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TW201420606A - 同源二聚體蛋白 - Google Patents

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TW201420606A
TW201420606A TW102128538A TW102128538A TW201420606A TW 201420606 A TW201420606 A TW 201420606A TW 102128538 A TW102128538 A TW 102128538A TW 102128538 A TW102128538 A TW 102128538A TW 201420606 A TW201420606 A TW 201420606A
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TW
Taiwan
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protein
homodimeric protein
polypeptide
seq
homodimeric
Prior art date
Application number
TW102128538A
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English (en)
Inventor
Jorge Alsina-Fernandez
Tamer Coskun
Ryan James Darling
Malgorzata Donata Gonciarz
Original Assignee
Lilly Co Eli
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Publication date
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Abstract

本發明係關於一種包含纖維母細胞生長因子21(FGF21)及胰高血糖素樣肽(GLP-1)之同源二聚體蛋白、包含該同源二聚體蛋白之醫藥組合物，及使用該同源二聚體蛋白治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之方法。

Description

同源二聚體蛋白
本發明係關於一種包含纖維母細胞生長因子21(FGF21)及胰高血糖素楊肽(GLP-1)之同源二聚體蛋白，包含該同源二聚體蛋白之醫藥組合物，及使用該同源二聚體蛋白來治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之方法。
FGF21屬於廣泛地於發育過程及成年組織中表現之大多肽家族，其在多種生理功能中發揮關鍵作用。FGF21係一種作為葡萄糖及脂質穩衡作用重要代謝調節劑起作用之激素。FGF21藉由上調GLUT1表現來促進脂肪細胞中之葡萄糖吸收，其機制與胰島素不同。於糖尿病齲齒動物及猴中，人類FGF21會減低葡萄糖之空腹血清濃度，及減低三酸甘油酯、胰島素及胰高血糖素之空腹血清濃度。另外，於飲食誘導之肥胖症之齲齒動物模型中，FGF21之投與會導致體重依劑量依賴性方式累積損失。因此，FGF21具有治療糖尿病、肥胖症、血脂異常、及代謝症候群之潛在效用。
除其對第2型糖尿病之有益效果外，已描述GLP-1化合物適於治療肥胖症。GLP-1可誘導許多生物學效應，諸如刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，抑制胃排空，抑制胃蠕動或腸蠕動，及引起體重損失。GLP-1之顯著特徵係其可刺激胰島素分泌而無採行胰島素治療或有些類型的藉由增加胰島素表現作用之口服治療時會觀察到的相關低血糖風險的能力。
雖然FGF21蛋白及GLP-1化合物均已顯示在治療肥胖症及第2型糖尿病方面之正效應，但仍有針對其他有益治療體重損失及第2型糖尿病之需求。
FGF21蛋白與GLP-1化合物之共同投與需要分開注射兩產品或單次注射兩不同組合物之共調配物。此兩次注射將准許給藥量及時間自由度，但基於順服性及疼痛對患者而言不方便。共調配物亦可提供部分給藥量自由度，但尋求准許兩組合物之化學及物理穩定性的調配條件通常會因為兩不同產品之不同分子特徵而極具挑戰性或係不可能的。
包含FGF21及GLP-1之融合蛋白已在WO2011/020319中進行說明。
本發明提供體重損失及糖尿病之替代治療。本發明之同源二聚體蛋白具有包括改良效力及/或改良醫藥穩定性之有利特徵。除改良效力外，本發明之同源二聚體蛋白具有一或多種適於具效率地製造及/或調配用為治療蛋白之有利穩定性特徵，包括降低之對羥基化易感性、減小之於高濃度下聚集之傾向性、及降低之於哺乳動物細胞系統之製造期間之轉譯後修飾程度。另外，本發明之同源二聚體蛋白潛在性地適用於治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群。
