比較。其結果，得知與陰性對照比較下，顯示毒性之被檢物質可被判斷出作為對於神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞)具有毒性之物質。
即，本發明為包含含有以下步驟之毒性評估方法。
(步驟1)將藉由本發明之製造方法1、2或3所製造之神經組織或神經系細胞在可生存之培養條件下，以一定時間在被檢物質之存在下進行培養後，測定細胞的傷害之程度的步驟、(步驟2)將本發明之製造方法1、2或3所製造的神經組織或神經系細胞在可生存之培養條件下，以一定時間在 被檢物質之非存在下或正對照組之存在下進行培養後，測定細胞的傷害程度之步驟、依據由(步驟3)(步驟1)及(步驟2)所測定的結果之差異，評估於步驟1中具有被檢物質之毒性的步驟。
其中，所謂「被檢物質之非存在下」表示包含取代被檢物質，僅添加培養液、溶解被檢物質之溶劑者。又，所謂「正對照組」表示具有毒性之已知化合物。作為測定細胞的傷害程度之方法，可舉出計算生存細胞數之方法，例如測定細胞內ATP量之方法、或藉由細胞染色(例如細胞核染色)與形態觀察計算活細胞數之方法等。
於步驟3，作為評估具有被檢物質之毒性的方法，例如比較步驟1之測定值與步驟2中之陰性對照的測定值，步驟1的細胞傷害程度大時，可判斷該被檢物質具有毒性。又，比較步驟1之測定值與步驟2中之正對照組之測定值，步驟1的細胞之傷害程度為同等以上時，判斷該被檢物質具有毒性。
5.醫藥組成物
本發明提供含有由本發明之製造方法1、2或3所製造的神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)之有效量的醫藥組成物。
該醫藥組成物含有由本發明之製造方法1、2或3所製造的神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網 膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)之有效量、及作為醫藥可被接受的載體。
作為醫藥可被接受的載體，可使用生理性水性溶劑(生理食鹽水、緩衝液、無血清培養基等)。視必要，對於移植醫療，含有移植之組織或細胞的醫藥中可添加通常使用的保存劑、安定劑、還原劑、等張化劑等。
本發明之醫藥組成物為將由製造方法1、2或3所製造的神經組織或神經系細胞藉由懸浮於適當生理性水性溶劑，可作為懸浮液製造。視必要，可添加冷凍保存劑，冷凍保存，於使用時解凍，以緩衝液洗淨後使用於移植醫療。
可將由本發明之製造方法所得之神經組織使用鑷子等細切成適當尺寸成為薄片劑。
又，由本發明之製造方法所得之細胞藉由以進行誘導分化之步驟(3)進行接著培養後可成形為薄片狀細胞成為薄片劑。
本發明之醫藥組成物可作為以神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)之障礙為準的疾病治療藥使用。
6.治療藥
由本發明之製造方法1、2或3所製造的神經組織或 神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)可使用於以該神經組織或神經系細胞的障礙為準的疾病之移植醫療上。其中，本發明為提供包含由本發明之製造方法1、2或3所製造的神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)之以該神經組織或神經系細胞的障礙為準的疾病治療藥。作為以該神經組織或神經系細胞的障礙為準的疾病治療藥，或者對於該神經組織的損傷狀態，欲補充該損傷部位時，可使用本發明之製造方法1、2或3所製造的神經組織或神經系細胞(例如網膜組織、網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞)。對於必須移植的以神經組織或神經系細胞的障礙為準的疾病、或神經組織之損傷狀態的患者，可移植由本發明之製造方法1、2或3所製造的神經組織或神經系細胞，藉由補充該神經系細胞或受到障礙之神經組織自體，可治療以神經組織或神經系細胞的障礙為準的疾病、或神經組織之損傷狀態。例如作為以神經組織或神經關連細胞的障礙為準的疾病，例如可舉出神經變性疾病(例如腦虚血障礙、腦梗塞、帕金森氏病、脊髓損傷、腦血管障礙．腦/脊髓外傷性障礙(例如腦梗塞、頭部外傷．腦挫傷(TBI)．脊髓損傷多系統萎縮症)、典型的神經變性疾病(筋萎縮性側索硬化症(ALS)、帕金森氏病 (PD)、帕金森綜合症、阿爾茨海默型癡呆、進行性核上性麻痺(PSP)、亨廷頓氏病、多系統萎縮症(MSA)、脊髓小腦變性症(SCD))、脫髓疾病．神經筋疾病(多發性硬化症(MS)、急性散在性腦脊髓炎(ADEM)、炎症性廣泛性硬化症(Schilder病)、亞急性硬化症全腦炎、進行性多巢性白質腦症、低酸素腦症、橋中心髓鞘破壞症、Binswanger病、格林-巴利綜合症、費雪症候群、慢性炎症性脫髓性多發根神經炎、脊髓空洞症、脊髓小腦變性症、黑質線條體變性症(SND)、橄欖橋小腦萎縮症(OPCA)、害羞-德雷格綜合徵(Shy-Drager症候群))、眼科疾病(黃斑變性症、加齡黃斑變性、網膜色素變性、白內障、青光眼、角膜疾病、網膜症)、難治性癲癇、進行性核上性麻痺、脊髓空洞症、脊髓性筋萎縮症(SMA)、球脊髓性筋萎縮症(SBMA)、原發性側索硬化症(PLS)、進行性核上性麻痺(PSP)、大腦皮質基底核變性症(CBD)、亨廷頓氏病(HD)、有棘紅血球舞踏病、脊髓空洞症、前頭側頭葉變性症、Charcot-Marie-Tooth disease病、張力障礙、Pantothenate kinase-associated neurodegeneration、家族性認知症、帕金森綜合症、老人性失認症、痙性對麻痺、路易體癡呆等。例如作為以大腦組織或大腦關連細胞的障礙為準的疾病，例如可舉出神經變性疾病(例如腦虚血障礙、腦梗塞、運動神經元病、ALS、阿爾茨海默氏病、聚谷氨醯胺病、大腦皮質基底核變性症)。作為以網膜組織或網膜關連細胞的障礙為準的疾病，例如可舉出網膜變性症、網膜 色素變性症、老化黃斑變性症、有機水銀中毒、氯喹視網膜病變、青光眼、糖尿病性網膜症、新生兒網膜症等。且作為神經組織之損傷狀態，可舉出神經組織摘出後的患者、對神經組織內腫瘤之放射線照射後之患者、外傷。
對於移植醫療，因組織適合性抗原之相異所引起的排斥為常發生的問題，但若使用由移植接受者之體細胞所建構的多能性幹細胞(例如人工多能性幹細胞)即可克服該問題。即，對於較佳態樣，本發明之方法中，作為多能性幹細胞，藉由使用自接受者的體細胞所建構的多能性幹細胞(例如人工多能性幹細胞)，造對於該接受者之免疫學性自體神經組織或神經系細胞，將此移植到該接受者。
又，由與接受者在免疫為適合(例如HLA型或MHC型為適合)之其他者之體細胞所建構的多能性幹細胞(例如人工多能性幹細胞)製造阿羅神經組織或神經系細胞，可將此移植至該接受者。
[實施例]
以下舉出實施例對本發明做詳細說明，但本發明並未受到此等任何限定。
實施例1：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之人類iPS細胞的前置處理的例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)依據 「Scientific Reports,4,3594(2014)」所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用StemFit培養基(AK03、味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
作為具體之維持培養操作，首先將進行亞融合(sub confluent)的人類iPS細胞(1231A3株)以PBS洗淨後，使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散為單一細胞。其後將前述分散為單一細胞的人類iPS細胞，播種於以Laminin511-E8進行塗布的塑質培養皿，在Y27632(ROCK阻礙物質、10μM)存在下，以StemFit培養基進無飼養培養。作為前述塑質培養皿，使用6孔板(Iwaki公司製之細胞培養用、培養面積9.4cm2)時，前述分散為單一細胞之人類iPS細胞的播種細胞數為6 x 103。於播種後1天，以未含有Y27632的StemFit培養基進行交換。以後於1天~2天進行未含Y27632之StemFit培養基的培養基交換。其後於播種後6天後，培養至成為亞融合(培養面積之6成被細胞包覆的程度)。
作為本案製造法步驟1之前置處理的具體例子進行以下操作。首先將成為亞融合的人類iPS細胞(1231A3株)以PBS洗淨後，使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)分散為單一細胞。其後，將前述分散為單一細胞的人類iPS細胞，播種於以Laminin511-E8塗布的塑質培養皿(Iwaki公司製)，在Y27632(ROCK阻礙物質、10μM)存在下，以StemFit培養基進無飼養培養。作 為前述塑質培養皿，使用6孔板(Iwaki公司製之培養面積9.4cm2)時，前述經分散為單一細胞的人類iPS細胞之播種細胞數為6 x 103。作為前述塑質培養皿，使用60mm盤子(Iwaki公司製之細胞培養用、培養面積21cm2)時，前述經分散為單一細胞的人類iPS細胞之播種細胞數為13 x 103。於播種後1天，以未含有Y27632的StemFit培養基進行交換。以後，於1天~2天進行一次的未含Y27632之StemFit培養基的培養基交換。其後，播種後5天，即培養至亞融合1天前(培養面積的5成被細胞覆蓋的程度)。其中，播種後6天培養之情況亦得到同樣結果。將前述無飼養培養之亞融合1天前的人類iPS細胞在SB431542(TGFβR阻礙劑(TGFβRi)、5μM)之存在下(步驟1：前置處理、圖1“前置處理TGFβRi 24hr”)、或者非存在下(步驟1：未經前置處理，圖1“Control”)下，進行1天無飼養培養。將培養的細胞使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察。其結果，得知即使於無飼養培養中進行TGFβR阻礙劑(SB431542)處理，對於人類iPS細胞的形態亦無太大影響(圖1)。
實施例2：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質或Shh作用物質之人類iPS細胞的前置處理的例-2
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，在SB431542(TGFβR 阻礙劑、5μM)、LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)、SAG(Shh作用物質、300nM)、或TGFβR阻礙劑及BMPR阻礙劑(SB431542以5μM、及LDN193189以100nM)之存在下(步驟1：前置處理(Precondition)處理)或者非存在下(步驟1：未經前置處理)，進行1天無飼養培養。將所得之細胞各以4%對甲醛進行固定，進行多能性幹細胞標示物之1的Oct3/4之免疫染色。將所得之經免疫染色的細胞，使用倒立型螢光顯微鏡(BIOREVO，基恩士公司)進行亮視野觀察及螢光像之觀察。對於免疫染色解析，判斷前述標示物是否為陽性時，與背景比較，若亮度值為2倍以上高時為陽性。其結果，得知以任一化合物進行前置處理的細胞皆與未經前置處理的細胞相同，其為Oct3/4陽性(圖2)。即得知在這些條件下進行前置處理的細胞皆維持多能性樣狀態。
實施例3：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之自人類iPS細胞的細胞凝集體形成例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，在SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)之存在下(步驟1、前置處理：TGFβRi處理)或者非存在下(步驟1：無前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞，使用TrypLE Select (Life Technologies)進行細胞分散液處理，再藉由移液操作分散為單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)。至浮游培養開始後第2天，無論是經前置處理條件或未經前置處理條件，皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，加入未含有Y27632之無血清培養基50μl。
將如此調製的浮游培養開始後第6天之細胞，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖3)。其結果，得知TGFβR阻礙劑(SB431542)之存在下進行前置處理的細胞為(圖3B)，與未經前置處理的細胞相比較(圖3A)，細胞凝集體的形狀較佳。
進一步將浮游培養開始後第6天之細胞凝集體的形態以倒立顯微鏡進行亮視野觀察，以形態良好(圖3C黑棒、圓形表面為光滑且中間緊密)、形態為中程度(圖3灰棒、圓形但成嚢胞化)、形態差(圖3C白棒、非圓形且崩壞)做區別並定量。其結果，得知未進行前置處理的條 件下，形態差的細胞凝集體為90%程度，形態為中程度之細胞凝集體為10%程度，形態良好的細胞凝集體為0%程度(圖3C“Control”由左第一個柱狀圖)。與此相比，得知在進行前置處理之條件下，形態差的細胞凝集體為0%程度，形態為中程度的細胞凝集體為0%程度，形態良好的細胞凝集體為100%程度(圖3C“前置處理(TGFβRi)”，由左第3個柱狀圖)。即，在步驟1使用TGFβR阻礙劑(SB431542,5μM)進行前置處理時，得知在步驟2及3之細胞凝集體的形態變的良好。
實施例4：在步驟1或步驟2，使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之自人類iPS細胞之細胞凝集體形成例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，在SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)之存在下(步驟1、前置處理：TGFβRi處理)或者非存在下(步驟1：無前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2 下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及TGFβR阻礙劑(SB431542,5μM)。至浮游培養開始後第2天，無論是經前置處理條件或未經前置處理條件，皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，加入添加未含Y27632的TGFβR阻礙劑(SB431542，5μM)的無血清培養基50μl。
將如此所調製的浮游培養開始後第6天之細胞凝集體以實施例3記載的方法觀察形態。其結果，得知在步驟1未經前置處理，在步驟2於添加TGFβR阻礙劑(SB431542)的條件中，形態差的細胞凝集體為30%程度，形態為中程度的細胞凝集體為60%程度，形態良好的細胞凝集體為10%程度(圖3C、‘Control+SB’，由左第2的柱狀圖)。與此相比，在步驟1進行前置處理，在步驟2以添加TGFβR阻礙劑(SB431542)的條件下，得知形態差的細胞凝集體為0%程度，形態為中程度的細胞凝集體為0%程度，形態良好的細胞凝集體為100%程度(圖3C、‘前置處理(TGFβRi)+SB’，由左第4個柱狀圖)。即，於步驟2及步驟3在添加TGFβR阻礙劑(SB431542)的條件下，亦在步驟1使用TGFβR阻礙劑(SB431542，5μM)進行前置 處理後，與在步驟1不進行前置處理的條件相比較，得知細胞凝集體的形態並不良好。
且，藉由實施例3與實施例4之比較，在步驟1使用TGFβR阻礙劑(SB431542)進行前置處理，在步驟2及步驟3不添加TGFβR阻礙劑(SB431542)之條件(圖3C“前置處理(TGFβRi)”，由左第3個柱狀圖)、與在步驟1不進行前置處理，在步驟2及步驟3添加TGFβR阻礙劑(SB431542)之條件相比(圖3C“Control+SB”，由左第2的柱狀圖)，得知細胞凝集體的形狀為良好之比例為高。即，作為TGFβR阻礙劑(SB431542)的添加時間點，得知在步驟1(前置處理)添加為佳。
實施例5：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之自人類iPS細胞的細胞凝集體形成例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)、或LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)之存在下(步驟1：前置處理)或者非存在下(步驟1：無前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V 底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)。至浮游培養開始後第2天，無論是經前置處理條件或未經前置處理條件，皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，加入未含有Y27632之無血清培養基50μl。浮游培養開始後第6天以後，2~4天一次，以未含有Y27632的前述無血清培養基進行培養基量的5~7成之培養基交換。
將如此調製的浮游培養開始後第9天之細胞凝集體，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖4)。其結果，得知與實施例3同樣地，於步驟1在TGFβR阻礙劑(SB431542)之存在下進行前置處理的細胞中(圖4B)，與未處理群相比較(圖4A)，在步驟3中之細胞凝集體的形狀為良好。且，在步驟1於BMPR阻礙劑(SB431542)之存在下進行前置處理的細胞(圖4C)亦與未處理群相比較(圖4A)得知在步驟3的細胞凝集體的形狀為良好。即，在前置處理(步驟1)，即使使用TGFβ家族信號傳達途徑的阻礙物質之TGFβR阻礙劑(SB431542)與BMPR阻礙劑(LDN193189)中任一種，得知可得到可使細 胞凝集體的形狀良好的效果。
