[go: up one dir, main page]

TW201437226A - 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用 - Google Patents

豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TW201437226A
TW201437226A TW103118244A TW103118244A TW201437226A TW 201437226 A TW201437226 A TW 201437226A TW 103118244 A TW103118244 A TW 103118244A TW 103118244 A TW103118244 A TW 103118244A TW 201437226 A TW201437226 A TW 201437226A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
strain
circovirus
pcv2
porcine
type
Prior art date
Application number
TW103118244A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI508974B (zh
Inventor
Tsun-Yung Kuo
Hsu Chung Gabriel Chen
Chung-Chin Wu
Han-Ting Chen
Original Assignee
Sbc Virbac Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sbc Virbac Ltd filed Critical Sbc Virbac Ltd
Publication of TW201437226A publication Critical patent/TW201437226A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI508974B publication Critical patent/TWI508974B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/00063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10071—Demonstrated in vivo effect
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

本發明係關於一種新穎的豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2, PCV2)株。本發明並關於一種含有該新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)之免疫組合物、一種豬第二型環狀病毒(PCV2)檢測套組，以及該新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)之應用。

Description

豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
本發明係關於動物保健領域，特別是關於一種新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)、含有該病毒之免疫組合物、檢驗套組及應用。
豬環狀病毒(porcine circovirus, PCV)最早是在豬腎細胞株(PK-15, ATCC CCL33)中被發現，雖然會持續感染該細胞，但是並不產生細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)；另外該病毒雖會感染豬隻，但是並不造成豬隻產生任何病變。該病毒為一環狀單股、全長1759 bp的正二十面體(icosahedron)病毒，在1995年被歸類為環狀病毒科(Circoviridae)的一員。
而1991年首度於加拿大發現的仔豬離乳後多系統耗弱症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, 以下簡稱PMWS)，主要發病的對象為5到12週齡的保育後期及肥育前期仔豬，其臨床症狀包括漸進性的消瘦、呼吸急促、皮膚蒼白及偶爾可見黃疸等，解剖分析可看到間質性肺炎肉芽腫、肝炎、腎炎及淋巴病變等。自從PMWS在加拿大爆發後，北美、歐洲及亞洲等世界各主要國家幾乎都有報導PMWS的發生。近年，從罹患PMWS的病豬身上被分離出另一種新的環狀病毒，該病毒與當初從PK-15細胞分離出的環狀病毒外形非常相似，但是基因組序列的相似度只有68-76%，後來將無致病性的豬環狀病毒稱為豬第一型環狀病毒(porcine circovirus type 1, PCV1)，而會造成PMWS的病毒則稱為豬第二型環狀病毒 (porcine circovirus type 2, PCV2)。
豬第二型環狀病毒(PCV2)屬於環狀病毒科(circoviridae)，為不具套膜(envelope)的正二十面體(icosahedron)病毒，直徑約17 nm，病毒核酸為單股環狀DNA，在DNA的環狀基因組上有一莖-環狀(stem-loop)的構造為複製起始點，此為環狀病毒共通的特徵。PCV2的基因組有1768或1767個核苷酸，是目前已知最小的動物病毒。PCV2基因組序列經軟體分析後發現順時針加上逆時針共有11個開放閱讀框架(open reading frame, ORF)，其中ORF1、ORF2是2個最主要的基因。ORF1可轉錄出Rep及Rep’蛋白，與該病毒的複製有關。而ORF2則是PCV2的外殼蛋白(capsid)，是最有可能誘發出中和抗體的抗原。
PCV2在全世界都有很高的感染率。PCV2會造成豬隻育成率及飼料換肉率的降低，而使得養豬業受到極大的衝擊與經濟損失，所以PCV2檢測/診斷試劑及疫苗的開發，可說是刻不容緩且極為重要的事。
本發明於第一部份中提供一種新穎的豬第二型環狀病毒株，該病毒株係自一受感染的豬隻中分離及純化。該病毒具有如SEQ ID No: 1所示之正股基因組序列；經鑑定後，確認該病毒為一種新穎的豬第二型環狀病毒株，命名為豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)。將該病毒株寄存於新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，寄存日為中華民國99年7月6日，寄存編號為BCRC 970053。
本發明於第二部分中提供一種含有該新穎之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的免疫組合物。於一實施例中，該免疫組合物為一疫苗，係將上述豬第二型環狀病毒H株不活化，或進行病毒株弱化，再與一藥學上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable vehicle)，製備成一適用本發明疫苗之劑型。然而，該疫苗之劑型包含但不限於：死毒(不活化)疫苗、活毒(減毒)疫苗、次單位疫苗、DNA疫苗、或藉由該新穎豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)或其核苷酸序列、胺基酸序列所製備而得之疫苗。
本發明所述之不活化處理(或去活化處理, inactivated treatment)包含但不限於：去活化劑處理、熱處理等適用本發明之不活化方法。其中去活化劑包含但不限於：甲醛(formaldehyde)、多聚甲醛(paraformaldehyde)、β-丙內酯(Beta-Propiolactone, BPL)、2-溴乙胺(binary ethyleneimine, BEI)，或適用本發明之去活化劑等。
其中該藥學上可接受之載劑包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、界面活性劑(surfactant)、佐劑(adjuvant)，及其他類似或適用本發明之載劑。
其中該佐劑包含但不限於：油質佐劑(如：礦物油、植物油、動物油、佛氏完全佐劑、佛氏不完全佐劑等)、水質佐劑(如：氫氧化鋁)、雙相油質佐劑(如：水包油包水劑型，w/o/w)、生物型佐劑(如：CpG寡核苷酸、細菌類毒素toxoid)等。其中該雙相油質佐劑係包含一界面活性劑以及一油相物質；該界面活性劑係包括一或多種下列所選之群組者：山梨醇(sorbitol)脂肪酸酯；山梨醇脂肪酸酯與環氧乙烷(ethylene oxide)或環氧丙烷(propylene oxide)濃縮物；甘露醇(mannitol)脂肪酸酯；甘露醇脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；甘露醇脂肪酸酯與下列所選之親水基：羧酸(carboxylic acid)、胺基(amine)、醯胺(amide)、醇類(alcohol)、聚酯多元醇(polyol)、醚類(ether)、氧基(oxide)之接合物；無水甘露醇(anhydromannitol)脂肪酸酯；無水甘露醇脂肪酸酯與下列所選之親水基：羧酸、胺基、醯胺、醇類、聚酯多元醇、醚類、氧基之接合物；蔗糖(saccharose)脂肪酸酯；蔗糖脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；甘油脂肪酸酯；甘油脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；脂肪酸與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；脂肪醇與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；以及甘油磷脂(glycerophospholipid)。該油相物質包括一或多種下列所選之群組者：礦物油、植物油以及動物油。
