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TW201417817A - Ｇｓｋ３抑制劑與抗ｄｒ５抗體之組合 - Google Patents

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TW201417817A
TW201417817A TW102134268A TW102134268A TW201417817A TW 201417817 A TW201417817 A TW 201417817A TW 102134268 A TW102134268 A TW 102134268A TW 102134268 A TW102134268 A TW 102134268A TW 201417817 A TW201417817 A TW 201417817A
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TW
Taiwan
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cancer
amino acid
amino
group
mmol
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TW102134268A
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English (en)
Inventor
Kenichi Wakita
Naomi Shimazaki
Shiho Iwasaki
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本發明係提供一種組合GSK3抑制劑與抗DR5抗體而成的癌症之併用治療方法。本發明係提供組合LY2090314、下述通式所表示的化合物或其鹽等之GSK抑制劑，與各種抗DR5抗體而成的醫藥或併用治療方法，□[式中，R1、R2、R3、R4、X1、X2與說明書中各自的定義同意義]。

Description

GSK3抑制劑與抗DR5抗體之組合
本發明係關於組合肝醣合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(death receptor，DR5)抗體而成的癌症之併用治療。
GSK3係被發現為將肝醣合成酶磷酸化的絲胺酸/蘇胺酸激酶(非專利文獻1)，目前已知有α及β之2個亞型存在。已有報告因GSK3β基因缺損小鼠為胚致死(embryonic lethal)(非專利文獻2)，其機能於細胞之生存為重要的，且於與癌症的關聯性亦深的Akt訊號(非專利文獻3)或Wnt訊號等(非專利文獻4)之重要的訊號，負擔廣泛的任務。相對於此，已有報告GSK3α基因缺損小鼠並非胚致死(非專利文獻5)，與一部分的糖代謝有關的機能跟正常相比為相異的。然而，其機能基本上為相互補強，已有報告GSKα及β兩者之基因缺損的情形，可見到更強的訊號抑制(非專利文獻6)。
GSK3之標的於肝醣合成酶以外，亦多方面關聯於類澱粉蛋白質、早老素(presenilin)、β連環蛋白(catenin)、細胞週期蛋白(cyclin)D1等(非專利文獻7)，作為於各式各樣的疾病之治療標的而受注目。
於癌症領域，藉由GSK3的β連環蛋白之磷酸化，於細胞內掌管β連環蛋白的分解，就結果而言因經由轉錄因子Tcf而抑制基因表現，被廣泛接納作為大腸癌之抑制因子的定位(非專利文獻4)。
然而，近年來，於MLL白血病、CML等之白血病，藉由GSK3抑制之抗腫瘤活性已被報告(非專利文獻8、9)，對使用GSK3抑制劑LY2090314的急性白血病的臨床試驗亦正進行中。
就抑制GSK3的化合物而言，已報告多樣的骨架(非專利文獻10)，已報告順丁烯二醯亞胺衍生物(專利文獻1、非專利文獻11)、嘧啶衍生物(專利文獻2、非專利文獻12)、嘧啶酮衍生物(專利文獻3)、吡啶衍生物(專利文獻4)、唑衍生物(非專利文獻13)、喹啉酮衍生物(專利文獻5、非專利文獻14)等。
細胞凋亡係所謂於活體內排除不要的細胞或受到損傷的細胞而保持正常細胞數的生理學過程上必須的現象。由於此細胞凋亡調節機構於癌症．免疫疾病經常受損、及細胞凋亡調節路徑的理解的進展，可利用於癌症．免疫疾病治療的新穎細胞凋亡誘導劑的開發正在進行著。尤其，對死亡受體所代表的關於細胞凋亡誘導的細胞表面受體之配位體或受體具有結合能力的抗體係被期待有對此等疾病的治療作用(非專利文獻15)。
死亡受體之一種的Death Receptor 5(DR5)亦被稱為KILLER、TRICK2A、TRAIL-R2、TRICKB、或CD262，於細胞誘導細胞凋亡的激動劑抗體有多數為已知(非專 利文獻16或17、或專利文獻7乃至12)。
一些抗體現在作為治療藥候補在前臨床或臨床的開發階段，期待表現該受體的細胞(癌細胞．免疫疾病關聯細胞)特異地作為激動劑作用，而有使其死滅的治療效果。起因於抗體的抗腫瘤作用中DR5之表現為必須的，但是作用及表現量無相關性係藉由前臨床試驗而變得明瞭(非專利文獻18)。關於此點，一般認為係因為藉由與細胞凋亡路徑有關的凋亡蛋白酶-8(Caspase-8)或Bcl-2等之細胞內訊號分子之表現量等之多種類的主要因素而支配細胞反應(非專利文獻19)。而且，於增強抗DR5抗體之作用的目的下，已嘗試組合該抗體與其他醫藥來投與。
已知藉由GSK3抑制劑而增加DR5之表現量，而經由DR5之內生性配位體之TRAIL(TNF相關的細胞凋亡誘導配位體，TNF-RELATED APOPTOSIS-INDUCING LIGAND)增強細胞凋亡誘導(非專利文獻20)。然而，關於藉由併用GSK3抑制劑與抗DR5抗體之治療效果，包含所謂組合何種化合物與抗體為適合的點，則尚未知悉。
[先前技術文獻]
[專利文獻1]WO2003/076398
[專利文獻2]WO2003/070729
[專利文獻3]WO2003/072579
[專利文獻4]WO2003/068773
[專利文獻5]WO2007/106537
[專利文獻6]EP1650192
[專利文獻7]WO98/51793
[專利文獻8]WO2001/083560
[專利文獻9]WO2002/094880
[專利文獻10]WO2003/054216
[專利文獻11]WO2006/083971
[專利文獻12]WO2007/022157
[非專利文獻1]Eur. J. Biochem. 107 519-527 (1980)
[非專利文獻2]Nature 406 86-90 (2000)
[非專利文獻3]Nature 378 785-789 (1995)
[非專利文獻4]Science 272 1023-1026 (1996)
[非專利文獻5]Cell Metab. 6 329-337 (2007)
[非專利文獻6]Dev Cell. 12 957-971 (2007)
[非專利文獻7]Int. J. Alzheimers Dis. 2011 Article ID：505607 (2011)
[非專利文獻8]Nature 455 1205-1209 (2008)
[非專利文獻9]Blood 119 2335-2345 (2012)
[非專利文獻10]Expert Opin. Ther. Patents 15 1315-1331 (2005)
[非專利文獻11]Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 899-903 (2005)
[非專利文獻12]Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 2127-2130 (2004)
[非專利文獻13]J. Med. Chem 46 3333-3341 (2003)
[非專利文獻14]Bioorg. Med. Chem. 20 1188-1200 (2012)
[非專利文獻15]Cell Death and Differentiation 10 66-75 (2003)
[非專利文獻16]Journal of Immunology 162 2597-2605 (1999)
[非專利文獻17]Nature Medicine 7(8) 954-960 (2001)
[非專利文獻18]Cell Death and Differentiation 10 66-75 (2003)
[非專利文獻19]Journal of Clinical Oncology 26 3621-3630 (2008)
[非專利文獻20]Cancer Res. 68 (16) 6643-6651 (2008)
本發明係提供一種用於癌症治療之醫藥，其特徵為組合GSK3抑制劑與抗DR5抗體而投與；一種癌症之治療方法，其特徵為組合GSK3抑制劑與抗DR5抗體而投與。
本發明者們，專心檢討的結果，藉由組合GSK3抑制劑LY2090314、或具有下述通式(1)所表示的構造的化合物或其鹽與抗DR5抗體來使用，發現可獲得特別優異的抗腫瘤效果，遂而完成本發明。
即，本發明係關於下列之[1]~[17]。
[1]一種用於癌症治療之醫藥，其特徵為組合肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體而投與。
[2]如請求項1記載之醫藥，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體係各自作為相異的製劑之有效成分而被含有，且於同時或相異時間被投與。
[3]如請求項1記載之醫藥，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體係被含於單一製劑中。
[4]如請求項1記載之醫藥，其係含肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體的套組製劑。
[5]一種癌症之治療方法，其特徵為組合肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體而投與。
[6]如[1]至[4]中任一項記載之醫藥，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑係LY2090314或下述通式(1)所表示的化合物或其鹽， [式中，R1表示羧基、胺甲醯基或氰基，R2表示甲基或氫原子， R3表示鹵素原子，R4表示可具有選自下述A群的取代基的哌啶基、可具有選自下述A群的取代基的吡啶基、可具有選自下述A群的取代基的環己基或氫原子，X1表示C-H、C-F或N，X2表示CH2、N-H或S]；A群：可經1~3個之鹵素原子、羥基或甲氧基取代的C1-C6烷基、乙醯基、甲基磺醯基、羥基。
[7]如[5]記載之治療方法，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑係LY2090314或下述通式(1)所表示的化合物或其鹽， [式中，R1表示羧基、胺甲醯基或氰基，R2表示甲基或氫原子，R3表示鹵素原子，R4表示可具有選自下述A群的取代基的哌啶基、可具有選自下述A群的取代基的吡啶基、可具有選自下述A群的取代基的環己基或氫原子，X1表示C-H、C-F或N，X2表示CH2、N-H或S]；A群：可經1~3個之鹵素原子、羥基或甲氧基取代的 C1-C6烷基、乙醯基、甲基磺醯基、羥基。
[8]如[1]至[4]中任一項記載之醫藥，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑係LY2090314或選自下列之群組的1個化合物或其鹽， 。
[9]如[5]記載之治療方法，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑係LY2090314或選自下列之群組的1個化合物或其鹽， 。
[10]如[1]至[4]、[6]及[8]中任一項記載之醫藥，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號1所示的胺基酸序列之第1~449號的胺基酸殘基或第1~448號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號2所示的胺基酸序列之第1~213號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
[11]如[1]至[4]、[6]及[8]中任一項記載之醫藥，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號3所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號4所示的胺基酸序 列之第1~219號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
[12]如[1]至[4]、[6]及[8]中任一項記載之醫藥，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號5所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號6所示的胺基酸序列之第1~215號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
[13]如[5]、[7]、[9]中任一項記載之治療方法，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號1所示的胺基酸序列之第1~449號的胺基酸殘基或第1~448號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號2所示的胺基酸序列之第1~213號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
[14]如[5]、[7]、[9]中任一項記載之治療方法，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號3所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號4所示的胺基酸序列之第1~219號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
[15]如[5]、[7]、[9]中任一項記載之治療方法，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號5所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號6所示的胺基酸序列之第1~215號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
[16]如[1]至[4]、[6]、[8]、[10]至[12]中任一項記載之醫藥，其中癌症為血液癌(白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤)、腦腫瘤、頭頸部癌、食道癌、胃癌、闌尾癌、大腸癌、肛門癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、胃腸道基質腫瘤(gastrointestinal stromal tumor)、肺癌、肝臟癌、中皮瘤(mesothelioma)、甲狀腺癌、腎臟癌、前列腺癌、神經內分泌腫瘤、黑色素瘤、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤(soft tissue sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肌肉瘤、腎臟癌、膀胱癌或睪丸癌。
[17]如[5]、[7]、[9]、[13]至[15]中任一項記載之治療方法，其中癌症為血液癌(白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤)、腦腫瘤、頭頸部癌、食道癌、胃癌、闌尾癌、大腸癌、肛門癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、胃腸道基質腫瘤、肺癌、肝臟癌、中皮瘤、甲狀腺癌、腎臟癌、前列腺癌、神經內分泌腫瘤、黑色素瘤、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、肌肉瘤、腎臟癌、膀胱癌或睪丸癌。
本發明係有用於作為癌症之治療方法及/或抗癌劑。
第1-1圖係呈現LY2090314與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制 活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第1-2圖係呈現LY2090314與hTRA8對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第1-3圖係呈現LY2090314與可那木單抗(Conatumumab)對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-1圖係呈現實施例化合物(化合物)18與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-2圖係呈現化合物21與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-3圖係呈現化合物36與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-4圖係呈現化合物52與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-5圖係呈現化合物37與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-6圖係呈現化合物53與hB273對人類急性淋巴性 白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-7圖係呈現化合物27與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-8圖係呈現化合物39與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第2-9圖係呈現化合物54與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第3-1圖係呈現化合物18與可那木單抗對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第3-2圖係呈現化合物36與可那木單抗對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第3-3圖係呈現化合物37與可那木單抗對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第3-4圖係呈現化合物39與可那木單抗對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第3-5圖係呈現化合物53與可那木單抗對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖 抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第3-6圖係呈現化合物54與可那木單抗對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第4-1圖係呈現化合物18與hTRA8對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第4-2圖係呈現化合物36與hTRA8對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第4-3圖係呈現化合物37與hTRA8對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第4-4圖係呈現化合物39與hTRA8對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第4-5圖係呈現化合物53與hTRA8對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第4-6圖係呈現化合物54與hTRA8對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第5-1圖係呈現化合物21與hB273對人類黑色素瘤細胞株A375於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第5-2圖係呈現化合物21與hB273對人類骨髓瘤細胞株NCI-H929於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第5-3圖係呈現化合物21與hB273對人類慢性骨髓性白血病細胞株K562於活體外的併用效果(增殖抑制活性及細胞死亡(凋亡蛋白酶)誘導活性)的圖。
第6-1圖係呈現LY2090314與hB273(上段圖)、與hTRA8(下段圖)對人類黑色素瘤細胞株A375之活體內的併用效果的圖。於上段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示LY2090314 100mg/kg、符號黑色圓圈表示LY2090314 100mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示LY2090314 200mg/kg、符號黑色四方形表示LY2090314 200mg/kg+hB273 3mg/kg。於下段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hTRA8 10mg/kg、符號白色圓圈表示LY2090314 100mg/kg、符號黑色圓圈表示LY2090314 100mg/kg+hTRA8 10mg/kg、符號白色四方形表示LY2090314 200mg/kg、符號黑色四方形表示LY2090314 200mg/kg+hTRA8 10mg/kg。
第6-2圖係呈現LY2090314與可那木單抗對人類黑色素瘤細胞株A375之活體內的併用效果的圖。於圖中，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示可那木單抗3mg/kg、符號白色圓圈表示LY2090314 100mg/kg、符號黑色圓圈表示LY2090314 100mg/kg+可 那木單抗3mg/kg、符號白色四方形表示LY2090314 200mg/kg、符號黑色四方形表示LY2090314 200mg/kg+可那木單抗3mg/kg。
第7-1圖係呈現化合物18(上段圖)、21(下段圖)與hB273對人類黑色素瘤細胞株A375之活體內的併用效果的圖。於上段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示化合物18 7.5mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物18 7.5mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物18 15mg/kg、符號黑色四方形表示化合物18 15mg/kg+hB273 3mg/kg。於下段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示化合物21 3.5mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物21 3.5mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物21 7mg/kg、符號黑色四方形表示化合物21 7mg/kg+hB273 3mg/kg。
第7-2圖係呈現化合物36(上段圖)、27(下段圖)與hB273對人類黑色素瘤細胞株A375之活體內的併用效果的圖。於上段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示化合物36 3mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物36 3mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物36 6mg/kg、符號黑色四方形表示化合物36 6mg/kg+hB273 3mg/kg。於下段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表 示化合物27 2.5mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物27 2.5mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物27 5mg/kg、符號黑色四方形表示化合物27 5mg/kg+hB273 3mg/kg。
第7-3圖係呈現化合物53(上段圖)或54(下段圖)與hB273對人類黑色素瘤細胞株A375之活體內的併用效果的圖。於上段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示化合物53 3mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物53 3mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物53 6mg/kg、符號黑色四方形表示化合物536mg/kg+hB273 3mg/kg。於下段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示化合物54 25mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物54 25mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物54 50mg/kg、符號黑色四方形表示化合物54 50mg/kg+hB273 3mg/kg。
第8圖係呈現化合物21(上段圖)或化合物18(下段圖)與hB273對人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11之活體內的併用效果的圖。於上段圖，符號白色三角形表示無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示化合物21 2mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物21 2mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物21 4mg/kg、符號黑色四方形表示化合物21 4mg/kg+hB273 3mg/kg。於下段圖，符號白色三角形表示 無處置對照組、符號黑色三角形表示hB273 3mg/kg、符號白色圓圈表示化合物18 7.5mg/kg、符號黑色圓圈表示化合物18 7.5mg/kg+hB273 3mg/kg、符號白色四方形表示化合物18 15mg/kg、符號黑色四方形表示化合物18 15mg/kg+hB273 3mg/kg。
[實施發明之形態]
於本發明，用語「腫瘤」及「癌」可交換使用。又，於本發明，有將腫瘤、惡性腫瘤、癌、惡性生長、癌瘤、肉瘤等總稱而表現為「腫瘤」或「癌」的情形。
於本發明，GSK3係指藉由GSK3基因所編碼的蛋白質。只要未特別區別而記載，包含為異構物的GSKα及GSKβ兩者。GSK3蛋白質係包含藉由全長之GSK3基因編碼的GSK3蛋白質或藉由GSK3基因變異體(包含缺損變異體、取代變異體或加成變異體)編碼的GSK3蛋白質等。於本發明，GSK3亦包含來自各種動物種的同系物(homolog)。
於本發明，GSK3抑制劑係指GSK3之作為激酶之機能的抑制劑。GSK3之抑制活性測定使用本來周知之方法即可，例如，可依據後述之試驗例1記載之方法來進行。
就GSK3抑制劑而言，可舉例上述非專利文獻10記載的化合物、專利文獻1或非專利文獻11記載的順丁烯二醯亞胺衍生物、專利文獻2或非專利文獻12記載的嘧 啶衍生物、專利文獻3記載的嘧啶酮衍生物、專利文獻4記載的吡啶衍生物、非專利文獻13記載的唑衍生物、專利文獻5或非專利文獻14記載的喹啉酮衍生物等、LY2090314、上述通式(1)記載的化合物或其鹽等，但只要具有抑制GSK3的作用的化合物即可，並未特別限定。本文中，LY2090314係WO03/076442之實施例365記載的化合物，可參考該文獻來合成。
於本發明，就使用的GSK3抑制劑而言，LY2090314或上述通式(1)記載的化合物或其鹽為較佳，LY2090314或選自下述之群組的化合物或其鹽為更佳。
於本發明，「C1~C6烷基」係指碳數1~6之直鏈、分支鏈之烷基。就「C1~C6烷基」而言，例如，可舉例甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、tert-丁基等。
