TW201332567A

TW201332567A - 止血組成物

Info

Publication number: TW201332567A
Application number: TW101139397A
Authority: TW
Inventors: Paul J Sanders; Shane Donovan; Prasad Dande; Mark A Nordhaus
Original assignee: Baxter Int; Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2013-08-16
Also published as: UY34415A; US20130129710A1; WO2013060769A3; WO2013060769A2

Abstract

本發明揭示一種用於製造止血組成物之方法，其包含混合適用於止血之生物相容性聚合物與京尼平型交聯劑，藉由該京尼平型交聯劑交聯該聚合物以獲得經交聯之生物相容性聚合物，及將該經交聯聚合物最終加工成醫藥學上可接受之止血組成物；新穎止血組成物；及使用此等組成物之方法。

Description

止血組成物

本發明係關於止血組成物及製造此等組成物之方法。

例如自WO98/008550A或WO2003/007845A已知包含生物相容性生物可降解的穩定物質之止血組成物。

因為此等產品須施用於人類，所以有必要為最終產品及其組分之品質、儲存穩定性及滅菌提供最高安全標準。另外，應儘可能便利且高效地進行製造及操作。

此領域中之極成功產品利用了單獨使用或與復原之凍乾凝血酶溶液結合使用之戊二醛交聯型明膠基質。藉由戊二醛交聯明膠或其他生物材料需要在投予患者之前將未反應之交聯劑審慎移除及/或失活。在先前技術中已提出用於生物醫學材料之各種替代性交聯劑以向此等材料提供所需個別特徵。然而，通常極難事前預測既定材料在用各種交聯候選分子交聯後之性質及止血效能。

本發明之一個目的在於提供一種基於經交聯生物材料之止血組成物，其中避免使用戊二醛來交聯。該等組成物亦應以便利且可用之方式提供，較佳呈可流動糊劑之形式提供。該等產品較佳應呈能夠便利地提供「即用型」止血組成物之產品形式提供，其可直接施用於損傷而無需任何耗時之復原步驟。

因此，本發明提供一種用於製造止血組成物之新穎方法，其包含混合適用於止血之生物相容性聚合物與京尼平型(genipin-type)交聯劑，藉由該京尼平型交聯劑交聯該聚合物以獲得經交聯之生物相容性聚合物，及將該經交聯聚合物最終加工成醫藥學上可接受之止血組成物。

本發明亦關於止血組成物，其包含可藉由根據本發明之方法獲得之經交聯生物相容性聚合物；治療損傷或外傷或外科介入(例如傷口、出血、受損組織及/或出血組織)之方法，其包含投予此止血組成物；及用於治療此損傷之套組。

此外，還揭示一種用於提供即用形式之根據本發明之止血組成物的方法，以及一種即用型止血組成物，其包含可藉由根據本發明之方法獲得的經交聯生物相容性聚合物。

本發明提供一種用於製造止血組成物之方法，其包含混合適用於止血之生物相容性聚合物與京尼平型交聯劑，藉由該京尼平型交聯劑交聯該聚合物以獲得經交聯之生物相容性聚合物，及將該經交聯聚合物最終加工成醫藥學上可接受之止血組成物。

京尼平交聯型生物材料，尤其京尼平交聯型明膠本身為已知的(參見例如US6,608,040B1；EP2181722A2；WO2008/076407A2；Bigi等人，Biomaterials 23(2002),4827-4832；Yao等人，Mat.Chem.Phys.83(2004),204-208；Turo等人，Int.J.Biol.Macromol.(2011),doi： 10.1016；Chiono等人，J.Materl.Sci.：Mater Med.(2008)19：889-898)。本發明提供一種可流動之止血組成物，其避免使用戊二醛作為交聯劑。意外的是，藉由使用京尼平型交聯劑，可提供性質與戊二醛交聯型物質相當或甚至比其優越之止血物質(「京尼平交聯」)。利用本發明，所製造之物質之可流動組成物可有效地用於治療需要快速止血之損傷及/或外傷。

根據本發明之京尼平交聯型生物相容性聚合物，尤其京尼平交聯型明膠(「Gen-Gel」)具有優於戊二醛交聯型物質，尤其戊二醛交聯型明膠「Glu-Gel」)之特定優勢，其可概述如下：

如藉由凝血彈性描記法(thromboelastography；TEG)所測定，與Glu-Gel相比，在反應之前2分鐘(尤其在前40秒/第一分鐘內)期間，試管內止血時間明顯減少。因為其減少失血，故比較容易觀測手術區域，且亦減小本身與不良臨床結果相關之輸血的可能性。此外，與Glu-Gel相比，使用Gen-Gel亦提高凝塊強度。本發明之Gen-Gel產品允許減少對外科醫師接近製劑以達成止血或較快速止血之要求，其具有較之戊二醛交聯型製劑改良之生物相容性且其可藉由較簡單的製造方法製備。此外，需要時，Gen-Gel產品允許較佳地觀測處於手術背景中之產品(藉由與明膠型止血劑相比之藍色變體抑或部分脫色之變體)。

Gen-Gel變體(依據擠壓力資料)類似於或優於現存的Glu-Gel材料，此有助於其用於廣泛多種手術應用中。 Gen-Gel與Glu-Gel產品相當或比其更佳。

Glu-Gel產品因其中雜有微黃色摻合物而具有被周圍組織掩蔽之傾向。此使得所需應用之目測評估成問題。依據交聯程度、反應條件以及後續處理及最終加工步驟，根據本發明之京尼平交聯型明膠產品顯現自淺黃色至深藍色或綠色之可變顏色。因為此顏色將其與周圍組織區分開，而非可能被周圍組織掩蔽，所以成品顏色之此顏色可調性及獲得所需顏色之能力具有一個附加優勢，即向醫師提供在傷口部位中適當產品施用之視覺指示。此為本發明之另一新穎特徵。另一方面，視對於最終產品之需要而定，可移除顏色以獲得基本上無色之產品。

因為試劑、能量及時間成本較低，所以根據本發明之京尼平交聯型明膠產品的製造成本要低於戊二醛交聯型明膠產品。京尼平交聯型明膠反應可在中性pH值之水中在室溫下進行<16小時。該產品可由乙醇及/或水洗滌來清潔，如此不僅比較便宜，而且更重要的是，對操作者比較安全。

該方法較佳應用在交聯步驟之前呈乾燥形式存在的適用於止血之生物相容性聚合物。

根據本發明之較佳京尼平型交聯劑當然為京尼平((1R,2R,6S)-2-羥基-9-(羥甲基)-3-氧雜雙環[4.3.0]壬-4,8-二烯-5-甲酸甲酯)；然而，亦可使用環烯醚萜型或裂環烯醚萜型之其他交聯劑，諸如橄欖苦苷(oleuropein)。用於交聯之京尼平的較佳濃度係在0.5 mM至20 mM，較佳在1 mM至15 mM，尤其在2 mM至10 mM之範圍內。

適用於止血之生物相容性聚合物較佳為蛋白質、包含胺基之多醣、包含胺基之生物聚合物、包含胺基之非生物聚合物；及其衍生物及組合。亦可使用具有親核基團及/或氫鍵供體/受體之天然或合成來源之聚合物。較佳蛋白質係選自由以下組成之群：明膠、膠原蛋白、白蛋白、血紅素、纖維蛋白原、纖維蛋白、酪蛋白、纖維結合蛋白、彈性蛋白、角蛋白及層黏連蛋白(laminin)；及其衍生物及組合。尤佳蛋白質係選自由以下組成之群：明膠、膠原蛋白、纖維蛋白原、纖維結合蛋白及纖維蛋白，更佳為明膠或膠原蛋白，尤佳為明膠。較佳的包含胺基之多醣係選自由以下組成之群：葡糖胺聚糖、果膠、包含胺基之改質澱粉、包含胺基之改質纖維素、包含胺基之改質聚葡萄糖、包含胺基之改質半纖維素、包含胺基之改質木聚糖、包含胺基之改質瓊脂糖、包含胺基之改質海藻酸鹽、甲殼素及聚葡萄胺糖；及其衍生物及組合。較佳聚合物係選自由以下組成之群：聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚伸乙基亞胺、聚離胺酸、聚精胺酸及聚醯胺基胺(PAMAM)樹枝狀聚合物。

根據本發明之一個較佳具體實例，經交聯之生物相容性聚合物用諸如漂白劑、tBu-氫過氧化物等氧化劑進行淬滅/氧化步驟，較佳用過碳酸鈉、次氯酸鈉、氯水或過氧化氫(H₂O₂)進行處理，尤佳用過碳酸鈉或H₂O₂進行處理，最佳用過碳酸鹽進行處理。

較佳H₂O₂濃度為0.5%至20%(w/w)、尤其為1%至15%(w/w)、更佳為約5%(w/w)。在一個尤佳具體實例中，京尼平濃度係在5 mM至10 mM之間，明膠與京尼平之反應時間係在3小時至10小時之間，具體言之為6小時，H₂O₂濃度係在3%至5%(w/w)之間且京尼平交聯型明膠與H₂O₂之反應時間為約20小時，

較佳過碳酸鈉濃度係在1%至10%(w/w)、尤其在1%至5%(w/w)、更佳在1%至4%(w/w)之間。在一個尤佳具體實例中，京尼平濃度係在5 mM至10 mM之間(具體言之為約8 nM)，明膠與京尼平之反應時間係在3小時至10小時之間(具體言之為約5小時)，過碳酸鈉濃度係在1%至10%(w/w)之間，尤佳在1%至4%(w/w)之間，且京尼平交聯型明膠與過碳酸鈉之反應時間係在1小時至20小時之間，較佳在1小時至5小時之間(例如1小時、2小時或3小時)。