本發明提供一種同源二聚體蛋白，其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為 (SEQ ID NO：1)。
本發明亦提供一種編碼本發明之同源二聚體蛋白之DNA分子。
本發明亦提供一種經一或多個DNA分子轉形之哺乳動物細胞，該細胞能夠表現本發明之同源二聚體蛋白。
本發明亦提供一種用於製造本發明之同源二聚體蛋白之方法，該方法包括於使得本發明之同源二聚體蛋白得以表現之條件下培養哺乳動物細胞。
本發明亦提供一種依該方法所製得之本發明同源二聚體蛋白。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之同源二聚體蛋白及至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑、或賦形劑。
本發明亦提供一種治療患者之第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之方法，該方法包括對該患者投與本發明之同源二聚體蛋白。
本發明亦提供一種治療患者之第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之方法，該方法包括對該患者投與本發明之醫藥組合物。
另外，本發明提供一種用於治療中之本發明同源二聚體蛋白。較佳地，本發明提供一種用於治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之本發明同源二聚體蛋白。
另外，本發明提供一種以本發明之同源二聚體蛋白於製造用於治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之藥物中之 用途。
本發明亦關於編碼上述本發明同源二聚體蛋白之各多肽之多核苷酸。
另外，本發明提供一種編碼多肽之多核苷酸，其中該多肽之胺基酸序列為 (SEQ ID NO：1)。
本發明亦提供一種編碼本發明同源二聚體蛋白之各多肽之多核苷酸，其中該核苷酸序列為SEQ ID NO：2。
編碼上述同源二聚體蛋白之多核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式，其中DNA包括cDNA及合成DNA。DNA可為雙股或單股。編碼本發明同源二聚體蛋白之編碼序列可因遺傳密碼之豐餘性或間併性而變化。
編碼本發明之同源二聚體蛋白之多核苷酸可包含以下：僅編碼蛋白之序列、編碼蛋白之序列及諸如前導或分泌序列或原蛋白序列之其他編碼序列；編碼蛋白之序列及非編碼序列(諸如內含子)或編碼蛋白之該序列之非編碼序列5'及/或3'。因此，術語「編碼蛋白之多核苷 酸」包涵可不僅包括編碼蛋白之序列之多核苷酸，而且亦包涵包括其他編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。
本發明之多核苷酸將會在宿主細胞中於其序列以操作方式聯結至表現控制序列之後得以表現。表現載體通常係在宿主生物體中作為離合染色小體(episome)或作為宿主染色體DNA之組成部分可複製的。通常，表現載體將包含篩選標記(例如，四環素、新黴素)及二氫葉酸還原酶，以准許偵測其等經預期DNA序列轉形之細胞。
本發明之同源二聚體蛋白可輕易地在以下細胞中製得：哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0、HEK293或COS細胞；細菌細胞，諸如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、或螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence)；或真菌或酵母細胞。宿主細胞係利用為相關技藝熟知的技術進行培養。較佳之哺乳動物宿主細胞為包含麩醯胺酸合成酶(GS)表現系統之CHOK1SV細胞系(參見US 5,122,464)。
包含所研究的多核苷酸序列(例如，FGF21及GLP-1之蛋白、及表現控制序列)之載體可依所熟知方法轉移至宿主細胞中，該等載體根據細胞宿主之類型改變。例如，氯化鈣轉形通常係用於原核細胞，然而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。
可利用各種不同蛋白純化方法及該等方法為相關技藝熟知且述於(例如)Deutscher，Methods in Enzymology 182：83-89(1990年)及Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Springer，NY(1994年)中。