就「鹵素原子」而言，可舉例氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
以下，說明式(1)中之各取代基。
下述通式(1)中，
R1表示羧基、胺甲醯基或氰基。
R2表示甲基或氫原子。
R3表示鹵素原子，氟原子或氯原子為較佳，氟原子為特佳。
R4表示可具有選自上述A群的取代基的哌啶基、可具有選自上述A群的取代基的吡啶基、可具有選自上述A群的取代基的環己基或氫原子。
其中，哌啶基及吡啶基之結合位置並未特別限定，但於3位或4位之位置結合者為較佳。
哌啶基、吡啶基及環己基上的取代基並未特別限定，但於哌啶基及吡啶基的情形，於氮原子上取代者為較佳，就取代基而言，乙醯基及甲基為特佳。就環己基之取代基而言，羥基為較佳。
X1表示C-H、C-F或N。
X2表示CH2、N-H或S。
於本發明中的通式(1)所表示的化合物於具有胺基等的鹼性基的情形，依所欲可作成醫藥上可容許的鹽。就此類鹽而言，例如可舉例鹽酸鹽、碘化氫酸鹽等之鹵素化氫酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽等之低級烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽等之芳基磺酸鹽；甲酸、乙酸、蘋果酸、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等之有機酸鹽；及鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等之胺基酸鹽；鹵素化氫酸鹽及有機酸鹽為較佳。
本發明中的通式(1)所表示的化合物具有羧基等之酸性基的情形，一般而言形成鹼加成鹽係可能的。就醫藥上可容許的鹽而言，例如，可舉例鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等之鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等之鹼土類金屬鹽；銨鹽等之無機鹽；二苄基胺鹽、啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡萄糖胺(glucamine)鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、環己胺鹽、二環己胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽等之有機胺鹽等。
本發明中的通式(1)所表示的化合物或其鹽亦有呈游離體或溶媒合物存在的情形。亦有藉由吸收空氣中之水分等而呈水合物存在。就溶媒合物而言，只要 為醫藥上可容許者即可，並未特別限定，但具體而言，水合物、乙醇合物等為較佳。又，於通式(1)所表示的化合物中存有氮原子的情形，可為N-氧化物體，此等溶媒合物及N-氧化物體亦含於本發明之範圍。
本發明中的通式(1)所表示的化合物或其藥理上可容許的鹽係依彼等之構造而可產生立體異構物。本發明中的通式(1)所表示的化合物或其鹽亦包含此等之立體異構物、及此等之立體異構物之任意比率的混合物全部。立體異構物之定義係如1996 IUPC，Pure and Applied Chemistry 68，2193-2222所示。又，本發明之通式(I)所表示的化合物或其藥理上可容許的鹽係呈互變異構物存在的情形，包含彼等之互變異構物為併行狀態下存在的情形、或某型為優勢存在的情形任一者。互變異構物係指分子之1個之原子的質子位移至其他原子而產生的異構物。
本發明中的通式(1)所表示的化合物亦包含構成的原子之一個或複數個為非天然之比率的原子同位素者。就原子同位素而言，例如，可舉例氘(2H)、氚(3H)、碘-125、(125I)或碳-14(14C)等。此等之化合物係有用於作為治療或預防劑、研究試藥(例如：分析試藥)、及診斷劑(例如：活體影像診斷劑)。通式(1)所表示的化合物之全部同位素變種，不論是否為放射性，皆含於本發明之範圍內。
又，活體內的生理條件下，藉由酵素或胃酸等反應而變換為化合物(1)的化合物，即，發生酵素性氧 化、還原、水解等而變化為化合物(1)的化合物或藉由胃酸等水解等而變化為化合物(1)的「醫藥上可容許的前藥化合物」亦包含於本發明。
就上述前藥而言，於化合物(1)有胺基存在的情形，可舉出此胺基經醯基化、烷基化、磷酸化的化合物(例如，其胺基經二十醯基化、丙胺醯基化、戊胺基羰基化、(5-甲基-2-側氧-1,3-二氧戊環-4-基)甲氧羰基化、四氫呋喃基化、吡咯啶基甲基化、三甲基乙醯氧基甲基化、tert-丁基化的化合物等)等；化合物(1)存有羥基的情形，可舉出其羥基經醯基化、烷基化、磷酸化、硼酸化的化合物(例如，其羥基經乙醯基化、十六醯基化、丙醯基化、三甲基乙醯基化、琥珀醯基化、反丁烯二醯基化、丙胺醯基化、二甲胺基甲基羰基化的化合物等)等。又，化合物(I)存有羧基的情形，可舉例其羧基經酯化、醯胺化的化合物(例如，其羧基經乙基酯化、苯基酯化、羧甲基酯化、二甲胺基甲基酯化、三甲基乙醯氧基甲基酯化、乙氧基羰氧基乙基酯化、醯胺化或甲基醯胺化的化合物等)等。
化合物的前藥可依據周知方法由化合物(1)而製造。又，化合物之前藥係如廣川書店1990年刊「醫藥品之開發」第7卷，分子設計163頁~198頁記載，亦包含於生理的條件下變化為化合物(1)者。
其次，說明通式(1)所表示的化合物之代表的製造法。通式(1)所表示的化合物可依據各種製造法來製造，以下所示製造法為一例，本發明不應被解釋為受此 等限定。又，反應之際，因應必要，可將取代基以適當保護基加以保護來進行，保護基之種類並未特別限定。本文使用的原料可作為市售品而購入，或文獻周知之化合物，或可參考實施例或參考例來合成。
[製造法1]
具有硝基的苯甲酸2為可取得或合成的情形，可如以下合成。後半之中間體6以後的製造步驟，較佳順序係依化合物而異。又，烯胺4中之取代基R係甲基、乙基、異丙基、t-丁基等之烷基，表示為COOR之酯基。此酯基即使取代為氰基亦可同樣地合成。
以下，呈現上述簡圖的各步驟(簡圖中，R2、R3、R4 、X1、X2係與上述相同)。
步驟1
由化合物1至2之硝基化反應係以一般已知的硝基化條件進行(Albright，L.F.；Carr.R.V.C.；Schmitt，R.J.Eds.Nitration；ACS Symposium Series 623，1996)。具體而言，於硝基化容易進行的基質，將乙酸、濃硫酸等作為溶媒，可於室溫使用1莫耳~過剩莫耳之硝酸鉀來實施。於硝基化不容易進行的基質的情形，將濃硫酸或乙酸酐或三氟乙酸酐作為溶媒，可於加熱條件使用大量過剩的硝酸或發煙硝酸來實施。亦有不使用溶媒，僅以發煙硝酸進行硝基化的情形。又，作為硝基源，有使用硝酸二銨鈰(IV)等之鹽，或亞硝酸丁酯等之酯的情形。又，亦已有報告使二氧化氮與臭氧氣體共存的方法(Suzuki,H.；Murashima,T.；Shimizu,K.；Tsukamoto,K.Chem.Lett.1991,817-818)。
步驟2
由化合物2至3之變換係於對反應無不良影響的適當溶媒(二氯甲烷或四氫呋喃等)中，觸媒量之N,N-二甲基甲醯胺存在下，以1~過剩莫耳之草醯氯作用而實施。反應時間為30分鐘~24小時、反應溫度為0℃~80℃，0℃~室溫為較佳。亦可使用亞硫醯氯作為試藥。一般而言，將試藥及溶媒餾除的殘渣直接使用於下一步驟。
步驟3
由化合物3至5之變換係於對反應無不良影響的適當溶媒(甲苯或四氫呋喃、乙腈等)中，可藉由相對於對應 的烯胺1莫耳，使1莫耳~數莫耳之酸氯化物作用而實施。因應必要，亦有使三乙胺、二異丙基乙胺等之鹼1莫耳~數莫耳共存的情形。反應溫度係於0℃~100℃之範圍，0℃~室溫為較佳，但欲進行至環化反應的情形，於鹼共存下，加熱至50℃~100℃為宜。反應時間係30分鐘~10小時左右為較佳，30分鐘~3小時左右為更佳。
步驟4
化合物5至6之環化反應係於對反應無不良影響的適當溶媒(四氫呋喃或丙酮、乙腈等)中，使用氫化鈉或碳酸鉀等之適當鹼1莫耳~數莫耳來實施。反應溫度係可於0℃~100℃之範圍下進行。使用氫化鈉的情形，0℃~40℃為較佳，使用碳酸鉀的情形，60℃~100℃為較佳。反應時間係30分鐘~10小時左右為較佳，30分鐘~3小時左右為更佳。
步驟5
化合物6至7之還原反應係於對反應無不良影響的適當溶媒(N,N-二甲基甲醯胺或二氯乙烷等)中，氫氣環境下，使用相對於基質為10~100wt%之鈀碳觸媒來進行。反應時間係依基質而異，為數小時~數日。反應溫度係0℃~40℃左右為較佳。由化合物9至10、12至13之還原反應亦同樣地進行。
氫氧化鈀、粗鉑(platina)碳觸媒等之其他觸媒、或酸性條件下，亦可使用鐵．鋅等之金屬來還原。又，亦可使用二硫亞磺酸鈉等之鹽。
步驟6
化合物7至8之取代反應係於對反應無不良影響的適當溶媒(N,N-二甲亞碸或N-甲基吡咯啶酮等)中，相對於母核1莫耳，使用1莫耳~數莫耳之胺來實施。依情況，可使1莫耳~數莫耳之三乙胺等之鹼共存。喹啉酮母核的情形，反應溫度係40℃~150℃為較佳，更佳為反應溫度60℃~100℃。反應時間係於數小時~數日進行。啶(naphthyridine)母核(X1為N原子)的情形，母核之反應性為比較低，反應溫度80℃~120℃、反應時間為12小時~數日下進行，但於微波反應裝置，反應溫度160℃下加熱一小時的方法為較佳。此外，亦可進行使用鈀等之金屬觸媒的耦合反應來合成。於此情形，反應部位不為氟原子，而是溴原子或氯原子為較佳。就溶媒而言，1,4-二烷、甲苯為特佳，相對於母核1莫耳，使用1莫耳~數莫耳之胺或芳香族胺、使用1莫耳~數莫耳之作為鹼的碳酸銫、t-丁醇鈉等、使用0.01~0.1莫耳之作為鈀觸媒的三(二亞苄基丙酮)二鈀等、使用0.01~0.2莫耳之作為觸媒配位體之4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基二苯并哌喃或2,2’-雙(二苯基膦)-1,1’-聯萘基等，於反應溫度70℃~120℃、反應時間為6小時~數日來實施。化合物10至11、13至14的情形亦相同。
步驟7
化合物6至9之脫酯化，於甲酯、乙酯、異丙酯的情形，係於一般鹼性條件下進行。醇等之易與水混和的適當溶媒中，可使用1莫耳~大量過剩莫耳之氫氧化鈉水溶液，較佳為3莫耳至10莫耳左右。反應溫度係於室溫~ 100℃，較佳為50℃~80℃。反應時間係於數小時~1日左右來進行。除氫氧化鈉之外，可使用氫氧化鉀、氫氧化鋰等。又，依情形，亦可選擇於如濃鹽酸-乙酸之酸性條件下之反應。另一方面，於t-丁酯的情形，於對反應無不良影響的適當溶媒(二氯甲烷等)中，使數莫耳~大量過剩的三氟乙酸作用。反應溫度係0℃~室溫為較佳，反應時間係1小時~1日為較佳。化合物7至10、8至11亦同樣地進行。
步驟8
化合物9至12之醯胺化步驟係於對反應無不良影響的適當溶媒(二氯甲烷等)中，於1-乙基3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺等之縮合劑，添加HOBt(1-羥基苯并三唑)等之酸性之添加劑亦可能實施，較佳為使用1莫耳~數莫耳之六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻、數莫耳~大量過剩莫耳之三乙胺等之鹼、數莫耳~大量過剩莫耳之氯化銨等之氮源來實施。反應溫度為0℃~40℃左右、反應時間為數小時~數日左右下進行。又，依基質，使用草醯氯等而調整酸氯化物後，亦可以於反應系統中添加氨水之類的簡便方法來合成。溶媒係對反應無不良影響，且易與水混和者(四氫呋喃或乙腈、二烷等)為較佳。反應溫度為0℃~60℃左右下進行。反應時間為30分鐘~數日，30分鐘~數小時為較佳。另一方面，未使酯水解，並與氨/甲醇溶液或氨水於封管中加以過熱亦可合成。反應溫度係60℃~100℃、反應時間係半日~數日下進行。化合物10至13、11至14之步驟亦同樣地進行。
步驟9
化合物14至15之氰基化步驟亦可使三光氣或五氯化磷等之脫水劑作用來進行，但記載於Tetrahedron Letter，No.21，pp1813-1816，1977之使用三氟乙酸酐的方法為較佳。於對反應無不良影響的溶媒(二氯乙烷等)中，使用1莫耳~過剩莫耳之三氟乙酸酐、1莫耳~過剩莫耳之三乙胺等之鹼。或，亦可於溶媒兼鹼之吡啶中進行反應。反應溫度係0℃~40℃為較佳，反應時間係30分鐘~數日為較佳。
[製造法2]
由不具有硝基的苯甲酸可以如以下方法合成。進行環化反應的時機依化合物而異。氮源係可利用苄基胺、烯丙胺、疊氮化物、氨等(簡圖中，R、R2、R3、R4、X1、X2與上述相同)。
步驟10
化合物18至20之N原子之導入步驟係可於對反應無 不良影響的溶媒(N,N-二甲基甲醯胺等)中，使1莫耳~數莫耳之p-甲氧基苄基胺類作用來進行。選擇p-甲氧基苄基胺、烯丙胺等之脫保護為容易的胺為較佳。反應溫度係於60℃~200℃，較佳為80℃~100℃。反應時間係於數小時~數日進行。亦可選擇疊氮化鈉作為其他氮源。於化合物19至21之步驟亦同樣地進行。
步驟11
化合物21至11之p-甲氧基苄基胺之脫保護之步驟係如PROTECTIVE GROUPS in Organic Synthesis記載，可於氫氣環境下使用鈀碳觸媒等的催化還原、或使用DDQ等的氧化的除去法。較佳為使用於對反應無不良影響的適當溶媒(二氯甲烷、二氯乙烷等)中，使用數莫耳~大量過剩之三氟乙酸，因應必要添加觸媒量~數莫耳之苯甲醚的方法。反應溫度係室溫~60℃、反應時間係數小時至半日左右下進行。之後，變化為羧酸、以及取代反應係與步驟6及步驟7同樣地進行。
使用烯丙胺的情形，如PROTECTIVE GROUPS in Organic Synthesis記載，可使用利用烯丙基之異構化的方法來進行。較佳為，於醇溶液中，使用10~100wt%之鈀碳觸媒，使1莫耳~大量過剩莫耳之甲烷磺酸或三氟乙酸共存。反應溫度係於室溫~100℃，60~80℃為較佳。反應時間係數小時~1日來進行。之後，變化為羧酸、以及取代反應係與步驟6及步驟7同樣地進行。
[製造法3]
喹啉環之9位為氫原子的化合物，亦可利用相當的苯 甲酸，但以如下的還原地除去鹵素原子的方法，可簡便地合成(簡圖中，R表示酯基、羧基、胺甲醯基、腈基，R2、R3、R4、X1、X2與上述同義)。
步驟12
化合物22至23之還原反應係使用對反應無不良惡影響的適當溶媒(含二氯乙烷、甲醇、乙醇、BHT等之抗氧化劑的四氫呋喃等)來進行。較佳為使用非質子性溶媒與醇之混合溶媒。鈀碳等之觸媒使用10~100wt%，較佳為30~50wt%左右，於氫氣環境下進行。反應溫度係於0~40℃，但室溫為較佳。反應時間係於數小時~數日下進行。
[製造法4]
啶型之化合物係由如以下的溴化中間體25，可以上述之「製造法2」相同的順序來合成。
步驟13
化合物24至25之溴化反應係於對反應無不良影響的適當溶媒(四氫呋喃或二乙基醚等)中，使2莫耳以上之甲基鋰或正丁基鋰等適當鹼作用後，使用1莫耳~大量過剩 莫耳之溴源(1,2-二溴四氯乙烷或苯基三甲基銨三溴化物等)，較佳使用數莫耳左右來實施。反應溫度係-100℃~室溫左右，反應時間係30分鐘~6小時下進行。
[製造法5]
前述烯胺4係可參考如文獻(Synthesis，(7)，1162-1170，2006(A法)或Europian Journal Organic Chemistry(3)505-511,2005(B法))已知的方法來合成。
方法A
方法B
就本發明所使用的抗DR5抗體而言，可舉例hTRA8。關於hTRA8之生產法，已記載於WO01/083560。hTRA8之重鏈序列係由序列識別號1所示的胺基酸序列之第1~449號的胺基酸殘基或第1~448號的胺基酸殘基而成。又，hTRA8之輕鏈序列係由序列識別號2所示的胺基酸序列之第1~213號的胺基酸殘基而成。又，序列表記載之序列識別號1之胺基酸序列之第1~118號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於hTRA8之重鏈可變區，序列表記載之序列識別號2之胺基酸序列之第1~107號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於hTRA8之輕鏈可變區。具有此等可變區及任意的恆定區的抗體亦可於本發明中使用。
就本發明所使用的其他抗DR5抗體而言，可舉例hB273。關於hB273之生產法，已記載於WO12/0577288。hB273之重鏈序列係由序列識別號3所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成。又，hB273之輕鏈序列係由序列識別號4所示的胺基酸序列之第1~219號的胺基酸殘基而成。又，序列表記載之序列識別號3之胺基酸序列之第1~122號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於hB273之重鏈可變區，序列表記載之序列識別號4之胺基酸序列之第1~114號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於hB273之輕鏈可變區。本發明亦可使用具有此等可變區及任意恆定區的抗體。
就本發明所使用的其他抗DR5抗體而言，又可舉例可那木單抗。可那木單抗係以WHO Drug Information，Vol.22，No.2，2008，p129-130記載的輕鏈、及重鏈之胺基酸序列為基礎，可以例如WO12/0577288記載之方法來生產。可那木單抗之重鏈序列係由序列識別號5所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成。又，可那木單抗之輕鏈序列係由序列識別號6所示的胺基酸序列之第1~215號的胺基酸殘基而成。又，序列表記載之序列識別號5之胺基酸序列之第1~122號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列相當於可那木單抗之重鏈可變區，序列表記載之序列識別號6之胺基酸序列之第1~110號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列相當於可那木單抗之輕鏈可變區。本發明亦 可使用具有此等之可變區及任意之恆定區的抗體。
本發明可使用的抗DR5抗體並未限於上述之三種抗體，只要對DR5表現細胞具有誘導細胞凋亡的機能，即可提供於與GSK3抑制劑之併用。例如，WO98/51793、WO2001/83560、WO2002/94880、WO2003/54216、WO2006/83971、WO2007/22157、WO11/039126或WO11/1098520已記載對DR5表現細胞誘導細胞凋亡的抗DR5抗體。又，稱為來沙木單抗(Lexatumumab)(HGS-ETR2)、HGS-TR2J、托利單抗(Drozitumab)(APOMAB)、LBY135、TAS266的抗DR5抗體亦可於本發明中使用。
托利單抗可基於WHO Drug Information，Vol.25，No.1，2011，p55-56記載的輕鏈、及重鏈之胺基酸序列來生產。托利單抗之重鏈序列係由序列識別號7所示的胺基酸序列之第1~451號的胺基酸殘基或第1~450號的胺基酸殘基而成。又，托利單抗之輕鏈序列係由序列識別號8所示的胺基酸序列之第1~213號的胺基酸殘基而成。又，序列表記載之序列識別號7之胺基酸序列之第1~121號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於托利單抗之重鏈可變區，序列表記載之序列識別號8之胺基酸序列之第1~113號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於托利單抗之輕鏈可變區。本發明中亦可使用具有此等之可變區及任意之恆定區的抗體。
來沙木單抗係可基於WHO Drug Information，Vol.21，No.1，2007，p69-70記載的輕鏈、及重鏈之 胺基酸序列，而加以生產。來沙木單抗之重鏈序列係由序列識別號9所示的胺基酸序列之第1~451號的胺基酸殘基或第1~450號的胺基酸殘基而成。又，來沙木單抗之輕鏈序列係由序列識別號10所示的胺基酸序列之第l~214號的胺基酸殘基而成。又，序列表記載之序列識別號9之胺基酸序列之第1~121號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於來沙木單抗之重鏈可變區，序列表記載之序列識別號10之胺基酸序列之第1~114號的胺基酸殘基而成的胺基酸序列係相當於來沙木單抗之輕鏈可變區。本發明可使用具有此等之可變區及任意恆定區的抗體。
又，本發明亦可使用保有上述任一者之抗體之互補決定區(CDR：Complemetarity deterring region)的抗體。CDR亦稱為高度可變區(hypervariable domain)，於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，係一次構造之變異性為特高的部位，於重鏈及輕鏈之多胜肽鏈之一次構造上，各自分離為3處。此等之部位係於立體構造上相互接近，且決定對結合的抗原的特異性。因此，例如具有hTRA8之重鏈及輕鏈上共計6處的CDR之組合的抗體亦可於本發明中使用，hB273等之其他抗DR5抗體亦相同。
於適當宿主細胞中導入編碼上述之抗DR5抗體之重鏈序列及輕鏈序列的基因而生產抗體的情形，可組合適當宿主細胞與表現載體來使用。將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因可被插入相同的表現載體，又亦可被插入各別的表現載體。使用真核細胞 作為宿主細胞的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。就動物細胞而言，可舉例(1)哺乳類細胞、例如，猴細胞COS細胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)或FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)，但未限定於此等之動物細胞。又，使用原核細胞的情形，例如，可舉例大腸菌、枯草桿菌。於此等細胞藉由轉形導入作為目的的抗體基因，藉由將經轉形細胞於活體外培養而可獲得抗體。於以上之培養法，有抗體的產量相異的情形，自抗體生產細胞中以產量為指標而選出作為醫藥之生產為容易者係可能的。
已知哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺欠(Journal of Chromatography A，705：129-134(1995))。又，已知相同重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸的2個胺基酸殘基缺失，位於新羧基末端的脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry，360：75-83(2007))。然而，此等之重鏈序列之缺失及修飾並不會影響抗體之抗原結合能力及效應劑(effector)機能(補體的活性化或抗體依存性細胞毒性作用等)。因此，於前述之重鏈羧基末端具有上述缺失或修飾的各種抗DR5抗體亦可於本發明使用。又，本發明之抗體可為具有抗體之抗原結合部位的抗體功能性片段(抗原結合片段)或 其修飾物。抗體以木瓜酶、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素加以處理，或者抗體基因藉由基因工程手法改變而使於適當培養細胞表現，可獲得該抗體之片段。此類抗體片段中，保持抗體全長分子所具有之機能的全部或一部分的片段可稱為抗體之功能性片段。就抗體之機能而言，一般可舉例抗原結合活性、中和抗原活性之活性、增強抗原活性之活性、抗體依存性細胞毒性、補體依存性細胞毒性及補體依存性細胞性細胞毒性。本發明中的抗體之功能性片段保持的機能係對DR5的結合活性，較佳為對細胞誘導細胞凋亡的活性，更佳為藉由對癌細胞的細胞凋亡之誘導的細胞毒性。惟，本發明之抗體除了對細胞誘導細胞凋亡的活性之外，可合併具有抗體依存性細胞毒性、補體依存性細胞毒性及/或補體依存性細胞性細胞毒性。
例如，就抗體之片段而言，可舉例Fab、F(ab’)2、Fv、或重鏈及輕鏈之Fv以適當連結物連結的單鏈Fv(scFv)、雙體(diabodies)、線狀抗體、及抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之片段。
於本發明，GSK3抑制劑與抗DR5抗體係「組合而被投與的醫藥」，係指假設GSK3抑制劑與抗DR5抗體被組合而投與的醫藥。
於本發明，GSK3抑制劑與抗DR5抗體係「組合而被投與」，係指於某一定期間，被投與對象將GSK3 抑制劑與抗DR5抗體攝入其體內。可投與GSK3抑制劑與抗DR5抗體含於單一製劑中的製劑，又，可彼此各別經製劑化，而被各別投與。各別製劑化的情形，其投與的時期並未特別限定，可同時投與，亦可隔一段時間之相異時間、或於相異日被投與。GSK3抑制劑與抗DR5抗體係於彼此相異的時間或日被投與的情形，其投與的順序並未特別限定。通常，各自之製劑係依據各自的投與方法而被投與，彼等之投與有成為相同次數的情形，亦有成為相異次數的情形。又，各自被分別製劑化的情形，各製劑之投與方法(投與路徑)可以相同亦可以相異投與方法(投與路徑)而被投與。又，GSK3抑制劑與抗DR5抗體並無同時存於體內的必要，可於某一定期間(例如，一個月，較佳為1週，更佳為數日，又更佳為1日)之間被攝入體內為宜，任一者之投與時另一有效成分已自體內消失亦可。
若例示本發明之醫藥之投與形態，例如，可舉出1)含GSK3抑制劑與抗DR5抗體的單一製劑之投與、2)將GSK3抑制劑與抗DR5抗體各別製劑化而獲得的2種之製劑以相同投與路徑之同時投與、3)將GSK3抑制劑與抗DR5抗體各別製劑化而獲得的2種之製劑以相同投與路徑隔著時間差之投與、4)將GSK3抑制劑與抗DR5抗體各別製劑化而獲得的2種之製劑以相異投與路徑之同時投與、5)將GSK3抑制劑與抗DR5抗體各別製劑化而獲得的2種之製劑以相異投與路徑隔著時間差之投與等。
於本發明，作成2種相異製劑的情形，亦可作 成含有彼等的套組。
本發明之醫藥係含有GSK3抑制劑及/或抗DR5抗體與藥學上可容許的載劑，可作成靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射等之各種注射劑，或者藉由經口投與或經皮投與等之各種方法來投與。藥學上可容許的載劑係指與將本發明之化合物或含本發明之化合物的組成物由某器官或臟器輸送至其他器官或臟器有關的藥學上可容許的材料(例如，賦形劑、稀釋劑、添加劑、溶媒等)。
就製劑之調製方法而言，可因應投與法而選擇適當的製劑(例如，經口劑或注射劑)，以通常使用的各種製劑之調製法來調製。就經口劑而言，例如，可例示錠劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、片劑(troche)、溶液劑、糖漿劑、酏劑、乳劑、或者油性或水性之懸浮液等。經口投與的情形，可為游離體本身，亦可為鹽的型式。水性製劑係可與藥學上可容許的酸形成酸加成物，或作成鈉等之鹼金屬鹽來調製。注射劑之情形，製劑中亦可使用安定劑、防腐劑或溶解輔助劑等。亦可為將含此等輔助劑等的溶液收納於容器後，藉由冷凍乾燥等而作成固形製劑而成為使用時調製的製劑。又，可將一次投與量收納於一個容器，又亦可將複數次投與量收納於一個容器。
就固形製劑而言，例如，可舉例錠劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、或片劑。此等之固形製劑於含有本發明之化合物的同時亦可含有藥學上可容許的添 加物。就添加物而言，例如，可舉例填充劑類、增量劑類、結合劑類、崩壞劑類、溶解促進劑類、濕潤劑類或潤滑劑類，可因應必要選擇此等而混合，並且製劑化。
就液體製劑而言，例如，可舉例溶液劑、糖漿劑、酏劑、乳劑、或懸浮劑。就添加物而言，例如，可舉例懸浮化劑或乳化劑，可因應必要選擇此等而混合，並且製劑化。
本發明可使用於哺乳類之癌治療，尤其是人類。本發明之醫藥的投與量及投與間隔可依疾病的部位、患者的身高、體重、性別或病歴，根據醫師之判斷而適宜選擇。將本發明之醫藥投與人類的情形，投與量之範圍，每一種類的有效成分，係每1日約0.01mg/kg體重~約500mg/kg體重，較佳為約0.1mg/kg體重~約100mg/kg體重。投與人類的情形，較佳為每1日1次，或者分成2至4次投與，以適當間隔重覆投與為較佳。又，依據醫師之判斷，因應必要，每1日量亦可超過上述量。
