TW201506036A - Vegf-c及ccbe1之治療用途 - Google Patents

Abstract

本發明有關於用於治療涉及受損淋巴系統的疾病與狀態之治療方法、用途以及組合物，其包括CCBE1與VEGF-C，其中受損淋巴系統特別係指淋巴水腫。

Description

VEGF-C及CCBE1之治療用途

本發明有關於用於治療之涉及受損淋巴系統，特別是淋巴水腫，之疾病與狀況的治療方法、用途以及組合物。

淋巴水腫是由不正常的淋巴系統造成之局部淋巴液滯留與逐漸腫脹之慢性疾病與損傷狀況。其為嚴重影響全球將近1億4千萬病患的生活品質之終身狀態。

原發性淋巴水腫是罕見的遺傳疾病，通常係由於淋巴管異常發育而造成。原發性淋巴水腫的症狀可在出生時發生或是而後發生。

後天或次發性淋巴水腫是由淋巴系統破壞而造成。在西方國家，最常是由淋巴結解剖、手術及/或輻射治療而造成，其中在特別是乳癌的癌症治療期間造成淋巴系統的破壞。經估計在美國約11萬乳癌病患因腋窩淋巴結解剖及/或輻射而具有淋巴水腫，以及每年約1萬5千個新病患形成乳癌相關的淋巴水腫。

治療性的淋巴管新生、淋巴管再生係治療淋巴水腫的具吸引力之前景。儘管最近已知掌管淋巴管新生的分子機制，仍尚未完全理解起始淋巴管新生的實際型態演發機制。

在胚胎發育以及成人的各種淋巴管新生過程中，血管內皮生長因子C(VEGF-C)是淋巴管新生的主要驅動者(Alitalo, 2011, Nature Medicine 17: 1371–1380)。VRGF-C藉由活化VEGFR-3以及其蛋白水解處理的成熟型VEGFR-2而作用。在老鼠中Vegfc基因的刪除造成淋巴發育失敗，係由於新分化的淋巴內皮細胞無法從中央靜脈遷移至形成第一淋巴結構的位置(Karkkainen et al, 2003, Nature Immunology 5: 74–80; Hägerling et al, 2013, EMBO J 32: 629-644)。可應用重組的VEGF-C而救回此表現型(Karkkainen et al, 2003, ibid.)。為了救回該表現型，使用VEGF-C的「成熟」重組形式，其缺少N-與C-端前胜肽。在分泌內生型VEGF-C的細胞中，為了使VEGF-C達到其整個的信號傳遞潛力，需要從中心VEGF同質區(VHD)蛋白水解切除這些前胜肽(Joukov et al, 1997, EMBO J 16: 3898–3911)。只有當兩個前胜肽被切除時，VEGF-C可明顯活化主要的血管新生受體VEGFR-2(Joukov et al, 1997, ibid.)，因此，成熟的VEGF-C亦刺激血管新生。

VEGF-C受體VEGFR-3的突變已經顯示造成已知為Milroy症的遺傳性淋巴水腫(Karkkainen et al, 2000, Nature Genetics 25: 153–159)。另一方面，Hannekam 巴管擴張–淋巴水腫症狀是關於膠原蛋白與鈣結合EGF區1(CCBE1)基因的突變(Alders et al, 2009, Nature Genetics 41: 1272–1274)，但不清楚突變的CCBE1如何造成淋巴表現型。在任何例子中，雙異質CCBE1+/-;VEGF-C+/-老鼠的表現已經推測CCBE-1與VEGF-C的遺傳物質交互作用(Hägerling et al, 2013, ibid.)。

雖然在角膜微囊分析中，CCBE1已經被推測為增加VEGF-C的促淋巴管新生活性(Bos et al. 2011, Circulation Research 109: 486–491)，但是其在淋巴管新生中的真實角色仍為模糊不明。理由之一是由於不可能產生天然全長度的CCBE1，因此實驗中所使用的CCBE1蛋白質是與人類IgG的Fc區融合的人工截斷的CCBE1蛋白質。

儘管近年來特異性表達在淋巴管的分子之辨識已有許多進步，但是仍無可用於淋巴水腫治療方法。由於目前實務係僅涉及緩和照護，因此需要對於淋巴水腫的改良治療方法。

在一方面，本發明有關於用於治療淋巴水腫之全長CCBE1與VEGF-C的組合物。

在另一方面，本發明有關於治療淋巴水腫的方法，其係藉由同時、分別或連續投予全長CCBE1與VEGF-C的組合至有需要的病患。

在上述方面的一些實施方式中，該組合包括多胜肽形式的CCBE1，其包括胺基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的胺基酸35-406或是與其具有至少80%胺基酸序列相同性的胺基酸序列。

在一些其他的實施方式中，該組合包括多胜肽形式的CCBE1，其包括核苷酸序列SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 2的核苷酸71-1291或是與其具有至少80%核苷酸序列相同性的核苷酸序列。

在一些其他實施方式中，該組合包括多胜肽形式的VEGF-C，其包括選自由SEQ ID NO: 3的胺基酸32-419、SEQ ID NO: 3的胺基酸32-227共架連接至胺基酸228-419、SEQ ID NO: 3的胺基酸112-227、SEQ ID NO: 3的胺基酸103-227以及與其具有至少80%胺基酸序列相同性的胺基酸序列所組成的群組之一胺基酸序列。

在一些其他實施方式中，該組合包括聚核苷酸形式的VEGF-C，其包括選自由SEQ ID NO: 4的核苷酸524-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸737-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸737-1111、SEQ ID NO: 4的核苷酸764-1111以及與其具有至少80%核苷酸序列相同性的核苷酸序列所組成的群組之一核苷酸序列。

本發明之另一方面有關於一種醫藥組成物，其包括上述任何實施方式中提出的全長CCBE1與VEGF-C之組合。

本發明之其他方面、特定實施方式、目的、細節以及優點說明於以下圖式、詳細說明與範例中。

VEGF-C‧‧‧血管內皮生長因子C

VHD‧‧‧同質區

以下內容將以較佳實施方式並參閱所附的圖式的方式更詳述說明本發明，其中：

第1圖說明CCBE1共同表現增加VEGF-C蛋白水解處理至成熟、完全活化的VEGF-C。以CCBE1單獨轉染293T細胞(第1A圖)，或是以VEGF-C +/-CCBE1轉染293T細胞(第1D圖)，以具輻射性胺基酸培養，用V5抗體(IP: V5)與可溶性VEGF-C受體(VEGFR-3/Fc)沉澱，而後進行自動放射顯影術，來分析培養液上清液(sup)與細胞溶解產物。注意細胞內與細胞外的CCBE1皆被偵測，以及CCBE1分泌不像膠原蛋白，並不依賴細胞培養液中的抗壞血酸鹽補充。第1B圖顯示VEGF-C的生合成與處理的示意圖。顯示的是VEGF-C前驅物與各種經處理之形式的圖式結構(Karpanen & Alitalo, 2008, Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 3: 367–397)。箭頭指向D的對應帶。第1D圖說明VEGF-C與VEGFR-3/Fc沉澱物包含未切割的、部分切割的以及切割的VEGF-C。CCBE1共表現減少未切割的VEGF-C之量，並且增加活化的VEGF-C的量。第1C圖說明相較於僅表現VEGF-C的細胞培養之上清液，表現CCBE1與VEGF-C之細胞培養的上清液對於促進Ba/F3-VEGFR-3/EpoR細胞生長具有較高活性。具顯著統計差異P<0.05以*標註，P<0.001以***標註，n.s.指無顯著統計差異；n=4。

第2圖說明CCBE1促使VEGF-C分泌。第2A圖顯示用VEGF-C與CCBE1或用VEGF-C而不用CCBE1轉染的細胞，上清液與溶解產物的VEGF-C免疫沉澱的結果。左邊的分子量顯示主要VEGF-C形式的移動性。注意，在CCBE1共轉染(比較行1、2至3、4)之後，上清液中VEGF-C成熟的21 kDa形式之量增加(8倍)，以及未切割的VEGF-C與29/31 kDa多胜肽的量減少(對應地，減少74%以及51%)。僅於共轉染細胞的上清液中偵測到來自於VEGF-C之N端切割的14 kDa片段。由於在CCBE-1共轉染細胞的細胞溶解產物中，細胞內VEGF-C多胜肽減少80%(比較行5、6至7、8)，因此CCBE1共轉染促使VEGF-C分泌。第2B圖顯示相較於來自僅表現VEGF-C之細胞培養的上清液，來自表現CCBE1與VEGF-C兩者之細胞培養的條件培養液對於促進表現老鼠(m)或人類(h) VEGFR-2/EpoR嵌合體的Ba/F3細胞生長具有較高活性。

