MX2014015280A - Sistema de expresion en cho. - Google Patents

Abstract

La presente invención está dentro del campo de la producción industrial de proteínas. Los inventores han diseñado y construido un nuevo sistema de expresión que comprende un vector de expresión que codifica una glutamina sintetasa de origen humano o canino y una línea celular de CHO. Más específicamente, la invención se refiere a una combinación de (i) un vector de ADN adecuado para la producción de una proteína recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa y (ii) una línea celular de ovario de hámster chino (CHO), en la que dicha GS comprende una secuencia al menos un 94,5 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

Description

SISTEMA DE EXPRESIÓN EN CHO Campo de la invención La presente invención está dentro del campo de la producción industrial de proteínas. Los inventores han diseñado y construido un nuevo sistema de expresión que comprende un vector de expresión que codifica una glutamina sintetasa de origen humano o canino y una línea celular de CHO. Más específicamente, la invención se refiere a una combinación de (i) un vector de ADN adecuado para la producción de una proteína recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa y (ii) una línea celular de ovario de hámster chino (CHO), en la que dicha GS comprende una secuencia al menos un 94,5 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

Aantecedentes de la invención Cuando se producen proteínas recombinantes a escala industrial, deben aislarse clones productores de altas cantidades de proteínas recombinantes.

Introducir clones heterólogos en células hospedadoras animales y cribar la expresión de los genes añadidos es un proceso tedioso y complicado. El proceso implica la transfección y selección de clones con expresión estable a largo plazo y el cribado de altos índices de expresión de la proteína recombinante.

Cuando se generan clones que expresan una proteína recombinante a partir de vectores de expresión, las células hospedadoras se transfectan habitualmente con un vector de ADN que codifica tanto la proteína de interés como el marcador de selección en el mismo vector. Dicho vector de expresión comprende por tanto un marcador seleccionable que permite la selección de clones en que está presente el vector de expresión. Dicho marcador seleccionable puede conducir también a que tenga lugar una coamplificación, permitiendo así el aislamiento de clones de alta producción.

Son conocidos en la materia varios de dichos marcadores seleccionables incluyendo, por ejemplo, G418, higromicina, puromicina, zeomicina, dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa (GS) e hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT). En particular, se usa ampliamente GS como marcador seleccionable en el campo de la producción industrial de proteína recombinante en células eucarióticas.

Más específicamente, el documento WO 87/04462 describe el uso de glutamina sintetasa (GS) como marcador seleccionable. Los ejemplos enseñan un vector de expresión que comprende, como marcador seleccionable, la secuencia de codificación de una GS de origen de hámster chino. Se muestra además que dicho vector de expresión permite la producción de una proteína recombinante tras transfección del vector de expresión en células de CHO, siendo la proteína recombinante tPA.

Aunque el sistema de expresión en CHO anterior basado en el uso de GS como marcador seleccionable se describió tan pronto como en los 80, sigue siendo un estándar de la materia todavía hoy en día. En particular, no se ha publicado ninguna mejora significativa del marcador seleccionable GS original.

Efectivamente, la patente coreana KR10-0267720 describe el uso de GS humana como un marcador seleccionable. Sin embargo, no se describe la secuencia exacta de la GS humana usada. Además, también se indica que el efecto téenico (rendimiento elevado) solo está ligado con la GS humana y con el promotor específico SV40 que se usa (es decir, un promotor SV40 que carece de las posiciones 128 a 270).

Existe por tanto la necesidad en la materia de sistemas de expresión adicionales y/o mejorados que permitan el aislamiento de un alto número de clones que expresen la proteína recombinante cuya producción se desea, exhibiendo al menos algunos de estos clones altos índices de expresión de la proteína recombinante.

Breve descripción de la invención Los inventores han encontrado sorprendentemente que, cuando se producen proteínas recombinantes en células de CHO, el uso de una GS de origen humano o canino proporciona mejores resultados que el uso de una GS de origen de CHO (véanse, por ejemplo, las Figuras 2 y 3).

En particular, se ha encontrado que el uso de una GS de origen humano es especialmente ventajoso, puesto que permite el aislamiento de más clones que expresan las proteínas recombinantes que cuando se usa una GS de origen de CHO, expresando algunos de ellos la proteína recombínante a niveles mayores que cuando se usa una GS de origen de CHO (véase, por ejemplo, la Figura 3).

Una modalidad de la invención proporciona una línea celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que comprende un vector de expresión de un ácido desoxirribonucleico (ADN), y en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamífero heteróloga y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en donde la GS comprende una secuencia proteica que es al menos 94,5 % identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o un fragmento de proteína de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la invención, la GS comprende una secuencia de al menos 94,5 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y a la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la invención, la GS comprende una secuencia de al menos 97,5 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1. En una modalidad particular de la invención, la GS es una GS humana y comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad particular de la invención, la GS es una GS canina y tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2.

Aún en otra modalidad de la invención, la línea celular de CHO comprende un vector de expresión de ácido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamífero heteróloga y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en donde los codones de triplete de dicha secuencia que codifica una GS ha sido sesgados para expresión en células de CHO. En otra modalidad de la invención, dicha secuencia que codifica una GS comprende una secuencia al menos 80 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En una modalidad particular de la invención, la secuencia que codifica una GS comprende una secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En otra modalidad de la invención, la secuencia que codifica una GS humana está dispuesta bajo el control de un promotor del virus vacuolante 40 de simio (SV40) y la proteína recombinante es un anticuerpo monoclonal.

Aún en otra modalidad de la invención, la línea celular de CHO comprende un vector de expresión de ácido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamífero heteróloga y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en donde los codones de triplete de dicha secuencia que codifica una GS ha sido sesgados para expresión en células de CHO. En otra modalidad, el vector comprende un primer casete de expresión adecuado para clonar una cadena ligera de anticuerpo, y un segundo casete de expresión adecuado para clonar una cadena pesada de un anticuerpo. Aún en otra modalidad, el primer y segundo casete de expresión comprende cada uno un promotor CMV y la línea celular de CHO es capaz de crecer en un medio sin suero y en un medio sin proteínas derivado de animal.

En una modalidad de la invención, la línea celular de CHO es la línea celular depositada con el No. CCL-61 en la ATCC o se deriva de la línea celular depositada con el No. CCL-61 en la ATCC. En otra modalidad de la invención, la línea celular de CHO permite obtener clones que producen al menos 1 mg/L de proteína recombinante tras transfección de dicho vector en la línea celular de CHO depositada con el No. CCL-61 en la ATCC.

Aún en otra modalidad de la invención, la línea celular de CHO comprende un vector de expresión de ácido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia nucleótida de glutamina sintasa (GS) (es decir, una secuencia nucleótida que codifica una glutamina sintetasa (GS)) y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante. En una modalidad, el vector no contiene un gene heterólogo para la expresión de una proteína recombinante. En otra modalidad de la invención, el vector contiene al menos una secuencia que codifica una proteína recombinante. En otra modalidad, el vector contiene un gene heterólogo que codifica una proteína recombinante que es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad de la invención, el vector contiene un gene heterólogo que codifica una proteína recombinante que es una proteína inmunogénica para inducir una respuesta del anticuerpo. En otra modalidad de la invención, el vector contiene un gene heterólogo que codifica una proteína recombinante que es una enzima para terapia de reemplazo enzimático o para uso industrial.

Una modalidad de la invención proporciona un vector de expresión de un ácido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia nucleótida que codifica una glutamina sintetasa (GS) bajo el control de un promotor del virus vacuolante 40 de simio (SV40) y un primer casete de expresión adecuado para clonar una proteína heteróloga recombinante bajo el control de un promotor de CMV. En una modalidad particular de la invención, la secuencia GS comprende una secuencia proteica que es al menos 94,5 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o un fragmento de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

Otra modalidad de la invención proporciona un vector de expresión de un ácido desoxirribonucleico (ADN), y el vector comprende una secuencia nucleótida que codifica una glutamina sintetasa (GS) bajo el control de un promotor del virus vacuolante 40 de simio (SV40) y un primer casete de expresión adecuado para clonar una cadena ligera de anticuerpo bajo el control de un promotor de CMV, y un segundo casete de expresión adecuado para clonar una cadena pesada de anticuerpo bajo el control de un promotor de CMV. En una modalidad particular de la invención, la secuencia GS comprende una secuencia proteica que es al menos 94,5 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

Una modalidad de la invención proporciona un vector como se define en la Figura 1.

