[go: up one dir, main page]

CN118956905B - 一种禽源pcv2基因及其应用 - Google Patents

一种禽源pcv2基因及其应用

Info

Publication number
CN118956905B
CN118956905B CN202411172833.6A CN202411172833A CN118956905B CN 118956905 B CN118956905 B CN 118956905B CN 202411172833 A CN202411172833 A CN 202411172833A CN 118956905 B CN118956905 B CN 118956905B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
apcv
pcv2
virus
apcv2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202411172833.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN118956905A (zh
Inventor
宋长绪
吴寿堂
张歆明
刘逸龙
梁彦晴
徐铮
刘燕玲
张乐宜
梁鹏帅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202411172833.6A priority Critical patent/CN118956905B/zh
Publication of CN118956905A publication Critical patent/CN118956905A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN118956905B publication Critical patent/CN118956905B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

本发明提供了一种禽源PCV2基因及其应用，属于动物病毒学及免疫学技术领域。本发明提供了一种禽源PCV2基因，命名为aPCV2，所述aPCV2基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1‑2或与SEQ ID NO.1、2同源性为90％以上的序列中的任意一种。含有本发明所述aPCV2基因的病毒株具有高病毒效价且能够稳定传代的优势。利用含有本发明aPCV2基因的病毒株制备成的灭活疫苗以及利用本发明aPCV2基因中的Cap基因或Rep基因制备成的亚单位疫苗对鸡鸭鹅等家禽具有显著的保护作用，利用本发明aPCV2基因中的Cap基因或Rep基因制备成的ELISA检测板能够准确检测血清内PCV2抗体水平，且具有高度特异性和可重复性。

Description

一种禽源PCV2基因及其应用
技术领域
本发明属于动物病毒学及免疫学技术领域，尤其涉及一种禽源PCV2基因及其应用。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)是一种小型无包膜病毒，具有单链环状DNA基因组，属于圆环病毒科圆环病毒属，迄今为止，已发现至少四种猪圆环病毒(PCV)，分别包括PCV1至PCV4。PCV2最初于1990年代初在加拿大被发现，随后该病毒引起的疾病在北美被命名为猪圆环病毒相关疾病(PCV-associated disease，PCVAD)，PCVAD的特征主要包括断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍、肠炎以及呼吸系统疾病等多种症状，除此之外，PCV2亚临床感染猪的免疫系统会受到抑制，利于其他病毒的感染，且混合感染后表现出更加严重的临床症状。(Afghah etal.,2017；Opriessnig etal.,2007；Saha et al.,2011)。PCV2目前分为6种主要基因型(PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e和PCV2f)，其中PCV2b和PCV2d基因型是中国的主要菌株。PCV2的完整基因组范围为1766或1768bp，编码至少11个预测的开放阅读框(ORF)。
迄今为止，在许多宿主被发现可以感染PCV2，如猪，野猪，小鼠、小牛、水貂、狗、狐狸和山羊等，而猪是其天然宿主，目前并未有报道PCV2可以感染家禽，对于病毒性传染病快速、有效的分离病原是诊断和疫病防控工作的关键。可以持续增殖该病毒的细胞是病毒诊断和后续研究最重要的工具之一。此前Zhu等(Zhu et al.,2007)报道，PK-15细胞群在PCV2感染的允许性方面是异质的，只有大约20％的细胞群易受感染(Tischer et al.,1987)，并且病毒滴度从未超过105TCID50滴度(Meerts et al.,2005)。目前PCV2的体外高效分离传代仍然较为困难，存在分离难度大、分离率低、分离率不稳定的问题。同时目前还没有成熟的PCV2疫苗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种禽源PCV2(aPCV2)基因及其在制备PCV2疫苗中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种检测PCV2的ELISA检测板、一种灭活疫苗以及一种亚单位疫苗。
本发明的另一目的在于提供一种高效分离禽源PCV2或猪源PCV2的方法以及MDCC-MSB1细胞系在分离和培养PCV2中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种aPCV2基因，所述aPCV2基因的核苷酸序列包括以下的任意一种：(1)SEQ ID NO.1，(2)SEQ ID NO.2，(3)与SEQ ID NO.1同源性为90％以上的序列，(4)与SEQ ID NO.2同源性为90％以上的序列。
本发明还提供了上述aPCV2基因在制备PCV2疫苗中的应用。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述aPCV2基因中的Cap基因或Rep基因，所述Cap基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4，所述Rep基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白为诱导上述宿主细胞表达纯化所得。