本發明所述之免疫組合物，可進一步包含一種或多種病原抗原，該病原抗原包含但不限於：豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、豬黴漿菌(Mycoplasma)、豬小病毒 (Parvovirus, PPV)、豬丹毒( Erysipelas )、偽狂犬病(Aujeszky's disease)，且該等病原抗原之形式包含但不限於：重組蛋白、次單位蛋白、基因缺損之病原、滅活之病原抗原等。
本發明於第三部分中提供一種豬隻對抗豬第二型環狀病毒(PCV2)病毒之方法，包含使用有效量之上述免疫組合物以施予豬隻，以增強該豬隻對抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之免疫力，降低病毒血症之嚴重性，進而提升、改善其臨床症狀、存活率、及增重趨勢。
本發明於第四部分中提供一種抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體，係藉由本發明之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)所製備或衍生而得；該抗體包括但不限於：單株抗體、多株抗體，以及經基因重組之抗體。於一實施例中，該抗體係為經由將本發明之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)施打於一動物體內而得到之多株抗體。於另一實施例中，該抗體係為經由篩選單株化融合瘤所得到之單株抗體。
本發明於第五部分中提供上述新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)所含之DNA片段，其具有如SEQ ID No: 1、2、4、6所示之序列。該DNA片段之應用包含，但不限於：製成DNA疫苗、次單位疫苗、或用於設計引子或探針以偵測豬第二型環狀病毒(PCV2)。於一實施例中，該DNA片段為豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之基因組全長，其具有如SEQ ID No: 1所示之序列。於另一實施例中，該DNA片段為豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之開放閱讀框架(open reading frame, ORF)，包含但不限於：     第一開放閱讀框架(ORF 1)，其具有如SEQ ID No: 2所示之序列，其係編碼如SEQ ID No: 3所示之胺基酸序列；     第二開放閱讀框架(ORF 2)，其具有如SEQ ID No: 4所示之序列，其係編碼如SEQ ID No: 5所示之胺基酸序列；以及     第三開放閱讀框架(ORF 3)，其具有如SEQ ID No: 6所示之序列，其係編碼如SEQ ID No: 7所示之胺基酸序列。
本發明於第六部分中提供一種豬第二型環狀病毒(PCV2)之檢測套組，該檢測套組係用以偵測檢驗樣本是否含有豬第二型環狀病毒(PCV2)或偵測檢驗樣本內是否含有抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體。該檢測套組包含但不限於：(1)一抗原，該抗原係為該豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的病毒抗原，於一實施例中，該抗原係置於一抗原盤上，並以去活化劑處理；或(2)一抗體，該抗體係由該豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)所衍生、製備而得之單株抗體或多株抗體；或(3)一經基因重組之抗原或抗體，該基因重組之抗原或抗體係利用該豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之全基因組序列(如SEQ ID No: 1所示)、或其核苷酸片段(如SEQ ID No: 2、4、6所示)所衍生、製備而得；或(4)一多核苷酸(polynucleotide)，該多核苷酸係由該豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之全基因組序列(如SEQ ID No: 1所示)、或其核苷酸片段(如SEQ ID No: 2、4、6所示)所衍生、製備者，如：引子或探針；於一實施例中，該多核苷酸係可用以偵測出豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)序列之引子對，如SEQ ID No: 8~11所示。
該檢測套組之形式包含但不限於：酵素連結免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)套組、微晶片檢驗套組(Microchip kit)、免疫螢光分析法(immuno fluorescent assay, IFA)檢測套組、聚合酶連鎖反應(PCR)檢驗套組、或其他藉由該豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)所製得之檢測套組。於一實施例中，該檢測套組至少包含一含有該豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之抗原盤，可用以檢驗樣本中是否含有抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體。
本發明所述之新穎的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)，亦應包含其繼代培養之後代，或突變株，但仍具有與本發明所述之菌種特性、基因體(genomic)、或致病性相同者。
本發明所述之「DNA(核酸)」、「多核苷酸」、「胺基酸」、「胜肽」、「多胜肽」可為自然存在、單離的、重組的，或人工合成的。
術語“預防、保護、對抗”意謂，相較於未使用本發明之免疫組合物的動物的免疫力，使用本發明免疫組合物，將可有效增強免疫動物對抗豬第二型環狀病毒(PCV2)的能力 ，並可預防及保護該免疫動物免於感染豬第二型環狀病毒(PCV2)及其衍生之相關疾病。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一　豬第二型環狀病毒 (PCV2) 之分離與鑑定
1. 種病毒株來源：
受感染的豬隻肺臟及淋巴結檢體係自一養豬場(台灣，新竹)中採集而來。這些受採樣的八週齡豬隻皆具有仔豬離乳後多系統耗弱症(PMWS)的臨床徵狀。肺臟及淋巴結檢體採集後隨即置於-70°C中保存。
為了分離檢體中的病毒，將已均質化之上述檢體0.2ml接種於未受豬環狀病毒(PCV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、豬腺病毒(porcine adenoviruses)、豬小病毒(porcine parvovirus)、豬繁殖與呼吸綜合症(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬偽狂犬病(pseudorabies virus, PRV)、豬水泡病病毒(swine vesicular disease virus, SVDV)、黴漿菌及其他細菌污染的豬腎細胞(PK-15)單層細胞或其衍生(derived)之細胞株進行培養，於37°C、5% CO2作用1小時後，以滅菌PBS沖洗3次，置入含2%胎牛血清之新MEM培養液培養4小時，將培養液倒棄，加入300mM之D-glucosamine作用30分鐘，以PBS沖洗3次後，置入約含8%胎牛血清之新MEM培養液中，於37°C、5% CO2培養箱內培養72小時，再以免疫螢光分析法(IFA)進行檢測有無病毒存在。
免疫螢光分析法(IFA)的步驟如下：樣品來自上述接種後之細胞，首先將培養液去除，以1倍PBS洗三次，每次五分鐘。加入75μl的80%丙酮(以蒸餾水配製)，於4°C固定三十分鐘，將丙酮去除後，以1倍PBS洗三次，每次五分鐘。接著將PBS去除，再加入75μl以PBS稀釋1500倍之porcine circovirus anti-viral polyclonal antiserum (VMRDO)(一級抗體)，於37°C培養箱中培養三十分鐘後，再將一級抗體移除，以1倍PBS洗三次，每次五分鐘。移除PBS後，加入75μl以PBS稀釋1000倍之Rabbit anti-Pig IgG-FITC (whole molecule) (Sigama, F1638)(二級抗體)，於37°C培養箱中培養三十分鐘後，將二級抗體去除後，以1倍PBS洗三次，每次五分鐘。最後於96孔盤中加入200μl的1倍PBS，以螢光顯微鏡觀察螢光。