本發明所使用的含有抗DR5抗體的醫藥組成物可含有用以變換或保持pH、浸透壓、黏度、透明度、顏色、等滲性、無菌性、安定性、溶解率、緩釋率、吸收率、滲透率之製劑用的物質。就製劑用的物質而言，可舉例以下者，但並未限定於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝劑、碳酸氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等之緩衝劑、甘露糖醇或 甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥丙基β-環糊精等之錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單糖類、二糖類等之其他碳水化物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成對離子、羥基氯苯胺、苯甲酸、水楊酸、乙基汞硫代水楊酸鈉(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、克羅西希定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶媒、甘露糖醇或山梨糖醇等之糖醇、懸浮劑、山梨醇酐酯(sorbitan ester)、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等之聚山梨醇酯、Triton®、胺丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等之安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露糖醇．山梨糖醇等之彈性增強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上之輔助劑。此等之製劑用的物質之添加量係相對於抗DR5抗體之重量，以0.01~100倍，尤其0.1~10倍添加者為較佳。製劑中之較佳醫藥組成物之組成可由本項技術領域中具通常知識者因應適用疾病、適用投與路徑等而適宜決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載劑可為液體亦可為固體。適當賦形劑或載劑可為注射用之水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或非藉由口投與所通常使用的其他物質。於載劑亦可使用中性之生理食鹽水或含血清白蛋白的生理食鹽水。醫藥組成物中可含有pH7.0-8.5之Tris緩 衝劑、pH4.0-5.5之乙酸緩衝劑、pH3.0-6.2之檸檬酸緩衝劑。又，此等緩衝劑中亦可含有山梨糖醇或其他化合物。
成為治療對象的癌症之種類只要為對GSK3抑制劑與抗DR5抗體之併用治療確認有感受性的癌即可，並未特別限定，但可舉例血液癌(白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤)、腦腫瘤、頭頸部癌、食道癌、胃癌、闌尾癌、大腸癌、肛門癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、胃腸道基質腫瘤、肺癌、肝臟癌、中皮瘤、甲狀腺癌、腎臟癌、前列腺癌、神經內分泌腫瘤、黑色素瘤、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、肌肉瘤、腎臟癌、膀胱癌或睪丸癌。
被認定為MLL(混合型白血病，mixed-lineage leukemia)基因之易位(translocation)的白血病或急性白血病等之血液癌、可見GSK3之活性化的胰臟癌、大腸癌、神經膠質瘤(Glioma)細胞、黑色素瘤等為較佳。
細胞之增殖抑制活性可使用本項技術領域中具通常知識者通常使用的增殖抑制試驗法來調查。細胞之增殖抑制活性係，例如，可藉由比較試驗藥劑之存在下或非存在下的細胞(例如，腫瘤細胞)之增殖程度來實施。增殖之程度係除了下述試驗例2至5記載的方法之外，例如，可使用測定活細胞的試驗系統來調查。就活細胞之測定方法而言，例如，可舉例[3H]-胸苷之攝入試驗、BrdU法或MTT分析等。
就細胞之細胞凋亡分析法而言，可舉例藉由電泳之染色體DNA的階梯狀條帶(DNA ladder)的確認、藉 由TUNEL染色檢測出染色體之片段化、藉由標識AnnexinV之細胞膜內的磷脂醯絲胺酸分布之變化、與細胞凋亡有關的各種凋亡蛋白酶(caspase)之表現量或活性測定。又，包含上述方法之用以檢測出細胞凋亡的各種套組已被廣泛地販售，可使用此等套組檢測出藉由GSK3抑制劑與抗DR5抗體之組合的細胞凋亡。
又，活體內的抗腫瘤活性可使用本項技術領域中具通常知識者通常使用的抗腫瘤試驗法來調查。例如，對小鼠、大鼠等移植各種腫瘤細胞，確認移植細胞存活附著後，將GSK3抑制劑及DR5抗體藉由適合的投與方法來投與，數日~數週後，比較無投與藥劑組中的腫瘤增殖與投與化合物組中的腫瘤增殖，可確認本發明之活體內之抗腫瘤活性。
本發明之醫藥亦可與其他抗腫瘤劑併用。例如，可舉例抗腫瘤抗生素、抗腫瘤性植物成分、BRM(生物學的反應性控制物質)、荷爾蒙、維生素、抗腫瘤性抗體、分子標的藥、烷基化劑、代謝拮抗劑之其他抗腫瘤劑等。
更具體而言，作為烷基化劑，例如，可列舉氮芥類(nitrogen mustard)、氮芥類N-氧化物或氯芥苯丁酸(chlorambucil)等之烷基化劑；卡波醌(carboquone)或塞替派(thiotepa)等之氮丙啶系烷基化劑；二溴甘露糖醇(dibromomannitol)或二溴半乳糖醇(dibromogalactitol)等之環氧化物系烷基化劑；卡氮芥(carmustine)、洛莫司丁(lomustinum)、司莫司汀(semustine)、尼莫司汀鹽酸鹽 (nimustine hydrochloride)、鏈脲黴素(streptozocin)、氯脲黴素(chlorozotocin)或雷莫司汀(ranimustine)等之亞硝基脲系烷基化劑；白消安(busulfanum)、英丙舒凡甲苯磺酸鹽(improsulfan tosilate)、替莫唑胺(temozolomide)或達卡巴(dacarbazine)等。
作為各種代謝拮抗劑，例如，可列舉6-巰基嘌呤、6-硫鳥糞嘌呤或硫肌苷(thioinosine)等之嘌呤代謝拮抗劑；氟尿嘧啶、替加氟(tegafur)、替加氟．尿嘧啶、卡莫氟(carmofur)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、溴尿苷(broxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)或依諾他濱(enocitabine)等之嘧啶代謝拮抗劑；甲氨蝶呤(methotrexate)或三甲曲沙(trimetrexate)等之葉酸代謝拮抗劑等。
作為抗腫瘤性抗生素，例如，可列舉絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、培洛黴素(peplomycin)、柔红黴素(daunorubicin)、阿克拉黴素(aclarubicin)、阿黴素(doxorubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、THP-阿德力黴素(adriamycin)、4’-表阿黴素(epidoxorubicin)或泛艾黴素(epirubicin)等之蒽環系(anthracycline)抗生素抗腫瘤劑；色黴素(chromomycin)A3或放線菌素(Actinomycin)D等。
作為抗腫瘤性植物成分，例如，可列舉長春地辛(vindesine)、長春新鹼(vincristine)或長春鹼(vinblastine)等之長春花生物鹼類(vinca alkaloid)；太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)等之紫杉 烷類(taxane)；或依托泊甙(etoposide)或替尼泊甙(teniposide)等之表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)類。
作為BRM，例如，可列舉腫瘤壞死因子或吲哚美辛(indomethacin)。
作為荷爾蒙，例如，可列舉氫化可的松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基氫化潑尼松(methylprednisolone)、氫化潑尼松、普拉酮(prasteronum)、貝他美沙松(betamethasone)、安西諾隆(triamcinolone)、羥甲睪丸素(oxymetholone)、諾隆(nandrolone)、美替諾隆(metenolone)、磷雌酚(fosfestrol)、乙炔雌二醇(ethinylestradiol)、氯地孕酮(chlormadinone)或甲羥孕酮(medroxyprogesterone)等。
作為維生素，例如，可列舉維生素C或維生素A等。
作為抗腫瘤性抗體、分子標的藥，可列舉曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、地諾單抗(denosmab)、貝伐單抗(bevacizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesilate)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、克唑替尼(crizotinib)等。
作為其他之抗腫瘤劑，例如，可列舉順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、它莫西芬(tamoxifen)、喜樹鹼(camptothecin)、異環磷醯 胺(ifosfamide)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、美法侖(melphalan)、L-天冬醯胺酶(L-asparaginase)、醋葡醛內酯(aceglatone)、西佐喃(sizofiran)、必醫你舒(picibanil)、丙卡巴肼(procarbazine)、哌泊溴烷(pipobroma)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、羥基脲、烏苯美司(ubenimex)或雲芝多糖(krestin)等。
本發明亦包含癌症之預防方法及/或治療方法，其特徵為投與本發明化合物或其鹽。
[實施例]
藉由以下所示實施例而具體說明本發明，但本發明並未受此等限定，此等例亦未被限定解釋為任何意義。又，於本說明書，未特別記載的試藥、溶媒及起始材料，係由市售供給源可獲得，或可由文獻周知之製法來合成。
以下呈現與本案發明有關的參考例及實施例(合成)。
實施例1
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-{[3-(吡啶2-基)丙基]胺基}-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
[(4R)-4-甲基-1,3-四氫噻唑-2-亞基]乙酸乙酯
於(2R)-2-胺基丙烷-1-硫醇(5g、39.17mmol)之乙醇溶液(50mL)中，冰浴下添加三乙胺(5.46mL、39.17mmol)及氰基乙酸乙酯(4.52g、39.17mmol)。將反應液加溫至80℃，並攪拌3日。將反應液回到室溫，以氯仿稀釋，以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗淨。以無水硫酸鈉乾燥後，以快速矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=2：1)純化，獲得呈油狀物之標題化合物(6.83g)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.12-1.28(6H,m),2.84(1H,dd,J=11.4,6.5Hz),3.33(1H,dd,J=9.9,5.7Hz),3.93-4.03(2H,m),4.08-4.18(1H,d,J=40.0Hz),4.51(1H,s),8.16(1H,brs).
ESI m/z 188(M+H)+.
(步驟2)
(1R)-7,8,9-三氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
使2,3,4,5-四氟-6-硝基-苯甲酸(20.80g、86.99mmol)懸浮於二氯甲烷(200mL)，於室溫添加草醯氯(17.51mL，200.74mmol)及N,N-二甲基甲醯胺1滴，並攪拌18小時。對減壓濃縮反應液的殘留物之乙腈(200mL)溶液，冰浴下添加[(4R)-4-甲基-1,3-四氫噻唑-2-亞基]乙酸乙酯(12.53g、66.91mmol)、二異丙基乙胺(34.97mL、200.74mmol)。加熱至90℃，攪拌4小時後，減壓濃縮反 應液。殘留物以乙酸乙酯稀釋，以10%檸檬酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗淨。以無水硫酸鈉乾燥後，以快速矽膠管柱層析(氯仿：乙酸乙酯=2：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(10.1g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.39(3H,t,J=7.1Hz),1.51(3H,d,J=6.6Hz),3.05(1H,d,J=11.5Hz),3.63(1H,dd,J=11.5,7.6Hz),4.41(2H,q,J=7.1Hz),5.74-5.81(1H,m).
(步驟3)
(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將(1R)-7,8,9-三氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(3.91g、10.07mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(50mL)，添加10%Pd-C(AD，濕重，3g)，並於氫氣環境下、室溫中攪拌30小時。濾除觸媒後，將濾液注入水中，濾取析出的固體，獲得呈固體之標題化合物(2.79g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.43(3H,t,J=7.1Hz),1.44(3H,d,J=6.6Hz),2.95(1H,d,J=11.5Hz),3.55(1H,dd,J=11.5,7.7Hz),4.39-4.49(2H,m),5.68-5.75(1H,m),7.00(2H,s).
(步驟4)
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-{[3-(吡啶2-基)丙基]胺基}-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(2.79g、7.79mmol)溶解於二甲亞碸(50mL)，添加3-(2-吡啶基)丙胺(4.88g、23.36mmol)、三乙胺(7.60mL，54.50mmol)，並於120℃攪拌8小時、於90℃攪拌15小時。反應液以氯仿稀釋，以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。減壓餾除溶媒後，以快速矽膠管柱層析(1%甲醇/氯仿→2%)純化，獲得呈油狀物之標題化合物(3.8g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.39(3H,d,J=6.1Hz),1.42(3H,t,J=7.1Hz),2.04-2.12(2H,m),2.87-2.93(3H,m),3.45-3.56(3H,m),4.39-4.47(2H,m),4.53(1H,br s),5.64-5.74(1H,m),6.74(2H,br s),7.11-7.18(2H,m),7.61(1H,td,J=7.6,1.9Hz),8.51-8.57(1H,m).
(步驟5)
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-{[3-(吡啶2-基)丙基]胺基}-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
將(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-{[3-(吡啶2-基)丙基]胺基}-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(3.80g、8.01mmol)溶解於乙醇(50mL)，並滴加1M氫氧化鈉水溶液(48.05mL，48.05mmol)。反應液加熱至60℃，攪拌2.5小時。減壓餾除大部分之乙醇後，於反應液中添加1M鹽酸水(50mL)、飽和碳酸氫鈉水，以10%甲醇/氯仿萃取。減壓濃縮後，殘留物以二乙基醚、二氯甲烷之混合液加以固體化，濾取並獲得呈固體之標題化合物(0.59g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.40(3H,d,J=6.7Hz),2.08-2.15(2H,m),2.88-3.00(3H,m),3.52-3.63(3H,m),5.01(1H,br s),5.72-5.78(1H,m),6.49(2H,br s),7.13-7.18(2H,m),7.62(1H,td,J=7.6,1.8Hz),8.55(1H,d,J=4.3Hz).
HRESIMS計算值C21H20F2N4O3S+H 447.13024，實測值447.12693.
實施例2
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-(甲胺基)-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-(甲胺基)-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將實施例1之步驟3獲得的(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(300mg、0.84mmol)溶解於二甲亞碸(20mL)，添加甲胺鹽酸鹽(452mg、6.70mmol)、三乙胺(254mg，2.51mmol)，並於100℃攪拌19小時。反應液以乙酸乙酯稀釋，以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。減壓餾除溶媒後，殘留物以二乙基醚洗淨，獲得呈固體之標題化合物(288mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.36-1.45(6H,m),2.88(1H,d,J=11.5Hz),3.12-3.18(3H,m),3.49(1H,dd,J=11.5,7.7Hz),4.06(1H,br s),4.36-4.51(2H,m),5.66-5.72(1H,m),6.76(2H,br s).
(步驟2)
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-(甲胺基)-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
將(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-(甲胺基)-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(288mg、0.78mmol)溶解於二甲亞碸(5mL)，滴加1M氫氧 化鈉水溶液(4.0mL，4.0mmol)。反應液加熱至60℃，並攪拌2小時。減壓餾除大部分之乙醇後，添加1N鹽酸水(4mL)，並以10%甲醇/氯仿萃取。減壓濃縮後，殘留物以二乙基醚、乙醇之混合液加以固體化，濾取而獲得呈固體之標題化合物(70mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.30(3H,d,J=6.1Hz),3.00-3.11(3H,m),3.14(1H,d,J=11.7Hz),3.58(1H,dd,J=11.7,7.7Hz),5.67-5.81(1H,m),6.38(1H,br s),7.18(2H,br s).
HRESIMS計算值C14H13F2N3O3S+H 342.07239，實測值342.06854.
實施例3
(1R)-6-胺基-8-{[(2S)-1,4-二烷-2-基甲基]胺基}-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
於實施例1之步驟3獲得的(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(50mg、0.14mmol)之二甲亞碸溶液(1ml)中添加1-[(2S)-1,4-二烷-2-基]甲胺(49mg、0.42mmol)及三乙胺(58μl，0.42mmol)，並於100度攪拌一晚。以乙酸乙酯稀釋後，以水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(乙酸乙酯-己烷系)純化，並獲 得固體。於獲得的固體(55mg)之乙醇懸浮液(1.5ml)中添加1M氫氧化鈉水溶液(780μl，0.78mmol)，並於60度攪拌4小時。以1M鹽酸中和，添加飽和碳酸氫鈉水並以含有10%甲醇的氯仿萃取，減壓餾除溶媒。添加乙酸乙酯，濾取析出物，獲得呈固體之標題化合物(38mg、69%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.30(3H,d,J=5.7Hz),3.15(1H,d,J=11.5Hz),3.25(1H,dd,J=11.5,9.7Hz),3.33-3.77(9H,m),5.71-5.78(1H,m),6.26(1H,br s),7.23(2H,br s).
MS(ESI)m/z：428[M+H]+.
實施例4
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(1R)-6-胺基-8-{[(1-tert-丁氧基羰基)哌啶-4-基]胺基}-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將實施例1之步驟3獲得的(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(100mg、0.28mmol)、4-胺基-1-tert-丁氧基羰基哌啶(190mg、0.95mmol)、N-甲基吡咯啶酮(1ml)之混 合物於100℃攪拌11小時。反應混合物分配於乙酸乙酯-飽和碳酸氫鈉水，有機層以飽和食鹽水洗淨2次，並以硫酸鎂乾燥。減壓餾除溶媒，殘留物以矽膠層析(己烷：乙酸乙酯=8：2→2：8)純化，獲得呈固體之標題化合物(145mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.38-1.44(10H,m),1.47(9H,s),2.83-2.96(3H,m),3.50(1H,dd,J=11.2,7.6Hz),3.76-3.85(2H,m),4.03-4.10(2H,m),4.39-4.47(2H,m),5.65-5.72(1H,m),6.79(1H,br s).
(步驟2)
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-(哌啶-4-基胺基)-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將(1R)-6-胺基-8-{[(1-tert-丁氧基羰基)哌啶-4-基]胺基}-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(140mg)溶解於二氯甲烷(1ml)，冰冷下添加三氟乙酸(2ml)，於室溫攪拌30分鐘。減壓餾除溶媒，獲得呈固體之標題化合物(155mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.26(3H,t,J=7.0Hz),1.30(3H,d,J=6.4Hz),1.65-1.75(2H,m),2.00-2.06(2H,m),2.93-3.03(2H,m),3.11(1H,d,J=11.4Hz),3.29-3.36(2H,m),3.55(1H,dd,J=11.4,7.3Hz),3.77-3.86(1H, m),4.20(2H,q,J=7.0Hz),5.56-5.77(3H,m),8.21-8.31(1H,m),8.52-8.59(1H,m).
(步驟3)
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
將(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-(哌啶-4-基胺基)-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(56mg、0.13mmol)溶解於二氯甲烷(1ml)，冰冷下，添加三乙胺(27μl)、乙醯氯(12μl)，並於同溫攪拌0.5小時。將反應混合物分配於乙酸乙酯-飽和碳酸氫鈉水，有機層以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿：甲醇=19：1)純化，並獲得固體。
將上述獲得的固體(40mg、0.08mmol)溶解於四氫呋喃(0.5ml)-乙醇(0.5ml)，添加1M氫氧化鈉水溶液(0.29ml)，並於60℃攪拌8小時。將反應混合物放冷後，冰冷下添加1M鹽酸(0.3ml)後，分配於乙酸乙酯-飽和食鹽水。有機層以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒，獲得呈固體之標題化合物(25mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.37-1.44(2H,m),1.41(3H,d,J=6.3Hz),2.12-2.20(2H,m),2.13(3H,s),2.74-2.83(1H,m),2.98(1H,d,J=11.5Hz),3.16-3.25(1H,m),3.58 (1H,dd,J=11.5,7.8Hz),3.83-4.09(3H,m),4.60(1H,d,J=12.9Hz),5.71-5.79(1H,m),6.54(2H,br s).
實施例5
(1R)-8-{[(3S)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
於實施例1之步驟3獲得的(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(11.27g)之乙醇(50ml)懸浮液中，於65℃加熱下歷經10分鐘滴加1M氫氧化鈉水溶液(33.5ml)。於同溫度攪拌50分鐘後，冷卻至室溫。於反應液中添加乙酸(1.92ml)並於室溫中攪拌，濾取析出的固體並以水洗淨。以真空泵一邊加熱至40℃一邊乾燥，獲得呈固體之含莫耳純度7/10左右之目標羧酸體的混合物(3.75g)。本中間體不再純化而使用於下一反應。
ESI-MS m/z：331(M+H)+.
(步驟2)
(1R)-8-{[(3S)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并 [3,2-a]喹啉-4-甲酸
將前步驟獲得的固體(200mg)、1-[(3S)-3-胺基-1-哌啶基]乙酮(175mg、1.23mmol)及二異丙基乙胺(200μl、1.15mmol)溶解於二甲亞碸(3.0ml)，並於100℃攪拌2日。反應液以乙酸乙酯稀釋，以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。餾除溶媒後，加以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：1)，獲得呈固體之標題化合物(93mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.37-1.43(3H,m),1.53-1.86(3H,m),2.00-2.20(4H,m),2.96(1H,t,J=11.4Hz),3.18-3.66(3.7H,m),3.79-4.07(2.3H,m),4.14-4.36(1H,m),5.66-5.82(1H,m),6.31-6.76(2H,br).
MS(ESI)m/z：453(M+H)+.
實施例6
(1R)-8-{[(3R)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
使用實施例5之步驟1獲得的固體及1-[(3R)-3-胺基-1-哌啶基]乙酮，藉由與實施例5之步驟2同樣之方法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.41(3H,d,J=6.0Hz),1.51-1.71(2H,m),1.71-1.89(1H,m),2.05-2.19(4H,m),2.97(1H,t,J=11.2Hz),3.13-3.40(2H,m),3.48-3.66(1.5H,m),3.78-4.01(2H,m),4.08-4.32(1.5H,m),5.65-5.84(1H,m),6.32-6.78(2H,m).
MS(ESI)m/z：453(M+H)+.
實施例7
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-8-{[(3R)-1-(甲基磺醯基)哌啶-3-基]胺基}-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
使用實施例5之步驟1獲得的固體及(3R)-1-(甲基磺醯基)哌啶-3-基胺，藉由與實施例5之步驟2同樣之方法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：-4.45(1H,s),1.40(3H,d,J=6.3Hz),1.66-1.81(2H,m),1.82-2.00(2H,m),2.82(3H,s),2.96(1H,d,J=11.2Hz),3.15-3.27(2H,m),3.28-3.38(1H,m),3.46-3.65(2H,m),4.04-4.16(1H,m),4.43-4.54(1H,m),5.70-5.81(1H,m),6.36-6.68(2H,br).
MS(ESI)m/z：489(M+H)+.