本發明亦提供一種用於製備同源二聚體蛋白之方法，其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1，該方法包括以下步驟： i)於使得該多肽序列得以表現之條件下培養包含編碼具有胺基酸序列為SEQ ID NO：1之多肽之多核苷酸的哺乳動物宿主細胞；及 ii)自該宿主細胞回收同源二聚體蛋白，其中該蛋白之各多肽之胺 基酸序列為SEQ ID NO：1。
本發明亦提供依上述方法所製得之同源二聚體蛋白。
具有表示為SEQ ID NO：5之胺基酸序列之多肽於哺乳動物細胞中表現時為同型二聚體。本文所用之「同源二聚體蛋白」或「同型二聚體」係指由兩個具有相同胺基酸序列之多肽構成之蛋白，其中各多肽經非共價鍵相互作用及/或分子間二硫鍵與另一者結合。本發明同源二聚體蛋白之各多肽包含Fc部分(SEQ ID NO：1之胺基酸47至274)。如熟習本技藝者所明瞭，該等多肽之哺乳動物細胞表現可在高度保留之N-醣基化部位處獲得Fc部分(SEQ ID NO：1之胺基酸47至274)之醣基化部位。
本發明同源二聚體蛋白之醫藥組合物可依相關技藝所熟知之可實現治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之一般預期目的之任何方式投與。較佳之投藥途徑為非經腸式。投藥劑量將取決於接受者之年齡、健康狀況及體重、合併治療類型(若有的話)、治療之頻率、及所預期效應之本質。典型劑量水平可利用標準臨床技術最佳化及將取決於投藥模式及患者病況且可由熟習本技藝者決定。
本發明之同源二聚體蛋白係依已知方法調配以製備醫藥上適用之組合物。一所期望調配物為經適宜稀釋劑或含可選醫藥上可接受的載劑、防腐劑、賦形劑或穩定劑之高純度溶液復水之穩定凍乾產品[Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro編輯，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995年]。
本發明之同源二聚體蛋白可藉由醫藥上可接受的緩衝劑調配，及調整pH而給予可接受的穩定性及投藥可接受的pH。此外，本發明之組合物可以放置在容器(諸如瓶、管、筆形遞送裝置(pen delivery device)、針筒、靜脈內投藥管或靜脈內投藥袋)中，其中該容器為單位劑量容器。
術語「血脂異常」意指脂蛋白代謝之失調(包括脂蛋白過度產生或缺乏)。血脂異常可表現為總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇及三酸甘油酯濃度之增加、及/或血液中高密度脂蛋白(HDL)膽固醇濃度之降低。
術語「代謝症候群」之特徵係個人之代謝風險因子組。其包括：腹部脂肪，於大多數人中，腰圍40英寸或更大；高血糖，空腹後為至少110毫克/分升(mg/dl)；高三酸甘油酯，血液中至少150mg/dL；低HDL，小於40mg/dl；及/或，血壓為130/85或更高。
術語「肥胖症」定義為其中與瘦體質量相稱之皮下脂肪過量的病況(Stedman's Medical Dictionary，第28版，2006年，Lippincott Williams & Wilkins)。
「患者」為哺乳動物，較佳係人。
術語「治療(treating)」(或「治療(treat)」或「治療(treatment)」)意指減慢、降低、或逆轉症狀、病症、病況、或疾病之進展或嚴重度。
術語「治療有效量」係指本發明之同源二聚體蛋白在依單一或多劑量投與患者時可提供所預期治療的量或劑量。
術語「第2型糖尿病」之特徵係不管胰島素之可利用性而過量產生葡萄糖，及循環葡萄糖含量因葡萄糖清除不充分而導致保持過高。
可參照以下實例來實施本發明。然而，此不應解釋為限制本發明之範疇。
實例1 同源二聚體蛋白於CHOK1SV細胞中之表現
本發明之同源二聚體蛋白係使用CHOK1SV細胞在哺乳動物細胞表現系統中產生。編碼本發明同源二聚體蛋白之基因經次選殖進入含麩醯胺酸合成酶(GS)之表現質體主鏈(基於pEE12.4之質體)中。編碼 同源二聚體蛋白之該基因係藉由將編碼GLP-1化合物之DNA在框內接合至編碼IgG4 Fc-FGF21蛋白之DNA建構。編碼本發明同源二聚體蛋白之cDNA序列係在框內與較佳信號肽序列之編碼序列接合以促進分泌所預期產物進入組織培養基。較佳之信號肽序列為如胺基酸序列SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所顯示之多肽。
由病毒性巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動表現。利用電穿孔及適量的重組型表現質體穩定轉染CHOK1SV細胞，及經轉染之細胞依適宜細胞密度保持在懸浮培養物中。藉由在含甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)之無血清培養基中生長及於35至37℃及5至7% CO2下培養實現經轉染之細胞之選擇。