淬滅亦可在抗氧化劑(諸如抗壞血酸鈉)存在下進行，或藉由控制反應環境之氧化電位，諸如在諸如氮氣或氬氣之惰性氛圍中進行淬滅及/或京尼平反應來進行。

較佳交聯反應條件包括在水溶液中進行，較佳在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/乙醇緩衝液中，尤其在4至12，較佳5.0至10.0，尤其6至8之pH值下進行，或在去離子水或可含有介於0%至50%之間之水混溶性有機溶劑之其他水性緩衝液中進行。PBS緩衝液在生理學pH值之磷酸鹽緩衝液中含有生理量之NaCl及KCl。PBS緩衝液之一個實例含有137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄．2 H₂O、1.76 mM KH₂PO₄(pH=7.4)。PBS緩衝液之另一實例由以下組成： 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄ and 1.4 mM KH₂PO₄(pH=7.5)。

該反應亦可在含有至多50%水混溶性有機溶劑及/或處理助劑(諸如PEG、PVP、甘露糖醇、過碳酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉等)之水性緩衝液中進行。

交聯步驟較佳在4℃至45℃、較佳15℃至45℃、尤其20℃至40℃之溫度下進行。

交聯步驟之後可為淬滅步驟，尤其用含有胺基之淬滅劑，較佳用胺基酸，尤其甘胺酸進行之淬滅步。在用淬滅劑之情況下，尚未反應之京尼平型交聯劑失活(例如藉由與過量淬滅劑反應)以防止進一步交聯。淬滅亦可藉由將溶液pH值升高至介於8至14之間，或藉由使用含有胺基、硫醇基或羥基之親核性化合物以及升高pH值與使用親核性化合物之組合來進行。在根據本發明之京尼平-明膠交聯反應之後之淬滅步驟可積極地針對賦予所需物理效能，諸如膨脹及TEG，其為高於單獨之一般京尼平交聯之止血活性的重要決定因素。

經交聯之生物相容性聚合物較佳在交聯步驟後進行洗滌，較佳藉由甲醇、乙醇或水，尤其藉由去離子水進行洗滌。另一較佳的洗滌步驟應用含有至多50%(v/v)水混溶性有機溶劑及/或一或多種處理助劑之水性緩衝液。

根據一個較佳具體實例，經交聯之生物相容性聚合物經乾燥。在此乾燥狀態下，止血組成物甚至在高溫(例如超過20℃、超過30℃或甚至超過40℃)下亦可長期穩定儲存。較佳乾燥條件包括經交聯之生物相容聚合物經乾燥至具有低於15%(w/w)、較佳低於10%、更佳低於5%、尤其低於1%之水分含量。在另一較佳具體實例中，該產品可呈水合狀態或濕潤狀態提供，其中水合溶液可為生物相容性緩衝液或溶液。

根據本發明之一個較佳具體實例，適用於止血之生物相容性聚合物為明膠，尤其是B型明膠。適合明膠材料之實例尤其描述於EP1803417B1之實施例1及實施例2，以及US6,066,325A及US6,063,061A之實施例14中。適用於止血之生物相容性聚合物較佳為布倫強度(Bloom strength)為200至400之明膠，尤其是布倫強度為200至400之B型明膠。布倫為量測明膠強度之測試。該測試測定探針(直徑通常為0.5吋)將凝膠表面偏轉4 mm而不使其破損所需之重量(公克)。結果以布倫(級別)表示。為了對明膠進行布倫測試，在測試之前在10℃下保持6.67%明膠溶液17小時至18小時。

明膠亦可與處理助劑(諸如作為再水合助劑之PVP、PEG及/或聚葡萄糖)一起使用。在本發明之一個特定態樣中，組成物將包含水分含量為20%(w/w)或20%(w/w)以下之經交聯明膠粉末，其中該粉末在再水合助劑存在下交聯，以致粉末之水溶液再水合率比在無再水合助劑下製備之類似粉末之再水合率高至少5%。「再水合率(re-hydration rate)」係根據EP1803417B1來定義，意謂1公克粉末(乾重)在三十秒內所吸收之水溶液(典型地為 0.9%(w/w)鹽水)之量，以g/g表示。再水合率係藉由混合經交聯明膠與鹽水溶液30秒並在真空下將濕明膠沈積於濾膜上以移除自由水溶液來量測。接著記錄截留於過濾器上之濕明膠之重量，將其乾燥(例如在120℃下2小時)，接著記錄明膠乾重且計算每公克乾燥明膠所吸收之溶液的重量。

較佳本發明之組成物的再水合率將為至少2 g/g，較佳為至少3.5 g/g且經常為3.75 g/g或3.75 g/g以上。在無再水合助劑下製備之類似粉末之再水合率典型地低於3，且再水合率之增加百分比將通常為至少5%，較佳為至少10%，且更佳為至少25%或25%以上。

再水合率改良之本發明之乾燥經交聯明膠粉末較佳係藉由在某些再水合助劑存在下製備粉末來獲得。在製備粉末期間將存在此等再水合助劑，但其可自最終產品中移除。舉例而言，存在的約20%總固體含量之再水合助劑在最終產品中可典型地減少至1重量%以下，經常減少至0.5重量%以下。例示性再水合助劑包括分子量較佳在500至20,000之間的聚乙二醇(PEG)；平均分子量較佳為至多50,000之聚乙烯吡咯啶酮(PVP)；及平均分子量典型地為至多40,000之聚葡萄糖。當製備本發明之組成物時，較佳採用此等再水合助劑中之至少兩種，且更特定言之較佳採用全部三種。以明膠重量計，再水合助劑較佳包含2.5%至20%(w/w)PEG、1.25%至20%(w/w)PVP及1.25%至20%(w/w)聚葡萄糖。

本發明亦關於包含可藉由根據本發明之方法獲得之經交聯生物相容性聚合物的新穎止血組成物。

根據本發明之止血組成物較佳包含明膠聚合物，如經交聯之生物相容性聚合物，較佳為B型明膠聚合物。明膠性質可對交聯製程具有有利性質。已證明B型明膠對於京尼平交聯尤其有利。一種尤佳之明膠製劑可如下製備：在室溫下以2 N NaOH處理小牛真皮約1小時，中和至pH 7至8，均質化並加熱至70℃。接著將真皮完全溶解為明膠，其中溶液中含3%至10%(w/w)、較佳7%至10%(w/w)之明膠。此溶液可經澆鑄、乾燥及研磨以提供B型明膠粉末。

根據本發明之止血組成物較佳含有呈微粒形式，尤其呈粒狀物質形式的經交聯生物相容性聚合物。此粒狀物質當暴露於流體(亦即，醫藥學上可接受之稀釋劑)時可快速膨脹，且呈此膨脹形式能夠有助於可流動糊劑施用於出血部位。生物相容性聚合物(例如明膠)可呈膜形式提供，其可接著經粉碎形成粒狀物質。此粒狀物質中所含大部分粒子(例如大於90% w/w)之粒度較佳為10 μm至1000 μm，較佳為50 μm至800 μm，更佳為50 μm至700 μm、150 μm至700 μm、200 μm至700 μm，尤佳為300 μm至550 μm，最佳為350 μm至550 μm。

根據本發明之一個較佳具體實例，適用於止血之微粒形式生物相容性聚合物為經交聯明膠。乾燥經交聯明膠粉末可製備成當與醫藥學上可接受之稀釋劑接觸時可快速再水合。如WO98/08550A及WO2003/007845A中所述，明膠顆粒，尤其呈明膠粉末形式之明膠顆粒較佳包含相對較大的粒子，亦稱作片段或次單元。較佳(中值)粒度為10 μm至1000 μm，較佳為50 μm至800 μm，更佳為50 μm至700 μm、150 μm至700 μm、200 μm至700 μm，尤佳為300 μm至550 μm，最佳為350 μm至550 μm，但在此較佳範圍外之粒度在許多情況下亦可適用。乾燥組成物當暴露於水性再水合介質(=醫藥學上可接受之稀釋劑，亦稱作復原介質)時亦將呈現顯著「平衡膨脹(equilibrium swell)」。膨脹較佳將在400%至1000%之範圍內。「平衡膨脹」可藉由用完全水合且因此完全膨脹時明膠水凝膠粉末之重量減去其乾重來測定。接著用該差值除以乾重且乘以100以得到以膨脹百分比表示之膨脹量度。乾重應在物質暴露於高溫一段足以移除實質上所有殘留水分之時間後(例如在120℃下兩小時後)量測。如下可達成物質之平衡水合：將乾燥物質浸於醫藥學上可接受之稀釋劑(諸如鹽水溶液)中一段足以使水含量變得恆定之時期，典型地在室溫下持續18小時至24小時。

如下為用於製造經交聯明膠之例示性方法。獲得明膠並將其懸浮於水溶液中以形成固體含量典型地為1重量%至70重量%，通常為3重量%至10重量%之非交聯水凝膠。

根據本發明之止血組成物較佳呈乾燥組成物形式提供，其中生物相容性京尼平交聯型聚合物係呈乾燥形式存在。

根據本發明之「乾燥」止血組成物僅具有可近似地對應於相當的可用產品(諸如戊二醛交聯型明膠，其乾燥產品形式通常具有約12%水分)之水分含量的殘留水分含量。

適用於止血之微粒形式生物相容性聚合物較佳為粉末形式之明膠，具體言之其中粉末粒子之中值粒度為10 μm至1000 μm，較佳為50 μm至800 μm，更佳為50 μm至700 μm、150 μm至700 μm、200 μm至700 μm，尤佳為300 μm至550 μm，最佳為350 μm至550 μm。根據本發明之「生物相容性聚合物之乾燥粒狀製劑」通常為已知的(但用不同交聯方式)，例如自WO98/08550A已知；因此，已知之用於例如戊二醛交聯型明膠之乾燥及造粒方法亦可適用於本發明之京尼平交聯型物質，尤其明膠。因此，該聚合物較佳為生物相容性、生物可降解的乾燥穩定粒狀物質。

