CN1630714A - 干/祖细胞自我更新和分化和时钟控制基因表达的节律控制 - Google Patents

Abstract

通过提供具有节律时钟系统的适宜的细胞，并在能有效控制骨髓细胞发育、干细胞自我更新、分化和/或功能以及调控区具有E－盒序列的时钟控制基因表达的条件下，操纵节律时钟系统，控制骨髓细胞发育、干细胞自我更新、分化和/或功能以及调控区具有E－盒序列的时钟控制基因表达的方法。另外，还公开了体外的工程化组织，其中包括多个相互间密切接触以形成组织的细胞或细胞类型，这些细胞或细胞类型具有已被调控来调节组织内细胞或细胞类型的生长、发育和/或功能的节律时钟系统。

Description

干/祖细胞自我更新和分化和时钟控制 基因表达的节律控制

本申请要求2001年9月21日提交的美国临时专利申请No.60/324,190的在先权益，该申请在此完整引用作为参考。

本发明至少有部分是在国家科学基金(批准号BES-9631670)和国家航空航天局(批准号NAG 8-1382)的资助下完成的。因此，美国政府在本发明中享有某些权利。

                        发明领域

本发明总体上涉及节律(circadian)控制系统在以下方面的应用：干细胞和工程化组织的体外发育、干细胞和组织发育的体内调节以及时钟控制基因表达的体外和体内控制。

                        发明背景

最近已识别哺乳动物时钟系统的分子组成(Albrecht等，“两种公认的哺乳动物节律调节子mper1和mper2对光的差异应答”，Cell 91：1055-1064(1997)；Honma等，“哺乳动物时钟基因Clock的伴侣BMAL1在大鼠视交叉上核的节律变化”， Biochem.Biophys.Res.Commun.250：83-87(1998)；Kume等，“mCRY1和mCRY2是节律时钟反馈环负肢的基本组分”， Cell 98：193-205(1999)；Sangoram等，“哺乳动物自调节环：一种永恒的正向同源基因和mPer1相互作用并负调节CLOCK-BMAL1-诱导的转录”， Neuron 21：1101-1113(1998)；Sun等，“RIGUI，一种公认的果蝇周期基因的哺乳动物正向同源基因”， Cell 90：1003-1011(1997)；Tei等，“果蝇周期基因的哺乳动物同系物的节律变化”， Nature389：512-516(1997)；Zylka等，“哺乳动物的3个周期同系物：在视交叉节律时钟的差异光应答以及脑外不同的转录物”， Neuron 20：1103-1110(1998))。它们由正调节子CLOCK和BMAL1以及负调节子PER1、PER2、PER3、TIM、CRY1和CRY2组成。在时钟系统，周期基因的表达受到反馈机制的控制(Dunlap，“节律时钟的分子基础”， Cell 96：271290(1999))。反馈控制的结果是周期基因的表达以节律方式变化。中枢节拍器位于视交叉上核，视交叉上核(“SCN”)的时钟基因的节律变化已有报道。已发现时钟基因在一些外周组织有表达，且有变化((Zylka等，“哺乳动物的3个周期同系物：在视交叉节律时钟的差异光应答以及脑外不同的转录物”， Neuron 20：1103-1110(1998))；Sakamoto等，“大鼠周期同系物(rPer2)mRNA的多组织节律表达受到哺乳动物节律时钟-大脑的视交叉上核的控制”， J.Biol.Chem.273：27039-27042(1998)；Balsalobre等，“在哺乳动物组织培养细胞血清休克诱导节律基因表达”， Cell 93：929-937(1998))，包括肝脏、骨骼肌细胞和睾丸，表明节律时钟在至少一些外周组织存在。

关于人和小鼠系统的血细胞形成的不同方面的节律已有文献报道((Laerum，“血细胞形成具有节律性”， Exp.Hematol.23：1145-1147(1995)；Smaaland，“细胞分裂的节律性”， Prog.Cell.Cycle.Res.2：241-266(1996))。在涉及小鼠的研究中(Levi等，“小鼠骨髓集落形成细胞的节律和周期节奏影响其对抗癌剂4′-O-四氢吡喃阿霉素(THP)的耐受性”， Exp.Hematol.16：696-701(1988)；Perpoint等，“重组小鼠IL-3、小鼠GM-CSF和人G-CSF在小鼠髓样祖细胞的体外时间药理学”， Exp.Hematol.23：362-368(1995)；Wood等，“不同的节律时间以髓样和类红祖细胞和多能细胞集落发生以及髓前体细胞增殖动力学为特征”， Exp.Hematol.26：523-533(1998)；Aardal和Laerum，“小鼠骨髓的节律变异”， Exp.Hematol.11：792-801(1983)；Aardal，“小鼠集落生成细胞昼夜节律周期性的年周期变化”， Exp.Hematol.12：61-67(1984))，已表明骨髓集落生成单位(CFUs)的数量，包括多能集落(CFU-GEMM)，爆发集落生成-红细胞(BFU-E)，CFU-红细胞(CFU-E)和CFU-粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)具有集落依赖性。而且，类红和髓样谱系呈现完全不同的节律节奏，由CFU分析和细胞循环分析证实(Wood等，“不同的节律时间以髓样和类红祖细胞和多能细胞集落发生以及髓前体细胞增殖动力学为特征”， Exp.Hematol.26：523-533(1998))。同样地，在人体研究中(Smaaland等，“人骨髓DNA合成呈现节律阶段依赖性”，Blood 77：2603-2611(1991)；Abrahamsen等，“正选择人CD34+骨髓细胞的细胞得率及增殖活性对节律时间得变化”， Eur.J.Haematol.60：7-15(1998)；Smaaland等，“人骨髓细胞的集落-形成单位-粒细胞-巨噬细胞和DNA合成是节律依赖性的，呈现相关变异”， Blood 79：2281-2287(1992)；Abrahamsen等，“人体类红和髓细胞生成的节律细胞循环变化”， Eur.J.Haematol.58：333-345(1997))，髓细胞生成和红细胞生成均观察到DNA合成活性的明显节律变化((Abrahamsen等，“人体类红和髓细胞生成的节律细胞循环变化”， Eur.J.Haematol.58：333-345(1997))。骨髓细胞CFU-GM的数量呈现明显的24小时节律并与DNA合成活性相关(Smaaland等，“人骨髓细胞的集落-形成单位-粒细胞-巨噬细胞和DNA合成是节律依赖性的，呈现相关变异”，Blood 79：2281-2287(1992))。尽管已有许多文献报道，但控制节律变化的分子机制仍属未知。

已表明永生化的SCN细胞系，如SCN2.2细胞，具有产生内源节律的能力以及象体内SCN细胞一样，通过可扩散信号赋予其它细胞节律性的能力((Allen等，“超过预定时间的变化：源自永生化视交叉上核细胞的可扩散信号在培养的成纤维细胞调节节律性”， J.Neurosci.21(20)：7937-43(2001))。

已有大量的时钟控制基因(CCGs)被识别。包括，例如，生压素((Jin等，“调节视交叉节律时钟节律输出的分子机制”， Cell 96：57-68(1999))；5-羟色胺-N-乙酰转移酶(Chong等，“小鸡5-羟色胺-N-乙酰转移酶通过时钟基因异源二聚体/E盒相互作用活化的特征”， J.Biol.Chem.275：32991-32998(2000))；芳基烷基氨基N-乙酰转移酶((Chen和Baler，“大鼠芳基烷基氨基N-乙酰转移酶E-盒：在主从变化中的不同应用”， Mol.Brain Res.81：43-50(2000))；以及激动素原2(Cheng等，“激动素原2传输视交叉上核的行为节律”， Nature417(6887)：405-410(2002))。然而，这些CCGs中没有一个被表明在骨髓组织受到调节。

骨髓具有自己的时钟系统还是已知的时钟元件(CCGs)在骨髓表达的问题尚待探索。因此，有必要识别骨髓是否真的在时钟系统的控制之下。如果确实如此，那么还需要进一步识别节律时钟系统的分子组成及其应用。

本发明的目的就是解决这些问题以及现有技术中的其它缺陷。

                        发明概述

一方面，本发明涉及控制骨髓细胞发育的方法，包括：提供具有节律时钟系统的骨髓细胞以及在能有效控制骨髓细胞发育的条件下操纵节律时钟系统。

另一方面，本发明涉及控制干细胞自我更新、分化和/或功能的方法，其中所述的方法包括：提供具有节律时钟系统的干细胞以及在能有效控制干细胞自我更新、分化和/或功能的条件下操纵节律时钟系统。

另一方面，本发明涉及体外工程化组织，包括：多个相互间密切接触形成组织的细胞或细胞类型，其中所述的细胞或细胞类型具有时钟节律系统，该节律时钟系统已被调制来调节组织内细胞或细胞类型的生长、发育和/或功能。

另一方面，本发明涉及控制时钟基因表达的方法，包括：提供具有节律时钟系统的细胞以及在能有效改变时钟控制基因表达的条件下，操纵细胞的节律时钟系统，其中所述的时钟控制基因选自GATA结合蛋白(GATA)-2、白介素(IL)-12、IL-16、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)-2、LATS2、骨形成蛋白(BMP)-2、BMP-4、端粒末端转移酶逆转录酶(催化亚单位)(TERT)、转化生长因子(TGF)-β1、TGF-β2、TGF-β3、Piwi-like-1、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)-α、牙本质基质蛋白(DMP)-1、成年星形胶质细胞特异诱导物质(OASIS)、LIM同源异型框(homeobox)蛋白(Lhx)-2、同源异型框B4(hox-B4)、配对框基因5(Pax5)以及睫状嗜神经因子受体(CNTFR)。通过控制各种时钟控制基因的表达，有可能(i)治疗由某种时钟控制基因的表达或缺陷(deficiency)介导的疾病，或者增强或调节由某种时钟控制基因的表达或缺陷介导的身体机能或活性(如时差(jetlag)、倒班)以及(ii)增强免疫系统和/或影响细胞自我更新、增殖、分化、活性、寿命、功能和/或潜能。

本发明还涉及分子控制机制的识别，这些分子控制机制可以用来在各组织控制和操纵细胞的节律时钟系统，并由此调节细胞生长和分化涉及的各种蛋白的表达，提供治疗与这些蛋白的表达不足或过表达相关的疾病以及增强或调节相关的机体机能或活性的方法。一种在节律时钟系统使用的，控制以节律方式调节的各种蛋白的分子控制机制是在调控区域出现称为E盒的元件(CANNTG，SEQ ID No：1，其中N是任何核苷酸)。

                        附图简述

图1A-B表示mPer1在小鼠骨髓细胞的表达。图1A显示不同时间点的mPer1表达的相对定量RT-PCR分析的代表性结果；图1B显示在不同环境钟时间(ZT)mPer1 mRNA的相对量。对应于mPer1的DNA条带的强度以18S rRNA内对照来校准。在每次实验中，最高的校准后的水平定为100，由此来计算mRNA的相对量。每个值代表来源于4-5只小鼠的平均±SEM(单向ANOVA，p＜0.01)。底部的水平条代表明暗循环。ZT0和20的数据画了两次。

图2A-B显示mPer2在小鼠骨髓细胞的表达。图2A显示不同时间点的mPer2表达的相对定量RT-PCR分析的代表性结果；图2B显示在不同环境钟时间(ZT)mPer2 mRNA的相对量。mPer2的mRNA的相对量按照图1的说明中的方法来计算。每个值代表来源于4-5只小鼠的平均±SEM(单向ANOVA，p＝0.07)。底部的水平条代表明暗循环。ZT0和20的数据画了两次。

图3A-B显示mPer1及mPer2在小鼠骨髓细胞髓样富集(Gr-1阳性)组分中的表达。mPer的mRNA的相对量按照图1的说明中的方法来计算。图3A显示在不同环境钟时间(ZT)mPer1 mRNA的相对量。图3B显示在不同环境钟时间(ZT)mPer2 mRNA的相对量。3A和3B的数据代表来源于4-6只小鼠的平均±SEM。与ZT4的值比较，*p＜0.05。底部的水平条代表明暗循环。ZT0和20的数据画了两次。

图4以图解表明了小鼠GATA-2外显子IS上游3个CACGTG(SEQID No：2)E-盒的识别及大概位置。前两个外显子是IS和IG。3个E-盒元件以粗体显示。XhoI位点有下划线。下端显示了6个不同插入(3a-1，-2，-3，-4，-7以及-14)的位置。基因组DNA克隆原来的插入由3a-2和3a-4组成。E：EcoRI；N：NotI。

图5显示在CLOCK及BMAL1存在下，IS启动子的增强的转录活性。含有野生型IS启动子(pGL3-3a-7)或截短的启动子(pGL3-3a-31和pGL3-3a-39)的荧光素酶报告基因的转录激活。图中标出了3个E盒(E)的位置。在有(黑条)或无(白条)mCLOCK及hBMAL1存在的条件下，用报告质粒(pGL3-3a-7、pGL3-3a-31或pGL3-3a-39)瞬时转染H1299细胞。对于每个报告构建体，结果用对应于对照(无mCLOCK及hBMAL1)的倍数来表示。每个值均是3次重复的平均±SEM。

图6A-B显示mGATA-2 IG转录物在总的小鼠骨髓细胞的表达。图6A是mGATA-2 IG转录物的相对定量RT-PCR的代表性结果。图6B显示了mGATA-2 IG转录物在不同节律时间点的相对量。对应于IG转录物的DNA条带的强度以18S rRNA内对照来校准。在每次实验中，最高的校准后的水平定为100，由此来计算mRNA的相对量。每个值代表来源于4-5只小鼠的平均±SEM(单向ANOVA，p＜0.05)。底部的水平条代表明暗循环。ZT0和20的数据画了两次。

图7A-B显示mGATA-2 IS转录物在lin^-的小鼠骨髓细胞的表达。图7A是mGATA-2 IS转录物的相对定量RT-PCR的代表性结果。图6B显示了mGATA-2 IS转录物在不同节律时间点的相对量。对应于IS转录物的DNA条带的强度以18S rRNA内对照来校准。在每次实验中，最高的校准后的水平定为100，由此来计算mRNA的相对量。每个时间点，lin^-细胞来源于两只小鼠的总骨髓细胞。每个值代表来源于三次重复的平均±SEM(单向ANOVA，p＜0.05)。底部的水平条代表明暗循环。ZT0和20的数据画了两次。

图8表示GATA-2 IS启动子区域的每个E-盒在介导CLOCK和BMAL-1依赖性的反式激活中的作用。其中，上面的图用图解的方法描述了pGL3-Elb-GEs，-GE1，-GE2和-GE3的构建体。用含有3个或单个E-盒(E)及其侧翼区域的荧光报告构建瞬时转染H1299细胞。图中显示了报告基因及其表达质粒的有(+)或无(-)。结果用对照报告载体(pGL3-E1b)的倍数形式表示。每个值都是3次重复的平均±SEM。

图9表示GATA-2 IS启动子通过单个PER蛋白对CLOCK和BMAL-1的转录活性进行负调节。用报告质粒(pGL3-3a-7)在有(+)或无(-)表达质粒存在条件下，对H1299细胞进行瞬时转染。每个值都是3次重复的平均±SEM。E：E-盒。

图10A-C表示mlats2b及mlats2c的整个结构及其核苷酸和蛋白序列。图10A表示mlats2b(SEQ ID Nos：4和5)的核苷酸和蛋白序列。图10B表示mlats2c(SEQ ID Nos：6和7)的核苷酸和蛋白序列。终止密码用星号标出。起始密码按照mLATS2序列(GenBank AccessionBAA92380，此处完整引用作为参考)来指定。公认的剪切位点用短箭头表示。公认的多聚腺苷酸信号用方框框住。数字每行第一个核苷酸或最后一个氨基酸的位点。PstI限制位点用下划线表示出。图10C表示mLATS2b和mLATS2c相对于mLATS2的总的结构。数字表示氨基酸位点。3个蛋白的N-端113个氨基酸(黑盒)是相同的。MLATS2c的49个氨基酸的插入用开盒表示。有网眼的盒子表示mLATS2b和mLATS2c之间的相同区域。图10C未按比例画。