使用流式細胞計數儀來產生選殖衍生之細胞系。哺乳動物細胞中蛋白之表現一般會獲得GLP1化合物N-末端序列HGEGT，亦即，在N-末端處無甲硫胺酸殘基，諸如，同源二聚體蛋白，其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1。自CHO細胞分泌至培養基中之同源二聚體蛋白係遵循標準層析技術藉由蛋白A親和層析接著進行製備型尺寸篩除層析來純化。簡言之，來自所收集培養基之同源二聚體蛋白藉PBS pH 7.4操作緩衝液而捕獲至Mab Select蛋白A(GE，Piscataway，NJ)上；短暫以操作緩衝液沖洗以移除非特異性結合的物質；及以10mM檸檬酸鹽pH 3.5溶離。將含同源二聚體蛋白之溶離份組併在一起及藉由添加1/10體積之1M Tris pH 8.0中和pH。濃縮經中和之溶出液且藉由PBS pH 7.4流動相加載至Superdex 200尺寸篩除層析柱(GE，Piscataway，NJ)上。將含單體蛋白(一種共價聯結之同源二聚體蛋白)之溶離份組併在一起，濃縮，然後儲存。
或者，含同源二聚體蛋白之無細胞培養基經洗滌劑(Triton X-100)處理達成病毒之失活。使培養基之pH調整至6.0及施加至在10mM檸檬酸鹽、150mM NaCl pH 6中達成平衡之Capto MMC管柱。於 樣本施加之後，利用平衡緩衝液洗滌樹脂以移除非特異性結合的物質。自該管柱利用在50mM Tris pH 8中之pH梯度溶出同源二聚體蛋白。將Capto MMC主流加熱至55℃維持兩小時。形成之沉澱藉由深層過濾(Millipore)移除。同源二聚體蛋白進一步於在50mM Tris pH 8中達成平衡之POROS 50 HQ陰離子交換柱上純化。利用在20mM Tris 300mM NaCl pH 8中之鹽梯度溶出結合的蛋白。溶出的同源二聚體蛋白進一步藉由疏水交互作用層析法進行純化。將POROS 50 HQ主流溶出液調整至1M硫酸鈉及施加至利用1M硫酸鈉在20mM Tris pH 7中達成平衡之苯基瓊脂糖凝膠(Phenyl Sepharose)HP管柱。同源二聚體蛋白以逆轉鹽梯度在20mM Tris pH 7中溶出。純化之同源二聚體蛋白可利用於再生纖維素膜(Millipore)上之切向流超過濾通過病毒滯留過濾器(諸如Planova 20N(Asahi Kasei Medical))接著濃縮/濾洗進入10mM檸檬酸鹽、150mM NaCl pH 7中。
實例2 3T3-L1-βKlotho纖維母細胞葡萄糖吸收檢定
3T3-L1-βKlotho纖維母細胞係自3T3-L1纖維母細胞藉由包含野生型小鼠βKlotho之編碼序列及殺稻瘟菌素(blasticidin)抗性標記之CMV驅動之哺乳動物表現載體之反轉錄病毒轉導產生。於15μM殺稻瘟菌素的存在下生長14天之後選擇殺稻瘟菌素抗性細胞，及βKlotho蛋白表現係由利用抗βKlotho抗體之免疫墨點法(immunoblot)驗證。在接種用於實驗之前，可將該等3T3-L1-βKlotho纖維母細胞維持在含10%胎牛血清及15μM殺稻瘟菌素之杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)中。
就葡萄糖吸收而言，3T3-L1-βKlotho纖維母細胞依20,000個細胞/孔接種於96孔盤中及在含10%胎牛血清之DMEM中培養48小時。該等細胞於具有或不具有所研究同源二聚體蛋白之含0.1%胎牛血清白蛋白 (BSA)之DMEM中培養3小時，接著於具有或不具有所研究同源二聚體蛋白之含100μM 2-脫氧-D-(14C)葡萄糖之克氏-林格氏(Krebs-Ringer)磷酸鹽(KRP)緩衝液(15mM Hepes(pH 7.4)、118mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、0.1% BSA)中培養1小時。由所選孔在含1mM 2-脫氧-D-(14C)葡萄糖之克氏-林格氏碳酸氫鹽/Hepes(KRBH)緩衝液中之培養來確定非特異性結合。藉由添加20μM細胞鬆弛素B至該等細胞來終止反應及利用液體閃爍計數器測定葡萄糖吸收。
於該3T3-L1-βKlotho纖維母細胞葡萄糖吸收檢定中，同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之活體外效力(EC50)為0.283±0.026nM，95%置信區間為0.189至0.423。
實例3 人類293細胞-βKlotho-SRE luc檢定
建構293-βKlotho-SRE luc報導子細胞：
於37℃、5% CO2下，在含10%胎牛血清(FBS)之生長培養基(GM)中於杜貝卡氏改良依格培養基中培養HEK-293(人胚胎腎細胞)。以含有CMV啟動子驅動之人βKlotho表現序列盒之質體及含有血清響應元素(SRE)驅動之螢光素酶表現序列盒之質體共轉染該等細胞。βKlotho表現質體亦含有SV40啟動子驅動之新黴素轉磷酸酶表現序列盒以賦予胺基糖苷抗生素G418抗性。利用600μg/mL G418選擇經轉染之HEK-293細胞，以選擇出其中經轉染之質體已整合於基因組中之細胞。藉由稀釋選殖所選擇的細胞及在添加所研究同源二聚體蛋白後第24小時測試螢光素酶產生增量。選擇顯示螢光素酶發生最大FGF21依賴性增加之純系作為用於測量相對蛋白活性之細胞系。