聚合物粒子之平均粒徑(「平均粒徑(mean particle diameter)」為如藉由雷射繞射測定法量測之中值尺寸；「中值尺寸(median size)」(或質量中值粒徑)為將頻率分佈分成兩半之粒徑；既定製劑之50%粒子具有較大直徑，且50%粒子具有較小直徑)通常為10 μm至1000 μm，較佳為50 μm至800 μm，更佳為50 μm至700 μm、150 μm至700 μm、200 μm至700 μm，尤佳為300 μm至550 μm，最佳為350 μm至550 μm(中值尺寸)。儘管有時使用術語粉末及粒狀(或碎粒(granulate))區分個別物質種類，但粉末在本文中定義為粒狀物質之特定子集。具體言之，粉末係指具有較細晶粒尺寸之粒狀物質，且因此其在流動時具有較大之形成塊之傾向。顆粒包括較粗的粒狀物質，該等物質除了在潤濕時外否則不傾向於形成塊。

適用於止血之本發明之微粒形式之經交聯生物相容性聚合物可包括在空間上呈各向同性或非各向同性之形式。舉例而言，根據本發明之生物相容性聚合物可為顆粒或纖維；且可呈不連續結構形式存在，例如呈粉末形式存在。

根據一個較佳具體實例，止血組成物具有液體吸收性。舉例而言，在與液體(例如水性溶液或懸浮液，具體言之緩衝液或血液)接觸時，該聚合物吸收液體且將視水化程度而呈現一定程度膨脹。該物質較佳吸收至少300重量%、較佳約400重量%至約2000重量%、尤其約500重量%至約1300重量%水或水性緩衝液，對應於次單元個別粒子之直徑或寬度在例如約50%至約500%，通常約在50%至約250%之範圍內之標稱增加。舉例而言，若(乾燥)粒狀粒子之較佳尺寸範圍為0.01 mm至1.5 mm，尤其為0.05 mm至1 mm，則完全水合之組成物(例如在投予傷口上之後或在與緩衝水溶液接觸之後)之尺寸範圍可為0.05 mm至3 mm，尤其為0.25 mm至1.5 mm。

視預定用途而定，本發明之較佳生物相容性聚合物的平衡膨脹一般可在例如400%至1300%範圍內，較佳為500%至1100%，尤其為600%至900%。此平衡膨脹可例如(對於經交聯聚合物)藉由改變交聯程度來控制，交聯程度又係藉由改變諸如以下之交聯條件來達成：交聯用京尼平型試劑之暴露持續時間、交聯用京尼平型試劑之濃度、交聯溫度及其類似因素。具有不同平衡膨脹值之物質在不同應用中具有不同效能。控制交聯及平衡膨脹之能力允許針對多種應用最佳化本發明之組成物。除平衡膨脹外，在即將傳遞至目標部位之前控制物質之水合作用亦很重要。水合與平衡膨脹當然密切關聯。0%水合之物質將不膨脹。100%水合之物質將處於其平衡水含量。在0%與100%之間的水合將對應於在最小量與最大量之間的膨脹。

為了將經交聯聚合物最終加工成醫藥學上可接受之止血組成物，使用醫藥學上可接受之稀釋劑。

醫藥學上可接受之稀釋劑較佳為水溶液且可含有選自由NaCl、CaCl₂、乙酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉、癸酸鈉及甘露糖醇組成之群的物質。舉例而言，醫藥學上可接受之稀釋劑包含注射用水，且彼此獨立地為50 mM至200 mM NaCl(較佳為150 mM)、10 mM至80 mM CaCl₂(較佳為40 mM)、1 mM至50 mM乙酸鈉(較佳為20 mM)及至多10% w/w甘露糖醇(較佳為2% w/w)。稀釋劑較佳亦可包括緩衝液或緩衝系統以便緩衝復原之乾燥組成物的pH值，該緩衝液或緩衝系統之pH值較佳為3.0至10.0，更佳為6.4至7.5，尤其為6.9至7.1。

根據一個較佳具體實例，醫藥學上可接受之稀釋劑包含凝血酶，較佳為10 I.U.至1000 I.U.凝血酶/毫升，尤其為250 I.U.至700 I.U.凝血酶/毫升。此即用形式之止血組成物較佳含有10 I.U.(國際單位)至100.000 I.U.，更佳含有100 I.U.至10.000 I.U.，尤其含有500 I.U.至5.000 I.U.凝血酶。即用型組成物中之凝血酶濃度較佳在10 I.U.至10.000 I.U.、更佳在50 I.U.至5.000 I.U.、尤其在100 I.U./ml至1.000 I.U./ml之範圍內。該稀釋劑之用量應在即用型組成物中達成所需最終濃度。凝血酶製劑可含有其他有用組分，諸如離子、緩衝劑、賦形劑、穩定劑等。凝血酶製劑較佳含有人類白蛋白、甘露糖醇或其混合物。較佳鹽為NaCl及/或CaCl₂，二者均以適用於凝血酶之常用量及濃度使用(例如0.5%至1.5% NaCl(例如0.9%)及/或20 mM至80 mM CaCl₂(例如40 mM))。

凝血酶(或任何其他凝結誘導劑(coagulation inducing agent)，諸如蛇毒、血小板活化劑、凝血酶受體活化肽及纖維蛋白原沈澱劑)可源自適用於人類(亦即醫藥學上可接受)之任何凝血酶製劑。凝血酶之適合來源包括人血或牛血、血漿或血清(若預期無不良免疫反應，則可應用其他動物來源之凝血酶)、重組來源之凝血酶(例如人類重組凝血酶)；自體性人類凝血酶對於一些應用可為較佳的。

稀釋劑較佳包含pH較佳為3.0至10.0之緩衝液或緩衝系統。

在一個較佳具體實例中，本發明提供一種止血組成物，其包含適用於止血之微粒形式京尼平型交聯明膠，其中該組成物係以含有5%至30%(w/w)，較佳10%至25%(w/w)、尤其12%至20%(w/w)之量的經交聯生物相容性聚合物之糊劑形式存在。在另一具體實例中，經交聯聚合物(例如明膠)之存在量為15.0%至19.5%(w/w)(= 乾燥明膠重量/最終組成物重量)，較佳為16.0%至19.5%(w/w)、16.5%至19.5%(w/w)、17.0%至18.5%(w/w)或17.5%至18.5%(w/w)，更佳為16.5%至19.0%(w/w)或16.8%至17.8%(w/w)，尤佳為16.5%至17.5%(w/w)，且其中該組成物視情況包含擠壓增強劑(extrusion enhancer)，具體言之白蛋白。舉例而言，若擠壓增強劑為白蛋白(其尤佳，尤其是人類血清白蛋白)，則其提供量必須在0.5%至5.0%(w/w)(=擠壓增強劑重量/最終組成物重量)，較佳在1.0%至5.0%(w/w)，較佳在2.0%至4.5%(w/w)，更佳在1.5%至5.0%(w/w)之間，尤佳為約1.5%(w/w)。

在一個較佳具體實例中，與京尼平型交聯劑(例如京尼平)經交聯之生物相容聚合物(例如明膠)為均質(均一)經交聯之聚合物，如可例如藉由如本申請案之實施例6中所述之螢光量測來顯示。在一個尤佳的具體實例中，生物相容性聚合物(諸如明膠)係呈均質京尼平交聯型微粒形式生物相容性聚合物(諸如明膠)形式存在。

根據另一態樣，本發明係關於一種適用於治療選自由傷口、出血、受損組織、出血組織及/或骨缺損組成之群之損傷的止血組成物。

本發明之另一態樣為一種治療選自由傷口、出血、受損組織及/或出血組織組成之群之損傷的方法，其包含向損傷部位投予根據本發明之止血組成物。

根據另一態樣，本發明亦提供一種用於將根據本發明之止血組成物傳遞至患者身體之目標部位的方法，該方法包含將藉由根據本發明之方法製得的止血組成物傳遞至目標部位。儘管在某些具體實例中，亦可將乾燥組成物直接施用於目標部位(且必要時，視情況在目標部位與醫藥學上可接受之稀釋劑接觸)，但較佳使乾燥止血組成物在投予目標部位之前與醫藥學上可接受之稀釋劑接觸，以便獲得呈潤濕形式，尤其呈水凝膠形式之可流動止血組成物。

在此方法中。可應用一種套組，此套組包含a)根據本發明之止血組成物；及b)使用說明。

此套組之較佳另一組分為(尤其是當含有乾燥形式之止血組成物時)用於復原止血組成物之醫藥學上可接受之稀釋劑。該套組之其他組分可為投藥構件，諸如注射器、導管、刷子等(若組成物未曾提供於投藥構件中)，或用於醫學(手術)實踐所必需之其他組分，諸如代用針或導管、額外小瓶或其他傷口覆蓋構件。根據本發明之套組較佳包含容納乾燥且穩定之止血組成物的注射器，及含有稀釋劑之注射器(或提供用於自另一稀釋劑容器吸取稀釋劑)。

醫藥學上可接受之稀釋劑為如先前所述之稀釋劑。

稀釋劑可進一步含有其他成分，諸如賦形劑。「賦形劑」為一種添加至溶液中例如以確保凝血酶在儲存(或滅菌(例如藉由輻射))時保持其化學穩定性及生物活性或用於美觀性原因(例如顏色)之惰性物質。較佳賦形劑包括蛋白質，例如人類白蛋白、碳水化合物(例如甘露糖醇)、聚合物(例如聚乙二醇(PEG))及乙酸鈉。復原產品中人類白蛋白之較佳濃度為0.1 mg/ml至100 mg/ml，較佳為1 mg/ml至10 mg/ml。較佳甘露糖醇濃度可在0.5 mg/ml至500 mg/ml，尤其10 mg/ml至50 mg/ml之濃度範圍內。較佳PEG濃度可在0.5 mg/ml至500 mg/ml，尤其10 mg/ml至50 mg/ml之濃度範圍內。PEG之平均分子量可在500至20,000之範圍內。較佳乙酸鈉濃度在1 mg/ml至10 mg/ml，尤其2 mg/ml至5 mg/ml之範圍內。