图11表示mLATS2、mLATS2b和mLATS2c在小鼠骨髓的表达。在有(+)或无(-)逆转录酶存在条件下，进行RT-PCR来分析mLATS2、mLATS2b和mLATS2c在小鼠骨髓的表达。mLATS2(483bp)、mLATS2b(379bp)和mLATS2c(525bp)在小鼠骨髓的表达用箭头标出。

图12A-B表示mLATS2和mLATS2b在总的小鼠骨髓细胞的节律表达。图12A，表示不同时间点的mLATS2的mRNA的相对量。与光启动后4小时的值相比(t检验)，^*p＜0.05。图12B，表示不同时间点的Mlats2b的mRNA的相对量。与光启动后4和20小时的值相比(t检验)，^*p＜0.05。对应于mLATS2和mLATS2b转录物的DNA条带的强度以18S rRNA内对照来校准。在每次实验中，最高的校准后的水平定为100，由此来计算mRNA的相对量。每个时间点，lin^-细胞来源于两只小鼠的总骨髓细胞。每个值代表来源于三只小鼠的平均±SEM。底部的水平条代表明暗循环。ZT0和20的数据画了两次。

图13表示小鼠和人LATS2蛋白的比对和对比。上面的部分用氨基酸序列相似性的百分比来表示N-端区域和激酶区域内的高度同源性。数字表示氨基酸位置。水平条表示大约100个氨基酸。下面表示N-端区域的序列比对(小鼠LATS2，SEQ ID No：8；人LATS2，SEQ ID No：9)。mLATS2的GenBank Accession是BAA92380(此处完整引用作为参考)，hLATS2/KPM的GenBank Accession是AAF80561(此处完整引用作为参考)。相同碱基用阴影背景显示出来。用短划线表示缺口。

图14是一个表示神经递质类似物对NIH 3T3细胞的作用的条形图，其中NIH 3T3细胞用含有在mper1启动子的7.2kb区域控制下的荧光素酶的质粒pGL3-mPer1-7.2kb转染。暴露于10^-6M的毛喉素的细胞作为阳性对照，将细胞暴露于10^-6M异丙基肾上腺素(β-肾上腺素激动剂)，10^-6M心得安(β-肾上腺素拮抗剂)，10^-6M苯肾上腺素(α-肾上腺素拮抗剂)以及10^-6M苯妥拉明(α-肾上腺素拮抗剂)7小时。

                       发明详述

本发明涉及一种分子控制机制的识别，该控制机制可以用来在各种组织控制和操纵节律时钟系统，从而调节细胞生长和分化涉及的各种蛋白的表达，提供治疗疾病或与这些蛋白的过表达或表达不足相关的机体功能或活性的增强或调节的方法。在节律时钟系统所用的，控制以节律方式调节的各种蛋白表达的分子控制机制(即时钟控制基因或CCGs的产物)是在其上游或其它调控区域出现此处称为E-盒的元件。

CCGs的转录调节是一种重要的方式，节律时钟由此来执行其功能。时钟控制基因可以受到时钟组分(如CLOCK和BMAL1)的直接调节。如果一种时钟控制基因编码转录因子，那么该转录因子的节律积累可以引导下游基因的节律表达。其结果是，节律时钟可以同时控制许多基因。

E-盒是如下的核苷酸序列：CANNTG(SEQ ID No：1)，其中N可以是任何核苷酸。各种组织的所有CCGs被认为都是以在其上游或其它调节区域出现一或多个E盒为特征的。在大量不同的CCGs已经发现E盒的存在，也已表明正负调节子会影响CCGs的表达水平，本发明提供了控制CCGs表达的方法，因而，也就控制了涉及CCGs表达的一定表型的变化。

此处的“节律时钟系统”用来表示这样的意思，即无论在体内或体外，给细胞提供全部或部分节律时钟的正或负调节子(按照需要)。现在已知的正调节子是CLOCK和BMAL1，负调节子是PER1、PER2、PER3、TIM、CRY1和CRY2。这些调节子又称为时钟元件。

已知有大量的信号分子调节或调制节律时钟系统的正或负调节子的活性。例如，已知视交叉上核(SCN)产生的信号分子和糖皮质激素调节时钟元件。如此处所公开，已发现一些神经递质或其类似物有调节时钟元件的能力。此处的信号分子可以是上述的任何分子或其它以后识别的信号分子。

因而，靶细胞节律时钟系统的调制可以通过以下方式实施：将靶细胞暴露于SCN细胞的信号分子；将靶细胞暴露于糖皮质激素或能调节时钟元件的神经递质(或其类似物)。其它调节节律时钟系统的方法包括但不局限于，用一或多个时钟元件或信号分子的组成的或可诱导的工程基因转染靶细胞；将RNA分子或蛋白导入靶细胞(如融合蛋白)，其中的RNA编码或融合蛋白包含一个时钟元件或信号分子(或其活性片段)。调节靶细胞节律时钟系统的进一步方法包括在细胞所处的环境中调节氧化还原电位，即通过NADH含量、氧含量的调控或用羰基m-氯苯腙氰化物控制消耗率(Rutter等，“通过NAD辅因子的氧化还原状态调节时钟和NPAS2 DNA结合”， Science 293：510-514(2001)；Takahashi等，“在低PO₂下线粒体呼吸控制可以补偿细胞内氧成分”，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physio.283(3)：H871-878(2002)，此处均完整引用作为参考)或往培养基中添加乳酸；在某些组织(如肝脏)改变个体的喂养方案来调节节律时钟系统(参见Rutter等，“昼夜节律的代谢和控制)”，Annu.Rev.Biochem.71：307-331(2002)，此处完整引用作为参考)或改变个体的明暗循环暴露。其它调节节律时钟系统的方法，无论已有的或随后发展起来的，均可以用于本发明。

节律时钟系统可以按照本发明调节的靶细胞可以位于体内(即在靶组织或器官)或体外(即细胞培养或工程化组织)。

许多体内组织自然含有节律时钟系统，可以通过正或负调节子水平的控制达到调节时钟控制基因(CCGs)表达的目的，操纵节律时钟系统。已知具有组织特异节律控制系统的示例组织系统包括但不局限于：肝脏、胰腺、骨骼肌、睾丸、骨髓和心脏。为调控体内某种靶细胞的节律时钟系统，可以给予个体特异的信号分子或正或负调节子(如作为融合蛋白)或将RNA给予个体被靶细胞摄取。或用基因治疗方法(即用组成的或可诱导的表达)。最终，可以调整喂养计划或明、暗暴露循环来控制靶细胞(或组织)的节律时钟系统。

在体外调控培养的靶细胞的节律时钟系统的方法是：将培养的细胞与已知表达各种节律时钟基因并传递节律信号的SCN细胞系一起孵育。SCN细胞系优选位于同一培养液但不与靶细胞发生物理接触(即通过渗透性膜隔开)。合适的SCN细胞系包括通过将原代胎小鼠SCN细胞永生化而得到的SCN2.2(参见Earnest等，“源自大鼠视交叉上核的腺病毒ElA永生化细胞系的建立和特征”， J.Neurobiol.39(1)：1-13(1999)；Allen等，“超过预定时间的变化：来自永生化视交叉上核细胞的可扩散信号在培养的成纤维细胞调节昼夜节律性”， J.Neurosci.21(20)：7937-43(2001)，此处均完整引用作为参考)。SCN细胞会按照其正常的节律变化模式给培养细胞提供节律信号。另外，还可以将正或负调节子导入体外细胞。可以通过多种方式来实现此目的，包括但不局限于用已知的重组技术进行蛋白或RNA转导或基因构建体的重组表达。

体外系统

节律调节子的核苷酸序列是已知的：CLOCK(参见GenBankAccession NM_152221(人)和NW_000231(小鼠)，此处完整引用作为参考)，BMAL1(参见GenBank Accession NM_001178(人)和NW_000332(小鼠)，此处完整引用作为参考)；PER1(参见GenBank Accession NM_002616(人)和AF223952(小鼠)，此处完整引用作为参考)；PER2(参见GenBank Accession NM_022817和NM_003894(人)和NM_011066(小鼠)，此处完整引用作为参考)；PER3(参见GenBank AccessionNM_016831(人)和XM_124453(小鼠)，此处完整引用作为参考)；TIM(参见GenBank Accession NT_007933，NT_007914，和NT_004873(人)和XM_138545(小鼠)，此处完整引用作为参考)；CRY1(参见GenBankAccession NM_004075(人)和NM_007771(小鼠)，此处完整引用作为参考)和CRY2(参见GenBank Accession XM_051030(人)和XM_130307(小鼠)，此处完整引用作为参考)。

用常规的分子遗传学亚克隆基因片段的操作可以得到编码上述正或负调节子的DNA分子，如Sambrook等， 分子克隆：实验指南，ColdSprings Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)，和Ausubel等(ed.)， 现代分子生物学操作指南，John Wiley & Sons(New York，NY)(1999及其后续版)，此处完整引用作为参考。而且，还可以用PCR技术来获得DNA分子，其中所选的特异引物代表开放阅读框的上或下游末端。Erlich等， Science 252：1643-51(1991)，此处完整引用作为参考。

一旦获得目的DNA分子，就可以通过将编码开放阅读框的DNA分子与合适的调节序列连接来进行DNA构建，其中的调节序列包括但不局限于可操作性连接于DNA分子的5’端的启动子序列，可操作性连接于DNA分子的3’端的调控序列以及任何增强子元件、抑制子元件等。然后，可以将DNA构建体插入适当的表达载体。随后可以用载体转化宿主细胞，重组的宿主细胞可以表达正或负调节子。

要产生可以给予个体的RNA转录物或正或负调节子(即作为融合蛋白、非融合蛋白或其活性片段)，优选原核宿主细胞。当选择原核细胞进行随后的转化时，DNA构建体(即转基因)所用的启动子区域和多聚腺苷区域应当适于其特异宿主。现有技术已知大量的适于原核表达的合适的启动子(组成的或诱导的)、起始密码子、增强子元件以及多聚腺苷信号。关于基因表达最大化的综述参见Roberts和Lauer， 酶 学方法，68：473(1979)，此处完整引用作为参考。

另外，也可以用真核细胞，优选哺乳动物细胞来产生RNA转录物或正或负调节子。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不局限于：COS(如ATCC No.CRL 1650或1651)，BHK(如ATCC No.CRL 6281)，CHO(ATCC No.CCL 61)，HeLa(如ATCC No.CCL 2)，293(ATCC No.1573)，CHOP以及NS-1细胞。现有技术已知大量的适于真核表达的合适的启动子(组成的或诱导的)、起始密码子、增强子元件以及多聚腺苷信号。

无论选择何种宿主细胞，一旦目的DNA已用众所周知的分子克隆技术连接于其合适的调节区域，它便可以被导入合适的载体或用众所周知的转化方法直接导入宿主细胞(Sambrook等， 分子克隆：实验指南，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)，此处完整引用作为参考)。

重组DNA构建体可以通过转化，尤其是转导、连接、固相化、电泳或其它合适技术导入宿主细胞。合适的宿主包括但不局限于细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。宿主在适当的培养基中生长时，可以表达RNA或正或负调节子或信号分子，表达产物可以分离出来，如果必要的话可以进行纯化。RNA或正和/或负调节子或信号分子优选纯化形式(优选至少80％纯，更优选90％纯)，纯化可以用常规技术，包括蛋白回收的免疫纯化技术以及RNA回收的杂交技术。

本发明方法中的细胞的体外培养可以通过三维细胞培养装置或生物反应器进行，后者模拟天然的胞外基质和丰富表面区域，允许细胞在发生于天然组织的组织样细胞密度下相互作用。生物反应器可以有许多不同的配置，都可以提供三维结构。本型号的生物反应器在2000年11月17日提交的属于Wu等的美国专利申请序列号09/715,852以及2001年3月1日提交的属于Wu等的09/796,830中已有详述。

大体上讲，生物反应器包含一个容器，容器内有支架，各种细胞可以在其内生长于合适的培养基中。

容器的壁可以包含任何数量的材料如玻璃、陶瓷、塑料、聚碳酸酯、乙烯、聚乙烯氯化物、金属等。

支架可以由缠绕的纤维、有孔的颗粒或海绵或海绵样材料组成。合适的作支架的底物可以用多种材料制备，包括但不局限于天然多聚物如多糖和纤维蛋白；合成多聚物如多聚酰胺(尼龙)多聚酯、多聚氨基甲酸乙酯；半合成材料；无机物包括陶瓷和金属；珊瑚；明胶、聚丙烯酰胺；棉花；玻璃纤维；角叉藻聚糖和葡聚糖。示例性的缠结纤维包括但不局限于玻璃丝、钢丝和金属丝或纤维网。示例性的有孔颗粒包括但不局限于珠(玻璃、塑料等)、纤维素、琼脂、羟基磷灰石、处理或未处理的骨、胶原和Sephacryl、Sephadex、Sepharose、琼脂糖或聚丙烯酰胺等胶。“处理的”骨可以用以下不同的化学物质处理制得，如酸或碱溶液。这样的处理改变了骨的多孔性。如果理想的话，这些底物还可以用细胞外基质被覆，如胶原、基质胶、纤连蛋白、肝素硫酸盐、透明质硫酸盐及硫酸软骨素、层粘连蛋白、hemonectin或蛋白聚糖。

支架基本上具有多孔结构，孔径由目的细胞类型决定。本领域的技术人员都可以决定合适的孔径并通过合适的支架材料达到理想的孔径。通常，可以用约15-约1000微米的孔径。优选孔径在约100-约300微米。

另外，生物反应器还包含促进气体交换的膜。膜允许气体通过，厚度范围为约10-约100微米，优选约40-约60微米。膜置于底部的开口处或容器或小室的侧面。为了防止基质或细胞从生物反应器的过度泄漏，可以在开口的周围放置垫圈和/或在开口的下方或旁边放置固体盘并安装固定。

培养基置于多孔或纤维底物的上面或周围。合适的培养基应该能支持各种组织及其(可选择的)包含其中的任何从属细胞的生长和分化。示例性的培养基包括但不局限于(I)典型的培养基如Fisher′s培养基(Gibco)，Basal Media Eagle(BME)，Dulbecco′s Modified Eagle Media(D-MEM)，Iscoves′s Modified Dulbecco′s Media，最低基本培养基(MEM)，McCoy′s 5A培养基以及RPMI培养基，可选择性添加维生素及氨基酸溶液，血清和/或抗生素；(ii)特殊的培养基如MyeloCult^TM(Stem CellTechnologies)以及Opti-Cell^TM(ICN Biomedicals)或无血清培养基，如Stem Span SFEM^TM(StemCell Technologies)，StemPro34 SFM(LifeTechnologies)和Marrow-Gro(Quality Biological Inc.)。骨髓的优选培养基包括McCoy′s 5A培养基(Gibco)，以70％v/v使用，补充大约1×10^-6M的氢化可的松，大约50μg/ml青霉素，大约50mg/ml链霉素大约0.2mM L-谷氨酰胺，大约0.45％碳酸氢钠，大约1x MEM丙酮酸钠，大约1x MEM维生素溶液，0.4x MEM氨基酸溶液，大约12.5％(v/v)加热灭活的马血清，大约12.5％热灭活的FBS或自体固有的血清。

培养基中还可以添加上述类型的能调节或修饰CCGs表达和/或时钟元件的信号分子。

体内治疗

为增加正或负调节子在特异组织或细胞的表达水平，可以给予以蛋白为基础的递送系统、核酸递送系统或体外转染细胞。与本发明采取的方法无关，如果想对细胞的节律时钟系统进行操纵(即处理)，正或负调节子可以被细胞摄取或在其中表达。