本发明还提供了上述表达载体、上述宿主细胞或上述重组蛋白在制备检测PCV2的产品或在制备PCV2疫苗中的应用。
本发明还提供了一种检测PCV2的ELISA检测板，所述ELISA检测板包被有上述的重组蛋白，所述重组蛋白的包被浓度为1.0μg/ml-2.0μg/ml。
本发明还提供了一种灭活疫苗，包括含有上述aPCV2基因的病毒株。
本发明还提供了一种亚单位疫苗，包括上述重组蛋白和佐剂。
本发明还提供了一种高效分离PCV2的方法，包括如下步骤：在8-11日龄的禽胚尿囊腔中注射PCV2病毒液，孵育后收集尿囊液获取PCV2病毒，所述PCV2病毒液包括禽源PCV2病毒液或猪源PCV2病毒液，所述禽源PCV2病毒液为含有上述aPCV2基因的病毒株的病毒液。
本发明还提供了MDCC-MSB1细胞系在分离和培养猪源PCV2或禽源PCV2中的应用，所述禽源PCV2为含有上述aPCV2基因的病毒株。
本发明的有益效果：
本发明首次提供了一种aPCV2基因，含有aPCV2基因的病毒株具有高病毒效价且能够稳定多次传代。利用含有本发明aPCV2基因的病毒株制备成的灭活疫苗对鸡鸭鹅等家禽具有显著的保护作用，利用本发明aPCV2基因中的Cap基因或Rep基因制备成的亚单位疫苗对鸡鸭鹅等家禽也具有显著的保护作用，利用本发明aPCV2基因中的Rep基因或Cap基因制备成的ELISA检测板能够准确检测PCV2，且具有高度特异性和可重复性。
本发明提供的分离PCV2的方法，能够在体外高效分离猪源PCV2和aPCV2，具有分离难度小、分离率高以及分离率稳定的优势。同时，本发明首次提出MDCC-MSB1细胞系能够用于PCV2的分离和培养，具有能够稳定传代的优势。
附图说明
图1为禽源临床样品PCV2 Cap检测琼脂糖凝胶电泳图，图中的M代表2000bpDNAMarker，1、2代表鸡源肾脏组织样品，3、4代表鸡源血清样品，5、6代表鸭源肾脏组织样品，7、8代表鸡源血清样品，“─”表阴性对照，“+”代表PCV2阳性对照；
图2为禽源PCV2与其他物种圆环病毒全基因遗传进化分析图；
图3为aPCV2分离株aPCV2-duck-GDYF1全基因组，图中黄色为ORF1基因序列，绿色为ORF2基因序列；
图4为aPCV2分离株aPCV2-chicken-GDQY2全基因组，图中黄色为ORF1基因序列，绿色为ORF2基因序列；
图5为所分离出的5株aPCV2分离株的ORF1、ORF2氨基酸序列对比图，其中A为Rep基因，B为Cap基因；
图6为所分离出的5株aPCV2分离株的同源性分析图；
图7为MDCC-MSB1细胞分离aPCV2-duck-GDYF1毒株F2-F15代次aPCV2 Cap检测琼脂糖凝胶电泳图；
图8为MDCC-MSB1细胞分离aPCV2-chicken-GDQY2毒株F2-F15代次aPCV2 Cap检测琼脂糖凝胶电泳图；
图9为透射电镜检测结果，其中A图为aPCV2-duck-GDYF1结果，B图为aPCV2-chicken-GDQY2结果；
图10为免疫灭活aPCV2后抗体水平，其中左图为aPCV2-chicken-GDQY2灭活疫苗结果，右图为aPCV2-duck-GDYF1灭活疫苗结果；
图11为鸡免疫灭活疫苗后不同组织中aPCV2病毒拷贝数，其中左图为aPCV2-chicken-GDQY2灭活疫苗(记为GDQY2株灭活疫苗)结果，右图为aPCV2-duck-GDYF1灭活疫苗(记为GDYF1株灭活疫苗)结果，***代表差异极显著；
图12为aPCV2-duck-GDYF1 Cap PCR扩增图，其中左边条带为2000bp DNAMarker；
图13为aPCV2-duck-GDYF1 Rep PCR扩增图，其中左边条带为2000bp DNAMarker；
图14为YF-aPCV2 Cap重组蛋白纯化结果，其中M为8-180蛋白Marker，1为直流样，2为20mmol咪唑洗脱，3为50mmol咪唑洗脱，4为100mmol咪唑洗脱，5为200mmol咪唑洗脱，6为300mmol咪唑洗脱，7为500mmol咪唑洗脱
图15为YF-aPCV2 Rep重组蛋白纯化结果，其中M为8-180蛋白Marker，1为直流样，2为20mmol咪唑洗脱，3为50mmol咪唑洗脱，4为100mmol咪唑洗脱，5为200mmol咪唑洗脱，6为300mmol咪唑洗脱，7为500mmol咪唑洗脱；
图16为YF-aPCV2 Cap重组蛋白Western-blot鉴定结果，其中M为8-180蛋白Marker，1为20mmol咪唑洗脱，2为50mmol咪唑洗脱，3为100mmol咪唑洗脱，4为200mmol咪唑洗脱，5为300mmol咪唑洗脱，6为500mmol咪唑洗脱；
图17为YF-aPCV2 Rep重组蛋白Western-blot鉴定结果，其中M为8-180蛋白Marker，1为20mmol咪唑洗脱，2为50mmol咪唑洗脱，3为100mmol咪唑洗脱，4为200mmol咪唑洗脱，5为300mmol咪唑洗脱，6为500mmol咪唑洗脱；
图18为免疫aPCV2 Cap蛋白后抗体水平；
图19为免疫aPCV2 Rep蛋白后抗体水平；
图20为免疫aPCV2 Cap后不同组织PCV2病毒拷贝数结果，****代表差异极显著；
图21为免疫aPCV2 Rep后不同组织PCV2病毒拷贝数结果，****代表差异极显著；
图22为WB验证aPCV2感染MDCC-MSB1细胞效果图；
图23为IFA验证aPCV2感染MDCC-MSB1细胞效果图；
图24为尿囊液中PCV2病毒拷贝数，****代表差异极显著。
具体实施方式
本发明提供了一种禽源PCV2(avian PCV2，aPCV2)基因，所述aPCV2基因的核苷酸序列包括以下的任意一种：(1)SEQ ID NO.1，(2)SEQ ID NO.2，(3)与SEQ ID NO.1同源性为90％以上的序列，(4)与SEQ ID NO.2同源性为90％以上的序列。
本发明首次提出PCV2可以感染家禽，并在家禽中分离出禽源的aPCV2毒株，并鉴定为PCV2b毒株。利用含有本发明aPCV2基因的病毒株制备成的灭活疫苗以及利用本发明aPCV2基因中的Cap基因或Rep基因制备成的亚单位疫苗，皆对鸡鸭鹅等家禽具有保护作用。利用本发明aPCV2基因中的Cap和Rep基因制备成的ELISA检测板能够准确检测家禽血清抗体水平，并具有特异性高和可重复性的特点。