在一個較佳具體實例中，醫藥學上可接受之稀釋劑係提供於單獨容器中。此可較佳為注射器。注射器中之稀釋劑接著可輕易地施加於最終容器中以便復原根據本發明之乾燥止血組成物。若最終容器亦為注射器，則兩個注射器可一起裝在一個包裝中作為成品。因此，較佳將根據本發明之乾燥止血組成物提供於於一個注射器中，將該注射器與含有用於復原該乾燥且穩定之止血組成物的醫藥學上可接受之稀釋劑的稀釋劑注射器一起作為成品。

根據一個較佳具體實例，最終容器進一步含有當暴露於滅菌輻射時有效抑制聚合物改質之量的穩定劑，較佳為抗壞血酸、抗壞血酸鈉、抗壞血酸之其他鹽，或抗氧化劑。

用此醫藥學上可接受之稀釋劑，可提供即用形式之本發明止血組成物，其可接著直接施用於患者。因此，亦提供一種用於提供即用形式之根據本發明之止血組成物的方法，其中在第一注射器中提供止血組成物且在第二注射器中提供復原用稀釋劑，將第一注射器與第二注射器彼此連接，且將流體引入第一注射器以產生可流動形式之止血組成物；且視情況使可流動形式之止血組成物返回至第二注射器至少一次。即用型製劑較佳呈水凝膠形式存在或提供。在此項技術中通常已知此類產品，但呈不同形式。因此，本發明之一個較佳具體實例為用於提供即用形式之根據本發明之止血組成物的方法，其中在第一注射器中提供止血組成物且在第二注射器中提供復原用稀釋劑，將第一注射器與第二注射器彼此連接，且將稀釋劑引入第一注射器以產生可流動形式之止血組成物；且視情況使可流動形式之止血組成物返回至第二注射器至少一次。此方法(亦稱作「噴湧(swooshing)」)提供適合的即用形式之根據本發明組成物，其可在短時間內輕易且高效地進行，例如在手術期間在緊急情況下進行。由此方法提供的此可流動形式之該止血組成物尤其適用於治療選自由傷口、出血、受損組織、出血組織及/或骨缺損組成之群的損傷。

出於穩定性原因，此等產品(以及根據本發明之產品)通常呈乾燥形式提供於最終容器中且在臨用前轉變為即用形式(其通常呈(水)凝膠、懸浮液或溶液形式)，由此需要添加潤濕劑或溶合劑(懸浮劑)。

可流動形式之止血組成物較佳含有超過50%(w/w)具有100 μm至1000 μm尺寸之粒子，較佳超過80%(w/w)具有100 μm至1000 μm尺寸之粒子。

因此，本發明亦關於一種即用型止血組成物，其包含可藉由根據本發明方法獲得之經交聯生物相容性聚合物。可流動形式較佳含有5%至30%(w/w)、較佳10%至25%(w/w)、尤其12%至20%(w/w)之量的經交聯生物相容性聚合物。

根據本發明之生物相容性止血經交聯聚合物一旦施用於傷口，即形成高效基質，其可形成血流之屏障。具體言之，該止血聚合物之膨脹性質可使其成為針對出血及再出血過程之有效機械屏障。

本發明之組成物可另外含有親水性聚合物組分(亦稱作「反應性親水性組分」或「親水性(聚合物)交聯劑」)，其進一步增強本發明組成物的黏著性質。根據本發明之止血組成物之此親水性聚合物組分充當親水性交聯劑，一旦該止血組成物施用於患者(例如施用於患者之傷口或患者需要止血活性之另一位置)，其即能夠與該親水性聚合物組分之反應性基團反應。因此，對於本發明而言重要的是，聚合物組分之反應性基團當施用於患者時具有反應性。因此必需製造根據本發明之止血組成物以使得應在止血組成物施用於傷口後立即反應的聚合物組分之反應性基團在製造製程期間得以保留。

對於反應性基團可水解之親水性聚合物交聯劑，必須防止在投予患者止血組成物之前，尤其在製造期間過早與水或水性液體接觸。然而，在製造期間對於親水性聚合物組分之處理亦可能在水性介質中在反應性基團之反應受抑制之條件下(例如在低pH值下)進行。若親水性聚合物組分可熔融，則可將熔融之親水性聚合物組分噴灑或印刷於生物聚合物之基質上。亦可能將乾燥形式(例如粉末)親水性聚合物組分與適用於止血之乾燥形式生物相容性聚合物混合。必要時，接著可提高溫度以使噴撒於適用於止血之生物相容性聚合物之親水性聚合物組分熔融，從而達成止血組成物之持久性塗佈。或者，可將此等親水性聚合物組分溶解於惰性有機溶劑(相對於親水性聚合物組分之反應性基團為惰性的)中且置於生物材料之基質上。此等有機溶劑之實例為無水乙醇、無水丙酮、無水DMF、二噁烷、DMSO或THF(其對於諸如NHS酯取代之PEG之親水性聚合物組分為例如惰性的)。

在一個較佳具體實例中，親水性聚合物組分為單一親水性聚合物組分且為聚氧化烯聚合物，較佳為包含PEG之聚合物。此反應性聚合物之反應性基團較佳為親電子基團。或者，亦可添加親核基團(例如PEG-SH)。

反應性親水性組分可為多親電子性聚氧化烯聚合物，例如多親電子性PEG。反應性親水性組分可包括兩個或兩個以上親電子基團，較佳為包含兩個或兩個以上選自以下之反應性基團之PEG：丁二醯亞胺基酯(-CON(COCH₂)₂)、醛(-CHO)及異氰酸酯(-N=C=O)，例如WO2008/016983A(以全文引用的方式併入本文中)中揭示之組分。

根據本發明之親水性聚合物交聯劑的較佳親電子基團為對蛋白質之胺基、羧基、硫醇基及羥基具有反應性之基團，或其混合物。

較佳胺基特異性反應性基團為在碳化二亞胺、異氰酸酯或THPP(β-[參(羥甲基)膦基]丙酸)存在下之NHS-酯基、醯亞胺基酯基、醛基、羧基，尤佳為季戊四醇聚(乙二醇)醚戊二酸四丁二醯亞胺基酯(=季戊四醇肆[1-1'-側氧基-5'-丁二醯亞胺基戊酸酯-2-聚側氧基乙二醇]醚(=具有MW 10,000之NHS-PEG)。

較佳羧基特異性反應性基團為在碳化二亞胺存在下之胺基。

較佳硫醇基特異性反應性基團為順丁烯二醯亞胺或鹵基乙醯基。

較佳羥基特異性反應性基團為異氰酸酯基。

親水性交聯劑上之反應性基團可相同(同官能性)或不同(異官能性)。親水性聚合物組分可具有兩個(同/異雙官能性)或兩個以上(同/異-三官能性或三官能性以上)反應性基團。

在特定具體實例中，該物質為合成聚合物，較佳包含PEG。該聚合物可為包含適於交聯及黏著於組織之反應性側基之PEG的衍生物。

利用該等反應性基團，親水性反應性聚合物能夠交聯血蛋白以及組織表面蛋白質。亦可能交聯生物材料。

多親電子性聚氧化烯可包括兩個或兩個以上丁二醯亞胺基。多親電子性聚氧化烯可包括兩個或兩個以上順丁烯二醯亞胺基。

多親電子性聚氧化烯較佳為聚乙二醇或其衍生物。

在一個最佳具體實例中，親水性聚合物組分為季戊四醇聚(乙二醇)醚戊二酸四丁二醯亞胺基酯(=COH102，亦為季戊四醇肆[1-1'-側氧基-5'-丁二醯亞胺基戊酸酯-2-聚側氧基乙二醇]醚)。

該親水性聚合物組分為一種親水性交聯劑。根據一個較佳具體實例，此交聯劑具有兩個以上用於交聯之反應性基團(「臂(arm)」)，例如三、四、五、六、七、八個或八個以上具有用於交聯之反應性基團之臂。舉例而言，NHS-PEG-NHS為根據本發明之有效親水性交聯劑。然而，對於一些具體實例，4臂聚合物(例如4臂-p-NP-PEG)可為更佳的；基於相同基本原理，8臂聚合物(例如8臂-NHS-PEG)對於多反應性交聯為有利之具體實例而言可甚至為更佳的。此外，親水性交聯劑為一種聚合物，亦即由典型地藉由共價化學鍵連接之重複結構單元構成之大分子(巨分子)。親水性聚合物組分應具有至少1000 Da之分子量(以適當地用作根據本發明之止血組成物中的交聯劑)；根據本發明之經交聯聚合物較佳具有至少5000 Da，尤其至少8000 Da之分子量。

對於一些親水性交聯劑，存在鹼性反應條件(例如在投藥部位)對於功能效能(例如對於在投藥部位較快地進行交聯反應)為較佳或必需的。舉例而言，碳酸根或碳酸氫根離子(例如當緩衝液pH值為7.6或7.6以上，較佳為8.0或8.0以上，尤其為8.3及8.3以上時)可另外提供於投藥部位(例如呈緩衝溶液形式或呈此緩衝液浸泡之織物或襯墊之形式)，以使根據本發明之止血組成物的效能得到改良或使其高效用作止血及/或傷口黏著材料。