第3圖說明膠原蛋白區截斷、融合Fc的CCBE1並不影響VEGF-C的VEGFR-3刺激活性。在固定劑量(5 µg/ml)的有缺失之CCBE1-Fc(“A”)或是僅包含Fc部分的負控制組蛋白質(“B”)存在下，用增加濃度之人類VEGF-CΔNΔC(成熟的VEGF-C；第3A圖)或是全長的VEGF-C(VEGF-C前驅物，第3B圖)刺激hVEGFR-3/EpoR-Ba/F3細胞。細胞於刺激條件下總共培養3天。在此期間結束時，將噻唑藍溴化四唑(MTT，Sigma-Aldrich)加入細胞培養中，以及藉由OD540光學密度量測每一個細胞培養中存活細胞量(細胞增生的直接分數)(黃色的MTT會被活細胞的粒線體酵素還原而產生深藍色物質)。

第4圖顯示反式表現CCBE1的細胞會促進VEGF-C切割。以VEGF-C或CCBE1轉染不同的細胞族群，而後如所指示，混合該細胞族群代謝標示期間。注意，當共轉染CCBE1時，上清液中成熟VEGF-C(21 kDa)的量增加，以及全長(58 kDa)或部分切割(29/31 kDa)的VEGF-C減少(第4A圖)，然而細胞溶解產物中的量卻保持不變(第4B圖)。同樣地，注意穩定與暫時轉染細胞之間VEGF-C遷移的小差異，這是由於穩定轉染的293S GnTI細胞產生的不同的VEGF-C醣化型態(Chaudhary et al, 2012, Nature Protocols 7: 453–466)。

第5圖顯示CCBE1之VEGF-C促進切割活性分泌至培養液中，亦即為產生CCBE1之293T細胞的條件化上清液的可溶性組成。這說明該活性並不侷限於細胞表面或是細胞外基質，而是可作為治療用投予，例如作為可溶性蛋白質。再者，促進切割活性不會被添加10% FCS而抑制或明顯抑制。然而，並不是所有CCBE1形式都會增強VEGF-C切割。例如，DU-4475產生的CCBE1不會增強VEGF-C的切割。

第6圖說明CCBE1增強體內的淋巴管新生。編碼所指示之因子的AAV9所轉染並且對於所指示之抗原染色的老鼠脛骨前肌肉之免疫染色。注意，當以淋巴管的LYVE-1與Prox-1染色偵測時，單獨全長的VEGF-C僅誘導輕微的淋巴管新生反應，但是其與CCBE1共轉染造成強反應。使用編碼ΔNΔC-VEGF-C(完全處理的成熟VEGF-C之均等物)的AAV9作為正控制組。將對於血清白蛋白的反應與對於CCBE1單獨的反應比較。統計顯著差異P<0.05標註為*，P<0.01標註為**，以及P<0.001標註為***，n.s.指差別無統計意義；n＝ 5。

第7圖說明CCBE1與VEGF-C共轉染刺激血管新生。脛骨前肌肉中內皮(PECAM-1)與平滑肌肉細胞(SMA)標定物的免疫化學。染色區域之定量顯示於右方。統計顯著差異P<0.05標註為*，P<0.01標註為**，以及P<0.001標註為***；n＝ 5。

第8圖說明藉由CCBE1/VEGF-C共轉導召集的CD45+白血球。Prox1轉錄因子是作為淋巴內皮細胞的標定物。分析於第7圖中完成。

第9圖說明將指示之AAV9載體注入老鼠脛骨前肌肉中的VEGFR-3-螢光酵素報告信號。注意，VEGF-C與CCBE1共轉染造成強的螢光酵素信號，其指示大量的淋巴管新生反應，然而全長的VEGF-C與CCBE1僅造成少量的螢光酵素活性。

第10圖顯示在脈衝追蹤中，野生型VEGF-C分泌在2小時達到高峰，然而無C端前胜肽(ΔC-VEGF-C)的VEGF-C突變已在15至45分鐘之間達到高峰。

第11圖顯示VEGF-C之N-與C-端前胜肽對於生長因子處理的效應。注意，藉由與C以及N端前胜肽的競爭，降低VEGF-C的成熟21 kDa形式與14 kDa N端前胜肽的量(第11A圖)。第11B圖說明在CCBE1共轉染存在或不存在之下的VEGF-D與VEGF-D/VEGF-C嵌合體(CDC)的蛋白水解處理。C-pp：C端前胜肽；N-pp：N端前胜肽；HAS：人類血清白蛋白；ΔNΔC：相當於成熟VEGF-C之VEGF-C的C與N端缺失形式。

本發明是基於全長膠原蛋白-與鈣結合EGF區1(CCBE1)蛋白質促進血管內皮生長因子C(VEGF-C)分泌以及大量未活化VEGF-C前驅物之蛋白水解切割的發現，造成VEGF-C的完全活化，其造成體內增加的VEGF-C受體VEGFR-3與VEGFR-2訊息傳遞、淋巴管新生以及血管新生。因此，本發明提供一種治療工具，CCBE1與VEGF-C的組合，用於在與例如淋巴水腫之功能異常淋巴系統有關之許多疾病中的淋巴管新生與血管新生的調節。

可用各種方式實施CCBE1與VEGF-C的治療用途。例如，可藉由基因治療、蛋白質治療或是其任何所欲之組合而達到CCBE1與VEGF-C之共同投予。換言之，可獨立選擇投予CCBE1與VEGF-C的路徑與方法。再者，CCBE1與VEGF-C的共同投予可為同時、分別或連續的。

如本文所使用，除非內文中另外清楚指出，否則術語「或」包含「或」運算符，並且均等於術語「及/或」。除此之外，在整個說明書中，「一」及「該」的意義包含複數個。

如本文所使用，「基因治療」一詞是指使其表現治療有效量的方式，將CCBE1或VEGF-C聚核苷酸轉入所選擇之標的細胞或組織中。根據本發明，基因治療可用以在具有受損淋巴系統的哺乳動物中，特別是人類，替換一缺陷基因，或是補充一基因產物，其生產未達治療有效量或是治療可用的時間。

如本文所使用，「蛋白質治療」一詞是指對於，以治療有效量投予CCBE1或是VEGF-C至具有受損淋巴系統之需要治療的哺乳動物，特別是人類。在本文中，術語「多胜肽」與「蛋白質」可交換使用，以指任何長度的胺基酸聚合物。

如本文所使用，術語「治療有效量」是指最少藉其改善受損淋巴系統的有害影響的CCBE1或VEGF-C的量。

如本文所使用，除非另外清楚聲明，術語「CCBE1」是指全長的CCBE1多胜肽或是指編碼該全長CCBE1的聚核苷酸。較佳地，CCBE1是哺乳動物的CCBE1，較佳為人類。在一些實施方式中，該全長的CCBE1多胜肽包括SEQ ID NO: 1描繪的胺基酸序列，較佳地是無訊息胜肽。假設人類CCBE1的訊息胜肽由SEQ ID NO: 1的胺基酸1-34組成，但是當在哺乳動物細胞中產生時，該訊息胜肽會自動被正確地切除。值得注意的是CCBE1多胜肽，Bos等人在Clinical Research 2011, 109: 486-491中揭露的CCBE1^Δcollagen -Fc是由編碼SEQ ID NO: 1的胺基酸1-191之cDNA所產生之有缺失的CCBE1多胜肽以及人類IgG₁ 的Fc部分。此有缺失的CCBE1是由CCBE1的EGF與鈣-結合EGF區與至人類IgG的Fc部分融合而組成，但缺少膠原蛋白重複區。

對於此領域具通常知識者而言，很明顯的是根據本發明將被使用的CCBE1多肽可由SEQ ID NO: 1所描繪的多胜肽變化而得，只要其維持其生物活性。判定CCBE1變異株是否保有其生物活性的範例方法是判定其切除全長VEGF-C的能力。此進行方式例如藉由培養表現全長VEGF-C的細胞與待測之CCBE1變異株，以及如果促進VEGF-C切除，則斷定該CCBE1變異株仍保留其生物活性。可根據該領域中已知的方法，例如藉由代謝標定與專一性蛋白質沉澱，例如免疫沉澱，來判定VEGF-C切除。若需要，具有SEQ ID NO: 1描繪之胺基酸序列的CCBE1可作為正控制組。

在一些實施方式中，該CCBE1多胜肽包括一胺基酸序列，其為SEQ ID NO: 1的保守(conservative)序列變異。關於多胜肽，術語「保守(conservative)序列變異」是指胺基酸序列修飾，其來自於利用該領域中已知的類似胺基酸的胺基酸取代(例如，大小類似且具有類似帶電性質的胺基酸)以及不明顯改變待測多胜肽的生物性質。亦須考量胺基酸的刪除與加入。在一些其他的實施方式中，該CCBE1多胜肽包括與SEQ ID NO: 1描繪之胺基酸序列具至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同性的胺基酸序列。

如本文所使用，兩個序列之間的%相同性是兩個序列分享的相同位置數目的函數(亦即，%相同性=相同位置的數目/位置的總數目 x100)，考量間隙數目以及每一間隙的長度，其需要被導入用於該兩序列之最佳對準。可使用該領域中可得之數學運算而完成序列比較以及兩序列之間相同性比例的判定。這適用於胺基酸與核苷酸序列。