一种将蛋白或多肽或RNA分子递送入细胞的方法涉及脂质体的使用。大体上讲涉及提供包含要递送的蛋白或多肽或RNA的脂质体，然后在能将蛋白或多肽或RNA递送入细胞的条件下将靶细胞与脂质体接触。

脂质体是由一或多个浓度梯度的脂双层组成的囊泡，可以装入水相。通常不漏，但如果膜上出现小洞或孔或者膜溶解或降解或者膜温度达到相转换温度就会泄漏。现代的通过脂质体的药物递送方法要求脂质体载体最终变成可以泄漏，将胶囊内的药物释放于靶位点。这可以通过，例如，被动的方式来完成，其中的脂双层在体内各种物质作用下随时间而降解。每个脂质体组成在循环中或体内的其它位点具有特征性的半衰期，通过控制脂质体组成的半衰期，脂双层降解的半衰期可以得到调节。

与药物的被动释放相比，主动药物释放涉及在脂质体囊泡诱导通透性改变的物质。可以构建当周围环境变酸时，就变得不稳定的脂质体膜(参见 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851(1987)；Biochemistry 28：908(1989)，此处完整引用作为参考)。当脂质体被靶细胞内吞后，例如，它们可以被导入酸性小体，使脂质体变得不稳定，从而释放药物。

也可以构建脂质体递送系统使其可以通过主动定向的方式(如通过在脂质体表面整合抗体或激素)在靶器官、组织或细胞积累，可以按照已知的方法来达到此目的。

可以按照下述方法来制备不同类型的脂质体，如Bangham等， J. Mol.Biol.13：238-252(1965)；Hsu等的美国专利5,653,996；Lee等的美国专利5,643,599；Holland等的美国专利5,885,613；Dzau等的美国专利5,631,237；Loughrey等的美国专利5,059,421，此处均完整引用作为参考。

另一种递送蛋白或多肽的方法按照Heartlein等的美国专利5,817,789，涉及嵌合蛋白的制备，此处完整引用作为参考。嵌合蛋白包括配体域和，例如，正或负调节子或其它信号分子。配体域对位于靶细胞上的受体是特异的。因而，当嵌合蛋白通过静脉给予或定位于靶器官位点时，嵌合蛋白会吸附于靶细胞，靶细胞将嵌合蛋白内化。有大量的方法可以使用，包括佐剂如Bioporter，以脂类为基础的转染试剂(可从Gene Therapy System获得)，Chariot(可从Active Motif获得；参见Morris等，“将生物活性蛋白递送入哺乳动物细胞的肽载体”， Nature Biotech.19：1173-1176(2001)，此处完整引用作为参考)，Pro-Ject，一种以阳离子脂类为基础的转染试剂(可从Pierce获得)以及TAT介导的融和蛋白(参见Becker-Hapak等，“TAT-介导的哺乳动物细胞蛋白转导”，Methods 24：247-256(2001)，此处完整引用作为参考)。

如果想得到目的蛋白或多肽或RNA分子在靶细胞的外源表达，可以将编码目的蛋白或多肽或RNA的DNA分子导入细胞。大体上包括如下步骤：提供编码RNA或正或负调节子或信号分子(见上述)的核苷酸分子，然后在能使RNA或正或负调节子或信号分子在细胞有效表达的条件下，将核苷酸分子导入细胞。优选在导入细胞前，将核苷酸分子插入表达载体。

转化哺乳动物细胞，使蛋白或多肽外源表达时，可以利用腺病毒载体。腺病毒基因转移系统可以很容易的制备和使用，参见Berkner，Biotechniques 6：616-627(1988)和Rosenfeld等，Science 252：431-434(1991)，WO93/07283，WO93/06223和WO93/07282，此处完整引用作为参考。也可以构建腺相关病毒基因转移系统来递送基因。这些系统的体内应用参见Flotte等， Proc.Nat′1 Acad.Sci.90：10613-10617(1993)；和Kaplitt等， Nature Genet.8：148-153(1994)，此处完整引用作为参考。其它类型的腺病毒载体在Wickham等的美国专利6,057,155；Bout等的美国专利6,033,908；Wilson等的美国专利6,001,557；Chamberlain等的美国专利5,994,132；Kochanek等的美国专利5,981,225；Spooner等的美国专利5,885,808；以及Curiel的美国专利5,871,727，此处完整引用作为参考)。

还可以使用改造过的可以形成感染性转化系统的逆转录病毒载体来将编码目的正或负调节子的核苷酸导入细胞。此类型的逆转录病毒载体之一种参见Kriegler等的美国专利5,849,586，此处完整引用作为参考。

无论所用的感染性转化系统是何种类型，都要能将核苷酸递送到特异的细胞类型。然后感染的细胞表达目的RNA或正或负调节子或信号分子来调节节律时钟系统。

另外，还可以将体外的转染细胞给予个体。例如，可以转染骨髓细胞，将其培养于前述的生物反应器，然后给予个体，在个体的骨髓定居来调控骨髓的节律时钟系统。

应用

如实施例所示，骨髓细胞受到节律时钟系统的直接调控，尤其是大量的CCGs在节律控制下在骨髓细胞表达。本发明一方面涉及在体内或体外控制骨髓细胞发育。本发明的该方面可以通过下述实施：提供具有节律时钟系统的骨髓细胞，在能有效控制骨髓细胞发育的条件下，操纵节律时钟系统。

发育可以调控的骨髓细胞包括但不局限于干细胞(如全能干细胞、多能干细胞、髓样干细胞、间充质干细胞(mesenchymal)和淋巴样干细胞)；骨髓祖细胞(如CFU-GEMM细胞、前B细胞、淋巴样祖细胞、前胸腺细胞、BFU-E细胞、CFU-Meg细胞、CFU-GM细胞、CFU-G细胞、CFU-M细胞、CFU-E细胞、CFU-Eo细胞)；骨髓前体细胞(如前单核细胞、原巨核细胞、原粒细胞、原单核细胞、晚幼红细胞、原红细胞、B-淋巴细胞前体以及T-淋巴细胞前体)以及特异功能的细胞(如自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、骨细胞包括破骨细胞和成骨细胞、牙齿细胞如成牙质细胞和破牙质细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞和巨噬细胞)。调控的结果是受影响的细胞进行自我更新、增强或调节功能或活性或者发育为某一类成熟的血或骨髓细胞(如巨核细胞、中性中幼粒细胞、嗜酸性中幼粒细胞、嗜碱性中幼粒细胞、红细胞、血小板、多形核嗜中性细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞、树突细胞、骨细胞和浆细胞)以及其它血细胞、肝脏细胞、神经元细胞、肌细胞、软骨细胞(chondrocytes，cartilage cells)、骨细胞包括破骨细胞和成骨细胞、牙齿细胞如成牙质细胞和破牙质细胞、脂肪细胞、造血辅助细胞、胰腺细胞、角膜细胞、视网膜细胞和心肌细胞。

可以操纵骨髓细胞来激活或失活其发育。

本发明的一个相关方面涉及在体内或体外控制干细胞自我更新、分化和/或功能的方法。实施方法如下：提供具有节律时钟系统的干细胞，在能有效控制干细胞自我更新、分化和/或功能的条件下操纵节律时钟系统。可以处理的干细胞包括但不局限于全能干细胞、多能干细胞、髓样细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、肌肉干细胞、脂肪组织干细胞、皮肤干细胞、肢体干细胞、造血干细胞、AGM(主动脉-性腺-中肾)干细胞、卵黄囊干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞、胚胎胚芽细胞以及淋巴样干细胞。

刺激分化的结果是干细胞定向发育为肝脏细胞、神经元细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、牙齿细胞、脂肪细胞、造血辅助细胞、胰腺细胞、角膜细胞、视网膜细胞或心肌细胞。

本发明另一方面还涉及调控区含有E-盒的各种CCGs的表达的控制。基因含有E-盒，因而其表达可以通过操纵节律时钟系统而控制的示例性蛋白包括但不局限于GATA-2(GenBank Accession NM_002050，此处完整引用作为参考)，GM-CSF(GenBank Accession AJ224148，此处完整引用作为参考)，IL-12(GenBank Accession U89323，此处完整引用作为参考)，IL-16(GenBank Accession AF077011，此处完整引用作为参考)，LATS-2及其变异(GenBank Accession NM_014572，此处完整引用作为参考)，BMP-2(参见gi|20559789：6481126-6891400人染色体20参考基因组毗连序列群，可从GenBank获得，此处引用作为参考)，BMP-4(see gi|20874093：c1747657-1642415小鼠WGS超毗连Mm14_WIFeb01_273和gi|22048717：c35056312-34329142人毗连序列群，可从GenBank获得，此处引用作为参考)，TERT(see gi|18560952：1-92564人毗连序列群和gi|20909147|ref|NW_000084.1|Mm13_WIFeb01_265鼠肌WGS超毗连序列群Mm13_WIFeb01_265，均可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，TGF-β1(参见gi|18590119：c1040201-951525人毗连序列群gi|20822543：1775929-1843023鼠肌WGS超毗连序列群Mm7_WIFeb01_149，均可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，TGF-β2(see gi|20835056：c3324644-3050222鼠肌WGS超毗连序列群Mm1_WIFeb01_22，均可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，TGF-β3(see gi|20909979：c31249210-30994966小鼠WGS超毗连序列群Mm12_WIFeb01_235，均可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，Piwi-like-1(参见gi|18601829：814574-1034194人毗连序列群，可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，C/EBP-α(参见gi|20826395：1538637-1613557小鼠WGS超毗连序列群Mm7_WIFeb01_157，均可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，DMP-1(see gi|20839315：8361795-8573110小鼠WGS超毗连序列群Mm5_WIFeb01_80，均可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，OASIS(参见gi|20841149：33045239-33303239小鼠WGS超毗连序列群Mm2_WIFeb01_27，均可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，Lhx-2(参见gi|17449540：c4011934-3862220人毗连序列群，可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，hox-B4(参见gi|17480533：1-609558H人毗连序列群，可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，Pax5(参见gi|17451799：c2761059-2564015人毗连序列群，可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)，以及CNTFR(参见gi|17451799：25577-74425人毗连序列群，可从GenBank获得，此处完整引用作为参考)。

无论其蛋白表达水平在细胞中受到调控的是何种CCG(体内或体外)，本发明均可以通过以下方法实施：提供具有节律时钟系统的细胞，在能有效控制CCGs表达的条件下操纵节律时钟系统。可以处理的细胞包括上述任何干细胞、造血和/或基质细胞如骨髓祖细胞和骨髓前体细胞以及在特定条件下成熟的血液或骨髓细胞。处理的结果是因所用的正或负调节子或信号分子的不同，靶CCGs的表达水平失活或激活。

因此，按照本发明，GATA-2的表达水平可以上调(激活)或下调(失活)，从而影响干细胞自我更新或分化。

同样地，按照本发明，GM-CSF的表达水平可以上调(激活)或下调(失活)，从而影响造血和/或基质细胞和/或干细胞的自我更新或分化。而且，GM-CSF的表达水平可以利用来治疗GM-CSF或其缺陷(deficiency)介导的疾病如I型神经纤维瘤、幼骨髓单核细胞白血病或骨髓增生障碍。而且，还可以用GM-CSF来增强免疫系统和/或影响细胞分化和/或潜能(如B族链球菌清除时所发生)(参见Online MendelianInheritance in Man(OMIM)138960，此处完整引用作为参考)。

CCGs还包括一或多种白介素，如IL-12和IL-16。按照本发明，IL-12和IL-16的表达水平可以上调(激活)或下调(失活)，从而影响造血和/或基质细胞和/或干细胞的自我更新或分化。而且，还可以用IL-12和IL-16来增强免疫系统和/或影响细胞分化和/或潜能。另外，IL-12还在预防UV-诱导的皮肤癌方面有作用(参见OMIM 161560和603035，此处完整引用作为参考)。

表达水平可以操纵的另一种CCG包括LATS2及其剪切变异体LATS2b和LATS2c。因而，按照本发明，LATS2及其剪切变异体的表达水平可以上调(激活)或下调(失活)，从而影响造血和/或基质细胞和/或干细胞的自我更新或分化。而且，LATS2(或其剪切变异体)的表达水平可以利用来治疗由其或其缺陷介导的疾病如癌症、白血病或其它增殖或恶性疾病(参见OMIM 604861，此处完整引用作为参考)。

同样地，按照本发明，TERT的表达水平可以上调(激活)或下调(失活)，从而影响造血和/或基质细胞和/或干细胞的自我更新或分化。而且，TERT的表达水平可以利用来治疗由其介导的疾病如癌症的不受复制衰老检查的无限生长。而且，TERT还可以用来提高体外细胞系的复制寿命。参见OMIM 187270，此处完整引用作为参考。

CCGs还包括一或多种形态发生蛋白，如BMP-2和BMP-4。按照本发明，BMP-2和BMP-4的表达水平可以上调(激活)或下调(失活)，从而影响造血和/或基质细胞和/或干细胞的自我更新或分化。而且，BMP-2和BMP-4可以用来影响骨细胞分化和发育(参见OMIM 112261和112262，此处完整引用作为参考)。

CCGs还包括一或多种生长因子、转录因子和分化诱导剂，如TGF-β1，-β2和-β3，Piwi-like-1，C/EBP-α，DMP-1，OASIS，Lhx-2，HoxB4，Pax5和CNTFR。因此，按照本发明，这些基因的表达水平可以上调(激活)或下调(失活)，从而影响造血和/或基质细胞和/或干细胞的产生、维持、自我更新和/或分化。尤其是，CNTFR能影响神经元细胞或干细胞的存活、扩展或分化；TGF-β1，-β2和-β3影响细胞存活、增殖。分化或诱导凋亡；Piwi-like-1能影响分裂；C/EBP-α能影响谱系定型(lineage commitment)；DMP-1能影响向牙齿细胞样细胞的分化；OASIS能影响成骨细胞分化和/或成熟；Lhx-2和HoxB4能产生、扩展或维持造血干细胞；Pax5能影响淋巴细胞发育、神经元细胞发育或精子发生。

按照本发明，与节律时钟系统的调节相关的是产生体外工程化组织的能力，工程化组织包括多个相互之间密切接触形成组织的细胞或细胞类型，其中至少一种细胞或细胞类型具有节律时钟系统，已被调控来调节组织中至少一个细胞或细胞类型的生长和发育。甚至工程化组织中所有的细胞或细胞类型都具有时钟节律系统，且所有细胞或细胞类型的节律时钟系统都可以被调控。

组织可以是骨髓、血液、血管、淋巴结、甲状腺、甲状旁腺、皮肤、脂肪、软骨、肌腱、韧带、骨、牙齿、牙本质、牙周组织、肝脏、神经组织、脑、脊髓、视网膜、角膜、骨骼肌、平滑肌、心肌、胃肠组织、泌尿生殖组织、膀胱、肺或肾组织。骨髓在上述型号的三维生物反应器的离体发育已有报道(参见Wu等的美国专利申请09/715,852，2000年11月17日提交和Wu等的09/796,830，2001年3月1日提交，此处均完整引用作为参考)。

细胞在体内的节律时钟系统可以用上述任何一种技术调控，包括但不局限于：控制光暴露、限制性喂养、给予糖皮质激素或其它能调控节律时钟的分子。其中包括由SCN天然产生的因子或设计或发现的能以某种方式调控节律时钟的分子。

培养的细胞或所列举的细胞类型或工程化组织的节律时钟系统可以用上述任何一种技术进行调控，包括但不局限于：与SCN共培养、转染培养的一或多种细胞类型或工程化组织以便其表达一或多种正或负调节子或信号分子、将一或多种正或负调节子(作为(TAT-)融合蛋白、RNA分子或信号分子导入基质被细胞或细胞类型所摄取、或者调节基质的氧化还原电位(例如通过羰基m-氯苯腙氰化物或往培养基中添加乳酸来控制氧含量和氧消耗率)。其它控制节律基因表达的方法包括按照预定的方式给予培养基或血清来调节培养细胞的节律。包括使用不同浓度的输送因子如SCN条件培养基或含有SCN信号分子、糖皮质激素和其它能调控节律时钟的分子的培养基。