實施例6：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質進行前置處理之自人類iPS細胞的神經組織之形成例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)之存在下(步驟1：前置處理)或者非存在下(步驟1：無前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)。至浮游培養開始後第2天，無論是經前置處理條件或未經前置處理條件，皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第 3天，加入未含有Y27632之無血清培養基50μl。浮游培養開始後第6天以後，2~4天一次，以未含Y27632的前述無血清培養基進行半量培養基交換。做半量培養基交換操作，丟棄培養器中之培養基的體積之一半量，即丟棄75μl，加入新的前述無血清培養基75μl，使培養基量合計為150μl。
將如此調製的浮游培養開始後第23天之細胞，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖5A，B)。其結果，得知首先在步驟1不進行前置處理的條件下，在步驟3細胞凝集體會崩壞，神經組織亦全部無法形成(圖5A)。另一方面，在步驟1於BMPR阻礙劑(LDN193189)之存在下進行前置處理的細胞中，在步驟3之細胞凝集體的形狀為良好，形成具有神經上皮結構的神經組織(圖5B)。且將浮游培養開始後第23天的細胞使用倒立顯微鏡(基恩士公司)，藉由亮視野觀察來觀察其形態，各定量為「崩壞，神經組織為3%以下的細胞凝集體(形態較差的細胞凝集體)」、「殘留凝集體，但神經組織為10%以下之細胞凝集體(形態為中程度的細胞凝集體)」「殘留凝集體，神經組織為10%以上之細胞凝集體(含有神經組織之細胞凝集體)」。其結果，得知在步驟1未進行前置處理的條件下，形態差的細胞凝集體為100%程度，形態為中程度的細胞凝集體為0%程度，含有神經組織的細胞凝集體為0%程度。與此相比，得知在步驟1的進行前置處理的條件下，形態差的細胞凝集體為0%程 度，形態為中程度的細胞凝集體為0%程度，含有神經組織的細胞凝集體為100%程度。
且，將前述將進行前置處理的iPS細胞作為起始原料所製作的浮游培養開始後第23天之細胞凝集體(圖5B之條件)，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於神經組織標示物(神經系前驅細胞)之1的Nestin(抗Nestin抗體、Millipore公司、老鼠)、神經組織標示物(神經元)之1的TuJ1(抗βIII-tubulin抗體、Promega公司、老鼠)、或神經組織標示物之1的PSA-NCAM(抗PSA-NCAM抗體、Millipore公司、老鼠IgM)進行免疫染色。將這些經免疫染色的切片，使用倒立型螢光顯微鏡進行觀察。其結果，得知在以BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理的條件所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Nestin陽性細胞的比例為20%程度，全細胞中之TuJ1陽性細胞的比例亦為70%程度，而PSA-NCAM陽性細胞的比例為70%程度(圖5C-E)。且，由連續切片之解析，可確認在倒立顯微鏡之亮視野的形態觀察中可判斷神經組織之區域為Nestin陽性、TuJ1陽性、及PSA-NCAM陽性(圖5C-E)。由該結果得知，將無飼養所培養的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質進行前置處理後，在步驟3可有效率地製造神經組織。
實施例7：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻 礙物質進行前置處理，在步驟3作為誘導分化劑使用BMP信號傳達途徑作用物質之自人類iPS細胞的網膜組織之形成例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)之存在下(步驟1：前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)。浮游培養開始後第2天為止，在進行前置處理之條件下，形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，加入未含有Y27632之無血清培養基50μl。
於此作為步驟3，以以下條件1、條件2進行 培養。作為條件1(+BMP)，於浮游培養開始後第6天，於含有未含Y27632的人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基，進行培養基交換至外來性人類重組BMP4的最終濃度成為1.5nM(55ng/ml)(圖6B，D)。作為條件2(-BMP)，於浮游培養開始後第6天，以未含有未含Y27632的BMP信號傳達途徑作用物質之培養基，在未添加外來性人類重組BMP4之條件下，進行半量培養基交換(圖6A，C)。
浮游培養開始後第6天以後，2~4天一次，以未含Y27632、及人類重組BMP4的前述無血清培養基進行半量培養基交換。於浮游培養開始後第23天以倒立顯微鏡觀察形態時，得知將經前置處理的iPS細胞作為起始原料的本實施例中，維持細胞凝集體，且形成神經組織。
將如此所調製的在步驟1進行前置處理的iPS細胞作為起始原料所製作的浮游培養開始後第23天之細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司，綿羊)、或網膜組織標示物之1的Rx(抗Rx抗體、Takara公司、豚鼠)進行免疫染色。將這些經免疫染色的切片，使用倒立型螢光顯微鏡進行觀察。其結果，得知於步驟1以BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理，於步驟3自未添加BMP4的條件所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Rx陽性細胞的比例未達10%(Rx強陽性(對應網膜)為未達3%，Rx弱陽性(對應網膜以外的神經組織)為未達7%)，且Chx10陽性細胞的比例亦未達 3%(圖6A，C)。另一方面，得知於步驟1以BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理，於步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Rx陽性細胞的比例為60%程度，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為60%程度(圖6B，D)。且由連續切片之解析得知對於Chx10陽性細胞的比例高之(95%程度)神經組織，Rx亦為強陽性(圖6B，D)。該結果得知，於步驟1在進行前置處理的條件下形成神經組織，且在步驟3於浮游培養中作為誘導分化物質添加BMP信號傳達途徑作用物質後，自經無飼養培養的人類iPS細胞(以下亦稱為無飼養人類iPS細胞)可有效率地製造網膜組織。
實施例8：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質或Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質之自無飼養人類iPS細胞的神經組織之形成例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)、LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)或SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下(前置處理)或者非存在下(步驟1：無前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，以下條件1、2之2條件下進行培養。作為條件1(+SAG)，於浮游培養開始時於前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)(圖7B-D，F-H、‘+SAG’)。作為條件2(-SAG)，在浮游培養開始時，於前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)，不添加SAG(圖7A，E、‘-’)。至浮游培養開始後第2天為止，在任何條件下亦形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。浮游培養開始後，於第3天加入未含有Y27632及SAG的無血清培養基50μl。
於浮游培養開始後第6天，使用未含Y27632及SAG，含有或未含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基，進行培養基交換至成為含有外來性人類重組BMP4的最終濃度至1.5nM的培養基(圖7E-H)、或未添加BMP信號傳達途徑作用物質之培養基(圖7A-D)。浮游培養開 始後第6天以後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4的前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製的細胞於浮游培養開始後第23天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖7)。且，將浮游培養開始後第23天之細胞凝集體的形態，以實施例6記載之方法進行定量(圖7I)。其結果，得知在步驟1未進行前置處理，在步驟2無添加SAG的條件下，細胞凝集體會崩壞，且不會形成神經組織(圖7A，E)。另一方面，得知於步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542)、BMPR阻礙劑(LDN193189)、或Shh信號傳達途徑作用物質進行前置處理，於步驟2在添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件下，形成細胞凝集體，可有效率地形成神經組織(圖7B-D，F-I)。
且，將前述以TGFβR阻礙劑(SB431542)或BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理的iPS細胞作為起始原料所製作的浮游培養開始後第23天之細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於神經組織標示物(神經系前驅細胞)之1的Nestin(抗Nestin抗體、Millipore公司、老鼠)、神經組織標示物(神經元)之1的TuJ1(抗βIII-tubulin抗體、Promega公司、老鼠)、或神經組織標示物之1的PSA-NCAM(抗PSA-NCAM抗體、Millipore公司、老鼠IgM)進行免疫染色。將這些經免疫染色的切片，使用倒立型螢光 顯微鏡進行觀察。其結果，得知TGFβR阻礙劑(SB431542)或在以BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理的條件所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Nestin陽性細胞的比例為20%程度，全細胞中之TuJ1陽性細胞的比例亦為70%程度，而PSA-NCAM陽性細胞的比例為70%程度(圖8A-F)。且，由連續切片之解析可確認，由以亮場圖像之形態觀察可判斷為神經組織之區域為Nestin陽性、TuJ1陽性、及PSA-NCAM陽性(圖8A-F)。
由這些結果可得知，在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質或Shh信號傳達途徑作用物質進行前置處理，且在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件下，在步驟3添加或不添加BMP信號傳達途徑作用物質之條件下，皆可有效率地自無飼養人類iPS細胞製造出神經組織。
實施例9：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3作為誘導分化劑使用BMP信號傳達途徑作用物質之自無飼養人類iPS細胞的網膜組織之形成例
在實施例8記載之方法中，作為無飼養培養基使用StemFit培養基的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβR阻礙物質(SB431542)或BMPR阻礙物質(LDN193189，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3於添加或不添加BMP信號傳達途徑作用物 質的條件下，調製出細胞凝集體。這些所有條件所形成的浮游培養開始後第23天之細胞凝集體，形成神經組織。將前述細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司，綿羊)、或網膜組織標示物之1的Rx(抗Rx抗體、Takara公司、豚鼠)進行免疫染色，並以螢光顯微鏡觀察。其結果，得知於步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542)或BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，於步驟3未添加BMP4的條件下所製作之細胞凝集體中，全細胞中的Rx陽性細胞的比例為未達10%(Rx強陽性(對應網膜)為未達3%，Rx弱陽性(對應網膜以外之神經組織)為未達7%)，且Chx10陽性細胞的比例亦未達3%(圖9A，C，E，G)。另一方面，於步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542)進行前置處理，於步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，於步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中的Rx陽性細胞的比例為80%以上，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例亦為70%以上(圖9B，F)。又，得知在步驟1以BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中的Rx陽性細胞的比例為50%以上，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為40%以上(圖9D，H)。且，得知由連續切片之解析可確認Chx10亦為陽性細胞的比例高(95%以 上)之神經組織中，其為Rx強陽性(圖9B，D，F，H)。
由這些結果得知，在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質進行前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3作為浮游培養中誘導分化物質添加BMP信號傳達途徑作用物質後，可自無飼養人類iPS細胞有效率地製造網膜組織。
實施例10：作為無飼養培養基使用Essential 8培養基的將人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之細胞凝集體的形成例
人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)依據「Scientific Reports,4,3594(2014)」所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Essential 8培養基(Life technologies公司製之Nature Methods,8,424-429(2011))，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
作為具體之維持培養操作，首先成為亞融合(培養面積之6成被細胞包覆的程度)之人類iPS細胞(1231A3株)以PBS洗淨後，使用TrypLE Select(Life Technologies)分散為單一細胞。其後，將前述分散為單一細胞的人類iPS細胞，播種於以Laminin511-E8塗布的塑質培養皿(Iwaki公司製)，Y27632(10μM,ROCK阻礙物質)存在下，以Essential 8培養基進行無飼養培養。作為前述塑質培養皿，使用6孔板(Iwaki公司製之培養面積 9.4cm2)時，前述經分散為單一細胞的人類iPS細胞之播種細胞數為6 x 103。於播種後1天，以未含Y27632的Essential 8培養基交換。其後，於播種後6天，培養至亞融合(培養面積之6成被細胞包覆的程度)。
作為前置處理操作，首先將成為亞融合之人類iPS細胞(1231A3株)以PBS洗淨後，使用TrypLE Select(Life Technologies)分散為單一細胞。其後，將前述分散為單一細胞的人類iPS細胞，播種於以Laminin511-E8塗布的塑質培養皿(Iwaki公司製)，Y27632(10μM,ROCK途徑阻礙物質)存在下，以Essential 8培養基進行無飼養培養。作為前述塑質培養皿，使用6孔板(Iwaki公司製之細胞培養用、培養面積9.4cm2)時，前述分散為單一細胞之人類iPS細胞的播種細胞數為6 x 103。於播種後1天，以未含Y27632的Essential 8培養基交換。其後，播種後5天，培養至亞融合前1天(培養面積之5成由細胞所覆蓋的程度)。將前述經無飼養培養的亞融合前1天的人類iPS細胞在SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)、LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)、或TGFβR及BMPR2重阻礙(SB431542為5μM、及LDN193189為100nM)之存在下(步驟1：前置處理)、或者非存在下(步驟1：未經前置處理，對照組)，進行1天無飼養培養。得知將培養的細胞使用倒立顯微鏡(基恩士公司)，進行亮視野觀察後，在無飼養培養中以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙劑進行處理，對於人類iPS細胞的形態亦無大影響。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，以下條件1、2之2條件下進行培養。作為條件1(+SAG)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)(圖10C，F，H，J，L，N“+SAG”)。作為條件2(-SAG)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)，未添加SAG(圖10A，B，D，E，G，I，K，M“-”)。浮游培養開始後第2天為止，任一條件下亦形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。浮游培養開始後第3天加入未含有Y27632及SAG的無血清培養基50μl。