如本文所使用，術語「CCBE1聚核苷酸」是指任何聚核苷酸，例如單或雙股DNA或RNA，其包括編碼CCBE1多胜肽的核苷酸序列。在一些實施方式中，CCBE1聚核苷酸包括SEQ ID NO: 2所描繪的核苷酸序列，其具有5’-與3’未轉譯區域(UTR)或是其保守的序列變異。在一些較佳實施方式中，CCBE1聚核苷酸包括全長CCBE1之編碼序列(CDS)，亦即SEQ ID NO: 2的核苷酸71-1291，或是其保守的序列變異。

關於聚核苷酸，術語「保守的序列變異」是指核苷酸序列修飾，其不明顯改變編碼的多胜肽之生物活性。保守的核苷酸序列變異包括來自於遺傳碼退化與來自無聲突變之變異。亦須考量核苷酸的取代、刪除與加入。因此，存在任何CCBE1多胜肽的多個CCBE1編碼聚核苷酸序列，其中任何一個可根據本發明作為治療使用。在一些其他實施方式中，該CCBE1聚核苷酸可與SEQ ID NO: 2所描繪的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的相同性，只要其編碼保有生物活性的CCBE1多胜肽。

如本文所使用，術語「VEGF-C多胜肽」是指VEGF-C之任何已知的形式，其包含預前VEGF-C(prepro-VEGF-C)、部分處理的VEGF-C以及完全處理的成熟VEGF-C。在其生合成期間，全長形式的VEGF-C(58 kDa)先進行C端部分的蛋白水解切割，造成29/31 kDa中間形式經由雙硫鍵而保持在一起，在N端的兩個替代位置的後續切割，產生成熟、完全活化的21 kDa或23 kDa形式的VEGF-C。已知這個過程並無效率，因為大部分的VEGF-C蛋白質並未變成有活性的。然而，在成熟與29/31 kDa中間形式之間的淋巴管新生潛力的差異是明顯的(Anisimov et al, 2009, Circulation Research 104:1302–1312)。

在一些實施方式中，根據本發明作為治療使用的VEGF-C多胜肽為全長或是預前形式的VEGF-C。在一些其他非限制的實施方式中，該預前VEGF-C多胜肽缺少訊息序列，且因此，例如，可包括SEQ ID NO: 3所描繪的序列之胺基酸32-419。本領域具通常知識者理解訊息胜肽酶有替代切割位置，以及其他蛋白酶可處理VEGF-C的N端而不影響其活性。因此，VEGF-C多胜肽可不同於包括或由SEQ ID NO: 3之胺基酸32-419所組成的胜肽。

或者，或是除此之外，VEGF-C多胜肽可為經部分處理的VEGF-C形式，例如包括至SEQ ID NO: 3所描繪的胺基酸序列之胺基酸32-227與胺基酸228-419共價連接的形式。同樣地，由於訊息胜肽酶與其他蛋白酶有替代的切割位置，經部分處理的VEGF-C多胜肽可具有不同於上述非限制範例的胺基酸組成物，而不偏離本發明及其實施方式。

在一些其他實施方式中，將投予至具有淋巴管新生不全之個體的VEGF-C多胜肽是其經完全處理的或是成熟的形式，例如包括SEQ ID NO: 3所描繪的胺基酸序列之胺基酸112-227或是103-227的形式。再者，VEGF多胜肽可為任何其他自然發生或遺傳工程形成的形式。若需要，不同形式的VEGF-C多胜肽可用於任何組合中。較佳地，VEGF-C多胜肽是哺乳動物VEGF-C多胜肽，更佳為人類的VEGF-C多胜肽。

亦考量本文所述之任何VEGF-C多胜肽可變化其胺基酸序列，只要其仍保留其生物活性，特別是其結合並活化VEGFR-2及/或VEGFR-3的能力。在一些實施方式中，VEGF-C多胜肽可為本文所描述之任何VEGF-C多胜肽之保守的序列變異，或是其可包括與SEQ ID NO: 3所描繪的胺基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同性的胺基酸序列，或是其任何生物相關片段。

如本文所述，術語「VEGF-C聚核苷酸」係指任何聚核苷酸，例如單股或雙股DNA或RNA，其包括編碼任何VEGF-C多胜肽的核苷酸序列。例如，VEGF-C聚核苷酸可編碼全長的VEGF-C，並且包括或由SEQ ID NO: 4所描繪之核苷酸序列的核苷酸524-1687所組成。在一些其他實施方式中，VEGF-C聚核苷酸可編碼VEGF-C的中間形式，以及包含或由SEQ ID NO: 4所描繪之核苷酸序列的核苷酸737-1687或是764-1687所組成。在一些其他實施方式中，VEGF-C聚核苷酸可編碼VEGF-C的成熟形式，以及包括或由SEQ ID NO: 4所描繪之核苷酸序列的核苷酸737-1111或764-1111所組成。上述實施方式無一包含編碼訊息胜肽或是停止密碼子的序列，但是其他實施方式可包括此序列。在一些其他實施方式中，該成熟形式的C端可被縮短而不失去受體活化潛力。

亦考量該核苷酸序列的保守序列變異。據此，對於任何給定的VEGF-C多胜肽存在著編碼聚核苷酸序列的多個VEGF-C，其中任一者可作為治療使用，如本文所述。

在一些其他實施方式中，VEGF-C聚核苷酸可包括核苷酸序列，其與上述該VEGF-C核苷酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同性，只要其編碼的VEGF-C的多胜肽仍具有其生物活性，特別是結合且活化VEGFR-2與VEGFR-3的能力。

較佳地，本文所描述之任何CCBE1或是VEGF-C聚核苷酸包括額外的N端核苷酸序列區，其編碼可操作連結至聚核苷酸序列的分泌訊息胜肽。該分泌訊息胜肽，典型包括約5至30個胺基酸的鏈，引導細胞外的多胜肽傳輸通過內質網，並且是從分泌的多胜肽切割。適合的訊息胜肽序列包含那些天然用於CCBE1或VEGF-C、得自於另一分泌蛋白質，例如CD33、Ig kappa或IL-3以及合成的訊息序列。

CCBE1或VEGF-C聚核苷酸亦可包括在標的細胞中用於表現之合適的促進子與/或加強子序列，該序列可操作地連結編碼序列之上游。若需要，促進子為可誘發的促進子或是細胞形式特異性促進子，例如內皮細胞特異性促進子。該領域中立即可得到適合促進子與/或加強子序列，其包含但不限於EF1、CMV以及CAG。

再者，本文所描述之任何CCBE1或是VEGF-C聚核苷酸可包括可操作地連結編碼序列下游之合適的聚腺苷酸化序列。

關於基因治療，上述「裸露的」CCBE1或是VEGF-C聚核苷酸可以重組DNA、質體或是病毒載體形式被應用。可用任何物理性或化學性通透細胞膜的方法進行裸露的聚核苷酸輸送。可在該領域中得到該些方法，並且包含但不限於電穿孔、基因轟擊、聲穿孔、磁性轉染、脂質轉染、脂質體媒介的核苷酸輸送及其任何組合。

在一些其他實施方式中，在合適的表現控制序列下，CCBE1或是VEGF-C聚核苷酸可併入病毒載體。此基因之合適的病毒載體包含但不限於反轉錄病毒載體，例如慢病毒(lentivirus)載體、腺病毒相關病毒載體以及腺病毒載體。較佳地，病毒載體是無法複製的病毒載體，亦即在哺乳動物個體中無法複製的載體。此無法複製之載體的非限制較佳範例是無法複製的腺病毒。該領域中可得到合適的病毒載體。

可藉由該領域中已知的病毒方式，完成治療性CCBE1或VEGF-C聚核苷酸輸送至哺乳動物個體，較佳是人類個體。例如，藉由注射至具有受損淋巴管之標的組織，包括CCBE1或VEGF-C編碼聚核苷酸之病毒載體可直接投予至將被治療之該個體的身體內。此輸送造成在體內表現該多胜肽，因而通常稱為體內基因治療。或者，或是除此之外，可藉由使用病毒載體或是裸露的多胜肽，而於活體外(ex vivo)產生本發明治療用的多胜肽之輸送的效果。活體外基因治療是指在活體外，用本發明的聚核苷酸轉染(或是用病毒轉換)標的細胞(較佳為取自於待治療之個體)，而後投予至個體達到治療目的。用於活體外基因治療的合適標的細胞之非限制範例包含內皮細胞、內皮前驅細胞、平滑肌細胞、白血球以及特別是各種種類的幹細胞。

在基因治療中，CCBE1或是VEGF-C的表現可為穩定的或是暫時的。通常偏好暫時的表現。本領域具通常知識者知道何時以及如何使用穩定或暫時的基因治療。

可由熟悉治療疾病或狀況之臨床領域的技藝之人士輕易地判定CCBE1與VEGF-C根據本發明的治療性投予的量以及方案，其中該疾病或狀況涉及受損的淋巴血管系統。通常，CCBE1或VEGF-C治療的劑量會依照考量而變化，該考量例如年齡、性別以及待治療病患之一般健康狀況；若需要，同時治療的種類；治療頻率以及所欲之效果的本質；組織受傷的程度；症狀期間；以及待個別醫師調整之其他變數。例如，當病毒載體要用於基因輸送時，載體典型地、任選地在醫藥可接受的載體中，以10⁷ 至10¹³ 病毒顆粒的量 (較佳以至少10⁹ 病毒顆粒的量)被投予。另一方面，當使用蛋白質治療時，典型劑量在0.01至20 mg/kg的範圍，更佳在0.1至10 mg/kg的範圍，最佳在0.5至5 mg/kg。所欲之劑量可在合適的間隔於一或多個劑量中被投予，以得到所欲之結果。典型的非限制每日劑量可從約50 mg/日變化至約300 mg/日。

