TW201237408A - Real-time monitor solid phase peptide synthesis by mass spectrometry - Google Patents

Description

201237408 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本申請案主張2010年10月28日所申請之美國臨時申 請專利案號61/408,072之優先權效益，此美國臨時專利申 請號61/408,072的全部内容係納入此處參考。 本發明係提供了一種在大氣壓力下即可線上檢測胜肽 中間體或產品之即時監測固相胜肽合成（SPPS)系、统和方 法。本發明同時也證實了此即時監測系統能追蹤固相胜肽 合成中的每一個步驟並確認反應完成程度。本發明之另一 態樣係提供了一種能乘載固態樣品之樣品載台，此載台能 影響雷射脫附及電喷灑游離質譜之分析穩定度及靈敏度 ' 【先前技術】 組合化學（combinatorial chemistry)為一種能同時很 快地製造出大量不同的化合物並快速篩選出有用化合物的 一種技術。如胜肽分子資料庫能被用於篩選酵素之受質及 抑制劑或者細胞結合肽（cell binding peptides)。不像傳統 合成方法—次只能處理一種類型的分子，組合化學為一種 用來=發新藥、催化劑及材料的重要工具。由於胜肽分子 具有尚特異性及低毒性的性質，目前已有數百種的胜肽藥 ，進入臨床試驗的階段或已上市。預期後續對胜肽藥物的 而求將會大量增加’而利用組合化學之化學,合成方法將扮 演重要的角色。 各種不同的化學合成法中，在1963年美國紐約洛克斐 勒大學的Merrifiled教授首次報導了胜肽的固相合成 SPPS)’而後因其具備了簡單的反應步驟及容易將產物純化 3 201237408 分離而成為發展組合化學的重大突破。此方法 體個广旨或塑膠探針構成的不溶性支撐 體並且將其他帶有保護基的胺基酸依序麵合接上而 所欲之序列。_合齡法可財每-個步較 反應試劑來趨使反應完全並利用反覆的清洗而達到純化^ 目的。此方法依靠高效率的化學合成步驟發展出自動化 ，肽製備流程而省去多餘且耗時的純化流程。因此，在新 藥的開發中’利用固相化學合成之組合資料庫已成為例行 性的策略。 然而，固相化學合成仍存在著一些缺點，特別是在分 析方面。儘管質譜儀能為組合資料庫提供高通量的分析， 但大多數分子因不具備適當的游離特性而使這項技術無法 普及。此外，使用一般光譜檢測方法來進行多步驟之化學 合成的線上監測，皆要求樣品必須脫離固相支撐體的研究 下/谷解樣品。通常胜肽化合物的彳貞測都是在一個合成階段 的反應完成後才進行此乃因為此時胜肽會從固相支撐體水 解釋放進入溶液中才能進行偵測。而將樣品從固相支撐體 切下（cleavage)再去進行分析的策略應用於品質管控及反 應監測上會導致幾個缺點。此種化合物評估的型式不僅對 中間體造成破壞也造成樣品的浪費，且為了自固相支撐體 切下樣品所使用的裂解試劑（cleavage reagents)也可能產 生副反應（side-reactions)’而造成質譜圖的複雜性，使得胜 肽產物的確定更為困難。 已有數篇報導（Michael C. F. et al.，厶/oorgawc ά Chemistry Letters, Vol. 6, 979-982, 1996; Stephen C. M. et al., 办on 他π Vol· 40, 2407-2410, 1999)顯示基質輔助雷 射脫附游離飛行式質譜儀（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF)能 201237408 被用來分析一些以易光解的連接子（photolabile linker)連 接在固相樹脂上且被Fmoc所保護的胺基酸或胜肽化合 物。