通过控制体外工程化组织的节律时钟系统，有可能产生一种在细胞类型和数量上发育和成熟适宜的组织，以便能更容易地改进细胞将其导入具有自身节律时钟系统的病人体内。

                        实施例

以下实施例旨在解释本发明的实施方案，绝不是对本发明范围的限定。

在实施例中用到了以下材料和方法。

动物的饲养

为避免雌性小鼠的雌激素周期的干扰，全部使用雄性小鼠(Balb/c，3-4周龄；Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。小鼠买来后，在实验前，将其置于同一个屋子内进行为期两周的12:12明-暗驯服。为减小睡眠时相的影响，每个笼子放2-3只小鼠。在每个时间点，收集来自一个笼子内小鼠的骨髓细胞。操作在明-暗循环暗相的弱光下进行。

骨髓收集

在环境钟时间(Zeitgeber Time，ZT)0，4，8，12，16和20，将小鼠脱颈处死。(在ZT0，将灯打开，在ZT12，将灯关闭)。在不同实验中，均在ZT0或ZT20起始实验，以消除样品差异。取下小鼠的股骨，用含1％胎牛血清(FBS；Hyclone，Logan，UT)的洗液(McCoy′s 5A；Gibco，Gr和Is1和，NY)冲洗。一些实验中(实施例1-2)，每个时间点处死4-5只小鼠以便进行统计。需要进行RNA提取时，每个时间点收集的骨髓细胞用裂解缓冲液RLT(Qiagen，Valencia，CA)裂解，在总RNA提取前，贮存于-70℃(少于一周)(实施例5)。

Gr-1阳性细胞的分离：

用CEL凝集素亲合素结合试剂盒(Dynal)，根据制造商的说明书，用免疫磁珠分离Gr-1阳性细胞。简言之，即：将生物素化的大鼠抗小鼠Gr-1单克隆抗体和链亲合素偶联的聚苯乙烯磁珠在室温孵育30分钟，从而达到用生物素化的大鼠抗小鼠Gr-1单克隆抗体包被链亲合素偶联的聚苯乙烯磁珠的目的。将7×10⁶骨髓细胞与40μl的抗体包被磁珠混合，4℃孵育30分钟。然后用洗液洗涤磁珠，并用磁极分离。分离的细胞直接在磁珠上裂解，进行总RNA提取。为保证具有统计学意义，每个时间点处死4-6只小鼠。

Gr-1阳性细胞的流式细胞分析：

为用流式细胞仪分析免疫磁化分离细胞群的纯度，进行如下操作：按照操作指南，将样品细胞与生物素化的大鼠抗小鼠Gr-1单克隆抗体(Pharmingen)在4℃孵育30分钟。然后用1×磷酸缓冲盐(PBS；Gibco)洗涤细胞，将细胞与FITC-标记的羊抗兔IgG多抗(Pharmingen)4℃孵育30分钟。再次洗涤细胞，重悬于1×PBS中。阴性对照，则略去一级抗体。通过流式细胞仪对Gr-1阳性细胞的百分比进行定量，所用软件为EPICS Profile Analyzer(Coulter)，分析10,000个事件。

相对定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)(实施例1和2)：

RT-PCR实验时，每次分析六个时间点采集的样品。用RNeasy MiniKit(Qiagen)，按照说明书，从Gr-1阳性或未分离的骨髓细胞纯化总RNA。DNase(Promega)处理后，用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT；Stratagene)对大约2μg总RNA进行逆转录。然后90℃5分钟使逆转录酶失活。按照说明书，使用内对照(定量RNA18S内标；Ambion)对不同时间点的mPer1和mPer2 mRNA进行相对定量分析。18S非复制竞争引物(Competimer；Ambion)携带修饰的3’末端，可以阻断DNA聚合酶的延伸。18S非复制竞争引物与18S引物的比率为9∶1，以降低18S cDNA信号相对于靶基因的量。18S cDNA和靶cDNA(mPer1或mPer2)在同一PCR管里共扩增。下表1所示为mPer1的特异引物((PER1F，SEQ ID No：10和PER1R，SEQ ID No：11)和mPer2的特异引物(PER2F，SEQ ID No：12和PER2R，SEQ ID No：13)。

表1：Per1和Per2的RT-PCR引物

                                             GenBank

引物   序列(5’→3’)

                                             Accession   核苷酸位置

PER1F  CCTCCACTGTATGGCCCAGACATGAGTG          AF022992    205-232

PER1R  GCACTCAGGAGGCTGTAGGCAATGGAC           AF022992    524-550

PER2F  CAGCAATGGCCAAGAGGAGTCTCACCGGAG        AF035830    1621-1650

PER2R  CCGGGATGGGATGTTGGCTGGGAACTCGC         AF035830    1952-1980

表1中每个GenBank Accession均完整引用作为参考

PCR实验时，先用6个时间点的cDNA库决定PCR扩增的线性范围。用Taq DNA聚合酶(AdvantagecDNA Polymerase Mix；Clontech)在含0.8mM dNTP的1×PCR缓冲液(Clontech)中进行PCR，反应条件如下：94℃3分钟，然后94℃30秒，60℃45秒和72℃1分钟，共进行28-32(根据线性范围)个循环，随后72℃延伸7分钟。阴性对照则不加逆转录酶，RT反应产物进行同样的PCR扩增。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳(Gibco)对PCR产物进行分析，用荧光染料染色(GelStar；FMC)，用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)相对定量。

分类细胞计数：

用细胞离心机(Sh和on，Sewickly，PA)对4×10⁴细胞/玻片在700rpm下离心5分钟，制得细胞离心涂片。离心后，将玻片空气干燥，用Wright’s染料((Georetric Data，Wayne，PA)染色20分钟，蒸馏水洗涤2分钟。然后用光学显微镜(Olympus，Melville，NY)进行分类细胞计数，随机计数100个以上细胞。

免疫磁化细胞分离

将骨髓细胞与ACK裂解缓冲液(0.15M NH₄Cl，1mM KHCO₃和0.1mM Na₂EDTA；pH7.2)在室温孵育4分钟，除去红细胞。按照说明书，用MACS磁性分离系统(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)除去谱系标记-阳性细胞，得到lin^-(谱系标记阴性)骨髓细胞。所用抗体为PE-标记的大鼠抗小鼠Gr-1，TER119，B220，CD4，CD8和Mac-1单抗(均购自BD PharMingen，San Diego，CA)。简言之，即：将细胞与上述的谱系标记抗体鸡尾酒在6-10℃孵育15分钟。用含0.5％FBS(Hyclone)的1×磷酸缓冲盐(PBS；Sigma，St.Louis，MO)洗涤两次，然后与抗-PE抗体包被的磁珠(Miltenyi Biotec)在6-10℃孵育15分钟。接着用含0.5％FBS(Hyclone)的1×PBS(Sigma)洗涤，用磁柱(MiltenyiBiotec)去除阳性细胞。

相对定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)(实施例3)：

RT-PCR实验时，每次分析六个时间点采集的样品。用RNeasy MiniKit(Qiagen)，按照说明书，从lin^-或未分离的骨髓细胞纯化总RNA。用SUPERSCRIPT II逆转录酶(Gibco)，随机引物((Invitrogen，Carlsbad，CA)对从10⁶个未分离的骨髓细胞和2×10⁵个lin^-细胞提取的总RNA在20μl进行逆转录，反应条件为42℃60分钟。按照说明书，使用内对照(定量RNA18S内标；Ambion)对不同时间点的mPer1、mClock或GATA-2的mRNA进行相对定量分析。18S非复制竞争引物(Competimer；Ambion)携带修饰的3’末端，可以阻断DNA聚合酶的延伸。18S非复制竞争引物与18S引物的比率为10∶1，以降低18S cDNA信号相对于靶基因的量。18S cDNA和靶cDNA(mPer1、mClock或GATA-2)在同一PCR管里共扩增。

PCR实验时，先用6个时间点的cDNA库决定PCR扩增的线性范围。用Taq DNA聚合酶(AdvantagecDNA Polymerase Mix；Clontech)在含0.8mM dNTP的1×PCR缓冲液(Clontech)中进行PCR，反应条件如下(mPer1、mClock或GATA-2 IG转录物)：94℃孵育3分钟，然后94℃30秒，60℃45秒和72℃1分钟，共进行25-33(根据线性范围)个循环，随后72℃延伸7分钟。GATA-2 IS转录物在96℃孵育1分钟，然后96℃20秒，68℃1分钟，共进行28-33(根据线性范围)个循环。RT-PCR所用引物为：mPer1的正向和反向引物分别为((SEQID Nos：10和14，)；mPer2的正向和反向引物分别为(SEQ ID Nos：15和16)；mClock的正向和反向引物分别为(SEQ ID Nos：17和18)；GATA-2 IG的正向和反向引物分别为(SEQ ID Nos：19和20)；GATA-2 IS的正向和反向引物分别为(SEQ ID Nos：21和22)(如下述表2所总结)。

表2：mPer1、mPer2、mClock、GATA-2 IG和GATA-2 IS的RT-PCR引物

                                             GenBank

靶基因       引物序列(5’→3’)

                                             Accession   核苷酸位置

mPer1        CCTCCACTGTATGGCCCAGACATGAGTG    AF022992    205-232

             ATGGGCTCTGTGAGTTTGTACTCTT       AF022992    496-520

mPer2        CAGCAATGGCCAAGAGGAGTC           AF035830    1621-1641

             CCGGGATGGGATGTTGGCTGGGAACTC     AF035830    1950-1978

mClock       ATGGTGTTTACCGTAAGCTGTAG         AF000998    389-411

             CCAGTACTGTCGAATCTCACTAG         AF000998    666-688

GATA-2 IG    CACCCCTATCCCGTGAATCCGCC         AF448814    1433-1455

             AGCTGTGCTGGCTCCATGTAGTTAT       AB000096    246-270

GATA-2 IS    TGGCCTAAGATCACCTCAACCATCG       AB009272    1638-1662

             AGCTGTGCTGGCTCCATGTAGTTAT       AB000096    246-270

表2中每个GenBank Accession均完整引用作为参考

阴性对照则不加逆转录酶，RT反应产物进行同样的PCR扩增。然后用2％的琼脂糖凝胶电泳(Gibco)对PCR产物进行分析，用荧光染料染色(GelStar；FMC)，用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)相对定量。

为检测地塞米松和佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸(PMA)对mPer1和mPer2表达的影响，将lin^-细胞与含有200nM地塞米松(Sigma)或1μM PMA(Sigma)的RPMI 1640在有湿度的37℃5％CO2孵箱中孵育1或2小时。对照组包含同样量的乙醇来溶解溶液中各自的试剂。如前所述进行相对定量RT-PCR。

小鼠GATA-2基因5’区域的分析：

从小鼠基因组DNA克隆3a(Dr.Masayuka Yamamoto，TohokuUniversity，Japan惠赠)纯化噬菌体DNA，其中包含小鼠GATA-2基因的5’区域(Minegishi等，“选择性启动子调节小鼠GATA-2基因的转录”，J.Biol.Chem.273(6)：3625-3634(1998)，此处完整引用)，然后用NotI消化和EcoRI部分消化，亚克隆入pBluescript II KS(-)载体(Stratagene，La Jolla，CA)。得到6个明确的克隆(图4)。分离的质粒然后用限制酶Pml I(New England Biolab，Beverly，MA)消化来识别和定位CACGTG(SEQ ID No：2)E-盒。

瞬时转染分析(实施例3和4)：

如下进行荧光素酶报告构建体：克隆3a-7用KpnI和SacI消化，将所切下来的插入片段克隆入pGL3-Basic((Promega，Madison，WI)的相同位点，构建pGL3-3a-7。除去pGL3-3a-7的EcoRI位点和第三个PmlI位点或第一个PmlI位点和Xba I位点(5′到3′)之间的DNA片段，分别产生pGL3-3a-31或pGL3-3a-39。pGL3-Elb报告载体源自pG5Elb-Luc(Hsiao等，“Kennedy′s神经原疾病与第一个识别的与雄激素受体多谷氨酰胺区域偶联的共激活剂ARA24之间的联系”， J.Biol. Chem.，274(29)：20229-20234(1999)，此处完整引用，但将其中的5个GAL4结合位点替换为pBluescript II KS(-)载体(Stratagene)的多克隆位点(从KpnI到XbaI)。PCR扩增相应于图4中76-351的核苷酸，将其克隆于pGL3-Elb的EcoRI和BamHI位点，产生pGL3-Elb-Ges。通过重叠延伸PCR产生其中单个或所有E-盒((CACGTG，SEQ ID No：2)元件突变为GGATTC(SEQ ID No：23)的同样的插入。将变异的插入克隆于EcoRI-BamHI双消化的pGL3-Elb，分别产生pGL3-Elb-GesM1、pGL3-Elb-GEsM2、pGL3-Elb-GEsM3和pGL3-Elb-GEsM123。PCR扩增相应于图4中76-223、139-299和235-351的核苷酸，然后将其克隆于pGL3-Elb的EcoRI和BamHI位点，分别产生pGL3-Elb-GEl，pGL3-Elb-GE2和pGL3-Elb-GE3。mPER1、mPER2和mPER3的表达质粒(Jin等，视交叉上核来源的分子机制调节的节律输出”， Cell 96(1)：57-68(1999)，在此完整引用)由哈佛医学院的Steven M.Reppert博士惠赠。仓鼠BMAL1(hBMAL1)(Gekakis等，“CLOCK蛋白在哺乳动物节律机制中的作用”， Science 280(5369)：1564-1569(1998)，在此完整引用)由哈佛医学院的Charles J.Weitz博士惠赠。mCLOCK的全长cDNA(由西南大学的Joseph S.Takahashi博士惠赠)，亚克隆于pcDNA3(Invitrogen).用退火的寡聚核苷酸5′-AATTCAGACATGAGTGGTCCCCTA-3′(SEQ ID No：24)和5′-CGTAGGGGACCACTCATGTCTA-3′(SEQ ID No：25)替换mPER1表达质粒的EcoRI-ClaI之间的片段，产生mPER1ΔPAS。该质粒中去除了mPER1的6-515位氨基酸。H1299细胞保存于含10％FBS(Hyclone)的RPMI1640(Gibco)中。NIH3T3细胞保存于含10％FBS(Hyclone)的DMEM(Gibco)中。转染前，将细胞加入六孔板，每孔3×10⁵细胞。细胞用500ng的各表达质粒、100ng的萤火虫荧光素酶报告基因构建体以及2ng的海洋腔肠动物(Renilla)荧光素酶对照质粒(pRL-SV40；Promega)转染，转染所用试剂为Superfect转染试剂(Qiagen)，按照说明书进行操作。将海洋腔肠动物荧光素酶对照质粒共转染来对转染效率进行校准。不加表达质粒时，用同样量的pcDNA3代替。转染后40小时，细胞用1×PBS洗涤，用500μl的被动裂解缓冲液(Promega)裂解。然后按照制造商的建议，用荧光检测仪(Optocompl；MGM Instruments)，双荧光素酶报告分析系统分析细胞的荧光素酶活性。

RNA随机引物PCR(RAP-PCR)(实施例5)：

用RNeasy Mini Kit(Qiagen)，按照说明书，从骨髓细胞纯化总RNA。用RAP-PCR试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)，按照说明书，进行RAP-PCR。DNase(Promega，Madison，WI)处理之后，用随机引物A2(Stratagene)从1μg总RNA合成第一链cDNA，条件为37℃60分钟。所合成cDNA的1/4用同样的随机引物在下述条件下进行PCR：第一个循环为94℃1分钟，36℃5分钟，72℃5分钟，然后94℃1分钟，52℃2分钟和72℃2分钟进行40个循环。PCR产物用7M尿素6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染进行鉴定(Pharmacia，Piscataway，NJ)。切割差异条带并从胶中提取DNA、扩增、克隆和测序。然后用BLASTn搜索程序在GenBank上将DNA序列用各数据库进行比较。