根據本發明之組成物中的親水性聚合物組分(如所提及的，其充當交聯劑)之反應性保留於組成物中。此意謂交聯劑之反應性基團尚未與止血組成物反應且未被水水解(或至少未以顯著量發生，而以顯著量發生會對本發明組成物之止血功能具有負面影響)。此可藉由以不引起交聯劑之反應性基團與止血聚合物或與水反應之方式組合止血聚合物與親水性交聯劑來達成。此通常包括省去水性條件(或潤濕)，尤其在不存在酸性條件情況下進行之潤濕(若在酸性條件下交聯劑無反應性)。此允許提供活性止血材料。

根據本發明之止血組成物中生物相容性經交聯聚合物與親水性聚合物組分之較佳比率為0.1%至50%(w/w)，較佳為5%至40%(w/w)。

根據本發明之止血組成物中可存在其他組分。根據較佳具體實例，根據本發明之止血組成物可進一步包含選自由以下組成之群的物質：抗纖維蛋白溶解劑、促凝血劑、血小板活化劑、抗生素、血管收縮劑、染料、生長因子、骨形態生成蛋白及止痛藥。

根據本發明之止血組成物可包含京尼平交聯型明膠及多價親核性物質(較佳為人類血清白蛋白)之另一組成物，其視情況呈鹼性pH(例如pH 8至11，較佳為9至10，尤其為pH 9.5)。

本發明亦關於一種藉由根據本發明之方法獲得之成品最終容器。此成品容器含有呈無菌、儲存穩定且可銷售之形式的根據本發明之止血組成物。最終容器可為適於容納(及儲存)醫藥學上可投予之化合物的任何容器。可使用注射器、小瓶、管等；然而，尤佳在注射器中提供根據本發明之止血組成物。亦因為注射器在醫學實踐中具有操作優勢，所以如先前技術中所揭示，注射器已成為投予止血組成物之較佳手段。該等組成物接著可較佳經由注射器之特定針或經由適合導管來施用(在復原後)。復原之止血組成物(其較佳經復原形成水凝膠)亦可藉由各種其他手段施用，例如藉由刮勺、刷子、噴霧劑施用，藉由壓力手動地施用，或藉由任何其他習知技術施用。藉由內窺鏡(內視鏡)手段向患者投予復原之止血組成物尤佳。復原之根據本發明之止血組成物通常將使用注射器或能夠擠壓復原之組成物穿過孔口(orifice)、小孔(aperture)、針、管或其他通道以形成珠粒、層或類似材料部分的類似施料器來施用。可藉由擠壓穿過注射器或其他施料器中之孔口(典型地具有在0.01 mm至5.0 mm，較佳在0.5 mm至2.5 mm之範圍內之尺寸)來機械破壞組成物。

然而，止血組成物較佳將最初自具有所需粒度之乾燥形式製備(其在復原時，尤其是藉由水合復原時得到必要尺寸之次單元(例如水凝膠次單元))或將在最終擠壓或其他施用步驟之前以機械方式部分或完全地破壞至必要尺寸。當然顯而易知的是，此等機械組件必須呈無菌形式(內部及外部)提供以滿足人類使用之安全性要求。

本發明之另一態樣係關於一種用於提供即用型止血組成物之方法，其包含使藉由根據本發明方法製造之止血組成物與醫藥學上可接受之稀釋劑接觸。

以下實施例及圖式中將進一步描述本發明，然而本發明不限於此。

使用以下縮寫：

實施例

京尼平為一種源自京尼平苷(geniposide)之糖苷配基，其見於山黃梔(Gardenia jasminoides Ellis)之果實中。京尼平具有分子式C₁₁H₁₄O₅且含有二氫哌喃環。京尼平自發地與胺基酸(主要為離胺酸之一級胺)反應，形成分子內蛋白質交聯(圖1)。經交聯蛋白質呈現深藍色。京尼平可交聯明膠中之一級胺，即戊二醛所交聯之相同官能基。此變化對最終產品之製造程序及效能具有最小影響。意外的是，京尼平交聯型明膠產品(「Gen-Gel」)已顯示出一些優於戊二醛交聯型明膠(「Glu-Gel」)材料之出乎意料之效能及製造優勢。該等優勢在本發明之實施例部分中進一步詳細呈現。

實施例1：京尼平交聯型明膠

為進行概念驗證演示，合成許多Gen-Gel變體。在含有約5% EtOH之pH 7.4 PBS中進行反應。在室溫下及在38℃下進行反應。明膠濃度恆定保持於5% w/v。評估不同濃度(5 mM、9.7 mM及2.5 mM)之京尼平且使反應進行16小時或39小時。藉由首先用EtOH且接著用H₂O進行澈底洗滌，或藉由懸浮於0.25 M甘胺酸溶液(pH 9.9)中保持24小時，接著進行澈底EtOH/H₂O洗滌，來淬滅反應。最後用MeOH洗滌所有反應產物且在烘箱中在34℃下乾燥。

藉由磨擦來減小乾燥反應產物的尺寸且使其尺寸處於25號篩與80號篩之間，得到在177 μm至710 μm之間的標稱尺寸分佈。在此最後一個處理步驟之後，藉由TEG、EF測試、平衡膨脹測試及顯微鏡法分析/評估不同變體(表1)。

發現與Glu-Gel相比，Gen-Gel變體具有類似之平衡膨脹(在400%至900%之間)、EF(<10 lbf，代表樣本)，及相當或更佳之TEG效能(圖2)。根據圖2之TEG特徵展示Gen-Gel形成凝塊，其至少與Floseal VH S/D同樣快速的形成且同樣強大。實務上，Gen-Gel在40秒內展示40或40以上之TEG幅值(一些變體在40秒之後甚至超過50或超過60)。此表現係在一系列反應條件下觀測到，表明穩固且可調之合成製程。該等結果亦顯示合成係穩固且簡單的。

藉由在去離子水中進行反應來重複實驗且獲得類似結果。

實施例2：效能測試

與實施例1中相同，在其他製造實驗中系統地調節三個關鍵反應參數。改變京尼平濃度(1 mM、2.5 mM及5 mM)及反應時間(2小時、4小時、6小時、8小時、12小時及 16小時)且與Glu-Gel相比較。亦改變合成後步驟(例如H₂O洗滌相對於醇/H₂O洗滌)。

使用以下測試來評估系統調節此等反應參數對產品效能(SAR)之影響：

a)平衡膨脹%：藉由以下方法(亦揭示於EP 1803 417 B1之實施例7中)進行測試：使樣本在0.9%鹽水溶液中水合約20小時，且測定其膨脹重量。樣本接著在120℃下乾燥2小時且測定其乾重。使用重量差計算平衡膨脹%。

b)凝血彈性描記法(TEG)：藉由以下方法進行TEG：對於本發明之實施例，使用TEG^® 5000 Thromboelastography^®止血系統，其採用4.2.3版軟體TEG分析軟體(TEG Analytical Software，TAS)。簡言之，用625 μl含有500 IU/ml凝血酶及40 mM CaCl₂之凝血酶儲備溶液復原0.125 g測試物品，接著使其靜置5分鐘。將約150 μl或150 mg復原之測試物品轉移至TEG杯中，將該杯置於該儀器中。立即將加有5 U/ml肝素抗凝血劑之210 μl血液添加至杯中且快速混合。接著開始TEG且收集資料，典型地持續20分鐘。使用振幅(Amplitude，A)值及最大振幅(Maximal Amplitude，MA)值對產品效能評分。Glu-Gel用作參考標準。Glu-Gel之代表性TEG特徵將提供諸如以下之值：A=66.2 mm、MA=65.4 mm及A/MA=1.012。A及MA值>50 mm且A/MA值>1預示著良好止血活性及穩固凝塊形成。

c)擠壓力(EF)：進行EF分析以測定配有公型魯爾(Luer)鎖系統(內徑為0,482吋之圓柱體，附接有標準6.35 cm傳遞尖端)之5 cc注射器的力值。簡言之，將0.80 g測試物品轉移至5.0 ml基質(如上所述)注射器中。將4.0 ml凝血酶/CaCl₂儲備溶液(含有500 IU/mL凝血酶及40 mM CaCl₂及約50 mg/ml白蛋白)溶解於配有母型(female)魯爾鎖系統之5.0 ml標準注射器中。連接兩個注射器且快速復原測試物品20次，接著使其等待30±3分鐘，隨後進行分析。接著使互連之注射器再「噴湧」兩次，且對含有復原樣本之配有公型魯爾鎖系統之注射器配備施料器尖端且插入MTS Insight^TM機電測力計中。在250毫米/分鐘之設置壓縮速率下擠壓樣本，且記錄在整個樣本擠壓過程中測定之其平均力。

自此等力如下計算平均擠壓力：總能量(mJ)=平均力(N)

最大偏轉(mm)

亦量測所需之最大擠壓力且將容許之力上限設為10 lbf。

注射器及施料器係作為Floseal止血基質之部件自Baxter公司購得。

d)膠原酶分析：另外，對一小組Gen-Gel變體進行初步試管內酶(膠原酶)分析。藉由以下方法進行膠原酶分析：在直立圓筒混合機中將0.08 g各樣本與2 ml PBS緩衝液一起在37℃下培育30分鐘。此後在室溫下，在埃彭多夫離心機(Eppendorf centrifuge)中以14000 rpm對樣本離心5分鐘。棄置上清液且將沈澱物再懸浮於1,2 ml含有0,111 U/ml膠原酶之PBS緩衝液中。參考樣本係與1,2 ml PBS緩衝液(未添加膠原酶)一起培育。在直立圓筒混合機中在37℃下培育樣本且在規定的靜置時間之後，對上清液進行抽吸、稱重及收集以用於蛋白質測定(BCA測試)，且以1.2 ml含有膠原酶之PBS緩衝液再填充樣本。可藉由量測隨時間釋放至上清液中之降解蛋白質之含量來確定溶解時間。此分析量測該測試物品之經估計90%溶解時間且為對測試物品之可能活體內滯留時間之間接估計。將Glu-Gel用作參考標準，且將作為對測試物品之可能活體內滯留時間之間接估計的90%溶解時間與關於Glu-Gel獲得之值相比較。