Una modalidad de la invención proporciona un método in vitro para producir una proteína recombinante que comprende las etapas de proporcionar una línea celular de CHO; cultivar la línea celular de CHO obtenida en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y aislar y/o purificar dicha proteína recombinante. Otra modalidad proporciona una etapa adicional de formulación de la proteína recombinante en una composición farmacéutica.

Una modalidad de la invención pertenece a una combinación de: i) una línea celular eucariótica (por ejemplo, una línea celular de ovario de hámster chino (CHO)); y ¡i) un vector de ADN adecuado para la producción de una proteína recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamífero heteróloga (por ejemplo, una GS que comprende una secuencia al menos un 94,5% identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2).

Otro aspecto de la presente invención está dirigido a un kit que comprende la combinación anterior.

Aún otro aspecto de la invención está dirigido al vector de ADN como tal.

Aún otro aspecto de la invención está dirigido a una línea celular de CHO que comprende el vector de ADN.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro de producción de una proteína recombinante que comprende las etapas de: a) proporcionar un vector como se define anteriormente; b) transfectar una línea celular con dicho vector; c) cultivar la línea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y d) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.

Aún otro aspecto de la invención se refiere al uso de dicha combinación, o de dicho vector, o de dicha línea celular, para producir una proteína recombinante in vitro.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra un esquema de los vectores usados en los Ejemplos (pBH3695, pBH3700, pBH3694, pBH3699, pBH3698, pBH3697 y pBH3623).

La Figura 2 muestra el número de pocilios ocupados y productividades conseguidas con una línea celular de CHO transformada con los vectores pBH3695, pBH3700, pBH3694, pBH3699, pBH3698, pBH3697 y pBH3623.

La Figura 3 muestra las productividades conseguidas por los clones obtenidos durante el experimento mostrado en la Figura 2, para los vectores pBH3695, pBH3700 y pBH3623. Cada barra representa un clon.

La Figura 4 muestra los resultados del experimento llevado a cabo en la línea celular 9E4. Se muestran las productividades y el número de clones obtenidos. El número “0” en el eje horizontal indica que no se obtuvo clon (que es el caso para los vectores pBH3700, pBH3694, PBH3697, pBH3698 y pBH3699).

La Figura 5 muestra un alineamiento de secuencia entre la GS humana de SEQ ID NO: 1 , la GS canina de SEQ ID NO: 2 y la GS de CHO de SEQ ID NO: 3, que se preparó usando el programa de "alineamiento de secuencia múltiple CLUSTAL 2.1”. Los residuos que son diferentes en GS humana y canina, en comparación con GS de CHO, se indican con flechas negras. Estos residuos corresponden a los residuos 12, 16, 18, 19, 33, 49, 80, 82, 91 , 1 16, 191 , 269, 282, 350, 355 y 356 de SEQ ID NO: 1 y de SEQ ID NO: 2 (las variaciones de aminoácidos correspondientes a 12G, 16V, 18M, 19S, 33I, 49S, 80V, 82A, 91 K, 116T, 191A, 269Y, 282Q, 350S, 355L y 356I, respectivamente). Los residuos que son diferentes en GS humana, en comparación con GS canina y de CHO, se indican con una flecha gris. Estos residuos corresponden a los residuos en la posición 2, 68, 98, 107, 169, 213 de SEQ ID NO: 1 (las variaciones de aminoácidos correspondientes a 2T, 68L, 98L, 107R, 169R y 213S, respectivamente).

La Figura 6 muestra la concentración de anticuerpo obtenida después de la transfección transitoria de células de CHO-S con vectores de control (Control 1 y Control 2), y con los vectores pBH3695 y pBH3772, que expresan respectivamente los anticuerpos 13C3 y anti-CD38.

Descripción detallada de la invención Otro aspecto de la presente invención está dirigido a una combinación de: i) una línea celular eucariótica; y ii) un vector de ADN (ácido desoxirribonucleico) adecuado para la producción de una proteína recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) de mamífero heteróloga.

La línea celular eucariótica puede ser, por ejemplo, una línea celular de levadura (por ejemplo, una línea celular de Saccharomyces cerevisiae o Yarrowia lipolytica), una línea celular de hongo (por ejemplo, una línea celular de Aspergillus niger), una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero (incluyendo, pero sin limitación, líneas celulares de CHO, líneas celulares humanas tales como HEK293 o PERC.6, líneas celulares de ratón tales como NSO y líneas celulares de mono). En una modalidad especifica, la línea celular eucariótica es una línea celular de CHO. La GS codificada por el vector de ADN se origina en una especie de mamífero, y puede originarse por ejemplo en ser humano o perro.

En una modalidad específica, dicha GS de mamífero heteróloga comprende o consiste en una secuencia: al menos un 94,5% identica a al menos una de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y/o - consistente en un fragmento de al menos 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Dicha combinación, a que se hace referencia además como "combinación según la invención", constituye un sistema de expresión.

Más específicamente, un aspecto de la invención está dirigido a una combinación de: i) un vector de ADN adecuado para la producción de una proteína recombinante, en la que dicho vector comprende una secuencia de codificación de una glutamina sintetasa (GS); y ii) una línea celular de ovario de hámster chino (CHO); en la que dicha GS comprende una secuencia: - al menos un 94,5% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o - consistente en un fragmento de al menos 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. La combinación según la invención puede proporcionarse, por ejemplo, en forma de un kit, por ejemplo con un vial que comprende el vector de ADN y otro vial que comprende la línea celular.

Cuando el sistema de expresión se usa para producir una proteína recombinante, el vector se introduce en la línea celular (puede transfectarse, por ejemplo, estable o transitoriamente en la línea celular).

La presente invención engloba por tanto: una combinación en la que el vector está presente en la línea celular por un lado, y - una combinación en la que el vector se aísla de la línea celular por otro lado. 1. Vector según la invención El vector de ADN para uso en la combinación según la invención (al que se hace referencia además como "vector según la invención") es adecuado para la producción de una proteína recombinante, y comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS).

Como se usa en la presente descripción, el término “glutamina sintetasa” o “GS” hace referencia a un polipéptido capaz de catalizar la condensación de glutamato y amoníaco formando glutamina, como se representa por la siguiente reacción bioquímica: ATP + L-glutamato + NH3 <=> ADP + fosfato + L-glutamina.

Dicho polipéptido se clasifica con el número 6.3.1.2 de la Comisión de Enzimas (EC). Los polipéptidos capaces de catalizar la reacción anterior exhiben “actividad GS”.

La GS que se usa en el marco de la presente invención (a la que se hace referencia además como "GS según la invención") puede comprender o consistir en una secuencia al menos un 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% o 100% idéntica a al menos una de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Es más, se ha encontrado que dicha GS es ventajosa para uso como marcador seleccionable en células de CHO (véase el Ejemplo 1 ). Puede comprender también o consistir en un fragmento de al menos 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, a condición de que la proteína retenga su actividad GS.

En una modalidad especifica, la GS según la invención comprende o consiste en una secuencia al menos un 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% o 100% idéntica tanto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

En una modalidad específica, la GS según la invención comprende o consiste en una secuencia al menos un 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% o 100% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1. Dicha GS es particularmente ventajosa para uso como marcador seleccionable en células de CHO (véase el Ejemplo 1 ), en particular la línea celular E94 de CHO (véase el Ejemplo 2).

En una modalidad específica, la GS según la invención es una GS humana, concretamente una GS de origen humano. Como se usa en la presente descripción, el término "GS humana" hace referencia a una secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 1 , así como a variantes de la misma que exhiban actividad GS. Dichas variantes pueden corresponder, por ejemplo, a variantes que aparecen naturalmente en la especie humana (tales como variantes alélicas o variantes de corte y empalme). Como alternativa, dichas variantes pueden corresponder a variantes obtenidas por ingeniería genética. Lo más preferible, dichas variantes difieren solo de la secuencia de SEQ ID NO: 1 por la presencia de como máximo 22, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 variaciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1 (incluyendo dichas variaciones sustituciones, inserciones y supresiones).