相对定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)(实施例5)：

RT-PCR实验时，每次分析六个时间点采集的样品。用RNeasy MiniKit(Qiagen)，按照说明书，从2×10⁶骨髓细胞纯化总RNA。用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT；Stratagene)，随机引物(Stratagene)对1/6总RNA在20μl体系中进行逆转录，条件为37℃60分钟。按照说明书，使用内对照(定量RNA18S内标；Ambion)对不同时间点的所述mRNA进行相对定量分析。18S非复制竞争引物(Competimer；Ambion)携带修饰的3’末端，可以阻断DNA聚合酶的延伸。18S非复制竞争引物与18S引物的比率为9∶1，以降低18S cDNA信号相对于靶基因的量。18S cDNA和靶cDNA(6A-2-9、mlats2或mlats2b)在同一PCR管里共扩增。如下表所示，克隆6A-2-9所用引物为正向引物1(SEQID No：26)和反向引物4(SEQ ID No：31)，mlats2所用引物为正向引物1(SEQ ID No：26)和反向引物1(SEQ ID No：28)，mlats2b所用引物为正向引物1(SEQ ID No：26)和反向引物2(SEQ ID No：29)。正向引物2是SEQ ID No：27，反向引物3是SEQ ID No：30。

表3：mlats、mlats2、mlats2b和mlats2c的PCR引物

                                       GenBank

引物       序列(5’→3’)              Accession    核苷酸位置

正向引物1  AAGGAAACTGGACTAACAATGAGGC   AB023958     116-140 in mlats2

正向引物2  CACTGACACTGTTGACTGTTCTCT    AB023958     50-63 in mlats2

反向引物1  GGTCTGCTTGATGACTCGCACAATC   AB023958     574-598 in mlats2

反向引物2  GACACGCACCAGGAATATGCATCTG   AY015061     421-445 in mlats2b

反向引物3  ACACGCACCAGGAATATGCATTGT    AY015062     568-591 in mlats2c

反向引物4  ATCTGCCGGTTCACCTCTGCAGC     AB023958     416-438 in mlats2

表3中每个GenBank Accesion均完整引用作为参考

PCR实验时，先用6个时间点的cDNA库决定PCR扩增的线性范围。用Taq DNA聚合酶(AdvantagecDNA Polymerase Mix；Clontech)在含0.8mM dNTP的1×PCR缓冲液(Clontech)中进行PCR，反应条件如下(mPer1、mClock或GATA-2 IG转录物)：94℃孵育3分钟，然后94℃30秒，58℃(6A-2-9和mlats2)或62℃(mlats2b)30秒和72℃30秒，共进行25-30(取决于线性范围)个循环，随后72℃延伸7分钟。阴性对照则不加逆转录酶，RT反应产物进行同样的PCR扩增。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳(Gibco)对PCR产物进行分析，用荧光染料染色(GelStar；FMC)，用Image-Pro Plus软件(MediaCybernetics)相对定量。

3’-cDNA末端的快速扩增(RACE)

用RNeasy Mini Kit(Qiagen)，按照说明书，从骨髓细胞纯化总RNA。用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH)，按照说明书，进行3’-cDNA末端的快速扩增(RACE)。简言之，即用含有oligo(dT)和通用引物结合序列(CLONTECH)的引物进行cDNA第一链的合成。然后用正向引物1(见上表3)和通用引物(CLONTECH)按照如下进行PCR：94℃5秒、70℃10秒和72℃3分钟，共5个循环，接着94℃5秒、68℃10秒和72℃3分钟，共30个循环。将PCR产物克隆于pCRII-TOPOTA克隆载体((Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后用373 AD DNA测序仪(Applied Biosystems)进行测序。

逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)(实施例6)：

DNase(Promega)处理后，用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT；Stratagene)及随机引物，对大约2μg小鼠骨髓细胞来源的总RNA在在20μl体系中进行逆转录。所得反应混合物(2.5μl)作为PCR模板，用Taq DNA聚合酶(AdvanTaq Plus DNA Polymerase；Clontech)在25μl体系，下述条件下进行PCR：94℃孵育3分钟，然后94℃10秒，58℃30秒和72℃30秒，共进行35个循环，随后72℃延伸7分钟。mlats2所用引物为正向引物1和反向引物1，mlats2b所用引物为正向引物1和反向引物2。mlats2c所用引物为正向引物2和反向引物3，见上表3所示。

不同小鼠组织基因表达的PCR分析(实施例5)：

用基于PCR的方法，通过RAPID-SCAN Gene Expression Panel(OriGene，Rockville，MD)，来分析mlats2、mlats2b以及mlats2c在不同小鼠组织的表达概况。参照说明书，通过从成年Swiss Webster小鼠的不同组织分离总RNA，来制备表达条。分离Poly-A⁺RNA，用Oligo(dT)引物进行第一链cDNA合成。确保cDNA库无基因组DNA的污染。每种组织1ng的cDNA作为模板，来分析mlats2、mlats2b以及mlats2c表达。各种拼接突变体的特异引物如上所述。mlats2和mlats2b在同一PCR管中进行共扩增。PCR条件同上所述的RT-PCR。对于β-肌动蛋白，则按照说明，用各种组织来源的1pg的cDNA和β-肌动蛋白引物(OriGene)。

质粒构建：

通过将完整的mLATS2开放读码框(由Osaka大学的Dr.Hiroshi惠赠)或BamHI-NotI片段分别插入pcDNA3(Invitrogen)的BamHI和XhoI位点或BamHI和NotI位点，产生pcDNA3-mLATS2和pcDNA3-mLATS2N373。将PCR产生的mlats2b的完整编码区插入pGBKT7(CLONTECH)的NdeI和SmaI位点，与GAL4 DNA结合域的框架一致，得到pGBKT7-mLATS2b。同样的PCR产物还克隆入pcDNA3，产生pcDNA3-mLATS2b。通过将pcDNA3-mLATS2的BsmI-XhoI片段，插入pGBKT7-mLATS2b的BsmI和Sal位点，得到IpGBKT7-mLATS2。通过去除pGBKT7-mLATS2的NotI片段，得到pGBKT7-mLATS2N373。通过去除pGBKT7-mLATS2b的PstI片段，得到pGBKT7-mLATS2N96。用小鼠总骨髓制备的cDNA PCR扩增得到mRBT1的编码区，将其克隆于pM(CLONTECH)的EcoRI和PstI位点，与GAL4 DNA结合域的框架一致，得到pM-mRBT1。所用引物为5′-TCGCCGGTTCATGGGAGGCTTAAAGAGG-3′(SEQ ID No：32)和5′-GCGGCTGCAGCTTTAGGATCCCAGGAT-3′(SEQ ID No：33)。同样的PCR产物还克隆入pGADT7(CLONTECH)的EcoRI和SmaI位点，与GAL4 DNA结合域的框架一致，产生pGADT7-mRBT1。从pGADT7-mRBT1去除xhoI片段，得到pGADT7-mRBTlN121。将编码mRBT1的C-末端76个氨基酸的PCR产物，克隆于pGADT7的EcoRI和SmaI位点，得到pGADT7-mRBT1 C76。同样的PCR产物还克隆入pM(CLONTECH)的EcoRI和PstI位点，产生pM-mRBTlC76。如前所述(Hsiao等，“Kennedy′s神经原疾病与ARA24-第一个识别的与雄激素受体多谷氨酰胺区域偶联的共激活剂-之间的联系”， J.Biol. Chem.，274(29)：20229-20234(1999)，此处完整引用作为参考)，产生pG5-Elb-LUC。

酵母双杂交分析：

用MATCHMAKER GAL4双杂交系统3(CLONTECH)，按照说明，进行酵母双杂交，人骨髓MATCHMAKER cDNA文库购自CLONTECH。如下制备感受态细胞(AH109)：接种单个克隆于YPD培养基(2ml；2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)，30℃振摇孵育过夜。然后将过夜的培养物(100μl)转入25mlYPDA培养基(YPD培养基中加入0.003％的腺嘌呤)，30℃振摇培养过夜，至稳定期。进而将过夜培养物转入150ml的YPDA培养基，再培育2-3小时。收集细胞，并用35ml蒸馏水洗涤。最后，将细胞重悬于0.75ml 1×TE/LiAc溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA和0.1M的LiAc，pH7.5)。按照说明，用诱饵和文库质粒转化细胞。转化后，将细胞置于四种缺失(-Ade/-His/-Leu/-Trp)的平板，筛选阳性蛋白-蛋白相互作用。四种缺失平板上生长的克隆进一步用在含有X-α-Gal(CLONTECH)的平板上长出蓝色克隆来确认。用DNA测序仪(Perkin-Elmer ABI 377)对阳性克隆中的插入片段进行测序。

哺乳动物单杂交分析：

NIH3T3用含10％FBS(Hyclone)的DMEM培养基维持培养。转染前一天，按照3×10⁵细胞/孔的量将其加入六孔培育板。用Superfect转染试剂(Qiagen)，用说明所示量的表达质粒，即100ng的pG5-Elb-LUC和4ng的海洋腔肠动物荧光素酶对照质粒(pRL-SV40；Promega)转染细胞。海洋腔肠动物荧光素酶对照质粒共转染以使转染效率正常化。同时加入质粒pcDNA3，使质粒总量达到1.6μg/孔。转染后40小时，用磷酸缓冲盐(PBS；Gibco)洗涤一次，然后用500μl的被动裂解缓冲液(Promega)裂解细胞。然后按照制造商的建议，用荧光检测仪(Optocompl；MGM Instruments)，双荧光素酶报告分析系统分析细胞的荧光素酶活性。

Southern印迹分析

用Genomic-tip 500柱(Qiagen)，按照说明书，从骨髓细胞纯化基因组DNA。基因组DNA(10μg)用PstI消化，0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离。然后通过毛细作用，将DNA转移到带正电的尼龙膜(BoehringerMannheim)上。然后用通过PCR产生的地高辛标记探针，进行Southern印迹分析。地高辛标记探针用地高辛探针合成试剂盒(BoehringerMannheim)，按说明书操作而合成，简单步骤如下：将膜用阻断液(Boehringer Mannheim)在42℃封闭2小时。杂交用含有地高辛标记探针的DIG Easy Hyb(Boehringer Mannheim)杂交缓冲液(终浓度25ng/ml)在42℃下过夜进行。杂交后，将膜用2×洗液(2×SSC和0.1％SDS)在室温下，洗涤两次，每次5分钟，然后再用0.5×洗液(0.5×SSC和0.1％SDS)在68℃下，洗涤两次，每次5分钟。然后用碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体和化学发光底物CSDP(Boehringer Mannheim)进行检测，化学发光用X-光胶片进行检测(Kodak，Rochester，NY)。

实施例1  骨髓mPer1和mPer2节律表达的检测

首先用RT-PCR证实mPer1和mPer2基因在骨髓有表达，所用引物(见上表1所示)为mPer1的特异引物(PER1F，SEQ ID No：10和PER1R，SEQ ID No：11)和mPer2的特异引物(PER2F，SEQ ID No：12和PER2R，SEQ ID No：13)。然后用相对定量RT-PCR，同样的引物，分析其mRNA水平，检测这两种基因的时间依赖和节律表达。为消除管与管之间的差异，用18SrRNA作为内对照。18SrRNA通常比靶mRNA丰度高，所以通常会观察到18SrRNA的过度扩增。为解决这一问题，如上所述，将18S引物与18S非复制竞争引物(Competitor；Ambicon)混合，来降低18S的PCR扩增效率。用18ScDNA复制子对不同时间点靶mRNA的量进行校准，然后比较其相对表达量。

如实验设计，阴性对照未加逆转录酶，所以无PCR产物。而随着实验进行，不同时间点采集的所有骨髓样品均可以检测到mPer1的RT-PCR产物。mPer1的mRNA量以时间依赖的方式变化(图1A-B)。用单向ANOVA(p＜0.01)分析，发现其节律变异具有统计学意义。24小时内，分别在ZT0和ZT8出现两个峰。mPer1的mRNA水平的峰-谷幅度是1.9倍。

同样地，所有骨髓样品均可以检测到mPer2的RT-PCR产物，且24小时内，mPer2的mRNA量有差异(图2A-B)。此种昼夜节律差异有显著统计学意义(单向ANOVA，p＝0.07)。而且，与mPer1的模式相似，在ZT20-0之间一个峰，ZT8一个峰。mPer2的mRNA水平的峰-谷幅度是1.7倍。

实施例2  Gr-1阳性细胞mPer1和mPer2的节律表达

为验证mPer1和mPer2的表达模式是否是谱系依赖性的，检测了mPer1和mPer2在髓样细胞的表达。用抗-Gr-1抗体包被的磁珠纯化髓样细胞。流式细胞证实Gr-1阳性部分的纯度将近95％。基于细胞形态的分类细胞分析证实Gr-1阳性部分主要由髓样细胞组成。检测发现，Gr-1阳性部分的mper1(图3A)和mPer2(图3B)的表达模式与未分离的骨髓细胞不同，只在ZT8呈现一个明显的峰(t检验，p＜0.05)。结果表明骨髓的节律基因表达是谱系和/或分化阶段特异的。

实施例1和2的讨论

据报道，人体某些细胞因子的血清浓度在24小时内会有变化，包括促红细胞生成素、肿瘤坏死因子α、白介素(IL)-2、IL-6、IL-10和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等((Sothern等，“临床健康人体血和尿中IL-6的昼夜节律表达”， In Vivo 9：331-339(1995)；Young等，“人体血清IL-2、IL-10、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的昼夜节律性”， Chronobiol.Int.12：19-27(1995)；Wide等，“人体血清促红细胞生成素的昼夜节律性”， Br.J.Haematol.72：85-90(1989)，此处均完整引用作为参考)。然而，并没有直接证据表明促红细胞生成素的昼夜节律与血清中细胞因子的变化有关联。最近的研究(Perpoint等，“小鼠髓样祖细胞中重组小鼠IL-3和小鼠GM-CSF以及人G-CSF的时间药理学”Exp.Hematol.23：362-368(1995)，此处完整引用作为参考)表明小鼠CFU-GM对CSFs的应答以昼夜节律模式变化。而且，这种变化不依赖于所测CSF的类型和剂量。这些结果表明，促红细胞生成素的昼夜节律不只是对血清细胞因子浓度变化的被动应答，髓细胞受独立时钟控制的影响。但是，究竟是骨髓中存在内部时钟还是已知的时钟成分在骨髓细胞中表达，尚属未知。

实施例1和2表明小鼠骨髓细胞表达mPer1和mPer2(两种已知的时钟成分)。还表明，mPer1的表达在24小时周期中有较大变化。尽管mPer2表达的变化不如mPer1显著，但表达模式非常类似。

不像其它组织，mPer1和mPer2在小鼠骨髓的表达模式在24小时周期中出现两个峰。已有报道表明，如在CFU分析和细胞循环分析所观察的那样，不同的细胞谱系呈现不同的昼夜节律循环(Wood等，“以髓前体增殖动力学及髓样和类红祖细胞以及多能细胞克隆发生为特征的不同昼夜节律时间结构”， Exp.Hematol.26：523-533(1998)，此处完整引用作为参考)。与此相一致，mPer1和mPer2的节律表达模式在Gr-1阳性细胞和未分离的骨髓细胞是不同的。在未分离骨髓细胞观察到的节律基因表达的第二个峰主要由Gr-1阳性细胞引起。因此，mPer1和mPer2在骨髓的节律表达是谱系和/或分化阶段依赖性的。