於浮游培養開始後第6天，使用未含有Y27632及SAG，含有或未含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基進行培養基交換至外來性人類重組BMP4之 最終濃度為1.5nM之培養基(圖10D-F)、或成為未含有BMP信號傳達途徑作用物質之培養基(圖10K-N)。浮游培養開始後第6天以後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4的前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此調製的細胞在浮游培養開始後第7天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖10)。其結果，得知在步驟1未進行前置處理，在步驟2未添加SAG的條件下，細胞凝集體會崩壞，未形成神經組織(圖10A)。而已知於步驟1進行前置處理的條件下，在步驟2未添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件下，在步驟2未添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件下，皆形成細胞凝集體(圖10)。即，得知即使作為無飼養培養基使用Essential 8培養基之情況下，藉由在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之前置處理，自人類iPS細胞所形成的細胞凝集體的形態會變的良好。
實施例11：作為無飼養培養基使用Essential 8培養基的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質之神經組織的形成例
以實施例10記載的方法，作為無飼養培養使用Essential 8培養基之人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβR阻礙物質(SB431542)，在步驟2使用Shh信 號傳達途徑作用物質調製出細胞凝集體。將浮游培養開始後第18天之前述細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於神經組織標示物(神經系前驅細胞)之1的Nestin(抗Nestin抗體、Millipore公司、老鼠)、神經組織標示物(神經元)之1的TuJ1(抗βIII-tubulin抗體、Promega公司、老鼠)、或神經組織標示物之1的PSA-NCAM(抗PSA-NCAM抗體、Millipore公司、老鼠IgM)進行免疫染色，以螢光顯微鏡進行觀察。其結果，得知前述細胞凝集體中，全細胞中之Nestin陽性細胞的比例為30%程度，全細胞中之TuJ1陽性細胞的比例亦為70%程度，而PSA-NCAM陽性細胞的比例為70%程度(圖11)。且，由連續切片之解析可確認，由以亮場圖像之形態觀察可判斷為神經組織之區域為Nestin陽性、TuJ1陽性、及PSA-NCAM陽性(圖11)。即，得知在步驟1以TGFβR阻礙物質進行前置處理，在步驟2添加SAG之條件下所製作的細胞凝集體，可有效率地形成神經組織。
實施例12：作為無飼養培養使用Essential 8培養基的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3使用BMP信號傳達途徑作用物質之網膜組織的形成例
在實施例10記載之方法中，作為無飼養培養使用 Essential 8培養基的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβR阻礙物質(SB431542)，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加或無添加BMP信號傳達途徑作用物質的條件下，調製出細胞凝集體。將浮游培養開始後第18天的前述細胞凝集體各以4%對甲醛進行固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司，綿羊)、或網膜組織標示物之1的Rx(抗Rx抗體、Takara公司、豚鼠)進行免疫染色，以螢光顯微鏡觀察。其結果，得知在步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542)進行前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3未添加BMP4的條件所製作的細胞凝集體中，全細胞中的Rx陽性細胞的比例為未達10%(Rx強陽性(對應網膜)為未達3%、Rx弱陽性(對應網膜以外的神經組織)為未達7%)，Chx10陽性細胞的比例亦未達3%(圖12)。另一方面，得知在步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542)進行前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Rx強陽性細胞的比例為30%以上，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為20%以上(圖12)。且，由連續切片之解析可確認Chx10的陽性細胞的比例為高(95%以上)之神經組織中，其為Rx強陽性。由該結果得知，將作為無飼養培養使用Essential 8培養基的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβR阻礙物質，在步驟2使用Shh 信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質之條件下可製造網膜組織。
實施例13：作為無飼養培養基使用StemFit的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3使用BMP信號傳達途徑作用物質之網膜組織的形成例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基一直到亞融合前1天為止進行無飼養培養。在將該亞融合前1天的人類iPS細胞，SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下，進行1天無飼養培養(步驟1、前置處理：TGFβRi+SAG處理)。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基中添加 Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)。於浮游培養開始後第2天為止的1天，形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。此後，於步驟3在下述條件1~3下進行培養。
條件1.於浮游培養開始後第3天加入未含Y27632、SAG及BMP信號傳達途徑作用物質的無血清培養基50μl。浮游培養開始後第6天以後，於3天一次，以未含Y27632、SAG及BMP信號傳達途徑作用物質之前述無血清培養基，進行半量培養基交換(體積之一半量，即丟棄75μl，加入未含Y27632、SAG及BMP信號傳達途徑作用物質的前述無血清培養基75μl)。
條件2.於浮游培養開始後第3天，加入未含Y27632及SAG，使人類重組BMP4之最終濃度到達1.5nM之無血清培養基。浮游培養開始後第6天以後，3天一次，以未含Y27632、SAG及BMP作用物質的前述無血清培養基，進行半量培養基交換(體積之一半量，即丟棄75μl，加入未含有Y27632、SAG及BMP信號傳達途徑作用物質之前述無血清培養基75μl)。
條件3.於浮游培養開始後第3天，加入未含Y27632、SAG及BMP信號傳達途徑作用物質之無血清培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，加入未含有Y27632及SAG，使人類重組BMP4的最終濃度至1.5nM的無血清培養基。浮游培養開始後第6天以後，3天一次，以未含有Y27632、SAG及BMP作用物質之前述無血 清培養基，進行半量培養基交換(體積之一半量，即丟棄75μl，加入未含有Y27632、SAG及BMP信號傳達途徑作用物質之前述無血清培養基75μl)。
以上述條件1~3進行培養後，即使在浮游培養開始後第26天，任一條件下亦形成細胞凝集體，形成神經組織。將前述浮游培養開始後第26天之細胞凝集體，各以4%對甲醛進行固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司，綿羊)進行免疫染色。其結果，得知條件1的細胞凝集體為全細胞中之Chx10陽性細胞的比例未達3%(圖13左)。另一方面，條件2及條件3之細胞凝集體中，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例為60%以上(圖13中、右)。由該結果得知，在步驟1使用TGFβR阻礙物質(SB431542)及Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質的條件下，可製造網膜組織。
實施例14：步驟2中之播種細胞數的檢討(作為無飼養培養基使用StemFit的人類iPS細胞作為起始原料使用，在步驟1使用TGFβ信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質)
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，SB431542(TGFβR阻礙 劑、5μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下，進行1天無飼養培養(步驟1、前置處理：TGFβRi+SAG處理)。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散為單一細胞。其後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中，在以下4條件，即0.4 x 104、0.8 x 104、1.2 x 104、或1.6 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10%KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質，300nM)。於浮游培養開始後第2天為止1天，形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。此後，於步驟3，於浮游培養開始後第3天加入未含Y27632及SAG，使人類重組BMP4的最終濃度至1.5nM的無血清培養基。浮游培養開始後第6天以後，2~4天一次，以未含Y27632、SAG及BMP作用物質之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
浮游培養開始後第18天中任一條件下皆形成 細胞凝集體，形成神經組織(圖14上段)。將前述浮游培養開始後第18天之細胞凝集體，各以4%對甲醛進行固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司，綿羊)、或網膜組織標示物之1的Rx(抗Rx抗體、Takara公司、豚鼠)進行免疫染色，以螢光顯微鏡進行觀察。其結果，得知所有播種細胞數(0.4 x 104、0.8 x 104、1.2 x 104、或1.6 x 104細胞)為全細胞中之Chx10陽性細胞的比例為20%以上(圖14中、右)。特別為播種細胞數在0.8 x 104、或1.2 x 104細胞的條件下，特別以Chx10陽性細胞的比例為高。有關Rx陽性細胞的比例，亦為與Chx10之同樣結果。由該結果得知，步驟2中之播種細胞數在0.4 x 104~1.6 x 104細胞的條件下皆可製造網膜組織。
實施例15：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之Lefty，在步驟2作為Shh信號傳達途徑作用物質使用SAG的自無飼養人類iPS細胞之神經組織的形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
以實施例1所記載的方法，將人類iPS細胞 (1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。其後，下述3條件下1天無飼養培養。
．條件1.人類重組Lefty-A(Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質、R&D公司製之Lefty-A C-terminus、20μg/ml)
．條件2.人類重組Lefty-A(Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質、R&D公司製之Lefty-A C-terminus,20μg/ml)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)
．條件3.外來性之TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質非存在下(無前置處理條件)
將如此調製之前述條件1-3的人類iPS細胞，使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)中，以每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，在以下條件1、2之2條件下進行培養。作為條件1(+SAG)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基 添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)。作為條件2(-SAG)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)，但未添加SAG。至浮游培養開始後第2天為止，所有條件皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，使外來性人類重組BMP4的最終濃度成為1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，以未含Y27632、SAG、及人類重組BMP4之無血清培養基進行半量培養基交換。其後，於2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製的細胞於浮游培養開始後第18天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製)，進行亮視野觀察(圖15)。其結果，得知於步驟1未經前置處理，在步驟2未添加SAG的條件下，細胞凝集體會崩壞，未形成神經組織(圖15、A)。另一方面，得知在步驟1以Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質、或Nodal/Activin 信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質進行前置處理，在步驟2添加或不添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件下，形成細胞凝集體，且有效率地形成神經組織(圖15、B，C，D)。
由這些結果得知，在步驟1使用作為TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質的Nodal/Activin信號傳達途徑 阻礙物質之Lefty進行前置處理的條件下，由無飼養人類iPS細胞形成品質高的凝集體，神經上皮之製造效率為佳。
實施例16：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之A83-01，在步驟2作為Shh信號傳達途徑作用物質使用SAG之自無飼養人類iPS細胞的神經組織及網膜組織之形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將以實施例15記載之方法所調製的亞融合1天前之人類iPS細胞在A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)之存在下(前置處理)或者非存在下(步驟1：無前置處理)下，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中， 使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，藉由以下條件1、2之2條件進行培養。作為條件1(+SAG)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、最終濃度30nM)。作為條件2(-SAG)，於浮游培養開始時於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)，未添加SAG。直到浮游培養開始後第2天為止，任何條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度到1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4的無血清培養基進行半量培養基交換。其後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製之細胞在浮游培養開始後第20天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製)進行亮視野觀察(圖16、A-B)。其結果，得知於步驟1未經過前置處理，在步驟2未添加SAG的條件下，細胞凝集體崩壞，神經組織未形成(圖16、A)。另一方面，得知在步驟1以A83-01進行前置處理，在步驟2添加SAG之條件下，形成細 胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖16、B)。