En otra modalidad específica, la GS según la invención es una GS canina, concretamente una GS de origen canino. Como se usa en la presente descripción, el término "GS canina" hace referencia a una secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2, así como a variantes de la misma que exhiban actividad GS. Dichas variantes pueden corresponder, por ejemplo, a variantes que aparecen naturalmente en la especie canina (tales como variantes alélicas o variantes de corte y empalme). Como alternativa, dichas variantes pueden corresponder a variantes obtenidas por ingeniería genética. Lo más preferiblemente, dichas variantes difieren solo de la secuencia de SEQ ID NO: 2 por la presencia de como máximo 22, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 variaciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 2 (incluyendo dichas variaciones sustituciones, inserciones y supresiones).

En una modalidad específica, la GS según la invención comprende al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 16, 20 o 22 de los siguientes aminoácidos: 12G, 16V, 18M, 19S, 33I, 49S, 80V, 82A, 91 K, 116T, 191A, 269Y, 282Q, 350S, 355L, 356I, 2T, 68L, 98L, 107R, 169R y 213S, en los que el número indica la posición en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, y la letra la naturaleza del aminoácido (usando el código genético de una letra). En una modalidad más específica, la GS según la invención comprende al menos 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 de los siguientes aminoácidos: 2T, 68L, 98L, 107R, 169R y 213S. En otra modalidad más específica, la GS según la invención comprende al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 o 16 de los siguientes aminoácidos: 12G, 16V, 18M, 19S, 33I, 49S, 80V, 82A, 91 K, 1 16T, 191 A, 269Y, 282Q, 350S, 355L y 356I. Los aminoácidos anteriores parecen ser específicos de GS humana y/o canina, en comparación con la GS de CHO (véase la Figura 5).

Se entiende por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de consulta de la presente invención, que la secuencia de aminoácidos del polipéptido en cuestión sea idéntica a la secuencia de consulta excepto porque la secuencia polipeptídica en cuestión pueda incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de consulta, pueden insertarse, eliminarse o sustituirse con otro aminoácido hasta un 5% (5 de 100) de los residuos de aminoácidos de la secuencia en cuestión.

En el marco de la presente invención, el porcentaje de identidad se calcula usando un alineamiento global (concretamente, las dos secuencias se comparan en toda su longitud). Los métodos para comparar la identidad y homología de dos o más secuencias son bien conocidos en la materia. El programa "Needle", que usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48: 443-453) para encontrar el alineamiento óptimo (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se considera toda su longitud, puede usarse, por ejemplo, para efectuar un alineamiento global. Este programa "Needle" está disponible, por ejemplo, en el sitio web www.ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad de acuerdo con la invención se calcula preferiblemente usando el programa "EMBOSS::needle (global)" con un parámetro "abertura de hueco" igual a 10,0, un parámetro de "extensión de hueco" igual a 0,5 y una matriz Blosum62.

Las variantes de una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como supresiones, inserciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia de referencia. En caso de sustituciones, la sustitución corresponde preferiblemente a una sustitución conservadora como se indica en la tabla siguiente.

El vector de ADN según la invención comprende una secuencia de codificación de dicha GS según la invención. La secuencia de codificación de dicha GS según la invención puede ser una secuencia de nucleótidos de origen natural. Como alternativa, los codones de triplete de la secuencia de codificación de dicha GS pueden estar sesgados para expresión en células de CHO. Son conocidos en la materia el software y los algoritmos para sesgar secuencias para obtener una expresión óptima e incluyen, por ejemplo, el algoritmo descrito en Raab et al. (2010, Syst. Synth. Biol. 4: 215-25). Este algoritmo no solo proporciona los mejores codones disponibles para expresión, sino que tiene en cuenta también el contenido de GC y la ausencia de motivos de ADN no deseados.

Por ejemplo, la secuencia de codificación de la GS según la invención puede comprender o consistir en una secuencia al menos un 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la secuencia de SEQ ID NO: 8 (concretamente, una secuencia de codificación de la GS humana de SEQ ID NO: 1 , que se ha diseñado para expresión óptima en células de CHO) y/o de la secuencia de SEQ ID NO: 9 (concretamente, una secuencia de codificación de una GS canina de SEQ ID NO: 2, que se ha diseñado para expresión óptima en células de CHO).

En una modalidad específica, la secuencia de codificación de la GS según la invención comprende o consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.

En el vector de ADN según la invención, la secuencia de codificación de la GS según la invención puede disponerse bajo el control de cualquier promotor conocido por aquellos expertos en la materia.

Por ejemplo, la secuencia de codificación de la GS según la invención puede disponerse, por ejemplo, bajo el control de un promotor del virus vacuolante 40 de simio (SV40), por ejemplo el promotor tardío o temprano de SV40. Se describe un promotor temprano de SV40, por ejemplo, en Benoist y Chambón (1981 , Nature. 290: 304-10) y en Moreau et al. (1981 , Nucleic Acids Res. 9: 6047-68). En particular, dicho promotor SV40 es un promotor completo. Dicho promotor SV40 puede tener también un origen de replicación que contiene una repetición 72bp.

En una modalidad específica, dicho promotor SV40 no es un promotor SV40 en el que las posiciones 128 a 270 se han eliminado, es decir, dicho promotor SV40 no es el promotor SV40 descrito en la patente coreana No. 10-0267720 y que transforma E. coli transformante depositada en el Gene Bank, Institute of Bioengineering, KIST el 17 de Diciembre de 1997 con el Número de Depósito: KCTC 8860 P.

En otra modalidad específica, la secuencia que codifica la GS según la invención no está dispuesta bajo el control de un promotor SV40.

Los vectores de ADN que son adecuados para la producción de proteínas recombinantes son conocidos por aquellos expertos en la materia. Dichos vectores de ADN corresponden típicamente a vectores de expresión que comprenden un origen de replicación y al menos un módulo de expresión que permite la clonación y expresión de la proteína recombinante cuya producción se desea. Un módulo de expresión comprende típicamente una región 5' no traducida (que comprende o consiste en una secuencia promotora, y opcionalmente potenciadora), uno o más sitios de restricción que permiten la clonación de una secuencia de codificación de la proteína recombinante, una región 3' no traducida (por ejemplo, una señal de poliA) y opcionalmente uno o más intrones. La secuencia promotora puede corresponder a cualquier promotor fuerte bien conocido en la materia tal como, por ejemplo, el promotor de CMV humano. El vector según la invención puede tener, por ejemplo, la estructura exhibida en la Figura 1 , que se explica con más detalle en el Ejemplo 1 , a condición de que la cadena pesada y la cadena ligera de 13C3 puedan reemplazarse por otras dos secuencias de codificación (por ejemplo, secuencias de codificación de la cadena pesada y la cadena ligera de otro anticuerpo).

La proteína recombinante puede corresponder a cualquier proteína que sea de interes para aquellos expertos en la materia. Como se usa en la presente descripción, el término "proteína" pretende englobar péptidos (concretamente, cadenas de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos), polipéptidos (concretamente, cadenas de aminoácidos de al menos 50 aminoácidos), proteínas monoméricas (concretamente, proteínas consistentes en una cadena de aminoácidos) y proteínas multiméricas (concretamente, proteínas consistentes en dos o más cadenas de aminoácidos tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales).

El vector según la invención comprende típicamente un número de módulos de expresión que es idéntico al número de diferentes cadenas de aminoácidos que constituyen la proteína (por ejemplo, un módulo de expresión en el caso de una proteína monomérica o proteína homodimérica, dos en el caso de una proteína heterodimérica o de un anticuerpo monoclonal, etc.).

Como alternativa, el vector de ADN según la invención puede comprender solo un módulo de expresión incluso cuando se desea la producción de una proteína heterodimérica o de un anticuerpo monoclonal. En dicho caso, la secuencia o secuencias de codificación de las demás cadenas de aminoácidos de la proteína están presentes en un vector de expresión separado, que se cotransfecta con el vector según la invención en la línea celular de CHO.

En una modalidad específica, el vector de ADN según la invención puede estar desprovisto de módulo de expresión. En dicho caso, el módulo o módulos de expresión adecuados para la expresión de la proteína recombinante están presentes en un vector de expresión separado, que se cotransfecta con el vector según la invención en la línea celular de CHO.

