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TW201300027A - 促肪解大豆胜肽之最適水解條件、序列及其應用 - Google Patents

促肪解大豆胜肽之最適水解條件、序列及其應用 Download PDF

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TW201300027A
TW201300027A TW100121652A TW100121652A TW201300027A TW 201300027 A TW201300027 A TW 201300027A TW 100121652 A TW100121652 A TW 100121652A TW 100121652 A TW100121652 A TW 100121652A TW 201300027 A TW201300027 A TW 201300027A
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Abstract

本發明所揭一種製備促脂解大豆蛋白水解物之方法，首先係先將一配置好預定濃度之分離大豆蛋白，再加入一風味蛋白酶(Flavourzyme)於一最適水解條件下，進行水解反應，其中，該分離大豆蛋白與風味蛋白酶之比例為100：1，而該最適水解條件係如下：反應酸鹼值介於7～7.5間、反應溫度為40～50℃、水解時間為100～150分鐘，得到一具有極佳之促脂解活性之大豆蛋白水解物。本發明係更進一步分離鑑定出該大豆蛋白水解物中之活性胜肽序列具有九種組合，分別為Val-His-Val-Val、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Ile、Leu-Ile-Leu、Leu-Ile-Ile、Ile-Leu-Leu、Ile-Leu-Ile、Ile-Ile-Leu及Ile-Ile-Ile。

Description

促肪解大豆胜肽之最適水解條件、序列及其應用
本發明係有關於機能性蛋白及其應用，特別係指一種促脂解大豆胜肽之最適水解條件、序列及其應用。
按，肥胖已經成為許多已開發國家的流行趨勢，國人肥胖的發生率又與消費能力呈正相關。而依據我國行政院衛生署2009年之研究指出，台灣約有1/4之成年人體重過重。先前研究指出，造成體重過重與肥胖的主要原因是能量攝取不平衡，當生物體能量攝取高於能量消耗時，多餘的能量就會以三酸甘油酯的形式儲存於脂肪組織，而脂肪細胞為構成脂肪組織最主要之細胞。許多研究更進一步指出肥胖與一些疾病的發生有關，例如：第二型糖尿病、心血管疾病、睡眠呼吸暫停及癌症等。而藉由脂肪分解之過程，使脂肪細胞降解以及釋放三酸甘油脂，能夠達成治療肥胖之目標。脂肪組織脂解被認為係一種良好之代謝途徑，於代謝過程中使三酸甘油脂分解成為非酯化脂肪酸以及甘油。
食品蛋白質為人體之重要營養來源之一，能夠提供人體所需之胺基酸與能量，用以維持適當之生長與健康；先前研究雖指出動物蛋白質較植物蛋白質容易被人體消化吸收，惟，亦有許多研究報告證實植物蛋白質能夠提供較良好之機能性，例如：降血脂、降低血液中之膽固醇、減緩糖尿病引發腎臟疾病等，並且隨著民眾健康意識增加，原被用以使消化系統受損病患獲取足夠蛋白質來源之蛋白質水解物，也被研究出具有許多生理活性，如抗氧化活性、抗菌活性、免疫調節活性、降血壓活性、降血中膽固醇與三酸甘油酯活性、抗脂質生成活性、促進3T3-L1脂肪細胞脂肪分解活性等。
而目前蛋白質水解物常用的製程方法包含有酸水解、發酵法以及酵素水解三種。其中，酸水解具有低成本、高水解率、無苦味等特性，但水解過程可能伴隨產生致癌物單氯丙二醇(monochloropropanol;MCP)與二氯丙醇(dichloropropanol;DCP)，以及水解後中和pH所產生的高鹽分(氯化鈉大於40%)和高含量麩胺酸鈉(monosodium glutamate;MSG)等不良影響；發酵法因利用麴菌進行水解蛋白質，反應過程不僅單純水解蛋白質，亦會產生揮發性物質，如醇類、有機酸、醛類、酯類等，因此發酵法多用於醬油生產；而酵素水解採用單純的蛋白質分解酶對蛋白質進行水解，對於水解產物的控制較發酵法方便，水解過程不會產生單氯丙二醇、二氯丙醇等致癌物，並且水解酵素於溫和條件如常壓、低溫下進行即有很大的反應速率，相對也耗能低、對基質有特異的選擇性等。雖然酵素水解法具有上述優點，然而其水解率往往不及於酸水解，導致產率下降，不過藉由改變酵素種類、水解環境之pH值與離子強度、作用溫度與時間等條件得以改善水解率，此外，酵素水解過程會產生疏水性胜肽(hydrophobic peptide)，導致蛋白質水解物產生苦味，為此，於水解時使用多種酵素來改善苦味產生，如使用由Novo Nordisk公司研發之風味蛋白酶(Flavourzyme)，其係來自於Aspergillus oryzae，為一同時含有內切型蛋白酶(endopeptidase)與外切型蛋白酶(exopeptidase)之複合蛋白酶，具有高效率以及低苦味之優點。
大豆又稱黃豆，係為一種富含蛋白質、油脂及多種營養物之食物，蛋白質約含有35%；大豆經由脫脂、去皮與磨粉處理後可獲得脫脂大豆粉(defatted soy flour)，其蛋白質含量約為50%；脫脂大豆粉再以酸與乙醇去除醣類及風味物質可得濃縮大豆蛋白(soy protein concentrate)，其蛋白質含量提升至65~70%；濃縮大豆蛋白進一步以鹼液萃取蛋白質，離心去除纖維，再加酸調製大豆蛋白等電點使蛋白質沉澱而製成分離大豆蛋白(isolated soy protein;ISP)，蛋白質含量可高達85~90%。