293-βKlotho-SRE luc FGF21活性檢定：
沖洗293-βKlotho-SRE luc細胞及放置於CD 293懸浮培養基 (Invitrogen)中。於37℃、6% CO2、125rpm下使細胞在懸浮液中生長過夜。對細胞進行計數，藉由離心粒化，及再懸浮於含有0.1% BSA之CD 293培養基中。依25,000個細胞/孔將該等細胞置於白色96孔盤中。製備所研究同源二聚體蛋白在CD 293/0.1% BSA中之4倍連續稀釋液，以獲得具有最終濃度自100nM至0.006nM之八種稀釋液。將稀釋液添加至該等細胞重複三份及於37℃、5% CO2下培養16至20小時。藉由添加等體積的OneGloTM螢光素酶底物(Promega)及測量相對發光來確定螢光素酶含量。利用四參數邏輯斯諦模型(four parameter logistic model)(XLfit 5.1版)分析數據以擬合曲線及測定EC50。
於該人293細胞-βKlotho-SRE luc檢定中，同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之平均活體外效力(EC50)為0.283±0.038nM。
實例4 活體外胰高血糖素樣肽1受體(hGLP-1R)刺激之cAMP功能檢定
GLP-1刺激之cAMP功能檢定選殖自293HEK膜單離之人胰高血糖素樣肽1受體(hGLP-1R)(Graziano MP、Hey PJ、Borkowski D、Chicchi GG、Strader CD，Biochem Biophys Res Commun.1993年10月15日；196(1)：141-6)。hGLP-1R cDNA經次選殖進入表現質體phD(完全γ羧酸化重組人蛋白C之反式活化表現，一種抗血栓形成因子。Grinnell.B.W.、Berg,D.T.、Walls,J.及Yan,S.B.Bio/Technology 5：1189-1192(1987年))中。該質體DNA經轉染進入293HEK細胞中及利用200μg/mL潮黴素進行選擇。
細胞經所研究同源二聚體蛋白刺激，且利用來自Perkin Elmer之放大發光近似均質檢定(Alpha Screen)(6760625R)定量於該細胞中產生之cAMP。簡言之，於該細胞中誘導之cAMP會競爭使來自套組之生物素化之cAMP結合至塗覆之抗cAMP抗體受體珠粒及經卵白素 (strepavidin)塗覆之施體珠粒。隨著該細胞中cAMP含量之增加，出現受體珠粒-生物素化之cAMP-施體珠粒複合體的中斷及所觀察到的信號降低。
自利用無酶細胞裂解液(專用培養基5-004-B)之次匯合組織培養皿收集hGLP-1R-HEK293細胞。於低速度下粒化該等細胞及利用檢定緩衝液[含於HBSS中之25mM HEPES-含Mg與Ca(GIBCO，14025-092)，含0.1%無脂肪酸BSA]洗滌3次然後稀釋至125,000個細胞/mL之最終濃度。依1個單位/0.04mL之最終濃度將來自Alpha Screen套組之生物素化之cAMP添加至經稀釋之細胞。亦添加磷酸二酯酶抑制劑IBMX(250mM含於DMSO中)至該等經稀釋之細胞至500μM之最終濃度。於-80℃下，將GLP-1呈冷凍等分試樣以1mg/mL儲存於PBS中。GLP-1(cAMP標準物)及所研究同源二聚體蛋白經連續稀釋至檢定緩衝液中達到6×最終濃度。在96孔低容量白色聚苯乙烯Costar盤(3688)中進行功能檢定。藉由將0.01mL經稀釋之同源二聚體蛋白、GLP-1、或cAMP添加至0.04mL細胞混合物中來啟動反應。於室溫下進行1小時之後，藉由添加0.03mL溶胞緩衝液[含有各1個單位/0.03mL受體及施體珠粒之10mM HEPES(pH 7.4)、1% NP40、及0.01%無脂肪酸BSA，獲自Alpha Screen套組]終止該反應。在黑暗中進行溶胞緩衝液之添加以防止檢測用珠粒漂白。以箔紙包覆該等盤，輕輕地振盪1分鐘然後於室溫下讓其平衡過夜。於Perkin-Elmer Envision儀器上讀取該等盤。基於cAMP標準曲線，將Alpha screen單位轉換為每孔所產生之cAMP皮莫耳數。將各孔所產生之cAMP皮莫耳數轉換為所觀察到最大反應相對GLP-1對照之百分比。藉由非線性回歸分析，利用最大反應百分比相對於所添加之肽濃度導出EC50值。
同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)在hGLP-1R之平均活體外效力(EC50)為0.067±0.011nM，95%置 信區間為0.033至0.136。
實例5 物理穩定性
為了測定本發明同源二聚體蛋白之物理穩定性，以1至2mg/mL於10mM檸檬酸鹽pH 7、150mM NaCl中透析並製備同源二聚體蛋白，及藉由SEC分析以確定HMW%(表1：「初始值」)。