A lo largo de la presente especificación, el término “proteína recombinante” hace referencia a cualquier proteína recombinante cuya producción se desee. Puede corresponder, por ejemplo, a una proteína terapéutica y/o profiláctica, concretamente una proteína pretendida para uso como medicamento (incluyendo vacunas). En una modalidad específica, la proteína recombinante cuya producción se desea no es una glutamina sintetasa (GS). En otra modalidad específica, la proteína recombinante cuya producción se desea es un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo monoclonal. En aún otra modalidad específica, la proteína recombinante cuya producción se desea es una proteína antigénica. Aún en otra modalidad específica, la proteína recombinante para la que se desea la producción no es eritropoyetina (EPO).

El término “anticuerpo” se usa en la presente descripción en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales completos) de cualquier isotipo tales como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos. Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab’ o F(ab’)2) y proteínas de fusión que comprenden un fragmento de anticuerpo. Puede generarse un anticuerpo reactivo con un antígeno específico mediante métodos recombinantes tales como selección de colecciones de anticuerpos recombinantes en fago o vectores similares, o inmunizando un animal con el antígeno o un ácido nucleico de codificación de antígeno.

Un “anticuerpo monoclonal”, como se usa en la presente descripción, es un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogenea, concretamente, los anticuerpos que forman esta población son esencialmente idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que podrían estar presentes en cantidades menores. Estos anticuerpos están dirigidos contra un solo epítopo (o un solo grupo de epítopos en el caso de anticuerpos monoclonales multiespecíficos) y son por lo tanto altamente específicos.

Un anticuerpo monoclonal típico consta de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que se unen por puentes disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos llamados "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR") o "regiones hipervariables", que son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Se hacen referencia a ellas habitualmente como CDR1 , CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente desde el extremo N (véase Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a edición, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991 ). Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables se llaman las "regiones estructurales”.

El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de múrido, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humano.

Cuando la proteína recombinante cuya producción se desea es un anticuerpo monoclonal, el vector según la invención puede comprender un primer módulo de expresión adecuado para clonación de la cadena ligera del anticuerpo y un segundo módulo de expresión adecuado para clonación de la cadena pesada del anticuerpo.

En una modalidad específica, dichos primer y segundos módulos de expresión comprenden cada uno el promotor de citomegalovirus (CMV), por ejemplo un promotor de CMV de un CMV de humano o múrido. Más específicamente, dichos primer y segundo módulos de expresión pueden comprender: - un promotor potenciador temprano inmediato de CMV (por ejemplo, el que tiene la secuencia descrita en Teschendorf et al., 2002, Anticancer Res. 22: 3325-30); o una región promotora/potenciadora de IE2 de CMV de ratón (por ejemplo, la que tiene la secuencia descrita en Chatellard et al., 2007, Biotechnool. Bioeng. 96: 106-17); o - un elemento regulador de hCMV-MIE (por ejemplo, el que tiene la secuencia descrita en el documento WO 89/01036).

El término “proteína antigénica” se usa en la presente descripción en su sentido más amplio y cubre cualquier proteína capaz de generar una respuesta inmunitaria, sola o en combinación con un coadyuvante. Puede pretenderse para uso en una vacuna profiláctica o en una vacuna terapéutica. En una modalidad específica, la proteína antigénica es una proteína de vacuna, concretamente una proteína pretendida para uso en una vacuna profiláctica.

En el marco de la presente invención, el vector de ADN podría comprender al menos una secuencia de codificación de la proteína recombinante de interés (por ejemplo, una secuencia de codificación de una proteína monomérica, una secuencia de codificación de una cadena de anticuerpo o dos secuencias de codificación de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo, respectivamente), o podría estar vacío (concretamente, desprovisto de dicha secuencia de codificación de la proteína recombinante de interés).

En un aspecto, la invención está dirigida al vector según la invención per se. Dicho vector se pretende preferiblemente para uso en una línea celular de CHO. Sin embargo, puede usarse también para expresar proteínas en otras líneas celulares eucarióticas tales como líneas celulares de levadura, hongo, insecto o mamífero (por ejemplo, ser humano, ratón, mono, etc.). 2. Línea celular según la invención La línea celular para uso en la combinación según la invención (a la que se hace referencia además como "línea celular según la invención") es una línea celular eucariótica, por ejemplo, una línea celular de mamífero tal como una línea celular de CHO. Las líneas celulares de CHO se usan comúnmente para la producción industrial de proteína, y muchas líneas celulares de CHO son conocidas por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, dichas líneas celulares de CHO incluyen, por ejemplo, la línea celular CHO-K1 (número ATCC: CCL-61 ), la línea celular CHO DP-12 (ATCC n° CRL-12444 y 12445) y la línea celular CHO 1-15 (número ATCC CRL-9606). Estas cepas están disponibles al público en el American Type Culture Collection.

En una modalidad específica, la línea celular de CHO según la invención es capaz de crecer en medio exento de suero (por ejemplo, un medio definido químicamente) y/o en suspensión. Dicha línea celular puede obtenerse fácilmente por aquellos expertos en la materia adaptando la línea celular original para crecer en medio exento de suero y/o en suspensión (por ejemplo, mediante una clonación monocelular, mediante adaptación progresiva y/o mediante un proceso de “privación de nutrientes y recuperación”).

La línea celular de CHO según la invención puede ser una línea celular deficiente en GS o una línea celular que comprenda un gene de GS endógeno que codifica un polipéptido de GS endógeno.

En una modalidad específica, la línea celular de CHO es la línea celular depositada con el n° CCL-61 en la ATCC. Como se usa en la presente descripción, el término "línea celular depositada con el n° CCL-61 en la ATCC" engloba el clon original realmente depositado en la ATCC por un lado y clones derivados del mismo, por ejemplo mediante clonación monocelular, adaptación progresiva y/o mediante un proceso de "privación de nutrientes y recuperación", por otro lado. Más específicamente, la línea celular depositada con el n° CCL-61 en la ATCC puede usarse para obtener clones capaces de crecer en medio exento de suero y/o en suspensión.

En una modalidad específica, la combinación según la invención se caracteriza porque permite obtener clones productores de al menos 1 , 2, 3, 4 o 5 mg/l de proteína recombinante tras la transfección del vector en la línea celular depositada con el n° CCL-61 en la ATCC.

En otro aspecto, la invención está dirigida a una línea celular de CHO que comprende un vector según la invención. Preferiblemente, dicha línea celular de CHO se transfecta (se transfecta estable o transitoriamente) con dicho vector. Lo más preferiblemente, dicha línea celular de CHO comprende dicho vector integrado en su genoma.

Más específicamente, la invención se dirige a la línea celular de CHO que comprende un vector de expresión de ADN, y en donde dicho vector comprende una secuencia nucleótida que codifica una glutamina sintetasa (GS) heteróloga de mamífero y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en donde dicha GS comprende una secuencia proteica: a) al menos un 94,5% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o b) consistente en un fragmento de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. 3. Kits, métodos y usos según la invención Un aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende o consiste en una combinación según la invención. En dicho kit, el vector está preferiblemente vacío, puesto que esto permite la clonación de la proteína de interés para aquellos expertos en la materia. Además, el vector de ADN se aísla preferiblemente de la línea celular en dicho kit. El kit puede comprender además medios adecuados para el cultivo de la línea celular, medios adecuados para la transfección del vector en la línea celular y/o instrucciones para el uso del sistema de expresión.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la combinación según la invención, o del vector según la invención, o de la línea celular según la invención, para producir una proteína recombinante in vitro.

Aún otro aspecto de la invención se refiere a un metodo in vitro de producción de una proteína recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho método en las siguientes etapas: a) proporcionar una combinación según la invención; b) transfectar dicha línea celular con dicho vector de ADN; c) cultivar la línea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y d) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.

Como resulta inmediatamente evidente para aquellos expertos en la materia, el aspecto anterior hace referencia a una combinación según la invención en la que el vector de ADN se aísla de la línea celular en la etapa (a).

Aún otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de producción de una proteína recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho método en las siguientes etapas: a) proporcionar una combinación según la invención; b) cultivar la línea celular transfectada en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y c) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.

Como resulta inmediatamente evidente para aquellos expertos en la materia, el aspecto anterior hace referencia a una combinación según la invención en la que la línea celular comprende el vector de ADN (por ejemplo, la línea celular se ha transfectado previamente con el vector de ADN) en la etapa (a).

Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de producción de una proteína recombinante, que comprende o consiste en las siguientes etapas: a) proporcionar un vector según la invención, en el que dicho vector comprende al menos una secuencia de codificación de una proteína recombinante; b) transfectar una línea celular según la invención con dicho vector; c) cultivar la línea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y d) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.