而依據先前研究，無論是分離大豆蛋白或是濃縮大豆蛋白皆足夠人體之需求，因此大豆蛋白係可作為取代動物性蛋白質之完全植物性蛋白。除此之外，大豆蛋白係具有許多機能性，如降低血液中膽固醇及三酸甘油脂、抑制食慾以及降低高血壓患者之血壓等。更有研究進一步證實大豆蛋白經由不同酵素作用所分解出不同生理活性之胜肽更能提升原有蛋白質的機能性，例如：鹼性酶(Alcalase)水解分離大豆蛋白生產具有抑制高血壓活性的胜肽片段；利用微生物獲得的蛋白酶水解大豆蛋白，其水解物可減緩肉品脂質過氧化影響；分離大豆蛋白經由枯草桿菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶水解產生的水解物可顯著降低肥胖大鼠的血脂與體脂含量等。
除了上述所提及之活性胜肽外，目前許多研究更致力於使用風味蛋白酶(Flavourzyme)與中性蛋白酶(Neutrase)水解分離大豆蛋白，原因在於其所獲得的水解物係具有促進3T3-L1脂肪細胞脂解活性之功效，未來可應用於治療肥胖之用。不過由於影響水解效率之因子很多，因此，必須要找出風味蛋白酶水解大豆蛋白最適作用環境以及適當之水解時間，用以提昇水解效率以及使水解物具有最佳之生理活性。惟，由於風味蛋白酶中包含有多種蛋白分解酶，使得要準確描述最適作用環境有一定困難度存在。過去有學者係以8%分離大豆蛋白溶液探討風味蛋白酶之酵素活性，採用一次一因子(one factor at a time)之實驗設計探討最適作用環境。然而，此種實驗設計所得之結果無法完全表達出複合蛋白脢作用中其他固定因子與單一處理因子間之交互作用，亦即無法完整描述實際之最適作用環境，倘若不改變實驗設計，而將因子間之交互影響納入考慮，則須增加實驗次數，造成時間與成本之浪費，並且當因子間交互影響具有顯著差異實，所得結果亦無法呈現真正的最適值。
因此，本發明之主要目的係在於提供一種製備大豆蛋白水解物之方法，其係於一最適水解條件下進行水解反應，用以獲得促脂解活性最高之大豆蛋白水解物，其中：該製備大豆蛋白水解物之方法係將一配置為預定濃度之大豆蛋白，加入一定量之風味蛋白酶(Flavourzyme)於反應酸鹼值介於7～7.5間、反應溫度為40～50℃，水解時間為100～150分鐘之條件下，進行水解反應，而得到大豆蛋白水解物。
而該大豆蛋白係可選自大豆蛋白粉、濃縮大豆蛋白、分離大豆蛋白(isolated soy protein;ISP)或是其他經處理過之大豆蛋白等，以分離大豆蛋白為佳；並該大豆蛋白與該風味蛋白酶之較佳比例為100：1。
更進一步而言，經由該製備方法所獲得之大豆蛋白水解物係具有促脂解活性。
本發明之另一目的係在提供一種單離之機能性蛋白質，其胺基酸序列得為下列(1)或(2)：
(1)Val-His-Val-Val。
(2)由三個胺基酸所排列組成之序列，其中：
第一個胺基酸係可為Leu或Ile；
第二個胺基酸係可為Leu或Ile；
第三個胺基酸係可為Leu或Ile。
而該單離之機能性蛋白質係由以風味蛋白酶(Flavourzyme)水解大豆蛋白，具有促脂解活性，用以提昇生物體中脂肪細胞丙三醇之釋放量之功效，其中，該大豆蛋白係可選自大豆蛋白粉、濃縮大豆蛋白、分離大豆蛋白或是其他經處理過之大豆蛋白等，而以分離大豆蛋白為佳。
本發明之次一目的係在於提供一種用以減肥之醫藥組成物，其有效成份係包含一由大豆蛋白水解而得之機能性蛋白質，其胺基酸序列得為下列(1)或(2)：
(1)Val-His-Val-Val。
(2)由三個胺基酸所排列組成之序列，其中：
第一個胺基酸係可為Leu或Ile；
第二個胺基酸係可為Leu或Ile；
第三個胺基酸係可為Leu或Ile。
本發明所揭一種製備大豆蛋白水解物之方法，首先係先將一配置好預定濃度之分離大豆蛋白，再加入一風味蛋白酶(Flavourzyme)於一最適水解條件下，進行水解反應，其中，該分離大豆蛋白與風味蛋白酶之比例為100：1，而該最適水解條件係如下：反應酸鹼值介於7～7.5間、反應溫度為40～50℃、水解時間為100～150分鐘，得到一具有極佳之促脂解活性之大豆蛋白水解物。本發明係更進一步分離鑑定出該大豆蛋白水解物中之活性胜肽序列具有九種組合，分別為Val-His-Val-Val、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Ile、Leu-Ile-Leu、Leu-Ile-Ile、Ile-Leu-Leu、Ile-Leu-Ile、Ile-Ile-Leu及Ile-Ile-Ile。
以下，為了能夠清楚地說明本發明，茲舉若干實例並搭配表格或圖式做更詳細之說明如后。
於此必須先加以說明者，由於水解大豆蛋白會受到多重因子之影響，且各因子間會相互影響。因此，本發明於以下實例中係依照陡升路徑法，利用中心混層實驗設計(central composite design)給予星點、軸點與中心點之實驗，模擬出起點周圍之反應狀況，再將實驗所得結果，利用反應曲面法(response surface methodology;RSM)，其係結合數學及統計之技術，分析各變數對於系統之影響，以求得最適反應條件。
再者，脂肪細胞具有脂質生成作用以及脂質分解作用，其中，脂質分解作用係為三酸甘油酯藉由三種脂解酵素作用水解過程，包含有三酸甘油酯脂解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、荷爾蒙敏感性脂解酶(hormone-sensitive lipase,HSL)與單酸甘油酯脂解酶(monoglyceride lipase)，使三酸甘油酯代謝產生游離脂肪酸以及丙三醇兩種產物。由於丙三醇於脂肪細胞中不易被利用，而被釋放出細胞外，因此，脂肪細胞丙三醇釋放量之多寡或是細胞內三酸甘油酯之殘留量皆可用以評估脂肪細胞脂解作用之程度。
是以，本發明為了能夠無誤求得最適水解條件，係分別測定3T3-L1脂肪細胞培養液中丙三醇(glycerol)之釋放量，分析該數據以作為判斷水解大豆蛋白之最適水解條件之用。
實例一：製備分離大豆蛋白水解物
取購自台灣振芳股份有限公司之分離大豆蛋白(isolated soy protein;ISP)，以及自Novo Industry A/S(Copenhagen,Denmark)購入風味蛋白酶(Flavourzyme Type A)。
