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TW201512174A - 細胞增生抑制劑及其結合物 - Google Patents

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TW201512174A
TW201512174A TW103109256A TW103109256A TW201512174A TW 201512174 A TW201512174 A TW 201512174A TW 103109256 A TW103109256 A TW 103109256A TW 103109256 A TW103109256 A TW 103109256A TW 201512174 A TW201512174 A TW 201512174A
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alkyl
antibody
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immunoconjugate
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TW103109256A
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Paul A Barsanti
Sylvie Chamoin
Lionel Doumampouom-Metoul
Bernhard Hubert Geierstanger
Robert Martin Grotzfeld
Stephanie Guerro-Lagasse
Darryl Brynley Jones
Alexei Karpov
Marc Lafrance
Cristina Nieto-Oberhuber
Weijia Ou
Grazia Piizzi
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Novartis Ag
Irm Llc
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Abstract

本文揭示包含Eg5抑制劑鍵聯於抗原結合部分(諸如抗體)之免疫結合物，其適用於治療細胞增生病症。亦揭示新穎Eg5抑制劑，其可單獨或作為免疫結合物之一部分使用來治療細胞增生病症。該等Eg5抑制劑包括如本文所述之下式之化合物： □本發明進一步提供包含此等化合物及免疫結合物、視情況包括治療輔劑之醫藥組合物，及使用此等化合物、結合物及組合物來治療細胞增生病症之方法。

Description

細胞增生抑制劑及其結合物
本發明提供藉由抑制Eg5活性來抑制細胞增生且因此適用於治療與過度Eg5活性有關之細胞增生病症的化合物。本發明亦提供包含鍵聯於抗原結合部分之Eg5抑制劑之結合物，及含有此等結合物之醫藥組合物。亦包括使用此等化合物及結合物來治療細胞增生病症，包括癌症之方法。
近年來，大量研究已針對使用抗體，藉由形成抗體-藥物結合物(ADC)來遞送細胞增生抑制劑及細胞毒性劑至消除所靶向之特定細胞。ADC典型地含有因結合於治療介入所靶向之細胞的能力而選擇之抗體，該抗體鍵聯至因細胞抑制或細胞毒性活性而選擇之藥物。抗體結合於靶向細胞會遞送藥物至其治療效應所需之位點，且因此降低脫靶活性，同時改良利用有效負載化合物之效率。
已揭示多種識別且選擇性結合於靶向細胞(如癌細胞)之抗體用於ADC，且亦已描述多種用於將有效負載(藥物)化合物(諸如細胞毒素)連接於抗體之方法。儘管大量工作針對ADC，但僅數種類別之細胞增生抑制劑或細胞毒素已廣泛用作ADC有效負載。即使2000年發佈了在美國批准用於人類之第一種ADC(Mylotarg®，其稍後在市場上撤回)，十年後僅數種化學類別之藥物化合物(類美登素、奧里斯他汀 (auristatin)、加利車黴素(calicheamycin)及倍癌黴素(duocarmycin))已作為ADC有效負載進入臨床試驗。Antibody-Drug Conjugates：the Next Generation of Moving Parts,A.Lash,Start-Up,2011年12月，1-6。此暗示了鑑別合適類別之藥物化合物來製備有效ADC有效負載的困難程度。已知廣泛承認ADC作為治療劑，尤其用於治療癌症之價值，因此仍需要適合用作ADC中的有效負載之新穎細胞增生抑制劑。
本發明包括新穎Eg5抑制劑，及使用Eg5抑制劑作為小分子藥物或作為抗體-藥物結合物(ADC)之藥物組分(有效負載)的方法。
Eg5亦稱為紡錘體驅動蛋白或KSP，為驅動蛋白馬達蛋白，牽涉於有絲分裂期間微管之交聯中，且因此為細胞分裂所需。Eg5抑制劑已知適用於治療細胞增生病症，如癌症(Rath及Kozielski,Nature Rev.Cancer，第12卷，527-39(2012)；亦參見WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388及WO2006/049835)。雖然已知Eg5抑制劑之多種不同化學家族，但其迄今尚未用於ADC。本發明包括Eg5抑制劑作為ADC之藥物有效負載的用途，及適用作ADC有效負載且適用作小分子藥物之新穎Eg5抑制劑。本發明進一步包括適用於將某些Eg5抑制劑併入ADC中之方法及中間物，及使用該等新穎化合物及結合物來治療細胞增生病症之方法。
本發明提供含有鍵聯於抗原結合部分(諸如抗體或抗體片段)之Eg5抑制劑的免疫結合物(例如ADC)。此等包含Eg5抑制劑之結合物適用於治療細胞增生病症，尤其在Eg5抑制劑鍵聯於識別癌細胞之抗體且因此促進將Eg5抑制劑遞送至攻擊所靶向之癌細胞時。該等免疫結合物尤其適用於治療某些癌症，如本文中進一步詳述。本文提供之資料證實，此等免疫結合物為有效細胞增生抑制劑且有效用於治療一些 類型的癌症；不受理論束縛，咸信其活性係歸因於對細胞中Eg5之抑制作用。
在一個態樣中，本發明之免疫結合物包括此式之化合物：
其中Ab表示抗原結合部分；L表示連接X至Ab之鍵聯基團；m為1-4之整數；n為1至16之整數；且X在每次出現時獨立地表示Eg5抑制劑。
在此等免疫結合物中，X可為如本文所述之式II化合物，或對Eg5之抑制作用的IC-50低於約100nM之任何Eg5抑制劑。多種該等Eg5抑制劑為已知的，包括伊斯平斯(ispinesib)、SB-743921、AZD4877、ARQ621、ARRY-520、LY2523355、MK-0731、EMD534085及GSK-923295，及WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388及WO2006/049835中所述之Eg5抑制劑。
典型地，在此式之免疫結合物中，m為1或2，較佳為1；且n為2-8，較佳為約2至約6，更佳在3與5之間。Ab可為任何合適之抗原結合部分，且通常為抗體。合適之抗體為此項技術中熟知的，且可為原生抗體序列，或其可藉由例如蛋白質工程改造技術來修飾以改良其適應性或活性。L可為適用於連接一或多個X基團至Ab之任何連接子；通常，L連接於離胺酸δ-胺基，或連接於抗體之半胱胺酸巰基。其可為天然存在之殘基，或其可引入抗體序列中之所選位置處。
X之合適選項包括本文中所揭示之式(II)化合物，以及單星素 (monastrol)(4-(3-羥基苯基)-6-甲基-2-亞硫基-3,4-二氫-1H-嘧啶-5-甲酸乙酯)；(2S)-4-(2,5-二氟苯基)-N-[(3R,4S)-3-氟-1-甲基-4-哌啶基]-2,5-二氫-2-(羥基甲基)-N-甲基-2-苯基-1H-吡咯-1-甲醯胺(MK-0731，CAS 845256-65-7)；利曲尼塞(Litronesib)(LY2523355，CAS 910634-41-2)；及(2S)-2-(3-胺基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-甲醯胺(ARRY520)；及AZ3146(9-環戊基-2-[[2-甲氧基-4-[(1-甲基哌啶-4-基)氧基]-苯基]胺基]-7-甲基-7,9-二氫-8H-嘌呤-8-酮)。
在某些實施例中，該免疫結合物具有式(I)
其中Ab表示抗原結合部分，諸如抗體或抗體片段；L表示藉由共價或非共價鍵結連接X至Ab之鍵聯基團，其可視情況連接一個以上X至Ab，且可或可不經設計以促進活體內裂解；X在每次出現時獨立地表示式(II)化合物：
如下文進一步描述；m為1-4之整數，典型地為1-2；且n為1至16之整數，較佳為2-8。
本發明提供使用Eg5抑制劑、尤其式(II)或(III)化合物作為待遞送之有效負載(藥物)來製備ADC之方法，及使用此等ADC來治療細胞增 生病症之方法。
本發明亦提供經修飾之式(II)化合物，其在本文中描述為式(IIA)及(IIB)及(IIC)：此等化合物為包含具有反應性官能基且視情況連接一或多種連接子組分之式(II)化合物的結構，以促進直接或間接連接該化合物至抗體或抗原結合片段。此等化合物適用於製備免疫結合物。因此，在另一態樣中，本發明提供式(IIA)及(IIB)及(IIC)化合物：
其中W包含可用於連接(IIA)或(IIB)或(IIC)至連接子組分或直接至Ab之反應性官能基，以提供式(I)之免疫結合物，且提供使用此等化合物來製備ADC之方法。
在另一態樣中，本發明提供如本文所述之式(III)之新穎Eg5抑制劑，及其醫藥學上可接受之鹽。
此等化合物為新穎Eg5抑制劑且具有如本文所示之抗癌活性。如本文所證實，其可用作ADC有效負載，或如其他Eg5抑制劑，其可用作用以治療細胞增生病症之小分子治療劑。
在另一態樣中，本發明提供包含與至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合且視情況與兩種或兩種以上醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合的式(I)免疫結合物或式(III)化合物之醫藥組合物，及使用此等組合物來治療細胞增生病症之方法。
在另一態樣中，本發明提供一種治療特徵在於過度或非所需細胞增生之病狀的方法，其包含向需要該治療之個體投與有效量的式(I)免疫結合物或式(III)化合物或如本文所述之其任何亞屬，或包含該化合物或免疫結合物之醫藥組合物。用於治療之個體可為哺乳動物，且較佳為人類。可藉由本文所述之化合物及方法治療的病狀包括各種形式之癌症，諸如胃、骨髓、結腸、鼻咽、食道及前列腺腫瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、白血病(例如慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T譜系急性淋巴母細胞白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其非霍奇金氏)、膀胱、腎、胃(例如胃腸基質腫瘤(GIST))、肝臟及胰臟癌及肉瘤。可用此等方法及組合物治療之其他細胞增生病症包括糖尿病性視網膜病變、肝臟及肺纖維化、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)及紅斑性狼瘡症。
本發明包括式(I)-(III)組合物及如本文所述之其亞屬，及所有立體異構體(包括非對映異構體及對映異構體)、互變異構體及其同位素增濃型式(包括氘取代)，以及此等化合物之醫藥學上可接受之鹽。本發明之組合物亦包含式(I)-(III)(或其子式)之多晶型物及其鹽，尤其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供包含改良之鍵聯基團的免疫結合 物，該鍵聯基團連接抗體與有效負載，諸如細胞毒素，包括本文所述之Eg5抑制劑。此等免疫結合物包含鍵聯基團，該鍵聯基團包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-之基團，其可為醯胺或胺基甲酸酯，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，R22為選自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23及-SO2R23之極性基團，其中k為0至4且各R23獨立地為H或C1-4烷基。此等鍵聯基團降低免疫結合物之聚集。
圖1A-1B。基於重鏈及輕鏈負載測定ADC之平均藥物負載(DAR，藥物與抗體比率)。
圖2A-2E。細胞培養物中各種式(II)及(III)化合物之抗增生活性。
圖3A-3L。在源自不同譜系之多種癌症細胞株中某些Eg5抑制劑之抗增生活性。
圖4A-4V。ADC對於針對高Her2表現經工程改造之細胞株對匹配之親本(Her2低表現)細胞株的活體外抗增生活性。
圖5A-5E。ADC對於具有內源性Her2表現之細胞株的活體外抗增生活性。
圖6(A)。TBS-Cmpd 220結合物在HCC 1954乳癌異種移植物中之功效。
圖6(B)。TBS-Cmpd 220結合物在HCC 1954乳癌異種移植物中之功效。
圖7(A)及(B)展示TBS-Cmpd 220結合物在SK-OV-3ip異種移植物中之功效。
圖8展示TBS-Cmpd 215結合物在SK-OV-3ip異種移植物中之功效。
圖9展示TBS-Cmpd 223結合物在SK-OV-3ip異種移植物中之功 效。
圖10(A)展示如藉由尺寸排阻層析法所量測，稱為ADC-110之構築體的聚集程度。所偵測到之聚集體的量為總的所偵測結合物之約12%。
圖10(B)展示ADC-111之聚集量，其為約2.4%。
圖10(C)展示ADC-112之聚集量，其為約2.7%。
圖11展示ADC-110及ADC-111針對各種細胞類型之活體外活性。
圖12展示具有鍵聯至抗體cKitA之不同有效負載(來自表5之5A、5B、5C、5D、5E及5F)之一系列免疫結合物的活性。其均在細胞培養物中展現對SK-OV-3ip之良好至優異活性。
圖13展示結合至曲妥珠單抗(TBS)之所選有效負載對各種腫瘤細胞株的活性，證實多種式II之有效負載對各種癌症細胞株具活性。該等有效負載化合物見於表5及6中。
圖14展示本發明之代表性抑制劑與其他化合物類別之Eg5抑制劑的比較；圖14中之化合物均經由Val-Cit連接子鍵聯至曲妥珠單抗。
圖15展示與具有美登素有效負載之免疫結合物相比，本發明之曲妥珠單抗免疫結合物對Her2高表現及Her2低表現細胞株之活性。具有非Her2抗原結合劑之免疫結合物包括在內以便進行比較。
圖16展示關於經單獨曲妥珠單抗、與化合物5B(5mg/kg劑量及10mg/kg劑量)結合之曲妥珠單抗及對照結合物(其中抗原結合基團不識別腫瘤抗原)處理之小鼠異種移植物腫瘤(SK-OV-3ip)的活體內腫瘤生長抑制結果。
圖17展示與具有美登素有效負載之結合物及一種缺乏有效負載之對照物及一種不具有腫瘤結合抗體之對照物相比，經曲妥珠單抗(抗Her2抗體)上具有Eg5抑制劑有效負載之免疫結合物處理的小鼠異種移植物腫瘤(SK_OV-3ip)上的活體內腫瘤生長抑制活性。
圖18展示經cKitA(抗cKit抗體)上具有Eg5抑制劑有效負載之免疫結合物處理的小鼠異種移植物腫瘤(H526)上之活體內腫瘤生長抑制活性。
圖19展示與含有美登素有效負載(DM1)之cKitA結合物相比，經cKitA(抗cKit抗體)上具有Eg5抑制劑有效負載之免疫結合物處理的小鼠異種移植物腫瘤(H526)上之活體內腫瘤生長抑制活性。
圖20展示經cKitA(抗cKit)抗體上及曲妥珠單抗抗體上具有Eg5抑制劑有效負載之免疫結合物處理的攜帶兩種異種移植物腫瘤(H526及SK-OV-3ip)之小鼠上之活體內腫瘤生長抑制活性。
圖21展示具有曲妥珠單抗抗體之多種Eg5抑制劑免疫結合物在小鼠異種移植物SK-OV-3ip腫瘤上測試之活性。為進行比較，免疫結合物具有與奧里斯他汀有效負載(MMAE)及美登素有效負載(DM1)結合之相同抗體。
圖22展示表5中之數種免疫結合物在小鼠異種移植物腫瘤中之活體內活性，使用Kadcyla®及抗Her2抗體作為比較物及使用僅媒劑作為對照物。
圖23展示表5中之數種免疫結合物在小鼠異種移植物中之活體內活性，使用Kadcyla®及化合物6U(抗Her2抗體結合物)及對病毒醣蛋白gH具特異性之igG1 κ鏈作為比較物及使用僅媒劑作為對照物。
圖24展示表5中之數種免疫結合物在小鼠異種移植物中之活體內活性，使用僅媒劑作為對照物。該等免疫結合物具有結合於表5中之化合物之抗cKit抗體，且細胞株對ckit抗體敏感。
圖25展示表5中之數種免疫結合物在小鼠異種移植物中之活體內活性，使用僅媒劑作為對照物。該等免疫結合物具有結合於表5中之化合物之抗cKit抗體。
圖26展示具有有效負載-連接子化合物5B之免疫結合物在小鼠異 種移植物中之活體內活性，及三種不同抗cKit抗體。cKitA為親本抗體；cKitB及cKitC為經半胱胺酸工程改造之cKitA突變蛋白，如此處所述。結果以兩種不同給藥含量展示，使用僅媒劑作為對照物。在兩種劑量下，經半胱胺酸工程改造之突變型抗體各提供比原生抗體更具活性之免疫結合物。
圖27展示包含與化合物5B結合之抗體cKitA的免疫結合物之活體內活性，使用cKitA抗體(未結合)及媒劑作為對照物。
圖28包括多種本發明之免疫結合物在多種不同腫瘤細胞類型上測試之活體外(細胞培養物)活性的曲線圖。最後一個圖(圖28-29)展示活體外活性並未受DAR之小變化顯著影響。
除非另外明確提供，否則以下定義適用。
術語「胺基酸」係指典型、合成及非天然胺基酸，以及以類似於典型胺基酸之方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。典型胺基酸為由遺傳密碼編碼之蛋白質胺基酸，且包括丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸，以及硒半胱胺酸、吡咯離胺酸及吡咯啉-羧基-離胺酸。胺基酸類似物係指與典型胺基酸具有相同基礎化學結構(亦即結合於氫、羧基、胺基及R基團之α-碳)之化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與典型胺基酸相同之基礎化學結構。
如本文所用之術語「抗原結合部分」係指能夠特異性結合於抗原之部分，且包括(但不限於)抗體及抗體片段。
如本文所用之術語「抗體」係指能夠非共價地、可逆地及以特 定方式結合相應抗原之免疫球蛋白家族多肽。舉例而言，天然存在之IgG抗體為包含藉由二硫鍵互連的至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之四聚體。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域，即CL。VH及VL區可進一步再分為與較為保守之區(稱作構架區(FR))交替之高變區(稱作互補決定區(CDR))。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序排列之3個CDR及4個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)的宿主組織或因子結合。
術語「抗體」包括(但不限於)單株抗體、人類抗體、人類化抗體、駱駝抗體、嵌合抗體及抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如本發明抗體之抗Id抗體)。該等抗體可為任何同型/類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)或子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
輕鏈及重鏈均分為結構及功能同源區。術語「恆定」及「可變」在功能上使用。就此而言，應瞭解輕鏈(VL)與重鏈(VH)部分之可變域決定抗原識別及特異性。相反地，輕鏈(CL)與重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定域賦予重要的生物特性，諸如分泌、經胎盤活動性、Fc受體結合、補體結合及其類似特性。按照慣例，恆定區中域之編號隨著其更加遠離抗體之抗原結合位點或胺基端而增大。N端為可變區且C端為恆定區；CH3及CL域實際上分別包含重鏈及輕鏈之羧基端域。
如本文所用之術語「抗原結合片段」係指保留特異性與抗原之抗原決定基相互作用(例如，藉由結合、位阻、穩定化/去穩定化、空 間分佈)的能力之抗體之一或多個部分。結合片段之實例包括(但不限於)單鏈Fv(scFv)；二硫鍵鍵聯之Fv(sdFv)；Fab片段、F(ab')片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，包含在鉸鏈區藉由二硫鍵鍵聯的兩個Fab片段之二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546,1989)，其由VH域組成；及分離之互補決定區(CDR)，或抗體之其他抗原決定基結合片段。
此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)由獨立基因編碼，但其可使用重組方法由合成連接子接合，該連接子能夠使其製造成其中VL及VH區成對以形成單價分子之單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(「scFv」)；參見例如Bird等人，Science 242：423-426,1988；及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883,1988)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語「抗原結合片段」內。此等抗體結合片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用對該等片段進行篩選。
抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體、最小抗體、奈米抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙scFv中(參見例如Hollinger及Hudson,Nature Biotechnology 23：1126-1136,2005)。抗原結合片段可接枝至基於多肽之骨架，諸如III型纖維結合蛋白(Fn3)中(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽單抗體)
抗原結合片段可併入包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)之單鏈分子中，該等區段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，Protein Eng.8：1057-1062,1995；及美國專利第5,641,870號)。
如本文所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具 有實質上一致胺基酸序列或源自相同基因來源之多肽，包括抗體及抗原結合片段。此術語亦包括單分子組成之抗體分子製劑。單株抗體組成展示對於特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。
如本文所用之術語「人類抗體」包括具有其中構架及CDR區均源自人類起源之序列的可變區之抗體。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自該等人類序列，例如人類生殖系序列，或人類生殖系序列之突變形式或含有源自人類構架序列分析之一致構架序列的抗體，例如如Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86,2000所述。
本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變或保守取代引入之突變以促進穩定性或製造)。
如本文所用之術語「人類化」抗體係指保留非人類抗體之反應性但在人類中之免疫原性較低的抗體。此可例如藉由保留非人類CDR區且抗體之剩餘部分用其人類對應物置換來達成。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3)：169-217(1994)。
術語「特異性結合」或「選擇性結合」當用於描述抗原(例如蛋白質)與抗體、抗體片段或抗體源性結合劑之間的相互作用之背景中時，係指結合反應，其對於蛋白質及其他生物製劑之異源群體中，例如生物樣品，例如血液、血清、血漿或組織樣品中存在抗原為決定性的。因此，在某些指定免疫分析條件下，具有特定結合特異性之抗體或結合劑與特定抗原的結合為背景之至少兩倍且實質上不以顯著量結合於樣品中存在之其他抗原。在一個實施例中，在指定免疫分析條件下，具有特定結合特異性之抗體或結合劑與特定抗原的結合為背景之 至少十(10)倍且實質上不以顯著量結合於樣品中存在之其他抗原。在該等條件下特異性結合於抗體或結合劑可能需要該抗體或結合劑已因其對於特定蛋白質之特異性而經選擇。必要時或適當時，此選擇可藉由扣除與來自其他物種(例如小鼠或大鼠)之分子或其他亞型交叉反應之抗體來達成。或者，在一些實施例中，選擇與某些所需分子交叉反應之抗體或抗體片段。
可使用多種免疫分析形式來選擇對特定蛋白質具特異性免疫反應性的抗體。舉例而言，常規地使用固相ELISA免疫分析來選擇對蛋白質具特異性免疫反應性之抗體(參見例如Harlow及Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)，關於描述可用於確定特異性免疫反應性之免疫分析形式及條件)。特異性或選擇性結合反應典型地將產生超過背景信號至少兩倍及更典型地超過背景至少10至100倍之信號。
如本文所用之術語「親和力」係指抗體與抗原之間在單抗原位點處的相互作用之強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由弱非共價力與抗原在多個位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。
術語「經分離之抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體。然而，特異性結合於一種抗原之經分離之抗體可與其他抗原具有交叉反應性。此外，經分離之抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於經典胺基酸聚合物以及非經典胺基酸聚合物。除非另外指示，否則特定多肽序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體。
如本文所用之術語「免疫結合物」或「抗體結合物」係指抗原 結合部分(諸如抗體或其抗原結合片段)與另一試劑(諸如化學治療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針、光譜探針及其類似物)之鍵聯。鍵聯可為共價鍵，或非共價相互作用，且可包括螯合。可採用此項技術中已知之各種連接子以形成免疫結合物。另外，免疫結合物可以可自編碼免疫結合物之聚核苷酸表現之融合蛋白形式提供。如本文所用，「融合蛋白」係指經由接合兩個或兩個以上最初編碼獨立蛋白質(包括肽及多肽)之基因或基因片段產生之蛋白質。融合基因之轉譯產生具有源自各初始蛋白質之功能特性的單一蛋白質。
如本文所用之術語「細胞毒素」或「細胞毒性劑」係指對細胞之生長及增生有害且可用以減少、抑制或破壞細胞或惡性腫瘤之任何試劑。
如本文所用之術語「抗癌劑」係指可用以治療細胞增生病症(諸如癌症)之任何試劑，包括(但不限於)細胞毒性劑、化學治療劑、放射線療法及放射線治療劑、靶向抗癌劑及免疫治療劑。
如本文所用之術語「藥物部分」或「有效負載」包括(但不限於)Eg5抑制劑，係指結合於或可結合於抗體或抗原結合片段以形成免疫結合物之化學部分，且可包括適用於連接於抗體或抗原結合片段之任何部分。本發明之免疫結合物包含例如Eg5抑制劑作為有效負載，但亦可包括一或多種其他有效負載。舉例而言，藥物部分或有效負載可為抗癌劑、消炎劑、抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生蟲劑、抗病毒劑或麻醉劑。在某些實施例中，藥物部分係選自V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、奧里斯他汀、多拉斯他汀(dolastatin)、類美登素、MetAP(甲硫胺酸胺基肽酶)、蛋白質CRM1之核輸出抑制劑、DPPIV抑制劑、粒線體中磷醯基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、蛋白酶體抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC 抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合劑及DHFR抑制劑。合適之實例包括奧里斯他汀，諸如MMAE及MMAF；加利車黴素，諸如γ-加利車黴素；及類美登素，諸如DM1、DM3及DM4。用於連接此等藥物部分中之每一者至可與抗體相容之連接子之方法及本發明方法為此項技術中已知的。參見例如Singh等人，(2009)Therapeutic Antibodies：Methods and Protocols，第525卷，445-457。此外，有效負載可為生物物理探針、螢光團、自旋標記、紅外探針、親和探針、螯合劑、光譜探針、放射性探針、脂質分子、聚乙二醇、聚合物、自旋標記、DNA、RNA、蛋白質、肽、表面、抗體、抗體片段、奈米粒子、量子點、脂質體、PLGA粒子、醣或多醣、反應性官能基(諸如本文所述者)或可連接結合物至另一部分或表面之結合劑等。
「腫瘤」係指贅生性細胞生長及增生(無論惡性或良性)及所有癌前及癌症細胞及組織。
術語「抗腫瘤活性」意謂腫瘤細胞增生速率、活力或代謝活性降低。展示抗腫瘤活性之可能方式係展示療法期間引起之異常細胞生長速率降低或腫瘤尺寸穩定性或降低。該活性可使用認可之活體外或活體內腫瘤模型來分析，該等模型包括(但不限於)異種移植物模型、同種異體移植物模型、MMTV模型及此項技術中已知研究抗腫瘤活性之其他已知模型。
術語「惡性腫瘤」係指非良性腫瘤或癌症。如本文所用之術語「癌症」包括特徵在於失調或不受控細胞生長之惡性腫瘤。例示性癌症包括：癌瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤。
術語「癌症」包括原發性惡性腫瘤(例如，細胞未遷移至個體體內非原始腫瘤位點之位點處的腫瘤)及繼發性惡性腫瘤(例如，源於轉移之腫瘤，即腫瘤細胞遷移至不同於原始腫瘤位點之繼發性位點 處)。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受之載劑」包括如為熟習此項技術者所知之任何及所有溶劑、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物穩定劑、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料及其類似物及其組合(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company,1990，第1289頁至第1329頁)。除了在任何習知載劑與活性成分不相容之情況下之外，涵蓋其在治療或醫藥組合物中之用途。
術語本發明化合物之「治療有效量」係指將引起個體之生物或醫學反應，例如酶或蛋白質活性降低或抑制，或改善症狀、緩解病狀、減緩或延遲疾病進展或預防疾病等之本發明化合物的量。在一個非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指當投與至個體時有效地至少部分緩解、抑制、預防及/或改善病狀或病症或疾病之本發明化合物的量。
在另一非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指當投與至細胞或組織或非細胞生物材料或培養基時有效地至少部分減少或抑制Eg5活性之本發明化合物的量。
如本文所用之術語「個體」係指動物。動物典型地為哺乳動物。個體亦係指例如靈長類動物(例如人類，男性或女性)、母牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、魚類、鳥類及其類似物。在某些實施例中，個體為靈長類動物。在特定實施例中，個體為人類。
如本文所用之術語「抑制(inhibit)」、「抑制(inhibition)」或「抑制(inhibiting)」係指減輕或遏止既定病狀、症狀或病症或疾病，或顯著降低生物活性或過程之基線活性。
如本文所用，在一個實施例中，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」任何疾病或病症係指改善該疾病或病症(亦即減緩或阻止或減慢疾病之發展或其至少一種臨床症狀)。在另一實施例中，「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指緩解或改善至少一種身體參數，包括患者無法辨識之參數。在又一實施例中，「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指在身體上(例如穩定化可辨識之症狀)、生理上(例如穩定化身體參數)或兩方面調節疾病或病症。在又一實施例中，「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指預防或延遲疾病或病症之進展。
如本文所用，若個體在生物學、醫學或生活品質上將受益於治療，則該個體「需要」該治療。
除非本文中另外指示或與上下文明顯抵觸，否則如本文所用，本發明之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)所用之術語「一(a)」、「一(an)」、「該(the)」及類似術語應解釋為涵蓋單數及複數。
在某些實施例中，本發明之經修飾之免疫結合物根據「X基團/抗體」比率(例如1、2、3、4、5、6、7或8或12或16)描述；此比率對應於式(I)中之『n』。雖然此比率對於特定結合物分子而言具有整數值，但應瞭解典型地使用平均值來描述含有多種分子之樣品，因為免疫結合物樣品內具有一定不均勻性程度。免疫結合物樣品之平均負載在本文中稱為「藥物與抗體比率」或DAR。在一些實施例中，DAR在約1與約16之間，且典型地為約1、2、3、4、5、6、7或8。在一些實施例中，至少50重量%之樣品為具有平均DAR±2之化合物，且較佳地，至少50%之樣品為含有平均DAR±1.5之產物。較佳實施例包括其中DAR為約2至約8，例如約2、約3、約4、約5、約6、約7或約8之免疫結合物。在此等實施例中，DAR為『約q』意謂對於DAR所量測 之值在q之±20%內，或較佳在q之±10%內。
如本文所用之術語「光學異構體」或「立體異構體」係指可針對本發明之既定化合物存在之各種立體異構組態中之任一者，且包括幾何異構體。應理解取代基可連接於碳原子之對掌性中心處。術語「對掌性」係指具有不重疊於其鏡像搭配物上之性質之分子，而術語「非對掌性」係指重疊於其鏡像搭配物上之分子。因此，本發明包括化合物之對映異構體、非對映異構體或外消旋體。「對映異構體」為一對彼此呈不重疊鏡像之立體異構體。一對對映異構體之1：1混合物為「外消旋」混合物。該術語用於在適當時指代外消旋混合物。「非對映異構體」為具有至少兩個不對稱原子，但其彼此不為鏡像之立體異構體。根據Cahn-Ingold-Prelog R-S系統指定絕對立體化學。當化合物為純對映異構體時，各對掌性碳處之立體化學可由R或S指定。絕對組態未知之解析化合物可視其在鈉D線之波長下使平面偏振光旋轉之方向(右旋或左旋)指定為(+)或(-)。本文所述之某些化合物含有一或多個不對稱中心或軸，且可由此產生可在絕對立體化學方面定義為(R)-或(S)-的對映異構體、非對映異構體及其他立體異構形式。
視起始物質及程序之選擇而定，化合物可以一種可能異構體或其混合物形式存在，例如純光學異構體，或異構體混合物，諸如外消旋體及非對映異構體混合物，視不對稱碳原子數目而定。除非另外陳述，例如在鑑別特定異構體之情況下，否則本發明意欲包括所有該等可能之異構體，包括外消旋混合物、非對映異構體混合物及光學純形式。可使用對掌性合成組元或對掌性試劑製備或使用習知技術解析光學活性(R)-及(S)-異構體。若化合物含有雙鍵，則取代基可為E或Z組態。若化合物含有經二取代之環烷基，則環烷基取代基可具有順式或反式組態。亦意欲包括所有互變異構體形式。
如本文所用之術語「鹽(salt)」或「鹽(salts)」係指本發明化合物 之酸加成鹽或鹼加成鹽。「鹽」尤其包括「醫藥學上可接受之鹽」。術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留本發明化合物之生物有效性及特性且典型地在生物學上或其他方面合乎需要之鹽。在許多狀況下，本發明化合物由於存在胺基及/或羧基或其類似基團而能夠形成酸式鹽及/或鹼式鹽。
可用無機酸及有機酸形成醫藥學上可接受之酸加成鹽，例如乙酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙烷二磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、馬尿酸鹽(hippurate)、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘甲酸鹽、萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽及三氟乙酸鹽。
可產生鹽之無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物。
可產生鹽之有機酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸及其類似物。可用無機及有機鹼形成醫藥學上可接受之鹼加成鹽。
可產生鹽之無機鹼包括例如銨鹽及來自週期表之第I欄至第XII欄之金屬。在某些實施例中，鹽係自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅及銅產生；特定言之，合適之鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽及鎂鹽。
可產生鹽之有機鹼包括例如一級、二級及三級胺；經取代之胺，包括天然產生之經取代之胺；環胺；鹼離子交換樹脂及其類似物。某些有機胺包括異丙胺、苄星(benzathine)、膽酸鹽(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺(meglumine)、哌嗪及緩血酸胺(tromethamine)。
可藉由習知化學方法自鹼性或酸性部分合成本發明之醫藥學上可接受之鹽。一般而言，該等鹽可藉由使此等化合物之游離酸形式與化學計量之量的適當鹼(諸如Na、Ca、Mg或K之氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或其類似物)反應或藉由使此等化合物之游離鹼形式與化學計量之量的適當酸反應來製備。該等反應典型地在水中或在有機溶劑中或在二者之混合物中進行。一般而言，在可實行時，需要使用非水性介質，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。額外合適的鹽之清單可見於例如以下文獻中：「Remington's Pharmaceutical Sciences」，第20版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985)；及「Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use」,Stahl及Wermuth(Wiley-VCH,Weinheim，德國，2002)。
本文中給出之任何式亦意欲表示化合物之未標記形式以及經同位素標記之形式。經同位素標記之化合物具有由本文中給出之式描繪之結構，除了一或多個原子經具有所選原子質量或質量數之原子置換。可併入本發明化合物中之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟及氯之同位素，分別諸如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本發明包括如本文所定義之各種經同位素標記之化合物，例如其中存在放射性同位素，諸如3H及14C之化合物，或其中存在非放射性同位素，諸如2H及13C之化合物。該等經同位素標記之化合物適用於代謝研究(使用14C)；反應動力學研究(使用例如2H或3H)；偵測或成像技術，諸如正電子發射斷層攝影術(PET)或 單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)，包括藥物或受質組織分佈分析；或患者之放射性治療。特定言之，18F或經標記化合物可能特別合乎PET或SPECT研究之需要。經同位素標記之式(I)化合物通常可藉由熟習此項技術者已知之習知技術，或藉由與伴隨實例及製備中所述類似之方法，使用適當經同位素標記試劑替代先前採用之未標記試劑來製備。
此外，以重同位素，尤其用氘(亦即2H或D)進行之取代可得到由較大代謝穩定性產生之某些治療優勢，例如活體內半衰期增加或劑量需求減小或治療指數改良。該種重同位素，詳言之氘之濃度可由同位素增濃因數確定。如本文所用之術語「同位素增濃因數」意謂指定同位素之同位素豐度與天然豐度之間的比率。若本發明化合物中之取代基表示為氘，則該化合物中各指定氘原子的同位素增濃因數為至少3500(各指定氘原子上52.5%氘併入)、至少4000(60%氘併入)、至少4500(67.5%氘併入)、至少5000(75%氘併入)、至少5500(82.5%氘併入)、至少6000(90%氘併入)、至少6333.3(95%氘併入)、至少6466.7(97%氘併入)、至少6600(99%氘併入)或至少6633.3(99.5%氘併入)。
如本文所用之術語『硫醇-順丁烯二醯亞胺』係指由硫醇與順丁烯二醯亞胺之反應形成的基團，具有此通式 其中Y及Z為欲經由硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵聯連接之基團，且可包含連接子組分、抗體或有效負載。
如本文所用之『可裂解』係指藉由共價連接來連接兩個部分， 但在生理學相關條件下分解以切斷共價連接之鍵聯基團或連接子組分，典型地可裂解鍵聯基團在細胞內環境中活體內比在細胞外部更快地經切斷，引起有效負載釋放優先在靶向細胞內部發生。裂解可為酶促或非酶促的，但一般自抗體釋放有效負載，而不降解抗體。裂解可留下連接於有效負載之鍵聯基團或連接子組分的某一部分，或其可釋放有效負載而無任何鍵聯基團殘餘物。
如本文所用之『Pcl』係指吡咯啉羧基離胺酸，例如
其中R20為H，其在併入肽中時具有下式：
其中R20為甲基之對應化合物為吡咯離胺酸。
如本文所用之『不可裂解』係指在生理學條件下並非尤其易於分解之鍵聯基團或連接子組分，例如，其至少與免疫結合物之抗體或抗原結合片段部分一樣穩定。該等鍵聯基團有時稱為『穩定的』，意謂其充分耐降解以保持連接於抗原結合部分Ab之有效負載，直至Ab自身至少部分降解，亦即Ab之降解先於鍵聯基團之活體內裂解。具有穩定或不可裂解鍵聯基團之ADC之抗體部分的降解可留下一些或所有鍵聯基團，例如連接於有效負載或活體內遞送之藥物部分之抗體的一或多種胺基酸基團。
如本文所用之術語「鹵素」(或鹵基)係指氟、溴、氯或碘，尤其氟或氯。經鹵素取代之基團及部分(諸如經鹵素取代之烷基(鹵烷基)) 可為單鹵化、多鹵化或全鹵化的。
除非另外提供，否則如本文所用之術語「雜原子」係指氮(N)、氧(O)或硫(S)原子，尤其氮或氧。
如本文所用之術語「烷基」係指完全飽和之分支鏈或未分支烴部分。除非另外提供，否則烷基係指具有1至10個碳原子、1至6個碳原子或1至4個碳原子之烴部分。烷基之代表性實例包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基及其類似基團。
經取代之烷基為含有一或多個取代基來替代氫，諸如1、2或3個取代基，高達未經取代之烷基上存在的氫數目之烷基。若未另外指定，則烷基之合適取代基可選自鹵素、CN、側氧基、羥基、C1-4烷氧基、經取代或未經取代之C3-6環烷基、經取代或未經取代之苯基、胺基、(C1-4烷基)胺基、二(C1-4烷基)胺基、C1-4烷基硫基、C1-4烷基磺醯基、-C(=O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C=O)-C1-4烷基、-NHC(=O)C1-4烷基及-NHC(=O)O C1-4烷基。烷基之較佳取代基包括鹵素、CN、側氧基、羥基、C1-4烷氧基、C3-6環烷基、苯基、胺基、(C1-4烷基)胺基、二(C1-4烷基)胺基、C1-4烷基硫基、C1-4烷基磺醯基、-C(=O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C=O)-C1-4烷基、-NHC(=O)C1-4烷基及-NHC(=O)O C1-4烷基。除非另外指定，否則在一些實施例中，C1-4經取代烷基具有1-3個取代基。
如本文所用之術語「伸烷基」係指具有1至10個碳原子及兩個開放價態以連接至其他特徵之二價烷基。除非另外提供，否則伸烷基係指具有1至10個碳原子、1至6個碳原子或1至4個碳原子之部分。伸烷基之代表性實例包括(但不限於)亞甲基、伸乙基、伸正丙基、伸異丙 基、伸正丁基、伸第二丁基、伸異丁基、伸第三丁基、伸正戊基、伸異戊基、伸新戊基、伸正己基、3-甲基伸己基、2,2-二甲基伸戊基、2,3-二甲基伸戊基、伸正庚基、伸正辛基、伸正壬基、伸正癸基及其類似基團。經取代之伸烷基為含有一或多個，諸如1、2或3個取代基之伸烷基；除非另外指定，否則合適取代基係選自上文關於烷基所列之取代基。
如本文所用之術語「鹵烷基」係指如本文所定義之烷基，其經一或多個如本文所定義之鹵基取代。鹵烷基可為單鹵烷基、二鹵烷基、三鹵烷基，或多鹵烷基，包括全鹵烷基。單鹵烷基可在烷基內具有一個碘、溴、氯或氟。氯及氟較佳在烷基或環烷基上；氟、氯及溴通常較佳在芳基或雜芳基上。二鹵烷基及多鹵烷基可在烷基內具有兩個或兩個以上相同鹵原子或不同鹵基之組合。多鹵烷基典型地含有至多12個，或10個，或8個，或6個，或4個，或3個或2個鹵基。鹵烷基之非限制實例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基及二氯丙基。全鹵-烷基係指所有氫原子均經鹵原子置換之烷基，例如三氟甲基。
如本文所用之術語「烷氧基」係指烷基-O-，其中烷基在上文中定義。烷氧基之代表性實例包括(但不限於)甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、戊氧基、己氧基及其類似基團。典型地，烷氧基具有1-10或1-6個碳，更通常地1-4個碳原子。
「經取代之烷氧基」為含有一或多個，諸如1、2或3個取代基在烷氧基之烷基部分上的烷氧基。除非另外指定，否則合適取代基係選自上文關於烷基所列之取代基，除了羥基及胺基通常不存在於直接連接至經取代之『烷基-O』基團的氧之碳上。
類似地，如「烷基胺基羰基」、「烷氧基烷基」、「烷氧基羰基」、 「烷氧基-羰基烷基」、「烷基磺醯基」、「烷基亞硫醯基」、「烷基胺基」之其他基團的各烷基部分應具有如以上提及之「烷基」定義中所述的相同含義。當以此方式使用時，除非另外指示，否則烷基通常為1-4個碳之烷基且不會進一步經除所指定之組分以外的基團取代。除非另外指定，否則當該等烷基經取代時，合適取代基為上文關於烷基所指定之取代基。
如本文所用之術語「鹵烷氧基」係指鹵烷基-O-，其中鹵烷基在上文中經定義。鹵烷氧基之代表性實例包括(但不限於)氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、三氯甲氧基、2-氯乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙氧基及其類似基團。典型地，鹵烷基具有1-4個碳原子。
如本文所用之術語「環烷基」係指3-12個碳原子之飽和或不飽和非芳族單環、雙環、三環或螺環烴基團：環烷基可為不飽和的且可稠合至另一可為飽和、不飽和或芳族之環，其限制條件在於連接至所關注分子式之環烷基的環原子不為芳環碳。除非另外提供，否則環烷基係指具有3個與9個之間的環碳原子或3個與7個之間的環碳原子之環狀烴基。除非另外指定，否則較佳地，環烷基為具有3-7個環原子之飽和單環。
經取代之環烷基為經1或2或3個或超過3個取代基(高達未經取代之基團上的氫數目)取代之環烷基。典型地，經取代之環烷基將具有1-4或1-2個取代基。除非另外指定，否則合適取代基獨立地選自由以下組成之群：鹵素、羥基、硫醇、氰基、硝基、側氧基、C1-4烷基亞胺基、C1-4烷氧亞胺基、羥基亞胺基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基、C1-4硫烷基、C2-4烯氧基、C2-4炔氧基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、胺基、C1-4烷基胺基、二C1-4烷基胺基、C1-4烷基胺基羰基、二C1-4烷基胺基羰基、C1-4烷基羰基胺基、C1-4烷 基羰基(C1-4烷基)胺基、C1-4烷基磺醯基、C1-4烷基胺磺醯基及C1-4烷基胺基磺醯基，其中各先前提及之烴基團(例如烷基、烯基、炔基、烷氧基殘基)可進一步經一或多個在每次出現時獨立地選自本文中關於『烷基』之較佳取代基清單的基團取代。環烷基之較佳取代基包括C1-4烷基、鹵素、CN、側氧基、羥基、C1-4烷氧基、胺基、(C1-4烷基)胺基、二(C1-4烷基)胺基、C1-4烷基硫基、C1-4烷基磺醯基、-C(=O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C=O)-C1-4烷基、-NHC(=O)C1-4烷基及-NHC(=O)O C1-4烷基。
例示性單環烴基包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基及環己烯基及其類似基團。例示性雙環烴基包括莰基、吲哚基、六氫吲哚基、四氫萘基、十氫萘基、雙環[2.1.1]己基、雙環[2.2.1]庚基、雙環[2.2.1]庚烯基、6,6-二甲基雙環[3.1.1]庚基、2,6,6-三甲基雙環[3.1.1]庚基、雙環[2.2.2]辛基及其類似基團。例示性三環烴基包括金剛烷基及其類似基團。
類似地，如「環烷氧基」、「環烷氧基烷基」、「環烷氧基羰基」、「環烷氧基-羰基烷基」、「環烷基磺醯基」、「鹵環烷基」之其他基團的各環烷基部分應具有如以上提及之「環烷基」定義中所述的相同含義。當在此等術語中使用時，環烷基典型地為未經取代或經1-2個基團取代之單環3-7碳環。當視情況經取代時，取代基典型地選自C1-C4烷基及上文陳述為適合於環烷基之基團。
如本文所用之術語「芳基」係指環部分中具有6-14個碳原子之芳族烴基。典型地，芳基為具有6-14個碳原子、通常6-10個碳原子之單環、雙環或三環芳基，例如苯基或萘基。此外，如本文所用之術語「芳基」係指可為單一芳環或稠合在一起之多個芳環的芳族取代基。非限制性實例包括苯基、萘基及1,2,3,4-四氫萘基，其限制條件為該四氫萘基經由四氫萘基之芳環的碳連接至所描述之式。
經取代之芳基為經1-5個(諸如1或2或3個)獨立地選自由以下組成之群之取代基取代的芳基：羥基、硫醇、氰基、硝基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基、C1-4硫烷基、C2-4烯氧基、C2-4炔氧基、鹵素、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、胺基、C1-4烷基胺基、二C1-4烷基胺基、C1-4烷基胺基羰基、二C1-4烷基胺基羰基、C1-4烷基羰基胺基、C1-4烷基羰基(C1-4烷基)胺基、C1-4烷基磺醯基、胺磺醯基、C1-4烷基胺磺醯基及C1-4烷基胺基磺醯基，其中各先前提及之烴基團(例如烷基、烯基、炔基、烷氧基殘基)可進一步經一或多個在每次出現時獨立地選自上文中作為烷基之較佳取代基列出的基團取代。芳基之較佳取代基為C1-4烷基、鹵素、CN、羥基、C1-4烷氧基、胺基、(C1-4烷基)胺基、二(C1-4烷基)胺基、C1-4烷基硫基、C1-4烷基磺醯基、-C(=O)-C1-4烷基、COOH、-COO(C1-4烷基)、-O(C=O)-C1-4烷基、-NHC(=O)C1-4烷基及-NHC(=O)O C1-4烷基。
類似地，如「芳氧基」、「芳氧基烷基」、「芳氧基羰基」、「芳氧基-羰基烷基」之其他基團的各芳基部分應具有如以上提及之「芳基」定義中所述的相同含義。
如本文所用之術語「雜環基」係指雜環基團，其為飽和或部分不飽和的，但不為芳族，且可為單環或多環(在多環，尤其雙環、三環或螺環之情況下)；且具有3至14個，更通常4至10個，且最佳5或6個環原子；其中一或多個，較佳1至4個，尤其1或2個環原子為獨立地選自O、S及N之雜原子(其餘環原子因此為碳)。即使描述為例如C5-6原子環，雜環含有至少一個雜原子作為環原子且具有所陳述之環原子數目，例如在此實例中為5-6。較佳地，雜環基具有1或2個該等雜原子作為環原子，且較佳地雜原子不直接連接至彼此。鍵結環(亦即，連接至所關注之式之環)較佳地具有4至12個，尤其5至7個環原子。雜環基團可稠合至芳環，其限制條件為連接至所關注之式之雜環基團原 子不為芳族的。雜環基團可經由雜環基團之雜原子(典型地為氮)或碳原子連接至所關注之式。雜環基可包括稠合或橋接環以及螺環，且多環雜環基團之僅一個環需要含有雜原子作為環原子。雜環之實例包括四氫呋喃(THF)、二氫呋喃、1,4-二噁烷、嗎啉、1,4-二噻烷、哌嗪、哌啶、1,3-二氧戊環、咪唑啶、咪唑啉、吡咯啉、吡咯啶、四氫哌喃、二氫哌喃、氧硫雜環戊烷、二硫雜環戊烷、1,3-二噁烷、1,3-二噻烷、氧硫雜環己烷、硫嗎啉及其類似物。
經取代之雜環基為獨立地經1-5個(諸如1或2或3個)選自上文關於環烷基所述之取代基的取代基取代之雜環基團。
類似地，如「雜環基氧基」、「雜環基氧基烷基」、「雜環基氧基羰基」之其他基團的各雜環基部分應具有如以上提及之「雜環基」定義中所述的相同含義。
除非另外指定，否則如本文所用之「環醚」係指含有4-7個環原子之雜環，其含有氧原子作為環成員，且對於5個或5個以上原子之環而言視情況含有兩個非相鄰氧原子。典型實例包括氧雜環丁烷、四氫呋喃、四氫哌喃、氧雜環庚烷及1,4-二噁烷。
如本文所用之術語「雜芳基」係指5-14員單環或雙環或三環芳環系統，其具有1至8個雜原子作為環成員；該等雜原子選自N、O及S。雜芳基及雜環可在本文中稱為例如C5-6雜芳基或雜環：應理解當使用此描述時，該5-6係指環原子總數，包括碳及雜原子；該等環可替代地稱為5-6員雜芳基或雜環基團。典型地，雜芳基為含有至少一個雜原子作為環成員之5-10員環系統，例如5-6員單環或8-10員雙環基團。典型雜芳基包括2-或3-噻吩基、2-或3-呋喃基、2-或3-吡咯基、2-、4-或5-咪唑基、1-、3-、4-或5-吡唑基、2-、4-或5-噻唑基、3-、4-或5-異噻唑基、2-、4-或5-噁唑基、3-、4-或5-異噁唑基、3-或5-1,2,4-三唑基、4-或5-1,2,3-三唑基、1-或2-四唑基、2-、3-或4-吡啶基、3-或4- 噠嗪基、3-、4-或5-吡嗪基、2-吡嗪基及2-、4-或5-嘧啶基。
術語「雜芳基」亦係指其中雜芳環稠合至一或多個芳基、環烷基或雜環基環之基團，其中連接至所關注之式之基團或點在雜芳環上。非限制性實例包括1-吲哚嗪基、2-吲哚嗪基、3-吲哚嗪基、5-吲哚嗪基、6-吲哚嗪基、7-吲哚嗪基或8-吲哚嗪基、1-異吲哚基、3-異吲哚基、4-異吲哚基、5-異吲哚基、6-異吲哚基或7-異吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基或7-吲哚基、2-吲唑基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、6-吲唑基或7-吲唑基、2-嘌呤基、4-嘌呤基、5-嘌呤基、6-嘌呤基、7-嘌呤基或8-嘌呤基、1-喹嗪基、2-喹嗪基、3-喹嗪基、4-喹嗪基、6-喹嗪基、7-喹嗪基、8-喹嗪基或9-喹嗪基、2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基或8-喹啉基、1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基或8-異喹啉基、1-酞嗪基、4-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基、7-酞嗪基或8-酞嗪基、2-啶基、3-啶基、4-啶基、5-啶基或6-啶基、2-喹唑啉基、3-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基或8-喹唑啉基、3-啉基、4-啉基、5-啉基、6-啉基、7-啉基或8-啉基、2-喋啶基、4-喋啶基、6-喋啶基或7-喋啶基、1-4aH咔唑基、2-4aH咔唑基、3-4aH咔唑基、4-4aH咔唑基、5-4aH咔唑基、6-4aH咔唑基、7-4aH咔唑基或8-4aH咔唑基、1-咔唑基、2-咔唑基、3-咔唑基、4-咔唑基、5-咔唑基、6-咔唑基、7-咔唑基或8-咔唑基、1-咔啉基、3-咔啉基、4-咔啉基、5-咔啉基、6-咔啉基、7-咔啉基、8-咔啉基或9-咔啉基、1-啡啶基、2-啡啶基、3-啡啶基、4-啡啶基、6-啡啶基、7-啡啶基、8-啡啶基、9-啡啶基或10-啡啶基、1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、5-吖啶基、6-吖啶基、7-吖啶基、8-吖啶基或9-吖啶基、1-啶基、2-啶基、4-啶基、5-啶基、6-啶基、7-啶 基、8-啶基或9-啶基、2-啡啉基、3-啡啉基、4-啡啉基、5-啡啉基、6-啡啉基、8-啡啉基、9-啡啉基或10-啡啉基、1-啡嗪基、2-啡嗪基、3-啡嗪基、4-啡嗪基、6-啡嗪基、7-啡嗪基、8-啡嗪基或9-啡嗪基、1-啡噻嗪基、2-啡噻嗪基、3-啡噻嗪基、4-啡噻嗪基、6-啡噻嗪基、7-啡噻嗪基、8-啡噻嗪基、9-啡噻嗪基或10-啡噻嗪基、1-啡噁嗪基、2-啡噁嗪基、3-啡噁嗪基、4-啡噁嗪基、6-啡噁嗪基、7-啡噁嗪基、8-啡噁嗪基、9-啡噁嗪基或10-啡噁嗪基、2-苯并異喹啉基、3-苯并異喹啉基、4-苯并異喹啉基、5-苯并異喹啉基、6-苯并異喹啉基，或1-苯并異喹啉基、3-苯并異喹啉基、4-苯并異喹啉基、5-苯并異喹啉基、6-苯并異喹啉基、7-苯并異喹啉基、8-苯并異喹啉基、9-苯并異喹啉基或10-苯并異喹啉基、2-噻吩并[2,3-b]呋喃基、3-噻吩并[2,3-b]呋喃基、4-噻吩并[2,3-b]呋喃基或噻吩并[2,3-b]呋喃基、2-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、3-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、5-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、6-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、7-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、8-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、9-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、10-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基或11-7H-吡嗪并[2,3-c]咔唑基、2-2H-呋喃并[3,2-b]-哌喃基、3-2H-呋喃并[3,2-b]-哌喃基、5-2H-呋喃并[3,2-b]-哌喃基、6-2H-呋喃并[3,2-b]-哌喃基或7-2H-呋喃并[3,2-b]-哌喃基、2-5H-吡啶并[2,3-d]-o-噁嗪基、3-5H-吡啶并[2,3-d]-o-噁嗪基、4-5H-吡啶并[2,3-d]-o-噁嗪基、5-5H-吡啶并[2,3-d]-o-噁嗪基、7-5H-吡啶并[2,3-d]-o-噁嗪基或8-5H-吡啶并[2,3-d]-o-噁嗪基、1-1H-吡唑并[4,3-d]-噁唑基、3-1H-吡唑并[4,3-d]-噁唑基或5-1H-吡唑并[4,3-d]-噁唑基、2-4H-咪唑并[4,5-d]噻唑基、4-4H-咪唑并[4,5-d]噻唑基或5-4H-咪唑并[4,5-d]噻唑基、3-吡嗪并[2,3-d]噠嗪基、5-吡嗪并[2,3-d]噠嗪基或8-吡嗪并[2,3-d]噠嗪基、2-咪唑并[2,1-b]噻唑基、3-咪唑并[2,1-b]噻唑基、5-咪唑并[2,1-b]噻唑基或6-咪唑并[2,1-b]噻唑基、1-呋喃并[3,4-c]啉基、3-呋喃并 [3,4-c]啉基、6-呋喃并[3,4-c]啉基、7-呋喃并[3,4-c]啉基、8-呋喃并[3,4-c]啉基或9-呋喃并[3,4-c]啉基、1-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、2-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、3-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、4-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、5-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、6-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、8-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、9-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、10-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基或11-4H-吡啶并[2,3-c]咔唑基、2-咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪基、3-咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪基、6-咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪基或7-咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪基、7-苯并[b]噻吩基、2-苯并噁唑基、4-苯并噁唑基、5-苯并噁唑基、6-苯并噁唑基或7-苯并噁唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、6-苯并咪唑基或7-苯并咪唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、6-苯并噻唑基或7-苯并噻唑基、1-苯并氧呯基、2-苯并氧呯基、4-苯并氧呯基、5-苯并氧呯基、6-苯并氧呯基、7-苯并氧呯基、8-苯并氧呯基或9-苯并氧呯基、2-苯并噁嗪基、4-苯并噁嗪基、5-苯并噁嗪基、6-苯并噁嗪基、7-苯并噁嗪基或8-苯并噁嗪基、1-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、2-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、3-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、5-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、6-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、7-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、8-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、9-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、10-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基或11-1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基。典型稠合雜芳基包括(但不限於)2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基或8-喹啉基、1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基或8-異喹啉基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基或7-吲哚基、2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基或7-苯并[b]噻吩基、2-苯并 噁唑基、4-苯并噁唑基、5-苯并噁唑基、6-苯并噁唑基或7-苯并噁唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、6-苯并咪唑基或7-苯并咪唑基及2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、6-苯并噻唑基或7-苯并噻唑基。
經取代之雜芳基為含有一或多個選自上文描述為適合用於芳基之取代基的取代基之雜芳基。
類似地，如「雜芳氧基」、「雜芳氧基烷基」、「雜芳氧基羰基」之其他基團的各雜芳基部分應具有如以上提及之「雜芳基」定義中所述的相同含義。
在一個態樣中，本發明提供包含Eg5抑制劑作為藥物或有效負載之免疫結合物(例如ADC)，及使用該等免疫結合物或ADC來治療細胞增生病症之組合物及方法。某些咪唑及三唑化合物在此項技術中已知作為Eg5抑制劑及作為治療細胞增生病症之治療劑，且可用作ADC有效負載；參見例如WO2007/021794、WO2006/002236、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381及WO2011/128388。此項技術中已知可能經調適用作ADC有效負載之其他Eg5抑制劑包括例如WO2006/049835、美國專利第7,504,405號、美國專利第7,939,539號及Rath及Kozielski,Nature Reviews：Cancer，第12卷，527-39(2012年8月)之圖3中所揭示的化合物。
包含Eg5抑制劑作為有效負載(藥物)之免疫結合物包括式(I)之結合物：
其中Ab表示抗原結合部分，諸如抗體或抗體片段；L表示藉由共價或非共價鍵結連接X至Ab之鍵聯基團，其可視情 況連接一個以上X至Ab，且可或可不含有可裂解之連接子組分；X表示Eg5抑制劑，諸如如本文所述之式(II)或式(III)化合物，或其他Eg5抑制劑，包括Rath(Rath及Kozielski,Nature Rev.Cancer，第12卷，527-39(2012))中所揭示之化合物，包括伊斯平斯、SB-743921、AZD4877、ARQ621、ARRY-520、LY2523355、MK-0731、EMD534085及GSK-923295，及WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388及WO2006/049835中所述之Eg5抑制劑；m為1-4之整數，典型地為1-2；且n為1至16之整數，較佳為2-8。
本發明之某些態樣及實例在以下所列舉實施例之清單中提供：
1. 一種式(I)之免疫結合物：
其中Ab表示抗原結合部分；L表示連接X至Ab之鍵聯基團；m為1-4之整數；n為1至16之整數；且X表示式(II)之基團
其藉由L連接至Ab， 其中：Z為N或CH；Ar1為視情況經多達3個選自鹵基、C1-3烷基及C1-3鹵烷基之基團取代的苯基；Ar2為苯基或吡啶基或4-6原子環醚，且Ar2視情況經多達兩個選自鹵基、CN、C1-3烷基、羥基、胺基及C1-3鹵烷基之基團取代；R1為C1-6烷基、-(CH2)0-2-C3-6環烷基或含有多達兩個選自N、O及S之雜原子作為環成員的-(CH2)0-2-C4-7雜環基(4-7員雜環)，其中各C1-6烷基、C3-6環烷基或C4-7雜環基視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基、胺基、側氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、C1-4烷基-胺基及COO(C1-4烷基)之基團取代；R2為H或C1-4烷基；T為(CH2)1-3；Y係選自C1-3胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基，其中C1-3胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基各自視情況經多達兩個選自胺基、側氧基、鹵基、羥基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)、-C(=O)NH(C1-4烷基)、-C(=O)N(C1-4烷基)2及C1-4鹵烷基之基團取代；A為NH、N(C1-4烷基)或在式(II)中之羰基與Q之間的鍵；Q係選自C1-4烷基、-O-C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6雜環基、-(CH2)0-2-C3-6環烷基、-(CH2)0-2-C5-6雜芳基及-(CH2)0-2-苯基，且視情況經多達三個選自鹵基、羥基、胺基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR、-O-葡萄糖醛酸酯基及-NR2之基團取代，其中各R為視情況經鹵基、-SH、-NH2、OMe或-OH取代之C1-6烷基；在一些實施例中，R亦可為C3-6環烷基或含有N、O或S作為環成員的4-6員雜環，且各R獨立地視 情況經鹵基、-SH、-NH2、OMe或-OH取代。
典型地，m為1或2，較佳為1；且n為2-8，較佳為約2至約4，或在3與5之間。
在一些此等實施例中，R1為C1-6烷基、-(CH2)0-2-C3-6環烷基或含有多達兩個選自N、O及S之雜原子作為環成員的-(CH2)0-2-C4-7雜環基，其中各C1-6烷基、C3-6環烷基或C4-7雜環基視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基、胺基、側氧基、經羥基取代之C1-4烷基、C1-4烷基-胺基及COO(C1-4烷基)之基團取代。在某些實施例中，各C1-6烷基、C3-6環烷基或C4-7雜環基經多達兩個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基、胺基及經羥基取代之C1-4烷基之基團取代，其中較佳取代基選自F、羥基、甲氧基及胺基。
R1之某些實施例包括4-四氫哌喃基及 且視情況亦包括 其中虛線指示各R1連接至式II之點。
1A. 在一些前述實施例中，R2為H。
1B. 在一些前述實施例中，A為羰基與Q之間的鍵。在其他實施例中，A為NH。在一些前述實施例中，當Y為雜環基或環烷基時，T為CH2且當Y為C1-3胺基烷基時，T為CH2或CH2CH2。
1C. 在一些前述實施例中，Q為經1或2個選自羥基、胺基、硫醇、胺基-C1-4烷氧基或胺基-C1-4烷基硫基之基團取代的C1-4烷基。在其他實施例中，Q為選自嗎啉、硫嗎啉、吡咯啶、四氫呋喃、哌嗪、苯基及吡啶之環，其中該環視情況經多達兩個選自C1-4烷基、鹵基、CN、羥基、胺基、C1-4烷基-胺基、C1-4烷基磺醯基及C1-4烷氧基之基團取代。
1D. 在一些前述實施例中，Y為視情況經多達兩個選自鹵基、C1-4烷基、羥基、胺基、羥基-C1-4烷基、胺基-C1-4烷基、C1-4烷基-胺基及C1-4烷氧基之基團取代的吡咯啶環。吡咯啶之較佳取代基包括F、甲基、羥基及羥基甲基。
2. 根據實施例1之免疫結合物，其中R2為H。
3. 根據實施例1或實施例2之免疫結合物，其中Z為CH。
4. 根據實施例1或2之免疫結合物，其中Z為N。
5. 根據實施例1至4中任一者之免疫結合物，其中R1為四氫哌喃基環且R1視情況經多達兩個選自側氧基及甲基之基團取代。
6. 根據前述實施例中任一者之免疫結合物，其中Ar1為二鹵基 苯基。在某些實施例中，Ar1為2,5-二鹵基苯基，例如Ar1可為2,5-二氟苯基。
在此等實施例中，Ar2可為苯基、鹵苯基、羥基苯基或胺基吡啶，例如苯基、3-氟苯基、3-羥基苯基、3-胺基-2-吡啶基。
7. 根據前述實施例中任一者之免疫結合物，其中式(II)化合物具有下式： 其中式(I)中之L連接至Y，或連接至Q，或連接至式(II)中之R1。在較佳實施例中，L連接至作為基團Y之一部分或基團Q之一部分的氧原子或胺氮。
7A. 根據前述實施例中任一者之免疫結合物，其中式(II)化合物具有下式：
其中L連接至R1，且R1為視情況經取代之烷基。在一些此等實施例中，R1為通式-CMe2(CH2)0-2-G-[L]之C3-6烷基，其中[L]指示其中R1連接至L之點，且G可為一鍵、-O-、-NH-、-S-、-CONH-或-COO-。在一些此等實施例中，R1為-C(Me)2-(CH2)0-2-R30，其中R30為羥基、羧基或胺基。在此等實施例中，L通常經由基團R30連接至R1。R1之實施 例包括-C(Me)2-(CH2)0-2-O-[L]、-C(Me)2-(CH2)0-2-NH-[L]、-C(Me)2-(CH2)0-2-C(=O)-[L]及-C(Me)2-(CH2)0-2-C(=O)-NH-[L]，其中[L]指示式(II)化合物連接至式I中之連接子L之點。
8. 根據實施例1-7中任一者之免疫結合物，其中R1為4-四氫哌 喃基。舉例而言，R1為。視情況，四氫哌喃環可經1或2個選 自羥基、甲基、甲氧基及鹵基之取代基取代。
9. 根據前述實施例中任一者之免疫結合物，其中式(II)中之Q為經1或2個選自羥基及胺基之基團取代的C1-4烷基。在其中A為NH或N(烷基)之實施例中，Q通常為-CH2OH、-CH2NH2或經1或2個選自-OH及-NH2之基團取代的C2-4烷基。在A為一鍵之情況下，Q可為C1-3烷基，視情況經-OH及/或NH2取代。基團Q之羥基或胺可用於連接式(II)化合物至式(I)中之L。
10. 根據前述實施例中任一者之免疫結合物，其中Y為視情況經1或2個選自氟、胺基、羥基、甲氧基及羥基甲基之基團取代的吡咯啶。在此等實施例中，吡咯啶環NH或在吡咯啶環上之胺基或羥基可為式(II)化合物連接至式(I)中之L的點。
11. 根據前述實施例中任一者之免疫結合物，其中A為-NH-。
11B. 或者，前述實施例中任一者之免疫結合物，其中A為一鍵。
12. 前述實施例中任一者之免疫結合物，其中鍵聯基團為可裂解的。可裂解鍵聯基團包括提供細胞中之酶促裂解位點之連接子組分，諸如二肽(例如val-cit)；對pH敏感且易於在細胞內部裂解之連接子組分，諸如腙或亞胺；傾向於在細胞內部裂解之二硫化物連接子組分；或葡萄醣醛酸酶敏感性連接子組分，諸如在胺基苯甲氧基之苯基環上 具有-O-葡萄糖醛酸基團之對胺基苯甲氧基羰基部分。
13. 實施例1-11中任一者之免疫結合物，其中鍵聯基團為不可裂解的。
13A. 實施例13之免疫結合物，其中連接子經選自-(CH2)1-2-COOH、-(CH2)1-2-OH、-COOH或-SO3H之極性基團取代，或其醫藥學上可接受之鹽。
14. 一種式(III)化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Z為N或CH；Ar1為視情況經多達3個選自鹵基、C1-3烷基及C1-3鹵烷基之基團取代的苯基；Ar2為苯基或吡啶基，且視情況經多達兩個選自鹵基、CN、C1-3烷基、羥基、胺基及C1-3鹵烷基之基團取代；R1為-(CH2)0-2-C4-7雜環基或-(CH2)0-2-C3-7環烷基，其中C4-7雜環基為含有多達兩個選自N、O及S之雜原子作為環成員的4-7員環，且C4-7雜環基及C3-7環烷基各自視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基(例如甲基)、C1-4鹵烷基(例如三氟甲基)、C1-4烷氧基、羥基、胺基、側氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基或COO(C1-4烷基)之基團取代；視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、側氧基或COO(C1-4烷基)之基團取代； R2為H或C1-4烷基；T為(CH2)1-3；Y係選自C1-2胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基，其中C1-2胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基各自視情況經多達兩個選自胺基、側氧基、鹵基、羥基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)及C1-3鹵烷基之基團取代；A為NH、N(C1-4烷基)或在式(III)中之羰基與Q之間的鍵；Q係選自C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6雜環基、-(CH2)0-2-C5-6雜芳基及-(CH2)0-2-苯基，且Q視情況經多達三個選自鹵基、羥基、胺基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR、-O-葡萄糖醛酸酯基及-NR2之基團取代，其中各R為視情況經鹵基、-SH、-NH2、OMe或-OH取代之C1-6烷基。
在一些式(III)之此等實施例中，R1為-(CH2)0-2-C3-6環烷基或含有多達兩個選自N、O及S之雜原子作為環成員的-(CH2)0-2-C4-7雜環基，其中各C3-6環烷基或C4-7雜環基視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基、胺基、側氧基、經羥基取代之C1-4烷基、C1-4烷基-胺基及COO(C1-4烷基)之基團取代。在某些實施例中，C3-6環烷基或C4-7雜環基經多達兩個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基、胺基及經羥基取代之C1-4烷基之基團取代，其中較佳取代基選自F、羥基、甲氧基及胺基。
在某些實施例中，R1係選自4-四氫哌喃基及
且視情況亦選自 其中虛線指示各R1之連接點。
在一些式(III)之前述實施例中，R2為H。
在一些式(III)之前述實施例中，A為羰基與Q之間的鍵。在其他實施例中，A為NH。在一些前述實施例中，當Y為雜環基或環烷基時，T為CH2且當Y為C1-3胺基烷基時，T為CH2或CH2CH2。
在一些式(III)之前述實施例中，Q為經1或2個選自羥基、胺基、硫醇、胺基-C1-4烷氧基或胺基-C1-4烷基硫基之基團取代的C1-4烷基。在其他實施例中，Q為選自嗎啉、硫嗎啉、吡咯啶、四氫呋喃、哌嗪、苯基及吡啶之環，其中該環視情況經多達兩個選自C1-4烷基、鹵基、CN、羥基、胺基、C1-4烷基-胺基、C1-4烷基磺醯基及C1-4烷氧基之基團取代。