關於蛋白質治療，可藉由標準的重組方法而得到CCBE1或VEGF-C。根據該領域中已知的方法，所欲之聚核苷酸可被選殖進入合適的表現載體，並且表現於可相容的宿主中。合適宿主的範例包含但不限於細菌(例如大腸桿菌)、酵母菌(例如S. cerevisiae)、昆蟲細胞(例如SF9細胞)，以及較佳為哺乳動物細胞株。可使用表現標籤，例如His-標籤、血球凝集素蛋白抗原表現決定區(hemagglutinin epitope，HA-tag)或是穀胱苷肽-S-轉移酶抗原表現決定區(glutathione-S-transferase epitopes，GST-tag)，以促進CCBE1或VEGF-C的純化。如果使用表現標籤，則在投予至有需要的個體之前，必須先將其切除。

如上所述，本發明之治療方法與用途關於涉及受損淋巴管系統的疾病與狀況之治療。此疾病與狀況之非限制範例包含例如原發性淋巴水腫(例如，Milroy症狀、Meige淋巴水腫以及晚發性淋巴水腫)、次發性淋巴水腫，以及脂性水腫的淋巴水腫。

如本文所使用，「治療」一詞是指為了包括不僅是完全治癒而且預防、減緩或緩解與受損之淋巴系統相關的疾病或症狀的目的，CCBE1與VEGF-C共同投予至較佳為人類之哺乳動物個體。可藉由監控症狀，例如受影響組織之腫脹、疼痛、不舒服、沉重或緊密，而評估CCBE1與VEGF-C的共同投予之治療效果。

本發明不僅提供用於治療與受損淋巴管系統相關的疾病與狀況之治療方法與用途，亦提供於該方法與治療用途中使用之醫藥組合物。此醫藥組合物包括分開或結合的CCBE1與VEGF-C，以及任何醫藥上可接受的載體，例如醫藥可接受的溶劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或是載體。例如，醫藥上可接受的載體可為無菌的非水載體，例如丙二醇、聚乙二醇或是可注射的有機酯。合適的水性載體包含但不限於水、食鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水以及Ringer葡萄糖溶液。

可使用各種投予路徑，以於該領域已知的所欲作用之位置達到有效劑量。因此，合適的投予路徑包含但不限於熟知該領域具通常知識者已知的腸胃外輸送(例如，靜脈內注射)、腸胃輸送(例如，口服)、區域投予、局部投予(例如，皮膚或經皮投予)。

該醫藥組合物可以濃縮形式或是依照要求所重製的粉末形式被提供。在冷凍乾燥的例子中，較佳是一些冷凍保護劑，包含聚合物(聚维酮碘、聚乙二醇、聚葡萄糖)、糖類(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、胺基酸(甘胺酸、精胺酸、麩胺酸)以及白蛋白。如果將重製溶液加至封裝之中，則其可由例如無菌水、氯化鈉溶液或是聚葡萄糖或葡萄糖溶液所組成。

調配本發明醫藥製備物的手段及方法為本領域具通常知識者已知，且可以本身已知的方法，例如以傳統混合、粒化、溶解、冷凍乾燥或是類似製程的方式而被製造。

上述的任何實施方式與特徵可獨立地應用於CCBE1與VEGF-C，並且可用於任何所欲之組合。因此，可藉由基因治療或是蛋白質治療而輸送CCBE1與VEGF-C其中之一或是二者。亦考量到可使用基因治療與蛋白質治療二者，以投予CCBE1或是VEGF-C。

對於本領域具通常知識者而言很明顯的是，由於技術進步，本發明的概念可以各種方式實施。本發明及其實施方式不限於以下所述之範例，而是可在申請專利範圍之內變化。

範例

材料與方法

選殖：經由重組的腺病毒相關病毒(rAAV9)載體而表現的基因被選殖進入psubCAG-WPRE質體(Paterna et al, 2000, Gene Therapy 7: 1304–1311)，其為psubCMV-WPRE的衍生物，其中CMV啟動子已經被替換為複合的CAG啟動子，其由雞的β-肌動蛋白啟動子、巨細胞病毒加強子以及β-肌動蛋白內含子所組成(Okabe et al, 1997, FEBS Letters 407: 313–319)。先前已描述將全長mVEGF-C、ΔNΔC-mVEGF-C以及HAS選殖進入AAV-載體(psubCAG-WPRE) (Anisimov et al, 2009, ibid.)。融合至V5標籤 (mCCBE1-V5)的mCCBE1被選殖如下：部分的CCBE1編碼DNA序列(CDS; Genebank #BC152322,影像選殖ID 40140631)被選殖為SacI/XbaI片段進入pVK1 (a pUC19-衍生的載體(Anisimov et al, 2007,Molecular Breeding 19: 241–253))。用引子5'-GCCGCTAGCGCCACCATGGTGCCGCCGCCT-3' (SEQ ID NO: 5)與5'-GGAGCTTGGGCACAAATGTC-3' (SEQ ID NO: 6)，從棕色脂肪組織mRNA放大失去的核苷酸，以及藉由插入NheI/SacI片段而完成上述CDS，形成載體pVK1-CCBE1。將PCR放大的V5-標籤(使用引子5'-ACCAGGAGCACCAGGAAGAC-3' (SEQ ID NO: 7)與5'-GCCTCTAGAACGCGTCTAGGTGCTGTCCAGGCCCAGCAGAGGGTTAGGGATAGGC　　TTGCCTGGATAAAAATTTCTTGGGG-3' (SEQ ID NO:8)而得)加入該CDS，成為Eco81I/XbaI片段。從所得的載體，切除完整的CDS成為MluI片段，並且選殖進入psubCAG-WPRE。

關於體外研究，建構相同的載體，其中用人類CCBE1 CDS (Genebank #NM_133459)替換老鼠CCBE1 CDS，而關於共同免疫沉澱研究，將StrepIII-標籤(Junttila et al, 2005,PROTEOMICS 5: 1199–1203)緊接著插入在該CCBE1 CDS之後。先前已經描述VEGF-C與ΔC-VEGF-C建構之哺乳動物表現建構(Joukov et al, 1997, ibid.)。藉由重疊PCR於pMosaic載體中而組合嵌合體VEGF-C/VEGF-D (CDC)表現建構(Jeltsch et al, 2006, J. Biol. Chem. 281: 12187–12195)。該插入包括編碼人類VEGF-C之胺基酸殘基Phe32-Ala111與Ser228-Ser419的序列以及人類VEGF-D的中間殘基Thr92-Arg206的序列。

在S2細胞中用於重組蛋白質表現的建構使用pMT-Ex載體(修飾版的pMT-BiP-V5His-C (Kärpänen et al, 2006, The FASEB Journal 20: 1462–1472))以及包括編碼N端前胜肽Phe32-Ala111、編碼C端前胜肽之Ser228-Ser419以及VEGF-C的ΔNΔC形式之Thr112-Arg227之胺基酸殘基的序列，而後為編碼六組胺酸標籤的序列。

rAAV之產生：如(Anisimov et al, 2009, ibid.)所描述，藉由三質體轉染方法形成rAAV9病毒，並且藉由使用不連續碘克沙醇梯度(iodixanol)之超高離心而將其純化。為了產生AAV9血清型，我們使用血清型-判定輔助質體p5E18-VP2/9替代p5E18-VP2/8 (Michelfelder et al, 2011,PLoS ONE 6: e23101)。

蛋白質表現與純化：使用Effectene (Qiagen, Venlo, The Netherlands)轉染S2細胞。轉染2天之後開始，用400 µg/ml的潮黴素(hygromycin)選擇穩定細胞群達三週。關於蛋白質生產，細胞適應於懸浮培養，並且用1 mM CuSO₄ 培養4-5天。在從經pH調整的條件化上清液批次結合至Ni²⁺ NTA凝膠(sepharose)之後，將該Ni²⁺ NTA凝膠置入管柱中，以 20 mM咪唑沖洗，並且用250 mM咪唑的階段梯度洗滌。接著在Superdex 200管柱上利用PBS作為流動緩衝液進一步將蛋白質依大小分離。

細胞培養：293T、293S GnTI-以及NIH-3T3細胞於DMEM 10% FCS中成長。PC-3細胞於Ham's F-12 10% FCS中成長，DU-4475細胞於RPMI 1640 20% FCS中成長，以及S2細胞於HyClone SFX-Insect (ThermoScientific, Rockford, IL)或是Insect-Xpress (Lonza Group, Basel, Switzerland)中成長。