將浮游培養開始後第20天之細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司製，綿羊)進行免疫染色，使用螢光顯微鏡觀察。其結果，得知在步驟1以A83-01進行前置處理，在步驟2添加SAG時，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例為20%程度(圖16、C)。
由這些結果得知，在步驟1以作為TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質的TGFβR阻礙劑之A83-01進行前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件下可製造網膜組織。
實施例17：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之A83-01、或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(A83-01)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、嘌嗎啡胺、或人類重組Shh中任一)的組合，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，自無飼養人類iPS細胞的神經組織之形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將以實施例15記載的方法所調製的亞融合1天前之人類iPS細胞以下述6條件下進行1天無飼養培養。
．條件1. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)
．條件2. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)及SAG(Enzo公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)
．條件3. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)及嘌嗎啡胺(Wako公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、0.2μM)
．條件4. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)及人類重組Shh(R&D公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、50ng/ml)
．條件5. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑0.5μM)及人類重組Shh(R&D公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、300ng/ml)
．條件6.外來性TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質非存在下(無前置處理條件)
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細 胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，藉由以下條件(A)、(B)之2條件進行培養。作為條件(A)(+SAG)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、30nM)。作為條件(B)(-SAG)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)，未添加SAG。
直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未添加Y27632、SAG、嘌嗎啡胺、人類重組Shh，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，以未含Y27632、SAG、嘌嗎啡胺、人類重組Shh、及人類重組BMP4之無血清培養基，進行半量培養基交換。其後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、嘌嗎啡胺、人類重組Shh、及人類重組BMP4之、前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製之細胞於浮游培養開始後第20 天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製)，進行亮視野觀察(圖17)。其結果，得知作為前述條件6，在步驟1未經前置處理，在步驟2未添加SAG的條件下，細胞凝集體崩壞，神經組織未形成(圖17、A)。另一方面，得知作為前述條件1-5，在步驟1使A83-01及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、PMA、人類重組Shh 50ng/ml、人類重組Shh 300ng/ml)起作用，在步驟2添加SAG的條件(條件(A)(+SAG))下，形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖17、B-F)。
由這些結果得知，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(A83-01)、或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(A83-01)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、PMA、人類重組Shh中任一)進行前置處理之條件下，自以無飼養所培養的人類iPS細胞可有效率地製造神經組織。
實施例18：在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、嘌嗎啡胺、或人類重組Shh中任一)之自無飼養人類iPS細胞的網膜組織之形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將以實施例15記載之方法所調製的亞融合1天前的人類iPS細胞，在A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑0.5μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下(前置處理)或者非存在下(步驟1：無前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
使用在步驟1所得之細胞，作為步驟2以以下條件開始浮游培養。即使在所有條件下，使用添加Y27632(最終濃度20μM)之前述無血清培養基。
．條件1.添加SAG(Enzo公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、30nM)。
．條件2.添加嘌嗎啡胺(Wako公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、0.2μM)。
．條件3.添加人類重組Shh(R&D公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、300ng/ml)。
．條件4.於浮游培養開始時未添加外來性Shh信號傳達途徑作用物質
直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632、SAG、嘌嗎啡胺、人類重組Shh，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，以未含有Y27632、SAG、嘌嗎啡胺、人類重組Shh、人類重組BMP4之無血清培養基，進行半量培養基交換。其後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製之細胞於浮游培養開始後第20天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖18、A-E)。其結果，得知在步驟1未進行前置處理，在步驟2未添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件(前述條件4下，細胞凝集體崩壞，神經組織未形成(圖18、A)。另一方面，得知在步驟1以A83-01及SAG進行前置處理，在步驟2未加入外來性Shh信號傳達途徑作用物質之條件、或作為Shh信號傳達途徑作用物質加入SAG、嘌嗎啡胺(PMA)、或人類重組Shh中任一者之條件下，形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖18、B-E)。
由這些結果得知，在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質進行前置 處理，於浮游培養開始時加入作為Shh信號傳達途徑作用物質之SAG、嘌嗎啡胺、或人類重組Shh之任一者之條件下，自無飼養人類iPS細胞可有效率地製造神經組織。
將浮游培養開始後第20天之細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司製，綿羊)進行免疫染色，使用螢光顯微鏡觀察。其結果，得知在步驟1以A83-01及SAG進行前置處理，在步驟2未添加外來性Shh信號傳達途徑作用物質的條件下，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例為40%程度(圖18、F)。另一方面，得知在步驟1以A83-01及SAG進行前置處理，於浮游培養開始時加入作為Shh信號傳達途徑作用物質的SAG、嘌嗎啡胺、或人類重組Shh中任一者的條件下，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例為90%程度(圖18、G-I)。
由這些結果得知，在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質進行前置處理，在步驟2加入作為Shh信號傳達途徑作用物質的SAG、嘌嗎啡胺、或人類重組Shh中任一者的條件下，自無飼養人類iPS細胞可有效率地製造網膜組織。
實施例19：在步驟1使用作為TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之SB431542及作為Shh信號傳達途徑作用物質之嘌嗎啡胺，在步驟2使用作為Shh信號傳達途徑作用 物質的嘌嗎啡胺之自無飼養人類iPS細胞的網膜組織之形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將以實施例15記載之方法所調製的亞融合第1天前之人類iPS細胞在SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)及嘌嗎啡胺(PMA；Shh信號傳達途徑作用物質、0.02μM或0.2μM)之存在下(前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(20μM)及嘌嗎啡胺(Wako公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、 0.2μM或2μM)(圖19)。直到浮游培養開始後第2天為止，形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未含Y27632及嘌嗎啡胺，含有人類重組BMP4(R&D公司製)的培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，以未含Y27632、嘌嗎啡胺、及人類重組BMP4的無血清培養基，進行半量培養基交換。其後，2~4天一次，以未含Y27632、嘌嗎啡胺、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
於將如此所調製之細胞在浮游培養開始後第17天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製)，進行亮視野觀察(圖19、A-D)。其結果，得知在步驟1以SB431542及嘌嗎啡胺(0.02μM或0.2μM)進行前置處理，在步驟2添加嘌嗎啡胺(0.2μM或2μM)之條件下，所有嘌嗎啡胺濃度中皆形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖19、A-D)。
將浮游培養開始後第17天之細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司製之綿羊)進行進行免疫染色。將這些經免疫染色的切片，使用倒立型螢光顯微鏡進行觀察。其結果，得知在步驟1以SB431542及嘌嗎啡胺(0.02μM或0.2μM)進行前置處理，在步驟2添加嘌嗎啡胺(0.2μM或2μM)的條件下，即使在所有嘌嗎啡胺濃度中，全細胞中的Chx10陽性 細胞的比例為60%程度(圖19、E-H)。
由這些結果得知，在步驟1以作為TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質使用SB431542及作為Shh信號傳達途徑作用物質使用嘌嗎啡胺進行前置處理，於浮游培養開始時加入Shh信號傳達途徑作用物質(嘌嗎啡胺)之條件下，自無飼養人類iPS細胞可有效率地製造網膜組織。
實施例20：在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質、或TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質與Shh信號傳達途徑作用物質之組合，進行1、2、或3天前置處理，自無飼養人類iPS細胞的神經組織之形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將前述人類iPS細胞以下述6條件進行無飼養培養。
．條件1. SAG(Enzo公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)48小時
．條件2. SAG(Enzo公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)72小時
．條件3. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)及SAG(Enzo公司製之Shh信號傳達途徑作用物 質、300nM)24小時
．條件4. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)及SAG(Enzo公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)48小時
．條件5. A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)及SAG(Enzo公司製之Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)72小時
．條件6.在外來性TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質非存在下(無前置處理條件)
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板、住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，藉由以下條件(A)、(B)之2條件進行培養。作為條件(A)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、30nM)。作為條件(B)，於浮游培養開始時，於前 述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)，未添加SAG。直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4之無血清培養基進行半量培養基交換。其後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
於將如此所調製之細胞在浮游培養開始後第17天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖20、A-J)。其結果，得知在步驟1未進行前置處理，於步驟2未添加SAG之條件下，細胞凝集體崩壞，未形成神經組織(圖20、A)。另一方面，得知在步驟1以SAG進行48或72小時前置處理，在步驟2添加或未添加SAG的條件(A)之條件(B)下，形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖20、B-D)。又，於步驟1以A83-01及SAG進行24、48或72小時前置處理，在步驟2添加SAG之條件(A)及未添加之條件(B)中，形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖20、E-J)。
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行48或72小時前置處理之條件、及在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達 途徑作用物質進行24、48或72小時前置處理之條件下，自無飼養人類iPS細胞可效率地製造神經組織。
實施例21：在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行24、48、72、96、120或144小時前置處理，其中於最後24小時，在TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質之共存下進行前置處理之自無飼養人類iPS細胞的神經組織之形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將該人類iPS細胞在SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下(前置處理)，開始進行無飼養培養。在SAG存在下的培養繼續24、48、72、96、120或144小時，最後的24小時，在A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑、0.5μM)及SAG之共存下培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進 行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，藉由以下條件(A)、(B)的2條件下進行培養。作為條件(A)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、30nM)。作為條件(B)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)，未添加SAG。直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。在浮游培養開始後第3天加入未含有Y27632及SAG之無血清培養基50μl。