在一些式(III)之前述實施例中，Y為視情況經多達兩個選自鹵基、C1-4烷基、羥基、胺基、羥基-C1-4烷基、胺基-C1-4烷基、C1-4烷基 -胺基及C1-4烷氧基之基團取代的吡咯啶環。吡咯啶之較佳取代基包括F、甲基、羥基及羥基甲基。
此等新穎Eg5抑制劑可用作低分子量藥物化合物來治療癌症，或其可併入用於靶向活體內遞送之ADC中。
15. 實施例14之化合物，其中R1為四氫哌喃基；在一些實施例中，R1為四氫哌喃-4-基。
16. 一種式(IIA)或(IIB)化合物，
其中Ar1、Ar2、Z、R1、R2、T、Q、Y及A如在以上實施例1中關於式(II)所定義，Q*係選自-CH2O-、-CH2S-、-CH2-NH-、-CH2-NMe-、-CH(Me)O-、-CH(OH)-CH2O-、-CH(O-)-CH2OH、-CH(OH)-CH2NH-、-CH(NH-)-CH2OH、-CH(O-)-CH2NH2、-CH(NH-)-CH2OH、-CH(Me)S-、-CH(Me)NH-、-CH2CH2O-、-CH2CH2NH-、-CH2CH2S-、-CH(Me)CH2O-、-CH(Me)CH2S-、-CH(Me)CH2NH-、 Y*係選自-CH(CH2F)NH-、-CH2NH-、 其中R10及R11獨立地為H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、COOH、COO(C1-4烷基)、CONH(C1-4烷基)、CON(C1-4烷基)2或OH；且W為包含一或多種連接子組分及反應性官能基之鍵聯部分。本文中揭示具有反應性官能基(諸如順丁烯二醯亞胺)之合適鍵聯部分，包括
其中各RN獨立地為H或CH2CH2-R30，其中R30為羥基、胺基或羧基，且RN較佳為H； 其中X表示式(IIA)或IIB化合物，且LG為適合提供醯化劑之脫離基，諸如Cl、-O-苯并三唑(-OBt)、-O-氮雜苯并三唑(-OAt)、-O-丁二醯亞胺、經取代之苯氧基、-OC(O)(苯基或經取代之苯基)、-OC(O)(C1-6烷基)或-OC(O)O(C1-6烷基)。
16B. 或者，式(III)化合物可具有式(IIC)：
其中Ar1、Ar2、Z、R2、T、Q、Y、W及A如上文關於式(III)所定義，R1*為視情況經側氧基、羥基、胺基或羧基取代之C3-6烷基，例如R1*為-C(Me)2-(CH2)0-2-R30，其中R30為羥基、羧基或胺基；且W為包含一或多種連接子組分及反應性官能基之鍵聯部分。
舉例而言，W可為-L1-L2-L3-L4-L5-G，其中G為反應性官能基，且L1、L2、L3、L4及L5為選自上文所述之彼等組分之連接子組分。合適之反應性官能基(G)為具有合適反應性以形成與抗體或抗原結合部分中之胺基酸的胺基酸側鏈之共價鍵聯之官能基，諸如分別為半胱胺酸或離胺酸之-SH或-NH2。合適之反應性官能基之實例包括順丁烯二醯亞胺、α-鹵基乙醯胺(鹵基=Cl、Br或I)、醛(CHO)、硫醇(以形成二硫化物)、2-胺基苯甲醛(ABA)、2-胺基-二苯甲酮(ABP)、2-胺基苯乙酮(AAP)、羧酸酯基，及容易與游離胺基形成醯胺之活化酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺及其類似物之酯。合適之反應性官能基ABA、AAP及ABP包括以下基團：
此等置於視情況選用之鍵聯基團的末端與有效負載相對之部分 與Pcl或Pyl反應，如Ou等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.2011,108(26),10437-42中所述，以形成鍵聯基團，其中L1為
其中R20為H或Me，且R30為H、Me或苯基。
本發明之此等實施例為適用於製備包含類似於上述式(II)及(III)化合物之Eg5抑制劑有效負載之結合物的活化中間物。在此等實施例中，該等化合物包含定位於一個位置處之反應性官能基，其耐受良好，甚至與不可裂解之連接子一起使用，例如鍵聯基團連接至式(II)中對應於Y或Q之原子。
17. 實施例16之化合物，其中W包含選自-SH、-NH2、-C(=O)H、-C(=O)Me、N-順丁烯二醯亞胺、-NHC(=O)-CH2-鹵基、-COOH及-C(=O)-OR'之反應性官能基，其中鹵基係選自Cl、Br及I，且-OR'為活化酯之脫離基部分。
18. 實施例14-17中任一者之化合物，其中Ar1為二鹵基苯基。尤其合適之基團包括2,5-二氟苯基、2-氟-5-氯苯基及2-氯-5-氟苯基。
19. 實施例14-18中任一者之化合物，其中Ar2為苯基或鹵苯基。尤其合適之基團包括苯基及3-氟苯基。
20. 實施例14-19中任一者之化合物，其中Z為CH。
21. 實施例14-19中任一者之化合物，其中Z為N。
22. 實施例16-21中任一者之化合物，其中R1為4-四氫哌喃基。
22A. 實施例16-21中任一者之化合物，其中R1*為-C(Me)2CH2C(O)NH-[W]，其中[W]指示R1*與W之連接點。
23. 實施例14-22中任一者之化合物，其中R2為H。在替代實施例中，R2可為甲基。
24. 實施例14-23中任一者之化合物，其中A為-NH-。
25. 實施例14-23中任一者之化合物，其中A為一鍵。
26. 實施例14-25中任一者之化合物，其中T為CH2或CH2CH2。較佳地，當Y或Y*為胺基烷基，諸如-CH(CH2F)NH2或-CH2NH2時，T為CH2CH2；且當Y或Y*為視情況經取代之吡咯啶，諸如以下各物時，T為-CH2-：
27. 實施例14-26中任一者之化合物，其中Y係選自- CH(CH2F)NH2、 其中R10及R11獨立地為H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、COOH、COO(C1-4烷基)或OH。
在該等化合物之某些實施例中，Y係選自-CH(CH2F)NH2、
Y之較佳實施例包括
其中[T]指示Y與式中之T的連接點。
Y*之較佳實施例包括
其中[T]指示Y*與式中之T的連接點；且[W]指示其中Y*連接至W。
28. 實施例14-27中任一者之化合物，其中Q係選自-CH2OH、-CH2-NH2、-CH(Me)OH、-CH(OH)-CH2OH、-CH(OH)-CH2NH2、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(Me)SH、-CH(Me)NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2CH2SH、-CH(Me)CH2OH、-CH(Me)CH2SH、-CH(Me)CH2NH2、
組合-A-Q之較佳實施例包括-CH2OH、-CH(Me)OH、-NH-CH2-CHOH-CH2OH、-NH-CH2-CH2OH及-NH-CHMe-CH2OH。詳言之，-A-Q可選自
其中[CO]指示-A-Q與式中之羰基的連接點。
29. 實施例14之化合物，其係選自表1中之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
30. 一種醫藥組合物，其包含實施例15-29中任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
31. 一種組合，其包含治療有效量之根據實施例14-15中一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種治療活性輔劑。
32. 一種治療細胞增生病症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量的實施例1-13中任一者之免疫結合物，或實施例14-15中任一者之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽。
33. 根據實施例14-15中任一者之化合物或實施例1-13中任一者之免疫結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用作藥劑。
34. 根據實施例33之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該藥劑係用於治療癌症。
在某些實施例中，癌症係選自胃、骨髓、結腸、鼻咽、食道及前列腺腫瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、白血病(例如慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T譜系急性淋巴母細胞白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其非霍奇金氏)、膀胱、腎、胃(例如胃腸基質腫瘤(GIST))、肝臟及胰臟癌及肉瘤。
35. 實施例1-13中任一者之免疫結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療癌症。
36. 根據實施例1之免疫結合物，其具有選自以下之式：
其中各RN獨立地為H或CH2CH2-R30，其中R30為羥基、胺基或羧基，且RN較佳為H；
其中R20為H或Me，且R30為H、Me或苯基。
以及視情況選用之
特定實例包括此等：
以及視情況選用之
37. 實施例1-14中任一者之免疫結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療癌症。
38. 一種免疫結合物Ab-L*-X，其包含鍵聯至抗體(Ab)之有效負載(X)，其中該鍵聯基團L*包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-之基團，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22為選自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23及-SO2R23之極性基團，其中k為0至4且各R23獨立地為H或C1-4烷基。較佳地，X為Eg5抑制劑，包括實施例14-29中任一者之化合物。
39. 一種式(I)之免疫結合物：
其中Ab表示抗原結合部分；L表示連接X至Ab之鍵聯基團；m為1-4之整數；n為1至16之整數；且X在每次出現時獨立地表示Eg5抑制劑。
在多個實施例中，X為根據實施例14-29中任一者之化合物。
在某些此等實施例中，X為此式之化合物：
其中R4a為H、F或OH；R4b為H或F；R1選自 Y4選自 且Q4選自 其中連接子L在Y4、Q4或R1處連接至X。
關於此等實施例之較佳連接子L包括以下各物，其中[Ab]指代與抗體之連接點：
及；或當Q4為時，L為
在最後一個選項中，
組合形成此基團-Q4-L：
40. 實施例39之免疫結合物，其中X為選自表1之化合物。
41. 實施例39或40之免疫結合物，其中m為1且該免疫結合物藉由使Ab與選自表2之化合物反應來形成。
42. 一種免疫結合物，其藉由使含有至少一個游離硫醇基團之抗體與選自以下群的順丁烯二醯亞胺化合物反應來製備： 及
在此等免疫結合物之一些實施例中，抗體係選自抗雌激素受體抗體、抗孕酮受體抗體、抗p53抗體、抗HER-2抗體、抗cKit抗體、抗EGFR抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗c-erbB-2抗體、抗P-醣蛋白抗體、抗CEA抗體、抗視網膜母細胞瘤蛋白抗體、抗ras腫瘤蛋白抗體、抗Lewis X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD1-抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD23抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD39抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD71抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD100抗體、抗S-100抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑色素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體及抗Tn-抗原抗體。
此等免疫結合物可具有在1與8之間，典型地在2與6之間且較佳 在3與5之間的藥物與抗體比率(DAR)。
在以上列舉之實施例中，Ab可為任何抗原結合部分，且較佳為識別細胞表面標記之抗原或抗原片段，該標記諸如本文所述作為標靶細胞，諸如癌細胞之特徵的標記。
在列舉之實施例中，X可為任何式(II)或(III)化合物，尤其為以上實施例1-11中或實施例14-15中所揭示之任何化合物，且包括表1中之任何物質。在實施例36之較佳實施方案中，X係選自
其中[L]指示X之哪個原子連接至實施例36中所述之鍵聯基團。
在額外實施例中，X具有下式：
除非另外描述，否則任何以上實施例中之Ab可為任何抗原結合部分，典型地為識別醫藥介入欲靶向之細胞(諸如癌細胞)的特徵抗原之部分。多種合適之抗原為此係技術中熟知的；本文中描述特別關注之特異性抗原。典型地，Ab為抗體，其可為分離的或經構築的，且可為天然或經修飾的(經工程改造)，或為保留與抗體類似之抗原結合活性之抗體片段。
以上實施例中之L可為連接Ab至一或多個X基團之任何鍵聯基團，包括直接連接Ab至式(II)化合物之原子的單鍵。用於ADC之合適連接子為此項技術中熟知的，且可用於本發明之結合物中。L可在Ab上之任何合適可用位置處連接至Ab。典型地，L連接至可用胺基氮原子(亦即一級或二級胺，而非醯胺)，或羥基氧原子，或可用巰基，諸如半胱胺酸上。
在式(I)之一些此等實施例中，m為1或2，且m較佳為1。
在式(I)之一些此等實施例中，n為1-10，通常為1-8或1-6，且較佳地n為1、2、3、4或5。
在式(II)、IIA、IIB及III化合物之一些實施例中，R1為或包含3-6員環烷基環或4-6員雜環基團，且可如各種所列舉實施例中所述經取代。在一些實施例中，R1為未經取代之5-6員雜環基團。在其他實施例中，R1為經胺或羥基取代之5-6員雜環基團，該胺或羥基中任一者視情況為鍵聯基團之連接點。
在任何前述實施例中，L可包含多達六種如本文進一步描述之連 接子組分L1、L2、L3、L4、L5及L6。因此，舉例而言，式(I)之免疫結合物可具有式(IA)：
其中Ab表示抗原結合部分；L1、L2、L3、L4、L5及L6各獨立地表示連接子組分；n為1至16之整數；且X表示Eg5抑制劑，例如如本文所述之式(II)或式(III)化合物。
此等免疫結合物可相等地描繪為以下，以指示連接子組分L6連接至式(II)化合物：
其中Ab表示抗原結合部分；L1、L2、L3、L4、L5及L6各獨立地表示連接子組分；n為1至16之整數；且Ar1、Ar2、R1、R2、T、Y、A、Q及Z如本文中關於式(II)或式(III)所定義。此式中之L6連接至所示之化學結構：-L6-可視為式(II)或(III)基團之取代基。在一些實施例中，L6連接至Q、Y或R1之原子，通常在Q、Y或R1或一種其取代基之氧原子或氮原子處。
在此等實施例中，各連接子組分可視情況為接合連接子組分任一側上之基團的鍵，因此在一些實施例中，式(IA)化合物包括連接Ab至X之連接子組分L1、L2、L3、L4、L5及L6中0、1、2、3、4、5或6者。
用於形成鍵聯基團L之合適連接子組分為此項技術中已知的，用 於構築鍵聯基團L之方法亦為已知的。此等組分包括通常用於連接基團至胺基酸之基團，諸如伸烷基及環氧乙烷寡聚物之間隔基，長度多達約4個胺基酸之胺基酸及短肽；及羰基、胺基甲酸酯基、碳酸酯基、脲、酯及醯胺鍵聯，及其類似物。
在此等結合物之一些實施例中，L1係選自在反應性官能基與通常用於結合之一條胺基酸側鏈反應時形成的基團，例如半胱胺酸之硫醇，或離胺酸之游離-NH2，或經工程改造至抗體中之Pcl或Pyl基團。參見例如Ou等人，PNAS 108(26),10437-42(2011)。合適之-L1-基團包括(但不限於)單鍵、 尤其用於連接至Ab之半胱胺酸殘基；及 尤其用於連接至Ab之離胺酸殘基之-NH2，其中各p為1-10，且各R獨立地為H或C1-4烷基(較佳為甲基)；及
其中R20為H或Me，且R30為H、Me或苯基，用於鍵聯至Pcl或Py1基團，其中所示之醯基連接至經工程改造之抗體中的Pcl或Pyl之離胺酸部分。
用於連接子組分L2、L3、L4及L5之合適選項包括例如伸烷基-(CH2)n-(其中n典型地為1-10或1-6)、乙二醇單元(-CH2CH2O-)n(其中n為1-20，典型地為1-10或1-6)、-O-、-S-、羰基(-C(=O)-)、醯胺- C(=O)-NH-或-NH-C(=O)-；包含-C(=O)-NR21-或-NR21-C(=O)-之醯胺或胺基甲酸酯，其中R21為經如本文所述之極性取代基取代的烷基；酯-C(=O)-O-或-O-C(=O)-；具有兩個可用連接點之環系統，諸如選自苯基(包括1,2-、1,3-及1,4-二取代之苯基)、C5-6雜芳基、C3-8環烷基(包括1,1-二取代之環丙基、環丁基、環戊基或環己基及1,4-二取代之環己基)及C4-8雜環基環以及下文描繪之特定實例的二價環；胺基酸-NH-CHR*-C=O-或-C(=O)-CHR*-NH-，或源自連接至相鄰結構之N(例如連接至順丁烯二醯亞胺氮)的胺基酸之具有式[N]-CHR*-C(=O)-之基團，其中R*為已知胺基酸(通常為經典胺基酸之一，例如trp、ala、asp、lys、gly及其類似物，亦包括例如正纈胺酸、正白胺酸、高絲胺酸、高半胱胺酸、苯基甘胺酸、瓜胺酸及其他通常指定的α-胺基酸)之側鏈、已知胺基酸之多肽(例如二肽、三肽、四肽等)、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵聯(藉由添加-SH至順丁烯二醯亞胺)、-S-CR2-及其他硫醇醚，諸如-S-CR2-C(=O)-或-C(=O)-CR2-S-，其中R在每次出現時獨立地為H或C1-4烷基、-CH2-C(=O)-及二硫化物(-S-S-)；以及此等組分中任一者與下述其他連接子組分之組合，例如一鍵、不可酶促裂解連接子、不可裂解連接子、可酶促裂解連接子、光穩定連接子、光可裂解連接子或包含自分解間隔基之連接子。
在一些實施例中，各連接子組分L1、L2、L3、L4、L5及L6係選自由以下組成之群：一鍵、-(CH2)q-、-(CR2)q-、-(CH2CH2O)q-、-(CH2)q-NR-(CH2)q-、-(CH2)q-O-(CH2)q-、-NH-CHR*-C(=O)-、-C(=O)-CHR*-NR-、-CHR*-C(=O)-、-C(=O)NR-、-NRC(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-NRC(=O)O-、-OC(=O)NR-、-(CH2)qS(CH2)q-、
其中R20為H或Me，且R30為H、Me或苯基，其中各q為0-10，較佳為0-6或1-6；各R、R5及R6獨立地為H或C1-4烷基，R*為常見胺基酸之側鏈，諸如gly、ala、trp、tyr、phe、leu、ile、val、asp、glu gln、asn、his、arg、lys、cys、met、ser、thr、苯基甘胺酸、第三丁基甘胺酸；R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶及吡啶； R8獨立地選自 R9獨立地選自H、C1-4烷基及C1-6鹵烷基；且L1至L6中任一者或全部可不存在，亦即其中任一者或全部可表示其欲連接之兩個基團之間的一鍵。
在某些實施例中，連接子L包含至少一種式-C(O)-NR21-或-NR21-C(O)-或-O-C(=O)-NR21-、-NR21-C(=O)-O-之連接子組分，其中R21具 有式-(CH2)1-4-R22，其中R22為諸如-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23或-SO2R23之極性基團，其中k為0至4且各R23獨立地為H或C1-4烷基。已發現，在連接抗體至有效負載之鍵聯基團中使用此部分會降低結合物之聚集，且藉此改良免疫結合物之溶解性及功效。在較佳實施例中，R22為-(CH2)2-OH或-(CH2)2-COOH。
用於連接子組分L6之尤其合適選項包括如本文所解釋之共價鍵、羰基[-C(=O)-]、 其中G為可酶裂解之基團，諸如葡萄糖醛酸酯基，各q為1-10，Z為諸如-COOH或-SO3H之極性基團，且各R獨立地為H或C1-4烷基(較佳為H或甲基)。
在另一態樣中，本發明提供一種免疫結合物Ab-L*-X，其包含鍵聯至抗體(Ab)之有效負載(X)，其中該鍵聯基團L*包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-之基團，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22為選自- OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23及-SO2R23之極性基團，其中k為0至4且各R23獨立地為H或C1-4烷基。有效負載可為任何合適之有效負載，諸如細胞毒素，如類美登素、奧里斯他汀、毒傘毒素或鵝膏蕈鹼，或在ADC中具有治療效用之其他已知有效負載。在此等免疫結合物之一些實施例中，X為Eg5抑制劑，諸如如本文所述者。
在式I實施例中之X可為任何Eg5抑制劑，但較佳為如上文所述之式II化合物，或在所列舉實施例中描述之此式之任何子類，諸如如上文所述之式(III)化合物。在一些實施例中，X為選自表1之化合物。雖然式(II)及(III)描述『中性』化合物，但應理解在結合物之背景中，X包含一個共價連接至L或直接連接至Ab之原子。
除非另外提供，否則X經由任何可用位置連接至以上各式中之鍵聯基團。在一些實施例中，X經由式(II)或式(III)中由Q表示之基團或由Y表示之基團或由R1表示之基團的一個原子連接至鍵聯基團。
類似地，Ab可為任何抗原結合部分，包括本文所述者。較佳地，Ab為抗體，其可經修飾；例如，除至少一種本發明之Eg5抑制劑意外，Ab亦可具有其他所連接之有效負載。在其中Ab連接至順丁烯二醯亞胺環或連接至鍵聯基團L之-CH2-或-S-的實施例中，其典型地經由Ab之半胱胺酸的硫原子連接；在其中Ab在鍵聯基團之羰基處連接至鍵聯基團的實施例中，其典型地經由Ab中之氮原子，諸如離胺酸之胺連接。
本發明涵蓋任何小分子Eg5抑制劑作為免疫結合物之細胞毒性有效負載之用途。其由式(II)之Eg5抑制劑說明，但不限於此等抑制劑，且已經證實與其他類別之Eg5抑制劑合作。在較佳實施例中，Eg5抑制劑為式(II)或(III)化合物，尤其包括表1中之任何化合物。
應理解，當式(II)或(III)化合物為免疫結合物之一部分時，其共 價連接至鍵聯基團L(或連接至作為L之一部分的連接子組分)或自身連接至Ab。因此，在本發明之免疫結合物中，式(II)或(III)化合物具有開放價態，藉此其共價鍵聯至L(或直接鍵聯至Ab)，較佳足夠緊密以用於活體內遞送至抑制或消除所靶向之細胞。典型地，Eg5抑制劑與Ab之間的鍵聯涉及抗原結合部分Ab共價連接至Eg5抑制劑，通常經由包含一或多種連接子組分(諸如本文所述者)之鍵聯基團。
在使用中，在ADC到達且結合至靶向細胞上之抗原之前或更典型地之後，Eg5抑制劑將自Ab釋放：較佳地，Eg5抑制劑主要在靶向細胞內，在ADC結合至表面抗原且接著內化至靶向細胞中之後釋放。在一些實施例中，鍵聯基團L經設計為可裂解的，且Eg5抑制劑在內化後自ADC脫離。
在一些實施例中，鍵聯基團未設計為可裂解的，且Eg5抑制劑之釋放在抗原結合基團(例如抗體)活體內降解時發生。典型地，Ab之降解在靶向細胞內部，如藉由蛋白酶消化而發生。在此等實施例中，鍵聯基團L之至少一部分可保持連接於Eg5抑制劑X，其限制條件為保持在X上之鍵聯基團L的該部分不會干擾用於抑制Eg5之抑制劑X的亞微莫耳濃度親和性。
用於ADC中之多種鍵聯基團為已知的(參見例如Lash,Antibody-Drug Conjugates：the Next Generation of Moving Parts,Start-Up,2011年12月，1-6)，且可用於本發明範疇內之結合物中。鍵聯基團可為Eg5抑制劑之原子與抗體原子之間的單一共價鍵；舉例而言，Q可為烷基，諸如甲基，且A可不存在於式(II)中，從而提供此式之Eg5抑制劑：
為了連接此抑制劑至抗原結合部分，其可轉化為下式之經修飾Eg5抑制劑，具有碘化物(I)作為反應性官能基：
該碘化物化合物α-鹵基乙醯胺可直接與抗體上之游離硫醇基團反應，從而提供此式之免疫結合物： 其中S為抗體之半胱胺酸殘基的硫原子，且 式(I)中之鍵聯基團L表示CH2與S之間的共價鍵。
在式(I)之結合物之其他實施例中，L可包含2、3、4、5、6或6種以上連接子組分，例如L1、L2、L3、L4、L5及L6。多種包含多種連接子組分之連接子為此項技術中已知的，且各種連接子組分可經選擇及組合以提供可實行之本發明免疫結合物。在某些實施例中，該免疫結合物具有式(IA)：
其中Ab表示抗原結合部分；L1、L2、L3、L4、L5及L6表示連接子組分；n為1至16之整數；且X表示Eg5抑制劑，例如如本文所述之式(II)或式(III)化合物。
在該等化合物中，L1典型地選自在反應性官能基與通常用於結合之一條胺基酸側鏈反應時形成的基團，例如半胱胺酸之硫醇，或離胺酸之游離-NH2，或經工程改造至抗體中之Pcl或Pyl基團。參見例如Ou等人，PNAS 108(26),10437-42(2011)。合適之-L1-基團包括(但不限於)如上文所述之單鍵、 尤其用於連接至Ab之半胱胺酸殘基；及 尤其用於連接至Ab之離胺酸殘基，其中各n為1-10，且各R獨立地為H或C1-4烷基(較佳為甲基)。
用於連接子組分L2、L3、L4及L5之合適選項除一鍵以外亦包括例如伸烷基-(CH2)n-(其中n典型地為1-10或1-6)、乙二醇單元(-CH2CH2O-)n(其中n典型地為1-10或1-6)、-O-、-S-、羰基(-C(=O)-)、醯胺-C(=O)-NH-或-NH-C(=O)-、酯-C(=O)-O-或-O-C(=O)-；具有兩個可用連接點之環，諸如二價苯基、C5-6雜芳基、C3-8環烷基或C4-8雜環基；胺基酸-NH-CHR*-C=O-或-C(=O)-CHR*-NH-，或源自連接至N(例如連接至順丁烯二醯亞胺氮)的胺基酸之具有式[N]-CHR*-C(=O)- 之基團，其中R*為已知胺基酸(通常為經典胺基酸之一，亦包括例如正纈胺酸、正白胺酸、高絲胺酸、高半胱胺酸、苯基甘胺酸、瓜胺酸及其他指定的α-胺基酸)之側鏈、已知胺基酸之多肽(例如二肽、三肽、四肽等)、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵聯(藉由添加-SH至順丁烯二醯亞胺)、-S-CR2-及其他硫醇醚，諸如-S-CR2-C(=O)-或-C(=O)-CR2-S-，其中R在每次出現時獨立地為H或C1-4烷基、-CH2-C(=O)-及二硫化物(-S-S-)；以及此等組分中任一者與下述其他連接子組分之組合，例如一鍵、不可酶促裂解連接子、不可裂解連接子、可酶促裂解連接子、光穩定連接子、光可裂解連接子或自分解間隔基。
在一些實施例中，各連接子組分係選自由以下組成之群：在任一側上之基團之間的一鍵(意謂連接子組分有效地不存在，因此與其側接之基團連接在一起)、-(CH2)q-、-(CH2CH2O)q-、-(CH2)q-NR-(CH2)q-、-NH-CHR*-C(=O)-、-CHR*-C(=O)-、-C(=O)-CHR*-NH-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、-(CH2)qS(CH2)q-、
其中各q為0-10，較佳為0-6或1-6；各R、R5及R6獨立地為H或C1-4烷基，R7獨立地選自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶及吡啶；R8獨立地選自 R9獨立地選自H、C1-4烷基及C1-6鹵烷基；且各R*表示胺基酸之側鏈，該胺基酸可為由遺傳密碼編碼之一種胺基酸，或α-胺基酸類似物，諸如瓜胺酸、第三丁基甘胺酸、苯基甘胺酸、高絲胺酸及其類似物；且此等組分中之任一者或全部可不存在，亦即其可表示其欲連接之兩個基團之間的一鍵。
用於連接子組分L6之較佳選項包括共價鍵、羰基[-C(=O)-]、 其中G為可酶裂解之基團，諸如葡萄糖醛酸酯基，各n為1-10，且各R獨立地為H或C1-4烷基(較佳為甲基)。
本發明之另一態樣提供減少ADC聚集且因此改良ADC功能及特性之連接子。熟知ADC之聚集可對其活性有害，且聚集取決於有效負載以及連接子之特徵。某些親水性連接子已用於減少聚集。實例4說明減少聚集之新穎連接子(例如，ADC-111及ADC-112中之連接子)。 此等新穎連接子包含作為通式-C(O)-NR21-或-NR21-C(O)-或-O-C(=O)-NR21-或-NR21-C(=O)-O-之N-取代醯胺或胺基甲酸酯的連接子組分，其中R21為經諸如羥基、胺基、單烷基胺或二烷基胺、羧酸酯基、羧醯胺或烷基磺醯基之極性基團取代的烷基。正如實例4及圖10(A)-10(C)中之資料證實，在簡單連接子之醯胺上添加極性基團會減少ADC之聚集，該ADC在其他情況下展示顯著聚集，如由尺寸排阻層析法所量測。因此，本發明包括通式Ab-L*-X之ADC，其中Ab為抗體，諸如本文所述者，X為有效負載，諸如細胞毒素或Eg5抑制劑，諸如本文所述之任何Eg5抑制劑，且L*為連接子，其包含式-C(O)-NR21-或NR21-C(O)-之醯胺或式-O-C(=O)-NR21-或-NR21-C(=O)-O-之胺基甲酸酯，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22為諸如-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23及-SO2R23之極性基團，其中k為0至4且各R23獨立地為H或C1-4烷基。連接子之較佳實施例包含其中R21具有式-(CH2)1-2R23之實施例；R23之較佳實施例包括羥基及羧基。
同樣，已知多種與癌細胞相關之抗原，且結合於此等抗原之抗體可用於本發明範疇內之免疫結合物中。舉例而言，雖然Lash中報告之臨床候選ADC僅利用四種有效負載類別，但其包括至少15種與各種靶向細胞相關之抗原。本發明之免疫結合物之代表性實例描述於本文中，但該等實例不限制本發明或申請專利範圍之範疇。
除非本文另外指出或上下文另外明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何合適順序進行。使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲較佳地說明本發明，且不對另外所主張之本發明之範疇造成限制。
本發明之各種所列舉實施例描述於本文中。應認識到，各實施例中所指定之特徵可與其他所指定之特徵組合以提供本發明之其他實 施例。
本發明之醫藥學上可接受之溶劑合物包括其中結晶溶劑可經同位素取代(例如D2O、d6-丙酮、d6-DMSO)之溶劑合物，以及具有非增濃溶劑之溶劑合物。
本發明化合物，亦即含有能夠充當氫鍵之供體及/或受體之基團的式(I)化合物，可能夠用合適的共晶形成劑來形成共晶。此等共晶可藉由已知之共晶形成程序由式(I)化合物來製備。該等程序包括在溶液中將式(I)化合物與共晶形成劑一起在結晶條件下研磨、加熱、共昇華、共熔融或接觸，及分離藉此形成之共晶。合適之共晶形成劑包括WO 2004/078163中所述之共晶形成劑。因此，本發明進一步提供包含式(I)化合物之共晶。
本發明化合物之任何不對稱原子(例如碳或其類似物)可以外消旋或對映異構性增濃形式，例如(R)-、(S)-或(R,S)-組態存在。在某些實施例中，各不對稱原子具有(R)-或(S)-組態之至少50%對映異構體過量、至少60%對映異構體過量、至少70%對映異構體過量、至少80%對映異構體過量、至少90%對映異構體過量、至少95%對映異構體過量或至少99%對映異構體過量；亦即，對於光學活性化合物，通常較佳使用一種對映異構體來實質性排除另一對映異構體。若可能，則具有不飽和雙鍵之原子處的取代基可以順式(Z)-或反式(E)-形式存在。
因此，如本文所用，本發明化合物可呈可能之異構體、旋轉異構體、滯轉異構體、互變異構體或其混合物中一者之形式，例如呈實質上純之幾何(順式或反式)異構體、非對映異構體、光學異構體(對映體)、外消旋體或其混合物形式。如本文所用之『實質上純』或『實質上不含其他異構體』意謂以重量計，產物含有相對於較佳異構體之量小於5%且較佳小於2%的其他異構體。
基於該等成分之物理化學差異，例如藉由層析法及/或分步結 晶，可將任何所得之異構體之混合物分離為純的或實質上純的幾何異構體或光學異構體、非對映異構體、外消旋體。
任何所得之最終產物或中間物之外消旋體均可藉由已知方法解析為光學對映體，例如藉由分離用光學活性酸或鹼獲得之其非對映異構體鹽及釋放光學活性酸性或鹼性化合物。特定言之，因此，可採用鹼性部分將本發明化合物解析成其光學對映體，例如藉由分步結晶用光學活性酸形成之鹽，該光學活性酸例如為酒石酸、二苯甲醯基酒石酸、二乙醯基酒石酸、二-O,O'-對甲苯甲醯基酒石酸、杏仁酸、蘋果酸或樟腦-10-磺酸。亦可藉由對掌性層析法，例如使用對掌性吸附劑之高壓液相層析法(HPLC)解析外消旋產物。
此外，本發明化合物(包括其鹽)亦可以其水合物形式獲得或包括其結晶所用之其他溶劑。本發明化合物可固有地或有意地與醫藥學上可接受之溶劑(包括水)形成溶劑合物；因此，本發明意欲涵蓋溶合形式及非溶合形式。術語「溶劑合物」係指本發明化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽)與一或多個溶劑分子之分子複合物。該等溶劑分子為醫藥技術中常用之溶劑分子，已知其對於接受者無害，例如為水、乙醇及其類似物。術語「水合物」係指溶劑分子為水之複合物。
本發明化合物(包括其鹽、水合物及溶劑合物)可固有地或有意地形成多晶型物。
Eg5抑制劑
本發明之ADC可包括任何合適Eg5抑制劑，尤其分子量低於1000Da、較佳低於700Da之抑制劑。在一些實施例中，Eg5抑制劑具有低於1微莫耳濃度之IC-50；在較佳實施例中，用作有效負載之Eg5抑制劑具有低於100奈莫耳濃度(nM)之IC-50。用於此目的之IC50可如WO2006/002236中所述來量測。合適之Eg5抑制劑包括Rath(Rath及Kozielski,Nature Rev.Cancer，第12卷，527-39(2012)中所揭示之化 合物，包括伊斯平斯、SB-743921、AZD4877、ARQ621、ARRY-520、LY2523355、MK-0731、EMD534085及GSK-923295，及WO06/002236、WO2007/021794、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381、WO2011/128388及WO2006/049835中所述之Eg5抑制劑：較佳之有效負載為本文中所述之式(II)及(III)化合物。
用作ADC有效負載之式(II)或(III)之Eg5抑制劑可在抑制劑上之各種位置處連接至鍵聯基團L(或直接連接至Ab)；在一些實施例中，式(II)化合物經由基團Q或Y或R1之原子連接至L。式(II)化合物上之任何可用價態均可連接至L，但為了便利製備結合物或經修飾之式(IIA)或(IIB)之Eg5抑制劑，連接至L典型地發生在Q或Y之雜原子(N、O或S)處。在式(I)之結合物之一些實施例中，式(II)化合物包含游離-NH-或游離-OH或游離-SH，其用於連接式(II)化合物至鍵聯基團L。在一些實施例中，游離-NH-、-OH或-SH為式(II)中之基團Q或Y或R1之一部分。應注意，游離-NH-可為胺基(-NH2)、環胺(例如，在諸如吡咯啶酮、哌啶或嗎啉之環狀基團中的-NH-)或二級非環胺；在各種情況下，-NH-基團較佳地不為醯胺之一部分或並未結合至羰基或結合至芳基或雜芳基環，該結合將降低其反應性。
連接該等有效負載至鍵聯基團以構築結合物之方法為此項技術中已知的。通常，游離一級或二級胺或羥基藉由醯化反應，使用包含活化酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺酯或經磺酸酯取代之N-羥基丁二醯亞 胺酯之連接子組分進行結合以形成酯或醯胺鍵聯。或者，一級胺可藉由用連接子組分之羰基(典型地為-CH(=O)或-C(=O)Me)形成席夫鹼來進行結合。在Eg5抑制劑包含硫醇基團時，結合物可用包含順丁烯二醯亞胺或α-鹵基乙醯胺(-NH-C(=O)-CH2LG，其中LG為Br、Cl或I)之連接子組分形成，或其可藉由形成二硫鍵聯結合至含硫醇之連接子組分或抗原結合部分。
在本發明之一個態樣中，提供式(III)之Eg5抑制劑。式III化合物可用作小分子治療劑，或其可作為有效負載併入ADC中。
或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Z為N或CH；Ar1為視情況經多達3個選自鹵基、C1-3烷基及C1-3鹵烷基之基團取代的苯基；Ar2為苯基或吡啶基，視情況經多達兩個選自鹵基、CN、C1-3烷基、羥基、胺基及C1-3鹵烷基之基團取代；R1為-(CH2)0-2-C4-7雜環基，其中C4-7雜環基含有多達兩個選自N、O及S之雜原子作為環成員，且視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷氧基、羥基、胺基、側氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、甲基、三氟甲基或COO(C1-4烷基)之基團取代；視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、側氧基或-COO(C1-4烷基)之基團取代； R2為H或C1-4烷基；T為(CH2)1-3；Y係選自C1-2胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基，其中C1-2胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基各自視情況經多達兩個選自胺基、側氧基、鹵基、羥基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)及C1-3鹵烷基之基團取代；A為NH、N(C1-4烷基)或在式(III)中之羰基與Q之間的鍵；Q係選自C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6雜環基、-(CH2)0-2-C5-6雜芳基及-(CH2)0-2-苯基，且Q視情況經多達三個選自鹵基、羥基、胺基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR及-NR2之基團取代，其中各R為視情況經鹵基、-SH、-NH2、OMe或-OH取代之C1-6烷基。
額外實施例包括式(III)化合物，其中或R1為經-OH、-NH2、-COOH、-COO(C1-4烷基)、-CONMe2、CONHMe或-CONH2取代之C3-5烷基；且所有其他特徵均如上文關於式(III)所述。
在此等化合物中，Z可為CH或N；在多個實施例中，Z為CH。
在此等化合物中，Ar1可為如上文所述之經取代苯基，典型地為二取代之苯基，諸如二鹵基苯基。在較佳實施例中，Ar1為2,5-二鹵基苯基，諸如2,5-二氟苯基、2-氯-5-氟苯基或2-氟-5-氯苯基。
在此等化合物中，Ar2可為如上文所述之經取代苯基或吡啶，或視情況經取代之環醚。在多個實施例中，Ar2為未經取代或單取代之苯基或吡啶。用於經取代Ar2之合適取代基包括鹵基、羥基及胺基；該取代基可在任何位置處，例如其可在連接至式中之咪唑/三唑環的Ar2位置之間位。
在式(III)化合物之此等實施例中的任一者中，R2可為H或C1-4烷基，典型地其為H或Me，較佳為H。
在式(III)化合物之此等實施例中的任一者中，R1可為如上文所述 之經取代或未經取代雜環基團；在一些實施例中，R1為環醚，諸如四氫哌喃-4-基、四氫哌喃-3-基、四氫呋喃-3-基或氧雜環丁烷-3-基。四氫哌喃-4-基有時為較佳的：當併入至ADC中時，此部分減少當例如R1為第三丁基時可發生之結合物聚集，因此此部分對於ADC目的為尤其有利的。證實此益處之資料包括在本文中之表7中。
在式(III)化合物之此等實施例中的任一者中，T可為亞甲基、伸乙基或伸丙基。在較佳實施例中，當Y為所述之雜環基團或環烷基之一時，T為亞甲基，且當Y為式(III)範疇內之胺基烷基時，T為亞甲基或-CH2CH2-。
在式(III)化合物之此等實施例中的任一者中，A可為一鍵；在其他實施例中，A較佳為-NH-。
在式(III)化合物之此等實施例中的任一者中，Y可為如上文所述之胺基烷基或雜環基團。在一些實施例中，Y為胺基烷基，諸如1-氟-2-胺基-2-乙基或1-胺基-2-乙基或1-甲氧基-2-胺基-2-乙基。在一些實施例中，Y為吡咯啶環，例如吡咯啶-3-基，且可經F、CH2F、CF3、Me或OH取代。在較佳實施例中，Y為在位置4處經此等基團之一(F、CH2F、CF3、Me或OH)取代之3-吡咯啶基。
在式(III)化合物之此等實施例中的任一者中，R2可為H或C1-4烷基；在一些實施例中，R2為H或甲基，較佳為H。
用於本發明之免疫結合物的Eg5抑制劑之一些實例包括表1中之任何化合物，諸如：
類似地，以下Eg5抑制劑中之任一者均可用於本發明之免疫結合物中：
在式(II)或(III)化合物之某些實施例中，R1為雜環基團，諸如環醚，例如四氫哌喃基(例如4-四氫哌喃)：如與具有第三丁基作為R1之結合物相比，當用作ADC有效負載時，在式(II)化合物中之R1處的雜環基團減少聚集，因此此等化合物展現優於已知Eg5抑制劑之優勢。
鍵聯基團
式(I)中之鍵聯基團L可為直接連接有效負載化合物X至Ab之一鍵(亦即，L或各連接子組分可表示連接與其側接之基團在一起的一鍵)，或其可為包含一或多種連接子組分L1、L2、L3、L4、L5、L6等之鍵聯部分。一些較佳鍵聯基團描繪於本文中。用於ADC之鍵聯基團通常含有兩種或兩種以上連接子組分，其可經選擇以便於組裝結合物，或其可經選擇以影響結合物特性。連接子組分包括當連接Ab至X時容易形成之化學基團，諸如硫醇-順丁烯二醯亞胺基、硫醚、醯胺及酯；在靶向細胞中、靶向細胞上或靶向細胞周圍發現之條件下容易活體內裂解之基團，諸如二硫化物、腙、二肽(如Val-Cit)、經取代苯甲氧基羰基及其類似基團；使X在相對於Ab之合適位置中定向之間隔基，諸如苯基、雜芳基、環烷基或雜環基環及伸烷基鏈；及/或藥物 動力學特性增強基團，諸如經一或多個極性基團(羧基、磺酸酯基、羥基、胺、胺基酸、醣)取代之伸烷基，及含有一或多個-NH-或-O-來代替亞甲基之伸烷基鏈，諸如二醇醚(-CH2CH2O-)p，其中p為1-10，例如其可增強溶解性或減少分子間聚集。
鍵聯基團可為二價的，意謂其可僅鍵聯一個X基團至Ab，或其可為三價的(能夠鍵聯兩個X基團至Ab)，或其可為多價的。三價、四價及多價鍵聯基團可用於增加抗體上之藥物負載，從而增加藥物於抗體比率(DAR)，而不需要抗體上之額外位點來連接鍵聯基團。該等鍵聯基團為此項技術中已知的，參見例如Bioconjugate Chem.,1999年3月-4月；10(2)：279-88；US6638499；Clin Cancer Res 2004年10月15日10；7063；WO2012/113847A1。
用於式(I)之免疫結合物中的鍵聯基團可為可裂解的或不可裂解的。可裂解之鍵聯基團，諸如含有腙、二硫化物、二肽Val-Cit之鍵聯基團，及含有葡萄醣醛酸酶可裂解之對胺基苯甲氧基羰基部分之鍵聯基團，為此項技術中熟知的，且可加以使用。參見例如Ducry等人，Bioconjugate Chem.，第21卷，5-13(2010)。對於此等免疫結合物，鍵聯基團實質上在活體內穩定直至免疫結合物結合於或進入細胞，在該點處細胞內酶或細胞內化學條件(pH、還原能力)裂解鍵聯基團以釋放Eg5抑制劑。
或者，不可裂解之鍵聯基團可用於式(I)之免疫結合物中。不可裂解之連接子缺乏經設計以在細胞中降解之結構組分，且因此其結構可實質上改變。參見例如Ducry等人，Bioconjugate Chem.，第21卷，5-13(2010)。咸信此等免疫結合物進入靶向細胞且經歷抗體之蛋白水解降解而非鍵聯基團分解；因此，至少一部分之鍵聯基團及甚至一些抗體或抗體片段可保持連接於Eg5抑制劑。式(IIA)及(IIB)及(IIC)表示具有在特定位置連接之鍵聯基團的活化Eg5抑制劑，在該等位置中已顯 示鍵聯基團及/或抗體之殘餘部分不會妨礙對Eg5之抑制作用；因此當使用不可裂解之鍵聯基團時，在式(IIA)及(IIB)及(IIC)中由W表示之位置處連接鍵聯基團為較佳的。
尤其合適之鍵聯基團為減少聚集之鍵聯基團。本文中之化合物367及368中的鍵聯基團已顯示當與本文所述之Eg5抑制劑一起使用時具有減少聚集之效應。因此，本發明中亦包括式(V)之鍵聯基團：
其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22為選自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23及-SO2R23之極性基團，其中k為0至4且各R23獨立地為H或C1-4烷基；且j為選自1、2、3及4之整數；及免疫結合物Ab-L*-X，其包含鍵聯至抗體(Ab)之有效負載(X)，其中該鍵聯基團L*包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-之基團。較佳地，鍵聯基團具有式(V)。在式(V)中，[PL]指示有效負載之連接點，且[Ab]指示與抗體之連接點。抗體典型地經由半胱胺酸殘基之硫原子連接至L*，該半胱胺酸殘基可為來自原生抗體序列之半胱胺酸或藉由蛋白質工程改造引入之半胱胺酸。此等連接子之較佳極性基團包括羥基及羧基，j典型地為2、3或4，且R21通常為-(CH2)2-3-R23。
式(IIA)及(IIB)及(IIC)化合物
式(IIA)及(IIB)及(IIC)化合物包含連接至反應性基團之Eg5抑制劑及視情況選用之一或多種連接Eg5抑制劑至反應性基團之連接子組分。表2描繪此等化合物之實例，該等化合物包含Eg5抑制劑(諸如表1中所示之抑制劑)加上反應性官能基及視情況選用之一或多種連接子組分。
條目508及509作為比較性實例提供，具有此項技術中已知但不在式II範疇內之Eg5抑制劑。
抗原結合部分
式(I)或(IA)中之抗原結合部分可為選擇性結合於靶向細胞類型上發現之細胞表面標記的任何部分。在一些態樣中，Ab為特異性結合於主要或優先發現於癌細胞表面上之抗原(例如腫瘤相關抗原)之抗體或抗體片段(例如抗體之抗原結合片段)。在一些態樣中，Ab為特異性 結合於細胞表面受體蛋白或其他細胞表面分子、細胞存活調節因子、細胞增生調節因子、與組織發育或分化相關(例如已知或懷疑在功能上有助於組織發育或分化)之分子、淋巴因子、細胞激素、牽涉於細胞週期調節中之分子、牽涉於血管生成中之分子或與血管新生相關(例如已知或懷疑在功能上有助於血管新生)之分子的抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。腫瘤相關抗原可為簇分化因子(亦即CD蛋白)。在本發明之一些態樣中，本發明之抗原結合部分特異性結合於一種抗原。在本發明之一些態樣中，本發明之抗原結合部分特異性結合於本文所述之兩種或兩種以上抗原，例如本發明之抗原結合部分為雙特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段。
例示性抗體或抗原結合片段包括(但不限於)抗雌激素受體抗體、抗孕酮受體抗體、抗p53抗體、抗HER-2抗體、抗cKit抗體、抗EGFR抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗c-erbB-2抗體、抗P-醣蛋白抗體、抗CEA抗體、抗視網膜母細胞瘤蛋白抗體、抗ras腫瘤蛋白抗體、抗Lewis X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD1-抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD23抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD39抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD71抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD100抗體、抗S-100抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑色素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體及抗Tn-抗原抗體。
在一個實施例中，式(I)或(IA)之抗體-藥物結合物(ADC)的抗原結合部分特異性結合於由ErbB基因編碼之受體。抗原結合部分可特異性結合於選自EGFR、HER2、HER3及HER4之ErbB受體。抗原結合部分可為將特異性結合於HER2受體之細胞外域(ECD)且抑制過度表現HER2受體之腫瘤細胞生長的抗體。該抗體可為單株抗體，例如鼠類單株抗體、嵌合抗體或人類化抗體。人類化抗體可為huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7或huMAb4D5-8(曲妥珠單抗)。抗體可為抗體片段，例如Fab片段。
用於本文實例中之抗體具有表3中所列之重鏈及輕鏈序列。該等序列與曲妥珠單抗之序列相同，且該抗體在本文中稱為「曲妥珠單抗」或「TBS」。曲妥珠單抗因此為用於式(I)或(IA)之免疫結合物中的一種合適抗體。
式I或IA中之抗原結合部分包括(但不限於)針對細胞表面受體及腫瘤相關抗原之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。該等腫瘤相關抗原為此項技術中已知的，且可經製備用於使用此項技術中熟知之方法及資訊產生抗體。在嘗試發現針對癌症診斷及療法之有效細胞標靶時，研究人員已設法鑑別如與在一或多種正常非癌性細胞上相比在一 或多種特定類型之癌細胞的表面上特異性表現之跨膜或在其他方面腫瘤相關之多肽。通常，如與在非癌性細胞之表面上相比，該等腫瘤相關多肽較大量地表現於癌細胞之表面上。鑑別該等腫瘤相關之細胞表面抗原多肽可獲得特異性靶向癌細胞以經由基於抗體之療法進行破壞的能力。
適用於本發明之免疫結合物的抗體及抗體片段(例如抗原結合片段)包括經修飾或經工程改造之抗體，諸如經修飾以引入半胱胺酸殘基或離胺酸殘基來代替原生序列的至少一種胺基酸之抗體，由此提供在抗體或片段上之反應性位點以結合於Eg5抑制劑。類似地，抗體或抗體片段可經修飾以併入Pcl或吡咯離胺酸(Noren等人，(1989)Science 14；244(4901)：182-188；Mendel等人，(1995)Annu Rev Biophys Biomol Struct.24：435-462)作為用於結合於Eg5抑制劑之位點。用於使該等抗體與有效負載或連接子-有效負載組合結合之方法為此項技術中已知的。
適用於本發明之抗原結合部分(例如抗體及抗原結合片段)亦可具有其他修飾或結合於其他部分，諸如(但不限於)聚乙二醇標籤、白蛋白及其他融合多肽。
產生抗體
本發明之抗體及抗體片段(例如抗原結合片段)可藉由此項技術中已知之任何方式製造，包括(但不限於)重組表現、化學合成及酶促消化抗體四聚體，而全長單株抗體可藉由例如雜交瘤或重組產生來獲得。重組表現可來自此項技術中已知之任何適當宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本發明進一步提供編碼本文所述之抗體的聚核苷酸，例如編碼包含如本文所述之互補決定區的重鏈或輕鏈可變區或區段之聚核苷酸。
聚核苷酸序列可藉由重新(de novo)固相DNA合成或藉由編碼抗體或其結合片段之現存序列(例如如以下實例中所述之序列)之PCR突變誘發產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法來實現，諸如Narang等人，Meth.Enzymol.68：90,1979之磷酸三酯方法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之胺基磷酸二乙酯方法；及美國專利第4,458,066號之固體支撐方法。藉由PCR向聚核苷酸序列引入突變可如以下所述來進行：例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,Innis等人(編)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明中亦提供用於產生上述抗體或抗體片段之表現載體及宿主細胞。可採用各種表現載體來表現編碼本發明之抗體鏈或結合片段的聚核苷酸。基於病毒之表現載體與非病毒表現載體均可用於哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、典型地具有用於表現蛋白質或RNA之表現卡匣的游離載體及人類人造染色體(參見例如Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，適用於表現哺乳動物(例如人類)細胞中之聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、pThioHis B及pThioHis C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、pEBVHis B及pEBVHis C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及此項技術中已知之用於表現其他蛋白質的許多其他載體。適用之病毒載體包括基於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP EB病毒之載體；牛痘病毒載體及勝利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)。參見Smith,Annu.Rev. Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇視欲表現載體之宿主細胞而定。典型地，表現載體含有啟動子及其他調節序列(例如增強子)，可操作地連接於編碼本發明抗體鏈或片段的聚核苷酸。在一些實施例中，採用誘導性啟動子以防止所插入序列在誘導條件以外表現。誘導性啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子或熱休克啟動子。轉型之生物體培養物可在不偏向編碼序列群的非誘導條件下擴增，宿主細胞更耐受該等編碼序列之表現產物。除啟動子以外，其他調節元件亦可為本發明抗體鏈或片段的有效表現所需或需要。此等元件典型地包括ATG起始密碼子及鄰近核糖體結合位點或其他序列。此外，表現效率可藉由包括適於使用之細胞系統的增強子來增強(參見例如Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，SV40增強子或CMV增強子可用於增加哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與由所插入之抗體序列編碼的多肽形成融合蛋白。更通常，所插入之抗體序列在包括於載體中之前鍵聯至信號序列。欲用於接收編碼抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體使可變區表現為具有恆定區之融合蛋白，藉此導致產生完整抗體或其片段。典型地，該等恆定區為人類的。
用於泊入及表現本發明之抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核的。大腸桿菌為適用於選殖及表現本發明之聚核苷酸之一種原核宿主。其他適合使用之微生物宿主包括桿菌，諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)；及其他腸內菌科，諸如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)；及各種假單胞菌種。在此等原核宿主中，吾人亦可製造表現載體，其典型地含有可與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製 起點)。此外，可存在許多各種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或噬菌體λ之啟動子系統。該等啟動子典型地視情況與操縱序列(operator sequence)一起控制表現，且具有用於起始及完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。其他微生物，諸如酵母，亦可用於表現本發明之抗體或抗體片段。亦可使用與桿狀病毒載體組合之昆蟲細胞。
在一個態樣中，使用哺乳動物宿主細胞來表現及產生本發明之抗體及抗體片段。舉例而言，其可為表現內源性免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株(例如，如實例中所述之骨髓瘤融合瘤純系)或泊入外源性表現載體之哺乳動物細胞株。此等細胞包括任何正常致死或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已開發出多種能夠分泌完整免疫球蛋白之合適宿主細胞株，包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、海拉(HeLa)細胞、骨髓瘤細胞株、經轉型之B細胞及融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽通常論述於例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用於哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及增強子(參見例如Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)，及必要加工資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止序列。此等表現載體通常含有源自哺乳動物基因或哺乳動物病毒之啟動子。合適啟動子可為組成性、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調節或可調控的。適用之啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素誘導性CMV啟動子(諸如人類即刻早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-增強子組合。
用於引入含有所關注之聚核苷酸序列之表現載體的方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主(一般參見Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉型、注射及顯微注射、衝擊方法、病毒顆粒、免疫脂質體、多價陽離子：核酸結合物、裸DNA、人造病毒粒子、融合疱疹病毒結構蛋白VP22(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、藥劑增強之DNA吸收及離體轉導。對於長期高產率生產重組蛋白而言，通常將需要穩定表現。舉例而言，穩定表現抗體鏈或結合片段之細胞株可使用本發明之表現載體來製備，該等表現載體含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選擇標記基因。在引入載體之後，可使細胞於增濃培養基中生長1-2天，隨後將其轉入選擇性培養基中。可選擇標記之用途為對選擇賦予抵抗性，且其存在使得在選擇性培養基中成功表現經引入之序列的細胞生長。抵抗性、經穩定轉染之細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增生。
免疫結合物
本發明提供包含鍵聯於抗原結合部分(諸如抗體或抗體片段)之Eg5抑制劑的免疫結合物。本發明之較佳免疫結合物為如本文所述之式(I)或(IA)之免疫結合物。用於製備該等免疫結合物之方法為此項技術中熟知的。較佳免疫結合物包括表5及6中所揭示之免疫結合物，及具有另一抗原結合部分替代曲妥珠單抗之其變體，尤其其中曲妥珠單抗由選自下列清單之抗體置換的該等結合物：例示性抗體或抗原結合片段包括(但不限於)抗雌激素受體抗體、抗孕酮受體抗體、抗p53抗體、抗HER-2抗體、抗cKit抗體、抗EGFR抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗c-erbB-2抗體、抗P-醣蛋白抗體、抗CEA抗 體、抗視網膜母細胞瘤蛋白抗體、抗ras腫瘤蛋白抗體、抗Lewis X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD1-抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD23抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD39抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD71抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD100抗體、抗S-100抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑色素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體及抗Tn-抗原抗體。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含具有抗原結合活性之抗體或抗體片段Ab，其中鍵聯基團L在Ab之半胱胺酸硫原子處連接於Ab：
其中L及X如關於式(I)所定義，且R'及R"為鄰近於Ab中之半胱胺酸的胺基酸側鏈。在此等實施例中，-S-L-通常包含硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵聯，且L視情況包含額外連接子組分。在其他實施例中，結合物經由包含-S-CH2-C(=O)-NH-L2-L3-L4-L5-L6-之鍵聯基團鍵聯於X， 其中連接子組分L2、L3、L4、L5及L6如關於式(IA)所定義。此項技術中熟知藉由使具有α-鹵基乙醯胺或順丁烯二醯亞胺之化合物與抗原結合部分(抗體)中的半胱胺酸殘基之硫原子反應來形成此等結合物的方法。
較佳免疫結合物包括包含下表(表5及6)中與抗體(AntiB)結合之任何有效負載化合物的免疫結合物，其中該結合物具有表中所示之結構，其中AntiB-S-表示經由抗體之半胱胺酸殘基的硫原子(結構中之S)鍵結至順丁烯二醯亞胺環之抗體。在較佳實施例中，抗體(AntiB)為識別癌細胞上表現之抗原的抗體。本文中揭示合適之抗原，包括抗雌激素受體抗體、抗孕酮受體抗體、抗p53抗體、抗HER-2抗體、抗cKit抗體、抗EGFR抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗c-erbB-2抗體、抗P-醣蛋白抗體、抗CEA抗體、抗視網膜母細胞瘤蛋白抗體、抗ras腫瘤蛋白抗體、抗Lewis X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD1-抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD23抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD39抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD71抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD100抗體、抗S-100抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑色素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體及抗Tn-抗原抗體。
連接抗體與順丁烯二醯亞胺化合物之半胱胺酸殘基可天然地存在於原生抗體中，或其可已藉由此項技術中已知的蛋白質工程改造方 法引入抗體中。經工程改造以含有藉由蛋白質工程改造引入之半胱胺酸殘基的抗體有時為較佳的。詳言之，經工程改造以引入半胱胺酸來代替以下位點中的至少一者之抗體尤其適合用於本發明之免疫結合物中：重鏈位點K360、E152及S375；及輕鏈殘基K107。詳言之，組合HC-K360C與LC-K107C及HC-E152C與HC-S375C為充分適合的。(EU編號)
應瞭解，抗體可含有超過一種有效負載：在典型實施例中，結合物含有2-6種、較佳3-5種有效負載化合物(Eg5抑制劑)在由兩條重鏈及兩條輕鏈之肽組成之抗體上。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。該醫藥組合物可經調配用於特定投與途徑，諸如經口投與、非經腸投與及直腸投與及其類似途徑。另外，本發明之醫藥組合物可以固體形式(包括(不限於)膠囊、錠劑、丸劑、顆粒、散劑或栓劑)或以液體形式(包括(不限於)溶液、懸浮液或乳液)構成。該等醫藥組合物可經習知醫藥操 作(諸如滅菌)及/或可含有習知惰性稀釋劑、潤滑劑或緩衝劑以及佐劑(諸如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑及緩衝劑等)。
本發明之免疫結合物典型地在水性緩衝液及/或等張水溶液中經調配為溶液或懸浮液。其典型地在接近中性之pH下經調配及投與以保護蛋白質組分之穩定性，例如在6與8之間之pH下，且可包括醫藥學上可接受之鹽。及/或緩衝液。因為蛋白質組分典型地由細胞產生，所以其可含有細胞中發現之相對離子，例如磷酸根、乙酸根、鈉、鉀及其類似物，且該等相對離子若存在，則典型地未經特定鑑別或表徵。此外，其典型地在緩衝溶液(諸如磷酸鹽緩衝之生理食鹽水)中經分離及處置，且不預期任何存在之相對離子影響活性。該等免疫結合物典型地藉由注射或藉由輸注非經腸投與。其調配及投與方法類似於其他生物基藥物(諸如抗體治療劑)之調配及投與方法，且為熟習此項技術者已知。
用作小分子藥物之式(III)化合物可經調配用於習知途徑且藉由習知途徑投與，諸如經口、經表面、非經腸、經頰、藉由吸入或作為栓劑。
用於經口投與之合適組合物包括有效量之呈以下形式的本發明化合物：錠劑、口含錠、水性或油性懸浮液、可分散粉劑或顆粒、乳液、硬或軟膠囊或糖漿或酏劑。根據製造醫藥組合物之技術中已知之任何方法來製備意欲經口使用之組合物，且該等組合物可含有一或多種選自由以下組成之群之試劑：甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑，以提供醫藥學上精緻且可口之製劑。錠劑可含有活性成分與適於製造錠劑之醫藥學上可接受之無毒賦形劑的混合物。此等賦形劑為例如惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化及崩解劑，例如玉米澱粉或褐藻酸；黏合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑為未包覆包衣的 或藉由已知技術包覆包衣以延遲在胃腸道中之崩解及吸收，且藉此提供較長時期內之持續作用。舉例而言，可採用時間延遲物質，諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用於經口使用之調配物可以其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合之硬明膠膠囊形式或以其中活性成分與水或油介質(例如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合之軟明膠膠囊形式呈遞。
某些可注射組合物為等張水溶液或懸浮液，且栓劑宜自脂肪乳液或懸浮液製備。該等組合物可經滅菌及/或含有佐劑，諸如防腐劑、穩定劑、濕潤劑或乳化劑、溶解促進劑、用於調節滲透壓之鹽及/或緩衝液。另外，其亦可含有其它治療上有價值之物質。該等組合物係分別根據習知混合、粒化或包覆方法製備，且含有約0.1-75%或含有約1-50%活性成分。
用於經皮施用之合適組合物包括有效量之本發明化合物及合適載劑。適於經皮遞送之載劑包括可吸收之藥理學上可接受之溶劑以幫助傳遞通過宿主皮膚。舉例而言，經皮器件係呈繃帶形式，其包含稱底部件、含有化合物及視情況具有之載劑之貯器、視情況在延長時期內以受控及預定速率向宿主皮膚遞送化合物之速率控制障壁、及使該器件固定於皮膚之構件。
用於表面施用(例如至皮膚及眼睛)之合適組合物包括水溶液、懸浮液、軟膏、乳膏、凝膠或例如藉由氣溶膠或其類似物遞送之可噴射調配物。該等表面遞送系統將尤其適於真皮施用，例如用於治療皮膚癌，例如以日霜、洗劑、噴霧劑及其類似形式用於預防性用途。因此，其尤其適合用於此項技術中熟知之表面(包括化妝)調配物。該等物質可含有增溶劑、穩定劑、張力增強劑、緩衝劑及防腐劑。
如本文所用，局部施用亦可關於吸入或鼻內施用。其可以乾粉形式(單獨，以混合物形式(例如與乳糖之無水摻合物)或混合組分顆粒 (例如與磷脂))自乾粉吸入器或以氣溶膠噴霧形式在使用或不使用合適推進劑之情況下自加壓容器、泵、噴霧器、霧化器或氣霧器便利地遞送。
本發明進一步提供包含本發明化合物作為活性成分之無水醫藥組合物及劑型，因為水可能促進某些化合物之降解。
本發明之無水醫藥組合物及劑型可使用無水或含低水分之成分且在低水分或低濕氣條件下製備。無水醫藥組合物可經製備及儲存以使得維持其無水性質。因此，無水組合物使用已知防止暴露於水之材料經封裝，使得其可包括在合適配方之套組中。合適封裝之實例包括(但不限於)密封之箔、塑膠、單位劑量容器(例如小瓶)、泡殼包裝及條狀包裝。
本發明進一步提供醫藥組合物及劑型，其包含一或多種降低作為活性成分之本發明化合物將分解之速率的試劑。本文中稱為「穩定劑」之該等試劑包括(但不限於)諸如抗壞血酸之抗氧化劑、pH緩衝劑或鹽緩衝劑等。
呈游離形式或呈鹽形式之式I化合物展現有價值之藥理學活性：如本文中之資料證實，式(II)及(III)化合物抑制腫瘤細胞生長，且因此適用於治療癌症。如資料進一步證實，此等化合物可有利地以ADC之有效負載形式遞送。如本文中所證實之該等結合物展現活體外對靶向細胞及活體內對腫瘤之實質活性，如表示不同人類癌症之異種移植物腫瘤的有效生長抑制所證實。因此，包含鍵聯於抗原結合部分(諸如抗體)之式(II)或(III)有效負載之本發明免疫結合物亦適用於治療癌症，諸如神經膠質瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、白血病(例如慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T譜系急性淋巴母細胞白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其非霍奇金氏)、膀胱、腎、胃(例如胃腸基質腫瘤 (GIST))、肝臟及胰臟癌及肉瘤。
本發明之化合物及免疫結合物尤其適用於治療此項技術中已知藉由對Eg5具活性的化合物抑制之癌症，及本文中證實易受本發明化合物及結合物抑制之彼等腫瘤類型。針對治療之合適適應症包括(但不限於)胃、骨髓、結腸、鼻咽、食道及前列腺腫瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、白血病(例如慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T譜系急性淋巴母細胞白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其非霍奇金氏)、膀胱、腎、胃(例如胃腸基質腫瘤(GIST))、肝臟及胰臟癌及肉瘤。
因此，作為另一實施例，本發明提供式(I)或(III)化合物或在如本文所述之式(I)及(III)範疇內之任何實施例用於療法之用途。在另一實施例中，療法係針對可藉由抑制Eg5來治療之疾病。在另一實施例中，本發明化合物適用於治療癌症，包括(但不限於)乳癌、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、白血病、骨髓性白血病、淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、毛細胞白血病及多發性骨髓瘤。
該等方法典型地包含向需要該治療之個體投與有效量的如本文所述之化合物或包含該化合物之醫藥組合物。該化合物可藉由任何合適方法，諸如本文所述之方法來投與，且投與可以由治療醫師選擇之時間間隔重複。
因此，作為另一實施例，本發明提供式(I)或(III)化合物或本文所述之該等化合物之任何實施例用於製造藥劑之用途。在另一實施例中，該藥劑係用於治療可藉由抑制Eg5來治療之疾病。在另一實施例中，該疾病係選自胃、骨髓、結腸、鼻咽、食道及前列腺腫瘤、神經 膠質瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、白血病(例如慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T譜系急性淋巴母細胞白血病或T-ALL)、淋巴瘤(尤其非霍奇金氏)、膀胱、腎、胃(例如胃腸基質腫瘤(GIST))、肝臟及胰臟癌及肉瘤。
對於約50-70kg之個體，本發明醫藥組合物或組合可呈約1-1000mg活性成分、或約1-500mg或約1-250mg或約1-150mg或約0.5-100mg、或約1-50mg活性成分的單位劑量。化合物、醫藥組合物或其組合之治療有效劑量取決於個體之物種、體重、年齡及個體狀況、經治療之病症或疾病或其嚴重性。一般熟練之醫師、臨床醫師或獸醫可容易地確定預防、治療或抑制病症或疾病進展所必需之各活性成分的有效量。
醫藥組合係指呈一種劑量單位形式之固定組合，或其中本發明化合物及組合搭配物(例如，如下文所解釋之另一藥物，亦稱為「治療劑」或「輔劑」)可在相同時間獨立地或在時間間隔內分別地投與，尤其其中此等時間間隔允許組合搭配物展示合作、例如協同效應之組合投與。單一組分可在套組中或分別地封裝。該等組分(例如散劑或液體)之一或兩者可在投與之前復原或稀釋至所需劑量。如本文所用之術語「共投與」或「組合投與」或其類似術語意欲涵蓋向有需要之單一個體(例如患者)投與所選之組合搭配物，且意欲包括其中試劑不必要藉由相同投與途徑或在相同時間投與之治療方案。如本文所用之術語「醫藥組合」意謂藉由混合或組合一種以上活性成分所產生之產物且包括活性成分之固定或非固定組合。術語「固定組合」意謂活性成分，例如本發明化合物及組合搭配物，以單一實體或劑量之形式同時投與患者。術語「非固定組合」意謂活性成分，例如本發明化合物及組合搭配物，以各別實體形式同時、並行或依序投與至患者， 而無特定時間限制，其中該投與提供兩種化合物在患者體內之治療有效含量。後者亦應用於雞尾酒療法，例如投與三種或三種以上之活性成分。
可有利地使用哺乳動物(例如小鼠、大鼠、狗、猴)或經分離器官、組織及其製劑在活體外及活體內測試中證明上述劑量特性。本發明化合物可以溶液(例如水溶液)形式活體外應用，及例如以懸浮液形式或於水溶液中經腸、非經腸、有利地經靜脈內活體內應用。活體外劑量可介於約10-3莫耳濃度與10-9莫耳濃度之間。視投藥途徑而定，活體內治療有效量可介於約0.1-500mg/kg之間，或較佳約1-100mg/kg之間之範圍內。
本發明化合物可與一或多種治療輔劑同時或在其之前或之後投與。本發明化合物可分別地藉由相同或不同投與途徑，或與輔劑在同一醫藥組合物中一起投與。
在一個實施例中，本發明提供包含式(I)化合物及至少一種其他治療輔劑之產品作為在療法中同時、分別或依序使用之組合製劑。在一個實施例中，該療法係治療藉由Eg5介導之疾病或病狀，諸如癌症。作為組合製劑提供之產品包括包含式(I)或(III)化合物及其他治療輔劑一起在同一醫藥組合物中，或式(I)或(III)化合物及其他治療輔劑呈各別形式，例如呈套組形式之組合物。
在一個實施例中，本發明提供包含式(I)或(III)化合物及另外的治療輔劑之醫藥組合物。視情況，醫藥組合物可包含如上文所述之醫藥學上可接受之載劑。
與本發明化合物及結合物一起使用之合適輔劑包括抗癌劑、抗過敏劑、抗噁心劑(或鎮吐藥)、疼痛緩解劑、消炎劑、細胞保護劑及其組合。
考慮與本文揭示之化合物及結合物組合使用之特定輔劑包括阿 那曲唑(Arimidex®)、比卡魯胺(Casodex®)、硫酸博萊黴素(Blenoxane®)、硫酸布他卡因(Myleran®)、硫酸布他卡因注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡鉑(Paraplatin®)、卡莫司汀(BiCNU®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、順鉑(Platinol®)、克拉屈濱(Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(DTIC-Dome®)、更生黴素(放線菌素D，Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多烯紫杉醇(Taxotere®)、鹽酸小紅莓(Adriamycin®，Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉賓(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®，Efudex®)、氟他胺(Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(二氟去氧胞嘧啶核苷)、羥基脲(Hydrea®)、艾達黴素(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲醯四氫葉酸鈣、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺喋呤(Folex®)、米托蒽醌(Novantrone®)、麥羅塔(mylotarg)、太平洋紫杉醇(Taxol®)、菲妮克絲(phoenix)(釔90/MX-DTPA)、戊糖苷、具有卡莫司汀植入物之聚苯丙生20(Gliadel®)、檸檬酸他莫西芬(Nolvadex®)、替尼泊甙(Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、噻替派、替紮拉明(tirapazamine)(Tirazone®)、用於注射之鹽酸拓朴替康(Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞濱(Navelbine®)。