在本发明中，所述禽源包括鸡源和鸭源。本发明从鸡源和鸭源的肾脏组织以及血清样品中分离获得了5株毒株，其核苷酸序列的相似度较高，其中aPCV2-duck-GDYF1毒株的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述aPCV2-chicken-GDQY2毒株的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。其余3株毒株的核苷酸序列分别与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有较高同源性。
本发明还提供了上述aPCV2基因在制备PCV2疫苗中的应用。在本发明中，所述疫苗的种类包括灭活疫苗和亚单位疫苗。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述aPCV2基因中的Cap基因或Rep基因，所述Cap基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4，所述Rep基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。
在本发明中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的aPCV2-duck-GDYF1毒株中的Cap基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的aPCV2-duck-GDYF1毒株中的Rep基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的aPCV2-chicken-GDQY2毒株中的Cap基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的aPCV2-chicken-GDQY2毒株中的Rep基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。在本发明中，所述载体优选的包括原核表达载体pET-28a。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。在本发明中，所述宿主细胞优选的包括大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白为诱导上述宿主细胞表达纯化所得。
本发明还提供了上述表达载体、上述宿主细胞或上述重组蛋白在制备检测PCV2的产品或在制备PCV2疫苗中的应用。在本发明中，所述检测PCV2的产品优选的包括ELISA试剂盒。
本发明还提供了一种检测PCV2的ELISA检测板，所述ELISA检测板包被有上述的重组蛋白，所述重组蛋白的包被浓度为1μg/ml-2.0μg/ml。在本发明中，所述ELISA检测板的制备方法优选的包括以下步骤：用磷酸盐缓冲液将PCV2 cap蛋白或PCV2 Rep蛋白稀释至浓度为1μg/ml-2.0μg/ml，然后以100μL/孔加入酶标板，经孵育，洗涤，拍干，封闭，洗涤，干燥获得。
本发明还提供了一种灭活疫苗，包括含有上述aPCV2基因的病毒株。所述灭活疫苗为将含有上述aPCV2基因的病毒株进行灭活所得，在本发明中，所述灭活优选的为使用二乙烯亚胺(BEI)进行。
本发明还提供了一种亚单位疫苗，包括上述重组蛋白和佐剂。在本发明中，所述佐剂优选的包括弗氏佐剂，在本发明所述亚单位疫苗中，所述重组蛋白的浓度优选为0.3mg/mL-0.35mg/mL。
本发明还提供了一种高效分离PCV2的方法，包括如下步骤：在8-11日龄的禽胚尿囊腔中注射PCV2病毒液，孵育后收集尿囊液获取PCV2病毒，所述PCV2病毒液包括禽源aPCV2病毒液或猪源PCV2病毒液，所述禽源aPCV2病毒液为含有上述aPCV2基因的病毒株的病毒液。
在本发明中，所述禽胚优选的包括鸡胚或鸭胚，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为72h。
本发明还提供了MDCC-MSB1细胞系在分离和培养猪源PCV2或禽源aPCV2中的应用，所述禽源aPCV2为含有上述aPCV2基因的病毒株。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
禽源猪圆环病毒2型(aPCV2)的分离与鉴定
1.1aPCV2检测
PCR扩增检测
对所采猪圆环病毒2型阳性的鸡源、鸭源肾脏组织及血清样品进行病毒总核酸提取，病毒核酸提取具体操作按照美基生物科技有限公司病毒总DNA/RNA提取试剂盒说明书严格进行。提取的总核酸用表1所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系如表2所示，PCR扩增的反应程序如表3所示。
表1引物序列
引物名称 引物序列(5’-3’) Genbank序列号
aPCV2CapF ATGGTTTTTATTATTCATTAAGGGTTAAGTGGGGG(SEQ ID NO.7) MG732815.1
aPCV2CapR TCAGATATGACGTATCCAAGGAGG(SEQ ID NO.8) MG732815.1
aPCV2RepF AGCAACATGCCCAGCAAAAAGAAT(SEQ ID NO.9) MG732815.1
aPCV2RepR AAAAAGACTCAGTAATTTATTTCATATGGAAATTCAGGGCATG(SEQ ID NO.10) MG732815.1
aPCV2F TCGTAATGGTTTTTATTATTCATTAAGGGTTAAGTGGGG(SEQ ID NO.11) MG732815.1
aPCV2R AGTGATAAAAAAGACTCAGTAATTTATTTCATATGG(SEQ ID NO.12) MG732815.1
aPCV2Q1F GTAGAAGCTCTTTATCGGAGG(SEQ ID NO.13) MG732815.1
aPCV2Q1R AACTACTCCTCCCGCCATACCATA(SEQ ID NO.14) MG732815.1
aPCV2Q2F TTTGACTGTGGTTCGCTTGATAGTATATCC(SEQ ID NO.15) MG732815.1
aPCV2Q2R AGGAGCTCCACATTCCATCAGTAAGTT(SEQ ID NO.16) MG732815.1