其他的文獻（Delphine M. et al_，Jowwiz/ ς/* 伽 吵，Vol. 12,1099-1105,2001)也報導了 利用飛行時間二次離子質譜儀（Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometer，TOF-S-SIMS)在不需要樣品前處理 的步驟下直接偵測連結在固體支撐物上的分析物。然而， 不管是MALDI-TOF或TOF-S-SIMS，兩者均須在高真空的 環境下進行脫附以及游離的操作步驟，因此仍不是監測全 程固相胜肽合成反應的最佳策略。 本發明提供了一種能直接線上即時監測固相胜肽合成 的分析系統，此系統可在大氣壓力下分析，樣本不需處在 尚真空的環境下分析，因此也提高了線上分析的可行性。 此系統對待測樣品並不具破壞性或僅有極小的破壞性，因 此不但可以確實監測合成的品質，並且不會降低合成的產 〇 【發明内容】 本發明係提供一種能在大氣壓力下即時監測固相胜肽 =成分析系統的一種實施態樣，此系統能直接線上分析連 結在固相支撐體之胜肽中間體或產物。整個偵測流程只需 要將固相合成之樣品置於有機溶劑之中再以脈衝雷射照 射，胜肽與固相支撐體（如樹脂）中的化學鍵斷裂後，整^ 產物與電嘴灑游離團融合而後發生游離，並進入質^ 士、,、斤（如圖11)。發明人也成功的驗證本發明可以利質 f儀直接偵測連接於樹脂上的胜肽產物，而省略以酸性試 d將產物自樹脂切下等化學前處理步驟。 5 201237408 【實施方式】 本發明的一種實施態樣係提供一種能直接偵測在固態 支樓體上合成胜肽的重要分析方法。在某些態樣中，固雜 支撐體為一樹脂。該領域之習知技藝者所能得知的各種固 態支撐體均能於此發明所描述之方法在本系統中使用，然 而還是以對苯二甲酸二乙酯樹脂為最佳的固態支樓體。整 個質譜偵測流程除了只需要將連接在樹脂上之胜肽樣品置 於有機溶劑中外，並不需要額外的樣品前處理步驟。當利 用傳統的破壞性分析法以特徵化於固相支撲體上的大量化 合物時’必須以酸水解及酸切割胜肽分子以從非溶解性的 樹月曰中分離分子。結果’如解塊（de-blocking)或去保護 (de-protecting)之副作用於系統中導致額外片段的形成，且 中間體及產物的判斷變得混亂及困難。不像這些酸釋放方 法’本系統並不需要以酸試劑將產物切下等化學前處理步 驟而能成功地直接彳貞測到整段胜狀產物的分子離子訊號， 並且能夠大大的減低因分析所需要的樣品損耗。比起需要 在高度真空下操作的技術，本系統可以在大氣壓力下即時 監測反應及官控品質。如此一來，此種能直接降低樣品損 耗之即時監測方法可於胜狀合成反應中的每一個階段以確 認產物，對整個固相合成的品質控制會有極大的幫助。 本發明的一種實施態樣係提供一種即時監測化學反應 之系統，該系統包含： ~ ⑻一樣品； (b) —溶劑置換貯存槽； (c) 一光源； (d) —電喷灑單元；及 ⑻一質譜儀。 其中此處所提及之樣品係為胜肽合成樣品，此系統能夠 201237408 用來監測發生在逐步改良之固相支撐體上的各種化學反 應二如5前述，此系統包含了 一種溶劑置換貯存槽，此裝 置能夠，樣品在溶劑中跟切、卜般為雷射光源）更容易 接觸/谷劑般為低彿點溶劑，其在即時監測的情況下是 不反應的。此溶劑置換貯存槽可設計於系統中而能使溶劑 的加入到樣品（及固相支撐體）中’亦或者此溶劑置換 ' 、丁子槽可設計獨立於系統之外，此時溶劑則由操作者自行 加=到樣品（及固相支撐體）中。光源則為典型的雷射光源 並中照射到樣品上。各種的雷射光源可以應用於此系統 八中包括了 Nd-YAG 雷射（266-1064 nm, 20 Hz)， L^tis^Tii公司生產型號為LS_2l3〇的Ν(1_γΑ〇雷射也可 搭配间電壓電源供應器提供高電壓輸出（0-30KV, 0-300 μΑ，