Las condiciones adecuadas para la producción de proteínas recombinantes son bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Pueden usarse por ejemplo los protocolos descritos en los Ejemplos.

En una modalidad específica, se añade un inhibidor de GS tal como metionina sulfoximina (msx) o fosfinotricina cuando se cultiva la línea celular según la invención. En una modalidad más específica, se añaden concentraciones crecientes de dicho inhibidor de GS cuando se cultiva la línea celular. Esto permite seleccionar clones en que se ha amplificado el gene de GS derivado del vector (y por tanto la secuencia de codificación de la proteína recombinante).

Los métodos anteriores pueden comprender además la etapa de formular la proteína recombinante en una composición farmacéutica.

Aún otro aspecto de la invención está dirigido a un metodo para coamplificar una secuencia de ADN recombinante que codifica una proteína recombinante, que comprende o consiste en las siguientes etapas: a) proporcionar un vector según la invención, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica dicha proteina recombinante; b) proporcionar una línea celular según la invención; c) transfectar dicha línea celular con dicho vector; y d) cultivar dicha línea celular transfectada en condiciones que permitan seleccionar los transformantes que contienen un número amplificado de copias de una secuencia derivada de vector que codifica GS, en el que dichos transformantes también contienen un número amplificado de copias de la secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos completa de la proteína recombinante. La etapa (d) del método anterior puede comprender cultivar la línea celular transfectada en medios que contienen un inhibidor de GS y seleccionar los transformantes que sean resistentes a un nivel progresivamente elevado del inhibidor de GS. Los medios que contienen el inhibidor de GS pueden contener además metionina, con lo que pueden reducirse las concentraciones de inhibidor de GS en los medios.

La invención está también dirigida a un método de uso de un vector de ADN como marcador seleccionable dominante en un proceso de cotransformación, en el que dicho método comprende o consiste en las siguientes etapas: a) proporcionar un vector según la invención, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica una proteína recombinante; b) proporcionar una línea celular según la invención; c) transfectar dicha línea celular con dicho vector; y d) seleccionar celulas transformantes que sean resistentes a inhibidores de GS, con lo que se seleccionan células transformantes en que una secuencia de ADN recombinante derivada de vector que codifica GS sirve como marcador seleccionable y coamplificable dominante.

En una modalidad específica de los kits y métodos anteriores, la línea celular es una línea celular de CHO.

En una modalidad específica, el uso de la combinación según la invención o del vector según la invención, o de la línea celular según la invención permite (i) aumentar los clones que expresan las proteínas recombinantes y/o (ii) aumentar la producción de la proteína recombinante, que cuando se usa una GS de origen de CHO.

Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta especificación. Cada uno de los documentos de la presente descripción (incluyendo cualquier artículo de revista o resumen, solicitud de patente publicada o no publicada, patente expedida, especificaciones o instrucciones del fabricante, etc.) se incorpora a la presente como referencia. Sin embargo, no se admite que ningún documento citado en la presente descripción sea de hecho téenica anterior con respecto a la presente invención.

La invención se describirá además por referencia a los siguientes dibujos y ejemplos, que son solo ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención. Es más, la invención se define por las reivindicaciones, que deberían interpretarse con la ayuda de la descripción y los dibujos.

Breve descripción de las secuencias La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una GS de origen humano.

La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una GS de origen canino.

La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una GS de origen de hámster chino.

La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de una GS de origen de levadura ( Saccharomyces cerevisiae).

La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de una GS originada en sapo ( Xenopus laevis).

La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de una GS originada en plantas ( Arabidopsis thaliana).

La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de una GS originada en insectos ( Drosophila melanogaster).

La SEQ ID NO: 8 muestra una secuencia de nucleótidos de codificación de una GS de origen humano.

La SEQ ID NO: 9 muestra una secuencia de nucleótidos de codificación de una GS de origen canino.

La SEQ ID NO: 10 muestra una secuencia de nucleótidos de codificación de una GS de origen de hámster chino.

La SEQ ID NO: 1 1 muestra una secuencia de nucleótidos de codificación de una GS de origen de levadura ( Saccharomyces cerevisiae).

La SEQ ID NO: 12 muestra una secuencia de nucleótidos de codificación de una GS originada en sapo ( Xenopus laevis).

La SEQ ID NO: 13 muestra una secuencia de nucleótidos de codificación de una GS originada en plantas ( Arabidopsis thaliana).

La SEQ ID NO: 14 muestra una secuencia de nucleótidos de codificación de una GS originada en insectos ( Drosophila melanogaster).

Ejemplos Ejemplo 1 : Identificación de una GS que proporciona resultados mejorados Los inventores aspiraban a desarrollar nuevos vectores para la expresión y producción de proteínas recombinantes en líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO). Se diseñó un conjunto de siete vectores como se describe a continuación en la presente descripción.

Se usaron como informadores para valorar la calidad del vector dos cADN que codifican una versión humanizada del anticuerpo 13C3 (un cADN que codifica la cadena pesada de 13C3 y otro cADN que codifica la cadena ligera de 13C3, respectivamente, formando la combinación de dichas cadenas el anticuerpo 13C3 humanizado). El anticuerpo 13C3 de múrido es un anticuerpo que se une específicamente a la forma protofibrilar de la proteína b-amiloide humana, como se describe en el documento WO 2009/065054. Como se usa además en la presente descripción, el término “13C3" hace referencia a la versión humanizada del anticuerpo 13C3 de múrido.

Los siete vectores se representan esquemáticamente en la Figura 1. Estos ocho vectores comprenden todos: - una secuencia de codificación de una GS, dispuesta bajo el control del promotor temprano de SV40; - un primer módulo de expresión, en que la secuencia de codificación de la cadena ligera del anticuerpo 13C3 se dispone bajo el control del promotor de CMV; - un segundo módulo de expresión, en que la secuencia de codificación de la cadena pesada del anticuerpo 13C3 se dispone bajo el control del promotor de CMV; - un origen de replicación procariótico; - un origen de replicación eucariótico; y un marcador seleccionable para uso en células procarióticas, a saber, una secuencia de codificación de una proteína que confiere resistencia a ampicilina, dispuesta bajo el control de su promotor natural.

Más específicamente, la secuencia de codificación de GS se dispone bajo el control del promotor de SV40, incluyendo el potenciador de SV40. Dicho promotor temprano de SV40 contiene los potenciadores repetidos en tándem de 72 pb de SV40 ligados con las repeticiones no en tándem de 21 pb, y la secuencia de proteína líder de SV40 excluyendo cualquier secuencia de codificación. El uso de esta región como promotor fuerte se ha descrito por Benoist y Chambón (1981 , Nature. 290: 304-10) y en Moreau et al. (1981 , Nucleic Acids Res. 9: 6047-68). Se usa clásicamente como promotor para la expresión de marcadores de selección en células de mamífero. En los siete vectores pBH3694 a pBH3700, el sitio de restricción Hindlll natural estaba destruido y se añadieron sitios de restricción únicos (Salí y Xmal) en el extremo 5' y 3' de la región promotora, de tal modo que se permitiera un intercambio sencillo de los diferentes cADN de GS.

Los siete vectores difieren entre sí por la secuencia de codificación de GS. Es más, se clonaron en los vectores secuencias de codificación de GS que tienen diferentes orígenes.

Más específicamente, se generaron siete cADN que codifican respectivamente una GS de hámster chino ( Cricetulus griseus), ser humano ( Homo sapiens), perro (Can/s lupus), levadura ( Saccharomyces cerevisiae), Drosophila ( Drosophila melanogaster), planta ( Arabidopsis thaliana) y sapo ( Xenopus laevis) usando las secuencias de aminoácidos de origen natural que están disponibles en bases de datos públicas. Partiendo de estas secuencias, se retradujeron las proteínas usando una matriz de los codones más frecuentes usados en CHO. Después de ello, se modificaron los cADN para contener sitios de clonación apropiados y se optimizaron las secuencias de nucleótidoss. Ha de observarse que, aunque las secuencias de nucleótidoss se optimizaron para expresión en CHO, la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas permanece idéntica a la de las proteínas codificadas naturalmente.