aPCV2Q3F ACACCCCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTT(SEQ ID NO.17) MG732815.1
aPCV2Q3R AACAGTATATACGACCAGGAATACAATATC(SEQ ID NO.18) MG732815.1
aPCV2Q4F ATCTAGGACAGGTTTGGGGGTAAAGTA(SEQ ID NO.19) MG732815.1
aPCV2Q4R AGCCATCTTGGCCAGATCCTC(SEQ ID NO.20) MG732815.1
表2PCR扩增的反应体系
组分 体积(μL)
2×TaqMasterMix 12.5
Forwardprimer 1
RorwardPrimer 1
总核酸 2
ddH2O 补足20
表3PCR扩增反应程序
步骤 温度 时间 循环数
预变性 95℃ 5min 1
变性 95℃ 30s 35
退火 58℃ 30s 35
延伸 72℃ 60s 35
终延伸 72℃ 5min 1
保存 4℃ ∞ 1
PCR结束后，将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。以DEPC水作为阴性对照，以pCDNA3.1-PCV2质粒作为PCV2阳性对照，结果如图1所示，样品均检测到特异性的阳性条带。从而说明，该禽源组织中存在aPCV2病毒。
根据所设计的引物扩增出aPCV2的全基因组，共在收集的病料中获得5株毒株，为了确定鸡源和鸭源中检测出的PCV2与其他物种圆环病毒的遗传距离，对分离出的5株PCV2毒株进行了遗传进化树分析，结果发现鸡源、鸭源PCV2与猪源PCV2的遗传距离较近，处于同一分支，并处于PCV2b分支，如图2所示。其中aPCV2-duck-GDYF1突变株序列如图3所示，aPCV2-chicken-GDQY2毒株的全基因组序列如图4所示。然后在MegAlign中对禽源PCV2ORF1、ORF2与猪源PCV2 ORF1、ORF2基因进行氨基酸比对，其氨基酸比对结果见图5。然后在MegAlign中对禽源PCV2与猪源PCV2进行碱基同源性分析，结果见图6，发现同源性均在94％以上，并且与PCV2b分支毒株同源性最高。
1.2MDCC-MSB1细胞的培养与aPCV2的分离
(1)细胞复苏：提前把恒温水浴锅调到37℃，等水温达到37℃后从液氮罐中取出冻存的MDCC-MSB1细胞，并在37℃水浴锅中快速左右晃动，进行解冻，然后75％医用酒精进行冻存管外部消毒，然后800r/min，离心5min，弃去冻存液，加入1mL回温好的1640细胞培养基，轻轻吹打混匀，然后转移到T25细胞培养瓶中，39℃，5％CO2恒温培养箱培养8h后，转移至锥形细胞培养瓶中，39℃，5％CO2，100r/min进行悬浮培养；
(2)aPCV2-duck-GDYF1、aPCV2-chicken-GDQY2毒株分离：PCR检测的阳性鸡源、鸭源病料用已灭菌的剪刀剪碎，然后加入高压灭菌后遇冷的PBS，在冰上进行研磨，然后10000r/min离心5min，转移上清至另外一个5mL离心管中，然后无菌超净工作台中先用0.45μm的过滤器进行过滤，然后再使用0.22μm的过滤器进行过滤，然后-80℃冰箱保存备用。待MDCC-MSB1细胞的细胞数生长至2×106后，800r/min离心5min收集细胞，然后使用无菌的1640细胞培养基将组织过滤液按照10％的体积比进行稀释，然后加入细胞沉淀中，轻轻重悬细胞，39℃，5％CO2恒温培养箱孵育2h，800r/min离心5min收集细胞，加入5ml新鲜1640培养基，然后加入300mM的D氨基葡萄糖，继续培养72小时，然后-80℃保存，如此操作盲传至第15代。
(3)PCR扩增与鉴定
将步骤(2)分离获得的aPCV2-duck-GDYF1、aPCV2-chicken-GDQY2病毒液分别在MDCC-MSB1细胞上继续进行15代传代，并在此过程中挑选第2、5、10、15代次细胞培养物分别各取200μL，对所采样品进行病毒总核酸提取，提取的总核酸进行PCR扩增(总核酸提取及反应体系、程序同步骤1.1)。用aPCV2Cap F1：ATTATTCATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT(SEQ IDNO.21)和aPCV2 Cap R1：TCAGATATGACGTATCCAAGGAGGCGT(SEQ ID NO.22)引物进行Cap基因扩增，结果如图7、图8所示，本发明所述分离毒株从第2代开始一直到第15代，不同代次细胞培养物样品均检测到特异性的阳性条带。从而说明，本发明分离毒株aPCV2-duck-GDYF1、aPCV2-chicken-GDQY2可在MDCC-MSB1中连续传代。对PCR扩增产物进行测序，测序结果显示，aPCV2-duck-GDYF1分离毒株的Cap基因序列如SEQ ID NO.3所示，aPCV2-chicken-GDQY2分离毒株的Cap基因序列如SEQ ID NO.4所示
(4)电镜观察
取aPCV2-duck-GDYF1、aPCV2-chicken-GDQY2病毒液，以10000r/min离心30分钟，取上清液40000r/min离心5小时，弃上清液，沉淀物用0.5mL去离子水溶解，然后送样至华南农业大学测试中心进行制样，然后进行透射电镜观察，如图9所示，结果可以看出样品中有大量的病毒颗粒，其直径在16-18nm左右，颗粒大小均匀。
(5)病毒毒价测定
取aPCV2-duck-GDYF1、aPCV2-chicken-GDQY2第5、10、15代次病毒液按10倍倍比稀释为10-1～10-8，接种于96孔板培养的PK-15单层细胞中，每个稀释度接种8孔，每孔加入0.1mL病毒稀释液，于37℃、5％CO2培养箱中培养，96h后进行IFA检测，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50，检测结果显示aPCV2-duck-GDYF1第5、10、15代次的病毒滴度为104.5TCID50/mL、107TCID50/mL、107TCID50/mL，aPCV2-chicken-GDQY2第5、10、15代次的病毒滴度为105TCID50/mL、107.5TCID50/mL、107TCID50/mL。
实施例2
禽源猪圆环病毒2型aPCV2-duck-GDYF1、aPCV2-chicken-GDQY2株灭活疫苗制备