實施例8
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉 -4-甲酸
(步驟1)
(1R)-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
使3-氯-2,4,5-三氟-6-硝基-苯甲酸(6.24g、24.4mmol)懸浮於二氯甲烷(80ml)，添加N,N-二甲基甲醯胺2滴，並於室溫歷經20分鐘滴加草醯氯(4.26ml、48.8mmol)。室溫中攪拌2小時後，減壓濃縮，與甲苯共沸，獲得呈殘留物之油狀物。將上述殘留物之一部分(4.76g)溶解於四氫呋喃(60ml)，冰冷下滴加實施例1之步驟1獲得的[(4R)-4-甲基-1,3-四氫噻唑-2-亞基]乙酸乙基酯(2.50g、13.4mmol)之四氫呋喃溶液(10ml)。於室溫攪拌1小時後，於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水，以乙酸乙酯萃取。有機層以飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，減壓餾除溶媒，以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=4：1)粗製純化，獲得油狀物(4.14g)。將上述油狀物溶解於四氫呋喃(50mL)，冰浴下，添加氫化鈉(55%於油，390mg、9.75mmol)。於室溫攪拌45分鐘後，冰浴下，於反應液中添加10%檸檬酸水溶液，並以乙酸乙酯萃取。有機層以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，餾除溶媒，以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=1：1)純化。獲得的固體以乙酸乙酯洗淨，濾取，獲得呈 固體之標題化合物(1.74g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.24-1.45(6H,m),3.01(1H,d,J=11.4Hz),3.59(1H,dd,J=10.5,7.3Hz),4.38-4.44(2H,m),6.72-6.78(1H,m).
(步驟2)
(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
(1R)-6-胺基-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將(1R)-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(1.74g、4.30mmol)溶解於四氫呋喃(30ml)及N,N-二甲基甲醯胺(15ml)之混合液，並添加5%鈀碳(AD，濕重、870mg)，氫氣環境下，室溫中攪拌6小時。觸媒一邊以乙酸乙酯洗淨一邊濾除，獲得的濾液以水洗淨2次、以飽和食鹽水洗淨1次，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，餾除溶媒而以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=1：1→乙酸乙酯)純化，各自獲得呈固體之低極性成分之標題9-氯體(1.15g)、高極性成分之標題9-氫體(174mg)。
9-氯體
1H-NMR(CDCl3)δ：1.23(3H,d,J=6.0Hz),1.42(3H,t,J=6.9Hz),2.90(1H,d,J=11.0Hz),3.53(1H, dd,J=11.0,6.9Hz),4.40-4.47(2H,m),6.66-6.72(1H,m).
9-H體
1H-NMR(CDCl3)δ：1.43(3H,t,J=7.3Hz),1.50(3H,d,J=6.4Hz),2.94(1H,d,J=10.1Hz),3.56(1H,dd,J=10.5,7.8Hz),4.45(2H,q,J=7.0Hz),5.02-5.09(1H,m),6.19(1H,dd,J=11.7,6.6Hz).
(步驟3)
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
於(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(251mg)之二甲亞碸(2.0mL)溶液中，添加1-乙醯基-4-胺基哌啶(300mg)，並於65℃攪拌2日。減壓下餾除溶媒後，於殘渣中添加二氯甲烷、飽和氯化鈉水溶液。以二氯甲烷萃取二次，合併的有機層以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，殘渣以矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇=50：1→30：1)純化，獲得呈固體之目標物(327mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.11(3H,d,J=6.4Hz),1.31-1.53(5H,m),1.97-2.23(5H,m),2.74-2.91(2H,m),3.12-3.27(1H,m),3.49(1H,dd,J=11.4,6.9Hz), 3.75-3.89(1H,m),3.89-4.02(1H,m),4.28-4.36(1H,m),4.38-4.48(2H,m),4.48-4.58(1H,m),6.37-6.47(1H,m),6.70-7.20(2H,br).
(步驟4)
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
於(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(327mg)之四氫呋喃(5.0mL)溶液中，添加10%鈀碳觸媒(AD，濕重，118mg)，並於氫氣環境下攪拌4小時。添加乙醇(2.5mL)，氫氣環境下攪拌5小時後，使用矽藻土製品(Celite)過濾分離觸媒。減壓下濃縮濾液，殘渣以矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇=50：1→5：1)純化，獲得呈固體之目標物(246mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.07-1.65(8H,m),1.92-2.60(5H,m),2.63-2.80(1H,m),2.86-3.06(1H,m),3.06-4.01(4H,m),4.26-4.72(4H,m),6.14-6.88(4H,m).
(步驟5)
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
於(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(246mg)之乙醇(50mL)溶液中，添加1M氫氧化鈉水溶液(1595μL)，並於70℃攪拌3小時。於反應液中添加1M鹽酸(1600μL)並中和後，添加二氯甲烷、飽和氯化鈉水溶液。以二氯甲烷萃取，合併的有機層以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，殘渣以矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇=50：1→25：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(128mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.39-1.71(5H,m),2.01-2.26(5H,m),2.88-3.05(2H,m),3.22-3.36(1H,m),3.55-3.74(2H,m),3.80-3.93(1H,m),4.36-4.55(2H,m),5.09-5.28(1H,m),5.69-5.82(1H,m),6.30-6.57(2H,br).
MS(ESI)m/z：435(M+H)+.
實施例9
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(1R)-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
於實施例8之步驟2獲得的(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(257mg)之二甲亞碸(2mL)溶液中，添加4-胺基-1-甲基哌啶(261μL)，並於65℃攪拌28小時。減壓下餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇=50：1→30：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(322mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.10(3H,d,J=6.4Hz),1.41(3H,t,J=7.1Hz),1.45-1.67(2H,m),1.92-2.05(1H,m),2.05-2.22(3H,m),2.30(3H,s),2.70-2.89(3H,m),3.48(1H,dd,J=11.0,6.9Hz),3.67-3.82(1H,m),4.29-4.50(3H,m),6.38-6.48(1H,m),6.67-7.16(2H,br).
(步驟2)
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
於(1R)-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(322mg)之THF(5.0mL)溶液中，添加10%鈀碳觸媒(113mg)，並於氫氣環境下攪拌4小時。添加乙醇 (2.5mL)，並於氫氣環境下攪拌4.5小時後，添加乙酸(200μL)，並於氫氣環境下攪拌6小時。使用矽藻土製品過濾分離觸媒，減壓下濃縮濾液。殘渣以矽膠管柱(僅二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇=10：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(280mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.43(3H,t,J=7.1Hz),1.49(3H,d,J=6.6Hz),1.55-1.69(2H,m),2.00-2.12(2H,m),2.13-2.25(2H,m),2.32(3H,s),2.74-2.86(2H,m),2.89(1H,d,J=11.2Hz),3.27-3.41(1H,m),3.54(1H,dd,J=11.4,7.7Hz),4.18-4.28(1H,m),4.37-4.50(2H,m),5.02-5.14(1H,m),5.63(1H,d,J=6.6Hz),6.62-6.98(2H,br).
(步驟3)
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸
於(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(280mg)之乙醇(50mL)溶液中，添加1M氫氧化鈉水溶液(1933μL)，並於70℃攪拌3小時。於反應液中添加1M鹽酸(1933μL)並中和後，添加二氯甲烷、飽和氯化鈉水溶液。以二氯甲烷萃取，合併的有機層以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，殘渣以矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇 =100：1→30：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(225mg)。
1H-NMR(CD3OD)δ：1.42(3H,d,J=6.4Hz),1.56-1.76(2H,m),1.99-2.12(2H,m),2.23-2.38(5H,m),2.86-2.98(2H,m),3.11(1H,d,J=11.4Hz),3.46-3.80(2H,m),5.35-5.51(1H,m),5.98(1H,d,J=6.4Hz).
MS(ESI)m/z：407(M+H)+.
實施例10
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例8之步驟5獲得的(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸(106mg)之二氯甲烷(4.0mL)溶液中，添加氯化銨(123mg)、六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻(183mg)、三乙胺(367μL)，並於室溫中攪拌5日。於反應液中，添加二氯甲烷、飽和氯化鈉水溶液。以二氯甲烷萃取，合併的有機層以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，殘渣以矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇=50：1→15：1)及矽膠管柱(乙酸乙酯：甲醇=50：1→15：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(74mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.41-1.63(5H,m),2.06-2.18(5H,m),2.87(1H,d,J=11.2Hz),2.91-3.02(1H,m), 3.19-3.33(1H,m),3.45-3.65(2H,m),3.80-3.91(1H,m),4.23-4.31(1H,m),4.42-4.52(1H,m),5.03-5.14(1H,m),5.52-5.61(1H,m),5.72(1H,d,J=6.6Hz),6.54-6.95(2H,m),10.02(1H,d,J=5.1Hz).
MS(ESI)m/z：434(M+H)+.
實施例11
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例9之步驟3獲得的(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫-5H-[1,3]噻唑并[3,2-a]喹啉-4-甲酸(123mg)之二氯甲烷(5.0mL)懸浮液中，添加氯化銨(165mg)、六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻(236mg)、三乙胺(485μL)，室溫中攪拌3日。於反應液中添加二氯甲烷、飽和氯化鈉水溶液。以二氯甲烷萃取，合併的有機層以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，殘渣以NH矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇=100：1→50：1)及NH矽膠管柱(乙酸乙酯：甲醇=20：1→15：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(74mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.48(3H,d,J=6.3Hz),1.56-1.76(2H,m),2.00-2.12(4H,m),2.14-2.26(2H,m),2.32(3H,s),2.76-2.86(2H,m),2.86(1H,d,J=11.2Hz),3.30-3.42(1H,m),3.48(1H,dd,J=11.2,7.8Hz), 4.25-4.33(1H,m),5.03-5.13(1H,m),5.52-5.60(1H,m),5.70(1H,d,J=6.6Hz),10.04(1H,d,J=4.6Hz).
MS(ESI)m/z：406(M+H)+.
實施例12
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-{[2-(吡啶-2-基胺基)乙基]胺基}-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(4R)-4-甲基-1,2,3-氧雜四氫噻唑(oxothiazolidine)-3-甲酸 tert-丁基酯 2,2-二氧化物
於咪唑(10.7g、56.8mmol)、三乙胺(12.5ml、89.6mmol)之二氯甲烷(200ml)溶液中，於-50℃添加亞硫醯氯(3.3ml、44.8mmol)及[(R)-2-羥基-1-甲基乙基]胺基甲酸tert-丁基酯(7.0g、40mmol)之二氯甲烷(100ml)溶液，混合物於-5~0℃攪拌24小時。於反應液中添加水(300ml)後，將二層分離。有機層以飽和食鹽水(300ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，將獲得的殘餘物溶解於乙腈(200ml)。於此溶液中，冰冷下，添加過碘酸鈉(9.4g、44mmol)、氯化釕(83mg、0.4mmol)及水(200ml)，混合物於-5~0℃攪拌4小時半。於反應液中添加水(300ml)後，以二乙基醚(300ml)萃取2次。萃取液以飽和食鹽水(300ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，獲得的殘餘物藉由以n-己烷加以洗淨，獲 得呈固體之標題化合物(8.3g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.51(3H,d,J=6.3Hz),1.56(9H,s),4.20(1H,dd,J=9.2,2.8Hz),4.37-4.46(1H,m),4.67(1H,dd,J=9.0,6.1Hz).
(步驟2)
tert-丁基(5R)-2-(1-乙氧基羰基亞甲基)-5-甲基吡咯啶-1-甲酸
於乙醯乙酸乙酯(5.5g、42.1mmol)之四氫呋喃(100ml)溶液中，冰冷下，添加氫化鈉(55%於油中，1.8g，42.1mmol)，混合物於同溫下攪拌15分鐘。於反應液中添加n-丁基鋰(1.67M於n-己烷、25.7ml、42.1mmol)，混合物於同溫下攪拌15分鐘。於反應液中添加(4R)-4-甲基-1,2,3-氧雜四氫噻唑-3-甲酸 tert-丁基酯 2,2-二氧化物(5.0g、21.1mmol)，混合物於室溫中攪拌17小時。於反應液中添加6M鹽酸(17.5ml)並於室溫中攪拌1小時。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水後，以乙酸乙酯(200ml×3)萃取。萃取液以飽和食鹽水(200ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，將獲得的殘餘物加以矽膠管柱層析(200g)，藉由減壓下濃縮n-己烷：乙酸乙酯=10：1溶出部分，獲得呈固體之標題化合物(3.3g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.19-1.27(6H,m),1.53(9H,s),1.54-1.67(1H,m),1.91-2.06(1H,m), 2.87-3.01(1H,m),3.41-3.52(1H,m),4.07-4.16(2H,m),4.23-4.33(1H,m),6.47(1H,s).
(步驟3)
2-[(5R)-5-甲基吡咯啶-2-亞基]乙酸 乙酯
於tert-丁基(5R)-2-(1-乙氧基碳基亞甲基)-5-甲基吡咯啶-1-甲酸(3.3g、12.3mmol)之二氯乙烷(60ml)溶液中添加三氟乙酸(6ml)，混合物於室溫中攪拌27小時。於反應液中添加冰水，並以碳酸氫鈉中和後，將二層分離。水層以氯仿(50ml×2)萃取，合併有機層並以飽和食鹽水(50ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，將獲得的殘餘物加以矽膠管柱層析(50g)，藉由減壓下濃縮n-己烷：乙酸乙酯=7：1溶出部分，獲得呈油狀物之標題化合物(1.8g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.23(3H,d,J=6.6Hz),1.25(3H,t,J=7.3Hz),1.45-1.56(1H,m),2.07-2.16(1H,m),2.52-2.68(2H,m),3.84-3.95(1H,m),4.10(2H,q,J=7.1Hz),4.48(1H,s),7.90(1H,br s).
(步驟4)
2-[(5R)-5-甲基吡咯啶-2-亞基]-3-側氧-3-(2,3,4,5-四氟-6-硝基苯基)丙酸酯 乙酯
於2,3,4,5-四氟-6-硝基苯甲酸(3.1g、12.8mmol)之二氯甲烷(50ml)溶液中添加N,N-二甲基甲醯胺(5滴)及草醯氯(3.3ml、38.3mmol)，混合物於室溫中攪拌13小時。減壓下濃縮反應液，懸浮於甲苯(20ml)。於此懸浮液中添加2-[(5R)-5-甲基吡咯啶-2-亞基]乙酸 乙酯(1.8g、10.7mmol)之甲苯(10ml)溶液，混合物於室溫中攪拌30分鐘。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水(50ml)後，以乙酸 乙酯(50ml×3)萃取。萃取液以飽和食鹽水(50ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，獲得的殘餘物加以矽膠管柱層析(60g)，藉由於減壓下濃縮n-己烷：乙酸 乙酯=3：1溶出部分，獲得呈油狀物之標題化合物(3.8g)，將其直接用於下一反應。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.10(3H,t,J=7.1Hz),1.39(3H,d,J=6.6Hz),1.63-1.74(1H,m),2.26-2.38(1H,m),3.24(1H,br s),3.44(1H,br s),3.95-4.08(2H,m),4.09-4.22(1H,m),11.52(1H,br s).
(步驟5)
(1R)-7,8,9-三氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
於2-[(5R)-5-甲基吡咯啶-2-亞基]-3-側氧-3-(2,3,4,5-四氟-6-硝基苯基)丙酸酯 乙酯(3.8g)之1,4- 二烷(30ml)溶液中，添加氫化鈉(55%於油中，0.53g，12.2mmol)，混合物於室溫中攪拌15小時。冰冷下，於反應液中添加10%檸檬酸水溶液後，以乙酸乙酯(30ml×3)萃取。萃取液以飽和食鹽水(30ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，將獲得的殘餘物加以矽膠管柱層析，藉由減壓下濃縮n-己烷：乙酸乙酯=1：1溶出部分，獲得呈固體之標題化合物(1.1g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.37(3H,t,J=6.8Hz),1.44(3H,d,J=6.8Hz),2.05-2.12(1H,m),2.39-2.51(1H,m),3.36-3.57(2H,m),4.37(2H,q,J=7.1Hz),5.28-5.38(1H,m).
(步驟6)
(1R)-7,8,9-三氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於(1R)-7,8,9-三氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(1.1g、3.0mmol)中添加乙酸(8ml)及鹽酸(8ml)，混合物於80℃攪拌1小時半。冷卻後，於反應液中添加冰水，藉由濾取析出物，獲得呈固體之標題化合物(0.9g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.50(3H,d,J=6.6Hz),2.20(1H,dd,J=12.8,8.7Hz),2.44-2.58(1H,m),3.54-3.67(1H,m),4.17(1H,dd,J=20.4,9.2Hz), 5.41-5.52(1H,m),14.15(1H,br s).
(步驟7)
(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於(1R)-7,8,9-三氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(0.9g、26mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(30ml)溶液中添加10%鈀碳觸媒(AD，濕重，0.2g)，混合物於氫氣環境下室溫中攪拌3日。反應液以矽藻土製品濾過後，濾液以乙酸乙酯(60ml)稀釋，依序以水(30ml×3)、飽和食鹽水(30ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，獲得的殘餘物藉由以乙醇與二乙基醚之混合溶媒洗淨，獲得呈固體之標題化合物(0.35g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.41(3H,d,J=6.3Hz),2.04-2.13(1H,m),2.35-2.48(1H,m),3.45-3.58(1H,m),4.08(1H,dd,J=20.0,9.5Hz),5.31-5.41(1H,m),6.81(2H,br s).
(步驟8)
(1R)-6-胺基-7,9-二氟-1-甲基-5-側氧-8-{[2-(吡啶2-基胺基)乙基]胺基}-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於(1R)-6-胺基-7,8,9-三氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(100mg、0.32mmol)之二甲亞碸(3ml)溶液中，添加2-(2-吡啶基胺基)乙胺2鹽酸鹽(0.2g、0.96mmol)及三乙胺(0.27mL，1.9mmol)，混合物於氮氣環境下100℃攪拌15小時。於反應液中添加冰水，並以乙酸乙酯(40ml×3)萃取。萃取液依序以水(40ml×3)、飽和食鹽水(40ml)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下餾除溶媒，獲得的殘餘物以劃分用薄層矽膠層析(氯仿：甲醇=20：1)純化。獲得的殘餘物藉由以乙酸乙酯及n-己烷之混合溶媒加以固化，獲得呈固體之標題化合物(25mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.34(3H,d,J=6.3Hz),2.00(1H,dd,J=12.7,9.0Hz),2.27-2.40(1H,m),3.38-3.50(1H,m),3.70(2H,br s),3.77(2H,br s),4.02(1H,dd,J=19.7,9.6Hz),4.69(1H,s),5.28(1H,br s),6.06(1H,s),6.44(1H,d,J=8.5Hz),6.48(2H,br s),6.63(1H,dd,J=6.8,5.1Hz),7.41(1H,td,J=7.3,2.2Hz),8.12(1H,d,J=3.9Hz).
MS(FAB)：430(M+H)+.
實施例13
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(1R)-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將3-氯-2,4,5-三氟-6-硝基-苯甲酸(39g、153mmol)懸浮於二氯甲烷(300ml)，添加草醯氯(40ml)、N,N-二甲基甲醯胺(2滴)後，攪拌17小時。減壓濃縮反應混合物，於殘留物中添加甲苯，再度減壓濃縮。再度添加甲苯，減壓餾除溶媒。
將殘留物溶解於甲苯(400ml)，冰冷下滴加實施例12之步驟3獲得的2-[(5R)-5-甲基吡咯啶-2-亞基]乙酸 乙酯(26g、154mmol)之甲苯(40ml)溶液。反應混合物於室溫攪拌1小時後，倒入飽和碳酸氫鈉水中，並以乙酸乙酯萃取。水層以乙酸乙酯萃取後，合併有機層，以硫酸鎂乾燥，減壓餾除溶媒。將殘留物溶解於丙酮(300ml)，添加碳酸鉀(26g)，並加熱回流12小時。以1M鹽酸作成弱酸性，以氯仿萃取、以飽和食鹽水洗淨，並以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(二氯甲烷：乙酸乙酯=10：0→9：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(34.6g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.35-1.39(6H,m),2.01-208(1H,m),2.41-2.51(1H,m),3.37-3.53(2H,m)，4.34-4.39(2H,m),6.17-6.25(1H,m).
(步驟2)
(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
(1R)-6-胺基-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
將(1R)-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(34.6g、89.54mmol)溶解於二氯乙烷(200ml)-乙醇(200ml)之混合溶媒，添加10%鈀碳觸媒(AD，濕重，7.6g)，並於氫氣環境下，攪拌16小時。濾除觸媒後，減壓餾除溶媒，殘留物以矽膠層析(二氯甲烷：乙酸乙酯=4：1)純化，獲得呈固體之氯體標題化合物(22.1g)。
又，氯被還原的化合物(1.15g)亦呈固體(與不純物之混合物)而獲得。此化合物不再純化而進入下一步驟。
9-Cl體
1H-NMR(CDCl3)δ：1.29(3H,d,J=6.4Hz),1.39(3H,t,J=7.1Hz),1.90-1.97(1H,m),2.33-2.43(1H,m),3.31-3.37(2H,m),4.39(2H,q,J=7.2Hz),6.14-6.22(1H,m).
9-H體
無機器數據
(步驟3)
(1R)-6-胺基-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
將(1R)-6-胺基-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(1.15g)溶解於四氫呋喃(10ml)-乙醇(5ml)，添加1M氫氧化鈉水溶液(7.1ml)，並攪拌18小時。添加乙酸(0.82ml)，攪拌後，濾取不溶物、水洗、乾燥，而獲得呈固體之標題化合物(1.05g)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.32(3H,d,J=6.4Hz),2.00(1H,dd,J=12.4,8.7Hz),2.30-2.42(1H,m),3.47-3.57(1H,m),3.83(1H,dd,J=19.3,8.7Hz),5.01-5.10(1H,m),6.97(1H,dd,J=12.4,6.4Hz),7.81(1H,br s).
(步驟4)
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於(1R)-6-胺基-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(300mg、0.88mmol)、1-甲基-哌啶-4-基胺(350mg)中添加二甲亞碸(4ml)，並於100℃攪拌3小時。將反應混合物冷卻至室溫後，減壓餾除溶媒。殘留物以NH矽膠層析(二氯甲烷：甲醇=10：0~8：2) 純化，獲得呈固體之標題化合物(254mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：143(3H,d,J=6.4Hz),1.59-1.83(2H,m),2.02-2.11(3H,m),2.17-2.24(2H,m),2.33(3H,s),2.36-2.45(1H,m),2.77-2.87(2H,m),3.33-3.43(1H,m),3.46-3.58(1H,m),4.06(1H,dd,J=19.5,9.4Hz),4.40-4.46(1H,m),4.76-4.84(1H,m),5.75(1H,d,J=6.4Hz),6.51(2H,br s).