一些患者可在投與期間或之後經歷對本發明化合物及/或其他抗癌劑之過敏反應；因此，通常投與抗過敏劑以使過敏反應之風險降至最低。合適之抗過敏劑包括皮質類固醇，諸如地塞米松(例如Decadron®)、倍氯米松(例如Beclovent®)、氫皮質酮(亦稱為皮質酮、 氫皮質酮丁二酸鈉、氫皮質酮磷酸鈉，且以商標名Ala-Cort®、磷酸氫皮質酮、Solu-Cortef®、Hydrocort Acetate®及Lanacort®出售)、潑尼龍(以商標名Delta-Cortel®、Orapred®、Pediapred®及Prelone®出售)、潑尼松(以商標名Deltasone®、Liquid Red®、Meticorten®及Orasone®出售)、甲潑尼龍(亦稱為6-甲基潑尼龍、乙酸甲潑尼龍、甲潑尼龍丁二酸鈉，以商標名Duralone®、Medralone®、Medrol®、M-Prednisol®及Solu-Medrol®出售)；抗組織胺，諸如苯海拉明(例如Benadryl®)、羥嗪及賽庚啶(cyproheptadine)；及支氣管擴張劑，諸如β-腎上腺素激導性受體促效劑、舒喘寧(albuterol)(例如Proventil®)及特布他林(terbutaline)(Brethine®)。
一些患者可在投與本發明化合物及/或抗癌劑期間及之後經歷噁心；因此，使用鎮吐藥來預防噁心(上胃)及嘔吐。合適之鎮吐藥包括阿瑞吡坦(aprepitant)(Emend®)、昂丹司瓊(ondansetron)(Zofran®)、格拉司瓊HCl(Kytril®)、勞拉西泮(lorazepam)(Ativan®、地塞米松(Decadron®)、普魯氯嗪(Compazine®)、卡索匹坦(casopitant)(Rezonic®及Zunrisa®)及其組合。
通常開具用以緩解在治療時期期間經歷之疼痛的藥物處理以使患者更舒適。通常使用常見非處方止痛劑，諸如Tylenol®。然而，類鴉片止痛藥，諸如氫可酮/撲熱息痛或氫可酮/乙醯胺苯酚(例如Vicodin®)、嗎啡(例如Astramorph®或Avinza®)、氧可酮(例如OxyContin®或Percocet®)、鹽酸氧嗎啡酮(Opana®)及芬太尼(例如Duragesic®)亦適用於中等或重度疼痛。
在致力於保護正常細胞免受治療毒性及限制器官毒性的過程中，細胞保護劑(諸如神經保護劑、自由基清除劑、心臟保護劑、蒽環黴素噴溢中和劑、營養素及其類似物)可用作輔助療法。合適之細胞保護劑包括阿米福汀(Amifostine)(Ethyol®)、麩醯胺酸、地美司鈉 (Tavocept®)、美司鈉(Mesnex®)、右雷佐生(dexrazoxane)(Zinecard®或Totect®)、紮利羅登(xaliproden)(Xaprila®)及甲醯四氫葉酸(亦稱為甲醯四氫葉酸鈣、嗜橙菌因子及醛葉酸)。
在一個實施例中，本發明提供包含兩種或兩種以上各別醫藥組合物之套組，該等醫藥組合物中之至少一者含有式(I)或(III)化合物。在一個實施例中，套組包含用於分別保留該等組合物之構件，諸如容器、分隔之小瓶或分隔之鋁箔封包。該套組之實例為如典型地用於封裝錠劑、膠囊及其類似物之泡殼包裝。
本發明之套組可用於例如經口及非經腸投與不同劑型，以不同劑量間隔投與各別組合物，或相對於彼此滴定各別組合物。為了幫助順應性，本發明套組典型地包含投藥指導。
在本發明之組合療法中，本發明化合物及其他治療輔劑可由相同或不同製造商製造及/或調配。此外，本發明化合物及其他治療劑可共同用於組合療法：(i)在對醫師發行組合產品之前(例如，在套組包含本發明化合物及其他治療劑的情況下)；(ii)在投藥之前不久由醫師親自進行(或在醫師指導下進行)；(iii)由患者本人進行，例如，在本發明化合物及其他治療劑之依序投藥期間。
因此，本發明提供式(I)或(III)化合物用於治療由Eg5介導之疾病或病狀的用途，其中該藥劑經製備用於與另一治療劑一起投與。本發明亦提供另一治療輔劑用於治療疾病或病狀之用途，其中該藥劑與式(I)或(III)化合物一起投與。
本發明亦提供用於治療由Eg5介導之疾病或病狀之方法中的式(I)或(III)化合物，其中該式(I)或(III)化合物經製備用於與另一治療劑一起投與。本發明亦提供用於治療由Eg5介導之疾病或病狀之方法中的另一治療輔劑，其中該另一治療輔劑經製備用於與式(I)或(III)化合物一起投與。本發明亦提供用於治療由Eg5介導之疾病或病狀之方法中 的式(I)或(III)化合物，其中該式(I)或(III)化合物與另一治療輔劑一起投與。本發明亦提供用於治療由Eg5介導之疾病或病狀之方法中的另一治療輔劑，其中該另一治療輔劑與式(I)或(III)化合物一起投與。
本發明亦提供式(I)或(III)化合物用於治療由Eg5介導之疾病或病狀的用途，其中患者先前(例如在24小時內)已用另一治療劑治療。本發明亦提供另一治療劑用於治療由Eg5介導之疾病或病狀的用途，其中患者先前(例如在24小時內)已用式(I)或(III)化合物治療。
合成方法
所有用以合成本發明化合物之起始物質、架構基塊、試劑、酸、鹼、脫水劑、溶劑及催化劑均為市售的或可藉由一般技術者已知之有機合成方法(參見例如Houben-Weyl第4版1952,Methods of Organic Synthesis,Thieme，第21卷)製得。此外，本發明化合物可藉由一般技術者已知之有機合成方法鑒於以下實例來製造。
多種Eg5抑制劑式(II)化合物可根據此項技術中已知之方法，包括WO2007/021794、WO2006/002236、WO2008/063912、WO2009/077448、WO2011/128381及WO2011/128388中揭示之方法來製備。
式(III)化合物可類似地使用已知方法與本文所述之方法組合來製備。此等化合物之合成之說明性實例提供於以下一般流程中。
此過程以在α-碳處具有THP基團之已知受保護對掌性胺基酸為起始物，且用適當α-鹵基苯乙酮形成酯以提供所需Ar1基團。用乙酸銨處理可提供經取代之咪唑，其中在咪唑環之C-2上的基團處保留對掌性。咪唑氮可用弱鹼烷基化以引入Ar2CH2-。使胺基甲酸酯脫除保護基可提供游離胺，該游離胺可藉由用戴斯-馬丁高碘烷(DMP)氧化或類似氧化及席夫鹼形成，繼而使用氰基硼氫化物或類似還原劑還原亞胺而由合適一級醇烷基化。在該流程中，此步驟引入吡咯啶環，但可類似地引入在式(II)或(III)範疇內之其他基團以針對式(II)或(III)化合物提供具有不同-T-Y基團之其他化合物。保護基可在需要時使用以例如允許各種R10基團存在於吡咯啶環上，或以在需要時在Ar1或Ar2上提供取代。
該游離胺可接著用任何合適醯化劑醯化以使用此項技術中已知之習知方法引入適當-A-Q部分。在該流程中之說明性實例中，使用對掌性乳酸鹽衍生物來引入呈受保護形式之醯基，該醯基具有用於式(II)及(III)中之基團A的一鍵，及用於基團Q之受保護羥基烷基。使吡咯啶環氮及在Q上之羥基脫除保護基可提供式(III)化合物。
用於製備本發明化合物之多種合適吡咯啶環為此項技術中已知的，且流程2描繪其中某些之合成。已知之3-吡咯啉環由苯甲氧羰基(CBZ)或其他合適保護基保護，且由間氯過氧苯甲酸氧化。環氧化物接著在溴化銅(I)存在下用格林納試劑，諸如乙烯基格林納打開以提供反式二取代之吡咯啶。其可用於製備各種吡咯啶中間物，且其對映異構體可容易地分離。其可如流程2中所描述例如用於製備氟化吡咯啶環。羥基可使用諸如全氟-1-丁烷磺醯氟(PBSF)或DAST之氟化試劑在立體化學反轉下經F置換。乙烯基可接著用四氧化鋨氧化，且所得醛可藉由諸如硼氫化鈉之習知方法還原以提供流程1中所用之對掌性吡咯啶。
流程3說明其中A為-NH-之化合物的合成，以來自流程1之中間物為起始物。二氯甲烷中之光氣，繼而引入合適胺，可提供受保護之中間物，且脫除保護基可在習知條件，例如在甲醇中之鈀/碳下，使用甲酸銨或氫氣來實現。
流程3A說明一種合成式(IIA)化合物之方法，該等化合物具有經由式(II)化合物之醯基連接之反應性官能基(在此情況下，順丁烯二醯亞胺)，亦即L連接至Q。來自流程2之所示中間物使用雙(對硝基苯酚)碳酸酯轉化為活化醯化劑，從而形成具有對硝基苯氧基脫離基之混合碳酸酯。接著使混合碳酸酯與合適胺反應，繼而脫除吡咯啶環氮之保護基以提供式(IIA)化合物，其中W為順丁烯二醯亞胺，該化合物適合與Ab上或連接至Ab之連接子組分上之硫醇反應。此實例中之產物將被視為不可裂解之連接子，因為存在之連接子組分均未經設計用於以比該部分將在式(I)之ADC中連接的抗體之降解速率快之速率活體內裂解。
流程3B說明使用流程1之產物來製備式(IIB)化合物之方法。在此方法中，使用雙(對硝基苯酚)碳酸酯形成含順丁烯二醯亞胺之鍵聯基團的混合碳酸酯。該混合碳酸酯接著用於醯化Eg5抑制劑之吡咯啶氮，從而提供上文所示之式(IIB)化合物。在此實例中，式(IIB)中之W的反應性官能基為順丁烯二醯亞胺，且基團W中之連接子組分包括可裂解連接子(val-cit)，因此此化合物例示具有可裂解鍵聯基團之結合物，該鍵聯基團經受由組織蛋白酶B進行之裂解。對胺基苯甲氧基胺基甲酸酯連接子組分充當自分解連接子：一旦組織蛋白酶B自對胺基裂解val-cit二肽，則胺基甲酸苯甲酯自發分解以釋放Eg5化合物。
本發明另外包括本發明方法之任何變體，其中將可於其任何階段獲得之中間產物用作起始物質且進行其餘步驟，或其中該等起始物質係在反應條件下當場形成，或其中該等反應組分係以其鹽或光學純物質形式使用。
下列實例意欲說明本發明且不應解釋為對其進行限制。溫度以攝氏度給出。若未另外提及，則所有蒸發均在減壓下進行，典型地在約15mm Hg與100mm Hg(=20-133毫巴)之間。最終產物、中間物及起始物質之結構係藉由標準分析方法證實，例如微量分析及光譜特徵(例如MS、IR、NMR)。所用之縮寫為此項技術中習知之縮寫。
DCM：二氯甲烷
DIAD：偶氮二甲酸二異丙酯
DIPEA：二異丙基乙胺
DMF：N,N-二甲基甲醯胺
ETOAC：乙酸乙酯
TBSCl：第三丁基二甲基矽烷基氯
TFA：三氟乙酸
THF：四氫呋喃
所有反應均在Ar下使用商品級溶劑進行，無需任何進一步蒸餾。試劑無需進一步純化即用作商品級。使用具有0.2mm矽膠(Merck F254)之TLC鋁板進行薄層層析法。使用ISCO Combiflash Companion系統，使用急驟級預填充Redisep®管柱進行管柱層析法。
使用以下光譜儀在23℃或29℃下記錄NMR光譜：Bruker 400MHz及Bruker AVANCE 600MHz質子頻率，配備有1.7mm 1H{13C,15N}CryoProbeTM。在Waters Autopurification系統上在以下條件下進行製備型HPLC：Column Sunfire C18 30 x 100mm，5μ，在30ml/min下以水+0.1% TFA中之CH3CN-CH3CN梯度溶離。
用Waters Acquity UPLC/SQD系統，使用光電二極體陣列偵測器及單一四偶極質量偵測器產生LC/MS資料。利用以下條件：管柱：Waters Acquity HSS T3 1.8μm 2.1 x 50mm
溶離劑A：水+0.05%甲酸+3.75mM乙酸銨
溶離劑B：乙腈+0.04%甲酸
管柱溫度：60℃
注射體積1μl，部分迴路
PDA全掃描210-450nm及一種使用者可選擇之波長
方法A：LCMS_2_分鐘
流動1.0ml/min
停止時間2.00min
梯度：時間 % A(溶離劑A) % B(溶離劑B)
質量範圍ESI +/-：100-1200m/z
方法B：LCMS_10_分鐘
流動1.0ml/min
停止時間10.00min
質量範圍ESI +/-：100-1600m/z
方法C：LC-MS管柱Acquity UPLC BEH C18 1.7μm,2.1*50mm
5分鐘(流動0.7ml/min，溶劑A：水+0.1%甲酸，溶劑B：ACN+0.1%甲酸，梯度：在4.3min內20至100% B)
在未指定LC方法時，若滯留時間低於1.5分鐘，則使用方法A且對於在1.5與10分鐘之間的滯留時間，使用方法B。
UPLCMS-方法D(極性方法，2分鐘運作)：系統：具有Waters SQ偵測器之Waters Acquity UPLC。
管柱：Acquity HSS T3 1.8μm 2.1 x 50mm。
流動：1ml/min。管柱溫度：60℃。
梯度：在1.4min內1至98% B，A=水+0.05%甲酸+3.75mM乙 酸銨，B=乙腈+0.0.4%甲酸。
UPLCMS方法E(4分鐘運作)
系統：具有Waters SQ偵測器之Waters Acquity UPLC。
管柱：Sunfire C18 3.5μm 2.1x20mm。
流動：0.62ml/min。管柱溫度：40℃。
梯度：在4min內5至100% B，A=水+0.1%三氟乙酸，B=乙腈+0.1%三氟乙酸。
製備型LC方法
正相層析-PrepLC方法A
系統：CombiFlash Rf200。
管柱：RediSep Column Silica。
梯度：0至100% B，A=庚烷，B=乙酸乙酯。
正相層析-PrepLC方法B
系統：CombiFlash Rf200。
管柱：RediSep Column Silica。
梯度：0至100% B，A=二氯甲烷，B=MeOH。
製備型逆相層析-PrepLC方法C
系統：具有Waters SQ偵測器之Waters Acquity Prep LC/MS。
管柱：Sunfire Preparative C18,5μm,30 x 100mm。
流動：30ml/min。
梯度：5至100% B，A=乙腈+0.1%三氟乙酸，B+水+0.1%三氟乙酸。
製備型逆相層析-PrepLC方法D
系統：具有Waters SQ偵測器之Waters Acquity Prep LC/MS。
管柱：Sunfire Preparative C18,5μm,30 x 150mm。
流動：60ml/min。
梯度：5至100% B，A=乙腈+0.1%三氟乙酸，B+水+0.1%三氟乙酸。
合成所選之中間物 2,5-二氫-1H-吡咯-1-甲酸苯甲酯
向2,5-二氫-1H-吡咯(30g，434mmol，96%來自Alfa Aesar)於二噁烷(1000mL，0.43M溶液)中之溶液中添加CbzOSu(130g，521mmol)。在室溫下攪拌18小時之後，濃縮反應混合物至約300mL，用1000mL EtOAc稀釋。有機層用水及鹽水洗滌，經無水Na2SO4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由急驟管柱層析獲得呈無色油狀之所需2,5-二氫-1H-吡咯-1-甲酸苯甲酯，91%產率(80.0g)。Rf=0.6(30% EtOAc於己烷中)。1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ7.32(5H,m),5.80(2H,m),5.77(2H,s),4.22(4H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 204.2,160.1(-44),0.86min。
6-氧雜-3-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-甲酸苯甲酯
向2,5-二氫-1H-吡咯-1-甲酸苯甲酯(33g，163mmol；90%來自Aldrich)於二氯甲烷(540mL，0.3M溶液)中之溶液中添加m-CPBA(44g，340mmol，77%來自Aldrich)。反應混合物在室溫下攪拌18小時之後，添加500mL飽和Na2CO3水溶液，且所得混合物在室溫下攪拌1小時。分離有機層，用水及鹽水洗滌，經無水Na2SO4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由急驟管柱層析獲得呈黃色油狀之所需產物，83%產率(29.5g)。Rf=0.5(30% EtOAc於己烷中)。1H NMR(CDCl3,400 MHz)：δ 3.38(2H,dd,J=12.8,6.0Hz),3.68(2H,d,J=3.6Hz),3.87(2H,dd,J=13.2,19.6),5.11(2H,s),7.33(5H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 220.0,0.69min。
3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
在-40℃下向6-氧雜-3-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-甲酸苯甲酯(28.5g，130mmol)及CuBr．SMe2(26.7g，130mmol)於無水THF(260mL，0.5M溶液)中之溶液中緩慢添加乙烯基溴化鎂(520mL，THF中之1.0M溶液)。反應混合物接著溫至-20℃，持續2小時。在用飽和NH4Cl水溶液(200mL)淬滅之後，反應混合物用EtOAc(500mL)萃取。有機層用水及鹽水洗滌，經無水Na2SO4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由急驟管柱層析獲得呈黃色油狀之所需反式(±)-3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯外消旋混合物，48%產率(15.5g)。Rf=0.2(30% EtOAc於己烷中)。1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ 2.71(1H,m),3.28(2H,m),3.72(2H,m),4.11(1H,m),5.14(2H,s),5.16-5.23(2H,m),5.69(1H,m),7.33(5H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 248.0,0.78min。
解析反式(±)-3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
反式(±)-3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯外消旋混合物(14g)提交至巴塞爾分離實驗室(聯繫：Eric Francotte博士，Tel.+41 6169 62971)。獲得所需之對映異構體增濃之(3S,4R)-3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(6.3g，>99.5%ee)及非所需(3R,4S)-3-羥基-4-乙烯基 吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(6.7g，99.5%ee)，92%回收率。
(3R,4R)-3-氟-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
向(3S,4R)-3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(5.0g，20.2mmol)於PhCF3(81mL，0.25M溶液)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(53mL，303mmol)、三乙胺三氫氟化物(19.8mL，121mmol)及全氟-1-丁烷磺醯氟(PBSF，3.6mL，20.2mmol)。所得混合物在室溫下攪拌。在60及120分鐘之後，添加額外全氟-1-丁烷磺醯氟(3.6mL，20.2mmol)。18小時之後，將反應混合物轉移至分液漏斗且用50mL 1.0N HCl(警告！產生大量熱)洗滌兩次，用飽和NaHCO3水溶液洗滌兩次且用H2O及鹽水洗滌一次。有機相經無水Na2SO4乾燥，過濾且濃縮，提供粗棕色油狀物。藉由急驟管柱層析(SiO2,10%-30% EtOAc於己烷中)獲得呈黃色油狀之純(3R,4R)-3-氟-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯，81%產率(4.1g)。Rf=0.55(30% EtOAc於己烷中)。1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ 7.37-7.25(5H,m),5.9(1H,m),5.24(2H,m),5.14(2H,m),5.03(1H,dt,J=52.8,3.2Hz),3.9-3.5(3H,m),3.53(1H,q,J=10.4Hz),2.83(1H,m)。13C NMR(CDCl3,100MHz)：δ 154.7,154.6,136.6,131.89,131.83,128.48,128.02,127.94,119.00,118.94,95.23,94.47,93.42,92.67,66.99,66.94,53.16,52.94,52.83,52.60,48.17,48.02,47.91,47.83,47.2,47.1。LC/MS(uplc)：MH+ 250.0,0.93min。
(3R,4S)-3-氟-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
向(3R,4R)-3-氟-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(1.78g，7.15mmol)於CH3OH及H2O(2：1,18mL)中之溶液中添加OsO4於H2O中之溶液(3mL 4% w/v溶液，0.5mmol)。接著一次性添加NaIO4(4.6g，21.5mmol)且所得混合物在室溫下攪拌。2小時後，過濾混合物以移除沈澱之白色固體且用EtOAc洗滌濾餅。使濾液在真空中濃縮以移除大部分有機溶劑。殘餘物用3部分之EtOAc萃取且經組合之有機層經無水Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。粗產物(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯用於下一步驟，而無需進一步純化。LC/MS(uplc)：MH+ 208.2(-44),0.69min。
向以上(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯粗產物於CH2Cl2(20mL)中之冰冷卻溶液中添加NaBH4(330mg，14.30mmol)。在室溫下攪拌反應物。在反應完成時，用0.5M HCl酸化粗混合物且攪拌30min。反應混合物分配於CH2Cl2與水之間。有機層用飽和NaHCO3(兩次)及水(兩次)洗滌，接著經Na2SO4乾燥且在減壓下蒸發溶劑，生成呈油狀之所需產物(3R,4S)-3-氟-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(1.7g，6.9mmol，97%)。粗產物不經任何進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(uplc)：MH+ 254.2,210.2(-44),0.78min。
2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸(R)-2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯。
向(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸(4.82g. 18.6mmol)及K2CO3(2.3g，16.7mmol)於丙酮(372mL)中之冰冷卻溶液中相繼添加2-氯-1-(2,5-二氟苯基)乙酮(4.25g，22.3mmol)、KI(0.77g，4.6mmol)。在攪拌下使反應物達到室溫。在藉由LC/MS(uplc，方法)發現反應完成時，將混合物冷卻至0℃且用冷水(600mL)淬滅。在0℃下攪拌15min之後，過濾反應混合物且用丙酮/H2O(1/3)洗滌沈澱物，提供呈固體狀之2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2- (四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸(R)-2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯(4.1g，9.71mmol，52%)。固體在高真空下乾燥隔夜，且無需任何進一步純化即用於下一步驟中。
1H-NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.66(1H,m),7.61(1H,m),7.49(1H,m),7.32(1H,m),5.33(2H,m),4.06(1H,m),3.86(2H,m),3.24(2H,m),2.01(1H,m),1.75-1.4(13H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 414.1,1.11min(方法A)。
(R)-((4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯。
向2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸(R)-2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯(4.1g，9.71mmol)於甲苯(50mL)中之溶液中添加乙酸銨(15g，194mmol)。所得溶液在回流下加熱(110℃)。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，將混合物冷卻至室溫且分配於EtOAC與H2O之間。有機層經分離且用H2O(兩次)及飽和NaHCO3溶液(兩次)洗滌，接著經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發，生成呈棕色固體狀之粗產物(R)-((4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯(4g，9.7mmol，99%)。固體在高真空下乾燥隔夜，且無需任何進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(uplc)：MH+ 394.2,0.99min(方法A)。
(R)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基) 甲基)胺基甲酸第三丁酯。
向(R)-((4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯(4g，9.7mmol)及K2CO3(2.8g，20.4mmol)於DMF(68mL)中之冰冷卻溶液中添加苯甲基溴(1.4mL，11.2mmol)，且反應在0℃下攪拌1小時，繼而在室溫下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，添加80mL水且在添加時，固體沈澱。固體經過濾且用DMF/H2O(1/1)洗滌，提供(R)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯(3.7g，7.6mmol，73%)。固體在高真空下乾燥隔夜，且無需任何進一步純化即用於下一步驟中。1H-NMR(CDCl3,400MHz)：δ 7.85(1H,m),7.36(4H,m),7.21(2H,m),7.05(1H,m),6.87(1H,m),5.30(1H,m),5.22(1H,m),5.13(1 H,d,m),4.69(1H,m),4.00(1 H,m),3.81(1H,m),3.30(2H,m),2.13(1H,m),1.80(1H,m),1.45(9H,m),1.30(1H,m),1.01(1H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 484.3,1.34min(方法A)。
(R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺。
向(R)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯(3.7g，7.6mmol)於CH2Cl2(80mL)中之冰冷卻溶液中添加三氟乙酸(20mL)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，粗產物於CH2Cl2中稀釋且混合物分配於CH2Cl2與飽和NaHCO3溶液之間。有機層經分離且用飽和NaHCO3溶液(兩次)及水(兩次)洗滌，接著經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑，生成粗產物(R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺(2.8g，7.3mmol，95%)之TFA鹽。粗產物在高真空下乾燥隔夜，且無需任何進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(uplc)：MH+ 384.2,0.83min(方法A)。
(3R,4R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
向(3R,4S)-3-氟-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(2.9g，11.4mL)於CH2Cl2(80mL)中之溶液中添加戴斯-馬丁高碘烷(6.5g，15.20mmol)。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。在反應完成時，粗產物(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯無需進一步處理即以溶液形式用於下一步驟中。
向(R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺(2.9g，7.6mmol)及三乙醯氧基硼氫化鈉(8.1g，38mmol) 於CH2Cl2(60mL)中之溶液中添加來自前一步驟的(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯於CH2Cl2中之溶液。反應混合物在室溫下攪拌2小時。在反應混合物於CH2Cl2中稀釋時，其分配於CH2Cl2與H2O之間。有機層經分離且用飽和NaHCO3溶液(兩次)及H2O(兩次)洗滌，接著經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。在藉由正相管柱層析法純化之後獲得所需(3R,4R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(PrepLC方法A，2.7g，4.5mmol，59%)。LC/MS(uplc)：MH+ 619.3,1.23min(方法A)。
中間物N-醯化之一般程序
向胺(1mmol)於CH2Cl2(0.1M)中之冰冷卻溶液中相繼添加iPr2EtN(7mmol)、醯基氯(6mmol)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，混合物於CH2Cl2中稀釋且分配於CH2Cl2與H2O之間。有機層經分離且用飽和NaHCO3溶液(兩次)及H2O(兩次)洗滌，接著經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。 在藉由正相管柱層析法(PrepLC方法A或C)純化之後獲得所需Cbz-醯胺有效負載。
合成所選之連接子 連接子1。
a：TBSC1，咪唑，DMF，室溫，53%產率；b：順丁烯二醯亞胺，DIAD，PPh3，-78...RT，THF，甲苯，62%產率；c：CF3COOH，CH2Cl2，100%產率。
(2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)乙基)(2-羥基乙基)胺基甲酸第三丁酯
如Liang,Qiren；De Brabander,Jef K.,Tetrahedron,2011，第67卷，第5046-5053頁中所述加以製備。
(2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)乙基)(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸第三丁酯
在N2下：在-78℃下向DIAD(0.237mL，1.221mmol)及三苯膦(320mg，1.221mmol)於10mL甲苯中之經攪拌溶液中添加新鮮製備之順丁烯二醯亞胺(118mg，1.221mmol)及(2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)乙基)(2-羥基乙基)胺基甲酸第三丁酯(300mg，0.939mmol)於10mL THF中之溶液。使混合物溫至RT且攪拌隔夜，用DCM稀釋且用水洗滌。有機物經Na2SO4乾燥，過濾且吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化後獲得呈黃色固體狀之所需產物(矽膠24g，梯度0至100% EtOAC於庚烷中，232mg，0.582mmol，62%)。在室溫下藉由1H-NMR觀測旋轉異構體之混合物。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.09及 6.97(2H,s),3.68-3.63(2H,m),3.57-3.52(2H,m),3.20-3.14(2H,m),3.40-3.36(2H,m),1.31(9H,s),0.85(9H,s),0.02(6H,s)。LC/MS(方法A)：MH+ 399.4,1.39min。
1-(2-((2-羥基乙基)胺基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(用於ADC-1之連接子1)
在N2下：將(2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)乙基)(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸第三丁酯(220mg，0.552mmol)溶解於20mL DCM中，且添加TFA(2.126mL，27.6mmol)。反應混合物在室溫下攪拌2小時。反應混合物在真空中濃縮，再溶解於乙腈與水之混合物中且冷凍乾燥，生成呈黃色油狀之所需產物(185mg，0.552mmol，100%產率)之三氟乙酸鹽。連接子1不經進一步純化即使用。1H-NMR(CD3OD,400MHz)：1H-NMR(CD3OD,400MHz)：δ 6.94(2H,s),3.92-3.87(2H,m),3.83-3.79(2H,m),3.32-3.28(2H,m),3.23-3.18(2H,m)。
合成連接子2
a：乙醇胺，90%產率；b：二碳酸二第三丁酯，TEA，THF，50%產率；c：順丁烯二醯亞胺，D1AD，PPh3，43%產率；d：CF3COOH，60%產率。
3-((2-羥基乙基)胺基)丙酸第三丁酯
如Aebi,Johannes；Binggeli,Alfred；Green,Luke；Hartmann,Guido；Maerki,Hans P.；Mattei,Patrizio；Ricklin,Fabienne；Roche,Olivier，專利：US2010/16282 A1,2010；P.23中所述獲得
3-((第三丁氧基羰基)(2-羥基乙基)胺基)丙酸第三丁酯
在N2下，將3-((2-羥基乙基)胺基)丙酸第三丁酯(1304mg，6.89mmol)溶解於20mL THF中，且相繼添加三乙胺(0.960mL，6.89mmol)、Boc-酐(1.600mL，6.89mmol)。反應混合物在室溫下攪拌4小時。反應混合物於真空中濃縮且分配於乙酸乙酯與鹽水之間。有機物經Na2SO4乾燥，過濾且吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化後獲得呈無色油狀之所需產物(矽膠80g，梯度0至100% EtOAC於庚烷中，988mg，3.41mmol，50%)。
3-((第三丁氧基羰基)(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)丙酸第三丁酯
在N2下：在-78℃下向DIAD(0.863mL，4.44mmol)及三苯膦 (1164mg，4.44mmol)於10mL甲苯中之經攪拌溶液中添加新鮮製備之順丁烯二醯亞胺(431mg，4.44mmol)及3-((第三丁氧基羰基)(2-羥基乙基)胺基)丙酸第三丁酯(988mg，3.41mmol)於10mL THF中之溶液。使反應混合物溫至室溫且攪拌隔夜。反應混合物用DCM稀釋且用水洗滌。有機物經Na2SO4乾燥，過濾且吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化後獲得呈無色油狀之所需產物(矽膠80g，梯度0至100% EtOAC於庚烷中，903mg，1.48mmol，43%，藉由LC-MS、UV發現純度60%)。LC/MS(方法A)：MH+ 369.3,1.11min。
3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)丙酸第三丁酯
在N2下：將3-((第三丁氧基羰基)(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)丙酸第三丁酯(870mg，2.361mmol)溶解於5mL DCM中，且反應混合物冷卻至-10℃。添加TFA(5mL，64.9mmol)。反應混合物在-10℃下攪拌3小時，接著在真空中濃縮，再溶解於乙腈與水之混合物中且冷凍乾燥，生成1086mg呈黃色油狀之粗所需產物(1.420mmol，60.1%產率，如藉由純化小批量所測定為約50%純)。
藉由逆相管柱層析法純化100mg粗化合物，生成50mg純連接子2(呈三氟乙酸鹽)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)：δ 6.76(2H,s),3.96-3.91(2H,m),3.39-3.29(4H,m),2.79-2.73(2H,m),1.48(9H,s)。LC/MS(方法A)：MH+ 269.6,0.48min。
合成連接子4
3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
在-78℃下經5分鐘向三苯膦(1.40g，5.34mmol)於無水THF(53ml)中之溶液中逐滴添加偶氮二甲酸二異丙酯(1.04mL，5.34mmol)，且所得混合物攪拌5分鐘。3-(羥基甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(1.00g，5.34mmol)接著經5分鐘添加至反應中。當添加順丁烯二醯亞胺(0.518g，5.34mmol)時，所得溶液再攪拌5分鐘。使反應混合物溫至RT且再攪拌18小時。反應濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，44%產率；UPLC-MS：Rt=0.87min；MS m/z[M+H]+ 267.0；方法A。
2,2,2-三氟乙酸3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-鎓
向3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(624mg，2.34mmol)於DCM(23.5ml)中之溶液中緩慢添加三氟乙酸(9.03mL，117mmol)，且反應混合物在RT下攪拌30分鐘。反應濃縮至乾，生成呈淺黃色固體狀之所需產物，99%產率；UPLC-MS：Rt=0.22min；MS m/z[M+H]+ 167.0；方法A。
合成連接子5
(3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基甲酸第三丁酯
向3-第三丁氧基羰基)胺基)丙酸(500mg，1.97mmol)及HATU(1.50g，3.93mmol)於DMF(20ml)中之溶液中緩慢地相繼添加三乙胺(1.37mL，9.84mmol)、1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(500mg，1.97mmol)，且反應混合物在RT下攪拌24小時。反應在EtOAc中稀釋且用1M HCl水溶液洗滌。有機層經萃取，用飽和NaHCO3水溶液洗滌。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，24%產率；UPLC-MS：Rt=0.65min；MS m/z[M+H]+ 312.1；方法A。
2,2,2-三氟乙酸3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-3-側氧基丙-1-銨
向3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(624mg，2.34mmol)於DCM(23.5ml)中之溶液中緩慢添加三氟乙酸(0.80mL，10.4mmol)，且反應混合物在RT下攪拌30分鐘。反應濃縮至乾，生成呈淺黃色固體狀之所需產物，定量產率；UPLC-MS：Rt=0.24min；MS m/z[M+H]+ 212.1；方法A。
碳酸2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基(4-硝基苯基)酯
向1-(2-羥基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(250mg，1.77mmol)於DCM(8.9ml)中之溶液中添加二異丙基乙胺(1.5mL，8.86mmol)及碳酸雙(4-硝基苯基)酯(701mg，2.30mmol)，且反應混合物在RT下攪拌3小時。反應用水及DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，88%產率；1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 8.34-8.32(2H,m),7.54-7.51(2H,m),7.09(2H,s),4.36-4.34(2H,m),3.81-3.79(2H,m)。
1-(2-(2-羥基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮
在0℃下向(2-胺基乙氧基)乙醇(2.9mL，29.0mmol)於飽和NaHCO3水溶液(150ml)中之溶液中添加N-(甲氧基羰基)順丁烯二醯亞胺(4.5g，29.0mmol)，且反應混合物在RT下攪拌30分鐘，且接著在RT下再攪拌3小時。以DCM萃取反應物。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，生成呈淺黃色油狀之標題化合物，53%產率； UPLC-MS：Rt=0.35min；MS m/z[M+H]+ 186.0；方法E。
碳酸2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基(4-硝基苯基)酯
以與碳酸2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基(4-硝基苯基)酯類似之方式，改為使用1-(2(2-羥基乙氧基)乙基-1H)-吡咯-2,5-二酮來合成產物；63%產率；UPLC-MS：Rt=1.80min；MS m/z[M+H]+ 697.0；方法E。
經磺酸酯取代之連接子的合成
用於製備此連接子之一般方法自公開方法(J.Med.Chem.2011，第54卷，3606-23)改編；選擇五氟苯基酯來替代參考文獻中使用之N-羥基丁二醯亞胺。
合成實例1. (3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟 苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
LC/MS(uplc)：MH+ 733.3,1.36min(方法A)。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(115mg，0.14mmol)於MeOH(2mL)中之溶液中添加Pd/C(30.4mg，0.03mmol)及甲酸銨(108mg，1.7mmol)。反應混合物在55℃下加熱1小時。在完成時，過濾反應物以移除Pd/C且在減壓下蒸發溶劑，生成粗產物乙酸(S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯。LC/MS(uplc)：MH+ 599.2,0.92min。 粗產物不經任何進一步純化即用於下一步驟中。
向來自Cbz保護基脫除步驟之乙酸(S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯於MeOH(3mL)中之溶液中添加K2CO3(197mg，1.4mmol)。反應物在室溫下攪拌1小時。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，過濾粗混合物以移除固體，且在藉由逆相管柱層析法純化時獲得所需產物(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺(PrepLC方法C),60mg，0.09mmol，63%)。產物以TFA鹽形式經分離。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.80(1H,m),7.75(1H,m),7.45-.7.25(6H,m),7.09(1H,m),5.71(1H,m),5.25(2H,m),5.11(1H,m),4.95(1H,m),4.05(1H,m),3.80(1H,m),3.35(2H,m),3.20(1H,m),2.90(1H,m),2.83(1H,m),2.73(1H,m),2.68(1H,m),2.22(1H,m),1.87(1H,m),1.45(1H,m),1.35(1H,m),1.25(3H,m),1.09(1H,m),0.67(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(upl)：MH+ 557.2,0.84min(方法A)。
BOC保護之一般方法
向脲有效負載(1mmol)於MeOH(0.1M)中之溶液中添加K2CO3(2mmol)及Boc酐(3mmol)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，過濾反應混合物以移除固體，且在藉由正相管柱層析法(PrepLC方法A或B)純化後分離出所需產物Boc-脲。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
BOC保護之一般程序：LC/MS(uplc)：MH+ 657.3,1.30min(方法A)。
合成實例2. (S)-2-胺基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-3-羥基丙醯胺
Cbz保護基脫除之一般程序。18mg，0.023mmol，49%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.80(1H,m),7.75(1H,m),7.40(2H,m),7.32(4H,m),7.11(1H,m),5.27(1H,m),5.29(1H,m),5.14(1H,m),4.98(1H,m),3.82(1H,m),3.79(1H,m),3.65(1H,m),3.51(1H,m),3.40(2H,m),2.92(1H,m),2.84(1H,m),2.78(1H,m),2.59(1H,m),2.20(1H,m),2.01(1H,m),1.88(1H,m),1.65(1H,m),1.45(1H,m),1.30(1H,m),1.18(1H,m),0.89(1H,m),0.65(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 572.2,0.71min(方法A)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
Boc保護之一般程序：LC/MS(uplc)：MH+ 772.2,1.36min(方法A)。
合成實例3. (3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
792mg，1.0mmol，76%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.70(1H,m),7.52(1H,m),7.30-7.10(10H,m),6.90(1H,m),5.78(s,1H),5.37(2H,bs),5.34(2H,m),5.30(1H,bs),5.05(1H,m),4.92(2H,bs),4.25(2H,bs),3.87(2H,m),3.81(1H,m),3.71(1H,m),3.64(2H,m),3,43(2H,m),3.26(1H,m),2.61(1H,m),2.45(1H,m),2.01(1H,m),1.61-1.25(4H,m),1.12(3H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 720.3,1.25 min。(方法A)。
合成實例4. (3R,4R)-3-(((3S,4R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3,4-二羥基吡咯啶-1-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
2870mg，2.3mmol，60%。LC/MS(uplc)：MH+ 748.2,1.19min(方法A)。
合成實例5. (3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(2,3-二羥基丙基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
670mg，0.9mmol，39%。LC/MS(uplc)：MH+ 736.2,1.16min。(方法A)。
(3R,4R)-3-((N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-羥基氮雜環丁烷-1-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
572mg，0.64mmol，66%。LC/MS(uplc)：MH+ 718.2,1.23min(方法A)。
(3R,4R)-3-((N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-羥基哌啶-1-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
異構體A：LC/MS(uplc)：MH+ 746.2,1.27min(方法A)。
異構體B：LC/MS(uplc)：MH+ 746.2,1.28min(方法A)。
Cbz保護基脫除：
向Cbz-脲有效負載(1.0mmol)於MeOH(0.1M)中之溶液中添加Pd/C(含量10%,0.2mmol)及甲酸銨(12mmol)。反應在55℃下加熱30分鐘。在完成時，過濾反應以移除Pd/C且在逆相管柱層析法時分離出所需脲。(PrepLC方法C或D)。
合成實例6. 1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-1-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-3-((S)-1-羥基 丙-2-基)脲
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.75(2H,m),7.40-7.25(6H,m),7.09(1H,m),5.90(1H,bs),5.36-5.30(3H,m),4.96(1H,m),4.71(1H,m),3.85(2H,m),3.79(1H,m),3.58(2H,m),3.29(4H,m),2.79(2H,m),2.57(1H,bs),2.17(1H,bs),1.72(1H,m),1.60(1H,m),1.38(2H,m),0.95(2H,m),1.08(3H,bs)。1個信號隱藏在溶劑峰下。LC/MS(uplc)：MH+ 586.3,0.86min。(方法A)。
1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-1-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-3-(2-羥基乙基)脲。
15mg，0.025mmol，19%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ7.78-7.68(2H,m),7.44-7.36(2H,m),7.36-7.25(4H,m),7.15-7.04(1H,m),6.45-6.28(1H,m),5.45-521(3H,m),5.10-4.91(1H,m),4.71-4.57(1H,m),3.91-3.79(1H,m),3.67-3.52(2H,m),3.28-3.14(4H,m),3.09-2.91(1H,m),2.84-2.68(1H,m),2.24-2.12(1H,m),1.97-1.78(1H,m),1.59-1.49(1H,m),1.47-1.37(1H,m),1.36-1.27(1H,m),1.22-1.10(1H,m), 0.79-0.60(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 572.2,0.83min(方法A)。
合成實例7. (3S,4R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-3,4-二羥基吡咯啶-1-甲醯胺
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.73(2H,bs),7.38-7.25(6H,m),7.06(1H,bs),5.5(2H,m),4.95(1H,m),4.84(2H,bs),4.82(1H,bs),4.02(2H,m),3.81(1H,m),3.60(1H,bs),3.49(2H,bs),3.27(1H,m),3.13(1H,bs),2.93(1H,m),2.72(1H,m),2.39(1H,bs),2.28(1H,m),1.85(1H,bs),1.73(1H,m),1.58(1H,m),1.03(1H,m),0.97(1H,m),0.28(1H,m),5 H隱藏在溶劑峰下缺失。LC/MS(uplc)：MH+ 614.3,0.82min。(方法A)。
合成實例8. 1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(2,3-二羥基丙基)-1-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.76(2H,bs),7.40-7.25(6H,m),7.09(1H,bs),6.36(1H,bs),5.40(1H,bs),5.30(2H,m),4.95(1H,m),4.79(1H,bs),4.60(1H,bs),3.84(1H,m),3.61(1H,m),3.56(1H,m),3.54(1H,bs),3.29(1H,m),3.25(4H,m),3.10(1H,m),2.94(1H,m),2.68(1H,m),2.56(1H,m),2.13(1H,m),1.80(1H,m),1.49(1H,m),1.42(1H,m),1.35(1H,m),1.18(1H,m),0.71(1H,m)。2個信號隱藏在溶劑峰下。LC/MS(uplc)：MH+ 602.3,0.78min。(方法A)。
N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-3-羥基氮雜環丁烷-1-甲醯胺。
45mg，0.073mmol，92%。LC/MS(uplc)：MH+ 584.2,0.84min(方法A)。
N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-3-羥基哌啶-1-甲醯胺。
異構體A：LC/MS(uplc)：MH+ 612.30.88min(方法A)。
異構體B：LC/MS(uplc)：MH+ 612.30.89min(方法A)。
合成實例9. (3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯 合成Boc-脲有效負載之一般程序：
脲偶合：向光氣(20%於甲苯中，2mmol)於CH2Cl2(0.1M)中之冰冷卻溶液中添加胺(1mmol)及三乙胺(3mmol)於CH2Cl2(1M)中之溶液。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，添加用於脲(20mmol)之所需胺，且反應在60℃下攪拌2小時，且接著在室溫下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，在減壓下蒸發粗溶劑，且在藉由正相管柱層析法(PrepLC方法A或B)純化後獲得所需產物。
0.49mg，0.69mmol，68%。LC/MS(uplc)：MH+ 686.3,1.25min。(方法A)。
(3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(2-羥基乙基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
1.05g，1.6mmol，85%。LC/MS(uplc)：MH+ 782.2,0.90min(方法A)。
合成實例10. (3R,4R)-3-(((3S,4R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3,4-二羥基吡咯啶-1-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
817mg，1.09mmol，47%。LC/MS(uplc)：MH+ 714.2,1.18min。(方法A)。
合成實例11. (3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(2,3-二羥基丙基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
317mg，0.43mmol，49%。LC/MS(uplc)：MH+ 702.2,1.16min。(方法A)。
(3R,4R)-3-((N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-羥基氮雜環丁烷-1-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
240mg，0.33mmol，73%。LC/MS(uplc)：MH+ 684.2,1.23min(方法A)。
(3R,4R)-3-((N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-羥基哌啶-1-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
異構體A：LC/MS(uplc)：MH+ 712.3,129min(方法A)。
異構體B：LC/MS(upcl)：MH+ 712.3,1.30min(方法A)。
合成實例12. (3R,4R)-3-((3-((S)-1-疊氮基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4- 氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(100mg，0.15mmol)於CH2Cl2(0.8mL)及吡啶(24μl，0.29mmol)中之冰冷卻溶液中緩慢添加對甲苯磺醯氯(40.3mg，0.21mmol)。在室溫下攪拌反應混合物。在反應完成時，反應混合物於CH2Cl2中稀釋且分配於H2O與CH2Cl2之間。有機層經分離且用H2O洗滌兩次，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發，生成粗產物(3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-(甲苯磺醯氧基)丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(109mg，0.1mmol，71%)。粗混合物不經進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：704.3(-135)。(方法A)。
向(3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-(甲苯磺醯氧基)丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(109mg，0.1mmol)於DMF(0.6mL)中之溶液中添加疊氮化鈉且反應混合物在70℃下攪拌。在反應完成時，混合物冷卻至室溫且在EtOAc(5mL)中稀釋。反應混合物分配於H2O與EtOAc之間。有機層經分離且用H2O洗滌兩次，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。在藉由管柱層析法純化(梯度30至100% EtOAC於庚烷中，40mg，0.053mmol，52%)後獲得所需產物 (3R,4R)-3-((3-((S)-1-疊氮基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.73(1H,bs),7.68(1H,bs),7.36-7.29(6H,m),7.09(1H,bs),6.29(1H,bs),5.34(2H,m),5.07(1H,m),3.97(1H,m),3.85(1H,m),3.70(2H,m),3.50(1H,m),3.37-3.20(6H,m),2.69(1H,m),2.58(1H,m),2.17(1H,m),1.96(1H,m),1.45(1H,m),1.30(1H,m),1.18(9H,s),1.12(1H,m),0.86(2H,m)。3個信號隱藏在溶劑峰下。LC/MS(uplc)：MH+ 711.4,1.41min。(方法A)。
(3R,4R)-3-((3-((S)-1-胺基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4R)-3-((3-((S)-1-疊氮基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(100mg，0.14mmol)於THF(2mL)中之溶液中添加三苯膦(111mg,0.42mmol)及H2O(51μl，2.81mmol)。反應混合物在50℃下攪拌。在反應完成時，混合物冷卻至室溫且用EtOAc(5mL)稀釋。使反應混合物分配於EtOAc與H2O之間。有機層用H2O洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。在管柱層析法(梯度0至10% MeOH於CH2Cl2中，51mg，0.071mmol，50%)後分離出所需 產物(3R,4R)-3-((3-((S)-1-胺基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。LC/MS(uplc)：MH+ 685.4,1.08min。(方法A)。
3-((S)-1-胺基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-1-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲
向(3R,4R)-3-((3-((S)-1-胺基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(40mg，0.058mmol)於乙腈(1.2mL)中之溶液中添加三氟乙酸(0.6mL)且反應混合物在室溫下攪拌。在反應完成時，過濾粗產物以移除固體，且在逆相管柱層析法(梯度5%至35% MeCN(+0.1% TFA)於H2O(+0.1% TFA)中，19.1mg，0.031mmol，53%)之後分離出所需產物3-((S)-1-胺基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-1-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲。該TFA鹽用PL-HCO3 MP SPE管柱中和，得到游離鹼。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.75(2H,bs),7.40-7.28(6H,m),7.09(1H,bs),6.02(1H,bs),5.40-5.30(3H,m),4.95(1H,m),3.84(1H,m),3.74(1H,m),3.61(2H,m),3.34(2H,m),3.24(2H,m),2.95(1H,m),2.72(1H,m),2.66(1H,m),2.59(1H,m),2.55(1H,m),2.19(1H,m),1.82(1H,m),1.56(1H,m),1.42(1H,m),1.34(1H,m),1.119(1H,m),1.08(3H,bs),0.71(1H,m)。2個信號隱藏在溶劑峰下。LC/MS(uplc)： MH+ 585.3,0.73min。(方法A)。
合成實例13。
(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3,3-二甲基戊-4-烯酸 如WO2005/54186 A2,2005；P.48-49中所述加以製備 (R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3,3-二甲基戊-4-烯酸2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯
在N2下：向2-氯-1-(2,5-二氟苯基)乙酮(1.974g，10.36mmol)及K2CO3(1.074g，7.77mmol)於150mL丙酮中之冰冷卻溶液中相繼添加(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3,3-二甲基戊-4-烯酸(2.1g，8.63 mmol)、KI(0.358g，2.158mmol)，移除冷卻浴且反應混合物在RT下攪拌3.5小時。
反應混合物傾入碎冰中且用DCM萃取。有機物經Na2SO4乾燥，過濾且吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化(矽膠80g，梯度0至20% EtOAC於庚烷中，2.95g，86%)後獲得呈黃色固體狀之所需產物。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 7.72-7.57(2H,m),7.55-7.45(1H,m),6.94(1H,d,8.9Hz),5.97(1H,dd,17.4,10.7Hz),5.40-5.25(2H,m),5.10-4.95(2H,m),4.11(1H,d,9.0Hz),1.39(9H,s),1.13(6H,s)。LC/MS(方法C)：MH+ 398.2,3.25min。
(R)-(1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基甲酸第三丁酯
(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3,3-二甲基戊-4-烯酸2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯(2.95g，7.42mmol)溶解於45mL甲苯中且添加乙酸銨(11.44g，148mmol)。將所得混合物加熱至回流並持續40小時。
反應混合物冷卻至RT，用水、飽和NaHCO3水溶液及鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且在真空中濃縮。殘餘物在減壓下在40℃下乾燥42小時。(2.69g，93%，藉由LC-MS、UV發現97%純)呈黃色泡沫狀且無需進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(方法A)：MH+ 378.5,1.22min。
(R)-(1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基甲酸第三丁酯
在0℃下向(R)-(1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基甲酸第三丁酯(2.69g，6.91mmol)於20mL DMF中之溶液中相繼添加K2CO3(1.911g，13.83mmol)、苯甲基溴(0.904mL，7.6mmol)。所得混合物在RT下攪拌3小時。
添加冰水，產生沈澱物。藉由過濾收集灰白色固體，用DMF/水(1/2)、水洗滌且在減壓下乾燥48小時，生成呈固體狀之所需產物且無需進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(方法A)：MH+ 468.2,1.53min。
(R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-胺
在N2下：(R)-(1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基甲酸第三丁酯(10.768g，23.03mmol)溶解於180mL DCM中且反應混合物冷卻至0℃，接著逐滴添加TFA(44.4mL，576mmol)。反應混合物在0℃下攪拌5分鐘，接著在RT下攪拌1小時。殘餘物在減壓下濃縮，用DCM稀釋且用NaOH(2M)鹼化。用 DCM萃取(3x)，有機物經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。獲得呈微黃色固體狀之所需產物(8.7g，23.68mmol，100%產率，97%純)且無需任何純化即用於下一步驟中。LC/MS(方法A)：MH+ 368.3,0.90min。
(3R,4R)-3-((((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在N2下：向(3R,4S)-3-氟-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(4.07g，18.55mmol)於CH2Cl2(120mL)中之溶液中添加戴斯-馬丁高碘烷(13.11g，30.9mmol)。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。在反應完成時，粗產物(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯無需進一步處理即以溶液形式用於下一步驟中。
在0℃下向(R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-胺(5.68g，15.46mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(16.38g，77mmol)及分子篩(20g)於CH2Cl2(120mL)中之溶液中添加來自前一步驟的(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯於CH2Cl2中之溶液。反應混合物在RT下攪拌1小時。反應混合物經過濾，用DCM稀釋且用飽和NaHCO3及鹽水洗滌。有機物經Na2SO4乾燥，過濾且吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化(330g矽膠，0至40% EtOAC於庚烷中，3.186g，5.6mmol，36%)後獲得所需產物。LC/MS(方法B)：MH+ 569.3,6.60min。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在N2下：在0℃下向含(3R,4R)-3-((((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(3.03g，5.33mmol)之CH2Cl2(50mL)中相繼添加DIPEA(4.65mL，26.6mmol)、(S)-2-乙醯氧基丙醯氯(1.349mL，10.66mmol)。所得溶液在0℃下攪拌5分鐘，接著溫至RT且攪拌2小時。反應混合物用DCM稀釋且用飽和NaHCO3，接著飽和NaCl洗滌。有機層經乾燥，濃縮且吸附於isolute上。在藉由管柱層析純化(120g矽膠，0至50% EtOAC於庚烷中，3.143g，4.6mmol，86%)後獲得呈無色固體狀之所需產物。LC/MS(方法A)：MH+ 683.3,1.51min。
合成實例14。 (3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在N2下：(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.5g，2.197mmol)於THF(20mL)中之溶液冷卻至0℃且逐滴添加硼烷於THF(4.39mL，4.39mmol，1M)中之溶液。使反應混合物溫至RT且攪拌4小時。將其冷卻至0℃且相繼用25mL THF/EtOH 1：1、40mL磷酸鹽緩衝液(pH 7)淬滅，最終添加H2O2(2.244mL，21.97mmol，30%水溶液)且反應混合物在RT下攪拌隔夜。鹽水添加至反應混合物中且用ETOAc將其萃取3次。有機層相繼用冷飽和Na2S2O5、水及鹽水洗滌3次，經Na2SO4乾燥，過濾且吸附於isolute上。在藉由管柱層析純化(80g矽膠，0至100% EtOAC於庚烷中，1.075g，1.519mmol，69%)後獲得呈無色油狀之所需產物。LC/MS(方法A)：MH+ 701.4,1.33min。在室溫下藉由1H-NMR觀測旋轉異構體之混合物。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 7.85-7.65(2H,m),7.41-7.28(6H,m),7.15-7.05(1H,m),5.86及5.81(1H，兩個單峰，旋轉異構體)，5.40-5.17(3H,m),4.96(1H,d,15Hz),4.22-4.14(1H,m),3.95-3.70(2H,m),3.27-3.20(1H,m),3.15-2.97(1H,m),2.63-2.55(1H,m),2.22-2.14(1H,m),2.11(3H,s),1.70-1.49(5H,m),1.35-1.20(3H,m),1.09(9H,s),0.95(6H,s)。
(S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
在藉由逆相管柱層析純化後藉由類似於連接子-有效負載組合之 Boc保護基脫除的一般方法(RT,16h)中所述方法之方法製備標題化合物(17mg，0.024mmol，85%產率，呈TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 559.3；Rt 3.25min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物，比率約3：1)：δ 9.01(1H,br s),8.69(1H,br s),8.00及7.92(1H，兩種旋轉異構體之兩個雙重峰3.6及4.2Hz),7.45-7.30(7H,m),7.17-7.07(1H,m),5.87及5.85(1H，兩種旋轉異構體之兩個單峰)，5.50-5.00(3H,m),4.65-4.58(1H,m),4.30-3.90(2H,m),3.35-3.15(6H,m),2.42-2.32(1H,m),1.97-1.85(2H,m),1.55-1.40(1H,m),1.40-1.20(4H,m),1.02及0.90(3H，兩種旋轉異構體之兩個單峰)，0.82及0.68(3H，兩種旋轉異構體之兩個單峰)。
合成實例15。
步驟1：(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸
在0℃下向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(200mg，0.285mmol)於丙酮(體積：7ml)中之溶液中逐滴添加瓊斯試劑(2M,0.856mL，1.712mmol)。所獲得之黃色溶液在室溫下攪拌2.5小時。
在0℃下過量瓊斯試劑用異丙醇(2ml)逐滴淬滅，接著濃縮反應混合物，用水稀釋且用乙酸乙酯萃取(*3)。經組合之有機層經乾燥且蒸發，提供標題化合物(198mg，0.255mmol，89%產率，92%純)，其無需任何進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 715.3,Rt 1.27min。
步驟2：(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酸
在(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸(步驟1)(928mg，1.078mmol)於甲醇(體積：40ml)中之攪拌溶液中添加NaOH(1M,3.23mL，3.23mmol)且反應混合物在室溫下攪拌1小時。反應混合物用水稀釋，蒸發，用HCl(1M)酸化且用EA萃取(*3)。經組合之有機層經乾燥且濃縮，生成所需產物(980mg，1.005mmol，93%產率，69%純)，其無需任何進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 673.4,Rt 1.23min。
步驟3：(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-4-(甲基胺基)-4-側氧基丁基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酸(步驟2)(38mg，0.056mmol)及2M甲胺於THF中之溶液(0.113mL，0.226mmol)溶解於DMF(體積：2ml)中，且相繼添加DIPEA(0.049mL，0.282mmol)、HATU(32.2mg，0.085mmol)。反應混合物在室溫下攪拌1小時。用EA稀釋且用鹽水洗滌(*3)。經組合之有機層經乾燥且濃縮，生成37mg所需產物(37mg，0.026mmol，46.8%產率，49%純)，其無需任何進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 686.3,Rt 1.22min。
步驟4：(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-N,3,3-三甲基丁醯胺