Más específicamente, las secuencias de codificación de origen natural de las diferentes GS se recogieron de diferentes colecciones de cADN públicas. Por ejemplo, se usó el n° de referencia NCBI NM_002065.5 para GS humana. Se usó el n° de referencia NCBI NM_001 002965.1 para GS canina. Se usó el n° de referencia NCBI NM_078568.2 para GS de Drosophila. Se encontró la secuencia de codificación de GS de levadura en el sitio web disponible en www.yeastgenome.org (n° de referencia. YPR035W). La secuencia de aminoácidos de GS de hámster chino corresponde a la que se muestra en la secuencia de referencia NCBI: XP_003502909.1 (REFSEQ: n° de acceso XM_003502861.1 ). Partiendo de las secuencias de cADN de origen natural, se sesgaron los codones de triplete de la secuencia de codificación de dicha GS para expresión en celulas de CHO usando un software desarrollado por Wagner y colaboradores, que está basado en el algoritmo descrito en Raab et al. (2010, Syst. Synth. Biol. 4: 215-25). Esta téenica no solo proporciona los mejores codones disponibles para expresión, sino que tiene en cuenta también el contenido de GC y la ausencia de motivos de ADN no deseados.

Se clonaron los cADN obtenidos en el esqueleto portador de los módulos de expresión para el anticuerpo 13C3, proporcionando asi los vectores representados en la Figura 1.

Se muestra en la tabla siguiente el nombre de estos vectores, así como el origen y secuencia de la GS codificada.

Se nucleoporaron los vectores anteriores usando condiciones clásicas en una línea celular de CHO. 24 horas después de la transfección, se sembraron aproximadamente 2000 células en 480 a 960 pocilios de placas de 96 pocilios, comprendiendo cada pocilio 200 mI de ^ medio CD-CHO que contiene metionina sulfoximina (msx) a una concentración de 25 mM.

Aproximadamente 20 días después de la siembra, se cambiaron los medios de los pocilios a medio reciente y selectivo (el mismo que se describe anteriormente).

Cuatro días después, se contó el número de pocilios ocupados, concretamente, se cuentan los números de pocilios que contienen clones en crecimiento. Se ensayó en cada sobrenadante de los pocilios ocupados su productividad de anticuerpo 13C3 usando una teenología de fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) desarrollada 25 por Cisbio Bioassays (Bagnols/Ceze, Francia).

Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3. Puede concluirse a partir de estas figuras que dos vectores, a saber pBH3695 y PBH3700, dan mejores resultados que los demás vectores. Permiten obtener tanto más clones como una mejor productividad.

Se muestran en las tres tablas siguientes los porcentajes de identidad entre secuencias de las diferentes GS que se ensayaron. Estos porcentajes de identidad se calcularon usando el programa EMBOSS Needle, usando los siguientes parámetros por defecto: - Matriz: EBLOSUM62; - Penalización de hueco: 10,0; y Penalización por extensión: 0,5; A partir de estas tablas, puede concluirse que las dos secuencias que proporcionan los mejores resultados, a saber GS humana y canina, se caracterizan porque su secuencia exhibe al menos un 94,5% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 1 , y/o 2. Este rasgo no es cierto para las secuencias de las demás GS que se ensayaron, lo que condujo a resultados menos óptimos.

Ejemplo 2: Confirmación de las propiedades ventajosas del uso del vector que codifica una GS humana en una segunda línea celular de CHO.

El experimento anterior se repitió con la línea celular de CHO a la que se hace referencia como “9E4”, que es adecuada para la producción industrial de proteínas recombinantes.

Se estableció la línea celular 9E4 a partir de un clon de la línea celular CHO-K1 mediante un proceso de clonación monocelular. Se obtuvo la línea celular CHO-K1 por Puck en 1957 y se ha depositado en la ATCC con el número CCL-61. La línea celular 9E4 de CHO parece expresar una proteína GS endógena y funcional, puesto que esta línea celular puede crecer en ausencia de glutamina. Por tanto, debería usarse preferiblemente metionina sulfoximina (msx) para la selección de clones transfectados.

Se introdujo el vector en la línea celular 9E4 mediante nucleoporación. Se efectuó un primer experimento usando los seis vectores construidos en el Ejemplo 1 (a saber, pBH3695, pBH3700, pBH3694, pBH3697, pBH3698 y pBH3699). Las condiciones de selección fueron idénticas a las condiciones descritas en el Ejemplo 1 (msx añadida a una concentración de 25 mM). Se midieron el número de pocilios ocupados y la concentración del anticuerpo 13C3 como se describe en el Ejemplo 1. Se muestran los resultados en la Figura 4.

En la línea celular 9E4, pBH3695 es el único vector capaz de generar clones productores de anticuerpos 13C3. Este plásmido es el que porta el cADN que codifica GS humana en que los codones de triplete se sesgaron para expresión en células de CHO. El uso de un vector que comprende una secuencia de codificación de una GS humana es por tanto particularmente ventajoso para producir proteínas recombinantes en líneas celulares de CHO.

Ejemplo 3: Expresión transitoria de X14 en HEK 293 usando el vector pBH basado en GS humana y el promotor CMV humano.

En este experimento, se ha usado un vector que contiene la GS humana de la secuencia SEQ ID NO: 1 posicionado bajo el control del promotor SV40, y un único casete de expresión que contiene un cADN que codifica el receptor X14 humano o de ratón (tambien denominado familia 14 del dominio de lectina tipo C, miembro A (CLEC14A), y que tiene respectivamente el número de referencia NCBI NP_778230.1 y NP_080085.3) bajo el control del promotor CMV humano y un sitio de poliadenilación. El vector que contiene el cADN que codifica el receptor X14 humano es de aquí en adelante el vector pBH4590, y el vector que contiene el cADN que codifica el receptor X14 de ratón se denomina de aquí en adelante vector pBH4589.

El vector pBH4590, vector pBH4589 o un vector de control (es decir, un vector plásmido no relacionado) se introdujeron por transfección con Jet PEI en células HEK 293-FS como describe el fabricante Poly Plus transfection.

Las células se analizaron 24h después de la transfección mediante inmunofluorescencia, citometría de flujo o inmunocitoquímica después de marcar apropiadamente para la detección de X14 humano o de ratón.

Detección por inmunofluorescencia Para la detección por inmunofluorescencia, las células transfectadas se centrifugaron y se descartaron los sobrenadantes. Los pelets celulares se resuspendieron en amortiguador PBS que contenía 1 % de albúmina de suero bovino (P/V) y 0, 1 % de Tween (V/V) (PBS T BSA) y se saturaron 10 minutos en este amortiguador. Las celulas se lavaron dos veces con el mismo amortiguador y se incubaron con Suero 1 primario (es decir, suero obtenido justo antes de la inmunización del animal, denominado suero pre-inmune que representa el control negativo) o Suero 2 (es decir, el suero que es el suero inmune sin purificar obtenido después de la inmunización del animal) con el dominio extracelular de X14 humano purificado como se describe a continuación a la dilución 1/5000 en el amortiguador (PBS T BSA) durante 10 minutos a Temperatura Ambiente.

Después de separar por lavado el anticuerpo primario sin unir, se añade un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra unido a un fluróforo Alexa (Alexa 488nm Ref A1 1034 de Invitrogen). La inmunofluorescencia se realizó usando un conjunto de microscopio de fluorescencia Leica para detectar Alexa a 488 nm.

No se puede observar fluorescencia Alexa 488 de fondo ni con el plásmido de control y suero 1 o el plásmido de control y el suero 2, respectivamente. Esto indica la ausencia de fluorescencia de fondo no específica. Por el contrario, aparece una fuerte fluorescencia Alexa 488 en la membrana plasmática de las células transfectadas con los vectores pBH4590 y pBH4589. El uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana es por lo tanto particularmente ventajoso para promover la expresión transitoria de proteínas unidas a membrana.

Detección por citometría de flujo.

Para la detección por citometría de flujo se consiguió marcar el X14 humano mediante dos incubaciones en serie con tres preparaciones de anticuerpos diferentes y un resto de anticuerpo IgG Fe anti Conejo secundario. Las dos líneas celulares transfectadas se analizaron con tres diluciones diferentes del suero anti-X14 (1/5000, 1/1000, 1/500): Suero 1 , obtenido justo antes de la inmunización del animal, llamado suero pre-inmune que representa el control negativo, • Suero 2 que es el suero inmune sin purificar y obtenido después de la inmunización del animal con el dominio extracelular purificado de X14 humano, • Suero 3 que corresponde a la fracciones de inmunoglobulina de Suero 2, dirigida contra la lectina de X14 humana.