首先，配置重量百分比2.5%之分離大豆蛋白，而後加入風味蛋白酶，其中，風味蛋白酶與分離大豆蛋白之比例為1：100。依據先前文獻，可知影響大豆蛋白水解效率最主要之三個因子分別為反應酸鹼值(pH)、水解時間(hydrolysis time;HT,min)以及反應溫度(reaction temperature;RT,℃)，因此，採用三變數、五階層之中心混層實驗設計，得到如表一之水解反應參數。
表一：三變數五階層中心混層實驗設計水解反應參數
是以，將混合好之溶液依據表一所設定之不同條件進行水解反應。等到水解時間到，再將所得之水解物取出，並以沸水浴分別加熱15分鐘，用以使酵素失去活性，經冷卻後將水解物經9000×g離心15分鐘，取上清液進行冷凍乾燥所得分離大豆蛋白水解物(ISP hydrolysate,ISPH)作為後續實例之用。
實例二：培養3T3-L1脂肪細胞
本發明係自食品工業發展研究所購得3T3-L1前脂肪細胞株，將該3T3-L1前脂肪細胞株置入24孔盤，細胞數量為每孔1×104細胞。所有細胞係以含有10%胎牛血清之培養液(Dulbecco's Modified Eagle Medium;DMEM)，於37℃，5%二氧化碳之培養箱中培養。每兩天更換一次培養液。等到細胞長滿平面後，此即為分化第0天，此時，將培養液置換成含外源性分化試劑之分化培養液(differentiation medium;DM)以促進細胞分化，其中，外源性分化培養液為1.74μM胰島素(insulin)、0.86mM皮質類固醇激素(dexamethasone;DEX)和0.5mM異丁基甲基花黃素(isobutyl-methylxanthine;IBMX)。並自分化第2天及其後每2天分別更換含有1.74uM胰島素之培養液，直到分化第8天，此時，培養分化出之成熟3T3-L1脂肪細胞。
實例三：測定3T3-L1脂肪細胞之丙三醇釋放量
取實例二中所培養之3T3-L1脂肪細胞，先以磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline;PBS)清洗細胞，再分別加入含有實例一中依照不同變數所得大豆蛋白水解物400ppm之培養液，培養至分化第11天。
收集脂肪細胞培養液30μL與檢測試劑(GY105)混合，於室溫下反應5分鐘，檢測波長520nm之吸光值，換算出脂肪細胞外丙三醇釋放量，結果如下表二所示。
表二：3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量
由上表二之實驗結果，依據中心混層實驗設計所分析得到對於3T3-L1脂肪細胞之丙三醇釋放量介於339.27～352.79 nmol/mg protein之間。
實例四：分析大豆蛋白水解物最適水解條件
將表二中所得之19個結果利用統計軟體(statistical analysis system)之反應曲面回歸分析(RSREG)獲得一個二次模型多項式，如下所示：
Y=55.43+68.35X1+3.12X2-0.24X3-5.67X1 2-0.04X2 2-0.0011X3 2+0.094X1X2+0.0634X1X3+0.0012X2X3
而根據上述多項式，分別固定一變數，以其餘兩雙數繪製出曲面圖，結果如第一至三圖所示，其中，第一圖係固定水解時間為120分鐘，以反應酸鹼值與反應溫度對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之影響，第二圖係固定反應溫度為50℃，反應酸鹼值與水解時間對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之影響，第三圖係固定反應酸鹼值為7時，水解時間與反應溫度對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之影響。
綜合第一至三圖之結果，可知大豆蛋白之最適水解條件範圍係為酸鹼值為7～7.5間、水解時間為100～150分鐘、反應溫度為40～50℃時，大豆蛋白水解物對於3T3-L1脂肪細胞有最高丙三醇之釋放量，並可進一步依照實驗結果所得之二次模型多項式，估計出最適水解條件為反應酸鹼值為7.12、反應溫度為48.8℃以及水解時間為124.9分鐘時，所得之大豆蛋白水解物對於3T3-L1脂肪細胞具有最大之丙三醇釋放量。
更進一步依照估算出之最適水解條件進行六次獨立之水解反應，用以驗證，結果如下表三所示。
表三：最適水解條件之驗證結果
顯示大豆蛋白水解物對於3T3-L1脂肪細胞之丙三醇釋放量實測值為359.92 nmol/mg protein，預測值亦坐落在實驗值的95%信心區間。因此，依照最適水解條件進行水解反應的確會使大豆蛋白水解物具有最大丙三醇釋放量，即最大的促脂解作用。
實例五：以濾膜區分大豆蛋白水解物
於本實例中，係使用不同分子量限值(molecuiar weight cut-off;MWCO)之濾膜依序進行區分大豆蛋白水解物。
首先，將分離大豆蛋白以風味蛋白酶於實例四所得最適水解條件下，進行水解反應而得到一大豆蛋白水解物。將該大豆蛋白水解物經離心後所收集之上清液依序以30 kDa、10 kDa以及1 kDa之分子量限值濾膜處理，收集不同分子量限值區間之濾膜區分物，即30 kDa保留液、10 kDa保留液、1 kDa之濾液及1 kDa保留液。將各該區分物經凍乾後以相同克數回溶，利用高效能液向層析(High performance liquid chromatography;HPLC)系統搭配膠體管柱檢測各該區分物之分子量分布情形，結果如第四圖所示。
顯示大豆蛋白水解物依標準品分子量包括12588、6512、2126、189與75 Da，評估其分子量分布主要以大於12588 Da為主，小於12588 Da之胜肽片段相對較少。大豆蛋白水解物之30 kDa保留液分子量大多集中在大於12588 Da；10 kDa保留液分子量則以12588 Da為主，並含有小部分區分物分子量介於6512-12588 Da間；1 kDa保留液之分子量則包含2126-12588 Da以及殘留小於2126 Da之片段，1 kDa濾液之分子量分布則大多小於2126 Da。
實例六：測定不同濾膜區分物之丙三醇釋放量