浮游培養開始後第6天以後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製之細胞於浮游培養開始後，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製)，進行亮視野觀察。其結果，得知在步驟1以SAG進行24~144小時，且最後之24小時在A83-01與SAG共存下進行前置處理之條件中，所有條件下細胞凝集體皆成長，且有效率地形成神經組織(圖21、A-L)。
由這些結果得知，在步驟1之Shh信號傳達 途徑作用物質的前置處理之期間為24~144小時中任一條件下，自無飼養人類iPS細胞皆可效率地製造神經組織。
實施例22：在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行2天前置處理，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加1次或者複數次之BMP作用物質的自無飼養人類iPS細胞之網膜組織的形成例
將人類iPS細胞(Ff-I01株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將該亞融合2天前之人類iPS細胞，在SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下(前置處理)進行2天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞，使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)(圖22)。直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。浮游培養開始後第3天以後，在以下之條件1-3之3條件下添加BMP4。
．條件1.於(+BMP4 1次添加)浮游培養第3天，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度成1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。浮游培養開始第6天以後，以未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4的無血清培養基進行半量培養基交換。
．條件2.於(+BMP4 2次添加)浮游培養第3天，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度到1.5nM(55ng/ml)，加入未含Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始第6天除去培養基50μl，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度維持在1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。浮游培養開始第9天後，進行未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4之無血清培養基的半量培養基交換。
．條件3.於(+BMP4 3次添加)浮游培養第3天，欲使 外來性人類重組BMP4的最終濃度到1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。浮游培養開始第6天及第9天，除去培養基50μl，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度維持在1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。浮游培養開始1第2天以後，進行未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4之無血清培養基的半量培養基交換。
其後，2~4天一次，進行未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4之前述無血清培養基的半量培養基交換。
將如此所調製之細胞於浮游培養開始後第16天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製)，進行亮視野觀察(圖22、A-C)。其結果，得知將BMP4添加1、2、及3次之各條件下，細胞凝集體成長，且有效率地形成神經組織(圖22、A-C)。
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)進行2天前置處理，在步驟3將BMP信號傳達途徑作用物質添加1、2或3次之條件下，自無飼養人類iPS細胞可效率地製造神經組織。
將浮游培養開始後第16天的細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司製，綿羊)進行免疫染色。將這些經免疫染色之切片，使用螢光顯微鏡觀察。其結果，得知將BMP4進行1 次添加之條件下，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例為60%程度，經2次或3次添加之條件下為80%程度(圖22、D-F)。
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)進行2天前置處理，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質1、2或3次之條件(即，BMP信號傳達途徑作用物質之濃度(1.5nM)維持在3、6、9天之條件)下，自無飼養人類iPS細胞可有效率地製造網膜組織。
實施例23：在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行2天前置處理，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3將BMP4添加1.5nM或5nM之自無飼養人類iPS細胞的網膜組織之形成例
將人類iPS細胞(Ff-I01株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將亞融合2天前的人類iPS細胞，在SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下(前置處理)進行2天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作 分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、1000nM)。直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。
於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)、或成為5nM(183ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天除去培養基50μl，欲維持外來性人類重組BMP4的最終濃度於1.5nM(55ng/ml)、或5nM(183ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。其後，2~4天一次，進行未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4之前述無血清培養基的半量培養基交換。
將如此所調製之細胞於浮游培養開始後第16 天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製)，進行亮視野觀察。其結果，得知將BMP4以1.5nM及5nM添加之各條件下，形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖23、A，B)。
將浮游培養開始後第16天的細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司製，綿羊)進行免疫染色，使用螢光顯微鏡觀察。其結果，得知欲將BMP4之最終濃度成為1.5nM，以二次添加條件下，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例為70%程度(圖23、C)。又，得知欲使BMP4之最終濃度成5nM，在二次添加條件下，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例為80%程度(圖23、D)
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行2天前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3將BMP4以1.5nM或5nM經2次添加之條件(即，BMP信號傳達途徑作用物質之濃度(1.5nM或5nM)維持6天的條件)下，可有效率地製造網膜組織。
實施例24：在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(A83-01)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、30nM、300nM、500nM、或1000nM)進行1天前置處理，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)之字無飼 養人類iPS細胞的神經組織之形成例
將人類iPS細胞(Ff-I01株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將亞融合1天前之人類iPS細胞，A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑0.5μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、30nM、300nM、500nM、或1000nM)之存在下(前置處理)，進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)。直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞 凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天除去培養基50μl，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度維持在1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。其後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製之細胞於浮游培養開始後第17天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察(圖24)。其結果，得知在步驟1以A83-01、及SAG(30~1000nM之濃度範圍)進行前置處理，在步驟2添加SAG的條件下，形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖24、A-D)。
由這些結果得知，在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(A83-01)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、30nM~1000nM之濃度範圍)進行前置處理之條件下，自無飼養人類iPS細胞可效率地製造神經組織。
實施例25：在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(A83-01)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)進行1天前置處理，在步驟2將Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)使用30nM、300nM、500nM、或1000nM之濃度的 自無飼養人類iPS細胞的神經組織之形成例
將人類iPS細胞(Ff-I01株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
將亞融合1天前之人類iPS細胞，以A83-01(Wako公司製之TGFβR阻礙劑0.5μM)及、SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、1000nM)之存在下(前置處理)進行1天無飼養培養。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加、10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、30nM、300nM、500nM、1000nM)(圖25)。直到浮游培養開始後 第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。
於浮游培養開始後第3天，與使外來性人類重組BMP4(R&D公司製)的最終濃度到1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632及SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。
於浮游培養開始後第6天，進行未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4之無血清培養基的半量培養基交換。其後，2~4天一次，進行未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4之前述無血清培養基的半量培養基交換。
將如此所調製之細胞於浮游培養開始後第17天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察。其結果，得知在步驟1以A83-01及SAG進行前置處理，在步驟2將SAG以30nM、300nM、500nM、或1000nM之濃度添加的條件下，形成細胞凝集體，有效率地形成神經組織(圖25、A-D)。
由這些結果得知，在步驟1以TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質(A83-01)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)進行前置處理，在誘導分化開始時，將SAG自30至1000nM之濃度範圍下添加時，自無飼養人類iPS細胞可效率地製造神經組織。
實施例26：使用血凝日本的病毒建構，將經無飼養 培養的人類iPS細胞作為起始原料使用，於步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟3使用BMP信號傳達途徑作用物質之自人類iPS細胞的網膜組織之製造例
人類iPS細胞(DSPC-3株、由大日本住友製藥所建構)可使用市售的血凝日本的病毒載體(Oct3/4、Sox2、KLF4、c-Myc的4因子、DNAVEC公司(現、ID Pharma公司)製Site Tune套組)，亦可使用Life Technologies公司之公開協議(iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit、Publication Number MAN0009378、Revision 1.0)、及京都大學之公開協議(人類iPS細胞的建構．維持培養、CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310、http：//www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)所記載的方法之同時，使用StemFit培養基(AK03；味之素公司製)、Laminin511-E8(Nippi公司製)進行建構。
將該人類iPS細胞(DSPC-3株)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
以實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(DSPC-3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，在下述3條件下，進行1天無飼養培養。
．條件1. SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)(圖26、B，C，F，G)
．條件2. LDN193189(BMP信號傳達途徑阻礙物質、100nM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)(圖26、D，E，H，I)
．條件3.外來性TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質非存在下(圖26、A)