2.1aPCV2种毒的制备：制备方式同实施例1中的1.2。
2.2aPCV2灭活疫苗病毒液制备：
(1)细胞复苏：提前把恒温水浴锅调到37℃，等水温达到37℃后从液氮罐中取出冻存的所需MDCC-MSB1细胞，并在37℃水浴锅中快速左右晃动，进行解冻，然后75％医用酒精进行消毒冻存管外部，然后800r/min，离心5min，弃去冻存液，加入1mL回温好的1640细胞培养基，轻轻吹打混匀，然后转移到T25细胞培养瓶中，39℃，5％CO2恒温培养箱培养8h后，转移至锥形细胞培养瓶中，39℃，5％CO2，100r/min进行培养；
(2)细胞扩大培养
细胞培养72小时，细胞密度为5.0×106个/ml，用1640培养基制成密度为1×106个/ml的细胞悬液，分装于细胞摇瓶中，置39℃、5％CO2培养箱中培养，72小时后即可按照1：3-1：4比例(相当于100ml细胞悬液可以扩大到400～500ml体系培养)进行传代。
(3)病毒接种
待细胞密度为5.0×106个/ml时，800r/min离心5分钟，然后加入新鲜培养基重悬细胞，吸取细胞悬液到细胞摇瓶中，加入四倍(40ml)的培养基，同时接种培养基体积10％的病毒原液，培养72小时即可获得病毒。
2.3aPCV2灭活疫苗病毒液的纯净性检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明该基础毒种无细菌、支原体和外源病毒污染。
2.4aPCV2灭活疫苗病毒液的灭活
(1)制备二乙烯亚胺(BEI)
将2mol/L的2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)和2mol/L的NaOH溶液等体积混合，置37℃水浴，每隔10～15分钟摇匀1次，60分钟后即环化产生二乙烯亚胺(BEI)，终浓度为1mol/L；
(2)病毒灭活
取细胞破碎后的禽源猪圆环病毒2型抗原液，加入步骤(1)制备的BEI至其浓度为2mmol/L，再加入体积比0.8‰的甲醛，置于37℃恒温摇床120rpm/min灭活24小时，最后加入终浓度为2mmol/L的硫代硫酸钠终止灭活。
2.5疫苗制备
(1)油相制备：取注射用白油，加司本-80混合，再加硬脂酸铝加热，边加边搅拌，至透明为止。
(2)水相的制备：取吐温-80，装入带玻璃球的瓶中灭菌，冷却后分别加入灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液，充分振荡，使吐温-80完全溶解。
(3)疫苗制备：乳化取油相置于高速剪切机内，以300转/分钟搅拌10分钟，缓慢加入水相，再以3000转/分钟乳化30分钟。定量分装并密封于4℃，即得。
按照上述流程分别制备获得aPCV2-chicken-GDQY2灭活疫苗和aPCV2-duck-GDYF1灭活疫苗，用于下面免疫保护效果检测。
2.6免疫保护效果检测
分别购买20只15日龄SPF鸡和20只15日龄雏鸭，20只SPF鸡分为两组(PBS安慰组、aPCV2-chicken-GDQY2灭活疫苗组)，20只雏鸭分为两组(PBS安慰组、aPCV2-duck-GDYF1灭活疫苗组)。第一次免疫记为第一天，14天后进行第二次免疫，第35天时进行攻毒，对照组每只400μl PBS，实验组每只400μl病毒液，并对第0-35天所采血清进行抗体检测，结果如图10所示，然后第42天、49天采集血清，初步进行病毒拷贝数检测，看aPCV2是否在体内复制，并在第49天对试验动物进行处死并采样进行检测，结果如图11所示，表明本发明制备的灭活疫苗对家禽具有保护作用。
实施例3
(1)重组表达质粒pET-28a-YF-aPCV2 cap、pET-28a-YF-aPCV2 Rep的构建
以禽源猪圆环病毒2型aPCV2-duck-GDYF1毒株核酸为模板，PCR扩增aPCV2 Cap、Rep基因片段，扩增引物如表4所示，扩增反应体系和反应程序分别如表2和表3所示；然后Cap经ScaI、XhoI，Rep经XhoI、BmtI双酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pET-28a进行连接反应，构建原核表达质粒pET-28a-YF-aPCV2 Cap、pET-28a-YF-aPCV2 Rep，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α，随机挑取多个单菌落接种于2mL LB/Ampr培养液中，37℃振摇8h。然后进行PCR鉴定和酶切鉴定，结果如图12和图13所示，同时PCR产物送公司进行测序确证。然后验证准确的菌液进行大摇(200mL)，然后进行质粒提取。
重组表达质粒pET-28a-QY-aPCV2 cap、pET-28a-QY-aPCV2 Rep的构建与其相同。
表4扩增引物
(2)重组蛋白的诱导表达与纯化
将测序正确的重组表达质粒pET-28a-YF-aPCV2 cap、pET-28a-YF-aPCV2 Rep再次转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接入10mL LB/Ampr培养液中，37℃振摇培养过夜，次日按1:100将菌液接入LB/Ampr培养液，37℃振摇培养2～4h至OD600值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续振摇培养12h进行诱导表达。将诱导表达的样品按His.tag蛋白纯化试剂盒说明书方法进行纯化，分步洗脱并收集目的蛋白洗脱液，得到纯化的重组YF-aPCV2 cap、YF-aPCV2 Rep蛋白，对纯化的重组YF-aPCV2cap、YF-aPCV2 Rep蛋白进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测，结果如图14、图15所示。
重组蛋白QY-aPCV2 cap、QY-aPCV2 Rep的制备方法同重组蛋白YF-aPCV2 cap、YF-aPCV2 Rep的制备方法。
(3)重组蛋白的鉴定
将纯化的重组YF-aPCV2 cap、YF-aPCV2 Rep蛋白经SDS-PAGE电泳并进行膜转移后，用5％(m/v)的脱脂奶粉4℃封闭过夜。孵育鼠源PCV2 Cap、PCV2 Rep一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western-blot鉴定，结果如图16、17所示，表明成功获得了重组蛋白YF-aPCV2 cap、YF-aPCV2 Rep。