實施例14
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於實施例13之步驟3獲得的(1R)-6-胺基-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(300mg、0.88mmol)、1-乙醯基-哌啶-4-基胺(440mg)中添加二甲亞碸(4ml)，並於100℃攪拌3小時。將反應混合物冷卻至室溫後，減壓餾除溶媒。將殘留物分配於氯仿-飽和碳酸氫鈉水，有機層以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(二氯甲烷：甲醇=10：0→9：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(292mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.44(3H,d,J=6.9Hz),1.48-1.55(2H,m),2.05-2.17(6H,m),2.36-2.46(1H,m),2.92-2.99(1H,m),3.24-3.32(1H,m),3.48-3.65(2H,m),3.82-3.90(1H,m),4.03-4.11(1H,m),4.39-4.42(1H,m), 4.45-4.52(1H,m),4.78-4.85(1H,m),5.77(1H,d,J=6.4Hz),6.54(2H,br s).
實施例15
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
(步驟1)
(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於實施例13之步驟2獲得的(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(4.9g、13.7mmol)中添加乙醇(50ml)，並加熱至60℃作成均一溶液。於同溫下添加1M氫氧化鈉水溶液(41ml)，攪拌1.5小時後，添加乙酸(3.2ml)，並冷卻至室溫。濾取析出物，水洗、醚洗後，乾燥，獲得呈固體之標題化合物(4.5g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.33(3H,d,J=6.9Hz),1.99-2.07(1H,m),2.38-2.49(1H,m),3.50-3.61(1H,m),4.01-4.10(1H,m),6.30-6.38(1H,m).
(步驟2)
(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(7.3g、22.2mmol)、氯化銨(23.8g、444mmol)中添加二氯甲烷(200ml)，添加六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻(12.1g、23.3mmol)、三乙胺(93ml)，並攪拌18小時。反應混合物以二氯甲烷稀釋，以1M氫氧化鈉水溶液洗淨後，以硫酸鎂乾燥，並減壓餾除溶媒。於殘留物中添加甲醇，濾取不溶物、乾燥，獲得呈固體之標題化合物(3.54g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.28(3H,d,J=6.6Hz),1.91-1.97(1H,m),2.32-2.43(1H,m),3.51-3.61(1H,m),4.00(1H,ddd,J=19.6,9.8,2.6Hz),5.59(1H,br s),6.19-6.23(1H,m),9.72(1H,s).
(步驟3)
(1R)-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於(1R)-6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺(500mg、1.53mmol)、1-甲基-哌啶-4-基胺(765μl)中添加二甲亞碸(5ml)，並於110℃攪拌2.5小時。將反應混合物冷卻至室 溫後，減壓餾除溶媒。將殘留物分配於二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉水，有機層以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以NH矽膠層析(二氯甲烷：乙酸乙酯=10：0~9：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(320mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.16(3H,d,J=6.0Hz),1.48-1.65(2H,m),1.80-1.88(2H,m),1.98-2.03(1H,m),2.07-2.20(3H,m),2.30(3H,s),2.34-2.44(1H,m),2.75-2.84(2H,m),3.14-3.19(1H,m),3.58(1H,dt,J=19.3,8.7Hz),3.73-3.80(1H,m),3.86(1H,dq,J=19.0,4.8Hz),4.50(1H,d,J=7.8Hz),5.51-5.55(1H,m),6.04-6.12(1H,m),6.72-7.20(1H,m),9.85-9.94(1H,m).
(步驟4)
(1R)-6-胺基-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
將(1R)-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺(200mg、0.47mmol)溶解於甲醇(5ml)-四氫呋喃(5ml)，添加10%鈀碳觸媒(AD，濕重，200mg)，並於氫氣環境下，攪拌20小時。濾除觸媒，減壓餾除溶媒，殘留物以NH矽膠層析(氯仿：甲醇=19：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(124mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.40(4H,d,J=6.4Hz),2.00 (1H,dd,J=12.6,8.5Hz),2.04-2.11(2H,m),2.16-2.24(2H,m),2.27-2.37(5H,m),2.78-2.85(2H,m),3.32-3.41(1H,m),3.48-3.58(1H,m),4.05(1H,dd,J=19.2,9.2Hz),4.26-4.32(1H,m),4.68-4.75(1H,m),5.47-5.54(1H,m),5.71(1H,d,J=6.9Hz),6.71(2H,br s),10.09-10.17(1H,m).
實施例16
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
(步驟1)
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例15之步驟2獲得的化合物(250mg，0.76mmol)、1-乙醯基-哌啶-4-基胺(430mg)中添加二甲亞碸(1.5ml)，並於110℃攪拌4小時。將反應混合物冷卻至室溫後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(二氯甲烷：甲醇=10：0~9：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(232mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.16(3H,d,J=6.4Hz),1.35-1.50(2H,m),1.80-1.87(2H,m),2.03-2.20(4H,m),2.35-2.44(1H,m),2.79-2.90(1H,m),3.14-3.25(2H,m), 3.53-3.63(1H,m),3.77-3.91(2H,m),3.93-4.02(1H,m),4.44-4.55(2H,m),5.50-5.55(1H,m),602-6.11(1H,m),6.80-7.18(1H,m),9.81-9.90(1H,m).
(步驟2)
(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
將(1R)-8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1-甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺(230mg、0.51mmol)溶解於甲醇(5ml)-四氫呋喃(5ml)，添加10%鈀碳觸媒(AD，濕重，272mg)，並於氫氣環境下，攪拌6小時。濾除觸媒，減壓餾除溶媒，將殘留物分配於氯仿-飽和碳酸氫鈉水，有機層以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒，獲得呈固體之標題化合物(149mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.41(3H,d,J=6.4Hz),1.45-1.56(2H,m),1.98-2.04(1H,m),2.08-2.17(5H,m),2.27-2.36(1H,m),2.92-3.01(1H,m),3.24-3.31(1H,m),3.49-3.62(2H,m),3.82-3.88(1H,m),4.01-4.10(1H,m),4.26-4.30(1H,m),4.42-4.51(1H,m),4.68-4.78(1H,m),5.49-5.56(1H,m),5.72(1H,d,J=6.9Hz),6.75(2H,br s),10.08-10.12(1H,m).
實施例17
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(1-羥基-5,5-二甲基吡咯啶-2-基)乙酸酯 異丙酯
氬氣環境下於四氫呋喃(300ml)中添加1.14M鋰二異丙基醯胺/n-己烷-四氫呋喃溶液(95ml)，將其冷卻至-78℃。於同溫下滴加乙酸異丙酯(11.5ml)，滴下結束後攪拌20分鐘。於其中，同溫下滴加5,5-二甲基-1-二氫吡咯N-氧化物(9.0g、78mmol)之四氫呋喃(50ml)溶液，滴加後攪拌1.5小時。添加飽和氯化銨水溶液，使反應淬滅後，分配於乙酸乙酯-飽和食鹽水，有機層以硫酸鎂乾燥。減壓餾除溶媒後，殘留物以矽膠層析(n-己烷：乙酸乙酯=9：1-6：4)純化，獲得呈油狀物之標題化合物(14.3g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.04(3H,s),1.17(3H,s),1.23(6H,d,J=6.4Hz),1.36-1.46(1H,m),1.51-1.64(1H,m),1.93-2.01(1H,m),2.38(1H,dd,J=14.7,7.8Hz),2.68(1H,dd,J=14.7,5.0Hz),3.29-3.37(1H,m),4.82(1H,br s),4.97-5.07(1H,m).
(步驟2)
(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)乙酸酯 異丙酯
將(1-羥基-5,5-二甲基吡咯啶-2-基)乙酸酯 異丙酯(14，3g、66mmol)溶解於二氯甲烷(200ml)，添加三苯基膦(26g、100mmol)、四氯化碳(9.6ml、100mmol)、及三乙胺(14ml)，並加熱回流3小時。將反應混合物放冷後，減壓餾除溶媒，於殘留物中添加乙酸乙酯，濾除不溶物(2次)，濾液以矽膠層析(n-己烷：乙酸乙酯=10：0-8：2)純化，獲得呈油狀物之標題化合物(11.5g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.23(6H,d,J=6.3Hz),1.28(6H,s),1.78(2H,t,J=7.7Hz),2.63-2.67(2H,m),4.41(1H,s),4.95-5.04(1H,m),7.84(1H,br s).
(步驟3)
7,8,9-三氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 異丙酯
將2,3,4,5-四氟-6-硝基-苯甲酸(10g、42mmol)懸浮於二氯甲烷(150ml)，添加草醯氯(11ml)、N,N-二甲基甲醯胺(2滴)後，攪拌24小時。減壓濃縮反應混合物，於殘留物中添加甲苯，再度減壓濃縮。
將殘留物溶解於甲苯(100ml)，滴加(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)乙酸酯 異丙酯(7.1g、36mmol)之甲苯(40ml)溶液。反應混合物於室溫攪拌2小時後，倒入飽和碳酸氫 鈉水，並以乙酸乙酯萃取。水層以乙酸乙酯萃取後，合併有機層，並以硫酸鎂乾燥，減壓餾除溶媒。將殘留物溶解於丙酮(100ml)，添加碳酸鉀(6.6g)，並加熱回流18小時。冰冷下，以1M鹽酸作成弱酸性，並以乙酸乙酯萃取。含不溶物的水層以二氯甲烷萃取，合併有機層，以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(二氯甲烷：甲醇=10：0-19：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(11.2g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.35(6H,d,J=6.0Hz),1.77(6H,d,J=4.1Hz),2.27(2H,t,J=7.6Hz),3.30(2H,t,J=7.6Hz),5.15-5.25(1H,m).
(步驟4)
7,8,9-三氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於7,8,9-三氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 異丙酯(1.9g、4.8mmol)中添加乙酸(15ml)、濃鹽酸(15ml)，並於80℃攪拌1.5小時。於反應混合物中添加冰水，濾取析出物、乾燥，獲得呈固體之標題化合物(1.9g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.84(6H,d,J=3.7Hz),2.34(2H,t,J=7.8Hz),3.87(2H,t,J=7.6Hz).
(步驟5)
6-胺基-7,8,9-三氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
將7,8,9-三氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(6.9g、19.4mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(250ml)，添加5%鈀碳觸媒(M、濕重、820mg)，並於氫氣環境下攪拌20小時。觸媒以矽藻土製品濾除，並減壓濃縮濾液。將殘留物懸浮於二氯甲烷，濾取不溶物、乾燥，獲得呈固體之標題化合物(3.6g)。又，母液以矽膠管柱層析(氯仿：甲醇=19：1)純化，由另外的方式獲得呈固體之標題化合物(762mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.67(7H,d,J=3.7Hz),2.20(2H,t,J=7.6Hz),3.61(2H,t,J=7.6Hz),7.80(2H,br s).
(步驟6)
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於6-胺基-7,8,9-三氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四 氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(1.6g、4.9mmol)、1-(4-胺基-哌啶-1-基)乙酮(1.53g、10.8mmol)中添加二甲亞碸(20ml)，並於100℃攪拌1小時。減壓餾除溶媒，殘留物以矽膠層析(二氯甲烷：甲醇=10：0-9：1)純化，並濃縮目標部分。於殘留物中添加甲醇、二甲基醚，並濾取析出物、乾燥，獲得呈固體之標題化合物(2.09g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.35-1.46(2H,m),1.70(3H,s),1.71(3H,s),2.07-2.12(1H,m),2.12(3H,s),2.18(2H,t,J=7.8Hz),2.74-2.84(1H,m),3.16-3.26(1H,m),3.71(2H,t,J=7.6Hz),3.81-4.06(3H,m),4.60(1H,d,J=13.7Hz),6.62(2H,br s).
實施例18
6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於實施例17之步驟5獲得的化合物(925mg、2.84mmol)中添加1-甲基-哌啶-4-基胺(1.4ml)、二甲亞碸(15ml)，並於100℃攪拌1小時。將反應混合物放冷後，減壓餾除溶媒，殘留物以NH矽膠層析(二氯甲烷：甲醇=10：0-8：2)純化，獲得呈固體之標題化合物(1.3g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.50-1.61(2H,m),1.70(3H,s),1.71(3H,s),2.05-2.19(6H,m),2.31(3H,s),2.77-2.88 (2H,m),3.67-3.78(3H,m),4.03-4.10(0H,m),6.59(2H,s).
實施例19
8-{[(3S)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於實施例17之步驟5獲得的化合物(135mg)及1-乙醯基-3-胺基哌啶(180mg)之二甲亞碸(2.0ml)溶液中，添加二異丙基乙胺(211μL)，並於100℃攪拌4小時。於反應液中添加飽和氯化鈉水溶液、水，並以乙酸乙酯及二氯甲烷萃取。以無水硫酸鈉乾燥後，減壓下餾除溶媒。殘渣以矽膠管柱(二氯甲烷：甲醇=50：1)純化後，添加乙酸乙酯並洗淨，獲得呈固體之標題化合物(138mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.56-1.88(9H,m),2.05-2.23(6H,m),3.19-3.40(2H,m),3.50-3.59(0.5H,m),3.64-3.76(2H,m),3.81-3.98(2H,m),4.09-4.27(1.5H,m),6.48-6.78(2H,br).
實施例20
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例17之步驟6獲得的化合物(1.98g、4.42mmol)、氯化銨(4.72g、88.3mmol)中添加二氯甲烷(80ml)，添加六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻(2.8g、5.3mmol)、三乙胺(18.5ml)，並攪拌7小時。反應混合物以氯仿稀釋，以1M氫氧化鈉水溶液、水洗淨後，以硫酸鎂乾燥，並減壓餾除溶媒。於殘留物中添加乙酸乙酯，並濾取析出物、乾燥，獲得呈固體之標題化合物(1.46g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.33-1.45(2H,m),1.66(3H,s),1.67(3H,s),2.07-2.17(6H,m),2.75-2.83(1H,m),3.15-3.23(1H,m),3.62(2H,t,J=7.3Hz),3.81-3.93(3H,m),4.54-4.62(1H,m),5.49-5.56(1H,m),6.73(2H,br s),9.81(1H,s).
實施例21
6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
將實施例18獲得的化合物(1.19g、2.8mmol)溶解於二氯甲烷(50ml)，添加氯化銨(3.0g、57mmol)、三乙胺(12ml)、六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻(1.6g)，並攪 拌2小時。反應混合物以二氯甲烷稀釋後，以1M氫氧化鈉水溶液洗淨，以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(二氯甲烷：甲醇=10：0-6：4)純化，獲得呈固體之標題化合物(392mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.67(3H,s),1.67(3H,s),2.04-2.13(4H,m),2.18-2.27(2H,m),2.36(3H,s),2.85-2.94(2H,m),3.62(2H,t,J=7.6Hz),3.67-3.76(1H,m),3.88-3.95(1H,m),5.48-5.54(1H,m),6.62-6.80(2H,m),9.81-9.85(1H,m).
實施例22
8-{[(3S)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例19獲得的化合物(70mg)之二氯甲烷(1.5ml)溶液中添加1-羥基苯并三唑(22mg)、2M氨甲醇溶液(350μL)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(39mg)，並於室溫中攪拌3日。於反應液中，追加二氯甲烷(3.0ml)、2M氨甲醇溶液(300μl)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(40mg)，室溫中攪拌4小時。反應液以二氯甲烷稀釋後，添加10%檸檬酸水。以二氯甲烷萃取，合併的有機層以飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。減壓下濃 縮後，於殘渣中添加乙酸乙酯，並洗淨、濾取。以薄層層析(二氯甲烷：甲醇=20：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(20mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.53-1.72(9.5H,m),2.00-2.20(5.5H,m),3.15-3.38(2H,m),3.49-3.68(2H,m),3.77-3.95(2.25H,m),3.98-4.25(1.25H,m),5.50-5.65(1H,m),6.57-6.94(2H,br),9.70-9.93(1H,m).
實施例23
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈
(步驟1)
(1-羥基-5,5-二甲基吡咯啶-2-基)乙腈
於乙腈(2.2ml、42.4mmol)之四氫呋喃(20ml)溶液中，於-78℃滴加1.14M鋰二異丙基醯胺/n-己烷-四氫呋喃溶液(37.2ml、42.4mmol)後，攪拌10分鐘。於反應混合物中，於-78℃添加5,5-二甲基-1-二氫吡咯N-氧化物(4.0g、35.3mmol)之四氫呋喃(5ml)溶液。反應混合物於-78℃攪拌45分鐘，添加水，並回到室溫。於反應混合溶液中添加水，以乙酸乙酯萃取。有機層以無水硫酸鎂乾燥，過濾後，減壓濃縮濾液。殘留物以快速矽膠管柱層析(35%乙酸乙酯/n-己烷)純化，獲得呈油狀物之標題化合物(3.48g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.04(3H,s),1.18(3H,s),1.47-1.68(3H,m),1.96-2.08(1H,m),2.59(2H,d,J=5.5Hz),3.17-3.26(1H,m),4.50(1H,br s).
(步驟2)
(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)乙腈
於(1-羥基-5,5-二甲基吡咯啶-2-基)乙腈(3.48g、22.6mmol)、三乙胺(12.6ml、902mmol)之二氯甲烷(40ml)溶液中，冰冷下添加甲烷磺醯氯(2.1ml、27.1mmol)。將反應混合物加熱回流1小時，並回到室溫。將反應混合物減壓濃縮。於殘留物中添加水、乙酸乙酯，並以乙酸乙酯萃取。有機層以飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥後，過濾、減壓濃縮濾液。殘留物以快速矽膠管柱層析(30%乙酸乙酯/n-己烷)純化，獲得呈固體之標題化合物(1.86g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.22-1.32(6H,m),1.82-1.89(2H,m),2.61-2.67(1H,m),2.83-2.89(1H,m),3.61-3.63(0.5H,m),3.87-3.90(0.5H,m),4.83(0.5H,brs),5.18(0.5H,br s).
(步驟3)
2-(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)-3-側氧-3-(2,3,4,5-四氟-6-硝基苯基)丙腈
於2,3,4,5-四氟-6-硝基苯甲酸(1.5g、6.34mmol)之二氯甲烷(30ml)懸浮液中添加草醯氯(1.1ml、12.7mmol)、N,N-二甲基甲醯胺(2滴)，並於室溫攪拌4.5小時。將反應混合物減壓濃縮。於殘留物中添加甲苯(30ml)，使其冰冷、添加三乙胺(1.3ml、9.52mmol)、(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)乙腈(864mg、6.34mmol)。反應混合物於冰冷下攪拌1小時後，於室溫攪拌1小時。於反應混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，並以乙酸乙酯萃取。有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮濾液。殘留物以快速矽膠管柱層析(氯仿)純化，獲得呈固體之標題化合物(1.81g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.56(6H,s),2.06(2H,t,J=7.7Hz),3.14(2H,t,J=7.7Hz),10.24(1H,br s).
(步驟4)
7,8,9-三氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈
於2-(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)-3-側氧-3-(2,3,4,5-四氟-6-硝基苯基)丙腈(2.11g、5.91mmol)中添加丙酮(40ml)、碳酸鉀(1.06g、7.68mmol)。反應混合物於室溫攪拌一晚，減壓濃縮。於殘留物中添加水，以氯仿萃取。減壓濃縮有機層，並獲得固體。於獲得的固體中添加 己烷/乙酸乙酯=2/1，濾取，獲得呈固體之標題化合物(1.91g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.83(3H,s),1.84(3H,s),2.44(2H,t,J=7.8Hz),3.42(2H,t,J=7.8Hz).
(步驟5)
6-胺基-7,8,9-三氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈
於7,8,9-三氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈(302mg、0.90mmol)中添加N,N-二甲基甲醯胺(5ml)、甲醇(5ml)、水(5ml)、二硫亞磺酸鈉(623mg、2.69mmol)，並於70-75℃攪拌3小時。將反應混合物回到室溫，添加水，濾取、獲得固體。濾液以氯仿萃取後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮濾液，並獲得固體。合併獲得的固體，以快速矽膠管柱層析(1%甲醇/氯仿)純化，獲得呈固體之標題化合物(199mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.65(3H,s),1.66(3H,s),2.25(2H,t,J=7.3Hz),3.28(2H,t,J=7.3Hz),7.89(2H,br s).
(步驟6)
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7,9-二氟-1,1- 二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈
將6-胺基-7,8,9-三氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈(50mg、0.16mmol)1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮(69mg、0.49mmol)之二甲亞碸(2ml)溶液於80℃攪拌4.5小時。將反應混合物回到室溫，減壓濃縮。殘留物以快速矽膠管柱層析(35%乙酸乙酯/氯仿→3%甲醇/氯仿)純化，並獲得固體。於獲得的固體中添加乙醇，濾取，獲得呈固體之標題化合物(57mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.30-1.45(2H,m),1.69(3H,s),1.70(3H,s),2.06-2.18(5H,m),2.23(2H,t,J=7.6Hz),2.73-2.83(1H,m),3.15-3.27(3H,m),3.80-3.96(3H,m),4.54-4.62(1H,m),6.76(2H,br s).
MS(m/z)：430(M+H).
實施例24
6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈
將實施例23之步驟5獲得的化合物(59mg、0.19mmol)、4-胺基-1-甲基哌啶(66mg、0.58mmol)之二甲亞碸(2ml) 溶液於80℃攪拌3小時。將反應混合物回到室溫，並減壓濃縮。殘留物以劃分用薄層層析(15%甲醇/氯仿展開)純化，並獲得固體。獲得的固體以快速NH矽膠管柱層析(40%乙酸乙酯/氯仿)純化，並獲得固體。於獲得的固體中添加乙醇，濾取，獲得呈固體之標題化合物(57mg、74%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.47-1.58(2H,m),1.69(3H,s),1.70(3H,s),2.00-2.18(4H,m),2.22(2H,t,J=7.6Hz),2.31(3H,s),2.77-2.86(2H,m),3.23(2H,t,J=7.6Hz),3.63-3.75(1H,m),3.90-3.99(1H,m),6.73(2H,br s).
MS(m/z)：402(M+H).
實施例25
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
(1-羥基-5,5-二甲基吡咯啶-2-基)乙酸 tert-丁酯
在氮氣環境下於四氫呋喃(400ml)中添加1.1M鋰二異丙基醯胺(n-己烷-四氫呋喃溶液、200ml)，將其冷卻至-78℃。於同溫滴加乙酸tert-丁酯(29ml)，滴加結束後攪拌30分鐘。於其中，於同溫添加5,5-二甲基-1-二氫吡咯N-氧化物(22.3g、194mmol)之四氫呋喃(50ml)溶液，滴加後並攪拌2小時。添加飽和氯化銨水溶液，將反應淬滅後 ，分配於乙酸乙酯-飽和食鹽水，有機層以硫酸鎂乾燥。將溶媒減壓餾除後，殘留物以矽膠層析(n-己烷：乙酸乙酯=9：1-6：4)純化，獲得呈油狀物之標題化合物(45.9g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.04(3H,s),1.17(3H,s),1.36-1.43(1H,m),1.45(9H,s),1.52-1.60(2H,m),1.92-2.02(1H,m),2.32(1H,dd,J=14.4,8.0Hz),2.63(1H,dd,J=14.7,5.0Hz),3.26-3.35(1H,m),4.77(1H,br s).