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-4-(甲基胺基)-4-側氧基丁基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟3)(37mg，0.026mmol，49%純)溶解於乙腈(體積：2ml)中，且添加TFA(0.416mL，5.40mmol)，且反應混合物在rt下攪拌1小時。濃縮且藉由逆相層析純化，生成所需產物(6.5mg，9.29μmol,35%產率，呈TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 586.7,Rt 3.03min。1H-NMR(DMSO,600MHz，比率為約5：1之旋轉異構體的混合物，次要旋轉異構體之一些峰無法清除鑑別)：δ 8.99(1.2H,br s),8.71(1.2H,br s),7.91-7.86(0.2H,m),7.84-7.81(1H,m),7.80-7.75(1H,m),7.69-7.65(1H,m),7.57(0.2H,d,3.6Hz),7.45-7.29(6.5H,m),7.15-7.10(1.4H,m),6.22(1H,s),5.78(0.2H,s),5.59(0.2H,d,16.2Hz),5.48(0.2H,d,16.2Hz),5.34(1H,d,15.1Hz),5.17(1H,d,15.1Hz),5.10(1H,d,52.2Hz),4.83-4.77(0.2H,m),4.57-4.51(1H,m),4.49-4.42(0.2H,m),4.06-4.01(0.4H,m),3.95-3.92(2H,m),3.35-3.24(1.2H,m),3.14-3.00(1.2H,m),2.56(0.6H,d,4.2Hz),2.31-2.23(1H,m),2.19(1H,d,13.5Hz),2.10-2.00(0.4H,m),2.00-1.92(1H,m),1.90(1H,d,13.5Hz),1.72-1.58(1H,m),1.35(3H,d,6.0Hz),1.15(0.6H,s),1.08(0.6H,s),1.05(3H,s),0.95(3H,s),0.77(0.6H,d,6.0Hz)。一個CH3基團隱藏在DMSO峰下，OH未見。
合成實例16。
步驟1：(3R,4R)-3-(((2S)-2-乙醯氧基-N-((1R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3,4-二羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向4-甲基嗎啉-N-氧化物(73.6mg，0.628mmol)及四氧化鋨4%(0.082mL，10.47μmol)於水(6mL)中之攪拌溶液中添加含(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(143mg，0.209mmol)之THF(4ml)。混合物在室溫下攪拌18小時。反應混合物用飽和Na2S2O5水溶液淬滅且將其在室溫下攪拌1小時，接著用DCM萃取(3次)。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮，生成157mg所需產物(157mg，0.169mmol，81%產率，77%純)，其無需任何進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 717.3；Rt 1.23/1.28min。(2種非對映異構體)。
步驟2：(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
(3R,4R)-3-(((2S)-2-乙醯氧基-N-((1R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3,4-二羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟1)(120mg，0.129mmol)及K2CO3(35.6mg，0.258mmol)溶解於THF(6mL)中。添加含NaIO4(83mg，0.387mmol)之水(4ml)。混合物在室溫下攪拌3小時。藉由過濾移除白色沈澱物，接著用EA萃取濾液3次。有機層相繼用飽和Na2S2O5、接著鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。無進一步純化，獲得105mg所需產物(105mg，0.090mmol，70%產率，59%純)且用於下一步驟。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 685.4；Rt 1.42min。
步驟3：(R)-3-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙酸
在N2下：在0℃下向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟2)(102mg，0.149mmol)於丙酮(10mL)中之溶液中逐滴添加瓊斯試劑2M(0.372mL，0.745 mmol)。所獲得之黃色溶液在室溫下攪拌3小時。在0℃下過量瓊斯試劑用異丙醇(6ml)逐滴淬滅，接著濃縮反應混合物，用水稀釋且用乙酸乙酯萃取(*3)。經組合之有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。
獲得81.5mg所需產物(81.5mg，0.078mmol，52%產率，67%純)且無需進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 701.3；Rt 1.29min。
步驟4：(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
將(R)-3-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙酸(步驟3)(46mg，0.066mmol)及含2M甲胺之THF(0.656mL，1.313mmol)溶解於DMF(2mL)中。相繼添加DIPEA(0.057mL，0.328mmol)、HATU(37.4mg，0.098mmol)。反應混合物在室溫下攪拌24小時。混合物用乙酸乙酯稀釋且用鹽水洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮，生成46.9mg所需產物(46.9mg，0.066mmol，100%產率)，其無需任何進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 714.3；Rt 1.29min。
步驟5：(S)-乙酸1-(((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲 基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟4)(46.9mg，0.066mmol)溶解於乙腈(2ml)及水(1ml)中。添加TFA(0.506mL，6.57mmol)且反應混合物在60℃下攪拌4小時。溶液稀釋於EA中，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，接著用鹽水洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。無進一步純化，獲得40.3mg所需產物(40.3mg，0.066mmol，100%產率)且用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 614.3；Rt 0.89min。
步驟6：(R)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-N,2,2-三甲基丁醯胺
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟5)(40.3mg，0.066mmol)溶 解於MeOH(3mL)中。添加K2CO3(45.4mg，0.328mmol)。反應混合物在室溫下攪拌40分鐘。
混合物經過濾及提交以藉由逆相層析純化。獲得8.9mg呈TFA鹽之預期產物(8.9mg，0.012mmol，19%產率，94%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 572.2；Rt 2.92min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體之混合物，報告主要旋轉異構體之峰)：δ 9.04(1H,br s),8.85(1H,br s),7.76-7.70(3H,m),7.45-7.31(6H,m),7.13-7.07(1H,m),6.42(1H,s),5.25-5.20(2H,m),5.14-5.09(1H,m),4.57-4.51(1H,m),3.92-3.85(2H,m),3.35-3.25(1H,m),3.20-3.05(1H,m),2.48(3H,d,4.5Hz),2.33-2.25(1H,m),1.98-1.88(1H,m),1.82-1.68(1H,m),1.36-1.32(6H,m),1.06(3H,s)。
合成實例17。
步驟1：(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羥基-2,2-二甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下在N2下向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(232.6mg，0.340mmol)於THF(12ml)中之溶液中添加NaBH4(19.28mg，0.510mmol)及2mL MeOH，得到澄清溶液。反應混合物在室溫下攪拌1小時。混合物在0℃下經飽和NH4Cl水溶液淬滅，用EA萃取，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。
無進一步純化，獲得233mg所需產物(233mg，0.340mmol，100%產率，100%純)且用於下一步驟。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 687.3；Rt 1.37min
步驟2：(S)-乙酸1-(((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羥基-2,2-二甲基丙基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羥基-2,2-二甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟1)(26mg，0.038mmol)溶解於乙腈(1mL)及水(0.5mL)中。添加TFA(0.292mL，3.79mmol)且其在60℃下攪拌1小 時。反應混合物稀釋於EA中，用飽和NaHCO3洗滌，接著用鹽水洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。
無進一步純化，獲得22.2mg所需產物(22.2mg，0.038mmol，100%產率)且用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 587.3；Rt 0.93min
步驟3：(S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羥基-2,2-二甲基丙基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
向(S)-乙酸1-(((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-羥基-2,2-二甲基丙基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯(步驟2)(22.2mg，0.038mmol)於甲醇(2mL)中之攪拌溶液中添加K2CO3(26.2mg，0.189mmol)。反應混合物在室溫下攪拌1.5小時。混合物經過濾及提交以藉由逆相層析純化。獲得8.8mg呈TFA鹽之預期產物(8.8mg，0.013mmol，35%產率，100%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 545.3；Rt 3.24min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體之混合物，報告主要旋轉異構體之峰)：δ 9.09(1H,br s),8.87(1H,br s),7.80-7.87(1H,m),7.70-7.76(1H,m),7.30-7.44(6H,m),7.1-7.15(1H,m),6.03(1H,s),5.35-5.08(3H,m),4.60-4.55(1H,m),4.05-3.85(2H,m),3.35-3.20(2H,m),3.12-3.04(2H,m),2.41-2.31(1H,m),2.01-1.79(2H,m),1.35(3H,d,6.2Hz),0.90(3H,s),0.80(3H,s)。
合成實例18。
步驟1：(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在N2下：向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(200mg，0.285mmol)於無水DCM(12ml)中之溶液中添加戴斯-馬丁高碘烷(161mg，0.380mmol)。反應混合物在室溫下攪拌35分鐘。溶液稀釋於DCM中，用水、鹽水洗 滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。
無進一步純化，獲得199mg所需產物(199mg，0.285mmol，100%產率)且用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 699.5；Rt 1.39min
步驟2：(3R,4R)-3-(((2S)-2-乙醯氧基-N-((1R,E)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((第三丁基亞磺醯基)亞胺基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在50℃下，(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(250mg，0.358mmol)、2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺(步驟1)(217mg，1.789mmol)及CuSO4.5H2O(447mg，1.789mmol)於DCM(10mL)中攪拌42小時。過濾反應混合物且用另外DCM洗滌沈澱物。濾液(=產物)在真空中濃縮。
無進一步純化，獲得496mg所需產物(496mg，0.353mmol，99%產率，57%純)且用於下一步驟。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 802.5；Rt 1.48min。
步驟3：(3R,4R)-3-(((2S)-2-乙醯氧基-N-((1R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(1,1-二甲基乙基亞磺醯胺基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
(3R,4R)-3-(((2S)-2-乙醯氧基-N-((1R,E)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((第三丁基亞磺醯基)亞胺基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟2)(496mg，0.353mmol)溶解於MeOH(15mL)中。緩慢添加NaBH4(66.7mg，1.763mmol)。反應混合物變色(棕色)且發泡。將其在室溫下攪拌4小時。殘餘物稀釋於EA中，用水洗滌，接著用鹽水洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。
無進一步純化，獲得379mg所需產物(379mg，0.420mmol，119%產率(未乾燥)，89%純)且用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 804.7；Rt 1.42min。
步驟4：(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-4-胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下，在N2下，(3R,4R)-3-(((2S)-2-乙醯氧基-N-((1R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(1,1-二甲基乙基亞磺醯胺基)- 2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟3)(106mg，0.117mmol)溶解於MeOH(3mL)中。添加含4M HCl之二噁烷(0.059mL，0.235mmol)。反應混合物在0℃下攪拌1小時20分鐘，接著在0℃下用飽和NaHCO3淬滅。溶液稀釋於EA中，用水洗滌，接著用鹽水洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。
無進一步純化，獲得82mg所需產物(82mg，0.076mmol，65%產率，65%純)且用於下一步驟。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 700.5；Rt 1.04min。
步驟5：(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-4-乙醯胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁基)-2-乙醯氧基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-4-胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟4)(44mg，0.041mmol)及DIPEA(0.021mL，0.123mmol)於DCM(1mL)中。添加乙醯氯(4.35μl，0.061mmol)。混合物在室溫下攪拌1小時20分鐘。反應混合物稀釋於DCM中，相繼用水、飽和NaHCO3及鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。
無進一步純化，獲得30.3mg所需產物(30.3mg，0.041mmol，100%產率)且用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 742.5；Rt 1.25min。
步驟6：(S)-乙酸1-(((R)-4-乙醯胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-4-乙醯胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁基)-2-乙醯氧基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟5)(30.3mg，0.041mmol)溶解於乙腈(2ml)及水(1ml)中。添加TFA(0.157mL，2.042mmol)且反應混合物在60℃下攪拌1小時40分鐘。
溶液稀釋於EA中，用飽和NaHCO3洗滌，接著用鹽水洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。無進一步純化，獲得30.3mg所需產物(26.2mg，0.041mmol，100%產率)且用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 642.4；Rt 0.84min。
步驟7：(S)-N-((R)-4-乙醯胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
向(S)-乙酸1-(((R)-4-乙醯胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯(步驟6)(26.2mg，0.041mmol)於甲醇(2mL)中之攪拌溶液中添加K2CO3(28.2mg，0.204mmol)，且反應混合物在室溫下攪拌1小時。
溶液經過濾及提交以藉由逆相層析純化。獲得7.7mg呈TFA鹽之預期產物(7.7mg，0.011mmol，26%產率，100%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 600.4；Rt 3.09min。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.06(1H,br s),8.78(1H,br s),7.93(1H,d,3.7Hz),7.80-7.74(1H,m),7.60-7.55(1H,m),7.44-7.30(6H,m),7.17-7.09(1H,m),5.84(1H,s),5.40-5.06(3H,m),4.62-4.56(1H,m),4.05-3.90(2H,m),3.35-3.21(2H,m),2.90-2.80(2H,m),2.45-2.35(1H,m),2.00-1.85(2H,m),1.73(3H,s),1.38-1.41(1H,m),1.35(3H,d,6.2Hz),1.18-1.11(2H,m),0.93(3H,s),0.80(3H,s)
合成實例19。
步驟1：(R)-2-(((S)-2-羥基-1-苯基乙基)胺基)-2-(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)乙腈
4-甲基四氫-2H-哌喃-4-甲醛(4.8g，37.5mmol)於DCM(體積：50ml)中之溶液冷卻至0℃。添加(S)-(+)-苯基甘醇(5.65g，41.2mmol)且反應混合物在0℃下攪拌1小時。逐滴添加氰化三甲基矽烷(7.49mL，56.2mmol)且反應混合物在室溫下攪拌24小時。反應混合物用NaOH(2M)淬滅，用DCM萃取。有機物用NaOH(2M)再次洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。再溶解於THF(20mL)中且用10mL HCl(濃)酸化。接著用NaOH(2M)鹼化且用EA萃取。有機物經Na2SO4乾燥，過濾，濃縮且吸附於Isolute上。殘餘物藉由用庚烷/乙酸乙酯溶離之急驟層析(120g，矽膠)純化，生成兩種非對映異構體：呈無色油狀之所需非對映異構體4.17g(41%產率)及1.69g(15%產率)非所需非對映異構體。
所需非對映異構體之分析資料： LC/MS(方法A)：[M+H]+ 275.4,Rt 0.88min。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 7.40-7.25(5H,m),5.18(1H,t,J=5.7Hz),3.90-3.82(1H,m),3.60-3.33(6H,m),3.09(1H,d,J=12.9Hz),2.63(1H,d,J=12.9),1.68-1.36(3H,m),1.31-1.22(1H,m),1.10(3H,s)。
第二非對映異構體之分析資料： LC/MS(方法A)：[M+H]+ 275.4,Rt 0.82min。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 7.42-7.21(5H,m),4.79(1H,t,J=5.4Hz),3.81-3.62(4H,m),3.55-3.42(4H,m),2.69(1H,dd,J=9.5,4.7Hz),1.71-1.55(2H,m),1.48-1.36(1H,m),1.34-1.22(1H,m),1.09(3H,s)。
(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸
步驟2：(R)-2-(((S)-2-羥基-1-苯基乙基)胺基)-2-(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)乙腈(步驟1)(4.17g，15.20mmol)在濃HCl(57.7mL，608mmol，32%)及AcOH(25mL，437mmol)之混合物中在85℃下加熱3小時。濃縮，與甲苯共蒸發(兩次)。無需任何純化即用於下一步驟中。
步驟3：殘餘物溶解於MeOH(體積：70mL)中，反應混合物用N2淨化，接著添加Pd-C(1.608g，1.511mmol，10%)且將充滿氫氣之氣球連接至隔膜。反應混合物用氫氣淨化，接著在氫氣下在室溫下攪拌3天，直至起始物質經消耗。經由矽藻土用MeOH溶離來過濾，且濃縮。
步驟4：殘餘物懸浮於DCM(體積：40mL)中，相繼添加二異丙胺(6.50mL，30.2mmol)、Boc2O(3.31g，15.2mmol)且反應混合物在RT下攪拌16小時。濃縮，用NaOH(0.2M)稀釋且用DCM洗滌。水層用HCl(4M)酸化至pH 1且產物用EA萃取。有機物經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮，生成所需產物(1.89g，6.57mmol，44%產率)。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 12.59(1H,s),6.92(1H,d,J=9.2Hz),3.98(1H,d,J=9.2Hz),3.69-3.55(2H,m),3.54-3.42(2H,m),1.70-1.45(2H,m),1.39(9H,s),1.36-1.21(2H,m),0.99(3H,s)。
(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯
藉由類似於流程1中所述方法之方法，藉由用(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸置換(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸來製備標題化合物；無色固體(6.9g，16.14mmol，88%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 428.2,Rt 1.16min。
(R)-((4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯
藉由類似於流程1中所述方法之方法，藉由用(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯置換(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯來製備標題化合物；黃色泡沫(6.58g，16.14mmol，100%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 408.2,Rt 1.06min。
(R)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯
藉由類似於流程1中所述方法之方法，藉由用(R)-((4-(2,5-二氟苯 基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯置換(R)-((4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯來製備標題化合物；微黃色固體(6.58g，10.58mmol，78%產率)。LC/MS(方法A)：[M+H]+ 498.3,Rt 1.44min。
(R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺
藉由類似於流程1中所述方法之方法，藉由用(R)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯置換(R)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸第三丁酯來製備標題化合物；微黃色固體(4.23g，10.58mmol，99%產率，呈TFA鹽)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 398.2,Rt 0.90min。
(3R,4R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
藉由類似於流程1中所述方法之方法，藉由用(R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺置換 (R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺來製備標題化合物；無色油狀物(360mg，0.55mmol，44%產率)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 633.3,Rt 6.05min。
(3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
藉由類似於脲化合物之合成的一般程序中所述方法之方法來製備標題化合物。
無色油狀物(207mg，0.24mmol，42%產率，85%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 734.3,Rt 1.32min。
1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-1-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲
藉由類似於Cbz保護基脫除之一般程序中所述方法之方法來製備標題化合物。
藉由通過PL-HCO3筒將TFA鹽轉化為游離鹼。無色固體(8mg， 0.012mmol，14%產率)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 600.2,Rt 3.71min。1H-NMR(DMSO,600MHz)(旋轉異構體之混合物)：δ 7.87-7.80(1H,m),7.77-7.68(1H,m),7.43-7.26(6H,m),7.13-7.06(1H,m),6.13-6.05(1H,m),5.67-5.62(1H,m),5.37-5.22(2H,m),5.94-4.91(1H,m),4.66(1H,br s),3.95-3.75(2H,m),3.70-3.55(2H,m),3.46-3.38(2H,m),3.27-3.17(2H,m),2.97-2.81(1H,m),2.68-2.54(1H,m),2.08-2.02(1H,m),1.89-1.74(1H,m),1.56-1.44(2H,m),1.35-1.28(2H,m),1.17-0.98(7H,m)。一些信號隱藏在溶劑峰下。
合成實例20。
步驟1：(S)-4-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)嗎啉-2-甲酸
(S)-嗎啉-2-甲酸鹽酸鹽[CAS 154731-81-4](100mg，0.597mmol)及碳酸氫鈉(251mg，2.98mmol)溶解於H2O(3ml)中，且添加Fmoc-OSu[Aldrich,82911-69-1](302mg，0.895mmol)於二噁烷(4ml)中之溶液。RM在RT下攪拌3小時。分配於EtOAc與NaHCO3(飽和)之間。水層用EA洗滌且接著酸化至pH3(用HCl 1M)且萃取。有機物經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。獲得210mg呈無色油狀之所需產物。
無色油狀物(210mg，0.582mmol，98%產率，98%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 354.1,[M+NH4]+ 371.1,Rt 0.93min。
步驟2：2-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)嗎啉-4-甲酸(S)-(9H-茀-9-基)甲酯
(S)-4-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)嗎啉-2-甲酸(步驟1)(210mg，0.582mmol)溶解於DCM(10ml)中，接著相繼添加DMF(7.95μl，0.103mmol)、乙二醯氯(0.081mL，0.924mmol)。反應混合物在室溫下攪拌1小時，濃縮且與甲苯共蒸發兩次。殘餘物溶解於10mL DCM中且冷卻至0℃，相繼添加吡啶(0.332mL，4.10mmol)、DMAP(2.507mg，0.021mmol)。最終逐滴添加(3R,4R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(120mg，0.205mmol)於5mL DCM中之溶液。RM在0℃下攪拌15分鐘，接著在室溫下攪拌2小時。用NaHCO3(飽和)稀釋且用DCM萃取，經Na2SO4乾燥，過濾且吸附於Isolute上。藉由用庚烷/乙酸乙酯溶離之急驟層析(40g，矽膠)純化殘餘物，得到135mg呈無色油狀之所需產物。
無色油狀物(135mg，0.142mmol，69%產率，97%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 920.4 Rt 1.53min。
步驟3：(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫- 2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)嗎啉-2-甲醯胺
藉由與哌啶在DMF中反應來移除Fmoc基團。
在藉由逆相管柱層析純化後藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除的一般方法(RT,16h)中所述方法之方法製備標題化合物(23mg，0.028mmol，65%產率，呈雙重TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 598.2,Rt 2.23min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體之混合物，120℃)：δ 7.83-7.77(1H,m),7.68(1H,br s),7.45-7.35(3H,m),7.30-7.22(3H,m),7.12-7.05(1H,m),5.42-5.13(4H,m),4.71(1H,br s),4.05-3.92(2H,m),3.90-3.80(2H,m),3.73-3.64(2H,m),3.50-3.15(9H,m),2.72-2.61(2H,m),2.30-2.10(1H,m),1.50-1.20(3H,m),0.97-0.80(1H,m)。
步驟1：2-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H- 哌喃-4-基)甲基)(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)嗎啉-4-甲酸(R)-(9H-茀-9-基)甲酯
藉由類似於關於(S)-非對映異構體所述方法之方法來製備標題化合物。藉由用庚烷/乙酸乙酯溶離之急驟層析(40g，矽膠)純化，得到104mg呈無色油狀之所需產物。
無色油狀物(135mg，0.113mmol，34%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 920.3 Rt 1.54min。
亦獲得(S)-非對映異構體：無色油狀物(190mg，0.207mmol，62%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 920.3 Rt 1.56min。
步驟2：(R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)嗎啉-2-甲醯胺
藉由與哌啶在DMF中反應來移除Fmoc基團。
在藉由逆相管柱層析純化後藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除的一般方法(RT,16h)中所述方法之方法製備標題化合物(15mg，0.018mmol，98%產率，呈雙重TFA鹽)。LC/MS(方法B)：[M+H]+ 598.2,Rt 2.55min。
合成實例21. 4-羥基-THP-核心骨架合成
4-((2R,5S)-5-異丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氫吡嗪-2-基)四氫-2H-哌喃-4-醇。
向(S)-2-異丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氫吡嗪(5.4mL，30mmol，1eq)於THF(60mL)中之預冷卻(-78℃)溶液中添加nBuLi(1.6M於己烷中，31.5mmol，1.1eq)。反應混合物在-78℃下攪拌1小時。1小時之後，添加二氫-2H-哌喃-4(3H)-酮(3g，30mmol，1eq)於THF(40mL)中之溶液。反應混合物在-20℃下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，用AcOH(1.8mL，31.5mmol，1.1eq)於THF(15mL)中之溶液淬滅反應混合物，且使其溫至rt。反應混合物分配於 Et2O與H2O之間。有機層經分離，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由逆相管柱層析(PrepLC方法B)純化粗產物，生成所需產物(7.3g，25.7mmol，86%)。LC/MS(uplc)：MH+ 285.2,0.96min(方法A)。
(R)-2-胺基-(4-羥基四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸甲酯。
向4-((2R,5S)-5-異丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氫吡嗪-2-基)四氫-2H-哌喃-4-醇(4.3g，15.1mmol，1eq)於THF(107mL)中之溶液中添加HCl(0.2Nm 151mL，30.2mmol，2eq)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應混合物用NaOH(1.0M)淬滅直至pH=8，且以溶液形式用於下一步驟中。LC/MS(uplc)：MH+190.1,0.17min(方法D，極性方法)。
(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(4-羥基四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸甲酯。
向來自前一步驟之溶液(6.62g,14mmol，1eq)中添加NaHCO3(4.1g，49mmol，3.5eq)及Cbz-Cl(5mL，35mmol，2.5eq)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應混合物分配於EtOAc(100mL)與H2O(100mL)之間。有機層經分離，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由正相管柱層析 (PrepLC方法A)純化粗產物，生成所需產物(5.4g，16.7mmol，60%)。LC/MS(uplc)：MH+ 324.2,0.78min。
(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸甲酯。
向(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(4-羥基四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸甲酯(2.3g，6.4mmol，1eq)於CH2Cl2(5mL)中之冰冷卻溶液中添加2,6-二甲基吡啶(5mL，42.9mmol，6.7eq)及TBSOTf(5mL，21.8,3.4eq)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應混合物分配於H2O(50mL)與CH2Cl2(50mL)之間。有機層經分離，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由正相層析(PrepLC方法A)純化粗產物，生成所需產物(2.1g，4.6mmol，73%)。LC/MS(uplc)：MH+ 438.2,1.42min(方法A)。
(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸。
向(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸甲酯(2.1g，4.9mmol，1eq)於THF中之溶液中添加KOH(1.0M,14.7mL，14.7mmol)。在室溫下攪拌反應混合物。在反應完成(uplc，方法A)時，反應混合物用HCl(1.0M)淬 滅，直至pH=4。反應物分配於EtOAc(60mL)與H2O(60mL)之間。有機層經分離，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑，生成所需產物(2.2g，4.8mmol，99%)。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+424.3,1.25min(方法A)。
2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)乙酸(R)-2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 578.3,1.49min(方法A)。
(S)-((4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)胺基甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 558.3,1.48min(方法A)。
(S)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 648.6.3,1.64min(方法A)。
(S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺。
為製備此化合物，遵循關於一般Cbz保護基脫除描述之程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 514.6,1.40min(方法A)。
(3R,4R)-3-((((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。 藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 715.6,1.65min(方法A)。
(3R,4R)-3-((1-((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 817.5,1.59min(方法A)。
合成實例22. 環丙醇-核心骨架合成
以(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(1-羥基環丙基)乙酸為起始 物，根據所述方案進行製備：Esposito,A.；Paolo-Piras,P.；Ramazzotti,D.；Taddei,M.Org.Lett. 2001,3,3273-3275。
(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)乙酸。
向(R)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(1-羥基環丙基)乙酸(3g，11.3mmol，1eq)及咪唑(2.3g，34mmol，3eq)於DMF(23mL)中之溶液中添加TBSCl(4.3g，28.3mmol，2.5eq)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應混合物分配於EtOAc(100mL)與HCl(1.0M,100mL)之間。有機層經分離，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑，生成黃色油狀物。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 380.3,1.25min(方法A)。
2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)-2-(1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)乙酸(R)-2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 534.4,1.51min(方法A)。
(S)-((1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)胺基甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 514.8,1.47min(方法A)。
(S)-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)甲基)胺基甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 604.1,1.64min(方法A)。
(S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)甲胺。
為製備此化合物，遵循關於一般Cbz保護基脫除描述之程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 470.3,1.26min(方法A)。
(3R,4R)-3-((((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)甲基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 706.4,1.62min(方法A)。
(3R,4R)-3-((1-((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 807.6,1.60min(方法A)。
(3R,4R)-3-((1-((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)環丙基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的保護基交換程序(Cbz保護基脫除，Boc保護)。藉由正相層析(PrepLC方法B)純化粗產物。
Cbz保護基脫除：LC/MS(uplc)：M+ 672.4,1.25min(方法A)。
Boc保護：LC/MS(uplc)：M+ 772.7.1.61min(方法A)。
合成實例23. 2-甲氧基丙基-核心骨架合成
(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-甲氧基-3-甲基丁酸。
向NaH(60%礦物油，2.5g，64.mmol，3eq)及(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-羥基-3-甲基丁酸(5g，21.4mmol，1eq)於THF中之冰冷卻溶液中添加MeI(1.6mL，25.7mmol，1.2eq)且反應混合物在室溫下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應物用HCl(1.0M)淬滅，直至pH=3。粗反應物分配於EtOAc(100mL)與HCl(1.0M,100mL)之間，分離兩層，且有機層用HCl(1.0M,3 x 100mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑，生成(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-甲氧基-3-甲基丁酸。粗產物不經任何進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(uplc)：MH+ 248.2,0.79mi(方法D，極性方法)。
2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-甲氧基-3-甲基丁酸(R)-2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 402.2,1.20min(方法A)。
(S)-(1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)胺基甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 382.3,1.08min(方法A)。
(S)-(1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)胺基甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 472.4,1.44min(方法A)。
(S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙-1-胺。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 372.4,0.88min(方法A)。
(3R,4R)-3-((((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 573.7,1.38min(方法A)。
(3R,4R)-3-((1-((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 674.4,1.34min(方法A)。
(3R,4S)-3-((((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
向(S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙-1-胺(0.7g，0.72mmol)及三乙醯氧基硼氫化鈉(8.1g，38mmol)於CH2Cl2(3mL)中之溶液中添加含(3S,4R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯之CH2Cl2(1mL)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應混合物分配於CH2Cl2與H2O之間。有機層經分離且用飽和NaHCO3溶液(兩次)及H2O(兩次)洗滌，接著經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物，生成(3R,4S)-3-((((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(250mg，0.33mmo,46%)。LC/MS(uplc)：MH+ 685.9,1.76min(方法A)。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：M+ 799.5,1.69min(方法A)。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
向(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(108mg，0.13mmol，1eq)於THF(2mL)中之溶液中添加TBAF(1.0M於THF中，0.15mmol，1.1eq)。在藉由LC/MS(uplc，方法)發現反應完成時，反應物分配於NH4Cl(飽和溶液)與CH2Cl2之間。有機層經分離且用NaCl(飽和溶液)洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 685.6,1.34min(方法A)。
(3R,4S)-3-(((S)-N-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法B)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 643.3,1.30min(方法A)。
(S)-N-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-2-羥基-N-(((3S,4S)-4-羥基吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法B)純化粗產物。17.6mg，0.031mmol，71%。
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 7.93-7.87(1H,m),7.80-7.71(1H,m),7.45-7.28(6H,m),7.15-7.06(1H,m),6.00-5.87(1H,m),5.46-5.31(1H,m),5.18-5.05(1H,m),4.93-4.77(2H,m),4.77-4.64(1H,m),3.69-3.53(3H,m),2.95-2.83(3H,m),2.75-2.63(1H,m),2.39-2.28(1H,m),2.26-2.07(1H,m),1.59-1.45(1H,m),1.44-1.34(3H,m),1.33-1.22(3H,m),1.21-1.12(1H,m),0.79-0.69(3H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 543.3, 0.91min(方法A)。
合成實例24. 2-羥基丙基-核心骨架合成
2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-羥基-3-甲基丁酸(R)-2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。 粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 388.3,1.04min(方法A)。
(S)-(1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羥基-2-甲基丙基)胺基甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH+ 368.5,0.96min(方法A)。
(S)-(1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羥基-2-甲基丙基)胺基甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH2+ 459.5,1.36min(方法A)。
(S)-1-胺基-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲基丙-1-醇。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。粗產物不經任何進一步純化即使用。LC/MS(uplc)：MH2+ 359.3,0.80min(方法A)。
(3R,4R)-3-((((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羥基-2-甲基丙基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：MH+ 593.3,1.24min(方法A)。
(3R,4R)-3-((((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-2-甲基丙基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
向(3R,4R)-3-((((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羥基-2-甲基丙基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(1.5g，0.94mmol，1eq)於CH2Cl2(5mL)中之冰冷卻溶液中添加2,6-二甲基吡啶(0.7mL，5.7mmol，6eq)及TBSOTf(0.7mL，3.8mL，4eq)。反應 物在0℃下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法)發現反應完成時，反應物分配於H2O(20mL)與CH2Cl2(20mL)之間。有機層經分離，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由正相層析(PrepLC方法A)純化粗產物，生成所需產物(0.13mmol，130mg，14%)。LC/MS(uplc)：MH+ 707.3,1.70min(方法A)。
(3R,4R)-3-((1-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-2-甲基丙基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的程序。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。LC/MS(uplc)：M+ 808.4,1.64min(方法A)。
(3R,4R)-3-((1-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-2-甲基丙基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
為製備此化合物，遵循關於THP系列之類似化合物描述的保護基 交換程序(Cbz保護基脫除，Boc保護)。藉由正相管柱層析(PrepLC方法A)純化粗產物。
Cbz保護基脫除：LC/MS(uplc)：M+ 674.4,1.33min(方法A)。
Boc保護：LC/MS(uplc)：M+ 774.4. 1.66min(方法A)。
合成實例25. (3S,4R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
含(3S,4R)-3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(4.00g，16.18mmol)之DCM(54ml)相繼用咪唑(1.65g，24.3mmol)、第三丁基二甲基矽烷氯(2.93g，19.4mmol)處理，且反應混合物在室溫下攪拌16小時。混合物用飽和NH4Cl水溶液淬滅且有機層經DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，生成呈淺黃色油狀之標題化合 物，102%產率；UPLC-MS：Rt=1.56min；MS m/z[M+H]+ 362.2；方法A。
(3S,4S)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-((R)-1,2-二羥基乙基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
在0℃下向(3S,4R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(4.90g，13.6mmol)於第三丁醇(40ml)及水(28ml)之混合物中之溶液中緩慢添加過錳酸鉀(1.63g，10.3mmol)及氫氧化鈉(0.352g，8.81mmol)於水(10ml)中之溶液。反應混合物在0℃下攪拌1小時。用DCM萃取混合物。組合有機層，經Na2SO4乾燥，經矽藻土過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，64%產率；UPLC-MS：Rt=1.21min；MS m/z[M+H]+ 396.1；方法A。
(3S,4S)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-((R)-1,2-二羥基乙基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在氬氣下向(3S,4S)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-((R)-1,2-二羥基乙基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(3.41g，8.62mmol)於甲醇(55ml)中之溶液中相繼添加10%鈀/碳(0.917g，0.862mmol)、甲酸銨(6.52 g，103mmol)，且反應混合物在50℃下攪拌30分鐘。混合物接著冷卻至RT，經矽藻土過濾且用甲醇洗滌。向濾液中添加二碳酸二第三丁酯(2.63g，12.1mmol)且反應混合物在RT下攪拌1小時。藉由蒸發移除甲醇且反應混合物接著用乙酸乙酯及飽和NaHCO3水溶液萃取。有機層接著用鹽水洗滌，且有機相經組合，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%(10%甲醇於DCM中)於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，85%產率；UPLC-MS：Rt=1.25min；MS m/z[M+H]+ 362.1；方法A。
(3S,4R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下向(3S,4S)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-((R)-1,2-二羥基乙基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(2.95g，8.16mmol)於甲醇(44ml)及水(11ml)之混合物中之溶液中添加高碘酸鈉(2.09g，9.79mmol)，且反應混合物在RT下攪拌45分鐘。過濾反應混合物且藉由蒸發移除甲醇。添加水(15ml)，且反應物用DCM萃取。有機層經組合，經Na2SO4乾燥，經由矽藻土過濾且濃縮至乾，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，100%產率：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 9.69(1H,br s),4.57-4.53(1H,m),3.71-3.49(3H,m),3.24-3.19(1H,m),3.01-2.95(1H,m),1.45(9H,s),0.88(9H,s),0.08(6H,s)。
(3R,4S)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶- 1-甲酸第三丁酯
向三乙醯氧基硼氫化鈉(5.77g，27.2mmol)於DCM(14ml)中之溶液中添加(R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺(2.09g，5.44mmol)。向反應混合物中緩慢添加(3S,4R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(2.69g，8.16mmol)於DCM(14ml)中之溶液，且反應混合物在RT下攪拌16小時。混合物接著藉由添加水淬滅且反應混合物用1M Na2S2O3水溶液及DCM萃取。有機層用飽和NaHCO3水溶液洗滌，接著用鹽水洗滌。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，95%產率；UPLC-MS：Rt=1.64min；MS m/z[M+H]+ 697.8；方法A。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下，向(3R,4S)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪 唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.79g，2.57mmol)於無水DCM(26ml)中之溶液中緩慢地相繼添加N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(0.63mL，3.60mmol)、(S)-乙酸1-氯-1-側氧基丙-2-基酯(0.36mL，2.83mmol)。反應混合物在0℃下攪拌5分鐘，接著使其溫至RT，且再攪拌1.5小時。反應用飽和NaHCO3水溶液淬滅且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，88%產率；UPLC-MS：Rt=1.63min；MS m/z[M+H]+ 811.2；方法A。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.92g，2.37mmol)於THF(12ml)中之溶液中緩慢添加四丁基氟化銨(0.619g，2.37mmol)。反應混合物在RT下攪拌30分鐘。反應用飽和NH4Cl水溶液淬滅且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，66%產率；UPLC-MS：Rt=1.25 min；MS m/z[M+H]+ 696.9；方法A。
(3S,4R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
以與實例25類似之方式，改為使用(3R,4S)-3-羥基-4-乙烯基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯來合成產物；105%產率；UPLC-MS：Rt=1.63min；MS m/z[M+H]+ 697.0；方法A。
(3S,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
定量產率；UPLC-MS：Rt=1.63min；MS m/z[M+H]+ 811.0；方法A。
(3S,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
32%產率；UPLC-MS：Rt=1.26min；MS m/z[M+H]+ 696.9；方法E。
合成實例26。 (R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙-1-胺
如WO2008086122 A2,2008；P.50-52中所述加以製備。
(3R,4S)-3-((((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
以與實例1類似之方式，使用(R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙-1-胺來合成產物；93%產率；UPLC-MS：Rt=2.66min；MS m/z[M+H]+ 669.5；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
39%產率；UPLC-MS：Rt=3.86min；MS m/z[M+H]+ 783.6；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
43%產率；UPLC-MS：Rt=2.96min；MS m/z[M+H]+ 669.4；方法E。
合成實例27。
(3R,4S)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((R)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向光氣(20%於甲苯中，0.76mL，1.4mmol)於DCM(7.2mL)中之溶液中添加(3R,4S)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(0.50g，0.717mmol)及三乙胺(0.30mL，2.15mmol)於DCM(7.2mL)中之溶液。反應混合物在室溫下攪拌45分鐘。添加L-丙胺醇(1.26mL，16.1mmol)且反應在40℃下攪拌16小時。反應濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，76%產率；UPLC-MS：Rt=1.54min；MS m/z[M+H]+ 797.9；方法A。
(3R,4S)-3-((3-((R)-1-乙醯氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在RT下向(3R,4S)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((R)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(0.43g，0.539mmol)於無水DCM(5.4ml)中之溶液中緩慢地相繼添加吡啶(0.87mL，10.8mmol)、乙酸酐(1.01mL，10.8mmol)。反應混合物在RT下攪拌16小時。反應濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，89%產率；UPLC-MS：Rt=1.60min；MS m/z[M+H]+ 840.0；方法A。
(3R,4S)-3-((3-((R)-1-乙醯氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
以與實例1類似之方式合成產物；76%產率；UPLC-MS：Rt=1.23min；MS m/z[M+H]+ 725.9；方法A。
合成實例28。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下，向(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4- 羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.32g，1.89mmol)於DCM(19ml)中之溶液中相繼添加甲烷磺醯氯(0.74mL，9.47mmol)、三乙胺(1.3mL，9.47mmol)，且反應混合物在0℃下攪拌1.5小時。反應濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，47%產率；UPLC-MS：Rt=2.67min；MS m/z[M+H]+ 775.5；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(693mg，0.894mmol)於MeOH(9ml)中之溶液中添加碳酸鉀(148mg，1.07mmol)，且反應混合物在RT下攪拌30分鐘。反應物用鹽水稀釋且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到定量產率之呈淺黃色固體狀之粗標題化合物且無需進一步純化即用於下一步驟中；UPLC-MS：Rt=2.54min；MS m/z[M+H]+ 733.4；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(655mg，0.894mmol)於DCM(8.9ml)中之溶液中相繼添加1H-咪唑(0.91mg，1.34mmol)、第三丁基氯二甲基矽烷(202mg，1.34mmol)及DMAP(1mg，催化劑)，且反應混合物在RT下攪拌4小時。再相繼添加第三丁基氯二甲基矽烷(229mg，1.52mmol)、1H-咪唑(0.55mg，0.804mmol)，且反應再攪拌2天。反應物用鹽水稀釋且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈灰白色固體狀之標題化合物，36%產率；UPLC-MS：Rt=3.32min；MS m/z[M+H]+ 847.6；方法E。
(3R,4R)-3-乙醯氧基-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(52mg， 0.061mmol)於DMF(0.6ml)中之溶液中添加乙酸鉀(12mg，0.123mmol)，且反應混合物在110℃下攪拌2小時。反應冷卻至RT且用水稀釋，且用MTBE萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，生成88%產率之呈黃色固體狀之粗產物，其無需進一步純化即用於下一步驟中；UPLC-MS：Rt=3.41min；MS m/z[M+H]+ 811.6；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4R)-3-乙醯氧基-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(44mg，0.054mmol)於MeOH(0.55ml)中之溶液中添加碳酸鉀(8mg，0.054mmol)，且反應混合物在RT下攪拌20分鐘。反應濃縮至乾，得到定量產率之呈淺黃色固體狀之標題化合物且無需進一步純化即用於下一步驟中；UPLC-MS：Rt=3.17min；MS m/z[M+H]+ 769.6；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下，向(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(160mg，0.208mmol)於DCM(2.1ml)中之溶液中添加甲烷磺醯氯(0.08mL，1.04mmol)及三乙胺(0.15mL，1.04mmol)，且反應混合物在0℃下攪拌1.5小時。反應混合物濃縮至乾，且藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，85%產率；UPLC-MS：Rt=3.27min；MS m/z[M+H]+ 847.6；方法E。
(3S,4R)-3-疊氮基-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)-4-((甲基磺醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(149mg，0.176mmol)於DMF(1.8ml)中之溶液中添加疊氮化鈉(0.014g，0.211mmol)，且反應混合物在65℃下攪拌18小時。反應用水淬滅且用TBME萃取，且有機萃取物經組合，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至 乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，72%產率；UPLC-MS：Rt=3.55min；MS m/z[M+H]+ 794.6；方法E。
合成實例29。
3-(1-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-甲氧基-2-側氧基亞乙基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯
向3-側氧基氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯(5.0g，24.4mmol)及2-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)乙酸甲酯(7.24g，24.4mmol)於DCM(122ml)中之溶液中逐滴添加2,3,4,6,7,8,9,10-八氫嘧啶并[1,2-a]氮呯(4.4mL，29.2mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1小時。反應濃縮至乾。添加水且反應藉由添加2N HCl水溶液變為酸性。隨後用EtOAc萃取反應物。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，88%產率；UPLC-MS：Rt=2.24min；MS m/z[M+Na]+ 399.1；方法E；
3-(1-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-甲氧基-2-側氧基乙基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯
在氬氣下向3-(1-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-甲氧基-2-側氧基亞乙基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯(8.0g，21.3mmol)於EtOAc(47ml)中之溶液中添加10%鈀/碳(3.39g，3.19mmol)。該氛圍由氫氣置換且所得反應混合物在RT下攪拌2小時。反應經由矽藻土過濾且接著濃縮至乾。殘餘物溶解於DCM(48ml)中，接著在0℃下添加三乙胺(5.9 mL，42.5mmol)及氯甲酸苯甲酯(4.8mL，31.9mmol)。反應在RT下攪拌72小時。反應用2N HCl水溶液酸化且反應用DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，35%產率；UPLC-MS：Rt=1.03min；MS m/z[M+H]+ 379.4；方法A。