QY-aPCV2 cap、QY-aPCV2 Rep蛋白的鉴定如YF-aPCV2 cap、YF-aPCV2 Rep蛋白一致。
实施例4
PCV2的ELISA检测板制备
将实施例3所得纯化后的YF-aPCV2 Rep蛋白作为抗原进行包被，YF-aPCV2 Rep蛋白用ELISA涂层缓冲液稀释成2.0μg/mL，将100μL稀释后的抗原加入96孔ELISA板，4℃保存过夜。包被完抗原后弃去包被液(ELISA涂层缓冲液)，用350μL PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤三次后，用牛血清白蛋白(BSA)(含1％BSA的PBS)在4℃下封闭平板12h。封闭后，用350μL PBST洗涤平板3次，37℃烘干60min。
实施例5
aPCV2 Rep间接ELISA检测方法的建立
(1)包被抗原的浓度及抗体稀释浓度的确定
用实施例3纯化好的原核表达的YF-aPCV2 Rep蛋白作为抗原进行包被，抗原采用倍比稀释法，用包被稀释液稀释成2.0、1.0、0.5、0.25、0.1μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜，包被完抗原后弃去包被液，加入封闭液进行过夜封闭。将阳性血清和阴性血清分别做1：25、1：50、1：100稀释，利用正交法设置包被浓度及稀释倍数组合，每个阴性和阳性样品设置3个重复，后续按照常规的步骤进行。以血清OD阳性值在1.0左右，并且阳性OD/阴性OD(P/N)比值最大的抗原包被浓度为最佳工作浓度。由正交试验结果显示(见表5)，当包被抗原浓度为2.0μg/mL和血清稀释比为1：50时，aPCV2阳性血清的OD450nm值接近于1.0，并且P/N的比值最大，符合选择条件。因此最佳包被抗原浓度为2.0μg/ml，最适血清稀释比为1：50。
表5包被YF-aPCV2 Rep抗原的浓度及抗体稀释浓度的正交试验结果
注：P/N*＝阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值。
(2)酶标二抗的工作浓度的优化
用抗原包被浓度为2.0μg/mL，血清的稀释比为1：50进行酶标二抗优化实验，山羊抗鸡酶标二抗做三个稀释比，浓度分别为1：10000、1：20000、1：30000进行间接ELISA。每个步骤的反应在37℃下进行30min，显色12～15min后结束。在450nm波长下测量样品OD值。以P/N值最大时的酶二抗浓度为最佳工作浓度。结果如表6所示，当酶标二抗稀释比为1：20000时，P/N值最大，因此最适二抗的工作浓度是1：20000。
表6酶标二抗稀释结果
(3)间接ELISA阴阳性临界值的确定
选择30份SPF级家禽血清作为阴性对照，按照已经优化好确定的ELISA步骤来检测PCV2抗体水平，读取各样本的OD450值，计算30份SPF级家禽血清的OD450平均值及其标准方差。根据公式：OD450平均值+3倍的标准方差(SD)。P/N为阳性血清OD450值/阴性血清OD450值，P/N血清样本的鉴定界限为阴性对照的3个SDs。30个阴性血清样品在450nm波长下的平均吸光度为0.133，并测定吸光度的标准差为0.039。因此，ELISA的临界值为0.133+3×0.039＝0.250，OD450 nm等于或高于该临界值的血清样本为阳性。
(4)根据上述(1)-(3)的筛选最优结果进行ELISA检测，包括以下步骤：
96孔ELISA板(实施例4所得)每孔加入100μL用样品稀释液(1×PBS)稀释的100μL血清，设置阴、阳性对照，37℃孵育60min。PBST洗涤5次后，每次2～3min，分别加入120μLPBST稀释的辣根过氧化物酶标记(HRP)山羊抗猪IgG二抗、辣根过氧化物酶标记(HRP)山羊抗鸡IgG二抗、辣根过氧化物酶标记(HRP)山羊抗鸭IgG二抗。37℃孵育30min，然后用350μLPBST洗涤5次，每次2～3min。最后，以100μL四甲基联苯胺-过氧化氢(TMB)溶液作为底物，观察过氧化物酶反应。在室温避光孵育15min后，每孔加入50μL 2M硫酸停止反应，用450nm的酶标仪读取450nm处的光密度(OD450)，OD450 nm等于或高于0.250的血清样本为阳性，否则为阴性。
实施例6
实施例5所述检测方法的特异性和重复性
使用对以下每种病毒都具有特异性的临床血清：猪源猪圆环病毒3型(PCV3)、禽源猪圆环病毒2型(aPCV2)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和经典猪瘟病毒(CSFV)。这些血清均已采用商品化试剂盒进行鉴定，测试了每种病原体的三份血清，按照实施例5步骤(4)的ELISA检测步骤，同时设阴性对照和空白对照，统计其OD450值判断阴阳性以检测其特异性。结果如表7所示，猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和经典猪瘟病毒的阳性血清OD450nm的值均小于临界值0.250，因此该条件建立的间接ELISA方法有较高的特异性。
表7特异性检测结果
为了评估试验的重复性，取不同禽源抗体水平的阴性和阳性血清各四份，用实施例5步骤(4)的ELISA检测步骤分别进行3次批内和批间重复，结果如表8所示，批内和批间的实验结果的变异系数都小于10％，由此可知本发明检测方法有较高的可重复性。
表8重复性检测结果
实施例7
aPCV2 cap的ELISA检测板制备
将实施例3所得纯化后的YF-aPCV2 cap蛋白作为抗原进行包被，YF-aPCV2 cap蛋白用ELISA涂层缓冲液稀释成2.0μg/mL，将100μL稀释后的抗原加入96孔ELISA板，4℃保存过夜。包被完抗原后弃去包被液(ELISA涂层缓冲液)，用350μLPBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤三次后，用牛血清白蛋白(BSA)(含1％BSA的PBS)在4℃下封闭平板12h。封闭后，用350μLPBST洗涤平板3次，37℃烘干60min。
实施例8
亚单位疫苗的制备和免疫保护效果
8.1疫苗制备
(1)计算每次注射所需抗原的量和体积。皮下注射或肌肉注射时，每只雏鸡每次50-200μg抗原，注射体积小于50μL；腹腔内注射时，每只雏鸡每次注射体积为200-400μl。强洗涤剂会减弱乳化效应，需避免。准备大约比最终所需量多50％的疫苗。