結果及討論

TEG及平衡膨脹%效能

在第一組反應中，當將1 mM京尼平用於交聯反應中時，評估反應時間對產品效能之影響。如所預期，就TEG與膨脹%而言之效能隨反應時間增加而改良(圖3a及3b)。16小時反應所具有之TEG效能(圖3a)與Glu-Gel參考標準處於相同範圍內。

在第二組反應(圖4)中，在2.5 mM京尼平反應濃度下評估反應時間及處理方案對產品效能之影響。將京尼平濃度提高至2.5 mM在所有反應時間及處理條件下均產生優良TEG及膨脹%效能(圖4a及4b)。

在第三組反應(圖5)中，在5 mM京尼平反應濃度下評估產品效能。在所有反應時間及處理條件下，TEG效能(圖5a)相比2.5 mM京尼平反應進一步改良。如所預期，就膨脹%而言之效能亦得到改良。以H₂O洗滌再次產生相對於EtOH洗滌膨脹%減小之經交聯變體(圖5b)。

反應及製程條件對擠壓力(EF)之影響

EF直接影響使用容易度。對所合成之一小組Gen-Gel變體進行EF量測。表2中呈現代表性資料。

EF量測值揭露了反映來自膨脹%量測之觀察結果的有趣趨勢。如先前章節中所討論，與H₂O洗滌相對，醇洗滌Gen-Gel產品產生顯著較高之膨脹%值。此趨勢在EF量測中反覆出現，其中與類似經H₂O洗滌之變體相比，EtOH洗滌之變體具有顯著較高EF值。

間接活體內滯留時間估計-試管內膠原酶分析

在試管內膠原酶分析中測試5 mM京尼平系列之變體且確定90%溶解時間(表3)。達到90%溶解之時間與各變體之反應時間成正比。預期反應時間增加使得交聯程度提高，因此需要較長久地暴露於膠原酶以達到90%溶解。該等結果支持此假設。5 mM京尼平、6小時反應以及H₂O洗滌處理之90%溶解時間最接近地模擬參考Glu-Gen基質。

結論

京尼平濃度、反應時間及洗滌處理為所評估之參數。使用試管內效能量測(諸如TEG、膨脹%、EF及膠原酶降解分析)來評估所產生之Gen-Gel變體。一系列產品性質可藉由改變反應及製程條件來獲得。使用5 mM京尼平系列作為代表性實例得到之該等產品性質概述於表4中。

京尼平濃度及反應時間之影響：提高京尼平反應濃度及/或增加反應時間會增加在既定時段內與明膠之化學反應事件之數目，其又引起交聯密度之提高。因此，增大此等參數中一者或兩者會產生膨脹較小、TEG改良且擠壓力較低之產品。因此，觀察到與此等參數均成正比之90%溶解時間增加。因此，京尼平濃度及反應時間為控制交聯程度及產品效能之兩個關鍵變數。

合成後處理之重要性-洗滌：與H₂O相比，以醇洗滌使產品具有顯著不同之效能特徵。醇洗滌具有處理後乾燥時間(20小時)快於H₂O洗滌(60小時)之優勢。然而，H₂O具有環保以及產生在全部三個效能標準方面均具有較佳效能之產品的雙重優勢。

根據化學及效能分析，選定5 mM京尼平、6小時反應接著H₂O洗滌作為將在豬肝模型中進行評估之主要候選條件。

實施例3：豬肝穿刺活組織檢查模型

材料及方法：動物模型

對於此模型，進行中線剖腹術，接著進行電灼法以使手術切口停止出血。暴露出肝且分離肝葉。使用10 mm直徑穿刺活組織檢查以產生一系列2個不完全厚度之損害，約5 mm深，且核心組織已移除。對該損害進行治療前評估，包括用預稱重之紗布收集自各損害流出之血液，持續10秒。

將測試物品隨機化且提供給對樣本處理不知情之外科醫師。將約1.0 ml指定測試物品局部施用於損害。使用鹽水潤濕之紗布來幫助測試物品接近其指定損害，且計時器開始計時。30秒之後移除鹽水潤濕之接近紗布。

按照圖6中所描繪，評估在將測試物品施用於其指定損害後30秒、60秒、90秒、120秒、300秒及600秒時之出血程度。

產品中充滿血液，但無活動性出血計為「0」(零)。在評估300秒之後使用鹽水自損害灌洗去除過量測試物品。重複該程序且在多個肝葉中進行。由單個外科醫師製造損害、進行處理及進行觀察結果評估。外科醫師亦可獲得關於產品效能、外觀、使用容易度等之視訊/像片資料。

按照分子設計及合成化學小組所開發且於實施例2中詳述之合成程序來合成用於在豬肝模型中進行活體內評估之測試物品。

將0.7918 g京尼平溶解於35 ml絕對EtOH中。在恆定攪拌下向其中添加665 ml PBS(pH 7.5)及35公克未交聯明膠且在室溫下攪拌所得懸浮液6小時。在反應期中，懸浮液顏色自極暗淡的褐色變為鮮藍色。在6小時後，藉由過濾來分離交聯之京尼平-明膠產品且用去離子水澈底洗滌。接著將其再懸浮於700 ml之100 mM甘胺酸溶液中且在室溫下攪拌隔夜。再次過濾產品且以去離子水洗滌直至洗滌液之電導率讀數<10 μS/cm為止。將過濾之產品轉移至玻璃烤盤中且在烘箱中在34℃下乾燥約3日。自烘箱移除乾燥Gen-Gel產品且使用設為「點滴」設置之哈密爾頓-比奇(Hamilton-Beach)咖啡磨來研磨。在25號篩(篩孔尺寸為約700微米)與80號篩(篩孔尺寸為約180微米)之間篩分經研磨之粉末產物。產品指定為批號27786-86B。

將測試物品分配於再指定為27888-51A之5 ml注射器(0.8公克/注射器)中且在豬肝模型中加以評估。

測試物品調配物

在使用2只動物(每日1只)之豬肝穿刺活組織檢查模型中進行27888-51A之活體內評估。製備在40 mM CaCl₂溶液中含有500 I.U./ml凝血酶之凝血酶/CaCl₂儲備溶液。以2種調配物評估測試物品27888-51A：

1.5 mM京尼平-明膠0.25 g/ml明膠(27888-51A-125)

2.5 mM京尼平-明膠0.2 g/ml明膠(27888-51A-100)

Glu-Gen用作參考標準。各樣本藉由在注射器之間通過(「噴湧」)20次來快速混合，使其靜止5分鐘，接著再噴湧3次。將復原測試物品之1 ml等分試樣分配於個別3 ml體積之注射器中。接著使用此等個別3 ml注射器，在各個時點將測試物品施用於肝穿刺損害。

結果及討論

在使用2只動物(每日1只動物)之豬肝穿刺活組織檢查模型中進行27888-51A之活體內評估。結果呈現於圖7中。圖7中呈現之資料清楚地顯示27888-51A(27786-86B)在豬肝穿刺活組織檢查模型中止血成功。按照上述程序合成之5 mM Gen-Gel使得兩種調配物均止血成功。此外，在此模型中，就成功百分比而言，Gen-Gel調配物優於Glu-Gen調配物。

實施例4：使Gen-Gel脫色

與京尼平產品交聯之明膠具有深藍色。當產品復原且施用於出血部位之後保持此顏色(圖8)。Gen-Gel產品之藍色為在胺基與京尼平反應期間所形成之藍色發色團所致。京尼平-胺反應之產物具有多個不飽和共軛(雙)鍵，從而在可見光譜中引起光吸收且產生鮮藍色。根據本發明之一個較佳具體實例，可將除藍色外之所需顏色引入最終Gen-Gel產品中。此具有針對所需應用(包括(但不限於)止血)定製顏色之優勢。視特定手術程序或傷口位置而定，對於止血，不同顏色亦可為較佳的。

Gen-Gel之藍色為京尼平與明膠之間交聯反應之數目的直接結果。因此，可能藉由降低交聯程度來改變顏色。此可藉由將交聯反應中京尼平濃度降至極低程度(1 mM)來達成。如此成功地產生具有範圍自棕黃色至褐色，或藍色，或綠色的各種所需色調之有色產品。減弱Gen-Gel之藍色的另一方法為用H₂O₂處理Gen-Gel以破壞發色性共軛系統。

研究3種不同H₂O₂濃度及3種不同京尼平交聯濃度對產品外觀及效能之影響。表5中描繪此實驗矩陣。

通用合成程序

將京尼平溶解於去離子水中達到所需濃度。添加未交聯明膠達到5% w/v之濃度。在室溫下攪拌所得懸浮液6小時，在此期間在反應容器中形成京尼平交聯型明膠之深藍色懸浮液。使用巴克納漏斗(Buckner funnel)及54號華特門(Whatman # 54)濾紙過濾藍色懸浮液。以H₂O澈底洗滌截留於濾紙上之固體產物直至所得洗滌液之電導率讀數<10 μS/cm為止。將產品再懸浮於5% H₂O₂溶液(藉由用去離子水稀釋30 wt%儲備溶液來製備)中。5% H₂O₂溶液之體積與用於交聯反應之去離子水之體積相同。密封此反應容器且在室溫下攪拌反應約16小時至20小時。過濾反應產物且用H₂O澈底洗滌直至在洗滌液中偵測不到過氧化物、洗滌液pH值=7.0且電導率讀數<10 μS/cm為止。將過濾之經H₂O₂淬滅之產物轉移至玻璃皿中且在34℃下乾燥2至4日。使用設為「點滴」設置之哈密爾頓-比奇咖啡磨來研磨乾燥產物。使經研磨粉末之尺寸處於25號篩與80號篩之間，得到177 μm至710 μm之標稱尺寸範圍。