取實例五中400 ppm之大豆蛋白水解物以及各該濾膜區分物，本實例步驟如同實例三，用以測定各該濾膜區分物對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之影響，結果如第五圖所示，其中，控制組為完全無添加大豆蛋白水解物或是各濾膜區分物者。
由第五圖之結果顯示添加大豆蛋白水解物可顯著促進脂肪細胞丙三醇釋放達363.13 nmol/mg protein，而10 kDa保留液、1 kDa保留液與1 kDa濾液亦皆可顯著提升丙三醇釋放量，僅30 kDa保留液與控制組無顯著差異，其中，又以1 kDa保留液具有最高丙三醇釋放量378.19 nmol/mg protein。
實例七：測定不同濾膜區分物之三酸甘油脂殘留量
取實例二中所培養之3T3-L1脂肪細胞，先以磷酸鹽緩衝液清洗細胞，再分別加入含有實例五中400 ppm之大豆蛋白水解物或是各該濾膜區分物之培養液，培養至分化第11天。以磷酸鹽緩衝液沖洗細胞後，加入裂解緩衝液(lysis buffer)使細胞破碎，以13000 xg離心10分鐘，取10 μL上清液與1 ml檢測試劑(TR213)混合，於室溫下反應5分鐘，檢測波長500nm之吸光值，換算出可知脂肪細胞內三酸甘油酯殘留量(μmol/mL)，結果如第六圖所示，其中，控制組為完全無添加大豆蛋白水解物或是各濾膜區分物者。
由第六圖之結果顯示，經過400 ppm大豆蛋白水解物處理之三酸甘油酯殘留量為2.42 μmol/mg protein，係顯著低於控制組的3.08 μmol/mg protein，而各該濾膜區分物皆可顯著降低三酸甘油酯殘留量，又以1 kDa保留液所處理過之脂肪細胞具有最低三酸甘油酯殘留量2.16 μmol/mg protein，並顯著低於經大豆蛋白水解物處理之脂肪細胞。
藉由實例六及七之結果，相較於未區分之大豆蛋白水解物，經濾膜區分後之1 kDa保留液係將脂肪細胞外丙三醇釋放量由原本增加15%轉變為增加為20%，脂肪細胞內三酸甘油酯殘留量也由原本降低21%更減少為30%。因此，可推知1 kDa保留液係具有最佳促脂解活性。
實例八：製備自大豆蛋白水解物區分出之1kDa保留液
如同實例一所述流程，首先，先取分離2.5%大豆蛋白以及風味蛋白酶，於反應酸鹼值7.0、反應溫度50℃、水解時間2小時下之條件，進行水解，而得到一大豆蛋白水解物。
再依據實例五之所述流程，將大豆蛋白水解物依序以30 kDa、10 kDa以及1 kDa之分子量限值濾膜處理，並收集其1kDa保留液以供下列實例之用。
實例九：荷爾蒙敏感性脂解酶(HSL)之表現量
取實例二中所培養之3T3-L1脂肪細胞，再以含有實例八中所製備之1kDa保留液50ppm之培養液，於預定環境下分別培養12、24、48以及72小時。而後將3T3-L1脂肪細胞以緩衝液清洗2次，再以裂解緩衝液使脂肪細胞破碎，取濃度約為10μg之細胞破碎液與緩衝液混合，於95℃加熱後，以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳片(SDS-PAGE)進行電泳將蛋白質分離，將蛋白質轉漬於聚二氟乙烯膜上。而後分別利用荷爾蒙敏感性脂解酶一級抗體、磷酸化之荷爾蒙敏感性脂解酶一級抗體以及二級抗體進行免疫印跡分析，用以辨識目標蛋白質，結果如第七圖及第八圖所示。
由第七圖之結果顯示，於添加大豆蛋白水解物之1kDa保留液之環境下，經培養24、48以及72小時後之脂肪細胞，荷爾蒙敏感性脂解酶表現量逐漸減少，又以於培養72小時之脂肪細胞，其荷爾蒙敏感性脂解酶表現量顯著減少。
而由第八圖之結果顯示，於添加大豆蛋白水解物之1kDa保留液之環境下，經培養48及72小時後之脂肪細胞，被磷酸化之荷爾蒙敏感性脂解酶表現量顯著增加。
因此，綜合上述結果，可推知以添加大豆蛋白水解物之培養液培養48或72小時後，脂肪細胞內之荷爾蒙敏感性脂解酶減少，而促進荷爾蒙敏感性脂解酶磷酸化之情形增加，使得磷酸化荷爾蒙敏感性脂解酶表現增加，提昇脂解活性。
實例十：以免疫染色法分析荷爾蒙敏感性脂解酶(HSL)之移位作用
由實例九可知經過培養48及72小時之脂肪細胞顯著增加荷爾蒙敏感性脂解酶磷酸化之情形，因此，於本實例中係分別取經過培養48及72小時之脂肪細胞，以含有4%福馬林以及0.01%生物介面活性劑(Triton X-100)之磷酸緩衝液(PBS)，於室溫下固定20分鐘，而後再以磷酸緩衝液沖洗3次。再加入低溫甲醛完全覆蓋於該脂肪細胞而置於冰箱內，使脂肪細胞內特異性結合點被5%正常血清所阻斷，並以磷酸緩衝液(PBS)沖洗3次。進行螢光染色，先以抗荷爾蒙敏感性脂解酶磷酸化之兔子多株抗體於4℃培養一個晚上，再以螢光標記之驢抗兔二級抗體(FITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG)於室溫下1小時。以螢光顯微鏡觀察免疫螢光，結果如第九圖所示。
結果顯示經過大豆蛋白水解物1kDa保留液之48及72小時之刺激，相較於控制組，荷爾蒙敏感性脂解酶有明顯向脂肪細胞周圍油滴聚集之現象，使細胞中油滴周圍免疫螢光強度顯著增強，如第九圖中左邊兩小圖內之亮環所示。因此，可得知經由大豆水解物處理後之脂肪細胞，其荷爾蒙敏感性脂解酶有明顯向油滴聚集，產生移位作用(translocation)至油滴進行脂解反應。
實例十一：以膠體層析法區分大豆蛋白水解物1 kDa保留液
取大豆蛋白水解物1 kDa保留液並配製成適當濃度，經由0.22 μm濾膜過濾後，進行注射500 μL，並以30%乙腈(acetonitrile)為移動相，於流速為0.5 mL/min下，偵測波長為280 nm的吸光值，結果如第十圖所示，其依照吸收波峰起伏情況可區分為4個區段，並配合分子量標準品對照後，顯示獲得該4個分子量不同之膠體區分片段(gel filtrate)，分別為分子量大於6512 Da之GF1區分片段、分子量介於2080-6512 Da之GF2區分片段、分子量介於189-2080 Da之GF3區分片段以及分子量小於189 Da之GF4區分片段。
實例十二：測定不同膠體區分片段之丙三醇釋放量