Después de separar por lavado el anticuerpo primario sin unir, se añadió un anticuerpo secundario anti conejo de cabra unido a un fluróforo Alexa (Alexa 488nm, Número de Catálogo A-1 1034, de Life Technologies). Las células transfectadas se analizaron usando un conjunto de citometría de flujo para detectar Alexa 488 con tres diluciones diferentes de Suero 1 , 2 y 3 respectivamente.

Vale la pena señalar que todos los histogranas presentan un único pico de fluorescencia, indicando una población celular homogénea. La intensidad de fluorescencia media de este pico está entre 102 y 103 unidades de fluorescencia. Sin embargo, las células incubadas con suero 2, diluidas a 1/500e, presentan una intensidad de fluorescencia media de aproximadamente 1000 unidades de fluorescencia. Esta intensidad de fondo mínima es adecuada para estudiar la detección en la membrana plasmática. El citómetro de flujo se calibró de manera que la fluorescencia observada con el vector de control y el suero 1 diluido a 1/5000e, se tomó como fluorescencia de referencia de fondo.

Se analizaron a continuación las células transfectadas con el vector pBH4590. La intensidad de fluorescencia de la célula transfectada con X14 humano con suero 1 , para cada dilución, es similar a las señales de las células de control. Por el contrario, las señales de fluorescencia eran marcadamente más intensas para el suero 2 y los anticuerpos policlonales purificados (Suero 3) que para el suero pre inmune (Suero 1 ). De hecho, la intensidad de fluorescencia media para el suero inmune (Suero 2) y el anticuerpo purificado (Suero 3) en células transfectadas con X14 humano es de 104 unidades de fluorescencia. Ello aumenta en un factor de 10-20 a las tres concentraciones de los antisueros específicos ensayados.

Estos resultados demuestran que en las células HEK 293-FS transfectadas con el vector pBH4590, X14 humano se produce a un nivel claramente detectable tal como se observa mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Además, X14 humano se hace accesible a la detección extracelular indicando que se expresa en la membrana plasmática.

Ejemplo 4: Expresión de los receptores X14 humanos y murinos en las células de CHO El objetivo de este experimento era ensayar si el mismo vector que se usó para la expresión de X14 humano o de ratón transitoria podría usarse para la expresión en celulas de CHO como clones estables del receptor X14 humano o de ratón. Para ello, el vector pBH4590 o el vector pBH589 que porta cADN de GS humana se transfectó en la línea celular de CHO-9E4, usando el protocolo desarrollado por el dispositivo de nucleoporación Lonza/Amaxa. Se electroporaron dos millones de células de CHO-9E4 con 10pg del vector pBH4590 o el vector pBH4589 descrito anteriormente en la presente descripción. Poco después del choque eléctrico, las células se diluyeron en 2ml de medio CD-CHO reciente y 24 horas después las células se diluyeron de nuevo en un medio reciente CD-CHO que contenía 25mM de sulfoximida de metilo (msx) a una concentración de 10.000 células por i. Se sembraron aproximadamente diez placas de 96 pocilios a 2.000 células por pocilio.

Se criban los semi clones CHO, obtenidos después de la transfección de las células de CHO con el vector pBH4590 o el vector pBH4589, usando el marcador GS detectable. También se realizó una transfección con el control de referencia que expresa el anticuerpo 13C3. Dicho control se usó como control para el análisis por citómetro de flujo. Se obtuvieron treinta semi clones X14 humanos, cuarenta y un semi clones X14 de ratón y veintinueve semiclones para el vector de control.

Después del paso de semi clones a placas de 24 pocilios, que es el comienzo del proceso de amplificación, se realizó la detección de la presencia o ausencia de antígeno X14 humano o de ratón usando las herramientas descritas anteriormente.

Se ha observado que, por ejemplo, el semi clon humano n°12 tiene una intensidad de fluorescencia menor que el semi clon n°30 murino. De hecho, con semi clones murinos, se observó la presencia de picos únicos de fluorescencia que tenían una intensidad de fluorescencia de 103 unidades de fluorescencia, mientras que en el caso de semi clones humanos, el pico se extendía y la intensidad de fluorescencia media no excedía las 500 unidades de fluorescencia.

Se realizó la amplificación de semi clones que se analizaron como positivos mediante citometría de flujo, permitiendo de esa forma general finalmente 10 semi clones de lectina X14 murina que expresan establemente líneas de CHO y 4 semi clones de lectina X14 humana que expresan establemente líneas de CHO.

El uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana es por tanto particularmente ventajoso para generar proteínas recombinantes que expresan establemente líneas celulares de CHO.

Ejemplo 5: Transfección transitoria en CHO-S de diferentes plásmidos de ADN que codifican dos anticuerpos diferentes Para estudiar la posibilidad de usar nuestro vector que porta el cADNs de Gs humana para la transfección transitoria en CHO-S, se contruyó un segundo vector, derivado de pBH3695 reemplazando los dos cADNs correspondientes a la cadena pesada y ligera del anticuerpo 13C3 por la cadena ligera y pesada del cADNs de anti-CD38 usando teenologías de clonación clásicas y cuatro sitios de restricción única.

Consecuentemente, el vector pBH3772 comprende: una secuencia de codificación de una GS, dispuesta bajo el control del promotor temprano de SV40; un primer casete de expresión, en que la secuencia de codificación de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD38 se dispone bajo el control del promotor de CMV; un segundo casete de expresión, en que la secuencia de codificación de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD38 se dispone bajo el control del promotor de CMV; un origen de replicación procariótico; - un origen de replicación eucariótico; y un marcador seleccionadle para uso en celulas procarióticas, a saber, una secuencia de codificación de una proteína que confiere resistencia a ampicilina, dispuesta bajo el control de su promotor natural.

CHO-S se transfectaron a continuación usando el aparato Maxcyte® con (i) dos vectores de control clásicamente usados para la transfección transitoria y que contienen el cADN de la cadena ligera y pesada de dos anticuerpos diferentes (es decir, llamados Control 1 y Control 2), y (ii) los vectores pBH3695 y pBH3772 en las condiciones descritas por la Compañía Maxcyte®. Las células de CHO-S se cultivaron en CD-CHO que contenía Glutamina 8mM en condiciones de cultivo de CHO-S clásicas (Paso cada 2-3 días a 0,3 106 células/ml). El día antes de la transfección, las células se dividieron en 1 ,2 106 células/ml y se transfectaron 24 horas después. El ajuste de temperatura y la alimentación ai medio se realizaron de acuerdo con el protocolo de Maxcyte®. Las muestras de cultivo se tomaron los días 3, 6, 7, 8 y 9 y se midieron por SEC-HPLC usando el anticuerpo purificado como curva de referencia estándar.

Los resultados de tal experimento se muestran en la figura 6.

Se puede concluir de esta figura que los vectores pBH3695 y pBH3772 son capaces de producir anticuerpos a un nivel que son equivalentes o mejores que los dos vectores e control clásicamente usados para la transfección transitoria.

En conclusión, los dos vectores pBH3695 y pBH3772 basados en la Glutamina Sintasa humana son capaces de producir un nivel significativo de anticuerpos por encima de 1000 mg/l.

El uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana es por lo tanto particularmente ventajoso para expresar estable o transitoriamente anticuerpos o proteínas unidas a membrana.

Ejemplo 6: Expresión de eritropoyetina (EPO) humana en células de CHO Para realizar la expresión de EPO humana, el vector pBH4590 se digirió con enzimas de restricción Nhel y EcoRI y dos cADN de EPO humana, es decir, cADN1 o cADN2 limitado con los sitios Nhel y EcoRI, se insertaron en dicho vector usando téenicas clásicas de biología molecular.

Esto permite obtener el vector pBH4614 que lleva el cADN1 de EPO humana, y el vector pBH4615 que lleva cDNA2 de EPO humana.

Los dos vectores se prepararon al nivel de preparación máximo usando un kit desarrollado por la compañía Qiagen.