結果及討論

變體27786-90B至27786-90D用15% H₂O₂溶液淬滅且顯示最淺色澤。變體27786-96A至27786-96C用1% H₂O₂溶液淬滅且具有最深顏色。用5% H₂O₂溶液處理27786-92系列且顏色處於其他兩者中間。回到27786-90系列-90B與5 mM京尼平交聯、90C與7.5 mM京尼平交聯且90D與10 mM京尼平交聯。在此系列中，自B至D顏色相應地加深。因此，最終產品之顏色與淬滅所用H₂O₂之濃度成反比且與京尼平交聯濃度成正比。

在完成初始效能評估之後，對不同經H₂O₂淬滅之Gen-Gel變體進行目測外觀評價。產品之真實物理外觀只能在呈其復原形式時得到真實評估。因此，表5中詳述之變體係用凝血酶溶液復原且經評估物理外觀。圖9呈現呈復原形式之表5變體之顏色比較。依據重要評估，27786-90及27786-92系列自目測外觀之觀點來看為可接受的。

使用先前關於Gen-Gel所述相同之TEG、膨脹%及EF測試程序來評估H₂O₂淬滅之Gen-Gel變體。表6中提供結果：

京尼平交聯及用H₂O₂或過碳酸鈉處理之其他結果

明膠粉末藉由添加至6 mM至10 mM京尼平之DIW溶液中進行交聯，產生5%明膠懸浮液。在4小時至6小時後，排出過量溶液且藉由篩網(270號近似篩孔尺寸)捕集固體。

將截留的固體再懸浮於3%至5% H₂O₂溶液(pH 7)中達到在前一交聯步驟期間所用之近似反應體積。使此溶液混合隔夜，持續約16小時至20小時。排出溶液且保留固體。使用至少3次分批沖洗或3個透析體積(diavolume)之DIW洗滌固體，直至溶液電導率<0.1 mS/cm為止。接著在烘箱中乾燥固體。藉由量測膨脹來監測交聯程度，其中膨脹係如先前所述來定義。

表7提供交聯及H₂O₂處理之結果。

或者，可將截留的固體再懸浮於1%至4%過碳酸鈉溶液中而非懸浮於H₂O₂溶液中，保持1小時至16小時。過碳酸鈉係呈粉末形式直接添加至再懸浮之經交聯明膠溶液中且由約28%之可用H₂O₂組成。排出溶液且保留固體。使用至少3次分批沖洗或3個透析體積之DIW洗滌固體，直至溶液電導率<0.1 mS/cm為止。在烘箱中乾燥固體。

表7提供交聯及過碳酸鹽處理之結果。

實施例5：H ₂ O ₂ 淬滅之Gen-Gel-在豬肝模型中之功效

實驗設計

實驗設計及目的類似於關於上述Gen-Gel活體內功效測定所述者。在上述豬肝穿刺活組織檢查模型中評估活體內止血功效。

合成測試物品

10 mM京尼平、6小時反應、5% H₂O₂淬滅[27888-91B(27786-110A)]：按照上述通用合成程序合成27786-110A。將120 g未交聯明膠用作起始物質且所有其他試劑均以上述比率使用。研磨及篩分之後，藉由最小劑量為25 kGy之γ放射對終產物進行滅菌。滅菌後，產品再指定為27888-91B。將產品包裝於5 ml「公型(male)」注射器中(0.8公克/注射器)且提交用於在豬肝模型中加以評估(TEG=良好，膨脹%=823.1%，EF 0.25 g Gen-Gel/ml=8.43 lbf，顏色=灰綠色)。

10 mM京尼平、6小時反應、甘胺酸淬滅(27888-91A(27888-89A))：按照上述程序合成27888-80A。將120 g未交聯明膠用作起始物質且所有其他試劑均以上述比率使用。研磨及篩分之後，藉由最小劑量為25 kGy之γ放射對終產物進行滅菌。滅菌後，產品再指定為27888-91A。將產品包裝於5 ml「公型」注射器中(0.8公克/注射器)且提交用於在豬肝模型中加以評估(TEG=良好，膨脹%=734.6%，EF 0.25 g Gen-Gel/ml=8.24 lbf，顏色=深藍色)。

調配物

在使用2只動物(每日1只)之豬肝穿刺活組織檢查模型中進行27888-91A及27888-91B之活體內評估。如上所述製備凝血酶/CaCl₂儲備溶液。測試物品27888-51A係以其各別調配物(0.25 g Gen-Gel/ml)形式評估，亦即每0.8 g Gen-Gel基質(一個注射器)使用3.2 ml凝血酶溶液。Glu-Gen用作參考標準。使各樣本快速復原20次，使其靜置5分鐘，接著再噴湧3次。將復原測試物品之1 ml等分試樣分配於個別3 ml體積之注射器中。接著使用此等個別3 ml注射器，在各個時點將測試物品施用於肝穿刺損害。

結果及討論

27888-91A及2788-91B之活體內評估結果呈現於圖10中。在所有研究時點，兩種測試物品均同樣地具有等於或優於Glu-Gel參考標準之止血成功率。止血成功係定義為不出血(圖10a)。當應用不出血或滲出之止血成功準則(圖10b)時，效能差異改良，有利於H₂O₂淬滅之變體27888-91B。

實施例6：

按照Floseal藥品說明書調配明膠樣本，但存在幾個關鍵差別。首先，使用氯化鈉代替氯化鈣且以125%固體代替100%固體來調配明膠。使明膠/凝血酶調配物靜置25分鐘，接著棄置1 ml製劑。將另外1 ml物質施用於局部止血系統(topical hemostasis system，THS)。預先用貧血小板血漿底塗THS裝置。

THS為一種設計用於模擬流血傷口之裝置。人工傷口為在聚矽氧基板中之圓柱形孔。用纖維蛋白原層塗佈聚矽氧圓柱之表面。注射泵排出凝結流體(全血、血漿等)，在此情況下為貧血小板血漿，同時記錄背壓。在此實驗中，血漿以0.25 ml/min之固定速率流過在圓柱形傷口之底部中心之小孔。在即將施用止血基質前，用紗布吸收過量血漿。當血漿繼續流動時，將1 ml止血基質施用於圓柱形傷口。將其立即以濕紗布覆蓋且施加固定壓力。30秒之後，移除重物且血漿繼續流動8分鐘至10分鐘，此時停止流動且凝塊保留於潮濕箱中，在其中停留超過2小時。在兩小時結束時，在8℃下將凝塊安裝於振動組織切片機(vibratome)上，在其中自凝塊切下約500 μm厚之切片。將此等切片浸於PBS緩衝液中。切片在不使用時儲存於5℃冰箱中。將該切片置於蓋玻片上且用運行NIS-Elements Advanced Research v3.22.00 Build 710軟體之Nikon A1R共焦顯微鏡成像。為收集顯微照片，將平場螢光型(plan fluor)10×物鏡與488 nm之雷射激發光及500 nm至550 nm之發射收集窗一起使用。使用透射光偵測器同時收集透射光影像。用此等成像參數，使用由該軟體進行之自動拼接來產生肉眼可見之樣本圖。樣本之較小區域亦藉由收集光學薄片厚度為5.125 μm之影像之3D z-堆疊來特性化。使用複合共焦圖鑑別位於表面之明膠顆粒，且將其切片。此對於原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)中彈性量測之定位很重要。將凝塊切片安裝於Veeco Multimode AFM中。該multimode配備有Nanoscope V控制器及JV壓電掃描儀。用支撐4.5 μm聚苯乙烯球之Novascan AFM懸臂進行力量測。藉由熱調法，測定懸臂之力常數為0.779 N/m。將懸臂定位於明膠顆粒中心上方，接著以16×16陣列量測力。每一力曲線包括向上移動明膠顆粒使其與聚苯乙烯球接觸，及繼續向上移動顆粒直至懸臂偏轉達到2伏之預置引發值為止，此時，明膠自引發位置縮回1.00微米之距離。

討論

螢光資料顯示戊二醛交聯型明膠未均一交聯。實情為，在顆粒邊緣周圍之交聯密度似乎較高，且顆粒中心部分之交聯顯著少於邊緣。相比之下，京尼平交聯型明膠似乎在整個顆粒中均一(均質)交聯。對螢光強度不存在實質邊緣效應。因為交聯劑本身可能造成螢光差異，所以京尼平交聯型及戊二醛交聯型物質之螢光強度不能直接比較。然而，AFM量測之彈性模數量測值顯示京尼平交聯型明膠比戊二醛交聯型明膠硬，戊二醛交聯型明膠似乎較軟(可撓性較強)。