取實例十一所分離出之GF1~GF4區分片段、實例五中未區分之大豆蛋白水解物以及其1 kDa保留液，分別添加入3T3-L1脂肪細胞之培養液中。如同實例三之測定流程，測定各該區分片段對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量，結果如第十一圖所示，其中，控制組為完全無添加大豆蛋白水解物或是各區分物者。
由第十一圖之結果顯示GF2及GF4區分片段對於脂肪細胞丙三醇釋放量與控制組比較均無顯著差異，而GF1與GF3區分片段相較於控制組可顯著提升丙三醇釋放量，即從控制組基礎釋放量314.79 nmol/mg protein分別提升至415.23 nmol/mg protein與487.73 nmol/mg protein。又，GF1區分片段與1kDa保留液之間對於丙三醇釋放量經統計分析後無顯著差異，而GF3區分片段則顯著高於1kDa保留液。
實例十三：測定不同膠體區分片段之三酸甘油酯殘留量
取實例十一所分離出之GF1~GF4區分片段、實例五中未區分之大豆蛋白水解物以及其1 kDa保留液，分別添加入3T3-L1脂肪細胞之培養液中。取實例二中所培養之3T3-L1脂肪細胞，經過磷酸鹽緩衝液清洗後，分別培養至分化第11天。如同實例七之檢測步驟，分別測定各該區分片段對於3T3-L1脂肪細胞內三酸甘油酯殘留量，結果如第十二圖所示，其中，控制組為完全無添加大豆蛋白水解物或是各區分物者。
由第十二圖中可清楚地得知，GF1～GF4區分片段相較於控制組，皆可顯著降低脂肪細胞中三酸甘油酯殘留量。更進一步觀察，將GF2與GF4該二區分片段與1 kDa保留液相比對，顯示三者間之三酸甘油酯殘留量並無顯著差異，而另觀GF3區分片段則具有最低三酸甘油酯殘留量1.95 μmol/mg protein，且顯著低於GF1區分片段的2.11 μmol/mg protein。
綜合實例十二及十三之結果，指出經由膠體層析後所獲得之GF3區分片段可提昇55%丙三醇釋放量，且相對減少36%之三酸甘油酯殘留量，因此，可確認GF3區分片段係為具有較佳促進脂解活性之胜肽片段。
實例十四：以不同大豆蛋白水解物GF3區分片段添加劑量測定丙三醇釋放量
將大豆蛋白水解物GF3區分片段分別配置為濃度0.5、1、2、4、25、100以及400 ppm，分別添加於3T3-L1脂肪細胞之培養液中，進行培養。而後再收集培養液30μL與檢測試劑混合，於室溫下反應5分鐘，檢測波長520nm之吸光值而換算出添加不同濃度之GF3區分片段對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量，結果如第十三圖所示，其中，未添加大豆蛋白水解物或是GF3區分片段為控制組。
結果顯示無論添加何種濃度之GF3區分片段皆可顯著提昇脂肪細胞丙三醇釋放量，而濃度為1～400 ppm之GF3區分片段所得丙三醇釋放量又顯著高於濃度為0.5 ppm之GF3區分片段，並且，添加劑量為2 ppm以及4 ppm時具有最大丙三醇釋放量，可提升61%之丙三醇釋放量。
實例十五：以不同大豆蛋白水解物GF3區分片段添加劑量測定三酸甘油脂殘留量
將大豆蛋白水解物GF3區分片段分別配置為濃度0.5、1、2、4、25、100以及400 ppm，分別添加於3T3-L1脂肪細胞之細胞培養液中，進行培養。檢測步驟等同實例七，係以波長500nm分別檢測，換算出各該脂肪細胞內三酸甘油酯之殘留量，結果如第十四圖所示，其中，未添加大豆蛋白水解物或是GF3區分片段為控制組。
將本實例所測得結果與控制組相比較，添加0.5～400 ppm GF3區分片段均可顯著降低脂肪細胞中三酸甘油酯殘留量，其中，添加劑量為2 ppm、4 ppm與25 ppm時均有最低三酸甘油酯殘留量，但之間並無顯著差異。
綜合實例十四及十五之結果，顯示GF3區分片段添加劑量為0.5 ppm以上時，對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量即有顯著的影響，又當添加劑量為4 ppm可達最大丙三醇釋放量，並可使脂肪細胞內三酸甘油酯殘留量分別從3.11 umol/mg protein減少為1.69 umol/mg protein。因此，經統計分析結果顯示GF3區分片段添加劑量為4 ppm係有最佳促脂解活性。
實例十六：以高效能液相層析法分離GF3區分片段
首先，取實例十一所分離出之將GF3區分片段製備至預定濃度，使用DevelosilTM ODS-HG-5逆相層析管柱，以高效能液相層析系統(HP 1100 series)進行分離純化，注射量為20 μL，移動相為去離子水與乙腈，乙腈於滯留時間0~20分鐘自5%提升至75%，進行梯度沖提，流速為每分鐘1.0毫升進行分離，偵測波長為214 nm，結果如第十五圖所示之圖譜，其中，圖譜訊號係大致區分為四個區段，分別為HF1區段(HPLC filtrate 1)、HF2區段(HPLC filtrate 2)、HF3區段(HPLC filtrate 3)以及HF4區段(HPLC filtrate 4)，並將此四個區段分別收集凍乾後供以下實例之用。
實例十七：測定HF1~HF4各區段之丙三醇釋放量
首先，取實例十六中所收集之HF1~HF4區段分別4 ppm，分別添加於3T3-L1脂肪細胞之細胞培養液中，進行培養脂肪細胞至分化第11天，而後流程係如同實例三中所述，以520nm波長檢測各該脂肪細胞培養液與檢測試劑混合物之吸光值，而得知丙三醇釋放量，結果如第十六圖所示，其中，控制組為未添加任何大豆蛋白水解物及其區分片段。
由第十六圖中可清楚得知HF2、HF3與HF4區段相較於控制組，皆對脂肪細胞丙三醇釋放量有顯著提升，又以HF4區段之影響最為顯著，亦明顯高於未分離之GF3區分片段，使脂肪細胞外丙三醇釋放量由基礎釋放量317.15 nmol/mg protein提升83% 581.63 nmol/mg protein。
實例十八：測定HF1~HF4各區段之三酸甘油脂殘留量
取實例十六中所收集之HF1~HF4區段分別4 ppm，分別添加於3T3-L1脂肪細胞之細胞培養液中作為細胞培養液之成份，進行培養脂肪細胞至分化第11天，而後流程係如實例七中所述，將脂肪細胞碎裂離心後，再以520nm波長檢測，換算出各該脂肪細胞內三酸甘油酯殘留量，結果如第十七圖所示，其中，控制組為未添加任何大豆蛋白水解物及其區分片段者。