Spellman a司，型號為CZE1000PN30)’以及其他可相比的 雷射光源。而電噴灑單元及質譜儀則於之後彳紹（其中包括 了由Bmker公司所生產的離子阱質譜儀，型號為Esquire 3000 plus)。 本發明的一種實施態樣係利用質譜儀提供一種即時監 測化學反應之方法’該方法包含以下步驟 (a) 在/從一化學合成發生之容器中提供一樣品； (b) 將此合成的樣品加人―有機溶劑； (c) 使用=光源打斷化學鍵並將分析物分子傳送到電 . 嘴灑游離團内；及 () 析刀析物分子之前驅離子(precursor ion)光譜而 ’則疋合成產物之分子量。 本發明的一種實施態樣係利用質譜儀提供一種即時監 測固相胜肽$成之方法，該方法包含以下步驟： (a)在/從一化學合成發生之容器中提供一連結之 胜肽； 201237408 (b) 將此合成的胜肽加入有機溶劑後置於一載台上； (c) 使用一光源打斷化學鍵並將分析物分子傳送到電 喷灑游離團内；及 (d) 刀析刀析物分子之前驅離子(precurs〇r i〇n)光譜而 測定合成產物之分子量。 本發明的一種實施態樣，該化.學反應係在一化學合成 反應器中進行。其中化學反應也包括了胜肽合成。在某些 態樣中，胜肽合成係為固相胜肽合成。任何固相支撐體均 可應用於此系統，其中包括了聚苯乙稀（polystyrene)及聚 醯胺（polyamide)樹脂。胜肽分子利用c端以共價鍵先鍵 結到樹脂的連接子（linker)上，此連接子為容易被酸或光 所分解之連接子。在其他態樣中，此連接子為酸不穩定之 連接子。在其他態樣中，連接子係為如同2_氣三苯甲基之 二苯曱基連接子。而胜肽合成一般透過耦合具有保護基之 胺基酸至^結合樣品的N端。具有保護基之胺基酸係利用 叔丁氧基羰基出〇〇，如卜1)_1(^(：姑〇1^1)〇1_9_苐基曱氧基 羰基(Fmoc ’ 9-fluorenylmethyloxycarbonyl)當作 N 端以及側 鏈之保護基。 在某些態樣中，樣品或者化學合成反應器、溶劑置換 貯存槽、光源、電魏單元以及㈣#量分析⑽在同一個裝置 中。在某些紐中，化學合成反應ϋ係與溶缝換貯存槽以 Ϊ 5 Ϊ Ϊ t結。在其他態樣中，反應室（代_ chamber) 與务劑置換貝丁存槽相同，即反應室亦可當作溶劑置換貯存 槽。 、 存槽包含了欲傳遞到反應室的溶劑，如此 -來在暴路到雷射光源前會先與溶劑接觸。 實施態樣，該溶劑係包含了極性與非極性之有機二: 丨？ 某些態樣中’此溶劑係為二氯甲境。在某些 8 201237408 劑係為一種極性含質子之溶劑，如曱醇。其中一種實施態 樣，該溶劑基本上並不包含於暴露在光源下能昇華及/或轉 移電荷至樣品之固態基質（solid matrices)或結晶性低分 子量有機分子’例如應用於MALDI (基質輔助雷射脫附 游離）的那些基質。這些所謂低分子量之基質係包含了分 子量低於1000、500、400或300克/莫耳以及芥子酸(3,5-二甲氧基-4-經基肉桂酸，sinapinic acid ， 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid)、α-氰-4_輕基肉桂酸 (a-cyano-4-hydroxycinnamic acid ， alpha-cyano or alpha-matrix) 以及 2,5- 二羥基苯甲酸 (2,5-dihydroxybenzoic acid ，DHB)等化合物。 