選出IFA結果最佳者之細胞所感染的病毒為種病毒株。並對該病毒株基因組序列進行定序，定序結果如SEQ ID No: 1所示，經序列比對鑑定確認為新病毒株(病毒株鑑定方法與結果如下所述)，將之命名為豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)。
2. 種病毒株繼代：
將上述選出之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)感染新鮮的PK-15細胞或其衍生之細胞株，得到的病毒稱之為P1代。收集所培養細胞的上清液(P1代)並將之稀釋(比例為1:2)後，再感染新鮮的PK-15細胞或其衍生之細胞株，培養3天後，收集培養細胞的上清液(含P2代病毒株)，再次稀釋(比例為1:2)並感染新鮮的PK-15細胞或其衍生之細胞株，培養3天後收集上清液得到P3代。重複上述步驟3次以上，以取得豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain) P6代。
以PK-15細胞或其衍生之細胞株培養豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的過程中，觀察到該病毒株會造成宿主PK-15細胞或其衍生之細胞株產生細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)的現象，CPE現象如圖一B所示；其中圖一A為未感染豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的PK-15細胞，培養4天後細胞生長的形態(100×)；圖一B為感染豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的PK-15細胞，培養4天後細胞生長的形態(100×)。其中PK-15衍生之細胞株的CPE現象亦可參閱圖一B所示。
3. 種病毒株鑑定：
本發明所分離得到的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的基因組序列如SEQ ID No: 1所示，將SEQ ID No: 1所示序列與美國國家生物技術資訊中心(NCBI)基因資料庫(GenBank)進行比對，結果如表一所示，豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的基因序列與豬第二型環狀病毒(PCV2)相似，相似度可達99%，但並無發現GenBank資料庫中有與豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)基因序列完全一樣(相似度100%)的豬第二型環狀病毒(PCV2)存在。因此，由比對結果可知，本發明所得到的病毒分離株係屬豬第二型環狀病毒(PCV2)一員，且為一株新穎的病毒株。經親緣關係樹分析結果如圖二所示，由分析結果可知，豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)屬於PCV2 2d亞群(subgroup)的一員。
表一 PCV2 H株基因組序列於NCBI比對之結果
分析結果顯示，本發明之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)具有第一開放閱讀框架(ORF 1)，其具有如SEQ ID No: 2所示之序列，其係編碼如SEQ ID No: 3所示之胺基酸序列；第二開放閱讀框架(ORF 2)，其具有如SEQ ID No: 4所示之序列，其係編碼如SEQ ID No: 5所示之胺基酸序列；以及第三開放閱讀框架(ORF 3)，其具有如SEQ ID No: 6所示之序列，其係編碼如SEQ ID No: 7所示之胺基酸序列。
由於豬第二型環狀病毒(PCV2)的ORF2基因序列編碼的外殼蛋白(capsid)，是較有可能誘發出中和抗體的抗原，因此，本案發明人將豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的ORF2 DNA序列(如SEQ ID No: 4所示)及胺基酸序列(如SEQ ID No: 5所示)與NCBI的資料庫(GenBank)進行比對。結果顯示，GenBank資料庫內並無與豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的ORF2 DNA序列或胺基酸序列完全一樣(相似度100%)的序列存在，胺基酸序列相似度最高達98%。將胺基酸序列相似度最高的前三名序列與豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的ORF2胺基酸序列進行比對，結果如圖三所示，比對後發現有6個胺基酸不同。而與豬第二型環狀病毒(PCV2) 2d亞群的原型株(prototype)(GenBank編號：ZJ0955b)的ORF2 (GenBank登錄號：ADD25772)胺基酸序列相比，結果如圖四所示，豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)與該序列有7個胺基酸相異，相似度為97%。
此外，本案發明人亦將豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之ORF1以及ORF3的DNA序列(如SEQ ID No: 2及6所示)及胺基酸序列(如SEQ ID No: 3及7所示)序列分別與NCBI的GenBank資料庫進行比對，結果發現GenBank資料庫中亦無與本發明豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之ORF1及ORF3的DNA序列及胺基酸序列完全相同者(相似度100%)。
經上述結果證實，本發明所提供之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)係為一新穎的豬第二型環狀病毒株(PCV2)，該病毒株已於中華民國99年7月6日寄存於新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 970053。
實施例二　豬第二型環狀病毒 H 株 (PCV2 H strain) 疫苗之製備
步驟一 病毒培養
取未受豬環狀病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬腺病毒、豬小病毒、豬繁殖與呼吸綜合症(PRRSV)、豬偽狂犬病(PRV)、豬水泡病病毒(SVDV)、黴漿菌及其他細菌的污染的PK-15細胞，在37°C、5% CO2之下培養於細胞生長培養基(約含有5%胎牛血清之MEM培養基，pH 7.2±0.2)內。待該PK-15細胞鋪平長滿後，以約0.2% Trypsin-EDTA完整消化細胞，以細胞維持培養基(約含有2%胎牛血清之MEM培養基, pH 7.4±0.2)沖散細胞後計算細胞數，加入適量細胞生長培養基，調整細胞數為3.0×105/ml，分裝至迴轉瓶，於37°C下迴轉培養3~4日之使形成單層細胞。
以細胞維持培養基將豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)種毒液調整為104.0TCID50/ml。將已長成單層細胞之迴轉瓶內的培養基移除，加入PBS洗淨細胞面，接種已配製好之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)種毒液，將迴轉瓶置於37°C下進行病毒增殖培養。病毒接種後48~96小時間，抽樣以免疫螢光分析法(IFA)測定病毒含有量，當病毒含有量達106.0TCID50/ml以上時收集病毒液；或當細胞病變(CPE)達70~80%時收集病毒液。
步驟二 不 活化處理 (inactivated process)
將37%甲醛溶液(formaldehyde)加入步驟一所收集之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)病毒液中，並調整甲醛含量至終濃度為0.2% (w/v)，並於37°C下持續震盪至少24小時，較佳者可為48小時，以進行不活化處理；經過驗證實驗確定豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)病毒液已完全不活化後，將含有甲醛的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)病毒液離心，移除上清液以去除甲醛，並將豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)病毒液懸浮於緩衝溶液(如：蒸餾水或磷酸緩衝鹽溶液，phosphate buffered saline, PBS)中，即可製得含抗原的疫苗原液(死毒抗原)，並保存於4°C備用。
步驟三 豬第二型環狀病毒 H 株 (PCV2 H strain) 不 活化疫苗之 調製
取步驟二所製得之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)滅活抗原，加入已滅菌之雙相油質佐劑(如：MONTANIDETMISA 206雙相油質佐劑，最終濃度50%，v/v)後，置於乳化桶內混合均勻，進行油質乳化反應，反應完成後即獲得豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化油質佐劑疫苗。