轉染、代謝標定以及蛋白質分析：用編碼所指出蛋白質之表現架構(共同)轉染293T與293S GnTI-細胞。轉染24小時之後，用[³⁵ S]-半胱胺酸/[³⁵ S]-甲硫胺酸(PerkinElmer, Waltham, MA)代謝標定細胞，並且在48小時之後，收取條件化的細胞培養液以及細胞溶解產物。針對短期標定實驗，已經在24小時之後進行收取。或者，為了產生用於西方墨點(Western blotting)的未標定的蛋白質，將細胞的培養液替換為D-MEM 0.2% BSA，並在48小時之後，收取上清液與細胞溶解產物。

在免疫沉澱之前，視需要用蛋白質A凝膠(多株抗體與兔子抗血清)或蛋白質G凝膠(單株抗體)預先清理樣品。使用抗VEGF-C抗血清(Baluk et al, 2005, J. Clin. Invest. 115: 247–257)、抗V5抗體(Invitrogen, Carlsbad, CA, #46-0705)、抗hCCBE1抗體(Atlas Antibodies AB, Stockholm, Sweden, #HPA041374)、抗VEGF-D抗體VD1(Achen et al, 2000, Eur. J. Biochem. 267: 2505–2515)或是嵌合體VEGFR-3/IgGFc (Mäkinen et al, 2001,Nature Medicine 7: 199–205)用於免疫沉澱。

清洗樣品，並且以4-20% SDS-PAGE重新溶解樣品。關於自動放射顯影術，將膠體乾燥，並且將其暴露至磷酸影像器板或是X光底片。關於免疫偵測，將蛋白質轉移至硝化纖維素。用抗VEGF-C抗血清、抗V5抗體或是抗hCCBE1抗體結合ECL偵測特定信號。使用ImageJ軟體 (NIH, Bethesda, MD)，由雷射掃描器讀出或是掃描的X光底片，進行自動放射顯影術與西方墨點法的定量。

Ba/F3-VEGFR/EpoR分析：如(Mäkinen et al, 2001, ibid.)所描述，用條件化的細胞培養液必要地進行Ba/F3-hVEGFR-3/EpoR (Achen et al, 2000, ibid.)與Ba/F3-mVEGFR-2/EpoR (Stacker et al, 1999b)生物分析。Ba/F3-hVEGFR-2/EpoR細胞株類似於上述細胞株而被產生；然而，使用pCI-neo代替pEF-BOS。該嵌合體的接合胺基酸序列為...FFIIEGAQEKTNLEGS (VEGFR-2部分的末端) – (mEpoR部分的開始) LILTLSLILVLISLLLTVLALLSHRRTLQQKIWPGIPSPESEFE... (分別為SEQ ID NOs: 9與10)。用一次30 ms 1400V脈衝(Neon transfection device, Invitrogen)將此嵌合體架構電穿孔進入Ba/F3細胞。細胞生長於含有2 ng/ml mIL-3的培養液中36小時，而後細胞分裂，並用1.2 mg/ml G418開始篩選三週。用次理想的mIL-3濃度(0.4 ng/ml)以及最理想的VEGF-A與VEGF-C濃度(分別為200與300 ng/ml)維持細胞。

脈衝追蹤：轉染293T細胞，並且在6公分盤中生長36小時直到接近長滿。使細胞在met-/cys-缺乏的D-MEM、5%透析的FCS中飢餓30分鐘，而後用[³⁵ S]-半胱胺酸/[³⁵ S]-甲硫胺酸代謝標定細胞2小時。而後，用溫的PBS清洗細胞，並且加入5 ml追蹤培養液(D-MEM、10% FCS + 2 mM無放射線的L-甲硫胺酸+ 2mM無放射線的L-半胱胺酸)。在所指示的時間點，將培養盤放在冰上，並且移除培養液，進行分析。

藉由VEGF-C前胜肽競爭VEGF-C切割：VEGF-C/CCBE1共轉染的293T細胞之標定培養液中包含濃度為25 µg/ml之純化的組胺酸-標籤蛋白質。從轉染之後30-72小時，將該標定培養液條件化，用Ni²⁺ NTA膠體去除組胺酸-標籤蛋白質，並且免疫沉澱VEGF-C，用PAGE分離，並藉由暴露至X光底片而顯影。由雷射掃描器讀出，藉由定量14 kDa N端切割產物而量測VEGF-C之N端切割的抑制。

strep-標籤的CCBE1的共同免疫沉澱分析：用CCBE1-strepIII或全長VEGF-C架構轉染293T細胞。條件化的培養液分開地或作為CCBE1與全長VEGF-C的混合而用於Strep-Tactin (Qiagen)拉下。在用於拉下(pull-down)之前，混合的培養液置於室溫10分鐘。在SDS-PAGED與西方墨點法之後，用抗CCBE1抗體與抗VEGF-C抗血清分析沉澱物。輸入代表25 µl的全長VEGF-C條件化培養液，其載入作為正控制組。

體內實驗：將編碼m(鼠)CCBE1-V5、全長mVEGF-C或HAS的rAAV9s之1:1混合溶液，注入FVB/N公鼠的脛前肌。AAV9-HSA與AAV9-ΔNΔC-mVEGF-C單一載體對應地作為負與正控制組。在單一注射劑量中該載體粒子的總濃度為6x10¹⁰ 。轉染三週之後，用過量的二氧化碳犧牲老鼠。分離脛前肌肉，將其包埋至O.C.T. (Sakura Finetek Europe, Alphen aan den Rijn, The Netherlands)、切片(厚度10 µm)並且將淋巴(LYVE-1, Prox-1)與血管(PECAM-1)以及平滑肌細胞/外被細胞(平滑肌肌動蛋白，SMA)與白血球標記(CD45)染色，而後使用Alexa接合的二次抗體 (Molecular Probes, Invitrogen)。用Axioplan 2顯微鏡(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)得到螢光影像；物鏡為：10x NA=0.3 WD 5.6以及20x NA=0.5 WD 2.0；相機為Zeiss AxioCamHRm 14-位元灰階CCD；獲取軟體為Zeiss AxioVision 4.6。使用ImageJ軟體完成染色區域的定量。手動計數Prox-1正的細胞核。如先前所述進行EGFP/Luc Vegfr3EGFP/Luc老鼠中螢光酵素活性的偵測(Martínez-Corral et al, 2012, PNAS 109: 6223-6228)。南芬蘭省級國家動物實驗委員會通過本研究所進行的所有動物實驗。

統計分析：使用單向ANOVA判定差異的顯著性。當假設相同變異時，使用土耳其測試作為事後 (post-hoc)測試。當未假設變異相同時，使用Games-Howell測試作為事後測試。使用邏輯回歸，計算Ba/F3分析的EC50。圖式中的誤差桿代表標準偏差。

結果： CCBE1促進VEGF-C處理與分泌，造成增加的VEGFR-3活化。在細胞溶解產物與以CCBE1表現載體轉染的293T細胞之條件化培養液中皆偵測到CCBE1為40-55 kDa分子量的蛋白質(第1A圖)。在上清液中，對應於推定的CCBE1雙體(dimer)，部分的CCBE1遷移為擴散的、醣化的帶狀。轉染的VEGF-C表現為未切割的58 kDa前驅物，C端處理的29/31 kDa與完全處理的21 kDa成熟形式(第1D圖，第1行)。然而，當VEGF-C與CCBE1被共同轉染時，未切割的VEGF-C與29/31 kDa多胜肽的量明顯減少，並且成熟的、完全活化的VEGF-C成為主要種類(第1D圖，比較第1至3行)。這些結果代表CCBE1加速VEGF-C的N端與C端蛋白水解處理。

為了能夠分析CCBE1共同轉染對於細胞內VEGF-C形式的效果，我們使用較短的標定期間。由於在共轉染細胞的溶解產物中，細胞內的含量降低80%，因此用CCBE1共轉染促進VEGF-C的分泌(第2A圖，比較第5、6與7、8行)。

相較於單獨轉染VEGF-C的細胞上清液，來自CCBE1/VEGF-C共轉染細胞培養的條件化培養液更能刺激Ba/F3-VEGFR-3/EpoR與Ba/F3-VEGFR-2/EpoR細胞的成長與存活，而CCBE1單獨轉染則顯示非常低的活性。這確認所促進的分泌與切割造成細胞培養中活化的VEGF-C蛋白質含量增加(第1C圖與第2B圖)。注意，同樣地，單獨表現CCBE1的細胞上清液造成Ba/F3-VEGFR-3/EpoR細胞存活的稍微增加，假設這是由於細胞內生成的VEGF-C的處理與活化增加。