將如此調製的條件1-3之人類iPS細胞，使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，再藉由移液操作分散為單一細胞。其後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(Sumilon橢球體V底平板PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基加入Y27632(20μM)，再加入作為外來性Shh信號傳達途徑作用物質的SAG之條件(最終濃度30nM)、或使用不加入SAG之條件的無血清培養基。於浮游培養開始後第2天，形成細胞凝集體。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入不 含Y27632與SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，進行未含有Y27632、SAG及人類重組BMP4之無血清培養基的半量培養基交換。其後，2~4天一次，以不含Y27632、SAG、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製的細胞凝集體，於浮游培養開始後第22天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製之BIOREVO)進行亮視野觀察(圖26、A-E)。其結果，得知無前置處理條件(條件3)中細胞凝集體並無成長，並未形成神經上皮(圖26、A)。另一方面，得知在步驟1以SB431542及SAG、或LDN193189及SAG進行前置處理之條件(條件1，2)中細胞凝集體有成長，形成神經上皮(圖26、B-E)。
將如此所調製之細胞凝集體，於浮游培養開始後第22天，各以4%對甲醛進行固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司、綿羊)進行免疫染色，以螢光顯微鏡(基恩士公司公司製之BIOREVO)進行觀察。
其結果，得知首先在步驟1以SB431542及SAG進前置處理，在步驟2未添加SAG，在步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為90%程度(圖26、F)。又，於 步驟1以SB431542及SAG進行前置處理，在步驟2添加SAG，在步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為70%程度(圖26、G)。即，得知在步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542)及Shh信號傳達途徑作用物質進行前置處理，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質之條件下，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質之條件下或不添加的條件下，皆可製造網膜組織。
且得知在步驟1以LDN193189及SAG進行前置處理，在步驟2未添加SAG，在步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為90%程度(圖26、I)。又，得知在步驟1以LDN193189及SAG進行前置處理，在步驟2添加SAG，在步驟3添加BMP4的條件下所製作的細胞凝集體中，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例亦為60%程度(圖26、H)。即，得知在步驟1以BMPR阻礙劑(LDN193189)及Shh信號傳達途徑作用物質進行前置處理，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質之條件下，在步驟2之添加或不添加Shh信號傳達途徑作用物質的條件下，皆可製造網膜組織。
由這些結果得知，在步驟1添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質後，製造血凝日本的病毒，將經無飼養培養的人類iPS細胞作為起始原料， 製造網膜組織。
實施例27：將經無飼養培養的人類ES細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3使用BMP信號傳達途徑作用物質之自人類iPS細胞的網膜組織之製造例
將Rx：：GFP敲入人類ES細胞(來自KhES-1株；Cell Stem Cell,2012,10(6)771-785)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養(圖27、A)。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
以實施例1所記載的方法將人類ES細胞(Rx：：GFP株)使用StemFit培養基，進行無飼養培養至亞融合1天前為止。將亞融合1天前之人類iPS細胞，在下述3條件下，進行1天無飼養培養。
．條件1. SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、30nM)(圖27、C，E)
．條件2. LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、30nM)(圖27、D，F)
．條件3.外來性之TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質非存在下(圖27、B)
將如此調製之條件1-3的人類ES細胞使用 TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散為單一細胞。其後，將分散為前述單一細胞之人類ES細胞在非細胞接著性之96穴培養平板(Sumilon橢球體V底平板PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加、10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
在條件3之無前置處理條件，於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基加入Y27632(20μM)，再使用未加入外來性Shh信號傳達途徑作用物質的條件之無血清培養基。
在條件1及2，於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基加入Y27632(20μM)，再使用作為外來性Shh信號傳達途徑作用物質加入SAG之條件(最終濃度30nM)的無血清培養基(圖27)。於條件1-3中任一皆於浮游培養開始後第2天，形成細胞凝集體。於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未含Y27632與SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天，以未含Y27632、SAG、及人類重組BMP4之無血清培養基，進行 半量培養基交換。其後，3天一次，以未含Y27632、SAG、及人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製之細胞凝集體，於浮游培養開始後第18天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製之BIOREVO)進行亮視野觀察。其結果，得知在無前置處理條件(條件3)，細胞凝集體的神經上皮形成之效率為差(圖27、B)。另一方面，得知在步驟1以SB431542及SAG之組合或LDN193189及SAG之組合進行前置處理之條件(條件1，2)中，細胞凝集體有成長，形成神經上皮(圖27、C，D)。即，得知在藉由步驟1之前置處理操作，可使神經上皮之製造效率變良好。
如此所調製之細胞凝集體(人類ES細胞Rx：：來自GFP株)中之Rx基因啟動子控制下的GFP之表現以螢光顯微鏡(基恩士公司公司製之BIOREVO)觀察。其結果，得知在步驟1以SB431542及SAG之組合、或LDN193189及SAG之組合進行前置處理，在步驟2添加SAG，在步驟3添加BMP4之條件下，全細胞中的90%程度為GFP強陽性(圖27、E，F)。
由這些結果得知，在步驟1添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質，將經無飼養培養的人類ES細胞作為起始原料，可製造網膜組織。
實施例28：將經無飼養培養的人類iPS細胞 作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3使用BMP信號傳達途徑作用物質之自人類iPS細胞之網膜組織的製造例
在實施例1記載之方法，將人類iPS細胞(1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，以TGFβR阻礙劑(SB431542、5μM)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、300nM)進行1天無飼養培養(前置處理)。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於浮游培養開始時，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及Shh信號作用物質(SAG、30nM)。浮游培養開始後第2天為止，形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。
浮游培養開始後，於第3天使用未含有Y27632及 SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之前述無血清培養基，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度成1.5nM進行培養基交換。浮游培養開始後第3天以後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、及人類重組BMP4的前述無血清培養基進行半量培養基交換。在浮游培養開始後第17天，細胞凝集體有成長，形成神經上皮。
將該浮游培養開始後第17天之細胞凝集體，移至90mm的低接著培養皿(住友Bakelite公司製)，以含有Wnt信號傳達途徑作用物質(CHIR99021、3μM)及FGF信號傳達途徑阻礙物質(SU5402、5μM)的無血清培養基(於DMEM/F12培養基添加1% N2 supplement之培養基)，在37℃，於5%CO2，進行3天即浮游培養開始後第20天為止進行培養。此期間，每一片90mm的低接著培養皿，將50個程度的凝集體，在10ml之含有前述CHIR99021及SU5402的無血清培養基下進行浮游培養。浮游培養開始後第20天，形成薄神經上皮，形成擬網膜色素上皮(RPE)之組織。
且，將該浮游培養開始後第20天的細胞凝集體以90mm的低接著培養皿(住友Bakelite公司製)，以未含Wnt信號傳達途徑作用物質及FGF信號傳達途徑阻礙物質的血清培養基(於DMEM/F12培養基中添加10%牛胚胎血清、1% N2 supplement、0.5μM視黃酸、及100μM牛磺酸之培養基)，在37℃，5%CO2，大氣壓之氧氣濃度(20%程度)，進行81天即浮游培養開始後第101天為止進 行浮游培養。浮游培養開始以後第20天至第101天為止之間，2~4天一次，以前述血清培養基進行半量培養基交換。此期間，每一片90mm的低接著培養皿，將30個程度的凝集體在15ml之前述血清培養基下進行浮游培養。浮游培養開始後第30天以後，存在擬神經網膜組織。
如此所調製的浮游培養開始後第101天後各以4%對甲醛所固定而製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Rx(抗Rax/Rx抗體、Takara公司製之豚鼠)、增殖細胞標示物之1的Ki67(抗Ki67抗體、Leica公司製之兔子)、神經網膜前驅細胞標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司、綿羊)、感光細胞前驅細胞標示物之1的Crx(抗Crx抗體、Takara公司製之兔子)、感光細胞前驅細胞標示物之1的Blimp1(抗Blimp1抗體、Santa Cruz公司製之大鼠)、神經節細胞標示物之1的Brn3b(抗Brn3b抗體、Santa Cruz公司製之羊)進行免疫染色，以螢光顯微鏡(基恩士公司製之BIOREVO)觀察。
其結果，得知如此所調製的細胞凝集體中，全細胞中的Rx陽性細胞的比例為90%程度(圖28、A)。由連續切片之解析得知，Rx強陽性細胞中含有Ki67陽性且Chx10陽性之神經網膜前驅細胞(圖28、B，C)。又，得知於該細胞凝集體中含有Crx強陽性之感光細胞前驅細胞(圖28、D)。由連續切片之解析得知Crx強陽性細胞的一部分為Blimp1陽性之感光細胞前驅細胞(圖28、E)。 又，得知於該細胞凝集體含有Brn3b陽性之神經節細胞(圖28、F)。
由這些結果得知，以本發明之製造方法所製作的網膜組織藉由繼續培養，可往含有神經網膜前驅細胞、感光細胞前驅細胞、神經節細胞之網膜組織進行分化．成熟化。
實施例29：將經無飼養培養的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3使用BMP信號傳達途徑作用物質之自人類iPS細胞的網膜組織之製造例
以實施例28記載的方法，使用作為無飼養培養基之StemFit培養基的人類iPS細胞(1231A3株)作為起始原料，在步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542、5μM)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、300nM)進行1天前置處理，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、30nM)，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質(BMP4、最終濃度1.5nM)之條件下調製出細胞凝集體。於浮游培養開始後第18天，形成神經上皮。
將該浮游培養開始後第18天之細胞凝集體，移至90mm的低接著培養皿(住友Bakelite公司製)，以含有Wnt信號傳達途徑作用物質(CHIR99021、3μM)及FGF信號傳達途徑阻礙物質(SU5402、5μM)的無血清培養基(於 DMEM/F12培養基添加1% N2 supplement之培養基)，在37℃，以5%CO2，進行5天即浮游培養開始後第23天為止的培養。此期間，每一片90mm之低接著培養皿，將50個程度的凝集體在10ml之含有前述CHIR99021及SU5402之無血清培養基下進行浮游培養。於浮游培養開始後第23天，形成薄神經上皮，形成擬網膜色素上皮(RPE)之組織。
且，將該浮游培養開始後第23天之細胞凝集體，以90mm之低接著培養皿(住友Bakelite公司製)以未含有Wnt信號傳達途徑作用物質及FGF信號傳達途徑阻礙物質的血清培養基(於DMEM/F12培養基添加10%牛胚胎血清、1% N2 supplement、0.5μM視黃酸、及100μM牛磺酸之培養基)，在37℃，5%CO2，大氣壓之氧氣濃度(20%程度)下，於浮游培養開始後第130天為止(107天)、浮游培養開始後第137天(114天)為止、或浮游培養開始後第178天(155天)為止進行浮游培養。自浮游培養開始以後第23天至浮游培養終了時為止之間，2~4天一次，以前述血清培養基進行半量培養基交換。此期間，每一片90mm的低接著培養皿，將30個程度的凝集體，在15ml之前述血清培養基下進行浮游培養。浮游培養開始後第35天以後存在擬神經網膜組織。
將如此所調製的浮游培養開始後第130天、第137天、及第178天的細胞凝集體各以4%對甲醛進行固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於介在神經 標示物(神經節細胞及無長突細胞)之1的Calretinin(抗Calretinin抗體、Millipore公司製之兔子)、錐體感光細胞標示物之1的S-opsin(抗S-opsin抗體、Millipore公司製之兔子)、網膜組織標示物之1的Rx(抗Rax/Rx抗體、Takara公司製之豚鼠)、介在神經標示物(神經節細胞及無長突細胞)之1的Pax6(抗Pax6抗體、BD公司製之老鼠)、感光細胞標示物之1的Recoverin(抗Recoverin抗體、Millipore公司製之兔子)、視桿細胞標示物之1的Rhodopsin(抗Rhodopsin抗體Ret-P1、Sigma公司製之老鼠)、視桿細胞前驅細胞標示物之1的NRL(抗NRL抗體、R and D公司製之羊)、介在神經標示物(水平細胞)之1的Calbindin(抗Calbindin抗體、Millipore公司製之兔子)進行免疫染色，以共焦點雷射顯微鏡(Zeiss公司製之LSM780)觀察。
首先解析浮游培養開始後第130天之細胞凝集體後，得知全細胞中的Rx陽性細胞的比例為90%程度。Rx強陽性之網膜組織中，於內側存在Calretinin陽性之介在神經細胞(圖29、A)。
解析浮游培養開始後第137天之細胞凝集體後，得知全細胞中的Rx陽性細胞的比例為90%程度。又，Rx強陽性之網膜組織中，含有Crx陽性之感光細胞前驅細胞或Recoverin陽性之感光細胞。且得知該Rx強陽性之網膜組織中，含有S-opsin陽性之錐體感光細胞(圖29、B)。
浮游培養開始後第178天之細胞凝集體後，得知全細胞中的Rx陽性細胞的比例為90%程度(圖29、C)。由連續切片之解析得知，Rx強陽性的網膜組織之中，於內側存在Pax6陽性的介在神經(無長突細胞及神經節細胞)(圖29、D)。又得知該Rx強陽性的網膜組織之中，於外側含有Recoverin陽性的感光細胞、Rhodopsin陽性的視桿細胞、NRL陽性的視桿細胞前驅細胞、Calbindin陽性的水平細胞(圖29、E-H)。
由這些結果得知，以本案製造法所製作的網膜組織，藉由繼續培養，可往含有感光細胞前驅細胞、感光細胞、錐體感光細胞、視桿細胞、水平細胞、其他介在神經細胞之網膜組織進行分化．成熟化。
實施例30：將經無飼養培養的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3使用BMP信號傳達途徑作用物質之自人類iPS細胞的網膜組織之製造例
以實施例29記載之方法，作為無飼養培養基使用StemFit培養基之人類iPS細胞(1231A3株)作為起始原料，在步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542、5μM)及Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、300nM)進1天前置處理，在步驟2使用Shh信號傳達途徑作用物質(SAG、30nM)，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質(BMP4、 最終濃度1.5nM)之條件下，調製出細胞凝集體。於浮游培養開始後第18天形成神經上皮。