已表明，时钟系统的输出是通过时钟控制基因(CCGs)控制的。在肝脏，白蛋白位点D结合蛋白(DBP)，一种在肝脏高表达的转录因子是一种CCG(Ripperger等，“时钟，一种基本的节拍器组分，控制节律转录因子DBP的表达”， Genes Dev.14：679-689(2000)，此处完整引用作为参考)，其表达在时钟基因的控制下。而且，一些DBP介导的基因也以节律方式表达(Lavery等，“小鼠肝脏类固醇15α-羟化酶(Cyp2a4)和香豆素7-羟化酶(Cyp2a5)的节律表达是由PAR亮氨酸拉链转录因子DBP调节的”，Mol.Cell.Biol.19：6488-6499(1999)，此处完整引用作为参考)。因而，肝脏的时钟系统似乎介导DBP基因的节律表达，后者又反过来驱动下游靶基因的节律表达。以前报道的促红细胞生成素的节律变化以及本发明所示的mPer1和mPer2在骨髓的变化表明，在骨髓很可能也存在类似的时钟系统。因此，在骨髓识别CCGs并将内部时钟和促红细胞生成素的细胞活性相联系是很有意义的。

前述的实验第一次表明，两种已知的时钟基因mPer1和mPer2在骨髓细胞有表达。而且，提供证据支持谱系和/或分化阶段依赖性的昼夜节律，并且为了解控制造血发生节律变化的分子机制提供了支持。

实施例3  小鼠骨髓GATA-2基因的节律表达

已有报道表明，mGATA-2调节造血干/祖细胞的增殖和分化。尤其是mGATA-2的表达水平对其功能是很关键的。因此认为mGATA-2的表达受到骨髓节律时钟的调节。为验证这一假说，对小鼠骨髓mGATA-2基因24小时的表达模式进行了检测。已报道(Minegishi等，“选择性的启动子调节小鼠GATA-2基因的转录”， J.Biol.Chem.273(6)：3625-3634(1998)，此处完整引用作为参考)mGATA-2基因存在两种不同的第一外显子(IS和IG)。为识别包含不同第一外显子(IS和IG转录物)的转录物，PCR分析时使用IS或IG特异的引物(参见表2)。在总骨髓中，IG转录物的表达有显著变化(单向ANOVA，p＜0.05)并呈现节律模式，而IS转录物的表达却未观察到(图6)。

为检测IS转录物的节律表达模式，如上所述，通过从小鼠骨髓细胞去除谱系标记阳性的细胞，得到lin^-的细胞。在明-暗循环的的不同时间点采集的lin^-细胞中，都检测到IS和IG转录物的表达。令人惊讶的是IG转录物的表达在24小时内无变化，而IS转录物的表达却有有显著变化(单向ANOVA，p＜0.05)并呈现节律模式(图7)。IS转录物的mRNA水平峰值在光起始后20小时，峰-谷幅度为2.7倍。

为进行对比，还分析了lin^-细胞mCLOCK和mPer1的表达模式。mPer1以节律方式表达，光起始后12小时，有一个显著的峰值，而不同节律时间点采集的样品中，mCLOCK的表达无显著变化。还检测了lin-细胞地塞米松和PMA对mPer1和mPer2表达的影响。已有报道表明，在培养的Rat-1成纤维细胞，地塞米松和PMA能诱导mPer1的表达并激发节律基因的表达((Balsalobre等，“多个信号传导通路激发培养的Rat-1成纤维细胞节律基因的表达”， Current Biology 10(20)：1291-1294(2000)，此处完整引用作为参考)。而且，地塞米松还能通过糖皮质激素受体重调体内的外周时钟Balsalobre等，“糖皮质激素信号介导的外周组织节律时间的重调”， Science 289(5488)：2344-2347(2000)，此处完整引用作为参考)。地塞米松大大增强了lin^-细胞mPer1的表达，而mPer1的表达却不受PMA的影响。另一方面，地塞米松和PMA对mPer2的表达均无较大影响。

已知，一些时钟控制基因直接受到CLOCK和BMAL异源二聚体中的CACGTG(SEQ ID No：2)E-盒的调节(Jin等，“一种调节交叉上核节律输出的分子机制”，Cell 96(1)：57-68(1999)；Chen和Baler，“大鼠芳基烷基氨基N-乙酰转移酶E-盒：在主从变化中的不同应用”， Mol. Brain Res.81(1-2)：43-50(2000)；Ripperger等，“CLOCK，一种基本的节拍器组分，控制节律转录因子DBP的表达”，Genes Dev.14：679-689(2000)，此处均完整引用作为参考)。为验证是否同样的机制适用于lin^-细胞IS转录物的节律表达，用限制性内切酶PmlI分析小鼠GATA-2基因的5’区域，其后者特异识别CACGTG(SEQ ID No：2)基序。在外显子IS的上游约3kbp范围内，共识别出3个E-盒。本研究分析的区域内未发现其它E-盒。

实施例4  mGATA-2基因表达的正或负调节

为直接检测CLOCK和BMAL1异源二聚体在激活mGATA-2基因表达方面的作用，将对应于外显子IS和其启动子区域的4.5-kbp DNA片段克隆于无启动子的荧光素酶报告载体(pGL3-Basic)(图5)。为进行对比，还构建了两个缺失突变。在mCLOCK和hBMAL1存在下，野生型报告构建体的表达提高了4.5倍(图5)。而在去除3个E-盒和侧翼区域后(图5)，CLOCK和BMAL1诱导的转录激活则完全消失(图5)。

为进一步研究3个E-盒的功能，将含有3个E-盒的275bp的DNA片段以及单个的E-盒及其侧翼区域(每个位点70-80bp)克隆入Elb最小启动子包含载体(pGL3-Elb；图8)。在CLOCK和BMAL1存在下，每个带有E-盒的构建体均较对照有实质性提高，其中对照不含有E-盒(5-10倍诱导；图8)。而且，3个E-盒在CLOCK和BMAL1介导的转录中激发了47.5倍的提高(图8)。

诱导要求mCLOCK和hBMAL1两者均存在。单独E-盒的变异总是降低CLOCK和BMAL1异源二聚体介导的转录激活(野生型构建值的27.5-56.8％)，3个E-盒都变异会完全阻断275bpDNA片段的增强活性(与对照报告载体Pgl3-Elb相比)。总之，结果表明CLOCK和BMAL1通过3个E-盒来激活基因表达。

已有报道表明，在瞬时转染分析中，节律时钟的负调节因子(例如PER1，PER2和PER3)抑制CLOCK和BMAL1介导的时钟控制基因的表达(Jin等，“视交叉上核节律时钟的分子机制调节的节律输出”，Cell 96(1)：57-68(1999)；Kume等，“mCRY1和mCRY2是节律时钟反馈环负调节支的基本组分”， Cell 98(2)：193-205(1999)，此处完整引用作为参考)。为进一步验证CLOCK和BMAL1依赖的mGATA-2基因的激活，将细胞用mPER1、mPER2或mPER3(节律时钟的负调节因子)的表达质粒共转染。如图9所示，mPER1、mPER2或mPER3中的每一个都显著抑制CLOCK和BMAL1介导的报告基因通过IS启动子的转录。同样地，PER蛋白还抑制3个E-盒介导的CLOCK和BMAL1依赖的转录激活。PER蛋白的抑制效应是特异的，因为PAS域去除后mPER1抑制效应消失。

实施例3和4的讨论

血细胞形成不同方面的节律改变已有报道(Laerum，“血细胞形成的节律性”， Exp.Hematol.23：11451147(1995)；Smaaland，“细胞分化的昼夜节律”， Prog.Cell.Cycle.Res.2：241-266(1996)，此处完整引用作为参考)。然而，调控节律的分子机制尚属未知。如实施例1和2所示，mPer1和mPer2在小鼠骨髓的节律表达模式表明，时钟系统在骨髓出现来在局部调节血细胞生成。为进一步对这些研究进行延伸，对mPer1和mCLOCK在lin^-骨髓细胞的表达进行了分析。所得数据与节律时钟的一致性在于：1)mPer1的mRNA水平在24小时内有变化；2)mCLOCK的mRNA水平没有显著变化(Okano等，“小鼠BMAL2的克隆及其在视交叉上核的昼夜表达模式：Bma1基因复制后Bmal2的序列多样性”， Neurosci.Lett.300(2)：111-114(2001)；Yagita等，“培养的成纤维细胞的生物钟的分子机制”， Science 292(5515)：278-281(2001)，此处均完整引用作为参考)；3)mPer1的表达受糖皮质激素信号通路的调节(Balsalobre等，“多个信号通路在培养的Rat-1成纤维细胞激发节律基因的表达”， Current Biology 10(20)：1291-1294(2000)；Balsalobre等，“通过糖皮质激素信号在外周组织重调节律时间”， Science 289(5488)：2344-2347(2000)，此处均完整引用作为参考)。因此，功能性时钟系统似乎存在于lin^-骨髓细胞。

对mGATA-2进行分析，以判断其在骨髓是否是时钟控制基因。用相对定量PCR对小鼠骨髓的IS和IG转录物的节律表达模式进行分析，发现IS转录物在lin^-骨髓细胞以节律方式进行表达。相反，IG转录物的表达水平在不同的时间并没有改变。因此，IS和IG转录物的表达被两个明显不同的启动子控制(Minegishi等，“另外的启动子调节小鼠GATA-2基因的转录”， J.Biol.Chem.273(6)：3625-3634(1998)，此处完整引用作为参考)。由于IS和IG转录物编码同样的蛋白，所以很有可能mGATA-2的表达仅在原始造血细胞受到节律控制。

尽管IG转录物在总骨髓和lin^-细胞均能检测到，但IS转录物只在lin^-细胞发现。这些数据与人体研究一致，人IS转录物仅在CD34⁺骨髓细胞检测到，而IG转录物在总骨髓和CD34⁺细胞均能检测到(Pan等，“人GATA-2基因远端IS外显子的识别及其在造血干细胞分类中的表达”， J.Biochem.127(1)：105-112(2000)，此处均完整引用作为参考)。由于两个转录物均不在谱系标记阳性的细胞表达(Minegishi等，“另外的启动子调节小鼠GATA-2基因的转录”， J.Biol.Chem.273(6)：3625-3634(1998)，此处完整引用作为参考)，因此IS转录物的表达可能局限于更原始的造血细胞。尽管IG转录物在lin^-的骨髓细胞没有改变，但其表达水平在总的骨髓细胞呈现昼夜节律。对此结果的一种可能的解释是：IG转录物表达细胞的数量在小鼠骨髓细胞24小时内有变化。

除mGATA-2 IS转录物在lin^-骨髓细胞的节律表达模式外，在瞬时转染分析中还发现IS启动子内的3个功能性E-盒。CLOCK和BMAL1通过野生型IS启动子增强转录，而不是缺乏3个E-盒的截短的启动子。而且，还表明每个E-盒都介导CLOCK和BMAL1依赖的转录激活。这些结果表明，mGATA-2基因是CLOCK和BMAL1异源二聚体在骨髓的直接靶标。

一些谱系的证据表明，在造血发生中控制谱系定型的是各种造血转录因子的平衡/组合而不是一种主要调节因子的出现或缺失(Sieweke和Graf，“血细胞分化过程中的转录因子群”， Curr.Opin.Genetics & Development 8(5)：545-551(1998)；Orkin，“造血干细胞：分子多样性及其发育的相互联系”， Stem Cell Biology，Marshak等，Eds.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)，p.289，此处均完整引用作为参考)。在多能祖细胞定向分化为个体谱系之前，一些谱系促进的转录因子共表达。(Cheng等，“在个体初级造血细胞分化中的基因表达水平的瞬时图谱”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(23)：13158-13163(1996)；Tsang等，“FOG，一种多型锌指蛋白，作为红细胞和巨核细胞分化过程中转录因子GATA-1的辅因子”， Cell 90(1)：109-119(1997)；和rews等，“红细胞转录因子NF-E2是一种造血特异碱性-亮氨酸拉链蛋白”， Nature 362(6422)：722-728(1993)；Scott等，“转录因子PU.1在多个造血谱系发育中的需求”， Science 265(5178)：1573-1577(1994)；Sposi等，“纯分化造血祖细胞GATA-1表达的细胞循环依赖性的起始和谱系依赖性的停止”， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(14)：6353-6357(1992)，此处均完整引用作为参考)。同样地，已表明多谱系基因表达促进谱系定型(Hu等，“多谱系基因表达在造血系统促进定型”， Genes & Development 11(6)：774-785(1997)，此处完整引用作为参考)。一些造血转录因子与(如GATA-1、PU.1和C/EBP等)与其它因子联合发挥作用(Tsang等，“FOG，一种多型锌指蛋白，作为红细胞和巨核细胞分化过程中转录因子GATA-1的辅因子”， Cell 90(1)：109-119(1997)；Nerlov和Graf，“PU.1诱导多能造血祖细胞向髓样谱系分化”， Genes Dev.12(15)：2403-2412(1998)；Nerlov等，“嗜酸性粒细胞谱系定型和成熟需要明确的C/EBP功能”， Genes Dev.12(15)：2413-2423(1998)，此处均完整引用作为参考)。有些情况下，造血转录因子形成大蛋白复合物(Wadman等，“LIM唯一蛋白Lmo2是装配红细胞以及包括TAL1，E47，GATA-1和Ldbl/NLI蛋白的DNA结合复合物的桥分子”， EMBO J.16(11)：3145-3157(1997)，此处完整引用作为参考)，在分化过程中，单独的转录因子可以出现在不同的蛋白复合物中，打开不同的基因(Sieweke和Graf，“血细胞分化过程中的转录因子群”， Curr.Opin.Genetics & Development 8(5)：545-551(1998)，此处完整引用作为参考)。另外，谱系附属的转录因子之间的负交叉调节也已有描述。例如，PU.1和GATA-1之间通过直接的蛋白-蛋白相互作用彼此负调节(Zhang等，“造血调节因子之间的负通讯：GATA蛋白抑制PU.1”， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15)：87058710(1999)；Zhang等，“PU.1通过阻断GATA-1DNA结合，抑制GATA-1功能和红细胞分化”， Blood 96(8)：2641-2648(2000)；Nerlov等，“GATA-1与髓样PU.1转录因子相互作用并抑制PU.1-依赖性的转录”， Blood 95(8)：2543-2551(2000)；Rekhtman等，“造血转录因子PU.1和GATA-1的直接相互作用：在红细胞的功能拮抗”，Genes Dev.13(11)：1398-1411(1999)，此处均完整引用作为参考)。因此，特异转录因子数量的一个微小变化会对关键的蛋白-蛋白相互作用产生重要影响。事实上，造血转录因子(如GATA-1，PU.1和GATA-2)的浓度依赖的作用已有报道(Heyworth等，“GATA-2/雌激素受体嵌合体作为自我更新的配体依赖型负调节剂发挥作用”， Genes Dev.13(14)：1847-60(1999)；McDevitt等，“cis-元件基因打靶引起的‘击倒’变异揭示了红细胞成熟对转录因子GATA-1水平的依赖性”， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94(13)：6781-6785(1997)；DeKoter和Singh，“PU.1的分级表达对淋巴细胞和巨噬细胞发育的调节”， Science 288(5470)：1439-1441(2000)，此处均完整应用作为参考)。因此，一些谱系附属的转录因子的上调和/或下调会破坏平衡，导致谱系定型。以上的数据支持这一观点，即造血转录因子的变化可以通过时钟组分控制，也表明造血的发生是受到节律时钟调节的。

总之，以上内容表明：mGATA-2在骨髓是时钟控制基因。作为一种在造血干细胞和祖细胞表达的转录因子，mGATA-2会促进其靶基因的节律表达，因而导致造血活性的昼夜循环。