Los vectores pBH4614 y pBH4615 se usaron para transfectar las tres líneas celulares de CHO-S, CHO-9E4 y CHO 30D12 usando las teenicas de electroporación de Lonza, respectivamente. Para ello, las células se dividieron un día antes de la transfección para alcanzar una densidad celular de 1X106 células/ml. Se centrifugaron dos millones de células y se suspendieron en 100m I de disolución V en presencia de 10pg de ADN, respectivamente para cada ADN y línea celular. Las células se electroporaron usando en programa X05. Rápidamente después de la electroporación, las células se diluyeron en 2ml de medio CD-CHO que contenía glutamina 6mM (Life Technologies) y se incubaron durante 24 horas a 37°C y C02 al 5%. Después de esta incubación, las células se diluyeron en 200ml del mismo medio sin Glutamina y en presencia de msx 25mM y se distribuyeron en placas de 96 pocilios usando 200mI por pocilio. Después de 15 (CHO-S) a 25 días (CHO-9E4, CHO 30D12), se cambió el medio a uno reciente en los pocilios que contenían las células supervivientes. De 4 a 5 días después, las células supervivientes se transfirieron a 1 mi de CD-CHO que contenía msx 25 sin agitación respectivamente para cada pocilio. Para CHO-S, se amplificaron 24 semi-clones, mientras que se amplificaron 12 semi clones para las otras dos lineas celulares, respectivamente para los dos cADN de EPO. En total se amplificaron 96 semi-clones, crecieron y se verificó su capacidad de producir eritropoyetina humana. Para ello, después de 3-4 días de incubación, los 1 mi se diluyeron en 4ml del medio de CD-CHO que contenía msx 25mM y se pusieron con agitación a 37°C y C02 al 5%. Despues de 3-4 días, los cultivos se diluyeron de nuevo con 5 mi de medio reciente. Después de 3-4 días, la densidad celular se midió y las células se diluyeron a 3X105 células /mi y crecieron durante 3-4 días una primera vez. Se midió la densidad celular y las células se sembraron a 3X105 células/ml en medio de CD-CHO que contiene msx 25mM y Feed B al 30% (Life Technologies).

Las células crecieron en 10ml del medio anterior(37°C, C02 al 5%) durante 10 días. La densidad celular y la viabilidad se midieron después de los días 8 y 10. Se tomaron en partes iguales 0,6 mi de muestra para evaluar la concentración de EPO humana. Los sobrenadantes del cultivo (0,6ml) fueron cribados primero usando la teenología Caliper microfluídica evaluando la presencia de proteína al peso molecular aparente de la EPO humana.

Los dieciséis mejores clones sobrenadantes, por ejemplo, que tienen la señal de EPO más intensa, se sometieron a detección específica ELISA de EPO humana usando el kit desarrollado por R&D System® para diagnóstico in vitro (Kit Quantikine® IVD ELISA de eritoproyetina humana para Uso Diagnóstico In Vitro, referencia de catálogo DEP00). Siete clones mostraron tener productividades interesantes medidas el Día 8 y Día 10 (Tabla a continuación).

Las productividades de los clones oscilaban de 0,3 a 2,0 g/l. El semi-clon 90 era el mejor produciendo clones con una productividad de 1 , 1 a 2,0 g/L el Día 8 y Día 10 respectivamente.

La viabilidad de este clon el Día 10 era de alrededor de 70% con menos de un millón de celulas por mi (0,8 millones de células/ml) haciendo imposible calcular la productividad específica ya que el número de células disminuía entre el Día 8 y el Día 10. Ello no hace posible el cálculo de una actividad específica (Tabla a continuación). Este fenómeno se observa para la mayor parte de los semi-clones excepto para los semi-clones 21 , 24, 92 y 93. En ese caso, la productividad específica expresada en mg/106 células/día puede ir hasta 441 y 854 (Tabla a continuación).

Estos resultados muestran que, tanto en términos de volumen o productividad específica, el uso de un vector que comprende una secuencia que codifica una GS humana permite tener una productividad por encima de 300pg de proteínas por millón de células.

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Una línea celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que comprende un vector de expresión de ácido desoxirribonucleico (ADN), y en donde dicho vector comprende una secuencia nucleótida que codifica una glutamina sintetasa (GS) heteróloga de mamífero y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en donde dicha GS comprende una secuencia: al menos un 94,5% identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o - consistente en un fragmento de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

2. La línea celular según la reivindicación 1 , en la que dicha GS comprende una secuencia al menos un 94,5% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 y a la secuencia de SEQ ID NO: 2.

3. La línea celular de CHO según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha GS comprende una secuencia al menos un 97,5% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1.

4. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha GS es una GS humana.

5. La línea celular de CHO según la reivindicación 4, en la que dicha GS comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1.

6. La línea celular de CHO según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha GS es una GS canina.

7. La línea celular de CHO según la reivindicación 6, en la que dicha GS canina comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2.

8. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que los codones de triplete de dicha secuencia de codificación de GS se han sesgado para expresión en celulas de CHO.

9. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha secuencia de codificación de GS comprende una secuencia al menos un 80% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.

10. La línea celular de CHO según la reivindicación 9, en la que dicha secuencia de codificación de GS comprende una secuencia de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.

11. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha secuencia de codificación de GS humana se dispone bajo el control de un promotor del virus vacuolante 40 de simio (SV40).

12. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , en la que dicha proteína recombinante es un anticuerpo monoclonal.

13. La línea celular de CHO según la reivindicación 12, en la que dicho vector comprende un primer módulo de expresión adecuado para clonación de una cadena ligera de anticuerpo, y un segundo módulo de expresión adecuado para clonación de una cadena pesada de anticuerpo.

14. La línea celular de CHO según la reivindicación 13, en la que dichos primer y segundo módulos de expresión comprenden cada uno un promotor de CMV.

15. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha línea celular de CHO es capaz de crecer en medio exento de suero.

16. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha línea celular de CHO es la línea celular depositada con el n° CCL-61 en la ATCC.

17. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque permite obtener clones productores de al menos 1 mg/l de proteína recombinante tras la transfección de dicho vector en la línea celular de CHO depositada con el n° CCL-61 en la ATCC.

18. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicho vector no contiene un gene heterólogo para expresión.

19. La línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que dicho vector comprende al menos una secuencia de codificación de una proteína recombinante.

20. La línea celular de CHO según la reivindicación 19, en la que dicha proteína recombinante es un anticuerpo monoclonal.

21. La línea celular de CHO según la reivindicación 19, en la que dicha proteína recombinante es una proteína antigenica.

22. Un vector de expresión de un ácido desoxirribonucleico (ADN), y en donde dicho vector comprende una secuencia nucleótida que codifica una glutamina sintetasa (GS) heteróloga de mamífero bajo el control de un promotor del virus vacuolante 40 de simio (SV40), un primer casete de expresión adecuado para la clonación de una proteína heteróloga recombinante bajo el control de un promotor CMV, en donde dicha GS comprende una secuencia proteica: a) al menos un 94,5% identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o b) consistente en un fragmento de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

23. El vector de ADN según la reivindicación 22, en el que dicho vector es un vector como se define en la reivindicación 20 o 21.

24. Un vector de expresión de un ácido desoxirribonucleico (ADN), y en donde dicho vector comprende una secuencia nucleótida que codifica una glutamina sintetasa (GS) heteróloga de mamífero bajo el control de un promotor del virus vacuolante 40 de simio (SV40) y un primer casete de expresión adecuado para clonar una cadena ligera de anticuerpo bajo el control de un promotor de CMV, y un segundo casete de expresión adecuado para clonar una cadena pesada de anticuerpo bajo el control de un promotor de CMV, en donde dicha GS comprende una secuencia proteica. a) al menos un 94,5% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o b) consistente en un fragmento de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

25. Una combinación de: i) una linea celular de ovario de hámster chino (CHO); y i) un vector de ADN (ácido desoxirribonucleico) adecuado para la producción de una proteína recombinante, en donde dicho vector comprende una secuencia que codifica una glutamina sintetasa (GS) heteróloga de mamífero, en donde dicha GS comprende una secuencia: - al menos un 94,5% identica a la secuencia de SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de SEQ ID NO: 2; o - consistente en un fragmento de al menos 100 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

26. Un kit que comprende la combinación según la reivindicación 25.

27. Un método in vitro de producción de una proteína recombinante que comprende las etapas de: a) proporcionar una línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 ; b) cultivar dicha línea celular de CHO obtenida en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y c) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.

28. El método según la reivindicación 27, que comprende además la etapa de formular dicha proteína recombinante en una composición farmacéutica.

29. Uso de la línea celular de CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , o del vector según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, o de la combinación según la reivindicación 25, para producir una proteína recombinante in vitro.