對於該領域具有通常技藝者亦可藉由習知技藝，挑選其他適用之佐劑以製備本發明之豬第二型環狀病毒(PCV2)不活化疫苗，其中該雙相油質佐劑(如：水包油包水劑型，w/o/w)亦可更換但不限為油質佐劑(如：礦物油、植物油、動物油、佛氏完全佐劑、佛氏不完全佐劑等)、水質佐劑(如：氫氧化鋁)、生物型佐劑(如：CpG寡核苷酸、細菌類毒素toxoid)等。
實施例三　豬第二型環狀病毒 (PCV2) 檢測套組之 製備 -1
於本實施例中，豬第二型環狀病毒(PCV2)檢測套組為含有本發明豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)病毒抗原之抗原盤。首先將PK-15細胞(或其單株化之細胞株)進行繼代培養，將PK-15細胞調整細胞濃度至2×105cells/ml，並取96孔微量平底培養盤，每孔加入PK-15細胞懸浮液50 μl，並於每一孔中加入50 μl豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)病毒液(1’103TCID50)，再置於37°C、5% CO2之培養箱中培養72小時後，以無菌PBS清洗2次，以80%丙酮在室溫下固定15分鐘，再以PBS液清洗3次去除固定液後，倒置放進37°C培養箱中風乾後，保存於-20°C下備用。該抗原盤可用來檢測豬血清樣本中是否含有抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體。(Tischeret al., 1995)
實施例四　豬第二型環狀病毒 (PCV2) 檢測套組之 製備 -2
於本實施例中，豬第二型環狀病毒(PCV2)檢測套組為含有本發明豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的重組外殼蛋白(capsid)(即ORF2基因片段編碼的蛋白)之抗原盤。該重組外殼蛋白(capsid)具有如SEQ ID No: 5 (ORF2胺基酸序列)所示之序列，係作為抗原盤上的抗原。
首先，以聚合酶連鎖反應(PCR)增幅本發明豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain) ORF2 DNA片段。取本發明豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain) DNA，將該病毒DNA溶於50 μl二次水作為DNA模板。使用GeneAmp PCR System 2400反應器(購自Applied Biosystems)進行PCR。取8 μl的DNA模版、5 μl 10倍PCR buffer (MDBio, Inc.)、8 μl 1.25 mM dNTP、50 μM正向及反向引子各1 μl、0.5 μl Pfu DNA polymerase (MDBio, Inc.)，最後以二次水補至總體積為50 μl。PCR反應條件為：95°C反應5分鐘後，進行95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒，共25個循環，最後以72°C反應5分鐘以進行延伸反應。將PCR產物以PCR-M純化套組(Viogene)純化之。其中該正向引子及反向引子為該領域具有通常技藝者，可依本發明所提供之PCV2 H株之DNA片段(如：ORF2 DNA片段)為模板以設計之。在本實施例中，該正向引子具有限制酶HindIII切位，而該反向引子具有限制酶XhoI切位。
接著，將該純化後的PCR產物構築於pET24a表現載體。先將該PCR產物與pET24a表現載體(Novagen)分別以HindIII及XhoI兩種限制酶(New England Biolabs)，於37°C下，進行限制酶切割反應(Restriction Enzyme Cleavage Reaction) 8小時。並以PCR-M純化套組(Viogene)純化該酶切後的PCR產物及pET24a表現載體。再將酶切後PCR產物與酶切後的pET24a載體進行接合反應(ligation)，以取得pET24a-ORF2質體，並將該質體利用轉殖作用(transformation)送入表現宿主大腸桿菌(E. coli)中，經選殖挑選出菌株中帶有該PCR產物片段之質體後，進行定序確認增殖之PCR產物序列無誤，以得到含有pET24a-ORF2質體之菌株。
再將含有pET24a-ORF2質體之菌株以2 ml之LB培養基，於37°C培養16~18小時，再將菌液以1：50的比例接種至含有25 μg/ml kanamycin之新鮮LB培養基中，置於37°C、200 rpm之培養箱中培養，直到菌液濃度達O.D 600 nm為0.6時，加入β-D-thiogalactoside (IPTG)使其最終濃度為1 mM，再於37°C、200 rpm之培養箱中培養6小時，吸取1 ml菌液，經10,000 ×g離心後，取離心後之菌塊以B-PERTM細菌蛋白質萃取試劑(B-PERTM Bacterial Protein Extraction, Pierce Protein Research Produces)來確認重組蛋白為可溶性蛋白或是包涵體(inclusion body)。確認方法為於菌塊中加入40 μl的反應試劑，劇烈震盪(vortex) 1分鐘後，10,000 ×g離心，離心後重組蛋白在上層部份為可溶性蛋白，在下層部份則為包涵體。將可溶性蛋白溶於SDS-PAGE用的1x sample buffer，下層的菌塊則加入2x的SDS-PAGE sample buffer。以乾浴槽100°C煮沸20分鐘後離心之，吸取上層液體部份，以15%的SDS-PAGE確認重組蛋白表現的情況；確認無誤後，取所得之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的重組外殼蛋白(capsid)進行抗原盤之製備。
以pH 9.6 PBS將所得之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的重組外殼蛋白(capsid)稀釋至終濃度為10 mg/ml，包覆於96孔微量平底培養盤(100μL/孔)，於37°C下作用2小時後，於4°C包覆過夜；以PBS洗滌3次，每次3~5分鐘；每孔加200μL的0.15% BSA阻隔液(blocking solution)阻隔(block)該96孔微量平底培養盤，置於37°C作用2小時後以PBS洗滌，並存放於4°C下作為豬第二型環狀病毒(PCV2)檢測套組備用。
實施例五　抗豬第二型環狀病毒 H 株 (PCV2 H strain) 抗體之製備
1. 抗 PCV2 H 株之多株抗體：
培養PCV2 H病毒株至適當之病毒力價後，採收病毒液進行去活化。將去活化後之病毒液與適用之佐劑(如：弗氏完全佐劑)混合後施與動物(如：鼠、豬、山羊、兔)以進行初級免疫，經適當時間間隔後(如：2~3週)，視需要以不活化後之病毒液及適當之佐劑(如：弗氏不完全佐劑)施與二級免疫。經適當時間間隔後(如：2~3週)，採集免疫動物(如：鼠、豬、山羊、兔)之血清，即製得抗PCV2 H株之多株抗體。
其中該抗PCV2 H株之多株抗體，可視需要與顯色劑或螢光結合。
其中該動物經施予初級免疫及二級免疫後，可視需要增加免疫次數，以提高抗體力價。
其中施與之動物包含，但不限於：鼠、兔、禽(蛋)、豬、山羊、牛、水產動物。
2. 抗 PCV2 H 株之單株抗體：
將PCV2 H株濃縮之病毒，或其特定PCV2 H株之抗原片段(如：ORF2)之抗原蛋白施予動物(如：小鼠)，視需要可添加適當之佐劑(如：弗氏完全佐劑)，以進行初級免疫。經適當時間間隔後(如：2~3週)，視需要以不活化之病毒(或抗原蛋白)及適當之佐劑(如：弗氏不完全佐劑)施與二級免疫。經適當時間間隔後(如：2~3週)，採集免疫動物(如：小鼠)之血清，用以評估適合用以採集脾臟細胞之小鼠。從該適用之小鼠採集脾臟細胞與骨髓瘤細胞(如：FO細胞株、NS細胞株)以PEG( Polyethylene Glycol，如PEG1500)進行細胞融合。從融合細胞中篩選出具分泌能力之融合瘤並單株化後，可得一適合用以產製抗PCV2 H株之單株抗體的融合細胞系。
經上述製備所得之抗體，可用於免疫檢測試劑、治療劑、或加入食品、飼料中使食用者具有免疫力。
實施例六　豬第二型環狀病毒 (PCV2) 不 活化疫苗之效力試驗 -1
1. 小鼠免疫試驗
用5~6週齡健康雌性清潔級Balb/c小鼠60隻作為試驗動物，所有小鼠的豬第二型環狀病毒(PCV2)酵素結合免疫吸附分析(ELISA)抗體皆呈陰性。將這60隻小鼠隨機分為4組，每組15隻，第1~3組分別以肌肉注射3個批次的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗，注射劑量為0.2ml/隻，兩週後用相同免疫劑量加強免疫一次；第4組為空白對照組，隔離飼養觀察，首次免疫後第2、3、4、5週分別隨機取出5隻，採血分離血清，測定血清內豬第二型環狀病毒(PCV2)之ELISA抗體力價。
2. 血清抗體之判定 – 以酵素連結免疫分析(ELISA)測定豬第二型環狀病毒(PCV2)抗體力價