(步驟2)
(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)乙酸酯 t-丁酯
將(1-羥基-5,5-二甲基吡咯啶-2-基)乙酸 tert-丁酯(45.9g、200mmol)溶解於二氯甲烷(500ml)，添加三苯基膦(75g、286mmol)、四氯化碳(229ml、300mmol)、及三乙胺(42ml)，並加熱回流4小時。反應混合物放置冷卻後，減壓餾除溶媒，於殘留物中添加乙酸乙酯，濾除不溶物(2次)，濾液以矽膠層析(n-己烷：乙酸乙酯=4：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(30g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.28(6H,s),1.47(9H,s),1.76(2H,t,J=7.8Hz),2.61-2.65(2H,m),4.37(1H,s),7.74(1H,br s).
(步驟3)
9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 tert-丁酯
將3-氯-2,4,5-三氟-6-硝基-苯甲酸(10g、39.1mmol)溶解於二氯甲烷(150mL)，添加5滴N,N-二甲基甲醯胺，並於室溫滴加草醯氯(3.58mL、41.1mmol)。攪拌2.5小時後，減壓濃縮，作甲苯共沸而獲得呈油狀物之殘留物。
於烯胺(6.89g、32.6mmol)之四氫呋喃溶液(150mL)中，冰冷下，滴加上述殘留物之四氫呋喃溶液(150mL)。於室溫攪拌30分鐘後，冰冷下，於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水，並以乙酸乙酯萃取。有機層以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，減壓餾除溶媒，以矽膠管柱層析(10%乙酸乙酯/己烷→30%)粗製純化，獲得油狀物。
於獲得的油狀物之四氫呋喃(150mL)溶液中，冰冷下，添加氫化鈉(55%於油中，1.43g，35.8mmol)。於室溫攪拌1.5小時後，冰冷下，於反應液中添加10%檸檬酸水溶液，並以乙酸乙酯萃取。有機層以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。獲得的固體以乙醇洗淨，濾取而獲得呈乳白色固體之標題化合物(10.19g)。又，減壓濃縮濾液，加以矽膠管柱層析(20%乙酸乙酯/己烷→50%)，進一步獲得呈固體之標題化合物(620mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.56(9H,s),1.97(6H,s),2.19(2H,t,J=7.1Hz),3.27(2H,t,J=7.3Hz).
(步驟4)
6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
將9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 t-丁酯(4.53g、10.6mmol)溶解於1,2-二氯乙烷(150mL)，添加10%鈀碳(AD、濕重，906mg)，並於氫氣環境下，於室溫攪拌9小時。濾除觸媒，減壓濃縮濾液，作甲苯共沸，並獲得油狀物。
於獲得的殘留物之二氯甲烷溶液(60mL)中添加三氟乙酸(15mL)，於室溫攪拌4小時。減壓濃縮，甲苯共沸後，獲得的固體以乙醇洗淨，獲得呈固體之標題化合物(3.24g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.98(6H,s),2.15(2H,t,J=7.0Hz),3.73(2H,t,J=7.0Hz).
(步驟5)
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸(201mg、0.586mmol)及1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮(250mg、1.76mmol)中添加N-甲基吡咯啶酮(1.5mL)，並於70℃攪拌2小時半。將反應液分配於水、乙酸乙酯，並添加10%檸檬酸水溶液。有機層以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，減壓餾除溶媒，加以矽膠管柱層析(10%甲醇/氯仿)，獲得呈固體之9-Cl中間體(181mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.37-1.49(2H,m),1.88(3H,s),1.92(3H,s),2.08-2.13(7H,m),2.85(1H,t,J=12.8Hz),3.21(1H,t,J=11.9Hz),3.67(2H,t,J=6.6Hz),3.78-3.85(1H,m),3.94-4.05(1H,m),4.49-4.62(2H,m),6.70-6.99(2H,brs).
將上述中間體之一部分(140mg、0.301mmol)溶解於四氫呋喃(4mL)及異丙醇(4mL)之混合溶液。添加10%鈀碳(AD，濕重，100mg)，並於氫氣環境下，於室溫攪拌15小時。濾除觸媒後，減壓濃縮濾液，加以矽膠管柱層析(10%甲醇/氯仿)，獲得呈固體之標題化合物(73.6mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.47-1.55(2H,m),1.77(6H,s),2.08-2.18(3H,m),2.13(3H,s),2.99(1H,t,J=13.8Hz),3.29(1H,t,J=13.9Hz),3.51-3.59(1H,m),3.72(2H,t,J=7.8Hz),3.86-3.89(1H,m),4.12(1H,dd,J=14.0,7.0 Hz),4.37-4.40(1H,m),4.45-4.49(1H,m),6.14(1H,d,J=6.6Hz),6.50-6.69(2H,brs).
實施例26
6-胺基-7-氟-8-[(反式-4-羥基環己基)胺基]-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
使用實施例25之步驟4獲得的化合物及反式-(4-羥基環己基)胺，藉由與實施例25之步驟5相同之方法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.30-1.58(5H,m),1.74(6H,s),1.99-2.23(6H,m),3.22-3.35(1H,m),3.67(2H,t,J=7.8Hz),3.69-3.81(1H,m),4.13-4.24(1H,m),5.44-5.57(1H,m),6.06(1H,d,J=6.8Hz),6.53-6.90(2H,br),10.03-10.15(1H,m).
MS(ESI)m/z：403(M+H)+.
實施例27
6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-胺基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸鹽酸鹽
於實施例25之步驟4獲得的化合物(1.03g、3.01mmol) 及4-胺基-1-甲基哌啶(1.13mL、9.03mmol)中添加N-甲基吡咯啶酮(8mL)，並於80℃攪拌4小時半。減壓濃縮反應液而餾除溶媒後，於殘渣中添加氨水及乙醇，並減壓濃縮。殘留物加以矽膠管柱層析(5%甲醇/氯仿→10%→氯仿：甲醇：水=7：3：1之下層)，獲得呈非晶形之9-Cl體。
將上述非晶形溶解於1,2-二氯乙烷(15mL)及乙醇(15mL)之混合溶媒，添加10%鈀碳(AD，濕重，550mg)，並於氫氣環境下，於室溫攪拌13小時。於反應液中添加氨水後，濾除觸媒，並減壓濃縮濾液。於獲得的殘留物中添加乙醇(10mL)，並加熱至95℃，添加氨水直到不溶物溶解。直接加熱而使氨緩緩氣化，使固體析出。回到室溫，藉由濾取，獲得呈固體之標題化合物(646mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.73(6H,s),1.85(2H,m),2.05(2H,m),2.20(2H,t,J=7.9Hz),2.60(3H,brs),2.88-3.00(2H,m),3.22-3.31(2H,m),3.51-3.67(3H,m),6.15-6.24(2H,m),7.01-7.10(2H,brs).
實施例28
6-胺基-7-氟-8-{[(2R)-1-羥基丙烷-2-基]胺基}-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
使用上述實施例25之步驟4獲得的化合物及(2R)-(1- 羥基丙烷-2-基)胺，藉由與實施例25之步驟5同樣的手法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：-3.73(1H,s),1.33(3H,d,J=6.1Hz),1.77(6H,d,J=9.8Hz),2.15-2.21(1H,br),2.21(2H,t,J=7.9Hz),3.59-3.76(4H,m),3.78-3.88(1H,m),4.49-4.58(1H,m),6.28(1H,d,J=6.8Hz),6.40-6.59(2H,br).
MS(ESI)m/z：364(M+H)+.
實施例29
8-{[(3S)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
使用上述實施例25之步驟4獲得的化合物及1-[(3S)-3-胺基-1-哌啶基]乙酮，藉由與實施例25之步驟5同樣的手法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：-3.93(0.2H,s),-3.77(0.8H,s),1.55-1.97(8H,m),2.02-2.28(6H,m),2.63(1H,dd,J=12.9,9.8Hz),3.11-3.24(1H,m),3.26-3.86(5H,m),4.34-4.48(1H,m),4.70-4.81(1H,m),6.14(0.2H,d,J=6.6Hz),6.33(0.8H,d,J=7.1Hz),6.42-6.70(2H,m).
實施例30
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
(步驟1)
6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例25之步驟3獲得的9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 tert-丁酯(7.5g、17.5mmol)之二氯甲烷溶液(200ml)中添加三氟乙酸(2.6ml)，於室溫中攪拌2小時。添加甲苯，並減壓餾除溶媒。將殘留物溶解於二氯甲烷，滴加草醯氯(3.88ml、45.2mmol)，並滴加1滴N,N-二甲基甲醯胺。室溫中攪拌2小時後，減壓餾除溶媒。溶解於二烷(25ml)，冰冷下，滴入氨水(50ml)中。室溫中攪拌1小時後，添加水而濾取固體(5.6g)。將獲得的粗生成物溶解於N,N-甲醯胺：1,2-二氯乙烷：乙酸=1：1：0.2(150ml)中，添加10%鈀碳(AD，濕重，1.0g)，並於氫氣環境下，室溫中攪拌一晚。過濾後，濃縮母液，殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(3.8g)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.86(6H,s),2.06(2H,t,J=7.2Hz),3.43(2H,t,J=6.9Hz),7.34(1H,d,J=3.4Hz),8.91(1H,d,J=4.0Hz).
MS(ESI)m/z：342[M+H]+.
(步驟2)
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺(200mg、0.59mmol)之二甲亞碸溶液(5ml)中添加1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮(250mg、1.76mmol)，並於100℃攪拌一晚。添加水，並以含有10%甲醇之氯仿萃取，以無水硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(220mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.34-1.44(1H,m),1.47-1.55(1H,m),1.79(3H,s),1.80(3H,s),1.84-1.93(2H,m),2.66-2.73(1H,m),3.08-3.15(1H,m),3.38(2H,t,J=6.9Hz),3.76-3.83(2H,m),4.23-4.29(1H,m),5.08-5.12(1H,m).
MS(ESI)m/z：464[M+H]+.
(步驟3)
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-9-氯-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺(110mg、0.24mmol)之二氯甲烷-甲醇溶液(4：1、2.5ml)中添加10%鈀碳(AD，濕重，30mg)，氫氣環境下，室溫中攪拌一晚。過濾後，濃縮母液，殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(76mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.34-1.51(2H,m),1.68(6H,s),1.85-1.98(2H,m),2.01(3H,s),2.10(2H,t,J=7.7Hz),2.73-2.81(1H,m),3.16-3.24(1H,m),3.49(2H,t,J=7.7Hz),3.56-3.64(1H,br m),3.84(1H,d,J=14.3Hz),4.32(1H,d,J=13.2Hz),5.98(1H,d,J=6.9Hz),6.06(1H,d,J=6.9Hz),7.00(1H,d,J=4.6Hz),9.53(1H,d,J=4.6Hz).
MS(ESI)m/z：430[M+H]+.
實施例31
6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
(步驟1)
6-胺基-9-氯-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例30之步驟1獲得的6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺(200mg、0.59mmol)之N-甲基吡咯啶酮溶液(5ml)中添加4-胺基-1-甲基哌啶(0.162ml、1.29mmol)，並於80度攪拌一晚。添加水，並以乙酸乙酯萃取，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(130mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.53-1.63(2H,m),1.79(6H,s),1.82-1.88(2H,m),1.96-2.05(4H,m),2.18(3H,s),2.68-2.78(2H,br m),3.38(2H,t,J=7.2Hz),3.55-3.62(1H,br m),5.02(1H,d,J=7.4Hz),7.18(1H,d,J=5.2Hz),9.17(1H,d,J=4.0Hz).
MS(ESI)m/z：436[M+H]+.
(步驟2)
6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於6-胺基-9-氯-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺(130mg、0.30mmol)之二氯甲烷-甲醇溶液(4：1、4ml) 中添加10%鈀碳(AD，濕重，30mg)，並於氫氣環境下，室溫中攪拌一晚。過濾後，濃縮母液，殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(61mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.68(6H,s),1.79-1.90(2H,m),2.04-2.13(4H,m),2.74(4H,br s),3.50(2H,t,J=7.4Hz),3.58-3.65(1H,m),6.03(1H,d,J=6.9Hz),6.24(1H,d,J=8.6Hz),7.00-7.03(1H,m),9.50-9.53(1H,m),10.17-10.27(1H,br m).
MS(ESI)m/z：402[M+H]+.
實施例32
8-{[(3S)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
使用實施例30之步驟1獲得的化合物及1-[(3S)-3-胺基-1-哌啶基]乙酮，以與實施例30之步驟2及步驟3相同之手法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.52-1.97(9H,m),2.00-2.25(6.25H,m),2.64(0.75H,dd,J=12.9,9.5Hz),3.09-3.24(0.75H,m),3.24-3.87(4.5H,m),4.20-4.34(1H,m),4.68-4.80(0.75H,m),5.43-5.58(1H,m),6.07(0.25H,d,J=7.1Hz),6.25(0.75H,d,J=6.8Hz),6.55-6.93(2H, br),9.96-10.17(1H,m).
MS(ESI)m/z：430(M+H)+.
實施例33
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈
於實施例30之步驟3獲得的化合物(223mg、0.519mmol)及三乙胺(0.579mL、4.15mmol)之二氯甲烷溶液(20mL)中，冰浴下，添加三氟乙酸酐(0.145mL，1.04mmol)並攪拌。30分鐘後，再添加三氟乙酸酐(0.145mL，1.04mmol)及三乙胺(0.290mL、2.07mmol)，並攪拌30分鐘。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水，並攪拌18小時後，以氯仿萃取，以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓餾除溶媒，獲得殘留物。將獲得的殘留物溶解於乙醇(10mL)，添加1N氫氧化鈉水溶液(2mL)而於40℃攪拌20小時。減壓濃縮反應液，以水稀釋，並以二氯甲烷萃取。以無水硫酸鈉乾燥後，過濾，減壓餾除溶媒而以矽膠管柱層析(3%甲醇/氯仿)純化。獲得的固體以二乙基醚洗淨，獲得呈固體之標題化合物(107mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.49-1.56(2H,m),1.75(6H,s),2.08-2.13(2H,m),2.13(3H,s),2.26(2H,t,J=7.3Hz),2.98(1H,t,J=12.6Hz),3.22(2H,t,J=8.2Hz),3.29(1H,m),3.47-3.57(1H,m),3.86(1H,d,J=14.7Hz), 4.28(1H,dd,J=8.0,3.4Hz),4.45(1H,br d,J=14.7Hz),6.02(1H,d,J=7.8Hz),6.63-6.83(2H,m).
實施例34
8-{[(3S)-1-乙醯基哌啶-3-基]胺基}-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲腈
使用實施例32獲得的化合物，藉由與實施例33相同之方法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.50-1.97(8H,m),1.99-2.33(6H,m),2.48-2.65(1H,m),3.08-3.55(4.65H,m),3.69-3.89(1.35H,m),4.22-4.39(1H,m),4.71-4.84(1H,m),6.03(0.2H,d,J=6.6Hz),6.22(0.8H,d,J=6.6Hz),6.53-6.93(2H,m).
實施例35
2-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
(步驟1)
4-溴-2,6-二氯-5-氟吡啶3-甲酸
於2,6-二氯-5-氟吡啶3-甲酸(50g，0.24mol)之四氫呋 喃(1000ml)溶液中，於-78℃歷經1小時滴加甲基鋰(1M二乙基醚溶液、500ml、0.50mol)。歷經2小時一邊將反應液升溫至-20℃並一邊攪拌後，再次冷卻至-78℃。於反應液中添加1,2-二溴四氯乙烷(85g，0.26mol)後，於0℃攪拌1小時30分鐘。於反應液中以冰水稀釋後，以氯仿洗淨。於獲得的水層中添加1M鹽酸水而中和，濾取析出的固體，獲得呈固體之標題化合物(33.6g)。本化合物不再純化而直接用於下一步驟。
MS(ESI)m/z：244(M+H)+.
(步驟2)
丙烷-2-基 3-(4-溴-2,6-二氯-5-氟吡啶3-基)-2-(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)-3-側氧丙酸酯
於4-溴-2,6-二氯-5-氟吡啶3-甲酸(8.1g、28mmmol)中添加亞硫醯氯(20ml、0.27mol)及二甲基甲醯胺(觸媒量)，並於100℃攪拌1小時。減壓餾除反應液，將獲得的殘渣溶解於四氫呋喃(100ml)。將實施例17之步驟2獲得的化合物(6.0g、28mmol)之四氫呋喃(50ml)溶液於室溫下滴加，於50度攪拌21小時。減壓餾除溶媒後，以乙酸乙酯稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水的順序洗淨，並以硫酸鈉乾燥。減壓餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=10：1-3：1)純化，獲得呈固 體之標題化合物(6.7g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.95-0.98(6H,m),1.45(6H,s),1.96-1.99(2H,m),3.40-3.45(2H,m),4.87-4.92(1H,m),11.62(1H,br s).
MS(ESI)m/z：469(M+H)+.
(步驟3)
丙烷-2-基 3-[2,6-二氯-5-氟-4-(丙-2-烯-1-基胺基)吡啶3-基]-2-(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)-3-側氧丙酸酯
於丙烷-2-基 3-(4-溴-2,6-二氯-5-氟吡啶3-基)-2-(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)-3-側氧丙酸酯(5.0g、10.1mmol)之乙腈(20ml)溶液中添加烯丙胺(8.0ml、0.11mol)，並於室溫攪拌一晚、於60℃攪拌2小時。減壓餾除溶媒後，殘渣以乙酸乙酯稀釋，以水、飽和食鹽水之順序洗淨，並以硫酸鈉乾燥。減壓餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=8：1-2：1)純化，獲得呈油狀物之標題化合物(2.5g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.43 86H,d,J=10.3Hz),1.56(6H,s),1.92-2.00(2H,m),3.19-3.28(1H,m),3.45-3.54(1H,m),3.94-3.97(2H,m),4.57-4.60(1H,m),4.88-4.9,3.45-3.54(1H,m),3.94-3.97(2H,m),4.57-4.60(1H,m),4.88-4.95(1H,m),5.18(1H,dd,J=10.3,1.2Hz),5.25 (1H,dd,J=17.1,1.2Hz),5.84-5.93(1H,m),11.56(1H,br s).
MS(ESI)m/z：444(M+H)+.
(步驟4)
丙烷-2-基 2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-4-(丙-2-烯-1-基胺基)-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸酯
於丙烷-2-基 3-[2,6-二氯-5-氟-4-(丙-2-烯-1-基胺基)吡啶3-基]-2-(5,5-二甲基吡咯啶-2-亞基)-3-側氧丙酸酯(2.37g、5.1mmol)之四氫呋喃(50ml)溶液中，於-10℃添加55%油性氫化鈉(0.46g、10.6mmol)，並於0℃攪拌1小時30分鐘。於反應液中添加飽和氯化銨水溶液後，以乙酸乙酯萃取有機物。獲得的有機層以水、飽和食鹽水之順序洗淨，以硫酸鈉乾燥。減壓餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=6：1-1：1)純化，獲得呈固體之標題化合物(1.7g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.38(6H,d,J=5.7Hz),1.78(6H,s),2.12(2H,t,J=7.7Hz),3.24(2H,t,J=7.7Hz),4.15-4.19(2H,m),5.15-5.18(1H,m),5.24-5.29(2H,m),5.92-5.98(1H,m),11.18-11.21(1H,m).
MS(ESI)m/z：408[M+H]+.
(步驟5)
4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
於丙烷-2-基 2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-4-(丙-2-烯-1-基胺基)-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸(700mg，1.7mmol)之異丙醇(20ml)溶液中添加10%鈀碳(350mg)與甲烷磺酸(210mg、2.2mmol)，並於80℃攪拌7小時。濾除不溶物後，減壓餾除溶媒，將獲得的殘渣溶解於乙醇(10ml)及四氫呋喃(10ml)，添加1M氫氧化鈉水溶液(10ml)並於50℃攪拌19小時。將反應液冷卻至室溫後，添加乙酸並中和，藉由添加水並濾取析出的固體，獲得呈固體之標題化合物(370mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.75(6H,s),2.16(2H,t,J=7.7Hz),3.63(2H,t,J=7.7Hz),8.17(1H,s),9.06(1H,s).
MS(ESI)m/z：326[M+H]+.
(步驟6)
2-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
於4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸(60mg，0.18mmol)之N-甲基吡咯啶酮(1ml)溶液中添加1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮(52mg、0.37mmol)及三乙胺(51μl、0.37mmol)，並於100℃攪拌一晚。反應液以乙酸乙酯稀釋，以水、飽和食鹽水之順序洗淨。再以含有10%甲醇之氯仿萃取水層，合併獲得的有機層並以硫酸鈉乾燥。減壓餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱層析(氯仿：甲醇=99：1-9：1)純化獲得的粗純化體以乙酸乙酯洗淨，獲得呈固體之標題化合物(40mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.40-1.57(2H,m),1.76(6H,s),1.84-1.93(2H,m),2.02(3H,s),2.13(2H,t,J=8.0Hz),2.60-2.64(1H,m),3.06-3.11(1H,m),3.58(2H,t,J=8.0Hz),3.87-3.91(1H,m),4.01-4.09(1H,m),4.38-4.43(1H,m),7.09-8.26(4H,m).
ESI-MS m/z：432(M+H)+.
實施例36
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
於實施例35之步驟5獲得的化合物(300mg、0.92mmol)之二甲亞碸(3ml)溶液中添加1-甲基哌啶-4-胺(525mg、4.61mmol)，並於微波照射下於160℃攪拌1小時。減壓餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱層析(氯仿：甲醇=99：1-4：1)純化獲得的粗純化體以乙酸乙酯洗淨，獲得呈固體之標題化合物(220mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.58-1.67(2H,m),1.81(6H,s),2.04-2.08(2H,m),2.13-2.19(4H,m),2.33(3H,s),2.84-2.89(2H,m),3.72(2H,t,J=8.0Hz),3.89-3.95(1H,m),4.81-4.84(1H,m).
ESI-MS m/z：404(M+H)+.
實施例37
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[{1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基}胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
使用實施例35之步驟5獲得的化合物及1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-胺，以與實施例36相同之方法獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(D2O+NaOD)δ：1.50-1.58(2H,m),1.70(6H,s),1.93-1.97(2H,m),2.13(2H,t,J=7.8Hz),2.21-2.26(2H,m),2.60(2H,t,J=5.8Hz),2.93-2.97(2H,m),3.10(2H,t,J=7.8Hz),3.37(3H,s),3.61(2H,t,J=5.8Hz),3.89-3.93(1H,m).
ESI-MS m/z：448(M+H)+.
實施例38
4-胺基-3-氟-2-[{1-(2-羥基-2-甲基丙基)哌啶-4-基}胺基]-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
使用實施例35之步驟5獲得的化合物及1-(4-胺基哌啶-1-基)-2-甲基丙烷-2-醇，以與實施例36相同之方法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(D2O+NaOD)δ：1.55-1.63(2H,m),1.71(6H,s),1.89-1.92(2H,m),2.14(2H,t,J=7.9Hz),2.31-2.36(2H,m),2.44(2H,s),2.99-3.03(2H,m),3.10(2H,t,J=7.8Hz),3.88-3.94(1H,m).
ESI-MS m/z：462(M+H)+.
實施例39
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-2-[{1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基}胺基]-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
使用實施例35之步驟5獲得的化合物及1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-胺，以與實施例36同樣之方法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.61-1.69(2H,m),1.80(6H,s),2.03-2.07(2H,m),2.17(2H,t,J=8.0Hz),2.53-2.58(2H,m),3.00-3.06(4H,m),3.72(2H,t,J=8.0Hz),3.90-3.94(1H,m),4.81(1H,d,J=6.3Hz).
ESI-MS m/z：472(M+H)+.
實施例40
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-2-(吡啶3-基胺基)-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
(步驟1)
2-氯-3-氟-4-(4-甲氧基苄基胺基)-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸 tert-丁酯
使用實施例35之步驟1獲得的化合物與實施例25之 步驟2獲得的化合物，以與實施例35之步驟2,3,4相同之手法，將步驟3之烯丙胺變更為對甲氧基苄基胺(5等量)來實施，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.58(9H,s),1.76(6H,s),2.10(2H,t、J=7.9Hz),3.20(2H,t、J=7.9Hz),3.79(3H,s),4.67-4.69(2H,m),6.84-6.87(2H,m),7.25-7.27(2H,m),11.41-11.44(1H,m).
MS(ESI)m/z：502[M+H]+.
(步驟2)
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-2-(吡啶3-基胺基)-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
將2-氯-3-氟-4-(4-甲氧基苄基胺基)-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸 tert-丁酯(1.0g、1.99mmol)、3-胺基吡啶(375mg、9.98mmol)、BINAP(62mg、0.1mmol)溶解於二烷(20ml)，添加碳酸銫(1.3g)，並作氮取代。添加雙鈀三亞苄基丙酮(90mg)，並於80℃攪拌15小時、加熱回流攪拌4小時。追加3-胺基吡啶(200mg)、BINAP(65mg)、雙鈀三亞苄基丙酮(95mg)，再加熱回流15小時。將反應液分配於乙酸乙酯- 飽和碳酸氫鈉水，有機層以硫酸鎂乾燥後，餾除溶媒。殘留物以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=10：0→9：1)粗製純化，獲得中間體。
於上述中間體之二氯甲烷(3ml)溶液中，添加三氟乙酸(3ml)，並攪拌7小時。減壓餾除溶媒，於殘留物中添加甲苯，再度餾除溶媒。於殘留物中添加4M鹽酸/二烷，再度餾除溶媒後，使用二烷-甲醇並加以固體化，獲得呈固體之標題化合物(554mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：1.58(6H,s),2.08(2H,t,J=7.8Hz),3.60(2H,t,J=7.8Hz),7.80-7.86(1H,m),8.31-8.36(1H,m),8.50-8.53(1H,m),8.91-8.94(1H,m),9.87-9.93(1H,m).
實施例41
2-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
(步驟1)
4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
於實施例35之步驟5獲得的4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲 酸(1.2g，3.7mmol)之二氯甲烷(30ml)溶液中添加氯化銨(3.94g、74mmol)及三乙胺(15ml、0.11mol)、六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻(2.1g，4.1mmol)，並於室溫攪拌5小時。反應液以氯仿稀釋，以水、飽和食鹽水之順序洗淨後，以硫酸鈉乾燥。減壓餾除溶媒所得的固體以乙酸乙酯洗淨，獲得呈固體之標題化合物(0.89g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.80(6H,s),2.13(2H,t,J=8.0Hz),3.75(2H,t,J=8.0Hz),5.31-5.56(2H,m),9.70(2H,br s).
MS(ESI)m/z：325[M+H]+.
(步驟2)
2-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
於4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺(250mg、0.77mmol)之二甲亞碸(5ml)溶液中添加1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮(330mg、2.3mmol)，並於微波照射下於150℃攪拌3.5小時。減壓餾除溶媒後，殘渣以乙酸乙酯與甲醇之混合溶媒洗淨，獲得標題化合物之粗純化體A，再將於濾液中溶出的目的物以矽膠管柱層析(氯仿：甲醇=99：1-9：1)純化獲得粗純化體B。合併A及B，再度以矽膠管柱層析(氯 仿：甲醇=99：1-9：1)純化而獲得的粗純化體以乙酸乙酯洗淨，獲得呈固體之標題化合物(230mg)。
1H-NMR(CD3OD)δ：1.46-1.61(2H,m),1.80-1.82(6H,m),1.92-2.14(7H,m),2.77-3.16(2H,m),3.59-3.62(2H,m),3.90-4.29(3H,m).
ESI-MS m/z：431(M+H)+.
實施例42
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
於實施例41之步驟1獲得的4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺(250mg、0.77mmol)之二甲亞碸(3ml)溶液中添加1-甲基哌啶-4-胺(390μl、3.1mmol)，並於微波照射下於150℃攪拌3小時。減壓餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱層析(NH)(氯仿：甲醇=99：1-9：1)純化，再以矽膠管柱層析(氯仿：甲醇=99：1-9：1)純化獲得的粗精製體以乙酸乙酯洗淨，獲得呈固體之標題化合物(160mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.59-1.66(2H,m),1.72(6H,s),1.78-1.83(2H,m),1.90-1.95(2H,m),2.04(2H,t,J=8.0Hz),2.18(3H,s),2.80-2.84(2H,m),3.53(2H,t,J=8.0Hz),3.76-3.83(1H,m),6.86-9.50(5H,m).
ESI-MS m/z：403(M+H)+.
實施例43
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a]-1,8-啶-6-甲腈
(步驟1)
4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a]-1,8-啶-6-甲腈
於實施例41之步驟1所獲得的4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺(1.01g、3.11mmol)、三乙胺(1.3m、9.33mmol)之二氯甲烷(20ml)懸浮液中，冰冷下添加三氟乙酸酐(0.66μl、4.67mmol)。反應混合物於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，並以二氯甲烷萃取。有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮濾液。殘留物以矽膠管柱層析(20%乙酸乙酯/氯仿)純化，並獲得固體。於獲得的固體中添加乙醇，濾取，獲得呈固體之標題化合物(479mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.72(6H,s),2.18(2H,t,J=7.8Hz),3.30(2H,t,J=7.8Hz),8.00(1H,s),9.36(1H,s).
(步驟2)
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a]-1,8-啶-6-甲腈
將4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a]-1,8-啶-6-甲腈(144mg、0.44mmol)、1-甲基哌啶-4-基胺(153mg、1.33mmol)之N-甲基吡咯啶酮(2ml)溶液於120℃攪拌15小時。將反應混合物回到室溫，減壓濃縮。殘留物以快速NH矽膠管柱層析(10%氯仿/乙酸乙酯)純化，減壓濃縮溶出液。殘留物以快速矽膠管柱層析(5%甲醇/氯仿→4%(8N NH3/甲醇)/氯仿)純化，減壓濃縮溶出液。殘留物以劃分用PLC(20%甲醇/氯仿展開)純化，並獲得固體。於獲得的固體中添加n-己烷/乙酸乙酯=1：1，濾取，獲得呈固體之標題化合物(70mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.60-1.68(2H,m),1.79(6H,s),2.00-2.23(6H,m),2.32(3H,s),2.80-2.90(2H,m),3.24(2H,t,J=7.8Hz),3.81-3.94(1H,m),4.68-4.75(1H,m).
實施例44
2-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a]-1,8-啶-6-甲腈
使用實施例43之步驟1獲得的化合物及1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮，藉由與實施例43之步驟2相同的手法，獲 得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.34-1.58(2H,m),1.72(6H,s),1.80-1.94(2H,m),2.01(3H,s),2.14(2H,t,J=7.8Hz),2.56-2.66(1H,m),3.02-3.13(1H,m),3.22(2H,t,J=7.8Hz),3.83-4.06(2H,m),4.33-4.44(1H,m),7.03(1H,d,J=7.8Hz).
ESI-MS(m/z)：413(M+H)+.
實施例45
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
2-(2-乙氧基-2-側氧亞乙基)-4,4-二甲基咪唑啶-1-甲酸 苄酯
於1,2-二胺基-2-甲基丙烷(4.96g，56.2mmol)之乙醇溶液中添加3-乙氧基-3-亞胺基丙酸乙酯鹽酸鹽(10.0g、51.1mmol)，於室溫中攪拌1小時。餾除溶媒後，添加飽和碳酸氫鈉水(100ml)及四氫呋喃(150ml)，並滴加N-(苄氧基羰氧基)-琥珀醯亞胺(5.95g，23.9mmol)之四氫呋喃溶液(50ml)，室溫中攪拌2小時。以乙酸乙酯萃取後，以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒，獲得標題化合物。本化合物不再純化，而使用於下一反應。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.25(3H,t,J=7.1Hz),1.28 (3H,s),1.33(3H,s),3.59-3.61(2H,m),4.10(2H,q,J=7.2Hz),5.22(1H,s),734-7.39(5H,m).
MS(ESI)m/z：319[M+H]+.
(步驟2)
3-苄基 4-乙基 9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2-二氫咪唑并[1,2-a]喹啉-3,4(5H)-二甲酸酯
於3-氯-2,4,5-三氟-6-硝基苯甲酸(2.0g，7.83mmol)之二氯甲烷溶液中，添加草醯氯(0.75ml)及N,N-二甲基甲醯胺(1滴)，並攪拌3小時。將減壓濃縮反應物的殘留物之四氫呋喃溶液(30ml)於冰冷下加到2-(2-乙氧基-2-側氧亞乙基)-4,4-二甲基咪唑啶-1-甲酸 苄酯(4.41g，13.9mmol)之四氫呋喃溶液(70ml)，室溫中攪拌1小時。添加水，以乙酸乙酯萃取，以飽和食鹽水洗淨後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得固體(4.63g)。於獲得的固體(4.60g、8.28mmol)之四氫呋喃溶液(200ml)中添加二異丙基乙胺(14.4ml，82.8mmol)，加熱回流2日。放製冷卻至室溫後，添加水，並以乙酸乙酯萃取。減壓餾除溶媒，添加乙酸乙酯而濾取析出物，獲得呈固體之標題化合物(1.6g)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.14(3H,t,J=7.2Hz),1.89(6H,s),4.03-4.07(4H,m),5.25(2H,s),7.35-7.44(5H,m).
MS(ESI)m/z：536[M+H]+.
(步驟3)
6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
於3-苄基 4-乙基 9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-6-硝基-5-側氧-1,2-二氫咪唑并[1,2-a]喹啉-3,4(5H)-二甲酸酯(500mg)之N,N-二甲基甲醯胺(10ml)溶液中添加5%鈀碳(AD，濕重，150mg)，氫氣環境下、室溫中攪拌一晚。過濾後，濃縮母液，殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(230mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.25(3H,t,J=7.2Hz),1.82(6H,s),3.54(2H,s),4.19(2H,q,J=7.3Hz),8.62(1H,s).
MS(ESI)m/z：372[M+H]+.
(步驟4)
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
於6-胺基-9-氯-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧 -1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(230mg)之二甲亞碸溶液(3ml)中添加1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮(528mg、3.71mmol)，於130度攪拌一晚。添加水，以含有10%甲醇之氯仿萃取，以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(161mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.23(3H,t,J=7.2Hz),1.31-1.49(2H,m),1.66-1.68(6H,m),1.83-1.96(2H,m),2.01(3H,s),2.76(1H,t,J=11.2Hz),3.18(1H,t,J=11.5Hz),3.56(3H,s),3.83(1H,d,J=14.9Hz),4.15(2H,q,J=7.1Hz),4.30(1H,d,J=14.9Hz),5.69-5.72(1H,m),5.86(1H,d,J=6.9Hz),8.41(1H,s).
MS(ESI)m/z：460[M+H]+.
(步驟5)
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(70mg，0.15mmol)之二烷-水-甲醇(15：7：10、3.2ml)混合溶液中添加氫氧化鋰一水合物(13mg，0.3mmol)，並於室溫中攪拌整夜。添加乙酸(26μl，0.46mmol)，並以含有10%甲醇的氯仿萃取，以無水硫酸鈉乾燥後，減壓 餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(60mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.33-1.50(2H,m),1.84-1.96(2H,m),2.01(3H,s),2.73-2.79(1H,m),3.16-3.23(1H,m),3.64-3.66(3H,m),3.81-3.86(1H,m),4.29-4.34(1H,m),5.95(1H,d,J=6.9Hz),6.09(1H,d,J=6.9Hz),7.03(1H,br s),8.75(1H,s).
MS(ESI)m/z：432[M+H]+.
實施例46
6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
(步驟1)
6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯
使用實施例45之步驟3所獲得的化合物及4-胺基-1-甲基哌啶，藉由與實施例45之步驟4相同之手法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.23(3H,t,J=7.2Hz),1.49-1.58(2H,m),1.65(6H,s),1.85(2H,d,J=12.0Hz),1.96-2.02(2H,m),2.17(3H,s),2.74-2.79(2H,m),3.55(2H,s),4.15(2H,q,J=7.1Hz),5.64-5.67(1H,m),5.82 (1H,d,J=6.9Hz),8.40(1H,s).
MS(ESI)m/z：432[M+H]+.
(步驟2)
6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
於6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲酸 乙酯(159mg，0.37mmol)之二烷-水-甲醇(3：1：1、5ml)混合溶液中添加氫氧化鋰一水合物(93mg，2.21mmol)，室溫中攪拌整夜。添加乙酸(148μl，2.58mmol)作成酸性後，添加氨水而作成鹼性，以含有10%甲醇的氯仿萃取，以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(110mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.52-1.61(2H,m),1.69(6H,s),1.82-1.88(2H,m),1.96-2.03(3H,m),2.17(3H,s),2.73-2.80(2H,m),3.23-3.31(1H,m),3.64(2H,s),5.91(1H,d,J=6.9Hz),6.05(1H,d,J=6.3Hz),7.01(1H,br s),8.73(1H,s).
MS(ESI)m/z：404[M+H]+.
實施例47
8-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-6-胺基-7-氟-1,1-二甲 基-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例45之步驟4獲得的化合物(80mg、0.17mmol)中添加氨-甲醇溶液(8N、1ml)、氨水(1ml)，於封菅中100度攪拌一晚。濃縮後，以劃分用薄層層析(氯仿：甲醇=1：1)及逆相層析(水-乙腈系)純化，獲得呈固體之標題化合物(25mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.32-1.50(2H,m),1.68(6H,s),1.85-1.97(2H,m),2.01(3H,s),2.75-2.80(1H,m),3.16-3.22(1H,m),3.54-3.61(9H,m),3.83(1H,d,J=12.0Hz),4.30(1H,d,J=12.0Hz),5.70-5.74(1H,m),5.89(1H,d,J=6.9Hz),6.85(1H,d,J=5.2Hz).
MS(ESI)m/z：431[M+H]+.
實施例48
6-胺基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫咪唑并[1,2-a]喹啉-4-甲醯胺
於實施例46之步驟1所獲得的化合物(200mg、0.46mmol)中添加氨-甲醇溶液(8M、1ml)、氨水(50ml)，並於封菅中80度攪拌一晚。濃縮後，添加甲酸而加以中和，以逆相層析(水-乙腈系)及超臨界層析(甲醇40%)純化 ，獲得呈固體之標題化合物(45mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.53-1.63(2H,m),1.66(6H,s),1.88(2H,d,J=11.5Hz),2.13(2H,t,J=11.5Hz),2.24(3H,s),2.84(2H,d,J=11.5Hz),3.22-3.32(1H,m),3.59(2H,s),5.77(1H,d,J=6.9Hz),5.84(1H,d,J=6.9Hz),6.91(1H,d,J=5.2Hz),8.19(1H,s),9.39(1H,s),9.73(1H,d,J=5.2Hz).
MS(ESI)m/z：403[M+H]+.
實施例49
6-胺基-9-氯-4-氰基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫咪唑并[1,2-a]喹啉-3(5H)-甲酸
(步驟1)
2-(氰基甲基)-4,4-二甲基-4,5-二氫-1H-咪唑-1-甲酸 tert-丁酯
於乙基 2-氰基乙烷亞胺酯(imidate)鹽酸鹽(5.12g、34.5mmol)之乙醇溶液(130ml)中添加1,2-二胺基-2-甲基丙烷(3.93ml，37.9mmol)，並於室溫中攪拌2小時。餾除溶媒後，添加四氫呋喃(300ml)與飽和碳酸氫鈉水(150ml)、二碳酸二tert-丁酯(8.27g，37.9mmol)並於室溫中攪拌1小時。以乙酸乙酯萃取，以飽和食鹽水洗淨。減壓餾除溶媒，殘留物以矽膠層析(乙酸乙酯-己烷系)純化，獲得 呈固體之標題化合物(1.24g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.29(3H,s),1.34(3H,s),1.52(9H,s),3.45(1H,s),3.53(1H,s),3.59(2H,s).
MS(ESI)m/z：436[M+H]+.
(步驟2)
6-胺基-9-氯-4-氰基-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2-二氫咪唑并[1,2-a]喹啉-3(5H)-甲酸 tert-丁酯
於3-氯-2,4,5-三氟-6-硝基苯甲酸(858mg，3.36mmol)之二氯甲烷溶液中添加草醯氯(0.32ml)及N,N-二甲基甲醯胺(1滴)，並攪拌3小時。將減壓濃縮反應物的殘留物之甲苯溶液(30ml)滴入2-(氰基甲基)-4,4-二甲基-4,5-二氫-1H-咪唑-1-甲酸 tert-丁酯(817mg，3.44mmol)之甲苯溶液(10ml)中，室溫中攪拌2小時。添加三乙胺(436μl，3.13mmol)，攪拌一晚。添加飽和碳酸氫鈉水，以氯仿萃取，並以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒。於殘留物(1.49g)之丙酮溶液(30ml)中添加碳酸鉀(520mg、3.76mmol)，室溫中攪拌3小時。添加水，以氯仿萃取，以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒。添加乙酸乙酯，並濾取析出的固體。於獲得的固體(620mg)之N,N-二甲基甲醯胺(10ml)溶液中添加10%鈀碳(AD，濕重，120mg)，氫氣環境下，室溫中攪拌一晚。過濾後，濃縮母液，殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題 化合物(560mg)。
MS(ESI)m/z：425[M+H]+.
(步驟3)
6-胺基-9-氯-4-氰基-7-氟-1,1-二甲基-8-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-1,2-二氫咪唑并[1,2-a]喹啉-3(5H)-甲腈
於6-胺基-9-氯-4-氰基-7,8-二氟-1,1-二甲基-5-側氧-1,2-二氫咪唑并[1,2-a]喹啉-3(5H)-甲酸 tert-丁酯(150mg)之N-甲基吡咯啶酮溶液(5ml)中添加4-胺基-1-甲基哌啶(266μl、2.12mmol)，並於130度攪拌一晚。餾除溶媒，溶解於二甲亞碸後，添加甲酸並作成酸性後，以逆相矽膠層析(水-乙腈系)純化，獲得呈固體之標題化合物(20mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.58-1.67(2H,m),1.76(6H,s),2.02-2.09(2H,m),2.19(2H,t,J=10.6Hz),2.32(3H,s),2.78-2.87(2H,m),3.22-3.31(1H,br m),3.66(2H,s),4.17-4.22(1H,m),5.85(1H,d,J=6.9Hz),6.37(1H,s),6.64(1H,br s).
MS(ESI)m/z：385[M+H]+.
實施例50
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
(步驟1)
2-氯-3-氟-4-[(4-甲氧基苄基)胺基]-9,9-二甲基-5-側氧-8,9-二氫-5H-咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6,7-二甲酸 7-苄基酯 6-乙基酯
於實施例35之步驟1獲得的化合物(5g、17.3mmol)中添加亞硫醯氯(8ml)、N,N-二甲基甲醯胺(3滴)，並於70℃攪拌2小時。減壓餾除溶媒，於殘留物中添加甲苯，再度減壓餾除溶媒，溶解於四氫呋喃(50ml)。添加實施例45之步驟1所獲得的化合物(6.1g、19mmol)之四氫呋喃(10ml)溶液後，添加碳酸氫鈉(1.5g)，並於50℃攪拌8小時後，於室溫中攪拌10小時。將反應混合物分配於乙酸乙酯-飽和碳酸氫鈉水，有機層以硫酸鎂乾燥。減壓餾除溶媒，殘留物以矽膠層析(己烷：乙酸乙酯=6：4)粗製純化，獲得油狀物(6.85g)。
於上述油狀物(6.85g)中添加乙腈(30ml)、p-甲氧基苄基胺(4.7ml)，並於50℃攪拌2小時。再添加p-甲氧基苄基胺(1ml)，於同溫攪拌2小時。將反應混合物分配於乙酸乙酯-水，有機層以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(己烷：乙酸乙酯=9：1~3：7)純化，獲得呈固體之標題化合物(2.2g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.27(3H,t,J=7.2Hz),1.68 (3H,s),1.69(3H,s),3.79(3H,s),3.98(2H,s),4.22(2H,q,J=7.2Hz),4.59(2H,d,J=5.5Hz),5.24(2H,s),6.82-6.85(2H,m),7.27-7.30(2H,m),7.35-7.38(5H,m),10.62(1H,t,J=5.5Hz).
(步驟2)
2-氯-3-氟-4-[(4-甲氧基苄基)胺基]-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸
將2-氯-3-氟-4-[(4-甲氧基苄基)胺基]-9,9-二甲基-5-側氧-8,9-二氫-5H-咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6,7-二甲酸 7-苄基酯 6-乙基酯(299mg、0.33mmol)溶解於四氫呋喃(3ml)-甲醇(3ml)，添加氫氧化鋰一水合物(56mg、1.32mmol)、水(1ml)，並攪拌3日。於反應混合物中添加1M鹽酸(1.35ml)，並分配於乙酸乙酯-飽和食鹽水。有機層以硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒，於殘留物中添加二乙基醚，濾取不溶物、乾燥，獲得呈固體之標題化合物(106mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.79(3H,s),1.80(3H,s),3.78-3.81(5H,m),4.63(2H,d,J=5.5Hz),6.86-6.90(2H,m),7.29-7.33(2H,m),9.20(1H,s),10.04-10.09 (1H,m).
(步驟3)
4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
於2-氯-3-氟-4-[(4-甲氧基苄基)胺基]-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸(87mg，0.19mmol)之二氯乙烷懸浮液(2ml)中添加氯化銨(208mg，3.89mmol)、六氟磷酸(苯并三唑1-基氧基)三吡咯啶鏻(122mg、0.23mmol)、三乙胺(814μl，5.84mmol)，並於室溫中攪拌一晚。以含有10%甲醇之氯仿稀釋，以1M氫氧化鈉水溶液洗淨。以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒，添加乙酸乙酯，濾取析出的固體。於獲得的固體(75mg)之二氯甲烷懸浮液(2ml)中添加三氟乙酸(149μl，2.02mmol)，並於室溫中攪拌4小時。餾除溶媒後，添加氨水作成鹼性，濾取析出物，獲得呈固體之標題化合物(45mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.90(6H,s),3.63-3.65(2H,br m),9.21(1H,br s).
MS(ESI)m/z：326[M+H]+.
(步驟4)
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
於4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺(360mg、1.11mmol)之二甲亞碸溶液(18ml)中添加4-胺基-1-甲基哌啶(1.39ml、11.1mmol)，微波照射下，於150度攪拌15分鐘。添加氨水，並以含有10%甲醇之氯仿萃取，以無水硫酸鈉乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(315mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.54-1.64(8H,m),1.74-1.80(2H,m),1.95(2H,br s),2.18(3H,s),2.75-2.83(2H,m),3.63(2H,s),3.85-3.92(1H,m),6.47(1H,br s),6.65(1H,d,J=6.9Hz),6.97(1H,d,J=5.2Hz),9.47(1H,br s),9.68(1H,d,J=5.2Hz),9.90(1H,s).
MS(ESI)m/z：404[M+H]+.
實施例51
2-[(1-乙醯基哌啶-4-基)胺基]-4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺
於實施例50之步驟3獲得的4-胺基-2-氯-3-氟-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫咪唑并[1,2-a][1,8]啶-6-甲醯胺(300mg)之二甲亞碸溶液(10ml)中添加1-(4-胺基哌啶-1-基)乙酮(1.12g、7.88mmol)，並於微波照射下，於150度攪拌15分鐘。添加氨水，並以含有10%甲醇之氯仿萃取，以無水硫酸鎂乾燥後，減壓餾除溶媒。殘留物以矽膠層析(氯仿-甲醇系)純化，獲得呈固體之標題化合物(155mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.32-1.52(2H,m),1.62(6H,s),1.78-1.91(2H,m),2.01(3H,s),2.60(1H,t,J=12.6Hz),3.08(1H,t,J=12.6Hz),3.63(2H,s),3.84(1H,d,J=13.7Hz),4.09-4.18(1H,m),4.37(1H,d,J=12.6Hz),6.49(1H,br s),6.72(1H,d,J=8.0Hz),6.99(1H,d,J=4.9Hz),9.50(1H,br s),9.68(1H,d,J=4.9Hz),9.90(1H,s).
MS(ESI)m/z：464[M+H]+.
實施例52
4-胺基-3-氟-9,9-二甲基-2-[(1-甲基哌啶-4-基)胺基]-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸甲酸鹽
於實施例35之步驟5獲得的化合物(70mg、0.21mmol)與1-甲基哌啶-4-胺(49mg、0.43mmol)之N-甲基吡咯啶酮(1ml)溶液中添加三乙胺(60μl，0.43mmol)，並於100℃攪拌3日。反應混合物以逆相HPLC[乙腈：水：甲酸]純化、減壓濃縮後，獲得的殘渣藉由乙酸乙酯洗淨而獲得呈固體之目標物(25mg)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：1.61-1.71(2H,m),1.75(6H,s),1.80-1.86(2H,m),2.00-2.07(2H,m),2.13(2H,t,J=7.8Hz),2.23(3H,s),2.86-2.91(2H,m),3.57(2H,t,J=7.8Hz),3.79-3.88(1H,m),6.58-8.61(2H,m),7.23(1H,d,J=7.8Hz),8.17(1H,s).
MS(ESI)m/z：404[M+H]+.
實施例53
4-胺基-3-氟-2-[{1-(2-羥基-2-甲基丙基)哌啶-4-基}胺基]-9,9-二甲基-5-側氧-5,7,8,9-四氫吡咯并[1,2-a][1,8]啶-6-甲酸鹽酸鹽
於實施例35之步驟5獲得的化合物(500mg、1.5mmol)及1-(4-胺基哌啶-1-基)-2-甲基丙烷-2-醇(397mg、 2.3mmol)之二甲亞碸(10ml)溶液中添加三乙胺(1.1ml、7.7mmol)並於微波照射下於150℃攪拌6小時。減壓餾除溶媒後，殘渣以矽膠管柱層析[氯仿：甲醇=99：1→9：1(v/v)]純化。獲得的殘渣以甲醇稀釋後，添加4N鹽酸-二烷溶液並攪拌。減壓餾除溶媒後，於獲得的殘渣中添加異丙醇與乙酸乙酯並加以固化，獲得呈固體之目標物(150mg)。
1H-NMR(D2O+NaOD)δ：1.55-1.63(2H,m),1.71(6H,s),1.89-1.92(2H,m),2.14(2H,t,J=7.9Hz),2.31-2.36(2H,m),2.44(2H,s),2.99-3.03(2H,m),3.10(2H,t,J=7.8Hz),3.88-3.94(1H,m).
ESI-MS m/z：462[M+H]+.
實施例54
6-胺基-7,9-二氟-1,1-二甲基-8-[{1-(2-羥基-2-甲基丙基)哌啶-4-基}胺基]-5-側氧-1,2,3,5-四氫吡咯并[1,2-a]喹啉-4-甲酸
使用實施例17之步驟5獲得的化合物及1-(4-胺基哌啶-1-基)-2-甲基丙烷-2-醇，以與實施例17同樣之方法，獲得呈固體之標題化合物。
1H-NMR(D2O+NaOD)δ：1.21(6H,s),1.52-1.59(2H,m),1.65(3H,s),1.66(3H,s),1.87-1.93(2H,m),2.17-2.27(4H,m),2.37(2H,s),2.92-2.95(2H,m),3.11 (2H,t,J=7.5Hz),3.53-3.677(1H,m).
ESI-MS m/z：479(M+H)+.
(試驗例1 GSK-3抑制活性)
測定被驗化合物存在下或非存在下的GSK3之激酶活性。基質胜肽係因GSK3之激酶活性而受到磷酸化。藉由激酶被磷酸化的基質與未磷酸化的基質相比，因與磷酸基相當之電荷而變成負(陰性)，此變化以電泳原理加以分離(Mobility Shift Assay法)，定量磷酸化的程度。
(1)試料的調製及酵素反應
使用於人類之GSK3β全長(1-420胺基酸)之N末端側導入GST標籤，且於昆蟲細胞中呈病毒依存性表現的GST-GSK3蛋白(GSK3β，Carna Biosciences)。
其次，調製含上述之GST-GSK3蛋白與100mM HEPES(pH7.4)、0.003% Brij-35、0.004% Tween-20、1mM DTT、10mM MgCl2的GSK3β酵素溶液，並分注於384孔盤(Corning)。
被驗化合物係溶解於DMSO，使用DMSO調製稀釋系列(dilution series)。將此化合物溶液添加於經分注的GSK3酵素溶液，混合後，於室溫中進行30分鐘的預培育。
於含上述被驗化合物的孔中添加基質溶液(100mM HEPES(pH7.4)、0.003% Brij-35、0.004% Tween-20、1mM DTT、10mM MgCl2、ATP(最終濃度20μM)、FL-Peptide 15(Caliper Life Sciences)，混合後，於28℃放置1.5小時，使酵素反應進行。
確認酵素反應之進行的陽性對照組係使用DMSO替代化合物溶液，酵素反應未進行的陰性對照組係使用基質溶液去除ATP者來替代基質溶液，並進行同樣的操作。
(2)酵素反應的檢出
於酵素反應後，各孔中添加反應停止液(100mM HEPES(pH7.4)、0.015% Brij-35、40mM EDTA、0.1% Coating Reagent 3(Caliper Life Sciences)後，使用Caliper Life Sciences公司之EZ Reader II而分離經磷酸化的基質與未經磷酸化的基質，測定基質胜肽經磷酸化的比率(Conversion)與抑制活性(Inhibition)。藉由將測定值擬合S形(Sigmoid)曲線，算出化合物顯示50%抑制的濃度作為GSK3β酵素抑制活性之IC50值。
各實施例化合物之IC50值係20nM以下。
(試驗例2 LY2090314與各種抗DR5抗體之活體外併用效果的檢討)
將人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11(美國ATCC公司)以2×104個細胞/孔接種於96孔盤並培養一晚。作成於其中添加LY2090314之稀釋系列於各孔的細胞群、或添加LY2090314之稀釋系列以及抗DR5抗體(最終濃度1μg/mL)與交聯用之2次抗體(山羊抗人類IgG抗體、MP Biomedicals，LLC、Cat#：55071、最終濃度2μg/mL)溶液於各孔的細胞群，再培養1日。之後，於各孔中添加CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega)或凋亡蛋白酶-GloTM 3/7 Assay(Promega)之試 藥，各自將細胞內ATP量之變化(反映細胞數)或細胞內凋亡蛋白酶3/7活性(細胞死亡之誘導)作為發光量來測定。於凋亡蛋白酶3/7活性，被測定的數值，除以CellTiter-GloTM之發光量數值(反映細胞數)，作為每單位細胞的凋亡蛋白酶活性。未含被驗化合物的孔的細胞所示每單位細胞的凋亡蛋白酶活性之數值作為1的情形，評價以被驗物質或抗體處理的細胞之凋亡蛋白酶活性之誘導倍率。起因於抗DR5抗體之對藥效的效果確認係與上述之非添加抗DR5抗體之細胞群的比較下進行。於本試驗，使用的抗DR5抗體係hB273、hTRA8、及可那木單抗。
結果示於第1-1圖~第1-3圖。
(試驗例3 實施例化合物(化合物)18、21、27、36、37、39、52、53、54與hB273之活體外併用效果之檢討)
將人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11(美國ATCC公司)以2×104個細胞/孔接種於96孔盤而培養一晚。作成於其中添加化合物18、21、27、37、39、52、53之稀釋系列於各孔的細胞群、或添加化合物18、21、27、37、39、52、53或54之稀釋系列以及hB273(最終濃度10μg/mL)與交聯用之2次抗體(山羊抗人類IgG抗體、MP Biomedicals，LLC、Cat#：55071、最終濃度20μg/mL)溶液於各孔的細胞群，再培養1日。之後，將CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega)或凋亡蛋白酶-GloTM 3/7 Assay(Promega)添加於各孔，各自將細胞內ATP量之變化(反映細胞數)或細胞 內凋亡蛋白酶3/7活性(細胞死亡之誘導)作為發光量來測定。於凋亡蛋白酶3/7活性，將被測定的數值除以CellTiter-GloTM之發光量之數值(反映細胞數)，作為每單位細胞之凋亡蛋白酶活性。未含被檢化合物的孔的細胞所示每單位細胞的凋亡蛋白酶活性之數值作為1的情形，評價以被驗物質或抗體處理的細胞之凋亡蛋白酶活性的誘導倍率。起因於hB273之對藥效的效果確認係與上述之非添加抗DR5抗體之細胞群的比較下進行。
結果示於第2-1圖~第2-9圖。
(試驗例4 化合物18、36、37、39、53、54與可那木單抗或hTRA8之活體外併用效果之檢討)
將人類急性淋巴性白血病細胞株RS4；11(美國ATCC公司)以2×104個細胞/孔接種於96孔盤而培養一晚。作成於其中添加化合物18、36、37、39、53或54之稀釋系列於各孔的細胞群、或添加化合物18、36、37、39、53或54之稀釋系列以及可那木單抗或hTRA8(最終濃度10μg/mL)、與交聯用之2次抗體(山羊抗人類IgG抗體、MP Biomedicals，LLC、Cat#：55071、最終濃度20μg/mL)溶液於各孔的細胞群，再培養1日。之後，添加CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega)或凋亡蛋白酶-GloTM 3/7 Assay(Promega)於各孔，各自將細胞內ATP量之變化(反映細胞數)或細胞內凋亡蛋白酶3/7活性(細胞死亡的誘導)作為發光量來測定。於凋亡蛋白酶3/7活性，將測定的數值除以CellTiter-GloTM之發光量之數值(反映細胞數)，作為每單 位細胞之凋亡蛋白酶活性。未含被檢化合物的孔之細胞將所示每單位細胞的凋亡蛋白酶活性之數值作為1的情形，評價以被檢物質或抗體處理的細胞之凋亡蛋白酶活性之誘導倍率。起因於hTRA8或可那木單抗之對藥效的效果確認係與上述之非添加抗DR5抗體之細胞群之比較下進行。
結果示於第3-1圖~第3-6圖、第4-1圖~第4-6圖。
(試驗例5 藉由化合物21與hB273之併用而對各種細胞株之活體外併用效果之檢討)
將人類黑色素瘤細胞株A375(美國ATCC公司)以5×103個細胞/mL、人類骨髓瘤細胞株NCI-H929以5×103個細胞/mL、人類慢性骨髓性白血病細胞株K562以2×104個細胞/孔，各自接種於96孔盤而培養一晚。作成於其中添加化合物21之稀釋系列於各孔的細胞群、或添加化合物21之稀釋系列以及hB273(最終濃度10μg/mL)與交聯用之2次抗體(山羊抗人類IgG抗體、MP Biomedicals，LLC、Cat#：55071、最終濃度20μg/mL)溶液於各孔的細胞群，再培養1日。之後，於各孔添加CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega)或凋亡蛋白酶-GloTM 3/7 Assay(Promega)，各自將細胞內ATP量之變化(反映細胞數)或細胞內凋亡蛋白酶3/7活性(細胞死亡之誘導)作為發光量來測定。於凋亡蛋白酶3/7活性，將被測定的數值除以CellTiter-GloTM之發光量之數值(反映細胞數)，作為每單位細胞之凋亡蛋白酶活性。未含被檢化合物的孔的細胞所示每單位細胞之凋亡蛋白酶活性之 數值作為1的情形，評價經被檢物質或抗體處理的細胞之凋亡蛋白酶活性之誘導倍率。對藉由抗DR5抗體之藥效之效果確認係於與上述之非添加抗DR5抗體之細胞群之比較下進行。
結果示於第5-1圖~第5-3圖。
(試驗例6 LY2090314與各種抗DR5抗體之活體內併用效果之檢討)
將A375細胞調整為4×107個細胞/mL，將腫瘤細胞懸浮液移植0.1mL至BALB/c裸鼠(雌性、5~7週齡)之皮下，確認腫瘤體積的平均超過100mm3後，使用腫瘤體積值進行分組，將LY2090314以100mg/kg或200mg/kg強制經口投與小鼠，再於併用投與組中將抗DR5抗體由尾靜脈投與。自投與開始第4日，再將LY2090314以100mg/kg或200mg/kg強制經口投與小鼠。從而，LY2090314係2次投與、抗DR5抗體係初日僅1次投與。經時地以電子數位游標卡尺計測腫瘤的長徑(mm)及短徑(mm)，藉由以下所示計算式(4)，評價判定日(投與1週後)之腫瘤增殖抑制率(GI%)。
GI(%)=(1-A/B)×100‧‧‧(4)
A：化合物投與組之判定日之平均腫瘤體積(＊)
B：無處置對照組之判定日之平均腫瘤體積(＊)
＊：腫瘤體積係以1/2×[腫瘤長徑]×[腫瘤短徑]×[腫瘤短徑]而算出。於本試驗，使用的抗DR5抗體及其投與量係hB273(3mg/kg)、hTRA8(10mg/kg)及可那木單抗(3mg/kg)。
結果示於第6-1圖~第6圖-3及表1~表3。
(試驗例7 化合物18、21、27、36、53、54與hB273之活體內併用效果之檢討)
將A375細胞調整為4×107個細胞/mL，將腫瘤細胞懸浮液移植0.1mL於BALB/c裸鼠(雌性、5~7週齡)之皮下，確認腫瘤體積之平均為超過100mm3後，使用腫瘤體積值進行分組，以表中所示濃度強制經口投與度被驗化合物於小鼠，再於併用投與組，以3mg/kg由尾靜脈投與hB273。投與係初日僅1次，經時地以電子數位游標卡尺計測腫瘤之長徑(mm)及短徑(mm)，藉由以下所示計算式(4)，評價判定日(投與1週後)之腫瘤增殖抑制率(GI%)。
GI(%)=(1-A/B)×100‧‧‧(4)
A：化合物投與組之判定日之平均腫瘤體積(＊)
B：無處置對照組之判定日之平均腫瘤體積(＊)
＊：腫瘤體積係以1/2×[腫瘤長徑]×[腫瘤短徑]×[腫瘤短徑]而算出。
結果示於第7-1圖至第7-3圖及表4~表9。
(試驗例8 化合物21、18與hB273之活體內併用效果之檢討)
將RS4；11細胞調整為1×108個細胞/mL，將腫瘤細胞懸浮液移植0.1mL於NOD/scid小鼠(雌性、4~5週齡)之皮下，確認腫瘤體積之平均超過100mm3後，使用腫瘤體積值進行分組，被驗化合物以表中所示濃度強制經口投與小鼠，再於併用投與組以3mg/kg由尾靜脈投與hB273。投與係初日僅1次，經時地以電子數位游標卡尺計測腫瘤的長徑(mm)及短徑(mm)，藉由以下所示計算式(4)，評價判定日(投與1週後)之腫瘤增殖抑制率(GI%)。
GI(%)=(1-A/B)×100‧‧‧(4)
A：化合物投與組之判定日之平均腫瘤體積(＊)
B：無處置對照組之判定日之平均腫瘤體積(＊)
＊：腫瘤體積係以1/2×[腫瘤長徑]×[腫瘤短徑]×[腫瘤短徑]而算出。
結果示於第8圖及表10、表11。
<110> 第一三共股份有限公司
<120> GSK3抑制劑與抗DR5抗體之組合
<130> FP1337
<160> 10
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hTRA8之重鏈胺基酸序列
<220>
<223> 發明人：Wakita,Kenichi；Shimazaki,Naomi
<223> 發明人：Iwasaki,Shiho
<400> 1
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hTRA8之輕鏈胺基酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 452
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hB273之重鏈胺基酸序列
<400> 3
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hB273之輕鏈胺基酸序列
<400> 4
<210> 5
<211> 452
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 可那木單抗(Conatumumab)之重鏈胺基酸序列
<400> 5
<210> 6
<211> 215
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 可那木單抗(Conatumumab)之輕鏈胺基酸序列
<400> 6
<210> 7
<211> 451
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 托利單抗(drozitumab)之重鏈胺基酸序列
<400> 7
<210> 8
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 托利單抗(drozitumab)之輕鏈胺基酸序列
<400> 8
<210> 9
<211> 451
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 來沙木單抗(Iexatumumab)之重鏈胺基酸序列
<400> 9
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 來沙木單抗(Iexatumumab)之輕鏈胺基酸序列
<400> 10

Claims (17)

  1. 一種用以治療癌症之醫藥，其特徵為組合投與肝醣合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)抑制劑、及抗死亡受體5(death receptor，DR5)抗體。
  2. 如請求項1之醫藥，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體係各自作為相異製劑之有效成分而被含有，被於同時或相異時間投與。
  3. 如請求項1之醫藥，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體係被含於單一製劑中。
  4. 如請求項1之醫藥，其係含有肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體的套組製劑。
  5. 一種癌症之治療方法，其特徵為組合肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑與抗死亡受體5(DR5)抗體而投與。
  6. 如請求項1至4中任一項之醫藥，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑為LY2090314或下述通式(1)所表示的化合物或其鹽， [式中，R1表示羧基、胺甲醯基或氰基，R2表示甲基或氫原子，R3表示鹵素原子，R4表示可具有選自下述A群的取代基的哌啶基、可 具有選自下述A群的取代基的吡啶基、可具有選自下述A群的取代基的環己基或氫原子，X1表示C-H、C-F或N，X2表示CH2、N-H或S]；A群：可經1~3個之鹵素原子、羥基或甲氧基取代的C1-C6烷基、乙醯基、甲基磺醯基、羥基。
  7. 如請求項5之治療方法，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑為LY2090314或下述通式(1)所表示的化合物或其鹽， [式中，R1表示羧基、胺甲醯基或氰基，R2表示甲基或氫原子，R3表示鹵素原子，R4表示可具有選自下述A群的取代基的哌啶基、可具有選自下述A群的取代基的吡啶基、可具有選自下述A群的取代基的環己基或氫原子，X1表示C-H、C-F或N，X2表示CH2、N-H或S]；A群：可經1~3個之鹵素原子、羥基或甲氧基取代的C1-C6烷基、乙醯基、甲基磺醯基、羥基。
  8. 如請求項1至4中任一項之醫藥，其中肝醣合成酶激酶 3(GSK3)抑制劑係LY2090314或選自下列群的1個化合物或其鹽， 。
  9. 如請求項5之治療方法，其中肝醣合成酶激酶3(GSK3)抑制劑係LY2090314或選自下列群的1個化合物或其鹽， 。
  10. 如請求項1至4、6、8中任一項之醫藥，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號1所示的胺基酸序列之第1~449號的胺基酸殘基或第1~448號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號2所示的胺基酸序列之第1~213號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
  11. 如請求項1至4、6、8中任一項之醫藥，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號3所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號4所示的胺基酸序列之 第1~219號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
  12. 如請求項1至4、6、8中任一項之醫藥，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號5所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號6所示的胺基酸序列之第1~215號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
  13. 如請求項5、7、9中任一項之治療方法，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號1所示的胺基酸序列之第1~449號的胺基酸殘基或第1~448號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號2所示的胺基酸序列之第1~213號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
  14. 如請求項5、7、9中任一項之治療方法，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號3所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號4所示的胺基酸序列之第1~219號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
  15. 如請求項5、7、9中任一項之治療方法，其中抗死亡受體5(DR5)抗體係由序列識別號5所示的胺基酸序列之第1~452號的胺基酸殘基或第1~451號的胺基酸殘基而成的重鏈序列、及序列識別號6所示的胺基酸序列之第1~215號的胺基酸殘基而成的輕鏈序列而成的抗體。
  16. 如請求項1至4、6、8、10至12中任一項之醫藥，其中癌症為血液癌(白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤)、腦腫瘤、頭頸部癌、食道癌、胃癌、闌尾癌、大腸癌、肛門癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、胃腸道基質腫瘤(gastrointestinal stromal tumor)、肺癌、肝臟癌、中皮瘤(mesothelioma)、甲狀腺癌、腎臟癌、前列腺癌、神經內分泌腫瘤、黑色素瘤、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤(soft tissue sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肌肉瘤、腎臟癌、膀胱癌或睪丸癌。
  17. 如請求項5、7、9、13至15中任一項之治療方法，其中癌症為血液癌(白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤)、腦腫瘤、頭頸部癌、食道癌、胃癌、闌尾癌、大腸癌、肛門癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、胃腸道基質腫瘤、肺癌、肝臟癌、中皮瘤、甲狀腺癌、腎臟癌、前列腺癌、神經內分泌腫瘤、黑色素瘤、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、肌肉瘤、腎臟癌、膀胱癌或睪丸癌。
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