实施例5  小鼠骨髓一种有效的时钟控制基因mlats2的识别和特征

在6个不同的节律时间点，收集总的小鼠骨髓细胞，通过RNA

随机引物PCR技术，直接对比基因表达模式。从胶上切割显示节律变化的DNA条带，分析其序列。克隆编码与循环调节子hLATS1同源的多肽的cDNA(6A-2-9)。通过相对定量RT-PCR来验证6A-2-9的节律表达模式。6A-2-9的开放阅读框含有一个公认的起始密码子，但3’端不完整。用3’-RACE技术克隆该基因的全长cDNA，所用引物对应于公认的起始密码子(正向引物1，SEQ ID No：26，上表3)，所得结果显示两个明显不同的cDNA片段，分别得到750和890bp的两个PCR产物。随后发现，cDNA克隆6A-2-9实际上编码部分mLATS2(Yabuta等，“一种果蝇肿瘤抑制基因lats/warts的哺乳动物同源物LATS2的结构、表达和染色体图谱”，Genomics 63(2)：263-270(2000)，此处完整引用作为参考)。然而，3’-RACE产物比报道的mlats2 cDNA(＞3000bp)短很多。原先克隆的3’-RACE产物的前357个碱基对(核苷酸67-423，图10A)，即克隆3-1和3-3，与mlats2的5’区域相同(核苷酸116-472，GenBank Accession AB023958，此处完整引用作为参考)。通过用正向引物2(SEQ ID No：27)和反向引物2(SEQ ID No：29，克隆3-1)或反向引物3(SEQ ID No：30，克隆3-3)(见上表3)进行PCR，扩增出5’相同区域(核苷酸1-66，图10A)。在克隆3-1和3-3(图10A)的poly-A尾的上游14bp处发现多聚腺苷信号AATAAA((SEQ IDNo：34)。与mLATS2(GenBank Accession BAA92380，此处完整引用作为参考)相比较，推导出的克隆3-1和3-3的氨基酸序列包含与mLATS2相同的N-末端113个残基，但C-末端不同(图10C)。而且，克隆3-3还包含mLATS2和克隆3-1没有的框内49个氨基酸的插入。

对mlats，hlats2/kpm，克隆3-1/3-3及其相应的人基因组DNA序列(GenBank Accession NT-009917，此处完整引用作为参考)进行序列比对，发现在hlats2/kpm的716和717核苷酸之间有一个公认的内含子。公认的剪切位点对应于克隆3-1/3-3的423和424核苷酸，其代表mlats和克隆3-1/3-3之间的一致性破坏的精确位点(图10A)。人基因组DNA序列中的公认的拼接供体和受体与GT/AG原则一致(Stephens和Schneider，“从人剪切位点的信息分析得出的剪切小体的进化和功能特征”，J.Mol.Biol.228(4)：1124-1136(1992)，此处完整引用作为参考)。由于mlats2和hlats2/kpm的核苷酸序列在这一区域是高度保守的，所以很有可能，mlats2的核苷酸472和473也在外显子和内含子的临界处。而且，3个转录物中的5’区域[包括5’非翻译区(5’UTR)的一部分]相同的事实，进一步支持克隆3-1和3-3来源于mlats2基因的不同的拼接的观点。为进一步分析在小鼠基因组中，mlats2是否是单拷贝基因，用mlats2、克隆3-1和克隆3-3的共同区域的探针进行Southern印迹分析(克隆3-1中的核苷酸67-389)。基于人基因组DNA和mlats2 cDNA的对比，发现探针所覆盖的区域似乎位于一个外显子内。因此，如果mlats2、克隆3-1和克隆3-3来源于同一基因，那么在Southern印迹上应该出现单一条带。Southern杂交结果确实发现一条约1.6kb的单一条带。

而且，通过种间特异的小鼠回交图谱，mlats2基因定位于小鼠染色体14的中间区域(Yabuta等，“一种果蝇肿瘤抑制基因lats/warts的哺乳动物同源物LATS2的结构、表达和染色体图谱”，Genomics 63(2)：263-270(2000)，此处完整引用作为参考)。综上所述，可以看出克隆3-1和3-3是mlats的另外的拼接形式。因此，将这两个新的拼接变异体分别命名为mlats2b和mlats2c。

通过用转录物特异的引物，进行RT-PCR，证实mlats2、mlats2b和mlats2c在小鼠骨髓有表达，得到期待大小的PCR产物(mlats2为483bp，mlats2b为397bp，mlats2c为525bp，见图11)。所有的PCR产物均进行测序以证实其一致性。在各种小鼠组织，使用相同的PCR引物对来检测mlats2、mlats2b和mlats2c的表达。mlats2在检测的多数组织中都有表达，在睾丸的表达量最高，而在胸腺的表达量非常低。同样地，mlats2b也有广泛表达。然而，mlats2和mlats2b的表达水平的比率似乎是组织特异的。尤其在脑、脾和睾丸，mlats2的表达比mlats2b高很多，而在胸腺和肺则相反。mlats2c的表达在除肝以外的所有组织(在肝的表达水平可与mlats2和mlats2b相比)均相对较弱。

实施例6  mLats2和mLats2b的节律表达分布图

尽管先前的相对定量RT-PCR结果已证实，RAP-PCR筛选得到的克隆6A-2-9的节律表达模式，但所用引物为扩增3个转录物mlats2、mlats2b和mlats2c的引物。为明确mlats2和mlats2b各自的节律表达模式，用mlats2和mlats2b特异的引物分别进行相对定量RT-PCR。如图12A-B所示，mlats2和mlats2b的节律表达模式非常相似。两者在24小时内均有变化，光开启后12小时达到高峰。将mlats2和mlats2b的节律表达模式与克隆6A-2-9的节律表达模式比较，发现即有相似性也有差异性。光开启后0和12小时的平均值总是较其前后的时间点高。然而，克隆6A-2-9在时间点0呈现峰值。因而，可能还存在一或多个剪切变异体有待识别。换句话说，mlats2c也可能在时间点0高表达。

位于LATS2的C-末端附近的激酶域在人和小鼠蛋白是高度保守的。值得注意的是，另一个高度保守区域是LATS2的N-末端域(图13)。很可能这个区域对蛋白-蛋白相互作用非常重要。因而有趣的是mlats2b与mlats2具有相同的N-末端，但缺乏激酶域。mLATS2b的功能可能是通过与靶蛋白竞争结合来调节mLATS2的功能。为阐明mLATS2b的功能，用酵母双杂交技术寻找其潜在的相互作用伴侣。用mLATS2b为诱饵，对超过106克隆的人骨髓cDNA文库进行筛选，共获得47个阳性克隆。所识别的基因和克隆号如下：RBT1(1)；RACK1(8)；ABP-280(7)；eIF3亚单位5(2)；DRAL/SLIM3/FHL2(2)；凋亡前体caspase适配子蛋白(1)；胸苷激酶(1)；肌腱蛋白XA(1)；溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B(1)；琥珀酸脱氢酶(1)；谷氨酰胺合成酶(1)；vanyl-tRNA合成酶2(1)；fibulin5(1)；抗药蛋白(1)；核糖体蛋白L17(1)；mitofilin(1)；赖氨酰氧化酶(1)；芳基硫酸酯酶A(1)；peroxiredoxin 2(1)；以及其它13个编码的未识别蛋白。这些潜在的mLATS2b-相互作用蛋白包括参予翻译、细胞骨架重构、信号转导和代谢通路等的蛋白。其中尤其引起关注的是复制蛋白结合反式激活剂，以前认为是与复制蛋白A相关的转录共激活剂(Cho等，“RBT1，一种新的转录共激活剂，结合复制蛋白A的第二个亚单位”，Nucl.Acids Res.28(18)：3478-3485(2000)，此处完整引用作为参考)，它可能在DNA复制的调节中发挥作用。

进一步用酵母双杂交对mRBT1和mLATS2/2b之间的相互作用进行分析，结果与预料一致，mLATS2与mRBT1有相互作用。由于得到的可比较的结果只涉及mLATS2(mLATS2N373)的N-末端373个氨基酸，所以激酶域对于mRBT1和mLATS2之间的相互作用并非必须。但是，mLATS2/2b的N-末端96个氨基酸(mLATS2N96)不与mRBT1相互作用。mRBT1的N-末端121个氨基酸(mRBT1N121)可与mLATS2、mLATS2N373以及mLATS2b相互作用，但不与mLATS2N96相互作用。而mRBT1的C-末端76个氨基酸(mRB T1C76)，其中包含反式激活域，不与mLATS2/2b相互作用。结合mLATS2和mLATS2b有共同的N-末端113个氨基酸，可以看出mLATS2/2b的RBT1相互作用区位于共同区域，对应于氨基酸96和113的多肽对相互作用是必须的。

由于RBT1具有位于其C-末端的反式激活域(Cho等，“RBT1，一种新的转录共激活剂，结合复制蛋白A的第二个亚单位”，Nucl.Acids Res.28(18)：3478-3485(2000)，此处完整引用作为参考)，所以用哺乳动物单杂交分析mLATS2和mLATS2b对RBT1的影响。与以前的结果一致(Cho等，“RBT1，一种新的转录共激活剂，结合复制蛋白A的第二个亚单位”， Nucl.Acids Res.28(18)：3478-3485(2000)，此处完整引用作为参考)，当与GAL4DNA结合域融合时，mRBT1的全长及C-末端76个氨基酸在哺乳动物单杂交分析中均表现出较高的转录活性(与单独的GAL4相比＞1000倍)(数据未显示)。在mLATS2存在时，mRBT1的转录活性受到明显抑制。因为GAL4DNA结合域的转录活性不受mLATS2的影响，所以mLATS2能对RBT1发挥抑制作用。而且，mLATS2对mRBT1的抑制作用依赖于其相互作用，因为在酵母双杂交分析中不与mLATS2相互作用的mRBT1的C末端76个氨基酸(mRBT1C76)未受到mLATS2的负调节。激酶域的去除会完全删除mLATS2对mRBT1的转录活性的抑制作用。最后，mLATS2对mRBT1的转录活性的抑制作用受mLATS2b的拮抗。

实施例5和6的讨论

通过对6个节律时间点的基因表达模式进行比较，阐述了小鼠骨髓的时钟控制基因。基于mlats2的节律表达，对相应于其5’区域的cDNA片段进行了克隆。Lats1及lats2(Yabuta等，“果蝇肿瘤抑制基因lats/warts的哺乳动物同系物LATS2的结构、表达及染色体图谱″，Genomics 63(2)：263-270(2000)；Tao等，“黑腹果蝇lats肿瘤抑制基因的人同系物调制CDC2活性”， Nature Genetics 21(2)：177-181(1999)；Nishiyama等，“果蝇warts肿瘤抑制基因的人同系物h-warts定位于有丝分裂器并在有丝分裂过程中特异的磷酸化”， FEBS Letters 459(2)：159165(1999)；Hori等，“与果蝇肿瘤抑制子同源的新的人蛋白激酶kpm的分子克隆”， Oncogen 19：3101-3109(2000)，此处完整引用作为参考)是首先在果蝇识别为肿瘤抑制基因的warts/lats基因(Xu等，“在遗传嵌合体识别肿瘤抑制子：果蝇lats基因编码一种公认的蛋白激酶”， Development 121(4)：1053-1063(1995)，此处完整引用作为参考)的哺乳动物同系物。一些品系的证据表明LATS1及LATS2参予细胞循环的调节。例如，已表明hLATS1的磷酸化是细胞循环依赖性的，磷酸化的hLATS1在有丝分裂相通过形成hLATS1-CDC2复合物，对CDC2活性进行负调节(Tao等，“黑腹果蝇lats肿瘤抑制基因的人同系物调制CDC2活性”， Nature Genetics 21(2)：177-181(1999)，此处完整引用作为参考)。Lats1^-/-小鼠软组织肉瘤和卵巢基质细胞肿瘤发病率较高也支持LATS1在细胞循环控制中的这种作用(St.John等，“Lats1缺陷小鼠形成软组织肉瘤、卵巢瘤和垂体技能障碍”， Nature Genetics 21(2)：182-186(1999)，此处完整引用作为参考)。而且，当导入lats1缺陷细胞时，hLATS1通过抑制CDC2激酶活性，引起细胞循环在G2/M相阻滞(Yang等，“果蝇lats的人同系物LATS1通过诱导G(2)/M阻滞或凋亡对生长进行负调控”， Oncogene 20(45)：6516-6523(2001)，此处完整引用作为参考)。同样地，已表明，人KPM蛋白(与hLATS1相同)在有丝分裂相进行磷酸化，提示其在有丝分裂进程中发挥作用(Hori等，“一种新的果蝇肿瘤抑制子warts/lats的人同系物蛋白激酶kpm的分子克隆”， Oncogene 19：3101-3109(2000)，此处完整引用作为参考)。而且，hLATS1的表达受一种参与细胞循环控制的肿瘤抑制基因p53的诱导(Kostic和Shaw，“16种新的p53应答基因的分离和特征”， Oncogene19(35)：3978-3987(2000)，此处完整引用作为参考)。因此，认为骨髓时钟可以通过mLATS2调节细胞增殖，后者又反过来引起骨髓细胞循环状态的节律变异。

还识别了mLATS2的较短的剪切变异体mLATS2b和mLATS2c。选择剪切的一个重要功能是，通过包含或排除对蛋白-蛋白相互作用、转录激活或催化活性重要的域来产生功能性变异体。尤其，选择性剪切的结果使一些细胞循环调节剂以不同的形式表达。例如，已识别人CDC25B的3个剪切变异体，在体内呈现不同的磷酸酶活性(Baldin等，“人CDC25B酪氨酸磷酸酶的选择性剪切。生长控制的可能的本质？”，Oncogene 14(20)：2485-2495(1997)，此处完整引用作为参考)。另一个例子是p10，一种人p15细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的选择性剪切形式。与p15不同，p10不与CDK4或CDK6结合(Tsuburi等，“一种p15细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的选择性剪切形式p10的克隆和特征”， Cancer Res.57(14)：2966-2973(1997)，此处完整引用作为参考)。而且，细胞周期蛋白C、D1及E各自的剪切变异体具有不同的表达模式和功能，这一点已有报道(Li等，“选择性剪切的细胞周期蛋白C mRNA受到广泛表达和细胞循环调节且编码一个截短的细胞周期蛋白盒”， Oncogene 13(4)：705-712(1996)；Sawa等，“细胞周期蛋白D1的选择性剪切形式以一种反向的方式调节进入细胞循环”，Oncogene 16(13)：1701-1712(1998)；Sewing等，“人细胞周期蛋白E的选择性剪切”， J.Cell Science 107(Pt2)：581-588(1994)；Mumberg等，“细胞周期蛋白ET，人细胞周期蛋白E的一种新的剪切变异体，在细胞循环进程和分化中具有独特的表达模式”， Nucl.Acids Res.25(11)：2098-2105(1997)，此处完整引用作为参考)。mLATS2、mLATS2b及mLATS2c之间的对比(图10C)揭示三者具有相同的N-末端113个氨基酸。但是，mLATS2b及mLATS2c缺乏激酶域，表明mLATS2b及mLATS2c可能通过与相同的靶蛋白竞争性结合来调节mLATS2的功能。通过与mLATS2/2b相互作用蛋白的识别揭示了这种可能性。酵母双杂交分析表明mRBT1能与mLATS2及mLATS2b相互作用。而且，mLATS2在哺乳动物单杂交分析中抑制mRBT1的转录活性，且mLATS2的这种抑制作用受到mLATS2b的拮抗。上述表明，mLATS2b是mLATS2的负调节子。

mLATS2能负调节mRBT1的事实进一步支持mLATS2作为细胞循环调节子发挥作用的观点。作为一个复制蛋白A(RPA)-相互作用蛋白，很有可能RBT1促进细胞增殖。事实上，hRBT1在癌细胞的表达量较非转化细胞高(Cho等，“一种新的转录共激活剂RBT1结合复制蛋白A的第二亚单位”， Nucl.Acids Res.28(18)：3478-3485(2000)，此处完整引用作为参考)。而且，RBT1的反式激活受到p53的明显下调(Cho等，“一种新的转录共激活剂RBT1结合复制蛋白A的第二亚单位”，Nucl.Acids Res.28(18)：3478-3485(2000)，此处完整引用作为参考)，尽管p53是否通过LATS2来抑制RBT1尚属未知。

总之，mlats2被识别为小鼠骨髓的一种时钟控制基因。而且，mLATS2受到mLATS2b(通过选择性剪切产生的一种mLATS2的同功型)的负调节。基于以上的证据以及文献报道的骨髓细胞的细胞循环状态的节律变异，可以看出mLATS2是一种细胞循环调节子。