2-(1-((苯甲氧基)羰基)氮雜環丁烷-3-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)乙酸
在0℃下向3-(1-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-甲氧基-2-側氧基乙基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯(2.71g，7.16mmol)於甲醇(36ml)中之溶液中逐滴添加碳酸鉀(1.98g，14.3mmol)於水(36ml)中之溶液，且反應混合物在RT下攪拌18小時。在減壓下移除甲醇且藉由添加10% HCl水溶液使溶液變為約6之pH。反應接著濃縮至乾。所得固體在RT下在200mL DCM中攪拌2小時且接著藉由過濾移除固體。濾液經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到89%產率之呈白色固體狀之標題化合物，其無需進一步純化即用於下一步驟中；UPLC-MS：Rt=0.92min；MS m/z[M-H]- 363.2；方法A。
3-(1-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙氧基)-2-側氧基乙基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯
以與實例13類似之方式，改為使用2-(1-((苯甲氧基)羰基)氮雜環丁烷-3-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)乙酸來合成產物；97%產率；UPLC-MS：Rt=2.53min；MS m/z[M+Na]+ 541.3；方法E。
3-(((第三丁氧基羰基)胺基)(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯
81%產率；UPLC-MS：Rt=1.82min；MS m/z[M+H]+ 499.3；方法E。
3-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯
42%產率；UPLC-MS：Rt=2.71min；MS m/z[M+H]+ 589.4；方法E。
(R)-3-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯
3-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯之外消旋混合物(4.12g)提交至巴塞爾分離實驗室(聯繫：Eric Francotte博士，Tel.+41 6169 62971)。獲得所需之對映異構體增濃之(R)-3-(胺基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯(1.51g，99.3%ee)及非所需(S)-3-(胺基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯(1.53g，98.0%ee)，74%回收率。藉由標題化合物之x射線結晶學確立絕對組態。
(R)-3-(胺基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸苯甲酯
定量產率；UPLC-MS：Rt=1.93min；MS m/z[M+H]+ 489.3；方法E。
(3R,4R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((苯甲氧基)羰基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三 丁酯
34%產率；UPLC-MS：Rt=2.27min；MS m/z[M+H]+ 690.5；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((苯甲氧基)羰基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
87%產率；UPLC-MS：Rt=3.05min；MS m/z[M+H]+ 804.5；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-氮雜環丁烷-3-基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在氬氣下，向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4- (2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((苯甲氧基)羰基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(820mg，1.02mmol)於甲醇(10.2ml)中之溶液中相繼添加10%鈀/碳(54mg，0.051mmol)、甲酸銨(772mg，12.2mmol)，且反應混合物在RT下攪拌2小時。反應經由矽藻土過濾且濃縮至乾。添加飽和NaHCO3水溶液且反應用DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% MeOH於DCM中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，83%產率；UPLC-MS：Rt=1.92min；MS m/z[M+H]+ 670.4；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-氮雜環丁烷-3-基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下，向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-氮雜環丁烷-3-基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(571mg，0.853mmol)於甲醇(2.8ml)中之溶液中緩慢添加NaBH4(213mg，5.63mmol)，且反應混合物在0℃下攪拌7小時。反應藉由在0℃下逐滴添加飽和NH4Cl水溶液來淬滅且反應用DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由逆相層析(5% TFA於MeCN中/5% TFA於水中)純化粗產物，在凍乾後得到呈淺黃色固體狀之標題化合物的TFA鹽，35%產率；UPLC-MS：Rt=1.79min；MS m/z[M+H]+ 628.0；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-乙醯基氮雜環丁烷-3-基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
產物作為合成(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-氮雜環丁烷-3-基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯之副產物獲得；19%產率；UPLC-MS：Rt=2.27min；MS m/z[M+H]+ 670.3；方法E。
合成實例30。
2-(1-((苯甲氧基)羰基)哌啶-4-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)乙酸
如WO02076450 A1,2002；P.66中所述加以製備。
4-(1-((第三丁氧基羰基)胺基)-2-(2-(2,5-二氟苯基)-2-側氧基乙氧基)-2-側氧基乙基)哌啶-1-甲酸苯甲酯
以與實例13類似之方式，改為使用2-(1-((苯甲氧基)羰基)哌啶-4-基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)乙酸來合成產物；96%產率；UPLC-MS：Rt=1.27min；MS m/z[M-H]- 545.0；方法A。
4-(((第三丁氧基羰基)胺基)(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯
103%產率；UPLC-MS：Rt=1.22min；MS m/z[M-H]- 525.1；方法A。
4-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯
45%產率；UPLC-MS：Rt=1.45min；MS m/z[M+H]+ 617.5；方法A。
(R)-4-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯
4-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯之外消旋混合物(6.00g)提交至巴塞爾分離實驗室(聯繫：Eric Francotte博士，Tel.+41 6169 62971)。獲得所需之對映異構體增濃之(R)-4-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯(1.91g，>99.5%ee)及非所需(S)-4-((1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯(2.20g，>99.5%ee)，69%回收率。藉由標題化合物之x射線結晶學確立絕對組態。
(R)-4-(胺基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲 酸苯甲酯
定量產率；UPLC-MS：Rt=2.01min；MS m/z[M+H]+ 517.3；方法E。
4-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯
79%產率；UPLC-MS：Rt=2.32min；MS m/z[M+H]+ 718.4；方法E。
4-((R)-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸苯甲酯
76%產率；UPLC-MS：Rt=3.15min；MS m/z[M+H]+ 832.5；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(哌啶-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
56%產率；UPLC-MS：Rt=1.94min；MS m/z[M+H]+ 698.4；方法E。
合成實例31。
(3S,4S)-3-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
如WO06066896,2006；P.385-388中所述加以製備
(3R,4S)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H- 哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3S,4S)-3-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(5.23g，15.1mmol)於無水DCM(38ml)中之溶液中添加戴斯-馬丁高碘烷(12.84g，30.3mmol)，且所得混合物在RT下攪拌1.5小時。此溶液接著添加至(R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲胺(5.80g，15.1mmol)及三乙醯氧基硼氫化鈉(16.0g，76.0mmol)於DCM(38ml)中之懸浮液中。所得混合物在RT下攪拌18小時。混合物接著藉由添加水淬滅且反應混合物用1M Na2S2O3水溶液及DCM萃取。有機層用飽和NaHCO3水溶液洗滌，接著用鹽水洗滌。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈黃色油狀之標題化合物，51%產率；UPLC-MS：Rt=1.61min；MS m/z[M+H]+ 711.4；方法A。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在0℃下，向(3R,4S)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(3.9g，5.49mmol)於DCM(55ml)中之溶液中相繼添加二異丙基乙胺(1.34mL，7.68mmol)、(S)-乙酸1-氯-1-側氧基丙-2-基酯(0.83mL，6.58mmol)，且使反應混合物溫至RT且攪拌16小時。反應用DCM萃取且用飽和NaHCO3水溶液洗滌。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，78%產率；UPLC-MS：Rt=3.54min；MS m/z[M+H]+ 825.6；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(3.55g，4.30mmol)於THF(21.5ml)中之溶液中添加TBAF(1.69g，6.45mmol)，且反應混合物在RT下攪拌2小時。反應用飽和NH4Cl水溶液稀釋且反應用DCM萃取，且有機層用鹽水洗滌。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，79%產率； UPLC-MS：Rt=2.42min；MS m/z[M+H]+ 711.4；方法E。
(3S,4R)-4-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-1-甲酸
在0℃下，向(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(300mg，0.422mmol)於丙酮(2.1ml)中之溶液中逐滴添加含2M三氧化鉻之H2SO4水溶液(1.3mL，3.93mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1小時。過量瓊斯試劑藉由在0℃下逐滴添加異丙醇(4ml)來淬滅。反應濃縮至乾。添加水，且反應物用EtOAc萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到81%產率之呈固體狀之標題化合物，其無需進一步純化即用於下一步驟中；UPLC-MS：Rt=0.65min；MS m/z[M+H]+ 312.1；方法A。
合成實例32。
3-(2-(((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺甲醯基)苯基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向2-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基)苯甲酸(152mg，0.523mmol)於DMF(1.5ml)中之溶液中添加HATU(248mg，0.653mmol)、二異丙基乙胺(0.22mL，1.31mmol)及(R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-胺(160mg，0.435mmol)，且所得反應混合物在RT下攪拌1小時。反應濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈無色固體狀之非對映異構體混合物，77%產率；UPLC-MS：Rt=2.93及2.96min；MS m/z[M+H]+ 641.3；方法E。
3-(2-(((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)胺甲醯基)苯基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
以與實例14類似之方式合成產物；67%產率(非對映異構體混合物)；UPLC-MS：Rt=2.54及2.58min；MS m/z[M+H]+ 659.3；方法E。
(4R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(2-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基)苯甲醯胺基)-3,3-二甲基丁酸
28%產率(非對映異構體混合物)；UPLC-MS：Rt=2.64及2.65min；MS m/z[M+H]+ 673.1；方法E。
合成實例33。 3-(2-(甲氧基羰基)苯氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
向2-氟苯甲酸甲酯(0.83mL，6.49mmol)於DMF(16.2ml)中之溶液中添加3-羥基氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(1.124g，6.49mmol)及碳酸銫(10.6g，32.4mmol)，且反應混合物在75℃下攪拌18小時。反應用水及DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈無色油狀之標題化合物，17%產率；UPLC-MS：Rt=2.10min；MS m/z[M+Na]+；方法E。
2-((1-(第三丁氧基羰基)氮雜環丁烷-3-基)氧基)苯甲酸
向3-(2-(甲氧基羰基)苯氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯(325mg，1.06mmol)於甲醇(4.4ml)及水(0.9ml)中之溶液中添加氫氧化鋰(127mg，5.29mmol)，且反應混合物在RT下攪拌18小時。反應用1M HCl水溶液及DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到呈無色固體狀之標題化合物，94%產率；UPLC-MS：Rt=171min；MS m/z[M+Na]+ 330.0；方法E。
(R)-3-(2-((1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺甲醯基)苯氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
以與實例9類似之方式合成產物；103%產率；UPLC-MS：Rt=2.95min；MS m/z[M+H]+ 643.2；方法E。
(R)-3-(2-((1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)胺甲醯基)苯氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
30%產率；UPLC-MS：Rt=2.53min；MS m/z[M+H]+ 661.2；方法E。
(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(2-((1-(第三丁氧基羰基)氮雜環丁烷-3-基)氧基)苯甲醯胺基)-3,3-二甲基丁酸
32%產率；UPLC-MS：Rt=2.67min；MS m/z[M+H]+ 675.1；方法E。
合成實例34。
(R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
以與實例4類似之方式合成產物；79%產率；UPLC-MS：Rt=1.15min；MS m/z[M+H]+ 566.9；方法A。
(R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
91%產率；UPLC-MS：Rt=1.25min；MS m/z[M+H]+ 667.9；方法A。
額外有效負載實例： (3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(150mg，0.215mmol)於甲醇(1.1ml)中之溶液中添加碳酸鉀(36mg，0.258mmol)，且反應混合物在RT下攪拌18小時。反應用飽和NH4Cl水溶液及DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到呈透明油狀之標題化合物，定量產率；UPLC-MS：Rt=1.20min；MS m/z[M+H]+ 655.5；方法A。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基-N-(((3S,4S)-4-羥基吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；61%產率；UPLC-MS：Rt=0.78min；MS m/z[M+H]+ 555.5；方法A。
(3S,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
使用與(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯 啶-1-甲酸第三丁酯類似之方案產生產物；定量產率；UPLC-MS：Rt=1.19min；MS m/z[M+H]+ 655.0；方法A。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基-N-(((3R,4R)-4-羥基吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；54%產率；UPLC-MS：Rt=0.79min；MS m/z[M+H]+ 555.5；方法A。
(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
使用與(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯類似之方案產生產物；定量產率；UPLC-MS：Rt=2.88min；MS m/z[M+H]+ 627.3；方法E。
(S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)-2-羥基-N-(((3S,4S)-4-羥基吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；67%產率，呈TFA鹽；UPLC-MS：Rt=1.94min；MS m/z[M+H]+ 527.2；方法E。1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體之混合物)：δ 7.88-7.87(1H,m),7.81-7.76(1H,m),7.41-7.28(7H,m),7.12-7.06(1H,m),5.80(1H,s),5.59-5.58(1H,m),5.34-5.30(1H,m),5.05-4.95(2H,m),4.72-4.65(1H,m),3.93-3.87(1H,m),3.75-3.66(2H,m),3.08-3.03(1H,m),2.73-2.64(1H,m),2.18-2.14(1H,m),1.75-1.58(1H,m),1.30-1.28(3H,m),0.80(9H,s)。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((戊基胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(S)-乙酸1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4S)-4-羥基吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯(4.6mg，0.0066mmol)及二異丙基乙胺(0.0011mL，0.066mmol)於無水DMF(0.07ml)中之溶液中添加碳酸雙(4-硝基苯基)酯(4.5mg，0.015mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1小時。添加戊胺 (0.003mL，0.027mmol)且反應在RT下攪拌1.5小時。反應用水及EtOAc萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，99%產率；UPLC-MS：Rt=1.16min；MS m/z[M+H]+ 810.5；方法E。
戊基胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
使用保護基脫除之一般方案1使產物脫除保護基；43%產率；UPLC-MS：Rt=1.96min；MS m/z[M+H]+ 668.5；方法E；1H-NMR(CDCl3,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.71(2H,br),7.72-7.67(1H,m),7.40-7.13(7H,m),7.04-6.92(1H,m),6.85-6.78(1H,m),5.67-5.64(1H,m),5.32-4.86(3H,m),4.65-4.38(1H,m),3.89-1.72(15H,m),1.51-1.07(13H,m),0.84-0.58(3H,m)。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(戊基胺甲醯基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向戊胺(0.023mL，0.119mmol)於DCM(0.18ml)中之溶液中相繼添加HATU(88mg，0.232mmol)、(3S,4R)-4-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-甲酸(80mg，0.110mmol)於DMF(0.18ml)中之溶液，且反應混合物在RT下攪拌1小時。反應用水及EtOAc萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物，定量產率；UPLC-MS：Rt=1.35min；MS m/z[M+H]+ 794.2；方法E。
(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-N-戊基吡咯啶-3-甲醯胺
使用保護基脫除之一般方案1使產物脫除保護基；43%產率，呈TFA鹽；UPLC-MS：Rt=0.94min；MS m/z[M+H]+ 652.5；方法A；1H-NMR(CDCl3,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 10.31(1H,br),8.78(1H,br),7.94-7.66(1H,m),7.51-7.42(1H,m),7.32-7.24(2H,m),7.17-7.15(2H,m),7.01-6.91(2H,m),6.84-6.80(1H,m),5.61-5.58(1H,m),5.20-5.16(1H,m),5.05-5.01(1H,m),4.67-4.49(1H,m),3.86-3.83(1H,m),3.63-2.54(14H,m),2.05-1.96(1H,m),1.44-1.36(2H,m),1.32-1.13(10H,m),0.83-0.80(3H,m)。
(R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
以與實例類似之方式，使用(R)-3-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯合成產物；59%產率；UPLC-MS：Rt=1.36min；MS m/z[M+H]+ 680.9；方法A。
(R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
88%產率；UPLC-MS：Rt=2.55min；MS m/z[M+H]+ 639.4；方法E。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基-N-((S)-吡咯啶-3-基甲基)丙醯胺
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；50eq；70%產 率；UPLC-MS：Rt=0.81min；MS m/z[M+H]+ 538.8；方法A；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 7：87-7.82(1H,m),7.51-7.52(1H,m),7.40-7.23(4H,m),7.09-7.03(2H,m),6.92-6.86(1H,m),5.75-5.72(1H,m),5.36-5.32(1H,m),5.10-5.06(1H,m),4.57-4.52(1H,m),3.99-3.96(1H,m),3.80-3.76(1H,m),3.52-3.21(4H,m),2.97-2.91(1H,m),2.78-2.69(2H,m),2.55-2.50(1H,m),2.08-2.04(1H,m),1.67-1.60(2H,m),1.50-1.47(1H,m),1.42-1.28(6H,m),0.90-0.80(1H,m)。
1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)-1-((S)-吡咯啶-3-基甲基)脲
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；50eq TFA；60%產率；UPLC-MS：Rt=0.82min；MS m/z[M+H]+ 584.3；方法A；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 7.84-7.82(1H,m),7.47-7.46(1H,m),7.35-7.24(5H,m),7.05-6.99(1H,m),6.85-6.84(1H,m),5.92(1H,s,br),5.50-5.43(2H,m),5.10-5.03(1H,m),3.99-2.07(17H,m),1.64-0.75(9H,m)。
(S)-N-((R)-(1-乙醯基氮雜環丁烷-3-基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；50eq；45%產率；UPLC-MS：Rt=1.45min；MS m/z[M+H]+ 570.1；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.07(1H,s,br),8.72(1H,s,br),7.83-7.66(2H,m),7.44-7.28(5H,m),7.15-7.10(1H,m),7.03-6.98(1H,m),6.23-5.65(1H,m),5.52-5.10(3H,m),4.54-4.44(1H,m),4.34-2.69(11H,m),2.44-2.11(2H,m),1.70-1.55(3H,m),1.30-0.98(3H,m)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(甲氧基羰基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-氮雜環丁烷-3-基(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(20mg，0.027mmol)於DCM(0.27ml)中之溶液中添加氯甲酸甲酯(0.0042mL，0.054mmol)、三乙胺(0.015mL，0.108mmol)及DMAP(0.3mg，0.003mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1.5小時。反應用飽和NaHCO3水溶液及DCM萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥， 過濾且濃縮至乾，得到呈無色固體狀之標題化合物，124%產率；UPLC-MS：Rt=2.51min；MS m/z[M+H]+ 686.2；方法E。
3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸甲酯
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；50eq；48%產率；UPLC-MS：Rt=1.63min；MS m/z[M+H]+ 586.1；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.05(1H,s,br),8.65(1H,s,br),7.83-7.66(2H,m),7.43-7.29(5H,m),7.15-7.10(1H,m),7.00-6.98(1H,m),6.24-5.71(1H,m),5.51-5.09(3H,m),4.52-4.43(1H,m),4.22-2.76(14H,m),2.47-2.10(2H,m),1.29-0.97(3H,m)。
4-((R)-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸4-硝基苯酯
向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(哌啶-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(80mg，0.115mmol)於無水DMF(0.57ml)中之溶液中添 加二異丙基乙胺(0.20mL，1.15mmol)及碳酸雙(4-硝基苯基)酯(70mg，0.229mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1小時。反應用水及EtOAc萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到淺黃色固體，138%產率；UPLC-MS：Rt=1.44min；MS m/z[M+H]+ 863.0；方法A。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(戊基胺甲醯基)哌啶-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
4-((R)-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸4-硝基苯酯(120mg，0.139mmol)及戊胺(0.024mL，0.209mmol)於MeOH(0.7ml)中之溶液在微波中加熱至100℃並保持1小時。添加額外戊胺(0.048mL，0.417mmol)且反應混合物再在微波中加熱至100℃並保持1小時。該循環再重複3次，直至反應完成。接著添加碳酸鉀(23mg，0.167mmol)且反應在RT下攪拌18小時。反應接著用飽和NH4Cl水溶液及DCM萃取，接著用飽和NaHCO3水溶液洗滌。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到呈黃色固體狀之標題化合物，60%產率；UPLC-MS：Rt=2.75min；MS m/z[M+H]+ 769.6；方法E。
4-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S,4R)-4- 氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-N-戊基哌啶-1-甲醯胺
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；50eq；50%產率，呈TFA鹽；UPLC-MS：Rt=1.86min；MS m/z[M+H]+ 669.4；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.11-9.02(1H,m),8.84(1H,br),7.86-7.68(2H,m),7.41-7.38(2H,m),7.35-7.31(1H,m),7.28-7.26(1H,m),7.15-7.07(2H,m),6.35-6.32(1H,br),5.62-5.02(4H,m),4.54-4.36(1H,m),4.01-3.18(9H,m),2.95-2.94(2H,m),2.69-2.02(4H,m),1.45-1.17(11H,m),0.94-0.84(5H,m),0.49-0.40(1H,m)。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-乙醯基哌啶-4-基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由與(S)-N-((R)-(1-乙醯基氮雜環丁烷-3-基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺之形成類似的反應產生產物；定量產率；UPLC-MS：Rt=2.53min；MS m/z[M+H]+ 740.5；方法A。
(S)-N-((R)-(1-乙醯基哌啶-4-基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
使用保護基脫除之一般方案1使產物脫除保護基；37%產率；UPLC-MS：Rt=1.46min；MS m/z[M+H]+ 598.4；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 8.97-8.80(1H,m),8.63-8.53(1H,m),7.79-7.62(2H,m),7.34-6.99(7H,m),5.59-5.44(1H,m),5.33-4.95(3H,m),4.45-1.98(14H,m),1.88-1.79(3H,m),1.47-0.26(7H,m)。
4-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)哌啶-1-甲酸乙酯
藉由與(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(甲氧基羰基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯之形成類似的反應，改為使用氯甲酸乙酯來產生產物；定量產率；UPLC-MS：Rt=2.94min；MS m/z[M+H]+ 770.5；方法E。
4-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)哌啶-1-甲酸乙酯
使用保護基脫除之一般方案1使產物脫除保護基；24%產率；UPLC-MS：Rt=1.78min；MS m/z[M+H]+ 628.5；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.04-8.96(1H,m),8.68-8.59(1H,m),7.87-7.70(2H,m),7.42-7.07(7H,m),5.64-5.52(1H,m),5.41-5.02(3H,m),4.53-4.35(1H,m),4.03-3.18(11H,m),2.86-2.57(3H,m),2.27-2.06(1H,m),1.51-1.37(1H,m),1.31-0.40(9H,m)。
4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-2-酮
向4-(羥基甲基)吡咯啶-2-酮(1.00g，8.69mmol)於DCM(80ml)中之溶液中添加咪唑(887mg，13.0mmol)及第三丁基氯二甲基矽烷(1.57g，10.4mmol)，且反應混合物在RT下攪拌3小時。反應濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到透明油狀物，101%產率；UPLC-MS：Rt=1.95min；MS m/z[M+H]+ 230.0；方法E。
1-((苯甲氧基)甲基)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-2-酮
向4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-2-酮(2.00g，8.72mmol)於THF(29ml)中之溶液中添加氫化鈉(384mg，9.59mmol)，且反應在RT下攪拌30分鐘。接著添加((氯甲氧基)甲基)苯(2.05g，13.1mmol)且反應混合物在RT下攪拌18小時。反應用飽和NH4Cl水溶液淬滅且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到透明油狀物，11%產率；UPLC-MS：Rt=2.79min；MS m/z[M+Na]+ 372.2；方法E。
1-((苯甲氧基)甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-2-酮
向1-((苯甲氧基)甲基)-4-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)吡咯啶-2-酮(340mg，973mmol)於THF(3.2ml)中之溶液中添加TBAF(254mg，0.973mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1.5小時。反應用飽和NH4Cl水溶液淬滅且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到透明油狀物，90%產率；1H-NMR(CDCl3,400MHz)：δ 7.55-7.7.27(5H,m),4.89-4.85(2H,s),4.55-4.52(2H,s),3.65-3.53(3H,m),3.35-3.31(1H,m),2.56-2.48(2H,m),2.27-2.20(1H,m)。
4-((((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)胺基)甲基)-1-((苯甲氧基)甲基)吡咯啶-2-酮
以與實例1類似之方式，使用1-((苯甲氧基)甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-2-酮來合成產物，生成呈非對映異構體混合物之產物；36%產率；UPLC-MS：Rt=1.88min；MS m/z[M+H]+ 601.4；方法E。
乙酸(2S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)((1-((苯甲氧基)甲基)-5-側氧基吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
以與實例1類似之方式合成產物；35%產率；UPLC-MS：Rt=2.59min；MS m/z[M+H]+ 715.5；方法E。
(2S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-((1-((苯甲氧基)甲基)-5-側氧基吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
向乙酸(2S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)((1-((苯甲氧基)甲基)-5-側氧基吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯(72mg，0.101mmol)於甲醇(1.0ml)中之溶液中添加碳酸鉀(21mg，20.9mmol)，且反應混合物在RT下攪拌0.5小時。反應用飽和NH4Cl水溶液淬滅且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾，得到呈淺黃色固體狀之產物，95%產率；UPLC-MS：Rt=1.21min；MS m/z[M+H]+ 673.3；方法A。
(2S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基-N-((5-側氧基吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺
向(2S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-((1-((苯甲氧基)甲基)-5-側氧基吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺(65mg，0.096mmol)於DCM(1.0ml)中之溶液中逐滴添加1.25M HCl之MeOH溶液(1.22mL，1.53mmol)，且反應混合物在60℃下攪拌18小時。反應用飽和NaHCO3水溶液淬滅且用DCM萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到標題化合物，13%產率；UPLC-MS：Rt=0.97min；MS m/z[M+H]+ 553.4；方法A；1H-NMR(CDCl3,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 7.76-7.70(1H,m),7.45-7.42(1H,m),7.29-7.24(3H,m),7.14-7.13(2H,m),7.00-6.92(1H,m),6.83-6.79(1H,m),5.66-5.63(1H,m),5.25-5.19(1H,m),5.01-4.95(1H,m),4.33-4.26(1H,m),3.90-3.87(1H,m),3.71-3.68(1H, m),3.54-3.08(5H,m),2.91-2.74(1H,m),2.68-2.59(1H,m),2.35-0.71(8H,m)。
(R)-3-(2-((1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-4-側氧基-4-(戊基胺基)丁基)胺甲醯基)苯氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
向(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(2-((1-(第三丁氧基羰基)氮雜環丁烷-3-基)氧基)苯甲醯胺基)-3,3-二甲基丁酸(30mg，0.044mmol)於DMF(0.45ml)中之溶液中添加HATU(20.3mg，0.053mmol)、二異丙基乙胺(0.04mL，0.222mmol)及戊胺(0.006mL，0.049mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1小時。額外HATU(8.5mg，0.022mmol)、二異丙基乙胺(0.023mL，0.133mmol)及戊胺(0.005mL，0.044mmol)，且反應混合物在RT下攪拌0.5小時。反應用2M Na2CO3水溶液及EtOAc萃取。組合有機層，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100% EtOAc於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈無色固體狀之標題化合物，109%產率；UPLC-MS：Rt=2.72min；MS m/z[M+H]+ 744.3；方法E。
(R)-2-(氮雜環丁烷-3-基氧基)-N-(1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基-4-側氧基-4-(戊基胺基)丁基)苯甲醯胺
使用保護基脫除之一般方案2使產物脫除保護基；20eq TFA；83%產率(TFA鹽)；UPLC-MS：Rt=1.96min；MS m/z[M+H]+ 644.2；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 9.01-9.00(1H,m),8.94-8.85(2H,m),7.97-7.94(1H,m),7.78-7.74(1H,m),7.65-7.63(1H,m),7.59-7.58(1H,m),7.46-7.42(1H,m),7.38-7.24(6H,m),7.11-7.06(2H,m),6.82-6.80(1H,m),5.56-5.39(3H,m),5.18-5.12(1H,m),4.50-4.46(1H,m),4.40-4.36(1H,m),4.30-4.24(1H,m),4.18-4.12(1H,m),3.10-2.93(2H,m),2.77-2.74(1H,m),2.23-2.20(1H,m),1.38-1.31(2H,m),1.24-1.19(4H,m),1.09(3H,s),0.94(3H,s),0.83-0.79(3H,m)。
合成實例35. 苯甲基修飾。
(R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-胺，TFA鹽
11g(R)-(1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基甲酸第三丁酯及9mL TFA於150mL DCM中之溶液在室溫攪拌16小時。反應混合物在真空下濃縮且獲得18.8g棕色/綠色油狀物。此物質直接用於下一步驟中(假定100%轉化率及48.5%純度)。UPLC-MS：Rt=0.73min；MS m/z[M+H]+ 278.2；方法A。
(3R,4R)-3-((((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
步驟1：將(3R,4S)-3-氟-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(8.28g)於無水DCM(100mL)中之攪拌溶液置於氬氣氛圍下且藉由使用含有環境溫度水之水浴使溶液溫度保持恆定。(在類似反應中，發現溫度控制重要：若反應混合物之溫度較熱幾度，則以一定程度發生氟基去 除。類似地，若反應在較冷溫度(0℃-10℃)進行，則氧化反應不夠快。)接著一次性添加戴斯-馬丁高碘烷(15.85g)且反應混合物在(約)18℃攪拌20分鐘，且接著直接用於步驟2。
步驟2：步驟1之反應混合物經由0.45μm PTFE針筒過濾器過濾至(R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-胺，TFA鹽(18.84g)及三乙醯氧基硼氫化鈉(19.8g)於無水DCM(150mL)中之攪拌溶液中。註釋：此溶液先前經超音波處理以分散及溶解任何大塊三乙醯氧基硼氫化物。在氬氣氛圍下繼續攪拌，同時確保溫度不超過20℃(藉由使用自來水浴)。2小時之後，LC-MS顯示反應實際上完成31%轉化為所需產物。反應藉由添加去離子水(150mL)淬滅且所得漿液在RT劇烈攪拌1小時。所得無機固體經由1號濾紙過濾且濾液由逐份添加碳酸氫鈉緩慢地變為鹼性，同時亦劇烈攪拌。一旦碳酸氫鈉添加完成(未觀察到更多發泡)，將兩相溶液轉移至分液漏斗且分離各層。水層用二氯甲烷(2x100mL)再萃取。合併之有機物用飽和碳酸氫鹽(150ml)、飽和鹽水(150mL)洗，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成暗棕色油狀物。該物質直接如下純化：
系統：Biotage SP4正相純化系統
固定相：40+M矽石筒
二元溶劑系統：極性溶劑：20% v/v甲醇/二氯甲烷，非極性溶劑：二氯甲烷
梯度：0%非極性/極性溶劑維持25分鐘且接著經35分鐘之時期斜線上升至40%極性溶劑，且接著在此水準下再維持15分鐘，此時產物已經自管柱溶離。組合含產物之溶離份且在真空中濃縮，生成12.65g暗棕色玻璃狀油，藉由LCMS發現約47%純。UPLC-MS：Rt=1.15min；MS m/z[M+H]+ 514.3；方法A。
此物質直接用於下一步驟中。
(3R,4R)-3-((((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
在室溫下且在氬氣氛圍下，向(3R,4R)-3-((((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(12.65g)及甲烷磺酸3-(甲氧基甲氧基)苯甲酯(8.57g，根據Bioorg.Med.Chem. 2006,14,1771-1784製備)於無水DMF(100ml)中之溶液中添加碳酸鉀(8.02g)。裝配水冷凝器且混合物在75℃下攪拌3小時，此時LC-MS顯示反應完成。將反應混合物冷卻至室溫且分配於去離子水(120mL)與乙酸乙酯(120ml)之間。萃取之後，水相用乙酸乙酯(150mL)再萃取。經組合之有機物接著用飽和鹽水(120mL)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成暗棕色油狀物。粗產物產率：19.88g。該物質直接如下純化： 系統：Biotage SP4正相純化系統
固定相：40+M矽石筒
二元溶劑系統：極性溶劑：乙酸乙酯，非極性溶劑：正庚烷
逐步梯度：
1. 0%極性溶劑-->維持5分鐘
2. 0%極性溶劑-->經15分鐘斜線上升至5%極性溶劑
3. 5%極性溶劑-->維持10分鐘
4. 5%極性溶劑-->經10分鐘斜線上升至7%極性溶劑
5. 7%極性溶劑-->維持20分鐘
6. 7%極性溶劑-->經10分鐘斜線上升至12%極性溶劑
7. 12%極性溶劑-->維持3分鐘
8. 12%極性溶劑-->經10分鐘斜線上升至20%極性溶劑
9. 20%極性溶劑-->維持10分鐘
10. 20%極性溶劑-->經10分鐘斜線上升至25%極性溶劑
11. 25%極性溶劑-->維持30分鐘
所需產物在7%極性溶劑與12%極性溶劑之間開始自管柱溶離。組合含產物之溶離份且在真空中濃縮，得到棕色油狀物。產率：7.7g，藉由LC-MS發現65%純。UPLC-MS：Rt=1.25min；MS m/z[M+H]+ 664.5；方法A。
此物質直接用於下一步驟中
(3R,4R)-3-((((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯 類似於(3R,4R)-3-((((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯製備
UPLC-MS：Rt=5.73min；方法B。
此物質直接用於下一步驟中
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
(3R,4R)-3-((((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(3.85g)於無水DCM(50mL)中之溶液使用冰浴冷卻至0℃。向此溶液中添加DIPEA(1.978mL)及(S)-乙酸1-氯-1-側氧基丙-2-基酯(0.956mL，Fluka)，觀察到渾濁發煙。使該暗橙色反應混合物溫至室溫且繼續攪拌1小時，此時LC-MS顯示反應完成，轉化為所需產物。在高真空下移除揮發物且粗物質直接如下純化： 系統：Biotage SP4正相純化系統
固定相：40+M矽石筒
二元溶劑系統：極性溶劑：乙酸乙酯，非極性溶劑：正庚烷
逐步梯度：
1. 0%極性溶劑-->維持10分鐘
2. 0%極性溶劑-->經20分鐘斜線上升至46%極性溶劑
3. 46%極性溶劑-->維持30分鐘。截至此階段，所有所需產物均 已經自管柱溶離。操作在此時刻停止。
組合含產物之溶離份且在真空中濃縮，得到棕色油狀物。
產率：2.545g，藉由LC-MS發現95%純。UPLC-MS：Rt=1.49min；MS m/z[M+H]+ 777.5；方法A。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
(3R,4R)-3-((((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(1.2g)於無水DCM(20mL)中之溶液使用冰浴冷卻至0℃。向此溶液中添加DIPEA(0.822mL)及(S)-乙酸1-氯-1-側氧基丙-2-基酯(0.397mL,Fluka)，觀察到渾濁發煙。使該暗橙色反應混合物溫至室溫且繼續攪拌1小時，此時LC-MS顯示反應完成，轉化為所需產物。反應混合物接著分配於去離子水(100mL)與二氯甲烷(70ml)之間。萃取之後，水相用二氯甲烷(70mL)再萃取。經組合之有機物接著用飽和鹽水(100mL)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成暗棕色油狀物。產率：1.4g UPLC-MS：Rt=1.46min；MS m/z[M+H]+ 796.5；方法A。
該物質具有合適純度以直接用於下一步驟中，而無需進一步純 化。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(2.545g)於無水THF(25mL)中之溶液使用冰浴冷卻至0℃，且接著藉由逐滴添加1.0M硼烷THF複合物(12.45mL)來處理。使反應混合物溫至室溫且繼續攪拌4小時。反應混合物接著冷卻至0℃且過量硼烷藉由相繼添加1：1混合物THF：EtOH(70mL)、pH 7.0磷酸鹽緩衝溶液(90mL)及30%過氧化氫溶液(4.45mL)來淬滅。使反應混合物在室溫下攪拌16小時且接著將飽和鹽水(15ml)添加至混合物中。將混合物轉移至分液漏斗中且用乙酸乙酯(2x200ml)萃取。經組合之有機物用20% w/v Na2S2O5(3x80ml)、飽和鹽水(150ml)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成淺棕色蠟狀固體。
產率：2.5917g，藉由LC-MS發現61%純。該物質無需純化即用於下一步驟中。UPLC-MS：Rt=1.29min；MS m/z[M+H]+ 795.6；方法A。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
將(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丁-3-烯-1-基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(1.4g)於無水THF(25mL)中之溶液置於氬氣氛圍下且使用冰浴冷卻至0℃。其接著藉由逐滴添加1.0M硼烷THF複合物(6.27mL)來處理。使反應混合物溫至室溫且繼續攪拌4小時。混合物接著冷卻至0℃且過量硼烷藉由相繼添加1：1混合物THF：EtOH(70mL)、pH 7.0磷酸鹽緩衝溶液(90mL)及30%過氧化氫溶液(2.24mL)來淬滅。使混合物在室溫下攪拌16小時且接著將飽和鹽水(15ml)添加至混合物中。將混合物轉移至分液漏斗中且用乙酸乙酯(2x200ml)萃取。經組合之有機物用20% w/v Na2S2O5(2x80ml)、飽和鹽水(150ml)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成淺棕色蠟狀固體。產率：1.445g，藉由LC-MS發現74%純。該物質無需純化即用於下一步驟中。UPLC-MS：Rt=1.28min；MS m/z[M+H]+ 814.7；方法A。
(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
向已經氬氣淨化之(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(2.59g)於甲醇(50ml)中之溶液中添加甲酸銨(2.508g)及5wt%鈀/碳(423mg)。所得黑色懸浮液在氬氣氛圍下在50℃下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應完成。反應混合物經由1號濾紙過濾，且鈀催化劑濾餅用甲醇(2x30ml)及二氯甲烷(30ml)洗滌。濾液接著直接用於下一步驟中。(其假定100%轉化率，60%純度。)UPLC-MS：Rt=0.85min；MS m/z[M+H]+ 661.8；方法A。
(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲 基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
向已經氬氣淨化之(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(1.445g)於甲醇(20ml)中之溶液中添加甲酸銨(2.489g)及5wt%鈀/碳(280mg)。所得黑色懸浮液在氬氣氛圍下在50℃下攪拌1.5小時，此時LC-MS顯示反應完成。反應混合物經由1號濾紙過濾，且鈀催化劑濾餅用甲醇(2x30ml)及二氯甲烷(30ml)洗滌。濾液接著直接用於下一步驟中。(其假定100%轉化率，76%純度。)
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向新鮮製備之含(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯之濾液中添加額外甲醇(50mL)及BOC酐(0.864g)。反應混合物在RT下攪拌30分鐘，此時LC-MS顯示吡咯啶BOC保護完成。揮發物在真空中濃縮且殘餘物分配於乙酸乙酯(150mL)與去離子水(100mL)之間。將混合物轉移至分液漏 斗中且在萃取之後，水相用乙酸乙酯(100ml)再萃取。註釋：在萃取過程期間，形成乳液。此乳液藉由添加少量飽和鹽水至分液漏斗中來解析。經組合之有機物接著用飽和鹽水(150ml)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成實際上透明且無色油狀物。粗產物產率：2.695g，藉由在254nm下之LC-MS發現56%純。純化如下進行：系統：Biotage SP4正相純化系統
固定相：25+M矽石筒
二元溶劑系統：極性溶劑：乙酸乙酯，非極性溶劑：正庚烷
逐步梯度：
1. 0%極性溶劑-->維持5分鐘
2. 0%極性溶劑-->經30分鐘斜線上升至80%極性溶劑
3. 80%極性溶劑-->維持25分鐘
4. 80%極性溶劑-->經10分鐘斜線上升至100%極性溶劑
5. 100%極性溶劑-->維持15分鐘
組合含產物之溶離份且在真空中濃縮，得到白色泡沫。產率：1.25g，藉由在254nm下之LC-MS發現87%純。UPLC-MS：Rt=1.30min；MS m/z[M+H]+ 761.6；方法A。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺 基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向新鮮製備之含(S)-乙酸1-(((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯之濾液中添加額外甲醇(20mL)及BOC酐(0.767g)。反應混合物在室溫下攪拌1小時，此時LC-MS顯示吡咯啶BOC保護完成。揮發物在真空中濃縮且直接如下純化：系統：Biotage SP4正相純化系統
固定相：25+M矽石筒
二元溶劑系統：極性溶劑：乙酸乙酯，非極性溶劑：正庚烷
逐步梯度：
1. 0%極性溶劑-->維持5分鐘
2. 0%極性溶劑-->經30分鐘斜線上升至50%極性溶劑
3. 50%極性溶劑-->維持10分鐘
4. 50%極性溶劑-->經20分鐘斜線上升至80%極性溶劑
5. 80%極性溶劑-->維持10分鐘
組合含產物之溶離份且在真空中濃縮，生成幾乎透明且無色之蠟狀油。產率：0.676g，藉由在254nm下之LC-MS發現96%純。UPLC-MS：Rt=1.28min；MS m/z[M+H]+ 780.5；方法A。
(S)-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(50mg)於乙腈(1ml)中之溶液中添加6M HCl(0.998mL)且RM在60℃下攪拌3小時，此時LC-MS顯示反應完成，完全轉化為所需的。混合物經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且所得透明溶液藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。組合含產物之溶離份且在真空中濃縮，得到灰白色粉末。產率：12.9mgUPLC-MS：Rt=0.77min；MS m/z[M+H]+ 575.2；方法A。UPLC-MS：Rt=2.87min；MS m/z[M+H]+ 575.2；方法B。
(S)-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(50mg)於乙腈(1ml)中之溶液中添加6M HCl(1.03mL)且混合物在60℃下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應完成，完全轉化為所需產物。混合物經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且所得透明溶液藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。組合含產物之溶離份且凍乾隔夜，生成灰白色鬆散粉末。產率：19.4mg UPLC-MS：Rt=0.70min；MS m/z[M+H]+ 593.1；方法A。UPLC-MS：Rt=2.59min；MS m/z[M+H]+ 593.2；方法B。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ 10.10(s,1H),9.04(s,1H),8.71(s,1H),7.91(s,1H),7.80-7.73(m,1H),7.41-7.30(m,1H),7.18-7.09(m,1H),6.69-6.57(m,2H),6.52(dd,J=16.2,10.3Hz,1H),5.80(s,1H),5.39-5.21(m,2H),4.97(d,J=15.5Hz,1H),4.64-4.57(m,1H),4.08-3.98(m,1H),3.95-3.85(m,1H),3.37-3.27(m,2H),3.23(dt,J=9.9,5.0Hz,2H),2.48-2.36(m,1H),2.08-1.95(m,1H),1.94-1.86(m,1H),1.51(ddd,J=23.3,13.9,6.7Hz,1H),1.35(t,J=7.0Hz,3H),1.30-1.22(m,1H),0.93(s,3H),0.84(s,3H)。
(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸
向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(520mg)於無水DMF(10mL)中之冷卻(0℃)溶液中添加重鉻酸吡錠(783mg)。在添加完成之後，在RT下攪拌該暗磚紅色/黃橙色RM隔夜，此時顏色已變為暗棕色。RM分配於乙酸乙酯(150mL)與去離子水(100mL)之間。將混合物轉移至分液漏斗中且在萃取之後，水相用乙酸乙酯(2x100ml)再萃取。經組合之有機物用去離子水(100ml)、飽和鹽水(150ml)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成棕色蠟狀油性物質。粗產物產率：563.8mg UPLC-MS：Rt=1.27min；MS m/z[M+H]+ 775.4；[M-H]- 773.4方法A。
(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶- 3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸
向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(300mg)於無水DMF(5mL)中之冷卻(0℃)溶液中添加重鉻酸吡錠(974mg)。在添加完成之後，在RT下攪拌該暗磚紅色/黃橙色RM隔夜，此時顏色已變為暗棕色。RM分配於乙酸乙酯(100mL)與去離子水(100mL)之間。將混合物轉移至分液漏斗中且在萃取之後，水相用乙酸乙酯(2x100ml)再萃取。經組合之有機物用去離子水(100ml)、飽和鹽水(150ml)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成棕色蠟狀油性物質。粗產物產率：322mg UPLC-MS：Rt=1.26min；MS m/z[M-H]- 791.2方法A。
(R)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-N,3,3-三甲基丁醯胺
步驟1：向(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸(60mg)及DIPEA(189μL)於無水DMF(2mL)中之溶液中添加HATU(124mg)。RM在RT下攪拌10分鐘且接著添加鹽酸甲胺(73mg)。RM在RT下攪拌隔夜， 此時LC-MS顯示反應完成。揮發物在高真空下經移除且將粗殘餘物溶解於1：1混合物乙腈：水(4ml)中。RM經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且所得透明溶液分為2x2mL批量且藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。組合來自兩個操作之含產物之溶離份且在真空中濃縮，得到淺藍色固體：產率：15mg。此物質直接用於下一步驟中：步驟2：BOC及MOM保護基脫除：向來自步驟1之粗產物中添加乙腈(1ml)及6M HCl(1.08mL)。RM在50℃下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應已完成，脫除保護基，生成所需最終產物。RM經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且接著藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。含產物之溶離份凍乾隔夜，生成白色鬆散粉末。產率：8.9mg。
UPLC-MS：Rt=2.41min；MS m/z[M+H]+ 603.3；方法B。
與目標結構一致之1H-NMR(HSQC)。
(R)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-N,3,3-三甲基丁醯胺
步驟1：向(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸(60mg)及DIPEA(264μL)於無水DCM(2mL)中之溶液中添加HATU(173mg)。RM在RT下攪拌10分鐘且接著添加鹽酸甲胺(102mg)。RM在RT下攪拌 2小時，此時LC-MS顯示反應完成。RM在高真空下濃縮，生成棕色蠟狀油。此物質直接用於下一步驟中。
步驟2：BOC、MOM及醯基保護基脫除：來自步驟1之粗產物溶解於乙腈(2ml)中且添加6M HCl(1.5mL)。RM在60℃下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應已完成，脫除保護基，生成最終產物。RM接著分配於去離子水(50mL)與乙酸乙酯(50mL)之間。萃取之後，水相用乙酸乙酯(70mL)再萃取。經組合之有機物接著用飽和鹽水(70mL)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成灰白色固體。RM溶解於2：1水：乙腈溶液(4mL)中且此溶液經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾。所得溶液分為2x2mL批量且藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。組合含產物之溶離份且接著凍乾隔夜，生成白色鬆散粉末。產量：18.9mg。
UPLC-MS：Rt=2.41min；MS m/z[M+H]+ 618.3；方法B。
與目標結構一致之1H-NMR(HSQC)。
合成有效負載-連接子組合
可裂解連接子：MC-ValCit-PABC ADC： 向有效負載(0.05mmol，1eq)於DMSO(0.1M)中之溶液中添加iPr2EtN(6eq)及碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲基(4-硝基苯基)酯(0.09mmol，1.6eq)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，粗產物經過濾以移除固體且直接藉由逆相管柱層析(使用PrepLC方法C或D)純化，生成呈TFA鹽之所需MC-ValCit-PABC-有效負載。
3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸(3R,4R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯。
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.98(1H,m),8.09(1H,m),7.80(1H,m),7.74(1H,m),7.71(2H,m),7.56(2H,m),7.37(3H,m),.7.31(4H,m),7.09(1H,m),7.00(2H,m),6.01(1H,m),5.68(1H,m),5.28(1H,m),5.18(1H,m),5.15(2H,m),5.01(1H,m),4.88(1H,m),4.73(1H,m)4.50(1H,m),4.39(1H,m),4.21(1H,m),3.80(1H,m),3.50-3.25(8H,m),3.37(2H,m),3.03(1H,m),2.98(1H,m),2.82(1H,m),2.60(1H,m),2.30(1H,m),2.20(1H,m),2.18(1H,m),2.14(1H,m),2.13(1H,m),2.12(1H,m),1.98(1H,m),1.71(1H,m),1.50(3H,m),1.49-1.35(3H,m),1.27(3H,m),1.23(1H,m),1.10(1H,m),0.98(1H,m),0.86(6H,m),0.70(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之峰。LC/MS(uplc)：M+：1155.5,1.07min(方法A)。
3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸(3R,4R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯。
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.99(1H,m),8.09(1H,m),7.80(1H,m),7.71(2H,m),7.57(3H,m),7.35(2H,m),7.30(4H,m),7.23(1H,m),7.09(1H,m),7.00(2H,s),5.97(2H,m),5.35(2H,m),5.07(2H,m),4.89(1H,m),4.77(1H,m),4.42(1H,m),4.20(1H,m),3.84(1H,m),3.79(1H,m),3.64(2H,m),3.40-3.23(8H,m),3.03(1H,m),2.96(2H,m),2.81(1H,m),2.57(1H,m),2.25(1H,m),2.15(2H,m),2.00(1H,m),1.66(2H,m),1.52-1.25(8H,m),1.21(2H,m),1.07(3H,m),0.84(6H,m),0.77(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之峰。LC/MS(uplc)：M+ 1184.5,1185.5(+H),1.04min(方法A)。
3-(((3S,4R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3,4-二羥基吡咯啶-1-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸(3R,4R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯。
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.99(1H,m),8.08(1H,m),7.80(1H,m),7.71(2H,m),7.58(2H,m),7.36(2H,m),7.21(2H,m),7.20(2H,m),7.17(2H,m),7.09(1H,m),7.00(2H,s),6.01(1H,m),5.75(1H,m),5.37(1H,m),5.13(1H,m),4.89(3H,m),4.41(1H,m),4.21(1H,m),4.06(1H,m),3.98(1H,m),3.82(1H,m),3.41(1H,m),3.37(2H,m),3.32(2H,m),3.13(2H,m),3.05(1H,m),2.97(2H,m),2.38(1H,m),2.35-2.05(3H,m),1.97(2H,m),1.70(2H,m),1.65(2H,m),1.60-1.40(6H,m),1.36(2H,m),1.19(2H,m),1.04(1H,m),1.01(1H,m),0.87(6H,m),0.46(2H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之峰。LC/MS(uplc)：M+ 1212.4,2.48min。
((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯。
1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 10.03-9.92(1H,m),9.09-8.90(1H,m),8.66-8.47(1H,m),8.14-7.96(1H,m),7.84-7.70(3H,m),7.68-7.53(2H,m),7.47-7.36(2H,m),7.36-7.21(7H,m),7.17-7.06(1H,m),7.06-6.94(2H,m),6.34-6.11(1H,m),6.10-5.90(1H,m),5.41-5.09(4H,m),5.05-4.89(2H,m),4.46-4.31(1H,m),4.31-4.14(1H,m),3.91-3.79(3H,m),3.79-3.69(1H,m),3.65-3.53(1H,m),3.52-3.27(6H,m),3.26-3.16(1H,m),3.16-3.07(2H,m),3.07-2.99(1H,m),2.99-2.89(1H,m),2.63-2.47(2H,m),2.45-2.29(1H,m),2.27-2.04(2H,m),2.03-1.86(2H,m),1.77-1.65(1H,m),1.65-1.55(1H,m),1.55-1.31(7H,m),1.30-1.14(4H,m),1.11-0.96(3H,m),0.91-0.78(6H,m),0.75-0.61(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之峰。LC/MS(uplc)：M+ 1183.6. 0.94min(方法A)。