缺失的CCBE1不促進VEGF-C刺激的VEGFR-3活性。如Bos等人揭示的方式截斷CCBE1(2011, ibid.)，亦即，使得膠原蛋白結合區被移除，而剩餘的CCBE1分子融合至人類IgG的Fc區而得到較佳的蛋白質穩定性。將缺失的CCBE1純化為均質，並且在已建立的體外系統與純化的全長或成熟的VEGF-C蛋白質一起進行測試。我們進行的實驗如下。在固定劑量(5 µg/ml)缺失的CCBE1-Fc或是Fc部分的負控制蛋白質存在下，藉由人類VEGF-CΔNΔC(成熟的VEGF-C)(第3A圖)或是全長VEGF-C (VEGF-C前驅物) (第3B圖)的增加濃度，刺激hVEGFR-3/EpoR-Ba/F3細胞。將細胞培養於刺激條件總共3天。此期間結束時，加入噻唑藍溴化四唑(MTT, Sigma-Aldrich)至細胞培養中，藉由OD540光密度量測每一培養中的活細胞數目(細胞增生的直接分數)(黃色MTT會被活細胞的粒腺體酵素還原，產生深藍色物質)。結果清楚顯示有缺失的CCBE1不能夠促進VEGF-C之FGFR-3刺激活性。

CCBE1可反式促進VEGF-C處理。在發育中的老鼠胚胎與斑馬魚中，CCBE1表現於鄰近發育中的淋巴結構，但是並非由內皮組織本身表現(Hogan et al, 2009, Nature Genetics 41: 396–398)。因此，我們想要判定由其他細胞反式產生的CCBE1是否亦可促進VEGF-C處理。我們以VEGF-C或CCBE1轉染分開培養的293T細胞，並且在轉染24小時之後將細胞族群混合。或者，我們將CCBE1-轉染的細胞與穩定表現VEGF-C的細胞混合。如同在共同轉染實驗中，CCBE1增加VEGF-C的細胞外處理效率(第4A圖)。相對地，當相鄰細胞產生過多的CCBE1時，VEGF-C的細胞內處理以及分泌不受影響(第4B圖)。

CCBE1促進體內VEGF-C之淋巴管新生活性。為了研究CCBE1是否促進體內淋巴管新生，我們用單獨表現CCBE1腺病毒相關病毒(AAV)載體(AAV9-CCBE1)與AAV9-VEGF-C載體比例1:1轉導老鼠脛前肌，或是轉導AAV9-人類血清白蛋白(HAS)作為負控制組。編碼VEGF-C (ΔNΔC-VEGF-C)活化形式的AAV9是作為正控制組，以模擬VEGF-C之完全蛋白水解處理的(成熟的)形式。

在AAV轉導兩週之後，使用內皮細胞(PECAM-1)、淋巴內皮細胞 (LYVE-1, Prox1)以及白血球(CD45)的標記，藉由免疫組織化學分析骨骼肌。在此分析中，全長的VEGF-C與ΔNΔC-VEGF-C皆刺激淋巴管新生，雖然以相同的病毒劑量，後者(“成熟的”形式)具有明顯較強的反應，然而僅∆N∆C-VEGF-C刺激血管新生(第6圖與第7圖，底列)。這推測在AAV9轉導的肌肉中，全長的VEGF-C之蛋白水解處理不足。

然而，當全長的VEGF-C與CCBE1共轉導時，明顯促進淋巴管新生，如LYVE-1與Prox-1染色所示(第6圖)。我們也明顯地觀察到更多血管新生(第7圖)，表示CCBE1亦促進體內的VEGF-C之蛋白水解處理。在共轉導全長VEGF-C/CCBE1之後，觀察到CD45+白血球數目增加(第8圖)，推測VEGF-C活化亦經由VEGFR-3而增加白血球募集。

為了證實這些發現，我們使用AAV9-轉導的異質(heterozygous) Vegfr3EGFP/Luc老鼠(Martínez-Corral et al, 2012, ibid.)，以藉由體內光學生物發光影像而監視淋巴管新生。在以編碼VEGF-C與CCBE1之AAV共轉導的老鼠中，我們偵測到強的螢光信號，然而在單獨以VEGF-C或CCBE1轉導的老鼠中，偵測到較弱的信號，以及在以HAS轉導的老鼠中，無生物發光信號(第9圖)。

VEGF-C前胜肽涉及CCBE1媒介的蛋白質水解。我們對於說明VEGF-C與CCBE1的物理交互作用的嘗試並不成功。因此，我們假設CCBE1-VEGF-C交互作用弱、短暫及也許是間接的。我們試著識別負責CCBE1媒介的加速分泌以及切割的VEGF-C中的結構元素。當我們在脈衝追蹤實驗中比較野生型VEGF-C與無C端前胜肽的VEGF-C突變株之間的分泌動力學時，在15與45分鐘之間，標定的VEGF-C突變株已經達到其分泌高峰，然而野生型VEGF-C僅在2小時之後達到其分泌高峰(第10圖)。這推測該C端前胜肽調節分泌效率。我們嘗試藉由加入高濃度的純化VEGF-C N端或C端前胜肽或VHD而抑制CCBE1促進之VEGF-C的處理。發現用C端前胜肽，VEGF-C處理有約79%抑制，用N端前胜肽，約43%抑制，然而用VHD或BSA控制組則不會改變轉染細胞產生的蛋白水解片段之比例(第11A圖)，確認VEGF-C前胜肽涉及CCBE1媒介的切割。雖然VEGF-D在結構與蛋白水解處理上非常類似於VEGF-C (Leppänen et al, 2011, Blood 117: 1507–1515; Stacker et al, 1999a, J. Biol. Chem. 274: 32127–32136)，但是CCBE1共轉染不會加速人類全長VEGF-D或是VEGF-D VHD由VEGF-C的N與C端前胜肽處理齊平的嵌合體因子的蛋白水解處理(第11B圖，第3-6行)。

 