可採用實施例三或實施例四所製備之抗原盤作為檢測套組。以含有500 ml/L Tween-20的50 mmol/L PBS (pH 7.2) (即PBST)洗滌抗原盤3次，每次3~5分鐘；再於抗原盤中加入0.15% BSA阻隔液(blocking solution)(200μL/孔)，以阻隔(block)抗原盤，並於37°C下作用2小時後，以PBS洗滌。將待檢測之小鼠血清以PBS緩衝液以1：50倍數稀釋，然後再做倍比稀釋；每孔加100μL稀釋之小鼠血清，於37°C下作用1小時後，以PBS洗滌；然後加入酵素(辣根過氧化酵素 (Horseradish peroxidase, HRP)標定之二級抗體(如：兔抗鼠之二級抗體)，於37°C下作用1小時後，以PBS洗滌；接著加入3, 3’, 5, 5’-四甲基聯苯胺二鹽酸(3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine, TMB)溶液顯色，最後用2mM的H2SO4終止反應後判定結果。判定結果標準為：血清樣本OD450值/陰性血清OD450值(P/N值) ≥ 2.1為陽性。以P/N值 ≥ 2.1的血清最大稀釋度作為該血清樣本的ELISA抗體力價。
除了本實施例所用之辣根過氧化酵素(HPR)與TMB之外，亦可使用其他具有相同功能之顯色試劑、或螢光標記，如：鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)、4-甲基傘形酮磷酸酯(4-Methylumbelliferyl Phosphate, 4-MUP)、螢光異硫氰酸鹽(Fluorescein isothiocyanate, FITC)。
3. 結果
小鼠經不同批次的疫苗首次免疫後，於首次免疫後第二週起均可從小鼠血清中檢測出抗豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之抗體，再經加強免疫後，其ELISA抗體力價於首次免疫後35天可達1800~2000 (圖五)；由此可知，本發明所提供之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗可有效誘發小鼠體內的免疫反應。
實施例七　豬第二型環狀病毒 (PCV2) 不 活化疫苗之效力試驗 -2
1. 豬體免疫試驗
取約5~6週齡健康仔豬2頭，以肌肉注射豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗，注射劑量為1ml/頭，三週後用相同免疫劑量加強免疫一次；於首次免疫前(約5~6週齡)、二次免疫前(約8~9週齡)，以及二次免疫後2週(約10~11週齡)分別採集血清及秤重，並以ELISA檢測血清中的抗體力價。
2. 血清抗體之判定 – 以酵素連結免疫分析(ELISA)測定豬第二型環狀病毒(PCV2)抗體力價
以實施例三或實施例四所製備之抗原盤作為檢測套組。以含有500 ml/L Tween-20的50 mmol/L PBS (pH 7.2) (即PBST)洗滌抗原盤3次，每次3~5分鐘；再於抗原盤中加入0.15% BSA阻隔液(blocking solution)(200μL/孔)，以阻隔(block)抗原盤，並於37°C下作用2小時後，以PBS洗滌。將待檢測之豬血清以PBS緩衝液以1：50倍數稀釋，然後再做倍比稀釋；每孔加100μL稀釋之豬血清，於37°C下作用1小時後，以PBS洗滌；然後加入二級抗體(如：山羊抗豬之二級抗體)，於37°C下作用1小時後，以PBS洗滌；接著加入TMB溶液顯色，最後用2mM的H2SO4終止反應後判定結果。判定結果標準為：血清樣本OD450值/陰性血清OD450值(P/N值) ≥ 2.1為陽性。以P/N值 ≥ 2.1的血清最大稀釋度作為該血清樣本的ELISA抗體力價。
3. 結果
請參閱表二，仔豬以本發明豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗免疫後，於首次免疫後三週內可從仔豬血清中檢測出抗豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)之抗體，再經二次免疫後二週內，其ELISA抗體力價可達11,000以上；由此可知，本發明所提供之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗可有效誘發仔豬體內的免疫反應。
表二 以ELISA判定仔豬血清樣本中之抗體力價的結果
實施例八　豬第二型環狀病毒 (PCV2) 不 活化疫苗之效力試驗 -3
1. 豬體免疫試驗
請參閱表三，取約2週齡健康仔豬40頭，隨機分為4組，每組10頭。於3週齡時第1~3組分別以肌肉注射3個批次的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗，注射劑量為1ml/頭，三週後用相同免疫劑量加強免疫一次；第4組為空白對照組，隔離飼養；首免前第1週(約2週齡)及首免疫後第1(約4週齡)、2(約5週齡)、3(約6週齡)和第5週(8週齡)分別採集血清及秤重，並以IFA檢測仔豬血清中抗體力價。
表三 豬隻免疫計劃及檢測項目
2. 血清抗體之判定 –免疫螢光分析法(IFA)法測定豬第二型環狀病毒(PCV2)抗體力價
將實施例三製得之豬第二型環狀病毒(PCV2)抗原盤由-20°C低溫保存環境取出之後，倒置放進37°C培養箱中風乾。將收集的豬隻血清樣本先以 PBS buffer進行50倍稀釋，然後連續以2倍稀釋的方式進行稀釋，再將稀釋之血清樣品分注於豬第二型環狀病毒(PCV2)抗原盤中，每孔分注50 μl。再將抗原盤置於37°C培養30分鐘後以PBS清洗3次，以去除未作用之抗體，每孔再加入50 μl rabbit-anti-pig IgG FITC conjugate (1：100, Sigma)，避光培養30分鐘後以PBS清洗3次，於螢光顯微鏡下觀察，並進行豬第二型環狀病毒(PCV2)抗體力價判定。(Rodriguez-Arriojaet al., 2000)
3. 結果
3.1 抗體力價
請參閱表四及圖六所示，仔豬經不同批次的疫苗首次免疫後，於首次免疫後第二週(5週齡)時，其抗體力價已升至約600，而對照組則無變化。再經二次免疫(6週齡)後，發現免疫組之抗體力價皆大幅度提升；於8週齡時，其抗體力價亦較6週齡時更為提升，而對照組仍無變化。
表四 以IFA判定仔豬血清樣本中之抗體力價的結果
3.2增重趨勢
請參閱表五及圖七所示，相較於對照組，仔豬經不同批次的疫苗免疫後，免疫組之體重增重趨勢，明顯高於對照組之增重趨勢。至8週齡時，免疫組之仔豬體重明顯高於對照組約2公斤。
表五 豬隻之增重趨勢(單位：公斤)
因此，經本發明之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗免疫後之豬隻，其抗體力價可大幅度提升，改善豬隻之免疫力，進而促使豬隻之增重率上升。
實施例九　豬第二型環狀病毒 (PCV2) 不 活化疫苗之效力試驗 -4
1. 豬體免疫試驗
取14~16日齡豬第二型環狀病毒(PCV2)抗體呈陰性的健康仔豬20頭，隨機分為4組，每組5頭。第1~3組分別以肌肉注射3個批次的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗，注射劑量為1ml/頭，兩週後用相同免疫劑量加強免疫一次；第4組為空白對照組，隔離飼養；首次免疫後第5週以第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)(強毒株)(106.0TCID50/ml)攻毒，每頭豬滴鼻1ml、肌肉注射2ml，攻毒後第7、11、19和25天採集血清和鼻拭之樣品，以PCR檢測有無病毒。
2. 以PCR偵測豬第二型環狀病毒(PCV2)(病毒血症)
以聚合酶連鎖反應(PCR)檢測豬隻血液樣本內豬第二型環狀病毒(PCV2)。病毒DNA的萃取用DNAzolR試劑，基本步驟為：於200μL血清中加入400μL DNAzol，以12,000 rpm/min離心15min後取上清，並加入2倍體積的無水乙醇沉澱，再以12,000 rpm/min離心15min後棄掉上清液，以75%乙醇洗滌DNA，再以12,000 rpm/min離心5min後棄掉上清液，最後以8mM NaOH溶DNA。
檢測豬隻血液樣本內豬第二型環狀病毒(PCV2)所用的引子序列如下： PCV2-F1: 5’ GTGAAGTGGTATTTTGGTGCC 3’         (SEQ ID No: 8) PCV2-R1: 5’ GTCTTCCAATCACGCTTCTGC 3’         (SEQ ID No: 9) 預期擴增片段在PCV2 ORF1區域，增幅的PCR產物大小為284bp。PCR反應總體積為25μL，含正向引子PCV2-F1 1μL、反向引子PCV2-R1 1μL、25mM Mg2+1.5μL、2.5 mM dNTPs 2.0μL、10×Mg2+free buffer 2.5μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、二次蒸餾水11.8μL，以及模板DNA 5μL。PCR反應條件為：95°C反應5分鐘後，進行94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒，共38個循環，再以72°C反應5分鐘以進行延伸反應，最後則維持在4°C。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。
另，用以檢測豬隻血液樣本內豬第二型環狀病毒(PCV2)之引子序列亦可為： PCV2-F2: 5’ TGTTGGCGAGGAGGGTAATG ’3          (SEQ ID No: 10) PCV2-R2: 5’ TGGGACAGCAGTTGAGGAGT ’3          (SEQ ID No: 11) 利用該引子對可增幅的PCR產物大小為676bp。