SEC分離方法係於具有尺寸30cm×0.78cm之Tosoh Bioscience 3000SWXL型5微米柱上實現。流動相係0.01M檸檬酸鈉150mM NaCl(pH 7)，流速為0.5mL/分鐘。先施用呈10mcL注射液之低濃度樣本及於214nm之吸收波長下監測，而50mg/mL樣本係呈1mcL注射液施用及於280nm下監測。
將同源二聚體蛋白濃縮至50mg/mL及再次分析(t=0)。在濃縮後，同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之HMW%自0.9%增加至1.4%。因此，同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)具有低初始HMW%及在蛋白經調配成50mg/mL時之低HMW%。
於4℃、25℃、及40℃下培養50mg/mL調配物4週以評估應力條件下之較長期穩定性。如表1所顯示，於4週時間(t=4週)時再次測定HMW%。於40℃下，同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之HMW%自1.9%增加至4.9%。於25℃下4週後，同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之HMW%水平為3.3%。
實例6 高濃度下之自締合(Self-association)
為了測試本發明同源二聚體蛋白自締合之傾向，於表2所列緩衝液中透析蛋白及藉由尺寸篩除層析法(SEC)分析以測定1.0mg/mL及75mg/ml溶液之高分子量%(HMW%)。HMW%為蛋白聚集及自締合之指標。
SEC分離方法係於具有尺寸30cm×0.78cm之Tosoh Bioscience 3000SWXL型5微米柱上實現。流動相係0.01M檸檬酸鈉、150mM NaCl(pH 7)，流速為0.5mL/分鐘。施用呈10mcL注射液之1.0mg/mL樣本及於214nm之吸收波長下監測，而75mg/mL樣本係呈1mcL注射液施用及於280nm下監測。
表2例示同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之1.0至1.4% HMW。接著將樣本濃縮至75mg/mL以模擬高濃度調配物及再次藉由SEC分析以測定HMW%。同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)於75mg/mL下僅包含1.2至1.9% HMW。
實例7 Ob/ob小鼠模型中之葡萄糖降低
雄性ob/ob小鼠及年齡匹配的ob/m(瘦)對照組在獲得時為7週齡及在開始處理時為8至9週齡。在獲得時，所有小鼠單獨關在籠中及容許在開始處理之前適應環境1至2週。以Purina嚙齒動物飼料5015餵養該等小鼠及由自動給水設備隨意地提供籠內用水。該等小鼠以12小時光照/黑暗週期與設定在75℉之環境溫度關養。在開始處理前的1至2天，經由尾出血採集血樣。利用Accu-Check Avivia血糖儀(Roche)測定血液葡萄糖含量及利用中尺度小鼠/大鼠胰島素檢定套組採集血清樣本以供胰島素檢定之用。於開始處理當天(第0天)，基於預處理時 之體重、血液葡萄糖、及血清胰島素將該等小鼠分組(BRAT分組軟體)。在第0天及第3天，0.3至30nmol/kg同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)以10mL/kg之體積進行小鼠(SQ)給藥。給藥媒劑為含0.03%小鼠血清白蛋白之無菌PBS(HyClone DPBS/改質鈣-鎂)(MSA；Sigma A3139)。連續7天每天測量血液葡萄糖及測定AUC。基於AUC計算葡萄糖降低之ED50。於Hitachi Modular P臨床分析器上測定殺死時所收集肝臟均勻液及肝臟三酸甘油酯。
在第7天，經媒劑處理之小鼠為高血糖，測得其平均血糖含量在387±63.0mg/dl(平均值±平均值標準偏差(SEM))，而ob/m瘦對照組小鼠具有162±9.0mg/dl(平均值±SEM)之血糖含量。同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)降低血液葡萄糖至與ob/m瘦對照組相當之水平。同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之葡萄糖AUC ED50為2.95nmol/kg(95%置信區間=2.06至4.23)。
實例8 飲食誘導之肥胖症(DIO)小鼠模型
將同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)給藥至C57Bl6飲食誘導之肥胖(DIO)小鼠。雖然該等動物為非糖尿病性，但在以高脂肪(60%千卡來自脂肪)飲食飼養12週之後仍可能呈現胰島素抗性、血脂異常、及肝脂肪變性、代謝症候群之所有特徵。