結果顯示HF4片段和控制組相比之下，對脂肪細胞三酸甘油酯殘留量有顯著下降，並將三酸甘油酯由基礎殘留量3.12 μmol/mg protein減少52%至1.5 μmol/mg protein，且HF4片段對脂肪細胞三酸甘油酯殘留量亦顯著低於GF3區分片段。
因此，由實例十七及十八之結果可推知由GF3區分片段中所分離出之HF4片段係具有最佳脂解活性。
實例十九：以高效能液相層析法分離HF4片段
由第十五圖可知HF4片段為疏水性胜肽片段，為了進一步確定HF4片段是否為單一片段，於本實例中將該HF4片段再次以DevelosilTM ODS-HG-5逆相層析管柱進行第二次分離，注射量為20 μL，移動相為去離子水與乙腈，乙腈於滯留時間0~15分鐘自10%提升至40%進行梯度沖提，流速為每分鐘1.0毫升。
結果如第十八圖所示，依照圖譜波峰分別收集到RHF4-1片段(repeat HF4-1)、RHF4-2片段(repeat HF4-2)以及RHF4-3片段(repeat HF4-3)。
實例二十：測定RHF-1~RHF-3片段之丙三醇釋放量
首先，取實例十九中所收集之RHF-1~RHF-3片段，分別添加4 ppm於3T3-L1脂肪細胞之細胞培養液中，進行培養脂肪細胞至分化第11天，而後流程係如同實例三中所述，以520nm波長檢測各該脂肪細胞培養液之吸光值，換算出對於脂肪細胞丙三醇釋放量，結果如第十九圖所示，其中，控制組為未添加任何大豆蛋白水解物者及其區分物。
由第十九圖可知，相較於控制組之丙三醇釋放量，RHF4-2與RHF4-3片段係顯著提升脂肪細胞丙三醇釋放量，分別提升84%與95%至580.59 nmol/mg protein與615.87 nmol/mg protein。
實例二十一：測定RHF-1~RHF-3片段之三酸甘油酯殘留量
取實例十九中所收集之RHF4-1~RHF4-3片段，分別添4 ppm於3T3-L1脂肪細胞之細胞培養液中作為細胞培養液之成份，進行培養脂肪細胞至分化第11天，而後流程係如實例七中所述，將脂肪細胞碎裂離心後，以520nm波長檢測吸光值，換算出各該脂肪細胞內三酸甘油酯殘留量，結果如第二十圖所示，其中，控制組係未添加任何大豆蛋白水解物及其區分物。
該實例結果顯示RHF4-2與RHF4-3片段對於脂肪細胞三酸甘油酯殘留量由控制組3.1 μmol/mg protein分別減少54%與57%至1.42 μmol/mg protein與1.34 μmol/mg protein，皆可顯著降低三酸甘油酯於脂肪細胞中之殘留量。
綜合實例二十及二十一之結果，可推知RHF4-2與RHF4-3片段係為具有較佳脂解功效之片段。
實例二十二：鑑定RHF4-2及RHF4-3片段
將RHF4-2片段與RHF4-3片段分別經由液相層析串聯質譜儀(LC/MS/MS)進行質譜分析；將質譜訊號圖譜經由圖譜指紋資料庫比對結果如第二十一圖與第二十二圖所示，其中，第二十一圖係RHF4-2片段之質譜圖，第二十二圖係為RHF4-3片段之質譜圖。
由第二十一圖可判別出RHF4-2片段係為由三個胺基酸所構成之三胜肽(tripeptide)，其中，各該胺基酸分別可為leucine(Leu)或isoleucine(Ile)，因此，RHF4-2片段之胺基酸序列組合共有八種：Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Ile、Leu-Ile-Leu、Leu-Ile-Ile、Ile-Leu-Leu、Ile-Leu-Ile、Ile-Ile-Leu與Ile-Ile-Ile。
而第二十二圖係顯示RHF4-3片段係由胺基酸序列為Val-His-Val-Val所構成之四胜肽(tetrapeptide)。
實例二十三：測定化學合成胜肽脂解活性
本實例係以細胞模式測定化學合成胜肽Ile-Ile-Ile(III)、Ile-Leu-Leu(ILL)、Leu-Leu-Leu(LLL)和Val-His-Val-Val(VHVV)之脂解活性。
分別取實例十九中所分離出之之RHF4-2片段、RHF4-3片段以及上述四段化學合成胜肽4 ppm添加於脂肪細胞培養液，檢測丙三醇釋放量及三酸甘油酯殘留量之流程分別如同實例三以及實例七，係分別以波長520nm以及500nm檢測吸光值，換算出脂肪細胞丙三醇釋放量及三酸甘油酯殘留量，結果如第二十三圖及第二十四圖所示，其中，第二十三圖係為RHF4-2片段、RHF4-3片段以及化學合成胜肽對3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之結果，第二十四圖係為RHF4-2片段、RHF4-3片段以及化學合成胜肽對3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯之結果，而第二十三及二十四圖中之控制組係為未加入任何大豆蛋白水解物及其區分片段者。
由第二十三圖之結果顯示RHF4-2片段與化學合成胜肽Ile-Leu-Leu、Leu-Leu-Leu相較於控制組，對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量皆顯著提升，分別從控制組之基礎釋放量312.3 nmol/mg protein提升至581.61 nmol/mg protein、540.81 nmol/mg protein與571.2 nmol/mg protein；而RHF4-3片段與化學合成胜肽序列Val-His-Val-Val之丙三醇釋放量則顯著高於控制組，分別由312.3 nmol/mg protein提升614.4 nmol/mg protein與682.91 nmol/mg protein。
因此，不論係為化學合成胜肽Ile-Leu-Leu、Leu-Leu-Leu、Val-His-Val-Val或是RHF4-2片段以及RHF4-3片段皆可增進脂肪細胞丙三醇釋放量。