3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-甲酸(3R,4S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯
10%產率。UPLC-MS：Rt=1.01min；MS m/z[M+H]+ 1153.4；方法A。
3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸(R)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯
14%產率；UPLC-MS：Rt=1.09min；MS m/z[M+H]+ 1137.4；方法A。
合適連接子： a)胺基甲酸酯連接
向Boc-有效負載(0.09mmol，1eq)於DMF(0.1M)中之溶液中相繼添加iPr2EtN(0.9mmol，10eq)、碳酸雙(4-硝基苯基)酯(0.14mmol，1.6eq)，且在室溫下攪拌1小時。在藉由LC/MS(uplc，方法)發現反應完成時，添加連接子(3eq)且反應混合物在室溫下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，在減壓下蒸發溶劑，且在藉由正相管柱層析(PrepLC方法B)純化後獲得所需產物(Boc-L-P)。
b)醯胺連接
向羧酸連接子(0.23mmo,1.8eq)、HATU(0.27mmol，2.1eq)於DMF(0.3M)中之溶液中添加iPr2EtN(1.4mmol，11eq)，繼而添加Boc-有效負載(0.13mmol，1eq)。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應混合物稀釋於EtOAc中且分配於EtOAc與H2O之間。有機層經分離且用H2O洗滌(兩次)，經 Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。在藉由正相管柱層析(PrepLC方法B)純化之後獲得所需產物。
c)點擊化學
向疊氫化物-Boc-有效負載(0.05mmol，1eq)及1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(0.078mmo,1.5eq)於THF(0.1M)中之溶液中添加CuSO4.5H2O及抗壞血酸鈉於H2O(1M)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，反應混合物稀釋於EtOAc中且分配於EtOAc與H2O之間。有機層經分離，用H2O洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由正相管柱層析(PrepLC方法B)分離所需產物。
d)磺基GMBS偶合
向Boc-有效負載(0.05mmol，1eq)於CH2Cl2(0.1M)中之溶液中添加iPr2EtNH(0.30mmol，6eq)及1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-側氧基-4-(全氟苯氧基)丁烷-2-磺酸(0.15mmol，3eq)。在室溫下攪拌反應物。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，在減壓下蒸發溶劑。藉由正相管柱層析(PrepLC方法B)分離呈非對映異構體混合物之所需產物。
連接子連接之一般方案1。
向Boc-有效負載(1eq)於無水DMF(0.1M)中之溶液中相繼添加iPr2EtN(10eq)、碳酸雙(4-硝基苯基)酯(2.2eq)，且反應在室溫下攪拌30分鐘。在藉由LC/MS(uplc)發現完成時，添加連接子(4eq)且反應在室溫下攪拌1小時。反應用水淬滅且用乙酸乙酯萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到標題化合物。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
80%產率；UPLC-MS：Rt=1.24min；MS m/z[M+H]+ 863.1；方法A。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
使用一般方案1，但使用1.5eq碳酸雙(4-硝基苯基)酯、1.5eq氯化2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙胺作為胺及15eq DIPEA來合成產物，生成所需產物，32%產率；UPLC-MS：Rt=2.62min；MS m/z[M+H]+ 907.5；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
使用一般方案1，但使用2,2,2-三氟乙酸6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己-1-銨作為胺來合成產物，生成所需產物，86%產率；UPLC-MS：Rt=1.35min；MS m/z[M+H]+ 919.2；方法A。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-羰基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
使用一般方案1，但使用1.5eq碳酸雙(4-硝基苯基)酯、1.5eq 2,2,2-三氟乙酸3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁-1-鎓作為胺及15eq DIPEA來合成產物，生成所需產物，39%產率；UPLC-MS：Rt=2.66min；MS m/z[M+H]+ 889.4；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
使用一般方案1，但使用1.5eq碳酸雙(4-硝基苯基)酯、1.5eq 2,2,2-三氟乙酸3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-3-側氧基丙-1-銨作為胺及15eq DIPEA來合成產物，生成所需產物，80%產率；UPLC-MS：Rt=2.66min；MS m/z[M+H]+ 934.3；方法E。
(3S,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
81%產率；UPLC-MS：Rt=1.27min；MS m/z[M+H]+ 863.3；方法A。
(3S,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-(((2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
50%產率；UPLC-MS：Rt=1.28min；MS m/z[M+H]+ 907.3；方法A。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
67%產率；UPLC-MS：Rt=3.05min；MS m/z[M+H]+ 835.5；方法E。
(3R,4S)-3-((3-((R)-1-乙醯氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
70%產率；UPLC-MS：Rt=1.26min，MS m/z[M+H]+ 892.5；方法E。
(3R,4S)-3-((3-((R)-1-乙醯氧基丙-2-基)-1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)脲基)甲基)-4-(((2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺甲醯基)氧基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
45%產率；UPLC-MS：Rt=1.28min；MS m/z[M+H]+ 936.3；方法A。
(R)-3-((S)-2-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-14-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-3,8-二側氧基-7,12-二氧雜-2,4,9-三氮雜十四烷基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
31%產率；UPLC-MS：Rt=1.29min；MS m/z[M+H]+ 878.2；方法A。
(3R,4R)-3-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-((3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-羰基)氧基)丙-2-基)脲基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
34%產率；UPLC-MS：Rt=1.28min；MS m/z[M+H]+ 878.2；方法A。
連接子連接之一般方案2
向Boc-有效負載(1eq)於無水DMF(0.2M)中之溶液中相繼添加iPr2EtN(3eq)、碳酸2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基(4-硝基苯基)酯(1.1eq)，且反應在室溫下攪拌1小時。在藉由LC/MS(uplc)發現完成時，反應用水淬滅且用乙酸乙酯萃取。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到標題化合物。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)羰基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
42%產率；UPLC-MS：Rt=2.49min；MS m/z[M+H]+ 795.3；方法E。
4-((R)-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-1-甲酸2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙酯
32%產率；UPLC-MS：Rt=2.74min；MS m/z[M+H]+ 909.6；方法E。
連接子連接之一般方案3
向羧酸連接子(1.8eq)、HATU(2.1eq)於DCM(0.2M)中之溶液中相繼添加iPr2EtN(11eq)、含Boc-有效負載(1eq)之DMF(1：9比率，具有DCM)。反應混合物在RT下攪拌1小時。在藉由LC/MS(uplc)發現反應完成時，反應混合物稀釋於EtOAc中且分配於EtOAc與H2O之間。有機層經組合，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到標題化合物。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)哌啶-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
99%產率；UPLC-MS：Rt=2.58min；MS m/z[M+H]+ 849.5；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯基)哌啶-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
99%產率；UPLC-MS：Rt=2.59min；MS m/z[M+H]+ 893.5；方法E。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
43%產率；UPLC-MS：Rt=2.32min；MS m/z[M+H]+ 779.2；方法E。
連接子連接之一般方案4
向Boc-有效負載(1.0eq)及iPr2EtN(7.0eq)於DMF(0.2M)中之溶液中相繼添加HATU(2.0eq)、胺連接子(2.0eq)。反應混合物在RT下攪拌1小時。在藉由LC/MS(uplc)發現反應完成時，反應混合物稀釋於EtOAc中且分配於EtOAc與H2O之間。有機層經組合，經Na2SO4乾燥，過濾且在減壓下蒸發溶劑。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶 離之矽石層析純化粗產物，得到標題化合物。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺甲醯基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
53%產率；UPLC-MS：Rt=2.46min；MS m/z[M+H]+ 847.0；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)丙醯胺基)甲基)-4-((2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺甲醯基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
27%產率；UPLC-MS：Rt=2.48min；MS m/z[M+H]+ 890.9；方法E；
3-(2-(((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)胺甲醯基)苯基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
使用連接子連接之一般方案4，但使用1.2eq HATU、1.1eq胺連接子及5eq DIPEA來合成產物，生成所需產物，89%產率；UPLC-MS：Rt=2.47及2.50min；MS m/z[M+H]+ 795.4；方法E。
(R)-3-(2-((1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)胺甲醯基)苯氧基)氮雜環丁烷-1-甲酸第三丁酯
使用連接子連接之一般方案4，但使用1.2eq HATU、1.1eq胺連接子及5eq DIPEA來合成產物，生成所需產物，96%產率；UPLC-MS：Rt=2.44min；MS m/z[M+H]+ 797.3；方法E。
(3R,4S)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)-4-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向(3S,4R)-3-疊氮基-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)丙醯胺基)甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(40mg，0.050mmol)及1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(10mg，0.076mmol)於MeCN(0.3ml)中之溶液中相繼添加碘化酮(I)(10mg，0.050mmol)於水(0.3ml)中之溶液、三乙胺(0.07mL，0.050mmol)，且反應混合物在RT下攪拌1小時。反應混合物經矽藻土過濾，用EtOAc萃取且用鹽水洗滌。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。藉由用0-100%乙酸乙酯於庚烷中溶離之矽石層析純化粗產物，得到呈淺黃色油狀之標題化合物，77%產率；UPLC-MS：Rt=3.19min；MS m/z[M+H]+ 929.6；方法E。
使N-BOC加上-O-乙酸酯基或-O-TBS同時脫除保護基之一般方案1
基質(1.0eq)溶解於乙腈與水(0.1M)之2：1混合物中。添加TFA(50eq)且反應混合物在60℃下攪拌直至如藉由UPLC-MS測定發現完成(7-72小時)。反應經過濾且藉由逆相管柱層析純化。在凍乾時分離出呈白色粉末狀之呈TFA鹽之產物。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
41%產率；UPLC-MS：Rt=0.86min；MS m/z[M+H]+ 721.1；方法A。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.11-8.63(2H,m),7.91-7.51(2H,m),7.45-7.05(8H,m),7.04-6.92(2H,m),5.65-4.98(3H,m),4.94-4.82(1H,m),4.55-4.44(1H,m),3.89-2.84(13H,m),2.69-1.70(4H,m),1.55-0.48(7H,m)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
24%產率；UPLC-MS：Rt=0.89min；MS m/z[M+H]+ 765.1；方法A；1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.07-8.71(2H,m),7.89-7.73(2H,m),7.42-7.07(8H,m),7.02-6.99(2H,m),5.65-5.49(1H,m),5.40-5.03(2H,m),4.49-4.47(1H,m),3.92-2.91(18H,m),2.69-2.10(3H,m),1.53-0.52(7H,m)。
(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基)胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
37%產率；UPLC-MS：Rt=0.95min；MS m/z[M+H]+ 777.2；方法A；1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物)：δ 8.96-8.75(2H,m),7.88-7.54(2H,m),7.43-7.26(6H,m),7.17-7.07(2H,m),7.01-7.00(2H,m),5.65-5.04(3H,m),4.94-4.85(1H,m),4.50-4.42(1H,m),3.94-2.83(14H,m),2.68-1.75(3H,m),1.52-0.51(15H,m)。
3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
40%產率；UPLC-MS：Rt=0.90min；MS m/z[M+H]+ 747.2；方 法A；1H-NMR(CDCl3,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 10.25-9.50(2H,m),7.93-7.56(2H,m),7.46-7.27(5H,m),7.22-6.91(2H,m),6.76-6.74(2H,m),5.98-4.44(3H,m),4.05-3.58(10H,m),3.45-3.18(3H,m),3.09-2.19(9H,m),1.40-0.64(7H,m)。
(3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
26%產率；UPLC-MS：Rt=0.84min；MS m/z[M+H]+ 792.1；方法A；1H-NMR(CDCl3,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.97-9.51(2H,m),7.88-7.61(2H,m),7.44-7.29(5H,m),7.14-6.81(2H,m),6.73-6.69(2H,m),5.98-4.44(5H,m),3.97-3.94(1H,m),3.75-2.32(22H,m),1.43-0.66(7H,m)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(3R,4R)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
30%產率；UPLC-MS：Rt=0.87min；MS m/z[M+H]+ 720.3；方法A；1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物)：δ 8.96-8.85(2H,m),7.92-7.66(2H,m),7.42-6.89(10H,m),5.66-5.03(3H,m),4.54-4.43(1H,m),4.08-2.93(18H,m),1.52-0.51(7H,m)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯 (2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(3R,4R)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
42%產率；UPLC-MS：Rt=0.89min；MS m/z[M+H]+ 765.2；方法A；1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物)：δ 8.97-8.85(2H,m),7.93-7.66(2H,m),7.42-6.84(10H,m),5.67-5.04(3H,m), 4.55-4.43(1H,m),4.09-2.93(21H,m),1.52-0.51(7H,m)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
60%產率；UPLC-MS：Rt=2.05min；MS m/z[M+H]+ 693.2；方法E；
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)哌啶-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
30%產率；UPLC-MS：Rt=1.57min；MS m/z[M+H]+ 707.4；方法E。1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 8.98-8.90(1H,m),8.64-8.56(1H,m),7.78-7.61(2H,m),7.34-7.18(6H,m),7.06-7.02(1H,m),6.93(2H,s),5.60-5.44(1H,m),5.34-4.96(3H,m),4.46-4.29(1H,m),4.19-1.97(17H,m),1.42-0.29(7H,m)。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2-(2,5-二 側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯基)哌啶-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
29%產率；UPLC-MS：Rt=1.59min；MS m/z[M+H]+ 751.5；方法E。1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.02-8.93(1H,m),8.66-8.57(1H,m),7.85-7.69(2H,m),7.42-7.24(6H,m),7.15-7.07(1H,m),7.01(2H,s),5.67-5.51(1H,m),5.42-5.03(3H,m),4.53-4.35(1H,m),4.27-2.05(22H,m),1.51-0.34(7H,m)。
4-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)哌啶-1-甲酸2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙酯
21%產率；UPLC-MS：Rt=1.70min；MS m/z[M+H]+ 767.5；方法E。
(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)吡咯啶-3-甲醯胺
28%產率；UPLC-MS：Rt=1.77min；MS m/z[M+H]+ 705.3；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 8.64-8.51(2H,m),8.34-8.32(1H,m),7.82-7.67(2H,m),7.43-7.27(6H,m),7.15-7.09(1H,m),7.02-7.00(2H,m),5.62-4.47(1H,m),5.36-5.01(2H,m),4.51-4.39(1H,m),3.89-2.99(18H,m),1.83-0.50(7H,m)。
(3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-N-(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)吡咯啶-3-甲醯胺
75%產率；UPLC-MS：Rt=1.80min；MS m/z[M+H]+ 749.4；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 8.62-8.58(2H,m),8.32-8.27(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.43-7.27(6H,m),7.15-7.09(1H,m),7.04-7.02(2H,m),5.63-4.46(1H,m),5.36-5.03(2H,m),4.44-4.40(1H,m),3.88-3.08(21H,m),2.84-2.62(1H,m),1.91-0.51(7H,m)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)吡咯啶-3-基酯
29%產率；UPLC-MS：Rt=0.87min；MS m/z[M+H]+ 750.2；方法A。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-((1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-羥基丙-2-基)脲基)甲基)吡咯啶-3-基酯
48%產率；UPLC-MS：Rt=0.88min；MS m/z[M+H]+ 794.2；方法A。
總體保護基脫除之一般方案2
基質(1.0eq)溶解於DCM(0.1M)中且添加TFA(20-50eq)，且反應混合物在RT下攪拌1-2小時。反應經過濾且藉由逆相管柱層析純化。在凍乾時分離出呈白色粉末狀之呈TFA鹽之產物。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4S)-4-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲 基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
50eq TFA，24%產率；UPLC-MS：Rt=1.65min；MS m/z[M+H]+ 715.4；方法E。1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.04-8.82(2H,m),8.09-8.04(1H,m),7.88-7.76(1H,m),7.71-7.60(1H,m),7.42-7.05(9H,m),5.58-5.55(1H,m),5.39-4.98(5H,m),4.68-4.66(2H,m),4.01-2.46(10H,m),1.47-0.45(9H,m)。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
50eq TFA；26%產率；UPLC-MS：Rt=1.46min；MS m/z[M+H]+ 679.2；方法E。1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.04(1H,s,br),8.69(1H,s,br),7.83-7.65(2H,m),7.43-7.29(6H,m),7.15-7.10(1H,m),7.02-6.97(2H,m),6.25-5.65(1H,m),5.52-5.07(3H,m),4.56-4.26(1H,m),4.16-2.76(17H,m),2.48-2.08(3H,m),1.30-0.97(3H,m)。
3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酯
50eq TFA；60%產率；UPLC-MS：Rt=1.65min；MS m/z[M+H]+ 695.3；方法E。1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體混合物)：δ 9.05(1H,s,br),8.69(1H,s,br),7.84-7.66(2H,m),7.43-7.29(6H,m),7.15-7.10(1H,m),7.02-6.98(2H,m),6.25-5.70(1H,m),5.51-5.08(3H,m),4.51-4.26(1H,m),4.15-2.76(17H,m),2.43-2.07(3H,m),1.29-0.97(3H,m)。
3-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯
50eq TFA；75%產率；UPLC-MS：Rt=1.78min；MS m/z [M+H]+ 778.3；方法E；
N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)-2-(吡咯啶-3-基)苯甲醯胺
20eq TFA；非對映異構體混合物；88%產率；UPLC-MS：Rt=1.72min；MS m/z[M+H]+ 695.2；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 9.50-9.46(1H,m),8.87-8.82(2H,m),8.12-8.10(1H,m),7.80-7.73(1H,m),7.53-7.26(11H,m),7.10-7.06(1H,m),6.97(2H,s),5.54-5.38(3H,m),3.76-3.57(1H,m),3.54-2.89(8H,m),2.87-2.80(1H,m),2.30-1.82(3H,m),1.10-1.08(3H,m),0.86-0.85(3H,m)。
(R)-2-(氮雜環丁烷-3-基氧基)-N-(1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)苯甲醯胺
20eq TFA；78%產率；UPLC-MS：Rt=1.70min；MS m/z [M+H]+ 697.2；方法E；1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 9.02-9.00(1H,m),8.87(2H,s,br),8.09-8.06(1H,m),7.79-7.75(1H,m),7.64-7.62(1H,m),7.59-7.58(1H,m),7.47-7.42(1H,m),7.36-7.26(6H,m),7.12-7.06(2H,m),6.85(2H,s),6.82-6.80(1H,m),5.53-5.38(3H,m),5.18-5.12(1H,m),4.52-4.45(1H,m),4.40-4.36(1H,m),4.28-4.22(1H,m),4.18-4.12(1H,m),3.46-3.42(2H,m),3.35-3.27(1H,m),3.19-3.11(1H,m),2.74-2.70(1H,m),2.20-2.17(1H,m),1.03(3H,s),0.89(3H,s)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-吡咯啶-3-基甲基)脲基)丙酯
40%產率；UPLC-MS：Rt=1.72min；MS m/z[M+H]+ 778.4；方法E。
連接子-有效負載之BOC保護基脫除的一般程序：
向以上含Boc-L-P組合(0.008mmol)之MeCN(0.1M)中添加三氟乙酸(0.5mL，6.5mmol)，且反應混合物在室溫下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，粗產物藉由逆相管柱層析(使用PrepLC方法C或D)純化。產物以TFA鹽形式經分離。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羥基乙基)胺甲醯基)氧基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1- 甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載羥基處使用(S)-2-胺基-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸第三丁酯(連接子3，TFA鹽)(45mg，0.127mmol)來製備標題化合物。
所需產物不經進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 967.5,Rt 1.42min。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 896.6,1.31min(方法A)。
5mg，0.005mmol，67%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.05 (1H,m),8.67(1H,m),7.77(3H,m),7.39(2H,m),7.32(2H,m),7.27(2H,m),7.10(1H,m),7.01(2H,m),6.33(1H,m),5.34(2H,m),5.25(1H,m),5.20(1H,m),3.96(2H,m),3.89(1H,m),3.83(1H,m),3.73(1H,m),3.60(1H,m),3.56(4H,m),3.39(2H,m),3.35(1H,m),3.30(1H,m),3.09(2H,m),2.59(1H,m),2.54(1H,m),2.26(1H,m),2.00(1H,m),1.45(1H,m),1.25-1.05(2H,m),1.10(3H,m),0.75(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 796.8,0.92min(方法A)。
(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 908.6,1.37min(方法A)。
4.5mg，0.005mmol，53%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.02(1H,m),8.65(1H,m),7.77(2H,m),7.39(2H,m),7.32(2H,m),7.27(2H,m),7.10(1H,m),7.01(1H,m),6.99(2H,m),6.32(1H,m),5.33(2H,m),5.24(1H,m)5.20(1H,m),3.94(1H,m),3.83(1H,m),3.72(1H,m),3.60(1H,m),3.38(3H,m),3.32(3H,m),3.21(1H,m),2.95(2H,m),2.60(1H,m),2.53(1H,m),2.27(1H,m),2.00(1H,m),1.47(2H,m),1.36(2H,m),1.21(5H,m),1.09(4H,m)。缺失隱藏在溶劑峰 下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 808.5,1.0min(方法A)。
N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-碘乙醯胺。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 753.3,1.40min(方法A)。
連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 653.2,0.94min(方法A)。
(2-(2-(2-碘乙醯胺基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 984.3,1.27min(方法A)。
連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 884.4,0.91min(方法A)。(6-(2-碘乙醯胺基)己基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟 苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 996.6,1.33min(方法A)。
4mg，0.004mmol，40%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.00(1H,m),8.63(1H,m),8.19(1H,m),7.77(3H,m),7.39(2H,m),7.30(1H,m),7.27(2H,m),7.10(1H,m),7.05(1H,m),6.31(1H,m),5.33(2H,m)5.23(1H,m),5.19(1H,m),3.94(4H,m),3.83(1H,m),3.71(1H,m),3.60(2H,m),3.47(1H,m),3.34(3H,m),3.20(1H,m),3.02(2H,m),2.95(2H,m),2.58(1H,m),2.54(1H,m),2.25(1H,m),2.00(1H,m),1.37(5H,m),1.24(5H,m),1.08(3H,m),0.69(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 896.5,0.97min(方法A)。
1-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-((S)-1-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-2-基)-1-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 846.5,1.31min(方法A)。
5.5mg，0.006mmol，86%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.07(1H,m),8.52(1H,m),8.03(1H,m),7.79(1H,m),7.75(1H,m),7.38(2H,m),7.32(2H,m),7.24(2H,m),7.11(1H,m),7.09(2H,m),6.42(1H,m),5.30-5.15(4H,m),4.67(2H,m),4.42(2H,m),4.21(1H,m),3.81(1H,m),3.58(1H,m),3.39(3H,m),3.30(1H,m),3.20(1H,m),2.53(1H,m),2.47(1H,m),2.30(1H,m),1.90(1H,m),1.35(1H,m),1.25(1H,m),1.11(4H,m),0.65(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 746.2,0.92min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 867.4,1.33min(方 法A)。
2mg，0.002mmol，36%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.11(1H,m),8.80(1H,m),7.78(2H,m),7.51(1H,m),7.40(2H,m),7.33(2H,m),7.22(2H,m),7.10(1H,m),7.02(2H,m),5.61(1H,m),5.52(1H,m),5.23(1H,m),5.09(1H,m),5.02(1H,m),3.83(1H,m),3.75(1H,m),3.62(1H,m),3.54(4H,m),3.30(1H,m),3.23(2H,m),3.09(2H,m),2.66(1H,m),2.61(1H,m),2.31(1H,m),2.18(1H,m),1.42(3H,m),1.38(2H,m),1.10(1H,m),0.67(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 767.3,0.92min(方法A)。
(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基)胺基甲酸(S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基酯
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 879.6,1.40min(方法A)。
3.2mg，0.0034mmol，27%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.20-9.06(1H,m),8.97-8.33(1H,m),7.83-7.73(2H,m),7.56-7.46(1H,m),7.44-7.36(2H,m),7.35-7.28(2H,m),7.27-7.19(2H,m),7.17-7.08(1H,m),7.03-6.96(2H,m),5.66-5.59(1H,m),5.59-5.43(1H,m),5.26-4.98(3H,m),3.88-3.77(1H,m),3.77-368(1H,m),3.36-3.27(4H,m),3.27-3.17(2H,m),3.07-2.96(1H,m),2.95-2.82(1H,m),2.72-2.56(2H, m),2.37-2.24(1H,m),2.23-2.05(1H,m),1.52-1.28(9H,m),1.28-1.16(2H,m),1.16-0.97(3H,m),0.73-0.56(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 779.4,1.01min(方法A)。
(2-(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 940.4,1.29min(方法A)。
4mg，0.004mmol，47%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 8.95(1H,m),8.45(1H,m),7.79(1H,m),7.76(1H,m),7.40(2H,m),7.33(2H,m),7.27(2H,m),7.11(1H,m),7.06(1H,m),7.03(2H,m),6.32(1H,m),5.34(2H,m),5.15-5.25(2H,m),3.96(1H,m),3.91(1H,m),3.85(1H,m),3.75(1H,m),3.60(1H,m),3.55-3.25(12H,m),3.18(1H,m),3.11(2H,m),2.65(2H,m),2.51(1H,m),2.28(1H,m),2.00(1H,m),1.40(2H,m),1.23(1H,m),1.10(3H,m),0.65(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 840.3,0.94min(方法A)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 852.4,1.28min(方法A)。
10mg，0.011mmol，69%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.03(1H,m),8.64(1H,m),7.78(1H,m),7.77(1H,m),7.40(2H,m),7.33(2H,m),7.27(2H,m),7.20(1H,m),7.08(1H,m),7.01(2H,m),6.92(1H,m),6.30(1H,m),5.34(2H,m),5.22(2H,m),3.90(3H,m),3.80(1H,m),3.74(1H,m),3.60(1H,m),3.33(2H,m),3.20(1H,m),3.13(2H,m),2.61(1H,m),2.54(1H,bs),2.28(1H,m),1.99(1H,m),1.45(1H,m),1.30-1.15(2H,m),1.11(3H,m),0.68(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 752.3,0.90min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)乙酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 882.2,1.26min(方法A)。
14mg，0.015mmol，71%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.11-9.00(1H,m),8.75-8.60(1H,m),7.81-7.71(2H,m),7.43-7.36(2H,m),7.36-7.24(4H,m),7.14-7.06(1H,m),7.05-7.00(2H,m),7.00-6.95(1H,m),6.79-6.65(1H,m),5.38-5.11(4H,m),4.02-3.95(2H,m),3.71-3.64(1H,m),3.64-3.59(1H.m),3.59-3.54(2H,m),3.54-.344(3H,m),3.44-3.26(7H,m),3.26-3.16(1H,m),3.13-3.04(2H.m),2.65-2.44(2H,m),2.43-2.26(1H,m),2.02-1.83(1H,m),1.45-1.33(1H,m),1.30-1.12(2H,m),0.78-0.60(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 782.2,0.90min(方法A)。
N-((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)-3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 880.4,1.25min(方法A)。
10.5mg，0.011mmol，89%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.06(1H,m),8.70(1H,m),7.99(1H,m),7.78(1H,m),7.76(1H,m),7.40(2H,m),7.33(2H,m),7.28(2H,m),7.10(1H,m),7.02(2H,m),6.35(1H,m),5.40-5.10(4H,m),3.83(3H,m),3.72(1H,m),3.45(2H,m),3.37-3.25(4H,m),3.25-3.05(4H,m),2.57(1H,m),2.50(2H,m),2.42(1H,m),2.30(2H,m),1.92(1H,m),1.40(1H,m),1.25(1H,m),1.22(1H,m),1.04(3H,m),0.70(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 780.3,0.93min(方法A)。
((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)胺基甲酸2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 896.2,1.27min(方法A)。
9mg，0.009mmol，40%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.11-8.96(1H,m),8.74-8.59(1H,m),7.82-7.69(2H,m),7.45-7.36(2H,m),7.35-7.20(5H,m),7.15-7.06(1H,m),7.05-6.98(2H,m),6.34-6.15(1H,m),5.38-5.12(4H,m),4.08-3.96(2H,m),3.90-3.79(2H,m),3.79-3.67(1H,m),3.40-3.27(4H,m),3.26-3.18(1H,m),3.12-2.98(2H,m),2.65-2.46(3H,m),2.46-2.30(1H,m),2.04-1.87(1H,m),1.46-1.34(1H,m),1.31-1.12(2H,m),1.09-0.97(3H,m),0.78-0.60(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 796.2,0.93min(方法A)。
N-((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 878.3,1.28min(方法A)。
19mg，0.02mmol，31%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.05(1H,m),8.72(1H,m),7.97(1H,m),7.77(2H,m),7.40(2H,m),7.35(2H,m),7.29(2H,m),7.11(1H,m),7.01(2H,m),6.40(1H,m),5.33 (2H,m),5.28-5.20(2H,m),3.84(2H,m),3.70(1H,m),3.60(1H,m),3.45(1H,m),3.37(2H,m),3.33(2H,m),3.22(2H,m),3.10(1H,m),2.57(2H,m),2.51(2H,m),2.44(1H,m),.2.07(2H,m),1.92(1H,m),1.49(3H,m),1.38(1H,m),1.24(1H,m),.1.19(2H,m),1.04(3H,m),0.70(1H,m)。LC/MS(uplc)：MH+778.2,0.96min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(3S,4R)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4-羥基吡咯啶-3-基酯及(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(3R,4S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4-羥基吡咯啶-3-基酯。
藉由2 OH之依序保護-脫除保護基步驟製備2種不同異構體，產生各呈純異構體之對應連接子-位置異構體。未進行指定各位置異構體之結構測定。
異構體A：Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 1038.7,1.50min(方法A)。
異構體B：Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 1039.2,1.49min(方法A)。
異構體A：2.3mg，0.002mmol，30%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.04(1H,m),8.74(1H,m),7.76(2H,m),7.39(2H,m),7.33(2H,m),7.25(2H,m),7.09(2H,m),7.02(2H,m),567(1H,m),5.38(1H,m),5.25(1H,m),4.93(1H,m),4.71(1H,m),4.27(1H,m),3.80(1H,m),3.71(2H,m),3.57(4H,m),3.40(2H,m),3.30(4H,m),3.27(4H,m),3.11(2H,m),2.81(1H,m),2.37(1H,m),2.22(1H,m),2.17(1H,m),1.70(1H,m),1.20(1H,m),1.05(1H,m),0.68(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 824.1,0.90min(方法A)。
異構體B：6.2mg，0.006mmol，43%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.03(1H,m),8.76(1H,m),7.75(2H,m),7.39(2H,m),7.33(2H,m),7.25(2H,m),7.10(2H,m),7.03(2H,m),5.71(1H,m),5.37(1H,m),5.25(1H,m),4.89(1H,m),4.77(1H,m),4.24(1H,m),3.83(1H,m),3.78(1H,m),3.58(4H,m),3.51(3H,m),3.40(2H,m),3.29(1H,m),3.14(2H,m),3.10(2H,m),2.80(1H,m),2.36(2H,m),2.30(1H,m),2.13(1H,m),1.72(1H,m),1.08(1H,m),0.88(1H,m),0.33(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 824.1,0.91min(方法A)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(3R,4S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4-羥基吡咯啶-3-基酯及 (2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(3S,4R)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4-羥基吡咯啶-3-基酯。
藉由2 OH之依序保護-脫除保護基步驟製備2種不同異構體，產生各呈純異構體之對應連接子-位置異構體。未進行指定各位置異構體之結構測定。
異構體A：Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 995.2,1.52min(方法A)。
異構體B：Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 994.2,1.51min(方法A)。
異構體A：11mg，0.012mmol，58%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.09-8.94(1H,m),8.71-8.53(1H,m),7.82-7.69(2H,m),7.42-7.36(2H,m),7.36-7.21(5H,m),7.16-7.06(1H,m),7.03-6.97(2H,m),5.72-5.62(1H,m),5.44-5.34(1H,m),5.34-5.16(1H,m),4.94-4.86(1H,m),4.74-4.66(1H,m),4.33-4.21(1H,m),3.88-3.76(1H,m),3.76-3.65(2H,m),3.65-3.53(1H,m),3.22-3.16(4H,m),3.16-3.03(2H,m),2.90- 2.77(1H,m),2.45-2.10(3H,m),1.77-1.67(1H,m),1.12-0.99(1H,m),0.91-0.81(1H,m),0.34-0.15(1H,m).1H,m),4.74-4.66(1H,m),4.33-4.21(1H,m),3.88-3.76(1H,m),3.76-3.65(2H,m),3.65-3.53(1H,m),3.22-3.16
異構體B：10mg，0.0011mmol，94%，1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.11-8.94(1H,m),8.80-8.57(1H,m),7.84-7.72(2H,m),7.44-7.36(2H,m),7.36-7.28(3H,m),7.28-7.20(2H,m),7.14-7.07(1H,m),7.05-6.99(2H,m),5.79-5.69(1H,m),5.43-5.33(1H,m),5.31-5.16(1H,m),4.91-4.82(1H,m),4.82-4.72(1H,m),4.27-4.17(1H,m),3.92-3.74(2H,m),3.24-3.02(4H,m),2.83-2.71(1H,m),2.44-2.25(3H,m),2.14-2.03(1H,m),1.76-1.64(1H,m),1.12-0.98(1H,m),0.92-0.79(1H,m),0.37-0.19(1H,m).9.11-8.94(1H,m),8.80-8.57(1H,m),7.84-7.72(2H,m),7.44-7.36(2H,m),7.36-7.28(3H,m),7.28-7.20(2H,m)，(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基)胺基甲酸(3R,4S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4-羥基吡咯啶-3-基酯及(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基)胺基甲酸(3S,4R)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4-羥基吡咯啶-3-基酯。
藉由2 OH之依序保護-脫除保護基步驟製備2種不同異構體，產生各呈純異構體之對應連接子-位置異構體。未進行指定各位置異構體之結構測定。
異構體A：Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 1050.3,1.57min(方法A)。
異構體B：Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 1050.3,1.57min(方法A)。異構體A：12mg，0.012mmol，83%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.06-8.93(1H,m),8.74-8.61(1H,m),7.84-7.69(2H,m),7.45-7.28(4H,m),7.28-7.21(2H,m),7.18-7.06(2H,m),7.05-6.96(2H,m),5.70-5.59(1H,m),5.43-5.33(1H,m),5.33-5.17(1H,m),4.99-4.88(1H,m),4.75-4.63(1H,m),4.33-4.20(1H,m),3.85-3.75(1H,m),3.75-3.63(2H,m),3.63-3.52(1H,m),3.30-3.19(3H,m),3.17-3.05(1H,m),3.01-2.89(2H,m),2.87-2.74(1H,m),2.44-2.08(3H,m),1.77-1.62(1H,m),1.54-1.44(2H,m),1.43-1.32(2H,m),1.31-1.13(4H,m),1.09-0.95(1H,m),0.93-0.79(1H,m),0.31-0.15(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 836.2,0.95min(方法A),4.00min(方法F)。
異構體B：9.5mg，0.0095mmol，72%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.07-8.93(1H,m),8.76-8.63(1H,m),7.80-7.70(2H,m),7.43-7.36(2H,m),7.36-7.28(2H,m),7.27-7.21(2H,m),7.18-7.13(1H,m),7.13-7.06(1H,m),7.04-6.98(2H,m),5.80-5.63(1H,m),5.42-5.32(1H,m),5.32-5.12(1H,m),4.97-4.83(1H,m),4.82-4.72(1H,m),4.23-4.17(1H,m),3.89-3.72(2H,m),3.72-3.56(2H,m),3.31-3.24(2H,m),3.21-3.05(2H,m),3.03-2.88(2H,m),2.86-2.71(1H,m),2.44-2.23(2H,m),2.21-1.99(1H,m),1.80-1.65(1H,m),1.55-1.43(2H,m),1.43-1.32(2H,m),1.31-1.14(4H,m),1.13-0.98(1H,m),0.94-0.80(1H,m),0.40-0.33(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(R)-1-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)-3-羥基丙-2-基酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 1026.3,1.51min(方法A),7.10min(方法B)。
6.1mg，0.006mmol，51%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.15- 8.96(1H,m),8.69-8.48(1H,m),7.83-7.67(2H,m),7.47-7.37(2H,m),7.37-7.21(4H,m),7.18-7.07(1H,m),7.07-6.99(2H,m),6.98-6.86(1H,m),6.80-6.59(1H,m),5.38-5.09(4H,m),4.78-4.63(1H,m),3.88-3.77(1H,m),3.54-3.43(4H,m),3.42-3.26(6H,m),3.25-3.14(2H,m),3.15-2.98(2H,m),2.61-2.44(3H,m),2.43-2.25(2H,m),2.00-1.78(1H,m),1.43-1.30(1H,m),1.30-1.08(2H,m),0.76-0.57(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 812.2,0.86min(方法A),3.37min(方法B)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(R)-3-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)-2-羥基丙酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 1026.3,1.52min(方法A),7.17min(方法B)。
4.0mg，0.004mmol，70%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.09-8.93(1H,m),8.59-8.37(1H,m),7.85-7.70(2H,m),7.45-7.36(2H,m),7.36-7.23(4H,m),7.15-7.06(2H,m),7.06-7.01(2H,m),6.68-6.56(1H,m),5.40-5.12(4H,m),4.06-3.95(1H,m),3.90-3.77(2H,m),3.77-3.65(2H,m),3.26-2.97(5H,m),2.64-2.46(3H,m),2.46-2.27(1H,m),1.98-1.81(1H,m),1.45-1.36(1H,m),1.30-1.10(2H,m),0.77-0.60(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 812.2,0.86 min(方法A),3.41min(方法B)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(R)-1-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)-3-羥基丙-2-基酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 982.3,1.51min(方法A)。
3.8mg，0.0041mmol，41%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.09-8.89(1H,m),8.55-8.35(1H,m),7.84-7.69(2H,m),7.45-7.36(2H,m),7.36-7.23(4H,m),7.16-7.07(2H,m),7.05-6.98(2H,m),6.73-6.58(1H,m),5.40-5.10(4H,m),4.87-4.64(2H,m),3.88-3.79(1H,m),3.72-3.64(1H,m),3.63-3.56(1H,m),3.25-3.03(6H,m),2.43-2.26(1H,m),1.96-1.80(1H,m),1.44-1.32(1H,m),1.29-1.09(2H,m),0.75-0.57(1H,m).9.09-8.89(1H,m),8.55-8.35(1H,m),7.84-7.69(2H,m),7.45-7.36(2H,m),7.36-7.23(4H,N-((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷甲醯胺。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：M+ 904.3,1.29min(方法A)。
31mg，0.032mmol，85%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.14-8.91(1H,m),8.76-8.59(1H,m),7.94-7.83(1H,m),7.83-7.68(2H,m),7.48-7.37(2H,m),7.37-7.23(4H,m),7.18-7.07(1H,m),7.06-6.98(2H,m),6.54-6.24(1H,m),5.43-5.14(4H,m),3.91-3.76(2H,m),3.76-3.65(1H,m),3.65-3.54(1H,m),3.52-3.28(4H,m),3.28-3.13(3H,m),3.13-3.01(1H,m),2.67-2.47(2H,m),2.47-2.31(1H,m),2.14-2.00(1H,m),2.00-1.86(1H,m),1.77-1.66(2H,m),1.66-1.57(2H,m),1.57-1.47(1H,m),1.44-1.35(1H,m),1.34-1.10(4H,m),1.08-0.99(3H,m),0.97-0.83(2H,m),0.78-0.60(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 804.2,0.93min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)氮雜環丁烷-3-基酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 894.2,1.26min(方法A)。
23mg，0.024mmol，61%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.15-8.97(1H,m),8.77-8.60(1H,m),7.88-7.78(1H,m),7.78-7.69(1H,m),7.43-7.37(2H,m),7.37-7.29(3H,m),7.28-7.21(2H,m),7.14-7.08(1H,m),7.05-6.99(2H,m),5.56-5.44(1H,m),5.43-5.21(2H,),5.16-4.96(2H,m),4.46-4.35(1H,m),4.12-4.03(1H,m),4.03-3.95(1H,m),3.88-3.80(1H,m),3.46-3.24(6H,m),3.26-3.13(1H,m),3.13-.303(2H,m),2.76-2.62(1H,m),2.58-2.34(3H,m),1.95-1.80(1H,m),1.68-1.53(1H,m),1.15-0.93(1H,m),0.49-0.30(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 794.2,0.91min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)哌啶-3-基酯。
獲得非對映異構體混合物，其在連接子偶合之前經分離。
Boc-連接子-有效負載，經分離為純非對映異構體。
異構體A，LC/MS(uplc)：M+ 922.3,1.33min(方法A)。
異構體B，LC/MS(uplc)：M+ 922.3,1.34min(方法A)。
異構體A：10mg，0.010mmol，47%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.11-8.93(1H,m),8.87-8.69(1H,m),7.85-7.74(1H,m),7.74-7.64(1H,m),7.45-7.36(2H,m),7.36-7.28(2H,m),7.27-7.18(2H,m),7.15-7.06(1H,m),7.06-6.97(3H,m),5.69-5.59(1H,m),5.46-5.36,(1H,m),5.31-5.13(1H,m),4.72-4.62(1H,m),4.62-4.54(1H,m),3.71-3.60(2H,m),3.59-3.46(6H,m),3.46-3.31(4H,m),3.31-3.16(2H,m),3.15-3.00(4H,m),2.99-2.90(1H,m),2.89-2.75(1H,m),2.48-2.30(2H,m),2.29-2.10(1H,m),1.94-1.80(1H,m),1.79-1.59(2H,m),1.58-1.48(1H,m),1.47-1.36(1H,m),1.19-1.04(1H,m),0.89-0.76(1H,m),0.55-0.38(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 822.3,0.96min(方法A)。
異構體B：22.5mg，0.022mmol，52%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.19-8.99(1H m),8.92-8.76(1H,m),7.81-7.73(1H,m),7.71-7.63(1H,m),7.45-7.37(2H,m),7.37-7.27(2H,m),7.26-7.20(2H,m),7.14-7.06(2H,m),7.05-6.99(2H,m),5.58-5.47(1H,m),5.42-5.31 (1H,m),5.25-5.07(1H,m),4.69-4.61(1H,m),4.56-4.47(1H,m),3.90-3.70(2H,m),3.65-3.46(6H,m),3.45-3.33(5H,m),3.33-3.20(1H,m),3.17-2.98(4H,m),2.98-2.86(2H,m),2.50-2.21(3H,m),1.99-1.87(1H,m),1.79-1.71(1H,m),1.71-1.63(1H,m),1.63-1.43(2H,m),1.22-1.06(1H,m),0.90-0.76(1H,m),0.55-0.39(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 822.3,0.97min(方法A)。
(3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯。
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 923.2,1.22min(方法A)。
6.1mg，0.006mmol，37%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.05(1H,m),8.64(1H,m),8.01(1H,m),7.78(2H,m),7.40(2H,m),7.33(2H,m),7.27(2H,m),7.12(1H,m),7.01(2H,m),6.97(1H,m),6.31(1H,m),5.34(2H,m),5.25(1H,m),5.20(1H,m),3.94(3H,m),3.80(1H,m),3.75(1H,m),3.50(1H,m),3.45(2H,m),3.25(2H,m),3.15(4H,m),2.59(1H,m),2.50(1H,m),2.26(1H,m),2.17(2H,m),2.01 (1H,m),1.45(1H,m),1.30-1.20(2H,m),1.10(3H,m),0.68(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：823.2,0.90min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸2-胺基-3-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-3-側氧基丙酯。
Boc-連接子-有效負載，非對映異構體混合物，LC/MS(uplc)：M+ 982.3,1.39min及1.40min(方法A)。
產物以非對映異構體之不可分離混合物(4：1，LC/MS，方法A)形式獲得。17.8mg，0.017mmol，70%。1H-NMR(DMSO,600MHz)主要非對映異構體：δ 9.34-9.21(1H,m),9.19-9.05(1H,m),8.71-8.55(3H,m),7.94-7.86(1H,m),7.82-7.72(1H,m),7.45-7.37(2H,m),7.37-7.31(2H,m),7.31-7.26(1H,m),7.26-7.21(2H,m),7.16-7.08(1H,m),7.06-7.01(2H,m),5.56-5.49(1H,m),5.41-5.35(1H,m),5.35-5.22(1H,m),5.19-5.07(1H,m),4.56-4.47(1H,m),4.38-4.29(1H,m),4.19-4.10(1H,m),4.00-3.90(1H,m),3.78-3.68(1H,m),3.63-3.54(3H,m),3.54-3.48(3H,m),3.31-3.22(1H,m),3.22-3.02(3H,m),2.83-2.71(1H,m),2.68-2.56(1H,m),2.46-2.35(1H,m),2.02-1.83(1H,m),1.45-1.33(1H,m),1.28-1.18(1H,m),1.01-0.86(1H,m),0.52-0.36(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 782.3,0.78min(主要)及0.79 min(次要)(方法A)。
N-((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺
Boc-連接子-有效負載：LC/MS(uplc)：MH+ 836.2,1.26min(方法A)。
4mg，0.004mmol，24%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.05(1H,m),8.67(1H,m),8.14(1H,m),7.79(1H,m),7.75(1H,m),7.40(2H,m),7.33(2H,m),7.27(2H,m),7.10(1H,m),7.02(2H,m),6.35(1H,m),5.35-5.25(4H,m),3.81(2H,m),3.75(1H,m),3.62(3H,m),3.45(2H,m),3.37(2H,m),3.16(2H,m),3.07(1H,m),2.57(1H,m),2.41(1H,m),2.39(2H,m),1.90(1H,m),1.45(1H,m),1.25(1H,m),1.15(1H,m),1.02(3H,m),0.70(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 736.2,0.89min(方法A)。
4-(((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)胺基)-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-側氧基丁烷-2-磺酸。
Boc-連接子-有效負載，非對映異構體混合物：LC/MS(uplc)：MH+ 930.5,1.01min(異構體A)及1.02min(異構體B)，(方法A)。
在Boc保護基脫除後使用逆相層析(PrepLC方法A)分離非對映異構體混合物。
異構體A，31mg，0.031mmol，10%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.08-8.48(1H,m),8.90-8.75(1H,m),7.94-7.84(1H,m),7.81-7.68(2H,m),7.47-7.36(2H,m),7.35-7.23(4H,m),7.15-7.04(1H,m),7.03-6.94(2H,m),6.20-6.08(1H,m),5.46-5.20(4H,m),3.95-3.67(6H,m),3.29-3.11(2H,m),2.90-2.64(4H,m),2.59-2.44(3H,m),2.13-1.91(1H,m),1.78-1.59(1H,m),1.52-1.36(1H,m),1.35-1.23(1H,m),1.19-1.07(1H,m),1.06-0.94(3H,m),0.70-0.53(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。9.08-8.48(1H,m),8.90-8.75(1H,m),7.94-7.