實施例7：

比較根據本發明之京尼平明膠製劑與根據Chiono等人,2008之京尼平明膠製劑-在豬肝模型中之功效

a)根據Chiono等人(2008)之製劑：在50℃下將布倫強度為約75之B型牛皮明膠(Sigma公司，目錄號G6650-1KG)溶解於蒸餾水中，獲得10% w/v溶液。添加京尼平(來自Wako公司，目錄號078-03021)以達到3.4% w/w之最終濃度。將溶液保持在50℃直至溶液略帶黏性為止(在約110分鐘後)。此後，將溶液傾入鐵氟龍(Teflon)塗佈盤(盤尺寸為約25.5 cm×38 cm)中且使其在室溫下風乾48小時。用蒸餾水(每個膜4升H₂O)洗滌經乾燥膜3次且在室溫下風乾以達到恆重(約69小時至88小時總乾燥時間)。用具有12齒推入配合式轉子(push-fit-rotor)及0.75 mm環篩之Retsch研磨機在6000 rpm下研磨該等膜。採用在25.7 kGy至44.2 kGy之間的劑量範圍對由此獲得之顆粒進行γ滅菌。

b)根據本發明之製劑：將布倫強度為約200至400之源自B型明膠之明膠膜研磨至在0.707 mm與0.177 mm之間的粒度。接著，將0.4532 g京尼平(Wako公司，目錄號078-03021)溶解於400 ml蒸餾/去離子水中且添加20.012 g經研磨明膠，且在室溫下攪拌6小時。在交聯後，用400 ml去離子水洗滌粒子，接著置於烘箱中在34℃下保持40小時以便乾燥。用具有12齒推入配合式轉子及0.75 mm環篩之Retsch研磨機在6000 rpm下研磨經乾燥之粒子。對由此獲得之顆粒進行γ滅菌(最小劑量25 kGy)。

c)樣本製備、活體內效能

兩種顆粒均用含有獲得17.5% w/w固液比之比率的500 IU/ml凝血酶及40 mM CaCl₂之凝血酶溶液調配，且在施用之前平衡至少15分鐘。

已使用如實施例3中所述之豬肝模型作為活體內效能模型。

圖11中所示之結果顯示，與Chiono等人(2008)中所述之方法相比，根據本發明方法製備之物質具有優越的活體內效能。

圖1展示京尼平與胺基酸(主要為離胺酸之一級胺)反應形成分子內蛋白質交聯之示意圖。

圖2展示Glu-Gel及Gen-Gel變體之TEG特徵。

圖3、圖4及圖5展示利用1 mM京尼平(圖3)、2.5 mM京尼平(圖4)及5 mM京尼平(圖5)之TEG及平衡膨脹%。

圖6展示對於測試物品施用及接近(approximation)後之出血嚴重性的評估。

圖7展示在豬肝穿刺活組織檢查模型(Porcine Liver Punch-Biopsy Model)中5 mM京尼平-明膠(27888-51A)之成功止血。

圖8展示(a)在第一次施用時；(b)在灌洗過量物質後復原及施用之Gen-Gel。

圖9展示復原之經H₂O₂淬滅之Gen-Gel變體。

圖10展示在豬肝穿刺活組織檢查模型中Gen-Gel及H₂O₂淬滅之Gen-Gel的成功止血。

圖11展示在豬肝穿刺活組織檢查模型中根據Chiono等人之Gen-Gel製劑之成功止血(定義為「不出血」)。

------展示根據本發明之製劑

____展示根據Chiono等人之製劑

x軸展示施用後之時間[秒]，y軸展示止血成功百分比。

Claims

一種用於製造止血組成物之方法，其包含混合適用於止血之生物相容性聚合物與京尼平型(genipin-type)交聯劑，藉由該京尼平型交聯劑交聯該聚合物以獲得經交聯之生物相容性聚合物，及將該經交聯聚合物最終加工成醫藥學上可接受之止血組成物。
如申請專利範圍第1項之用於製造止血組成物之方法，其中該適用於止血之生物相容性聚合物在該交聯步驟之前係呈乾燥形式存在。
如申請專利範圍第1項或第2項之用於製造止血組成物之方法，其中該京尼平型交聯劑為京尼平((1R,2R,6S)-2-羥基-9-(羥甲基)-3-氧雜雙環[4.3.0]壬-4,8-二烯-5-甲酸甲酯)。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該適用於止血之生物相容性聚合物為蛋白質、包含胺基之多醣、包含胺基之生物聚合物、包含胺基之非生物聚合物；及其衍生物及組合。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該適用於止血之生物相容性聚合物為選自由以下組成之群的蛋白質：明膠、膠原蛋白、白蛋白、血紅素、纖維蛋白原、纖維蛋白、酪蛋白、纖維結合蛋白、彈性蛋白、角蛋白及層黏連蛋白；及其衍生物及組合。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該適用於止血之生物相容性聚合物為選自由以下組成之群的包含胺基之多醣：葡糖胺聚糖、果膠、包含胺基之改質澱粉、包含胺基之改質纖維素、包含胺基之改質聚葡萄糖、包含胺基之改質半纖維素、包含胺基之改質木聚糖、包含胺基之改質瓊脂糖、包含胺基之改質海藻酸鹽、甲殼素及聚葡萄胺糖；及其衍生物及組合。
如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該適用於止血之生物相容性聚合物為選自由以下組成之群的聚合物：聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚伸乙基亞胺、聚離胺酸、聚精胺酸及聚醯胺基胺(PAMAM)樹枝狀聚合物。
如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該經交聯之生物相容性聚合物經歷氧化步驟，較佳經歷用過碳酸鈉、次氯酸鈉、氯水或H₂O₂進行之處理，尤其用1%至15% H₂O₂溶液進行之處理。
如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該交聯步驟係在水溶液中進行，較佳在PBS/乙醇緩衝液中尤其在7至8之pH值下進行，或在去離子水中進行。
如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該交聯步驟係在pH值為4至12之含有至多50%(v/v)水混溶性有機溶劑及/或一或多種處理助劑之水性緩衝液中進行。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該交聯步驟係在4℃至45℃、較佳15℃至45℃、尤其20℃至40℃之溫度下進行。
如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該交聯步驟之後為淬滅步驟，尤其用含有胺基之淬滅劑，較佳胺基酸，尤其甘胺酸進行的淬滅步驟。
如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中在該交聯步驟之後將該pH值升到8至14、添加親核試劑或將該pH值升到8至14且添加親核試劑。
如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中在該交聯步驟後洗滌該經交聯之生物相容性聚合物，較佳用甲醇、乙醇或水，尤其藉由去離子水進行洗滌。
如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中在該交聯步驟後用含有至多50%(v/v)水混溶性有機溶劑及/或一或多種處理助劑之水性緩衝液洗滌該經交聯之生物相容性聚合物。
如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中將該經交聯之生物相容性聚合物乾燥或呈於適合生物相容性緩衝液中之濕水凝膠的形式提供。
如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中將該經交聯之生物相容性聚合物乾燥至具有低於15%(w/w)、較佳低於10%、更佳低於5%、尤其低於1%之水分。
如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之用於製造止血組成物之方法，其中該適用於止血之生物相容性聚合物為布倫強度(Bloom strength)為200至400之明膠，尤其是布倫強度為200至400之B型明膠。
一種止血組成物，其包含可藉由如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之方法獲得的經交聯之生物相容性聚合物。
如申請專利範圍第19項之止血組成物，其中該經交聯之生物相容性聚合物為明膠聚合物。
如申請專利範圍第19項或第20項之止血組成物，其中該經交聯之生物相容性聚合物為B型明膠聚合物。
如申請專利範圍第19項至第21項中任一項之止血組成物，其中該經交聯之生物相容性聚合物係呈微粒形式存在，較佳呈粒狀物質形式存在。
如申請專利範圍第19項至第22項中任一項之止血組成物，其中該經交聯之生物相容性聚合物係呈乾燥形式存在。
如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之止血組成物，其中該經交聯之生物相容性聚合物為布倫強度為200至400之明膠。
如申請專利範圍第19項至第24項中任一項之止血組成物，其中該經交聯之生物相容性聚合物之平衡膨脹為至少400%，較佳為600%至900%。
一種用於治療選自由傷口、出血、受損組織、出血組織及/或骨缺損組成之群的損傷之如申請專利範圍第19項至第25項中任一項之止血組成物。
一種治療選自由傷口、出血、受損組織及/或出血組織組成之群之損傷的方法，其包含向損傷部位投予如申請專利範圍第19項至第26項中任一項之止血組成物。
一種用於治療選自由傷口、出血、受損組織及/或出血組織組成之群之損傷的套組，其包含a)如申請專利範圍第19項至第26項中任一項之止血組成物；及b)使用說明書。
如申請專利範圍第28項之套組，其進一步包含乾燥形式之如申請專利範圍第19項至第26項中任一項之止血組成物及用於復原該止血組成物之醫藥學上可接受之稀釋劑。
如申請專利範圍第28項或第29項之套組，其進一步包含醫藥學上可接受之稀釋劑，該稀釋劑含有選自由以下組成之群的物質：NaCl、CaCl₂、乙酸鈉及甘露糖醇。
如申請專利範圍第28項至第30項中任一項之套組，其中該醫藥學上可接受之稀釋劑包含緩衝液或緩衝系統，其pH值較佳為3.0至10.0。
如申請專利範圍第28項至第31項中任一項之套組，其中該醫藥學上可接受之稀釋劑包含凝血酶，較佳包含10 I.U.至1000 I.U.凝血酶/毫升，尤其包含250 I.U.至700 I.U.凝血酶/毫升。
一種用於提供即用形式之如申請專利範圍第19項至第26項中任一項之止血組成物的方法，其中在第一注射器中提供該止血組成物且在第二注射器中提供用於復原之醫藥學上可接受之稀釋劑，將該第一注射器與該第二注射器彼此連接，且將流體引入該第一注射器以產生可流動形式之該止血組成物；且視情況使該可流動形式之該止血組成物返回至該第二注射器至少一次。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該可流動形式之該止血組成物含有超過50%(w/w)具有100 μm至1000 μm尺寸之粒子，較佳超過80%(w/w)具有100 μm至1000 μm尺寸之粒子。
如申請專利範圍第33項或第34項之方法，其中該醫藥學上可接受之稀釋劑進一步包含凝血酶，較佳包含10 I.U.至1000 I.U.凝血酶/毫升，尤其包含50 I.U.至500 I.U.凝血酶/毫升。
如申請專利範圍第33項至第35項中任一項之方法，其中該經交聯之生物相容性聚合物為經交聯明膠，尤其為經交聯B型明膠。
一種即用型止血組成物，其包含可藉由如申請專利範圍第33項至第36項中任一項之方法獲得的經交聯之生物相容性聚合物。
如申請專利範圍第37項之即用型止血組成物，其中該可流動形式含有5%至30%(w/w)、較佳10%至25%(w/w)、尤其12%至20%(w/w)之量的經交聯之生物相容性聚合物。