<110> Laurantis Pharma Oy <120> VEGF-C與CCBE1之治療用途 <130> 2122047FI <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> 人類 <400> 1 Met Val Pro Pro Pro Pro Ser Arg Gly Gly Ala Ala Arg Gly Gln Leu 1 5 10 15 Gly Arg Ser Leu Gly Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly His Thr 20 25 30 Trp Thr Tyr Arg Glu Glu Pro Glu Asp Gly Asp Arg Glu Ile Cys Ser 35 40 45 Glu Ser Lys Ile Ala Thr Thr Lys Tyr Pro Cys Leu Lys Ser Ser Gly 50 55 60 Glu Leu Thr Thr Cys Tyr Arg Lys Lys Cys Cys Lys Gly Tyr Lys Phe 65 70 75 80 Val Leu Gly Gln Cys Ile Pro Glu Asp Tyr Asp Val Cys Ala Glu Ala 85 90 95 Pro Cys Glu Gln Gln Cys Thr Asp Asn Phe Gly Arg Val Leu Cys Thr 100 105 110 Cys Tyr Pro Gly Tyr Arg Tyr Asp Arg Glu Arg His Arg Lys Arg Glu 115 120 125 Lys Pro Tyr Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser Ser Asn Gly Thr 130 135 140 Leu Cys Ala His Ile Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser Tyr Arg Cys Glu 145 150 155 160 Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Arg Glu Asp Asp Gly Lys Thr Cys Thr Arg 165 170 175 Gly Asp Lys Tyr Pro Asn Asp 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Thr Glu Thr Arg Asp Leu Arg Ala 385 390 395 400 Pro Arg Asp Phe Tyr Pro 405 <210> 2 <211> 6276 <212> DNA <213> 人類 <400> 2 cggccgcgga ggagcaggac gcttggtccg gacggagctc ggcgctggga agaagccggg 60 agcttccctg atggtgccgc cgcctccgag ccggggagga gctgccaggg gccagctggg 120 caggagcctg ggtccgctgc tgctgctcct ggcgttggga cacacgtgga cctacagaga 180 ggagccggag gacggcgaca gagaaatctg ctcagagagc aaaatcgcga cgactaaata 240 cccgtgtctg aagtcttcag gcgagctcac cacatgctac aggaaaaagt gctgcaaagg 300 atataaattt gttcttggac aatgcatccc agaagattac gacgtttgtg ccgaggctcc 360 ctgtgaacag cagtgcacgg acaactttgg ccgagtgctg tgtacttgtt atccgggata 420 ccgatatgac cgggagagac accggaagcg ggagaagcca tactgtctgg atattgatga 480 gtgtgccagc agcaatggga cgctgtgtgc ccacatctgc atcaatacct tgggcagcta 540 ccgctgcgag tgccgggaag gctacatccg ggaagatgat gggaagacat gtaccagggg 600 agacaaatat cccaatgaca ctggccatga gaagtctgag aacatggtga aagccggaac 660 ttgctgtgcc acatgcaagg agttctacca gatgaagcag accgtgctgc agctgaagca 720 aaagattgct ctgctcccca acaatgcagc tgacctgggc aagtatatca ctggtgacaa 780 ggtgctggcc tcaaacacct accttccagg acctcctggc ctgcctgggg gccagggccc 840 tcccggctca ccaggaccaa agggaagccc aggcttcccc ggtatgccag gccctcctgg 900 gcagcccggc ccacggggct caatgggacc catgggacca tctcctgatc tgtcccacat 960 taagcaaggc cggaggggcc ctgtgggtcc accaggggca ccaggaagag atggttctaa 1020 gggggagaga ggagcgcctg ggcccagagg gtctccagga ccccctggtt ctttcgactt 1080 cctgctactt atgctggctg acatccgcaa tgacatcact gagctgcagg aaaaggtgtt 1140 cgggcaccgg actcactctt cagcagagga gttcccttta cctcaggaat ttcccagcta 1200 cccagaagcc atggacctgg gctctggaga tgaccatcca agaagaactg agacaagaga 1260 cttgagagcc cccagagact tctacccata gcacatccca acaccgtcac gccaaaggaa 1320 gagaaagatc aactcacctg cagttaaacc atctaaagag aagaaagacc actggagacc 1380 tagaaaacat acatttttct cttctcttct cctgacgtct ctccactcct cttcttccaa 1440 atacgatgct attttcagag tcccctccta ggcctgcaga catgagggag tgaatgattg 1500 atttacctgc ttctcactaa gagtccattg gggtggtttg cattgtaact tttcttttac 1560 atcctatttt tccaggaact ttggatttaa gtactctcac agtgtcttaa atcataaatt 1620 cttgaagtta aatttggcag agtatcaaaa gggggaaaat gacaaagtga gctctaagaa 1680 aatgtgaggc tacttctaag atgtgtgttc acaatagacc ataactcctc tagtatcaaa 1740 attggggctc ttcagttaaa aaggggtggg gaggacaaac gtgtcgatgt gctttggtgg 1800 agaatttttt ccttgtgctt ctagtagact ttaaatattg tatccctttg tcaaaccttg 1860 tttcccaaat tcaattaaag agaggagaga attgaatggc gtttagagaa gatagaaaag 1920 aatcacagtc atatatttac tgttatatag attgccacat tctaaaattc aaatacggtg 1980 cttaaggttt catgccatgc ttatctgtaa gtatcctatt tagggaagaa gattaaactc 2040 tcttttcaaa aaaacaaagt gaaatgcctg gattcacatt aaaacaatgg gctctcgttt 2100 gctataatat tttaaagctg tttaatcaac agtggagtct gctctataaa tatagattat 2160 ttgttcaata aactggctga gcttagagag aggtgcagaa ttcctggttc tgagcaggtg 2220 cccagaaggt accattaggt gccatgatcc aggctgaacc aatatacagt ggggctgaag 2280 tctgcaagga ggttgctggc ttgggctgac ctcactaatg ccatcagcag cggtaggtaa 2340 attttttctc cttgggtatt acaagttttt gtctggagcc aaccaagctt gccaccaaca 2400 tattgagagt aatacactat tgaaagttat cttggatggg gagaaaaaaa aatagtggtt 2460 ttccttgttt gcaaaaactt ccttcctatt ctcatttttt cttaattttc tttaatttag 2520 tccaagttcc agttctttta ggccttctct ttgatttatt ttcccctgca tgtgagaagc 2580 agttcagaaa aaggtctata tctccacctc ctagtgagtt agagtgtttt ctcagagcac 2640 ctctgggtgg caaagggaag catgttcctg ccaaggtttg ctgtggattc agaagcacca 2700 ggagcaagag accagaagga tgatctgctc ctttgtaacg ttgttgaggg ccctcttgtt 2760 tccaatgagc agcttatagg ttactcacag tccactttct cactggacac acaaagtggc 2820 tctttatcta cctttgcggg agattttcac tctcctgcaa atgatcgttc tcacactcat 2880 attagctcat gttggaattt cccatcctgc catgtccttt cccatttctt tttggctttt 2940 ttgcctccac cttttagccc acatcattta actccactac tgtgaaagct tgcttaaaga 3000 aaatccctct tggccgggtg tggtagccca cgcctctaat cccagcactt tgggaggctg 3060 aggcggggag atcacaaggt caggagatcg agaccagcct gaccaacatg gtgaaaccct 3120 gtctctacta aaaatacaaa aattagctgg gcgtgttggc acacacctgt aatcccagct 3180 actcaggagg ctgaggcagg agaattactt taacctgcgg ggggagccta gattgcgcta 3240 ctgcactcca gcctaggcaa cagagggaga ctctgtctca ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaggc cgggcttggt ggctcatgcc tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc 3360 gggcggatca cgaggtcagg agatcgagac cacagtgaaa ccctgtctct actaaaaaca 3420 caaaaaatta gtcgggcgtg gtggtgggcg cctgtggtcc cagctgctcg ggaggctgag 3480 gcaggagaat ggcgtgaacc tgggaggcgg agcttgcgct gagccgagat cgtgccactg 3540 cactccagcc tgggcgacag agcgagactc tgtctcaaaa aaaaaaaaat atcccttttg 3600 ttgtgtttga atgccacctt tcagtcttct tccttaagaa tgttaggaag gggctttgca 3660 aacctctagt ggcaacagtc ttccttccct tcttcctacc acgttggaaa tgcaggactc 3720 atgtcagtca gcatgtgacc gagtctttca tgaacacttt gctcctctat gtctcattta 3780 tgcaaaattc ctggtgactc tccactaaca tttttaaagt gaaagcaaac tttcacttta 3840 aaaaaagtga gcgagaggat cccttgagcc caggagttca aggccagtct gggcaacata 3900 gcaagacccc atccctaaaa aaaaaaaaat aagttttatt aaatgtggca ctttccccta 3960 gaagggcagt aaccccagga accagtctgc ctcttttcga ataaaggaga ctttttaaaa 4020 agaaaaaatt tctttttagg gtggggtgct ctttatctag catctttcct tcctccttct 4080 ctctgcaaaa ttcaacattc atgacagagg gccacaccaa ccacgggttt atagagagag 4140 gaactgaaca gctgttgatt cccatctgga atatatttaa tgtttgcctg cttgtggagc 4200 atggtattta aagggtgtgg atggatgaat gtttaaaaaa aaacacacaa aactatgcac 4260 aagctgtatg agagatggct aggtccatct atgatttttt ttaaaagaag aattttaata 4320 ccttttcttt gacagtgaac tgtatttaga aatatgatct ttattgtgaa atgctcataa 4380 aatgcaacca aactgcatgt ttggccatag gctagaataa tatattaaaa gaattaatgg 4440 aaagtagtat tgtctgggtt tcatgaaact attccagata atattctcca gcaaaactta 4500 tggtaacctg tattttataa tgtcaatctg ctggaccaag ttaatttaga aaataatttt 4560 taatcctcag attttcaaaa cttggactac tgcaagactg atatgtactt tttatgccca 4620 aatcatattt ttcaaagata ggacatcata aggcatcatt atttctaatg tatcttttaa 4680 ctagatagaa aaagctttac tgtctaaaca ggacttctgc tcaaaaccta atgggaaagc 4800 tatttctggg gtaagatttg taacagtgct tctaggtcat ttcatgtttt atagggaaaa 4800 agatctttgt acacctcctc aacctgttag tagaaatgtt gacttcgatt ttttgcaccc 4860 tcttcacagg acctcataag ttgcctctgt tcttggaaag caatgggaat aaaaatatgc 4920 tgttgaaaat agtgcatggg gccaggcaca gtggttatgc ctgtaatccc aacactttgg 4980 gaggctgagg cgggcgcatc atgaggtcag gagatcaaga ccatcctgac caacacgtgg 5040 tgaaacccca tctctactaa aataaataaa aaaaaaaatt agccaggcgt ggtggtgcac 5100 gcctgtagtc tcagctactc gggaagctga gacacaagaa ttgcttgaac ccgggaggtg 5160 gaggttgcag tgagccaaga ttgcgccact gcactccagc ctggctacag agtgagactc 5220 cgtctcgaaa aaagaaaata gtacatggag ggcatgcatt ttagtttagg aaacccccct 5280 cccttcccag ttccagaggg agaaattata agctatactg tgccaaaagt gagtggggct 5340 gcagagagaa tggtgccttt tctcaccttc tgagttaatg cccgacatct gccattggat 5400 tcattgacca aaggaagtca tttctactgt ataaactcag gagtatcata gcccaacaag 5460 taaataataa atgttcattg gttttggaag gaaggaaagg tgagtattac cccaccaaat 5520 accagcgaag agcaccctgg ctttggccat ctttccaagg ttcataattg ctgtgggcct 5580 ggtgagccct gttcccaggt atgcaaggga gggcttctcc aggccagaca tttctgtagg 5640 ttttcaggta gcaactcccc catcatattt tgggtgtcat tccccactct ctctccccac 5700 ttctcagcct gtgccccaga aacaaccaca gcagcctcat tctgcagact taacatctgt 5760 caaataacct tcctgaaaag gaaagttatt ggaggaatcc aggccaaaca acaagtagaa 5820 tagagccatc taaagttatt aataatgagt tcagggaaat agatgaattt tttcctggca 5880 tagtcaatat ttatatctca caacaagtca aaaataattt tccatttgga aaacaaaaca 5940 caccatgact gtaattgtta aggcatataa tcatgaactt cacatgctcc ctcaacaaac 6000 gttactgctc tagggaaatc atagaaaagg accctcttac tccccagggg atcaaagcaa 6060 gtccccttag gaatttcatg tgtgccgtgg gtctgttttt atttcacagt gactagtcat 6120 atactggagt agctctgttg ttcattattt gtaacaggtc catgtaacag tcaagttagc 6180 attcaagcaa ttatggatgt gatactatga tgtacttttg ttatgattgt atatgcttaa 6240 taacaaagtt atttttctta aaaaaaaaaa aaaaaa 6276 <210> 3 <211> 419 <212> PRT <213> 人類 <400> 3 Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe 20 25 30 Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala 35 40 45 Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser 50 55 60 Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala 100 105 110 His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys 115 120 125 Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe 130 135 140 Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr 165 170 175 Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu 180 185 190 Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser 195 200 205 Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile 210 215 220 Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn 225 230 235 240 Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys 245 250 255 Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser 260 265 270 Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu 275 280 285 Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys 290 295 300 Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys 305 310 315 320 Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu 325 330 335 Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro 340 345 350 Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys 355 360 365 Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr 370 375 380 Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro 405 410 415 Gln Met Ser <210> 4 <211> 2076 <212> DNA <213> 人類 <400> 4 cggggaaggg gagggaggag ggggacgagg gctctggcgg gtttggaggg gctgaacatc 60 gcggggtgtt ctggtgtccc ccgccccgcc tctccaaaaa gctacaccga cgcggaccgc 120 ggcggcgtcc tccctcgccc tcgcttcacc tcgcgggctc cgaatgcggg gagctcggat 180 gtccggtttc ctgtgaggct tttacctgac acccgccgcc tttccccggc actggctggg 240 agggcgccct gcaaagttgg gaacgcggag ccccggaccc gctcccgccg cctccggctc 300 gcccaggggg ggtcgccggg aggagcccgg gggagaggga ccaggagggg cccgcggcct 360 cgcaggggcg cccgcgcccc cacccctgcc cccgccagcg gaccggtccc ccacccccgg 420 tccttccacc atgcacttgc tgggcttctt ctctgtggcg tgttctctgc tcgccgctgc 480 gctgctcccg ggtcctcgcg aggcgcccgc cgccgccgcc gccttcgagt ccggactcga 540 cctctcggac gcggagcccg acgcgggcga ggccacggct tatgcaagca aagatctgga 600 ggagcagtta cggtctgtgt ccagtgtaga tgaactcatg actgtactct acccagaata 660 ttggaaaatg tacaagtgtc agctaaggaa aggaggctgg caacataaca gagaacaggc 720 caacctcaac tcaaggacag aagagactat aaaatttgct gcagcacatt ataatacaga 780 gatcttgaaa agtattgata atgagtggag aaagactcaa tgcatgccac gggaggtgtg 840 tatagatgtg gggaaggagt ttggagtcgc gacaaacacc ttctttaaac ctccatgtgt 900 gtccgtctac agatgtgggg gttgctgcaa tagtgagggg ctgcagtgca tgaacaccag 960 cacgagctac ctcagcaaga cgttatttga aattacagtg cctctctctc aaggccccaa 1020 accagtaaca atcagttttg ccaatcacac ttcctgccga tgcatgtcta aactggatgt 1080 ttacagacaa gttcattcca ttattagacg ttccctgcca gcaacactac cacagtgtca 1140 ggcagcgaac aagacctgcc ccaccaatta catgtggaat aatcacatct gcagatgcct 1200 ggctcaggaa gattttatgt tttcctcgga tgctggagat gactcaacag atggattcca 1260 tgacatctgt ggaccaaaca aggagctgga tgaagagacc tgtcagtgtg tctgcagagc 1320 ggggcttcgg cctgccagct gtggacccca caaagaacta gacagaaact catgccagtg 1380 tgtctgtaaa aacaaactct tccccagcca atgtggggcc aaccgagaat ttgatgaaaa 1440 cacatgccag tgtgtatgta aaagaacctg ccccagaaat caacccctaa atcctggaaa 1500 atgtgcctgt gaatgtacag aaagtccaca gaaatgcttg ttaaaaggaa agaagttcca 1560 ccaccaaaca tgcagctgtt acagacggcc atgtacgaac cgccagaagg cttgtgagcc 1620 aggattttca tatagtgaag aagtgtgtcg ttgtgtccct tcatattgga aaagaccaca 1680 aatgagctaa gattgtactg ttttccagtt catcgatttt ctattatgga aaactgtgtt 1740 gccacagtag aactgtctgt gaacagagag acccttgtgg gtccatgcta acaaagacaa 1800 aagtctgtct ttcctgaacc atgtggataa ctttacagaa atggactgga gctcatctgc 1860 aaaaggcctc ttgtaaagac tggttttctg ccaatgacca aacagccaag attttcctct 1920 tgtgatttct ttaaaagaat gactatataa tttatttcca ctaaaaatat tgtttctgca 1980 ttcattttta tagcaacaac aattggtaaa actcactgtg atcaatattt ttatatcatg 2040 caaaatatgt ttaaaataaa atgaaaattg tattat 2076 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 5 gccgctagcg ccaccatggt gccgccgcct 30 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 6 ggagcttggg cacaaatgtc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 7 accaggagca ccaggaagac 20 <210> 8 <211> 80 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 8 gcctctagaa cgcgtctagg tgctgtccag gcccagcaga gggttaggga taggcttgcc 60 tggataaaaa tttcttgggg 80 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 嵌合體hVEGFR-3/EpoR (VEGFR-2部分的一端)之接合胺基酸 <400> 9 Phe Phe Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 44 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 嵌合體hVEGFR-3/EpoR (start of mEpoR部分的開始)之接合胺基酸 <400> 10 Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Thr Leu Gln Gln Lys Ile 20 25 30 Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu 35 40