異構體B，35mg，0.017mmol，11%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ-NMR(DMSO,600MHz)：mmol，11%.m),7.94-7.84(1H,m),7.81-7.68(2H,m),7.47-7.36(2H,m),7.35-7.23(4H,m),7.15-7.04(1H,m),7.03-6.94(2H,m),6.20-6.08(1H,m),5.46-5.20(4H,m),3.95-3.67(6H,m),3.29-3.66(5H,m),3.29-3.16(2H,m),2.84-2.74(1H,m),2.73-2.58(1H,m),2.57-2.42(5H,m),2.08-1.97(1H,m),1.71-1.55(1H,m),1.42-1.24(2H,m),1.21-1.08(1H,m),1.07-0.95(3H,m),0.69-0.51(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 830.5,0.89 min。(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(1-羥基環丙基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯。
Boc-連接子-有效負載，LC/MS(uplc)：M+ 982.5,1.64(方法A)。
17.7mg，0.018mmol，66%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.20-9.08(1H,m),8.91-8.71(1H,m),7.89-7.81(1H,m),7.81-7.74(1H,m),7.40-7.36(2H,m),7.35-7.29(2H,m),7.27-7.23(2H,m),7.15-7.09(1H,m),7.05-7.00(3H,m),6.38-6.28(1H,m),5.37-5.14(4H,m),4.03-3.78(4H,m),3.77-3.68(1H,m),3.61-3.52(2H,m),3.52-3.45(2H,m),3.44-3.29(4H,m),3.13-3.03(2H,m),3.03-2.93(1H,m),2.57-2.42(3H,m),1.16-1.06(3H,m),0.69-0.50(3H,m),0.50-0.36(1H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 768.3,0.94min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-羥基-2-甲基丙基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯。
Boc-連接子-有效負載，LC/MS(uplc)：M+ 984.5,1.65min(方法A)。
4.1mg，0.004mmol，54%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.26-9.05(1H,m),9.00-8.76(1H,m),7.99-7.84(1H,m),7.83-7.71(1H,m),7.51-7.24(6H,m),7.19-7.09(1H,m),7.08-6.95(3H,m),6.55-6.37(1H,m),5.50-5.15(4H,m),4.09-3.88(2H,m),3.88-3.74(2H,m),3.60-3.53(3H,m),3.53-.344(3H,m),3.44-3.23(4H,),3.15-3.01(2H,m),2.70-2.59(1H,m),2.39-2.12(1H,m),2.08-1.93(1H,m),1.17-1.09(3H,m),1.09-0.98(3H,m),0.97-0.78(3H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 770.6,0.95min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((S)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-羥基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯。
Boc-連接子-有效負載，LC/MS(uplc)：M+ 1026.6,1.58min(方法 A)。
11.3mg，0.012mmol，32%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.17-8.95(1H,m),8.77-8.59(1H,m),8.02-7.88(1H,m),7.87-7.74(1H,m),7.45-7.38(2H,m),7.38-7.32(2H,m),7.32-7.27(2H,m),7.18-7.11(1H,m),7.06-6.99(3H,m),6.51-6.34(1H,m),5.55-5.10(4H,m),4.02-3.88(4H,m),3.88-3.71(2H,m),3.69-3.60(1H,m),3.60-3.54(3H,m),3.54-3.45(3H,m),3.44-3.37(2H,m),3.36-3.24(3H,m),3.16-3.02(2H,m),2.72-2.58(1H,m),2.40-2.20(1H,m),2.14-1.93(1H,m),1.52-1.33(2H,m),1.21-1.02(5H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 812.5,0.91min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯。
Boc-連接子-有效負載，LC/MS(uplc)：MH+ 884.6,1.36min(方法A)。25mg，0.026mmol，82%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.10-8.93(1H,m),8.78-8.61(1H,m),7.96-7.83(1H,m),7.82-7.70(1H,m),7.48-7.26(6H,m),7.20-7.08(1H,m),7.08-6.98(3H,m),6.55-6.38(1H,m),5.65-5.45(1H,m),5.45-5.25(2H,m),5.25-5.08(1H,m),3.62-3.53(2H,m),3.53-3.45(2H,m),3.45-3.35(2H,m),3.34-3.17(2H,m),3.16-3.05(2H,m),3.05-2.92(3H,m),2.58-2.39(2H,m),2.26-2.02(1H, m),2.02-1.82(1H,m),1.42-1.23(3H,m),1.23-1.06(3H,m),0.92-0.73(3H,m)。LC/MS(uplc)：MH+ 784.4,1.01min(方法A)。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(3S,4S)-4-(((S)-N-((S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-甲氧基-2-甲基丙基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基酯
Boc-連接子-有效負載，LC/MS(uplc)：MH+895.3,1.37min(方法A)。
26.8mg，0.031mmol，79%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.06-8.90(1H,m),8.88-8.73(1H,m),8.72-8.63(1H,m),7.96-7.91(1H,m),7.90-7.69(2H,m),7.45-7.30(8H,m),7.29-7.24(1H,m),7.19-7.07(3H,m),7.06-6.98(3H,m),6.00-5.84(1H,m),5.62-5.32(2H,m),5.17-5.03(2h,m),4.92-4.82(2H,m),4.81-4.70(3H,m),4.62-4.49(2H,m),4.11-3.99(1H,m),3.97-3.86(2H,m),3.83-3.73(1H,m),3.62-3.45(7H,m),3.44-3.28(4H,m),3.22-3.05(5H,m),3.04-2.96(1H,m),2.92-2.71(4H,m),2.43-2.33(1H,m),2.04-1.85(2H,m),1.66-1.51(m,1H),1.50-1.41(1H,m),1.36-1.30(3H,m),1.30-1.24(3H,m),1.08-0.98(1H,m),0.89-0.79(2H,m),0.77-0.65(3H,m)。旋轉異構體之混合物可藉由 NMR觀測。LC/MS(uplc)：MH+ 753.3,0.98min(方法A)。
(S)-2-((((R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁氧基)羰基)胺基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸
在藉由逆相管柱層析純化後藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除的一般方法(60℃，3天)中所述方法之方法製備標題化合物(8mg，17%，呈TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 769.4,Rt 3.21min。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 12.89(1H,br s),8.97(1H,br s),8.54(1H,br s),7.97(1H,d,3.9Hz),7.80-7.70(1H,m),7.45-7.30(7H,m),7.17-7.08(1H,m),6.99(2H,s),5.84(1H,s),5.40(1H,d,15,3Hz),5.25(1H,d,56Hz),5.06(1H,d,15.3Hz),4.63-4.54(1H,m),4.21-4.11(1H,m),4.06-3.88(2H,m),3.80-3.63(4H,m),3.34-3.23(2H,m),2.40-2.35(1H,m),2.00-1.85(1H,m),1.58-1.46(1H,m),1.35(3H,d,6.2Hz),1.32-1.21(1H,m),0.95(3H,s),0.71(3H,s)。1H隱藏在DMSO下，OH未見。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羥基乙基)胺甲醯基)氧基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在N2下：向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(40mg，0.057mmol)於DMF 1mL中之溶液中相繼添加DIPEA(0.299mL，1.712mmol)、碳酸雙(4-硝基苯基)酯(39.9mg，0.131mmol)。反應混合物在室溫下攪拌16小時。在藉由LC/MS(uplc)發現完成時，添加1-(2-((2-羥基乙基)胺基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(連接子1，TFA鹽)(66.1mg，0.114mmol)，且反應混合物在室溫下攪拌16小時。添加另外1-(2-((2-羥基乙基)胺基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(連接子1，TFA鹽)(66.1mg，0.114mmol)，且反應混合物在室溫下攪拌16小時。添加乙酸乙酯及冷水，有機層用鹽水洗滌兩次，經Na2SO4乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化(4g矽膠，0至100% EtOAC於庚烷中，18mg，0.017mmol，29%，純度85%)後獲得呈無色油狀之所需產物。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 911.5,Rt 1.27min。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羥基乙基)胺基甲酸(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酯
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羥基乙基)胺甲醯基)氧基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(18mg，0.017mmol)溶解於乙腈(1mL)及水(0.500mL)之混合物中。添加TFA(0.065mL，0.840mmol)且反應混合物在60℃下攪拌7天。在藉由逆相管柱層析純化之後獲得所需產物(9mg，59%，呈TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 769.5,Rt 3.35min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物 比率1：1)：δ 9.02(1H,br s),8.68(1H,br s),7.98(1H,s),7.82-7.73(1H,m),7.44-7.31(6H,m),7.16-7.10(1H,m),6.97及6.96(2H，兩個單峰，旋轉異構體)，5.84及5.84(1H，兩個單峰，旋轉異構體)，5.41(1H,d,15.4Hz),5.27(1H,d,54Hz),5.06(1H,d,15.4Hz),4.62-4.57(1H,m),4.05-3.90(2H,m),3.82-3.67(2H,m),3.57-3.49(2H,m),3.46-3.07(8H,m),2.42-2.36(1H,m),1.98-1.85(2H,m),1.58-1.49(1H,m),1.38-1.23(4H,m),1.01及0.97(3H，兩個單峰，旋轉異構體)，0.69及0.67(3H，兩個單峰，旋轉異構體)。
(3R,4R)-3-((R)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-14-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-((S)-2-羥基丙醯基)-4,4-二甲基-8-側氧基-7,12-二氧雜-2,9-二氮雜十四烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載羥基處製備標題化合物。未純化。無色油狀物(40mg，0.023mmol，55%產率，52%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 912.2,Rt 1.34min。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酯
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(60℃，29小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相管柱層析純化，無色固體(19mg，0.022mmol，94%，產率，TFA鹽)。LC/MS(方法B)：[M+H]+ 769.3,Rt 3.79min。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.04(1H,br s),8.73(1H,br s),7.97-7.93(1H,m),7.78-7.72(1H,m),7.44-7.30(6H,m),7.16-7.09(1H,m),7.00(2H,s),6.93-6.88(1H,m),5.84(1H,s),5.40(1H,d,15Hz),5.25(1H,d,54Hz),5.06(1H,d,15Hz),4.62-4.56(1H,m),4.05-3.65(4H,m),3.45-3.40(2H, m),3.37-3.15(2H,m),3.12-3.05(2H,m),2.42-2.33(1H,m),2.00-1.85(2H,m),1.60-1.50(1H,m),1.35(3H,d,5.9Hz),1.32-1.24(1H,m),0.93(3H,s),0.73(3H,s)。
(3R,4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙醯氧基丙醯基)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-32-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,4-二甲基-8-側氧基-7,12,15,18,21,24,27,30-八氧雜-2,9-二氮雜三十烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載羥基處製備標題化合物。未純化。無色油狀物(28mg，0.024mmol，粗產物)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 1175.4,[M+NH4]+ 1192.5,Rt 1.34min。
(23-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷基)胺基甲酸(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)- 4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酯
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相管柱層析純化。呈TFA鹽之無色固體(2.3mg，2.005μmol,9%產率，100%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 1033.3；Rt 4.02min。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由管柱層析(40g矽膠，0至100% EtOAc於庚烷中)純化。無色油狀物(500mg，0.604mmol，60%產率，96%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 795.6,Rt 1.20min。
(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酸(980mg，1.005mmol)及N-(2-胺基乙基)順丁烯二醯亞胺(TFA鹽，511mg，2.010mmol)溶解於DMF(30ml)中，且相繼添加DIPEA(0.878mL，5.03mmol)、HATU(573mg，1.508mmol)。反應混合物在RT下攪拌1小時。反應混合物用EA稀釋且用鹽水洗滌(3次)。經組合之有機層以Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。藉由管柱層析(40g矽膠，0至100% EtOAC於庚烷中)純化殘餘物，提供無色油狀物(500mg，0.604mmol，60%產率，96%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 795.6,Rt 1.20min。
(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，無色固體(112mg，0.137mmol，55%產率，呈TFA鹽)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(200mg，0.252mmol)溶解於DCM(4ml)中。添加TFA(1.94mL，25.2mmol)且反應混合物在RT下攪拌1小時。濃縮且藉由逆相層析純化，生成無色固體(112mg，0.137mmol，55%產率，呈TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 695.4,Rt 3.02min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物 比率5：1，次要旋轉異構體之一些峰無法明確地指定)：δ 8.96(1.2H,br s),8.66(1.2H,br s),7.85-7.80(2H,m),7.80-7.75(1H,m),7.44-7.31(6.8H,m),7.16-7.09(1.6H,m),7.01(0.4H,s),6.99(2H,s),6.17(1H,s),5.72(0.2H,s),5.55(0.2H,d,15.9Hz),5.46(0.2H,d,15.9Hz),5.33(1H,d,15.0Hz),5.17-5.05(2.2H,m),4.80-4.74(0.2H,m),4.57-4.50(1H,m),4.47-4.41(0.2H,m),4.04-3.99(0.4H,m),3.95-3.90(2H,m),3.41(2H,t,6.0Hz),3.34-2.98(5.2H,m),2.31-2.22(1.2H,m),2.12(1H,d,13.8Hz),2.08-2.02(0.2H,m),1.99-1.89(1.2H,m),1.82(1H,d,13.8Hz),1.73-1.58(1H,m),1.35(3H,d,6.0Hz),1.11(0.6H,s),1.04(0.6H,s),1.00(3H,s),0.92(3H,s),0.77 (0.6H,d,6.0Hz)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由管柱層析(24g矽膠，0至100% EtOAc於庚烷中)純化。無色油狀物(108mg，0.109mmol，44%產率，85%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 839.5,Rt 1.21min。
(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法 (RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，呈TFA鹽之無色固體(23mg，0.026mmol，48%產率)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 739.4,Rt 3.20min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物 比率5：1，次要旋轉異構體之一些峰無法清除地鑑別)：δ 8.93(1.2H,br s),8.61(1.2H,br s),7.86-7.76(2.6H,m),7.72-7.67(1H,m),7.60-7.56(0.2H,m),7.46-7.30(7.2H,m),7.16-7.09(1.8H,m),6.99(2.4H,br s),6.19(1H,s),5.69(0.2H,s),5.58(0.2H,d,15.0Hz),5.48(0.2H,d,15.0Hz),5.33(1H,d,15.0Hz),5.20-5.05(2.2H,m),4.81-4.75(0.2H,m),4.58-4.51(1.2H,m),4.05-3.90(2.4H,m),3.37-3.25(7.2H,m),3.15-3.00(5.2H,m),2.60-2.55(1.2H,m),2.32-2.25(2H,m),2.21(1H,d,13.8Hz),2.12-2.02(0.4H,m),2.00-1.90(2.2H,m),1.74-1.60(1H,m),1.35(3H,d,6.6Hz),1.13(0.6H,s),1.07(0.6H,s),1.04(3H,s),0.93(3H,s),0.77(0.6H,d,5.4Hz)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
未純化。粗化合物
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 781.4,Rt 1.19min。
(R)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-3-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-2.2-二甲基丙醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，呈TFA鹽之無色固體(2.4mg，3.02μmol,7%產率，100%純)。LC/MS(方法B)：[M+H]+ 681.2；Rt 3.13min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物，報告主要旋轉異構體之峰)：δ 8.95(1H,br s),8.67(1H,br s),7.84-7.73(2H,m),7.65(1H,d,3.7Hz),7.45-7.28(6H,m),7.15-7.05(1H,m),6.94(2H,s),6.42(1H,s),5.22-5.18(2H,m),5.16-5.07(1H,m),4.57-4.51(1H,m),3.95-3.85(2H,m),3.40-3.25(3H,m),3.15-3.00(3H,m),2.30-2.22(1H,m),1.97-1.87(1H,m),1.80-1.65(1H,m),1.34-1.30(6H,m),1.02(3H,s)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
未純化。粗化合物
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 825.4,Rt 1.20min。
(R)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)-3-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-2,2-二甲基丙醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，呈TFA鹽之無色固體(2.4mg，2.86μmol,6%產率，100%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 725.3；Rt 3.28min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物，報告主要旋轉異構體之峰)：δ 8.93(1H,br s),8.63(1H,br s),7.83-7.72(1H,m),7.71-7.66(2H,m),7.46-7.26(6H,m),7.13-7.06(1H,m),6.99(2H,s),6.43(1H,s),5.25-5.17(2H,m),5.16-5.03(1H,m),4.57-4.51(1H,m),3.95-3.83(2H,m),3.46-3.39(2H,m),3.34-3.21(3H,m),3.19-3.01(4H,m),2.98-2.86(1H,m),2.30-2.22(1H,m),1.97-1.87(1H,m),1.75-1.60(1H,m),1.40(3H,s),1.34(3H,d,6.2Hz),1.02(3H,s)。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺甲醯 基)氧基)-2,2-二甲基丙基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載羥基處製備標題化合物。未純化。無色油狀物(27mg，0.032mmol，粗產物)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 853.4,Rt 1.33min。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(R)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-2,2-二甲基丙酯
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(60℃，17小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。呈TFA鹽之無色固體(4mg，4.85μmol,15%產率，100%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 711.3；Rt 3.59min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物，報告主要旋轉異構體之峰)：δ 9.01(1H,br s),8.73(1H,br s),7.90(1H,d,3.8Hz),7.80-7.74(1H,m),7.44-7.30(6H,m),7.16-7.08(2H,m),6.99(2H,s),6.04(1H,s),5.36(1H,d,15.2Hz),5.22-5.04(2H,m),4.59-4.54(1H,m),4.05-3.85(2H,m，與水峰重疊)，3.80-3.72(2H,m),3.45(2H,t,6.0Hz),3.40-3.25(2H,m),3.14-3.08(2H,m),2.36-2.28(1H,m),2.00-1.90(1H,m),1.80-1.68(1H,m),1.34(3H,d,6.2Hz),0.87(3H,s),0.80(3H,s)。
(3R,4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙醯氧基丙醯基)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-13-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,4-二甲基-7-側氧基-6,11-二氧雜-2,8-二氮雜十三烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載羥基處製備標題化合物。未純化。無色油狀物(37mg，0.042mmol，粗產物)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 897.5,Rt 1.34min。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(R)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-3-((S)-N-(((3S,4R)- 4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-2,2-二甲基丙酯
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(60℃，16小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，生成所需產物。呈TFA鹽之無色固體(7.7mg,7.98μmol,19%產率，90%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 755.3；Rt 3.60min。1H-NMR(DMSO,600MHz旋轉異構體混合物，報告主要旋轉異構體之峰)：δ 9.00(1H,br s),8.70(1H,br s),7.90(1H,d,3.9Hz),7.84-7.74(1H,m),7.45-7.32(6H,m),7.16-7.09(1H,m),7.01(2H,s),6.94(1H,t,5.9Hz),6.07(1H,s),5.37(1H,d,15.3Hz),5.21-5.06(2H,m),4.60-4.53(1H,m),4.07-3.85(2H,m),3.80-3.70(2H,m，與水峰重疊)，3.60-3.22(7H,m，與水峰重疊)，3.20-3.00(3H,m),2.35-2.27(1H,m),2.00-1.90(1H,m),1.85-1.70(1H,m),1.34(3H,d,6.1Hz),0.91(3H,s),0.83(3H,s)。
步驟1：(3R,4R)-3-((R)-18-疊氮基-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((S)-2-羥基丙醯基)-4,4-二甲基-6-側氧基-10,13,16-三氧雜-2,7-二氮雜十八烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酸(60mg，0.043mmol)及11-疊氮基-3,6,9三氧雜十一-1-胺(0.017mL，0.086mmol)溶解於DMF(2ml)中，且相繼添加DIPEA(0.037mL，0.214mmol)、HATU(24.42mg，0.064mmol)。反應混合物在室溫下攪拌1小時。用EA稀釋且用鹽水洗滌(*3)。經組合之有機層經乾燥且濃縮，生成37mg(100%產率)所需產物，其無需進一步純化即用於下一步驟中。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 873.5,Rt 1.27min。
步驟2：(3R,4R)-3-((R)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-18-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-((S)-2-羥基丙醯基)-4,4-二甲基-6-側氧基-10,13,16-三氧雜-2,7-二氮雜十八烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
向含(3R,4R)-3-((R)-18-疊氮基-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-((S)-2-羥基丙醯基)-4,4-二甲基-6-側氧基-10,13,16-三氧雜-2,7-二氮雜十八烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(步驟1)(37mg，0.043mmol)及1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(9.94mg，0.074mmol)之乙腈(1mL)中相繼添加CuI(9.34mg，0.049mmol)於水(1mL)中之溶液、TEA(6.83μl，0.049mmol)。反應混合物在室溫下攪拌60小時。反應混合物經過濾，用乙酸乙酯稀釋，用鹽水洗滌且經Na2SO4乾燥。藉由管柱層析(12g矽膠，0至20% DCM於甲醇中)純化。無色油狀物(24mg，0.013mmol，27%產率，55%純)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 1008.5,Rt 1.15min。
步驟3：(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，生成呈無色固體狀之所需產物(2.8mg，2.60μmol,21.68%產率，TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 908.5,Rt 3.08min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物 比率5：1，次要旋轉異構體之一些峰無法明確地指定)：δ 8.97(1.2H,br s),8.69(1.2H,br s),7.96(1.2H,s),8.03-7.93(0.2H,m),7.85-7.75(3.4H,m),7.59-7.55(0.2H,m),7.45-7.29(7.4H,m),7.16-7.09(1.6H,m),7.07(2H,s),6.21(1H,s),5.72(0.2H,s),5.59(0.2H,d,16.2Hz),5.48(0.2H,d,16.2Hz),5.34(1H,d,15.0Hz),5.20-5.06(2.2H,m),4.82-4.76(0.2H,m),4.65(2.4H,s),4.57-4.52(1H,m),4.50-4.44(2.8H,m),4.07-4.02(0.2H,m),3.97-3.93(2H,m),3.38(2.4H,t,5.1Hz),3.52-3.40(10H,m),3.32-3.25(2.4H,m),3.17-3.12(2.4H,m),3.07-3.02(0.4H,m),2.32-2.25(1.2H,m),2.22(1H,d,15.0Hz),2.12-2.01(0.6H,m),2.00-1.90(2.2H,m),1.75-1.60(1H,m),1.36(3H,d,6.0Hz),1.15(0.6H,s),1.09(0.6H,s),1.06(3H,s),0.94(3H,s),0.78(0.6H,d,6.0Hz)。
(3R,4R)-3-((S)-2-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲 基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-14-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-3,8-二側氧基-7,12-二氧雜-2,4,9-三氮雜十四烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載羥基處製備標題化合物。藉由用DCM/MeOH溶離之急驟層析(24g，矽膠)純化。無色油狀物(70mg，0.077mmol，51%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 910.4,Rt 1.35min。
(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法 (RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，生成呈無色固體狀之所需產物(35mg，0.038mmol，49%產率，TFA鹽)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 810.2,Rt 4.10min。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 8.94(1H,bs),8.48(1H,bs),7.92(1H,d,3.9Hz),7.78-7.70(1H,m),7.45-7.25(7H,m),7.15-7.07(1H,m),7.03(2H,s),6.45(1H,d,7.4Hz),5.56(1H,s),5.39(1H,d,15.3Hz),5.30-5.07(2H,m),4.05-3.85(4H,m),3.84-3.70(1H,m),3.60-3.45(6H,m),3.43-3.20(6H,m),3.12-3.02(2H,m),2.47-2.37(1H,m),2.30-2.10(1H,m),1.82-1.67(1H,m),1.54-1.35(2H,m),1.30-1.20(1H,m),1.17-1.05(6H,m),0.97-0.89(1H,m)。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載胺處製備標題化合物。未純化(36mg，純度38%，粗產物，產率69%，0.016mmol)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 851.5；Rt 1.25min。
(S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2,5-二 側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(60℃，20小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到呈TFA鹽之無色固體(6mg，6.82μmol,43%產率，92%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 709.4；Rt 3.27min。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.05(1H,br s),8.75(1H,br s),7.93(1H,d,3.8Hz),7.80-7.74(1H,m),7.74-7.66(1H,m),7.44-7.30(6H,m),7.16-7.09(1H,m),6.99(2H,s),5.84(1H,s),5.38(1H,d,15.4Hz),5.25-5.19(1H,m),5.09(1H,d,15.4Hz),4.63-4.55(1H,m),4.05-3.90(2H,m),3.58-3.53(2H,m，與水峰重疊)，3.35-3.15(2H,m),2.86-2.78(2H,m),2.41-2.35(1H,m),2.31-2.23(2H,m),1.97-1.85(2H,m),1.41-1.32(4H,m),1.17-1.06(1H,m),0.92(3H,s),0.79(3H,s)。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載胺處製備標題化合物。未純化(33mg，產率100%，粗產物，0.037mmol)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 895.5；Rt 1.26min。
(S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(60℃，20小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到呈TFA鹽之無色固體(10mg，11.02μmol,30%產率，97%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 753.4；Rt 3.33min。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.05(1H,br s),8.75(1H,br s),7.93(1H,d,3.6Hz),7.80-7.74(1H,m),7.57-7.52(1H,m),7.45-7.30(6H,m),7.16-7.07(1H,m), 7.01(2H,s),5.84(1H,s),5.38(1H,d,15.3Hz),5.32-5.17(1H,m),5.09(1H,d,15.3Hz),4.63-4.55(1H,m),4.05-3.85(2H,m，與水峰重疊)，3.55-3.51(4H,m),3.47-3.43(2H,m),3.40-3.15(2H,m),2.90-2.80(2H,m),2.42-2.32(1H,m),2.23-2.16(2H,m),1.92-1.88(1H,m),1.45-1.30(4H,m),1.20-1.10(1H,m),0.93(3H,s),0.80(3H,s)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)嗎啉-2-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載胺處製備標題化合物。藉由用DCM/MeOH溶離之急驟層析(24g，矽膠)純化。無色油狀物(50mg，0.059mmol，72%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 849.2；Rt 1.26min。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)嗎啉-2-甲醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，6小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到呈TFA鹽之無色固體(12mg，0.013mmol，45%產率，95%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 749.2；Rt 3.27min。1H-NMR(DMSO,600MHz，旋轉異構體混合物，120℃)：δ 7.83-7.77(1H,m),7.67(1H,d,3.7Hz),7.45-7.32(3H,m),7.30-7.15(3H,m),7.10-7.07(1H,m),6.93(2H,s),5.40-5.10(4H,m),4.40-4.15(1H,m),4.05-3.85(4H,m),3.76-3.62(4H,m),3.55-3.25(7H,m),2.95-2.85(1H,m),2.75-2.55(5H,m),2.37-2.20(1H,m),1.55-1.25(3H,m),1.05-0.85(1H,m)。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯基)嗎啉-2-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載胺處製備標題化合物。藉由用DCM/MeOH溶離之急驟層析(12g，矽膠)純化。黃色油狀物(30mg，0.034mmol，57%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 893.3；Rt 1.27min。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)嗎啉-2-甲醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，4小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到呈TFA鹽之無色固體(22mg，0.024mmol，72%產率，99%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 793.1；Rt 3.56min。
(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基)嗎啉-2-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載胺處製備標題化合物。藉由用DCM/MeOH溶離之急驟層析(4g，矽膠)純化。黃色油狀物(13mg，0.014mmol，35%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 891.3；Rt 1.31min。
(S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)嗎啉-2-甲醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，6小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到呈TFA鹽之無色固體(10mg，10.72μmol,74%產率，97%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 791.3；Rt 3.72min。
(3R,4R)-3-(((R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)嗎啉-2-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載胺處製備標題化合物。藉由用DCM/MeOH溶離之急驟層析(12g，矽膠)純化。無色油狀物(15mg，0.018mmol，60%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 849.2；Rt 1.30min。
(R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)嗎啉-2-甲醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，3小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到呈TFA鹽之無色固體(15mg，0.017mmol，95%產率，99%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 749.1；Rt 3.56min。
(3R,4R)-3-(((R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基)嗎啉-2-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載胺處製備標題化合物。藉由用DCM/MeOH溶離之急驟層析(4 g，矽膠)純化。黃色油狀物(22mg，0.025mmol，84%產率)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 891.2；Rt 1.33min。
(R)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)嗎啉-2-甲醯胺
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，6小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到呈TFA鹽之無色固體(15mg，0.017mmol，66%產率，99%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 791.2；Rt 3.88min。
(3R,4R)-3-((S)-2-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-32-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-3,8-二側氧基-7,12,15,18,21,24,27,30-八氧雜-2,4,9-三氮雜三十二烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
藉由類似於有效負載與連接子組分之連接中所述方法之方法在有效負載羥基處製備標題化合物。未純化。黃色油狀物(63mg，0.054mmol，83%產率，粗產物)。
LC/MS(方法A)：[M+H]+ 1174.6,),[M+NH4]+ 1191.7,Rt 1.35min。
(23-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷基)胺基甲酸(S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(4-甲基四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙酯
藉由類似於連接子-有效負載組合之Boc保護基脫除之一般方法(RT，1小時)中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純 化，生成呈無色固體狀之所需產物(10mg，8.33μmol,16%產率，TFA鹽)。
LC/MS(方法Bv2)：[M+H]+ 1074.4,Rt 4.49min。
(3-(N-((R)-1-(3-苯甲基-7-氯-4-側氧基-3,4-二氫喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基)-4-甲基苯甲醯胺基)丙基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯
藉由類似於連接連接子至式(II)之有效負載化合物中之胺的一般程序中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到無色固體(8mg，6.74μmol,14%產率，94%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 1115.6；Rt 5.71min。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 9.96(1H,s),8.23(1H,d,J=8.6Hz),8.07(1H,d,J=7.5Hz),7.83-7.74(2H,m),7.65(1H,dd,J=8.6,2.1Hz),7.61-7.54(2H,m),7.41-7.10(12Hm),7.00(2H,s),6.77(1H,t,J=5.9Hz),5.97(2H,br s),5.88(1H,d,J=16.3Hz),5.53(1H,d,J=10.5Hz),5.07(1H,d,J=16.3Hz),4.89-4.75(2H,m),4.43-4.33(1H,m),4.19(1H,dd,J=8.6,6.7Hz),3.40-3.20(6H,m),3.08-2.90(2H,m),2.79-2.68(1H,m),2.46-2.40(2H,m),2.31(3H,s),2.24-2.04(2H,m),2.02-1.90(1H,m),1.76-1.10(10H,m),0.92-0.79(9H,m),0.48(3H,d,J=6.4Hz)。
(3-(N-((R)-1-(3-苯甲基-7-氯-4-側氧基-4H- 烯-2-基)-2-甲基丙基)- 4-甲基苯甲醯胺基)丙基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯
藉由類似於連接連接子至式(II)之有效負載化合物中之胺的一般程序中所述方法之方法來製備標題化合物。藉由逆相層析純化，得到無色固體(26mg，23μmol,38%產率，99%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 1115.5；Rt 5.58min。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ 9.96(1H,s),8.11-8.04(2H,m),7.90(1H,s),7.83-7.76(1H,d,J=8.6Hz),7.61-7.52(3H,m),7.29-7.11(12H,m),7.00(2H,s),5.99(2H,br s),5.76(1H,d,J=10.0Hz),4.90-4.77(2H,m),4.42-4.32(1H,m),4.23-4.12(2H,m),3.95-3.85(1H,m),3.42-3.25(3H,m),3.06-2.88(2H,m),2.64-2.53(6H,m),2.31(3H,s),2.25-2.05(1H,m),2.02-1.87(1H,m),1.75-1.65(1H,m),1.65-1.29(7H,m),1.25-1.10(3H,m),0.97(3H,d,J=6.6Hz),0.87-0.79(6H,m),0.57-0.50(3H,m)。
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)(2-羥基乙基)胺甲醯基)氧基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在N2下：向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(50mg，0.071mmol)於DMF 5mL中之溶液中相繼添加DIPEA(0.374mL，2.140mmol)、碳酸雙(4-硝基苯基)酯(50mg，0.164mmol)。反應混合物在室溫下攪拌16小時。在藉由LC/MS(uplc)發現完成時，添加1-(2-((2-羥基乙基)胺基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(連接子1，TFA鹽)(180mg，0.604mmol)，且反應混合物在室溫下攪拌16小時。添加乙酸乙酯及冷水，有機層用鹽水洗滌兩次，經Na2SO4乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化(4g矽膠，0至100% EtOAC於庚烷中，9mg，0.071mmol，14%)後獲得呈無色油狀之所需產物。LC/MS(方法A)：MH+ 911.7,1.26min。
(3R,4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙醯氧基丙醯基)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-9-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-4,4,14,14-四甲基-8,12-二側氧基-7,13-二氧雜-2,9-二氮雜十五烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
在N2下：向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4- (2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(50mg，0.071mmol)於DMF 5mL中之溶液中相繼添加DIPEA(0.374mL，2.140mmol)、碳酸雙(4-硝基苯基)酯(50mg，0.164mmol)。反應混合物在室溫下攪拌16小時。在藉由LC/MS(uplc)發現完成時，添加3-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)丙酸第三丁酯(連接子2，TFA鹽)(54.6mg，0.143mmol)，且反應混合物在室溫下攪拌16小時。添加乙酸乙酯及冷水，有機層用鹽水洗滌兩次，經Na2SO4乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。吸附於Isolute上。在藉由管柱層析純化(4g矽膠，0至100% EtOAC於庚烷中，40mg，0.040mmol，56%)後獲得呈無色油狀之所需產物。LC/MS(方法A)：MH+ 995.8,1.47min。
3-((((R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁氧基)羰基)(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)丙酸
(3R,4R)-3-((R)-2-((S)-2-乙醯氧基丙醯基)-3-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-9-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-4,4,14,14-四甲基-8,12-二側氧基-7,13-二氧雜-2,9-二氮雜十五烷基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(40mg，0.040mmol)溶解於乙腈(1mL)及水(1mL)之混合物中。添加TFA(0.155mL，2.010mmol)且反應混合物在60℃下攪拌3天。
在藉由逆相管柱層析純化之後獲得所需產物(13mg，35%，呈TFA鹽)。LC/MS(方法B)：MH+ 797.4,3.43min。在室溫下藉由1H-NMR觀測旋轉異構體之混合物，一些峰隱藏在水下。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 12.27(1H,br s),8.98(1H,br s),8.63(1H,br s),7.96(1H,s),7.76(1H,s),7.45-7.30(6H,m),7.16-7.09(1H,m),6.97及6.96(2H，兩個單峰，旋轉異構體)，5.83(1H,s),5.45-5.37(1H,m),5.26(1H,d,54Hz),5.09-5.03(1H,m),4.62-4.57(1H,m),4.04-3.90(2H,m),3.82-3.66(2H,m),2.46-2.35(3H,m),2.00-1.85(2H,m),1.55-1.20(5H,m),1.03及0.96(3H，兩個單峰，旋轉異構體)，0.67 and 0.63(3H，兩個單峰，旋轉異構體)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酯
(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺甲醯基)氧基)-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(50mg，0.073mmol)溶解於乙腈(1mL)及水(0.5mL)之混合物中。添加TFA(0.222mL，2.88mmol)且反應混合物在60℃下攪拌20小時。
在藉由逆相管柱層析純化之後獲得所需產物(17mg，34%，呈 TFA鹽)。LC/MS(方法B)：MH+ 725.4,3.59min。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.01(1H,br s),8.68(1H,br s),7.96(1H,s),7.76(1H,s),7.45-7.30(6H,m),7.15-7.03(2H,m),6.99(2H,s),5.84(1H,s),5.40(1H,d,15Hz),5.25(1H,d,54Hz),5.06(1H,d,15Hz),4.62-4.56(1H,m),4.05-3.65(4H,m),3.45-3.40(2H,m),3.37-3.15(2H,m),3.12-3.05(2H,m),2.42-2.33(1H,m),2.00-1.85(2H,m),1.60-1.50(1H,m),1.35(3H,d,5.9Hz),1.32-1.24(1H,m),0.93(3H,s),0.73(3H,s)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(R)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酯
步驟1(a)-活化：向(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(128mg)於DMF(4mL)中之攪拌溶液中添加DIPEA(304μl)及碳酸雙(4-硝基苯基)酯(88mg)。混合物在RT下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應完成，轉化為所需中間產物。
步驟1(b)-胺解：向以上粗產物混合物中添加N-(2-胺基乙基)順丁烯二醯亞胺三氟乙酸酯(98mg)。RM在50℃下再攪拌2小時，此時LC-MS顯示轉化為所需中間產物。將RM轉移至分液漏斗中且添加去離子水(40mL)及乙酸乙酯(40mL)。在萃取之後，水層用乙酸乙酯(40ml) 再萃取且經組合之有機物接著用飽和鹽水(80mL)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且濾液在真空中濃縮，生成黃色油狀物。粗產物產率：270mg。此物質直接用於下一步驟中。
步驟2：BOC及MOM及醯基保護基脫除：來自步驟1(b)之粗產物溶解於乙腈(1ml)中且添加6M HCl(1mL)。RM在60℃下攪拌3小時，此時LC-MS顯示反應已幾乎完成，脫除保護基，生成最終產物。RM經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且所得透明溶液藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。含產物之溶離份凍乾隔夜，生成白色鬆散粉末。產率：24.7mg。
UPLC-MS：Rt=0.85min；MS m/z[M+H]+ 741.3；方法A。
UPLC-MS：Rt=3.30min；MS m/z[M+H]+ 741.3；方法B。
與目標結構一致之1H-NMR(HSQC)。
(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基甲酸(R)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁酯
步驟1：將三光氣(119mg)於無水DCM(5mL)中之攪拌溶液冷卻至0℃且置於氬氣氛圍下。逐滴添加(3R,4R)-3-(((S)-2-乙醯氧基-N-((R)-1-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-4-羥基-2,2-二甲基丁基)丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(80mg)及DIPEA(0.258ml)於DCM(2ml)中之溶液且使RM溫至RT。在RT下繼續攪拌2小時。
步驟2：將以上粗RM冷卻至0℃且逐滴添加N-(2-胺基乙基)順丁烯二醯亞胺三氟乙酸酯(150mg)及DIPEA(0.258ml)於DCM(3mL)中之溶液。使RM溫至RT且繼續攪拌10分鐘。溫度接著上升至50℃且繼續攪拌1小時，此時LC-MS顯示轉化為所需中間產物。RM在高真空下濃縮，生成暗橙色油狀物。此物質直接用於下一步驟中。
步驟3：BOC、MOM及醯基保護基脫除：來自步驟2之粗產物溶解於乙腈(2ml)中且添加6M HCl(1.6mL)。RM在60℃下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應已完成，脫除保護基，生成最終產物。RM經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且所得溶液分為2x2mL批量且藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。
組合含產物之溶離份且接著凍乾隔夜，生成白色鬆散粉末。產率：34.3mg
UPLC-MS：Rt=0.74min；MS m/z[M-H]- 757.3；方法A。
UPLC-MS：Rt=2.94min；MS m/z[M+H]+ 759.2；方法B。
1H NMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 10.10(s,1H),9.03(s,1H),8.70(s,1H),7.93(s,1H),7.81-7.73(m,1H),7.41-7.29(m,1H),7.19-7.10(m,1H),7.06(t,J=6.2Hz,1H),6.98(s,2H),6.70-6.58(m,2H),6.53(d,J=10.5Hz,1H),5.79(s,1H),5.37-5.21(m,2H),4.95(d,J=15.6Hz,1H),4.60(q,J=6.3Hz,1H),4.03(dd,J=16.1,4.4Hz,1H),3.89(dd,J=15.9,7.4Hz,1H),3.82(q,J=8.3Hz,2H),3.65-3.37(m,2H),3.37-3.17(m,2H),3.08(q,J=5.9Hz,2H),2.47-2.33(m,1H),2.07-1.84(m,2H),1.69(dt,J=14.2,7.0Hz,1H),1.35(d,J=6.2Hz,4H),0.95(s,3H),0.77(s,3H)。
(R)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺
步驟1：向(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸(80mg)及DIPEA(189μL)於無水DMF(2mL)中之溶液中添加HATU(82mg)。RM在RT下攪拌10分鐘且接著添加N-(2-胺基乙基)順丁烯二醯亞胺三氟乙酸酯(92mg)。RM在RT下攪拌過週末，此時LC-MS顯示反應完成。RM分配於二氯甲烷(40mL)與去離子水(40mL)之間。將混合物轉移至分液漏斗中且在萃取之後，水相用二氯甲烷(40ml)再萃取。經組合之有機物用去離子水(40ml)、飽和鹽水(50ml)洗滌，經MgSO4乾燥，經由1號濾紙過濾且在真空中濃縮，生成棕色蠟狀油性物質。粗產物產率：251mg。產物仍含有一些DMF，但直接用於下一步驟中：
步驟2：BOC、MOM及醯基保護基脫除：向來自步驟1之粗產物中添加乙腈(4ml)及6M HCl(1.2mL)。RM在60℃下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應已完成，脫除保護基，生成所需最終產物。RM經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且所得透明溶液分為2x2.6mL批量且藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。組合含產物之溶離份且凍乾隔夜，生成米色/奶油色鬆散粉末。產率：7mg。
UPLC-MS：Rt=2.72min；MS m/z[M+H]+ 711.3；方法B。
與目標結構一致之1H-NMR(HSQC)。
(R)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-羥基苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺
步驟1：向(R)-4-((S)-2-乙醯氧基-N-(((3R,4R)-1-(第三丁氧基羰基)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)丙醯胺基)-4-(4-(2,5-二氟苯基)-1-(3-氟-5-(甲氧基甲氧基)苯甲基)-1H-咪唑-2-基)-3,3-二甲基丁酸(144mg)及DIPEA(450μL)於無水DCM(2mL)中之溶液中添加HATU(147mg)。RM在RT下攪拌10分鐘且接著添加N-(2-胺基乙基)順丁烯二醯亞胺三氟乙酸酯(164mg)。RM在RT下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應完成，生成中間產物。RM在真空中濃縮且殘餘物溶解於乙腈(3mL)中。溶液經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且分成2x1.5mL批量。此等批量藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。
組合含產物之溶離份且在真空中濃縮，得到白色粉末。產率：43mg。
步驟2：BOC、MOM及醯基保護基脫除：來自步驟1之產物溶解於乙腈(2ml)中且添加6M HCl(1.0mL)。RM在60℃下攪拌2小時，此時LC-MS顯示反應已實際上完成，脫除保護基，生成最終產物。RM經由0.2μm PTFE筒過濾器過濾且所得溶液分為2x2mL批量且藉由逆相製備規模HPLC方法C純化。
組合含產物之溶離份且接著凍乾隔夜，生成白色鬆散粉末。產率：23.2mg。
UPLC-MS：Rt=2.56min；MS m/z[M-H]- 727.4；方法B。
與目標結構一致之1H-NMR(HSQC)。
半胱胺酸代謝物： 合成半胱胺酸代謝物之一般程序：
向Boc-連接子-有效負載(0.1mmol，1eq)於乙腈(1mL)中之溶液中添加L-半胱胺酸(1mmol，10eq)及水(0.1mL)。反應混合物在室溫下攪拌1小時。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，粗產物(Boc-Cys-代謝物)用於下一步驟中。
向前一步驟之溶液中添加TFA(150mmol)且反應混合物在室溫下攪拌。在藉由LC/MS(uplc，方法A)發現反應完成時，粗產物藉由逆相管柱層析(PrepLC方法C或D)，梯度MeCN(+0.1% TFA)於H2O(+0.1% TFA)中來純化。產物以TFA鹽形式經分離。
(2R)-2-胺基-3-((1-((1R,5S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-5-甲基-3,8-二側氧基-1-(四氫-2H-哌喃-4-基)-7,12-二氧雜-2,4,9-三氮雜十四烷-14-基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸。
Boc-Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：MH+ 1017.6,1.07min。(方法A)。
21mg，0.018mmol，16%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.17-8.59(1H,m),8.81-8.59(1H,m),8.58-8.31(3H,m),7.83-7.69(2H,m),7.45-7.36(2H,m),7.35-7.21(4H,m),7.14-6.98(2H,m),6.43-6.23(1H,m),5.38-5.28(2H,m),5.27-5.10(2H,m),4.31-4.21(1H,m),4.15-4.03(1H,m),4.00-3.80(4H,m),3.78-3.68(1H,m),3.27-3.15(5H,m),3.14-3.02(4H,m),2.65-2.47(4H,m),2.33-2.15(1H,m),2.07-1.90(1H,m),1.46-1.32(1H,m),1.28-1.15(2H,m)1.14-1.02(3H,m),0.79-0.58(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 917.6,0.80min。(方法A)。
(3R)-6-((1R,5S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-5-甲基-3,8,16-三側氧基-1-(四氫-2H-哌喃-4-基)-7,12-二氧雜-2,4,9,15-四氮雜十七烷-17-基)-5-側氧基硫嗎啉-3-甲酸。
4mg，0.0037mmol，99%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ-NMR(DMSO,600MHz)：.基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-5-甲基-3,8,16-三側氧基-42-6.21(1H,m),5.40-5.09(4H,m),4.38-4.26(1H,m),4.06-3.80(5H,m),3.80-3.68(1H,m), 3.68-3.55(2H,m),3.26-3.07(8H,m),3.05-2.91(1H,m),2.80-2.69(1H,m),2.66-2.54(1H,m),2.36-2.15(1H,m),2.09-1.91(1H,m),1.47-1.35(1H,m),1.32-1.15(2H,m),1.14-1.04(3H,m),0.78-0.59(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：M+ 917.4,084min。
(2R)-2-胺基-3-((1-((1-((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸。
Boc-Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：MH+ 967.5,1.06min。(方法A)。
10mg，0.009mmol，62%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.20-8.90(1H,m),8.69-8.23(4H,m),8.08-7.97(1H,m),7.83-7.70(2H,m),7.41-7.36(2H,m),7.35-7.29(2H,m),7.26-7.22(2H,m),7.14-7.08(1H,m),6.58-6.31(1H,m),5.39-5.07(4H,m),4.72-4.58(2H,m),4.49-4.34,(2H,m),4.33-4.06(4H,m),3.92-3.81(2H,m),3.79-3.67(2H,m),3.11-2.98(1H,m),2.70-2.43(4H,m),2.38-2.18(1H,m),2.06-1.80(1H,m),1.41-1.29(1H,m),1.28-1.19(1H,m),1.18-1.02(4H,m),0.75-0.55(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 867.5,0.78min。(方法A)。
(2R)-2-胺基-3-((1-(4-(((S)-2-(3-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-3-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)脲基)丙基)胺基)-4-側氧基-2-磺基丁基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸。
Boc-cys-代謝物(非對映異構體混合物)：LC/MS(uplc)：MH+ 1051.5,0.97min。(方法A)。
在Boc保護基脫除後使用逆相層析(PrepLC方法A)分離非對映異構體混合物。
異構體A，27mg，0.024mmol，8%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.12-8.96(1H,m),8.96-8.78(1H,m),8.48-8.24(3H,m),7.97-7.84(1H,m),7.81-7.65(2H,m),7.48-7.37(2H,m),7.36-7.24(4H,m),7.17-7.01(1H,m),6.18-6.01(1H,m),5.49-5.16(4H,m),4.34-4.20(1H,m),4.15-4.05(1H,m),3.96-3.66(6H,m),2.87-2.64(4H,m),2.61-2.39(3H,m),,2.13-1.97(1H,m),1.93-1.58(2H,m),1.50-1.36(1H,m),1.35-1.20(1H,m,1.19-0.93(4H,m),0.71-0.52(1H,m)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 951.5,0.79min。(方法A)。
異構體B，28mg，0.025mmol，8%。1H-NMR(DMSO,600MHz)：δ 9.14-8.96(1H,m),8.86-8.61(1H,m),8.51-8.24(3H,m),8.11- 7.89(1H,m),7.80-7.65(2H,m),7.49-7.38(2H,m),7.37-7.23(4H,m),7.16-7.01(1H,m),6.01-5.90(1H,m),5.49-5.17(4H,m),4.35-4.19(1H,m),4.16-3.96(2H,m),3.92-3.66(6H,m),3.11-2.98(1H,m),2.89-2.77(1H,m),2.75-2.59(1H,m),2.58-2.44(4H,m),2.10-1.93(1H,m),1.72-1.56(1H,m),1.41-1.24(2H,m),1.21-1.09(1H,m),1.08-0.95(3H,m),0.75-0.53(1H)。缺失隱藏在溶劑峰下之信號。LC/MS(uplc)：MH+ 951.5,0.81min。(方法A)。
(2R)-2-胺基-3-((1-((1R,5S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-5-甲基-3,8-二側氧基-1-(四氫-2H-哌喃-4-基)-7-氧雜-2,4,9-三氮雜十五烷-15-基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸。
Boc-Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：M+ 1029.7,1.12min(方法A)。
Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：M+ 929.6,0.83min(方法A)。
(2R)-2-胺基-3-((1-((1R,4S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-4-甲基-3,6-二側氧基-1-(四氫-2H-哌喃-4-基)-5,10-二氧雜-2,7-二氮雜十二烷-12-基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸。
Boc-Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：M+ 988.5,1.10min(方法A)。
Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：M+ 888.5,0.79min(方法A)。
(3R)-6-((1R,4S)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-4-甲基-3,6,14-三側氧基-1-(四氫-2H-哌喃-4-基)-5,10-二氧雜-2,7,13-三氮雜十五烷-15-基)-5-側氧基硫嗎啉-3-甲酸。
Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：M+ 888.5,0.83min(方法A)。
(2R)-2-胺基-3-((1-(6-(((((S)-1-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)氧基)羰基)胺基)己基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸。
Boc-Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：M+ 1000.5,1.14min(方法A)。
Cys-代謝物：LC/MS(uplc)：M+ 900.4,0.83min(方法A)。
(2R)-2-胺基-3-((1-(3-((S)-2-(((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)胺甲醯基)嗎啉基)-3-側氧基丙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸
步驟1：向含(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-4-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)嗎啉-2-甲醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(25mg，0.029mmol)之乙腈(體積：1.5ml)及水(體積：0.500ml)中添加L-半胱胺酸(5.35mg，0.044mmol)，且RM在RT下攪拌2小時。
步驟2：添加HCl(25%水溶液)(0.179mL，1.472mmol)且RM在RT下攪拌2小時，添加另外HCl(25%水溶液)(0.179mL，1.472mmol)且RM在RT下攪拌4小時。濃縮。
藉由逆相層析純化，得到無色固體雙重TFA鹽(16mg，0.015mmol，50%產率，99%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 870.2；Rt 2.73min。
(2R)-2-胺基-3-((1-(2-((R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺基)乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸
步驟1：向含(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(30mg，0.038mmol)之乙腈(體積：1.5ml)及水(體積：0.500ml)中添加L-半胱胺酸(13.7mg，0.113mmol)，且RM在RT下攪拌16小時。
步驟2：添加TFA(0.145mL，1.887mmol)且RM在RT下攪拌60小時。濃縮。
藉由逆相層析純化，得到無色固體雙重TFA鹽(37mg,0.035mmol，93%產率，99%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 816.3；Rt 2.37min。
(2R)-2-胺基-3-((1-(2-(2-((R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺基)乙氧基)乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸
步驟1：向含(3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)-4-氟吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(54mg，0.055mmol，85%純)之乙腈(體積：1.5ml)及水(體積：0.500ml)中添加L-半胱胺酸(19.9mg，0.164mmol)，且RM在RT下攪拌16小時。
步驟2：添加TFA(0.211mL，2.74mmol)且RM在60℃下攪拌4小時。濃縮。
藉由逆相層析純化，得到無色固體雙重TFA鹽(48mg，0.044mmol，81%產率，99%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 860.5；Rt 2.50min。
(2S)-2-胺基-3-((1-((S)-2-((((R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁氧基)羰基)胺基)-2-羧基乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸
獲得11mg呈TFA鹽之無色粉末(11mg，9.84μmol，13.2%產率，100%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 890.3；Rt 2.54/2.63min(兩種非對映異構體)。
製備化合物5A、5D及5E之半胱胺酸代謝物，且均為高度有效Eg5抑制劑，IC-50分別為<0.5nM、0.5nM及0.6nM。
異化產物合成之一般方案2
向(L)-半胱胺酸(10eq)於水(0.1M)中之溶液中添加含Boc保護之連接子-有效負載(1.0eq)之DMF(0.1M)，且反應在室溫下攪拌1小時。用乙酸乙酯反應。組合有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮至乾。將殘餘物溶解於DCM(0.1M)中且添加三氟乙酸(50eq)。反應在RT下攪拌2小時，接著將其濃縮至乾。藉由用0-100%甲醇於DCM中溶離之矽石層析純化粗產物，得到標題化合物。
(2R)-2-胺基-3-((1-(2-(((((3S,4S)-4-(((S)-N-((R)-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(四氫-2H-哌喃-4-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)甲基)吡咯啶-3-基)氧基)羰基)胺基)乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸
49%產率；UPLC-MS：Rt=1.66及1.67min；MS m/z[M+H]+ 842.3；方法A。1H-NMR(DMSO,400MHz，旋轉異構體及非對映異構體之混合物)：δ 7.99-6.77(12H,m),5.64-4.99(3H,m),4.87-4.85(1H,m),4.53-4.51(1H,m),4.03-2.05(25H,m),1.51-0.57(7H,m)。
重排之半胱胺酸代謝物： (3R)-6-(2-((2-((R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺基)乙基)胺基)-2-側氧基乙基)-5-側氧基硫嗎啉-3-甲酸
(2R)-2-胺基-3-((1-(2-((R)-4-(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-((S)-N-(((3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基)甲基)-2-羥基丙醯胺基)-3,3-二甲基丁醯胺基)乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸(17mg，0.016mmol)溶解於乙腈(體積：0.5mL)中且添加1.5mL PBS緩衝液(pH7.2)。RM在RT下攪拌10天。藉由逆相層析純化，得到無色固體雙重TFA鹽(9mg，0.016mmol，57%產率，95%純)。
LC/MS(方法B)：[M+H]+ 816.5；Rt 2.54min。
合成ADC
獲得ADC且如以下一般結合程序中所述加以表徵。
連接子-有效負載(L-P)與抗原結合部分結合之一般方法
有效負載在2步驟方法中在部分還原之鉸鏈及鏈間二硫化物處結合於抗原結合部分(例如抗體之IgG1 κ或λ)。在含有2mM EDTA之PBS中的濃度為5-10mg/ml之抗體首先在37℃下由50mM巰基乙胺(以固體形式添加)部分還原1至1.5小時。在脫鹽及添加1% w/v PS-20清潔劑之 後，經部分還原之抗體(1-2mg/ml)在4℃下與每10mg抗體0.5-1mg之量的連接子-有效負載化合物反應隔夜，該化合物以10mg/ml溶解於DMSO或其他合適溶劑中。抗體-藥物結合物藉由蛋白A層析來純化。在用PBS進行基線洗滌之後，結合物用50mM檸檬酸鹽(pH 2.7)、140mM NaCl溶離，中和且無菌過濾。表5-6中描述之ADC根據此程序來製備。此程序產生每個抗體4-6個有效負載分子之平均藥物負載：此一般程序之產物的特定實例展示於表5-6中，該等表鑑別連接至具有曲妥珠單抗序列之抗體的鍵聯基團-有效負載部分，且提供經量測之DAR值及各結合物之%聚集數據。來自表5-6之所選結合物的生物資料提供於以下部分及相關圖中。
一種不同方法用於其中新的半胱胺酸殘基藉由蛋白質工程改造作為結合位點引入之抗體。為了還原所有原生二硫鍵及在經工程改造之半胱胺酸殘基的半胱胺酸或GSH加合物之間的二硫鍵，將新鮮製備之DTT添加至先前經純化之抗體的Cys突變體中，至20mM之最終濃度。在37℃下用DTT培育1小時之後，混合物在4℃下針對PBS透析3天，其中每天緩衝液交換以移除DTT及再氧化原生二硫鍵。一種替代方法係經由脫鹽管柱Sephadex G-25移除還原試劑。一旦蛋白質經充分還原，則將1mM氧化之抗壞血酸鹽(去氫抗壞血酸)添加至脫鹽樣品中且進行再氧化培育，持續20小時。再氧化恢復了鏈內二硫化物，而透析允許半胱胺酸及連接至新近引入之半胱胺酸的麩胱甘肽透析除去。(此等方法均產生類似結果，但遵循先前描述於文獻中之再氧化方案使用CuSO4的嘗試引起蛋白質沈澱。本文中之所有實例均使用上述透析方案。
再氧化之抗體藉由在50mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)中用0.35mM順丁烯二醯亞胺化合物培育5mg/ml抗體達1小時而與化合物223(5B)結合。反應之完全性藉由RP-HPLC監測且典型地獲得為3-4之DAR。關 於cKitA，藉由此方法製備之樣品的DAR為3.2。經工程改造之抗體在相同條件下產生略微較高之DAR，其中對於cKitB-5B結合物，DAR=3.9且對於cKitC-5B結合物，DAR=4.0。DAR量測值進一步藉由MS驗證。
以下ADC藉由上述程序使用抗Her2抗體(如曲妥珠單抗)作為抗體(本文中稱為「TBS」)來製備，證實式II之Eg5抑制劑作為有效負載化合物的通用性及功效。其中Ab=TBS之眾多免疫結合物的表徵資料(DAR及%聚集)呈遞於表7中；第110號ADC至第133號ADC之結構展示於此處。
ADC-112.
ADC-115.
ADC-118.
ADC-121.
ADC-124.
ADC-127.
ADC-131.