(2)根据所加材料的总体积选择针筒。佐剂和实施例3中获得的QY-aPCV2 cap或QY-aPCV2 Rep或YF-aPCV2 cap或YF-aPCV2 Rep蛋白(抗原)的总体积应大约为针筒体积的一半。例如，准备2.5ml的疫苗时，用5ml的针筒进行乳化。
(3)使用前37℃预热弗氏完全佐剂(或弗氏不完全佐剂)，振荡1-2min或用手倒转瓶子数次，将佐剂均匀重悬。吸取所需体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂到针筒内，连接针筒到双孔接头，排出空气(过量空气将妨碍稳定的乳化剂的形成)。
(4)吸取水溶性抗原到另一针筒，排出空气(过量空气可妨碍稳定的乳化剂的形成)。
(5)将有抗原的针筒连在双孔接头的一端。确定两个针筒均经Luer-lock安全地固定在双孔乳化接头上。
(6)平稳地推动活塞，使所有的抗原溶液穿过双孔接头与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合。相互交替，持续使混合物从一个针筒转到另一个。
(7)按上述步骤继续乳化，直到稳定的乳化剂形成。这将需要数分钟。推出一小滴乳化剂到盛有水的烧杯内，小乳滴应该在水面形成稳定的油珠。如果乳剂滴人水面分散，重新组装针筒，继续乳化。
(8)将所有乳化剂推入一个针筒。拔去双孔接头，加上注射针头。另外可选择将空针筒拔去，换上1ml无菌针筒。此时，乳化剂可转入1ml针筒以备注射。
8.2免疫保护试验
购买50只15日龄SPF鸡，然后随机分为5个组(对照组、QY-aPCV2 cap组、QY-aPCV2Rep组、YF-aPCV2 cap组、YF-aPCV2 Rep组)，静养一周，采集第0天血液，第一次免疫记为第一天，14天后进行第二次免疫，每次肌肉注射和皮下注射共300μl乳化后的疫苗，期间每7天采集一次血液，第35天时进行PCV2攻毒，对照组每只400μl PBS，实验组每只400μl病毒液，然后对第0天、7、14天、第21天、第28天、第35所采集血清进行检测抗体水平，并在第49天对试验动物进行处死并采样进行检测，Cap组抗体采用金诺诊断PCV2-dCap ELISA试剂盒进行检测，Rep组采用本专利所制备的ELISA检测方法进行检测，抗体水平结果如图18和图19所示，免疫保护如图20和图21所示，表明本发明亚单位苗对家禽具有保护作用。
实施例9
MDCC-MSB1能够用来分离培养aPCV2
9.1aPCV2感染MDCC-MSB1细胞效果
将MDCC-MSB1细胞复苏后在培养瓶中使用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，待细胞生长至2×106后，800r/min离心5min，弃去上清，加入少量新鲜培养基，轻轻重悬细胞。
使用无菌的1640将aPCV2病毒液(由实施例1中的1.2分离获得)按照10％的体积比进行稀释，然后加入到重悬的细胞液中，孵育1h，800r/min离心5min，弃去上清，加入10ml新鲜培养基，然后加入300mM的D氨基葡萄糖，继续培养24和48小时，800r/min离心5min，弃去上清，加入WB裂解液或者4％的多聚甲醛；对照组用PK-15进行，PK-15细胞生长至70％左右汇合度时进行病毒接种，换液为2％DMEM，37℃温箱培养24h和48h后，加入WB裂解液或者4％的多聚甲醛。然后进行WB以及IFA验证。
9.2WB验证
(1)样品制备：细胞丢弃培养基，加入WB细胞裂解液和1％蛋白酶磷酸酶抑制剂(操作在冰上进行)，用移液枪反复吹打使细胞从壁上脱落，转移至1.5mL离心管中。(2)电泳：蛋白上样，先85V恒压跑电泳，直到蛋白条带从浓缩胶跑至分离胶时，调节电压为100V，蛋白条带跑到合适位置时停止。(3)转膜：PVDF膜放入甲醛溶液(提前-20℃遇冷)中活化，使用湿转法转膜(转膜液需提前-20℃遇冷)，转膜在冰浴条件下进行，100V转膜2h。(4)封闭：转膜完成后将膜取出，正面朝上放入装有脱脂奶粉封闭液的盒中，室温封闭2h。(5)洗膜：用PBST洗脱液在摇床上洗五遍膜，每次洗5min。(6)孵育一抗：4℃过夜孵育。一抗按照1：1000使用一抗稀释液进行稀释。(7)洗膜：同步骤(5)。(8)孵育二抗：将膜放入稀释好的二抗溶液中，摇床上常温孵育1h。二抗使用山羊抗鼠二抗，按照1：5000使用二抗稀释液进行稀释。(9)洗膜：同步骤(5)。(10)曝膜：超敏ECL化学发光试剂盒中的A液、B液1：1混合后，将膜放入，使用仪器曝膜，拍照并保存结果，结果如图22所示(进行了三次平行试验)。
9.3IFA鉴定
采用4％的多聚甲醛对细胞进行固定，然后进行IFA检测，在荧光显微镜下进行观察荧光情况，并对需要的结果进行拍照储存，结果如图23所示。
由图22和图23可以看出，MDCC-MSB1可以感染禽源aPCV2病毒，并且感染效率高于PK-15，因此MDCC-MSB1可以用来分离培养禽源猪圆环病毒2型。
实施例10
鸡胚分离PCV2试验
购买40枚SPF级受精鸡蛋，37℃培养箱进行孵化，在第8日龄时，随机分为两个组(实验组、对照组)，实验组在无菌超净台中向尿囊腔中注射使用PK-15分离的猪源PCV2病毒液(PK-15分离猪圆环病毒2型方法参考徐朋丽等人文章进行(徐朋丽,2018))，每枚鸡蛋200μl病毒液，对照组不做处理。然后放回37℃培养箱进行孵育72h，然后无菌条件下收取尿囊液获取病毒，提取病毒总核酸，用q-PCR进行检测，以徐朋丽等文章中的PK-15分离猪圆环病毒2型的方法作为对照组，结果如图24所示，发现鸡胚分离的病毒含量较传统PK-15细胞分离的高。
此实施例说明猪源PCV2可以感染家禽，同时可以在尿囊液中检出较高滴度的猪源猪圆环病毒，表明可以用此方法分离猪圆环病毒2型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种aPCV2基因，其特征在于，所述aPCV2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.权利要求1所述aPCV2基因在制备PCV2疫苗中的应用。
3.一种灭活疫苗，其特征在于，包括含有权利要求1所述aPCV2基因的病毒株。
4.一种高效分离PCV2的方法，其特征在于，包括如下步骤：在8-11日龄的禽胚尿囊腔中注射PCV2病毒，孵育后收集尿囊液获取PCV2病毒，所述PCV2病毒为含有权利要求1所述aPCV2基因的病毒株。
5.MDCC-MSB1细胞系在分离和培养PCV2中的应用，所述PCV2为含有权利要求1所述aPCV2基因的病毒株。