3. 病理解剖和病理組織學觀察
豬隻於攻毒後第25天宰殺解剖，以觀察臟器病理變化，並採集淋巴結和肺臟組織，以4%甲醛固定，製備石蠟切片，進行甦木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)，顯微鏡觀察組織病變。
4. 結果
4.1病毒血症
從PCR檢測病毒血症之結果可知，在攻毒後25天時，免疫組(第1組、第2組、第3組)的病毒血症發生率比未免疫之對照組(第4組)的病毒血症發生率低40~60% (表六)，表示本發明之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗可誘發豬隻產生免疫力、降低病毒血症之嚴重性、縮短病毒血症之感染時間，進而提供豬隻足夠之保護效果以抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之感染。
表六、免疫豬隻經豬第二型環狀病毒(PCV2)攻毒後，病毒血症之檢測結果
a分母為檢測豬總頭數，分子為PCR結果呈陽性豬頭數
4.2 病理變化
請參閱表七，豬隻攻毒後第25天宰殺解剖，進行病理學觀察，結果顯示：攻毒對照組中2隻仔豬的腹股溝淋巴結、肺門淋巴結和腸系膜淋巴結明顯水腫、切面蒼白，1隻仔豬的肺臟彈性變小、水腫，或腎臟變黃，有少量灰白色點；而免疫組仔豬則皆沒有明顯的病理變化。
表七、豬攻毒後的肉眼病理變化觀察統計結果
a. 分母為剖解豬總頭數，分子為有病變豬頭數； b. 肉眼病理變化：淋巴結水腫，切面蒼白；肺臟水腫、彈性變小，或輕度實變；花斑腎指腎臟變黃，有少量灰白色點；其它病變包括肝膽輕度腫大，腸道鼓氣。
表八係為不同試驗豬隻經攻毒後，其病理變化及豬第二型環狀病毒(PCV2)檢測結果，結果顯示：攻毒對照組中各豬隻之病理變化明顯，如：淋巴結內淋巴細胞缺失(5/5)、巨噬細胞浸潤(4/5)、淋巴結中豬第二型環狀病毒(PCV2) PCR檢測結果均為陽性(5/5)；3隻仔豬的肺臟組織有單核細胞浸潤、肺組織中豬第二型環狀病毒(PCV2) PCR檢測結果有2隻仔豬呈陽性；而3個免疫組中只有1隻仔豬的淋巴結出現組織病理變化，淋巴結和肺組織中 豬第二型環狀病毒(PCV2) PCR檢測結果呈陽性(如表八所示)。因此，該三批次的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)滅活疫苗對於豬隻均有明顯保護作用，其保護率約為80%~100%。
表八、不同試驗豬隻經攻毒後，其病理變化及PCV2檢測結果
*分母為檢測豬總數，分子為出現該病變或病毒的豬數。
綜上所述，本發明所提供之豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)疫苗除可誘發豬隻產生免疫力外、亦可降低病毒血症之嚴重性、縮短病毒血症之感染時間、改善其臨床症狀，進而對抗豬第二型環狀病毒(PCV2)的感染，提供豬隻足夠的保護效果，促使豬隻之生理狀況更趨健康(如：增重趨勢)，更提供畜豬業者一保護豬隻對抗豬第二型環狀病毒(PCV2)感染之方法，藉此有效提升豬隻飼養率。
據此，較習知者，本發明所提供者更包含下列具其新穎性、進步性及產業利用性等技術特徵及其優點：
1. 本發明提供一種新穎的豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)。
2. 本發明並提供一種新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)免疫組合物，該免疫組合物經藉由該新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)H株，以製備成活化、不活化疫苗，並配合不同佐劑的使用，可製成油質或水質疫苗。經試驗證明本發明所提供之豬第二型環狀病毒(PCV2)免疫組合物可有效保護豬隻抵抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之感染。
3. 本發明進一步提供一種上述新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)之檢測套組，用以偵測檢驗樣本是否含有豬第二型環狀病毒(PCV2)或偵測檢驗樣本內是否含有抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體。
4. 本發明並提供一種豬隻對抗豬第二型環狀病毒(PCV2)病毒之方法，包含使用有效量之上述免疫組合物以施予豬隻，以增強該豬隻對抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之免疫力，降低病毒血症之嚴重性，進而提升、改善其臨床症狀、存活率、及增重趨勢。
5. 本發明並提供一種抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體，該抗體係藉由上述新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)所製備而得。
6. 本發明並關於上述新穎的豬第二型環狀病毒(PCV2)所含之DNA片段，該DNA片段之應用包含：製成DNA疫苗、次單位疫苗、或用於設計引子或探針以偵測豬第二型環狀病毒(PCV2)。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
圖一A為未感染豬第二型環狀病毒(PCV2)的PK-15細胞，培養4天後細胞生長的形態(100×)；圖一B為感染豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的PK-15細胞，培養4天後細胞生長的形態(100×)。
圖二為豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)基因組序列之親緣樹分析圖。
圖三為豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的ORF2胺基酸序列與美國國家生物枝術資訊中心(NCBI)基因資料庫(GenBanK)中胺基酸序列相似度最高的前三名序列進行比對(alignment)之結果。
圖四為豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)的ORF2胺基酸序列與豬第二型環狀病毒(PCV2)2d亞群的原型株(GenBanK編號：ZJ0955b)的ORF2(GenBank登錄號：ADD25772)胺基酸序列比對(alignment)之結果。
圖五為小鼠經豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苗免疫後，不同時間採集之血液樣本以豬第二型環狀病毒(PCV2)ELISA測走抗體力價之結果。
圖六為仔豬經豬第二型環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苖免疫後，不同時間採集之血液樣本以豬第二型環狀病毒(PCV2)IFA測定抗體力價之結果。
圖七為仔豬經豬第二凹環狀病毒H株(PCV2 H strain)不活化疫苖免疫後，不同時間之秤重結果所畫成之增重趨勢圖。
<110> 施懷哲維克有限公司 <120> 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物及檢測套組 <130> P14-0093 <150> US 61/426,087 <151> 2010-12-22 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1767 <212> DNA <213> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) <220> <223> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain)之基因組DNA <400> 1 <210> 2 <211> 945 <212> DNA <213> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) <220> <223> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain)ORF1 DNA序列 <400> 2 <210> 3 <211> 314 <212> PRT <213> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) <220> <223> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) ORF1胺基酸序列 <400> 3 <210> 4 <211> 705 <212> DNA <213> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) <220> <223> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain)ORF2 DNA序列 <400> 4 <210> 5 <211> 234 <212> PRT <213> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) <220> <223> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain)ORF2胺基酸序列 <400> 5 <210> 6 <211> 315 <212> DNA <213> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) <220> <223> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain)ORF3 DNA序列 <400> 6 <210> 7 <211> 104 <212> PRT <213> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain) <220> <223> 豬第二型環狀病毒H株(Porcine Circovirus Type 2 H strain)ORF3胺基酸序列 <400> 7 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 偵測豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)所用之引子/探針 <400> 8 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 偵測豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)所用之引子/探針 <400> 9 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 偵測豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)所用之引子/探針 <400> 10 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 偵測豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)所用之引子/探針 <400> 11

Claims (10)

  1. 一種抗豬第二型環狀病毒(PCV2)之抗體，係藉由具有如SEQ ID NO: 1所示之基因組序列的豬第二型環狀病毒株所製備而得。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，該抗體包含至少下列其中一種：一單株抗體、一多株抗體，以及一經基因重組之抗體。
  3. 一種多核苷酸，包含一編碼具有如SEQ ID NO: 1所示之基因組序列的豬第二型環狀病毒株所具有之多胜肽(polypeptide)之序列，該多胜肽之序列包含至少下列其中一種：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5，以及SEQ ID NO: 7
  4. 如申請專利範圍第3項所述之多核苷酸，其中該序列包含至少下列其中一種：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4，以及SEQ ID NO: 6。
  5. 一種豬第二型環狀病毒(PCV2)之檢測套組，包含一偵測單元，該偵測單元係選自於下列群組所組成中至少一者：一具有如SEQ ID NO: 1所示之基因組序列的豬第二型環狀病毒株(PCV2)之病毒抗原、一藉由具有如SEQ ID NO: 1所示之基因組序列的豬第二型環狀病毒株(PCV2)所製備之抗體、一如申請專利範圍第4項所述之多核苷酸，以及一偵測如SEQ ID NO: 1所示序列之核酸片段。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之檢測套組，其中該病毒抗原係置於一盤上。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之檢測套組，其中該病毒抗原係經過不活化處理(inactivation)。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之檢測套組，其中該抗體包含至少下列其中一種：一單株抗體、一多株抗體，以及一經基因重組之抗體。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之檢測套組，其中該多核苷酸之DNA序列包含至少下列其中一種：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4，以及SEQ ID NO: 6。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之檢測套組，其中該核酸片段之序列包含至少下列其中一種：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10，以及SEQ ID NO: 11。
TW103118244A 2010-12-22 2011-12-14 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用 TWI508974B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061426087P 2010-12-22 2010-12-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201437226A true TW201437226A (zh) 2014-10-01
TWI508974B TWI508974B (zh) 2015-11-21

Family

ID=46313165

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103118244A TWI508974B (zh) 2010-12-22 2011-12-14 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
TW100146224A TWI442935B (zh) 2010-12-22 2011-12-14 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100146224A TWI442935B (zh) 2010-12-22 2011-12-14 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用

Country Status (15)

Country Link
US (2) US9101571B2 (zh)
EP (2) EP3604504A1 (zh)
JP (2) JP2014507124A (zh)
KR (1) KR101740764B1 (zh)
CN (1) CN103314103B (zh)
AU (1) AU2011348702B2 (zh)
BR (1) BR112013015675A2 (zh)
DK (1) DK2657333T3 (zh)
EA (1) EA028376B1 (zh)
ES (1) ES2763327T3 (zh)
MX (1) MX351578B (zh)
PH (1) PH12013501233A1 (zh)
TW (2) TWI508974B (zh)
UA (1) UA110632C2 (zh)
WO (1) WO2012083837A1 (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA113192C2 (xx) 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)
CN103893750B (zh) * 2012-12-31 2015-11-25 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗猪伪狂犬病、猪流感疫苗组合物及其应用
EP2994162B1 (en) 2013-05-08 2021-04-07 Pharmgate Biologics Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
HUE060972T2 (hu) 2013-08-23 2023-05-28 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc 2-es típusú sertés cirkovírus (PCV) alegység vakcina
CN104749361B (zh) * 2015-01-21 2017-04-19 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒2型抗原捕获elisa试剂盒
CN105445457B (zh) * 2015-03-24 2017-08-11 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体及试剂盒
MX394778B (es) 2015-05-14 2025-03-21 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Método para la producción de circovirus porcino y vacunas pcv2.