將稱得體重為37至45g之3至4個月大的飲食誘導之肥胖(DIO)C57/Bl6雄性小鼠個別地關在具有12小時光照/黑暗週期(於22：00開燈)之溫度受控(24℃)設施中，可自由取得食物與水。在適應該設施2週之後，基於體重及脂肪質量將該等小鼠隨機分成幾個治療組(n=5/組別)，因此各組別具有相似起始平均體重及脂肪質量。
每三天連續15天在開始黑暗週期前30至90分鐘期間藉由SQ注射投與媒劑或已溶於媒劑(經磷酸鹽緩衝之鹽水，Hyclone，ThermoScientific)中之同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)(劑量範圍為1至30nmol/kg)至隨意餵養之DIO小鼠。於第1天、第4天、第7天、第10天、及第13天進行SQ注射。於整個研究中每日測量體重及食物攝入。藉由減去同一動物在第一次注射分子前之體重計算得絕對體重變化。在第1天及第15天，利用Echo Medical System(Houston，TX)儀器藉由核磁共振(NMR)測得總脂肪質量。
於身體組成測量之後，將動物殺死及取出肝臟並冷凍。自殺死時收集到的肝臟製成之均勻液確定肝臟三酸甘油酯及於Hitachi Modular P臨床分析器上測定。利用單因子ANOVA接著鄧恩多重比較試驗(Dunnett’s multiple comparison test)完成組別間之統計學比較。於GraphPad Prism中使用非線性擬合工具測定體重損失降低之ED50。
同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)以劑量依賴性方式降低體重及脂肪質量。以體重損失百分比表示之同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)之ED50為7.577nmol/kg。降低之體重主要係由於脂肪質量之降低所致。然而，由於在短時間期內之大量體重損失，亦觀察到顯著全水分損失(參見表3)。同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)亦導致研究結束時血漿三酸甘油酯降低70%及肝臟三酸甘油酯降低95%。
表3同源二聚體蛋白(其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1)對DIO小鼠身體組成之影響(負數指示實際損失量，公克)
序列
SEQ ID NO：1-同源二聚體蛋白
SEQ ID NO：2-同源二聚體蛋白之(DNA)
SEQ ID NO：3-人類運鐵蛋白(hTrf)信號肽
MRLAVGALLVCAVLGLCLA
SEQ ID NO：4-人類纖維母細胞生長因子結合蛋白-1(hFGFP-1)信號肽
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 4

Claims (9)

  1. 一種同源二聚體蛋白，其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為： (SEQ ID NO：1)。
  2. 一種編碼多肽之DNA分子，其中該多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1。
  3. 一種經如請求項2之DNA分子轉形之哺乳動物宿主細胞，該細胞能夠表現同源二聚體蛋白，其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1。
  4. 一種用於製造同源二聚體蛋白之方法，其中該蛋白之各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1，該方法包括以下步驟：i)於使得該多肽序列得以表現之條件下培養包含編碼具有胺基酸序列為SEQ ID NO：1之多肽之多核苷酸之哺乳動物宿主細胞；及ii)自該宿主細胞回收同源二聚體蛋白，其中該同源二聚體蛋白各多肽之胺基酸序列為SEQ ID NO：1。
  5. 一種依如請求項4之方法所製得之同源二聚體蛋白。
  6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1或5中任一項之同源二聚體蛋白、及至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
  7. 一種如請求項1或5中任一項之同源二聚體蛋白於製造用於治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、及/或代謝症候群之藥物中之用途。
  8. 如請求項1或5中任一項之同源二聚體蛋白，其係用於治療。
  9. 如請求項1或5中任一項之同源二聚體蛋白，其係用於治療第2型糖尿病、肥胖症、血脂異常及/或代謝症候群。
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