CN202411172833.6A 2024-08-23 2024-08-23 一种禽源pcv2基因及其应用 Active CN118956905B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411172833.6A CN118956905B (zh) 2024-08-23 2024-08-23 一种禽源pcv2基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411172833.6A CN118956905B (zh) 2024-08-23 2024-08-23 一种禽源pcv2基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN118956905A CN118956905A (zh) 2024-11-15
CN118956905B true CN118956905B (zh) 2025-11-18

Family

ID=93405217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411172833.6A Active CN118956905B (zh) 2024-08-23 2024-08-23 一种禽源pcv2基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118956905B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107337718A (zh) * 2017-06-20 2017-11-10 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用
CN118497227A (zh) * 2024-06-03 2024-08-16 华南农业大学 一种禽源pcv3基因及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI508974B (zh) * 2010-12-22 2015-11-21 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107337718A (zh) * 2017-06-20 2017-11-10 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用
CN118497227A (zh) * 2024-06-03 2024-08-16 华南农业大学 一种禽源pcv3基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN118956905A (zh) 2024-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103314103B (zh) 猪第二型环状病毒、含彼的免疫组合物、检测套组及其应用
Ellis et al. Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome
TWI445715B (zh) 新穎之鳥類星狀病毒
US10519427B2 (en) Method for porcine circovirus production and PCV2 vaccines
KR102336158B1 (ko) 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 백신 조성물
CN105451765A (zh) 猪圆环病毒2型(pcv2)亚单位疫苗
CN107523556B (zh) 一种禽腺病毒毒株、疫苗组合物及其应用
CN109097340B (zh) 一种禽腺病毒、一种四联疫苗及其制备方法
JP3950500B2 (ja) 魚類用のイリドウイルス感染症ワクチンと診断剤並びにこれ等の製法
CN118497227B (zh) 一种禽源pcv3基因及其应用
CN113633765B (zh) 一种猪伪狂犬gE基因缺失灭活疫苗及其生产方法
CN101688185A (zh) 对2型猪环状构象病毒(pcv2)感染高度容许的均质细胞系的产生
CN104873966A (zh) 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法
CN107854688B (zh) 猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型二价灭活疫苗及其制备方法
CN109550045B (zh) 猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗及其制备方法
CN118956905B (zh) 一种禽源pcv2基因及其应用
CN110564699B (zh) 一种新型番鸭腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法
CN105802918B (zh) 鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法和应用
CN112094339A (zh) 一种猪圆环病毒2型阳性血清及其制备方法
CN118853600A (zh) 一种鹅星状病毒疫苗株及其应用
CN109134619B (zh) 猪圆环病毒2型抗原、其制备的免疫原性组合物、制备方法和应用
CN110343670B (zh) 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒弱毒株、及其制备方法和应用
CN106754744B (zh) 一种血清4型的ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用
RU2746142C1 (ru) Штамм "pcv2/shbc" цирковируса свиней для производства профилактических и диагностических препаратов
CN111150840A (zh) 禽用四联疫苗及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant