[go: up one dir, main page]

TW201402817A - Ｃｈｏ表現系統 - Google Patents

Ｃｈｏ表現系統 Download PDF

Info

Publication number
TW201402817A
TW201402817A TW102121230A TW102121230A TW201402817A TW 201402817 A TW201402817 A TW 201402817A TW 102121230 A TW102121230 A TW 102121230A TW 102121230 A TW102121230 A TW 102121230A TW 201402817 A TW201402817 A TW 201402817A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
sequence
cell line
seq
vector
cho cell
Prior art date
Application number
TW102121230A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI605123B (zh
Inventor
Catherine Devaud
Bruno Dumas
Nabil Lounis
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of TW201402817A publication Critical patent/TW201402817A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI605123B publication Critical patent/TWI605123B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/55—Vectors comprising a special origin of replication system from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/01—Acid-ammonia (or amine)ligases (amide synthases)(6.3.1)
    • C12Y603/01002—Glutamate-ammonia ligase (6.3.1.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本發明係屬產業蛋白質生產領域內。本發明發明者已設計及構築一種新穎的表現系統，其包含編碼人類或犬來源之麩醯胺酸合成酶之表現載體及CHO細胞系。更具體而言，本發明係關於以下各項之組合：(i)適於產生重組蛋白之DNA載體，其中該載體包含編碼麩醯胺酸合成酶之序列，及(ii)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，其中該GS包含與SEQ ID NO:1序列或SEQ ID NO:2序列至少94.5%一致之序列。

Description

CHO表現系統
本發明係在工業蛋白質生產領域內。本發明的發明者已設計及構築一種新穎的表現系統，其包含編碼人類或犬來源之麩醯胺酸合成酶之表現載體及CHO細胞系。更具體而言，本發明係關於以下各項之組合：(i)適於產生重組蛋白之DNA載體，其中該載體包含編碼麩醯胺酸合成酶之序列，及(ii)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，其中該GS包含與SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致之序列。
當以工業規模生產重組蛋白時，必須分離產生大量重組蛋白之純系。
將異源基因引入動物宿主細胞中並針對所添加基因之表現進行篩選係一個漫長且複雜的過程。該過程涉及轉染及具有穩定長期表現之純系之選擇以及針對重組蛋白之高表現速率的篩選。
當從表現載體產生表現重組蛋白之純系時，通常用編碼相同載體上之目標蛋白質及選擇標記二者的DNA載體轉染宿主細胞。因此，該表現載體包含容許選擇其中存在表現載體之純系的可選標記。該可選標記亦可導致發生共擴增，由此容許分離高生產者純系。
此項技術中已知若干種該等可選標記，包括例如G418、潮黴素(hygromycin)、嘌羅黴素(puromycin)、博來黴素(zeomycin)、二氫葉 酸還原酶(DHFR)、麩醯胺酸合成酶(GS)及次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)。具體而言，在工業重組蛋白生產領域中在真核細胞中，GS被廣泛用作可選標記。
更具體而言，WO 87/04462闡述使用麩醯胺酸合成酶(GS)作為可選標記。該等實例教示包含編碼中國倉鼠來源之GS之序列作為可選標記的表現載體。進一步顯示，該表現載體容許在將表現載體轉染至CHO細胞中之後產生重組蛋白，其中該重組蛋白係tPA。
儘管上述基於使用GS作為可選標記之CHO表現系統係早在80年代闡述，但直到現在其仍為此項技術中之標準。具體而言，尚未公佈對最初的GS可選標記之顯著改良。
實際上，韓國專利KR10-0267720揭示使用人類GS作為可選標記。然而，並未揭示所使用之人類GS之準確序列。此外，亦指明，技術效應(高產率)僅與人類GS及所使用之特定SV40啟動子(即缺少位置128至270之SV40啟動子)二者相關聯。
因此，當前業內需要容許分離大量表現期望產生之重組蛋白之純系的額外及/或改良的表現系統，該等純系中之至少一些純系展現高重組蛋白表現速率。
本發明的發明者已令人驚奇地發現，當在CHO細胞中產生重組蛋白時，使用人類或犬來源之GS比使用CHO來源之GS獲得較好結果(參見例如圖2及圖3)。
具體而言，已發現，使用人類來源之GS尤其有利，此乃因其容許分離比使用CHO來源之GS時更多的表現重組蛋白之純系，其中一些純系之重組蛋白表現量高於使用CHO來源之GS時之表現量(參見例如圖3)。
本發明之一個實施例提供中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，其包含去 氧核糖核酸(DNA)表現載體，且其中該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列及至少一個用於表現重組蛋白之表現盒，其中該GS包含與SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致之蛋白質序列；或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之蛋白質片段。在本發明之另一實施例中，該GS包含與SEQ ID NO：1之序列及SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致之序列。在本發明之另一實施例中，該GS包含與SEQ ID NO：1之序列至少97.5%一致之序列。在本發明之特定實施例中，該GS係人類GS且包含SEQ ID NO：1之序列。在本發明之另一實施例中，該GS係犬GS且具有SEQ ID NO：2之序列。
在本發明之又一實施例中，CHO細胞系包含去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列及至少一個用於表現重組蛋白之表現盒，其中已使得該編碼GS之序列之三聯體密碼偏向在CHO細胞中表現。在本發明之另一實施例中，該編碼GS之序列包含與SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之序列至少80%一致的序列。在本發明之特定實施例中，編碼GS之序列包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之序列。在本發明之另一實施例中，編碼人類GS之序列處於猿猴空泡形成病毒40(SV40)啟動子之控制下且重組蛋白係單株抗體。
在本發明之又一實施例中，CHO細胞系包含去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列及至少一個用於表現重組蛋白之表現盒，其中已使得該編碼GS之序列之三聯體密碼偏向在CHO細胞中表現。在另一實施例中，該載體包含適於選殖抗體輕鏈之第一表現盒及適於選殖抗體重鏈之第二表現盒。在再一實施例中，第一及第二表現盒各自包含CMV啟動子，且該CHO細胞系能夠在無血清培養基或無血清且無動物源性蛋白 質之培養基中生長。
在本發明之一個實施例中，CHO細胞系係以編號CCL-61寄存在ATCC之細胞系，或源自以編號CCL-61寄存在ATCC之細胞系。在本發明之另一實施例中，CHO細胞系容許獲得在將該載體轉染至以編號CCL-61寄存在ATCC之CHO細胞系中之後產生至少1mg/L重組蛋白之純系。
在本發明之又一實施例中，CHO細胞系包含去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且該載體包含麩醯胺酸合成酶(GS)核苷酸序列(即編碼麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列)及至少一個用於表現重組蛋白之表現盒。在一個實施例中，載體不含有用於表現重組蛋白之異源基因。在本發明之另一實施例中，載體含有至少一個編碼重組蛋白之序列。在另一實施例中，載體含有編碼重組蛋白之異源基因，該重組蛋白係單株抗體。在本發明之另一實施例中，載體含有編碼重組蛋白之異源基因，該重組蛋白係用於誘導抗體反應之免疫原性蛋白質。在本發明之另一實施例中，載體含有編碼重組蛋白之異源基因，該重組蛋白係用於酶替代療法或用於工業用途之酶。
本發明之一個實施例提供去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且該載體包含在猿猴空泡形成病毒40(SV40)啟動子之控制下的編碼麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列及在CMV啟動子之控制下的適於選殖異源重組蛋白之第一表現盒。在本發明之特定實施例中，GS包含與SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致之蛋白質序列；或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之片段。
本發明之另一實施例提供去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且該載體包含在猿猴空泡形成病毒40(SV40)啟動子之控制下的編碼麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列及在CMV啟動子之控制下的適於選殖抗 體輕鏈之第一表現盒，以及在CMV啟動子之控制下的適於選殖抗體重鏈之第二表現盒。在本發明之特定實施例中，GS包含與SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致之蛋白質序列或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之片段。
本發明之一個實施例提供如圖1中所定義之載體。
本發明之一個實施例提供產生重組蛋白之活體外方法，該方法包含以下步驟：提供CHO細胞系；在適於產生重組蛋白之條件下培養獲得之CHO細胞系；以及分離及/或純化該重組蛋白。另一實施例提供將重組蛋白調配成醫藥組合物之另外步驟。
本發明之一個實施例係關於以下各項之組合：i)真核細胞系(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系)；及ii)適於產生重組蛋白之DNA載體，其中該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之序列(例如包含與SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致之序列的GS)。
本發明之另一態樣係關於包含上述組合之套組。
本發明之又一態樣係關於DNA載體本身。
本發明之又一態樣係關於包含該DNA載體之CHO細胞系。
在又一態樣中，本發明係關於產生重組蛋白之活體外方法，該方法包含以下步驟：a)提供如上文所定義之載體；b)用該載體轉染細胞系；c)在適於產生重組蛋白之條件下培養步驟(b)中獲得之經轉染細胞系；及d)分離及/或純化該重組蛋白。
本發明之又一態樣係關於該組合、或該載體、或該細胞系用於在活體外產生重組蛋白之用途。
圖1顯示實例中所用載體(pBH3695、pBH3700、pBH3694、pBH3699、pBH3698、pBH3697及pBH3623)之圖示。
圖2顯示用經載體pBH3695、pBH3700、pBH3694、pBH3699、pBH3698、pBH3697及pBH3623轉化之CHO細胞系達成之佔用孔之數量及生產率。
圖3顯示對於載體pBH3695、pBH3700及pBH3623，由在圖2中所示實驗期間獲得之純系達成之生產率。每一棒代表一個純系。
圖4顯示在9E4細胞系中所實施實驗之結果。顯示獲得之生產率及純係數量。水平軸上之數字「0」表示未獲得純系(此係pBH3700、pBH3694、pBH3697、pBH3698及pBH3699載體之情形)。
圖5顯示SEQ ID NO：1之人類GS、SEQ ID NO：2之犬GS及SEQ ID NO：3之CHO GS之間的序列比對，其係使用「CLUSTAL 2.1多序列比對」程式來實施。用黑色箭頭指出人類及犬GS中與CHO GS相比不同之殘基。該等殘基對應於SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之殘基12、16、18、19、33、49、80、82、91、116、191、269、282、350、355及356(分別對應於12G、16V、18M、19S、33I、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、350S、355L及356I之胺基酸變異)。用灰色箭頭指出人類GS中與犬及CHO GS相比不同之殘基。該等殘基對應於SEQ ID NO：1之位置2、68、98、107、169、213處之殘基(分別對應於2T、68L、98L、107R、169R及213S之胺基酸變異)。
圖6顯示在用對照載體(對照1及對照2)以及分別表現13C3及抗CD38抗體之pBH3695及pBH3772載體瞬時轉染CHO-S細胞之後獲得之抗體濃度。
本發明之另一態樣係關於以下各項之組合：i)真核細胞系；及ii)適於產生重組蛋白之DNA(去氧核糖核酸)載體，其中該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之序列。
真核細胞系可為(例如)酵母細胞系(例如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)細胞系)、真菌細胞系(例如黑麴菌(Aspergillus niger)細胞系)、昆蟲細胞系或哺乳動物細胞系(包括但不限於CHO細胞系、人類細胞系(例如HEK293或PERC.6)、小鼠細胞系(例如NS0)及猴細胞系)。在特定實施例中，真核細胞系係CHO細胞系。由DNA載體編碼之GS源自異源哺乳動物物種，且可例如源自人類或犬。
在特定實施例中，該異源哺乳動物GS包含以下序列或由以下序列組成：- 與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中之至少一者至少94.5%一致，及/或- 由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個、150個、200個、250個、300個或350個連續胺基酸之片段組成。
該組合(另外稱為「本發明之組合」)構成表現系統。
更具體而言，本發明之一態樣係關於以下各項之組合：i)適於產生重組蛋白之DNA載體，其中該載體包含編碼麩醯胺酸合成酶(GS)之序列；及ii)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系；其中該GS包含以下序列：- 與SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致；或- 由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個、150個、200 個、250個、300個或350個連續胺基酸之片段組成。
本發明之組合可例如以套組形式提供，例如，其中一個小瓶包含DNA載體，且另一個小瓶包含細胞系。
當表現系統係用於產生重組蛋白時，將載體引入細胞系中(其可例如穩定或瞬時轉染至細胞系中)。
因此，本發明涵蓋：- 一方面載體存在於細胞系內之組合，及- 另一方面載體自細胞系分離之組合。
1. 本發明之載體
用於本發明之組合中之DNA載體(另外稱為「本發明之載體」)適於產生重組蛋白，且包含編碼麩醯胺酸合成酶(GS)之序列。
本文所用之術語「麩醯胺酸合成酶」或「GS」係指能夠催化麩胺酸鹽與氨縮合形成麩醯胺酸之多肽，如由以下生物化學反應所表示：ATP+L-麩胺酸鹽+NH3<=>ADP+磷酸鹽+L-麩醯胺酸。
該多肽分類在酶學委員會(Enzyme Commission)(EC)編號6.3.1.2下。能夠催化上述反應之多肽展現「GS活性」。
用於本發明框架中之GS(另外稱為「本發明之GS」)可包含與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中之至少一者至少94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%一致之序列或由該序列組成。實際上，已發現，該GS有利於在CHO細胞中用作可選標記(參見實例1)。其亦可包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個、150個、200個、250個、300個或350個連續胺基酸之片段或由該片段組成，前提係蛋白質保留其GS活性。
在特定實施例中，本發明之GS包含與SEQ ID NO：1之序列及SEQ ID NO：2之序列二者至少94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、 97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%一致之序列或由該序列組成。
在特定實施例中，本發明之GS包含與SEQ ID NO：1之序列至少97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%一致之序列或由該序列組成。該GS尤其有利於在CHO細胞中(參見實例1)、尤其在E94 CHO細胞系中(參見實例2)用作可選標記。
在特定實施例中，本發明之GS係人類GS，即，人類來源之GS。本文所用之術語「人類GS」係指包含SEQ ID NO：1或由其組成之序列，以及其展現GS活性之變體。該等變體可例如對應於天然存在於人類物種中之變體(例如對偶基因變體或剪接變體)。或者，該等變體可對應於藉由基因工程獲得之變體。最佳地，該等變體與SEQ ID NO：1相比與SEQ ID NO：1之序列之不同之處僅在於存在至多22個、20個、15個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸變異(該等變異包括取代、插入及缺失)。
在另一特定實施例中，本發明之GS係犬GS，即，犬來源之GS。本文所用之術語「犬GS」係指包含SEQ ID NO：2或由其組成之序列，以及其展現GS活性之變體。該等變體可例如對應於天然存在於犬物種中之變體(例如對偶基因變體或剪接變體)。或者，該等變體可對應於藉由基因工程獲得之變體。最佳地，該等變體與SEQ ID NO：2相比與SEQ ID NO：2之序列之不同之處僅在於存在至多22個、20個、15個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸變異(該等變異包括取代、插入及缺失)。
在特定實施例中，本發明之GS包含以下胺基酸中之至少1者、2者、3者、4者、5者、6者、10者、15者、16者、20者或22者：12G、16V、18M、19S、33I、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、350S、355L、356I、2T、68L、98L、107R、169R及 213S，其中數字表示在SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2上之位置，且字母表示胺基酸之類型(使用單字母基因密碼)。在更特定實施例中，本發明之GS包含以下胺基酸中之至少1者、2者、3者、4者、5者或6者：2T、68L、98L、107R、169R及213S。在另一更特定實施例中，本發明之GS包含以下胺基酸中之至少1者、2者、3者、4者、5者、6者、10者、15者或16者：12G、16V、18M、19S、33I、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、350S、355L及356I。與CHO GS相比，上述胺基酸似乎對人類及/或犬GS具有特異性(參見圖5)。
所謂具有與本發明查詢胺基酸序列至少(例如)95%「一致」之胺基酸序列的多肽意指，除去按查詢胺基酸序列的每100個胺基酸計目標多肽序列可包括至多5處胺基酸改變外，該目標多肽之胺基酸序列與查詢序列一致。換言之，為獲得具有與查詢胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列的多肽，目標序列中至多5%(5/100)之胺基酸殘基可經插入、缺失或用另一胺基酸取代。
在本申請案之框架中，一致性百分比係使用整體比對(即，兩個序列在其全長範圍內進行比較)來計算。比較兩個或更多個序列之一致性及同源性之方法在此項技術中已熟知。當實施整體比對時，可例如使用《needle》程式，當考慮兩個序列之全長時，該程式使用Needleman-Wunsch整體比對演算法(Needleman及Wunsch，1970 J.Mol.Biol.48：443-453)找出該兩個序列之最佳比對(包括空位)。此needle程式可在例如ebi.ac.uk全球資訊網網站上得到。本發明之一致性百分比較佳使用EMBOSS：：needle(整體)程式用等於10.0之「空位開放」參數、等於0.5之「空位擴展」參數及Blosum62矩陣來計算。
參考序列之變體與參考序列相比可包含突變，例如缺失、插入及/或取代。在取代之情形下，取代較佳對應於如下表中所指示之保守取代。
本發明之DNA載體包含編碼本發明之該GS的序列。編碼本發明之該GS的序列可為天然存在之核苷酸序列。或者，編碼該GS之序列之三聯體密碼可偏向在CHO細胞中表現。用於偏向序列以獲得最佳表現之軟體及演算法在此項技術中已知，且包括例如Raab等人(2010,Syst Synth Biol.4：215-25)中所述之演算法。此演算法不僅提供用於表現之最佳可得密碼，而且考慮GC含量及非所需DNA基序之不存在。
例如，編碼本發明GS之序列可包含與SEQ ID NO：8之序列(即編碼SEQ ID NO：1之人類GS之序列，其係經設計以便在CHO細胞中最佳表現)及/或SEQ ID NO：9序列(即編碼SEQ ID NO：2之犬GS之序列，其係經設計以便在CHO細胞中最佳表現)至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列或由該序列組成。
在特定實施例中，編碼本發明GS之序列包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9序列或由該序列組成。
在本發明DNA載體上，編碼本發明GS之序列可處於彼等熟習此項技術者所習知之任何啟動子之控制下。
例如，編碼本發明GS之序列可處於例如猿猴空泡形成病毒40(SV40)啟動子(例如晚期或早期SV40啟動子)之控制下。早期SV40啟動子係闡述於例如Benoist及Chambon(1981,Nature.290：304-10)及 Moreau等人(1981,Nucleic Acids Res.9：6047-68)中。具體而言，該SV40啟動子係全長啟動子。該SV40啟動子亦可具有含有72bp重複之複製起點。
在特定實施例中，該SV40啟動子並非位置128至270已移除之SV40啟動子，即該SV40啟動子並非闡述於韓國專利第10-0267720號中且轉化在1997年12月17日以寄存號KCTC 8860 P寄存於基因庫(Gene Bank)，生物工程研究所(Institute of Bioengineering)，KIST之大腸桿菌(E.coli)轉化體之SV40啟動子。
在另一特定實施例中，編碼本發明GS之序列未處於SV40啟動子之控制下。
適於產生重組蛋白之DNA載體在此項技術中已習知。該等DNA載體通常對應於包含複製起點及至少一個容許期望產生之重組蛋白之選殖及表現之表現盒的表現載體。表現盒通常包含5’非翻譯區(包含啟動子及視情況增強子序列或由其組成)、一或多個容許編碼重組蛋白之序列之選殖之限制位點、3’非翻譯區(例如多聚腺苷酸化信號)及視情況一或多個內含子。啟動子序列可對應於此項技術中熟知之任何強啟動子，例如人類CMV啟動子。本發明之載體可具有例如圖1中所繪示之結構，其在實例1中更詳細地予以解釋，前提係13C3之重鏈及輕鏈可被兩個其他編碼序列(例如編碼另一抗體之重鏈及輕鏈的序列)替換。
重組蛋白可對應於熟習此項技術者感興趣之任何蛋白質。本文所用之術語「蛋白質」意欲涵蓋肽(即小於50個胺基酸之胺基酸鏈)、多肽(即至少50個胺基酸之胺基酸鏈)、單體蛋白質(即由一條胺基酸鏈組成之蛋白質)及多聚蛋白質(即由兩條或更多條胺基酸鏈組成之蛋白質，例如單株抗體)。
本發明之載體通常包含與組成蛋白質之不同胺基酸鏈之數目一 致之數目的表現盒(例如在單體蛋白質或同二聚蛋白質之情形下一個表現盒，在異二聚蛋白質或單株抗體之情形下兩個表現盒等)。
或者，本發明之DNA載體可甚至在期望產生異二聚蛋白質或單株抗體時僅包含一個表現盒。在該情形下，編碼蛋白質之其他胺基酸鏈之序列存在於單獨表現載體上，將該單獨表現載體與本發明之載體共轉染至CHO細胞系中。
在特定實施例中，本發明之DNA載體可無表現盒。在該情形下，適於表現重組蛋白之表現盒存在於單獨載體上，將該單獨載體與本發明之載體共轉染至CHO細胞系中。
在整篇本申請案中，術語「重組蛋白」係指期望產生之任何重組蛋白。其可例如對應於治療性及/或預防性蛋白質，即意欲用作醫藥(包括疫苗)之蛋白質。在特定實施例中，期望產生之重組蛋白並非麩醯胺酸合成酶(GS)。在另一特定實施例中，期望產生之重組蛋白係抗體，例如單株抗體。在又一特定實施例中，期望產生之重組蛋白係抗原性蛋白質。在又一特定實施例中，期望產生之重組蛋白並非紅血球生成素(EPO)。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛含義使用且明確涵蓋任一同種型(例如IgG、IgM、IgA、IgD及IgE)之單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、抗體片段(例如Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段)及包含抗體片段之融合蛋白。與特定抗原反應之抗體可藉由重組方法(例如選擇噬菌體或類似載體中之重組抗體庫)或藉由用抗原或編碼抗原之核酸免疫動物產生。
本文所用之「單株抗體」係自一群實質上同源之抗體獲得的抗體，即，構成該群之抗體除可能含有天然存在之可少量存在的突變外基本上相同。該等抗體係針對單一表位(或在多特異性單株抗體之情 形下，表位之單一群組)且因此具有高度特異性。
典型之單株抗體由藉由二硫鍵連接之兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈構成。各重鏈及輕鏈含有恆定區及可變區。各可變區含有三個稱為「互補決定區」(「CDR」)或「超變區」之區段，其主要負責結合抗原之表位。其通常被稱為CDR1、CDR2及CDR3，自N-末端順序編號(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health,Bethesda,MD,1991)。可變區中保守程度較高之部分稱為「框架區」。
單株抗體可例如為鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體或完全人類抗體。
當期望產生之重組蛋白係單株抗體時，本發明之載體可包含適於選殖抗體輕鏈之第一表現盒及適於選殖抗體重鏈之第二表現盒。
在特定實施例中，該第一及第二表現盒各自包含巨細胞病毒(CMV)啟動子，例如來自人類或鼠類CMV之CMV啟動子。更具體而言，該第一及第二表現盒可包含：- CMV立即早期增強子啟動子(例如，具有闡述於Teschendorf等人，2002,Anticancer Res.22：3325-30中之序列者)；或- 來自小鼠CMV之IE2啟動子/增強子區(例如，具有闡述於Chatellard等人，2007,Biotechnol Bioeng.96：106-17中之序列者)；或- hCMV-MIE調控元件(例如，具有闡述於WO 89/01036中之序列者)。
術語「抗原性蛋白質」在本文中係以最廣泛含義使用且涵蓋能夠單獨或與佐劑組合產生免疫反應之任何蛋白質。其可意欲用於預防性疫苗或治療性疫苗中。在特定實施例中，抗原性蛋白質係疫苗蛋白質，即意欲用於預防性疫苗中之蛋白質。
在本發明之框架中，DNA載體可包含至少一個編碼目標重組蛋 白之序列(例如一個編碼單體蛋白質之序列，一個編碼抗體鏈之序列，或兩個分別編碼抗體輕鏈及抗體重鏈之序列)，或其可為空的(即無編碼目標重組蛋白之該序列)。
在一個態樣中，本發明係關於本發明之載體本身。該載體較佳意欲用於CHO細胞系中。然而，其亦可用於在諸如酵母、真菌、昆蟲或哺乳動物(例如人類、小鼠、猴等)細胞系等其他真核細胞系中表現蛋白質。
2. 本發明之細胞系
用於本發明之組合中之細胞系(另外稱為「本發明之細胞系」)係真核細胞系，例如哺乳動物細胞系，例如CHO細胞系。CHO細胞系常用於工業蛋白質生產，且許多CHO細胞系已為熟習此項技術者所習知。例如，該等CHO細胞系包括(例如)CHO-K1細胞系(ATCC編號：CCL-61)、CHO DP-12細胞系(ATCC編號為CRL-12444及12445)及CHO 1-15細胞系(ATCC編號為CRL-9606)。該等品系可自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)公開獲得。
在特定實施例中，本發明之CHO細胞系能夠在無血清培養基(例如化學成分確定之培養基)及/或懸浮液中生長。該細胞系可容易地由熟習此項技術者藉由使母代細胞系適應在無血清培養基及/或懸浮液中生長(例如經由單細胞選殖、經由逐漸適應及/或經由「饑餓與挽救(starve and save)」過程)來獲得。
本發明之CHO細胞系可為GS缺陷細胞系或包含編碼內源GS多肽之內源GS基因之細胞系。
在特定實施例中，CHO細胞系係以編號CCL-61寄存在ATCC之細胞系。本文所用之術語「以編號CCL-61寄存在ATCC之細胞系」一方面涵蓋實際寄存在ATCC之母代純系，且另一方面涵蓋經由例如單細胞選殖、逐漸適應及/或「饑餓與挽救」過程源自母代純系之純系。 更具體而言，可使用以編號CCL-61寄存在ATCC之細胞系來獲得能夠在無血清培養基及/或懸浮液中生長之純系。
在特定實施例中，本發明之組合之特徵在於，其容許獲得在將載體轉染至以編號CCL-61寄存在ATCC之細胞系中之後產生至少1、2、3、4或5mg/L重組蛋白之純系。
在另一態樣中，本發明係關於包含本發明載體之CHO細胞系。較佳地，該CHO細胞系用該載體轉染(穩定或瞬時轉染)。最佳地，該CHO細胞系包含整合於其基因組中之該載體。
更具體而言，本發明係關於CHO細胞系，其包含DNA表現載體，且其中該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列及至少一個用於表現重組蛋白之表現盒，其中該GS包含以下蛋白質序列：a)與SEQ ID NO：1之序列或SEQ ID NO：2之序列至少94.5%一致；或b)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之片段組成。
3. 本發明之套組、方法及用途
本發明之一態樣係關於包含本發明之組合或由其組成之套組。在該套組中，載體較佳係空的，此乃因此容許選殖熟習此項技術者之目標蛋白質。另外，在該套組中，DNA載體較佳自細胞系分離。套組可進一步包含適於培養細胞系之培養基、適於將載體轉染至細胞系中之培養基及/或關於表現系統之使用之說明書。
本發明之另一態樣係關於本發明之組合、或本發明之載體、或本發明之細胞系用於在活體外產生重組蛋白之用途。
本發明之又一態樣係關於產生重組蛋白之活體外方法，該方法包含以下步驟或由以下步驟組成： a)提供本發明之組合；b)用該DNA載體轉染該細胞系；c)在適於產生重組蛋白之條件下培養步驟(b)中獲得之經轉染細胞系；及d)分離及/或純化該重組蛋白。
如熟習此項技術者所立即明瞭，上述態樣係關於在步驟(a)中DNA載體自細胞系分離之本發明之組合。
本發明之又一態樣係關於產生重組蛋白之活體外方法，該方法包含以下步驟或由以下步驟組成：a)提供本發明之組合；b)在適於產生重組蛋白之條件下培養經轉染細胞系；及c)分離及/或純化該重組蛋白。
如熟習此項技術者所立即明瞭，上述態樣係關於細胞系包含DNA載體(例如細胞系先前已用DNA載體轉染)之本發明之組合。
本發明之再一態樣係關於產生重組蛋白之活體外方法，該方法包含以下步驟或由以下步驟組成：a)提供本發明之載體，其中該載體包含至少一個編碼重組蛋白之序列；b)用該載體轉染本發明之細胞系；c)在適於產生重組蛋白之條件下培養步驟(b)中獲得之經轉染細胞系；及d)分離及/或純化該重組蛋白。
適於產生重組蛋白之條件已為熟習此項技術者所熟知。可使用例如闡述於實例中之方案。
在特定實施例中，在培養本發明之細胞系時，添加GS抑制劑，例如甲硫胺酸碸亞胺(msx)或膦絲菌素(phosphinothricin)。在更特定實 施例中，在培養細胞系時，添加增加濃度之該GS抑制劑。此容許選擇源自載體之GS基因(且因此編碼重組蛋白之序列)已經擴增之純系。
上述方法可進一步包含將重組蛋白調配成醫藥組合物之步驟。
本發明之又一態樣係關於共擴增編碼重組蛋白之重組DNA序列之方法，該方法包含以下步驟或由以下步驟組成：a)提供本發明之載體，其中該載體包含編碼該重組蛋白之序列；b)提供本發明之細胞系；c)用該載體轉染該細胞系；及d)在容許選擇含有擴增數目之編碼GS之源自載體之序列拷貝的轉化體之條件下培養該經轉染之細胞系，其中該等轉化體亦含有擴增數目之編碼重組蛋白之完整胺基酸序列之序列拷貝。
上述方法之步驟(d)可包含在含有GS抑制劑之培養基中培養經轉染細胞系及選擇對逐漸增加量之GS抑制劑具有抗性之轉化細胞。含有GS抑制劑之培養基可進一步含有甲硫胺酸，由此可降低培養基中GS抑制劑之濃度。
本發明亦係關於在共轉化過程中使用DNA載體作為顯性可選標記之方法，其中該方法包含以下步驟或由以下步驟組成：a)提供本發明之載體，其中該載體包含編碼重組蛋白之序列；b)提供本發明之細胞系；c)用該載體轉染該細胞系；及d)選擇對GS抑制劑具有抗性之轉化細胞，由此選擇編碼GS之源自載體之重組DNA序列作為顯性可選及可共擴增標記之轉化細胞。
在上述套組及方法之特定實施例中，細胞系係CHO細胞系。
在特定實施例中，本發明之組合、或本發明之載體、或本發明之細胞系之使用容許(i)增加表現重組蛋白之純系，及/或(ii)與使用 CHO來源之GS時相比，增加重組蛋白之產生。
在整篇本說明書之正文中引用若干個文件。本文中之各文件(包括任何期刊論文或摘要、已公佈或未公佈之專利申請案、已頒佈的專利、製造商說明、說明書等)以引用之方式併入本文中。然而，不承認本文中所引用之任何文件對於本發明而言實際上係先前技術。
將參考以下圖式及實例(其僅為闡釋性的且並不意欲限制本發明)進一步闡述本發明。實際上，本發明係由申請專利範圍界定，申請專利範圍應藉助說明及圖式進行理解。
序列簡單說明
SEQ ID NO：1顯示人類來源之GS之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2顯示犬來源之GS之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3顯示中國倉鼠來源之GS之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4顯示酵母來源(啤酒酵母菌)之GS之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5顯示源自蟾蜍(有爪蟾蜍(Xenopus laevis))之GS之胺基酸序列。
SEQ ID NO：6顯示源自植物(擬南芥(Arabiaopsis thaliana))之GS之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7顯示源自昆蟲(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))之GS之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8顯示編碼人類來源之GS之核苷酸序列。
SEQ ID NO：9顯示編碼犬來源之GS之核苷酸序列。
SEQ ID NO：10顯示編碼中國倉鼠來源之GS之核苷酸序列。
SEQ ID NO：11顯示編碼酵母來源(啤酒酵母菌)之GS之核苷酸序列。
SEQ ID NO：12顯示編碼源自蟾蜍(有爪蟾蜍)之GS之核苷酸序列。
SEQ ID NO：13顯示編碼源自植物(擬南芥)之GS之核苷酸序列。
SEQ ID NO：14顯示編碼源自昆蟲(黑腹果蠅)之GS之核苷酸序列。
實例 實例1：識別獲得改良結果之GS
本發明的發明者旨在研發用於在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系中表現及產生重組蛋白之新穎載體。如下文所述設計一組七種載體。
使用兩種編碼人類化形式之13C3抗體之cDNA(分別地，一種cDNA編碼13C3重鏈且另一cDNA編碼13C3輕鏈，該等鏈之組合構成人類化13C3抗體)作為用於評價載體品質之報告基因。鼠類13C3抗體係特異性結合人類β-澱粉樣蛋白之原纖維形式之抗體，如WO2009/065054中所述。另外如本文所用，術語「13C3」係指鼠類13C3抗體之人類化形式。
該七種載體示意性地表示於圖1上。該八種載體全部包含：- 編碼GS之序列，其處於早期SV40啟動子之控制下；- 第一表現盒，其中編碼13C3抗體之輕鏈之序列處於CMV啟動子之控制下；- 第二表現盒，其中編碼13C3抗體之重鏈之序列處於CMV啟動子之控制下；- 原核複製起點；- 真核複製起點；及- 用於原核細胞中之可選標記，即編碼賦予安比西林(ampicillin)抗性之蛋白質之序列，其處於其天然啟動子之控制下。
更具體而言，編碼GS之序列處於SV40啟動子(包括SV40增強子)之控制下。該SV40早期啟動子含有連接至21-bp非串聯重複序列之SV40 72-bp串聯重複序列增強子以及不包括任何編碼序列之SV40早 期前導蛋白質序列。此區域作為強啟動子之用途由Benoist及Chambon(1981,Nature.290：304-10)以及Moreau等人(1981,Nucleic Acids Res.9：6047-68)闡述。其經典地用作用於在哺乳動物細胞中表現選擇標記之啟動子。在該七種pBH3694至pBH3700載體中，天然HindIII限制位點被破壞且在啟動子區域之5’及3’末端添加獨特的限制位點(SalI及XmaI)，以此方式容許容易地交換不同GS cDNA。
該七種載體彼此不同之處在於編碼GS之序列。實際上，將編碼具有不同來源之GS之序列選殖至載體中。
更具體而言，使用可在公共數據庫中得到之天然存在之胺基酸序列產生七種分別編碼以下來源之GS之cDNA：中國倉鼠(灰倉鼠(Cricetulus griseus))、人類(智人)、犬(灰狼(Canis lupus))、酵母(啤酒酵母菌)、果蠅(黑腹果蠅)、植物(擬南芥)及蟾蜍(有爪蟾蜍)。自該等序列開始，使用CHO中使用之最頻繁密碼之矩陣回譯蛋白質。隨後，改質cDNA以便含有合適的選殖位點，且最佳化核苷酸序列。值得注意地，儘管核苷酸序列針對CHO表現經最佳化，但所編碼蛋白質之胺基酸序列仍然與天然編碼蛋白質之胺基酸序列一致。
更具體而言，在不同公共cDNA庫中挑選不同GS之天然存在編碼序列。例如，NCBI參考編號NM_002065.5用於人類GS。NCBI參考編號NM_001002965.1用於犬GS。NCBI參考編號NM_078568.2用於果蠅GS。已在yeastgenome.org全球資訊網網站上找到編碼酵母GS之序列(參考編號YPR035W)。中國倉鼠GS之胺基酸序列對應於顯示於NCBI參考序列：XP_003502909.1(REFSEQ：登記XM_003502861.1)中之序列。自天然存在之cDNA序列開始，使用由Wagner及其同事們研發之軟體使編碼該GS之序列之三聯體密碼偏向在CHO細胞中表現，該軟體係基於Raab等人(2010,Syst Synth Biol.4：215-25)中闡述之演算法。此技術不僅提供用於表現之最佳可得密碼，而且考慮GC含量及非所 需DNA基序之不存在。
將獲得之cDNA選殖至具有13C3抗體之表現盒之主幹中，由此獲得圖1中表示之載體。
該等載體之名稱以及所編碼GS之來源及序列顯示於下表中。
使用經典條件將上述載體核穿孔(nucleoporate)至CHO細胞系中。在轉染後24小時，將約2000個細胞接種於96孔板之480至960孔中，各孔包含200μl含有25μM濃度之甲硫胺酸碸亞胺(msx)的CD-CHO培養基。
在接種後約20天，將各孔之培養基換成新鮮的選擇培養基(與上文所述相同)。
4天後，計數佔用數目，即計數含有生長純系之孔的數目。使用由Cisbio Bioassays(Bagnols/Ceze,France)研發之均相時間解析螢光(HTRF)技術針對13C3抗體生產率對各佔用孔之上清液進行測試。
結果顯示於圖2及圖3上。自該等圖可斷定，兩種載體，即pBH3695及PBH3700比其他載體給出較好的結果。其容許獲得較多純系及較好的生產率。
所測試之不同GS之序列之間的一致性百分比顯示於下文之三個表中。該等一致性百分比係使用EMBOSS Needle程式使用以下缺省參數來計算： - 矩陣：EBLOSUM62；- 空位罰分：10.0；及- 擴展罰分：0.5。
自該等表可斷定，獲得最佳結果之兩個序列(即人類及犬GS)之特徵在於其序列展現與SEQ ID NO：1及/或2之序列至少94.5%之一致性。對於所測試之其他GS之序列，沒有此特徵，從而導致較不佳之結果。
實例2：在另一CHO細胞系中證實使用編碼人類GS之載體之有利特性
用稱為「9E4」之適於工業生產重組蛋白之CHO細胞系重複上述實驗。
9E4細胞系係經由單細胞選殖過程自CHO-K1細胞系之純系建立。CHO-K1細胞系係由Puck在1957年獲得，且以編號CCL-61寄存在ATCC。CHO 9E4細胞系似乎表現內源及功能GS蛋白質，此乃因此細胞系可在不存在麩醯胺酸下生長。因此，甲硫胺酸碸亞胺(msx)應較佳用於選擇經轉染純系。
經由核穿孔將載體引入9E4細胞系中。使用在實例1中構築之六種載體(即pBH3695、pBH3700、pBH3694、pBH3697、pBH3698及pBH3699)實施第一個實驗。選擇條件與實例1中所述之條件相同(添加25μM濃度之msx)。如實例1中所述量測佔用孔之數目及13C3抗體之濃度。結果顯示於圖4上。
在9E4細胞系中，pBH3695係唯一能夠生成產生13C3抗體之純系的載體。此質粒係具有編碼人類GS之cDNA者，其中三聯體密碼偏向在CHO細胞中表現。因此，使用包含編碼人類GS之序列之載體尤其有利於在CHO細胞系中產生重組蛋白。
實例3：X14之使用基於人類GS及人類CMV啟動子之pBH載體在HEK293中之瞬時表現
在此實驗中，使用含有處於SV40啟動子之控制下的序列SEQ ID NO：1之人類GS以及單一表現盒之載體，該表現盒含有在人類CMV啟動子及多聚腺苷酸化位點之控制下的編碼人類或小鼠X14受體(亦稱為C型凝集素結構域家族14之成員A(CLEC14A)，且分別具有NCBI參考編號NP_778230.1及NP_080085.3)之cDNA。該含有編碼人類X14受體之cDNA的載體係下文中之pBH4590載體，且含有編碼小鼠X14受體之cDNA的載體在下文中稱為pBH4589載體。
將pBH4590載體、pBH4589載體或對照載體(即不相關質粒載體)藉由用Jet PEI轉染引入HEK 293-FS細胞中，如製造商Poly Plus轉染所闡述。
在轉染之後24h在針對人類或小鼠X14檢測適當標記之後藉由免疫螢光、流式細胞術或免疫細胞化學分析細胞。
免疫螢光檢測
對於免疫螢光檢測，將經轉染細胞旋轉沈澱並棄除其上清液。將細胞沈澱再懸浮於含有1%牛血清白蛋白(W/V)及0.1% Tween(V/V)之PBS緩衝液(PBS T BSA)中，並在此緩衝液中飽和10分鐘。將細胞用相同緩衝液洗滌兩次，並與原始血清1(即在動物免疫之前即刻獲得之血清，稱為免疫前血清，其代表陰性對照)或血清2(即為在如下文所述用經純化X14人類細胞外結構域免疫動物之後獲得之未純化的免疫血清的血清)在1/5000稀釋下於(PBS T BSA)緩衝液中在室溫下一起培育10分鐘。
在洗掉未結合之一級抗體之後，添加連接至Alexa螢光團(Alexa 488nm Ref A11034，來自Invitrogen)之二級山羊抗兔抗體。使用設置用於檢測Alexa 488nm之Leica螢光顯微鏡實施免疫螢光。
分別用對照質粒及血清1或對照質粒及血清2無法觀察到背景Alexa 488螢光。此表示不存在背景非特異性螢光。相反地，在經以pBH4590及pBH4589載體轉染之細胞的質膜處會出現強的Alexa 488螢光。因此，使用包含編碼人類GS之序列之載體尤其有利於促進膜結合蛋白質之瞬時表現。
流式細胞術檢測
對於流式細胞術檢測，藉由與三種不同抗體製備品及二級抗體抗兔IgG Fc部分之兩次連續培育來達成人類X14標記。用抗X14血清之三種不同稀釋物(1/5000、1/1000、1/500)分析兩種經轉染細胞系： ●血清1，在動物免疫之前即刻獲得，稱為免疫前血清，其代表陰性對照，●血清2，其為在用經純化X14人類細胞外結構域免疫動物之後獲得之未純化的免疫血清，●血清3，其對應於血清2之針對X14人類凝集素之免疫球蛋白部分。
在洗掉未結合之一級抗體之後，添加連接至Alexa螢光團(Alexa 488nm，目錄編號為A-11034，來自Life Technologies)之二級山羊抗兔抗體。使用設置用於檢測Alexa 488之流式細胞術用血清1、2及3之三種不同稀釋物分別分析經轉染細胞。
值得注意地，所有組織圖均呈現單一螢光峰，從而表明均質細胞群體。此峰之中間螢光強度介於102個與103個螢光單位之間。然而，與稀釋至1/500e之血清2一起培育之細胞呈現約1000個螢光單位之中間螢光強度。此最小背景強度適於研究質膜處之檢測。採取用對照載體及稀釋至1/5000e之血清1時觀察到之螢光作為背景參考螢光，校準流式細胞儀。
隨後分析用pBH4590載體轉染之細胞。用血清1對於各稀釋物，人類X14轉染細胞之螢光強度與對照細胞之信號類似。相反，與免疫前血清(血清1)相比，對於血清2及經純化多株抗體(血清3)，螢光信號明顯更強。事實上，對於免疫血清(血清2)及經純化抗體(血清3)，人類X14轉染細胞之中間螢光強度係104個螢光單位。在所測試之特定抗血清之三種濃度下，其增加至10至20倍。
該等結果展示，在用pBH4590載體轉染之HEK 293-FS細胞中，產生可清楚檢測到之量的人類X14，如藉由螢光顯微術及流式細胞術所觀察。此外，細胞外檢測可檢測到人類X14，從而表明其在質膜處表現。
實例4：人類及鼠類X14受體在CHO細胞中之表現
此實驗之目的係測試用於瞬時人類或小鼠X14表現之相同載體是否可用於在作為穩定純系之CHO細胞中表現小鼠或人類X14受體。為此，使用由Lonza/Amaxa核穿孔器件(Lonza/Amaxa nucleoporation device)制定之方案將具有人類GS cDNA之pBH4590載體或pBH4589載體轉染至CHO-9E4細胞系中。用10μg上文所述pBH4590載體或pBH4589載體，將200萬個CHO-9E4細胞電穿孔。電擊後立即將細胞稀釋至2ml CD-CHO新鮮培養基中，且在24小時之後，將細胞以10000個細胞/ml之濃度再次稀釋至含有25μM甲基碸亞胺(msx)之新鮮CD-CHO培養基中。以每孔2000個細胞接種約10個96孔板。
使用可選標記GS篩選在用pBH4590載體或pBH4589載體轉染CHO細胞後獲得之CHO半純系。亦用表現抗體13C3之參考對照實施轉染。使用該對照作為藉由流式細胞儀實施分析之對照。獲得30種人類X14半純系、41種小鼠X14半純系及29種對照載體半純系。
在擴增過程開始時在24孔板中將半純系傳代之後，使用先前闡述之工具檢測存在或不存在人類或小鼠X14抗原。
觀察到，例如，人類半純系n°12具有低於鼠類半純系n°30之螢光強度。事實上，用鼠類半純系，觀察到存在具有103個螢光單位之最大螢光強度之單一峰螢光，然而在人類半純系之情形下，峰展開且平均螢光強度不超過500個螢光單位。
實施藉由流式細胞術分析呈陽性之半純系之擴增，從而容許最後產生10種穩定表現X14鼠類凝集素之CHO系半純系及4種穩定表現X14人類凝集素之CHO系半純系。
因此，使用包含編碼人類GS之序列之載體尤其有利於產生穩定表現重組蛋白之CHO系。
實例5：編碼兩種不同抗體之不同DNA質粒在CHO-S中之瞬時轉染
為研究使用具有人類GS cDNA之載體在CHO-S中瞬時轉染之可 行性，使用經典選殖技術及四種不同的獨特限制位點藉由用抗CD38 cDNA之輕鏈及重鏈替換對應於13C3抗體之輕鏈及重鏈之兩種cDNA來構築源自pBH3695之稱為的另一載體，稱為pBH3772載體。因此，pBH3772載體包含：- 編碼GS之序列，其處於早期SV40啟動子之控制下；- 第一表現盒，其中編碼抗CD38抗體之輕鏈之序列處於CMV啟動子之控制下；- 第二表現盒，其中編碼抗CD38抗體之重鏈之序列處於CMV啟動子之控制下；- 原核複製起點；- 真核複製起點；及- 用於原核細胞中之可選標記，即編碼賦予安比西林抗性之蛋白質之序列，其處於其天然啟動子之控制下。
隨後在Maxcyte®公司闡述之條件下使用Maxcyte®裝置用以下載體轉染CHO-S：(i)兩種對照載體，其經典地用於瞬時轉染且含有兩種不同抗體之輕鏈及重鏈之cDNA(即稱為對照1及對照2)，及(ii)pBH3695及pBH3772載體。在含有8mM麩醯胺酸之CD-CHO中在經典的CHO-S培養條件下培養CHO-S細胞(以0.3 106個細胞/ml每2-3天傳代一次)。轉染前一天，細胞分裂成1.2 106個細胞/ml且24小時後轉染。根據Maxcyte®方案實施溫度變化及培養基補給。在第3、6、7、8及9天取培養試樣，並藉由SEC-HPLC使用經純化抗體作為標準參考曲線進行量測。
該實驗之結果顯示於圖6上。
自此圖可斷定，pBH3695及pBH3772載體能夠以等於或優於兩種經典地用於瞬時轉染之對照載體的量產生抗體。
總之，兩種基於人類麩醯胺酸合成酶之pBH3695及pBH3772載體 能夠產生高於100mg/l之值得注意的量之抗體。
因此，使用包含編碼人類GS之序列之載體尤其有利於穩定或瞬時表現膜結合蛋白質或抗體。
實例6：人類紅血球生成素(EPO)在CHO細胞中之表現
為表現人類EPO，用限制性酶NheI及EcoRI消化pBH4590載體，並使用經典的分子生物學技術在該載體中插入兩種人類EPO cDNA，即與NheI及EcoRI位點接界之cDNA1或cDNA2。
此容許獲得具有人類EPO cDNA1之pBH4614載體及具有人類EPO cDNA2之pBH4615載體。
使用由Qiagen公司研發之套組以最大製備量製備該兩種載體。
使用Lonza電穿孔技術使用pBH4614及pBH4615載體分別轉染三種細胞系CHO-S、CHO-9E4及CHO 30D12。為此，在轉染前一天使細胞分裂以使細胞密度達到1×106個細胞/ml。對於各DNA及細胞系，分別將200萬個細胞旋轉沈澱並在10μg DNA存在下懸浮於100μl溶液V中。使用程式X05使細胞電穿孔。在電穿孔之後迅速地將細胞稀釋至2ml含有6mM麩醯胺酸(Life Technologies)之CD-CHO培養基中，並在37℃及5% CO2下培育24小時。在此培育之後，將細胞稀釋至200ml不含麩醯胺酸且存在25μM msx之相同培養基中，並使用200μl/孔分配於96孔板中。在15天(CHO-S)至25天(CHO-9E4、CHO 30D12)之後，在含有存活細胞之孔中更換新鮮培養基。4至5天後，對於各孔，分別在不攪動下將存活細胞轉移至1ml含有25μM msx之CD-CHO中。分別對於兩種EPO cDNA，對於CHO-S，擴增24種半純系，同時對於其他兩種細胞系，擴增12種半純系。擴增總共96種半純系，使其生長並驗證其產生人類紅血球生成素之能力。為此，在培育3至4天之後，將1ml稀釋至4ml含有25μM msx之CD-CHO培養基中並在37℃及5% CO2下攪動。3至4天之後，再次用5ml新鮮培養基稀釋培養物。3 至4天之後，第一次量測細胞密度，並將細胞以3×105個細胞/ml稀釋並生長3至4天。量測細胞密度，並將細胞以3×105個細胞/ml接種於含有25μM msx及30%給料B(Life Technologies)之CD-CHO培養基中。
使細胞在10ml上述培養基(37℃，5% CO2)中生長10天。在8天及10天後量測細胞密度及生存力。同樣地取0.6ml試樣以評估人類EPO濃度。首先使用微流體Caliper技術篩選培養物上清液(0.6ml)，從而評估具有人類EPO之表觀分子量之蛋白質之存在。
使用由R&D System®研發之用於活體外診斷之套組(用於活體外診斷使用之人類紅血球生成素Quantikine® IVD ELISA套組，目錄參考DEP00)使16種最佳純系上清液(例如具有最強之EPO信號)經受特定用於人類EPO檢測之ELISA。顯示七種純系具有令人感興趣之生產率，如在第8天及第10天所量測(下表)。
純系之生產率在0.3至2.0g/l之範圍內。半純系90係最佳產生純系，在第8天及第10天其生產率分別為1.1至2.0g/L。
在第10天，此純系之生存力約為70%，每ml具有小於100萬個細胞(80萬個細胞/ml)，從而使得不可計算比生產率，此乃因細胞之數目在第8天與第10天之間一直減小。此使得不可計算比活性(下表)。除半純系21、24、92及93以外，對於大多數半純系觀察到此現象。在該情形下，以μg/106個細胞/天表示之比生產率可達到441及854(下表)。
因此，該等結果顯示，就體積或比生產率而言，使用包含編碼人類GS之序列之載體容許具有高於300μg蛋白質/100萬個細胞之生產率。
<110> 法商賽諾菲公司
<120> CHO表現系統
<130> FR2012-007 ETR
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 373
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 373
<212> PRT
<213>灰狼
<400> 2
<210> 3
<211> 373
<212> PRT
<213> 灰倉鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 370
<212> PRT
<213> 啤酒酵母菌
<400> 4
<210> 5
<211> 373
<212> PRT
<213> 有爪蟾蜍
<400> 5
<210> 6
<211> 354
<212> PRT
<213> 擬南芥
<400> 6
<210> 7
<211> 369
<212> PRT
<213> 黑腹果蠅
<400> 7
<210> 8
<211> 1122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
<210> 9
<211> 1122
<212> DNA
<213> 灰狼
<400> 9
<210> 10
<211> 1122
<212> DNA
<213> 灰倉鼠
<400> 10
<210> 11
<211> 1113
<212> DNA
<213> 啤酒酵母菌
<400> 11
<210> 12
<211> 1122
<212> DNA
<213> 有爪蟾蜍
<400> 12
<210> 13
<211> 1065
<212> DNA
<213> 擬南芥
<400> 13
<210> 14
<211> 1110
<212> DNA
<213> 黑腹果蠅
<400> 14

Claims (29)

  1. 一種中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，其包含去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且其中該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(glutamine synthetase；GS)之核苷酸序列及至少一個用於表現重組蛋白之表現盒，其中該GS包含以下序列：與SEQ ID NO：1序列或SEQ ID NO：2序列至少94.5%一致；或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之片段組成。
  2. 如請求項1之CHO細胞系，其中該GS包含與該SEQ ID NO：1序列及該SEQ ID NO：2序列至少94.5%一致的序列。
  3. 如請求項1或2之CHO細胞系，其中該GS包含與該SEQ ID NO：1序列至少97.5%一致的序列。
  4. 如請求項1之CHO細胞系，其中該GS係人類GS。
  5. 如請求項4之CHO細胞系，其中該GS包含SEQ ID NO：1序列。
  6. 如請求項1或2之CHO細胞系，其中該GS係犬GS。
  7. 如請求項6之CHO細胞系，其中該犬GS包含SEQ ID NO：2序列。
  8. 如請求項1之CHO細胞系，其中該編碼GS之序列的三聯體密碼業經偏向可於CHO細胞中表現。
  9. 如請求項1之CHO細胞系，其中該編碼GS之序列包含與SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9序列至少80%一致的序列。
  10. 如請求項9之CHO細胞系，其中該編碼GS之序列包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9序列。
  11. 如請求項1之CHO細胞系，其中該編碼人類GS之序列處於猿猴空泡形成病毒40(SV40)啟動子之控制下。
  12. 如請求項1之CHO細胞系，其中該重組蛋白係單株抗體。
  13. 如請求項12之CHO細胞系，其中該載體包含適於選殖抗體輕鏈之第一表現盒及適於選殖抗體重鏈之第二表現盒。
  14. 如請求項13之CHO細胞系，其中該等第一及第二表現盒各自包含CMV啟動子。
  15. 如請求項1之CHO細胞系，其中該CHO細胞系能夠在無血清培養基中生長。
  16. 如請求項1之CHO細胞系，其中該CHO細胞系係以編號CCL-61寄存在ATCC之細胞系。
  17. 如請求項1之CHO細胞系，其中其容許獲得在將該載體轉染至該以編號CCL-61寄存在ATCC之CHO細胞系中之後產生至少1mg/L重組蛋白之純系。
  18. 如請求項1之CHO細胞系，其中該載體不含有用於表現之異源基因。
  19. 如請求項1之CHO細胞系，其中該載體包含至少一個編碼重組蛋白之序列。
  20. 如請求項19之CHO細胞系，其中該重組蛋白係單株抗體。
  21. 如請求項19之CHO細胞系，其中該重組蛋白係抗原性蛋白質。
  22. 一種去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且其中該載體包含在猿猴空泡形成病毒40(SV40)啟動子之控制下的編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列、在CMV啟動子之控制下的適於選殖異源重組蛋白之第一表現盒，其中該GS包含以下蛋白質序列：a)與SEQ ID NO：1序列或SEQ ID NO：2序列至少94.5%一致；或b)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之片段組成。
  23. 如請求項22之DNA載體，其中該載體係如請求項20或21中所定義之載體。
  24. 一種去氧核糖核酸(DNA)表現載體，且其中該載體包含在猿猴空泡形成病毒40(SV40)啟動子之控制下的編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之核苷酸序列、在CMV啟動子之控制下的適於選殖抗體輕鏈之第一表現盒及在CMV啟動子之控制下的適於選殖抗體重鏈之第二表現盒，其中該GS包含以下蛋白質序列：a)與SEQ ID NO：1序列或SEQ ID NO：2序列至少94.5%一致；或b)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之片段組成。
  25. 一種以下各項之組合，i)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系；及ii)適於產生重組蛋白之DNA(去氧核糖核酸)載體，其中該載體包含編碼異源哺乳動物麩醯胺酸合成酶(GS)之序列，其中該GS包含以下序列：與SEQ ID NO：1序列或SEQ ID NO：2序列至少94.5%一致；或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少100個連續胺基酸之片段組成。
  26. 一種套組，其包含如請求項25之組合。
  27. 一種產生重組蛋白之活體外方法，其包含以下步驟：a)提供如請求項1至21中任一項之CHO細胞系；b)在適於產生該重組蛋白之條件下培養獲得之該CHO細胞系；及c)分離及/或純化該重組蛋白。
  28. 如請求項27之方法，其進一步包含將該重組蛋白調配成醫藥組 合物之步驟。
  29. 一種如請求項1至21中任一項之CHO細胞系、或如請求項22至24中任一項之載體、或如請求項25之組合的用途，其用於在活體外產生重組蛋白。
TW102121230A 2012-06-14 2013-06-14 Ｃｈｏ表現系統 TWI605123B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12305677.2A EP2674495A1 (en) 2012-06-14 2012-06-14 CHO expression system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201402817A true TW201402817A (zh) 2014-01-16
TWI605123B TWI605123B (zh) 2017-11-11

Family

ID=48700539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102121230A TWI605123B (zh) 2012-06-14 2013-06-14 Ｃｈｏ表現系統

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9334489B2 (zh)
EP (2) EP2674495A1 (zh)
CN (2) CN107881151A (zh)
AR (1) AR091418A1 (zh)
AU (1) AU2013276467B2 (zh)
CA (1) CA2876550C (zh)
DK (1) DK2861741T3 (zh)
ES (1) ES2627954T3 (zh)
HU (1) HUE032968T2 (zh)
IN (1) IN2014KN02823A (zh)
MX (1) MX353499B (zh)
SG (1) SG11201408051VA (zh)
TW (1) TWI605123B (zh)
UY (1) UY34860A (zh)
WO (1) WO2013186371A1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR102333A1 (es) 2014-08-19 2017-02-22 Regeneron Pharma Selectividad eficiente de proteínas recombinadas
MX374934B (es) * 2014-10-23 2025-03-06 Sanofi Sa Marcador de seleccion novedoso para transfeccion celular y produccion de proteinas.
US11261462B2 (en) 2016-01-27 2022-03-01 Just-Evotec Biologics, Inc. Inducible expression from transposon-based vectors and uses
US11098310B2 (en) 2016-01-27 2021-08-24 Just-Evotec Biologics, Inc. Expression from transposon-based vectors and uses
ES2823173T3 (es) 2016-01-27 2021-05-06 Just Biotherapeutics Inc Promotor híbrido y usos del mismo
WO2018047154A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Anti-nkp46 antibodies and therapeutic use of same
CN118105471A (zh) 2017-05-24 2024-05-31 托埃瑞斯有限责任公司 谷氨酰胺合成酶用于治疗高氨血症的用途
IL253984A0 (en) 2017-08-14 2017-09-28 Yeda Res & Dev Immunotherapy against aranviruses that bind through transferrin receptor 1 (tfr1
CN108085337B (zh) * 2017-12-28 2020-10-16 未名生物医药有限公司 一种gs表达系统细胞株的筛选方法
CN109988777A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 南京金斯瑞生物科技有限公司 谷氨酰胺合成酶基因以及应用
CN113950532A (zh) * 2019-06-07 2022-01-18 拜康生物制品有限公司 哺乳动物表达载体
IL276627A (en) 2020-08-10 2022-03-01 Yeda Res & Dev Compositions for diagnosis and treatment of coronavirus infections
EP4214308B1 (en) 2020-09-21 2024-11-20 Sanofi Generation of a high producing recombinant chinese hamster ovary cell line for therapeutic protein production
US20250101402A1 (en) * 2021-08-03 2025-03-27 Shanghai Zhenge Biotechnology Co., Ltd. Selectable markers for eukaryotic expression system
CN118804978A (zh) * 2021-12-27 2024-10-18 上海臻格生物技术有限公司 用于重组生产系统的新型标志物
CN115287300A (zh) * 2022-08-11 2022-11-04 无锡多宁生物科技有限公司 一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8924021D0 (en) * 1989-10-25 1989-12-13 Celltech Ltd Recombinant dna method and vectors for the use therein
KR100267720B1 (ko) * 1997-12-29 2001-03-02 박호군 사람 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이를 이용하여 동물세포에서 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 방법
GB0216648D0 (en) * 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
EP2316487B1 (en) * 2003-04-11 2014-06-11 MedImmune, LLC Recombinant IL-9 antibodies & uses thereof
US7244616B2 (en) * 2003-06-27 2007-07-17 Bayer Pharmaceuticals Corporation Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells
EP1831366A2 (en) * 2004-12-30 2007-09-12 Agency for Science, Technology and Research Chinese hamster apoptosis-related genes
GB0508154D0 (en) * 2005-04-22 2005-06-01 Lonza Biologics Plc Mammalian expression vector comprising the mCMV promoter and first intron of hCMV major immediate early gene
GB0510277D0 (en) * 2005-05-20 2005-06-29 Lonza Biologics Plc High-level expression of recombinant antibody in a mammalian host cell
US20090142805A1 (en) * 2007-01-08 2009-06-04 Millipore Corporation High expression cell line that eliminates gene amplification
TR201816045T4 (tr) * 2007-10-12 2018-11-21 Hoffmann La Roche Birden fazla nükleik asitten protein ekspresyonu.
HRP20171292T1 (hr) 2007-11-16 2017-12-15 The Rockfeller University Polipeptidi i konjugati klorotoksina i njihove uporabe

Also Published As

Publication number Publication date
CN107881151A (zh) 2018-04-06
MX353499B (es) 2018-01-16
MX2014015280A (es) 2015-06-23
US9334489B2 (en) 2016-05-10
ES2627954T3 (es) 2017-08-01
EP2861741A1 (en) 2015-04-22
AU2013276467B2 (en) 2018-08-30
IN2014KN02823A (zh) 2015-05-08
SG11201408051VA (en) 2015-01-29
CA2876550C (en) 2021-07-13
CA2876550A1 (en) 2013-12-19
AU2013276467A1 (en) 2015-01-15
CN104540950A (zh) 2015-04-22
US20150140607A1 (en) 2015-05-21
DK2861741T3 (en) 2017-07-17
WO2013186371A1 (en) 2013-12-19
EP2674495A1 (en) 2013-12-18
HUE032968T2 (en) 2017-11-28
AR091418A1 (es) 2015-02-04
UY34860A (es) 2014-01-31
TWI605123B (zh) 2017-11-11
EP2861741B1 (en) 2017-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI605123B (zh) Ｃｈｏ表現系統
JP4344325B2 (ja) 新規なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及び高生産組換え細胞の選抜方法
KR20100014724A (ko) 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 증강시키기 위한 재조합 발현 벡터 요소(ｒＥＶＥ)
US12203103B2 (en) Selection marker for cell transfection and protein production
JP2022538430A (ja) Ｓｉｒｔ－１遺伝子ノックアウトを有する哺乳類細胞株
KR20240162570A (ko) 선택 마커로서 신규 글루타민 신테타제 변이체
JP2025510718A (ja) 哺乳動物細胞における選択マーカーとしての細菌グルタミン合成酵素
JP4555373B2 (ja) 新規なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及び高生産組換え細胞の選抜方法
HK40109435A (zh) 通过使用cre mrna进行的靶向整合来产生蛋白质表达细胞的方法
HK40060851B (zh) 通过使用cre mrna进行的靶向整合来产生蛋白质表达细胞的方法