將該浮游培養開始後第18天之細胞凝集體移至90mm之低接著培養皿(住友Bakelite公司製)，以含有Wnt信號傳達途徑作用物質(CHIR99021、3μM)及FGF信號傳達途徑阻礙物質(SU5402、5μM)的無血清培養基(於DMEM/F12培養基添加1% N2 supplement之培養基)，在37℃，5%CO2下進行5天即浮游培養開始後第23天為止的培養。此期間，每一片90mm之低接著培養皿，將50個程度的凝集體在10ml之含有前述CHIR99021及SU5402之無血清培養基下進行浮游培養。於浮游培養開始後第23天，形成薄神經上皮，形成擬網膜色素上皮(RPE)之組織。
且將該浮游培養開始後第23天之細胞凝集體，於90mm之低接著培養皿(住友Bakelite公司製)，以未含有Wnt信號傳達途徑作用物質及FGF信號傳達途徑阻礙物質之血清培養基(於DMEM/F12培養基添加10%牛胚胎血清、1% N2 supplement、0.5μM視黃酸、及100μM牛磺酸之培養基)，在37℃，5%CO2、大氣壓之氧氣濃度(20%程度)下，浮游培養開始後第63天為止(41天)下進行浮游培養。自浮游培養開始以後第23天至浮游培養終了時為止之間，2~4天一次，以前述血清培養基進行半量培養基交換。此期間，每一片90mm之低接著培養皿，將30個程度的凝集體，在15ml之前述血清培養基下進行浮 游培養。浮游培養開始後第35天以後存在擬神經網膜組織。
將如此所調製之浮游培養開始後第63天之細胞凝集體以倒立顯微鏡(尼康公司製)進行亮視野觀察時，得知存在神經網膜組織與色素沈著之擬RPE之組織。將所得之100個細胞凝集體做詳細解析後，得知全細胞中之90%以上為係由神經網膜所構成之細胞凝集體40個、神經網膜與網膜色素上皮(RPE，藉由色素沈澱可判斷)共存之複合網膜組織40個(圖30、A)、全細胞之中90%以上係由網膜色素上皮(RPE，藉由色素沈澱可判斷)所構成之細胞凝集體(圖30、B)20個形成。
且將前述該浮游培養開始後第63天的細胞凝集體以未含有Wnt信號傳達途徑作用物質及FGF信號傳達途徑阻礙物質之血清培養基(於DMEM/F12培養基中添加10%牛胚胎血清、1% N2 supplement、0.5μM視黃酸、及100μM牛磺酸之培養基)，至浮游培養開始後第130天為止(107天)進行浮游培養。將這些細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於睫狀體周緣部(CMZ)標示物之1的SSEA1(抗SSEA1抗體、Millipore公司製之老鼠)、RPE標示物之1的Mitf(抗Mitf抗體、Exalpha公司、老鼠)、RPE及睫狀體標示物之1的Aqp1(抗Aqp1抗體、Millipore公司製之兔子)進行免疫染色，以共焦點雷射顯微鏡(Zeiss公司製之LSM780)觀察。
將浮游培養開始後第130天之凝集體全體經 色素沈著的擬RPE之組織進行解析結果，得知全細胞的80%程度為Rx弱陽性。而由連續切片之解析得知，Rx弱陽性的細胞為Mitf陽性的RPE(圖30、D)。且，得知前述擬RPE之組織為Aqp1陽性(圖30、E)。由這些結果得知，以本發明之製造方法所製作的網膜組織可往RPE進行分化．成熟化。
將含有浮游培養開始後第130天之神經網膜與擬RPE之組織雙方的複合網膜組織進行解析後，得知全細胞中的Rx陽性細胞的比例為90%程度，其中Rx強陽性的神經網膜與Rx弱陽性的擬RPE之組織為存在。可得知於神經網膜(圖30、C右側)與RPE之境界，形成SSEA1陽性的睫狀體周緣部(圖30、C)。由該結果得知，以本發明之製造方法所製作之網膜組織可往睫狀體周緣部進行分化．成熟化。
實施例31：將經無飼養培養的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之自人類iPS細胞的大腦組織之製造例
以實施例1所記載的方法將人類iPS細胞(1231A3株)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
以實施例1所記載的方法，將人類iPS細胞 (1231A3株)使用StemFit培養基，至亞融合前1天進行無飼養培養。將該亞融合前1天的人類iPS細胞，以下述3條件，進行1天無飼養培養。
．條件1. SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)
．條件2. LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)
．條件3.外來性TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質非存在下(無前置處理條件)
將如此所調製之前述條件1-3的人類iPS細胞，使用TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散為單一細胞。其後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(Sumilon橢球體V底平板PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司)的每1孔中有0.9 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(GMEM+KSR)使用於GMEM培養基(Life Technologies公司製)中添加20% KSR(Life Technologies公司製)、0.1mM 2-巰基乙醇、1x非必須胺基酸(Life Technologies公司製)、及1mM丙酮酸(Life Technologies公司製)之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基加入Wnt信號傳達途徑 阻礙物質(IWR-1-endo、3μM)、TGFβR阻礙劑(SB431542、5μM)、及Y27632(20μM)的前述無血清培養基，進一步以含有或未含有SAG之條件(A)(Shh信號作用物質、100nM)之條件(B)下進行培養。於浮游培養開始後第2天，所有條件下皆形成細胞凝集體。
於浮游培養開始後第3天，以未含有Y27632及SAG，含有Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1-endo、3μM)及TGFβR阻礙劑(SB431542、5μM)之無血清培養基進行半量培養基交換。其後，至浮游培養開始後第25天或第27天為止，2~4天一次，以未含Y27632及SAG，含有Wnt信號傳達途徑阻礙物質(IWR-1-endo、3μM)及TGFβR阻礙劑(SB431542、5μM)之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將浮游培養開始後第25天的細胞凝集體使用倒立顯微鏡(基恩士公司製之BIOREVO)進行亮視野觀察。其結果，得知在無前置處理條件(條件3)，細胞凝集體未成長，神經上皮幾乎未形成(圖31、A)。另一方面，得知在步驟1以SB431542及SAG、或LDN193189及SAG進行前置處理之條件(條件1，2)下，在步驟2未加入SAG之條件(B)下細胞凝集體亦有成長，形成神經上皮(圖31、B，C)。同樣地，另一方面，得知在步驟1以SB431542及SAG、或LDN193189及SAG進行前置處理的條件(條件1，2)、在步驟2加入SAG之條件(A)下，細胞凝集體亦有成長，形成神經上皮。即，得知在步驟1未 添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Shh信號作用物質，在步驟2添加與未添加Shh信號作用物質之條件下，皆可神經上皮之製造效率變的良好。
將如此所調製之浮游培養開始後第27天的細胞凝集體各以4%對甲醛進行固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於神經系前驅細胞標示物之1的Sox2(抗Sox2抗體、Santa Cruz公司製之羊)、及大腦的標示物之1的FoxG1(抗FoxG1抗體、由理化學研究所所製作之As3514、兔子)進行免疫染色，以共焦點雷射顯微鏡(奧林巴斯公司製)觀察。
其結果，得知在步驟1以條件1進行培養的浮游培養開始後第27天的細胞凝集體中，於細胞凝集體的表面存在Sox2陽性的神經系前驅細胞(圖32、A)。且由共染色之解析，得知Sox2陽性的神經系前驅細胞的98%程度為Sox2陽性且FoxG1陽性的大腦神經系前驅細胞(圖32、B)。又，得知在步驟1以條件2下進行培養之浮游培養開始後第27天的細胞凝集體，亦與條件1同樣地，於細胞凝集體的表面存在Sox2陽性的神經系前驅細胞，Sox2陽性的神經系前驅細胞的98%程度為Sox2陽性且FoxG1陽性的大腦神經系前驅細胞。
由該結果得知，在步驟1添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Wnt信號傳達途徑阻礙物質後，將經無飼養培養的人類iPS細胞作 為起始原料，可製造大腦組織。
實施例32：將經無飼養培養的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之自人類iPS細胞的大腦組織之製造例
將以實施例31所記載之方法所調製的浮游培養開始後第27天的細胞凝集體，移至90mm的低接著培養皿(住友Bakelite公司製)，以於DMEM/F12培養基(Life Technologies公司製)加入1% N2 supplement(Life Technologies公司製)之無血清培養基，在37℃，以5%CO2進行浮游培養。此時，每一片90mm的低接著培養皿，將30個程度的凝集體在10ml之無血清培養基下進行浮游培養。其後，至浮游培養開始後第40天為止，2~4天一次，以於DMEM/F12培養基(Life Technologies公司製)加入1% N2 supplement(Life Technologies公司製)的無血清培養基進行半量培養基交換。
將所得之浮游培養開始後第40天的細胞凝集體於90mm之低接著培養皿(住友Bakelite公司製)，以於DMEM/F12培養基(Life Technologies公司製)添加10%牛胚胎血清、1% N2 supplement、及0.5μM視黃酸之血清培養基，在37℃，以5%CO2進行浮游培養。此時，每一片90mm之低接著培養皿，將30個程度的凝集體以10ml之無血清培養基下進行浮游培養。其後，至浮游培養開始後第60天為止，2~4天一次，以前述血清培養基進 行半量培養基交換。
將如此所調製的浮游培養開始後第60天的細胞凝集體各以4%對甲醛進行固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於大腦的標示物之1的FoxG1(抗FoxG1抗體，由理化學研究所所製作之As3514、兔子)、背側大腦神經系前驅細胞的標示物之1的Pax6(抗Pax6抗體、BD公司製之老鼠)、大腦之第6層神經元的標示物之1的Tbr1(抗Tbr1抗體、Abcam公司製之兔子)、及大腦的第5層神經元的標示物之1的Ctip2(抗Ctip2抗體、Abcam公司製之大鼠)進行免疫染色，以共焦點雷射顯微鏡(奧林巴斯公司製)觀察。
其結果，得知在步驟1以SB431542及SAG進行前置處理的條件(條件1)下進行培養的浮游培養開始後第60天之細胞凝集體中，其細胞凝集體的全細胞中的40%程度的細胞為FoxG1陽性的大腦之細胞(圖32、C)。且由連續切片之解析得知，含有FoxG1陽性細胞之細胞凝集體中，Pax6陽性的背側大腦神經系前驅細胞以全細胞中之30%程度含有(圖32、D)，Tbr1陽性的第6層神經元以全細胞中之5%程度含有，Ctip2陽性的第5層神經元以15%程度含有。
又，得知在步驟1以LDN193189及SAG進行前置處理之條件(條件2)下所培養的浮游培養開始後第60天之細胞凝集體亦與條件1同樣地，存在FoxG1陽性的大腦之細胞。且由連續切片之解析得知，在含有FoxG1 陽性細胞之細胞凝集體中，Pax6陽性的背側大腦神經系前驅細胞以全細胞中之30%程度含有，Tbr1陽性的第6層神經元以全細胞中之5%程度含有，Ctip2陽性的第5層神經元以15%程度含有。
且，得知在步驟1以條件1或條件2下培養，在步驟2含有SAG之條件(條件(A))或未含有SAG之條件(條件(B))中任一4條件下，在浮游培養開始後第60天之細胞凝集體中存在FoxG1陽性的大腦之細胞。
由這些結果得知，在步驟1添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Wnt信號傳達途徑阻礙物質後，將經無飼養培養的人類iPS細胞作為起始原料，可製造出大腦組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經元(例如第6層神經元、第5層神經元)。
實施例33：將經無飼養培養的人類iPS細胞作為起始原料，在步驟1使用TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質之神經組織的製造例
以實施例8所記載之方法，將經無飼養培養之亞融合1天前的人類iPS細胞(1231A3株)在下述2條件下，進行1天無飼養培養。
．條件1. SB431542(TGFβR阻礙劑、5μM)
．條件2. LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)
．條件3.外來性TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及Shh信號傳達途徑作用物質非存在下(無前置處理條件)
使用如此調製之條件1-3的人類iPS TrypLE Select(Life Technologies公司製)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散為單一細胞。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
其後，於下述2種類培養皿中播種細胞。
．條件(A).將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞使非細胞接著性的U底之96穴培養平板(Sumilon橢球體U底平板PrimeSurface 96U底平板，住友Bakelite公司)的每1孔中有1.2 x 104細胞下浮游於100μl之前述無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。
．條件(B).將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞在每非細胞接著性之60mm平底的細胞培養皿(浮游培養用碟，住友Bakelite公司)之1培養皿中，使其成為2.4 x 105細胞下浮游於4ml的前述無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。
條件3之無前置處理條件下，於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，使用於前述無血清培養基加入Y27632(20μM)，未加入外來性Shh信號傳達途徑作用物質的條件之無血清培養基。
在條件1及2中，於浮游培養開始時(浮游培 養開始後第0天開始步驟2)，使用於前述無血清培養基加入Y27632(20μM)，再加入作為外來性Shh信號傳達途徑作用物質之SAG的條件(最終濃度300nM)之無血清培養基(圖33)。條件1-3中任一者在浮游培養開始後第2天，形成細胞凝集體。於浮游培養開始後第4天，加入未含Y27632及SAG之前述無血清培養基。其後，2~4天一次，以未含Y27632及SAG之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製之細胞凝集體，於浮游培養開始後第19天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司公司製之BIOREVO)進行亮視野觀察。其結果，得知在無前置處理條件(條件3)，即使為U底平板(條件A)或平底培養皿(條件B)，亦無細胞凝集體成長，神經上皮幾乎無形成(圖33、A，F)。另一方面，得知在步驟1以TGFβR阻礙劑(SB431542)、或BMPR阻礙劑(LDN193189)進行前置處理之條件(條件1，2)中，即使U底平板(條件A)或平底培養皿(條件B)，細胞凝集體有成長，且形成神經上皮(圖33、B-E，G-J)。即，得知藉由在步驟1之前置處理操作，即使在U底平板(條件A)或平底培養皿(條件B)，可使神經上皮之製造效率變的良好。
實施例34：將使用無飼養培養基StemFit(AK03N)進行培養的人類iPS細胞，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行前置處理操作，在步驟2添加Shh信號傳達途 徑作用物質，在步驟3添加BMP4的網膜組織之形成例
將人類iPS細胞(Ff-I01株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03N；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
以實施例8記載之方法，將經無飼養培養的經亞融合2天前的人類iPS細胞，在SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之存在下，進行2天無飼養培養(步驟1、前置處理)。
將前述人類iPS細胞使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油、及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、500nM)。至浮游培養開始後第2天為止，形成細胞凝集體(步驟2終 了後開始步驟3)。
於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)或5nM(183ng/ml)，加入未含Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天除去培養基50μl，欲指外來性人類重組BMP4的最終濃度維持於1.5nM(55ng/ml)或5nM(183ng/ml)，加入未含有Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。其後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