实施例7  用神经递质调节Per1启动子诱导的转录

用前述方法构建Per1-荧光素酶报告质粒，即用mper1来源的7.2kb片段的启动子区域，构成pGL3-mPer1-7.2kb。然后参照前述方法用pGL3-mPer1-7.2kb转染NIH 3T3细胞，细胞暴露于10^-6M的毛喉素作为阳性对照，10^-6M异丙基肾上腺素(β-肾上腺素激动剂)，10^-6M心得安(β-肾上腺素拮抗剂)，10^-6M苯肾上腺素(α-肾上腺素拮抗剂)，10^-6M苯妥拉明(α-肾上腺素拮抗剂)。将细胞暴露于神经递质7小时，然后同前述检测荧光素酶活性。

如图14所示，每种神经递质类似物异丙基肾上腺素、心得安、苯肾上腺素及苯妥拉明的荧光素酶活性均较对照高(尽管相对于阳性对照毛喉素有轻微降低)。这些结果表明一些不同的神经递质可能作用于mper1启动子区域来诱导转录活性。

最近有证据表明外周时钟受到SCN调节的体液信号的影响。例如，在SCN损伤的大鼠，外周组织Per2的节律表达消失(Sakamoto等，“大鼠周期同系物(rPer2)mRNA的多组织节律表达受到哺乳动物节律时钟大脑交叉上核的调控”，J.Biol.Chem.273：27039-27042(1998)，此处完整引用作为参考)。而且，在培养的Rat-1成纤维细胞，血清休克迅速诱导Per1和Per2，随后这两种基因以及其它时钟依赖基因包括Dbp、Tef和Rev-Erba等呈现节律表达(Balsalobre等，“在哺乳动物组织培养细胞血清休克诱导节律基因表达”，Cell 93：929-937(1998)，此处完整引用作为参考)。一些因素包括毛喉素(腺苷环化酶激活剂)、佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐(PMA；蛋白激酶C激活剂)以及地塞米松等，在培养的Rat-1成纤维细胞，诱导Per1的迅速上调并引起Per1、Per2、Cry1、Dbp以及Rev-Erba的节律表达(Balsalobre等，“多个信号通路在培养的Rat-1成纤维细胞激发节律基因表达”，Current Biology 10(20)：1291-1294(2000)；Balsalobre等，“糖皮质信号引起的外周组织节律时间的重调”，Science 289(5488)：2344-2347(2000)，此处完整引用作为参考)。总之，这些数据表明Per1在外周组织的表达受到多个信号通路的调节，并且如在SCN观察到的那样，Per1的诱导是时钟重调的引发步骤。

尽管以上详细描述了优选的实施方案，但是很显然，相关领域的技术人员应该明白，可以进行各种修饰、添加和置换等而不偏离本发明，因此，这些也被视为在权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (117)

1.控制骨髓细胞发育的方法，所述方法包括：

提供具有节律时钟系统的骨髓细胞，以及

在能有效控制骨髓细胞发育的条件下操纵节律时钟系统。

2.权利要求1的方法，其中所述的方法在体外实施。

3.权利要求1的方法，其中所述的方法在体内实施。

4.权利要求1的方法，其中所述的骨髓细胞是干细胞。

5.权利要求4的方法，其中所述的干细胞选自全能干细胞、多能干细胞、髓样干细胞、间充质干细胞以及淋巴样干细胞。

6.权利要求1的方法，其中所述的骨髓细胞是骨髓祖细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述的骨髓祖细胞选自CFU-GEMM细胞、前B细胞、淋巴样祖细胞、前胸腺细胞、BFU-E细胞、CFU-Meg细胞、CFU-GM细胞、CFU-G细胞、CFU-M细胞、CFU-E细胞以及CFU-Eo细胞。

8.权利要求1的方法，其中所述的骨髓细胞是骨髓前体细胞。

9.权利要求8的方法，其中所述的骨髓前体细胞选自前单核细胞、原巨核细胞、原粒细胞、原单核细胞、晚幼红细胞、原粒细胞、原红细胞、B-淋巴细胞前体以及T-淋巴细胞前体。

10.权利要求1的方法，其中所述的骨髓细胞选自天然杀伤细胞、树突细胞、骨细胞、牙齿细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞以及巨噬细胞。

11.权利要求1的方法，其中所述的骨髓细胞发育为选自以下的细胞：血液细胞、肝细胞、神经细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、牙齿细胞、脂肪细胞、造血辅助细胞、胰腺细胞、角膜细胞、视网膜细胞以及心肌细胞。

12.权利要求1的方法，其中对骨髓细胞进行操纵，以激活骨髓细胞发育。

13.权利要求1的方法，其中对骨髓细胞进行操纵，使骨髓细胞发育失活。

14.权利要求1的方法，其中所述的操纵包括将骨髓细胞暴露于含有视交叉上核细胞的基质。

15.权利要求14的方法，其中的视交叉上核细胞是SCN2.2细胞。

16.权利要求1的方法，其中所述的操纵包括将骨髓细胞暴露于基质，该基质包含一或多种节律信号分子或一或多种正或负调节子。

17.权利要求16的方法，其中所述的一或多种节律信号分子选自糖皮质激素、神经递质、SCN细胞信号分子、氧化还原电位调节子以及它们的组合。

18.权利要求16的方法，其中所述的的骨髓细胞存在于包含正调节子、负调节子或其组合的基质中。

19.控制干细胞自我更新、分化和/或功能的方法，其中所述的方法包括：

提供具有节律时钟系统的干细胞，以及

在能有效控制干细胞自我更新、分化和/或功能的条件下操纵节律时钟系统。

20.权利要求19的方法，其中所述的方法在体外实施。

21.权利要求19的方法，其中所述的方法在体内实施。

22.权利要求19的方法，其中所述的干细胞选自全能干细胞、多能干细胞、髓样干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、脂肪组织干细胞、皮肤干细胞、肢体干细胞、造血干细胞、AGM(主动脉-性腺-中肾)干细胞、卵黄囊干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞、胚胎胚芽细胞以及淋巴样干细胞。

23.权利要求19的方法，其中所述的干细胞自我更新被激活。

24.权利要求19的方法，其中所述的干细胞自我更新失活。

25.权利要求19的方法，其中所述的干细胞分化被激活。

26.权利要求19的方法，其中所述的干细胞分化失活。

27.权利要求19的方法，其中所述的干细胞发育为选自以下的细胞：血液细胞、肝细胞、神经元细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、牙齿细胞、脂肪细胞、造血辅助细胞、胰腺细胞、角膜细胞、视网膜细胞以及心肌细胞。

28.权利要求19的方法，其中所述的操纵包括将干细胞暴露于含有视交叉上核细胞的基质。

29.权利要求28的方法，其中所述的视交叉上核细胞是SCN2.2细胞。

30.权利要求19的方法，其中所述的操纵包括将骨髓细胞暴露于基质，该基质包含一或多种节律信号分子或一或多种正或负调节子。

31.权利要求30的方法，其中所述的一或多种节律信号分子选自糖皮质激素、神经递质、SCN细胞信号分子、氧化还原电位调节子以及它们的组合。

32.权利要求30的方法，其中所述的干细胞存在于包含正调节子、负调节子或其组合的基质中。

33.一种体外工程化组织，其包含：

多个相互之间密切接触形成组织的细胞或细胞类型，其中的细胞或细胞类型具有节律时钟系统，该节律时钟系统已被调制以调节组织内细胞或细胞类型的生长、发育和/或功能。

34.权利要求33的工程化组织，其中所述的组织是骨髓、血液、血管、淋巴结、甲状腺、甲状旁腺、皮肤、脂肪、软骨、肌腱、韧带、骨、牙齿、牙本质、牙周组织、肝、神经组织、脑、脊髓、视网膜、角膜、骨骼肌、平滑肌、心肌、胃肠组织、泌尿生殖组织、膀胱、胰腺、肺或肾。

35.权利要求33的工程化组织，其中所述的多个细胞或细胞类型存在于含有视交叉上核细胞的基质。

36.权利要求35的工程化组织，其中所述的视交叉上核细胞是SCN2.2细胞。

37.权利要求34的工程化组织，其中所述的多个细胞或细胞类型存在于基质，该基质包含一或多种节律信号分子或一或多种正或负调节子。

38.权利要求37的工程化组织，其中所述的一或多种节律信号分子选自糖皮质激素、神经递质、SCN细胞信号分子、氧化还原电位调节子以及它们的组合。

39.权利要求37的工程化组织，其中所述的多个细胞或细胞类型存在于包含正调节子、负调节子或其组合的基质中。

40.控制时钟控制基因表达的方法，其中所述的方法包括：

提供具有节律时钟系统的细胞，以及

在能有效改变时钟控制基因表达的条件下操纵细胞的节律时钟系统，其中的时钟控制基因选自GATA-2、IL-12、IL-16、GM-CSF、LATS2、BMP-2、BMP-4、TERT、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、Piwi-like-1、CEBP-α、DMP-1、OASIS、Lhx2、HoxB4、Pax5以及CNTFR。

41.权利要求40的方法，其中所述的方法在体外实施。

42.权利要求40的方法，其中所述的方法在体内实施。

43.权利要求40的方法，其中所述的操纵包括将细胞暴露于含有视交叉上核细胞的基质。

44.权利要求43的方法，其中所述的视交叉上核细胞是SCN2.2细胞。

45.权利要求40的方法，其中所述的操纵包括将细胞暴露于基质，该基质包含一或多种节律信号分子或一或多种正或负调节子。

46.权利要求45的方法，其中所述的一或多种节律信号分子选自糖皮质激素、神经递质、SCN细胞信号分子、氧化还原电位调节子以及它们的组合。

47.权利要求45的方法，其中多个细胞或细胞类型存在于包含正调节子、负调节子或其组合的基质中。

48.权利要求40的方法，其中所述的细胞是干细胞。

49.权利要求48的方法，其中所述的干细胞选自全能干细胞、多能干细胞、髓样干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、脂肪组织干细胞、皮肤干细胞、肢体干细胞、造血干细胞、AGM(主动脉-性腺-中肾)干细胞、卵黄囊干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞、胚胎胚芽细胞以及淋巴样干细胞。

50.权利要求48的方法，其中所述的时钟控制基因是GATA-2.

51.权利要求50的方法，其中所述的操纵激活GATA-2表达。

52.权利要求50的方法，其中所述的操纵使GATA-2表达失活。

53.权利要求50的方法，其中所述的操纵改变GATA-2表达以影响干细胞的自我更新或分化。

54.权利要求40的方法，其中所述的细胞是造血和/或基质细胞。

55.权利要求54的方法，其中所述的造血和/或基质细胞是骨髓祖细胞。

56.权利要求54的方法，其中所述的造血和/或基质细胞是骨髓前体细胞。

57.权利要求54的方法，其中所述的造血和/或基质细胞是成熟的骨髓细胞。

58.权利要求54的方法，其中所述的造血和/或基质细胞是干细胞。

59.权利要求54的方法，其中的时钟控制基因是GM-CSF。

60.权利要求59的方法，其中所述的操纵激活GM-CSF的表达。

61.权利要求59的方法，其中所述的操纵使GM-CSF的表达失活。

62.权利要求59的方法，其中所述的操纵改变GM-CSF的表达以增强免疫系统和/或影响细胞分化和/或潜能。

63.权利要求59的方法，其中所述的操纵改变GM-CSF的表达以治疗由GM-CSF或其缺陷介导的疾病。

64.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是IL-12或IL-16。

65.权利要求64的方法，其中所述的操纵激活IL-12或IL-16表达。

66.权利要求64的方法，其中所述的操纵使IL-12或IL-16的表达失活。

67.权利要求64的方法，其中所述的操纵改变IL-12或IL-16的表达以增强免疫系统和/或影响细胞分化和/或潜能。

68.权利要求64的方法，其中所述的操纵改变IL-12的表达以治疗由IL-12或其缺陷或IL-16或其缺陷介导的疾病。

69.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是LATS2。

70.权利要求69的方法，其中所述的操纵激活LATS2表达。

71.权利要求69的方法，其中所述的操纵使LATS2的表达失活。

72.权利要求69的方法，其中所述的操纵改变LATS2的表达以治疗癌症、白血病或其它增殖或恶性疾病。

73.权利要求69的方法，其中所述的LATS2是LATS2b。

74.权利要求69的方法，其中所述的LATS2是LATS2c。

75.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是CNTFR。

76.权利要求75的方法，其中所述的操纵激活CNTFR表达。

77.权利要求75的方法，其中所述的操纵使CNTFR的表达失活。

78.权利要求75的方法，其中所述的操纵改变CNTFR的表达以影响神经元细胞或干细胞的存活、扩展或分化。

79.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是BMP-2或BMP-4。

80.权利要求79的方法，其中所述的操纵激活BMP-2或BMP-4表达。

81.权利要求79的方法，其中所述的操纵使BMP-2或BMP-4的表达失活。

82.权利要求79的方法，其中所述的操纵改变BMP-2或BMP-4的表达以影响向骨细胞样或牙齿细胞样细胞的分化或成熟。

83.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是TERT。

84.权利要求83的方法，其中所述的操纵激活TERT表达。

85.权利要求83的方法，其中所述的操纵使TERT的表达失活。

86.权利要求83的方法，其中所述的操纵改变TERT的表达以增加细胞潜在倍增的数量。

87.权利要求83的方法，其中所述的操纵改变TERT的表达以降低细胞潜在倍增的数量。

88.权利要求83的方法，其中所述的细胞是癌症细胞、干细胞或淋巴细胞。

89.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。

90.权利要求89的方法，其中所述的操纵激活TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3的表达。

91.权利要求89的方法，其中所述的操纵使TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3的表达失活。

92.权利要求89的方法，其中所述的操纵改变TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3的表达以影响细胞存活、增殖、分化或诱导凋亡。

93.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是Piwi-like-1。

94.权利要求93的方法，其中所述的操纵激活Piwi-like-1的表达。

95.权利要求93的方法，其中所述的操纵使Piwi-like-1的表达失活。

96.权利要求93的方法，其中所述的操纵改变Piwi-like-1的表达以影响细胞分裂。

97.权利要求93的方法，其中所述的细胞是干细胞。

98.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是CEBP-α。

99.权利要求98的方法，其中所述的操纵激活CEBP-α的表达。

100.权利要求98的方法，其中所述的操纵使CEBP-α的表达失活。

101.权利要求98的方法，其中所述的操纵改变CEBP-α的表达以影响谱系定型。

102.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是DMP-1。

103.权利要求102的方法，其中所述的操纵激活DMP-1的表达。

104.权利要求102的方法，其中所述的操纵使DMP-1的表达失活。

105.权利要求102的方法，其中所述的操纵改变DMP-1的表达以影响向牙齿细胞样细胞的分化。

106.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是OASIS。

107.权利要求106的方法，其中所述的操纵激活OASIS的表达。

108.权利要求106的方法，其中所述的操纵使OASIS的表达失活。

109.权利要求106的方法，其中所述的操纵改变OASIS表达以影响成骨细胞的分化和/或成熟。

110.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是lim-同源异型框-2或同源异型框-4。

111.权利要求110的方法，其中所述的操纵激活lim-同源异型框-2或同源异型框-4的表达。

112.权利要求110的方法，其中所述的操纵使lim-同源异型框-2或同源异型框-4的表达失活。

113.权利要求110的方法，其中所述的操纵改变lim-同源异型框-2或同源异型框-4的表达以产生、扩展或维持造血干细胞。

114.权利要求54的方法，其中所述的时钟控制基因是Pax5。

115.权利要求114的方法，其中所述的操纵激活Pax5的表达。

116.权利要求114的方法，其中所述的操纵使Pax5的表达失活。

117.权利要求114的方法，其中所述的操纵改变Pax5的表达以影响淋巴细胞发育、神经元细胞发育或精子发生。

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