抗體-藥物結合物之表徵
如上文所述製備之免疫結合物藉由LC/MS表徵，如圖1中對於一種免疫結合物所說明。結合典型地提供結合於抗體之連接子-有效負 載部分的複本數不同之結合物的混合物。質譜分析證實，連接子-有效負載基團連接於表5-6中之各結合物中的輕鏈及/或重鏈。結合物在樣品之平均藥物負載(DAR，藥物與抗體比率)及聚集(以%表示)方面進行表徵。
經還原及去糖基化之樣品的DAR值自LC-MS資料外推。如圖1中對於曲妥珠單抗與第223號化合物(TBS-化合物223)之結合物所說明，LC/MS允許定量ADC中連接至抗體之有效負載(藥物)分子的平均數目。HPLC將抗體區分為輕鏈及重鏈，且根據每條鏈的連接子-有效負載基團數目區分重鏈(HC)及輕鏈(LC)。質譜資料使得能夠鑑別混合物中之組分種類，例如LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。由LC及HC鏈上之平均負載，可計算ADC之平均藥物與抗體比率(DAR)(參見圖1B)。既定結合物樣品之DAR表示連接至含有兩條輕鏈及兩條重鏈之四聚體抗體的藥物(有效負載)分子之平均數目。在此實例中，DAR為5.8。
發現一些結合物形成聚集物，且本文中描述之結合物亦藉由聚集程度加以表徵。聚集藉由分析型尺寸排阻層析(Superdex 200 5/150 GL操作於PBS中)來量測。觀察到，聚集程度取決於連接子-有效負載及DAR。具有較低百分比聚集之結合物可能更適用於一些目的，因此展現小於50%聚集且較佳小於20%聚集之免疫結合物可為較佳的。資料亦證實，既定有效負載之聚集程度可藉由選擇鍵聯基團及DAR來操縱。表7亦指示各結合物之鍵聯基團為穩定地抑或可裂解的。
某些此等ADC(ADC-110至ADC-133)之結構發現於前述部分中。注意，ADC-127及ADC-128為比較性實例，有效負載在式(II)範疇外部。一些ADC在表中出現一次以上，表示ADC之不同製劑，其說明%聚集及DAR存在一些變化。DAR中高達15-20%之變化引起所觀察到之生物活性發生較少改變，參見圖28-29。
雖然表7中之實例結合於曲妥珠單抗，但數種本發明之連接子-有效負載組合亦已結合於針對不同抗原之其他抗體及抗原結合部分。對於其他抗體之描述及對於其表徵及活性之概述提供於以下活性實例中，且關於眾多此等結合物之表徵資料提供於下文中。具有針對其他腫瘤細胞抗原之抗體的結合物展示對表現高水準由ADC中之抗體識別的抗原之細胞的生長抑制效應大於對缺乏彼抗原之細胞的生長抑制效應。這證實，具有式(II)之Eg5抑制劑作為其有效負載之ADC可用於藉由選擇識別靶向細胞株上之抗原的抗體來靶向不同細胞株或腫瘤類型，從而提供本發明之有效結合物可利用靶向其他細胞及抗原之抗體 的證據。
cKitA抗體及抗gH抗原結合部分描述於實例中，參見實例5及實例8。
活性實例1. Eg5抑制劑之活體外抗增生活性
式(II)化合物在結構上類似於已知Eg5抑制劑。其在標靶位點處之活體外活性藉由測定針對Eg5之IC50來驗證。下表提供所選化合物之IC-50資料：關於所用分析條件之下限為0.0005μM。
物質及方法 細胞株
為了產生過度表現Her2之細胞株，用慢病毒構築體(pLenti 6.3(Invitrogen)；由細胞巨大病毒增強子-啟動子驅動)穩定地轉導MDA-MB-231乳癌細胞，該構築體編碼Her2抗原之突變型式(NM_004448；密碼子K753M)，缺乏激酶活性且因此為非致癌基因，但仍由抗Her2抗體識別。過度表現Her2之細胞株MDA-MB-231/Her2突變型純系16(「純系16」)藉由螢光活化之細胞分選及用殺稻瘟菌素選擇來分離。以相同方式分離經模擬轉導之MDA-MB-231-M40細胞株(用慢病毒轉導，但不表現外源性Her2)。純系16及親本MDA-MB-231培養物藉由在補充有10%(v/v)胎牛血清之RPMI-1640生長培養基中繼代來維持。在小鼠之腹腔中連續繼代SK-OV-3細胞時分離替代模型SK-OV-3ip以選擇在嚙齒動物宿主中茁壯生長之細胞。SK-OV-3ip細胞藉由在補充有10%(v/v)胎牛血清之McCoy's 5A生長培養基中繼代來維持。T47D2細胞為T47D乳癌細胞株之變異體。表現高水準Her2抗原之其他細胞株包括乳癌細胞株HCC1954及卵巢癌細胞株OE-19。胃癌細胞株NCI-N87為提供額外效能測試之適度Her2表現者。使用MDA-MB-231親本及M40細胞株以及Her2陰性乳癌細胞株MDA-MB-468來評估對Her2表現之選擇性。對高cKit NCI-H526細胞(小細胞肺癌細胞株)及cKit陰性MDA-MB-468細胞測試抗cKit ADC(cKitA、cKitB及cKitB)。所有其他細胞株均容易地自標準供應商獲得。所有細胞株均藉由在裝有5% CO2氛圍之含濕氣37℃培育箱中連續繼代來維持。
使用抗體-藥物結合物處理之細胞增生
在第0天，細胞於90μL生長培養基中以每孔3000個細胞接種於96孔透明底黑壁培養盤(Costar #3603)中。在第1天，抗體-藥物結合物以高於最終濃度10倍稀釋於細胞生長培養基中，以90μg/mL開始，經3倍連續稀釋降至1.5ng/mL。結合物稀釋液(10μL/孔)接著添加至96孔 細胞培養盤中；最終濃度介於9000ng/mL降至0.15ng/mL範圍內。製備雙重複或三重複樣品。細胞置於裝有5% CO2氛圍之含濕氣37℃培育箱中。在第5或6天，自培育箱移出96孔培養盤且使其平衡至室溫。細胞TiterGlo 2(50μL/孔；Promega #G7571)添加至各孔中，並攪動10分鐘。使用Wallac MicroBeta光度計量測生物發光(指示相對ATP含量)。
使用Eg5抑制劑處理之細胞增生
在第0天，細胞於90μL生長培養基中以每孔3000個細胞接種於96孔透明底黑壁培養盤(Costar #3603)中。在第1天，Eg5抑制劑以高於最終濃度10倍稀釋於細胞生長培養基中，以1000nM開始，經3倍連續稀釋降至51pM。抑制劑稀釋液(10μL/孔)接著添加至96孔細胞培養盤中；最終濃度介於100nM降至5.1pM範圍內。製備雙重複或三重複樣品。細胞置於裝有5% CO2氛圍之含濕氣37℃培育箱中。在第5或6天，自培育箱移出96孔培養盤且使其平衡至室溫。Cell TiterGlo 2(50μL/孔；Promega #G7571)添加至各孔中，並攪動10分鐘。使用Wallac MicroBeta光度計量測生物發光(指示相對ATP含量)。
效能值之定義及推導
對重複樣品之Cell TiterGlo 2數據求平均值，接著針對未處理細胞進行校正。使用如由用作MicroSoft Excel之附加的XL-Fit套裝軟體(IDBS)提供的四參數邏輯模型(S型劑量反應模型#205)來推導劑量反應曲線。
fit=(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))
inv=(C/((((B-A)/(y-A))-1)^(1/D)))
res=(y-fit)
EC50=在經擬合之Cell TiterGlo 2信號為由未處理細胞產生之信號的50%時測試物品之濃度。
IC50=在經擬合之Cell TiterGlo 2信號減少了未處理細胞與測試物品之最大效應之間的信號差異之50%時測試物品之濃度。舉例而言，若最大效應為信號減少降至未處理細胞之40%，則IC50為經擬合之劑量反應曲線達到未處理細胞之70%時的濃度。IC50等效於以上提供之擬合算法中之參數「C」。
結果
在Eg5抑制劑存在下之細胞增生如以上方法中所述來進行。5或6天之後，使用Cell TiterGlo 2試劑(圖2，除了圖2(A)-(B)外)測定細胞計數，其中培育3天。對雙重複樣品之數據求平均值，接著將平均值針對未處理細胞或以最低測試濃度處理之細胞的平均值進行校正。兩種校正方法產生可相當之發現結果。圖2(E)-(F)中化合物#2(表1)與化合物#14(表1)之比較使用每種濃度單一樣品來進行，該等濃度針對最低測試濃度進行校正。關於所選式(II)抑制劑之細胞活性及關於比較性Eg5抑制劑的資料提供於下表中。
此等Eg5抑制劑對來自多種不同譜系之細胞株具有抗增生活性，指示此等分子作為ADC有效負載及作為癌症治療劑具有廣泛潛力。此等分析中之抑制濃度一般在任何既定化合物之嚴密範圍內，在最大抑制中觀測到之變化看來與細胞週期停滯在G2/M過渡期、繼而細胞凋亡一致；細胞凋亡之開始時序在細胞株之間廣泛變化，這可解釋最大化合物效應之變化。
當在一組Eg5抑制劑中比較時，觀測到多種抗增生活性。注意，化合物效能之秩序一般在一種細胞株與另一細胞株之間維持。細胞效能受多種因素影響，包括Eg5酶活性之固有抑制及細胞膜對化合物之滲透性。舉例而言，化合物#77含有將在生理pH下大量去質子化之羧酸，這可解釋為何在此測試中此化合物之效力略微低於其他化合物(圖1E)。
多種化學骨架展示賦予強烈抗增生活性。舉例而言，圖2(A)-(E)展示在第三丁基及THP系列(分別地，R1=第三丁基或4-四氫哌喃基)中Eg5抑制劑之實例，及具有核心脲(A=NH)或核心醯胺(A=鍵)之THP系列抑制劑。來自各系列之實例在亞奈米莫耳濃度下抑制增生。亦觀察到具有相對較低效能之化合物：在一些情況下，具有較低效能之化合物當以抗體-藥物結合物形式遞送至細胞時作為細胞增生抑制 劑不成比例地有效。
圖3(A)-(L)說明特定Eg5抑制劑對於源自不同譜系之多種癌症細胞株之抗增生活性的實例(參見下表8)。雖然效能確實有變化，但這些譜系中之所有細胞株均對式(II)及(III)化合物敏感。
活性實例2. Eg5抑制劑ADC之活體外抗增生活性
在具有抗Her2曲妥珠單抗抗體(「TBS」)及Eg5抑制劑之抗體-藥物結合物(「ADC」)存在下之細胞增生如以上方法中所述來進行。5 或6天之後，使用Cell TiterGlo 2試劑測定細胞計數。對雙重複樣品之數據求平均值，接著將平均值針對未處理細胞之平均值進行校正。圖4A-V展示成對之劑量反應圖，說明ADC對於高Her2純系16細胞相對低Her2親本MDA-MB-231細胞之抗增生效應。與所用之特定連接子化學無關，ADC之活性對於升高之Her2表現高度敏感。
圖4A-H說明使用經設計以在溶酶體中裂解，從而在標靶細胞內部釋放未經修飾之Eg5抑制劑的連接子之ADC之活體外效能。不同有效負載(來自不同結構家族)與兩種不同可裂解連接子(含有二肽纈胺酸-瓜胺酸或聚糖-葡萄糖苷酸)之組合一般針對純系16細胞為抗增生的，但針對親本MDA-MB-231細胞之抗增生性差得多。
圖4G-H說明TBS-化合物312之選擇性活性，其併入含羧酸酯基之Eg5抑制劑化合物#77。該游離化合物具有適度抗增生活性(圖2E)，這可能歸因於在細胞外pH(約7)下之不良膜滲透性。當在酸性溶酶體(pH約為5)中釋放時，羧酸酯基將部分地質子化，從而移除電荷且改良膜滲透性，這又可解釋ADC之活性。
預期可經由使用不可裂解連接子獲得不同特性，藉此ADC之細胞內代謝將產生有效負載及偶合至源自抗體之一或多種胺基酸的連接子之加合物。具有不可裂解連接子之例示性ADC的活體外抗增生活性說明於圖4I-R中。此系列包含在已知或經預測不牽涉於Eg5結合中之抑制劑Eg5區域處連接的連接子。圖4I-R中表示之連接子關於連接至有效負載及連接至抗體半胱胺酸之模式而變化。另外，連接子在長度及經預測之物理特性(諸如親脂性及構形靈活性)方面變化。
所有此等ADC均經由連接子中之順丁烯二醯亞胺基團連接至抗體半胱胺酸，除了TBS-化合物300(圖4K、L、O、P)，其使用碘乙醯胺基團進行硫醇偶合。此ADC之Her2選擇性活體外效能證實，順丁烯二醯亞胺不為抗增生活性所需。
使用在不同位點處連接至有效負載之不可裂解連接子來產生具有圖4S-V中所說明之活體外活性的ADC。又，在有效負載上之不同位置處連接lin鍵聯基團ker不會防止達成Her2依賴性細胞效能，證實式(II)化合物上之鍵聯基團連接點可變化。
為了證實ADC可抑制內源性表現Her2之細胞的增生，將具有抗Her2抗體之所選ADC與HCC1954(圖5A、B)或SK-OV-3ip(圖5C-E)細胞一起培育。具有源自不同連接子-有效負載結構家族之可裂解或不可裂解連接子的ADC抑制此等高Her2細胞株之增生。
活性實例3. Eg5抑制劑ADC之活體內功效評估
結合至曲妥珠單抗(TBS)之本發明化合物亦在異種移植物腫瘤模型中證實顯著活性，該模型係基於將人類腫瘤細胞株植入免疫缺乏裸小鼠中。如先前所述(Sausville及Burger,2006)，使用該腫瘤異種移植物小鼠之研究已提供有價值之對於抗癌試劑的活體內功效之瞭解。特定言之，使用皮下注射有5.0 x 106個SK-OV-3ip細胞(Yoneda等人，1998)或HCC1954細胞之nu/nu小鼠進行活體內功效研究。此等細胞株係基於先前活體外效能分析來選擇，該等分析以抗原依賴性方式揭露其對於前述Eg5抑制劑ADC之高敏感性。在腫瘤達到約200-250mm3之尺寸之後，以單一劑量靜脈內注射Eg5抑制劑ADC，劑量為0.3mg/kg至10mg/kg，視實驗而定，其中各處理組包含9隻小鼠。在投與抗體-藥物結合物之後，每週兩次監測腫瘤體積。所有動物研究均根據Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH出版物；National Academy Press，第8版，2001)進行。
圖6(A)及6(B)展示具有與曲妥珠單抗結合之連接子-有效負載化合物第220號之ADC(TBS-化合物220)對於小鼠中HCC1954乳癌異種移植物腫瘤之功效。圖6(A)展示使用1、2或3mg/kg之單一劑量之TBS-化合物20結合物經約55天時期之腫瘤尺寸變化，該結合物含有 化合物12(表1)作為有效負載。1mg/kg劑量展示與不具有Eg5抑制劑之對照物相比適度腫瘤生長減少，而2mg/kg及3mg/kg劑量在測試期間預防腫瘤生長。圖3b展示3mg/kg及6mg/kg劑量之結果，該等劑量預防腫瘤擴大。
用單獨TBS(不含Eg5抑制劑之抗Her2抗體)(圖6(B))以6mg/kg(對應於所測試之最高結合物劑量中抗體之量)處理的動物在測試時期內允許腫瘤體積之約四倍，且看來類似於僅媒劑對照處理。其他動物接受同型對照-化合物220結合物，其為具有連接至不靶向HCC1954細胞之抗體之相同有效負載的結合物。在Eg5抑制劑之類似劑量下，同型對照物相對於TBS對照物呈現微小腫瘤生長抑制，但在抑制腫瘤生長方面明顯不如確實靶向HCC1954細胞之TBS-化合物220結合物有效，除了在6mg/kg之劑量下，同型對照物展示與TBS-化合物220幾乎相當之活性。
圖7(A)及7(B)在SKOV3ip異種移植物中展示類似結果。單一劑量之化合物220與TBS之結合物以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg及10mg/kg的劑量投與至小鼠，該結合物遞送5至96μg/kg劑量之化合物12。在此異種移植物中，3mg/kg劑量之TBS-化合物220結合物證實有效腫瘤生長抑制。在此腫瘤模型中，同型對照亦展示一些腫瘤生長抑制，不過低於TBS結合物，且單獨曲妥珠單抗抗體相對於媒劑對照物具有較小生長抑制效應。
圖8概述在單一劑量之化合物215與曲妥珠單抗之結合物(TBS-化合物215)以5mg/kg及10mg/kg劑量投與之後，SKOV3ip異種移植物之腫瘤生長。5mg/kg劑量達到顯著生長抑制，而10mg/kg劑量使腫瘤縮小。在此實驗中，5mg/kg劑量之單獨曲妥珠單抗(無Eg5抑制劑)及5mg/kg劑量之同型對照物(結合於不識別SKOV3ip腫瘤細胞之抗體的化合物215)均看來抑制腫瘤生長。此外，其均不如TBS-化合物215結 合物在可相當劑量下有效。
圖9概述在單一劑量之化合物223(含有化合物17作為有效負載)與曲妥珠單抗之結合物(TBS-化合物223，或TBS-5B)以5mg/kg及10mg/kg劑量投與之後，SKOV3ip異種移植物之腫瘤生長。5mg/kg劑量達到顯著生長抑制，而10mg/kg劑量導致腫瘤停滯。在此實驗中，10mg/kg劑量之單獨曲妥珠單抗(無Eg5抑制劑)適度抑制腫瘤生長。5mg/kg及10mg/kg劑量之同型對照物(結合於不識別SKOV3ip腫瘤細胞之抗體的化合物215)與經媒劑處理之腫瘤相比不顯著抑制腫瘤生長。
活性實例4. 減少ADC聚集之新穎連接子。
在此實例中，ADC由簡單連接子及有效負載化合物構築，其產生顯著且不需要之量的聚集。用於此實例中之各ADC中的抗體為TBS。稱為ADC-110之構築體使用未分支連接子且展現約12%聚集。參見圖10(A)。修飾此ADC(參見ADC-111及ADC-112)之連接子以引入醯化氮之極性基團會減少聚集至小於3%。參見圖10(B)及圖10(C)。
此等ADC中每一者之有效負載及有效負載+連接子連接點：
因此，ADC-111由連接至化合物367之順丁烯二醯亞胺基團的抗體曲妥珠單抗組成，且ADC-112由連接化合物368之順丁烯二醯亞胺基團的相同抗體組成。ADC-110由化合物366及曲妥珠單抗組成。此等ADC中之連接子被視為不可裂解的。此等ADC證實，式II、IIC及III化合物中之R1可用作與標靶結合部分(例如抗體，即使當使用不可裂解連接子時)之連接點。
圖11展示ADC-110及ADC-111針對數種癌症細胞株之活體外功效，證實該等結合物對具有高Her2含量之細胞株(SKOV3ip及MB231-M16)具有高度活性，對具有Her2但對曲妥珠單抗ADC不太敏感之細胞具有低活性，這可能歸因於Her2周轉率(MB231-W6)，且對Her2陰性細胞(MB468)具有低得多之活性，即時此等細胞對Eg5抑制劑高度敏感。SKOV3ip及MDA-MB231-M16細胞株具有高Her2表現且因此預期對此等曲妥珠單抗結合物敏感。MB231-W6亦具有Her2表現，但對曲妥珠單抗ADC之敏感性較低，這可能歸因於Her2之周轉率。MDA-MB468為Her2陰性，但對Eg5抑制劑高度敏感。
圖11(A)展示SKOV3ip細胞對ADC-110及ADC-111高度敏感，預期歸因於此等細胞上之高Her2水準。MB468細胞株之敏感性低得多，如基於其Her2缺乏所預期。圖11B展示MB321-M16細胞株比MB321-W6敏感，據信歸因於MB321-W6細胞中Her2抗原之較低周轉，引起不太有效之ADC內化。圖11(C)將SKOV3ip與兩種低敏感性細胞株MB468及MB231-W6相比。圖11中之資料亦展示，ADC-111中之分支鏈連接 子相對於ADC-110中之未分支連接子不會顯著影響其活性。因此，分支鏈連接子減少ADC之聚集，而不干擾功效。
類似地，使用抗體TBS及有效負載/連接子化合物6D(參見表6)製備ADC。此ADC具有在連接子之烷基鏈上直接具有羧酸酯基之連接子。製備在連接子上缺乏羧酸酯基之其他方面相同的ADC。在連接子上具有羧酸基團之ADC具有DAR=4.9及3%聚集，而在連接子上缺乏羧酸基團之對應ADC具有DAR=4.2，但聚集為11.6%。又，連接子上之極性基團顯著減少聚集。此等ADC均展現Her2+細胞株上在細胞培養物中之腫瘤細胞生長的抗體依賴性抑制，但在連接子上具有羧酸之ADC對MB468細胞(乳癌)顯著更具活性。
活性實例5. 靶向其他抗原之免疫結合物的活性。
由表5中展示之有效負載與稱為cKitA之抗體結合來製備免疫結合物。此抗體與稱為曲妥珠單抗之抗體識別不同抗原，曲妥珠單抗對抗原cKit(亦稱為CD117)具選擇性。cKit發現於造血乾細胞及祖細胞上，且與肥大細胞贅瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、生殖細胞腫瘤及一些白血病有關。因此，具有抗cKit抗體之本發明免疫結合物適用於治療此等病狀。
藥物與抗體比率(DAR)在3.0與4.5之間之結合物由此抗體藉由上述方法製備。在預期由抗cKit抗體cKitA識別之細胞株中測試免疫結合物之活性。圖12展示此等免疫結合物中之六者對細胞生長之抑制。雖然活性隨有效負載而變化，但其在低於1μg/mL免疫結合物之濃度下均極具活性，其中在約1ng/mL下最具活性，展示有效細胞生長抑制。
活性實例6. 具有連接子變化之免疫結合物的比較。
由表5及6中之化合物藉由本文所述之方法製備免疫結合物。此等化合物含有類似Eg5抑制劑作為有效負載，但具有不同連接子。在每種情況下，有效負載均經由對應於式II中之R1的基團鍵聯。使用本文中稱為TBS之抗體。該等免疫結合物均具有在3與5之間之DAR。此等免疫結合物針對四種預期對抗體之敏感性發生變化之不同細胞株測試細胞生長抑制。發現所有細胞株均受各化合物抑制。在如本文所述之式II範疇內之連接子變化具有可量測但一般適度的對細胞生長抑制之影響，如藉由圖13中之抑制曲線所說明。連接子之一個連接點，即在R1處之氮雜環丁烷環的氮原子，在測試條件下確實顯著降低活性。資料證實，多種連接子適合用於含有有效負載式II化合物之式I之免疫結合物中。值得注意的是，將羥基放於對應於Ar2之苯基環上不會顯著增加或降低細胞培養物中之活性。
活性實例7. 式II之Eg5抑制劑與其他Eg5抑制劑作為ADC有效負載之比較。
由表2中之有效負載6N(有效負載-連接子化合物509)及6P(化合物508)製備免疫結合物。此等有效負載為文獻中已知之有效Eg5抑制劑，且表示除式II化合物以外之化合物類別。為進行比較，將具有式II化合物(化合物220)作為有效負載且含有與6N及6P相同之『val-cit』可裂解連接子之免疫結合物連同其他類別之Eg5抑制劑一起測試。雖然其他類別之Eg5抑制劑展現作為有效負載之活性，但其免疫結合物之活性比具有式II有效負載化合物之免疫結合物低約10倍，如圖14中所說明。
活體內活性
一般程序：雌性nu/nu小鼠(Harlan Laboratories,Livermore,CA)經皮下在右肋注射懸浮於200μL總體積之HBSS/50% MatrigelTM(BD Biosciences)中的5x106個SK-OV-3ip1腫瘤細胞。或者，雌性SCID/Beige小鼠(Harlan Laboratories,Livermore,CA)經皮下在右肋注射懸浮於200μL總體積之HBSS/50% MatrigelTM(BD Biosciences)中的5x106個H526腫瘤細胞。所有動物研究均根據Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH出版物；National Academy Press，第8版，2001)進行。
對於功效研究，在植入後7-10天之間隨機分配小鼠，且平均腫瘤體積為約225mm3之動物納入研究中。典型地，至少5隻小鼠用於各處理組，每組中之小鼠數目指示於概述測試結果之圖中。經由側尾靜脈用抗體-藥物結合物或媒劑(50mM檸檬酸鹽，140mM NaCl，pH 7.3)對小鼠靜脈內給藥一次。
自第0天開始給藥，每週兩次在兩個維度(L及W)中用數位測徑規量測腫瘤異種移植物。腫瘤體積計算為(L x W2)/2。每週兩次量測體 重且每天記錄臨床觀察結果。藉由StudyDirector軟體(StudyLog,South San Francisco,CA)擷取且儲存腫瘤體積及體重。在50天之研究持續時間之後，將動物人道處死。
活性實例8.
如本文中所述製備表5中其中抗體(AntiB)為曲妥珠單抗之式5B免疫結合物(TBS-5B)。在細胞分析中，將其活性與具有相同抗體及已知ADC有效負載(DM1)之免疫結合物(TBS-DM1)及其中AntiB為對病毒醣蛋白gH具特異性之igG1 κ鏈的免疫結合物(免疫結合物：gH-5B)相比。圖15展示在具有高Her2表現之細胞株(SK-OV-3ip，人類卵巢癌細胞株)中TBS-5B、TBS-DM1及gH-5B之細胞增生結果。具有5B作為有效負載之結合物的活性與具有DM1作為有效負載之結合物可相當，證實Eg5抑制劑作為ADC有效負載之高功效。如所預期，具有gH作為抗體組分之結合物在相同細胞株中展現極小活性，證實TBS-5B結合物之活性依賴於TBS抗體。為進行比較，亦對具有低Her2表現之細胞株測試5B-TBS。如所預期，該免疫結合物對缺乏由其抗體靶向之抗原(Her2)的細胞株不具活性。這證實，5B之活性依賴於免疫結合物之抗體與細胞上其靶向抗原之表現的匹配。
接著，在活體內對小鼠中之SK-OV-3ip異種移植物腫瘤測試該等免疫結合物。此異種移植物對TBS-DM1之反應不良。
圖16展示本發明之免疫結合物TBS-5B之有效腫瘤生長抑制。使用兩個對照組：一個對照組用單獨TBS抗體(TBS)處理，且另一對照組用5B與對醣蛋白gH具特異性之IgG κ之結合物(gH-5B)處理。至第20天，使用所指示之標準，TBS-5B免疫結合物產生正常劑量反應及相對於媒劑及gH對照物之統計學顯著腫瘤抑制。在10mg/kg劑量下，在30天時幾乎無腫瘤生長。各組具有9隻小鼠，且無一組在處理期間展示顯著體重損失。使用所指示之標準，對照物之腫瘤生長抑制較低， 且在測試條件下不具統計學顯著性。此等結果展示，Eg5抑制劑為活體內用於治療藉由其抗體靶向之腫瘤的有效ADC有效負載，且功效取決於Eg5抑制劑及與細胞株匹配之抗體兩者。
圖17說明與含有用於臨床試驗中之ADC且連接至相同抗體(TBS)之有效負載(DM1)的結合物相比，Eg5免疫結合物在小鼠中活體內對SK-OV-3ip異種移植物腫瘤更具活性。又，TBS-5B免疫結合物在10mg/kg劑量下幾乎使腫瘤生長完全停止，且至30天時，使用所指示之標準，相對於對照物為統計學上顯著的。可相當劑量之TBS-SMCC-DM1不太有效，至30天時未達到統計學顯著性。用單獨抗體(TBS)或用連接至gH病毒醣蛋白IgG之DM1或5B處理的活性低得多。這證實，Eg5抑制劑有效負載至少與已在臨床試驗中成功之其他有效負載類別(DM1為FDA批准之免疫結合物Kadcyla®的有效負載)一樣有效，且其活體內功效依賴於免疫結合物之抗體對靶向腫瘤細胞的特定識別。
活性實例9：使用其他抗體之活體內功效
製備含有鍵聯至cKit抗原之特異性抗體(本文中稱為『cKit抗體』)的本發明Eg5抑制劑之免疫結合物。對小鼠中之人類小細胞肺癌異種移植物腫瘤(H526)測試cKit結合物。(n=5；任何組均無顯著體重損失)圖18展示在第一cKit抗體(cKitA)上具有有效負載-連接子5B之免疫結合物在6.5mg/kg劑量下的H526腫瘤生長抑制。較低劑量下之活性低得多，且單獨cKitA抗體或結合至對病毒醣蛋白gH具特異性之抗原結合基團的Eg5有效負載-連接子組合(5B)均未展現可量測之腫瘤生長。
圖19概述cKitA免疫結合物與Eg5抑制劑(5B)及SMCC-DM1之比較結果(每個曲線n=5；任何組均無顯著體重損失)。連接有5B或SMCC-DM1之cKitA免疫結合物在小鼠中展示H526異種移植物腫瘤之腫瘤生長抑制。使用所指示之標準，SMCC-DM1結合物在10mg/kg劑量下而 非在5mg/kg下展現統計學上顯著之腫瘤生長抑制。5B結合物在5mg/kg下產生抑制作用，其為統計學上顯著的且與SMCC-DM1結合物之10mg/kg劑量可相當，且5B(Eg5抑制劑)結合物在10mg/kg劑量下的活性高得多。對照物展示對5B與gH之結合物無活性，該結合物對病毒醣蛋白gH具特異性。
活性實例10. 交叉實驗。
對於此實驗，在每隻小鼠中植入兩種不同異種移植物腫瘤，即在身體一側植入SK-OV-3ip，且在另一側植入H526。SK-OV-3ip細胞株為Her2陽性(Her2+)且缺乏cKit(cKit-)，而H526細胞株為Her2陰性(Her2-)及cKit陽性(cKit+)。各小鼠接著用媒劑或三種免疫結合物之一處理：gH-5B、TBS-5B或cKitA-5B。如圖20展示，[Her2+,cKit-]腫瘤生長受到TBS-5B強烈抑制，如歸因於其與TBS抗體之預期結合所預期。其他處理均未顯著影響腫瘤生長。類似地，[Her2-,cKit+]腫瘤生長僅受cKit-5B結合物抑制，且不受任何其他處理影響。此交叉實驗證實，腫瘤抑制係歸因於免疫結合物，且不會因抗體或釋放之有效負載而發生，僅抗體與腫瘤上之抗原匹配的完整免疫結合物為有效的。
活性實例11. 連接子變化之影響
此實例說明連接子變化對具有與有效負載(5B、5H、5G及5A，參見表5)類似之Eg5抑制劑的免疫結合物之活體內功效之影響。使用不同連接子連接類似Eg5抑制劑至曲妥珠單抗抗體來製備四種免疫結合物。圖21概述免疫結合物之活性，該等免疫結合物在10mg/kg劑量下在抑制小鼠中之SK-OV-3ip腫瘤異種移植物方面類似地有效。此等免疫結合物之活性亦類似於相同抗體(TBS)與MMAF(用於臨床試驗中之ADC之有效負載)之免疫結合物(TBS-MC-MMAF)，且比在相同抗體上具有美登素有效負載之免疫結合物(TBS-SMCC-DM1)更具活性。如所預期，使用結合至對病毒醣蛋白(gH)具特異性之抗體的相同有效負 載及未結合抗體TBS之對照物展現極少或無腫瘤生長抑制。(對於所測試之每種免疫結合物，每組9隻小鼠(n=9)；任何組均無顯著重量損失)。
活性實例12. 不同Eg5有效負載/連接子組合之活體內活性
此實例比較不同連接子連接點及連接子，其中比較具有由連接子連接於兩個不同位置處之Eg5抑制劑作為有效負載的免疫結合物之活體內功效，對於每個連接點使用兩種不同連接子(5B、5E、5F及5D，參見表5)，均與曲妥珠單抗抗體結合。圖22概述免疫結合物之活性，該等免疫結合物在10mg/kg劑量下均抑制小鼠中之SK-OV-3ip腫瘤異種移植物生長。此等免疫結合物之活性類似，且當與TBS-SMCC-DM1結合物比較時為等效的或更佳的。如所預期，使用未結合抗體(TBS)之對照物展現極少生長抑制。(對於所測試之每種免疫結合物，每組8隻小鼠(n=8)；任何組均無顯著重量損失)。
活性實例13. 不同Eg5免疫結合物對NCI-N87異種移植物之活性
此實例比較了具有各種Eg5抑制劑作為有效負載以及連接子之免疫結合物對更難以抑制之腫瘤細胞株(NCI-N87，一種胃腫瘤細胞株)的活體內功效。使用不同Eg5抑制劑-有效負載組合製備具有Eg5抑制劑有效負載(5B、5E、5D及6U，參見表5-6)之四種免疫結合物，該等組合均與曲妥珠單抗抗體結合。圖23概述免疫結合物之活性，該等免疫結合物在10mg/kg劑量下均抑制小鼠中之N87腫瘤異種移植物生長。此等免疫結合物之活性在此模型中變化，且與曲妥珠單抗-SMCC-DM1免疫結合物相比。所有免疫結合物看來均抑制腫瘤生長；使用所指示之標準，5B及6U及DM1結合物在測試條件下均達成統計學顯著性。如所預期，使用未結合抗體(TBS)之對照物展現極少生長抑制。(對於所測試之每種免疫結合物，每組8隻小鼠(n=8)；任何組均無顯著重量損失)。
活性實例14. Eg5免疫結合物對H526異種移植物之活性
此實例比較了具有與cKit抗體結合之各種Eg5抑制劑作為有效負載之免疫結合物對表現cKit之腫瘤細胞株(H526)的活體內功效。使用不同Eg5抑制劑-有效負載組合製備具有Eg5抑制劑有效負載(5B、5E、5F、5C、5A及5D，參見表5)之六種免疫結合物，該等組合均與cKit抗體(cKitA)結合。圖24概述免疫結合物之活性，該等免疫結合物在5mg/kg劑量下均抑制小鼠中之H526腫瘤異種移植物生長。(對於所測試之每種免疫結合物，每組5隻小鼠(n=5)；任何組均無顯著重量損失)。有效負載/連接子組合5E及5D在5mg/kg劑量下更有效，使用所指示之標準，達成統計學顯著腫瘤生長抑制。
圖25概述相同免疫結合物在10mg/kg下對H526異種移植物之活性。(對於所測試之每種免疫結合物，每組5隻小鼠(n=5)；任何組均無顯著重量損失)。該等免疫結合物在10mg/kg下之活性在此模型中變化，其中5D看來最有效且持久；使用所指示之標準，5D及5E均在此劑量下達成統計學顯著腫瘤生長抑制。
活性實例15. Eg5抑制劑結合物中cKit抗體之比較
此實例比較了具有不同cKit抗體及Eg5抑制劑有效負載之免疫結合物對表現cKit之腫瘤細胞株(H526)的活體內功效。以cKit A為起始物，藉由以下一般方法製備兩種經修飾之cKit抗體。藉由使用如先前所述(Meissner等人，Biotechnol Bioeng.75：197-203(2001))之短暫轉染方法共轉染重鏈及輕鏈質體，在293 FreestyleTM細胞中表現cKitA抗體之Cys突變體。使用Qiagen質體製備套組根據製造商之協定來製備用於共轉染之DNA質體。293 FreestyleTM細胞在37℃下在5% CO2下於FreestyleTM表現培養基(Invitrogen)中懸浮培養。在轉染前一天，細胞分裂為在新鮮培養基中0.7 x 106個細胞/ml。在轉染當天，細胞密度典型地達到1.5 x 106個細胞/ml。該等細胞使用PEI方法(Meissner等人， 2001)用比率1：1之重鏈及輕鏈質體混合物轉染。經轉染之細胞進一步培養5天。藉由使培養物在2000x g下離心20分鐘且經由0.2微米過濾器過濾來採集來自培養物之培養基。使用蛋白質A-SepharoseTM(GE Healthcare Life Sciences)自經過濾之培養基純化所表現之抗體。藉由溶離緩衝液(pH 3.0)自蛋白質A-SepharoseTM管柱溶離抗體IgG，且立即用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，繼而緩衝液交換為PBS。
經工程改造之Cys ADC已經報告比藉由結合於部分還原之原生二硫化物或經由原生離胺酸殘基製造之ADC在小鼠及大鼠動物模型中耐受性更佳。為了評估經由經工程改造之Cys抗體結合的ADC與結合於部分還原之原生二硫鍵的ADC之間活體內功效之差異，將Eg5連接子-有效負載化合物223結合於抗體cKitA HC-E152C-S375C雙重突變體(cKitB：該等免疫結合物係稱為cKitB-化合物223或cKitB-5B)及cKitA HC-K360C-LC-K107C雙重突變體(cKitC：該等免疫結合物係稱為cKitC-化合物223或cKitC-5B)以及野生型cKitA抗體(免疫結合物cKitA-化合物223或cKitA-5B)。(殘基編號為EU編號)
經工程改造之抗體含有在特定位置處新近引入之半胱胺酸殘基，發現該等殘基特別適合於有效負載連接。抗體cKitB為具有兩個半胱胺酸殘基經工程改造至其重鏈中之cKitA的經修飾形式，且cKitC為具有一個半胱胺酸殘基經工程改造至其重鏈中及一個半胱胺酸殘基經工程改造至其輕鏈中之cKitA的經修飾形式。因為cKitB及cKitC各具有兩條重鏈及兩條輕鏈，故經修飾之抗體具有4個新近添加之半胱胺酸殘基，該等殘基適用於結合而無需還原鏈間二硫化物，因此可製備連接有四個有效負載基團之免疫結合物(DAR=4)。使用本文所述之方法使各cKit抗體與有效負載/連接子組合5B結合，以便比較修飾抗體序列之影響。
根據實例5中所述之方案製備抗體cKitA及突變體cKit B及 cKitC。根據實例6中所述之方案來還原及再氧化cKit B及cKitC。再氧化之抗體藉由在50mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)中用0.35mM化合物223培育5mg/ml抗體達1小時而與化合物223結合。反應之完全性藉由RP-HPLC監測且分別針對cKitB及cKitC結合物獲得為3.9及4.0之DAR。DAR量測值進一步藉由MS驗證。ADC經展示為有效及活體外細胞殺死分析，且在未帶腫瘤之小鼠中具有類似於未結合抗體之藥物動力學特性。
如以下在2步驟方法中製備具有結合於cKitA之原生二硫鍵之化合物223之ADC。在含有2mM EDTA之PBS中的濃度為5-10mg/ml之抗體首先在37℃下由50mM巰基乙胺(以固體形式添加)部分還原1小時。在脫鹽及添加1% w/v PS-20清潔劑之後，經部分還原之抗體(1-2mg/ml)在4℃下與每10mg抗體0.5-1mg之量的化合物223反應隔夜，該化合物以10mg/ml溶解於DMSO中。藉由蛋白質A層析純化ADC。在用PBS進行基線洗滌之後，結合物用50mM檸檬酸鹽(pH 2.7)、140mM NaCl溶離，中和且無菌過濾。平均DAR為3.2。
三種cKit ADC之特性： cKitA-5B：DAR=3.2，聚集0.8%
cKitB-5B：DAR=3.9，聚集1.5%
cKitC-5B：DAR=4.0，聚集3.2%
藉由相同方法製備及表徵具有有效負載與cKit及曲妥珠單抗抗體及突變型抗體之以下組合的免疫結合物。注意，經工程改造之抗體始終提供接近4之DAR，若每種抗體複合物中四個所添加之半胱胺酸殘基均結合於有效負載，則該DAR為預期負載：
圖26概述由經半胱胺酸工程改造之cKit抗體製造的兩種免疫結合物之活性，該等免疫結合物在5mg/kg及10mg/kg劑量下抑制小鼠中之H526腫瘤異種移植物生長。(對於所測試之每種免疫結合物，每組6隻小鼠(n=6)；任何組均無顯著重量損失)。可能因為經工程改造之抗體可形成結合物而不干擾原生二硫橋接結構，故其免疫結合物比cKitA結合物在兩種劑量下均更具活性。因此，當Eg5抑制劑之免疫結合物對各種cKit抗體(包括未經修飾者)具活性時，這證實蛋白質工程改造以將新半胱胺酸殘基引入恆定區中且使用新半胱胺酸殘基作為有效負載/連接子基團之連接點可提供經改良之免疫結合物。
關於腫瘤細胞生長抑制之額外活性資料
圖28提供額外資料，證實本發明免疫結合物抑制腫瘤細胞生長。圖28中之資料證實，此等免疫結合物抑制多種腫瘤細胞株之生長，包括SK-OV-3ip、MDA-MB-231、HCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231-M40、MDA-MB-231-M16、H526及NCI-N87。在每種情況下，如所預期，ADC之活性均部分地由經處理之細胞上由ADC之抗體識別的抗原之表現水準測定。額外資料證實，表示式(II)範疇之結構變化一般產生活性ADC，即使活性水準在細胞株之間變化。資料進一步證實，可使用多種連接子，且連接子可連接於基團R1、Y及Q上之位置處。
各種本發明ADC之活體外細胞生長抑制的概述提供於下表中。第一欄列出來自關於用於ADC中之有效負載/連接子組合的表2、5或6 之化合物ID編號；第二欄指示何種抗體用於ADC中。第三欄鑑別測試ADC所針對之細胞株：對於大多數ADC，活性針對高抗原細胞株且針對低抗原細胞株來測定，在高抗原細胞株中預期穩固活性，在低抗原細胞株中預期抗體遞送為無效的，因此預期活性低得多。活性經報告為絕對AC50(ng/mL)、Ainf(%)及相對EC50(ng/mL)。關於用於此資料之方法的資訊提供於表後。
用於前一表中之細胞株：
效能值之定義及推導
對重複樣品之細胞TiterGlo 2數據求平均值，接著針對未處理細胞進行校正。分析包括未經處理細胞之孔，反映未受抑制之細胞生長。對照物之平均值用於校正來自經處理樣品之結果至%規模。使用具有標準分析資料分析軟體(Helios軟體應用)之4參數邏輯模型來進行經校正資料之分析。
4個參數包括Ainf(最大活性之平線區，一般在高[ADC]下發現)，A0(最小活性之平線區，一般在低[ADC]下發現)，y軸上此兩個平線區之間中點處的ADC濃度，及n，即兩個平線區之間中點處經擬合曲線的斜率。
對於各化合物，該軟體推導出3種量度，即絕對AC50、相對EC50及Ainf。絕對AC50(表中之「Abs AC50」)為其中經擬合曲線跨Y軸之50%時的ADC濃度。相對EC50(表中之「Rel EC50」)為經擬合曲線在A0與Ainf之間的中點處之ADC濃度。
比較性免疫結合物：
TBS-SMCC-DM1：抗體=曲妥珠單抗；連接子=SMCC；有效負載=DM1：DAR為約3.5
MC-MMAF結合物，其使用順丁烯二醯亞胺己醯基連接子：

Claims (47)

  1. 一種式(I)之免疫結合物： 其中Ab表示抗原結合部分；L表示連接X至Ab之鍵聯基團；m為1至4之整數；n為1至16之整數；及X在每次出現時獨立地表示式(II)之基團 其藉由L連接至Ab，其中：Z為N或CH；Ar1為視情況經多達3個選自鹵基、C1-3烷基及C1-3鹵烷基之基團取代的苯基；Ar2為苯基或吡啶基，且Ar2視情況經多達兩個選自鹵基、CN、C1-3烷基、羥基、胺基及C1-3鹵烷基之基團取代；R1為C1-6烷基、-(CH2)0-2-C3-6環烷基或含有多達兩個選自N、O及S之雜原子作為環成員的-(CH2)0-2-C4-7雜環基，其中各C1-6烷基、C3-6環烷基或C4-7雜環基視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、羥基、胺基、羧基、 側氧基(oxo)、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基及COO(C1-4烷基)之基團取代；R2為H或C1-4烷基；T為(CH2)1-3；Y係選自C1-3胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基，其中C1-3胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基各視情況經多達三個選自胺基、側氧基、鹵基、羥基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)、-C(=O)NH(C1-4烷基)、-C(=O)N(C1-4烷基)2及C1-4鹵烷基之基團取代；A為NH、N(C1-4烷基)或在式(II)中之羰基與Q之間的鍵；Q係選自C1-4烷基、-O-C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6雜環基、-(CH2)0-2-C3-6環烷基、-(CH2)0-2-C5-6雜芳基及-(CH2)0-2-苯基，且視情況經多達三個選自鹵基、羥基、胺基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR、-O-葡萄糖醛酸酯基(glucuronate)及-NR2之基團取代，其中各R為C1-6烷基、C3-6環烷基或含有N、O或S作為環成員的4至6員雜環，且各R獨立地視情況經鹵基、-SH、-NH2、OMe或-OH取代。
  2. 如請求項1之免疫結合物，其中R2為H。
  3. 如請求項1或2之免疫結合物，其中Z為CH。
  4. 如請求項1或2之免疫結合物，其中Z為N。
  5. 如請求項1或2之免疫結合物，其中R1為四氫哌喃，且R1視情況經多達兩個選自側氧基及甲基之基團取代。
  6. 如請求項1或2之免疫結合物，其中Ar1為二鹵基苯基。
  7. 如請求項1或2之免疫結合物，其中該式(II)化合物具有下式： 其中L連接至Y，或連接至Q，或連接至R1。
  8. 如請求項1或2之免疫結合物，其中R1為4-四氫哌喃基。
  9. 如請求項1或2之免疫結合物，其中R1為-C(Me)2-(CH2)0-2R30，其中R30為-OH、COOH或NH2，且L連接至R1。
  10. 如請求項1或2之免疫結合物，其中Q為經1或2個選自羥基及胺基之基團取代的C1-4烷基。
  11. 如請求項1或2之免疫結合物，其中Y為視情況經鹵基、胺基或羥基取代之吡咯啶酮。
  12. 如請求項1或2之免疫結合物，其中A為-NH-。
  13. 如請求項1或2之免疫結合物，其中該鍵聯基團可裂解。
  14. 如請求項1或2之免疫結合物，其中該鍵聯基團不可裂解。
  15. 一種式(III)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Z為N或CH；Ar1為視情況經多達3個選自鹵基、C1-3烷基及C1-3鹵烷基之 基團取代的苯基；Ar2為苯基或吡啶基，視情況經多達兩個選自鹵基、CN、C1-3烷基、羥基、胺基及C1-3鹵烷基之基團取代；R1為-(CH2)0-2-C4-7雜環基或-(CH2)0-2-C3-7環烷基，其中該C4-7雜環基含有多達兩個選自N、O及S之雜原子作為環成員，且C4-7雜環基及C3-7環烷基各視情況經多達三個選自鹵基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、胺基、側氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、C1-4鹵烷基及COO(C1-4烷基)之基團取代；或R1為經-OH、-COOH或-NH2取代之C3-6烷基；R2為H或C1-4烷基；T為(CH2)1-3；Y係選自C1-2胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基，其中C1-2胺基烷基、C4-6雜環基及C3-6環烷基各視情況經多達三個選自胺基、側氧基、鹵基、羥基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、經胺基取代之C1-4烷基、COOH、COO-(C1-4烷基)、CONH(C1-4烷基)、CON(C1-4烷基)2及C1-3鹵烷基之基團取代；A為NH、N(C1-4烷基)或在式(III)中之羰基與Q之間的鍵；Q係選自C1-4烷基、-(CH2)0-2-C4-6雜環基、-(CH2)0-2-C5-6雜芳基及-(CH2)0-2-苯基，且Q視情況經多達三個選自鹵基、羥基、胺基、-SH、-R、-OR、-SR、-SO2R、-NHR及-NR2之基團取代，其中各R為視情況經多達三個選自鹵基、-SH、-NH2、OMe或-OH之基團取代的C1-6烷基。
  16. 如請求項15之化合物，其中R1為四氫哌喃基。
  17. 如請求項15之化合物，其中R1為式-C(Me)2-(CH2)0-2R30之基團，其中R30為-OH、COOH或NH2。
  18. 一種式(IIA)或(IIB)或(IIC)化合物： 其中Ar1、Ar2、Z、R1、R2、T、Q、Y及A如請求項1中所定義，Q*係選自-CH2O-、-CH2S-、-CH2-NH-、-CH2-NMe-、-CH(Me)O-、-CH(OH)-CH2O-、-CH(CH2OH)-O-、-CH(OH)-CH2NH-、-CH(CH2OH)-NH-、-CH(CH2NH2)-O-、-CH(CH2OH)-NH-、-CH(Me)S-、-CH(Me)NH-、-CH2CH2O-、-CH2CH2NH-、-CH2CH2S-、-CH(Me)CH2O-、-CH(Me)CH2S-、-CH(Me)CH2NH-、 Y*係選自-CH(CH2F)NH-、-CH2NH-、 其中R10及R11獨立地為H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、COOH、CONH(C1-4烷基)、CON(C1-4烷基)2、COO(C1-4烷基)或OH；R1*係選自經羥基、胺基或羧基取代之C3-6烷基；且W為包含一或多個連接子組分及一個反應性官能基之鍵聯部分。
  19. 如請求項18之化合物，其中W包含選自-SH、-NH2、-C(=O)H、-C(=O)Me、N-順丁烯二醯亞胺、-NHC(=O)-CH2-鹵基、-COOH及-C(=O)-OR'之反應性官能基，其中鹵基係選自Cl、Br及I，且-OR'為活化酯之脫離基部分。
  20. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中Ar1為二鹵基苯基。
  21. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中Ar2為苯基或鹵苯基或羥基苯基。
  22. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中Z為CH。
  23. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中Z為N。
  24. 如請求項15、18及19中任一項之化合物，其中R1為4-四氫哌喃基。
  25. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中R2為H。
  26. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中A為-NH-。
  27. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中A為一鍵。
  28. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中T為CH2或CH2CH2。
  29. 如請求項15至19中任一項之化合物，其中Y係選自 -CH(CH2F)NH2、 其中R10及R11獨立地為H、Me、OMe、F、CH2F、CH2OH、 COOH、COO(C1-4烷基)或OH。
  30. 如請求項15至29中任一項之化合物，其中Q係選自-CH2OH、-CH2-NH2、-CH(Me)OH、-CH(OH)-CH2OH、-CH(OH)-CH2NH2、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(NH2)-CH2OH、-CH(Me)SH、-CH(Me)NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2CH2SH、-CH(Me)CH2OH、-CH(Me)CH2SH、-CH(Me)CH2NH2、
  31. 如請求項15之化合物，其係選自表1中之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
  32. 一種醫藥組合物，其包含如請求項15至31中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
  33. 一種組合，其包含治療有效量之如請求項15至31中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種治療活性輔劑。
  34. 一種如請求項1至14中任一項之免疫結合物或如請求項15至17中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療細胞增生病症之藥劑。
  35. 如請求項15至17中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽， 其用作藥劑。
  36. 如請求項35之化合物，其中該藥劑係用於治療癌症。
  37. 如請求項1或2之免疫結合物，其用作藥劑。
  38. 如請求項37之免疫結合物，其中該藥劑係用於治療癌症。
  39. 如請求項1或2之免疫結合物，其用於治療癌症。
  40. 一種免疫結合物Ab-L*-X，其包含有效負載(X)鍵聯至抗體(Ab)，其中該鍵聯基團L*包含式-C(O)NR21-或-NR21-C(O)-之基團，其中R21具有式-(CH2)1-4-R22，其中R22為選自-OH、-NH2、N(R23)2、COOR23、CON(R23)2、-(OCH2CH2O)k-OCH2CH2OR23及-SO2R23之極性基團，其中k為0至4且各R23獨立地為H或C1-4烷基。
  41. 一種式(I)之免疫結合物： 其中Ab表示抗原結合部分；L表示連接X至Ab之鍵聯基團；m為1至4之整數；n為1至16之整數；及X在每次出現時獨立地表示Eg5抑制劑。
  42. 如請求項41之免疫結合物，其中X為選自表1之化合物。
  43. 如請求項41之免疫結合物，其中m為1，且該免疫結合物係由Ab與選自表2之化合物反應形成。
  44. 一種選自表5之化合物或其免疫結合物。
  45. 一種免疫結合物，其選自表5中之免疫結合物，其中AntiB表示抗體。
  46. 如請求項1、2及41至45中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合部分為具有至少一個非原生半胱胺酸殘基引入恆定區中之抗體，其中該鍵聯基團L連接至該非原生半胱胺酸殘基。
  47. 如請求項46之免疫結合物，其中m為1，且n在1與5之間，較佳為約2或約4。
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9504756B2 (en) 2012-05-15 2016-11-29 Seattle Genetics, Inc. Self-stabilizing linker conjugates
HK1207388A1 (zh) * 2012-05-15 2016-01-29 Seattle Genetics, Inc. 自稳定接头偶联物
MX2015010146A (es) 2013-02-08 2016-05-31 Novartis Ag Sitios especificos para modificar anticuerpos para hacer inmunoconjugados.
KR102329024B1 (ko) * 2013-12-23 2021-11-19 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 키네신 스핀들 단백질(ksp)과의 항체 약물 접합체 (adcs)
US10786578B2 (en) 2014-08-05 2020-09-29 Novartis Ag CKIT antibody drug conjugates
JP6743015B2 (ja) * 2014-12-15 2020-08-19 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤の脱グリコシル化抗ｔｗｅａｋｒ抗体との抗体薬物複合体（ａｄｃ類）
CN104478957A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 一种含腈基苯和双o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途
CN107614488B (zh) * 2015-03-19 2021-07-16 杭州多禧生物科技有限公司 新型亲水连接体和其在配体-药物共轭偶联物上的应用
WO2016207089A1 (de) * 2015-06-22 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA2990398A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-cd123-antibodies
CA2990411A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-b7h3-antibodies
US10973923B2 (en) * 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
JP2018525334A (ja) 2015-06-23 2018-09-06 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト キネシンスピンドルタンパク質（ｋｓｐ）阻害剤の抗ｔｗｅａｋｒ抗体との抗体薬物複合体
CN108025085A (zh) * 2015-06-23 2018-05-11 拜耳制药股份公司 Ksp抑制剂与抗b7h3抗体的抗体药物缀合物(adc)
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
KR20180123047A (ko) 2016-03-24 2018-11-14 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
EP3452492A1 (en) 2016-05-05 2019-03-13 Novartis AG Amatoxin derivatives and conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase
WO2017216028A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
EP3472178A4 (en) * 2016-06-17 2020-02-19 Magenta Therapeutics, Inc. COMPOSITION AND METHOD FOR DEPLYING CD117 + CELLS
AU2017204139B2 (en) * 2016-06-17 2018-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the depletion of cells
TWI851531B (zh) 2016-08-09 2024-08-11 美商思進公司 具有改善之生理化學性質之具自我穩定連接子之藥物結合物
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
US20210100912A1 (en) * 2017-06-19 2021-04-08 Sichuan Baili Pharmaceutical Co. Ltd. Antibody-drug conjugate having acidic self-stabilization junction
US10646585B2 (en) 2017-09-15 2020-05-12 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and ligand-drug conjugates thereof
CA3082310A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd5+ cells
WO2019243159A1 (de) 2018-06-18 2019-12-26 Bayer Aktiengesellschaft Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil
EP4319821A1 (en) * 2021-04-09 2024-02-14 Nanjing University Conjugate and the preparing method and use thereof
CN115417802A (zh) * 2021-05-16 2022-12-02 上海鼎雅药物化学科技有限公司 乌帕替尼及其中间体的制备方法
CN118324664A (zh) * 2024-03-14 2024-07-12 四川鸿日医药科技有限公司 一种丝氨酸衍生物的制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7662581B1 (en) * 2003-12-18 2010-02-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Eg5 co-crystals
KR101170925B1 (ko) * 2004-06-18 2012-08-07 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 암 치료용 키네신 방추 단백질 (ｋｓｐ) 억제제로서의ｎ-(1-(1-벤질-4-페닐-1ｈ-이미다졸-2-일)-2,2-디메틸프로필)벤자미드 유도체 및 관련 화합물
TW200800951A (en) * 2005-08-09 2008-01-01 Novartis Ag Substituted imidazole compounds as KSP inhibitors
MX2009005071A (es) * 2006-11-13 2009-05-25 Novartis Ag Compuestos de pirazol y triazol sustituidos como inhibidores de ksp.
GEP20125415B (en) * 2007-01-05 2012-03-12 Novartis Ag Imidazole derivatives as kinesin spindle protein inhibitors (eg-5)
US8252832B2 (en) * 2007-12-14 2012-08-28 Novartis Ag Kinesin inhibitors as cancer therapeutics
MY166446A (en) * 2008-03-18 2018-06-27 Genentech Inc Combinations of an anti-her2 antibody-drug conjugate and chemotherapeutic agents,and methods of use
WO2010084186A1 (en) * 2009-01-26 2010-07-29 Novartis Ag Salts and polymorphs of a kinesin inhibitor compound
US8748626B2 (en) * 2010-04-15 2014-06-10 Novartis Ag Oxazole and thiazole compounds as KSP inhibitors
EP2558450A1 (en) * 2010-04-15 2013-02-20 Novartis AG Triazole compounds as ksp inhibitors
EP2714684B1 (en) * 2011-05-27 2018-09-05 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
KR102087854B1 (ko) * 2011-06-10 2020-03-12 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 단백질-중합체-약물 접합체

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