光源、電喷灑單元以及質譜儀彼此均靠近化學合成反應 器。就光源而言’其定位在提供光給反應室。在某些態樣 中，反應室係位於由電喷灑單元所產生之電喷灑游離團 (electrospray plume)之路徑上。在某些態樣中，喷灑出來 之電喷灑游離團係通過反應室。 本發明的一種實施態樣，光源係為一雷射光，如脈衝 雷射。雷射光源具有足夠的能量打斷樣品與固相支撐體之 間的鍵結。斷裂後的分析物隨即與電喷灑游離團融合而發 生後游離’並進入質譜儀分析。 術語”電喷灑單元，，與，，電喷灑發射器（dectr〇spray emitter)在本申請案中是可互相置換的。電嘴灑單元可以 是任何形式存在，如針狀或者毛細管。且電噴灑單元是導 電的，或包含一個電極。在某些態樣中，質譜儀係包含一 個偵測離子質量之偵測器同時此偵測器，也可作為能產生 與電喷灑單元之間電場的輔助電極。藉由發射器（e^itter) 喷灑出的帶電液滴經由轉化成包含單分散液滴 (m_dispersed droplet)之電喷灑游離圑進入質譜儀中進 9 201237408 二偵測。不同於傳統的電喷灑游離方法，本申請案之電喷 之不含分析物的。分析物經由雷射脫附 發生雜錢人㈣譜儀分析。 本發月所k及之系統、材料以及方法均在環境壓力 J操作。而術語環境壓力是指在海平面 ， 一般為760毫米汞柱(_均)。 分析槐。係：之系統、設備、材料之—種實施態樣， 載a : 化干合成前或者化學合成中被放置於-樣品 施態樣中’分析樣品係在與雷射光源接 觸刖破放置於一樣品載台上。 △ f其他實施態樣中，此樣品載台係為鋼板或者聚醋載 口。在某些態樣中，聚酯纖維係選自聚對苯二甲酸二乙酯 、、气布）在其他態樣中，聚對苯二甲酸二乙醋係為黑色的。 實施例 曰以下實施例為更進一步幫助瞭解本發明，不應被理解成 是用來具體限定本發明. 實施例1 : 在沒有任何樣品前處理以及酸水解的步驟下，利用雷 $光源脫附以及電喷灑質譜儀直接分析了六個置放於有機 溶劑中的固相胜肽合成（spps)產物（樣品1到樣品6)。圖1 到圖6顯示出不同樣品的質譜圖，這些目標胜肽片段係利 用—般常用的連接子(linker)於固相樹脂上進行一步步地鍵 結合成。合成後的胜肽產物因具有完整的胜肽分子離子訊 號（[M+H]+)而容易被檢測。 此系統應用了一個模擬去Fmoc保護步驟反應（從5個 201237408 胺基酸分子到5個去Fmoc保護的胺基酸分子）的實施例來 證明此即時監測系統具有追蹤固相胜肽合成每一步反應的 能力。圖7顯示了以不同的重量比（1:9、3:7、5:5、7:3、 9:1、95:5以及99:1)混合樣品五（5 mer de-Fmoc)與樣品 四（5 mer)所分析後之質譜圖。由圖可看出，當5 mer de-Fmoc在去Fmoc的反應中增加重量比時，5 mer de-Fmoc (m/z 750.4)的訊號強度會增加，而5 mer (m/z 972.5)的訊號 強度則會降低。圖8是以5 mer與5 mer de-Fmoc的訊號強 度比例對5 mer de-Fmoc不同重量比例作圖。由圖可看出， 即使5 mer的重量比已經低於5% (表示5 mer de-Fmoc高於 95%)，5 mer與5 mer de-Fmoc的訊號強度比例能可以被债 測出往下的趨勢。這個結果說明了此偵測系統確實能夠應 用在固相胜肽合成反應中並且具有鑑定每一步反應的程 度。 樣品1 結構：