於將如此所調製之細胞進行浮游培養開始後第19天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察。其結果，得知將BMP4以1.5nM或5nM添加之條件中，細胞凝集體有成長，神經組織可有效率地形成(圖34、A-B)。
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)進行2天前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3將BMP4以1.5nM或5nM添加之條件下，自經無飼養培養的人類iPS細胞可有效率地製造出神經組織。
將浮游培養開始後第19天的細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha 公司製，綿羊)進行進行免疫染色。將這些經免疫染色的切片，使用倒立型螢光顯微鏡進行觀察。其結果，得知欲使BMP4的最終濃度成為1.5nM之二次添加條件下，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例為70%程度(圖34、C)。又，欲將BMP4的最終濃度成為5nM之二次添加條件下，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例為90%程度(圖34、D)。
將由這些結果得知，使用無飼養培養基StemFit(AK03N)進行培養之人類iPS細胞，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質(SAG)進行2天前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3將BMP信號傳達途徑作用物質以5nM進行2次添加之條件(即，將BMP信號傳達途徑作用物質之濃度維持6天之5nM的條件)下，可有效率地製造網膜組織。
實施例35：在步驟1以Shh信號作用物質進行1~4天之前置處理，在步驟2使用Shh信號作用物質，在步驟3添加BMP信號作用物質之自無飼養人類iPS細胞的網膜組織之形成例
將人類iPS細胞(Ff-I01株，由京都大學獲得)以、Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03N；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
以下述4條件進行前置處理。
．條件1.將亞融合之24小時前的人類iPS細胞，以添加SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之Stem Fit培養基(AK03N)進行24小時的無飼養培養。
．條件2.將亞融合之48小時前的人類iPS細胞，以添加SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)的Stem Fit培養基(AK03N)進行48小時的無飼養培養。
．條件3.將亞融合之72小時前的人類iPS細胞，以添加SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之Stem Fit培養基(AK03N)進行72小時的無飼養培養。
．條件4.將亞融合之96小時前的人類iPS細胞，以添加SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之Stem Fit培養基(AK03N)進行96小時的無飼養培養。
將以前述4條件所培養的人類iPS細胞，各使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1孔中有1.0 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
於浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基添加Y27632(最終濃度20μM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、500nM)(圖35)。直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。
於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未含Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。於浮游培養開始後第6天除去培養基50μl，欲使外來性人類重組BMP4的最終濃度維持在1.5nM(55ng/ml)，加入未含有Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。其後，2~4天一次，以未含有Y27632、SAG、人類重組BMP4之前述無血清培養基進行半量培養基交換。
將如此所調製的細胞凝集體在浮游培養開始後第19天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司)進行亮視野觀察。其結果，得知即使經前述條件1~4中任一的前置處理之條件下，細胞凝集體有成長，且可有效率地形成神經上皮(圖35、A-D)。
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行1~4天前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質之條件下，自無飼養人類iPS細胞可效率地製造神經組織。
將如此所調製之浮游培養開始後第19天的細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司製，綿羊)進行免疫染色，使用螢光顯微鏡觀察。其結果，得知以SAG進行24小時前置處理之條件(條件1)下，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為10%程度(圖35、E)。另一方面，得知以SAG進行48、72、或96小時前置處理之條件(條件2，3，4)下，全細胞中之Chx10陽性細胞的比例亦為80%程度(圖35、F-H)
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質進行1~4天之期間前置處理，在步驟2添加Shh信號傳達途徑作用物質，添加BMP信號傳達途徑作用物質之條件下之任一條件下，皆可有效率地製造網膜組織。
實施例36：在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質及BMP信號傳達途徑阻礙物質進行30分鐘~2天之前置處理，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質之自無飼養人類iPS細胞的網膜組織之形成例
將人類iPS細胞(1231A3株，由京都大學獲得)以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載的方法進行無飼養培養。作為無飼養培養基，使用Stem Fit培養基(AK03；味之素公司製)，作為無飼養足場，使用Laminin511-E8(Nippi公司製)。
以下述5條件進行前置處理。
．條件1.將亞融合前之人類iPS細胞以添加LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)之Stem Fit培養基(AK03)進行30分鐘無飼養培養。
．條件2.將亞融合前之人類iPS細胞以添加LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)的Stem Fit培養基(AK03)進行6小時的無飼養培養。
．條件3.將亞融合1天前之人類iPS細胞，以添加LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)的Stem Fit培養基(AK03)進行24小時的無飼養培養。
．條件4.將亞融合2天前的人類iPS細胞以添加LDN193189(BMPR阻礙劑、100nM)及SAG(Shh信號傳達途徑作用物質、300nM)的Stem Fit培養基(AK03)進行48小時的無飼養培養。
．條件5.以未添加TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Shh信號傳達途徑作用物質的條件下經無飼養培養之亞融合的人類iPS細胞。
將前述5個條件之人類iPS細胞，各使用TrypLE Select(Life Technologies)進行細胞分散液處理，進一步藉由移液操作分散於單一細胞後，將前述分散為單一細胞之人類iPS細胞於非細胞接著性96穴培養平板(PrimeSurface 96V底平板，住友Bakelite公司製)的每1 孔中有1.2 x 104細胞而浮游於100μl的無血清培養基中，在37℃，5%CO2下進行浮游培養。此時的無血清培養基(gfCDM+KSR)中，使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加10% KSR、450μM 1-一硫甘油及1 x Chemically defined lipid concentrate之無血清培養基。
浮游培養開始時(浮游培養開始後第0天開始步驟2)，於前述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20μM)。直到浮游培養開始後第2天為止，在所有條件下皆形成細胞凝集體(步驟2終了後開始步驟3)。
於浮游培養開始後第3天，欲使外來性人類重組BMP4之最終濃度至1.5nM(55ng/ml)，加入未含Y27632、SAG，含有人類重組BMP4(R&D公司製)之培養基50μl。其後，2~4天一次，以未含Y27632、SAG、人類重組BMP4之前述無血清培養基，進行半量培養基交換操作。
將如此所調製之細胞在浮游培養開始後第19天，使用倒立顯微鏡(基恩士公司製)，進行亮視野觀察。其結果，得知未進行前置處理操作的條件(條件5)下，凝集體崩壞，神經上皮幾乎未形成(圖36、A)。另一方面，得知以LDN193189及SAG，在30分鐘、6小時、24小時、48小時中任一期間進行前置處理之條件(條件1-4)下，凝集體有成長，神經上皮有效率地形成(圖36、B-E)。
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號作用 物質進行30分鐘~2天前置處理，在步驟3添加BMP信號作用物質之條件下，自無飼養人類iPS細胞可效率地製造神經組織。
如此所調製之浮游培養開始後第22天的細胞凝集體，以4%對甲醛固定，製作冷凍切片。有關這些冷凍切片，對於網膜組織標示物之1的Chx10(抗Chx10抗體、Exalpha公司製，綿羊)進行免疫染色。將這些經免疫染色的切片，使用倒立型螢光顯微鏡進行觀察。其結果，得知以LDN193189及SAG在30分鐘、6小時、24小時、48小時中任一期間進行前置處理之條件(條件1-4)下，全細胞中的Chx10陽性細胞的比例皆為80%程度(圖36、F-I)。
由這些結果得知，在步驟1以Shh信號傳達途徑作用物質及BMP信號傳達途徑阻礙物質進行30分~2天之前置處理，在步驟3添加BMP信號傳達途徑作用物質的條件下，自無飼養人類iPS細胞可有效率地製造網膜組織。
[產業上可利用性]
藉由本發明之製造方法，在飼養細胞非存在下，可由多能性幹細胞往神經系細胞進行誘導分化，製造出神經組織。本發明之製造方法可製造神經組織，該神經組織係由使用神經組織的醫藥品候補化合物、其他化學物質之毒性．藥效評估或使用於對神經組織移植治療用移植 材料的應用之試驗或治療之材料而成者。
含有此所述的專利、專利申請說明書及科學文獻之所有刊物所記載之內容為藉由引用於此，與該所有內容所揭示之同程度下記載於本說明書中。
本申請案係以在日本之申請的特願2014-217867(申請日：2014年10月24日)作為基礎者，該內容皆包含在本說明書中。

Claims (37)

  1. 一種神經系細胞或神經組織的製造方法，其特徵為含有下述步驟(1)~(3)；(1)將多能性幹細胞在飼養細胞非存在下，以含有1)TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或音蝟因子信號傳達途徑作用物質、以及2)未分化維持因子的培養基中進行培養的第一步驟、(2)將由第一步驟所得之細胞進行浮游培養，形成細胞的凝集體之第二步驟、及(3)將由第二步驟所得之凝集體於誘導分化因子的存在下或者非存在下進行浮游培養，得到含有神經系細胞或者神經組織之凝集體的第三步驟。
  2. 如請求項1之製造方法，其中對於第二步驟，分散由第一步驟所得之細胞，將該分散的細胞進行浮游培養。
  3. 如請求項1或2之製造方法，其中未分化維持因子為FGF信號傳達途徑作用物質。
  4. 如請求項3之製造方法，其中FGF信號傳達途徑作用物質為bFGF。
  5. 如請求項1~4中任一項之製造方法，其中於第二步驟，將細胞以含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質之無血清培養基中進行浮游培養者。
  6. 如請求項1~5中任一項之製造方法，其中於第三步驟，將凝集體於誘導分化因子的存在下進行浮游培養者。
  7. 如請求項1~6中任一項之製造方法，其中TGFβ家 族信號傳達途徑阻礙物質為Nodal/Activin信號傳達途徑阻礙物質、TGFβ信號傳達途徑阻礙物質、或BMP信號傳達途徑阻礙物質。
  8. 如請求項1~7中任一項之製造方法，其中TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質為Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。
  9. 如請求項1~8中任一項之製造方法，其中音蝟因子信號傳達途徑作用物質為Shh、SAG或嘌嗎啡胺。
  10. 如請求項1~9中任一項之製造方法，其中第三步驟中之誘導分化因子為BMP信號傳達途徑作用物質。
  11. 如請求項10之製造方法，其中BMP信號傳達途徑作用物質為選自由BMP2、BMP4、BMP7及GDF7所成群的1種以上蛋白質。
  12. 如請求項10之製造方法，其中BMP信號傳達途徑作用物質為BMP4。
  13. 如請求項1~12中任一項之製造方法，其中於第三步驟所得之凝集體為含有網膜組織之凝集體。
  14. 如請求項1~13中任一項之製造方法，其中於第三步驟所得之凝集體為含有選自由網膜前驅細胞、神經網膜前驅細胞、感光細胞前驅細胞、感光細胞、視桿細胞、錐體感光細胞、水平細胞、無長突細胞、介在神經細胞、神經節細胞、網膜色素上皮細胞、及睫狀體周緣部細胞所成群的1種或複數種細胞之凝集體。
  15. 如請求項13或14之製造方法，其中第三步驟中 之誘導分化因子為BMP信號傳達途徑作用物質，且第二步驟中之培養基為含有音蝟因子信號傳達途徑作用物質。
  16. 如請求項15之製造方法，其中多能性幹細胞為人類多能性幹細胞，於第二步驟中之培養基中的音蝟因子信號傳達途徑作用物質濃度相當於SAG10nM~700nM的音蝟因子信號傳達作用之濃度，網膜組織為人類網膜組織。
  17. 如請求項15或16之製造方法，其中於第三步驟，於自第二步驟開始後第1天至第9天之間，添加BMP信號傳達途徑作用物質於培養基中。
  18. 如請求項13或14之製造方法，其中於第三步驟，以音蝟因子信號傳達途徑作用物質的濃度相當於SAG700nM的音蝟因子信號傳達作用之濃度以下的培養基中培養凝集體。
  19. 如請求項1~9中任一項之製造方法，其中第三步驟中之誘導分化因子為TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質及/或Wnt信號傳達途徑阻礙物質。
  20. 如請求項19之製造方法，其中TGFβ家族信號傳達途徑阻礙物質為Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。
  21. 如請求項19或20之製造方法，其中Wnt信號傳達途徑阻礙物質為IWR-1-endo。
  22. 如請求項1~9或19~21中任一項之製造方法，其中於第三步驟所得之凝集體為含有大腦組織之凝集體。
  23. 如請求項1~22中任一項之製造方法，其中第一步 驟的培養時間為0.5小時~144小時。
  24. 如請求項1~23中任一項之製造方法，其中第一步驟係以接著培養法進行。
  25. 如請求項1~24中任一項之製造方法，其中於第三步驟，於第二步驟開始後第3天至第6天之間，添加誘導分化劑於培養基。
  26. 請求項1~15及17~25中任一項之製造方法，其中多能性幹細胞為靈長類多能性幹細胞。
  27. 如請求項1~26中任一項之製造方法，其中多能性幹細胞為人類多能性幹細胞。
  28. 如請求項1~27中任一項之製造方法，其中多能性幹細胞為人工多能性幹細胞。
  29. 如請求項1~28中任一項之製造方法，其中於第二步驟，形成均勻凝集體。
  30. 如請求項1~29中任一項之製造方法，其中浮游培養在基底膜標品非存在下進行。
  31. 一種被驗物質之毒性．藥效評估用試藥，其特徵為含有由如請求項1~30中任一項之方法所製造的神經系細胞或神經組織而成者。
  32. 一種物質的毒性．藥效評估方法，其特徵為含有使由如請求項1~30中任一項之方法所製造的神經系細胞或神經組織與被驗物質接觸後，檢定該物質對該細胞或該組織所造成的影響者。
  33. 一種以神經系細胞或神經組織之障礙為準的疾病 之治療藥，其特徵為含有由如請求項1~30中任一項之方法所製造的神經系細胞或神經組織而成。
  34. 如請求項33之治療藥，其中神經系細胞或神經組織為網膜前驅細胞、網膜層專一性神經細胞、網膜組織、大腦神經系前驅細胞、大腦層專一性神經細胞、或大腦組織。
  35. 一種以神經系細胞或神經組織的障礙為準的疾病之治療方法，其特徵為含有將由如請求項1~30中任一項之方法所製造的神經系細胞或神經組織之有效量移植至必須進行移植的對象者。
  36. 一種神經系細胞或神經組織，其係由如請求項1~30中任一項之方法所製造者，其特徵為使用於以神經系細胞或神經組織的障礙為準的疾病之治療上。
  37. 一種醫藥組成物，其特徵為含有由如請求項1~30中任一項之方法所製造的神經系細胞或神經組織作為有效成分者。
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