而由第二十四圖結果可知RHF4-2片段與化學合成胜肽Ile-Ile-Ile、Ile-Leu-Leu、Leu-Leu-Leu相較於控制組，對3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯殘留量皆顯著降低，其中，Ile-Leu-Leu、Leu-Leu-Le分別使基礎殘留3.2 μmol/mg protein減少至1.46 μmol/mg protein、1.41 μmol/mg protein與1.34 μmol/mg protein；RHF4-3片段與化學合成胜肽Val-His-Val-Val對3T3-L1脂肪細胞之三酸甘油酯殘留量皆顯著低於控制組，皆由3.2 μmol/mg protein減少至1.36 μmol/mg protein。
由本實例之結果可推定化學合成胜肽Ile-Ile-Ile具有抗脂質生成活性，而化學合成胜肽Ile-Leu-Leu、Leu-Leu-Leu與Val-His-Val-Val則具有促脂質分解活性。
實例二十四：模擬腸胃道消化試驗
分別配製1%化學合成胜肽Leu-Leu-Leu、Val-His-Val-Val於酸鹼值pH 2.0之0.1M氯化鉀-氯化氫緩衝溶液中，並分別置於反應槽待中心溫度達37℃，加入胃蛋白酶(酵素與受質比例為1：25)作用4小時以模擬胃的消化環境，之後以2N氫氧化鈉調整酸鹼值至中性，取部份樣品以沸水加熱15分鐘使酵素失活後凍藏備用；其餘樣品續以胰酵素(pancreatin)(酵素與受質比例為1：25)作用4小時模擬腸之消化環境，再行取樣以沸水浴加熱15分鐘使酵素失活，待冷卻後凍藏備用。
將經過胃腸模擬試驗之各該凍藏樣品經回溫後離心10,000×g、40分鐘，取上清液以0.22 μm濾膜過濾後，分別添加入脂肪細胞培養液中，進行脂肪細胞培養至分化第11天，而後依據實例三及實例七所述流程，將各該細胞培養液以及離心後之上清液經處理後，分別以500nm、520nm波長檢測其吸光值，換算出各該脂肪細胞之丙三醇釋放量及三酸甘油酯殘留量，結果如第二十五圖至第二十八圖所示，其中，各圖中之控制組係為未添加任何經處理過之化學合成胜肽者。
由第二十五圖至第二十八圖可知，不論係為受腸胃道酵素水解後之化學活性肽Leu-Leu-Leu或是Val-His-Val-Val，兩者皆對於脂肪細胞之丙三醇釋放量以及三酸甘油酯殘留量係顯著高於控制組。因此，化學活性肽Leu-Leu-Leu或是Val-His-Val-Val不易受腸胃道酵素破壞，仍有促脂解活性。
實例二十五：胰島素影響試驗
將脂肪細胞培養液中分別添加化學合成胜肽Leu-Leu-Leu及Val-His-Val-Val，並再分別添加胰島素，進行脂肪細胞培養，而後流程依據實例三級實例七所述，分別以不同吸光值檢定出各該脂肪細胞之丙三醇釋放量及三酸甘油酯殘留量，結果如第二十九及第三十圖所示，其中，控制組係未添加化學合成胜肽，僅添加胰島素。
由結果可知化學合成胜肽Leu-Leu-Leu及Val-His-Val-Val於胰島素作用之環境下，相較於控制組，亦顯著提昇脂肪細胞之丙三醇釋放量及顯著降低脂肪細胞之三酸甘油酯殘留量。因此，於胰島素作用下，化學合成胜肽Leu-Leu-Leu及Val-His-Val-Val仍具有脂解活性。
由上面各實例之說明，可知本發明所提供之最適水解條件確可獲得具有促脂解活性最高之大豆蛋白水解物，使得脂肪細胞具有最佳之丙三醇釋放量；且大豆蛋白水解物確可使荷爾蒙敏感性脂解酶磷酸化，增加脂解反應。再者，藉由分析純化之方法，分離出大豆蛋白水解物中具有脂解活性之單一胜肽片段，明顯提昇脂肪細胞丙三醇釋放量以及降低三酸甘油酯殘留量，並進一步鑑定出各該片段可能之胺基酸序列。此外，亦利用腸胃道模擬試驗以及胰島素影響試驗，得之化學合成胜肽不易受消化道酵素破壞及受胰島素影響，對於應用於生物體上，仍可具有促脂解活性，是以，未來係將自大豆蛋白中所分離純化之單一胜肽片段應用於具有減肥功效之醫藥組成物或是相關健康食品內，對於國民健康有確切之助益，有效地降低肥胖發生率。
上述說明係針對本發明之可行實施例之具體說明，為該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技術特徵所為之等效實施或是變更，均應包含於本案之專利範圍中。
第一圖係於水解時間為120分鐘下，反應溫度與反應酸鹼值對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之影響。
第二圖係於反應溫度為攝氏50度下，水解時間與反應酸鹼值對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之影響。
第三圖係於反應酸鹼值為7，反應溫度與水解時間對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之影響。
第四圖係為大豆蛋白水解物經不同分子量限值濾膜所區分出之區分物之分子量分布圖。
第五圖係為大豆蛋白水解物及其濾膜區分物對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第六圖係為大豆蛋白水解物及其濾膜區分物對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯釋放量之直條圖。
第七圖係為添加大豆蛋白水解物1 kDa保留液經不同培養時間對於3T3-L1脂肪細胞中荷爾蒙敏感性脂解酶表現量之電泳圖及其量化直條圖。
第八圖係為添加大豆蛋白水解物1 kDa保留液經不同培養時間對於3T3-L1脂肪細胞中磷酸化荷爾蒙敏感性脂解酶表現量之電泳圖及其量化直條圖。
第九圖係為添加大豆蛋白水解物1 kDa保留液經不同時間處理3T3-L1脂肪細胞之免疫螢光染色圖。
第十圖係為大豆蛋白水解物1 kDa保留液之膠體管柱區分圖譜。
第十一圖係為大豆蛋白水解物1 kDa保留液及其膠體管柱區分物對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第十二圖係為大豆蛋白水解物1 kDa保留液及其膠體管柱區分物對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯釋放量之直條圖。