VEGF-C‧‧‧血管內皮生長因子C

VHD‧‧‧同質區

Claims (1)

1. 1. 一種用於治療淋巴水腫之全長CCBE1與VEGF-C的組合物。
   2. 如申請專利範圍第1項所述的組合物，其中該CCBE1為一多胜肽形式，其包括如SEQ ID NO: 1所述的一胺基酸序列、SEQ ID NO: 1所述之胺基酸35-406或是與其具有至少約80%胺基酸序列相同性之一胺基酸序列。
   3.如申請專利範圍第1項所述的組合物，其中該CCBE1為一聚核苷酸形式，其包括SEQ ID NO: 2所述之一核苷酸序列或是與其具有至少80%核苷酸序列相同性的一核苷酸序列。
   4. 如申請專利範圍第1項所述的組合物，其中該VEGF-C為一多胜肽形式，其包括選自由SEQ ID NO: 3的胺基酸32-419、SEQ ID NO: 3的胺基酸32-227共價連結至SEQ ID NO: 3的胺基酸228-419、SEQ ID NO: 3的胺基酸112-227、SEQ ID NO: 3的胺基酸103-227以及與其具有至少80%胺基酸相同性的一胺基酸序列所組成之群組的一胺基酸序列。
   5. 如申請專利範圍第1項所述的組合物，其中該VEGF-C為一聚核苷酸形式，其包括選自由SEQ ID NO: 4的核苷酸524-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸737-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸764-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸737-1111、SEQ ID NO: 4的核苷酸764-1111以及與其具有至少80%核苷酸序列相同性之一核苷酸序列所組成之群組的一核苷酸序列。
   6. 如申請專利範圍第1項所述的組合物，其中淋巴水腫係選自由原發性淋巴水腫、Milroy症、Meige淋巴水腫、遲發性淋巴水腫、次發性淋巴水腫以及脂肪水腫所組成的群組。
   7. 一種醫藥組合物，其包括申請專利範圍第1項至第6項中任一項的該組合物，以及一醫藥上可接受的載體。
   8. 一種治療淋巴水腫的方法，其藉由同時、分別或是連續投予全長CCBE1與VEGF-C之組合物至有需要之一病患。
   9. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該CCBE1為一多胜肽形式，其包括如SEQ ID NO: 1所述的一胺基酸序列、SEQ ID NO: 1所述之胺基酸35-406或是與其具有至少約80%胺基酸序列相同性之一胺基酸序列。
   10. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該CCBE1為一聚核苷酸形式，其包括SEQ ID NO: 2所述之一核苷酸序列或是與其具有至少80%核苷酸序列相同性的一核苷酸序列。
   11. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該VEGF-C為一多胜肽形式，其包括選自由SEQ ID NO: 3的胺基酸32-419、SEQ ID NO: 3的胺基酸32-227共價連結至SEQ ID NO: 3的胺基酸228-419、SEQ ID NO: 3的胺基酸112-227、SEQ ID NO: 3的胺基酸103-227以及與其具有至少80%胺基酸序列相同性的一胺基酸序列所組成之群組的一胺基酸序列。
   12. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該VEGF-C為一聚核苷酸形式，其包括選自由SEQ ID NO: 4的核苷酸524-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸737-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸764-1687、SEQ ID NO: 4的核苷酸737-1111、SEQ ID NO: 4的核苷酸764-1111以及與其具有至少80%核苷酸序列相同性之一核苷酸序列所組成之群組的一核苷酸序列。
   13. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中淋巴水腫選自由原發性淋巴水腫、Milroy症、Meige淋巴水腫、遲發性淋巴水腫、次發性淋巴水腫以及脂肪水腫所組成的群組。