CN105606804A (zh) * 2016-01-20 2016-05-25 福州大北农生物技术有限公司 一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法
CN107686833B (zh) * 2016-04-18 2021-02-19 华南农业大学 一种猪细小病毒毒株及其应用
RS67051B1 (sr) 2016-11-03 2025-08-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vakcina protiv svinjskog parvovirusa
ES2942749T3 (es) 2016-11-03 2023-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vacuna contra el parvovirus porcino y el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, y métodos de producción de la misma
CN109206509B (zh) * 2017-06-29 2021-07-20 洛阳普泰生物技术有限公司 与伪狂犬病病毒gD蛋白结合的单克隆抗体及其应用
CN107308446B (zh) * 2017-07-14 2021-03-23 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法
CN107227380A (zh) * 2017-07-26 2017-10-03 杭州师范大学 一种同步检测pcv2和prv感染的引物序列及方法
CN110343670B (zh) * 2018-04-04 2022-08-30 普莱柯生物工程股份有限公司 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒弱毒株、及其制备方法和应用
CN110387355B (zh) * 2018-04-18 2022-08-30 普莱柯生物工程股份有限公司 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用
WO2019238611A1 (en) * 2018-06-11 2019-12-19 Ceva Sante Animale Vaccination against porcine circoviruses
CN109468413B (zh) * 2018-12-14 2021-09-10 湖南中净生物科技有限公司 一种母猪繁殖障碍病原检测引物、试剂盒、病原检测方法和应用
RU2697849C1 (ru) * 2019-04-26 2019-08-21 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) Способ диагностики цирковируса свиней
CN110041409B (zh) * 2019-05-07 2022-09-06 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用
CN110698542B (zh) * 2019-09-16 2022-03-22 长江大学 人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用
CN110711202B (zh) * 2019-10-25 2022-08-19 湖南农业大学 Phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用
FR3120944B1 (fr) 2021-03-21 2024-12-20 Virbac Procédé de détermination de l’âge optimum de vaccination de porcelets par mesure d’une teneur en anticorps dans le colostrum de truies au sein d’un élevage
CN114317456A (zh) * 2021-12-15 2022-04-12 成都史纪生物制药有限公司 一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法及猪圆环病毒疫苗
CN115094060B (zh) * 2022-06-23 2024-08-06 湖南农业大学 基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2核酸的试剂盒及方法
CN115947794A (zh) * 2022-07-19 2023-04-11 沈阳农业大学 一种pcv2 orf3特异性多肽及应用
CN116813718B (zh) * 2023-08-30 2023-10-27 北京瑞阳瑞泰生物科技有限公司 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用
CN118956905B (zh) * 2024-08-23 2025-11-18 华南农业大学 一种禽源pcv2基因及其应用
CN119798381B (zh) * 2025-01-03 2025-11-25 兰州大学 一种猪圆环病毒病4型Cap蛋白抗原表位肽及其单克隆抗体与应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7211379B2 (en) 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US7192594B2 (en) 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
UA78180C2 (uk) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
PT3127551T (pt) 2005-12-29 2020-10-09 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Composição imunogénica de pcv2 para atenuar os sintomas clínicos em porcos
EP1941903A1 (en) * 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP2242511A4 (en) * 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
CN101343671A (zh) * 2008-08-25 2009-01-14 湖南省兽医总站 猪2型圆环病毒pcr快速检测试剂盒
TWI367256B (en) * 2008-10-07 2012-07-01 Academia Sinica Vaccine composition and kit providing protective immunity against porcine circovirus 2
EP2367933A1 (en) * 2008-11-28 2011-09-28 Ceva Sante Animale Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof
CN101549155B (zh) * 2009-05-27 2012-05-09 福州大北农生物技术有限公司 猪圆环病毒ⅱ型灭活疫苗及其制备方法
UA113192C2 (xx) * 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)

Also Published As

Publication number Publication date
MX2013007211A (es) 2014-03-12
KR101740764B1 (ko) 2017-05-26
EP2657333A1 (en) 2013-10-30
US20120164170A1 (en) 2012-06-28
US20150297709A1 (en) 2015-10-22
EP3604504A1 (en) 2020-02-05
EP2657333A4 (en) 2014-11-12
EP2657333B1 (en) 2019-10-02
CN103314103A (zh) 2013-09-18
KR20130098430A (ko) 2013-09-04
JP6150864B2 (ja) 2017-06-21
DK2657333T3 (da) 2019-12-09
EA201370140A1 (ru) 2013-10-30
AU2011348702A1 (en) 2013-07-18
TWI442935B (zh) 2014-07-01
AU2011348702B2 (en) 2016-06-16
WO2012083837A1 (zh) 2012-06-28
MX351578B (es) 2017-10-19
JP2014507124A (ja) 2014-03-27
ES2763327T3 (es) 2020-05-28
US9101571B2 (en) 2015-08-11
TW201225975A (en) 2012-07-01
JP2016052313A (ja) 2016-04-14
BR112013015675A2 (pt) 2020-10-06
PH12013501233A1 (en) 2013-08-12
CN103314103B (zh) 2015-06-24
UA110632C2 (uk) 2016-01-25
US9770501B2 (en) 2017-09-26
TWI508974B (zh) 2015-11-21
EA028376B1 (ru) 2017-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI508974B (zh) 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
JP7661552B2 (ja) ブタサーコウイルス３型免疫原性組成物、その製造方法、およびその使用方法
EP2481421B1 (en) Treatment of sub-clinical pcvd
US20200237894A1 (en) Pcv2 orf2 carrier platform
RU2547589C2 (ru) Новый птичий астровирус
KR101640062B1 (ko) 돼지 토크 테노 바이러스 백신 및 진단
CN108220248B (zh) 猪轮状病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
AU2025267386A1 (en) Porcine circovirus type 3 (PCV3) vaccines, and production and uses thereof
KR20190096965A (ko) 선천적 진전 a를 야기하는 신규한 페스티바이러스의 단리
US20130251719A1 (en) Bone marrow aplasia with haemorrhagic disease in calves caused by novel pathogen
CN109134619B (zh) 猪圆环病毒2型抗原、其制备的免疫原性组合物、制备方法和应用
CN110343670B (zh) 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒弱毒株、及其制备方法和应用
CN114573708A (zh) 副鸡禽杆菌ha融合蛋白及其三聚体、制备的疫苗组合物、制备方法和应用
RU2803427C1 (ru) Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
WO2020227245A1 (en) Immunogenic compositions for novel reassortant mammalian ortheovirus from pigs