第十三圖係為大豆蛋白水解物GF3區分片段之不同添加劑量與3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第十四圖係為大豆蛋白水解物GF3區分片段之不同添加劑量與3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯殘留量之直條圖。
第十五圖係為大豆蛋白水解物GF區分片段之高效能液相層析圖譜。
第十六圖係為大豆蛋白水解物GF3區分片段及其逆相層吸管柱區分物對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第十七圖大豆蛋白水解物GF3區分片段及其逆相層吸管柱區分物對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯殘留量之直條圖。
第十八圖係為大豆蛋白水解物HF4片段之高效能液相層析圖譜。
第十九圖係為大豆蛋白水解物HF4片段及其逆相層吸管柱區分物對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第二十圖係為大豆蛋白水解物HF4片段及其逆相層吸管柱區分物對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯殘留。
量之影響。
第二十一圖係為大豆蛋白水解物RHF4-2片段之質譜圖。
第二十二圖係為大豆蛋白水解物RHF4-3片段之質譜圖。
第二十三圖係為大豆蛋白水解物RHF4-2及RHF4-3片段與化學合成胜肽對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第二十四圖係為大豆蛋白水解物RHF4-2及RHF4-3片段羽化學合成胜肽對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯釋放量之直條圖。
第二十五圖係為化學合成胜肽Leu-Leu-Leu經腸胃道消化酵素水解後對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第二十六圖係為化學合成胜肽Val-His-Val-Val經腸胃道消化酵素水解後對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第二十七圖係為化學合成胜肽Leu-Leu-Leu經腸胃道消化酵素水解後對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯殘留量之直條圖。
第二十八圖係為化學合成胜肽Val-His-Val-Val經腸胃道消化酵素水解後對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯殘留量之直條圖。
第二十九圖係為化學合成胜肽Leu-Leu-Leu及Val-His-Val-Val分別於胰島素作用之環境下對於3T3-L1脂肪細胞丙三醇釋放量之直條圖。
第三十圖係為化學合成胜肽Leu-Leu-Leu及Val-His-Val-Val分別於胰島素作用之環境下對於3T3-L1脂肪細胞三酸甘油酯殘留量之直條圖。

Claims (16)

  1. 一種製備促脂解大豆蛋白水解物之方法，主要係將一配置為預定濃度之大豆蛋白，加入一預定量之風味蛋白酶(Flavourzyme)於一水解條件下，進行水解反應，而得到大豆蛋白水解物，其中：該水解條件係如下：反應酸鹼值介於7～7.5間；反應溫度為40～50℃；水解時間為100～150分鐘。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述方法，其中，該大豆蛋白係可選自由分離大豆蛋白、大豆蛋白粉、濃縮大豆蛋白所組成之群。
  3. 依據申請專利範圍第1或2項所述方法，其中，該風味蛋白酶與該大豆蛋白之比例為1：100。
  4. 依據申請專利範圍1或2項所述方法，其中，該反應酸鹼值係為7.12。
  5. 依據申請專利範圍1或2項所述方法，其中，該反應溫度為攝氏48.8度。
  6. 依據申請專利範圍第1或2項所述方法，其中，該水解時間係為124.9分鐘。
  7. 一種單離之機能性蛋白質，其胺基酸序列為Val-His-Val-Val。
  8. 依據申請專利範圍第7項所述蛋白質，其係用以提昇生物體中脂肪細胞丙三醇之釋放量。
  9. 依據申請專利範圍第7或8項所述蛋白質，其係以風味蛋白酶(Flavourzyme)水解一大豆蛋白所得。
  10. 依據申請專利範圍第9項所述蛋白質，其中，該大豆蛋白係可選自由分離大蛋白、大豆蛋白粉、濃縮大豆蛋白所組成之群。
  11. 一種單離之機能性蛋白質，係由三個胺基酸所組成之序列所構成者，其中：第一個胺基酸係可選自由Leu及Ile所組成之群；第二個胺基酸係可選自由Leu及Ile所組成之群；第二個胺基酸係可選自由Leu及Ile所組成之群。
  12. 依據申請專利範圍第11項所述蛋白質，其係用以提昇生物體中脂肪細胞丙三醇之釋放量。
  13. 依據申請專利範圍第11或12項所述蛋白質，其係以風味蛋白酶(Flavourzyme)水解一大豆蛋白所得。
  14. 依據申請專利範圍第13項所述方法，其中，該大豆蛋白係可選自由分離大豆蛋白、大豆蛋白粉、濃縮大豆蛋白所組成之群。
  15. 一種用以減肥之醫藥組成物，其有效成份係為一機能性蛋白質，其中，該蛋白質之胺基酸序列係可選自下列(1)及(2)所組成之群者；(1)Val-His-Val-Val；(2)由三個胺基酸所排列組成之序列，其中：第一個胺基酸係可為Leu或Ile；第二個胺基酸係可為Leu或Ile；第三個胺基酸係可為Leu或Ile。
  16. 依據申請專利範圍第15項所述醫藥組成物，其中，該機能性蛋白質係為大豆蛋白水解物。
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