化學式：C90H94N9O: 真確質量：1476.71 分子量：1477.76 11

201237408 樣品2 結構. 化學式：c93h99n1()o12_ 真確質量：1547.74 分子量：1548.84 樣品 3 (4 mer de-Fmoc) 結構： 化學式：c29h53n4o9_ 真確質量：601.3813

12 201237408 樣品 4 (5 mer) 結構：

Ο Ο Ο Ο Ο

Η ϊ Η 1 Η ϊ Η 〇 Η II 5 N—CH-C—Ν—CH-C—Ν—CH-C—N-CH-C—Ν—CH-C—C ^[| CH2 CH (1η；, <1η2

Ο I w.〆\·\ 丨 丨 I ch-ch3 ch3 化學式：c53h72n5o12’ 真確質量：970.5177 樣品 5 (5 mer de-Fmoc) 結構.

化學式：c38h62n5o10· 真確質量：748.4497 13 201237408 樣品 6 (6 mer)

化學式：C61H87N6014· 真確質量：1127.6280 結構：

實施例2 : 用來乘載固態樣品的樣品載台材質也證實了會影響到 雷射脫附以及電喷灑質譜儀的分析穩定度及靈敏度。圖9 探討了將固相胜肽樹脂之樣品3 (4 mer de-Fmoc，m/z 603.3) 分別置於四種不同樣品載台之分析靈敏度，其中載台的材 質包括了棉墊、白色聚對苯二甲酸二乙酯、鋼板以及黑色 聚對苯二甲酸二乙酯。其結果顯示在固相胜肽合成樣品的 分析上，鋼及黑色聚對苯二甲酸二乙酯具有較高的靈敏度。 此外也針對鋼及黑色聚對苯二曱酸二乙酯兩種載台， 探討樣品 4 (5 mer，m/z 972·5)及樣品 5 (5 mer de-Fm〇c， m/z 750.4)兩種混和的固相胜肽合成樹脂的分析穩定度。如 圖10所示’經過進行三次實驗後，置於黑色聚對苯二甲酸 二乙酯的樣品有著比置於鋼的樣品具有更好的分析穩定 性。因此樣品載台材質的確會影響到分析靈敏度及穩定度。 【圖式簡單說明】 201237408 機溶劑（二氣甲烧）的樣品1的正電質 i毛細管而透於脈衝雷射光束及電喷 μ園圖^提供置於有機溶劑（二氣伐)的樣品2的正電質 ϊ毛。的樣品係暴露於脈衝雷射光束及電喷 灑毛、，、田s而游離且透過離子阱分析。 圖3提供置於有機溶劑（二氯甲烧）的樣品3(4咖 :η)的正電質譜圖，於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝 雷射光束及電喷灑毛細管而游離且透過離子陕分析。 圖二提供置於有機溶劑（二氣甲烧）的樣品4(5叫的 正電質’於液體溶劑巾的樣品絲露於脈衝雷射光束 及電喷灑毛細管而游離且透過離子阱分析。 圖5提供置於有機溶劑（二氯甲烧）的樣品5(5mer de-Fmoc)的正電質譜圖’於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝 雷射光束及電喷灑毛細管而游離且透過離子阱分析。 圖6提供置於有機溶劑（二氯甲烧）的樣品6(6mer)的 正電質譜圖’於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝雷射光束 及電喷灑毛細管而游離且透過離子味分析。 圖7為以不同的重量比（1:9、3:7、5:5、7:3、9:卜95:5 以及99.1)混合樣品5 (5 mer de-Fmoc)與樣品4 (5 mer)所 分析後之正電質譜圖。 圖8是以5 mer與5 mer de-Fmoc的訊號強度比例對5 mer de-Fmoc重量比例作圖，⑷重量比例1〇%〜99% ; (b)重 量比例30%〜90% ; (c)重量比例91%〜99%。 圖9為4 mer de-Fmoc (m/z 603.3)之胜肽樣品分別置 於四種不同樣品載台之質譜圖，其中⑻棉墊；（b)白色聚對 苯二甲酸二乙酯；（c)鋼板；（d)黑色聚對苯二曱酸二乙酯。 圖 10 為 5 mer (m/z 972.5’ 紅線）及 5 mer de-Fmoc (m/z 15 201237408 750.4,藍線）胜肽所混合之樹脂樣品置於(a)鋼樣品載台及 (b)黑色聚對苯二曱酸二乙酯上所得之EIC (萃取離子層 析，Extract Ion Chromatogram)圖。 圖11為本發明之說明圖，其中與支撐體結合的樣品係 以雷射光束打斷，以提供能利用質量分析儀於ESI發射器 光線中分析最低限度的反應產物分子。 16

Claims (1)

1. 201237408 七、申請專利範圍： * 1. 一種即時監測化學反應之系統，該系統包含： (a.) 一樣品， (b) —溶劑置換貯存槽； (c) 一光源； (d) —電喷灑單元；及 * (e)—質譜儀。 2. 如申請專利範圍第1項所述之系統，其中該樣品係在/從 一化學合成反應器中。 3. 如申請專利範圍第2項所述之系統，其中該化學反應為 胜肽合成。 4. 如申請專利範圍第3項所述之系統，其中該胜肽合成為 固相胜狀合成。 5. —種利用質譜儀即時監測化學反應之方法，該方法包含 以下步驟： (a) 在/從一化學合成發生之容器中提供一樣品； (b) 將該合成的樣品加入一有機溶劑； (c) 使用一光源打斷一化學鍵並將該分析物分子傳送 到一電喷灑游離團内；及 (d) 分析該分析物分子之前驅離子光譜而測定合成產 物之分子量。 6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該化學反應為 胜肽合成。 7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該胜肽合成為 固相胜肽合成。 8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該有機溶劑係 選自二氯曱烷或曱醇。 9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該有機溶劑係 17 201237408 選自二氯甲烷。 · 10. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該合成的樣品 係置於一載台上。 11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該載台係選自 鋼或聚g旨。 12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該聚酯係選自 聚對苯二甲酸二乙酯。 13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該聚對苯二曱 酸二乙酯係為黑色的。 14. 一種利用質譜儀提供即時監測固相胜肽合成之方法，該 方法包含以下步驟： (a) 在/從一化學合成發生之容器中提供一樹脂連結之 胜肽； (b) 將該合成的胜肽加入一有機溶劑，置於一載台上； (c) 使用一光源打斷一化學鍵並將該分析物分子傳送 到一電喷灑游離團内；及 (d) 分析該分析物分子之前驅離子光譜而測定合成產 物之分子量。 15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該有機溶劑係 選自二氣曱烷。 16. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該載台係選自 鋼或聚酯。 17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該聚酯係選自 聚對苯二曱酸二乙酯。 18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該聚對苯二甲 酸二乙酯係為黑色的。 18